JP7746437B2 - ウイルソン病を処置するための遺伝子治療構築物 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１月４日出願の米国仮特許出願第６２／７８８，３２４号；および２０１９年４月１６日出願の米国仮特許出願第６２／８３４，８３０号（これらの開示は、全ての目的のためにその全体において本明細書に参考として援用される）に基づく利益および優先権を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式において電子提出され、その全体において参考として援用される配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピー（作成日：２０１９年１２月３１日）は、名称ＵＬＰ－００３ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、大きさが４９，８４６バイトである。

発明の技術分野
本出願は概して、ウイルソン病（ＷＤ）を処置するための遺伝子治療におけるアデノ随伴ウイルスベクターおよびその使用法に関する。

発明の背景
ウイルソン病（ＷＤ）は、主に肝臓において、その後、神経系および他の組織において銅の蓄積を引き起こす常染色体劣性遺伝障害である。ＷＤは、３０，０００人に対しておよそ１人に罹患し、第１３染色体上の銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）遺伝子における変異によって引き起こされる希な障害である。６００超の特有のＡＴＰ７Ｂ変異が存在する。ＡＴＰ７Ｂは、主に肝細胞において発現され、銅の膜貫通輸送において機能する。ＡＴＰ７Ｂタンパク質の機能がないことまたは低減は、肝細胞が胆汁へと銅を排出することの低減を生じ、肝臓疾患を引き起こす。適切な処置なしに時間が経過すると、高い銅レベルによって、生命を脅かす器官損傷が引き起こされ得る。

肝臓のＷＤを有する患者は通常、小児期後期または思春期に現れ、急性肝炎、劇症肝不全、または進行性慢性肝疾患の特徴を示す。ＷＤの神経症状発現は、代表的には、肝臓疾患より遅く現れ、大部分は、２０年または３０年で現れ、錐体外路症状、小脳症状、および大脳関連症状を含む。

ＷＤの医療処置の目的は、身体からの銅の毒性沈着を除去し、その再蓄積を防止することである。ＷＤに関する現行の処置アプローチは、キレート剤（Ｄ－ペニシラミン、トリエンチン、および亜鉛塩）での毎日の経口治療である。内科的治療は、大部分において有効であるが、全てのＷＤ患者において有効であるわけではない。肝移植は、劇症肝不全または進行性肝不全を呈するＷＤ患者において治療選択肢である。しかし、移植レシピエントは、定常的な免疫抑制レジメンを維持して、拒絶を防止することが要求とされる。

本発明は、短縮されているがなお機能的なＡＴＰ７Ｂを発現する遺伝子を、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて患者に送達することによって、ＷＤの改善されかつ持続可能な処置の必要性に対処する。本発明の短縮型ＡＴＰ７Ｂは、ＷＤを処置するにあたって改善された有効性を有し、野生型およびＡＴＰ７Ｂタンパク質の他の短縮型形態を超える製造の容易さおよび効率という利点を有する。

発明の要旨
本発明は、遺伝子治療における組成物およびそれらの使用法を提供する。ＷＤの処置において有用なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、本明細書で提供される。１つの局面において、本発明は、５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；プロモーター配列；金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする核酸配列；ならびに３’－ＩＴＲ配列を含む組換え核酸構築物を提供する。

別の局面において、本発明は、ウイルソン病の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ここでｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよびその中にパッケージされたベクターゲノムを含み、上記ベクターゲノムは、５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；プロモーター配列；金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする核酸配列；ならびに３’－ＩＴＲ配列を含むｒＡＡＶを提供する。

本発明のこれらのおよび他の局面および特徴は、本出願の以下の節において記載される。

本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。

図１は、金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）（「ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ」または「ＡＴＰ７Ｂ ｄｅｌ１－３ネイティブ」）をコードするヌクレオチド配列を含む例示的ベクターゲノム構築物を示す例示的ダイアグラムである。例示的ベクターゲノム構築物の特徴は、以下で提供される：

図２は、例示的ＡＡＶベクター（ＤＴＣ３１９）の模式図であり、その中で種々の重要な構成要素が示される。

図３は、ＡＡＶベクターで宿主細胞に共トランスフェクトした場合に、パッケージングｒＡＡＶの中にＲｅｐおよびＣａｐ機能を提供する例示的プラスミド、ｐＡＡＶ２／８．ＫａｎＲ（ｐ２１２３ＦＨ）ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドの模式図である。

図４は、ＡＡＶベクターおよびＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドで宿主細胞に共トランスフェクトした場合の、ｒＡＡＶ生成のための例示的プラスミド、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）アデノウイルスヘルパープラスミドの模式図である。

図５は、１０^９、１０^１０、または１０^１１ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇのＡＴＰ７ＢｃｏＦＬ（コドン最適化されている全長ヒトＡＴＰ７Ｂ）のいずれかを注射したＣ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊ雌性マウス（丸によって表される）および１０^１０または１０^１１ ＧＣ／ｋｇいずれかのその同じベクターを注射したＣ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊ雄性マウス（四角によって表される）における肝臓銅（μｇ／ｇ）の散布図である。年齢を合わせた注射していない雄性および雌性ヘテロ接合性（Ｈｅｔ）のおよびＣ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスに由来する銅レベルをまた、散布図に表す。

図６は、ヒトＡＴＰ７Ｂの完全または部分的コード配列をコードするＡＡＶベクター（全長（ＦＬ）ヒトＡＴＰ７Ｂをコードするヌクレオチド配列を有するＡＡＶベクター；ＭＢＤ １～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在するヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）をコードするヌクレオチド配列を有するＡＡＶベクター；またはＭＢＤ １～４が欠失されているヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－４）をコードするヌクレオチド配列を有するＡＡＶベクター）のトランスフェクション後の宿主細胞から生成した全収量ｒＡＡＶ（ＧＣにおける滴定）を示す棒グラフである。

図７は、Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスに全長ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ ＦＬ）、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ、またはＡＴＰ７Ｂ Δ１－４を有するＡＡＶ８を注射した後にアッセイした尿中および肝臓銅レベル（それぞれ、四角および丸（μｇ／ｇ））の散布図である。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を投与したＣ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスを、コントロール（ビヒクル）として供した。

図８は、金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂをコードし、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９いずれかのキャプシドをコードするＡＡＶベクター（ＤＴＣ３１９）のトランスフェクション後の宿主細胞から生成した全収量ｒＡＡＶ（ＧＣにおいて滴定）を示す棒グラフである。

図９は、ビヒクルコントロール（希釈緩衝液；ＷＤ）の静脈内注射またはネイティブＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ（ＤｅｌＡ）を有するＡＡＶ８の注入を投与したＣ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスにおける肝臓銅蓄積レベル（μｇ／ｇ 乾燥重量）の棒グラフである。棒グラフにおいて表される注射していない野生型マウス（ＷＴ）の肝臓銅蓄積レベルを、陰性コントロールとして供した。値は平均±ＳＥＭ（平均標準誤差）として表した。

図１０は、酵素反応ベースの比色活性アッセイによって測定されるように、ビヒクルコントロール（希釈緩衝液；ＷＤ）の静脈内注射またはネイティブＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ（ＤｅｌＡ）を有するＡＡＶ８の注入を投与したＣ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスにおけるセルロプラスミン活性の棒グラフである。注射されていない野生型（ＷＴ）マウスにおけるセルロプラスミン活性はまた、その同じ酵素反応ベースの比色活性アッセイによって測定されるように、その棒グラフにおいて表される。

図１１は、核拡大および肝細胞肥大、組織崩壊、炎症性浸潤、および肝細胞壊死に関して、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）スライドの標準的評価後の平均スコアの棒グラフである。

図１２は、ＰＰＩＡポリＡを伴うＡＡＶ９キャプシド、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ／１４５ｂｐのＩＴＲを含む完全ｐ５プロモーターを伴うＩＴＲ、および金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードするヌクレオチド配列を含む例示的ベクターゲノム構築物ＤＴＣ３２７を示す例示的模式図である。

発明の詳細な説明
本発明は、ウイルソン病（ＷＤ）を処置することにおいて使用するための薬剤および組成物を提供する。本明細書で記載されるとおりの本発明の核酸配列、ベクター、組換えウイルス、および関連する組成物は、ＷＤを改善、防止、または治療するために使用され得る。

別段注記されなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学において共通する用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ、発行
Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 発行 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， 発行 ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）において見出され得る。

本開示の種々の実施形態の検討を促進するために、具体的な用語の以下の説明が提供される：

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）： ヒトおよびいくらかの他の霊長類の種に感染する、小さな複製欠損性の、エンベロープのないウイルス。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂中の細胞および休止細胞の両方に感染し得、宿主細胞のゲノムへと組み込まれることなく、染色体外状態で持続し得る。これらの特徴は、ＡＡＶを遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターにしている。現在では、１２の認識されているＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～１２）が存在する。

投与／投与する： 被験体に任意の効果的な経路によって薬剤（例えば、治療剤（例えば、組換えＡＡＶ））を提供するまたは与えること。例示的な投与経路としては、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、および静脈内）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻内、膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。

ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ： 本明細書で使用される場合、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳとは、金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）に言及する。

