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TWI848038B - 用於治療威爾森氏症之基因療法構築體 - Google Patents

用於治療威爾森氏症之基因療法構築體 Download PDF

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TWI848038B
TWI848038B TW109100147A TW109100147A TWI848038B TW I848038 B TWI848038 B TW I848038B TW 109100147 A TW109100147 A TW 109100147A TW 109100147 A TW109100147 A TW 109100147A TW I848038 B TWI848038 B TW I848038B
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aav
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克莉絲汀 利文斯頓
塞繆爾 沃茲沃思
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美商奧崔基尼克斯製藥公司
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Abstract

本申請案係關於編碼截短且功能性ATP7B之腺相關病毒載體，其用於治療威爾森氏症(WD)之基因療法中。本文所描述之截短ATP7B具有優於野生型ATP7B之若干優點，諸如較高功效及製造產率獲得提升。

Description

用於治療威爾森氏症之基因療法構築體
本申請案大體上係關於腺相關病毒載體及其在用於治療威爾森氏症(WD)之基因療法中之使用方法。
威爾森氏症(WD)為常染色體隱性遺傳病症，其引起主要在肝臟中且隨後在神經系統及其他組織中之銅積聚。WD為影響30,000個個體中大致1個個體的罕見病症，其由染色體13上銅轉運ATPase 2 (ATP7B)基因中之突變引起。存在超過600種獨特ATP7B突變。ATP7B主要在肝細胞中表現且在銅之跨膜轉運中起作用。ATP7B蛋白缺乏或功能降低導致銅經肝細胞分泌至膽汁中的減少，引起肝病。隨時間推移，在未進行適當治療之情況下，高銅含量可引起危及生命之器官損壞。
患有肝WD之患者一般出現於晚期兒童或青少年中，且展現急性肝炎、爆發性肝衰竭或進行性慢性肝病之特徵。WD之神經系統表現通常晚於肝病出現，最常在第二十年或第三十年中出現，且包括錐體外、小腦及小腦相關症狀。
WD之醫學治療之目標為自身體移除銅之毒性沈積且防止其再積聚。WD之當前治療方法為利用螯合劑(D-青黴胺、曲恩汀(trientine)及鋅鹽)之每日經口療法。醫學療法在大部分但並非所有WD患者中有效。肝臟移植為出現爆發性肝臟衰竭或進行性肝臟衰竭之WD患者的治療性選擇。然而，需要移植接受體來維持恆定免疫抑制方案以預防排斥。
本發明藉由將表現截短且功能性ATP7B之基因遞送至具有腺相關病毒載體之患者來解決對WD之改良及可持續治療的需要。本發明之截短ATP7B在治療WD方面具有改良之功效且具有優於野生型及其他截短形式之ATP7B蛋白之製造簡易性及效率。
本發明提供組合物及其在基因療法中之使用方法。更具體言之，本文提供適用於治療WD之腺相關病毒(AAV)載體。在一個態樣中，本發明提供一種重組核酸構築體，其包含：5'-反向末端重複(ITR)序列；啟動子序列；編碼截短人類銅轉運ATPase 2 (ATP7B)之核酸序列，其中金屬結合域(MBD) 1-3已缺失，但存在MBD3與MBD4之間包括兩個絲胺酸殘基(S340及S341)的富絲胺酸環；及3'-ITR序列。
在另一態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其適用於治療威爾森氏症，其中rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組包含：5'-反向末端重複(ITR)序列；啟動子序列；編碼截短人類銅轉運ATPase 2 (ATP7B)之核酸序列，其中金屬結合域(MBD) 1-3已缺失，但存在MBD3與MBD4之間包括兩個絲胺酸殘基(S340及S341)的富絲胺酸環；及3'-ITR序列。
本發明之此等及其他態樣及特徵描述於本申請案之以下部分中。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2019年1月04日申請之美國臨時專利申請案第62/788,324號及2019年4月16日申請之美國臨時專利申請案第62/834,830號之權益及優先權，該等美國臨時專利申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全文以引用的方式併入本文中。2019年12月22日創建之該ASCII複本名稱為ULP-003WO_SL_ST25.txt且大小為48,956個位元組。
本發明提供用於治療威爾森氏症(WD)之藥劑及組合物。如本文所描述之核酸序列、載體、重組病毒及相關組合物可用於改善、預防或治療WD。
除非另外指出，否則根據習知用途使用技術術語。分子生物學中之常用術語之定義可在以下中找到：Benjamin Lewin,Genes V , Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew等人(編),The Encyclopedia of Molecular Biology , Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A. Meyers (編),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference , VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)中。
為了促進檢閱本發明之各種實施例，提供特定術語之以下解釋：
腺相關病毒(AAV)：一種感染人類及一些其他靈長類物種之小型、複製缺陷型、無包膜型病毒。未知AAV是否會引起疾病且引發極輕度免疫反應。利用AAV之基因療法載體可感染分裂及靜止細胞兩者且可保持染色體外狀態而不整合至宿主細胞之基因組中。此等特徵使AAV成為用於基因療法之有吸引力的病毒載體。目前存在12種所識別之AAV血清型(AAV1-12)。
投與(administration/administer)：藉由任何有效途徑向個體提供或給予諸如治療劑(例如重組AAV)之藥劑。例示性投與途徑包括(但不限於)注射(諸如皮下、肌肉內、皮內、腹膜內及靜脈內)、經口、經導管內、經舌下、經直腸、經皮、經鼻內、經陰道及吸入途徑。
ATP7B Δ1-3-SS：如本文所使用，ATP7B Δ1-3-SS係指截短人類銅轉運ATPase 2 (ATP7B)，其中金屬結合域(MBD) 1-3已缺失，但存在MBD3與MBD4之間包括兩個絲胺酸殘基(S340及S341)的富絲胺酸環。
密碼子最佳化：「密碼子最佳化」核酸係指已經改變以使得密碼子對於特定系統(諸如特定物種或物種群組)中之表現最佳的核酸序列。舉例而言，核酸序列可針對在哺乳動物細胞或特定哺乳動物物種(諸如人類細胞)中之表現而最佳化。密碼子最佳化不改變經編碼之蛋白質之胺基酸序列。
強化子：一種藉由增加啟動子之活性來增加轉錄速率的核酸序列。
內含子：基因內一段不含蛋白質之編碼資訊之DNA。在轉譯信使RNA之前移除內含子。
反向末端重複(ITR)：有效複製所需之腺相關病毒之基因組中之對稱核酸序列。ITR序列位於AAV DNA基因組之各末端。ITR充當病毒DNA合成之複製起點且為載體衣殼化所需。
分離：「分離」生物組分(諸如核酸分子、蛋白質、病毒或細胞)已與其中天然存在組分之生物體之細胞或組織中的其他生物組分或生物體自身(諸如其他染色體及染色體外DNA及RNA、蛋白質及細胞)實質上分離或純化。已「分離」之核酸分子及蛋白質包括藉由標準純化方法純化之彼等核酸分子及蛋白質。該術語亦包括藉由重組表現於宿主細胞中製備之核酸分子及蛋白質以及化學合成之核酸分子及蛋白質。
