RU2416647C1 - Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса болезни найроби овец методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции - Google Patents
Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса болезни найроби овец методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2416647C1 RU2416647C1 RU2009141088/10A RU2009141088A RU2416647C1 RU 2416647 C1 RU2416647 C1 RU 2416647C1 RU 2009141088/10 A RU2009141088/10 A RU 2009141088/10A RU 2009141088 A RU2009141088 A RU 2009141088A RU 2416647 C1 RU2416647 C1 RU 2416647C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nsd
- sheep
- nairobi
- pcr
- disease virus
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 39
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 241001494479 Pecora Species 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 title abstract description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 abstract 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 206010010685 Congo-Crimean haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 5
- 208000000307 Crimean Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 5
- 201000003075 Crimean-Congo hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001457453 Nairobi sheep disease virus Species 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241001222053 Akabane virus Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010012741 Diarrhoea haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000006007 Nairobi Sheep Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000150218 Orthonairovirus Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 208000000705 Rift Valley Fever Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 208000019754 hemorrhagic gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к синтетическим олигонуклеотидным праймерам, комплементарным консервативной области S-сегмента генома вируса болезни Найроби овец, способу выявления вируса болезни Найроби овец и к тест-системе для обнаружения ДНК вируса болезни Найроби овец. Предложенное изобретение может быть использовано в ветеринарной вирусологии. Способ выявления вируса болезни Найроби овец включает выделение РНК из биологического материала. После чего осуществляют постановку полимеразной цепной реакции с использованием праймеров NSD F1 5'TATGCTTCTGCCTTGGTTG-3', NSD R1 5'-ATCCGATTGGCAGTGAAG-3', NSD F2 5'-AGAGCACATTGACTGGGC-3', NSD R2 5'-GCCTTCCAAAGCCAGTAG-3'. Далее проводят амплификацию РНК вируса. Затем осуществляют оценку проведения реакции гель-электрофорезом в агарозе, при этом результат реакции считается положительным, если размер фрагмента соответствует 360 пар нуклеотидов. Предложенное изобретение позволяет выявлять геномную РНК вируса болезни Найроби овец с помощью гнездового варианта ОТ-ПЦР с использованием двух синтезированных пар олигонуклеотидных праймеров, комплементарных к консервативной области гена нуклеокапсидного белка N. 3 н.п. ф-лы, 4 табл.
Description
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики.
Болезнь Найроби овец (далее - БНО) - зооантропонозная трансмиссивная болезнь овец и коз, проявляющаяся рецидивирующей лихорадкой, геморрагическим гастроэнтеритом, гломерулонефритом, слизисто-гнойными выделениями из носа и диареей; характеризуется уровнем смертности, который может варьировать между 40 и 90%.
Болезнь постоянно регистрируется в Кении, Танзании и Мозамбике и в Индии. Согласно данным МЭБ вспышки БНО были зарегистрированы также на Ближнем Востоке (Кувейт, 1995 г.) и в Европе (Греция, 2003 г.). Источником инфекции являются больные овцы и козы, а также скрытые вирусоносители.
Клинические симптомы сходны у овец и коз, хотя овцы более восприимчивы к инфекции.
Человек обычно заражается БНО при укусе инфицированными иксодовыми клещами, естественная восприимчивость людей высокая. После переболевания остается длительный иммунитет, повторные заболевания редки. В странах Африки мужчины заболевают чаще в связи с тем, что в этих местностях они, как правило, занимаются разведением животных. Инкубационный период длится 4-5 суток, основными клиническими симптомами являются: повышение температуры тела до 39-40°С с 2-3-суточными перерывами, озноб, боли в мышцах и суставах, кровавая диарея. В период разгара болезни на туловище и конечностях появляется сыпь. Описано бессимптомное течение болезни у человека.
Во время вспышки БНО при проведении противоэпизоотических мероприятий необходимо проведение быстрых и точных экспертизных исследований, позволяющих в кратчайшие сроки идентифицировать возбудитель.
