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TWI860979B - 利用游離病毒核酸改善癌症篩選 - Google Patents

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TWI860979B
TWI860979B TW107125941A TW107125941A TWI860979B TW I860979 B TWI860979 B TW I860979B TW 107125941 A TW107125941 A TW 107125941A TW 107125941 A TW107125941 A TW 107125941A TW I860979 B TWI860979 B TW I860979B
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慧君 趙
君賜 陳
培勇 江
偉棋 林
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香港中文大學
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Abstract

可分析生物樣本混合物中不含細胞之DNA分子以偵測病毒DNA。可測定病毒基因組中一或多個位點處病毒DNA分子之甲基化。可依據在特定病毒基因組之一組位點處甲基化之複數個不含細胞之DNA分子的一或多個量來量測混合物甲基化程度。可依各種方式測定混合物甲基化程度，例如：依在一個位點處或跨越多個位點或區域甲基化之不含細胞之DNA分子之密度形式測定。可比較混合物甲基化程度與參考甲基化程度，例如由至少兩個其他個體群組測定。群組可具有與特定病毒基因組相關聯之不同類別(包括第一病狀)。第一分類可依據比較來測定個體是否為具有第一病狀。

Description

利用游離病毒核酸改善癌症篩選
腫瘤細胞釋放腫瘤衍生之DNA進入血流的發現已激發能夠使用不含細胞之樣本(例如血漿)測定個體之腫瘤的存在、位置及/或類型之非侵襲性方法的開發。許多腫瘤若在出現早期偵測到，則為可治癒的。然而，當前方法可能缺乏在早期偵測腫瘤的靈敏度及/或特異性，且可能產生許多假陽性或假陰性結果。舉例而言，某些病毒與癌症相關聯，但可在沒有患有癌症之個體中偵測到病毒DNA，藉此產生假陽性結果。
測試之靈敏度可指病狀呈陽性之個體針對該病狀測試呈陽性的可能性。測試之特異性可指病狀呈陰性之個體針對該病狀測試呈陰性的可能性。靈敏度及特異性問題可能在用於腫瘤早期偵測之分析法中被放大，例如因為進行此類腫瘤偵測方法之樣本可能具有相對較少量的腫瘤衍生之DNA，且因為病狀本身在早期測試之個體當中可能具有相對較低的流行率。因此，對腫瘤偵測具有較高靈敏度及/或特異性之方法存在臨床需求。
實施例提供用於分析個體之生物樣本之系統、裝置及方法，例如在動物界(諸如人類)中。可分析生物樣本混合物中不含細胞之DNA分子以偵測病毒DNA，例如藉由測定特定病毒基因組中之位置。可測定病毒基因組中之一或多個位點處病毒DNA之甲基化狀態。可依據在複數個不含細胞之DNA分子的一或多個量中特定病毒基因組之一組位點處甲基化來量測混合物甲基化程度。可以各種方式測定混合物甲基化程度，例如以特定位點處或跨越多個位點及潛在地跨越多個區域(各自包括一或多個位點)甲基化之不含細胞之DNA分子之百分比/密度形式。
可比較混合物甲基化程度與參考甲基化程度，例如由至少兩個其他個體群組測定。群組可具有與特定病毒基因組相關聯之不同類別(包括第一病狀)。其他群組可對應於其他病狀。比較可以多種方式進行，例如藉由形成N個甲基化含量之多維點及測定與N個參考甲基化程度之差異。第一類別可依據比較來測定個體是否為具有第一病狀。
本發明之此等及其他實施例詳細描述於下文中。舉例而言，其他實施例係針對與本文中所描述之方法相關聯的系統、器件及電腦可讀媒體。
可參考以下詳細描述及隨附圖式來獲得對本發明之實施例之性質及優點的較佳理解。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2017年7月26日申請之題為「Enhancement Of Cancer Screening Using Cell-Free Viral Nucleic Acids」之美國臨時申請案第62/537,328號之優先權且為其非臨時版本，其全部內容以引用的方式併入本文中以用於所有目的。
附錄A展示當所收集之具有持續性陽性EBV DNA之3名個體及3名NPC患者之定序資料之間的此等CpG位點之甲基化百分比差異超過20%時，具有不同甲基化程度之跨越EBV基因組之個別CpG位點之列表。此等用*標記之位點之甲基化百分比差異超過40%，**之差異超過60%且***之差異超過80%。 術語
術語「樣本」、「生物樣本」或「患者樣本」意欲包括來源於活個體或死個體之任何組織或材料。生物樣本可為不含細胞之樣本，其可包括來自個體之核酸分子及來自病原體(例如病毒)之潛在核酸分子之混合物。生物樣本通常包含核酸(例如DNA或RNA)或其片段。術語「核酸」通常可指脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其任何雜交物或片段。樣本中之核酸可為不含細胞之核酸。樣本可為液體樣本或固體樣本(例如細胞或組織樣本)。生物樣本可為體液，諸如血液、血漿、血清、尿液、陰道液、來自水囊腫(例如睪丸)之液體、陰道沖洗液、胸膜液、腹水、腦脊髓液、唾液、汗液、淚液、痰液、支氣管肺泡灌洗液、乳頭排出液、來自身體不同部位(例如甲狀腺、乳房)之抽吸液等。亦可使用糞便樣本。在各種實施例中，已富集不含細胞之DNA之生物樣本(例如經由離心方案獲得之血漿樣本)中之大部分DNA可不含細胞(例如超過50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%之DNA可不含細胞)。離心方案可包括例如3,000 g×10分鐘，獲得流體部分，及在例如30,000 g下再離心另外10分鐘以移除殘餘細胞。
如本文中所使用，術語「片段」(例如DNA片段)可指聚核苷酸或多肽序列中包含至少3個連續核苷酸之部分。核酸片段可保留親本多肽之生物活性及/或一些特徵。核酸片段可為雙股或單股、甲基化或未甲基化、完整或帶切口、與其他大分子(例如脂質顆粒、蛋白質)複合或未複合的。在一個實例中，鼻咽癌細胞可將埃-巴二氏病毒(EBV) DNA之片段釋放至個體(例如患者)之血流中。此等片段可包含一或多個BamHI-W序列片段，其可用於偵測血漿中腫瘤衍生之DNA的含量。BamHI-W序列片段對應於可使用Bam-HI限制酶識別及/或消解之序列。BamHI-W序列可指序列5'-GGATCC-3'。
腫瘤衍生之核酸可指自腫瘤細胞釋放之任何核酸，包括來自腫瘤細胞中之病原體的病原體核酸。舉例而言，埃-巴二氏病毒(EBV) DNA可自患有鼻咽癌(NPC)之個體的癌細胞釋放。
術語「分析法」一般係指用於測定核酸特性之技術。分析法(例如第一分析法或第二分析法)一般係指用於測定樣本中核酸之量、樣本中核酸之基因組一致性、樣本中核酸之複本數變化、樣本中核酸之甲基化狀態、樣本中核酸之片段尺寸分佈、樣本中核酸之突變狀態或樣本中核酸之片段化模式的技術。一般技術者已知的任何分析法皆可用於偵測本文中提及之核酸的任何特性。核酸之特性包括序列、數量、基因組一致性、複本數、一或多個核苷酸位置處之甲基化狀態、核酸之尺寸、一或多個核苷酸位置處核酸之突變及核酸之片段化模式(例如核酸片段所處之核苷酸位置)。術語「分析法」可與術語「方法」互換使用。分析法或方法可具有特定靈敏度及/或特異性，且其作為診斷工具之相對有效性可使用ROC-AUC統計學來量測。
如本文中所使用，術語「隨機定序」一般係指在定序程序之前尚未具體鑑定或預先測定所定序之核酸片段的定序。不需要靶向特異性基因座之序列特異性引子。在一些實施例中，將銜接子添加至片段之末端中，且將用於定序之引子連接至銜接子。因此，任何片段皆可使用連接至相同通用銜接子之相同引子定序，且因此定序可為隨機的。可使用隨機定序進行大規模平行定序。
「序列讀數」一般係指在核酸分子之任何部分或全部中所定序的核苷酸串。舉例而言，序列讀數可為自核酸片段定序之短核苷酸串(例如20-150個鹼基)、在核酸片段之一端或兩端之短核苷酸串或存在於生物樣本中之整個核酸片段的定序。可以多種方式獲得序列讀數，例如使用定序技術或使用探針，例如在雜交陣列或捕捉探針中，或擴增技術，諸如聚合酶鏈反應(PCR)或使用單一引子之線性擴增或等溫擴增，或依據生物物理學量測，諸如質譜。
「甲基化組 」提供基因組(例如人類或其他動物基因組或病毒基因組)中之複數個位點或基因座處DNA甲基化的量之量測。甲基化組可對應於所有基因組、基因組之大部分或基因組之相對較小部分。相關甲基化組之實例為腫瘤細胞(例如鼻咽癌、肝細胞癌、子宮頸癌)之甲基化組、病毒甲基化組(例如駐留於個體之健康或腫瘤細胞內之EBV之甲基化組)；細菌甲基化組，及可促進DNA進入體液(例如血漿、血清、汗液、唾液、尿液、生殖器分泌物、精液、糞便液、腹瀉液、腦脊髓液、胃腸道之分泌物、腹水、胸膜液、眼內液體、來自水囊腫(例如睪丸)之液體、來自包囊之液體、胰腺分泌物、腸道分泌物、痰液、淚液、來自乳房及甲狀腺之抽吸液等)之器官(例如腦細胞、骨骼、肺、心臟、肌肉及腎等之甲基化組)。器官可為移植器官。胎兒之甲基化組為另一實例。
「血漿甲基化組」為自動物(例如人類)之血漿或血清測定之甲基化組。血漿甲基化組為不含細胞之甲基化組之一個實例，因為血漿及血清包括不含細胞之DNA。血漿甲基化組亦為混合甲基化組之實例，因為其為胚胎/母體甲基化組、腫瘤/患者甲基化組、來源於不同組織或器官之DNA、供體/受體甲基化組之混合物(在上下文或器官移植中)，及/或來自不同基因組(例如動物基因組及細菌/病毒基因組)之DNA之混合物。
「位點 」(亦稱為「基因組位點 」)對應於單一位點，其可為單一鹼基位置或相關鹼基位置群，例如CpG位點或相關鹼基位置之較大群。「基因座 」可對應於包括多個位點之區域。基因座可僅包括一個位點，此將使得基因座在該情形下等效於一個位點。
各基因組位點(例如CpG位點)之「甲基化指數 」可指在該位點展示甲基化之DNA片段(例如由序列讀數或探針測定)相對於覆蓋該位點之讀數總數之比例。「讀數」可對應於自DNA片段獲得之資訊(例如位點處之甲基化狀態)。讀數可使用優先雜配至特定甲基化狀態之DNA片段之試劑(例如引子或探針)獲得。典型地，此類試劑在用視DNA分子之甲基化狀態(例如亞硫酸氫鹽轉化，或甲基化敏感性限制酶，或甲基化結合蛋白質，或抗甲基胞嘧啶抗體)而差異調節或差異識別之方法處理後施用。在另一實施例中，識別甲基胞嘧啶及羥甲基胞嘧啶之單分子定序技術可用於闡明甲基化狀態及用於測定甲基化指數。
區域之「甲基化密度 」可指展示甲基化之區域內之位點處之讀數數目除以覆蓋區域中之位點之讀數總數。位點可具有特異性特徵，例如為CpG位點。因此，區域之「CpG甲基化密度」可指展示CpG甲基化之讀數數目除以覆蓋區域中之CpG位點(例如特定CpG位點、CpG島或較大區域內之CpG位點)之讀數總數。舉例而言，人類基因組中每100 kb分組之甲基化密度可自亞硫酸氫鹽處理之後在CpG位點處未轉化之胞嘧啶(其對應於甲基化胞嘧啶)的總數測定為映射至100 kb區域之序列讀數所覆蓋之所有CpG位點的比例。亦可對其他組距進行此分析，例如500 bp、5 kb、10 kb、50-kb或1-Mb等。區域可為整個基因組或染色體或染色體之一部分(例如染色體臂)。當區域僅包括CpG位點時，CpG位點之甲基化指數與區域之甲基化密度相同。「甲基化胞嘧啶之比例」可指相比於所分析之胞嘧啶殘基總數展示為甲基化(例如在亞硫酸氫鹽轉化之後未經轉化)之胞嘧啶位點「C」之數目，即包括區域中除CpG情形以外的胞嘧啶。甲基化指數、甲基化密度及甲基化胞嘧啶之比例為「甲基化程度 」之實例，其可包括其他涉及位點處甲基化讀數之計數之比率。除亞硫酸氫鹽轉化以外，熟習此項技術者已知之其他方法可用於查詢DNA分子之甲基化狀態，包括(但不限於)對甲基化狀態敏感之酶(例如甲基化敏感性限制酶)、甲基化結合蛋白、使用對甲基化狀態敏感之平台之單分子定序(例如奈米孔定序(Schreiber等人 Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 18910-18915)及藉由Pacific Biosciences單分子實時分析(Flusberg等人 Nat Methods 2010; 7: 461-465))。
「甲基化概況 」(亦稱為甲基化狀態)包括與區域之DNA甲基化相關之資訊。與DNA甲基化相關之資訊可包括(但不限於)CpG位點之甲基化指數、區域中CpG位點之甲基化密度、相鄰區域上CpG位點的分佈、含有超過一個CpG位點之區域內每個個別CpG位點之甲基化模式或程度以及非CpG甲基化。基因組之大部分(例如覆蓋超過10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)之甲基化概況可視為等效於甲基化組。哺乳動物基因組中之「DNA 甲基化 」通常指添加甲基至CpG二核苷酸中之胞嘧啶殘基之5'碳(亦即5-甲基胞嘧啶)。DNA甲基化可在例如CHG和CHH之其他情形下發生於胞嘧啶中，其中H為腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。胞嘧啶甲基化亦可呈5-羥甲基胞嘧啶形式。亦報導非胞嘧啶甲基化，諸如N6 -甲基腺嘌呤。
「甲基化檢測定序法 」係指允許吾人在定序方法期間確定DNA分子之甲基化狀態的任何定序方法，包括(但不限於)亞硫酸氫鹽定序、或前面為甲基化敏感性限制酶消解之定序、使用抗甲基胞嘧啶抗體或甲基化結合蛋白之免疫沈澱或允許闡明甲基化狀態之單分子定序。「甲基化檢測分析法 」或「甲基化敏感性分析法 」可包括依據定序及非定序之方法，諸如MSP、依據探針之查詢、雜交、限制酶消解接著進行密度量測、抗甲基胞嘧啶免疫分析法、甲基化胞嘧啶或羥甲基胞嘧啶之比例之質譜查詢、免疫沈澱接著不進行定序等。
「組織」對應於一組細胞，其共同歸類為一個功能單元。可在單一組織中發現超過一種類型之細胞。不同類型的組織可由不同類型的細胞(例如肝細胞、肺泡細胞或血細胞)組成，但亦可對應於來自不同生物體(宿主與病毒)之組織或對應於健康細胞與腫瘤細胞。術語「組織」通常可指人體中發現的任何細胞群(例如心臟組織、肺組織、腎臟組織、鼻咽組織、口咽組織)。在一些態樣中，術語「組織」或「組織類型」可用於指來源於不含細胞之核酸之組織。在一個實例中，病毒核酸片段可來源於血液組織，例如對於埃-巴二氏病毒(EBV)。在另一實例中，病毒核酸片段可來源於腫瘤組織，例如EBV或人類乳頭狀瘤病毒感染(HPV)。
「分離值 」(或相對豐度)對應於涉及兩個值之差異值或比率，例如DNA分子之兩個量、兩個分數貢獻或兩種甲基化程度，諸如樣本(混合物)甲基化程度及參考甲基化程度。分離值可為簡單的差異值或比率。作為實例，直接比率x/y以及x/(x+y)為分離值。分離值可包括其他因子，例如倍增因子。作為其他實例，可使用該等值之函數的差異值或比率，例如兩個值之自然對數(ln)的差異值或比率。分離值可包括差異值及/或比率。甲基化程度為相對豐度之實例，例如在甲基化DNA分子(例如在特定位點處)與其他DNA分子(例如特定位點處之所有其他DNA分子或僅未甲基化之DNA分子)之間。其他DNA分子之量可充當正規化因子。作為另一實例，可測定相對於所有或未甲基化之DNA分子之強度的甲基化DNA分子之強度(例如螢光或電強度)。相對豐度亦可包括每單位體積之強度。
如本文中所使用，術語「類別」係指與樣本之特定特性相關聯之任何數字或其他字符。舉例而言，「+」符號(或字組「陽性」)可表示樣本類別為具有特定病狀程度(例如癌症)。類別可為二元(例如陽性或陰性)或具有更高類別程度(例如自1至10或0至1之標度)。
術語「截止值 」、「臨限值 」或參考程度可指操作中使用之預定數字。臨限值或參考值可為在高於或低於其時應用特定類別之值，例如病狀之類別，諸如個體是否患有病狀或病狀之嚴重度。截止值可參考或不參考樣本或個體之特徵預定。舉例而言，可依據測試個體之年齡或性別選擇截止值。可在測試資料輸出後及依據測試資料輸出來選擇截止值。舉例而言，當樣本之定序達到某一深度時可使用某些截止值。作為另一實例，具有一或多種病狀之已知類別及所量測之特徵值(例如甲基化程度)之參考個體可用於測定參考程度，以區分不同病狀及/或病狀類別(例如個體是否患有病狀)。此等術語中之任一者可用於此等情形中之任一者中。
術語「對照」、「對照樣本」、「參考」、「參考樣本」、「正常」及「正常樣本」可互換使用，以大體上描述不具有特定病狀或在其他方面健康的樣本。在一個實例中，可對患有腫瘤之個體進行如本文中所揭示之方法，其中參考樣本為取自於個體之健康組織的樣本。在另一實例中，參考樣本為取自於患有疾病(例如癌症或癌症之特定階段)之個體的樣本。參考樣本可獲自個體或資料庫。參考物一般係指用於定位由對來自個體之樣本進行定序所獲得之序列讀數的參考基因組。參考基因組一般係指可比對及比較來自生物樣本及組成樣本之序列讀數的單倍體或二倍體基因組。對於單倍體基因組，各基因座僅存在一個核苷酸。對於二倍體基因組，可鑑別異型接合基因座，此類基因座具有兩個對偶基因，其中任一對偶基因可允許匹配以與基因座比對。參考基因組可對應於病毒，例如藉由包括一或多個病毒基因組。
