RU2458141C1 - Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления - Google Patents
Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2458141C1 RU2458141C1 RU2011109469/10A RU2011109469A RU2458141C1 RU 2458141 C1 RU2458141 C1 RU 2458141C1 RU 2011109469/10 A RU2011109469/10 A RU 2011109469/10A RU 2011109469 A RU2011109469 A RU 2011109469A RU 2458141 C1 RU2458141 C1 RU 2458141C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- eltor
- ctxb
- biovar
- rfbo1
- strains
- Prior art date
Links
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 title claims abstract description 36
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101150055191 cas3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 17
- 101150055502 rtxC gene Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 101100148266 Actinobacillus pleuropneumoniae apxIIIC gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 241000602423 Vibrio cholerae O1 Species 0.000 claims abstract description 15
- 101100005249 Escherichia coli (strain K12) ygcB gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- -1 pH 8.4 Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims abstract description 3
- 101150087320 ctxB gene Proteins 0.000 claims description 64
- 241000607343 Vibrio cholerae O1 biovar El Tor Species 0.000 claims description 22
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 abstract description 39
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 abstract description 32
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 abstract description 28
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 10
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 101100041135 Vibrio cholerae rstR gene Proteins 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 241000194314 Vibrio cholerae O139 Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 101150028842 ctxA gene Proteins 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 2
- 241001231453 Vibrio albensis Species 0.000 description 2
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 description 2
- 241000607253 Vibrio mimicus Species 0.000 description 2
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150021605 hlyA gene Proteins 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 101100378273 Brachyspira hyodysenteriae acpP gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000617624 Escherichia coli M17 Species 0.000 description 1
- 101100098690 Listeria monocytogenes serovar 1/2a (strain ATCC BAA-679 / EGD-e) hly gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 101000666752 Theionarchaea archaeon (strain DG-70-1) NAD(+) hydrolase TcpA Proteins 0.000 description 1
- 241000178648 Vibrio cholerae 569B Species 0.000 description 1
- 241001099962 Vibrio cholerae O37 Species 0.000 description 1
- 241000936820 Vibrio cholerae non-O1 Species 0.000 description 1
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 1
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 230000003616 anti-epidemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 101150097533 rstR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 101150021331 toxR gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение касается идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определения их биоваров и дифференциации V.cholerae биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты. Согласно изобретению мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят в один прием в двух реакционных смесях, где каждая из смесей содержит специально подобранное сочетание праймеров: одна - к генам rfbO1, cas3 и ctxBClass, вторая - к генам rfbO1, rtxC и ctxBEltor. Тест-система для осуществления способа включает компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР и компоненты для анализа результатов. Компоненты для проведения ПЦР содержат: 10-кратный буферный раствор, рН 8,4, минеральное масло, деионизированную стерильную воду, два положительных контроля, фермент Taq-полимеразу, смесь дНТФ, смесь праймеров №1 - rfbO1-F - rfbO1-R, cas3-F - cas3-R, ctxBClass-F-ctxBClass и смесь праймеров №2 - rfbO1-F - rfbO1-R, rtxC-F - rtxC-R, ctxBEltor-F - ctxBEltor-R. Изобретение позволяет быстро и достоверно выявлять биовар холерных вибрионов O1 серогруппы, определять их токсигенность и проводить дифференциацию выявленных токсигенных штаммов V.cholerae биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определению их биовара (классического или эльтор) и дифференциации V. cholerae O1 биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты.
Холера - особо опасная инфекционная болезнь с диарейным синдромом. Инфицирование человека происходит после употребления пищи или воды, зараженной холерными вибрионами, которые после попадания в организм человека продуцируют холерный токсин (XT), являющийся ключевым фактором вирулентности возбудителя. Возбудитель холеры Vibrio cholerae относится к двум серогруппам - O1 и O139. В свою очередь, холерные вибрионы O1 серогруппы подразделяются на два биовара - классический и эльтор, отличающихся по биохимическим свойствам и структуре генома. V. cholerae классического биовара был возбудителем первых шести пандемий азиатской холеры (1817-1923 гг.). Высокая вирулентность возбудителя холеры этого биовара обусловлена эффективной продукцией им XT. Возбудитель текущей, 7-й, пандемии холеры - V. cholerae биовара эльтор, который является менее токсигенным и менее вирулентным по сравнению с V. cholerae O1 классического биовара. Продукция XT у V. cholerae O1 обоих биоваров определяется генами ctxA и ctxB, образующими оперон ctxAB, который входит в состав профага СТХ. Одно из основных отличий холерных классических и эльтор вибрионов заключается в разных нуклеотидных последовательностях гена ctxB из оперона ctxAB, кодирующего биосинтез XT, а также гена - репрессора rstR, участвующего в контроле синтеза этого белка. Вследствие этого аллели указанных генов у классических холерных вибрионов обозначены как ctxBClass и rstRClass, у вибрионов эльтор - как ctxBEltor и rstREltor. Разная нуклеотидная последовательность генов ctxBClass и ctxBEltor определяет неодинаковую аминокислотную последовательность В-субъединиц их токсинов. Вследствие этого различают XT классического (или 1-го) типа, продуцируемый классическими вибрионами, и XT эльтор (или 2-го) типа, характерный для вибрионов эльтор. Несмотря на широкое распространение типичного возбудителя 7-й пандемии холеры на ее первом этапе (1960-1990 гг.), в последние годы в процессе эволюции возникли и заняли доминирующее положение новые варианты V. cholerae биовара эльтор с повышенной вирулентностью, получившие обозначение измененные варианты. Различия между типичными штаммами V.cholerae биовара эльтор и измененными вариантами состоят в разной нуклеотидной последовательности гена ctxB и в ряде случаев гена rstR, входящих в состав профага вирулентности СТХ и связанных с продукцией XT. Геном типичных токсигенных (вирулентных) штаммов содержит гены ctxBEltor и rstREltor, тогда как у измененных вариантов присутствуют гены ctxBClass и в ряде случаев rstRClass. Продукция с измененными вариантами V. cholerae O1 биовара эльтор XT классического типа приводит к повышению их вирулентности по сравнению с типичными штаммами (4, 12, 10).