Известны методы для диагностики инфекции, такие как реакция нейтрализации, иммуноферментный анализ, которые характеризуются высокой чувствительностью и широко применяются [1, 2]. Главным недостатком данных методов является длительность проведения анализа, а тот факт, что реакция нейтрализации дает перекрестные реакции с родственными буньявирусами, исключает возможность проверки подлинности результатов анализа.
Все исследования генома вируса БНО проведены сотрудниками Отдела вирусных и риккетсийных заболеваний Центра контроля и предотвращения болезней (Атланта, шт. Джорджия, США) [3, 4]. Ими были определены нуклеотидные последовательности S- и L-сегментов штаммов "NSD 708" и "Ganjam", проведен филогенетический анализ среди родственных найровирусов и разработаны методики амплификации различных участков генома вируса БНО. Однако одна половина сконструированных этими учеными олигонуклеотидных праймеров является штаммоспецифичными, а другая - родоспецифичными. Таким образом, данные праймеры не позволяют решить задачу выявления генома любого штамма вируса БНО из патологического материала и достоверной дифференциации его от других вирусов методом ПЦР.
Целью данного изобретения является разработка способа выявления геномной РНК вируса БНО с помощью гнездового варианта ОТ-ПЦР с использованием двух синтезированных пар олигонуклеотидных праймеров, комплементарных к консервативной области гена нуклеокапсидного белка N.
С помощью первой (внешней) пары праймеров можно амплифицировать фрагмент ДНК размером 690 пар нуклеотидов (далее - п.н.), являющийся мишенью для отжига второй (внутренней) пары праймеров, позволяющих синтезировать фрагмент размером 360 п.н. Использование двух пар праймеров позволяет добиться высокой специфичности и чувствительности реакции.
Поставленная цель достигается способом для обнаружения вируса БНО в образцах крови, пробах органов латентно инфицированных, больных или павших животных и/или в инфицированных культурах клеток, при котором вначале проводят синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК, а затем ее амплификацию. Данная процедура осуществляется с помощью 3-х наборов, составляющих тест-систему:
1. набор для выделения нуклеиновых кислот, включающий нуклеосорбент, лизирующий буфер с гуанидинтиоционатом и 2 раствора для последовательной отмывки сорбента;
2. набор для постановки ПЦР, включающий реакционную смесь для постановки ПЦР и 2 пары специфических олигонуклеотидных праймеров;
3. набор для проведения электрофореза, включающий агарозу и буфер для электрофореза с бромистым этидием.
Синтез кДНК проводят при температуре 50°С в течение 30 мин с праймером NSD R1, а затем терминируют реакцию 5-минутным прогреванием реакционной смеси при температуре 94°С.
Полученную кДНК используют для проведения 1-го раунда ПЦР с участием внешней пары праймеров - NSD F1 и NSD R1. Полученные в 1-ом раунде фрагменты ДНК размером 930 п.н. используют в качестве матрицы для проведения 2-го раунда ПЦР с использованием внутренней пары праймеров NSD F2 и NSD R2. Нуклеотидный состав используемых праймеров следующий:
NSD F1 5' -TAT GCT TCT GCC TTG GTT G - 3'
NSD R1 5' - АТС CGA TTG GCA GTG AAG - 3'
NSD F2 5' - AGA GCA CAT TGA CTG GGC - 3'
NSD R2 5' - GCC TTC CAA AGC CAG TAG - 3'
Температурные режимы для проведения обоих раундов ПЦР одинаковы и включают следующие этапы: 2 мин предварительной денатурации при 94°С, 35 циклов амплификации (94°С - 30 сек, 61°С - 30 сек, 72°С - 30 сек), 1 цикл достройки цепей (94°С - 2 мин, 72°С - 5 мин).
После постановки ОТ-ПЦР проводят разделение продуктов путем горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Учет результатов реакции проводят только по 2-ому раунду ПЦР.