如本文中所使用，片語「健康」一般係指個體具有良好的健康狀況。此類個體證實沒有任何惡性或非惡性疾病。「健康個體」可能患有與所分析之病狀無關的其他疾病或病狀，通常可能不視為「健康的」。
術語「癌症」或「腫瘤」可互換使用，且通常係指組織之異常腫塊，其中腫塊生長超越正常組織生長且與正常組織生長不協調。癌症或腫瘤可定義為「良性」或「惡性」，其視以下特徵而定：細胞分化程度(包括形態及功能)、生長速率、局部侵襲及轉移。「良性」腫瘤通常分化良好，生長典型地比惡性腫瘤更慢，且保持侷限於原發部位。此外，良性腫瘤不具有浸潤、侵襲或轉移至遠端部位之能力。「惡性」腫瘤通常分化不良(退行發育)，典型地快速生長伴隨有進行性滲透、侵襲及破壞周圍組織。此外，惡性腫瘤具有轉移至遠端部位之能力。「階段」可用於描述惡性腫瘤如何發展。與晚期惡性病相比，早期癌症或惡性病與體內腫瘤負荷較少相關聯，一般症狀較輕，預後較佳且治療結果較佳。晚期癌症或惡性病通常與遠端轉移及/或淋巴擴散相關聯。
術語「癌症 等級」(或更一般而言，「疾病等級 」或「病狀等級 」)可指是否存在癌症(亦即存在或不存在)、癌症狀態、腫瘤尺寸、是否存在轉移、身體之總腫瘤負荷、癌症對治療之反應及/或癌症嚴重度之其他量測(例如癌症復發)。癌症等級可為數字或其他標誌，諸如符號、字母及顏色。等級可為零。癌症等級亦可包括惡化前或癌變前病狀(狀態)。可以各種方式使用癌症等級。舉例而言，篩選可檢驗先前未知患癌之某人是否存在癌症。評估可調查已診斷患有癌症之某人以隨時間推移監測癌症之進程，研究療法有效性或確定預後。在一個實施例中，預後可用患者死於癌症之機率或特定期限或時間之後癌症進程之機率或癌症轉移之機率表示。偵測可意謂『篩選』或可意謂檢驗暗示有癌症特徵(例如症狀或其他陽性測試)的某人是否患有癌症。「病理等級」可指與病原體相關聯之病理等級，其中等級可如上文針對癌症所述。疾病/病狀之等級亦可如上文關於癌症所描述。當癌症與病原體相關聯時，癌症等級可為一種類型的病理等級。
術語「尺寸概況」及「尺寸分佈」一般係關於生物樣本中DNA片段之尺寸。尺寸概況可為提供各種尺寸之DNA片段之量分佈的直方圖。各種統計參數(亦稱為尺寸參數或僅參數)可區分一個尺寸概況與另一個尺寸概況。一個參數為相對於所有DNA片段或相對於另一尺寸或範圍之DNA片段的特定尺寸或尺寸範圍之DNA片段的百分比。
術語「假陽性」(FP)可指個體未患有病狀。假陽性一般係指個體未患有腫瘤、癌症、癌變前病狀(例如癌變前病灶)、局部或轉移癌症、非惡性疾病，或在其他方面健康。術語假陽性一般係指個體未患有病狀，但藉由本發明之分析法或方法鑑定為患有病狀。
術語「靈敏度」或「真陽性率」(TPR)可指真陽性之數目除以真陽性及假陰性之數目的總和。靈敏度可表徵分析法或方法正確鑑定真正患有病狀之群體之比例的能力。舉例而言，靈敏度可表徵方法正確鑑定患有癌症之群體內之個體數目的能力。在另一個實例中，靈敏度可表徵方法正確鑑定指示癌症之一或多個標記的能力。
術語「特異性」或「真陰性率」(TNR)可指真陰性之數目除以真陰性及假陽性之數目的總和。特異性可表徵分析法或方法正確鑑定真正未患有病狀之群體之比例的能力。舉例而言，特異性可表徵方法正確鑑定未患有癌症之群體內之個體數目的能力。在另一個實例中，特異性可表徵方法正確鑑定指示癌症之一或多個標記的能力。
術語「ROC」或「ROC曲線」可指接受者操作特徵曲線。ROC曲線可為二元分類器系統效能之圖形表示。對於任何既定方法，ROC曲線可藉由在各種臨限值設定下將靈敏度對特異性繪圖來生成。用於偵測個體存在腫瘤之方法的靈敏度及特異性可在個體之血漿樣本中腫瘤衍生之核酸的各種濃度下確定。此外，提供三個參數(例如靈敏度、特異性及臨限值設定)中之至少一者，ROC曲線可確定任何未知參數之值或期望值。未知參數可使用擬合成ROC曲線之曲線來確定。術語「AUC」或「ROC-AUC」一般係指接受者操作特徵曲線下的面積。此度量可提供方法之診斷效用的量度，同時考慮方法之靈敏度及特異性。一般而言，ROC-AUC範圍介於0.5至1.0，其中更接近0.5之值表明該方法具有有限的診斷效用(例如較低靈敏度及/或特異性)且更接近1.0之值表明該方法具有較大的診斷效用(例如較高靈敏度及/或特異性)。參見例如Pepe等人, 「Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic, Prognostic, or Screening Marker」 Am. J. Epidemiol 2004, 159 (9): 882-890，其以全文引用的方式併入本文中。使用似然函數、優勢比、資訊理論、預測值、校準(包括擬合優度)及重新分類量測以表徵診斷效用之額外方法根據Cook, 「Use and Misuse of the Receiver Operating Characteristic Curve in Risk Prediction」 Circulation 2007, 115: 928-935加以彙總，其以全文引用的方式併入本文中。
術語「約」或「大致」可意謂在特定值之可接受誤差範圍內，如由一般技術者所測定，該可接受誤差範圍將部分取決於如何量測或測定值，亦即量測系統之侷限性。舉例而言，根據此項技術中之實踐，「約」可意謂在1或大於1個標準差內。或者，「約」可意謂既定值之至多20%、至多10%、至多5%或至多1%之範圍。或者，尤其關於生物系統或方法，術語「約」或「大致」可意謂在數值之一定數量級內、在5倍內且更佳在2倍內。若特定值描述於本申請案及申請專利範圍中，除非另有說明，否則應假定術語「約」意謂在特定值之可接受誤差範圍內。術語「約」可具有如一般技術者通常所理解之含義。術語「約」可指±10%。術語「約」可指±5%。
本文中所使用之術語僅用於描述特定情況之目的且並不意欲為限制性的。如本文中所使用，單數形式「一」及「該」意欲亦包括複數形式，除非上下文另有明確指示。除非有相反的特定說明，否則「或」之使用意指「包括性的或」，而非「互斥性的或」。術語「基於」意欲意謂「至少部分地基於」。此外，就實施方式及/或申請專利範圍中使用術語「包括(including)」、「包括(includes)」、「具有(having)」、「具有(has)」、「具有(with)」或其變化形式之程度而言，此類術語意欲以類似於術語「包含」之方式為包括性的。
在本發明中，吾人描述用於依據血液中循環EBV DNA片段之甲基化模式之分析來區分不同EBV相關疾病、惡性病、狀態或完全健康個體之方法。存在許多用於不含細胞之EBV DNA分子之甲基化模式分析之應用或效用。在篩選、預測藥品、風險分級、監控及預測之情形下，非侵入性方式中不含細胞之病毒分子之甲基化分析之可行性將增強臨床應用。
實施例甚至可在單時間點分析(例如來自單次抽血)下區分患有不同病毒相關病狀之個體(例如NPC患者)與具有可偵測之血漿EBV DNA之表觀健康個體。實施例亦可用於篩選或偵測個體是否患有疾病或癌症、用於癌症患者中之疾病監測、用於預測及用於疾病或癌症風險預測(亦即用於預測個體未來是否可能發展疾病或癌症)。此方法亦可一般化至除EBV以外的病毒。因此，此方法為用於鑑別基於病毒DNA之生物標記之一般方法。 I. 癌症及病毒
已證實DNA及RNA病毒能夠在人類中引起癌症。在一些實施例中，個體可能患有由病毒(例如腫瘤病毒)引起之癌症。在一些實施例中，個體可能患有癌症，且該癌症可使用病毒DNA偵測。對於RNA之分析，核酸將以互補DNA (cDNA)之形式存在，其自RNA複製且為用於宿主細胞中之複製之媒介。此等cDNA可具有甲基化且用於實施例中。
各種病毒感染與各種癌症或其他病理學病狀相關聯。舉例而言，EBV感染與NPC及自然殺手(NK) T細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、胃癌及感染性單核白血球增多症緊密相關。B型肝炎病毒(HBV)感染及C型肝炎病毒(HCV)感染與產生肝細胞癌(HCC)之風險增加相關。人類乳頭狀瘤病毒感染(HPV)與產生子宮頸癌(CC)及頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)之風險增加相關。儘管實例更多關注於EBV，但技術同樣適用於癌症及其他與HPV、HBV及其他病毒相關之病狀，尤其與癌症相關聯之病狀。 A. EBV
據估計，全世界有95%的人群具有無症狀終身埃-巴二氏病毒(EBV)感染，藉此病毒保持潛伏在健康個體之記憶B細胞中且存留在體內(Young等人 Nat Rev Cancer 2016 16(12):789-802)。小部分個體發展症狀性感染，呈現為具有病毒感染之感染性單核白血球增多症。EBV亦由於其與上皮及血液來源之許多惡性病或癌症樣症候群之關聯性而被視為致癌病毒，包括鼻咽癌(NPC)、胃癌、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、自然殺手-T細胞(NK-T細胞)淋巴瘤及移植後淋巴增生病症(PTLD)。
已研究循環EBV DNA在EBV相關惡性病患者中之診斷及預後作用。在此方面，已確認血漿EBV DNA為NPC之生物標記(Lo等人 Cancer Res 1999; 59:1188-91)。建議將用血漿EBV DNA進行之常規監控用於具有確定的NPC診斷之患者，以用於偵測殘留疾病及復發(Lo等人 Cancer Res 1999; 59:5452-5，Chan等人 J Natl Cancer Inst 2002;94:1614-9，Leung等人 Cancer 2003, 98(2), 288-91及Leung等人 Ann Oncol 2014; 25(6):1204-8)。亦證實血漿EBV DNA在其他EBV相關惡性病中具有預後重要性，包括霍奇金氏淋巴瘤(Kanakry等人 Blood 2013; 121(18): 3547-3553)、結外NK-T細胞淋巴瘤(Wang等人 Oncotarget 2015; 6(30):30317-26，Kwong等人 Leukemia 2014; 28(4):865-870)及PTLD (Gulley及Tang. Clin Microbiol Rev 2010; 23(2): 350-66)。
然而，並非所有具有此類感染之個體皆會罹患相關癌症。無NPC人員之血漿EBV DNA的來源肯定不同。與EBV DNA自NPC細胞持續釋放至循環中不同，無NPC人員之EBV DNA的來源僅短暫釋放此類DNA。 B. 假陽性
在癌症篩選之情形下，吾人最近藉由定量PCR (qPCR)，使用血漿EBV DNA分析對NPC篩選進行大規模前瞻性研究(Chan等人 N Engl J Med 2017;377:513-522)。吾人分析在入選時無NPC症狀之所有募集個體(篩選群組)之血漿EBV DNA含量。在初始測試之後第4週，針對EBV DNA再次測試具有可偵測量之血漿EBV DNA之個體。在所募集的20,174名個體中，1,112名在其第一次測試中具有可偵測之血漿EBV DNA。基於血漿EBV DNA之量之量測，存在309名在後續測試中呈持續性陽性之個體。接著，藉由內窺鏡檢查及磁共振成像(MRI)，確認34名具有持續性陽性血漿EBV DNA結果之個體具有NPC。如所提及，可在無NPC或其他EBV相關惡性病之表面上健康個體中偵測到血漿EBV DNA。
在20,174名經歷NPC篩選之個體中，基於單一時間點分析，假血漿EBV DNA陽性率約5% ((1112-34)/(20174-34)=5.3%)。在對兩種情況之連續EBV DNA分析中，假陽性率降低至1.5%。然而，血漿EBV DNA之連續測試需要自具有初始陽性結果之個體收集額外血液樣本，其可能帶來後勤挑戰。又，顯著比例之具有陽性血漿EBV DNA結果之個體不具有NPC (96%的在單一時間點分析中展示陽性結果之個體不具有NPC，測定為(1112-34)/1112)。具有假陽性結果之個體將需要連續評估及非必要研究，包括用於決定性診斷之內窺鏡檢查及MRI。所有此等手續將引起患者焦慮及更高的隨訪成本。因此，吾人旨在藉由單一時間點血液分析區分具有NPC之患者與具有假陽性血漿EBV DNA結果之個體。在此實例中，假血漿EBV DNA陽性率可視為非NPC陽性率或亦稱為單次陽性率。 C. 甲基化之用途
先前研究已描述不同類型之病毒潛伏態(類型0、I、II及III)，其由在不同的EBV相關惡性病中發現之潛伏態相關病毒基因轉錄模式定義(Young等人 Nat Rev Cancer 2016; 16(12):789-802)。病毒潛伏態係由潛伏態相關基因轉錄模式定義。因此，不同類型的病毒潛伏態中之病毒具有不同的病毒基因轉錄模式。具有相同類型的病毒潛伏態之不同EBV相關疾病或病狀可具有類似的病毒基因轉錄模式。
在不同類型的潛伏態中，存在不同病毒基因表現概況及不同病毒基因啟動子之不同甲基化狀態，包括複製起點、C-啟動子、W-啟動子、Q-啟動子及LMP1/2啟動子(Woeller等人 Curr Opin Virol 2013;3(3):260-5)。已提出DNA甲基化有助於調節基因表現且存在潛伏態特異性甲基化模式(Lieberman. Nat Rev Microbiol 2013;11(12):863-75)。在一個實例中，先前研究使用甲基化特異性PCR，在來自NPC患者之鼻毛細胞學樣本之EBV DNA中，發現C啟動子之甲基化狀態，其與潛伏態II型特異性甲基化模式相容(Ramayanti等人 Int J Cancer 140,149-162)。然而，不同EBV相關疾病或病狀可具有相同類型的病毒潛伏態且因此將具有類似病毒基因轉錄模式(下一個段落中描述之實例)。因此，病毒潛伏態與疾病或癌症之階段無關。
吾人預期具有相同類型的病毒潛伏態之不同EBV相關疾病將具有類似的甲基化模式(Tempera等人 Semin Cancer Biol 2014;26:22-9，Fejer等人 J Gen Virol 2008;89:1364-70)。在一個實例中，先前研究使用甲基化特異性PCR展示出，在來自健康EBV血清反應呈陽性個體及來自EBV陽性淋巴瘤之腫瘤組織的B細胞中，跨越EBV之病毒啟動子區域之類似甲基化模式，其皆呈現I型潛伏態(Paulson等人 J Virol 1999;73:9959-68)。
先前研究亦嘗試藉由來自細胞株之經亞硫酸氫鹽轉化之DNA及不同EBV相關疾病之組織樣本之擴增子定序來研究EBV之甲基化概況(Fernandex等人 Genome Res 2009;19(3):438-51)。77個擴增子經設計以覆蓋94種不同EBV潛在及裂解基因之轉錄起始位點以及及兩個結構RNA，EBER1 及EBER2 。評估跨越EBV基因組之轉錄起始位點之甲基化狀態(甲基化或未甲基化)。此等結果僅表明相對於定量，游離病毒DNA不含DNA甲基化，且來自EBV相關惡性病之細胞株或組織樣本之病毒DNA具有許多甲基化EBV轉錄起始位點。重要的是，具有不同惡性病狀(亦即NPC及不同淋巴瘤)之樣本就轉錄起始位點之甲基化模式之叢集分析一起集群，且未鑑別暫時性陽性或持續性陽性個體。基於其甲基化模式，不同惡性病狀可無差別。
大部分先前研究集中於腫瘤及細胞株樣本中病毒甲基化概況之分析。此等腫瘤樣本需要經由侵襲性程序(例如手術活檢)獲得。此可限制診斷應用，例如對於篩選及連續監測。並且，先前研究已集中於定性態樣而非定量結果。
與以上報導之資料無關，吾人研究呈現相同類型的病毒潛伏態之不同EBV相關疾病中之區分可行性。與以上報導之資料相比，吾人描述基於血漿EBV DNA序列的甲基化概況之分析之方法，其可區分不同EBV相關疾病或疾病階段。舉例而言，代替僅分析病毒基因啟動子之甲基化狀態(甲基化或未甲基化)，吾人以基因組譜方式在更高解析度下研究不含細胞之EBV DNA分子之各CpG位點之甲基化程度。顯然，吾人的資料揭示吾人可依據不含細胞之EBV DNA分子之甲基化分析來區分具有相同潛伏態類型之不同EBV相關病狀及惡性病。因此，吾人的資料提供除潛伏態類型特異性可變性以外，關於不含細胞之EBV DNA甲基化模式之新資訊。
實施例可分析血液中(例如血漿或血清中)不含細胞之EBV DNA分子之甲基化模式。本發明之實施例亦可用於其他含有不含細胞之EBV DNA分子之體液，例如尿液(Chan等人 Clin Cancer Res 2008;14(15):4809-13)、血清、陰道液、子宮或陰道沖洗液、胸膜液、腹水、腦脊髓液、唾液、汗液、淚液、痰液、支氣管肺泡灌洗液等。亦可使用糞便樣本。技術挑戰為在與組織樣本中腫瘤DNA之分析相比時，病毒分子之低豐度及分段性質。本發明證明以非侵入性方式進行不含細胞之病毒分子之甲基化分析之可行性。 II. 量測不含細胞之EBVDNA分子之甲基化
可在基因組中各種位點處量測甲基化程度，例如動物(諸如人類)、病毒或其他基因組。可在一或多個位點(例如CpG位點)處使用甲基化資訊測定甲基化程度。甲基化資訊可包括既定位點處甲基化之DNA分子之計數，或對應於甲基化/未甲基化之DNA分子的量之強度信號。甲基化程度可提供甲基化DNA分子與未甲基化DNA分子之間的相對豐度，例如其中位點處所有或未甲基化DNA分子之量可充當正規化因子。
