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TWI866975B - 放大及檢測核糖核酸（rna）片段的方法 - Google Patents

放大及檢測核糖核酸（rna）片段的方法 Download PDF

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TWI866975B
TWI866975B TW109116971A TW109116971A TWI866975B TW I866975 B TWI866975 B TW I866975B TW 109116971 A TW109116971 A TW 109116971A TW 109116971 A TW109116971 A TW 109116971A TW I866975 B TWI866975 B TW I866975B
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TW109116971A
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邱國平
蕭欣杰
梓康 吳
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中央研究院
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Abstract

本發明係有關一種放大及檢測核糖核酸（RNA）片段的方法。具體而言，本發明之方法包含轉換RNA片段為cDNA及放大DNA。本發明亦提供一種用於進行本文所述方法的套組。

Description

放大及檢測核糖核酸（RNA）片段的方法
本申請案係於35 U.S.C. §119之規範下，主張2019年5月21日申請之美國專利臨時申請號62/850,651的權益，其全部內容在此併入本案以作為參考資料。
本發明係有關於一種放大及檢測核糖核酸（RNA）片段的方法。具體而言，本發明之方法包含轉換RNA片段為cDNA及放大DNA。本發明亦提供一種用於進行本文所述方法的套組。
RNA為參與基因表現與調控的重要遺傳物質。具體而言，生物流體（如，血液、唾液、尿液等）中的無細胞RNAs（cfRNAs）具有生物學與醫學意義的重要遺傳信息，因此，成為診斷許多疾病的有價值非侵入性樣本。然而，cfRNAs非常多樣，其結構與功能仍未知。此外，由於cfRNAs在正常情況下以少量存在於生物流體中，且可能容易降解或片段化，因此，以當前的方法檢測或分析cfRNAs一直都是挑戰。
已經開發出一些常規技術，用於RNA檢測、驗證、及定量。通常而言，從生物樣本中分離RNAs，並利用反轉錄反應（RT）轉換為互補DNAs（cDNAs），接著以常規或定量聚合酶鏈反應（qPCR）進行放大。常規的DNA放大PCR方法需要二或多條配對的寡核苷酸引子，每一配對包含一條正向引子與一條反向引子，以特異性地界定出欲放大之特定標靶核酸序列的邊界。舉例而言，New England Biolabs（NEB）商業化一種帶有套組的方法（NEBNext小型RNA文庫製備套組），其產生cDNA片段在5’端與3’端具有不同轉接子，供兩條不同的引子結合（參見圖1之步驟f），但其可能導致效率問題。在這方面，Ferrero等人描述了人類生物流體與健康個體替代組織中的小型非編碼RNA概貌（Ferrero等人，2018）。Yuan等人描述了健康與癌症病患的血漿細胞外RNA概貌（Yuan等人，2016）。Everaert等人描述了人類生物流體與細胞外囊泡（EVs）之總RNA定序的表現評估（Everaert等人，2019）。這些方法有所侷限，原因在於欲評估之cfRNAs的各種態樣，包括數量稀少、片段長度短、種類繁多、或降解迅速。因此，亟需能完整評估樣本中所有RNA種類的全面性方法。
本發明提供一種新穎的RNA評估方法。
通常，本發明提供一種增進之基於PCR的技術，以進行RNAs評估，其特徵在於RNAs的反轉錄反應以產生cDNA產物，其中在兩端皆具有單一類型（同源性）轉接子，使得能以單一引子作為正向與反向引子進行DNA放大。本發明之方法僅需以較少的RNA量作為初始投入量，且特別適於檢測微量的RNA分子，從而可以更高的靈敏度進行後續的標靶特異性探針檢測。此外，本發明之方法達到涵蓋各RNA種類之總RNA的全面RNA概貌而無偏差，其中放大的cDNAs保持原始樣本中相應之RNA片段的相對數量，其至少提供了優勢，即可以更高的靈敏度與更少的偽陰性進行後續的標靶特異性探針檢測。
特定而言，本發明提供一種轉換線性、單股RNA（ssRNA）片段為DNA片段及放大DNA片段的方法。該方法包含下列步驟： （a）從ssRNA片段移除5’磷酸根以產生去磷酸化之ssRNA片段； （b） 將P寡核苷酸（DNA）（具有P寡核苷酸序列且攜帶5’磷酸根的單股DNA）連接至去磷酸化之ssRNA片段的3’端以形成ssRNA-P寡核苷酸（DNA）股； （c） 藉由以5’-ssRNA-P寡核苷酸（DNA）-3’股作為模板且添加T寡核苷酸（DNA）（具有與P寡核苷酸（DNA）互補並黏合之T寡核苷酸序列的單股DNA）作為引子進行第一反轉錄反應，以合成與ssRNA片段互補的互補DNA（cDNA）股，以產生5’-T寡核苷酸（DNA）-cDNA-3’股，從而形成由ssRNA-P寡核苷酸（DNA）股與cDNA-T寡核苷酸（DNA）股組成的初始RNA/DNA雜合體； （d） 將T寡核苷酸（RNA）（與P寡核苷酸（DNA）互補的單股RNA）連接至初始RNA/DNA雜合體中之5’-ssRNA-P寡核苷酸（DNA）-3’股的5’端，以形成5’-T寡核苷酸（RNA）-ssRNA-P寡核苷酸（DNA）-3’股，從而形成由該5’-T寡核苷酸（RNA）-ssRNA-P寡核苷酸（DNA）-3’股與5’-T寡核苷酸（DNA）-cDNA-3’股組成的中間物RNA/DNA雜合體，其具有非互補T寡核苷酸（RNA）懸垂； （e） 以非互補T寡核苷酸（RNA）懸垂作為延伸模板進行第二反轉錄反應以取得完整cDNA股，其5’端具有T寡核苷酸序列且3’端具有P寡核苷酸序列，從而形成該5’-T寡核苷酸（RNA）-ssRNA-P寡核苷酸（DNA）-3’股與該完整cDNA股的完整RNA/DNA雜合體； （f）  從RNA/DNA雜合體移除T寡核苷酸（RNA）與ssRNA片段以產生部分、雙股DNA，其包含該完整cDNA股在其5’端與P寡核苷酸（DNA）部分地雜合化；以及 （g）利用此延伸之cDNA股作為PCR模板與具有T寡核苷酸序列的T寡核苷酸引子進行T寡核苷酸啟始之聚合酶鏈反應（TOP-PCR），以啟始合成雙股cDNA產物。
在一些具體實施例中，ssRNA片段包含一表示個體之健康/疾病狀態的核酸序列。
在一些具體實施例中，ssRNA片段係存在於個體（如，患病之個體）的樣本中。
在一些具體實施例中，樣本係取自體液樣本，包括但不侷限於，源自個體之血液、尿液、唾液、淚液、汗液、母乳、鼻分泌物、羊水、精液、或陰道分泌物的樣本。
在一些具體實施例中，ssRNA片段為無細胞RNAs（cfRNAs）。具體而言，cfRNAs為囊泡中之RNAs（vc-RNAs），如胞外體、微囊泡、或胞內體中之彼等。
在一些具體實施例中，在步驟（d）之前，ssRNA-P寡核苷酸（DNA）股係磷酸化。
在一些具體實施例中，在步驟（g）中，T寡核苷酸引子為唯一用於PCR反應的引子。
在一些具體實施例中，ssRNA片段係以0.01 ng至100 ng或更少量（如，0.01 ng至10 ng或更少）的初始投入量（總RNA）存在。
在一些具體實施例中，ssRNA片段係以約90 ng、80 ng、70 ng、60 ng、50 ng、40 ng、30 ng、20 ng、10 ng、5 ng、2.5 ng、1 ng、或更少量的初始投入量（總RNA）存在。