コドン最適化した： 「コドン最適化した」核酸とは、そのコドンが、特定のシステム（例えば、特定の種または種の群）における発現のために最適であるように変化させた核酸配列に言及する。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞または特定の哺乳動物種（例えば、ヒト細胞）における発現のために最適化され得る。コドン最適化は、そのコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。

エンハンサー： プロモーターの活性を増大させることによって、転写速度を増大させる核酸配列。

イントロン： タンパク質のコード情報を含まない遺伝子内のＤＮＡの伸長部。イントロンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。

逆位末端反復配列（ＩＴＲ）： 効率的な複製のために必要とされるアデノ随伴ウイルスのゲノムにおける対称的な核酸配列。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。上記ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡ合成のための複製起点として働き、ベクター被包化のために必要とされる。

単離された： 「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞）は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞もしくは組織、または生物自体における他の生物学的構成要素（例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞）から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製されたものを含む。上記用語はまた、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク、ならびに化学合成された核酸分子およびタンパク質を含む。

作動可能に連結された： 第１の核酸配列は、この第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係性に配置されている場合に、この第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、このプロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、そのコード配列に作動可能に連結されている。概して、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、同じリーディングフレームにある。

薬学的に受容可能なキャリア： 本開示において有用な薬学的に受容可能なキャリア（ビヒクル）は、従来どおりである。Ｅ． Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， 第１５版（１９７５））は、１またはこれより多くの治療用化合物、分子または薬剤の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載する。

概して、上記キャリアの性質は、使用されている特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、薬学的におよび生理学的に受容可能な流体（例えば、水、生理食塩水、平衡化塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固形の組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態）に関しては、従来の非毒性固体キャリアは、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与されるべき薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート））を含み得る。

疾患を防止する、処置する、または改善する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ， ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｒ ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ ａ ｄｉｓｅａｓｅ）： 疾患（例えば、ＷＤ）を「防止する」とは、疾患の完全な発生を阻害することをいう。「処置する」とは、疾患または疾患が発生し始めた後の病的状態（例えば、ＷＤ）の徴候または症状を改善する、治療的介入をいう。「改善する」とは、疾患（例えば、ＷＤ）の徴候または症状の数または重篤度の低減をいう。

プロモーター： 核酸（例えば、遺伝子）の転写を指示する／開始するＤＮＡの領域。プロモーターは、転写開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。

精製された： 用語「精製された」は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、それは相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然に関連付けられたタンパク質および他の夾雑物から完全にまたは部分的に単離されているものである。ある特定の実施形態において、用語「実質的に精製された」とは、細胞、細胞培養培地、または他の粗製調製物から単離され、その最初の調製物の種々の構成要素（例えば、タンパク質、細胞デブリ、および他の構成要素）を除去するために分画に供された、ペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物に言及する。

組換え： 組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するか、または２つの別の方法で分離された配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または核酸分子の単離されたセグメントの人工的な操作によって（例えば、遺伝子工学技術によって）達成され得る。

同様に、組換えウイルスは、天然に存在しない配列（例えば、ゲノム配列）または異なる由来の少なくとも２つの配列の人工的組み合わせによって作製される配列を含むウイルスである。用語「組換え」はまた、天然の核酸分子、タンパク質またはウイルスの一部の付加、置換、または欠失によってのみ変更された核酸、タンパク質およびウイルスを含む。本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶ」とは、組換え核酸分子（例えば、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂをコードする核酸分子（例えば、配列番号１または配列番号１５）をコードする組換え核酸分子）がパッケージされたＡＡＶ粒子をいう。

配列同一性： ２もしくはこれより多くの核酸配列、または２もしくはこれより多くのアミノ酸配列の間の同一性または類似性は、その配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は、パーセンテージ同一性に関して測定され得る；パーセンテージが高いほど、配列はより同一である。配列類似性は、パーセンテージ類似性に関して測定され得る（保存的アミノ酸置換が考慮される）；パーセンテージが高いほど、配列はより類似である。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的方法を使用して整列される場合、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、そのオルソログのタンパク質またはｃＤＮＡが、関係性がより遠い種（例えば、ヒト配列およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較して、関係性がより近い種（例えば、ヒト配列およびマウス配列）に由来する場合により顕著である。

比較のための配列のアラインメント法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、以下に記載される： Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２， １９８１； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０： Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ， ７３：２３７－４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ５：１５１－３， １９８９； Ｃｏｒｐｅｔら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ． １６：１０８８１－９０， １９８８； Ｈｕａｎｇら Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８， １５５－６５， １９９２：およびＰｅａｒｓｏｎら， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｒｉｏ． ２４：３０７－３１， １９９４。Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０は、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な考慮事項を示す。

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０）は、配列分析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとともに使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を含むいくつかの情報源から、およびインターネット上で入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩウェブサイトで見出され得る。

血清型： 抗原の特徴的なセットによって区別される、関連性が近い微生物（例えば、ウイルス）の群。

Ｓｔｕｆｆｅｒ配列： ２つの核酸特徴の間に（例えば、プロモーターとコード配列との間に）所望の間隔を作り出すために、または核酸分子が所望の長さのものであるように、核酸分子を伸長させるために代表的には使用されるより大きな核酸分子（例えば、ベクター）内部に含まれるヌクレオチドの配列をいう。Ｓｔｕｆｆｅｒ配列は、タンパク質コード情報を含まず、未知／合成由来／および／またはより大きな核酸分子の内部の他の核酸配列に関連しないものであり得る。

被験体： 生きている多細胞の脊椎のある生物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー）。

合成の： 実験室において人工的手段によって生成される。例えば、合成核酸は、実験室において化学合成され得る。

治療上有効な量： 薬剤で処置される被験体において、または細胞において、所望の効果を達成するために十分な、特定の医薬または治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）の量。上記薬剤の有効量は、処置されている被験体または細胞、および治療用組成物の投与様式が挙げられるが、これらに限定されないいくつかの要因に依存する。

ベクター： ベクターは、ベクターが宿主細胞において複製するおよび／または組み込まれる能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターはまた、１またはこれより多くの選択マーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含み得る。発現ベクターは、挿入された遺伝子の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。本明細書中のいくつかの実施形態において、上記ベクターは、ＡＡＶベクターである。

別段説明されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「その、この、上記（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に示さなければ、複数形への言及を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値が、近似値であり、説明のために提供されることは、さらに理解されるべきである。本明細書で記載されるものに類似または等価な方法および材料が本開示の実施または試験において使用され得るものの、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（用語の説明を含む）が優先する、さらに、上記材料、方法および例は、例証に過ぎず、限定ではないことが意図される。

ウイルスベクター
いくつかの局面において、本開示は、ＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）、およびＡＡＶ ３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。

いくつかの実施形態において、上記ゲノムは、エンハンサー、イントロン、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、および／または本明細書で記載されるとおりのポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記組換えベクターは、１またはこれより多くのｓｔｕｆｆｅｒ核酸配列をさらに含み得る。１つの実施形態において、ｓｔｕｆｆｅｒ核酸配列は、上記イントロンと、ＡＴＰ７Ｂの部分的または完全なコード配列との間に置かれている。

本明細書で記載される種々の実施形態において、上記組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。上記ＡＡＶベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のＡＡＶベクター（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２）、ならびにヒトおよび非ヒト霊長類組織から単離された１００を超える改変体のうちのいずれか１つであり得る。例えば、Ｃｈｏｉら， ２００５， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ２９９－３１０， ２００５およびＧａｏら， ２００５， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ２８５－２９７を参照のこと。任意の血清型のＡＡＶベクターは、本発明において使用され得、ＡＡＶ血清型の選択は、遺伝子治療のために標的化される細胞タイプに一部依存する。ＷＤの処置に関しては、肝臓は、関連する標的器官のうちの１つである。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型５（ＡＡＶ５）、またはこれらの改変体から選択される。例示的実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、血清型９（ＡＡＶ９）またはこれらの改変体である。

いくつかの実施形態において、上記組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、これは、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がｔｒａｎｓで提供される場合に、ベクターＤＮＡ複製起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。さらに、上記ＩＴＲは、大きなＲｅｐタンパク質による１本鎖ヌクレオチド内部ニック形成（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｔｉｃ ｎｉｃｋｉｎｇ）の標的として働き、個々のゲノムを複製中間体から分離する。

いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来し、配列番号２を含むかまたはからなる。他の実施形態において、上記５’－ＩＴＲ配列および／または上記３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源に由来する。

いくつかの例示的実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）ベクターであり、上記ベクターは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）、および本明細書で記載されるポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ９ベクターは、２つのＡＡＶ２、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９ 逆位末端反復（ＩＴＲ）配列をさらに含む：一方は、上記エンハンサーの５’側および一方は、上記ポリアデニル化シグナルの３’側。例示的実施形態において、上記ＡＡＶ９ベクターは、２つのＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む：一方は、上記エンハンサーの５’側および一方は、上記ポリアデニル化シグナルの３’側。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、配列番号２を含むかまたはからなる。別の例示的実施形態において、上記ＡＡＶ９ベクターは、２つのＡＡＶ９逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む：一方は、上記エンハンサーの５’側および一方は、上記ポリアデニル化シグナルの３’側。