Генетическое разнообразие возбудителя холеры O1 серогруппы указывает на необходимость определения его биовара (классического или эльтор). Кроме того, в связи с возникновением высоковирулентных измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, продуцирующих XT классического типа, которые могут быть завезены в любую страну мира, о чем свидетельствуют последние события на Гаити (7), и нанести значительный экономический ущерб, для повышения эффективности системы эпидемиологического надзора за холерой необходима разработка способа быстрой и достоверной их дифференциации от типичных вирулентных штаммов V. cholerae биовара эльтор с использованием современных методов анализа.
Из источников научно-технической информации известен способ определения серогруппы и биовара холерных вибрионов на основе выявления гена wbeO, входящего в состав кластера генов gmd-wbeO, встречающихся только у холерных вибрионов O1 серогруппы, и фрагмента гена hlyA, типичного для холерных вибрионов биовара эльтор (2).
Известна комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и оценки их вирулентности, позволяющая осуществлять идентификацию природных штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп и определять их вирулентность. Генодиагностическая тест-система включает набор специфических праймеров wbeW1-wbeW2, wbfR1-wbeW2, ctxA1-ctxA2, tepAclassica1 - tcpAclassica2, tcpAeltor1 - tcpAeltor2 к участкам генов wbeW, wbfR, ctxA, tcpAclassica, tcpAeltor (1).
Известна мультиплексная ПЦР тест-система с использованием праймеров на видоспецифический ген hapA и основных генов вирулентности ctxA, tcpA и toxR, позволяющая одновременно проводить идентификацию штаммов V. cholerae и дифференцировать их по эпидемической значимости (3).
Известен способ детекции и определения биовара, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления (5) с использованием метода мультилокусной ПЦР, которую проводят с применением трех пар синтезированных праймеров к генам wbeN, hlyA и ctxA, а набор состоит из комплекта реагентов для выделения ДНК из материала, комплекта для амплификации, содержащего праймеры wbeN1-wbeN2, hly1-hly2 и ctx2-ctx3, специфичные соответственно для генов wbeN, hlуА и ctxA, положительного и отрицательного контроля и комплекта для анализа продукта.
Однако описанные способы и тест-системы предназначены исключительно для идентификации типичных штаммов холерного вибриона биовара эльтор и не способны выявлять токсигенные измененные варианты с повышенной вирулентностью.
Известно выявление измененных токсигенных штаммов V. cholerae биовара эльтор методом ПЦР с использованием аллельспецифических праймеров для детекции классического или эльтор типа гена ctxB (11). Однако данный метод применим только для штаммов холерных вибрионов с предварительно установленными серогруппой и биоваром.
В то же время при мониторинговых исследованиях необходима не только идентификация токсигенных штаммов V. cholerae O1 серогруппы и определение их биовара, но и своевременная и быстрая дифференциация V. cholerae биовара эльтор по структуре гена ctxB с целью выявления измененных вариантов возбудителя холеры эльтор для повышения эффективности проводимых противоэпидемических мероприятий.
Таким образом, в данной области существует очевидная потребность в разработке информативного и быстрого способа, также тест-системы для идентификации токсигенных штаммов холерного вибриона O1 серогруппы, выяснения их биовара и дифференциации V. cholerae биовара эльтор на типичные штаммы и измененные варианты.
Техническим результатом изобретения является обеспечение возможности осуществления одновременной идентификации штаммов V. cholereae O1 серогруппы классического и эльтор биоваров (на основе присутствия в их геноме гена rfbO1 и биовароспецифических генов cas3 и rtxC), выяснения их токсигенности (на основе тестирования гена ctxB) и дифференциации V. cholerae биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты по присутствию в их геноме генов ctxBClass или ctxBEltor.
Технический результат достигается способом идентификации и дифференциации типичных и измененных токсигенных штаммов V. cholerae O1 методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, характеризующимся тем, что ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров к генам rfbO1, cas3, ctxBClass в первой, и rfbO1, rtxC, ctxBEltor во второй, с температурой отжига праймеров 58,2°С в течение 10 с при числе циклов амплификации, равном 25, с последующим анализом путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых и контрольных штаммов. Для типичных токсигенных штаммов V. cholerae классического биовара характерно наличие ампликонов генов rfbO1, cas3 и ctxBClass, идентичных контрольному образцу. Для типичных токсигенных штаммов V. cholerae O1 биовара эльтор характерно наличие ампликонов генов rfbO1, rtxC и ctxBEltor, идентичных контрольному образцу, а для измененных вариантов V. cholereae O1 биовара эльтор наряду с фрагментами генов rfbO1 и rtxC характерно наличие ампликона к гену ctxBClass.
В качестве контроля используют ДНК типичных токсигенных штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров.
Технический результат также достигается тест-системой для идентификации и дифференциации типичных и измененных токсигенных штаммов V. cholerae O1 биовара эльтор методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, включающей компоненты для выделения ДНК и компоненты для проведения ПНР: 10-кратный буферный раствор, рН 8,4, минеральное масло, деионизованную стерильную воду, два положительных контроля, фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дНТФ, смесь праймеров №1, содержащую rfbO1-F - rfbO1-R, cas3-F - cas3-R, ctxBClass-F - ctxBClass-R в соотношении 1,5:1:1 соответственно, смесь праймеров №2, содержащую rfbO1-F - rfbO1-R, rtxC-F - rtxC-R, ctxBEltor-F - ctxBEltor-R в соотношении 1,5:1:1, соответственно, а также компоненты для анализа результатов.