在一些具體實施例中，ssRNA片段係以0.01 ng至100 ng或更多量（如，0.1 ng至100 ng或以上、10 ng至100 ng或以上、或1微克或以上）的初始投入量（總RNA）存在。
在一些具體實施例中，本發明之方法更包含利用診斷或臨床裝置（如，質譜法、雜合法、或定序法）檢測放大之cDNA產物。
在一些具體實施例中，本發明之方法可包括一或多個純化步驟。
在一些具體實施例中，本發明之方法不包括純化步驟。
本發明亦提供一RNA評估方法，其包含： （i）  提供個體之生物流體樣本，其中生物流體包括ssRNA片段； （ii） 進行如本文所述之本發明RNA TOP-PCR方法，以將ssRNA片段轉換為相應之DNA片段及放大此DNA片段；以及 （iii）   分析放大之DNA片段，以測量放大之DNA片段的一或多個特徵。
在一些具體實施例中，（iii）分析步驟包括定序、匹配、及/或比對。
本發明亦提供一種進行如本文所述之RT-PCR方法的套組，其包含： （i）  去磷酸化試劑，其包含鹼性磷酸酶與去磷酸化緩衝液； （ii） 連接試劑，其包含連接酶、連接緩衝液、P寡核苷酸（DNA）、及T寡核苷酸（RNA）； （iii）   磷酸化試劑，其包含激酶與激酶緩衝液； （iv）反轉錄試劑，其包含反轉錄酶（RT）、RT緩衝液、dNTP、及T寡核苷酸（DNA）； （v）RNA消化試劑，其包含RNase與RNase緩衝液；以及 （vi）PCR試劑，其包含DNA聚合酶、PCR緩衝液、dNTP、及T寡核苷酸引子。
本發明之一或多個具體實施例之細節如以下的描述中所示。本發明之其他特徵或優勢將因以下數個具體實施例之詳盡說明以及所附之申請專利範圍而變得顯而易見。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術性與科學性術語具有與本發明所屬領域之技術人員通常所理解的相同含義。
本文中使用的冠詞「一」與「一個」意指一或一個以上（即至少一個）的冠詞語法對象。舉例而言，「一元件」意指一個元件或一個以上的元件。
「包含」或「包含有」等詞通常以包括/包括了的意義使用，其意指允許存在一或多個特徵、成分、或組分。「包含」或「包含有」等詞包括「組成自」或「由～組成」。
本文中使用的「約」、「大約」、或「近似」等詞通常可指一給定數值或範圍的20%以內，特別地10%以內，且更特別地5%以內。本文給定之數值為近似值，意指若無明確指出，則可推測為「約」、「大約」、或「近似」。
「多核苷酸」或「核酸」等詞意指由核苷酸單元組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，如去氧核糖核酸（「DNA」）與核糖核酸（「RNA」），以及核酸類似物，包括彼等具有非天然存在之核苷酸者。多核苷酸可諸如利用自動化DNA合成儀合成。「核酸」乙詞通常意指大型多核苷酸。多核苷酸或核酸可為單股（如，ssRNA或單股cDNA）或雙股（如，RNA/DNA雙股或dsDNA）。 將理解到，當將核苷酸序列以DNA序列（亦即，A、T、G、C）為代表時，此亦包括一RNA序列（亦即，A、U、G、C），其中以「U」代替「T」。「寡核苷酸」乙詞意指一相當短的核酸片段，通常小於或等於150個核苷酸長（如，介於5與150個之間）。寡核苷酸可視需求設計與合成。在引子方面，其長度通常介於5與50個核苷酸之間，特別是介於8與30個核苷酸之間。在探針方面，其長度通常介於10與100個核苷酸之間，特別是介於30與100個核苷酸之間。本文中使用的「P寡核苷酸」乙詞可指一攜帶5’磷酸根以連接RNA片段之3’端的寡核苷酸。本文中使用的「T寡核苷酸」乙詞可指一與P寡核苷酸互補的寡核苷酸。
本文中使用的「互補」乙詞意指兩個多核苷酸之相互作用表面的拓撲學相容性或相互匹配。因此，這兩個分子可描述為互補，且接觸表面之特徵為彼此互補。若第一多核苷酸之核苷酸序列與第二多核苷酸之多核苷酸結合配偶體的核苷酸序列相同，則第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，序列為5’-TATAC-3’之多核苷酸與序列為5’-GTATA-3’的多核苷酸互補。
本文中使用的標靶核酸乙詞意指欲於樣本中檢測出的特定感興趣核酸。特定而言，標靶核酸包括RNA，特別是cfRNA，包括mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、cfRNA、及/或vcRNA。標靶核酸可源自任何來源，包括天然存在之來源或合成之來源。舉例而言，標靶核酸可源自動物或病原體來源，包括但不侷限於，哺乳類動物（如，人類）及病原體（如，細菌、病毒、及真菌）。標靶核酸可取自任何體液或組織（如，血液、尿液、皮膚、頭髮、糞便、及黏液），或環境樣本（如，水樣本或食物樣本）。在一些具體實施例中，標靶核酸可為相同來源（如，源自正常或疾病個體或病原體的相同基因）之核酸分子的集合，但長度不同。
本文中使用的「無細胞RNA」或cfRNA（s）等詞意指在個體體液中循環之任何類型的RNAs，但不存在於細胞體或細胞核內部。無細胞RNAs已成為早期發現、預後、或監測疾病（尤其是癌症）的有價值侵入性生物標記。RNA不穩定，其對核糖核酸酶的降解敏感。發現到，在體液中循環的無細胞RNA被包裹在細胞外囊泡（EVs）之內，或以與脂蛋白或其他RNA結合蛋白結合的無囊泡形式存在。無細胞RNAs可為任何類型的RNA，包括但不侷限於，傳訊RNA（mRNA）、傳遞RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）、及非編碼RNA（包括長型非編碼RNA（IncRNA）（超過200個核苷酸）與小型非編碼RNA（SncRNA）（小於200個核苷酸））。SncRNA之實例包括小型干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、穹窿體RNAs（vtRNA）、及Y-RNA等。無細胞RNAs可為彼等全長或片段化者，例如，編碼一或多個蛋白（如，癌症相關蛋白、發炎相關蛋白、訊息傳遞相關蛋白、能量代謝相關蛋白）的mRNA片段（如，全長之至少80%、全長之至少70%、全長之至少60%、全長之至少50%、全長之至少40%等）。RNA的大小可變，例如，範圍為約10個鹼基或以下至約3,000個鹼基或以上，特定而言包括70至80個鹼基、80至90個鹼基、90至110個鹼基、及150至170個鹼基的群體。
有適合用於分離無細胞RNA的方法。通常，無細胞RNA分離自生物流體，如全血（較佳地加工成血漿或血清），或任何其他流體（如，唾液、腹水、尿液、脊髓液等），只要此類液體中存在無細胞RNA，即視為適用。在一些典型之具體實施例中，將全血離心以分離血漿。隨後，將由此獲得的血漿分離並離心以除去細胞碎片。利用商業化試劑（如，Qiagen試劑）從血漿中萃取出無細胞RNA。所得RNA樣本可在進一步處理之前冷凍。
本文中使用的與樣本中之核酸相關的「微量」或「低量」乙詞可指相對低於常規評估核酸之方法所用的量。舉例而言，與生物樣本中欲分析之RNAs相關之微量可指約0.01 ng至100 ng或更少量（如，0.01 ng至10 ng或更小，或者少數RNA分子或甚而單一RNA分子）。
本文中使用的「引子」乙詞意指可用於放大方法（如，聚合酶鏈反應（PCR））的寡核苷酸，以放大標靶核苷酸序列。在常規PCR中，欲進行放大，需要至少一對引子，包括一條正向引子與一條反向引子。通常，針對由欲放大之（+）股與（−）股組成的標靶DNA序列，正向引子為可雜合至（−）股之3’端的寡核苷酸，從而可在反應條件下開始新的（+）股的聚合反應；而反向引子為可在反應條件下雜合至（+）股之3’端的寡核苷酸，從而可在反應條件下開始新的（−）股的聚合反應。特定而言，作為一實例，正向引子可具有與（+）股之5’端相同的序列，且反向引子可具有與（−）股之5’端相同的序列。正常而言，進行標靶核酸序列放大的正向引子與反向引子彼此序列不同。本文中使用的「單一」引子意指僅一種類型之引子，其全部具有相同的序列，而非一對具有不同序列的引子，一者為正向引子，另一者為反向引子。
