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TWI605039B - 用於抑制微粒體前列腺素ｅ合成酶１之新穎甲基－哌啶化合物 - Google Patents

用於抑制微粒體前列腺素ｅ合成酶１之新穎甲基－哌啶化合物 Download PDF

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TWI605039B
TWI605039B TW104134250A TW104134250A TWI605039B TW I605039 B TWI605039 B TW I605039B TW 104134250 A TW104134250 A TW 104134250A TW 104134250 A TW104134250 A TW 104134250A TW I605039 B TWI605039 B TW I605039B
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mmol
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馬修 亞倫 史基佛勒
馬修 約瑟夫 費雪
史蒂芬 李 庫利許
凱瑟琳 瑪莉 帕翠吉
艾倫Ｍ 瓦休斯基
傑洛米 舒倫伯 約克
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美國禮來大藥廠
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Publication date
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Description

用於抑制微粒體前列腺素E 2 合成酶1之新穎甲基-哌啶化合物
本發明係關於新穎化合物；包含該等化合物的醫藥組合物；使用該等化合物治療與關節炎相關之疼痛及/或發炎的方法；以及用於合成該等化合物的中間物及方法。
關節炎涉及關節的發炎且往往伴隨著疼痛及僵硬。骨關節炎，最常見的關節炎形式，為複雜的關節退化疾病，其特徵為關節軟骨、關節周圍結構(包括骨骼、滑膜及相關纖維性關節組織)的進行性毀壞；以及不同程度的發炎。使用非類固醇、消炎藥(NSAID)及環加氧酶-2抑制劑(COX-2抑制劑)的現有藥物療法可減少與骨關節炎相關的疼痛，但隨著時間可能僅為中等有效的且各自具有變化的風險/收益考量。
NSAID及COX-2抑制劑經由抑制COX-2酶而減少發炎及疼痛。作為對促炎性刺激的反應，COX-2酶使得二十碳四烯酸代謝成前列腺素H2(PGH2)。PGH2另外藉由多種酶代謝成其他類廿烷酸，包括前列腺素E2(PGE2)、前列腺素I2(PGI2)、前列腺素F2α(PGF2α)、前列腺素D2(PGD2)及血栓素A2(TXA2)。此等代謝物已知可誘導生理學及病理生理學效應。據信，藥物介導PGI2與TXA2發生的不平衡可解釋NSAID及COX-2抑制劑為何產生有害的胃腸及心血管副作用。從而，對於許多患者而言，由於先前存在或出現的心血管及/或胃腸病狀，因此此 等類別的藥物可能為禁忌的。另外，患者隨著時間可能難以用特定藥物療法治療。
在二十碳四烯酸代謝物中，PGE2已鑑別為與骨關節炎相關之病狀(例如發熱、疼痛及發炎)的重要介體。前列腺素E2特定地經由微粒體前列腺素E2合成酶1(mPGES-1)使PGH2代謝而產生。據信，選擇性地抑制mPGES-1可為罹患關節炎的患者提供新的治療選項。
公開案WO 2013/146970揭示經三取代之喹啉化合物且提出所揭示之化合物可尤其適用於治療發炎疾病。然而，該公開案未揭示如本申請案中所主張的化合物。
仍需要治療發炎及緩解與關節炎相關之疼痛的其他選項。本發明提供抑制mPGES-1且可能有益於治療罹患關節炎及骨關節炎之患者的新穎化合物。
本發明提供式1化合物或其醫藥學上可接受之鹽， 其中R1為H或-CH3；R係選自： 及；及G係選自：
本發明提供式2化合物或其醫藥學上可接受之鹽： 其中：R1為H或-CH3；R係選自：、 及；及G係選自：
本發明亦提供式1或2化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1為-CH3。
在較佳的式1或2化合物或其醫藥學上可接受之鹽中，R係選自：
在更佳的式1或2化合物或其醫藥學上可接受之鹽中，R係選自：
在仍然更佳的式1或2化合物或其醫藥學上可接受之鹽中，R係選自：
在較佳的式1或2化合物或其醫藥鹽中，G為：
本發明亦提供式3化合物，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一個實施例中，式1、2或3化合物係以中性物質形式提供。在另一個實施例中，化合物係以醫藥學上可接受之鹽提供。在一種較佳 的鹽形式中，式3化合物係以鹽酸鹽形式提供。
本發明亦提供醫藥學上可接受之組合物，其包含式1、2或3化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑中的至少一者。
本發明亦提供一種治療患者的方法，該患者需要治療與關節炎或骨關節炎相關的疼痛。方法包含向患者投與有效量之醫藥學上可接受之組合物，該組合物包含式1、2或3化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑中的至少一者。