Техническим результатом изобретения является повышение степени специфичности и чувствительности, а также сокращение времени проведения диагностической работы по обнаружению вируса в пробах органов и крови от больных животных.
Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных праймеров (NSD F1, NSD R1, NSD F2, NSD R2) проводят гнездовую ОТ-ПЦР, позволяющую выявить геном вируса БНО. При наличии в исследуемых образцах РНК вируса БНО, во втором раунде ПНР синтезируется фрагмент ДНК размером 360 п.н. Использование двух пар праймеров позволяет увеличить специфичность и чувствительность метода.
Существенным отличием данных праймеров является то, что они:
1) комплементарны консервативной области гена нуклеокапсидного белка N вируса БНО и некомплементарны к - либо участкам геномов других вирусов;
2) фланкируют на кДНК, полученной на матрице вирусной РНК, фрагмент размером 970 п.н. (праймеры NSD F1, NSD R1) а внутри него - фрагмент размером 360 п.н. (праймеры NSD F2, NSD R2).
Изобретение иллюстрируется несколькими примерами.
Пример 1. Набор №1 используют для выделения РНК вируса БНО из крови, проб органов, культурального вируссодержащего материала.
Исследуемый материал (кровь, суспензия вируса, 10%-ная суспензия органов) в объеме 100-200 микролитров (далее - мкл) вносят в 1,5 см3 пробирки, в которые предварительно внесено 600 мкл лизирующего буфера на основе гуанидинтиоционата. Пробирки перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 8-10 мин. Затем добавляют 40 мкл нуклеосорбента, инкубируют при комнатной температуре 10 мин, периодически перемешивая смесь. После инкубации пробирки центрифугируют 30 сек при 8-13 тыс.об/мин, надосадочную жидкость отбрасывают. Добавляют 300 мкл отмывочного буфера, тщательно ресуспендируют сорбент, центрифугируют 30 сек при 8-13 тыс об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Дважды промывают сорбент 75%-ным этиловым спиртом и далее подсушивают 10 мин при температуре 56°С. К осадку добавляют 50 мкл элюирующего буфера, перемешивают и инкубируют 10 мин при температуре 56°С. Центифугируют пробирки в течение 1 мин при 13 тыс.об/мин и переносят надосадочную жидкость в новые пробирки. Супернатант используют в дальнейшем для синтеза кДНК.
Пример 2. Синтез и амплификация участка кДНК вируса БНО с применением набора №2 для проведения гнездовой ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами.
Расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров.
С помощью программы "BioEdit 7.0" выравнены нуклеотидные последовательности S-сегмента генома штаммов "NSD 708" и "Ganjam G619" вируса болезни Найроби овец. Проанализировав построенный элайнмент, внутри гена нуклеокапсидного белка N найден консервативный участок, расположенный между 238 и 1169 нуклеотидами (5'→3'). С помощью программы "Oligo 4.0" подобраны 2 пары праймеров - NSD F1 (238-256 нуклеотидные позиции) и NSD R1 (1152-1169), фланкирующих фрагмент размером 930 пар оснований, а также 2 пары праймеров - NSD F2 (642-659) и NSD R2 (984-1001), фланкирующих фрагмент размером 690 пар оснований.
С использованием программы "Oligo 4.0" описаны основные свойства рассчитанных праймеров, определившие возможность их использования в ПЦР. Данные свойства приведены в таблице.