本文中使用的「雜合反應」乙詞應包括一股核酸經由鹼基配對與互補股結合的任何過程。相關方法為本領域中已知，且描述於，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989），以及Frederick M.A.等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons, Inc.（2001）。通常，選擇的嚴格條件為比指定序列在規定之離子強度與pH下的熱熔點（Tm ）低約5至30°C。更常為，選擇的嚴格條件為比指定序列在規定之離子強度與pH下的Tm 低約5至15°C。舉例而言，嚴格的雜合條件為，彼等鹽類濃度小於約1.0 M鈉（或其他鹽類）離子者，通常在約為pH 7.0至pH 8.3下約0.01至約1 M鈉離子濃度，且針對短探針（如，10至50個核苷酸）之溫度為至少約25°C及針對長探針（如，大於50個核苷酸）之溫度為至少55°C。長探針（如，大於50個核苷酸）之示例性非嚴格或低嚴格條件將包含20 mM Tris，pH 8.5、50 mM KCl、及2 mM MgCl2 的緩衝液，以及反應溫度25°C。
本文中使用的「反轉錄反應」乙詞意指從RNA模板產生互補DNA（cDNA），其通常由酵素（如，反轉錄酶）進行，且需要引子黏合至RNA模板。
「單一（single）」、「同源性（homogenous）」、或「通用（universal）」引子意指在PCR反應中僅有一種類型的引子，其中存在相同序列，而非一對引子。「異源性引子（homogenous primers）」乙詞意指在PCR反應中存在至少一對引子，每一成員彼此具有不同序列。
本文中使用的「轉接子（adaptor）」乙詞意指可連接至核酸分子末端的寡核苷酸。轉接子之長度可為10至50個鹼基，較佳地長度為10至30個鹼基，更佳地長度為10至20個鹼基。長度小於10個核苷酸會降低黏合特異性。長度大於20個核苷酸可能不具成本效益。「同源性（homogenous）」轉接子乙詞意指用於連接雙股核酸分子兩端之單一類型轉接子。「異源性（heterogenous）」轉接子乙詞意指至少兩類型之轉接子，其彼此具有不同核苷酸序列，一者存在於雙股核酸分子5’端且一者存在於3’端。在本發明中，使用由P寡核苷酸與T寡核苷酸形成的同源性轉接子。在本發明之一具體實施例中，T寡核苷酸具有序列：5’-AGACTCCGACT-3’（SEQ ID NO: 2）；且P寡核苷酸具有相應之序列：5’-AGTCGGAGTCT-3’（SEQ ID NO: 1）。序列可為RNA形式（其中在一些位置可使用鹼基U而非鹼基T）。
本發明提供一種增進之RNA轉換與cDNA放大技術，稱作「RNA T寡核苷酸啟始之聚合酶鏈反應（RNA TOP-PCR）」，其特別適用於全面無偏誤放大微量的線性、單股RNA。相較於常規RT-PCR技術，其產生在5’端與3’端具有不同轉接子的cDNA片段，從而後續的放大反應需要兩條不同的引子，本發明方法產生具有同源性（單一類型）轉接子的cDNA片段（其由P寡核苷酸與T寡核苷酸彼此互補製成），從而所得cDNA片段可由單一T寡核苷酸引子黏合至同源性轉接子之P寡核苷酸而放大。據此，RNA片段之初始投入量可以更少，且RNA轉換為DNA及DNA放大效率增加。此外，樣本中的所有RNA片段皆可均等地放大，且後續的靶標特異性探針檢測可以提高的靈敏度進行。依據本發明之方法，微量的RNA樣本即足夠，例如，在欲檢測之樣本中，以約0.01 ng至100 ng或以下（如，90 ng或以下、80 ng或以下、70 ng或以下、60 ng或以下、50 ng或以下、40 ng或以下、30 ng或以下、20 ng或以下、10 ng或以下、5 ng或以下、1 ng或以下、0.5 ng或以下、0.1 ng或以下、0.01 ng或以下、或少數RNA分子或甚而單一RNA分子）作為初始投入量。可理解到，本發明之方法亦可應用在更高量的RNA樣本中，例如，0.01 ng至100 ng或以上（如，0.1 ng至100 mg或以上、10 ng至100 ng或以上、或1微克或以上）。
圖1為本發明方法之程序（步驟A至G）示意圖。步驟A進行cfRNA的5’去磷酸化。步驟B進行cfRNA之3’連接至P寡核苷酸。步驟C進行利用反轉錄反應的第一cDNA合成。步驟D進行cfRNA與T寡核苷酸（RNA形式）的5’轉接子連接。步驟E進行延伸的反轉錄反應。步驟F進行RNA消化反應。步驟G進行TOP-PCR放大反應。TOP-PCR技術已說明於，例如，美國專利申請公開號20160298172（亦即，美國專利號10,407,720），其全部內容在此併入本案以作為參考資料。細節將在下面實施例中說明。
本發明之RNA TOP-PCR係經特別設計以放大體液中的低量RNA片段。相較之下，NEBNext小型RNA文庫製備套組旨在從「總RNA」而非cfRNA製備小型RNA文庫，以進行由Illumina定序儀的定序。NEB之方法需要至少100 ng的總RNA作為起始材料以製造小型RNA定序文庫。此外，NEB之方法使用兩條不同轉接子，從而下游放大反應需要兩條不同的引子，其導致效率更低。Illumina之方法不適合少量cfDNA定序，從而亦不適合cfRNA/vcRNA定序。
本發明方法優於NEB方法之優勢包括但不侷限於，以下：1）本發明之方法可評估cfRNAs（包括vcRNAs），儘管其亦可應用在細胞中的RNAs；2）本發明之方法需要較少量的RNAs作為初始投入量（約1 ng或更少即足夠）；3）本發明之方法可檢測多種RNA群體，且不侷限於特定類型的RNAs；4）本發明之方法可藉由將樣本中之多種RNA種類轉換為相對量之相應cDNAs，達到全面的RNA概貌，而無偏誤；（5）當應用於診斷時，本發明之方法可提供更高的靈敏度與更少的偽陰性；6）本發明之方法產生單一類型（同源性）轉接子，而NEB之方法產生兩個（異源性）轉接子；以及7）本發明之方法利用T寡核苷酸啟始之聚合酶鏈反應（TOP-PCR）放大RNA衍生之cDNA，其使用單一T寡核苷酸引子（其在一些位置可使用鹼基U而非鹼基T）。相較於Illumina之方法，TOP-PCR為一優越且更有效的方法（Nai等人，2017；Sci. Rep. 7: 40767）。
藉由以下實施例進一步說明本發明，其之提供旨在說明而非侷限。鑑於本發明，本領域技術人員應理解到，可對揭示之特定具體實施例進行許多改變，且仍取得相似或類似之結果，而不脫離本發明之精神與範疇。
實施例
1. 材料與方法
1.1 無細胞 RNA 分離
無細胞RNA係從健康男性血漿中分離出。以BD Vacutainer靜脈採血管（BD，#367525）收集健康男性的全血樣本。利用miRNeasy血清/血漿套組（Qiagen，#217184）分離血漿fRNA片段。以Qubit RNA HS試驗套組（Thermo Fisher，#Q32852）將分離之cfRNA樣本定量並保存在-70o C。以採用RNA或DNA凝膠的片段分析儀（Fragment Analyzer，AATI）評估RNA與DNA樣本之定量與定性。
1.2 轉換 cfRNA 為 cDNA 及放大以取得 dsDNA 產物
圖1顯示本發明過程之程序，包括步驟A至G。
利用下列步驟將cfRNA樣本轉換為cDNA而不純化。
步驟 A ： cfRNA 之 5’ 去磷酸化
在步驟A中，將cfRNA的5’端去磷酸化。5 μL的去磷酸化混合物含有20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM MgCl2 、1單位/μL的RNase抑制劑（NEB，#M0314）、及1單位的蝦鹼性磷酸酶（NEB，#M0371）。混合物在37o C下培養30分鐘及在65o C下培養10分鐘。其結果為，cfRNA的5’端去磷酸化。