本發明亦提供治療患者的方法，該患者需要治療關節炎或骨關節炎。在一種形式中，本發明提供治療患者之骨關節炎之病徵及/或症狀的方法。方法包含向患者投與有效量之式1、2或3化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供一種治療患者的方法，該患者需要治療與關節炎或骨關節炎相關的發炎。方法包含向患者投與有效量之醫藥學上可接受之組合物，該組合物包含式1、2或3化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑中的至少一者。
本發明亦提供治療患者的方法，該患者需要治療與關節炎相關的疼痛。方法包含向患者投與有效量之式1、2或3化合物或其醫藥學上可接受之鹽。本發明另外提供治療患者之與骨關節炎相關之疼痛的方法。方法包含向患者投與有效量之式1、2或3化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明提供用作藥劑的式1、2或3化合物。藥劑或化合物可用於療法。療法可包括治療患者的關節炎或骨關節炎。在一個實施例中，療法可為治療與關節炎或骨關節炎相關的疼痛或發炎。
本發明亦提供化合物用於製造供治療關節炎或骨關節炎用之藥劑的用途。在一種形式中，藥劑用於治療與關節炎或骨關節炎相關的 疼痛或發炎。
如本文所用，術語「治療」或「欲治療」包括遏止或降低與關節炎或骨關節炎相關之現有症狀或病症(特定言之，疼痛及/發炎)的嚴重程度。
如本文所用，術語「患者」係指哺乳動物，諸如天竺鼠、大鼠、狗、貓、牛、馬、綿羊、山羊或人類；或家禽，諸如雞或鴨。較佳患者為哺乳動物，更佳為人類。
本發明的例示性化合物可根據所接受的實務調配成醫藥組合物。醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及稀釋劑之實例可見於Remington's Pharmaceutical Sciences,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.Easton Pa.,1990。非限制性實例包括以下：澱粉、糖、甘露醇及二氧化矽衍生物；黏合劑，諸如羧甲基纖維素及其他纖維素衍生物、單硬脂酸甘油酯；吸附性載體，諸如高嶺土及膨潤土；及潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣及硬脂酸鎂；及固體聚乙二醇。在一種形式中，醫藥調配物包括存在於25mM磷酸鹽緩衝液pH 2中的20%卡布迪索(Captisol)。
較佳醫藥組合物可調配成口服的錠劑或膠囊或調配成可注射溶液。錠劑、膠囊或溶液將包括有效治療需要治療之患者之量的本發明化合物。
如本文所使用，術語「有效量」係指本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的量或劑量，其以單次或多次劑量投與患者後，提供所要作用，諸如診斷或治療下之患者的疼痛及/或發炎減少或消除。
有效量可輕易由主治診斷醫師藉由使用已知技術及藉由在類似情形下獲得的觀測結果確定。在確定針對患者的有效量時，主治診斷醫師可考慮許多因素，包括(但不限於)哺乳動物的物種，其體型、年齡及一般健康狀況；症狀嚴重程度；個別患者的反應；投藥方式；式 1、2或3化合物或其醫藥學上可接受之鹽形式作為調配藥品在所選給藥方案中的生物可用性特徵；伴隨藥物的使用；及其他相關情形。
在一個實施例中，有效量可為約0.0005mg/kg體重至約100mg/kg。更佳地，有效量可為約0.001mg/kg至約50mg/kg。再更佳地，有效量可為約0.001mg/kg至約20mg/kg。
本發明化合物可與其他治療方法及/或其他治療劑組合。本發明化合物較佳可與亦有效治療關節炎或骨關節炎的其他藥劑組合。此等其他治療劑之實例包括：NSAID或COX-2抑制劑，諸如布洛芬(ibuprofen)、阿司匹林(aspirin)、乙醯胺酚(acetaminophen)、塞內昔布(celecoxib)、萘普生(naproxen)及酮基布洛芬(ketoprofen)；類鴉片，諸如羥考酮(oxycodone)及芬太尼(fentanyl)；及皮質類固醇，諸如氫皮質酮(hydrocortisone)、潑尼松龍(prednisolone)及潑尼松(predni-sone)。
本發明化合物及其他治療劑可經由相同遞送路徑及裝置(諸如單一丸劑、膠囊、錠劑或溶液)一起投與；或在各別遞送裝置中在相同時間分別投與或依序投與。
本發明化合物可以醫藥學上可接受之鹽提供。「醫藥學上可接受之鹽」係指認為臨床及/或獸醫使用可接受之本發明化合物的鹽。醫藥學上可接受之鹽及其製備之常用方法在此項技術中為熟知。參見例如P.Stahl等人，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection and Use,(VCHA/Wiley-VCH,2002)；S.M.Berge等人，"Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，第1期，1977年1月。