いくつかの例示的実施形態において、本開示は、ＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、配列番号１によって表され、ネイティブＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列、およびＡＡＶ ３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むベクターゲノムを含む組換え核酸を提供する。いくつかの例示的実施形態において、本開示は、ＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、配列番号１５によって表され、コドン最適化したＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列、およびＡＡＶ ３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むベクターゲノムを含む組換え核酸を提供する。いくつかの例示的実施形態において、本開示は、ＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、配列番号１によって表され、ネイティブＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列を含む、配列番号１４からなるベクターゲノム、またはそのベクターゲノムを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。

さらなる局面において、本出願は、ＷＤの処置において有用なベクターゲノムに相当する組換え核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、本出願は、配列番号１４と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である組換え核酸を提供する。従って、本出願は、配列番号１４と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％）同一である組換え核酸を提供する。例示的実施形態において、本出願は、ＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、配列番号１によって表され、ネイティブＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列、およびＡＡＶ ３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むベクターゲノムに相当する組換え核酸配列であって、ここで上記ベクターゲノムは、配列番号１４を含むかまたはからなる組換え核酸配列を提供する。例示的実施形態において、本出願は、ＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、配列番号１５によって表され、コドン最適化したＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列、およびＡＡＶ ３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むベクターゲノムに相当する組換え核酸配列を提供する。

プロモーター：
本明細書で記載の種々の局面において、導入遺伝子発現、例えば、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ（例えば、配列番号８によって表されるＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳのアミノ酸配列）の発現を駆動および調節する助けとなるプロモーター配列を含むＡＡＶベクターが、提供される。例示的実施形態において、上記プロモーター配列は、選択された５’－ＩＴＲ配列とＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳのコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）との間に位置する。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、エンハンサー配列の下流に位置する。いくつかの実施形態において、上記プロモーター配列は、イントロン配列の上流に位置する。いくつかの例証的実施形態において、本明細書で記載されるベクターは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターを使用し、これは、必要に応じて、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）の下流に位置し得る。

いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、α１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、およびＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、そのプロモーター、第１のエキソン、およびＣＢＡ遺伝子の第１のイントロン、およびウサギβ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを使用して構築される）から選択される。例示的実施形態において、上記プロモーターは、上記ＴＴＲプロモーターである。１つの実施形態において、上記ＴＴＲプロモーターは、配列番号１２を含むかまたはからなる。

プロモーターに加えて、ＡＡＶベクターは、他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、および効率的なＲＮＡプロセシングシグナルを含み得る。以下でさらに詳細に記載されるように、このような配列は、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、発現を増強する調節エレメント（すなわち、ＷＰＲＥ）、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、およびタンパク質安定性を増強する配列を含む。

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含むベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、イントロン配列の下流に位置する。１つの実施形態において、上記コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＧＣＣ（配列番号１１）である。当業者によって理解されるように、上記コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、代表的には、コード配列の直ぐ上流；この場合、短縮型ＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）の直ぐ上流に位置する。当業者によって認識されるように、上記コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、治療用ポリペプチド、例えば、短縮型ＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）（例えば、配列番号１または配列番号１５）の開始コドンに相当するＡＴＧ残基を共有すると考えられ得る。開示の単純さのために、上記コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、本明細書で記載される場合、治療用ポリペプチド、例えば、短縮型ＡＴＰ７Ｂをコードする核酸（配列番号１または配列番号１５によってコードされるＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）と共有されない領域に相当する６個のヌクレオチドの配列を含む。

ＡＴＰ７Ｂポリペプチド：
本明細書で記載されるように、本発明の局面は、ＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、配列番号８のアミノ酸配列を有する短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）、およびＡＡＶ ３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むゲノムを含む組換えベクターを提供する。ＡＴＰ７Ｂは、銅移行のための細胞膜を通過する経路を形成する８個の膜貫通ドメイン；および６個の金属結合ドメイン（ＭＢＤ）を有する大きなＮ末端（各々は、およそ７０アミノ酸を含む）および高度に保存された金属結合モチーフＧＭｘＣｘｘＣ（ここでｘは任意のアミノ酸である）を有する。標準配列（アイソフォームａとも称され、最も長いアイソフォームである； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：
ＮＰ＿００００４４．２）に加えて、４つのさらなるアイソフォームが公知である： ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ４つのさらなるアイソフォームが公知である： ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＮＰ＿ ００１００５９１８．１、ＮＰ ＿００１２３０１１１．１、ＮＰ ＿００１３１７５０７．１、ＮＰ＿ ００１３１７ ５０８．１。本明細書で記載される組成物および方法は、疾患を引き起こす非機能的ＡＴＰ７Ｂ改変体タンパク質を有する被験体を処置するために使用され得る。

１つの実施形態において、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）は、配列番号８に記載されるとおりのアミノ酸を有するタンパク質をコードする。配列番号１は、ＭＢＤ １～３が欠失したネイティブヒトＡＴＰ７ＢのｃＤＮＡを提供する。配列番号８は、野生型ＡＴＰ７Ｂ全長タンパク質配列の位置３４０および３４１に相当する２つのセリン残基が存在するＤＥＬ１－３ ネイティブまたはＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳタンパク質を表す。

本明細書で記載される種々の実施形態において、短縮型ＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）を含むゲノムを含むベクターが、提供される。

いくつかの実施形態において、コドン最適化したヒトＡＴＰ７Ｂの操作されたｃＤＮＡ（例えば、配列番号１５）を含むゲノムを含むベクターが、提供される。本明細書で記載されるベクターで送達されるポリペプチドは、ＭＢＤ １～３が欠失された短縮型ＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）を含み、これは、ＷＤを処置することにおける使用に適している。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるベクターで発現されるポリペプチドは、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（配列番号８）である。

ベクターエレメント：
いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、１またはこれより多くのエンハンサー配列をさらに含むゲノムを含む。１つの実施形態において、上記エンハンサーは、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）エンハンサー、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびアポリポプロテイン（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される。例示的実施形態において、上記エンハンサーは、上記ｅｎＴＴＲエンハンサーである。１つの実施形態において、上記ｅｎＴＴＲエンハンサーは、配列番号３を含むかまたはからなる。

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、１またはこれより多くのイントロン配列をさらに含むゲノムを含む。１つの実施形態において、上記イントロンは、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、β－グロビン／ＩｇＧキメライントロン（Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン）、またはｈＦＩＸイントロンから選択される。１つの例示的実施形態において、上記イントロンは、上記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロンである。１つの実施形態において、上記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン配列は、配列番号４を含むかまたはからなる。別の例示的実施形態において、上記イントロンは、上記ｒＨＢＢイントロンである。１つの実施形態において、上記ｒＨＢＢイントロン配列は、配列番号５を含むかまたはからなる。

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含むゲノムを含む。１つの実施形態において、上記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される。例示的実施形態において、上記ポリアデニル化シグナル配列は、上記ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である。１つの実施形態において、上記ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号６を含むかまたはからなる。別の例示的実施形態において、上記ポリアデニル化シグナル配列は、上記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である。１つの実施形態において、上記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号７を含むかまたはからなる。

ＡＡＶキャプシド：
別の局面において、本出願は、ＷＤの処置における遺伝子治療のための薬剤として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド、および本明細書で記載されるとおりのベクターゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、血清型９、８、１、２、３、４、５、６、７、１０、１１、１２、ｒｈ１０、またはｈｕ３７のＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｈｕ３７）に由来する。例示的実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）ベクター、ＡＡＶ９改変体ベクター、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクター、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）ベクター、またはＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ベクターである。ある特定の実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドおよびベクターは、ＡＡＶ９血清型に由来する。ある特定の実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドおよびベクターは、ＡＡＶ８血清型に由来する。

上記ＡＡＶ９キャプシドは、多数のＡＡＶ９ ＶＰタンパク質から構成される自己アセンブルされるＡＡＶキャプシドである。上記ＡＡＶ９ ＶＰタンパク質は、代表的には、配列番号１０のキャプシドタンパク質ＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＡＡＳ９９２６４）をコードする配列番号９の核酸配列または配列番号９の核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列をコードする選択的スプライス改変体として発現される。これらのスプライス改変体は、配列番号１０の異なる長さのタンパク質を生じる。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ９キャプシドは、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一または配列番号１０と９９％同一であるアミノ酸配列を有するＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。米国特許第７，９０６，１１１号、および国際公開番号ＷＯ／２００５／０３３３２１もまた参照のこと。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ９改変体は、例えば、国際公開番号ＷＯ／２０１６／０４９２３０、米国特許第８，９２７，５１４号、米国公開番号２０１５／０３４４９１１、および米国特許第８，７３４，８０９号に記載されるものを含む。

本明細書で示されるように、上記配列（例えば、配列番号９の核酸配列またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１をコードする配列番号１０のアミノ酸配列）によってコードされるＡＡＶ９キャプシド配列およびキャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶの生成において有用である。しかし、他の実施形態において、別のＡＡＶキャプシドが選択される。組織特異性は、キャプシドタイプによって決定される。適切な標的（例えば、肝臓、筋、肺、またはＣＮＳ）を形質導入するＡＡＶ血清型は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒｌ、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ８を含むＡＡＶウイルスベクターのキャプシドの供給源として選択され得る。例えば、米国特許公開番号２００７／００３６７６０；米国特許公開番号２００９／０１９７３３８；およびＥＰ１３１０５７１を参照のこと。国際公開番号ＷＯ ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７および他のシミアンＡＡＶ）、米国特許第７，２８２，１９９号および同第７，７９０，４４９号（ＡＡＶ８）も参照のこと。さらに、未だ発見されていないＡＡＶ、またはこれに基づく組換えＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドの供給源として使用され得る。これらの文書はまた、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶを記載し、参考として援用される。いくつかの実施形態において、上記ウイルスベクターにおける使用のためのＡＡＶキャプシドは、前述のＡＡＶキャプシドまたはそのコードする核酸のうちの１つの変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失、または置換によって）生成され得る。