步驟 B ： cfRNA 的 3’ 連接至 P 寡核苷酸
在步驟B中，添加P寡核苷酸，並連接至去磷酸化之cfRNA的3’端。18 μL的3’連接混合物含有50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl2 、1 mM DTT、1 mM ATP、40x莫耳比率之11nt P寡核苷酸（DNA）（Sigma，5’-磷酸-AGTCGGAGTCT（SEQ ID NO: 1）-[AmC3]-3’）、25% PEG 8000、1單位/μL的RNase抑制劑、及1單位/μL T4 RNA連接酶1（NEB，#M0437）。反應混合物在37o C下培養1小時，並保持在4o C。其結果為，得到cfRNA片段之3’端連接至P寡核苷酸。
步驟 C ：利用反轉錄反應（ RT ）進行第一 cDNA 合成
在步驟C中，添加T寡核苷酸（DNA形式，其與P寡核苷酸互補），並黏合至cfRNA片段之P寡核苷酸部分。30 μL的RT混合物含有50 mM Tris-HCl（pH 8.3）、75 mM KCl、6 mM MgCl2 、10 mM DTT、0.5 mM dNTP、1單位/μL的RNase抑制劑、及100單位的ProtoScript II反轉錄酶（NEB，#M0368）。在RT之前，將40x莫耳比率之11nt T寡核苷酸（DNA，其與P寡核苷酸互補）（IDT，5’-[AmMC6]-AGACTCCGACT（SEQ ID NO: 2）-3’）加入3’端連接混合物（取自步驟B）中，並在65o C下培養5分鐘，在37o C下培養5分鐘，在25o C下培養5分鐘，並保持在4o C下，導致T寡核苷酸黏合至P寡核苷酸。隨後，反應混合物在25o C下培養10分鐘，在42o C下培養50分鐘，在65o C下培養20分鐘，並保持在4o C下。其結果為，合成第一股cDNA，並形成RNA/DNA雜合體，包括第一股cDNA與具有P寡核苷酸之cfRNA片段互補。
步驟 D ： 具有T寡核苷酸（RNA形式）之cfRNA的5’轉接子連接
在步驟D中，添加T寡核苷酸（RNA形式），並連接至RNA/DNA雜合體中之cfRNA片段的5’端。45 μL的磷酸化混合物含有50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl2 、10 mM DTT、1.4 mM ATP、20% PEG 8000、1單位/μL的RNase抑制劑、及10單位的T4多核苷酸激酶（NEB，#M0201）。用於磷酸化之反應混合物在37o C下培養30分鐘，並保持在4o C下。隨後，以200X莫耳比率將RNA形式之11nt T寡核苷酸（IDT，5’-AmMC6-rArGrArCrUrCrCrGrArCrU（SEQ ID NO: 3）-3’）加入磷酸化混合物中，並在65o C下培養5分鐘，在37o C下培養5分鐘，在25o C下培養5分鐘，並保持在4o C下。接下來，將T寡核苷酸連接至cfRNA之5’端。在總共60 μL的連接混合物中含有50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、7.5 mM MgCl2 、7.5 mM DTT、1.8 mM ATP、25% PEG 8000、1單位/μL的RNase抑制劑、及5單位的T4 RNA連接酶2（NEB，#M0239）。用於連接的反應混合物係在37o C下培養2小時，並保持在16o C下。
步驟 E ：延伸之反轉錄反應
在步驟E中，進行延伸之反轉錄反應，以形成完整RNA-DNA雙股。75 μL的延伸之RT混合物含有50 mM Tris-HCl（pH 8.3）、75 mM KCl、6 mM MgCl2 、10 mM DTT、0.4 mM dNTP、1單位/μL的RNase抑制劑、及100單位的ProtoScript II反轉錄酶。反應混合物在42o C下培養20分鐘，在65o C下陪養20分鐘，並保持在4o C下。其結果為，形成完整RNA/DNA雜合體。
步驟 F ： RNA 消化反應
在步驟F中，添加RNase，以消化RNA/DNA雜合體中之RNA片段。將總共7.5單位的RNase H（NEB，#M0297）與7.5 μg的RNase A（QIAGEN，#19101）加入延伸之RT混合物（取自步驟E）中，隨後在37o C下培養20分鐘，在65o C下培養20分鐘，並保持在4o C下，以移除RNA，在TOP-PCR放大步驟之前僅保留DNA片段。
步驟 G ： TOP-PCR 放大反應
在步驟G中，以DNA片段（在變性之後無P寡核苷酸）作為模板，並以T-3U寡核苷酸（IDT，5’-AGCGCU AGACU CCGACU -3’）（SEQ ID NO: 4）作為單一引子，進行PCR放大反應，以取得dsDNA產物。
750 μL的PCR混合物含有1X Phusion HF緩衝液、0.2 mM dNTP、1 μM 17nt T-3U寡核苷酸、及15單位的Phusion U Hot Start DNA聚合酶（ThermoFisher，#F555）。PCR條件：1 ） 1個循環的初始變性反應（在98o C下30秒）；2 ） 3至5個循環的變性反應（在98o C下10秒）、引子黏合（在27o C下1分鐘）、及延伸反應（在72o C下1分鐘）；3 ） 15至20個循環的變性反應（在98o C下10秒）、引子黏合（在57o C下30秒）、及延伸反應（在72o C下1分鐘）；以及4 ） 最終延伸反應（在72o C下5分鐘）並保持在4o C下。以核酸外切酶I（NEB，#M0293）處理PCR產物，以移除引子，並以QIAquick核苷酸移除套組（QIAGEN，#28304）純化。以QubitTM DNA HS試驗套組（ThermoFisher，#Q32851）將轉接子連接之dsDNA定量，並保存在-70o C下。
在定序文庫構築之前移除T-3U寡核苷酸。
1.3 定序文庫製備與定序
TOP-PCR所使用的轉接子必須在定序文庫構築之前移除。欲製造定序文庫，在25 μL的1X TE緩衝液（10 mM Tris-HCl（pH 8.0），0.1 mM EDTA）中，以2單位的不耐熱USER II酵素（NEB，M5508）處理約10 ng前面步驟產生的DNA，然後在37o C下培養15分鐘並保持在25o C，以完全移除轉接子。按照製造商的說明，以NEBNext Ultra II DNA文庫製備套組（NEB，E7645）構築Illumina定序文庫。定序文庫以Qubit DNA HS試驗套組定量，並保存在-20o C下。
利用Agilent片段分析儀評估片段大小，並以Roche LightCycler LC480 II機器進行定量，其使用基於qPCR的KAPA文庫定量套組（Roche，KK4854）。文庫以2x150 bp配對端（PE）定序，其中使用HiSeq X Ten（Macrogen，South Korea）。
1.4 原始讀取之處理
利用Cutadapt軟體，從原始讀取中移除由P與T-3U寡核苷酸形成之轉接子序列的潛在遷移（carryover）。Cutadapt亦可調整Illumina定序所使用的P5與P7轉接子。隨後，以PRINSEQ軟體檢查鹼基品質評分與不明確鹼基（N）的存在。隨後，以NGS QC工具套組（使用預設參數）檢查讀取品質。針對每一步驟，最小讀長為15。應用FLASH，其具有定義之參數（-m 4 -M 151），將配對之讀取組合成片段。
1.5 匹配與序列分析