本發明化合物或其鹽可藉由此項技術中已知的多種程序製備，其中一些程序說明於下文的流程、製備及實例中。一般技術者認識到，所述各路徑中的特定合成步驟可以不同方式組合，或與不同流程 的步驟結合，以製備本發明化合物或其鹽。下文流程中各步驟的產物可藉由習知方法回收或純化，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、超臨界流體層析、過濾、濕磨及結晶。
個別異構體、對映異構體或非對映異構體可由一般技術者在合成式1化合物的任何方便時點藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析方法來分離或解析(參見例如J.Jacques等人，"Enantiomers,Racemates,and Resolutions",John Wiley and Sons,Inc.,1981，以及E.L.Eliel及S.H.Wilen,"Stereochemistry of Organic Compounds",Wiley-Interscience,1994)。另外，下文製備中所述之中間物含有氮及氧保護基團。保護及去保護條件為熟習此項技術者所熟知且描述於文獻中(參見例如"Greene's Protective Groups in Organic Synthesis"，第4版，Peter G.M.Wuts及Theodora W.Greene,John Wiley and Sons,Inc.2007)。
試劑及起始物質通常為一般技術者容易獲得的。其他物質可藉由有機及雜環化學之標準技術及下文製備及實例中所述之程序製備。
如下文所說明，使用穿過鍵的線描繪鍵指示取代基相對於分子其餘部分的連接點。
本文中所用之縮寫根據Aldrichimica Acta，第17卷第1期，1984定義。其他縮寫定義如下：「δ」係指相對於四甲基矽烷低場的百萬分率；「ATCC」係指美國菌種保藏中心；「BOP」係指(苯并三唑-1-基氧基)參(二甲基胺基)鏻六氟磷酸鹽；「BSA」係指牛血清白蛋白；「CDI」係指1,1'-羰基二咪唑；「DCC」係指1,3-二環己基碳化二亞 胺；「DCM」係指二氯甲烷；「DIC」係指1,3-二異丙基碳化二亞胺；「DMF」係指二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲亞碸；「EDCI」係指1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「ee」係指對映異構體過量；「EIA」係指酶免疫分析；「EIMS」係指電子電離質譜；「ESMS」係指電噴霧質譜；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「EtOH」係指乙醇(ethanol)或乙醇(ethyl alcohol)；「Ex.No.」係指實例編號；「HATU」係指(1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化物六氟磷酸鹽)；「HBTU」係指(1H-苯并三唑-1-基氧基)(二甲基胺基)-N,N-二甲基甲銨六氟磷酸鹽；「HOAT」係指1-羥基-7-偶氮苯并三唑；「HOBT」係指水合1-羥基苯并三唑；「IC50」係指藥劑濃度，其產生該藥劑可能之最大抑制反應的50%；「i-PrOH」係指異丙醇(isopropanol)或異丙醇(isopropyl alcohol)；「LPS」係指脂多醣；「MeOH」係指甲醇；「min」係指分鐘；「NSAID」係指非類固醇消炎藥；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「PGE2」係指前列腺素E2；「PGH2」係指前列腺素H2；「PGI2」係指前列腺素I2；「PyBOP」係指(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽)；「PyBrOP」係指溴(三吡咯啶基)鏻六氟磷酸鹽；「rhIL-1β」係指重組人類介白素1β；「SCF」係指超臨界流體；「SFC」係指超臨界流體層析；「TBME」係指第三丁基醚甲基醚；「THF」係指四氫呋喃；且「tR」係指滯留時間。
通用LCMS方法。所有分析均使用Agilent 1200 Infinity系列液相層析(LC)系統進行，該系統由以下組成：1260 HiP脫氣器(G4225A)、1260二元泵(G1312B)、1290自動取樣器(G4226A)、1290恆溫管柱隔室(G1316C)及與Agilent 6150單一四極質譜(MS)偵測器耦聯的1260二極體陣列偵測器(G4212B)。MS係使用電噴霧電離源(ESI)、以正離子及負離子模式操作。噴霧器壓力設定為50psi，乾燥氣體溫度及流速 分別設定為350℃及12.0L/min。所用毛細管電壓在正模式中為4000V且在負模式中為3500V。使用安捷倫Chemstation軟體進行資料擷取。
HPLC方法1。在Daicel ChiralPak AD-3R管柱(100mm長度，4.6mm內徑，3μm粒度)上進行分析。所用移動相為：A2=水+10mM碳酸氫銨，用氫氧化銨調節至pH 9；及B2=乙腈。在25℃溫度及1.5mL/min流速下，使用50%至95%(B2)梯度溶離3.0分鐘、隨後在95%(B2)保持3.0分鐘來進行運作。UV(DAD)擷取係在40Hz下進行，掃描範圍為190-400nm(步進5nm)。MS偵測器之前，使用1：1分流比。MS擷取範圍設定為100-800 m/z，步長為0.2 m/z，兩種極性模式。碎裂器電壓設定為70(ESI+)或120(ESI-)，增益設定為0.40(ESI+)或1.00(ESI-)且離子計數臨限值設定為4000(ESI+)或1000(ESI-)。總MS掃描週期時間為0.15秒/週期。