對於病毒基因組，可使用以下方程式計算血漿中跨越病毒基因組之特異性基因座之平均甲基化CpG密度(亦稱為甲基化密度，馬里蘭州)：，其中M為跨越病毒基因組之遺傳基因座內CpG位點處甲基化病毒讀數之計數且U為未甲基化病毒讀數之計數。若基因座內存在超過一個CpG位點，則M及U分別對應於跨越位點之甲基化及未甲基化讀數之計數。作為實例，可使用定序或數位PCR測定甲基化或未甲基化之個別DNA片段之此類計數。作為另一實例，相對於讀數之計數特異性數字，亦可使用實時PCR測定甲基化密度，以獲得信號之強度比率(例如甲基化強度與未甲基化強度之比率)。因此，可共同進行核酸之分析，其中強度信號對應於多重核酸。甲基化程度之特定形式可變化，例如如上所述之比例或M與U之間的比率。 A. 用於評估甲基化程度之各種技術
不同方法可用於測定甲基化程度，例如測定跨越所有或大部分基因組(例如人類基因組或病毒基因組)之甲基化概況。為了全面查詢甲基化概況，實例實施例可使用經亞硫酸氫鹽轉化之DNA之大規模平行定序(MPS)，以提供基因組譜資訊，及基於每個核苷酸及每個對偶基因之甲基化程度之定量評估。可使用任何甲基化敏感性分析法測定所選擇之CpG位點之甲基化程度。其他實例技術包括單分子定序(例如奈米孔定序(Simpson等人 Nat Methods 2017;14(4):407-410))、甲基化特異性PCR (Herman等人 Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93(18):9821-9826)、用基於DNA分子質甲基化狀態而以不同方式修飾DNA分子之酶(例如甲基化敏感性限制酶)進行之處理、甲基化結合蛋白(例如抗體)或基於質譜之方法(例如Lin等人 Anal Chem 2016;88(2):1083-7)。
可分析各種類型之甲基化。在一些實施例中，吾人使用胞嘧啶殘基之5-甲基化作為實例。亦可使用其他類型之DNA甲基化變化，例如腺嘌呤之羥甲基化或甲基化。因此，亦可使用用於偵測羥甲基化之技術，例如氧化亞硫酸氫鹽定序(Booth等人 Science 2012;336(6083):934-7)及Tet輔助之亞硫酸氫鹽定序(Nat Protoc 2012;7(12):2159-70)。關於甲基化概況之測定及使用之其他細節可見於美國專利公開案2015/0011403及2016/0017419以及2017/0029900中，其以全文引用之方式併入本文中。
在亞硫酸氫鹽修飾期間，未甲基化之胞嘧啶轉化成尿嘧啶且接著在PCR擴增之後轉化成胸嘧啶，而甲基化胞嘧啶將保持完整(Frommer M等人, Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:1827-31)。在定序及比對之後，由此可自CpG位點之胞嘧啶殘基處甲基化序列讀數之計數『M』(甲基化)及未甲基化序列讀數之計數『U』(未甲基化)推斷個別CpG位點之甲基化。使用亞硫酸氫鹽定序資料，可構築來自患有不同病毒相關病狀之個體之血漿之病毒甲基化組。
如上文所描述，可使用經亞硫酸氫鹽轉化之DNA之大規模平行定序(MPS)進行甲基化概況分析。可依隨機或霰彈槍方式或以靶向方式進行經亞硫酸氫鹽轉化之DNA之MPS。舉例而言，可使用基於溶液相或固相雜配之過程，接著進行MPS來捕捉經亞硫酸氫鹽轉化之DNA中之相關區域。
可使用以下方法進行MPS：合成定序平台(例如Illumina HiSeq或NextSeq或NovaSeq平台)、接合定序平台(例如來自Life Technologies之SOLiD平台)、基於半導體之定序系統(例如來自Life Technologies之Ion Torrent或Ion Proton平台)、GenapSys Gene Electronic Nano-Integrated Ultra-Sensitive (GENIUS)技術、單分子定序系統(例如Helicos系統或Pacific Biosciences系統)或基於奈米孔之定序系統(例如來自Oxford Nanopore Technologies或來自Roche (sequencing.roche.com/research---development/nanopore-sequencing.html)之Genia平台)。基於奈米孔之定序包括使用脂質雙層構築之奈米孔及蛋白質奈米孔，以及固態奈米孔(諸如基於石墨烯之奈米孔)。由於所選擇之單分子定序平台將允許在無亞硫酸氫鹽轉化情況下直接闡明DNA分子(包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶及5-羥甲基胞嘧啶)之甲基化狀態(B.A. Flusberg等人 2010 Nat Methods; 7:461-465；J. Shim等人 2013 Sci Rep: 3:1389. doi: 10.1038/srep01389)，因此可以使用此類平台分析未經亞硫酸氫鹽轉化之樣本DNA (例如血漿或血清DNA)之甲基化狀態。序列可包括配對端定序或提供整個DNA分子之單一序列讀數。
除定序以外，可使用其他技術，例如上文所提及之技術。在一個實施例中，可藉由以下方式進行甲基化概況分析：進行甲基化特異性PCR或甲基化敏感性限制酶消解，接著進行PCR；或進行連接酶鏈反應，接著進行PCR。在其他實施例中，PCR為單分子或數位PCR形式(B. Vogelstein等人 1999 Proc Natl Acad Sci USA; 96:9236-9241)。在其他實施例中，PCR可為實時PCR (Lo等人 Cancer Res 1999;59(16):3899-903及Eads等人 Nucleic Acids Res 2000;28(8):E32)。在其他實施例中，PCR可為多工PCR。在一個實施例中，可使用基於微陣列之技術分析甲基化概況。
在定序之後，可在甲基管道 (一種甲基化資料分析管道)中處理序列讀數(Jiang等人 PLoS One 2014;9:e100360)且映射至人工組合參考序列，其由完全人類基因組(hg19)、完全EBV基因組(AJ507799.2)、完全HBV基因組及完全HPV基因組組成。相對於組合成一個參考序列，可使用不同參考序列，且可分別對基因組中之每一者進行映射。映射至組合基因組序列中之獨特位置的定序讀數可用於下游分析。 B. 使用捕捉探針之靶向亞硫酸氫鹽定序
某些實施例可查詢血漿EBV DNA分子之甲基化模式之特異性區域。在一個實施例中，藉由捕捉富集物進行之靶向亞硫酸氫鹽定序可用於分析患有不同EBV相關疾病或病狀之個體之循環中的不含細胞之病毒DNA分子。舉例而言，捕捉探針可經設計以覆蓋EBV基因組之所有或一些CpG位點。此方法亦可用於其他病毒。因此，捕捉探針亦可經設計以覆蓋B型肝炎病毒(HBV)基因組、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)基因組及其他病毒/細菌基因組之所有或一些CpG位點。在相同分析中，亦可包括捕捉探針以靶向人類基因組中之基因組區域。
在一些實施例中，為了考慮病毒基因組與人類基因組之間的尺寸差異，與相關人類基因組區域可能使用之探針相比，更多的探針可經設計以與病毒基因組序列雜配。在另一實施例中，吾人可靶向完全病毒基因組，例如設計在約200 bp尺寸下覆蓋各病毒基因組區域之平均200個雜配探針(例如200X平鋪捕捉探針)。在一個實施例中且作為實例，對於人類基因組中之相關區域，吾人設計在約200 bp尺寸下覆蓋各區域之平均5個雜配探針(例如5X平鋪捕捉探針)。作為說明，可根據圖1設計捕捉探針。
圖1展示根據本發明之實施例之用於靶向亞硫酸氫鹽定序之捕捉探針之設計。圖1提供關於捕捉探針之資訊，例如捕捉區域之尺寸及由探針覆蓋之平鋪量。捕捉探針可為各種長度且彼此重疊。此類捕捉探針可使用SeqCap-Epi系統(Nimblegen)。其他實施例可能不使用此類捕捉探針。
第101欄鑑別序列類型，亦即人類或病毒目標之體染色體。第102欄鑑別特定序列(例如染色體或特定病毒基因組之序列)。第103欄提供由捕捉探針覆蓋之鹼基對(bp)之總長度。捕捉探針可能不覆蓋整個序列(例如關於體染色體所展示)，但可覆蓋整個序列，例如對於病毒基因組。第104欄提供捕捉探針深度，亦稱為探針填充摺疊。此等數字表示覆蓋任何既定位置之探針數目。對於體染色體，捕捉探針提供平均5x平鋪。對於病毒目標，捕捉探針提供平均200x平鋪。因此，與體染色體相比，每個單元長度用於病毒之探針數目為較高百分比/比例。這類較高程度之用於病毒目標之捕捉探針濃度可幫助最大化捕捉病毒DNA之機率。 III. 各種病狀之血漿EBV DNA之甲基化程度
吾人分析各種EBV相關疾病/病狀(例如NPC、感染性單核白血球增多症、霍奇金氏淋巴瘤、NK-T細胞淋巴瘤)患者及具有可偵測之血漿EBV DNA之表觀健康個體中血漿EBV DNA分子之甲基化模式。自關於NPC篩選而募集之個體群組檢索具有可偵測之血漿EBV DNA之此等表觀健康個體且分為2個組。第一組包括在初始測試中具有可偵測之血漿EBV DNA含量，但在後續測試中具有不可偵測之含量的個體，且表示為『暫時性陽性』。第二組包括在初始及後續測試中皆具有可偵測之血漿EBV DNA含量之個體且表示為『持續性陽性』。
使用藉由特定設計之捕捉探針，用捕捉富集物進行之靶向亞硫酸氫鹽定序。對於所分析之每個血漿樣本，使用QIAamp DSP DNA血液微型套組自4 mL血漿提取DNA。對於每個樣品，所有提取之DNA用於使用KAPA文庫製備套組(Roche)或TruSeq DNA無PCR文庫製備套組(Illumina)製備定序文庫。銜接子接合DNA產物經歷兩輪使用EpiTect Bisulfite套組(Qiagen)進行之亞硫酸氫鹽處理。使用KAPA HiFi HotStartUracil+ReadyMix PCR套組(Roche)對經亞硫酸氫鹽轉化之樣本進行十二至十五個PCR擴增循環。第一PCR擴增可增加用於目標捕捉之DNA之數量。可建議用於目標捕捉反應之DNA之輸入量。來自血漿(未擴增)之DNA輸入量可能不足以用於目標捕捉。
接著，使用覆蓋上述病毒及人類基因組區域之經定製設計之探針，用SeqCap-Epi系統(Nimblegen)捕捉擴增產物(圖1)。捕捉步驟中可存在顯著『DNA損失』。在目標捕捉反應之後的DNA之量可能小於定序所需的量。因此，第二擴增階段(例如使用PCR)可擴增DNA量以用於後續定序步驟。因此，在一些實施例中，在目標捕捉之後，藉由14個PCR循環富集捕捉產物以產生DNA文庫。用NextSeq平台(Illumina)對DNA文庫進行定序。對於每次定序操作，使用雙端模式對具有獨特樣本條形碼之四至六個樣本進行定序。由各DNA片段，自兩個端中之每一者對75個核苷酸進行定序，但可對其他數目之核苷酸進行定序。 A. 不同EBV相關病狀中血漿EBV DNA之甲基化概況
圖2展示根據本發明之實施例，感染性單核白血球增多症、NPC及NK-T細胞淋巴瘤患者中跨越EBV基因組之CpG位點之甲基化密度。經由血漿EBV DNA片段之靶向捕捉亞硫酸氫鹽定序來產生EBV DNA之甲基化概況。橫軸提供EBV參考基因組中之基因組座標。縱軸提供單一CpG位點解析處之甲基化密度。
由上文所描述之方程式獲得跨越EBV基因組之CpG位點之甲基化密度：。 吾人可觀測不同個體中血漿EBV DNA之甲基化密度之不同模式。可在整體或基因座特異性層面上分析DNA甲基化概況之此等差異。舉例而言，在整體層面上，吾人在感染性單核白血球增多症患者(TBR1610)(甲基化密度為57.3%)中觀測到與兩名NPC患者(TBR1392及TBR1416)(甲基化密度為83.8%及81.3%)相比整體更低的甲基化程度。整體甲基化程度使用跨越基因組之位點之甲基化量測以測定單一值。
亦在相對宏觀層面上，與兩名NPC患者(TBR1392及TBR1416)相比，具有NK-T細胞淋巴瘤之患者(TBR1629)在跨越EBV基因組之甲基化程度上呈現更大的非均質性，例如在基因組座標50000至100000之間。非均質性在甲基化密度曲線中展示為突降。NPC患者具有相對均勻密度。而淋巴瘤病患展示許多微小谷線，其中密度顯著降低，藉此產生梳狀結構。
亦可在基因座特異性或區域特異性層面上分析DNA甲基化之模式。此等基因座可具有任何尺寸及至少1個CpG位點。此等基因座可與或可不與任何標註之病毒基因相關聯。跨越患有相同病狀之不同個體，此類區域特異性甲基化程度可具有類似值，但相對於患有不同病狀之其他個體具有不同值。
在圖2中，吾人定義4個基因組區域，亦即區域201 (7,000-13,000)、區域202 (138,000-139,000)、區域203 (143,000-145,000)及區域204 (169,000-170,000)。與感染性單核白血球增多症(TBR 1610)之情況相比，兩個NPC病例(TBR 1392及TBR 1416)中之區域201及204中之區域特異性甲基化密度較高。相反，與感染性單核白血球增多症之情況相比，兩個NPC病例中之區域203中之區域特異性甲基化密度降低。與其他NPC病例及感染性單核白血球增多症相比，區域203中之區域特異性DNA甲基化密度在NK-T細胞淋巴瘤(TBR 1629)之情況下最高。此類結果說明在患有不同EBV相關病狀之患者中，在整體及基因座特異性層面上，存在血漿EBV DNA片段之甲基化概況之不同模式。
因此，區域201中之低甲基化程度可指示個體患有感染性單核白血球增多症。區域204中之高甲基化程度可指示個體具有NPC。並且，區域203中之高甲基化程度可指示個體具有NK-T細胞淋巴瘤。可基於圖2中展示之類型之量測值測定各區域之定義高或低(或中間範圍)之臨限值之特異性值。可藉由分析患有不同病狀之個體之甲基化概況及選擇對不同病狀具有不同甲基化密度之區域來選擇此類區域。此外，可組合來自多個區域之量測值，例如經由叢集技術或決策樹。 B. 早期NPC
圖3展示來自吾人之篩選群組之具有早期NPC (I期)患者(AL 038)而低血漿EBV DNA濃度(8個複本/毫升血漿，如藉由定量PCR所量測)之血漿EBV DNA之甲基化概況。自初始血液樣本提取血漿DNA。在4週後再測試具有陽性初始(基線)測試之個體，且視為後續測試。此患者在血液取樣時不具有NPC症狀且在兩階段分析下，經由使用血漿EBV DNA之實時PCR分析之篩選偵測到癌症。使用鼻內窺鏡檢查及MRI進一步確認藉由實時PCR發現具有持續性陽性血漿EBV DNA之個體。
圖3展示信號之雜訊更多，例如一些位點具有100%甲基化密度且一些位點具有極低甲基化密度，諸如零。為了移除此類雜訊性質，實施例可使用區域甲基化程度，其係在窗口內之位點處使用所有序列讀數之組合甲基化密度量測。舉例而言，可使用200 bp窗口，其可降低雜訊且提供更光滑之資料。因此，甚至在樣本中之低EBV DNA序列濃度下，可量測甲基化程度且用於區分不同病狀。展示此類區分病狀能力之更多資料提供於下文中。
在此患者中，與具有晚期NPC及高血漿EBV DNA血漿濃度之其他兩名患者(TBR1392及TBR1416)相比，所捕捉之血漿EBV DNA片段之量相對較低。如上文所提及，此說明其中甲基化程度仍可用於鑑別特定病狀(在此情況下，NPC)之情況，即使EPV濃度較低。此外，可使用血漿EBV之量作為測定疾病程度(例如癌症程度)之一部分。 C. 患者中甲基化概況之差異值
甲基化概況之差異可提供具有NPC及感染性單核白血球增多症之患者之間的比較。如早先圖2中所示，在具有不同EBV相關病狀之患者中存在血漿EBV DNA之不同甲基化模式。吾人藉由比較跨越此等不同患者之間的EBV基因組之CpG位點之甲基化密度來分析甲基化模式中之差異。 1. 不同病狀
圖4展示根據本發明之實施例之患有不同病狀的兩位患者之間跨越EBV基因組之CpG位點之甲基化密度之差異。橫軸為EBV基因組中之基因組座標。縱軸展示兩個患者之間的甲基化之每個位點之差異。NPC (TBR1392)與感染性單核白血球增多症(TBR1610)之間的中值甲基化差異為23.9% (IQR (四分位數範圍)：14.8-39.3%)，表明與感染性單核白血球增多症相比，在NPC中跨越EBV基因組中之CpG位點之NPC甲基化程度較高。在NPC (TBR1416)與感染性單核白血球增多症(TBR1610)之間的另一比較中觀測到類似模式之甲基化差異(中值：22.9%；IQR：13.3-37.8%)。
上部圖式展示NPC患者(TBR1392)與感染性單核白血球增多症患者(TBR1610)之間的甲基化密度差異。一個CpG位點處之正值指示在該特定位點處，與病例TBR1610相比，病例TBR1392中之甲基化密度較高。負值指示在該CpG位點處，與病例TBR1610相比，病例TBR1392中之甲基化密度較低。
下部圖式展示另一名NPC患者(TBR1416)與同一名感染性單核白血球增多症患者(TBR1610)之間的甲基化密度差異。此圖式說明不同EBV相關病狀中血漿EBV DNA之甲基化模式之分析及比較之一個實例。
一般而言，NPC患者具有較高甲基化，且甲基化差異具有顯著值。此類差異值可以各種方式定量，例如藉由求和以獲得整體差異值。此整體差異值可充當兩名個體之間的距離，如可用於叢集中，其中各甲基化值(例如作為每個位點之指數或每個區域之程度)為多維資料點中之一個資料點。 2. 相同病狀