| Таблица | ||||
| Свойства праймеров, рассчитанные с помощью программы "Oligo 4.0" | ||||
| Название праймера | Температура плавления,1 °С | ΔG гибридизации праймера на матрицу, kcal/mol | ΔG образования шпилечной структуры, kcal/mol | Эффективность отжига праймера на матрицу (Priming efficiency number)2 |
| NSD F1 | 61,5 | -35,9 | 1,4 | 392 |
| NSD R1 | 60,4 | -34,7 | 1,4 | 384 |
| NSD F2 | 60,1 | -34 | 1,4 | 429 |
| NSD R2 | 60 | -35,3 | 1 | 373 |
| Примечания. | ||||
| 1Температура плавления рассчитана по алгоритму Nearest neighbor method. | ||||
| 2Priming efficiency number - это величина, определяющая эффективность отжига данного праймера на заданный участок матрицы, рассчитывается по уникальному алгоритму, разработанному создателями программы "Oligo". Минимальное значение Priming efficiency number, при котором праймер в ходе ПЦР эффективно отжигается на специфический участок матрицы, -210. | ||||
Тест-система апробирована на различных штаммах вируса БНО. В качестве отрицательных контролей использованы штаммы родственных буньявирусов: лихорадки долины Рифт (ЛДР), Конго-Крымской геморрагической лихорадки (ККГЛ) и Акабане.
Для получения кДНК готовят и маркируют 0,6 см3 пробирки на N-количество образцов, включая отрицательные контроли. В пробирки вносят по 15 мкл реакционной смеси, включающей буфер для ревертазы, 10 пкмоль праймера NSD R1, 2,5 ммоль каждого dNTP, 20 ед. MMLV-ревертазы; поверх смеси наслаивают 1 каплю (40-45 мкл) минерального масла. Далее под масло вносят 5 мкл исследуемой РНК и помещают пробирки в амплификатор со следующим температурным режимом:
| 50°С | 30 мин | 1 цикл |
| 94°С | 5 мин |
После инкубации реакционную смесь используют как препарат кДНК. Для проведения 1-го раунда ПЦР приготавливают реакционную смесь объемом 25 мкл, включающую по 10 пкмоль праймеров NSD F1 и NSD R1, 2,5 ммоль каждого dNTP, буфер для Taq-полимеразы с 15 мM MgCl2, 1 ед. Taq-полимеразы. Эту смесь вносят в заранее промаркированные пробирки, наслаивают сверху каплю минерального масла и под масло вносят 5 мкл кДНК. Пробирки помещают в амплификатор со следующим температурным режимом:
| 94°С | 2 мин | 1 цикл |
| 94°С | 30 сек | 35 циклов |
| 61°С | 30 сек | |
| 72°С | 30 сек | |
| 94°С | 2 мин | 1 цикл |
| 72°С | 5 мин |
После завершения программы приступают к выполнению 2-го раунда ПЦР. Для этого переносят 5 мкл смеси из пробирок, в которых проводили 1-й раунд, в новые пробирки с 20 мкл реакционной смеси, включающей 10 пкмоль праймеров NSD F2 и NSD R2, 2,5 ммоль каждого dNTP, буфер для Taq-полимеразы с 15 мM MgCl2, 1 ед. Taq-полимеразы; сверху наслаивают 1 каплю минерального масла. Пробирки загружают в амплификатор с температурным режимом, аналогичным температурному режиму для проведения 1-го раунда ПЦР.
Пример 3. Определения размера продуктов ПЦР с применением набора №3 для проведения электрофореза.
Продукты 2-го раунда ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ом агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере.
15 мкл продукта ПЦР (уже содержащего буфер для внесения в гель) вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 15 мин). Результат электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 260 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результат считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента 360 пар оснований.
С применением тест-системы и рассчитанных праймеров выявлялись все исследуемые образцы вируса БНО. Отрицательные контроли не амплифицировались.
Пример 4. Определение чувствительности и специфичности ПЦР на основе синтетических олигонуклеотидных праймеров, на ген белка N.
| Результаты проведения ПЦР с праймерами, комплементарными гену белка N вируса БНО. | ||||
| Наименование препаратов | Титр вируса ТЦД50/мл | Шифр | Ожидаемый результат | Фактический результат |
| Вирус БНО штамм "ММ" | 6,0 | 1 | + | + |
| Вирус БНО штамм "ММ/К-05 | 5,8 | 2 | + | + |
| Вирус БНО штамм "ММ/К-05 | 1,8 | 3 | + | + |
| вирус ЛДР штамм "ВНИИВВиМ1974" | 6,5 | 4 | - | - |
| Вирус Акабане штамм "В8935" | 4,75 | 5 | - | - |
| вирус ККГЛ (положительный контроль из набора "АмплиСенс ККГЛ" производства ФГУН Ц ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора для выявления генома вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР) | 5,0 | 6 | ||
Тест-система и синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что тест-система не амплифицирует кДНК других вирусов.