При разработке способа особое значение придавали выбору новой ДНК-мишени для определения биовара холерных вибрионов. В результате исследований на основании анализа нуклеотидной последовательности CRISPR/CAS-системы отобран ген cas3, кодирующий хеликазу и присутствующий только у холерных вибрионов классического биовара, что повышает эффективность их идентификации. Ген cas3 использован в качестве ДНК-мишени для определения биовара впервые. Праймеры для выявления биовароспецифического гена cas3 сконструированы авторами с помощью программы Oligo 6.0 на основании представленных в базе данных нуклеотидных последовательностей выбранного гена и являются высокоспецифичными.
Праймеры на ген cas3, кодирующий хеликазу CRISPR/CAS-системы, имеют прямую и обратную нуклеотидные последовательности: cas3-F (5'-CAGCAGGTAAAAGGTGTAGTG-3') и cas3-R (5'-CGCATTTCCTCGCTTATCATC-3'), обеспечивающие образование фрагмента размером 415 п.н.
Праймеры были подобраны на уникальные последовательности гена cas3 в геноме V. cholerae таким образом, чтобы минимизировать вероятность их неспецифичного отжига. Праймеры были проверены на возможность образования шпилечных структур с высокими температурами плавления, а также образования димерных соединений как одноименных праймеров, так и двух праймеров между собой. Выбор длины и GC% состава праймеров производился в соответствии с режимом отжига других праймеров, входящих в набор. Размер получаемого фрагмента был подобран для упрощения процесса учета результатов таким образом, чтобы амплифицируемый фрагмент был визуально отделим от прочих.
Для подтверждения специфичности праймеров с помощью ПЦР было изучено 50 штаммов V. cholerae O1 биовара эльтор и 15 штаммов V. cholerae O1 классического биовара. При этом фрагмент, соответствующий гену cas3, был получен только для штаммов V. cholerae классического биовара.
Праймеры на другие использованные гены - rfbO1, rtxC и аллельспецифические праймеры для генов ctxBClass и ctxBEltor взяты из литературных данных (9, 8, 6, 11).
Пары праймеров, используемые в заявляемом способе, характеризуют как:
rfbO1-F - rfbO1-R - праймеры на ген rfbO1 (кодирующий биосинтез O1-антигена), обеспечивающие образование фрагмента размером 638 п.н.;
cas3-F - cas3-R - праймеры на ген cas3 (кодирующий хеликазу CRISPR/CAS-системы), обеспечивающие образование фрагмента размером 415 п.н. и имеющие прямую и обратную последовательности: cas3-F 5'-CAGCAGGTAAAAGGTGTAGTG-3', cas3-R 5'-CGCATTTCCTCGCTTATCATC-3'.
rtxC-F- rtxC-R праймеры на ген rtxC из кластера rtx генов (кодирующих биосинтез RTX-токсина), обеспечивающие образование фрагмента размером 265 п.н.;
ctxBClass-F - ctxBClass-R праймеры на аллель гена ctxB классического типа, обеспечивающие образование фрагмента размером 189 п.н.;
ctxBEltor-F - ctxBEltor-R - праймеры на аллель гена ctxB эльтор типа, обеспечивающие образование фрагмента размером 189 п.н.
Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения мультиплексной цепной реакции, подобрано сочетание праймеров, необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР, что является важным при проведении ПЦР анализа.
Заявляемая тест-система разделена на 3 комплекта:
комплект 1 содержит компоненты для выделения ДНК, упакованные в шесть пластиковых флаконов, содержащих раствор 1 (6М раствор гуанидинтиоционата), раствор 2 (4М раствор гуанидинтиоционата), раствор 3 (спиртосолевой раствор), ацетон, элюент для ДНК (ТЕ-буфер), 2 пластиковые пробирки с нуклеосорбентом;
комплект 2 содержит компоненты для проведения ПЦР и включает 2 пластиковые пробирки со смесью 1 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 2 (праймеры, дНТФ и вода), 1 пластиковую пробирку с 10-кратным буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую Taq-полимеразу, 1 пластиковую пробирку с ТЕ-буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую контрольный положительный образец с ДНК типичного токсигенного штамма V. cholerae O1 классического биовара, и 1 пластиковую пробирку, содержащую контрольный положительный образец с ДНК типичного токсигенного штамма V. cholerae O1 биовара эльтор;
комплект 3 содержит компоненты для учета результатов анализа и включает 1 пластиковый флакон, содержащий ТАЕ буфер, 2 флакона с агарозой для электрофореза и 1 флакон с буфером для нанесения проб.
Тест-система предназначена для определения методом мультилокусной полимеразной цепной реакции серогруппы, биовара, токсигенности исследуемых штаммов холерного вибриона и дифференциации выявленных токсигенных штаммов V. cholerae O1 биовара эльтор на типичные и измененные.
Система рассчитана на проведение 50 определений, включая контрольные образцы.
Заявляемый способ идентификации включает следующие этапы.
а) Выделение ДНК (комплект 1).
б) Проведение ПНР (комплект 2).
ПЦР проводят в один этап по следующей программе: предварительная денатурация 96°С - 2 мин, 25 циклов из 96°С - 10 с, 58,2°С - 10 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин.
в) Анализ результатов (комплект 3).
Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР осуществляют методом горизонтального гельэлектрофореза в 1,5% агарозном геле. Учет результатов ПЦР-анализа проводят путем сравнения полученных ампликонов с контрольными образцами в соответствии с идентификационной таблицей (табл.1).
Способ осуществляют следующим образом.