圖5展示根據本發明之實施例，具有相同NPC診斷之兩名患者(TBR1392及TBR1416)之間的跨越EBV基因組之CpG位點之甲基化密度差異。一般而言，與患有兩種不同疾病之患者之前述分析(圖4)相比，跨越EBV基因組之甲基化密度中存在較小差異。兩名NPC個體(TBR1392對TBR1416)之間的中值甲基化差異為0.3% (IQR：-1.2 - 2.5%)。此表明具有相同EBV相關疾病診斷之患者將具有類似的血漿EBV DNA之甲基化模式。甲基化密度差異對一些對特定病例具有特異性之疾病特徵可能有意義，且提供額外的診斷或預後資訊。 3. NPC及假陽性
圖6展示根據本發明之實施例之患有早期NPC之患者(AO050)與具有血漿EBV DNA假陽性結果之個體(HB002)之間的血漿EBV DNA之甲基化模式之差異。此比較展示早期NPC患者與未患有NPC，但在連續測試中血漿EBV DNA呈持續性陽性之個體之間的血漿EBV DNA之甲基化模式。其皆來自吾人之篩選群組。在募集時自其初始血液樣本提取血漿DNA。
如圖6中所示，早期NPC患者(AO050)與具有血漿EBV DNA之假陽性結果之個體(HB002)之間存在血漿EBV DNA之甲基化模式差異。然而，在NPC個體與IM個體之間，差異之數目及大小小於圖4之曲線。因此，NPC個體與假陽性個體之間的差異之事實表明提高癌症篩選之精確性之能力。並且，與IM個體相比，差異具有不同等級之事實表明任何區分患有三種病狀中之任一者之個體之能力。依據此觀測結果，吾人研究診斷效用以使用血漿EBV DNA甲基化模式區分兩個組(具有早期NPC及假陽性結果之個體)，其資料提供於後續章節中。 D. 類似及不同患者之甲基化密度之間的相關性
除分析不同位點處甲基化密度之間的差異值以外，可共同標繪甲基化密度以鑑別相關性或不存在相關性。舉例而言，二維圖中之各資料點可包括同一位點處來自兩名個體之兩個甲基化密度。若甲基化密度相關(例如兩名個體具有相同病狀)，則曲線將呈現線性性質。若甲基化密度不相關(例如兩名個體具有相同病狀)，則曲線將不呈現線性性質。
圖7A-7C說明兩個臨床病例之間的血漿EBV DNA之甲基化概況之差異。在圖7A-7C中，三個圖中之各資料點表示一名患者中跨越EBV基因組之CpG位點之甲基化密度(x軸上)及其他患者中相同CpG位點之相應甲基化密度(y軸上)。
圖7A及7B展示患有不同疾病之兩名患者(一名NPC及一名感染性單核白血球增多症)之間的甲基化密度。如可發現，甲基化密度不相關。NPC個體持續具有無法由IM個體匹配之高甲基化密度(例如超過80%)，藉此引起沿頂部之水平帶。此類性質指示兩名個體不同，例如不同病狀。不同病狀可包括一名患有疾病且另一名無疾病。
圖7C展示兩名不同的NPC患者之間的甲基化密度。在圖7C中，吾人可觀測對角線趨勢線(斜率約等於1)，表明在兩名不同的NPC患者之間，各CpG位點之甲基化密度類似。未在圖7A及7B中觀測到此圖形模式。此等結果再次表明患有不同EBV相關疾病之患者具有不同的血漿EBV DNA片段之甲基化概況。實施例可使用位點(或位點之區域)之此類不同甲基化特性以鑑別在不同病狀之間具有不同甲基化密度之位點/區域，及使用此等位點/區域測定甲基化程度以用於區分病狀。 IV. 使用血漿EBV DNA之甲基化模式區分EBV相關病狀
對於不同EBV相關病狀中血漿EBV DNA之甲基化概況之系統比較，在各情況下，吾人使用『甲基化百分比』(一種類型之『甲基化密度』之一個實例)。可使用以下方程式獲得血漿EBV DNA片段之甲基化百分比：其中M '為一或多個CpG位點處甲基化讀數之計數且U '為未甲基化之讀數之計數，其可經預先選擇。可基於由吾人之捕捉探針覆蓋之EBV基因組內的所有CpG位點或一些CpG位點計算甲基化百分比。亦可使用甲基化程度之其他實例。 A. 基因組譜聚集之甲基化程度
作為一個實例，可測定跨越EBV基因組之單一甲基化程度。特異性CpG位點集合處之甲基化EBV DNA分子之聚集物數目可用於測定甲基化百分比作為基因組譜甲基化程度，其中藉由所量測之量(包括其他DNA分子，例如體積之量測、對應於其他DNA分子之強度或其他DNA分子之計數)進行正規化。在一個實施例中，吾人基於由吾人之捕捉探針覆蓋之EBV基因組內的CpG位點計算血漿EBV DNA分子之甲基化百分比。
圖8展示根據本發明之實施例，基於患有感染性單核白血球增多症(IM)(患者數目n=2)、EBV相關淋巴瘤(n=3)、暫時性陽性血漿EBV DNA(n=3)、持續性陽性血漿EBV DNA (n=3)及NPC (n=6)之個體中覆蓋之所有CpG位點的血漿EBV DNA之甲基化百分比。圖8展示五種不同病狀之箱線圖(box and whisker plots)。如可發現，所有中值充分分離得以區分不同病狀。舉例而言，可在對EBV呈持續性陽性之患者與患有NPC之患者之間鑑別約79%之參考程度。
總體而言，吾人可經由血漿EBV DNA之基因組譜聚集甲基化百分比之分析(p 值 =8.52e-05，單向ANOVA測試)區分不同EBV相關疾病/病狀。六名NPC患者中之四名係來自篩選群組且患有早期NPC (I或II期)。因此，甚至可自未患有病狀之個體(例如甚至持續性陽性個體)辨別出病狀之早期階段。可使用不同參考程度來區分不同病狀，例如低於約57%可用於鑑別IM且在57%與63%之間可用於鑑別暫時性陽性個體。在一些實施例中，對於既定甲基化程度，可鑑別較大病狀集合中之超過一種病狀(例如可在57%至63%範圍內鑑別淋巴瘤及暫時性陽性)。在此類情形中，可對病狀中之每一者指定機率。舉例而言，可比較所測試之個體之甲基化與兩組參考個體，一組患有病狀A (例如淋巴瘤)且另一組患有病狀B (例如感染性單核白血球增多症)。可測定來自兩組參考個體之平均值之標準差之數值。依據標準差之數值，可計算患有兩種病狀之機率。此等機率可用於測定患有此等兩種病狀之相對可能性。
所選擇之特定參考值可取決於用於測定甲基化程度之指定方式。舉例而言，若甲基化DNA分子之數目M (例如使用許多讀數或強度測定)除以未甲基化之DNA分子之數目U (例如使用許多讀數或強度測定)，例如M/U，則甲基化百分比將具有不同參考水準。其他比例因子或累加因子將改變特定參考值。只要以與參考樣本之甲基化程度相同之方式測定當前樣本之甲基化程度，則所選擇之參考水準將為適用的。參考程度亦可取決於所選擇之用於量測甲基化程度之位點，如後續結果中所示。
使用甲基化程度區分不同病狀之能力可取決於在位點處偵測之DNA分子之數目，但本文中呈現之結果表明DNA分子之數目可相對較低。舉例而言，在圖8中，在不同個體中分析之血漿EBV DNA分子之第5個百分點為44，其中最小值為26。在各種實施例中，不含細胞之病毒DNA分子之數目可包括至少10個不含細胞之DNA分子，例如20、30、40、50、100或500個。在其他實施例中，關於個體及特定病毒基因組所分析之不含細胞之DNA分子之總數目可為至少1,000個不含細胞之DNA分子或更多(例如至少10,000個、至少100,000個或至少1,000,000個)。 B. 差異甲基化區域(DMR)
除了使用由捕捉探針覆蓋之所有位點，可僅使用某些位點。此等位點可藉由分析所有位點且接著選擇一個具有某一特性(例如在某些病狀中具有不同甲基化程度)之位點來測定。可藉由區域個別地或共同地分析位點，例如可將超過一個位點分配至一個區域且測定該區域之甲基化程度。藉由跨越病毒基因組，位點及區域可為基因組譜，例如不限於僅一個位點/區域。舉例而言，每1 kb、2 kb、5 kb或10 kb可使用至少一個位點/區域。
因此，一些實施例可基於差異甲基化區域(DMR)內之CpG位點計算甲基化百分比。吾人早先已證實不同EBV相關疾病中之血漿EBV DNA之甲基化模式不同。因此，應存在其中不同疾病/病狀之間的甲基化含量不同的DMR。除使用個別位點以外，可使用不同尺寸之非重疊窗口。舉例而言，非重疊區域之尺寸可設定為(但不限於)50 bp、100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、800 bp及1000 bp。在另一實例中，可分別分析各CpG位點，例如不使用區域組合位點。
可選擇DMR以在患有不同病狀之個體中具有特定甲基化程度。舉例而言，若區域內CpG位點之甲基化百分比在疾病/病狀之一或多個病例中小於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%且在另一種疾病/病狀之一種情況下超過10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，則可定義DMR。在另一實施例中，每種疾病可使用超過一個病例定義DMR。並且，可使用超過兩種疾病/病狀之截止準則，例如每種病狀之甲基化程度之不同範圍。 1. 使用IM＜50%及NPC＞80%之DMR
為了說明此類DMR之研究，吾人隨機選擇一名患有感染性單核白血球增多症之患者(TBR1610)及一名NPC患者(TBR1392)。此處，吾人首先設定跨越EBV基因組之尺寸為500個鹼基對(bp)之非重疊窗口，例如位置1-500、501-1000等之分組。在500-bp區域內，吾人計算IM (TBR1610)及NPC (TBR1392)患者中之區域內所有CpG位點之平均甲基化百分比。在此實例中，若區域內所有CpG位點之平均甲基化百分比在感染性單核白血球增多症(TBR1610)之情況下小於50%且在NPC (TBR1392)之情況下超過80%，則500-bp區域將滿足DMR之第一選擇準則。
圖9說明根據本發明之實施例之滿足第一選擇標準之差異甲基化區域(DMR)之研究。圖9對應於圖7A中展示之兩個病例。圖9中之各資料點表示IM個體中跨越EBV基因組之500-bp區域之甲基化百分比(x軸上)及NPC個體中相同500-bp區域之相應甲基化百分比(y軸上)。藉由上文所定義之此第一選擇準則，吾人鑑別總共39例DMR，其包含821個CpG位點(佔EBV基因組內約10%的全部CpG位點由吾人之探針捕捉)。此等39例DMR為圖9之左上角內之DMR。
在圖9中，NPC個體之甲基化百分比展示於縱軸上，且IM個體之甲基化百分比展示於橫軸上。垂直線901展示在IM之情況下，甲基化百分比之50%之截止值。水平線902展示在NPC之情況下之80%之截止值。因此，對於此實例，左上部分之區域(通常標記為910)對應於DMR。
圖10為列舉滿足圖9中描述之準則之39個差異甲基化區域之基因組座標之表格。第1001欄列舉病毒基因組，在此實例中其為EBV。第1002欄提供參考EBV基因組中之起始基因組座標。第1003欄提供參考EBV基因組中之末端基因組座標。第1004欄為IM個體及NPC個體中之甲基化密度。
接著，此等DMR可用於測定其他個體中之甲基化程度。在一個實施例中，使用覆蓋此DMR集合中之一者中之位點的各序列讀數之甲基化狀態測定對應於該DMR集合之甲基化百分比。可以與圖8類似之方式測定此甲基化百分比，但使用序列讀數之子集，亦即對應於DMR集合中之位點之序列讀數。在其他實施例中，可測定DMR中之每一者之個別甲基化程度。個體之甲基化程度可形成多維資料點，例如其中叢集技術或參考平面(多維空間中之超平面)可分離具有不同病狀或病狀之不同類別/程度之個體。可使用用於區分此等病狀之其他分析方法，例如(但不限於)樸素貝葉斯(Naïve Bayes)、隨機森林(random forest)、決策樹、支持向量機、k最近相鄰法、K均值叢集、高斯混合物模式(Gaussian mixture model；GMM)、基於密度之空間叢集、層級集群、羅吉斯回歸分類器(logistic regression classifiers)及其他受監督及不受監督之分類或回歸方法。
圖11展示根據本發明之實施例，患有感染性單核白血球增多症(IM)(n=2)、EBV相關淋巴瘤(n=3)、暫時性陽性血漿EBV DNA (n=3)、持續性陽性血漿EBV DNA (n=3)及NPC (n=6)之相同個體組中，如上文(圖8)所定義之39個DMR內基於821個CpG位點之血漿EBV DNA之甲基化百分比。此等為圖8中使用之相同個體。使用對應(例如比對)於39個DMR之集合中之821個位點的序列讀數，以單一值形式測定甲基化百分比。
圖11展示五種不同病狀之箱線圖。如可發現，可在不同病狀之間鑑別中值。舉例而言，以約75%之參考程度可鑑別在對EBV呈持續性陽性之患者與患有NPC之患者。吾人可觀測到不同組中甲基化百分比之統計顯著差異(p 值 =1.83e-05，單向ANOVA測試)，其優於圖8。
圖11與圖8具有一些差異。舉例而言，IM及NPC之值之散佈度較小，其由在此等個體之特定範圍中特異性選擇之DMR引起。此類結果表明，指示不同病狀之不同甲基化程度範圍之準則可提供選擇性更高的用於區分個體之不同類別之技術。此外，NPC個體與持續性陽性個體之間的差異大於圖8。 2. 使用IM＜80%及NPC＞90%之DMR
如同前述章節，吾人進行關於使用基於有差別的甲基化區域之甲基化百分比區分患有早期NPC之患者與具有可偵測之血漿EBV DNA之非NPC個體之分析。所分析之所有NPC患者及非NPC個體係經由前瞻性篩選群組(Chan等人 N Engl J Med 2017; 377:513-522)鑑別。為了研究DMR，吾人隨機選擇兩名NPC患者(TBR1416及FD089)及一名感染性單核白血球增多症患者(TBR1748)。在另一實施例中，其他EBV相關疾病或病狀，包括具有可偵測之血漿EBV DNA之非EBV個體，可用於DMR之研究。吾人設定跨越EBV基因組之尺寸為500個鹼基對(bp)之非重疊窗口。
圖12說明根據本發明之實施例之滿足第二選擇準則之差異甲基化區域(DMR)之研究。與前述章節相比，每種疾病(此分析中，NPC)包括超過一個病例以用於DMR之研究。第二選擇準則對應於：(1)尺寸為500 bp之非重疊、相鄰窗口及(2)區域內CpG位點之甲基化百分比在所選擇之感染性單核白血球增多症病例(TBR1748)中小於80%且在鼻咽癌之兩個病例(TBR1416及FD089)中超過90%。圖12中之各資料點表示IM個體中跨越EBV基因組之500-bp區域內所有CpG位點之平均甲基化百分比(x軸上)及兩名NPC個體中相同區域之相應平均甲基化百分比(y軸上)。
在圖12中，NPC個體之甲基化百分比展示於縱軸上，且IM個體之甲基化百分比展示於橫軸上。垂直線1201展示在IM之情況下，甲基化百分比之80%之截止值。水平線902展示在NPC之情況下之90%之截止值。藉由上文所定義之此第二選擇準則，吾人鑑別總共46例DMR，其包含1,520個CpG位點(EBV基因組內約20%的全部CpG位點由吾人之探針捕捉)。左上部分(通常標記為區域1210)中展示46例DMR。
圖13展示根據本發明之實施例之具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體、具有持久性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體及NPC患者中基於圖12中定義之46個DMR之血漿EBV DNA之甲基化百分比。各資料點對應於不同個體。如上文所描述測定暫時性陽性及持續性陽性之類別，亦即基於兩次自樣本獲得之EBV DNA讀數之數值。
吾人靶向亞硫酸氫鹽定序來分析117名具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體、39名具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體及30名NPC患者。所有非NPC個體及NPC患者係自前瞻性篩選群組募集。吾人依據如上文(圖12)所定義之DMR在三個組中比較血漿EBV DNA之甲基化百分比。使用對應(例如比對)於46例DMR之集合中之1,520個位點之序列讀數，以單一值形式測定甲基化百分比。
在一個實施例中，可針對各種DMR指定不同權重以用於計算累計甲基化百分比。此類加權可以各種方式實施，例如位點處各甲基化序列讀數之比例因子(例如當區域具有較高權重時，乘以超過1之因子)，或比例因子可應用於區域甲基化百分比，藉此提供區域甲基化百分比之加權平均值。在此實例中，吾人對所有所定義之DMR應用相同權重。
NPC組之基於46例DMR之血漿EBV DNA之平均甲基化百分比(平均值=88.3%)顯著高於具有暫時性陽性(平均值=65.3%)及持續性陽性(平均值=71.1%)血漿EBV DNA之另外兩個非NPC組之平均甲基化百分比(p＜0.0001，克拉斯卡-瓦立斯測試(Kruskal-Wallis test))。因此，基於血漿EBV DNA之甲基化概況之差異(例如由基於DMR之血漿EBV DNA之甲基化百分比表示)，可區分NPC患者與具有可偵測之血漿EBV DNA (暫時性或持續性陽性)之非NPC個體。
在此實例中且在本文中所描述之其他實施例中，可以各種方式測定用於區分類別之參考程度。在一個實施例中，用於區分患有NPC與未患有NPC之個體之截止值(參考程度)可為所分析之NPC患者(訓練集合)中之EBV DNA甲基化百分比之最低值。在其他實施例中，可測定截止值，例如以NPC患者之平均EBV DNA甲基化百分比減一個標準差(SD)、平均值減兩個SD、平均值減三個SD形式。在其他實施例中，截止值可使用接受者操作特徵(ROC)曲線或藉由非參數方法來確定，例如(但不限於)包括100%、95%、90%、85%、80%之所分析之NPC患者。