Таким образом, предлагаемая тест-система позволяет достичь высокого уровня чувствительности с помощью двух пар праймеров, позволяющих получить во 2-ом раунде ПЦР фрагмент размером 360 п.н.
Источники информации
1. Davies F.G. Nairobi sheep disease // Parassitologia. - 1997. - V.39 - №2 - C.95-98.
2. Davies F.G, Mungai J.N., Taylor M. The laboratory diagnosis of Nairobi sheep disease // Trop. Anim. Health. Prod. - 1977. - V.9 - №2 - С.75-80.
3. Marczinke В.I., Nichol. S.T. Nairobi sheep disease virus, an important tick-borne pathogen of sheep and goats in Africa, is also present in Asia // Virology. - 2002. - V.303. - №1 - С.146-151.
4. Terpstra C. Physical and biological properties of Nairobi sheep disease virus // Vet. Microbiol. - 1983. - V.8 - №6 - С.531-541.
Claims (3)
1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные консервативной области S-сегмента генома вируса болезни Найроби овец, используемые для выявления к ДНК вируса болезни Найроби овец, имеющие следующий нуклеотидный состав:
NSD F1 5'-TATGCTTCTGCCTTGGTTG-3'
NSD R1 5'-ATCCGATTGGCAGTGAAG-3'
NSD F2 5'-AGAGCACATTGACTGGGC-3'
NSD R2 5'-GCCTTCCAAAGCCAGTAG-3'.
NSD F1 5'-TATGCTTCTGCCTTGGTTG-3'
NSD R1 5'-ATCCGATTGGCAGTGAAG-3'
NSD F2 5'-AGAGCACATTGACTGGGC-3'
NSD R2 5'-GCCTTCCAAAGCCAGTAG-3'.
2. Способ выявления вируса болезни Найроби овец, включающий выделение РНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров, амплификацию РНК вируса, оценку проведения реакции гель-электрофорезом в агарозе, отличающийся тем, что синтез к ДНК проводят при температуре 50°С в течение 30 мин с праймером NSD R1, а затем терминируют реакцию 5-минутным прогреванием реакционной смеси при температуре 94°С, затем полученную к ДНК используют для проведения 1-го раунда ПЦР с участием внешней пары праймеров NSD F1 и NSD R1 по п.1, а полученные в 1-м раунде фрагменты ДНК используют в качестве матрицы для проведения 2-го раунда ПЦР с использованием внутренней пары праймеров NSD F2 и NSD R2 по п.1, при этом температурный режим ПЦР одинаков для 1-го и 2-го раундов и включает следующие этапы: 2 мин предварительной денатурации при 94°С, 35 циклов амплификации (94°С - 30 с, 61°С - 30 с, 72°С - 30 с), 1 цикл достройки цепей (94°С - 2 мин, 72°С - 5 мин), далее после 2-го раунда ПЦР проводят учет результатов реакции, при этом результат реакции считается положительным, если размер фрагмента соответствует 360 пар нуклеотидов.
