TWI742406B - 用以抗氧化之含乳酸菌菌株之食品組合物以及醫藥組合物 - Google Patents
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Abstract
一種長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
) GB-1496菌株，此乳酸菌菌株具有抗氧化及清除自由基之活性效果，且以食品組合物或醫藥組合物的形式存在。
Description
本發明是有關一種食品組合物以及醫藥組合物，特別是一種包含具有抗氧化活性效果之乳酸菌菌株之食品組合物以及醫藥組合物。
老化是人體器官最大的殺手，器官老化會導致慢性腎病、失智症、心血管疾病、糖尿病、癌症或其他慢性疾病，嚴重時可導致個體死亡。而身體所產生的自由基 (free radicals)則是造成器官老化的重要元凶，身體所產生的自由基主要分為活性氧類 (reactive oxygen species)以及活性氮類 (reactive nitrogen species)。活性氧類是生物正常代謝中會產生的副產品，包含一些氧離子、過氧化氫等等，這些活性氧物質在細胞信號傳導、對抗微生物感染和保持機體恆常性中扮演著很重要的角色。而活性氮類則是在病原菌入侵時，大量被免疫細胞產生，主要用於殺死入侵的病原菌。血管內皮細胞也會分泌少量的活性氮物質，來促進血管擴張及訊息傳導。因此，調節並維持良好的自由基平衡對人體非常重要。
當身體調節自由基的機轉喪失或失衡，過量的自由基產生則會破壞細胞DNA，改變細胞內蛋白質結構，攻擊細胞膜，最後導致體細胞的死亡。慢性腎病(chronic kidney disease)的其中一個原因則是因為慢性發炎而腎臟累積了過多的活性氧物質，造成腎細胞的死亡，使得腎器官逐漸喪失其生理功能，到了末期患者只能洗腎度日。阿茲海默症則是腦內類澱粉的堆積造成慢性發炎，而發炎所產生的自由基誘發神經元細胞死亡，最後造成失智症。皮膚老化也是因為長時間暴露於紫外線(UV exposure)或熱源(heat exposure)下，誘發活性氧的量急劇增多，導致皮膚暗沉、皮膚癌等疾病。
綜上所述，發展出一種安全且可長期使用之具有抗氧化活性效果之營養補充品有其迫切性。而乳酸菌一般來說是安全的，因此，找出具有抗氧化活性效果的乳酸菌菌株便是目前極需努力的目標。
本發明提供一種含乳酸菌菌株之食品組合物及醫藥組合物，其具有抗氧化之活性效果，因而能夠減少自由基濃度，以抑制器官老化。
本發明一實施例之含乳酸菌菌株之食品組合物包含具有抗氧化之活性效果之乳酸菌菌株，此乳酸菌株為長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
) GB-1496 菌株，寄存編號為BCRC 910503，上述乳酸菌菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所；以及生理上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
本發明另一實施例之含乳酸菌菌株之醫藥組合物包含具有抗氧化活性效果之乳酸菌菌株，此乳酸菌株為長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
) GB-1496 菌株，寄存編號為BCRC 910503，上述乳酸菌菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所；以及醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
以下藉由具體實施例配合所附的圖式詳加說明，當更容易瞭解本發明之目的、技術內容、特點及其所達成之功效。
以下將詳述本發明之各實施例，並配合圖式作為例示。除了這些詳細說明之外，本發明亦可廣泛地施行於其它的實施例中，任何所述實施例的輕易替代、修改、等效變化都包含在本發明之範圍內，並以申請專利範圍為準。在說明書的描述中，為了使讀者對本發明有較完整的瞭解，提供了許多特定細節；然而，本發明可能在省略部分或全部特定細節的前提下，仍可實施。此外，眾所周知的步驟或元件並未描述於細節中，以避免對本發明形成不必要之限制。圖式中相同或類似之元件將以相同或類似符號來表示。特別注意的是，圖式僅為示意之用，並非代表元件實際之尺寸或數量，有些細節可能未完全繪出，以求圖式之簡潔。
本發明所述之乳酸菌菌株之冷凍乾燥培養物已寄存於財團法人食品工業發展研究所(地址為台灣新竹市食品路331號)。寄存之詳細資料如表1所示：
表1 乳酸菌菌株之寄存資料
| 菌株名 | 分類 | 寄存編號 | 寄存日期 |
| GB-1496 | 長雙歧桿菌嬰兒亞種Bifidobacterium longum subsp.infantis | BCRC 910503 | 2011年02月11日 |
如表1所列已寄存的長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
) GB-1496菌株被發現具有抗氧化(高還原力)及清除自由基的活性效果。