在當前實例中，對於NPC偵測，可設定甲基化百分比之80%之截止值以獲得超過95%之靈敏度。使用此80%之截止值，30名NPC患者中之29名、119名具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體中之16名及39名具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體中之6名之血漿EBV DNA之甲基化百分比(藉由靶向亞硫酸氫鹽定序在46例既定DMR內測定)高於截止值(80%)。所計算之靈敏度、特異性及陽性預測值分別為96.7%、85.9%及58.5%。 C. 相同病狀之代表性甲基化保守區域
在以下實例中，吾人旨在鑑別跨越具有相同病狀之個體具有類似甲基化密度之區域。吾人將此類區域定義為病狀之代表性甲基化保守區域。在一些實施中，此類準則亦可與病狀中不同甲基化之準則組合。
為了說明『代表性』甲基化保守區域之鑑別，吾人隨機選擇兩名NPC患者(TBR1392及TBR1416)。此處，吾人將EBV基因組劃分為500 bp之非重疊區域。在其他實施例中，可設定重疊區域之不同尺寸。舉例而言，重疊區域之尺寸可設定為50 bp、100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、600 bp、800 bp及1000 bp。在500-bp區域內，吾人計算兩名NPC患者(TBR1392及TBR1416)中之區域內所有CpG位點之平均甲基化百分比。
圖14說明根據本發明之實施例之滿足第三選擇準則之代表性甲基化保守區域之研究。第三選擇準則對應於：(1)尺寸為500 bp之非重疊、相鄰窗口，(2)兩個NPC病例之間的區域之整體甲基化密度之差異小於1%，及(3)兩個病例之區域之整體甲基化密度超過80%。
在其他實施例中，若在兩個NPC病例之間，兩名NPC患者之間的甲基化百分比之差異小於2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%且甲基化百分比超過10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或90%，則可定義『代表性』甲基化保守區域。每種疾病可使用超過兩名個體定義『代表性』甲基化保守區域，例如每名個體之甲基化百分比在指定相似性截止值(例如1%)內且在指定甲基化百分比範圍(例如超過80%)內。
圖14中之各資料點表示NPC個體中跨越EBV基因組之500-bp區域之甲基化百分比(x軸上)及其他NPC個體中相同區域之相應甲基化百分比(y軸上)。藉由如上文所定義之選擇準則，吾人鑑別79個區域。此等79個DMR可見於圖14中之區域1410中。
在圖14中，第一NPC個體之甲基化百分比展示於縱軸上，且第二NPC個體之甲基化百分比展示於橫軸上。垂直線1401展示在IM之情況下，甲基化百分比之80%之截止值。水平線1402展示在NPC之情況下之80%之截止值。因此，對於此實例，右上部分之區域(通常標記為1410)對應於DMR。
圖15展示根據本發明之實施例，患有感染性單核白血球增多症(IM)(n=2)、EBV相關淋巴瘤(n=3)、暫時性陽性血漿EBV DNA (n=3)、持續性陽性血漿EBV DNA (n=3)及NPC (n=6)之相同個體組中，基於如上文(圖12)所定義之『代表性』甲基化保守區域之血漿EBV DNA之甲基化密度。吾人可觀測各組中之甲基化百分比之統計顯著差異(p值=0.00371，單向ANOVA測試)。依據此等資料，吾人可藉由分析代表性甲基化保守區域之血漿DNA之甲基化密度來測定測試樣本之狀態。舉例而言，90%之甲基化密度將指示樣本係自NPC患者收集，而80%之甲基化密度表明樣本係來自具有EBV陽性淋巴瘤之患者。 D. 單一CpG位點分析
除基於一組位點(例如以上章節中所描述)計算聚集物甲基化程度以外，實施例可基於EBV基因組內之個別CpG位點計算甲基化百分比。為了鑑別在不同EBV相關疾病中具有不同甲基化程度之個別CpG位點，吾人集合具有持續性陽性EBV DNA，但無NPC之3名個體之血漿DNA讀數之定序資料，得到7x之定序深度。接著，吾人比較3名具有持續性陽性EBV DNA之個體之所集合的定序資料與3名NPC患者(AO050、TBR1392及TBR1416)的定序資料之間的所有CpG位點之甲基化百分比。定序資料之集合意謂如同所有序列讀數係來自同一名個體測定甲基化百分比。
在各種實施例中，若CpG位點之甲基化百分比在疾病之一個病例(個體)中小於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%且在另一種疾病之一個病例中超過10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，則可定義具有不同甲基化程度之此等個別CpG位點。對於每種疾病，準則可應用於超過一個病例以定義DMR，例如上文關於使用區域之實例所描述，如可在不同病狀之不同範圍內進行以及具有不同(超過)或相同病狀(臨限值內)之個體之間的特異性分離。
附錄A展示當所收集之具有持續性陽性EBV DNA之3名個體及3名NPC患者之定序資料之間的此等CpG位點之甲基化百分比差異超過20%時，具有不同甲基化程度之跨越EBV基因組之個別CpG位點之列表。此等用*標記之位點具有超過40%之差異，**具有超過60%之差異且***具有超過80%之差異。在其他實施例中，可藉由大於20%、30%、50%、70%或90%之甲基化百分比差異定義具有不同甲基化程度之CpG位點。現分析具有超過60%之差異之一些實例位點。
圖16展示根據本發明之實施例之CpG位點之實例，其中在所集合之具有持續性陽性血漿EBV DNA之3種情況之定序資料中，各位點處之甲基化百分比超過80%，且在3名NPC個體中之平均值小於20%。亦包括兩名感染性單核白血球增多症患者之此等位點處之甲基化百分比。甲基化百分比提供於縱軸上，且橫軸列舉滿足準則之8個單獨位點。位點用連續編號標記。
如可發現，所有位點提供非NPC個體(包括持續性陽性及IM)及兩名NPC個體(TBR1416及TBR1392)之間的良好分離。對於NPC個體AO050，位點1-4、7及8提供良好分離，但位點5及6未提供良好分離。因此，經測定區分兩種病狀之個別差異甲基化位點(例如不僅作為區域)亦可用於區分一種病狀(NPC)與兩種或更多種病狀。
圖17展示根據本發明之實施例之CpG位點之實例，其中在所集合之具有持續性陽性血漿EBV DNA之3個個體之定序資料中，各位點處之甲基化百分比小於20%，且在3名NPC個體中超過80%。亦展示兩名感染性單核白血球增多症患者之此等位點處之甲基化百分比。此準則與用於圖16之準則相反。甲基化百分比提供於縱軸上，且橫軸列舉滿足準則之22個單獨位點。位點用連續編號標記。
如可發現，所有位點提供非NPC個體(包括持續性陽性及IM)與NPC個體之間的良好分離。此證實個別位點可用於區分類別。並且，與在指定長度之同一個相鄰區域內不同，位點可選自整個病毒基因組。可選擇更多的位點以提供更大的統計精確性，例如使得可偵測更多的EBV DNA片段。
在一個實施例中，在指定的彼此距離內選擇具有不同甲基化程度(例如附錄A以及圖16及17中定義)之多個CpG位點。以此方式，個別病毒DNA片段可各自覆蓋多個位點。舉例而言，指定距離可為150 bp，因為此約為血漿DNA分子之代表性尺寸。在此類情形中，藉由PCR擴增進行具有多個不同甲基化CpG位點之特定區域之靶向擴增將為可能的。與使用全基因組分析方法相比，此靶向分析將具有較低成本。
因此，在各種實施例中，甲基化模式之分析可基於完全病毒基因組之基因組區域或個別CpG位點。在此類區域分析中，病毒基因組可基於基因組座標分成不同區域，其中各區域包括此類區域內之所有CpG位點。或者，可首先選擇不同甲基化CpG位點且接著在區域內合併以形成DMR。在另一實例中，在無資訊性位點之先前選擇情況下，區域之甲基化密度之計算中可包括所有CpG位點。 E. 層級集群分析
一些實施例可使用除甲基化程度以外的方法區分類別。在一個實例中，可使用叢集技術。在此類叢集技術中，可測定各個體之多個甲基化程度，例如不同區域(各自包括一或多個位點)之甲基化程度、個別位點之甲基化程度或其組合。在一些實施例中，叢集為層級性。
甲基化程度之集合可形成向量，其表示具有等同於甲基化程度之數值之長度的多維資料點。如本文中所描述，區域(分組)可具有各種尺寸。並且，集群分析可基於不同尺寸之非重疊相鄰分組。舉例而言，分組之尺寸可定義為50 bp、100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp或1000 bp。因此，集群分析可基於不同個體中不同位點/分組之甲基化程度與相應甲基化程度之比較。
圖18展示根據本發明之實施例之6名NPC患者(包括來自吾人之篩選群組之4名患有早期疾病之患者)、2名患有結外NK-T細胞淋巴瘤之患者及2名患有感染性單核白血球增多症之患者中，基於血漿EBV DNA之甲基化模式分析之具有階層式集群分析之叢集樹枝狀圖。在此實例中，層級集群分析係基於尺寸為500 bp之非重疊相鄰區域內CpG位點之甲基化百分比之比較。叢集基於不同區域之甲基化百分比之差異將不同個體分組，其中可組合差異以提供距離。
在圖18中，沿頂部橫軸展示間距。可以各甲基化密度(百分比)之間的差異總和形式測定間距，例如當不同基因座處之甲基化密度對應於表示多維點之向量時，其中間距在兩個多維點之間。兩名個體在等於其之間的間距之點處組合。當測試新患者時，使用新的甲基化百分比(或其他程度)之多維點以測定最接近的一名參考個體(例如圖18中所展示)或最接近的子組，如節點(例如節點1801或1802)處所描繪。最接近的參考個體或參考節點之鑑別可提供類別。
叢集樹枝狀圖1800展示NPC個體共同遞增集群，其中所有NPC個體在節點1803處集群成子組，其不包括患有其他病狀之個體。此展示區分NPC個體與IM個體及淋巴瘤個體之能力。類似地，將IM個體分組在一起。值得注意的是，兩名NK-T細胞淋巴瘤患者未集群在一起。患者1629具有第IV階段疾病且患者1713具有第I階段疾病。此可指示甲基化模式將跨越相同疾病之不同階段發展。此發現結果之一個潛在應用將為使用甲基化概況進行患者之分級及預測。
吾人依據經由血漿EBV DNA之甲基化模式進行之集群分析證明不同EBV相關疾病之區分之可行性。舉例而言，在鑑別某一模式之後，實施例可加入或排除一種疾病。亦可使用其他分類演算法，包括(但不限於)主組分分析、線性判別分析、羅吉斯回歸(logistic regression)、機器學習模式、k均值叢集、k最近相鄰法及隨機決策森林。
圖19展示根據本發明之實施例之6名NPC患者(包括來自吾人之篩選群組之4名早期NPC患者)及3名具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體中，基於血漿EBV DNA之甲基化模式分析之具有階層式集群分析之叢集樹枝狀圖。在募集時自其第一血液樣本提取血漿DNA。在此實例中，層級集群分析係基於尺寸為500 bp之非重疊相鄰分組內CpG位點之甲基化百分比之比較。
在圖19中，亦沿頂部橫軸展示間距。可如上文所描述測定間距。與圖18類似，可在等同於其之間的間距之點處組合兩名個體。如所示，NPC個體與其他NPC個體集群在一起，例如節點1901及1902處。叢集樹枝狀圖1900展示NPC個體遞增集群在一起，其中所有NPC個體在節點1903處集群成子組，其不包括具有其他病狀(亦即，針對此實例係持續性陽性)之個體。類似地，首先將持續性陽性個體分組在一起。此證實區分NPC個體與持續性陽性個體之能力。
因此，吾人證明可在無需連續分析情況下，依據來自第一血液樣本之血漿EBV DNA之甲基化模式分析來區分早期NPC患者與具有假陽性血漿EBV DNA結果之非NPC個體之可行性。亦即，與需要在不同時間進行多次量測不同，藉由單一量測即可精確分類。此舉在確認目的之連續血液測試及其他研究之後勤配置上將有節省醫學成本的潛力。
圖20展示熱圖2000，其說明在患有鼻咽癌、NK-T細胞淋巴瘤及感染性單核白血球增多症之患者中，完整EBV基因組中之所有非重疊500-bp區域之甲基化程度。以該窗口內所有CpG位點(未選擇)之甲基化密度之平均值計算為各窗口之甲基化程度。吾人分析5名NPC患者、3名NK-T細胞淋巴瘤患者及3名感染性單核白血球增多症患者之血漿EBV DNA之甲基化模式。在當前實例中，在所有500-bp非重疊窗口內經由甲基化百分比分析甲基化模式。彩色基調/直方圖2050展示不同甲基化百分比之不同顏色，其中白色為約零，黃色(淺灰色)為低(例如約20%)，橙色(中等灰色)為中等(例如約50%)且紅色(深灰色)為高(例如約80%及更高)。彩色基調/直方圖2050亦展示具有特定甲基化程度之區域數目之直方圖。
熱圖2000展示所有病例中，EBV基因組上跨越所有非重疊500-bp窗口之甲基化程度。每一列表示一個500-bp區域且顏色表示其甲基化程度。每一欄表示一個病例。叢集樹枝狀圖2010展示不同病例之叢集。具有相同診斷之不同病例集群在一起。舉例而言，NPC病例皆集群在右側且呈現高甲基化程度，如由深紅色(深灰色)證明。淋巴瘤個體在中間集群且具有黃色(淺灰色)(低甲基化程度)與紅(深灰色)(高甲基化程度)之間的混合色。感染性單核白血球增多症樣本之叢集展示在左側且呈現相對低甲基化程度，如由淺黃色(淺灰色)證明。
圖20證明經由血漿EBV DNA之甲基化模式分析預測EBV相關疾病之可行性。此外，與跨越EBV基因組之所有區域相反，使用DMR發現更大的精確性。
在其他實施例中，可經由跨越EBV基因組之所有CpG位點之甲基化百分比獲得甲基化模式(如基因組譜分析)，例如在每個位點鹼基上。在另一實施例中，可針對任何個別CpG位點及/或DMR指定不同權重以用於預測EBV相關疾病或病狀。此類加權可以各種方式實施，如上文所描述，例如向中間甲基化程度施用比例因子(權重)以獲得區域或基因組譜之加權平均值。此處，吾人對所分析之所有CpG位點指定相同稱重。 V. 計數及尺寸之使用
除在不含細胞之樣本中使用不含細胞之病毒DNA片段之甲基化程度區分具有不同病狀及/或病狀程度之個體以外，一些實施例可使用不含細胞之樣本中不含細胞之病毒DNA片段之尺寸。一些實施例亦可使用不含細胞之樣本中不含細胞之病毒DNA片段之數目(例如比例)。各種實施例可使用不同技術之組合，例如藉由使用每一種技術需要相同個體類別。舉例而言，以下之任何組合可用於分類：a)與EBV比對之血漿DNA片段之比例，b)血漿EBV DNA片段之尺寸概況，及c)血漿EBV DNA之甲基化概況。當組合不同技術以獲得所需診斷靈敏度及特異性時，不同臨限值可用於分類。 A. 血漿EBV DNA片段之尺寸概況分析
除血漿EBV DNA片段之甲基化分析之可行性以外，基於EBV基因組中兩個末端處最外側核苷酸之座標推論各血漿EBV DNA片段之尺寸。不含細胞之EBV DNA片段之尺寸分佈視不同病狀(亦即不同模式)而變化，藉此允許區分患有不同病狀之個體且因此區分病狀程度。此等不同尺寸模式可以各種尺寸度量值定量，例如一個尺寸(例如第一尺寸範圍)處病毒DNA的量與另一尺寸(例如第二尺寸範圍)處病毒DNA的量之尺寸比率。舉例而言，尺寸比率可用於比較某一尺寸範圍(例如在80與110個鹼基對之間)內血漿EBV DNA讀數之比例，該尺寸範圍針對患有不同病狀之個體中相同尺寸範圍內體染色體DNA片段之量正規化。
圖21展示根據本發明之實施例之2名NPC患者(TBR1392及TBR1416)及2名感染性單核白血球增多症患者(TBR1610及TBR1661)以及連續分析中之3名具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體(AF091、HB002及HF020)中，映射至EBV基因組及人類基因組之經定序之血漿DNA片段之尺寸分佈之尺寸概況。曲線展示沿橫軸之尺寸(bp)及縱軸中既定尺寸處DNA之頻率(比例)。人類基因組DNA之尺寸分佈以藍色(灰色)展示，例如在尺寸分佈2104中。EBV尺寸分佈以紅色(黑色)展示，例如尺寸分佈2103。
觀測到與EBV基因組比對及與體染色體基因組比對之血漿EBV DNA片段之尺寸概況模式之差異。舉例而言，NPC個體具有在約160 bp峰值處對較小不含細胞之EBV DNA片段之偏移，其中下部末端處類似量之片段作為人類DNA，而IM個體與低於100 bp之人類DNA相比具有較大量之EBV DNA。持續性陽性個體隨尺寸增加而具有顯著向上及向下波動，以及相對於NPC個體之峰值之更顯著偏移。此等差異可用於區分患有不同病狀之個體，例如區分患有NPC之個體與具有假陽性血漿EBV DNA結果之個體。
為了比較個體中某一尺寸範圍(例如在80與110 bp之間)內血漿EBV DNA讀數之比例，可針對相同尺寸範圍內體染色體DNA片段之量正規化血漿EBV DNA片段之量。此度量為尺寸比率之實例。尺寸比率可由某一尺寸範圍內血漿EBV DNA片段之比例除以相應尺寸範圍內序列(例如來自人類體染色體之DNA片段)之參考集合之比例定義。可使用各種尺寸比率。舉例而言，在80與110個鹼基對之間的片段之尺寸比將為：
圖22展示根據本發明之實施例之6名NPC患者及3名血漿EBV DNA呈持續性陽性之個體中之尺寸比率。吾人可觀測兩組個體之尺寸比率之間的統計顯著差異(p 值=0.02，曼恩-惠特尼測試(Mann-Whitney test))。對於此特定尺寸比率，用於區分NPC個體與持續性陽性個體之實例參考尺寸值可在2-4之間(例如3)。