組換え核酸分子を含む宿主細胞
いくつかの局面において、組換え核酸分子、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、または本明細書で開示されるｒＡＡＶを含む宿主細胞が、本明細書で提供される。具体的実施形態において、上記宿主細胞は、ＡＡＶの増殖に適切であり得る。

非常に広い範囲の宿主細胞が使用され得る（例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物の細胞など）。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の生成に適した細胞（または細胞株）、例えば、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞株は、ＨｅＬａ細胞株（例えば、ＨｅＬａ Ｓ３）である。別の実施形態において、本発明の宿主細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞株である。

上記組換え核酸分子またはベクターは、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、宿主細胞培養物へと送達され得る。いくつかの実施形態において、ゲノムに挿入された上記組換え核酸分子またはベクターを有する適切な宿主細胞株が、生成される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるＡＡＶベクターを含む安定な宿主細胞株が生成される。上記宿主培養物へのＡＡＶベクターのトランスフェクション後に、上記ｒＡＡＶの、上記宿主ゲノムへの組み込みは、Ｎａｋａｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２００３） ３４：２９７－３０２； Ｐｈｉｌｐｏｔｔら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００２） ７６（１１）：５４１１－５４２１、およびＨｏｗｄｅｎら， Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． （２００８） １０：４２－５０によって記載されるように、種々の方法（例えば、抗生物質選択、蛍光活性化セルソーティング、サザンブロット、ＰＣＲベースの検出、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）によってアッセイされ得る。さらに、安定な細胞株が、当該分野で周知のプロトコール（例えば、Ｃｌａｒｋ， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｏｌ． ６１ （２００２）：Ｓ９－Ｓ１５、およびＹｕａｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
（２０１１） ２２（５）：６１３－２４に記載されるもの）に従って樹立され得る。

遺伝子治療のための組換えＡＡＶ：
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科およびＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ＡＡＶは、直線状の１本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージする、小さなエンベロープのないウイルスである。ＡＡＶ ＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、等しい頻度でＡＡＶキャプシドへとパッケージされる。

上記ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって特徴づけられる。上記ＡＡＶ２ゲノム、例えば、上記ＩＴＲの最初の１２５ヌクレオチドは、パリンドロームであり、これは、塩基対合を最大にするようにそれら自体を折りたたんで、Ｔ字型ヘアピン構造を形成する。上記ＩＴＲの他の２０塩基（Ｄ配列といわれる）は、対合しないままである。上記ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡ複製にとって重要なｃｉｓ作用性配列である；上記ＩＴＲは複製起点であり、ＤＮＡポリメラーゼによる第２鎖合成のプライマーとして働く。この合成の間に形成される２本鎖ＤＮＡ（これは、複製形態モノマーといわれる）は、第２回の自己感作複製のために使用され、複製形態ダイマーを形成する。これらの２本鎖中間体は、鎖置換機構を介して処理され、パッケージングに使用される１本鎖ＤＮＡおよび転写に使用される２本鎖ＤＮＡを生じる。Ｒｅｐ結合エレメントおよび末端分離部位（ＴＲＳ）が、ＩＴＲ内に位置する。これらの特徴は、２本鎖中間体を処理するために、ＡＡＶ複製の間にウイルス調節タンパク質Ｒｅｐによって使用される。ＡＡＶ複製におけるそれらの役割に加えて、上記ＩＴＲはまた、ＡＡＶゲノムパッケージング、転写、許容できない条件下での負の調節、および部位特異的組み込みにとって必須である（Ｄａｙｓ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． （２００８） ２１（４）：５８３－５９３）。

ＡＡＶの左側のＯＲＦは、４つのタンパク質－ Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＲｅｐ遺伝子を含む。右側のＯＲＦは、３つのウイルスキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を生成するＣａｐ遺伝子を含む。そのＡＡＶキャプシドは、正二十面体対称へと配置される６０のウイルスキャプシドタンパク質を含む。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１：１：１０モル比で存在する（Ｄａｙａ
ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．（２００８） ２１（４）：５８３－５９３）。

ＡＡＶは、現在のところ、遺伝子治療のために最も頻繁に使用されるウイルスのうちの１つである。ＡＡＶは、ヒトおよび数種の他の霊長類種に感染するものの、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂中の細胞および休止細胞の両方に感染し得、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、染色体外の状態で持続する。ＡＡＶの有利な特徴が原因で、本開示は、本明細書で開示される組換え核酸分子および方法のためのＡＡＶの使用を企図する。

ＡＡＶは、標的細胞に結合し、進入し、核に入る能力、長期間にわたって核において発現される能力、および低毒性を含め、遺伝子治療ベクターのいくつかの望ましい特徴を有する。しかし、ＡＡＶゲノムのサイズは小さいことから、組み込まれ得る異種ＤＮＡのサイズには制限がある。この問題を最小限にするために、Ｒｅｐおよび組み込み効率エレメント（ＩＥＥ）をコードしないＡＡＶベクターが、構築されている。上記ＩＴＲは、これらがパッキングに必要とされるｃｉｓシグナルであることから保持される（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． （２００８） ２１（４）：５８３－５９３）。

遺伝子治療に適したｒＡＡＶを生成するための方法は、当該分野で周知であり（例えば、米国特許出願公開２０１２／０１００６０６；同第２０１２／０１３５５１５；同第２０１１／０２２９９７１；および同第２０１３／００７２５４８；ならびにＧｈｏｓｈら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． （２００６）１３（４）：３２１－３２９を参照のこと）、本明細書で開示される組換え核酸分子および方法とともに利用され得る。

いくつかの局面において、本出願は、ウイルソン病（ＷＤ）の処置のための、本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用に関し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよびその中にパッケージされたベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順に：５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）、および３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むゲノムを含む。例示的実施形態において、上記ベクターゲノムはまた、上記プロモーター配列の上流にエンハンサー配列、上記プロモーターの下流にイントロン、および上記３’－ＩＴＲの上流にポリアデニル化配列を含む。従って、別の例示的実施形態において、上記ベクターゲノムは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順に：５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。さらなる例示的実施形態において、上記ベクターゲノムは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順に：ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ｅｎＴＴＲエンハンサー、ＴＴＲプロモーター、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、上記ベクターゲノムは、上記イントロン配列の下流に位置したコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

いくつかの局面において、本出願は、ウイルソン病（ＷＤ）の処置のための本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用に関し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよびその中にパッケージされたベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記ベクターゲノムは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順に：５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１）、および３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。例示的実施形態において、上記ベクターゲノムはまた、上記プロモーター配列の上流にエンハンサー配列、上記プロモーターの下流にイントロン、および上記３’－ＩＴＲの上流にポリアデニル化配列を含む。従って、別の例示的実施形態において、上記ベクターは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順に：５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１）、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むゲノムを含む。さらなる例示的実施形態において、上記ベクターは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順に：ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ｅｎＴＴＲエンハンサー、ＴＴＲプロモーター、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含むゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記パッケージされたゲノムは、上記イントロン配列の下流に位置したコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

いくつかの局面において、本出願は、ウイルソン病（ＷＤ）の処置のための本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用に関し、ここで上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよびパッケージされたベクターゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順に：５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１５）、および３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むパッケージされたゲノムを含む。例示的実施形態において、上記パッケージされたゲノムはまた、上記プロモーター配列の上流にエンハンサー配列、上記プロモーターの下流にイントロン、および上記３’－ＩＴＲの上流にポリアデニル化配列を含む。従って、別の例示的実施形態において、上記ベクターは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順に：５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１５）、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むパッケージされたゲノムを含む。さらなる例示的実施形態において、上記ベクターは、作動可能に連結された構成要素として、５’から３’の順に：ＡＡＶ２
５’－ＩＴＲ配列、ｅｎＴＴＲエンハンサー、ＴＴＲプロモーター、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１５）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含むパッケージされたゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記パッケージされたゲノムは、上記イントロン配列の下流に位置したコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

ＭＢＤ ４、５、および６を保持する短縮型ＡＴＰ７Ｂの発現のための例示的なパッケージされたベクターゲノム構築物を示す例示的な図解は、図１に提供される。５’－ＩＴＲは、ヌクレオチド１～１４５によって表される；ｅｎＴＴＲエンハンサーは、ヌクレオチド１４６～２４５によって表される；ＴＴＲプロモーターは、ヌクレオチド２４６～４３５によって表される；ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロンは、ヌクレオチド４３６～５３０によって表される；コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ヌクレオチド５３１～５３６によって表される；短縮型ＡＴＰ７Ｂコード配列は、ヌクレオチド５４０～４１４２によって表される；ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、ヌクレオチド４１４３～４３４０によって表される；３’－ＩＴＲは、ヌクレオチド４３４１～４４８５によって表される。

ある特定の実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列は、ネイティブヒト配列（配列番号１によって表される）である。あるいは、いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列は、コドン最適化したヒト配列（配列番号１５によって表される）である。