1. Подготовку проб проводят согласно МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» в боксе биологической безопасности II класса в противочумном костюме IV типа в резиновых или латексных перчатках. Клетки холерных вибрионов, выращенные на LB-агаре в течение 18 часов, ресуспендируют в 0,85% растворе натрия хлорида до концентрации
109 микробных клеток в 1 мл и последующим разведением в деионизованной воде доводят до концентрации 1×107 м.к./мл. Затем к суспензии добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревают его при 56°С в течение 30 мин. Далее, 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6М гуанидинизотиоцианата, и инкубируют 15 мин при 65°С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.
Выделение ДНК осуществляют с использованием комплекта 1.
Комплект для выделения ДНК извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре. Все реагенты комплекта добавляют отдельными наконечниками с помощью автоматических микропипеток.
Раствор 1 прогревают при температуре 60-65°С до полного растворения кристаллов, после чего добавляют к обеззараженным пробам в объеме 300 мкл. Пробы тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхиватиле и инкубируют при температуре 65°С. Сорбент тщательно ресуспендируют на микроцентрифуге/встряхиватиле. В каждую пробирку вносят 25 мкл подготовленного сорбента, перемешивают на микроцентрифуге/встряхиватиле 30 с и оставляют в штативе на 2 минуты. Процедуру повторяют дважды. Затем пробирки центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют.
К осадку добавляют 300 мкл раствора 2. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния, центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют.
К осадку добавляют 500 мкл раствора 3. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния и центрифугируют при 12000 g в течение 30 с. Супернатант удаляют, отмывку раствором 3 повторяют.
К осадку добавляют 400 мкл ацетона. Содержимое перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе, затем центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют. Осадок высушивают при температуре 65°С в течение 5-7 мин.
К осадку добавляют 50 мкл ТЕ-буфера и выдерживают при температуре 65°С в течение 10 мин, встряхивая на микроцентрифуге/встряхивателе 2-3 раза. По окончании взвесь центрифугируют при 12000 g в течение 1 мин. Супернатант содержит очищенную ДНК.
2. Для проведения ПЦР готовят необходимое количество микропробирок, соответствующее числу исследуемых проб, а также еще по три для каждой реакционной смеси: двух дифференцирующих положительных контролей (ПК-Class и ПК-Eltor), в качестве которых берут ДНК штаммов типичного классического и типичного эльтор биоваров, и отрицательного контроля (H2O).
Компоненты 2 комплекта извлекают из морозильной камеры, размораживают содержимое пробирок и готовят реакционные смеси для проведения ПЦР.
Для приготовления реакционной смеси №1 смешивают 11,7 мкл смеси 1, содержащей сочетание праймеров rfbO1-F - rfbO1-R, cas3-F - cas3-R, ctxBClass-F - ctxBClass-R в соотношении 1,5:1:1, смесь дНТФ и деионизованную воду с 3 мкл 10-кратного буфера и 0,3 мкл Taq-полимеразы. Для приготовления реакционной смеси для №2 смешивают 11,7 мкл смеси 2, содержащей сочетание праймеров rfbO1-F - rfbO1-R, rtxC-F - rtxC-R, ctxBEltor-F - ctxBEltor-R в соотношении 1,5:1:1, соответственно, смесь дНТФ и деионизованную воду с 3 мкл 10-кратного буфера и 0,3 мкл Taq-полимеразы. В подготовленные пробирки вносят по 10 мкл пробы. В пробирку, обозначенную как отрицательный контроль, вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирки с положительными контролями соответственно по 10 мкл ДНК из пробирок ПК-Class и ПК-Eltor. В качестве положительных контролей используют ДНК штамма V. cholerae 569B классического биовара (rfbO1+, cas3+, ctxBClass+ и rtxC-) и штамма V. cholerae M818 биовара эльтор (rfbO1+, rtxC+, ctxBEltor+ и cas3-).
Амплификацию ДНК осуществляют с использованием программируемого термостата с горячей крышкой «IQ5» (BioRad, США), либо используют его аналоги при следующих температурных режимах (по матричному способу регулирования): температура денатурации - 96°С в течение 2 мин; 25 циклов - денатурация ДНК при температуре 96°С в течение 10 с, отжиг праймеров 58,2°С - 10 с, синтез комплементарной цепи при температуре 72°С - 30 с; заключительный синтез комплиментарной цепи при температуре 72°С в течение 5 мин. Амплификацию контрольных образцов ПК-Class и ПК-Eltor проводят одновременно с исследуемыми пробами в том же приборе и при тех же условиях.
3. Для подготовки 50 мл 1,5% агарозного геля к 750 мг агарозы добавляют 50 мл ТАЕ буфера, разведенного в 50 раз. Агарозу доводят до кипения, охлаждают до 50°С и заливают в специальную ванночку, затем устанавливают гребенку и оставляют застывать. После полимеризации осторожно извлекают гребенку и переносят гель в камеру для проведения электрофореза. Затем к амплификату добавляют 5 мкл буфера для нанесения проб, перемешивают при помощи того же наконечника и вносят в карманы геля. Камеру подключают к источнику тока и задают напряжение 7-10 В/см. Электрофоретическое разделение продолжают в течение 50 мин до прохождения лидирующим красителем около 4/5 длины трека (рекомендуемая длина трека - 10 см), после чего гель извлекают из камеры и помещают на стекло трансиллюминатора с УФ-излучением 310 нм. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде оранжево-красных полос.
Оценивают результаты путем сравнения полученных в ПЦР ампликонов с маркерными фрагментами типичных токсигенных штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров. Учет результатов проводят в соответствии с идентификационной таблицей (табл.1).
На фиг.1 приведена электрофореграмма ампликонов, полученных при постановке мультиплексной ПЦР с различными штаммами V. cholerae. На дорожках 1 и 2 показано положение ампликонов типичных токсигенных штаммов соответственно классического и эльтор биоваров, на дорожках 3-5 представлены ампликоны измененных токсигенных вариантов холерного вибриона эльтор биовара. Дорожка 6 - отрицательный контроль.