SFC方法1。在Daicel ChiralPak OJ-H管柱(100mm長度，4.6mm內徑，5μm粒度)上進行分析。移動相為：8%(20mM NH3/i-PrOH)及92% CO2(scf)，壓力為100巴。在35℃溫度及3毫升/分鐘流速下進行運作。在220nm波長下進行UV(DAD)擷取。
SFC方法2。在Daicel ChiralPak AS-H管柱(100mm長度，4.6mm內徑，5μm粒度)上進行分析。移動相為：20%(20mM NH3/i-PrOH)及80% CO2(scf)，壓力為100巴。在35℃溫度及5毫升/分鐘流速下進行運作。在220nm波長下進行UV(DAD)擷取。
以下流程進一步說明本發明。
流程1
在流程1、步驟1中，在哌啶上安裝三氟甲基磺醯基以在隨後的步驟2反應中充當離去基。「PG」為針對胺基(諸如胺基甲酸酯及醯胺)開發之保護基。步驟1的產物接著使用鈀催化劑進行羰基化，得到步驟2的酯產物。四氫吡啶中的雙鍵可在氫化條件下還原。在步驟3、子步驟2中，哌啶胺可在酸性條件下脫除保護基。步驟3的哌啶產物接著可與經鹵素取代之G基團在適於親核性芳族取代的條件下發生反應，得到步驟4的產物。舉例而言，可使用無機鹼(諸如K2CO3)或有機鹼(諸如N,N-二異丙基乙胺、吡啶或三乙胺)，得到步驟4、子步驟1的產物。或者，步驟3的哌啶產物可與喹諾酮N-氧化物使用活化劑(諸如PyProp)反應，得到步驟4的產物。脫除哌啶羧基的保護基可在標準條件下使用無機鹼(諸如氫氧化鈉或氫氧化鋰水溶液)完成，得到步驟4、子步驟2的產物，或在酸性條件下使用4M HCl或硫酸水溶液完成。
流程2
在流程2中，步驟4的哌啶甲酸產物可與適當胺R-NH2在醯胺化條件下使用有機鹼(諸如三乙胺或二異丙基乙胺)、偶合劑(諸如EDCI)及偶合添加劑(諸如HOBT)進行偶合，得到步驟5、子步驟1的化合物。熟習此項技術者將認識到存在多種方法及試劑用於由羧酸與胺反應形成醯胺。舉例而言，胺化合物與適當羧酸在偶合劑存在下(使用或不使用有機鹼)發生反應，可得到式1化合物。偶合試劑包括碳二醯亞胺，諸如DCC、DIC、EDCI或羰基二咪唑，諸如CDI。亦可使用醯胺偶合添加劑(諸如HOBT及HOAt)增強反應。另外，可使用非親核性陰離子之或鏻鹽(諸如HBTU、HATU、BOP、PyBOP及PyBrOP)替代更多的傳統偶合試劑。可以使用諸如DMAP之添加劑增強反應。步驟5、子步驟1的產物在必要時可接著在標準條件下，在溶劑(諸如MeOH及THF)中，使用無機鹼(諸如氫氧化鈉或氫氧化鋰水溶液)脫除保護基，得到式1化合物。
本發明化合物的醫藥學上可接受之鹽(諸如鹽酸鹽)可例如藉由式1的適當游離鹼與醫藥學上可接受之適當酸(諸如鹽酸)於適合溶劑(諸如乙醚)中、在標準條件下發生反應而形成。另外，此類鹽之形成可與脫除氮保護基同時發生。此類鹽之形成在此項技術中已熟知及瞭解。參見例如Gould,P.L.,"Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics,33：201-217(1986)；Bastin,R.J.等人，"Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development,4：427-435(2000)；及Berge,S.M.等人，"Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences,66：1-19,(1977)。
以下製備及實例進一步說明本發明。
製備1 3,3-二甲基-4-(((三氟甲基)磺醯基)氧基)-3,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯
在氮氣氛圍下，將二異丙胺(260mL，1.85mol)於THF(1.0L)中之溶液冷卻至-20℃，接著歷經30分鐘逐滴添加正丁基鋰溶液(2.50M於己烷中，650mL，1.60mol)。允許混合物升溫至-10℃且攪拌1小時。將混合物冷卻至-74℃且歷經60分鐘逐滴添加3,3-二甲基-4-側氧基哌啶-1-甲酸第三丁酯(260g，1.14mol)於THF(1.0L mL)中之溶液。在-74℃攪拌混合物2小時，接著添加N-苯基雙(三氟甲烷磺醯亞胺)(430g，1.20mol)於THF(1.0L)中之溶液。將混合物升溫至0℃且攪拌2小時。允許混合物升溫至室溫且攪拌隔夜。用NH4Cl飽和水溶液(1.0L)淬滅反應；用水(2.0L)稀釋；分離各層；且用EtOAc(2×2L)萃取水層。合併有機萃取物；經Na2SO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮濾液。所得粗物質用0%至15%TBME/己烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到呈橙色油狀之標題化合物(430g，78%)，其純度以質量計為約75%，如藉由1H NMR所估算。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 1.05(s,6H),1.40(s,9H),3.36(s,2H),4.02(d,J=3.4Hz,2H),5.82(br s,1H)。