本發明包含具有抗氧化及清除自由基活性效果之乳酸菌菌株，該乳酸菌菌株為長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
)
GB-1496菌株，寄存編號為BCRC 910503，上述乳酸菌菌株寄存於 財團法人食品工業發展研究所；以及生理上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體所組成之食品組合物，或醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體所組成之醫藥組合物，其中乳酸菌菌株為具有活性的菌株。
於食品組合物之實施例中，生理上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體可為一食品。舉例而言，食品可包含但不限於乳製飲品、茶、咖啡、口香糖、潔牙糖(例如口含片、咀嚼錠、軟糖等)或以上之組合，其中乳製飲品可包含醱酵乳、優格、乳酪或乳製飲品乳粉等。醫藥組合物可為口服劑型。舉例而言，口服劑型可為錠劑、膠囊、溶液劑及粉劑等。
於食品組合物或醫藥組合物之實施例中，乳酸菌菌株之數量為106
CFU以上；較佳者，乳酸菌菌株之數量為1010
CFU以上。實例 1 ：
本發明之乳酸菌菌株之形態學以及一般性質
根據16S rDNA序列分析以及API細菌鑑定系統分析結果來確認菌株在分類學上的特徵。本發明之乳酸菌菌株在形態學及一般性質上的特徵詳細列於表2：
表2 本發明之乳酸菌菌株之形態學及一般性質特徵
實例 2
：本發明之乳酸菌菌株之收集、培養與保存
| 菌株名 | 形態特徵 |
| 長雙歧桿菌嬰兒亞種 GB-1496 | 1. 為厭氧菌，且為革蘭氏染色陽性桿菌。 2. 於 MRS 培養基生長出的菌落為白色實心圓形，菌體型態為中長桿狀，兩端偶伴有雙歧分支 (Y字型或V字型)。 |
本發明之乳酸菌菌株是以20%甘油保存於-80℃。使用前，以含有0.05% cysteine 之MRS broth (DIFCO)，37℃下活化(24小時)二次後使用。使用於研究之本發明乳酸菌菌株：長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
) GB-1496菌株，來源為人類母乳。實例 3
：本發明之乳酸菌菌株GB-1496菌株之自由基清除活性分析
DPPH (di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium)是穩定自由基分子，DDPH自由基在甲醇溶液中在波長517nm下有最高的吸收值。當DPPH自由基與抗氧化物質作用後，抗氧化物質提供氫質子而清除自由基，而DPPH自由基就會失去本身藍紫色的特性而造成吸光值的下降。利用測定OD517
值的下降來測定受測乳酸菌菌株之自由基清除能力。
乳酸菌菌株之自由基清除能力的檢測方法如下。將本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種GB-1496菌株之含菌株菌液 (約為2 × 109
CFU)、10μg/ml 維生素C (陽性控制組，positive control)、不具抗氧化活性效果之嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophiles
) SY-66菌株、鼠李糖乳酸桿菌 (Lactobacillus rhamnosus
) gL-35菌株、副乾酪乳酸桿菌 (Lactobacillus paracasei
) gL-30菌株及gL-180菌株之含菌株菌液 (約為2 × 109
CFU，陰性控制組，negative control)及二次水(空白組，blank)分別與0.2mM DPPH在甲醇溶液中1：1混合。混和均勻後，在黑暗室溫下反應30分鐘。接著於4℃離心(12000rpm，2min)後，取200μl到96孔盤中並測定OD517
值。自由基清除能力的計算公式如下：
自由基清除能力 = ODblank
- ODsample
/ ODblank
* 100 %
其中ODsample
為受測樣品的吸光值，ODBlank
為空白組的吸光值。
請參照圖1，其為本發明之乳酸菌菌株清除自由基能力分析(DPPH assay)之試驗結果，其中符號**表示p
值>0.01，亦即統計學上具有顯著差異。由圖1之試驗結果可知，相較於SY-66菌株 (Streptococcus thermophiles
)、gL-35菌株 (Lactobacillus rhamnosus
)、gL-30菌株 (Lactobacillus paracasei
)及gL-180菌株 (Lactobacillus paracasei
)，本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
)
GB-1496菌株具有強清除自由基的能力。實例 4
：本發明之乳酸菌菌株GB-1496菌株之抗氧化還原力活性分析
抗氧化還原力活性分析 (Ferric-reducing ability of power，FRAP assay)是一種普遍用來測試抗氧化劑還原力活性的一種方法，其是以樣品整體的還原能力作為抗氧化力。於酸性環境(pH 3.6 以下)下，FRAP 試劑中的三價鐵(Fe3+