Выявление ампликонов размером 638, 415 и 189 п.н. в смеси №1 указывает на присутствие в пробе токсигенного штамма холерного вибриона классического биовара;
присутствие ампликонов размером 638, 265 и 189 п.н. в смеси №2 указывает на присутствие в пробе токсигенного штамма холерного вибриона биовара эльтор;
присутствие в пробе токсигенных измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор, продуцирующих классический XT, тестируют на основе получения данных о наличии ампликонов размером 638 и 189 п.н. в реакционной смеси №1 и 638, 265 п.н. в смеси №2.
Специфичность заявляемого способа и тест-системы подтверждена на основе использования штаммов близкородственных видов - V. mimicus, V. anguillarum, V. parahae-molyticus, V. vulnificus, V. alginoliticus, V. albensis, а также энтеробактерий - E.coli, S. enteritidis, Sh. flexneri, A. hydrofilae. Результаты ПЦР тестирования указанных штаммов были отрицательными. При использовании заявляемой тест-системы со штаммами V. cholerae O139 и неО1/неО139 серогрупп показано отсутствие фрагментов, соответствующих локусу rfbO1 (638 п.н.). Результаты специфичности представлены в таблице 2.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Пример 1. Для определения эффективности заявляемого способа и тест-системы исследовано 23 клинических штамма V. cholerae, выделенных на различных территориях и в разные годы.
У всех исследуемых штаммов присутствовал ампликон размером 638 п.н., свидетельствующий об их принадлежности к O1 серогруппе.
Установлено, что среди них 5 изолятов относятся к токсигенным штаммам классического биовара, так как у них происходила амплификация фрагментов ДНК размером 415 п.н. и 189 п.н. в реакционной смеси №1, что свидетельствует о присутствии в их геноме соответственно биовароспецифического гена cas3, а также гена ctxBClass, связанного с продукцией XT - основного фактора вирулентности (табл.3).
У 18 штаммов V. cholerae при ПЦР-анализе наблюдалась иная картина. В их геноме присутствовал биовароспецифический ген rtxC, выявляемый с помощью реакционной смеси №2, поскольку во всех случаях формировался ампликон размером 265 п.н., что указывает на их принадлежность к холерным вибрионам биовара эльтор. При этом 5 изолятов относятся к типичным токсигенным штаммам V. cholerae O1 биовара эльтор, так как для них характерно наличие ампликона размером 189 п.н в реакционной смеси №2, указывающего на наличие в их геноме гена ctxBEltor. В то же время у 13 изолятов обнаружено присутствие в геноме гена ctxB классического типа (ctxBClass), о чем свидетельствует образование ампликона размером 189 п.н. со специфическими праймерами ctxBClass-F и ctxBClass-R в реакционной смеси №1. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что исследование природных штаммов холерных вибрионов с помощью предложенного способа и мультиплексной ПЦР тест-системы позволяет не только определять биовар и токсигенность штаммов холерного вибриона O1 серогруппы, но и дифференцировать штаммы V. cholerae биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты, несущие в геноме ген ctxB классического типа. Данные проведенного ПЦР-анализа сведены в таблицу 3.
Для подтверждения результатов по дифференциации типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, полученных с использованием заявляемого способа и ПЦР тест-системы, был секвенирован ген ctxB изучаемых штаммов. На фиг.2 представлены нуклеотидные последовательности гена ctxB исследуемых штаммов холерного вибриона. В результате проведенного анализа в последовательности гена ctxB у 13 изолятов обнаружены две нуклеотидные замены тимина (Т) на цитозин (С) в положениях 115 и 203, что указывает на присутствие в их геноме ctxB классического типа (ctxBClass). Таким образом, данные секвенирования полностью подтвердили результаты, полученные с использованием разработанного способа и мультиплесной ПЦР тест-системы, указав на принадлежность выявленных 13 штаммов холерного вибриона биовара эльтор действительно к измененным вариантам.
Таким образом, предлагаемый способ и мультиплексная ПЦР тест-система позволяют быстро и достоверно идентифицировать холерные вибрионы O1 серогруппы классического и эльтор биовара, определять их токсигенность и одновременно проводить дифференциацию выявленных токсигенных штаммов V. cholerae биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты.
Литература
1. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы и оценки их вирулентности. Патент РФ №2404257, опубликован 20.11.10 г.
2. Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Казакова Е.С., Шарова И.Н., Грачева И.В., Валова Т.В., Куличенко А.Н. Разработка метода биотипирования холерных вибрионов с помощью полимеразной цепной реакции. Сборник материалов проблемной комиссии «Холера и патогенные вибрионы». 2002; 15:59-61.
3. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции. Журнал эпидемиол., микробиол. и иммунологии. 2001. 6:11-16.
4. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Горяев А.А. и др. Эволюция генома Vibrio cholerae: пути формирования атипичных штаммов. Пробл. особо опасных инф. 2008, 3(97): 3-12.
5. Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления. Патент РФ 2360972, опубликован 10.07.10 г.
6. Bhattacharya Т., Chatterjee S., Maiti D. et al. Molecular analysis of the rstR and orfU genes of the CTX prophages integrated in the small chromosomes of environmental Vibrio cholerae non-O1, non-O139 strains. Environ. Microbiol. 2006; 8:526-534.
7. Chin C.S., Sorenson J., Harris J.B. et al. Origin of the Haitian cholera outbreak strain. N. Engl. J. Med. 2010; 364:33-42.
8. Chow, K.H., Ng, Т.К., Yuen, K.Y., Yam, W.C. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR. J Clin Microbiol. 2001; 39: 2594-2597.
9. Goel A.K., Ponmariappan, S., Kamboj, D.V., Singh, L. Single multiplex polymerase chain reaction for environmental surveillance of toxigenic-pathogenic O1 and non-O1 Vibrio cholerae. Folia Microbiol (Praha). 2007; 52: 81-85.