製備2 3,3-二甲基-2,6-二氫吡啶-1,4-二甲酸O1-第三丁酯O4-甲酯。
將乙酸鈀(II)(4.40g，20.0mmol)、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵(13.3g，22.8mmol)、3,3-二甲基-4-(((三氟甲基)磺醯基)氧基)-3,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯(72.0g，150mmol)、無水乙腈(850mL)、無水甲醇(570mL)及三乙胺(36.0mL，245mmol)合併於裝配有機械攪拌器的2L PARRTM高壓釜中。密封高壓釜。沖洗，接著用一氧化碳將高壓釜加壓至689kPa。加熱混合物至65℃維持2.25小時；冷卻混合物至室溫；且小心地自高壓釜排出。(注意！毒氣！)。在減壓下濃縮，得到粗物質。將此物質與藉由類似程序、依相似規模製備的其他五批物質合併。合併之物質用0%至20% TBME/己烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到呈黃色油狀之標題化合物(260g，88%)，其純度以質量計為約83%。MS(m/z)：214(M-t-Bu+2H)+。
製備3 (±)-3,3-二甲基哌啶-1,4-二甲酸O1-第三丁酯O4-甲酯
將鈀(10wt%/碳，5.4g，5.1mmol)懸浮於MeOH(700mL)中，接著將3,3-二甲基-2,6-二氫吡啶-1,4-二甲酸O1-第三丁酯O4-甲酯(130g，396mmol)溶解於MeOH(700mL)中的溶液添加至2.25L PARRTM反應器中。密封反應器且首先用氮氣沖洗，接著用氫氣沖洗。用氫氣將反應器加壓至414kPa且在室溫下攪拌混合物1.5小時。釋放壓力且過 濾混合物以移除催化劑。將濾液與自另外基本上相同反應獲得的物質合併且在減壓下濃縮，得到呈黃色油狀之標題化合物(240g，95%)，其純度以質量計為約85%。MS(m/z)：216(M-t-Bu+2H)+。
製備4 (±)-3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽
添加HCl(4.0M於1,4-二噁烷中的溶液，2.0L，8.0mol)至3,3-二甲基哌啶-1,4-二甲酸O1-第三丁酯O4-甲酯(240g，752mmol)於1,4-二噁烷(500mL)中之溶液中。所得混合物在室溫下攪拌隔夜且在減壓下濃縮。用TBME(500mL)稀釋殘餘物且藉由過濾收集所得固體。用TBME(2×400mL)沖洗濾餅且真空烘箱中在35℃乾燥固體隔夜，得到呈白色固體狀之標題化合物(144g，92%)。MS(m/z)：172(M+H)+。
製備5 (-)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸甲酯
將K2CO3(210g，1.52mol)添加至3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽(144g，693mmol)及2-氯-8-甲基喹啉(125g，704mmol)於DMSO(1.4L)中的混合物中。所得混合物在131±1℃攪拌隔夜。冷卻混合物至室溫；過濾以移除固體；收集濾液；用水(2L)稀釋濾液；接著用EtOAc(2×3L)萃取。合併之有機萃取物用水(3×1.5L)洗滌；經Na2SO4乾燥；過濾；收集且在減壓下濃縮濾液。所得粗物質用25%至30%(10% TBME/DCM)/己烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到標 題化合物的外消旋物。將此物質溶解於MeOH(7.5L)中且過濾。使用含有15%(0.2%二甲基乙基胺/i-PrOH)的CO2(scf)作為移動相，藉由每95秒注射5mL溶液直至所有物質已耗盡，在400g/min的流速下，對物質進行對掌性SFC(Chiralpak OJ-H,50mm×250mm×5μm)。每次注射時，收集所溶離的第一溶離份(t R=2.57min，根據SFC方法1)。將所收集的溶離份與以類似方式製備的來自先前反應的彼等物合併，得到98g粗3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽。在減壓下濃縮混合物且使該物質在熱EtOH(1.38L)中再結晶。收集晶體且在真空烘箱中、在40℃乾燥結晶物質隔夜，得到呈白色結晶固體狀之標題化合物(156g，43%產率，基於分批比例)。MS(m/z)：313(M+H)+,[α]20 D -45°(c 0.21,DCM)。ee=>99%，如藉由SFC方法1所測定。
製備6 (-)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸
用硫酸(10% v/v於水中，2.31L，2.75mol)處理甲基(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸甲酯(154g，493mmol)且將混合物回流隔夜。冷卻混合物至室溫且添加NaOH(50wt%於水中)直至pH達到13。添加TBME(500mL)，得到三相混合物。自上而下，各層標記為：「層A」、「層B」及「層C」。移除層C(底層)。添加水(600mL)至層A及B中且將水層與有機層分離。擱置有機層(A及B)。將水層與層C合併。合併之水層用TBME(500mL)萃取；分離各層；且擱置有機萃取物。添加HCl(5.0M)至水層中直至pH為6.5。所得含水混合物用TBME(2×400mL)萃取。合併所有有機萃取物(包括層A及B)；經MgSO4乾燥；過濾；收集且在減壓下濃縮濾液，得到96%純度的呈白 色固體狀之標題化合物(145g，95%)。MS(m/z)：299(M+H)+。[α]20 D -59.6°(c 3.12,CH3OH)。
製備7 (±)-2-((苯甲氧基)甲基)-2,3-二氫-4H-哌喃-4-酮
歷經90分鐘將ZnCl2於THF(0.5M，1.21L，607mmol)中的溶液添加至(E)-1-甲氧基-3-(三甲基矽烷基)氧基-1,3-丁二烯(95%純，100g，551mmol)及(苯甲氧基)乙醛(97%純，80mL，551.370mmol)於甲苯(551mL)中的冷(0℃)溶液中，同時維持反應混合物的內部溫度低於10℃。允許混合物升溫至室溫且攪拌隔夜。將反應混合物分成兩等份；每份進行以下程序。以四份添加三氟乙酸(35mL，457mmol)。20分鐘之後，在減壓下濃縮所得混合物；用EtOAc稀釋；添加過量的飽和NaHCO3；過濾以移除固體；收集濾液；分離且收集有機層。用NaCl飽和水溶液洗滌有機溶液；分離有機萃取物；經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮。將自先前所分離部分中之每一者獲得的物質合併。所得物質用20%至50% EtOAc/己烷溶離，進行矽膠急驟層析，得到92%純度的呈橙色油狀之標題化合物(96g，73%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.40-7.28(m,6H),5.42(d,J=6.0Hz,1H),4.65-4.56(m,3H),3.74-3.67(m,2H),2.75(dd,J=16.8,14.3Hz,1H),2.42(dd,J=16.9,3.2Hz,1H)。
製備8 (±)-2-(苯甲氧基甲基)四氫哌喃-4-酮
EtOAc(880mL)、(±)-2-((苯甲氧基)甲基)-2,3-二氫-4H-哌喃-4-酮 (96g，0.440mol)、三乙胺(123mL，0.882mol)及鈀(10%/碳，4.68g，4.40mmol)的混合物在氫氣氛圍下、在室溫下攪拌73小時。經由矽藻土過濾混合物；用EtOAc(250mL)沖洗濾餅；且依序用HCl水溶液(0.1M)、NaHCO3飽和水溶液及NaCl飽和水溶液洗滌濾液。有機層經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮，得到呈淡黃色物質形式之標題化合物(81.4g，84%)。LC/MS(ESI+)：221[M+H]+,238[M+NH4]+,243[M+Na]+。
製備9 (2S,4R)-2-(苯甲氧基甲基)四氫哌喃-4-醇
將(±)-2-(苯甲氧基甲基)四氫哌喃-4-酮(40.6g，184mmol)於THF(1.08L)中的溶液冷卻至-78℃。歷經15分鐘逐滴添加LiAlH4溶液(1.0M於THF中，240mL，240mmol)。添加完成之後，允許混合物升溫至0℃，且緩慢地逐滴添加水(8.4mL)。攪拌混合物5分鐘之後，添加NaOH溶液(15質量%於水中，8.4mL)且攪拌另外5分鐘。接著添加水(3×8.4mL)且允許混合物升溫至室溫。30分鐘後，過濾懸浮液以移除固體且在減壓下濃縮濾液，得到呈無色油狀之標題化合物。固體用THF沖洗一次；過濾；且在減壓下濃縮濾液。將此物質與自先前反應(以40g、22g及45g(±)-2-(苯甲氧基甲基)四氫哌喃-4-酮為起始物質，基本上根據相同程序進行)獲得的彼等物合併。將合併之物質溶解於i-PrOH(637mL)中。使用25% i-PrOH/CO2(scf)作為移動相，在300g/min流速下，藉由每114秒注射1.35g溶液直至所有物質已注射，對該物質進行對掌性SFC(Chiralpak AS-H，50mm×150mm×5μm)。每次注射時，收集所溶離的第一溶離份(主要異構體)。將所有收集的溶離份合併，得到>99% ee的標題化合物(62.8g，42%產率，基於分批 比例)，如藉由SFC方法2所測定。LC/MS(ESI)：223[M+H]+,240[M+NH4]+,245[M+Na]+,467[2M+Na]+。
製備10 ((2S,4R)-2-(苯甲氧基甲基)四氫哌喃-4-基)甲烷磺酸酯