利用RNA-seq比對器STAR（Dobin等人，2013），將品質讀取定位到人類基因體GRCh38.p12。此外，採用GENCODE參考註解（第29版），以鑑定人類基因體之基因（Frankish等人，2019）。計算與分析基因相關的讀取，以進一步利用featureCounts軟體進行分析（Liao等人，2014）。以SAMtools執行SAM/BAM文件的後處理（Li等人，2009），並以Picard工具從BAM文件產生統計資訊（https://broadinstitute.github.io/picard）。
2. 結果
2.1 cfRNA 評估
從三名健康男性之每一人的血漿中分離出cfRNA樣本，並進行本發明之RNA TOP-PCR方法。在讀取品質控制方面，發明人以QV值20作為截止值。表1顯示其結果。
表1. 無細胞RNAs之起源
  文庫
男性-1 男性-2 男性-3
#品質PE讀取 114,751,125 149,594,241 178,304,241
cfRNAs之起源 線粒體 12,770,790（12.4） 6,884,109（5.1%） 1,098,624（0.7%）
rRNA 59,537,165（57.6%） 59,568,493（43.7%） 105,099,757（64.9%）
tRNA 13,932（0.01%） 58,387（0.04%） 154,575（0.10%）
mRNA 15,615,460（15.1%） 35,709,856（26.2%） 27,354,378（16.9%）
lncRNA 6,079（0.01%） 10,033（0.01%） 2,985（0.00%）
YRNA 47,991（0.05%） 41,678（0.03%） 10,017（0.01%）
穹窿體RNA 280（0.00%） 27（0.00%） 33（0.00%）
未匹配 15,430,147（14.9%） 34,058,019（25.0%） 28,172,812（17.4%）
cfRNA片段的主要來源為1）rRNA，接著為2）mRNA，3）線粒體RNA，以及4）YRNA。特別感興趣的是YRNA，其已知涉及免疫性。
已經證實，本發明之方法能將微量的cfRNA片段轉換為DNA片段，其可進行放大及/或定序，以產生全面的RNA概貌，且有助於RNA種類的生物學研究與分析，例如，用於疾病診斷與早期檢測。
2.2 EV-RNA 評估
2.2.1 工作流程
以下概述工作流程，以說明細胞外囊泡RNAs（EV-RNAs）定序的過程（圖2）。簡言之，從EVs中分離出EV-RNAs，並進行RNA TOP-PCR，將RNAs轉換為cDNAs，接著再進行TOP-PCR放大反應。該過程在單一試管中進行，防止珍貴材料損失。利用酵素消化，移除經放大之cDNA中的轉接子，並利用NGS將cDNA定序。將品質讀取匹配至GENCODE數據庫，以鑑定人類基因體中的序列起源。隨後，數據以featureCounts進行分類。進一步分析mRNAs、lncRNAs、Y-RNAs、及miRNAs的序列。
2.2.2 文庫統計與大小分布
從三名健康男性之每一人的全血中分離出EV-RNA樣本，並進行本發明之RNA TOP-PCR方法。表2顯示文庫統計。本發明僅使用R1-R2配對之可射匹配讀取。
表2. EV-RNA文庫之文庫統計與分子組成
讀取之描述 研究個體之文庫IDs
M1 M2 M3
原始PE讀取 146,305,550 157,173,135 160,462,457
  品質PE讀取 全部 77,564,041 106,202,280 38,429,918
有重疊 72,042,366 95,664,333 35,015,882
無重疊 5,521,675 10,537,947 3,414,036
可匹配 76,264,355 105,021,697 26,958,493
分析所有EV-RNAs的大小分佈。剖析EV-RNA樣本中之片段大小顯示兩個主要區域（數據未顯示 ）。主要尖峰範圍介於150至170鹼基之間，主要由rRNAs與mRNAs形成，而第二個區域範圍介於90-110鹼基之間，主要由Y-RNAs與tRNAs（72至80個鹼基，87至89個鹼基（主要）與120至126個鹼基）組成。
2.2.3 EV-RNAs 包含多樣的 RNA 種類
如featureCounts所顯示，所有EV-RNA集合皆含有多樣的RNA種類（表3）。
表3. 註解之EV-RNAs之摘錄
類別 起源 M1 % M2 % M3 %
mRNA 蛋白_編碼 575,271 0.8 730,658 0.7 459,939 1.7
IG_C_基因 405 0.0 302 0.0 90 0.0
IG_D_基因 - 0.0 - 0.0 - 0.0
IG_J_基因 - 0.0 - 0.0 - 0.0
IG_V_基因 173 0.0 104 0.0 252 0.0
TR_C_基因 103 0.0 198 0.0 73 0.0
TR_D_基因 - 0.0 - 0.0 - 0.0
TR_J_基因 - 0.0 43 0.0 62 0.0
TR_V_基因 18 0.0 62 0.0 178 0.0
rRNA rRNA 23,721,471 31.1 45,737,594 43.6 10,739,589 39.8
tRNA tRNA 113,933 0.1 69,583 0.1 27,809 0.1
Mt_rRNA Mt_rRNA 4,684,838 6.1 4,212,871 4.0 437,174 1.6
Mt_tRNA Mt_tRNA 24,638 0.0 10,163 0.0 2,297 0.0
miRNA miRNA 51 0.0 162 0.0 1,030 0.0
Y-RNA Y-RNA 7,119,141 9.3 4,068,465 3.9 1,685,919 6.3
長型非編碼RNA 經加工_轉錄本 627 0.0 1,256 0.0 5,518 0.0
lincRNA 4,619,995 6.1 8,275,637 7.9 1,104,098 4.1
3’_重疊_ncRNA 41 0.0 - 0.0 77 0.0
反義 1,377 0.0 2,520 0.0 25,508 0.1
非_編碼 - 0.0 - 0.0 14 0.0
正義_內含子 146 0.0 355 0.0 2,929 0.0
正義_重疊 194 0.0 530 0.0 1,222 0.0
TEC 101 0.0 442 0.0 5,236 0.0
已知_ncrna - 0.0 - 0.0 - 0.0
微_lncRNA - 0.0 1 0.0 301 0.0
雙向_啟動子_lncRNA 178 0.0 619 0.0 1,027 0.0
lncRNA - 0.0 - 0.0 - 0.0
小型非編碼RNA snRNA 25,589 0.0 32,939 0.0 8,961 0.0
snoRNA 5,422 0.0 6,356 0.0 2,761 0.0
misc_RNA 855,309 1.1 721,280 0.7 84,783 0.3
核糖核酸酵素 - 0.0 - 0.0 - 0.0
sRNA - 0.0 - 0.0 - 0.0
scRNA 6 0.0 103 0.0 1 0.0
scaRNA 905 0.0 1,002 0.0 500 0.0
穹窿體RNA - 0.0 - 0.0 - 0.0
偽基因 經加工_偽基因 6,736 0.0 6,559 0.0 28,022 0.1
經轉錄_經加工_偽基因 290 0.0 717 0.0 3,281 0.0
經轉譯_經加工_偽基因 4 0.0 1 0.0 1 0.0
未經加工_偽基因 13,729 0.0 13,229 0.0 12,435 0.0
經轉錄_未經加工_偽基因 1,651 0.0 2,310 0.0 10,106 0.0
單一_偽基因 - 0.0 13 0.0 356 0.0
經轉錄_單一_偽基因 166 0.0 199 0.0 1,669 0.0
多型_偽基因 553 0.0 602 0.0 513 0.0