10. Kumar P., Jain M., Goel A.K. et al. A large cholera outbreak due to a new cholera toxin variant of the Vibrio cholerae O1 El Tor biotype in Orissa, Eastern India. J. Med. Microbiol. 2009, 58:234-238.
11. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008, 52(6): 314-317.
12. Nair G.В., Qadri F., Holmgren J. et al. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006, 44: 4211-4213.
| Таблица 1 | ||||||
| Реакционная смесь №1 | Реакционная смесь №2 | Результаты идентификации и дифференциации | ||||
| rfbO1 | cas3 | ctxBClass | rfbO1 | rtxC | ctxBEltor | |
| 638 п.н. | 415 п.н. | 189 п.н. | 638 п.н. | 265 п.н. | 189 п.н. | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм не относится к роду Vibrio |
| - | +/- | +/- | - | +/- | +/- | Штамм относится к роду Vibrio не O1-серогруппы |
| + | + | + | + | - | - | Типичный токсигенный штамм V. cholerae O1 классического биовара |
| + | - | - | + | + | + | Типичный токсигенный штамм V. cholerae O1 эльтор биовара |
| + | - | + | + | + | - | Измененный токсигенный штамм V. cholerae O1 эльтор биовара |
| Таблица 2 | |||||||||||
| № | Вид | Серогруппа и биовар | Штамм | Место и год выделения | Реакционная смесь №1 | Реакционная смесь №2 | Характеристика штамма на основе мПЦР* | ||||
| rfbO1 | cas3 | ctxBClass | rfbO1 | rtxC | ctxBEltor | ||||||
| 1. | V. cholerae | O139 | М028 | Индия, 1993 | - | - | - | - | + | + | не O1 |
| 2. | V. cholerae | O139 | 55 | Франция, 1994 | - | - | - | - | + | + | не O1 |
| 3. | V. cholerae | O139 | 62 | Франция, 1994 | - | - | - | - | + | + | не O1 |
| 4. | V. cholerae | O37 | 1322-69 | Коллекция Саказаки | - | - | + | - | - | - | не O1 |
| 5. | V. cholerae | O20 | 10332-62 | Коллекция Саказаки | - | - | - | - | - | - | не O1 |
| 6. | V. cholerae | O4 | NCTC4716 | Коллекция Саказаки | - | - | - | - | + | - | не O1 |
| 7. | V. cholerae | O41 | 14520 | Астрахань, 1976 | - | + | - | - | - | - | не O1 |
| 8. | V. cholerae | O42 | 13030 | Астрахань, 1976 | - | - | - | - | + | - | не O1 |
| 9. | V. cholerae | O41 | Р-4107 | Ростов, 1976 | - | - | - | - | + | - | не O1 |
| 10. | V. cholerae | н.и. | 16893 | Саратов, 1977 | - | - | - | - | - | - | не O1 |
| 11. | V. cholerae | O62 | KM3 | Узбекистан, 1971 | - | - | + | - | + | - | не O1 |
| 12. | V. cholerae | н.и. | Р-13673 | Узбекистан, 1987 | - | - | + | - | + | - | не O1 |
| 13. | V. cholerae | н.и. | Р-16149 | Узбекистан, 1998 | - | - | + | - | + | - | не O1 |
| 14. | V. cholerae | н.и. | KM159 | Узбекистан, 1988 | - | - | + | - | + | - | не O1 |
| 15. | V. cholerae | O9 | Р-16140 | Узбекистан, 1990 | - | - | + | - | + | - | не O1 |
| 16. | V. cholerae | O74 | Р-16148 | Узбекистан, 1990 | - | - | + | - | + | - | не O1 |
| 17. | V. cholerae | 074 | P-16135 | Узбекистан, 1990 | - | - | + | - | + | - | не O1 |
| 18. | V. cholerae | н.и. | P-16142 | Узбекистан, 1990 | - | - | + | - | + | - | не O1 |
| 19. | V. mimicus | - | ATCC 33653 | Институт Пастера | - | - | - | - | - | - | другой |
| 20. | V. anguillarum | - | ATCC 19264 | Институт Пастера | - | - | - | - | - | - | другой |
| 21. | V. parahaemoliticus | - | 745 | Новороссийск, 1975 | - | - | - | - | - | - | другой |
| 22. | V. parahaemoliticus | - | 4779 | Япония | - | - | - | - | - | - | другой |
| 23. | V. vulnificus | - | ATCC27562 | Калифорнийский университет | - | - | - | - | - | - | другой |
| 24. | V. alginoliticus | - | 281 | Новороссийск, 1976 | - | - | - | - | - | - | другой |
| 25. | V. albensis | - | 37263 | Ставрополь,1970 | - | - | - | - | - | - | другой |
| 26. | V. parahaemoliticus | - | 964 | н/и | - | - | - | - | - | - | другой |
| 27. | V. anguilanum | - | ATCC 19624 | н/и | - | - | - | - | - | - | другой |
| 28. | E. coli | - | M17 | н/и | - | - | - | - | - | - | другой |
| 29. | S. enteritidis | - | ВОЗ | н/и | - | - | - | - | - | - | другой |
| 30. | Sh. flexneri | - | 26 «C» | н/и | - | - | - | - | - | - | другой |
| 31. | A. hydrofilae | - | 401 | н/и | - | - | - | - | - | - | другой |
| Примечания: н/и - не известно; | |||||||||||
| * - штаммы: не O1, штаммы холерного вибриона не O1 серогруппы; другой, штаммы, не относящиеся к роду Vibrio. | |||||||||||
| Таблица 3 | |||||||||
| № | Штамм V. cholerae | Место и год выделения | Реакционная смесь №1 | Реакционная смесь №2 | Характеристика штамма на основе мПЦР | ||||
| rfbO1 | cas3 | ctxBClass | rfbO1 | rtxC | ctxBElton | ||||
| 1. | M8 | Волгоград, 1942 | + | + | + | + | - | - | ТК |
| 2. | М14 | Саратов, 1942 | + | + | + | + | - | - | ТК |
| 3. | 569В | Индия, 1950 | + | + | + | + | - | - | ТК |
| 4. | J89 | Пакистан, 1958 | + | + | + | + | - | - | ТК |
| 5. | Дакка 3 | Пакистан, 1958 | + | + | + | + | - | - | ТК |
| 6. | М295 | Туркменистан, 1965 | + | - | - | + | + | + | ТЭ |
| 7. | М818 | Саратов, 1970 | + | - | - | + | + | + | ТЭ |
| 8. | М1013 | Башкирия, 1972 | + | - | - | + | + | + | ТЭ |
| 9. | P13762 | Узбекистан, 1986 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 10. | M1259 | Пермь, 1990 | + | - | - | + | + | + | ТЭ |
| 11. | M1261 | Пермь, 1990 | + | - | - | + | + | + | ТЭ |
| 12. | P15384 | Украина, 1991 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 13. | M1264 | Сочи, 1993 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 14. | M1266 | Пермь, 1993 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 15. | Р17647 | Приморье, 1997 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 16. | Р17644 | Приморье, 1997 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 17. | М1293 | Дагестан, 1994 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 18. | М1344 | Казань, 2001 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 19. | М1345 | Казань, 2001 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 20. | М1349 | Казань, 2001 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 21. | М1429 | Башкирия, 2004 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 22. | М1430 | Тверь, 2005 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| 23. | Р18899 | Мурманск, 2006 | + | - | + | + | + | - | ИЭ |