可操作地連接：當第一核酸序列與第二核酸序列處於函數關係中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接於編碼序列。一般而言，可操作地連接之DNA序列為連續的，且當必需接合兩個蛋白質編碼區時，在相同閱讀框架中。
醫藥學上可接受之載劑：適用於本發明之醫藥學上可接受之載劑(媒劑)為習知的。Remington's Pharmaceutical Sciences , E. W. Martin著, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 第15版(1975)，描述適用於一或多種治療化合物、分子或藥劑之醫藥遞送的組合物及調配物。
一般而言，載劑之性質將視所採用之特定投與模式而定。舉例而言，非經腸調配物通常包含包括醫藥學上及生理學上可接受之流體的可注射流體，諸如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油或其類似物作為媒劑。對於固體組合物(例如散劑、丸劑、錠劑或膠囊形式)，習知無毒固體載劑可包括例如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除生物學中性載劑以外，待投與之醫藥組合物可含有少量無毒輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑及pH緩衝劑及其類似物，例如乙酸鈉或脫水山梨醇單月桂酸酯。
預防、治療或改善疾病：「預防」疾病(諸如WD)係指抑制疾病之完全發展。「治療」係指改善疾病或病理性病狀(諸如WD)之病徵或症狀在其開始發展之後的治療性干預。「改善」係指疾病(諸如WD)之病徵或症狀之數目或嚴重程度降低。
啟動子：引導/起始核酸(例如基因)之轉錄的DNA區域。啟動子包括轉錄起始位點附近之必需核酸序列。
純化：術語「純化」不要求絕對純度；相反，其意欲為相對術語。因此，舉例而言，經純化之肽、蛋白質、病毒或其他活性化合物為完全或部分地自天然相關蛋白質及其他污染物分離之物。在某些實施例中，術語「實質上經純化」係指已自細胞、細胞培養基或其他粗製劑分離且進行分餾以移除初始製劑之各種組分(諸如蛋白質、細胞碎片及其他組分)的肽、蛋白質、病毒或其他活性化合物。
重組：重組核酸分子為具有並非天然存在之序列或具有藉由人工組合兩個另外間隔開之序列片段製得之序列的核酸分子。此人工組合可藉由化學合成或藉由人工操縱核酸分子之分離片段來實現，諸如藉由基因工程改造技術實現。
類似地，重組病毒為包含非天然存在或藉由人工組合不同來源之至少兩個序列製得之序列(諸如基因組序列)的病毒。術語「重組」亦包括僅藉由添加、取代或缺失天然核酸分子、蛋白質或病毒之一部分而變化的核酸、蛋白質及病毒。如本文所用，「重組AAV」係指其中已封裝重組核酸分子(諸如編碼截短人類ATP7B之重組核酸分子(例如SEQ ID NO: 1))的AAV粒子。
序列一致性：兩種或更多種核酸序列或兩種或更多種胺基酸序列之間的一致性或相似性係依據序列之間的一致性或相似性來表現。序列一致性可依據一致性百分比進行量測；百分比愈高，序列愈一致。序列相似性可依據相似性百分比(其考慮保守胺基酸取代)量測；百分比愈高，序列愈相似。當使用標準方法比對時，核酸或胺基酸序列之同源物或直系同源物具有相對較高程度之序列一致性/相似性。當直系同源蛋白質或cDNA衍生自與更遠相關之物種(諸如人類及秀麗隱桿線蟲(C. elegans )序列)相比更緊密相關之物種(諸如人類及小鼠序列)時，此同源性更顯著
用於比較之序列比對方法為此項技術中所熟知。各種程式及比對演算法描述於：Smith & Waterman,Adv. Appl. Math . 2:482, 1981; Needleman & Wunsch,J. Mol. Biol. 48:443, 1970: Pearson & Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp,Gene , 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet等人,Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang等人Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992: 及Pearson等人,Meth. Mol. Rio. 24:307-31, 1994. Altschul等人,J. Mol. Biol . 215:403-10, 1990, 提出序列比對方法及同源性計算之詳細考慮。
NCBI鹼基局部比對搜尋工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST) (Altschul等人,J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)可獲自數種來源，包括國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)及在網際網路上，其與序列分析程式blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx結合使用。其他資訊可見於NCBI網站。
血清型：經特徵性抗原集合區分之一組緊密相關之微生物(諸如病毒)。
填充序列：係指較大核酸分子內所含有之核苷酸序列(諸如載體)，其通常用於在兩個核酸特徵之間(諸如在啟動子與編碼序列之間)產生所需間隔，或延伸核酸分子以使其具有所需長度。填充序列不含蛋白質編碼資訊且可具有未知/合成來源及/或與較大核酸分子內之其他核酸序列不相關。
個體：活的多細胞脊椎動物生物體，其為包括人類及非人類哺乳動物之類別。
合成：由人工手段產生於實驗室中，例如合成核酸可在實驗室中以化學方式合成。
治療有效量：一定量之指定醫藥或治療劑(例如重組AAV)，其足以在用該試劑治療之個體或細胞中達成所需效果。藥劑之有效量將視若干因素而定，該等因素包括(但不限於)所治療之個體或細胞及治療組合物之投與方式。
載體：載體為允許插入外來核酸而不妨礙載體在宿主細胞中複製及/或整合之能力的核酸分子。載體可包括准許其在宿主細胞中複製之核酸序列，諸如複製起點。載體亦可包括一或多個可選標記基因及其他基因元件。表現載體為含有允許一或多個插入基因轉錄及轉譯所需之調節序列的載體。在本文中之一些實施例中，載體為AAV載體。
除非另外解釋，否則本文中所用的所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同的含義。除非上下文另外明確指示，否則單數術語「一(a/an)」及「該」包括多個指示物。「包含A或B」意謂包括A、或B、或A及B。應進一步理解，對核酸或多肽所給出之所有鹼基大小或胺基酸大小及所有分子量或分子量值均為近似值，且出於描述而提供。儘管與本文所描述之方法及材料類似或等效之方法及材料可用於實踐或測試本發明，但在下文描述適合方法及材料。所有公開案、專利申請案、專利及所提及之其他參考案均以全文引用的方式併入本文中。在矛盾情況下，將以本說明書，包括術語解釋為准。另外，該等材料、方法及實例僅為說明性的且不意欲為限制性的。病毒載體：
在一些態樣中，本發明提供一種腺相關病毒(AAV)載體，其含有封裝基因組，該封裝基因組包含AAV 5'-反向末端重複(ITR)序列、啟動子序列、編碼ATP7B Δ1-3-SS之核酸序列(例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15)及AAV 3'-反向末端重複序列(ITR)。
在一些實施例中，封裝基因組可進一步包含如本文所描述之強化子、內含子、共同Kozak序列及/或聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，重組載體可進一步包括一或多種填充核酸序列。在一個實施例中，填充核酸序列位於ATP7B之內含子與部分或完整編碼序列之間。