圖23展示根據本發明之實施例之具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體、具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體及NPC患者中之EBV DNA尺寸比率。NPC組之平均EBV DNA尺寸比率(80-110 bp)(平均值=1.9)顯著低於其他兩個具有暫時性陽性(平均值=4.3)及持續性陽性(平均值=4.8)血漿EBV DNA之非NPC組之中值尺寸比率(p＜0.0001，克拉斯卡-瓦立斯測試)。
因此，可依據血漿EBV DNA之尺寸概況之差異(例如如由EBV DNA尺寸比率表示)區分NPC患者與具有可偵測之血漿EBV DNA(暫時性或持續性陽性)之非NPC個體。在當前實例中，使用3作為截止值以獲得90%之偵測靈敏度。使用3作為截止值，30名NPC患者中之27名、117名具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體中之23名及39名具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體中之7名通過截止值且其血漿EBV DNA之尺寸比率低於截止值。所計算之靈敏度、特異性及陽性預測值分別為90%、80.8%及49.2%。
可以各種方式測定截止(參考)值之選擇。在一個實施例中，在所分析之NPC患者(例如訓練集合)中，可選擇任何高於EBV DNA尺寸比率中之最高值的值作為EBV DNA尺寸比率之截止值。在其他實施例中，可測定截止值，舉例而言，如NPC患者之平均EBV DNA尺寸比率加一個標準差(SD)、平均值加兩個SD、平均值加三個SD。在其他實施例中，截止值可使用接受者操作特徵(ROC)曲線或藉由非參數方法來確定，例如包括100%、95%、90%、85%、80%之所分析之NPC患者。
尺寸比率或尺寸分佈之其他統計值之其他定義將產生每個個體之不同值，且因此具有用於區分個體之不同參考值。舉例而言，可使用不同尺寸範圍，或染色體之子集可用於體染色體DNA片段，或完全不使用體染色體DNA。可確定核酸片段尺寸分佈之各種統計值。舉例而言，可使用尺寸分佈之平均值(average)、模式、中值或平均值(mean)。可使用其他統計值，例如既定尺寸之累積頻率或不同尺寸之核酸片段之量之各種比率。累積頻率可對應於具有既定尺寸或小於或大於給既定寸之DNA片段的比例(例如百分比)。因此，分母中之任何正規化因子(若使用一個)可用於不同尺寸範圍之EBV DNA的量。統計值提供關於DNA片段之尺寸之分佈的資訊，以用於針對健康對照個體或其他病狀之一或多個尺寸臨限值之比較。熟習此項技術者將已知如何依據本發明測定此類臨限值。尺寸比率之其他實例可見於美國專利公開案2011/0276277、2013/0237431及2016/0217251中。 B. 計數
除血漿EBV DNA之甲基化百分比之分析以外，吾人分析來自靶向亞硫酸氫鹽定序之血漿EBV DNA讀數之比例。可以各種方式測定不含細胞之EBV DMA讀數之比例，例如以人類基因組及若干病毒基因組中所有DNA讀數之比例，或僅所分析之人類基因組及病毒基因組之所有DNA讀數之比例。在先前實例中，組合參考序列可包含完全人類基因組(hg19)、完全EBV基因組(AJ507799.2)、完全HBV基因組及完全HPV基因組。在各種實例中，比例可基於相對於所有其他DNA讀數與所分析之病毒基因組比對或僅可比對(例如獨特或具有指定失配數)之讀數之計數來測定。使用人類基因組及若干病毒基因組之參考基因組，吾人比較三組NPC患者、具有暫時性陽性之非NPC個體及具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體中血漿EBV DNA讀數之比例。
圖24展示根據本發明之實施例，在具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體、具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體及NPC患者中之所有經定序之血漿DNA讀數中，血漿EBV DNA讀數映射至EBV基因組之血漿DNA讀數)之比例。NPC組之血漿EBV DNA讀數之平均比例(平均值=0.075%)顯著高於其他兩個具有暫時性陽性(平均值=0.003%)及持續性陽性(平均值=0.052%)血漿EBV DNA之非NPC組之平均比例(p＜0.0001，克拉斯卡-瓦立斯測試)。因此，可依據血漿EBV DNA之數量之差異(亦即血漿EBV DNA之比例)區分NPC患者與具有可偵測之血漿EBV DNA (暫時性或持續性陽性)之非NPC個體。
在當前實例中，使用4.5×10-6 作為截止值，藉由靶向亞硫酸氫鹽定序，所有30名NPC患者、119名具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體中之79名及39名具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體中之34名之血漿EBV DNA之比例高於此截止值。所計算之靈敏度、特異性及陽性預測值分別為100%、27.6%及22.1%。
可以各種方式測定截止(參考)值之選擇。在一個實施例中，在所分析之NPC患者中，可選擇任何低於比例中之最低值的值作為血漿EBV DNA之比例之截止值。可設定截止值以捕捉所有NPC患者及實現最大靈敏度。在其他實施例中，可測定截止值，例如以NPC患者之血漿EBV DNA讀數之平均比例減一個標準差(SD)、平均值減兩個SD、平均值減三個SD形式。在當前實例中，截止值設定為所有NPC患者中血漿EBV DNA讀數之比例之平均值減三個SD。在其他實施例中，可在血漿DNA片段之比例之對數轉換映射至EBV基因組且接著以類似方式選擇(例如使用平均值等)之後測定截止值。在其他實施例中，截止值可使用接受者操作特徵(ROC)曲線或藉由非參數方法來確定，例如包括100%、95%、90%、85%、80%之所分析之NPC患者。 C. 組合分析
可組合此等三種技術以提供增加之精確性。舉例而言，可比較每種技術之度量值(每種技術潛在地包括多個度量值，例如多重甲基化程度)與各別參考值以對個體進行分類，例如可以決策樹形式進行，或鑑別個體對應於訓練值之曲線之特定部分(象限)。亦可使用叢集技術，例如上文所描述。
吾人評估組合血漿EBV DNA比例之分析(定量)及NPC鑑別之尺寸比率之值。吾人亦評估組合血漿EBV DNA比例之分析(定量)及NPC鑑別之甲基化百分比之值，且接著共同評估全部三個值。
圖25為根據本發明之實施例，NPC患者、具有暫時性陽性及持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體之血漿EBV DNA讀數之比例及相應尺寸比率值之曲線。圖23及24中定義之EBV DNA尺寸比率中之相同截止值及血漿EBV DNA讀數之比例由灰色點線表示。橢圓形突出顯示通過組合分析之象限2510。
在此組合分析中，若血漿樣本之定序資料同時通過比例分析及血漿EBV DNA之尺寸比率之截止值，則認為其係陽性。使用如上文所定義之截止值，NPC偵測之靈敏度、特異性及陽性預測值分別為90%、88.5%及61.7%。
圖26為根據本發明之實施例，NPC患者、具有暫時性陽性及持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體之血漿EBV DNA讀數之比例及相應甲基化百分比值之曲線。如圖13及24中分別定義之46例DMR內EBV DNA甲基化百分比中之相同截止值及血漿EBV DNA讀數之比例由灰色點線表示。橢圓形突出顯示通過組合分析之象限2610。
在此組合分析中，若血漿樣本之定序資料同時通過比例分析及血漿EBV DNA之甲基化百分比之截止值，則認為其係陽性(基於圖中定義之DMR)。使用如上文所定義之截止值，NPC偵測之靈敏度、特異性及陽性預測值分別為96.7%、89.1%及64.6%。
圖27A及27B展示根據本發明之實施例，NPC患者、具有暫時性陽性及持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體之血漿EBV DNA讀數之比例及相應尺寸比率及甲基化百分比值之3維曲線。吾人評估組合所有三個參數(血漿EBV DNA比例(定量)、尺寸比率及用於NPC鑑別之甲基化百分比)之值。以與圖24相同之方式測定比例。以與圖23相同之方式測定尺寸比率。並且，使用用於圖13之46例DMR測定甲基化程度。
在圖27A中，紫色表面2710表示3維空間中經擬合之3-D表面，其區分NPC患者與具有暫時性及持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體。使用經擬合之表面說明用於區分個體之參考值可比恆定值更複雜。舉例而言，在圖26中，甲基化百分比之截止值可隨序列讀數之比例而變化。此類測定類別之可撓性可提供更大的精確性。可選擇擬合以最佳化各種精確性度量值，例如特異性、靈敏度或其兩者之某一平均值。可使用支持向量機進行此類擬合。圖27B展示與圖27A中相同之資料，但無表面2710，且在圍繞資料之框中標記軸。
圖28A及28B展示根據本發明之實施例，基於計數、基於尺寸及基於甲基化之分析之各種組合之接受者操作特徵(ROC)曲線分析。精確性係用於NPC個體及非NPC個體之正確類別。以與圖27A及27B相同之方式測定參數(亦即比例、尺寸比率及甲基化程度)。截止值變化，藉此引起靈敏度及特異性變化。圖27A展示個別地使用三種技術之比較。展示曲線下面積(AUC)值。對於僅計數、僅尺寸及僅甲基化，AUC值分別為0.905、0.942及0.979。甲基化提供最佳結果。圖28B展示三種組合技術之比較。計數及尺寸之AUC值為0.97。計數及甲基化之AUC值為0.985。使用全部三種技術提供最佳精確性，其為0.989。 VI. 其他病毒實例
其他病毒亦與癌症相關聯。舉例而言，血漿人類乳頭狀瘤病毒(HPV)與頭部及頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)相關聯。並且，B型肝炎病毒(HBV)與肝細胞癌(HCC)相關聯。以下結果展示實施例可使用其他不含細胞之病毒DNA之甲基化程度，以與甲基化程度用於不含細胞之EBV DNA類似的方式對病狀之程度進行分類。 A. HPV
圖29展示5名HPV陽性頭部及頸部鱗狀細胞癌(HPV+ve HNSCC)病例之臨床階段。根據AJCC癌症分期手冊(AJCC Cancer Staging Manual)第8版進行病例分期。吾人藉由血漿DNA之目標亞硫酸氫鹽定序來分析來自此等5名HPV陽性頭部及頸部鱗狀細胞癌(HPV+ve HNSCC)患者之血漿人類乳頭狀瘤病毒(HPV)DNA讀數之甲基化概況。所有5名患者皆患有早期(I或II期)疾病。其在其血漿DNA樣本中皆具有可偵測之HPV DNA片段。
對於各臨床情況，使用QIAamp DSP DNA血液微型套組自4 mL血漿提取血漿DNA。對於各情況，所有提取之DNA用於使用TruSeq DNA無PCR文庫製備套組(Illumina)製備定序文庫。銜接子接合DNA產物經歷兩輪使用EpiTect Bisulfite套組(Qiagen)進行之亞硫酸氫鹽處理。使用KAPA HiFi HotStartUracil+ReadyMix PCR套組(Roche)對經亞硫酸氫鹽轉化之樣本進行十二至十五個PCR擴增循環。接著，使用覆蓋上述病毒及人類基因組區域之經定製設計之探針，用SeqCap-Epi系統(Nimblegen)捕捉擴增產物(圖1)。
在目標捕捉之後，藉由14個PCR循環富集所捕捉之產物以產生DNA文庫。用NextSeq平台(Illumina)對DNA文庫進行定序。對於每次定序操作，使用雙端模式對具有獨特樣本條形碼之四至六個樣本進行定序。對於各DNA片段，自兩個端中之每一者對75個核苷酸進行定序。在定序之後，可在甲基管道(一種甲基化資料分析管道)中處理序列讀數(Jiang等人 PLoS One 2014;9:e100360)且映射至人工組合參考序列，其包含完全人類基因組(hg19)、完全EBV基因組(AJ507799.2)、完全HBV基因組及完全HPV基因組。映射至組合基因組序列中之獨特位置之定序讀數(儘管在其他實施例中可允許失配)用於下游分析。
圖30展示根據本發明之實施例，患有HPV陽性頭部及頸部鱗狀細胞癌(HPV+ve HNSCC)之個別患者中血漿HPV DNA之甲基化概況。經由來自此等患者之血漿DNA之靶向捕捉物亞硫酸氫鹽定序來產生HPV DNA之甲基化概況。圖30展示可在HNSCC患者之血漿HPV16 DNA分子中偵測到HPV16 (HPV血清型16)甲基化。測定跨越HPV基因組之所有CpG位點之甲基化密度。
可使用以下方程式計算血漿中跨越病毒基因組之特異性基因座之甲基化密度MD：MD=M/(M+U)，其中M為甲基化病毒讀數之計數且U為跨越病毒基因組之遺傳基因座內CpG位點處未甲基化之病毒讀數之計數。在基因座特異性層面上，此等基因座可具有任何尺寸且具有至少1個CpG位點(1 bp)。若基因座內存在超過一個CpG位點，則M及U對應於跨越位點之計數。此等基因座可與且可不與任何標註之病毒基因相關聯。
吾人可觀測不同患者中血漿HPV DNA之甲基化概況之類似模式。通常非癌症個體中不存在HPV。吾人定義兩個基因組區域，亦即區域3001及區域3002。對於HPV+ve HNSCC之所有5個病例，區域3001中之區域特異性甲基化密度始終高於區域3002。可在整體或基因座特異性層面上分析患有相同病狀之個體之模式之此等類似性，及具有甲基化概況之不同病狀之個體之模式之差異。此類預定義區域之甲基化密度可預測臨床呈現，例如關於癌症階段、對治療之反應及復發風險。
圖31展示根據本發明之實施例，患有HPV+ve HNSCC之兩名患者中跨越HPV基因組之所有CpG位點之甲基化程度。第一患者以黑色且在底部上展示，如3101處所描繪。第二患者以灰色展示，且在可發現更大結果時，如3102中。如可發現，兩名患者在類似基因座處具有顯著甲基化程度，且許多基因座具有類似的甲基化程度值。藉由在整體或基因座特異性層面上比較病例中之甲基化程度，實施例可鑑別個體具有HNSCC。 B. HBV
對9名慢性B型肝炎感染患者及10名HCC患者進行血漿DNA之靶向亞硫酸氫鹽定序。吾人亦分析來自此等慢性B型肝炎感染及HCC患者之血漿HBV讀數之甲基化概況。
圖32A及32B展示根據本發明之實施例，9名慢性B型肝炎感染(HBV)患者及10名肝細胞癌(HCC)患者中，跨越HBV基因組之所有CpG位點之B型肝炎病毒(HBV)DNA讀數(映射至HBV基因組之血漿DNA讀數)之比例及甲基化百分比。
在圖32A中，測定相對於人類基因組與HBV基因組比對之DNA片段之百分比。在此特定實例中，獨特地比對HBV基因組之不含細胞之DNA片段之數目除以獨特地比對至包含如圖1中列舉之人類、HBV、HPV及EBV之基因組之組合參考基因組的不含細胞之DNA片段之數目。與慢性HBV感染患者(平均值=0.03%)相比，在HCC患者(平均值=0.006%)中觀測到較高的HBV DNA讀數之平均比例，但未獲得統計顯著性(p=0.07，史都登氏t測試(Student's t-test))。如吾人可目測發現，HCC個體及HBV個體之平均值類似。因此，基於計數之技術具有相對低預測能力。
在圖32B中，以跨越HBV基因組中所有CpG位點之整體甲基化程度形式測定HBV甲基化百分比。與慢性B型肝炎感染患者(平均值=23%)相比，吾人觀測到HCC患者(平均值=1.7%)之血漿HBV DNA之顯著更高的甲基化百分比(p=0.03，史都登氏t測試)。此類分離指示增加之區分具有HBV但無HCC之個體與具有HCC之個體的能力。因此，實施例可對HCC病狀程度(例如HCC或無HCC)進行分類。因此，實施例可依據樣本中血漿HBV DNA之基因組譜甲基化程度預測HCC之風險。
其他實施例可實施其他類型之甲基化程度，例如本文中所描述。舉例而言，可依據具有預定義準則之經區分之甲基化區域內之甲基化程度分類。 VII. 使用不含細胞之病毒DNA之甲基化之方法
如上文所描述，實施例可量測不含細胞之DNA樣本(包括不含細胞之病毒DNA及不含細胞之基因組人類DNA)中之一或多種甲基化程度。甲基化程度可藉由分析來自與病狀相關聯之特定病毒之DNA的甲基化程度對病狀程度進行分類。基於計數及基於尺寸之技術亦可用於補充甲基化技術。
作為實例，病狀程度可為病狀是否存在、病狀之嚴重程度、病狀階段、病狀展望、病狀對治療之反應或病狀之嚴重程度或進程之另一量測。作為癌症之實例，癌症程度可為癌症是否存在、癌症階段(例如早期及晚期)、腫瘤尺寸、癌症對治療之反應或癌症之嚴重程度或進程之另一量測。
對於EBV，實例病狀可包括感染性單核白血球增多症(IM)、鼻咽癌(NPC)、自然殺手(NK)-T細胞淋巴瘤，及無此等病狀，但可在樣本中展示顯著數目之不含細胞之EBV DNA片段之個體。對於HPV，實例病狀可包括頭部及頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)及具有顯著量之不含細胞之HPV DNA片段，但不具有HNSCC之個體。對於HBV，實例病狀可包括肝細胞癌(HCC)及具有顯著量之不含細胞之HBV DNA片段，但不具有HCC之個體。 A. 使用甲基化程度對病狀進行分類