| Примечание: * - штаммы: ТК - типичный токсигенный классического биовара; ТЭ - типичный токсигенный эльтор биовара; ИЭ - измененный токсигенный вариант эльтор биовара. | |||||||||
Claims (3)
1. Способ идентификации токсигенных штаммов V.cnolerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, характеризующийся тем, что полимеразную цепную реакцию проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров к генам rfbO1, cas3, ctxBClass в первой и rfbO1, rtxC, ctxBEltor во второй, с температурой отжига праймеров 58,5°С в течение 10 с при числе циклов амплификации, равном 25, с последующим анализом путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых и контрольных штаммов; для типичных токсигенных штаммов V.cholerae O1 классического биовара характерно наличие ампликонов генов rfbO1, cas3 и ctxBClass, идентичных контрольному образцу; для типичных токсигенных штаммов V.cholerae O1 биовара эльтор характерно наличие ампликонов генов rfbO1, rtxC и ctxBEltor, идентичных контрольному образцу; для измененных вариантов V.cholerae биовара эльтор, наряду с фрагментами генов rfbO1 и rtxC, характерно наличие ампликона к гену ctxBClass.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймеры cas3-F - cas3-R конструируют на участки гена cas3 и они имеют прямую и обратную последовательности: cas3-F 5'-CAGCAGGTAAAAGGTGTAGTG-3', cas3-R 5'-CGCATTTCCTCGCTTATCATC-3'.
3. Тест-система для осуществления способа по п.1 методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, характеризующаяся тем, что включает компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР, компоненты для анализа результатов, при этом компоненты для проведения ПЦР содержат: 10-кратный буферный раствор, рН 8,4, минеральное масло, деионизированную стерильную воду, два положительных контроля, фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дНТФ, смесь праймеров №1, содержащую rfbO1-F - rfbO1-R, cas3-F - cas3-R, ctxBClass-F - ctxBClass-R в соотношении 1,5:1:1 соответственно, смесь праймеров №2, содержащую rfbO1-F - rfbO1-R, rtxC-F - rtxC-R, ctxBEltor-F - ctxBEltor-R в соотношении 1,5:1:1 соответственно.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011109469/10A RU2458141C1 (ru) | 2011-03-14 | 2011-03-14 | Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011109469/10A RU2458141C1 (ru) | 2011-03-14 | 2011-03-14 | Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2458141C1 true RU2458141C1 (ru) | 2012-08-10 |
Family
ID=46849605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011109469/10A RU2458141C1 (ru) | 2011-03-14 | 2011-03-14 | Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2458141C1 (ru) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532225C1 (ru) * | 2013-05-07 | 2014-10-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации генов стафилококковых экзотоксинов, с высокой структурной гомологией с суперантигенами, методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
| RU2556127C2 (ru) * | 2014-01-09 | 2015-07-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Способ дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов vibrio cholerae биовара эль тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
| RU2560280C2 (ru) * | 2014-09-23 | 2015-08-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Способ одновременной идентификации токсигенных штаммов геновариантов возбудителя холеры эль тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции |
| RU2575046C2 (ru) * | 2014-05-06 | 2016-02-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ВНУТРИВИДОВОГО ТИПИРОВАНИЯ V. cholerae О1 И О139 СЕРОГРУПП |
| RU2627193C1 (ru) * | 2016-05-04 | 2017-08-03 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ молекулярно-генетического внутривидового типирования токсигенных штаммов Vibrio cholerae О1 Eltor |
| CN111511394A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-08-07 | 布里格姆妇女医院 | 具有益生菌特性的活减毒霍乱疫苗 |
| RU2729575C1 (ru) * | 2019-12-12 | 2020-08-07 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor |
| CN111534607A (zh) * | 2019-09-02 | 2020-08-14 | 广州微芯生物科技有限公司 | 用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 |
| RU2732448C1 (ru) * | 2019-07-30 | 2020-09-16 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации штаммов VIBRIO CHLERAE O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара ЭльТор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с учетом результатов в режиме "реального времени" |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1967234A (zh) * | 2006-08-26 | 2007-05-23 | 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的pcr检测方法 |
| RU2360972C1 (ru) * | 2007-12-18 | 2009-07-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления |
-
2011
- 2011-03-14 RU RU2011109469/10A patent/RU2458141C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1967234A (zh) * | 2006-08-26 | 2007-05-23 | 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的pcr检测方法 |
| RU2360972C1 (ru) * | 2007-12-18 | 2009-07-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532225C1 (ru) * | 2013-05-07 | 2014-10-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации генов стафилококковых экзотоксинов, с высокой структурной гомологией с суперантигенами, методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