偽基因 - 0.0 - 0.0 - 0.0
rRNA_偽基因 9,286 0.0 12,412 0.0 2,399 0.0
IG_C_偽基因 - 0.0 - 0.0 1 0.0
IG_J_偽基因 - 0.0 - 0.0 - 0.0
IG_偽基因 - 0.0 - 0.0 - 0.0
IG_V_偽基因 7 0.0 - 0.0 437 0.0
TR_J_偽基因 - 0.0 - 0.0 - 0.0
TR_V_偽基因 - 0.0 - 0.0 24 0.0
tRNA_偽基因 - 0.0 - 0.0 73 0.0
41,782,354 54.8 63,909,287 60.9 14,656,665 54.4
%，可匹配讀取數目之百分比。
發明人進一步分析EV-RNA種類與數個主要群組的關聯性（表4）。通常，rRNA構成主要群組，接著是Y-RNA。相反地，miRNA構成最小群組，可能係因從EVs中分離初始RNA時的損失（發明人使用的套組並非針對miRNA分析）。
表4. EV-RNAs之主要群組
  群組 M1 M2 M3
  全部可匹配讀取 76,264,355 % 105,021,697 % 26,958,493 %
1 rRNA 23,721,471 31.1 45,737,594 43.6 10,739,589 39.8
2 tRNA 113,933 0.1 69,583 0.1 27,809 0.1
3 Mt_rRNA 4,684,838 6.1 4,212,871 4.0 437,174 1.6
4 Mt_tRNA 24,638 - 10,163 - 2,297 -
5 mRNA 575,970 0.8 731,367 0.7 460,594 1.7
6 長型非編碼RNA 4,622,659 6.1 8,281,360 7.9 1,145,930 4.3
7 小型非編碼RNA 887,231 1.2 761,680 0.7 97,006 0.4
8 Y-RNA 7,119,141 9.3 4,068,465 3.9 1,685,919 6.3
9 miRNA 51 - 162 - 1,030 -
10 偽基因 32,422 - 36,042 - 59,317 0.2
  註釋總和（上述總和） 41,782,354 54.7 63,909,287 60.9 14,656,665 54.4
  未註釋總和 34,482,001 45.3 41,112,410 39.1 12,301,828 45.6
%，可匹配讀取數目之百分比；mRNA（蛋白編碼基因，其中包括線粒體基因，Igb，TCR）。
2.2.4 EV-mRNAs 源自數千個蛋白編碼基因
該受測之三名健康男性之EV-mRNAs係由總共約15,000個蛋白編碼基因轉錄而來，其中該三個體之彼等基因之間共有約25%的重疊（%意指在總數14,851個基因中所佔的百分比，數據未顯示）。
發明人進一步以IPA結合與全部三個體共有之蛋白編碼基因（總共3,688個）相關聯的EV-mRNAs進行途徑分析。結果顯示，前5個途徑皆與訊息傳遞有關（表5）。
表5. 基於所有三個體共有之3688個基因的途徑分析。
EV-mRNAs
途徑 p值 重疊
EIF2傳訊 5.17E-65 149/224（66.5%）
eIF4與p70S6K傳訊之調節 1.82E-40 99/157（63.1%）
mTOR傳訊 7.79E-36 112/210（53.3%）
整合素傳訊 7.73E-30 105/213（49.3%）
雌性激素受體傳訊 2.09E-28 136/328（41.5%）
另一個以IPA結合前5000個基因之每一者的獨立途徑研究，以相關讀取數目加權，亦顯示類似結果（表6）。
表6. 每一個體之IPA。
途徑 p值 重疊
M1
EIF2傳訊 1.05E-53 156/224（69.6%）
eIF4與p70S6K傳訊之調節 7.31E-36 107/157（68.2%）
mTOR傳訊 5.03E-32 124/210（59.0%）
整合素傳訊 9.38E-26 116/213（54.5%）
ERK/MAPK傳訊 2.26E-25 108/193（56.0%）
     
M2
EIF2傳訊 1.45E-54 157/224（70.1%）
eIF4與p70S6K傳訊之調節 3.51E-33 104/157（66.2%）
整合素傳訊 5.16E-27 118/213（55.4%）
癌症之分子機轉 1.03E-25 177/391（45.3%）
雌性激素受體傳訊 4.57E-25 155/328（47.3%）
     
M3
EIF2傳訊 1.86E-19 109/224（48.7%）
癌症之分子機轉 1.90E-14 150/391（38.4%）
蛋白激酶A傳訊 1.97E-14 152/398（38.2%）
GNRH傳訊 1.15E-13 81/173（46.8%）
整合素傳訊 9.61E-13 92/213（43.2%）
     
欲經由再現性評估數據可靠性，發明人確認與比較三個體之前50個蛋白編碼基因。發明人發現，在任何個體中，有50%以上的前50個蛋白編碼基因亦可與其他個體共有，顯示在彼等個體中之高度再現性（數據未顯示）。粒線體起源序列的高盛行率亦指出特定粒線體序列的選擇性，尤其是彼等編碼NADH去氫酶異構型的序列。
2.2.5 Y-RNA/RNY 分析
人類有四種Y RNAs。彼等Y RNAs已知為Ro 60-kDa（含有螺旋形HEAT重複序列的RNA結合蛋白）的抑制子及DNA複製的起始因子，且由Y RNA產生的小型RNA生合成係與miRNA無關 （Nicolas等人，2012）。每一類型的Y RNA皆含有環形結構域、上部莖（stem）結構域、下部莖結構域、及聚尿苷尾部。
發明人的結果顯示，RNY3與RNY4為EVs中之主要Y-RNA種類，接著是RNY1，RNY5則非常次要（表7）。
表7. 所有個體的Y-RNA種類
基因名稱 M1 M2 M3
RNY1 913,042 593,943 179,880
RNY3 3,301,852 1,573,633 643,852
RNY4 2,902,204 1,899,113 861,435
RNY5 2,043 1,776 752
7,119,141 4,068,465 1,685,919
2.2.6 發明人之數據與先前報導之數據的比較
發明人比較了其結果與先前的報導（表8）。大多數的報導（其亦由健康人類之血液血漿攜帶的EVs產生）聚焦在EVs中之小型或長型RNAs（Ferrero等人，2018；Li等人，2019；Yuan等人，2016）。在此，發明人比較了其結果與Everaert等人的報導（Everaert等人，2019），聚焦在總EV-RNAs的分析。
表8. 健康個體血漿衍生之EV-RNA概貌的比較。
參考對象 目的 個體 EV/分離方法 RNA萃取方法 文庫製備（讀長） 註釋數據庫（比對工具） 結果 （僅包括註釋之RNAs）
1. 發明人目前的研究 總EV-RNA概貌 3 l   exoRNeasy血清/血漿套組（Qiagen） l   RNA TOP-PCR +NEBNext Ultra II DNA文庫製備套組（Illumina）（2 × 150 bp） l   GENCODE v29（STAR） mRNA 7.59% lncRNA 42.27% 小型非編碼RNA 4.96% YRNA 43.61% 偽基因0.74% miRNA 0.01% tRNA 0.83%
2. Everaert等人，2019年 總RNA概貌 1 l   粒徑篩析層析法 + OptiPrep密度梯度離心法 l   miRNeasy血清/血漿套組（Qiagen） l   標準SMARTer總RNA-seq 套組（Clontech）（2 × 75 bp） l   GENCODE（STAR） mRNA 70% lncRNA 10.8% miscRNA 14% 偽基因3.3% 其他1.6%