圖33為流程圖，其說明根據本發明之實施例，用於測定第一病狀之類別之分析動物個體之生物樣本之方法3300。樣本可包括來自個體之DNA分子與來自病毒之潛在DNA分子之混合物。方法3300可包括臨床、實驗室及電子雜交(電腦)步驟。可進行方法3300作為個體篩選(例如篩選癌症)之一部分。因此，個體可無病狀之症狀。
在區塊3310處，自個體獲得生物樣本。作為實例，生物樣本可為血液、血漿、血清、尿液、唾液、汗液、淚液及痰液，以及本文所提供之其他實例。生物樣本可包括來自個體之基因組及來自一或多種其他基因組之不含細胞之DNA分子之混合物。舉例而言，一或多種其他基因組可包括病毒基因組，諸如EBV、HPV及/或HBV基因組。在一些實施例(例如關於血液)中，可純化不含細胞之DNA分子之混合物之生物樣本，例如離心血液以獲得血漿。
在區塊3320處，由生物樣本分析複數個不含細胞之DNA分子。不含細胞之DNA分子之分析可包括鑑別特定病毒基因組中不含細胞之DNA分子之位置，及測定不含細胞之DNA分子是否在特定病毒基因組之一或多個位點處甲基化。可分析各種數目之不含細胞之DNA分子(人類及病毒)，例如至少1,000個，其中各種數目鑑別為來自特定病毒基因組(例如10、20、30、50、100、200、500或1,000或更多)。
可如本文中所描述獲得序列讀數之位點之甲基化狀態。舉例而言，可使用DNA分子之序列讀數分析DNA分子，其中該定序法為甲基化檢測法。亦可使用其他甲基化檢測分析法。序列讀數可各自包括來自生物樣本之不含細胞之DNA分子之甲基化狀態。甲基化狀態可包括特定胞嘧啶殘餘物是否為5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。可以各種方式獲得序列讀數，各自如各種定序技術、PCR技術(例如實時或數位)、陣列及其他適合的用於鑑別片段之序列之技術。實時PCR為共同分析DNA組之實例，例如與位點處甲基化之DNA數目成比例之強度信號。取決於兩個位點之彼此接近性及序列讀數之長度，序列讀數可覆蓋超過一個位點。
可藉由自甲基化檢測定序法接收序列讀數來進行分析，且因此可僅對先前自DNA獲得之資料進行分析。在其他實施例中，分析可包括實際定序或其他用於進行DNA分子特性之量測之有效步驟。可以多種方式進行定序，例如使用大規模平行定序或下一代定序，使用單分子定序，及/或使用雙股或單股DNA定序文庫製備方案，及本文中所描述之其他技術。作為定序之一部分，有可能一些序列讀數可對應於細胞核酸。
定序可為靶向定序，例如本文中所描述。舉例而言，生物樣本可富集來自病毒之核酸分子。富集生物樣本之來自病毒之核酸分子可包括使用結合病毒之一部分或整個基因組的捕捉探針。其他實施例可使用對病毒之特定基因座具有特異性之引子。生物樣本可富集來自人類基因組之一部分的核酸分子，例如體染色體區。圖1提供此類捕捉探針之實例。在其他實施例中，定序可包括隨機定序。
在藉由定序器件定序之後，可藉由電腦系統接收序列讀數，該電腦系統可通信地與進行定序之定序器件耦接，例如經由有線或無線通信或經由可拆卸記憶體器件。在一些實施例中，可接收包括核酸片段之兩個末端的一或多個序列讀數。可藉由將DNA分子之一或多個序列讀數映射(比對)至人類基因組之各別部分(例如特異性區域，諸如差異甲基化區域(DMR))來測定DNA分子之位置。在一個實施方案中，若讀取未映射至相關區域，則可忽略讀取。在其他實施例中，特定探針(例如在PCR或其他擴增之後)可指示位置，諸如經由特定螢光顏色。鑑別可為對應於一組一或多個位點中之一者之不含細胞之DNA分子，亦即特定位點可能不為已知的，因為一或多個位點處甲基化之DNA之量為所有必需的。
在區塊3330處，依據特定病毒基因組之一組一或多個位點甲基化之複數個不含細胞之DNA分子之一或多個量來量測一或多個混合物甲基化程度。混合物甲基化程度可為位點集合或位點之子集之不含細胞之DNA分子之甲基化密度或百分比(例如本文中所描述)。舉例而言，甲基化程度可對應於甲基化密度，其係依據對應於位點集合之DNA分子之數目及甲基化數目而測定。可序列讀數與病毒基因組之比對以及一或多個位點處既定序列讀數之甲基化狀態來測定數目。
對於位點集合中之每一者，可測定位點處甲基化之DNA分子之各別數目。在一個實施例中，位點為CpG位點，且可僅為某些CpG位點，如使用本文中提及之一或多個準則選擇。在使用特定位點處所分析之DNA分子之總數(例如序列讀數之總數)進行正規化後，甲基化之DNA分子之數目等效於測定未甲基化之數目。舉例而言，區域之CpG甲基化密度增加等效於相同區域之未甲基化之CpG之密度降低。
當一組一或多個位點包括至少兩個位點時，可跨越至少兩個位點測定一個混合物甲基化程度。舉例而言，甲基化程度可計算為第一組之所有不含細胞之DNA分子之總甲基化密度。在另一實例中，可計算一或多個位點中之各位點或區域之單獨的甲基化密度，藉此提供N (例如2或更大的整數)個混合物甲基化程度作為多維點，例如章節IV.B-IV.E中所描述。可組合單獨的甲基化密度以獲得混合物甲基化程度，例如單獨的甲基化密度之平均值。
在其他實施例中，可保持單獨的甲基化程度以用於隨後分析，例如使用叢集及本文中所描述之其他技術。舉例而言，可比較多維點(N個混合物甲基化程度)與N個參考甲基化程度以獲得N個差異，其可用於測定個體是否屬於至少兩個群組中之一者。圖18-20提供層級集群分析之此類實例。可預先測定區域，例如上文關於具有50個鹼基與1,000個鹼基之間的尺寸之預先測定之區域所描述，其中區域之尺寸相同或不同。
若測定超過一個混合物甲基化程度，則不同程度可對應於位點集合之不同子集。舉例而言，可測定不同區域之甲基化程度，該等區域可各自包括一或多個位點。區域可跨越整個病毒基因組或僅對應於部分病毒基因組，例如可在選擇特定區域時進行。可根據一或多個準則針對差異甲基化來選擇此類區域，例如本文中所描述。此類準則可對應於特異性範圍內具有相同病狀之個體群組中之甲基化程度，且潛在地具有來自群組中之其他個體之臨限值內之差異。因此，區域或位點中之每一者之準則可包括(1)相同群組中之多個個體中之甲基化程度差異及/或(2)一個群組中之個體與另一群組中之個體之間的甲基化程度差異。
在區塊3340處，比較一或多個混合物甲基化程度與由其他個體之至少兩個群組測定之一或多個參考甲基化程度。至少兩個群組可具有與特定病毒基因組相關聯之不同類別，其中不同類別包括第一病狀。對於EBV DNA分子之數目，上文提供此類病狀之實例，例如NPC、IM、淋巴瘤及與暫時性或持續性陽性相關之非NPC狀態。群組及參考甲基化程度之實例提供於圖8、11、13、15及18-20。
比較可採取各種形式。舉例而言，可測定分離值，諸如混合物甲基化程度與參考甲基化程度之間的比率或差異。可定義各種分離值，包括有包括比率及差異之定義及其兩者之函數。比較可進一步包括分離值與截止值之比較，以測定統計顯著差異。舉例而言，參考甲基化程度可為群組之平均值，可比較樣本之混合物甲基化程度與群組之平均值之間的差異與截止值，該截止值可依據群組中使用之參考樣本之所量測之甲基化程度之標準差來測定。
在一些涉及多重甲基化程度及多重參考程度之實施例中，多重甲基化程度可對應於樣本多維點(例如形成向量之N個程度)，其中多重參考程度對應於N-1維度之表面(例如超平面)，其中表面可為封閉表面，例如其中資料點對應於相同病狀之球形。作為另一實例，多重甲基化程度與參考程度之比較可藉由測定樣本多維點與參考個體之代表性(參考)多維點之間的間距來實施。參考多維點可對應於單一參考個體，例如患者AL038。作為另一實例，代表性(參考)多維點可為來自具有相同病狀之個體之參考多維點之叢集之心形曲線。
作為另一實例，比較混合物甲基化程度與參考甲基化程度可包括將一或多個混合物甲基化程度輸入機器學習模式，該機器學習模式使用由其他個體之至少兩個群組測定之一或多個參考甲基化程度訓練。舉例而言，參考程度可為其他個體之所量測之甲基化程度，及叢集模式可使用此等參考程度訓練。舉例而言，可針對對應於特定群組之個體叢集選擇心形曲線。
在區塊3350處，依據該比較來測定個體是否為具有第一病狀之第一類別。第一類別可採取各種形式，例如二元結果或機率值。在一些實施例中，第一類別可提供第一病狀之程度，例如腫瘤尺寸、嚴重度或癌症階段。
至少兩個群組之不同類別亦可包括第二病狀，其中與一或多個參考程度之比較可測定個體是否為具有第二病狀之第二類別。舉例而言，單一參考含量可區分IM與淋巴瘤，或區分NPC與持續性陽性個體。
可比較一或多個混合物甲基化程度與複數個參考甲基化程度。作為使用一個甲基化程度但多個參考甲基化程度之實例，不同參考程度可區分不同病狀。舉例而言，第一參考甲基化程度可決定個體是否為具有第一病狀之第一類別(例如區分IM與不具有IM)，且第二參考甲基化程度可決定個體是否為具有第二病狀之第二類別(例如區分NPC與不具有NPC)，例如圖8、11及15中所描繪。因此，實施例可使用不同的參考層度以依據該比較測定個體是否為具有第二病狀之第二類別。
該方法可進一步包括回應於個體具有病狀之類別而治療個體之病狀，藉此改善病狀(例如移除病狀或降低嚴重度)。若病狀為癌症，則治療可包括手術、輻射療法、化學療法、免疫療法、靶向療法、激素療法、幹細胞移植或精確醫學。依據所判定之病狀程度，可研發治療計劃以降低對個體之傷害風險。方法可進一步包括根據治療計劃治療個體。
可在各種時間點獲得生物樣本且在此等時間點獨立地分析，或在其他時間點與量測及分類一起進行。此類時間點之實例包括癌症治療前及治療後(例如靶向療法、免疫療法、化學療法、手術)、癌症診斷之後的不同時間點、癌症進程之前及之後、轉移發生之前及之後、疾病嚴重度增加之前及之後或併發症發生之前及之後。 B. 使用甲基化程度與尺寸/計數之組合
如章節V中所描述，基於計數及/或基於尺寸之技術可與甲基化技術組合使用。可獨立地實施此類技術，例如各自提供單獨的類別。可能需要此類獨立類別中之每一者以提供相同結果，以提供該結果之最終類別。在其他實施例中，不同技術之參考值可取決於來自另一技術之度量值，例如尺寸參考值可取決於既定樣本之所量測之甲基化程度，如上文關於圖27所描述。在一些實施方案中，各度量值(例如甲基化程度)可為向量中之不同分量，藉此產生既定樣本之度量值之多維資料點。可由相同樣本或單獨樣本測定度量值中之每一者，例如其可在約相同時間自個體獲得。
在一些實施例中，可如下實施基於尺寸之技術以分析個體之生物樣本。樣本可與用於甲基化分析之樣本為相同或不同樣本。生物樣本可包括來自個體之基因組及來自一或多種其他基因組(例如病毒基因組)之不含細胞之DNA分子之混合物。對於生物樣本中之複數個不含細胞之DNA分子中之每一者，可測定尺寸及位置，例如本文中所描述。舉例而言，可將DNA分子之兩端定序(例如以提供整個DNA分子之一個序列讀數或兩個末端之一對序列讀數)且將序列讀數與參考基因組比對以測定尺寸。因此，實施例可量測DNA分子之尺寸及鑑別特定病毒基因組中DNA分子之位置。此等不含細胞之DNA分子可與用於甲基化分析之分子相同，例如其中使用甲基化檢測定序法。複數個DNA分子之尺寸可形成尺寸分佈。
可測定尺寸分佈之統計值(例如尺寸比率)。可比較統計值與由其他個體之至少兩個群組測定之參考尺寸值，該其他個體之至少兩個群組可為用於甲基化分析之相同兩個群組。該至少兩個群組可具有與特定病毒基因組相關聯之不同類別，包括第一病狀。可依據比較來測定個體是否為具有第一病狀之基於尺寸之類別。可共同使用基於尺寸之類別及基於甲基化之類別以提供最終類別。實例參考尺寸值提供於圖22、23、25及27中。
在一些實施例中，可如下實施基於計數之技術以分析個體之生物樣本。樣本可與用於甲基化分析之樣本相同或不同。生物樣本可包括來自個體之基因組及來自一或多種其他基因組(例如病毒基因組)之不含細胞之DNA分子之混合物。
可測定來源於樣本中之特定病毒基因組之不含細胞之DNA分子的量。在一些實施例中，對於生物樣本中複數個不含細胞之DNA分子中之每一者，測定該分子是否來源於特定病毒基因組，例如使用定序或探針(可能與擴增(諸如PCR)一起)。舉例而言，可測定位置，例如是否來自人類基因組或來自特定病毒基因組。可使用自不含細胞之DNA之混合物之定序獲得的複數個序列讀數測定位置。可測定與特定病毒基因組比對之複數個序列讀數的量。舉例而言，可測定與病毒基因組比對之序列讀數相對於序列讀數之總數之比例。序列讀數之總數可為與對應於病毒之參考基因組比對之序列讀數及與人類基因組比對之序列讀數的總和。亦可使用本文中所描述之其他比率，例如來自特定病毒基因組之讀數量除以人類讀數量。
可比較與參考基因組比對之序列讀數之量與由其他個體之至少兩個群組測定之參考值，該至少兩個群組可為用於甲基化及/或尺寸分析之相同兩個群組。該至少兩個群組可具有與特定病毒基因組相關聯之不同類別，包括第一病狀。可依據比較來測定個體是否為具有第一病狀之基於計數之類別。可共同使用基於計數之類別及基於甲基化之類別以提供最終類別。實例參考計數值提供於圖24-27及32A中。 VIII. 實例系統
圖34說明根據本發明之實施例之系統3400。如所示，系統在樣本固持器3410內包括樣本3405，諸如不含細胞之DNA分子，其中樣本3405可與分析3408接觸以提供物理特徵3415之信號。樣本固持器之實例可為包括分析之探針及/或引子的流槽或液滴藉以移動之管(在包括微滴之分析的情況下)。樣本之物理特徵3415 (諸如螢光強度值)係藉由偵測器3420偵測。偵測器3420可按時間間隔(例如，週期性時間間隔)進行量測，以獲得構成資料信號之資料點。在一個實施例中，類比至數位轉換器複數次將來自偵測器之類比信號轉換成數位形式。樣本固持器3410及偵測器3420可形成分析器件，例如根據本文所述之實施例進行定序之定序器件。資料信號3425自偵測器3420發送至邏輯系統3430。資料信號3425可儲存於局部記憶體3435、外部記憶體3440或儲存器件3445中。
邏輯系統3430可為或可包括電腦系統、ASIC、微處理器等。其亦可包括顯示器(例如監視器、LED顯示器等)及使用者輸入器件(例如滑鼠、鍵盤、按鈕等)或與其耦接。邏輯系統3430及其他組件可為獨立或網路連接電腦系統之一部分，或其可直接附接至或併入於熱循環器件中。邏輯系統3430亦可包括在處理器3450中執行之最佳化軟體。邏輯系統3430可包括電腦可讀媒體，其儲存用於控制系統3400進行本文所描述之方法中之任一者的指令。
本文中提及之任何電腦系統可利用任何適合數目之子系統。該等子系統之實例展示於圖35中之電腦系統10中。在一些實施例中，電腦系統包括單一電腦裝置，其中子系統可為電腦裝置之組件。在其他實施例中，電腦系統可包括具有內部組件之多個電腦裝置，其各自為子系統。電腦系統可包括桌上型及膝上型電腦、平板電腦、移動電話及其他移動器件。
圖35中所示之子系統經由系統匯流排75互連。展示其他子系統，諸如印表機74、鍵盤78、儲存器件79、與顯示器配接器82耦接之監視器76等。周邊設備及輸入/輸出(I/O)器件(其與I/O控制器71耦接)可藉由此項技術中已知的任何數目之構件(諸如輸入/輸出(I/O)埠77 (例如USB、FireWire® ))連接至電腦系統。舉例而言，I/O埠77或外部介面81(例如乙太網、Wi-Fi等)可用於將電腦系統10連接至廣域網路(諸如網際網路)、滑鼠輸入器件或掃描儀。經由系統匯流排75進行之互連實現中央處理器73與各子系統通信以及控制來自系統記憶體72或儲存器件79 (例如固定磁碟，諸如硬碟機，或光碟)之複數個指令之執行，以及子系統之間資訊之交換。系統記憶體72及/或儲存器件79可體現為電腦可讀媒體。另一子系統為資料收集器件85，諸如攝影機、麥克風、加速計及其類似物。本文中所提及之任何資料可自一個組件向另一個組件輸出且可向使用者輸出。
電腦系統可包括複數個相同組件或子系統，例如藉由外部介面81、內部介面或經由可自一個組件連接至另一組件及移除之可移除儲存器件連接在一起。在一些實施例中，電腦系統、子系統或裝置可經網路通信。在此等情況下，可將一台電腦視為用戶端且另一台電腦視為伺服器，其中每一者可為同一電腦系統之一部分。用戶端及伺服器可各自包括多個系統、子系統或組件。
可以模組或積體方式，使用硬體電路(例如特殊應用積體電路或場可程式化閘陣列)及/或使用電腦軟體與一般可程式化處理器，以控制邏輯形式實施實施例之態樣。如本文中所使用，處理器可包括單核處理器、同一個積體晶片上之多核處理器或單一電路板或網路硬體以及專用硬體上之多個處理單元。依據本文中提供之揭示內容及教示，一般技術者將知道及瞭解使用硬體及硬體與軟體之組合來實施本發明之實施例的其他方式及/或方法。
本申請案中所述之任何軟體組件或功能可使用例如習知或面向對象技術，以軟體程式碼形式實施，軟體程式碼係由使用任何適合電腦語言(諸如Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift)或腳本處理語言(諸如Perl或Python)的處理器執行。軟體程式碼可以一系列指令或命令形式儲存於電腦可讀取媒體上以用於儲存及/或傳輸。適合的非暫時性電腦可讀媒體可包括隨機存取記憶體(RAM)、唯讀記憶體(ROM)、磁性媒體(諸如硬碟機或軟碟機)或光學媒體，諸如光碟(CD)或DVD (數位化通用光碟)、快閃記憶體及其類似物。電腦可讀媒體可為此類儲存或傳輸器件之任何組合。