)會被抗氧化物如維生素C還原成二價鐵(Fe2+
)，而造成顏色的改變。利用TPTZ (2,4,6-Tri-(2-pyridyl)-5-triazine) 的呈色特性可測得樣品的還原能力。當 Fe3+
-TPTZ 複合物被還原成 Fe2+
-TPTZ 時，會由黃色轉為藍色，藍色越深表示抗氧化力越強。因此，檢測OD593
值即可計算出抗氧化劑的還原能力，也就是抗氧化能力。
本次實驗是將本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種GB-1496菌株之含菌株菌液 (約為6 × 109
CFU)、5μg/ml 維生素C (陽性控制組，positive control)、不具抗氧化特性之SY-66菌株 (Streptococcus thermophiles
)、gL-35菌株 (Lactobacillus rhamnosus
)、gL-30菌株 (Lactobacillus paracasei
)及gL-180菌株 (Lactobacillus paracasei
)菌株菌液 (約為6 × 109
CFU)，陰性控制組，negative control) 和Fe3+
-TPTZ做反應，並檢測OD593
值。所測的值和所製備的已知濃度的FeSO4
標準液混合FRAP 試劑所得到的標準檢量線做比對。利用檢量線公式計算出含本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種GB-1496菌株之菌液的還原力(μg/ml, Fe2+
)。
請參照圖2，其為本發明之乳酸菌菌株還原力分析試驗(FRAP assay)的試驗結果，其中符號***表示p
值>0.005，亦即統計學上具有非常顯著的差異。由圖2之試驗結果可知，相較於SY-66菌株 (Streptococcus thermophiles
)、gL-35菌株 (Lactobacillus rhamnosus
)、gL-30菌株 (Lactobacillus paracasei
)及gL-180菌株 (Lactobacillus paracasei
)，本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
)
GB-1496菌株具有很強的還原力，也就是抗氧化力。實例 5
：本發明之乳酸菌菌株誘發腸上皮細胞表現抗氧化酵素分析
身體內對於太多的自由基(oxidative stress)會有所謂的調控機制，體細胞會產生抗氧化劑(antioxidant)來因應，如合成穀胱甘肽(glutathione)、泛醇(ubiquinol)和尿酸(uric acid)等物質來吸收游離電子，另一方面從食物中攝取抗氧化劑如維生素C、維生素E等，也能抑制自由基的產生。身體細胞的另一個抗氧化系統為抗氧化酵素(antioxidant enzymes)網絡。超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)是一種重要的抗氧化酵素，可以將超氧化物通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫，人體內有三種超氧化物歧化酶，分別存在於胞外、細胞質(cytoplasm)及粒線體(mitochondria)中。另一種酵素為過氧化氫酶 (catalase)是可以將超氧化物歧化酶所產生的過氧化氫轉化為氧氣和水。在飽和的狀態下，一個過氧化氫酶分子每秒能將四千萬個過氧化氫分子轉化為水和氧氣。
Caco-2細胞為人類結腸腺癌細胞上皮細胞，其細胞結構和功能相似於分化的小腸上皮細胞。Caco-2細胞具有微絨毛等結構並含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系，因而被廣泛應用在模擬體內腸細胞生理活動模式。在細胞培養系統中，Caco-2細胞可以長成單一層細胞，細胞彼此排列緊密，不僅在形態學上和小腸上皮細胞相似，且具有同樣的胞飲作用、Tight junction等結構。
本實驗在Caco-2細胞的培養系統中加入本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
) GB-1496菌株之活菌(實驗組)、Streptococcus thermophiles
SY-66菌株之活菌(對照組)及不加入任何活菌(空白控制組，Control)，以比例1：100 (cells：probiotics) 共同培養16小時後，洗掉菌株，再將Caco-2細胞打破萃取蛋白質，以檢測細胞內的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性(其試驗結果如圖3所示)及過氧化氫酶(catalase)活性(其試驗結果如圖4所示)。SOD 活性分析是使用SOD Assay Kit (Cayman Cat.706002)，而catalase 活性分析是使用Catalase Assay Kit (Cayman Cat.707002)。所有實驗流程皆依照kit的說明書建議進行分析。