3. Тест-система для обнаружения ДНК вируса болезни Найроби овец, включающая пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Taq-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный и отрицательный контроли, отличающаяся тем, что содержит три набора: 1) набор для выделения нуклеиновых кислот, включающий нуклеосорбент с лизирующим буфером на основе гуанидинтиоционата и 2 раствора для последовательной промывки сорбента; 2) набор для постановки ПЦР, содержащий реакционную смесь для постановки ПЦР и синтетические олигонуклеотидные праймеры по п.1; 3) набор для проведения электрофореза, включающий агарозу и буфер для электрофореза с бромистым этидием.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009141088/10A RU2416647C1 (ru) | 2009-11-09 | 2009-11-09 | Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса болезни найроби овец методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009141088/10A RU2416647C1 (ru) | 2009-11-09 | 2009-11-09 | Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса болезни найроби овец методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2416647C1 true RU2416647C1 (ru) | 2011-04-20 |
Family
ID=44051347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009141088/10A RU2416647C1 (ru) | 2009-11-09 | 2009-11-09 | Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса болезни найроби овец методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2416647C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114144188A (zh) * | 2019-05-21 | 2022-03-04 | 台湾地区“中央研究院” | 放大及检测核糖核酸(rna)片段的方法 |
-
2009
- 2009-11-09 RU RU2009141088/10A patent/RU2416647C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MARCZINKE B.I. ET AL., Nairobi sheep disease virus, an important tick-borne pathogen of sheep and goats in Africa, is also present in Asia, Virology., 2002, v.303, no.1, p.146-51. TERPSTRA C., Physical and biological properties of Nairobi sheep disease virus, Vet Microbiol., 1983, v.8, no.6, p.531-41. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114144188A (zh) * | 2019-05-21 | 2022-03-04 | 台湾地区“中央研究院” | 放大及检测核糖核酸(rna)片段的方法 |
| CN114144188B (zh) * | 2019-05-21 | 2024-05-28 | 台湾地区"中央研究院" | 放大及检测核糖核酸(rna)片段的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2629604C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени | |
| RU2458141C1 (ru) | Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления | |
| RU2360972C1 (ru) | Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления | |
| CN113249517A (zh) | 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒 | |
| CN108778324A (zh) | 罗非鱼的正黏样病毒 | |
| CN112921122A (zh) | 猫常见病毒多重pcr快速检测试剂盒及其引物组 | |
| Fawzi et al. | Molecular diagnosis of three outbreaks during three successive years (2018, 2019, and 2020) of lumpy skin disease virus in cattle in Sharkia Governorate, Egypt | |
| CN101775443B (zh) | 用于检测猪伪狂犬病毒的lamp试剂盒及其制备方法 | |
| US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| RU2385943C2 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса блютанга методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации | |
| KR102820017B1 (ko) | 열성 질환 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| CN110760601B (zh) | 一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组、试剂盒及应用 | |
| Damaso et al. | A PCR-based assay for detection of emerging vaccinia-like viruses isolated in Brazil | |
| CN114790490B (zh) | 一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法 | |
| CN115961095A (zh) | 一种用于同时检测牛疱疹病毒4、5型的引物、探针和试剂盒 | |
| Liu et al. | A rapid and sensitive loop-mediated isothermal amplification procedure (LAMP) for Mycoplasma hyopneumoniae detection based on the p36 gene | |
| Picha et al. | PCR in lyme neuroborreliosis: a prospective study | |
| RU2416647C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса болезни найроби овец методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции | |
| Ranjan et al. | Use of nucleic acid recognition methods (m-PCR and RT-LAMP) for the detection of foot-and-mouth disease virus excreted in cow milk | |
| RU2710065C1 (ru) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления ДНК вируса АЧС методом петлевой изотермической амплификации | |
| MX2013007586A (es) | Composiciones y metodos para identificar y diferenciar componentes virales de vacunas multivalentes de fiebre del embarque. | |
| KR102466562B1 (ko) | 성매개 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물, 및 이를 이용한 성매개 감염 진단 방법 | |
| CN100537780C (zh) | 定性、定量检测蓝舌病毒的TaqMan探针 | |
| Mas et al. | Multi-matrix real time PCR in 108 patients with polymorphic signs suggestive of fibromyalgia or related to a tick bite | |
| Helmy et al. | Evaluation of Different PCR-Based Techniques in Diagnosis of Bovine Tuberculosis in Infected Cattle Lymph Nodes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161110 |