此類程序亦可使用適用於經由有線、光學及/或符合多種協定之無線網路(包括網際網路)傳輸的載波信號來編碼及傳輸。因此，電腦可讀媒體可使用又此類程式編碼的資料信號建立。由程式碼編碼之電腦可讀媒體可與相容器件一起封裝或與其他器件分開提供(例如經由網際網路下載)。任何此類電腦可讀媒體可駐存在單一電腦產品(例如硬碟機、CD或整個電腦系統)上或其內，且可存在於系統或網路內之不同電腦產品上或其內。電腦系統可包括用於向使用者提供本文中所提及之任何結果的監視器、印表機或其他適合之顯示器。
本文所描述之任何方法可完全或部分地使用電腦系統來進行，該電腦系統包括一或多個處理器，該等處理器可經組態以執行該等步驟。因此，實施例可針對經組態以執行本文所描述之任何方法之步驟的電腦系統，潛在地使用不同組件執行各別步驟或各別步驟組。儘管以帶編號之步驟形式呈現，但本文中之方法之步驟可同時或在不同時間或以不同順序執行。此外，此等步驟之一部分可與其他方法之其他步驟之一部分一起使用。又，所有或部分步驟可為視情況選用的。此外，任何方法之任何步驟可使用用於執行此等步驟之系統的模組、單元、電路或其他構件來執行。
可在不偏離本發明之實施例的精神及範疇的情況下以任何適合之方式組合特定實施例之特定細節。然而，本發明之其他實施例可針對與各個別態樣或此等個別態樣之特定組合相關的特定實施例。
已出於說明及描述之目的呈現本發明之實例實施例的上述描述。其並不意欲為窮盡性的或將本發明限制於所描述之精確形式，且根據以上教示，諸多修改及變化為可能的。
本文所提及之所有專利、專利申請案、公開案及描述皆以全文引用之方式併入以用於所有目的。不承認任一者為先前技術。 附錄A
10‧‧‧電腦系統71‧‧‧I/O控制器72‧‧‧系統記憶體73‧‧‧中央處理器74‧‧‧印表機75‧‧‧系統匯流排76‧‧‧監視器77‧‧‧I/O埠78‧‧‧鍵盤79‧‧‧儲存器件81‧‧‧外部介面82‧‧‧顯示器配接器85‧‧‧資料收集器件201‧‧‧區域202‧‧‧區域203‧‧‧區域204‧‧‧區域901‧‧‧垂直線902‧‧‧水平線910‧‧‧左上部分之區域1201‧‧‧垂直線1202‧‧‧水平線1210‧‧‧左上部分1401‧‧‧垂直線1402‧‧‧水平線1410‧‧‧右上部分之區域1901‧‧‧節點1902‧‧‧節點1903‧‧‧節點2510‧‧‧通過組合分析之象限2610‧‧‧通過組合分析之象限2710‧‧‧紫色表面3001‧‧‧區域3002‧‧‧區域3400‧‧‧系統3405‧‧‧樣本3408‧‧‧分析3410‧‧‧樣本固持器3415‧‧‧物理特徵3420‧‧‧偵測器3425‧‧‧資料信號3430‧‧‧邏輯系統3435‧‧‧局部記憶體3440‧‧‧外部記憶體3445‧‧‧儲存器件3450‧‧‧處理器
圖1展示根據本發明之實施例之用於靶向亞硫酸氫鹽定序之捕捉探針之設計。
圖2展示根據本發明之實施例之患有感染性單核白血球增多症、鼻咽癌(NPC)及自然殺手(NK)-T細胞淋巴瘤之患者中跨越埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus；EBV)基因組之CpG位點之甲基化密度。
圖3展示根據本發明之實施例之一名來自篩選群組之患有早期NPC (第I階段)之患者(AL038)中血漿EBV DNA之甲基化概況。
圖4展示根據本發明之實施例之患有不同病狀的兩名患者之間的跨越EBV基因組之CpG位點之甲基化密度之差異。
圖5展示根據本發明之實施例之患有NPC的兩名患者(TBR1392及TBR1416)之間的跨越EBV基因組之CpG位點之甲基化密度之差異。
圖6展示根據本發明之實施例之患有早期NPC之患者(AO050)與具有血漿EBV DNA假陽性結果之個體(HB002)之間的血漿EBV DNA之甲基化模式之差異。
圖7A-7C為點狀圖，其展示根據本發明之實施例之一位患者中跨越EBV基因組之CpG位點之甲基化密度(x軸上)及另一名患者中相同CpG位點之相應甲基化密度(y軸上)。
圖8展示根據本發明之實施例之患有感染性單核白血球增多症(IM)(n=2)、EBV相關淋巴瘤(n=3)、暫時性陽性血漿EBV DNA (n=3)、持續性陽性血漿EBV DNA (n=3)及NPC (n=6)之個體中，基於EBV基因組中之CpG位點之血漿EBV DNA之甲基化百分比。
圖9說明根據本發明之實施例之滿足第一選擇準則之差異甲基化區域(DMR)之研究。
圖10為列舉滿足圖9中描述之準則之差異甲基化區域之基因組座標之表格。
圖11展示根據本發明之實施例之患有感染性單核白血球增多症(IM)(n=2)、EBV相關淋巴瘤(n=3)、暫時性陽性血漿EBV DNA (n=3)、持續性陽性血漿EBV DNA (n=3)及NPC (n=6)之個體中，圖10中描述之39個DMR內基於821個CpG位點之血漿EBV DNA之甲基化百分比。
圖12說明根據本發明之實施例之滿足第二選擇準則之差異甲基化區域(DMR)之研究。
圖13展示根據本發明之實施例之具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體、具有持久性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體及NPC患者中基於圖12中定義之46個DMR之血漿EBV DNA之甲基化百分比。
圖14說明根據本發明之實施例之滿足第三選擇準則之代表性甲基化保守區域之研究。
圖15展示根據本發明之實施例之相同的患有感染性單核白血球增多症(IM)(n=2)、EBV相關淋巴瘤(n=3)、暫時性陽性血漿EBV DNA (n=3)、持續性陽性血漿EBV DNA (n=3)及NPC (n=6)之個體組中，基於圖12中描述之『代表性』CpG位點之血漿EBV DNA之甲基化百分比。
圖16展示根據本發明之實施例之CpG位點之實例，其中在所收集之具有持續性陽性血漿EBV DNA之3個個體之聚合定序資料中，各位點處之甲基化百分比超過80%，且在3名NPC個體中之平均值小於20%。
圖17展示根據本發明之實施例之CpG位點之實例，其中在所收集之具有持續性陽性血漿EBV DNA之3個個體之聚合定序資料中，各位點處之甲基化百分比小於20%，且在3名NPC個體中超過80%。
圖18展示根據本發明之實施例之6名NPC患者(包括來自吾人之篩選群組之4名患有早期疾病之患者)、2名患有結外NK-T細胞淋巴瘤之患者及2名患有感染性單核白血球增多症之患者中，基於血漿EBV DNA之甲基化模式分析之具有階層式集群分析之叢集樹枝狀圖。
圖19展示根據本發明之實施例之6名NPC患者(包括來自吾人之篩選群組之4名早期NPC患者)及3名具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體中，基於血漿EBV DNA之甲基化模式分析之具有階層式集群分析之叢集樹枝狀圖。
圖20展示熱圖2000，其說明在患有鼻咽癌、NK-T細胞淋巴瘤及感染性單核白血球增多症之患者中，完全EBV基因組中之所有非重疊500-bp區域之甲基化程度。
圖21展示根據本發明之實施例之2名NPC患者(TBR1392及TBR1416)及2名感染性單核白血球增多症患者(TBR1610及TBR1661)以及連續分析中之3名具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體(AF091、HB002及HF020)中，映射至EBV基因組及人類基因組之經定序之血漿DNA片段之尺寸分佈之尺寸概況。
圖22展示根據本發明之實施例之6名NPC患者及3名血漿EBV DNA呈持續性陽性之個體中之尺寸比率。
圖23展示根據本發明之實施例之具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體、具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體及NPC患者中之EBV DNA尺寸比率。
圖24展示根據本發明之實施例，在具有暫時性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體、具有持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體及NPC患者中之所有經定序之血漿DNA讀數中，血漿EBV DNA讀數映射至EBV基因組之血漿DNA讀數)之比例。
圖25為根據本發明之實施例，NPC患者、具有暫時性陽性及持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體之血漿EBV DNA讀數之比例及相應尺寸比率值之曲線。
圖26為根據本發明之實施例，NPC患者、具有暫時性陽性及持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體之血漿EBV DNA讀數之比例及相應甲基化百分比值之曲線。
圖27A及27B展示根據本發明之實施例，NPC患者、具有暫時性陽性及持續性陽性血漿EBV DNA之非NPC個體之血漿EBV DNA讀數之比例及相應尺寸比率及甲基化百分比值之3維曲線。
圖28A及28B展示根據本發明之實施例，依據計數、依據尺寸及依據甲基化之分析之各種組合之接受者操作特徵(ROC)曲線分析。
圖29展示5名HPV陽性頭部及頸部鱗狀細胞癌(HPV+ve HNSCC)病例之臨床階段。
圖30展示根據本發明之實施例，患有HPV陽性頭部及頸部鱗狀細胞癌(HPV+ve HNSCC)之個別患者中血漿HPV DNA之甲基化概況。
圖31展示根據本發明之實施例，患有HPV+ve HNSCC之兩名患者中跨越HPV基因組之所有CpG位點之甲基化程度。
圖32A及32B展示根據本發明之實施例，9名慢性B型肝炎感染(HBV)患者及10名肝細胞癌(HCC)患者中，B型肝炎病毒(HBV)DNA讀數(映射至HBV基因組之血漿DNA讀數)之比例及跨越HBV基因組之所有CpG位點之甲基化百分比。
圖33為流程圖，其說明根據本發明之實施例，用於測定第一病狀之類別之分析動物個體之生物樣本之方法。
圖34說明根據本發明之實施例之系統。
圖35展示可與根據本發明之實施例之系統及方法一起使用之實例電腦系統之方塊圖。

Claims (30)

  1. 一種分析動物個體之生物樣本之方法，該生物樣本包括來自該個體之基因組及來自一或多種其他基因組之不含細胞之DNA分子之混合物，該方法包括：分析來自該生物樣本之複數個不含細胞之DNA分子，其中該複數個不含細胞之DNA分子中之一者之分析包括：鑑別該不含細胞之DNA分子於特定病毒基因組中之位置；及在該特定病毒基因組之一或多個位點處測定該不含細胞之DNA分子是否甲基化；依據該特定病毒基因組在一組位點甲基化之複數個不含細胞之DNA分子之量來量測混合物甲基化程度，其中該組位點跨越複數個區域；比較該混合物甲基化程度與由至少兩個群組之其他個體所測定之一或多個參考甲基化程度，其中該至少兩個群組中之每一者對於個體是否具有與該特定病毒基因組相關聯之一或多個病狀具有不同類別，且其中第一群組具有具有第一病狀之類別；及依據該比較，測定該個體是否為具有該第一病狀之第一類別。
  2. 如請求項1之方法，其中該至少兩個群組之不同類別進一步包括第二病狀，該方法進一步包括：依據該比較測定該個體是否為具有該第二病狀之第二類別。
  3. 如請求項2之方法，其中比較該混合物甲基化程度與複數個參考甲基化程度，其包括第一參考甲基化程度及第二參考甲基化程度，其中該第一參考甲基化程度用於測定該個體是否為具有該第一病狀之第一類別，且其中該第二參考甲基化程度用於測定該個體是否為具有該第二病狀之第二類別。
  4. 如請求項3之方法，其中該特定病毒基因組具有埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)且該個體為人類，其中該第一病狀為鼻咽癌，且其中該第二病狀為感染性單核白血球增多症。
  5. 如請求項1之方法，其中該第一類別為該個體不具有該第一病狀。
  6. 如請求項1之方法，其中該第一類別之測定包括測定該第一病狀之程度。
  7. 如請求項1之方法，其中該特定病毒基因組為埃-巴二氏病毒且該個體為人類，且其中該第一病狀為鼻咽癌。
  8. 如請求項1之方法，其中該第一病狀為癌症，且其中該特定病毒基因組係屬於引起癌症之病毒。
  9. 如請求項1之方法，其中該量測包括量測N個混合物甲基化程度，N為大於一之整數，其中該混合物甲基化程度為N個混合物甲基化程度之一 者，其中N個混合物甲基化程度之每一者係使用跨越各複數個區域之各組位點進行量測，且其中該混合物甲基化程度與一或多個參考甲基化程度之比較包括比較該N個混合物甲基化程度與N個參考甲基化程度，其係藉由：量測該N個混合物甲基化程度與該N個參考甲基化程度之間的差異；及使用該等差異測定該個體是否屬於該至少兩個群組中之一者。
  10. 如請求項9之方法，其中使用該等差異測定該個體是否屬於該至少兩個群組中之一者包括進行層級集群分析。
  11. 如請求項9之方法，其中針對複數個預定區域中之一者量測該N個混合物甲基化程度中之每一者。
  12. 如請求項11之方法，其中該複數個預定區域具有相同尺寸且跨越該特定病毒基因組，且其中該相同尺寸在50個鹼基與1,000個鹼基之間。
  13. 如請求項11之方法，其中該複數個預定區域中之每一者滿足一或多個準則，包括(1)相同群組中之多名個體之甲基化程度之差異及/或(2)一個群組中之個體與另一個群組中之個體之間的甲基化程度之差異。
  14. 如請求項1之方法，其中該複數個區域之每一者各自滿足一或多個準則，包括(1)相同群組中之多名個體之甲基化程度之差異及/或，(2)一個群 組中之個體與另一個群組中之個體之間的甲基化程度之差異。
  15. 如請求項1之方法，其中該組位點滿足一或多個準則，包括(1)相同群組中之多名個體之甲基化程度之差異及/或，(2)一個群組中之個體與另一個群組中之個體之間的甲基化程度之差異。
  16. 如請求項1之方法，其中該混合物甲基化程度與由至少兩個群組之其他個體所測定之該一或多個參考甲基化程度之比較包括：將該混合物甲基化程度輸入機器學習模式中，該機器學習模式使用由至少兩個群組之其他個體所測定之該一或多個參考甲基化程度訓練。
  17. 如請求項1之方法，其進一步包括：對於該組位點中之各位點：測定在該位點處甲基化之DNA分子之各別數目，藉此測定在該特定病毒基因組之該組位點甲基化之複數個不含細胞之DNA分子之量。
  18. 如請求項17之方法，其進一步包括：進行該複數個不含細胞之DNA分子之甲基化檢測定序法以獲得序列讀數；及比對該等序列讀數與該特定病毒基因組以測定在該組位點中之各位點處甲基化之DNA分子之各別數目。
  19. 如請求項1之方法，其進一步包括：進行該複數個不含細胞之DNA分子之甲基化檢測分析法，作為測定該複數個不含細胞之DNA分子之位置及該複數個不含細胞之DNA分子是否在該組位點甲基化之一部分。
  20. 如請求項1之方法，其中該不含細胞之DNA分子之位置之鑑別包括測定該位置對應於該組位點中之一者。
  21. 如請求項1之方法，其中共同分析一組複數個不含細胞之DNA分子以測定在該特定病毒基因組之該組位點甲基化之該複數個不含細胞之DNA分子之量。
  22. 如請求項1之方法，其中該複數個不含細胞之DNA分子包括位於該特定病毒基因組中之至少10個不含細胞之DNA分子。
  23. 如請求項1之方法，其中該特定病毒基因組對應於埃-巴二氏病毒、人類乳頭狀瘤病毒或B型肝炎病毒。
  24. 如請求項1之方法，其進一步包括：對於樣本中一組不含細胞之DNA分子中之每一者：量測該不含細胞之DNA分子之尺寸；及鑑別該特定病毒基因組中該不含細胞之DNA分子之位置，該成組之不含細胞之DNA分子之尺寸形成尺寸分佈，該樣本為生物樣本或 包括來自個體之基因組及來自一或多種其他基因組之不含細胞之DNA分子之混合物的不同樣本；測定該尺寸分佈之統計值；比較該統計值與由至少兩個群組之其他個體所測定之參考尺寸值；依據該統計值與該參考尺寸值之比較來測定該個體是否為具有該第一病狀之第二類別；及使用該第一類別及該第二類別測定最終類別。
  25. 如請求項1之方法，其進一步包括：測定樣本中來源於該特定病毒基因組之不含細胞之DNA分子的量，該樣本為生物樣本或包括來自該個體之基因組及來自該一或多種其他基因組之不含細胞之DNA分子之混合物的不同樣本；比較該量與由該至少兩個群組之其他個體所測定之參考值；依據該量與該參考值之比較來測定該個體是否為具有該第一病狀之第二類別；及使用該第一類別及該第二類別測定最終類別。
  26. 一種電腦產品，其包含儲存複數個指令之電腦可讀媒體，該複數個指令用於控制電腦系統執行如請求項1至25中任一項之方法的操作。
  27. 一種系統，其包含：如請求項26之電腦產品；及一或多個處理器，其用於執行儲存於該電腦可讀媒體上之指令。
  28. 一種系統，其包含用於執行如請求項1至25中任一項之方法的構件。
  29. 一種系統，其經組態以執行如請求項1至25中任一項之方法。
  30. 一種系統，其包含分別執行如請求項1至25中任一項之方法之步驟的模組。
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