在本文所描述之各種實施例中，重組病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。AAV載體可為血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12之AAV載體(亦即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12)，以及自人類及非人類靈長類組織分離之超過100種變異體中之任一者。參見例如Choi等人，2005,Curr Gene Ther . 5: 299-310, 2005及Gao等人，2005,Curr Gene Ther. 5: 285-297。任何血清型之AAV載體可用於本發明中，且AAV血清型之選擇將部分地視基因療法所靶向之細胞類型而定。對於WD之治療，肝為相關目標器官中之一者。在一些實施例中，AAV載體選自血清型9 (AAV9)、血清型8 (AAV8)、血清型5 (AAV5)或其變異體。在一例示性實施例中，AAV載體為血清型9 (AAV9)或其變異體。
在一些實施例中，重組AAV載體包括AAV ITR序列，當AAV及腺病毒輔助功能以反式提供時，該AAV ITR序列充當載體基因組之載體DNA複製起點及封裝信號兩者。另外，ITR充當大型Rep蛋白質進行單股核酸內切酶切刻的目標，從而自複製中間物解析個別基因組。
在一些實施例中，5'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，5'-ITR序列及3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，5'-ITR序列及/或3'-ITR序列來自AAV2且包含SEQ ID NO: 2或由其組成。在其他實施例中，5'-ITR序列及/或3'-ITR序列來自非AAV2來源。
在一些例示性實施例中，AAV載體為AAV血清型9 (AAV9)載體，且該載體包括本文所描述之強化子、啟動子、內含子、編碼ATP7B Δ1-3-SS之核酸序列(例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15)及聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，AAV9載體進一步包括兩個AAV2、AAV8或AAV9反向末端重複(ITR)序列：一個在強化子之5'及另一個在聚腺苷酸化信號之3'。在一例示性實施例中，AAV9載體包括兩個AAV2反向末端重複(ITR)序列：一個在強化子之5'及另一個在聚腺苷酸化信號之3'。在一些實施例中，AAV2 ITR序列包含SEQ ID NO: 2或由其組成。在另一例示性實施例中，AAV9載體包括兩個AAV9反向末端重複(ITR)序列：一個在強化子之5'及另一個在聚腺苷酸化信號之3'。
在一些例示性實施例中，本發明提供包含SEQ ID NO: 14或由其組成之封裝基因組、或包含該封裝基因組之腺相關病毒(AAV)載體。
在其他態樣中，本申請案提供對應於適用於治療WD之封裝基因組的重組核酸序列。在一些實施例中，本申請案提供與SEQ ID NO: 14具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大一致性之重組核酸。因此，本申請案提供與SEQ ID NO: 14至少80% (例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)一致之重組核酸。在一例示性實施例中，本申請案提供一種重組核酸序列，其包含SEQ ID NO: 14或由其組成。啟動子：
在本文所描述之各種態樣中，提供病毒載體，其含有封裝基因組，該封裝基因組包含有助於驅動及調節轉基因表現(例如ATP7B Δ1-3-SS之表現)的啟動子序列(例如SEQ ID NO: 8)。在例示性實施例中，啟動子序列位於所選5'-ITR序列與ATP7B Δ1-3-SS之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1)之間。在一些實施例中，啟動子序列位於強化子序列下游。在一些實施例中，啟動子序列位於內含子序列上游。在一些說明性實施例中，本文所描述之載體使用甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子，其可視情況位於甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)下游。
在一些實施例中，啟動子選自雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒即刻早期基因(CMV)啟動子、甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子及CAG啟動子。在一例示性實施例中，該啟動子為TTR啟動子。在一個實施例中，該TTR啟動子包含SEQ ID NO: 12或由其組成。
除啟動子之外，載體可含有其他適當轉錄起始、終止、強化子序列及高效RNA處理信號。如下文進一步詳細描述，此類序列包括剪接及聚腺苷酸化(poly A)信號、增強表現之調節元件(亦即WPRE)、使細胞質mRNA穩定之序列、增強轉譯效率之序列(亦即Kozak共同序列)及增強蛋白質穩定性之序列。
在一些實施例中，AAV載體含有進一步包含共同Kozak序列之封裝基因組。在一些實施例中，該共同Kozak序列位於內含子序列下游。在一個實施例中，該共同Kozak序列為GCCGCC (SEQ ID NO: 11)。如熟習此項技術者將理解，共同Kozak序列通常緊鄰編碼序列之上游定位；在此情況下，緊鄰截短ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1)之上游。如熟習此項技術者應瞭解，共同Kozak序列可視為共用對應於治療性多肽(例如截短ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之起始密碼子(例如SEQ ID NO:1)之ATG殘基。為簡化本發明，如本文所描述之共同Kozak序列包含對應於不與治療性多肽(例如截短ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS) (例如SEQ ID NO: 1))共用之區域的六核苷酸序列。ATP7B 多肽：
如本文所描述，本發明之態樣提供重組載體，其包括封裝基因組，該封裝基因組包含AAV 5'-反向末端重複序列(ITR)、啟動子序列、具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15)及AAV 3'-反向末端重複序列(ITR)。ATP7B具有八個跨膜域，其形成用於銅易位之貫穿細胞膜的路徑；及具有六個金屬結合域(MBD)之大N端，該六個金屬結合域各自包含大致70個胺基酸及高度保守的金屬結合基元GMxCxxC (其中x為任何胺基酸)。除典型序列(亦稱為同功異型物，其為最長同功異型物；NCBI參考序列：NP_000044.2)以外，已知四種其他同功異型物：NCBI參考序列，已知四種其他同功異構物：NCBI參考序列NP_ 001005918.1、NP _001230111.1、NP _001317507.1、NP_ 001317 508.1。本文所描述之組合物及方法可用於治療具有引起疾病之非功能ATP7B變異蛋白的個體。
在一個實施例中，截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1)編碼具有如SEQ ID NO: 8中所描述之胺基酸的蛋白質。SEQ ID NO: 1提供具有MBD 1-3缺失之天然人類ATP7B之cDNA。
在本文所描述之各種實施例中，提供載體，其含有包含截短ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1)的封裝基因組。
在一些實施例中，提供載體，其含有包含人類ATP7B之經工程改造之cDNA的封裝基因組，該經工程改造之cDNA已經密碼子最佳化(例如SEQ ID NO: 15)。用本文所描述之載體遞送之多肽涵蓋其中MBD 1-3缺失(ATP7B Δ1-3-SS)之截短ATP7B，其適用於治療WD。
在一些實施例中，用本文所描述之載體表現的多肽為截短人類ATP7B (SEQ ID NO: 8)。載體元件：
在一些實施例中，AAV載體含有進一步包含一或多個強化子序列之封裝基因組。在一個實施例中，強化子選自細胞巨大病毒即刻早期基因(CMV)強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及ApoE強化子。在一例示性實施例中，該強化子為enTTR強化子。在一個實施例中，該enTTR啟動子包含SEQ ID NO: 3或由其組成。