ＷＤを処置することにおける改善された有効性：
ある特定の実施形態において、本明細書で記載される、配列番号１または配列番号１５によってコードされる短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）は、ＡＴＰ７Ｂの全長または他の短縮型形態（例えば、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－４、配列番号１３）より有効である。いくつかの局面において、本開示のＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳは、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）に局在する。ある特定の実施形態において、配列番号１の核酸配列を含み、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードするｒＡＡＶは、銅代謝障害（例えば、ウイルソン病）と診断された哺乳動物に注射されると、上記哺乳動物の肝臓および尿中の銅レベルを減少させる。

短縮型ＡＴＰ７Ｂを含むＡＡＶベクターの改善された収量：
１つの局面において、本明細書で記載される、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９にパッケージされたＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶは、全長ＡＴＰ７ＢまたはＡＴＰ７Ｂ Δ１－４のものより約１．１～約１０倍（例えば、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍）高い製造収量を有する。

ＡＡＶ９キャプシドを含むＡＡＶベクターの改善された収量：
１つの局面において、上記ＡＡＶ９キャプシドを含むｒＡＡＶは、上記ＡＡＶ８キャプシドを含むｒＡＡＶと比較すると、約１．１～約１０倍（例えば、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍）高い滴定収量を有する。

薬学的組成物：
本明細書で開示されるｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物は、本開示によって提供される。ｒＡＡＶの投与のための適切な薬学的製剤は、例えば、米国特許出願公開２０１２／０２１９５２８において見出され得る。本開示において有用な薬学的に受容可能なキャリア（ビヒクル）は、従来どおりである。Ｅ． Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， 第１５版（１９７５））は、１またはこれより多くの治療用化合物、分子または薬剤の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載する。

前段において強調されているように、本出願は、いくつかの局面において、本発明のｒＡＡＶを含む薬学的組成物に関する。いくつかの実施形態において、上記薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、上記薬学的組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内投与のために製剤化される。例示的実施形態において、上記薬学的組成物は、静脈内投与のために製剤化される。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ヒト被験体における注入に適した緩衝液／キャリア中に製剤化される。上記緩衝液／キャリアは、ｒＡＡＶが注入チューブに貼り付くことを防止するが、インビボでのｒＡＡＶ結合活性に干渉しない構成要素を含むべきである。種々の適切な溶液が、以下のうちの１またはこれより多くを含み得る： 緩衝化食塩水、界面活性剤、および約１００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭ 塩化ナトリウムに等しいイオン強度に調節された生理学的に適合性の塩もしくは塩の混合物、または等しいイオン濃度に調節された生理学的に適合性の塩。そのｐＨは、６．５～８．５、または７～８．５、または７．５～８の範囲にあり得る。適切な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接したポリオキシプリピレン１０（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノールおよびポリエチレングリコールから選択され得る。

ウイルソン病を処置する方法：
さらに別の局面において、本出願は、ヒト被験体においてＷＤを処置する方法であって、上記方法は、上記ヒト被験体に、治療上有効な量の、本明細書で開示される、短縮型ＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）をコードする配列番号１または配列番号１５を含むｒＡＡＶを投与する工程を包含する方法に関する。

１つの実施形態において、本出願は、ＷＤを処置する方法を提供し、上記方法は、ＡＡＶキャプシドおよびパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与する工程であって、ここで上記ベクターゲノムは、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）を含む工程を包含する。

さらに別の局面において、本出願は、ヒト被験体においてＷＤを処置する方法であって、上記方法は、ＡＴＰ７Ｂにおいて少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体に、治療上有効な量の、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）を含むベクターゲノムを含む少なくとも１つのｒＡＡＶを投与する工程を包含する方法に関する。１つの実施形態において、本出願は、ＡＴＰ７Ｂにおいて少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体においてＷＤを処置する方法を提供し、上記方法は、ＡＡＶキャプシドおよびパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与する工程であって、ここで上記ベクターゲノムは、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）を含む工程を包含する。配列番号１によって表されるとおりのコード配列は、配列番号８によって表される短縮型ＡＴＰ７Ｂをコードする。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

さらに別の局面において、本出願は、ヒト被験体においてＷＤを処置する方法であって、上記方法は、ＡＴＰ７Ｂにおいて少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体に、治療上有効な量の、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１）を含むベクターゲノムを含む少なくとも１つのｒＡＡＶを投与する工程を包含する方法に関する。１つの実施形態において、本出願は、ＡＴＰ７Ｂにおいて少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体においてＷＤを処置する方法を提供し、上記方法は、ＡＡＶキャプシドおよびパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与する工程であって、ここで上記ベクターゲノムは、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１）を含む工程を包含する。配列番号１によって表されるとおりのコード配列は、配列番号８によって表される短縮型ＡＴＰ７Ｂをコードする。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

さらに別の局面において、本出願は、ヒト被験体においてＷＤを処置する方法であって、上記方法は、ＡＴＰ７Ｂにおいて少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体に、治療上有効な量の、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１５）を含むベクターゲノムを含む少なくとも１つのｒＡＡＶを投与する工程を包含する方法に関する。１つの実施形態において、本出願は、ＡＴＰ７Ｂにおいて少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト被験体においてＷＤを処置する方法を提供し、上記方法は、ＡＡＶキャプシドおよびパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与する工程であって、ここで上記ベクターゲノムは、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）のコード配列（例えば、配列番号１５）を含む工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

任意の適切な方法または経路は、本明細書で記載されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ含有組成物を投与するために使用され得る。投与経路としては、例えば、全身、経口、吸入、鼻内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む組成物は、静脈内投与される。

投与される具体的用量は、各患者に対して均一な用量、患者の体重１ｋｇあたり例えば、１．０×１０^１１～１．０×１０^１４ ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｋｇであり得る。あるいは、患者の用量は、上記患者のおおよその体重または表面積に合わせて調節され得る。適切な投与量を決定することにおける他の要因としては、処置または防止される疾患または状態、疾患の重篤度、投与経路、ならびに上記患者の年齢、性別および医学的状態が挙げられ得る。処置に適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、当業者によって、特に、本明細書で開示される投与量情報およびアッセイに鑑みて慣用的に行われる。上記投与量はまた、適切な用量－応答データとともに使用される用量を決定するために公知のアッセイの使用を通じて決定され得る。個々の患者の投与量はまた、上記疾患の進行がモニターされるにつれて調節され得る。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ｑＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定されるように、例えば、約１．０×１０^１１ ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１１ ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１３ ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０^１２～約１×１０^１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約２×１０^１２ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約５×１０^１２ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約６×１０^１２ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１×１０^１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約７×１０^１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。上記ｒＡＡＶは、単一用量で、または所望の治療結果にとって必要とされる場合は、複数回用量で投与され得る（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くの用量）。いくつかの例示的実施形態において、特定のｒＡＡＶの単一用量のみが投与される。

詳細な説明全体を通じて、組成物が、特定の構成要素を有する、包含する、もしくは含むと記載される場合、またはプロセスおよび方法が、特定の工程を有する、包含する、もしくは含むと記載される場合、さらに、その記載される構成要素から本質的になるかまたはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびにその記載される処理工程から本質的になるかまたはそれからなる本発明に従うプロセスおよび方法が存在することは、企図される。

本出願において、要素または構成要素が、記載される要素または構成要素のリストの中に含まれるおよび／またはリストから選択されるといわれる場合、その要素もしくは構成要素が、その記載される要素もしくは構成要素のうちのいずれか１つであり得るか、またはその要素もしくは構成要素が、その記載される要素もしくは構成要素のうちの２もしくはこれより多くからなる群より選択され得ることは、理解されるべきである。

さらに、本明細書で記載される組成物または方法の要素および／または特徴が、本明細書で明示的であろうと暗示的であろうと、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の方法において組み合わされ得ることは、理解されるべきである。例えば、特定の化合物に対して言及がなされる場合、その化合物は文脈から別段理解されなければ、本発明の組成物の種々の実施形態においておよび／または本発明の方法において使用され得る。言い換えると、本出願の中で、実施形態は、明確かつ簡潔な適用が書かれ、描かれることを可能にする方法で記載され、示されているが、実施形態が、本教示および本発明から切り離されることなく、種々に組み合わされてもよいし、分離されてもよいことは、意図され、認識される。例えば、本明細書で記載され、示される全ての特徴が、本明細書で記載され、示される本発明の全ての局面に適用可能であり得ることは、認識される。

表現「のうちの少なくとも１」が、文脈および用途から別段理解されなければ、その表現の後に来る記載される物体の各々、およびその記載される物体のうちの２またはこれより多くの種々の実施形態を個々に含むことは、理解されるべきである。３またはこれより多くの記載される物体に関連して、表現「および／または」は、文脈から別段理解されなければ、同じ意味を有することが理解されるべきである。

用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、これらの文法上等価なものを含め、概して制限がなくかつ非限定的である、例えば、別段具体的に述べられなければ、または文脈から理解されなければ、さらなる記載されない要素または工程を排除しないと概して理解されるべきである。

用語「約」が定量的値の前で使用される場合、本発明はまた、別段具体的に述べられなければ、その特定の定量的値自体を含む。本明細書で使用される場合、用語「約」とは、別段示されなければまたは推測されなければ、名目上の値からの±１０％ 変動に言及する。