在0℃，將甲磺醯氯(11.7mL，150.6mmol)於DCM(70mL)中的溶液逐滴添加至(2S,4R)-2-(苯甲氧基甲基)四氫哌喃-4-醇(31g，139.5mmol)、DCM(1.40L)及N,N-二異丙基乙胺(73.0mL，418.4mmol)的混合物中。允許混合物升溫至室溫且攪拌隔夜。其後添加甲磺醯氯(0.537mL，6.98mmol)於DCM(5mL)中的溶液且在室溫下攪拌混合物5分鐘。冷卻混合物至0℃，將其傾倒入水中；分離；且收集有機層。用水(500mL)洗滌有機層；將有機層與自基本上相同的其他反應獲得的有機層/萃取物合併。合併之有機溶液經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮濾液，得到呈淺橙色油狀之標題化合物(84.7g，97%產率，基於分批比例)。1H NMR(400MHz,d 6-DMSO)δ 7.36-7.24(m,5H),4.86-4.77(m,1H),4.47(s,2H),3.96(dd,J=7.6,4.4Hz,1H),3.60-3.54(m,1H),3.48-3.36(m,3H),3.18(s,3H)2.05(d,J=7.8Hz,1H),1.98(d,J=7.8Hz,1H),1.58(app qd,J=12.0,4.8Hz,1H),1.40(app q,J=11.8Hz,1H)。
製備11 ((2S,4S)-4-胺基四氫-2H-哌喃-2-基)甲醇鹽酸鹽
將疊氮化鈉(12.85g，191.7mmol)添加至((2S,4R)-2-(苯甲氧基甲基)四氫哌喃-4-基)甲烷磺酸酯(32.0g，106.5mmol)於DMF(304mL) 中之溶液中。所得混合物加熱至100℃且攪拌4小時。冷卻反應混合物至室溫。將混合物傾倒入水(400mL)中，接著用EtOAc(2×400mL)萃取。合併有機萃取物且用NaCl飽和水溶液(3×200mL)洗滌。有機萃取物經MgSO4乾燥；過濾；且收集濾液。在減壓下濃縮濾液至約100mL總體積。將所得混合物溶解於EtOAc(700mL)中且將其添加至含有PtO2(2.7g，12mmol)及EtOAc(700mL)的PARRTM容器中。用氮氣沖洗容器；接著用氫氣加壓至414kPa。混合物在室溫下攪拌4小時。過濾混合物且在減壓下濃縮無色濾液，得到23.2g無色油狀物。將36.2g獲自先前反應、藉由基本上相同程序製備之物質合併。將合併之物質溶解於EtOH(600mL)中且添加HCl(37wt%於H2O中，50mL)。所得混合物添加至含有Pd(10%/碳，10.0g，9.40mmol)及EtOH(600mL)的PARRTM容器中。用氮氣沖洗反應器且用氫氣加壓至414kPa。在室溫下攪拌混合物1小時。過濾混合物；收集濾液；且在減壓下濃縮無色濾液，得到約72%純度的呈深色稠油狀之標題化合物(54.2g，85%)。LC/MS(ESI)：132[M+H]+。
製備12 (±)-(3,3-二甲基-1-[4-(三氟甲基)苯基]哌啶-4-甲酸甲酯
將K2CO3(460mg，3.33mmol)添加至3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽(300mg，1.44mmol)、1-氟-4-(三氟甲基)苯(475mg，2.89mmol)及DMSO(2mL)的混合物中。所得混合物在130℃攪拌2天。將混合物冷卻至室溫且攪拌3天。所得物質用10%至100%乙腈(0.1%甲酸)/水(0.1甲酸)梯度溶離，進行C18矽膠逆相急驟層析，得到呈黃色油狀之標題化合物(113mg，25%)。MS(m/z)：316(M+H)+。
製備13 (±)-3,3-二甲基-1-[4-(三氟甲基)苯基]哌啶-4-甲酸。
將2M NaOH水溶液(1mL，2mmol)添加至甲基(±)-3,3-二甲基-1-[4-(三氟甲基)苯基]哌啶-4-甲酸甲酯(113mg，0.36mmol)、MeOH(1mL)及THF(5mL)的混合物中。所得混合物在50℃攪拌隔夜。將混合物冷卻至室溫且添加HCl(33wt%於水中)直至混合物pH為3。在減壓下濃縮混合物，得到88%純度的呈黃色固體狀之標題化合物(123mg，99%產率)。MS(m/z)：302(M+H)+。
製備14 (±)-3,3-二甲基-1-[5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]哌啶-4-甲酸
將三乙胺(7.65mL，54.9mmol)添加至(±)-3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽(8.55g，41.2mmol)、2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶(5.0g，27.4mmol)及乙腈(67mL)的混合物中。混合物在微波中加熱至180℃維持1小時；接著冷卻混合物至室溫；且在減壓下濃縮。添加MeOH(40mL)、THF(80mL)及2M NaOH水溶液(40mL，80mmol)。所得混合物在50℃攪拌2天。添加2M NaOH水溶液(45mL，90mmol)且所得混合物在50℃攪拌4小時。將混合物冷卻至室溫，接著添加HCl(33wt%於水中)直至pH達到3。在減壓下濃縮。用1N HCl水溶液(100mL)稀釋且用EtOAc(2×100mL)萃取。合併之有機萃取物用鹽水(100mL)洗滌；經Na2SO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮，得到標題化合物(7.60g，61%)。MS(m/z)：302(M+H)+。
製備15 5,8-二甲基喹啉-1-氧化物