請參照圖3及圖4，以說明本發明之乳酸菌菌株誘發腸上皮細胞表現抗氧化酵素之效果，其中符號*表示p
值>0.05，亦即統計學上具有顯著差異；符號***表示p
值>0.005，亦即統計學上具有非常顯著的差異。相較於對照組Streptococcus thermophiles
SY-66菌株，本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
)
GB-1496菌株可以誘發Caco-2細胞增加抗氧化酵素的表現，以分解體內過多的自由基。
需注意的是，乳酸菌對身體健康的功能在於菌株(strain)的特異性，而非菌種(species)，此種對於人之身體健康有特殊功效之菌株稱為功能性益生菌(Guidelines for the evaluation of probiotics in food；Report of joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food；London Ontario, Canada April 30 and May 1, 2002：1-7)。舉例而言，根據2018年發表在Scientific Reports
的一篇論文，野生種Bifidobacterium longum
subsp.infantis
在有氧的環境下，由於菸鹼醯胺腺嘌呤二核甘酸磷酯 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶的作用，會在菌體內產生過多的活性氧自由基(H2
O2
)。因此，野生種Bifidobacterium longum
subsp.infantis
似乎無法有效清除自由基，並造成菌體的死亡或抑制其生長。而本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum
subsp.infantis
)
GB-1496菌株具有清除自由基的功效，相較於野生種Bifidobacterium longum
subsp.infantis
具有其獨特性。
綜合上述，相較於其它受測的乳酸菌菌株，本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種GB-1496菌株具有較佳的自由基清除能力以及還原能力，且能誘發Caco-2細胞增加抗氧化酵素的表現，因此，本發明之長雙歧桿菌嬰兒亞種GB-1496菌株具有抗氧化之活性效果，且能夠減少自由基濃度，以抑制器官老化。
以上所述之實施例僅是為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。
無
圖1為本發明之乳酸菌菌株之清除自由基能力分析的試驗結果。
圖2為本發明之乳酸菌菌株之還原能力分析的試驗結果。
圖3為本發明之乳酸菌菌株和人類腸上皮細胞株(Caco-2)共同培養後，腸上皮細胞所產生的超氧化物歧化酶活性分析的試驗結果。
圖4為本發明之乳酸菌菌株和人類腸上皮細胞株(Caco-2)共同培養後，腸上皮細胞所產生的過氧化氫酶活性分析的試驗結果。
財團法人食品工業發展研究所、2011年02月11日、BCRC 910503
Claims (7)
- 一種含乳酸菌菌株之食品組合物，包含： 具有抗氧化之活性效果之乳酸菌菌株，該乳酸菌菌株為長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp.infantis ) GB-1496 菌株，寄存編號為BCRC 910503，上述乳酸菌菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所；以及 生理上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
- 如請求項1所述之含乳酸菌菌株之食品組合物，其中該乳酸菌菌株為具有活性的菌株。
- 如請求項1所述之含乳酸菌菌株之食品組合物，其中該賦形劑、稀釋劑或載體為一食品。
- 如請求項3所述之含乳酸菌菌株之食品組合物，其中該食品包含醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品乳粉、茶、咖啡、口香糖、潔牙糖或以上之組合。
- 一種含乳酸菌菌株之醫藥組合物，包含： 具有抗氧化之活性效果之乳酸菌菌株，該乳酸菌菌株為長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp.infantis ) GB-1496 菌株，寄存編號為BCRC 910503，上述乳酸菌菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所；以及 醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
- 如請求項5所述之含乳酸菌菌株之醫藥組合物，其中該乳酸菌菌株為具有活性的菌株。
- 如請求項5所述之含乳酸菌菌株之醫藥組合物，其為口服劑型。
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