工程の順序またはある特定の行為を行うための順序は、本発明が実施可能なままである限りにおいて、重要ではないことが理解されるべきである。さらに、２またはこれより多くの工程または行為は、同時と見做されてもよい。

任意のおよび全ての例、または例示的な文言、例えば、「のような、例えば（ｓｕｃｈ
ａｓ）」または「が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の本明細書での使用は、本発明をよりよく例証することを意図するに過ぎず、別段特許請求されなければ、本発明の範囲に対する限定を課すものではない。本明細書中のいかなる文言も、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須として示すと解釈されるべきではない。

ここで一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによって容易に理解される。その実施例は、本発明のある特定の局面および実施形態を例証する目的でのみ含まれ、本発明を限定することは意図されない。

実施例１－ＡＡＶベクターおよびこのベクターから生成されるｒＡＡＶ
ＡＡＶベクター
この実施例は、２つのＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ、配列番号２）によって境を接する配列番号１によって表される核酸配列を有するＡＡＶベクターの構築を記載する。配列番号１は、ＭＢＤ １～３が欠失したネイティブヒトＡＴＰ７ＢのｃＤＮＡを表す。配列番号１におけるヌクレオチド２２３～２２５は、セリン残基、Ｓ３４０をコードし、配列番号１におけるヌクレオチド２２６～２２８は、セリン残基、Ｓ３４１をコードする（番号付けは、野生型全長ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列に基づく）。

図１に図示されるように、ＡＡＶベクター内で、ＡＴＰ７Ｂ発現カセットは、エンハンサー（ＥｎＴＴＲ）、プロモーター（ＴＴＲ）、イントロン（ＳＶ４０ ｓｍａｌｌ Ｔイントロン）、短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、およびＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含む。種々の構成要素を図示するベクターの環状マップを、図２に示す。

ＡＡＶベクターＤＴＣ３１９は、金属結合ドメイン４、５、および６が保持されている短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ配列を含む。上記短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ配列は、配列番号８によって表され、２個のセリン残基、Ｓ３４０およびＳ３４１を含むタンパク質をコードする（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００００４４．２に従って番号付けした）。

シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｊ０２４００（配列番号７））は、ＡＴＰ７Ｂ ｍＲＮＡの効率的ポリアデニル化のためのｃｉｓ配列を提供する。このエレメントは、新生転写物の３’末端における特異的切断事象および長いポリアデニルテールの付加のシグナルとして機能する。

各短縮型ＡＴＰ７Ｂ発現カセットを、ＡＡＶベクターにクローニングした。全てのＡＡＶベクターは、カナマイシン耐性遺伝子をコードする骨格を有した。例示的ＡＡＶベクターＤＴＣ３１９を図２に図示する。図１は、ＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）を発現するためのＤＴＣ３１９の発現カセットを示す。

ｒＡＡＶビリオン
ＡＡＶベクターゲノムは、１本鎖ゲノムである。ＩＴＲ配列の間のおよびＩＴＲ配列を含む配列のみが、ＡＡＶビリオンへとパッケージされる。３種のプラスミドを、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子生成物を提供するヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞へとトランスフェクトすることによって、ビリオンを生成した。第１のプラスミドは、本明細書で開示されるＡＡＶベクターであり得る。第２のプラスミドは、野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ８またはＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を含むパッケージングプラスミドであり得る。第３のプラスミドは、ヘルパーアデノウイルスプラスミドである。

例示的パッケージングプラスミド、ｐＡＡＶ２／８．ＫａｎＲ（ｐ２１２３ＦＨ）プラスミドの図は、図３に示される。このプラスミドにおいて、アデノ随伴Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド ｐＡＡＶ２／８．ＫａｎＲ（ｐ２１２３ＦＨ）（８３５４ｂｐ）は、血清型８に由来する、４つの野生型ＡＡＶ２ウイルス複製（Ｒｅｐ）タンパク質および３つの野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシド（ｃａｐ）タンパク質をコードする。そのプラスミド内で、Ｒｅｐ遺伝子発現を通常は駆動するＡＡＶ ｐ５プロモーターは、Ｒｅｐ領域の５’末端からＡＡＶ８ ｃａｐ領域の３’末端まで動かされている。この配置は、プロモーターとＲｅｐ遺伝子（すなわち、プラスミド骨格）との間にスペーサーを導入し、Ｒｅｐの発現のダウンレギュレーションおよび高力価ｒＡＡＶ生成を支持する能力の増大を生じる。カナマイシン耐性の遺伝子およびＭＢ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド生成のために含められる。

例示的ヘルパープラスミド、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）の図は、図４に示される。このプラスミドにおいて、ＡＡＶ複製にとって重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡが提供される。アデノウイルスＥ１機能がまた必要とされるが、ＨＥＫ２９３宿主細胞によって提供される。図４に示されるプラスミドは、他のアデノウイルス複製、構造遺伝子、またはアデノウイルス複製にとって極めて重要なｃｉｓエレメント（例えば、アデノウイルスＩＴＲ）を含まないので、感染性アデノウイルスは、生成されるとは予測されない。カナマイシン耐性の遺伝子およびＭＢ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド生成のために含められる。

実施例２－ヒトＡＴＰ７Ｂにおける金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３の欠失は、製造収量を改善する
この実施例は、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳが全長ＡＴＰ７Ｂまたは短縮型形態ＡＴＰ７Ｂ Δ１－４より高い収量を有することを示した実験を記載する。

機能的ＡＴＰ７Ｂの欠如は、肝臓および他の組織にいて銅の蓄積を生じ、神経症状または精神症状を有する肝疾患として出現する。ＷＤは、身体からの銅の吸収を低減させるか、または過剰な銅を除去することによって処置され得る。Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスは、機能的Ａｔｐ７ｂを発現しないので、ＷＤのマウスモデルとして役立つ。ＨＥＫ２９３細胞を、血清型８に由来する、４つの野生型ＡＡＶ２ウイルス複製（Ｒｅｐ）タンパク質および３つの野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシド（ｃａｐ）タンパク質をコードするＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドおよびヘルパープラスミドでトランスフェクトして、ＡＴＰ７ＢｃｏＦＬウイルス粒子を得るために、コドン最適化した全長ヒトＡＴＰ７Ｂ配列を含むＡＡＶベクターを使用した。

雄性Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスを、１０^１０ ＧＣ／ｋｇまたは１０^１１ ＧＣ／ｋｇいずれかのＡＴＰ７ＢｃｏＦＬ（コドン最適化した全長ヒトＡＴＰ７Ｂ）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。雌性Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスに、１０^９ ＧＣ／ｋｇ、１０^１０ ＧＣ／ｋｇ、または１０^１１ ＧＣ／ｋｇいずれかの同じベクターをｉ．ｖ．注射した。雄性マウス（四角で示す）および雌性マウス（丸で示す）における肝臓銅レベルを、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）によって評価し、年齢を合わせた注射していない雄性および雌性ヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウスおよびＣ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスの銅レベルを比較した。マウスを、およそ９ヶ月齢で剖検し、肝臓を採取した。データを図５に示す。

ＡＡＶベクターを利用する遺伝子治療は、ＷＤを処置するために使用され得る。しかし、ＡＡＶベクターキャプシドの内部にパッケージされ得るｃＤＮＡのサイズには制限がある。野生型ＡＡＶゲノムは、４．７ｋｂであり、より大きなゲノムをパッケージすることは、上記ＡＡＶキャプシド内に被包されるＤＮＡ配列の収量および完全性を潜在的に低減し得る。従って、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳをコードするヌクレオチド配列を、ＡＡＶ８キャプシド内にパッケージし、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳの製造収量を試験した。全長（ＦＬ）ヒトＡＴＰ７Ｂ、ＭＢＤ １～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在するヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）、またはＭＢＤ １～４が欠失されているヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－４）のいずれかをコードするＡＡＶベクターを、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトした。血清型８に由来する、４つの野生型ＡＡＶ２ウイルス複製（Ｒｅｐ）タンパク質および３つの野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシド（ｃａｐ）タンパク質をコードするＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド、およびヘルパープラスミドを、種々のＡＴＰ７Ｂタンパク質を発現するＡＡＶベクターとともに共トランスフェクトした。図６は、種々のＡＡＶベクターのトランスフェクション後の宿主細胞から生成したｒＡＡＶの滴定を示す棒グラフである。Ｙ軸は、ゲノムコピー（ＧＣ）単位で各ｒＡＡＶ滴定の全収量を示す。データは、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳが、全長またはＡＴＰ７Ｂ Δ１－４短縮型形態より高い収量を有したことを示す。

実施例３－ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳは、ＡＴＰ７Ｂ ＦＬと比較して、銅代謝の回復においてより有効である
この実施例は、Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスの銅代謝の回復において、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳがＡＴＰ７Ｂ全長（ＡＴＰ７Ｂ ＦＬ）またはＡＴＰ７Ｂ Δ１－４より有効であることを示した実験を記載する。