發明人的實驗程序與Everaert等人所使用的之間存在顯著差異。首先，其在文庫製備步驟期間預先排除rRNA，同時，欲與之比較EV-RNA概貌，發明人在此將rRNA屏蔽。其次，發明人在cDNA合成之前對RNA進行片段化，同時，發明人在單管程序中直接使用原始EV-RNAs，其中不涉及片段化或純化，直到TOP-PCR放大反應完成。此類實驗程序中之變化可能是導致結果差異的主要原因。
3. 討論
眾所周知，存在於生物體液中之cfRNAs為診斷許多疾病（包括癌症）的有價值的遺傳物質。然而，cfRNAs通常為片段化，豐度低且種類繁多，使得cfRNAs的鑑定與評估成為巨大挑戰。大多數先前的報告都聚焦在與特定疾病相關聯之特定類型RNAs，而有許多cfRNAs可能涉及不同的生理過程及/或疾病，但尚未進行鑑定或研究。
在本研究中，發明人開發了新穎的RNA TOP-PCR方法，以全面分析個體生物樣本中之RNAs。作為設計用於放大微量RNAs的方法，本發明之RNA TOP-PCR方法具有許多優勢，包括單一試管程序，其利用消除RNA/cDNA分離直到放大完成，以防止樣本損失。此外，可在放大反應之後移除轉接子，從而樣本可直接進行定序或用於常規方法的診斷。本發明之RNA TOP-PCR方法。
發明人證實，本發明之RNA TOP-PCR方法可用於全面放大與檢測個體生物流體樣本中之總cfRNAs。
血管在心血管循環中的作用就像超級運河系統一樣，可使人體潛在地在所有生理方面達到體內穩定狀態。在血液循環系統中，類似於攜帶氧分子的紅血球細胞，EVs的作用就像分子載具，用於細胞之間特定分子的系統性運輸。在此過程中，核酸（如，EV-mRNAs與EV-ncRNAs）已知分別保留其編碼與調節活性，以在細胞間協調基因表現與調節。EV-RNAs的研究逐步揭開了基因表現本身的水平協調，以及基因表現的調節，從細胞內層級延伸至細胞間層級。
重要的是，以獨立方式或方法進行EV-RNAs分析。藉由本發明之RNA TOP-PCR，發明人不僅鑑定了先前報導的ncRNAs，還鑑定了人類基因體中大量的新穎ncRNA轉錄位點。大多數先前的研究皆聚焦在一或少數幾類EV-RNAs，而在此，利用RNA TOP-PCR無偏誤之本質的優勢，發明人旨在調查EVs中之所有RNA種類。欲避免高估RNA含量，樣本製備未涉及片段化。
應注意到，EV-RNA定序之品質首先受到用於EV與RNA分離方法的影響，接著受到定序文庫製備方法的影響。特定「選擇性」試劑套組容許研究人員聚焦在特殊的RNA類型（如miRNA或mRNA），同時忽略其餘的。此外，下游序列數據分析亦受到匹配工具、所用數據庫、及生物資訊學方法的影響。
發明人鑑定了大量的EV-mRNAs，且發現彼等mRNA序列屬於約15,000個蛋白編碼基因，其亦主要參與訊息傳遞。在彼等男性之間的前50個EV-mRNA編碼基因之間存在高度重疊（三者共享者有44%，而任兩者共享者有8-40%）。此外，前20個EV-mRNAs的大多數皆編碼NADH去氫酶的次單元，其通常位於粒線體的內膜。參考資料 Dobin, A., Davis, C.A., Schlesinger, F., Drenkow, J., Zaleski, C., Jha, S., Batut, P., Chaisson, M., and Gingeras, T.R. (2013). STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics29 , 15-21. Everaert, C., Helsmoortel, H., Decock, A., Hulstaert, E., Van Paemel, R., Verniers, K., Nuytens, J., Anckaert, J., Nijs, N., Tulkens, J., et al. (2019). Performance assessment of total RNA sequencing of human biofluids and extracellular vesicles. Sci Rep9 , 17574. Ferrero, G., Cordero, F., Tarallo, S., Arigoni, M., Riccardo, F., Gallo, G., Ronco, G., Allasia, M., Kulkarni, N., Matullo, G., et al. (2018). Small non-coding RNA profiling in human biofluids and surrogate tissues from healthy individuals: description of the diverse and most represented species. Oncotarget9 , 3097-3111. Frankish, A., Diekhans, M., Ferreira, A.M., Johnson, R., Jungreis, I., Loveland, J., Mudge, J.M., Sisu, C., Wright, J., Armstrong, J., et al. (2019). GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res47 , D766-D773. Li, H., Handsaker, B., Wysoker, A., Fennell, T., Ruan, J., Homer, N., Marth, G., Abecasis, G., Durbin, R., and Genome Project Data Processing, S. (2009). The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics25 , 2078-2079. Li, Y., Zhao, J., Yu, S., Wang, Z., He, X., Su, Y., Guo, T., Sheng, H., Chen, J., Zheng, Q., et al. (2019). Extracellular Vesicles Long RNA Sequencing Reveals Abundant mRNA, circRNA, and lncRNA in Human Blood as Potential Biomarkers for Cancer Diagnosis. Clin Chem65 , 798-808. Liao, Y., Smyth, G.K., and Shi, W. (2014). featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics30 , 923-930. Nicolas, F.E., Hall, A.E., Csorba, T., Turnbull, C., and Dalmay, T. (2012). Biogenesis of Y RNA-derived small RNAs is independent of the microRNA pathway. FEBS Lett586 , 1226-1230. Yuan, T., Huang, X., Woodcock, M., Du, M., Dittmar, R., Wang, Y., Tsai, S., Kohli, M., Boardman, L., Patel, T., et al. (2016). Plasma extracellular RNA profiles in healthy and cancer patients. Sci Rep6 , 19413.