在一些實施例中，AAV載體含有進一步包含一或多個內含子序列之封裝基因組。在一個實施例中，內含子選自SV40小T內含子、兔血紅蛋白次單位β (rHBB)內含子、人類β血球蛋白IVS2內含子、Promega嵌合內含子或hFIX內含子。在一個例示性實施例中，該內含子為SV40小T內含子。在一個實施例中，該SV40小T內含子序列包含SEQ ID NO: 4或由其組成。在另一例示性實施例中，該內含子為rHBB內含子。在一個實施例中，該rHBB內含子序列包含SEQ ID NO: 5或由其組成。
在一些實施例中，AAV載體含有進一步包含聚腺苷酸化信號序列之封裝基因組。在一個實施例中，聚腺苷酸化信號序列選自牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列、SV40聚腺苷酸化信號序列及兔β血球蛋白聚腺苷酸化信號序列。在一例示性實施例中，該聚腺苷酸化信號序列為牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列。在一個實施例中，該BGH聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 6或由其組成。在另一例示性實施例中，該聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列。在一個實施例中，該SV40聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 7或由其組成。AAV 衣殼：
在另一態樣中，本申請案提供適用作用於治療WD之基因療法之藥劑的重組腺相關病毒(rAAV)，其中該rAAV包含如本文所描述之AAV衣殼及載體基因組。在一些實施例中，該AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV (亦即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10或AAVhu37)。在一例示性實施例中，該AAV載體為AAV血清型9 (AAV9)載體、AAV9變異體載體、AAV血清型8 (AAV8)載體、AAV血清型5 (AAV5)載體或AAV血清型2 (AAV2)載體。
AAV9衣殼為由多種AAV9 VP蛋白構成之自組裝AAV衣殼。AAV9 VP蛋白質通常以由SEQ ID NO: 9之核酸序列或與其至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%一致之序列編碼的替代剪接變異體形式表現，該序列編碼SEQ ID NO: 10 (GenBank寄存編號：AAS99264)之VP1胺基酸序列。此等剪接變異體產生具有不同長度之SEQ ID NO: 10的蛋白質。在某些實施例中，AAV9衣殼包括具有與AAS99264 99%一致或與SEQ ID NO: 10 99%一致的胺基酸序列之AAV。亦參見美國專利第7,906,111號及WO/2005/033321。如本文所使用，AAV9變異體包括描述於例如WO/2016/049230、美國專利第8,927,514號、美國專利公開案第2015/0344911號及美國專利第8,734,809號中之彼等變異體。
如本文所指示，AAV9序列及蛋白質適用於製造rAAV。然而，在其他實施例中，選擇另一AAV衣殼。組織特異性係藉由衣殼類型測定。可選擇轉導適合目標(例如肝臟、肌肉、肺或CNS)之AAV血清型作為AAV病毒載體衣殼來源，包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、AAVrh8。參見例如美國專利公開案第2007/0036760號；美國專利公開案第2009/0197338號；及EP1310571。亦參見WO 2003/042397 (AAV7及其他猴AAV)、美國專利第7,282,199號及第7,790,449號(AAV8)。另外，尚待發現之AAV或基於其之重組AAV可用作AAV衣殼來源。此等文獻亦描述可經選擇用於產生AAV之其他AAV且以引用之方式併入此等文獻。在一些實施例中，適用於病毒載體之AAV衣殼可藉由前述AAV衣殼中之一者或其編碼核酸之突變誘發(亦即藉由插入、缺失或取代)來產生。包含重組核酸分子之宿主細胞：
在一些態樣中，本文中提供宿主細胞，其包含重組核酸分子、病毒載體(例如，AAV載體)或本文中所揭示之rAAV。在特定實施例中，宿主細胞可適用於AAV繁殖。
可使用大量宿主細胞，諸如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等。在一些實施例中，宿主細胞可為適於製造重組AAV (rAAV)之細胞(或細胞株)，例如HeLa、Cos-7、HEK293、A549、BHK、Vero、RD、HT-1080、ARPE-19或MRC-5細胞。在某些實施例中，本發明之宿主細胞株為HeLa細胞株(例如HeLa S3)。在另一實施例中，本發明之宿主細胞株為HEK293細胞株。
可使用此項技術中已知之任何適合方法將重組核酸分子或載體遞送至宿主細胞培養物中。在一些實施例中，產生具有插入至宿主細胞株基因組中之重組核酸分子或載體的穩定宿主細胞株。在一些實施例中，產生穩定宿主細胞株，其含有本文中所描述之rAAV載體。在rAAV載體轉染至宿主培養物之後，可藉由各種方法分析rAAV至宿主基因組中之整合，諸如抗生素選擇、螢光活化細胞分選、南方墨點、基於PCR之偵測、螢光原位雜交(fluorescence in situ hybridization )，如Nakai等人, Nature Genetics (2003) 34, 297-302; Philpott等人, Journal of Virology (2002) 76(11):5411-5421, 及Howden 等人, J Gene Med 2008; 10:42-50所描述。此外，穩定細胞株可根據此項技術中熟知之方案建立，諸如Clark, Kidney International第61卷(2002): S9-S15, Yuan等人, Human Gene Therapy, 2011年5月；22(5):613-24中所描述之彼等方案。用於基因療法之重組 AAV ：
腺相關病毒(AAV)屬於細小病毒科(familyParvoviridae )及依賴病毒屬(genusDependovirus )。AAV為封裝線性單股DNA基因組之小型無包膜病毒。AAV DNA之有義股及反義股二者以相等頻率封裝於AAV衣殼中。
AAV基因組特徵在於側接兩個開放閱讀框架(ORF)之兩個反向末端重複(ITR)。AAV2基因組，例如ITR之前125個核苷酸為迴折(palindrom)，其自身摺疊以使鹼基配對最大化及形成T形髮夾結構。ITR之其他20個鹼基(稱為D序列)保持未配對。ITR為對AAV DNA複製而言重要的順式作用序列；ITR為複製起點且充當藉由DNA聚合酶進行之第二股合成的引子。在此合成期間形成之雙股DNA (稱為可複製形式單體)用於第二輪自啟動複製且形成可複製形式二聚體。此等雙股中間物經由股置換機制處理，產生用於封裝之單股DNA及用於轉錄之雙股DNA。Rep結合元件及末端解析位點(terminal resolution site，TRS)定位於ITR內。此等特徵在AAV複製期間由病毒調節蛋白Rep使用以處理雙股中間物。除其在AAV複製中之作用以外，ITR亦為AAV基因組封裝、轉錄、在非容許條件下之陰性調節及位點特異性整合所必需的(Days及Berns,Clin Microbiol Rev 21(4): 583-593，2008)。
AAV之左ORF含有Rep基因，其編碼四種蛋白質--Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。右ORF含有Cap基因，其產生三種病毒衣殼蛋白(VP1、VP2及VP3)。AAV衣殼含有排列成為二十面體對稱之60種病毒衣殼蛋白。VP1、VP2及VP3以1:1:10莫耳比存在(Daya及Berns,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008)。