上記の実施例２に記載されるように、かさ高いｃＤＮＡ配列をＡＡＶベクターキャプシドの中にパッケージすることは、ＤＮＡ配列の完全性を低減し得、潜在的な品質の問題を有し得る。従って、ヒトＡＴＰ７Ｂの短縮型バージョンを、ＡＡＶ８キャプシド内にパッケージし、銅代謝を回復することにおけるそれらの有効性を試験した。全長または短縮型いずれかのヒトＡＴＰ７Ｂを含むＡＡＶ８ベクターの１．０×１０^１３ ＧＣ／ｋｇを、Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスに投与した。肝臓および尿中銅レベルを、誘導結合プラズマ質量分析法によって評価した。図７は、Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスに全長ヒトＡＴＰ７Ｂ （ＡＴＰ７Ｂ ＦＬ）、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ、またはＡＴＰ７Ｂ Δ１－４を有するＡＡＶ８を注射した後にアッセイした尿中および肝臓銅レベルの散布図（それぞれ、四角および丸）である（μｇ／ｇ）。図７は、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳが、Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスの銅代謝の回復においてＡＴＰ７Ｂ全長（ＡＴＰ７Ｂ ＦＬ）またはＡＴＰ７Ｂ Δ１－４より有効であることを示す。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を投与したＣ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスは、コントロール（ビヒクル）として供した。

実施例４－ＡＡＶ９キャプシドを含むＡＡＶベクターは、より高いウイルス生成を示した
この実施例は、ＡＡＶ８キャプシドを含むＡＡＶベクターの生成との比較において、ＡＡＶ９キャプシドを含むＡＡＶベクターの生成がより高い収量を生成することを示した実験を記載する。異なるＡＡＶベクターを、ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）を定量するｑＰＣＲによって滴定した。図８は、金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒトＡＴＰ７ＢをコードするＡＡＶベクター（ＤＴＣ３１９）をトランスフェクトし、ＡＡＶ８キャプシドまたはＡＡＶ９キャプシドのいずれかをコードするプラスミドで共トランスフェクトした後に宿主細胞から生成したｒＡＡＶの全収量（ゲノムコピー（ＧＣ）において滴定）を示す。

実施例５－ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳの治療特性
この実施例は、マウスモデル（Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊ）においてウイルソン病（ＷＤ）の症状を改善し、ＷＤを処置するにあたって、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ（例えば、金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒトＡＴＰ７ＢをコードするｒＡＡＶベクターであるＤＴＣ３１９）の有効性を示した動物研究を記載する。この実施例において、雄性マウスの３つの群を評価した： ＡＡＶ８ベクター中にコードされるＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ（例えば、ＤＴＣ３１９）のＡＡＶ注入またはビヒクルコントロール（希釈緩衝液）の静脈内注射のいずれかを投与したＷＤマウス（Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウス）、および陰性コントロールとして供した野生型（ＷＴ）マウス。注入に関しては、ｒＡＡＶを、接着性ＨＥＫ細胞の三重の一過性トランスフェクションによって生成し、塩化セシウム勾配超遠心分離（当該分野で周知の精製法）によって精製した。研究エンドポイントにおいて、注入の４週間後に、各群からのマウスを、肝臓道蓄積、セルロプラスミン活性、および肝臓病理に関して評価した。

肝臓銅蓄積を、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）によって測定し、肝臓銅レベルが、ビヒクルコントロールと比較して、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ（例えば、ＤＴＣ３１９）を投与したＷＤマウスにおいて有意に低減されたことを示した（図９、ＤｅｌＡの棒を参照のこと）。図９は、ビヒクルコントロールの静脈内注射（希釈緩衝液、ＷＤの棒）またはネイティブＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳを有するＡＡＶ８の注入（ＤｅｌＡの棒）を投与した後のＣ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスにおける肝臓銅蓄積レベル（μｇ／ｇ）を示す。棒グラフにおいて表される注射していない野生型マウス（ＷＴ）における肝臓銅蓄積レベルは、陰性コントロールとして供した。値は、平均±ＳＥＭとして表した。

セルロプラスミン活性は、ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ（例えば、ＤＴＣ３１９）を投与した後のＷＤマウスにおいて有意に増大した（図１０、ＤｅｌＡの棒を参照のこと）。セルロプラスミン活性を、当該分野で周知の酵素反応ベースの比色活性アッセイを使用して検出した（Ｓｃｈｏｓｉｎｓｋｙら， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ． １９７４； ２０（１２）：１５５６－６３を参照のこと）。図１０は、酵素反応ベースの比色活性アッセイによって示されるように、ビヒクルコントロールの静脈内注射（希釈緩衝液、ＷＤの棒）またはＡＡＶ８ベクターにおいてコードされるＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳのＡＡＶ注入（ＤｅｌＡの棒）を受けた後の、Ｃ３Ｈｅ－Ａｔｐ７ｂ^ｔｘ－ｊマウスにおけるセルロプラスミン活性を示す。注射していない野生型（ＷＴ）マウスのセルロプラスミン活性はまた、酵素反応ベースの比色活性アッセイによって示されるように、棒グラフにおいて表される。そのプロットは、５４０ｎｍにおいて読み取られるとおりの光学密度、ＯＤにおいて測定されるとおりのセルロプラスミンの活性を示す。値は、平均±ＳＥＭとして表した。

肝臓を、各群において全ての動物から採取し、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）で染色した。Ｈ＆Ｅスライドを、核拡大および肝細胞肥大、組織崩壊、炎症性浸潤、および肝細胞壊死に関して、０～４のスコア付けシステムに従って、認定病理医（ｂｏａｒｄ ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ）が評価した。群における各マウスからのスコアを平均した。図１１は、各群における動物のＨ＆Ｅスライドの標準的評価後に得た場合の平均スコアを示す。

実施例６－ウイルソン病（ＷＤ）の実行可能な治療としてのＡＡＶ９遺伝子治療
この実施例は、被験体においてＷＤを処置することにおけるＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳを含むｒＡＡＶ粒子の使用を記載する。短縮型ヒトＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ Δ１－３－ＳＳ）をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクター、例えば、ＤＴＣ３１９（図２）、血清型９（ＡＡＶ９）に由来する、４つの野生型ＡＡＶ２ウイルス複製（Ｒｅｐ）タンパク質および３つの野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシド（ｃａｐ）タンパク質をコードするＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド、ならびにヘルパープラスミドは、実施例１に記載されるように、宿主細胞へと共トランスフェクトする。次いで、採取したｒＡＡＶ粒子は、ＷＤ治療の必要性のある被験体に静脈内投与される。あるいは、被験体は、ＷＤを処置するために、図１２によって表されるベクターでトランスフェクトした宿主細胞から採取されるｒＡＡＶ粒子を投与される。