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述發明內容及以下對本發明的詳細描述。欲說明本發明，在附圖中顯示當前較佳之特定具體實施例。然而，應理解到，本發明不侷限於所示之精確安排與工具。
圖1顯示本發明之方法（RNA T寡核苷酸啟始之聚合酶鏈反應（RNA TOP-PCR））與NEB之方法的比較。首先的兩個步驟（A-B與a-b）類似，除了本發明RNA TOP-PCR方法始於更少量的總RNA。隨後，兩個實驗程序實質上分歧：針對本發明之RNA TOP-PCR方法，第一股cDNA合成（C），隨後將T寡核苷酸（RNA形式）連接至RNA股之5’端（D），接著反轉錄為完整全長的第一股cDNA（E）。隨後，在TOP-PCR放大（G）之前，將RNA部分消化（F）。針對NEB之方法，先進行3’引子雜合反應（c），隨後進行5’單股RNA（ssRNA）轉接子連接（d），合成全長第一股cDNA（e），接著以其條件與兩個不同的PCR引子進行PCR放大（f）。此外，其PCR產物需進行大小篩選，以移除轉接子二元體，而TOP-PCR方法不需要大小篩選。
圖2顯示本發明特定具體實施例中之EV-RNA評估的工作流程。
<110> 中央研究院
<120> 放大及檢測核糖核酸(RNA)片段的方法
<130>
<140> 109116971
<141> 2020-05-21
<150> US 62/850,651
<151> 2019-05-21
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> P寡核苷酸
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Claims (16)

  1. 一種轉換線性、單股RNA的ssRNA片段為DNA片段及放大該DNA片段的方法，其包含：(a)從該ssRNA片段移除5’磷酸根以產生去磷酸化之ssRNA片段；(b)將具有P寡核苷酸序列且攜帶5’磷酸根的單股DNA的P寡核苷酸DNA連接至該去磷酸化之ssRNA片段的3’端以形成ssRNA-P寡核苷酸DNA股；(c)藉由以ssRNA-P寡核苷酸DNA股作為模板且添加具有與該P寡核苷酸DNA互補之T寡核苷酸序列的單股DNA的T寡核苷酸DNA作為引子進行第一反轉錄反應，以合成與該ssRNA片段互補的互補DNA的cDNA股，以產生cDNA-T寡核苷酸DNA股，從而形成由該ssRNA-P寡核苷酸DNA股與該cDNA-T寡核苷酸DNA股組成的初始RNA/DNA雜合體；(d)將與該P寡核苷酸DNA互補的單股RNA的T寡核苷酸RNA連接至該初始RNA/DNA雜合體中之該ssRNA-P寡核苷酸DNA股的5’端，以形成T寡核苷酸RNA-ssRNA-P寡核苷酸DNA股，從而形成由該T寡核苷酸RNA-ssRNA-P寡核苷酸DNA股與該cDNA-T寡核苷酸DNA股組成的中間物RNA/DNA雜合體，其具有非互補T寡核苷酸RNA懸垂；(e)以該非互補T寡核苷酸RNA懸垂作為延伸模板進行第二反轉錄反應以取得完整cDNA股，其5’端具有該T寡核苷酸序列且3’端具有該P 寡核苷酸序列，從而形成該T寡核苷酸RNA-ssRNA-P寡核苷酸DNA股與該完整cDNA股的完整RNA/DNA雜合體；(f)從該完整RNA/DNA雜合體移除該ssRNA片段與該T寡核苷酸RNA以產生部分、雙股DNA，其包含該完整cDNA股在其5’端與P寡核苷酸DNA部分地雜合化；以及(g)利用此完整cDNA股作為PCR模板與具有該T寡核苷酸序列的T寡核苷酸引子進行聚合酶鏈反應，以啟始合成雙股DNA產物。
  2. 如請求項1之方法，其中該ssRNA片段包含一表示個體之健康/疾病狀態的核酸序列。
  3. 如請求項1之方法，其中該ssRNA片段係存在於個體的樣本中。
  4. 如請求項3之方法，其中該樣本係取自體液。
  5. 如請求項3之方法，其中該樣本為個體的血液、尿液、唾液、淚液、汗液、母乳、鼻分泌物、羊水、精液、或陰道分泌物。
  6. 如請求項1之方法，其中該ssRNA片段為無細胞RNAs或囊泡中之RNAs。
  7. 如請求項1之方法，其中在步驟(d)之前，該ssRNA-P寡核苷酸DNA股係磷酸化。
  8. 如請求項1之方法，其中在步驟(g)中，該T寡核苷酸引 子為唯一用於放大的引子。
  9. 如請求項1之方法，其中該ssRNA片段係以0.01ng至100ng的初始投入量存在。
  10. 如請求項9之方法，其中該ssRNA片段係以0.01ng或10ng的初始投入量存在。
  11. 如請求項1之方法，其中該ssRNA片段係以0.01ng至5ng的初始投入量存在。
  12. 如請求項1之方法，其更包含檢測該放大之cDNA產物。
  13. 如請求項12之方法，其中該檢測係利用質譜法、雜合法、或定序法進行。
  14. 如請求項1之方法，其中不包括純化步驟。
  15. 一種RNA評估的方法，其包含：(i)進行如請求項1之方法，以將來自個體的生物流體樣本中的ssRNA片段轉換為DNA片段及放大該DNA片段；以及(ii)分析該放大之DNA片段，以測量該放大之DNA片段的一或多個特徵。
  16. 如請求項15之方法，其中該分析步驟包括定序、匹配、及/或比對。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201538732A (zh) * 2013-12-15 2015-10-16 Academia Sinica 未知序列之雙股線性核酸之全長增幅方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0851979A (ja) * 1994-08-09 1996-02-27 Toyobo Co Ltd Ｒｎａの逆転写方法およびその用途
FR2842211A1 (fr) * 2002-07-09 2004-01-16 Inst Necker Procede et moyens pour l'analyse quantitative du nombre des molecules d'arnm codant pour des genes differents dans des cellules
GB0319332D0 (en) * 2003-08-16 2003-09-17 Astrazeneca Ab Amplification
WO2008040355A2 (en) * 2006-10-06 2008-04-10 Exiqon A/S Novel methods for quantification of micrornas and small interfering rnas
GB2461476B (en) * 2007-04-16 2012-02-22 Immunivest Corp A rapid, semi-automated method to detect respiratory virus infected cells in direct specimens
RU2416647C1 (ru) * 2009-11-09 2011-04-20 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса болезни найроби овец методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции
EP3572528A1 (en) * 2010-09-24 2019-11-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
US8829172B2 (en) * 2011-03-11 2014-09-09 Academia Sinica Multiplex barcoded paired-end diTag (mbPED) sequencing approach and ITS application in fusion gene identification
US10612088B2 (en) * 2013-03-14 2020-04-07 The Broad Institute, Inc. Massively multiplexed RNA sequencing
US10704082B2 (en) * 2016-09-15 2020-07-07 ArcherDX, Inc. Methods of nucleic acid sample preparation
EP3610034B1 (en) * 2017-04-12 2022-06-08 Karius, Inc. Sample preparation methods, systems and compositions

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201538732A (zh) * 2013-12-15 2015-10-16 Academia Sinica 未知序列之雙股線性核酸之全長增幅方法

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