AAV目前為用於基因療法之最常使用之病毒中之一者。儘管AAV感染人類及一些其他靈長類動物物種，但未知其是否會引起疾病且引發極輕度免疫反應。利用AAV之基因療法載體可感染分裂及靜止細胞兩者且保持染色體外狀態而不整合至宿主細胞之基因組中。由於AAV之有利特徵，本發明涵蓋AAV用於本文所揭示之重組核酸分子及方法之用途。
AAV具有用於基因治療載體之若干所需特徵，包括結合及進入目標細胞、進入細胞核之能力、在細胞核中表現延長之時間段之能力及低毒性。然而，AAV基因組之小尺寸限制可併入的異源DNA之尺寸。為最小化此問題，已構築不編碼Rep及整合效率元件(integration efficiency element，IEE)之AAV載體。ITR由於其為封裝所需之順式信號而保留(Daya及Berns,Clin Microbiol Rev , 21(4):583-593, 2008)。
用於製造適用於基因療法之rAAV的方法為此項技術中熟知的(參見例如美國專利申請案第2012/0100606號、第2012/0135515號、第2011/0229971號及第2013/0072548號；及Ghosh等人，Gene Ther 13(4): 321-329, 2006)，且可與本文所揭示之重組核酸分子及方法一起使用。
在一些態樣中，本申請案係關於本文所揭示之rAAV用於治療威爾森氏症(WD)之用途，其中該rAAV包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組。在一些實施例中，載體含有封裝基因組，該封裝基因組包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：5'-反向末端重複序列(ITR)、啟動子序列、截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15)及3'-反向末端重複序列(ITR)。在一例示性實施例中，封裝基因組亦包含啟動子序列上游之強化子序列、啟動子下游之內含子及3'-ITR上游之聚腺苷酸化序列。因此，在另一例示性實施例中，載體含有封裝基因組，該封裝基因組包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：5'-反向末端重複序列(ITR)、強化子序列、啟動子序列、內含子序列、截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1)、聚腺苷酸化信號序列及3'-反向末端重複序列(ITR)。在另一例示性實施例中，載體含有封裝基因組，該封裝基因組包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：AAV25'-ITR序列、enTTR強化子、TTR啟動子、SV40小T內含子、截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1)、SV40聚腺苷酸化信號序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，該封裝基因組進一步包含位於內含子序列下游之共同Kozak序列。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。
展示用於表現保留MBD 4、5及6之截短ATP7B之例示性封裝基因組載體構築體的說明性圖式提供於圖 1 中，其以5'至3'次序展示：5'-ITR、enTTR強化子、TTR啟動子、SV40小T內含子、共同Kozak序列、截短ATP7B編碼序列、SV40聚腺苷酸化信號序列及3'-ITR。
在某些實施例中，編碼ATP7B Δ1-3-SS之核酸序列為天然人類序列。可替代地，在一些實施例中，編碼ATP7B Δ1-3-SS之核酸序列為密碼子最佳化之人類序列。在治療 WD 方面之經改良功效：
在某些實施例中，本文所描述之由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15編碼的截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)比全長或其他截短形式之ATP7B (例如ATP7B Δ1-4，SEQ ID NO: 13)更有效。在一些態樣中，本發明之ATP7B Δ1-3-SS定位至反式高爾基體網路(TGN)。在某些實施例中，包含SEQ ID NO: 1之核酸序列的rAAV在注射至經診斷患有銅代謝病症(例如威爾森氏症)之哺乳動物之後減少哺乳動物之肝臟及尿液中的銅含量，該rAAV編碼ATP7B Δ1-3-SS。 包含截短 ATP7B 之 AAV 載體之經改良產率 ：
在一個態樣中，本文所描述之包含封裝於AAV8或AAV9中的編碼ATP7B Δ1-3-SS之核酸序列的rAAV的製造產率比全長ATP7B或ATP7B Δ1-4高約1.1至10倍(例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍)。包含 AAV9 衣殼之 AAV 載體之經提升產率 ：
在一個態樣中，包含AAV9衣殼之rAAV之效價產率比包含AAV8衣殼之rAAV高約1.1至10倍(例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍)。醫藥組合物：
本發明提供包含本文中所揭示之rAAV及醫藥學上可接受之載劑的組合物。用於投與rAAV之適合醫藥調配物可發現於例如美國專利申請公開案第2012/0219528號中。適用於本發明之醫藥學上可接受之載劑(媒劑)為習知的。Remington's Pharmaceutical Sciences , E. W. Martin著, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 第15版(1975)，描述適用於一或多種治療化合物、分子或藥劑之醫藥遞送的組合物及調配物。
如前述段落中所強調，本申請案的一些態樣中係關於包含本發明之rAAV的醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，該醫藥組合物經調配用於皮下、肌肉內、皮內、腹膜內或靜脈內投與。在一例示性實施例中，該醫藥組合物經調配用於靜脈內投與。
在一些實施例中，rAAV以適用於輸注於人類個體之緩衝液/載劑的形式調配。緩衝液/載劑應包括防止rAAV黏附至輸注管但不干擾活體內rAAV結合活性之組分。各種適合之溶液可包括以下中之一或多者：緩衝生理鹽水、界面活性劑及生理學上相容之鹽或鹽之混合物，其經調節至等效於約100 mM氯化鈉(NaCl)至約250 mM NaCl之離子強度，或經調節至等效離子濃度之生理學上相容之鹽。pH可在6.5至8.5、或7至8.5、或7.5至8範圍內。適合之界面活性劑或界面活性劑之組合可選自泊洛沙姆(Poloxamer) (亦即，非離子三嵌段共聚物，其由側接聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))之兩個親水鏈的聚氧丙烯10 (聚(環氧丙烷))之中心疏水鏈構成)、SOLUTOL HS 15 (聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL (聚氧辛酸甘油酯)、聚氧基10油醚、TWEEN (聚氧伸乙基脫水山梨糖醇脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。治療威爾森氏症之方法：
在又一態樣中，本申請案係關於治療人類個體之WD之方法，其包含向該人類個體投與治療有效量之本文中所揭示的rAAV，其包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15以用於編碼截短ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)。
在一個實施例中，本申請案提供一種治療WD之方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15)。