援用の表示
本明細書で言及される特許文書および科学論文の各々の開示全体は、全ての目的のために参考として援用される。

均等物
本開示は、その趣旨および本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的形態において具現化され得る。従って、前述の実施形態は、全ての点において、本明細書で記載される開示を限定するのではなく例証であるとみなされるべきである。異なる実施形態の種々の構造的要素および種々の開示される方法の工程は、種々の組み合わせおよび並べ替えにおいて利用され得、全てのこのような改変は、本開示の形態であるとみなされるべきである。本開示の範囲は、従って、前述の説明によるのではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内に入る全ての変更は、その中に包含されることが意図される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
組換え核酸構築物であって、
（ａ）５’－逆位末端反復配列 （ＩＴＲ）；
（ｂ）プロモーター配列；
（ｃ）金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする核酸配列；ならびに
（ｄ）３’－ＩＴＲ配列
を含む、組換え核酸構築物。
（項目２）
前記プロモーターは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、α１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、およびＣＡＧプロモーターから選択される、項目１に記載の組換え核酸構築物。
（項目３）
前記プロモーターは、前記ＴＴＲプロモーターである、項目２に記載の組換え核酸構築物。
（項目４）
前記５’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する、項目１～３のいずれかに記載の組換え核酸構築物。
（項目５）
前記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する、項目１～３のいずれかに記載の組換え核酸構築物。
（項目６）
前記５’－ＩＴＲ配列および前記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する、項目１～３のいずれかに記載の組換え核酸構築物。
（項目７）
前記５’－ＩＴＲ配列および前記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号２を含むかまたはからなる、項目１～６のいずれかに記載の組換え核酸構築物。
（項目８）
前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源に由来する、項目１～３のいずれかに記載の組換え核酸構築物。
（項目９）
前記組換え核酸構築物は、１またはこれより多くのエンハンサー配列をさらに含む、項目１～８のいずれかに記載の組換え核酸構築物。
（項目１０）
前記エンハンサーは、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）エンハンサー、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびアポリポプロテイン（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される、項目９に記載の組換え核酸構築物。
（項目１１）
前記エンハンサーは、前記ｅｎＴＴＲエンハンサーである、項目１０に記載の組換え核酸構築物。
（項目１２）
前記エンハンサーは、配列番号３を含むかまたはからなる、項目１１に記載の組換え核酸構築物。
（項目１３）
前記エンハンサーは、前記プロモーター配列の上流に位置する、項目１０～１２に記載の組換え核酸構築物。
（項目１４）
前記組換え核酸構築物は、１またはこれより多くのイントロン配列をさらに含む、項目１～１３のいずれかに記載の組換え核酸構築物。
（項目１５）
前記イントロンは、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択される、項目１４に記載の組換え核酸構築物。
（項目１６）
前記イントロンは、前記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロンである、項目１５に記載の組換え核酸構築物。
（項目１７）
前記イントロンは、配列番号４を含むかまたはからなる、項目１６に記載の組換え核酸構築物。
（項目１８）
前記イントロンは、前記ｒＨＢＢイントロンである、項目１５に記載の組換え核酸構築物。
（項目１９）
前記イントロンは、配列番号５を含むかまたはからなる、項目１８に記載の組換え核酸構築物。
（項目２０）
前記組換え核酸構築物は、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、項目１～１９のいずれかに記載の組換え核酸構築物。
（項目２１）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、項目２０に記載の組換え核酸構築物。
（項目２２）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、前記ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である、項目２１に記載の組換え核酸構築物。
（項目２３）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号６を含むかまたはからなる、項目２２に記載の組換え核酸構築物。
（項目２４）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、項目２１に記載の組換え核酸構築物。
（項目２５）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号７を含むかまたはからなる、項目２４に記載の組換え核酸構築物。
（項目２６）
ウイルソン病の処置に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよびその中にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、
ａ．ＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；
ｂ．プロモーター／エンハンサー配列；
ｃ．金属結合ドメイン（ＭＢＤ）１～３が欠失されているが、ＭＢＤ３とＭＢＤ４との間の２個のセリン残基（Ｓ３４０およびＳ３４１）を含むセリンリッチループが存在する短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする核酸配列；ならびに
ｄ．ＡＡＶ ３’－ＩＴＲ、
を含む、ｒＡＡＶ。
（項目２７）
前記ＡＡＶキャプシドは、血清型９、８、１、２、３、４、５、６、７、１０、１１、１２、ｒｈ１０、またはｈｕ３７のＡＡＶに由来する、項目２６に記載のｒＡＡＶ。
（項目２８）
前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９に由来する、項目２７に記載のｒＡＡＶ。
（項目２９）
前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８に由来する、項目２７に記載のｒＡＡＶ。
（項目３０）
前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９改変体キャプシドである、項目２８に記載のｒＡＡＶ。
（項目３１）
前記プロモーターは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、α１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、およびＣＡＧプロモーターから選択される、項目２６～３０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目３２）
前記プロモーターは、前記ＴＴＲプロモーターである、項目３１に記載のｒＡＡＶ。
（項目３３）
前記５’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する、項目２６～３２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目３４）
前記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する、項目２６～３２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目３５）
前記５’－ＩＴＲ配列および前記３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する、項目２６～３２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目３６）
前記５’－ＩＴＲ配列および前記３’－ＩＴＲ配列は、配列番号２を含むかまたはからなる、項目２６～３５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目３７）
前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記ｔｈｅ ３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源に由来する、項目２６～３２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目３８）
前記パッケージされたゲノムは、１またはこれより多くのエンハンサー配列をさらに含む、項目２６～３７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目３９）
前記エンハンサーは、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）エンハンサー、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびアポリポプロテイン（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される、項目３８に記載のｒＡＡＶ。
（項目４０）
前記エンハンサーは、前記ｅｎＴＴＲエンハンサーである、項目３９に記載のｒＡＡＶ。
（項目４１）
前記エンハンサーは、配列番号３を含むかまたはからなる、項目４０に記載のｒＡＡＶ。
（項目４２）
前記エンハンサーは、前記プロモーター配列の上流に位置する、項目４０～４１に記載のｒＡＡＶ。
（項目４３）
前記パッケージされたゲノムは、１またはこれより多くのイントロン配列をさらに含む、項目２６～４２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目４４）
前記イントロンは、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン、およびｈＦＩＸイントロンから選択される、項目４３に記載のｒＡＡＶ。
（項目４５）
前記イントロンは、前記ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロンである、項目４４に記載のｒＡＡＶ。
（項目４６）
前記イントロンは、配列番号４を含むかまたはからなる、項目４５に記載のｒＡＡＶ。
（項目４７）
前記イントロンは、前記ｒＨＢＢイントロンである、項目４４に記載のｒＡＡＶ。
（項目４８）
前記イントロンは、配列番号５を含むかまたはからなる、項目４７に記載のｒＡＡＶ。
（項目４９）
前記パッケージされたゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、項目２６～４８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目５０）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、およびウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、項目４９に記載のｒＡＡＶ。
（項目５１）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、前記ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である、項目５０に記載のｒＡＡＶ。
（項目５２）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号６を含むかまたはからなる、項目５１に記載のｒＡＡＶ。
（項目５３）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、項目５０に記載のｒＡＡＶ。
（項目５４）
前記ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号７を含むかまたはからなる、項目５３に記載のｒＡＡＶ。
（項目５５）
項目１～２５のいずれかに記載の組換え核酸を含む、ｒＡＡＶ。
（項目５６）
組換え核酸構築物であって、
ａ．配列番号２のＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；
ｂ．配列番号３のエンハンサー配列；
ｃ．配列番号１２のプロモーター配列；
ｄ．配列番号１または配列番号１５の短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする核酸配列；および
ｅ．配列番号２のＡＡＶ ３’－ＩＴＲ、
を含む組換え核酸構築物。
（項目５７）
短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする前記核酸配列は、配列番号１である、項目５６に記載の組換え核酸構築物。
（項目５８）
短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする前記核酸配列は、配列番号１５である、項目５６に記載の組換え核酸構築物。
（項目５９）
ＡＡＶキャプシドおよびその中にパッケージされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムは、
ａ．配列番号２のＡＡＶ ５’－逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；
ｂ．配列番号３のエンハンサー配列；
ｃ．配列番号１２のプロモーター配列；
ｄ．配列番号１または配列番号１５の短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする核酸配列；および
ｅ．配列番号２のＡＡＶ ３’－ＩＴＲ、
を含む、ｒＡＡＶ。
（項目６０）
前記ベクターゲノムは、配列番号１の短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂをコードする前記核酸配列を含む、項目５９に記載のｒＡＡＶ。
（項目６１）
前記ベクターゲノムは、配列番号１５の短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする前記核酸配列を含む、項目５９に記載のｒＡＡＶ。
（項目６２）
項目１～２５もしくは５６～５８のいずれかに記載の組換え核酸、または項目２６～５５もしくは５９～６１のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む、宿主細胞。
（項目６３）
項目２６～５５または５９～６１のいずれかに記載のｒＡＡＶ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目６４）
項目１～２５または５６～５８のいずれかに記載の組換え核酸分子を含む、組換えベクター。
（項目６５）
前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目６４に記載の組換えベクター。
（項目６６）
前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）ベクターである、項目６５に記載の組換えベクター。
（項目６７）
ウイルソン病の処置における使用のためにｒＡＡＶ収量を増大させる方法であって、前記方法は、項目６４～６６のいずれかに記載の組換えベクターを真核生物宿主細胞培養物に送達する工程および前記ｒＡＡＶを前記真核生物細胞培養物から採取する工程を包含する方法。
（項目６８）
ヒト被験体においてウイルソン病を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、治療上有効な量の、項目２６～５５もしくは５９～６１のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは項目６３に記載のその組成物を投与する工程を包含する方法。
（項目６９）
前記ｒＡＡＶまたは前記組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内に投与される、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記ｒＡＡＶまたは前記組成物は、静脈内投与される、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記ｒＡＡＶは、約１×１０^１１～約１×１０^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、項目６８～７０のいずれかに記載の方法。
（項目７２）
前記ｒＡＡＶは、約１×１０^１２～約１×１０^１３ ＧＣ／ｋｇの用量で投与される、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記ｒＡＡＶを投与する工程は、単一用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目６８～７２のいずれかに記載の方法。
（項目７４）
前記ｒＡＡＶを投与する工程は、複数用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目６８～７２のいずれかに記載の方法。
（項目７５）
短縮型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードする前記核酸配列は、配列番号１または配列番号１５を含むかまたはからなる、項目１～２５もしくは５６～５８のいずれかに記載の組換え核酸構築物、項目２６～５５もしくは５９～６１のいずれかに記載のｒＡＡＶ、項目６３に記載の組成物、項目６２に記載の宿主細胞、項目６４～６６のいずれかに記載の組換えベクター、または項目６７～７４のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
配列番号１４と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む、組換え核酸。
（項目７７）
前記核酸配列は、配列番号１４を含む、項目７６に記載の組換え核酸。

Claims (10)

1. 配列番号１４と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む組換え核酸。
2. 前記核酸配列が配列番号１４に記載の核酸配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
3. 前記核酸配列が配列番号１４に記載の核酸配列からなる、請求項２に記載の組換え核酸。
4. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ＡＡＶキャプシドおよびその中にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え核酸を含む、ｒＡＡＶ。
5. 前記ＡＡＶキャプシドが、血清型９、８、１、２、３、４、５、６、７、１０、１１、１２、ｒｈ１０、またはｈｕ３７のＡＡＶに由来する、請求項４に記載のｒＡＡＶ。
6. 請求項４または請求項５に記載のｒＡＡＶと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物。
7. ヒト被験体においてウィルソン病を処置するための、請求項６に記載の組成物。
8. 前記組成物が、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内に投与される、請求項７に記載の組成物。
9. 前記ｒＡＡＶが、約１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ～約１×１０^１４ＧＣ／ｋｇの用量で投与される、請求項７または８に記載の組成物。
10. 前記ｒＡＡＶが、約５．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、約１．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、または約２．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇの用量で投与される、請求項９に記載の組成物。