| RU2556127C2 (ru) * | 2014-01-09 | 2015-07-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Способ дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов vibrio cholerae биовара эль тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
| RU2575046C2 (ru) * | 2014-05-06 | 2016-02-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ВНУТРИВИДОВОГО ТИПИРОВАНИЯ V. cholerae О1 И О139 СЕРОГРУПП |
| RU2560280C2 (ru) * | 2014-09-23 | 2015-08-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Способ одновременной идентификации токсигенных штаммов геновариантов возбудителя холеры эль тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции |
| RU2627193C1 (ru) * | 2016-05-04 | 2017-08-03 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ молекулярно-генетического внутривидового типирования токсигенных штаммов Vibrio cholerae О1 Eltor |
| CN111511394A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-08-07 | 布里格姆妇女医院 | 具有益生菌特性的活减毒霍乱疫苗 |
| CN111511394B (zh) * | 2017-07-12 | 2024-02-06 | 布里格姆妇女医院 | 具有益生菌特性的活减毒霍乱疫苗 |
| RU2732448C9 (ru) * | 2019-07-30 | 2021-05-26 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации штаммов VIBRIO CHOLERAE O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара ЭльТор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с учетом результатов в режиме "реального времени" |
| RU2732448C1 (ru) * | 2019-07-30 | 2020-09-16 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации штаммов VIBRIO CHLERAE O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара ЭльТор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с учетом результатов в режиме "реального времени" |
| CN111534607A (zh) * | 2019-09-02 | 2020-08-14 | 广州微芯生物科技有限公司 | 用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 |
| RU2729575C1 (ru) * | 2019-12-12 | 2020-08-07 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor |
| RU2808577C1 (ru) * | 2023-03-22 | 2023-11-29 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ обнаружения жизнеспособных холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров Classical и El Tor в окружающей среде с помощью бактериофага M3 методом количественной ПЦР |
| RU2825893C1 (ru) * | 2023-09-12 | 2024-09-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение " | Способ дифференциации вакцинного штамма "ВГНКИ" возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2458141C1 (ru) | Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления | |
| Chen et al. | PCR-based methodologies for detection and characterization of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii in foods and environmental sources | |
| Linton et al. | Rapid identification by PCR of the genus Campylobacter and of five Campylobacter species enteropathogenic for man and animals | |
| Mehrabadi et al. | Detection of toxigenic Vibrio cholerae with new multiplex PCR | |
| Ferrario et al. | Next generation sequencing-based multigene panel for high throughput detection of food-borne pathogens | |
| US9868995B2 (en) | Method for detecting Helicobacter pylori DNA in a stool sample | |
| Maurischat et al. | Rapid real-time PCR methods to distinguish Salmonella Enteritidis wildtype field isolates from vaccine strains Salmovac SE/Gallivac SE and AviPro SALMONELLA VAC E | |
| RU2360972C1 (ru) | Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления | |
| Benga et al. | Development of a multiplex PCR assay based on the 16S–23S rRNA internal transcribed spacer for the detection and identification of rodent Pasteurellaceae | |
| Imani et al. | Design of a multiplex PCR method for detection of toxigenic-pathogenic in Vibrio cholerae | |
| Ranjbar et al. | Rapid molecular approach for simultaneous detection of Salmonella spp., Shigella spp., and Vibrio cholera | |
| Ramazanzadeh et al. | Molecular characterization of Vibrio cholerae Isolated from clinical samples in Kurdistan province, Iran | |
| Vijayachari et al. | Supplement-Recent advances in the laboratory diagnosis of leptospirosis and characterisation of leptospires | |
| Kim et al. | Simultaneous detection of Pathogenic Vibrio species using multiplex real-time PCR | |
| Matucci et al. | Isolation and characterization of an atypical Mycoplasma gallisepticum strain showing a new mgc2 variant | |
| Ahmadi et al. | Molecular detection of Campylobacter species: comparision of 16SrRNA with slyD, cadF, rpoA, and dnaJ sequencing | |
| JP7479640B2 (ja) | Ｐｃｒ法を用いた赤痢菌の広域ｏ血清群判定方法 | |
| Benga et al. | Specific detection and identification of [Actinobacillus] muris by PCR using primers targeting the 16S–23S rRNA internal transcribed spacer regions | |
| Alishahi et al. | Facile and Rapid Detection of Vibrio cholerae by Multiplex PCR Based on ompU, ctxA, and toxR Genes. | |
| KR20030077790A (ko) | 병원성 미생물의 유전자 증폭용 프라이머, 이를 이용한병원성 미생물의 검출방법, 및 검출키트 | |
| US9234248B2 (en) | Simultaneous quantitative multiple primer detection of Clostridium difficile | |
| RU2556127C2 (ru) | Способ дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов vibrio cholerae биовара эль тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления | |
| Shivachandra et al. | Molecular diagnostic approaches for haemorrhagic septicaemia [HS]: A Review | |
| JP2007274934A (ja) | プライマーセット及び食中毒細菌の検出方法 | |
| US20050239067A1 (en) | Method of detecting and quantifying hemolysin-producing bacteria by overwhelmingly detecting and quantifying thermostable hemolysin-related genes (tdh-related hemolysin genes) of food poisoning bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170315 |