在又一態樣中，本申請案係關於治療人類個體之WD之方法，其包含向經診斷具有至少一種ATP7B突變之人類個體投與治療有效量之至少一種包含載體基因組之rAAV，該載體基因組包含截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1)。在一個實施例中，本申請案提供一種治療經診斷具有至少一種ATP7B突變之人類個體之WD的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之編碼序列(例如SEQ ID NO: 1)。如SEQ ID NO: 1表示之編碼序列編碼由SEQ ID NO: 8表示之截短ATP7B。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。
可使用任何適合之方法或途徑來投與本文所描述之rAAV或含rAAV組合物。投與途徑包括例如全身性、經口、吸入、經鼻內、經氣管內、經動脈內、經眼內、經靜脈內、經肌肉內、經皮下、經皮內及其他非經腸投與途徑。在一些實施例中，rAAV或包含rAAV之組合物經靜脈內投與。
所投與之特定劑量對於各患者可為均一劑量，例如每公斤患者體重1.0×1011 至1.0×1014 個病毒基因組(vg/kg)。可替代地，可以根據患者之大致體重或表面積定製患者的劑量。判定適當劑量之其他因素可包括待治療或預防之疾病或病狀、疾病之嚴重程度、投與途徑以及患者之年齡、性別及醫學病狀。熟習此項技術者依常規方式，尤其根據劑量資訊及本文所揭示之分析，進一步改進判定適當治療劑量所必需的計算。亦可經由使用用於判定劑量的已知分析，結合使用適當的劑量反應資料來判定劑量。可在監測疾病進展時調整個別患者的劑量。
在一些實施例中，rAAV係以例如約1.0×1011 vg/kg至約1×1014 vg/kg、約5×1011 vg/kg至約5×1013 vg/kg或約1×1012 vg/kg至約1×1013 vg/kg之劑量投與，如藉由qPCR或數位小滴PCR (ddPCR)所量測。在一些實施例中，rAAV係以約2×1012 vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV係以約5×1012 vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV係以約6×1012 vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV係以約1×1013 vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV係以約7×1013 vg/kg之劑量投與。rAAV可按需要為了所需治療結果而以單次劑量或以多次劑量(諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次劑量)投與。在一些例示性實施例中，僅投與單一劑量之特定rAAV。
在通篇說明書中，在組合物描述為具有、包括或包含特定組分的情況下，或在製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟的情況下，另外預期存在基本上由所列組分組成或由所列組分組成的本發明之組合物，且存在基本上由所列處理步驟組成或由所列處理步驟組成的根據本發明之製程及方法。
在其中稱一種元素或組分包括於所列元素或組分之清單中及/或選自所列元素或組分之清單的申請案中，應理解，該元素或組分可為所列元素或組分中之任一者，或該元素或組分可選自由所列元素或組分中之兩者或更多者組成之群。
此外，應理解，本文所描述之組合物或方法的元素及/或特徵可以多種方式組合而不背離本發明之精神及範疇，無論在本文中係明確抑或隱含的。舉例而言，除非上下文另外理解，否則當提及特定化合物時，該化合物可用於本發明組合物之各種實施例及/或本發明之方法中。換言之，在本申請案內，實施例已以使得申請案能夠得到簡明書寫及繪製的方式描述且描繪，但希望且應瞭解，可在不脫離本發明教示及本發明之情況下以各種方式組合或分離實施例。舉例而言，應瞭解，本文中所描述及描繪之所有特徵可適用於本文中所描述及描繪之本發明之所有態樣。
應理解，除非自上下文及用途另外理解，否則表述「……中之至少一者」個別地包括該表述之前的所列對象中之每一者及所列對象中之兩者或更多者之各種組合。除非自上下文另外理解，否則表述「及/或」結合三個或更多個所列對象時應理解為具有相同含義。
除非另外特定陳述或自上下文中理解，否則使用術語「包括(include/includes/including)」、「具有(has/have/having)」、「含有(contain/contains/containing)」，包括其文法等效物，通常應理解為開放端式的及非限制性的，例如不排除其他未列元素或步驟。
在數量值之前使用術語「約」時，除非另外具體說明，否則本發明亦包括特定數量值本身。除非另外說明或推斷，否則如本文所用，術語「約」係指相對於標稱值之±10%偏差。
應理解，步驟次序或用於執行某些動作之次序為非實質的，只要本發明仍可實施。此外，可同時進行兩個或更多個步驟或動作。
除非主張，否則本文中任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如(such as)」或「包括(including)」)的使用僅意欲更好地說明本發明且不對本發明之範疇造成限制。說明書中之語言不應理解為表示任何未主張之元素為實施本發明必不可少的。 實例
現已大體描述了本發明，將參考以下實例更容易地理解本發明，該等實例僅出於說明本發明之某些態樣及實施例之目的包括在內且不意欲限制本發明。實例 1 - rAAV 載體及由載體產生之 rAAV rAAV 載體
此實例描述具有由SEQ ID NO: 1表示之核酸序列的rAAV載體之構築，其藉由兩個AAV2反向末端重複(ITR，SEQ ID NO: 2)定界。如圖 1 中所說明，在rAAV載體內，ATP7B表現卡匣含有強化子(EnTTR)、啟動子(TTR)、內含子(SV40小T內含子)、編碼截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之SEQ ID NO: 1之核苷酸序列及SV40 poly(A)信號。說明各種組分之載體的圓形圖展示於圖 2 中。
rAAV載體DTC319含有其中保留金屬結合域4、5及6的截短人類ATP7B序列。截短人類ATP7B序列編碼包含由SEQ ID NO: 8表示之兩個絲胺酸殘基S340及S341 (根據NCBI參考序列編號：NP_000044.2)之蛋白質。
猴病毒40 (SV40)晚期聚腺苷酸化信號(Genbank寄存編號J02400 (SEQ ID NO: 7))提供用於ATP7B mRNA之高效聚腺苷酸化之順式序列。此元件充當新生轉錄物之3'-端處之特異性斷裂事件及長聚腺苷尾之添加的信號。
將各截短ATP7B表現卡匣選殖至rAAV載體中。所有rAAV載體均具有編碼康微素抗性基因(kanamycin-resistance gene)之主鏈。作為實例，rAAV載體DTC319係在圖 1 及圖 2 中說明。 rAAV 病毒粒子
rAAV載體基因組為單股DNA基因組。僅ITR序列之間且包括ITR序列的序列封裝於AAV病毒粒子中。藉由將三個質體轉染至人類胚胎腎293 (HEK293)細胞中來產生病毒粒子，其提供E1a及E1b基因產物。第一質體可為本文所描述之rAAV載體。第二質體可為含有野生型AAV2型rep及AAV8或AAV9 cap基因之封裝質體。第三質體為輔助腺病毒質體。
圖 3 中展示例示性封裝質體pAAV2/8.KanR (p2123-FH)質體之說明。在此質體中，腺相關Rep/Cap質體pAAV2/8.KanR (p2123-FH) (8354 bp)編碼來自血清型8之四種野生型AAV2病毒複製(Rep)蛋白及三種野生型AAV VP衣殼(cap)蛋白。在質體內，通常驅動Rep基因表現之AAV p5啟動子已自Rep區之5'-端移動至AAV8 cap區之3'-端。此配置在啟動子與Rep基因(亦即，質體主鏈)之間引入間隔子，從而引起Rep之表現下調及支援高效價rAAV製造之能力的增加。包括康微素抗性基因及MB1來源以用於大腸桿菌(E. coli )中之質體製造。
圖 4 中展示例示性輔助質體pAdΔF6 (Kan)之說明。在此質體中，提供對於AAV複製重要之腺病毒基因組之區，亦即E2A、E4及VA RNA。亦需要腺病毒E1功能，但其由HEK293宿主細胞提供。質體不含有其他腺病毒複製、結構基因或對於腺病毒複製(諸如腺病毒ITR)關鍵之順式元件，且因此預期不產生感染性腺病毒。包括康微素抗性基因及MB1來源以用於大腸桿菌中之質體製造。實例 2 - 在人類 ATP7B 中缺失金屬結合域 (MBD) 1-3 提升製造產率
此實例描述實驗，其表明ATP7B Δ1-3-SS具有高於全長ATP7B或截短形式ATP7B Δ1-4之產率。
缺乏功能ATP7B導致銅在肝臟及其他組織中積聚，其表現為具有神經或精神症狀之肝病。可藉由減少銅吸收或自身體移除過量銅來治療WD。C3He-Atp7btx-j 小鼠不表現功能Atp7b且因此充當WD之小鼠模型。含有經密碼子最佳化之全長人類ATP7B序列的rAAV載體係用於將HEK293細胞與Rep/Cap質體一起轉染，該質體編碼來自血清型8之四種野生動物型AAV2病毒複製(Rep)蛋白及三種野生動物型AAV VP衣殼(cap)蛋白及輔助質體，獲得ATP7BcoFL病毒粒子。
向雄性C3He-Atp7btx-j 小鼠經靜脈內(i.v.)注射1010 或1011 GC/kg的ATP7BcoFL (已經密碼子最佳化之全長人類ATP7B)。向雌性C3He-Atp7btx-j 小鼠經靜脈內注射109 、1010 或1011 GC/kg的相同載體。藉由感應耦合電漿-質譜分析(ICP-MS)評估雄性(由方塊表示)及雌性(由圓表示)之肝銅含量，且與來自年齡匹配之未經注射的雄性及雌性異種接合(Het)及C3He-Atp7btx-j 小鼠之銅含量進行比較。小鼠在大約9月齡時進行屍體剖檢且收集肝臟。資料呈現於圖 5 中。
利用AAV載體之基因療法可用於治療WD。然而，存在對可封裝於AAV載體衣殼內部之cDNA之尺寸的限制。野生型AAV基因組為4.7 kb，且封裝較大基因組可潛在地降低囊封於AAV衣殼內之DNA序列的產率及完整性。因此，將編碼ATP7B Δ1-3-SS之核苷酸序列封裝於AAV8衣殼內，且測試ATP7B Δ1-3-SS之製造產率。將編碼全長(FL)、ATP7B Δ1-3-SS或ATP7B Δ1-4之rAAV載體轉染至HEK293細胞中。將編碼來自血清型8之四種野生型AAV2病毒複製(Rep)蛋白及三種野生型AAV VP衣殼(cap)蛋白之Rep/Cap質體及輔助質體與表現各種ATP7B蛋白之rAAV載體共轉染。圖 6 展示在轉染各種rAAV載體之後自宿主細胞產生之rAAV的效價。Y軸指示基因組複本(GC)中各rAAV效價之總產率。ATP7B Δ1-3-SS的產率比全長或ATP7B del1-4截短形式高。實例 3 - ATP7B Δ1-3-SS 在恢復銅 代謝方面比 ATP7B FL 更有效
此實例描述一種實驗，其表明ATP7B Δ1-3-SS在恢復C3He-Atp7btx-j 小鼠之銅代謝方面比ATP7B全長(ATP7B FL)或ATP7B Δ1-4更有效。
如上文在實例 2 中所描述，將大型cDNA序列封裝在AAV載體衣殼內部可降低DNA序列之完整性且具有潛在品質問題。因此，將截短型式之人類ATP7B封裝於AAV8衣殼內且測試其在恢復銅代謝方面之功效。向C3He-Atp7btx-j 小鼠投與涵蓋全長或截短人類ATP7B之1.0 × 1013 GC/kg的AAV8載體。藉由感應耦合電漿-質譜分析評估肝臟及尿液銅含量。圖 7 展示ATP7B Δ1-3-SS在恢復C3He-Atp7btx-j 小鼠之銅代謝方面比ATP7B全長(ATP7B FL)或ATP7B Δ1-4更有效。實例 4 - 包含 AAV9 衣殼之 AAV 載體展示較高病毒製造
此實例描述一種實驗，其展示包含AAV9衣殼之AAV載體之製造與包含AAV8衣殼之AAV載體之製造相比產生較高產率。藉由qPCR量化DNase抗性粒子(DRP)對不同AAV載體進行滴定。圖 8 展示在轉染包含AAV8衣殼或AAV9衣殼之rAAV載體(DTC319)之後自宿主細胞產生之rAAV的總產率(基因組複本(GC)之效價)。實例 5 - ATP7B Δ1-3-SS 之治療特性
此實例描述動物研究，其表明ATP7B Δ1-3-SS (例如DTC319)在改善及治療小鼠模型(C3He-Atp7btx-j )中威爾森氏症(WD)之症狀方面的功效。在此實例中，評估三組雄性小鼠：WD小鼠(C3He-Atp7btx-j 小鼠)，其經投與在AAV8載體中編碼之ATP7B Δ1-3-SS (例如DTC319)之AAV輸注或媒劑對照(稀釋緩衝液)之靜脈內注射；及野生型(WT)小鼠，其充當陰性對照。對於輸注，rAAV係藉由黏附HEK細胞之三重短暫轉染產生且藉由氯化銫梯度超速離心(此項技術中熟知之純化方法)純化。在研究終點、輸注後4週，評估各組之小鼠之肝銅積聚、血漿銅藍蛋白活性及肝臟病病理學。
肝銅積聚係藉由感應耦合電漿-質譜分析(ICP-MS)量測，且相較於媒劑對照，在投與了ATP7B Δ1-3-SS (例如DTC319)之WD小鼠中的肝銅含量顯著降低(參見 圖 9 ，DelA為條形)。圖 9 展示在投與了媒劑對照(稀釋緩衝液；WD為條形)之靜脈內注射或攜載天然ATP7B Δ1-3-SS (DelA為條形)之AAV8輸注之C3He-Atp7btx-j 小鼠及野生型(WT)小鼠(WT為條形)中之肝銅積聚含量(µg /g)。值係以平均值±SEM表示。
投與ATP7B Δ1-3-SS (例如DTC319)之後的WD小鼠中之血漿銅藍蛋白活性顯著增加(參見 圖 10 ，DelA為條形)。使用如此項技術中熟知的基於酶反應之比色活性分析來偵測血漿銅藍蛋白活性(參見 Schosinsky等人,Clin Chem. 1974; 20(12):1556-63)。圖 10 展示在接受媒劑對照(稀釋緩衝液；WD為條形)之靜脈內注射或攜載天然ATP7B Δ1-3-SS (DelA為條形)之AAV8輸注之C3He-Atp7btx-j 小鼠中及WT (野生型)小鼠(WT為條形)中之血漿銅藍蛋白活性，如藉由基於酶反應之比色活性分析所量測。該圖展示如以在540 nm下讀取之光學密度OD量測之血漿銅藍蛋白的活性。值係以平均值±SEM表示。
自各組中之所有動物收集肝臟且用H&E (蘇木精及曙紅色料)染色。由專業認證病理學家根據0-4評分系統針對核增大及肝細胞肥大、結構紊亂、發炎性浸潤及肝細胞壞死對H&E載片進行評估。對一組中各小鼠之評分求平均。圖 11 展示如在對各組中動物的H&E載片進行標準評估之後獲得之平均評分。實例 6 - 作為威爾森氏症 (WD) 之可行療法的 AAV9 基因療法
此實例描述包含ATP7B Δ1-3-SS之rAAV粒子治療個體之WD之用途。含有編碼截短人類ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS)之核苷酸序列之rAAV載體(例如DTC319) (圖 2 )、編碼來自血清型9之四種野生型AAV2病毒複製(Rep)蛋白及三種野生型AAV VP衣殼(cap)蛋白之Rep/Cap質體及如實例 1 中所描述之輔助質體共轉染至宿主細胞中。接著向需要WD療法之個體經靜脈內投與所收集之rAAV粒子。可替代地，向個體投與自與圖 12 所表示之載體轉染之宿主細胞收集之rAAV粒子以用於治療WD。
序列表 SEQ ID NO: 1 (Δ1-3 ATP7B，天然) (呈粗體及帶底線之核苷酸編碼兩個絲胺酸殘基S340及S341)，其基於野生型蛋白質序列編號)) SEQ ID NO: 2 (AAV2 ITR) SEQ ID NO: 3 (enTTR強化子序列) SEQ ID NO: 4 (SV40小T內含子) SEQ ID NO: 5 (rHBB內含子) SEQ ID NO: 6 (BGH聚腺苷酸化信號序列) SEQ ID NO: 7 (SV40聚腺苷酸化信號序列) SEQ ID NO: 8 DEL 1-3 ATP7B天然，蛋白質 (S340及S341 (基於野生型蛋白質序列編號)係粗體及帶底線的) SEQ ID NO: 9 (AAV9核酸序列) SEQ ID NO: 10 (AAV9胺基酸序列) SEQ ID NO: 11 (共同Kozak序列) SEQ ID NO: 12 (TTR啟動子序列) SEQ ID NO: 13 (DEL 1-4 ATP7B天然，蛋白質) SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15
參考以下附圖可以更完全地理解本發明。
圖 1 為展示例示性封裝基因組載體構築體的示意圖，該基因組載體構築體包含編碼截短人類銅轉運ATPase 2 (ATP7B)之核苷酸序列，其中金屬化結合域(MBD) 1-3已缺失，但存在MBD3與MBD4之間包括兩個絲胺酸殘基(S340及S341)的富絲胺酸環(「ATP7B Δ1-3-SS」)。
圖 2 為例示性rAAV載體(DTC319)之示意性表示，其中展示各種關鍵組分。
圖 3 為例示性質體(pAAV2-8.KanR (p2123-FH) AAV Rep/Cap質體)之示意性表示，該質體在與rAAV載體共轉染至宿主細胞中時在封裝rAAV過程中提供Rep及Cap功能。
圖 4 為例示性質體(pAdΔ6 (Kan)腺病毒輔助質體)之示意性表示，該質體用於在與rAAV載體及Rep/Cap質體共轉染至宿主細胞中時製造rAAV。
圖 5 為注射ATPBcoFL (全長密碼子最佳化人類ATP7B)之109 、1010 或1011 個GC之C3He-Atp7btx-j 小鼠(雄性(方塊)及雌性(圓))中之肝銅散佈圖。
圖 6 展示在轉染編碼人類ATP7B之完全或部分編碼序列之rAAV載體(攜載編碼全長(FL)人類ATP7B、ATP7B Δ1-3-SS或MBD 1-4缺失(del 1-4)人類ATP7B (ATP7B Δ1-4)之核苷酸序列之rAAV載體)之後自宿主細胞產生之總產率rAAV (基因組複本(GC)之效價)。資料展示ATP7B Δ1-3-SS之產率比全長或ATP7B Δ1-4截短形式高。
圖 7 為展示ATP7B Δ1-3-SS在恢復C3He-Atp7btx-j 小鼠之銅代謝方面比ATP7B全長(ATP7B FL)或ATP7B Δ1-4有效的散佈圖。該圖表示分別在向C3He-Atp7btx-j 小鼠注射攜載全長人類ATP7B、ATP7B Δ1-3-SS或ATP7B Δ1-4之AAV8之後分析之尿銅及肝銅含量(µg/g) (方塊及圓)。投與有媒劑對照之C3He-Atp7btx-j (PBS)小鼠充當對照。
圖 8 展示在轉染編碼AAV8或AAV9衣殼之rAAV載體(DTC319)之後自宿主細胞產生之總產率rAAV (基因組複本(GC)中之效價)。
圖 9 為投與了媒劑對照(稀釋緩衝液；WD)之靜脈內注射或攜載天然ATP7B Δ1-3-SS (DelA)之AAV8輸注之C3He-Atp7btx-j 小鼠及野生型小鼠(WT)中之肝銅積聚含量(µg/g)之條形圖。值表示為平均值±SEM (平均值之標準誤差)。
圖 10 為投與有媒劑對照(稀釋緩衝液；WD)之靜脈內注射或攜載天然ATP7B Δ1-3-SS (DelA)之AAV8輸注之C3He-Atp7btx-j 小鼠及野生型小鼠(WT)中之血漿銅藍蛋白活性之條形圖，如藉由基於酶反應之比色活性分析所量測。
圖 11 為在針對核增大及肝細胞肥大、結構紊亂、發炎性浸潤及肝細胞壞死對H&E載片進行標準評估之後的平均評分的條形圖。
圖 12 為展示例示性封裝基因組載體構築體DTC327之直觀圖，該封裝基因組載體構築體DTC327包含：具有PPIA polyA、AAV2 Rep/ITR以及包含145 bps ITR之完全p5啟動子之AAV9衣殼；及編碼截短人類銅轉運ATPase 2 (ATP7B)之核酸序列，其中金屬結合域(MBD) 1-3已缺失，但存在MBD3與MBD4之間包括兩個絲胺酸殘基(S340及S341)的富絲胺酸環。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Claims (19)

  1. 一種重組核酸構築體，其包含：(a)5'-反向末端重複(ITR)序列；(b)啟動子序列；(c)一核酸序列，其編碼具有如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之截短人類銅轉運ATPase 2(ATP7B)，其中金屬結合域(MBD)1-3已缺失，但在MBD3與MBD4之間存在包括兩個絲胺酸殘基(S340及S341)的富絲胺酸環；及(d)3'-ITR序列。
  2. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組包含：a.AVV 5'-反向末端重複(ITR)序列；b.啟動子序列；c.一核酸序列，其編碼具有如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之截短人類銅轉運ATPase 2(ATP7B)，其中金屬結合域(MBD)1-3已缺失，但在MBD3與MBD4之間存在包括兩個絲胺酸殘基(S340及S341)的富絲胺酸環；及d.AAV 3'-ITR序列。
  3. 如請求項2之rAAV，其中該AAV衣殼來自血清型9、8、1、2、3、4、5、6、7、10、11、12、rh10或hu37之AAV。
  4. 如請求項2或3之rAAV，其中該啟動子序列係選自甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子序列、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子序列、細胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)即刻早期基因啟動子序列、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子序列、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子序列及CAG啟動子序列。
  5. 如請求項2或3之rAAV，其中該AAV 5'-ITR序列及/或該AAV 3'-ITR序列來自AAV2。
  6. 如請求項2或3之rAAV，其中該載體基因組進一步包含一或多個強化子序列，該強化子序列係選自甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)序列、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因強化子序列、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子序列、En34強化子序列及ApoE強化子序列。
  7. 如請求項6之rAAV，其中該強化子序列位於該啟動子序列上游。
  8. 如請求項2或3之rAAV，其中該載體基因組進一步包含一或多個內含子序列。
  9. 如請求項8之rAAV，其中該內含子序列係選自SV40小T內含子序列、兔血紅蛋白次單位β(rHBB)內含子序列、人類β血球蛋白IVS2內含子序列、Promega嵌合內含子序列及hFIX內含子序列。
  10. 如請求項2或3之rAAV，其中該載體基因組進一步包含聚腺苷酸化信號序列。
  11. 如請求項10之rAAV，其中該聚腺苷酸化信號序列係選自SV40聚腺苷酸化信號序列、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列及兔β血球蛋白聚腺苷酸化信號序列。
  12. 一種rAAV，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組包含：a)SEQ ID NO：2之AVV 5'-反向末端重複(ITR)序列；b)SEQ ID NO：3之強化子序列；c)SEQ ID NO：12之啟動子序列；d)編碼截短人類銅轉運ATPase 2(ATP7B)之核酸序列，其具SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15；及e)SEQ ID NO：2之AAV 3'-ITR序列。
  13. 一種組合物，其包含如請求項2至12中任一項之rAAV及醫藥學上可接受之載劑。
  14. 一種如請求項2至12中任一項之rAAV之用途，其係用以製備治療人類個體之威爾森氏症之藥物。
  15. 如請求項14之用途，其中該藥物係經皮下、經肌肉內、經皮內、經腹膜內或經靜脈內投與。
  16. 如請求項14或15之用途，其中該藥物係以提供約1×1011基因組複本(genome copies，GC)/kg至約1×1014GC/kg之劑量之rAAV投與。
  17. 如請求項16之用途，其中該藥物係以提供約1×1012GC/kg至約1×1013個GC/kg之劑量之rAAV投與。
  18. 如請求項14或15之用途，其中該治療包含投與單次劑量之rAAV。
  19. 如請求項14或15之用途，其中該治療包含投與多次劑量之rAAV。
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