將3-氯過氧苯甲酸(5.96g，24.1mmol)添加至5,8-二甲基喹啉(2g，12.1mmol)與DCM(80mL)的混合物中，在0℃維持。1小時之後，添加Na2SO4(5g)且過濾混合物。收集濾液。所得混合物在室溫下攪拌隔夜。用DCM(100mL)稀釋；用1N NaOH水溶液(3×50mL)洗滌；經Na2SO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮至乾燥。所得粗物質用15%至70%乙腈(10mM碳酸氫銨)/水(10mM碳酸氫銨)梯度溶離，進行C18矽膠逆相急驟層析，得到標題化合物(372mg，18%)。MS(m/z)：327(M+H)+。
製備16 (±)-1-(5,8-二甲基-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸甲酯。
將N,N-二異丙基乙胺(2.02mL，11.6mmol)及PyBroP(1.75g，3.75mmol)添加至(±)-3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽(600mg，2.89mmol)、5,8-二甲基喹啉-1-氧化物(678mg，3.91mmol)及DCM(15mL)的混合物中。所得混合物在室溫下攪拌3天。粗反應物用10%至100%乙腈(0.1%甲酸)/水(0.1%甲酸)梯度溶離，進行C18矽膠逆相急驟層析。合併含有所要產物的溶離份且在真空下濃縮至約30mL體積。經由添加1N NaOH水溶液而將pH調節至6。水溶液用EtOAc(2 x 30mL)萃取，用pH 6水性緩衝溶液(4 x 30mL)洗滌，經MgSO4乾燥；過濾；且在減壓下濃縮，得到標題化合物(166mg，18%)。MS(m/z)： 327(M+H)+。
製備17 (±)-1-(5,8-二甲基-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸。
在微波容器中，合併(±)-1-(5,8-二甲基-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸甲酯(166mg，0.51mmol)、MeOH(0.1mL)、THF(0.5mL)及1M NaOH水溶液(2.5mL，2.5mmol)的混合物。所得混合物在微波反應器中、在120℃加熱2小時。將混合物冷卻至室溫且添加1N HCl水溶液直至pH為6。用CHCl3(2×25mL)萃取；經Na2SO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮，得到標題化合物(135mg，85%)。MS(m/z)：312(M+H)+。
製備18 (±)-1-(8-氯-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸甲酯。
將K2CO3(1.07g，7.75mmol)添加至(±)-3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽(700mg，3.37mmol)、2,8-二氯喹啉(876mg，4.38mmol)及DMSO(4.5mL)的混合物中。所得混合物在130℃攪拌隔夜。將混合物冷卻至室溫；過濾以移除固體；用水(5mL)稀釋；且用EtOAc(4×20mL)萃取。合併之有機萃取物用水(20mL)洗滌，接著用鹽水(20mL)洗滌。有機萃取物經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮。所得粗物質用0%至40% EtOAc/己烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到標題化合物(1.1g，98%)。MS(m/z)：332(M+H)+。
製備19 (±)-1-(8-氯-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸
在微波容器中合併(±)-1-(8-氯-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸甲酯(1.1g，3.3mmol)、MeOH(0.8mL)、THF(3.3mL)及1M NaOH水溶液(3.3mL，17mmol)的混合物。所得混合物在微波中在120℃加熱2小時。將混合物冷卻至室溫，接著添加5N HCl水溶液直至pH為6。用EtOAc(3×10mL)萃取混合物。合併有機萃取物；經Na2SO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮，得到標題化合物(815mg，77%)。MS(m/z)：318(M+H)+。
製備20 4-苯胺基-2,5-二氫呋喃-3-甲酸甲酯
將對甲苯磺酸(500mg，3.16mmol)添加至(±)-4-側氧基四氫呋喃-3-甲酸甲酯(6.6g，45.8mmol)、苯胺(4.3mL，47.2mmol)及甲苯(70mL)的混合物中。反應容器裝配有迪安-斯塔克分離器(Dean-Stark trap)且加熱至140℃。所得混合物在室溫攪拌隔夜。反應物加熱至140℃且攪拌2小時。冷卻混合物且添加乙醚(100mL)及水(100mL)。混合物用乙醚(3×50mL)萃取；經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮。所得粗物質在矽膠上進行急驟層析，用0%至100% EtOAc於庚烷中之梯度溶離，得到標題化合物(6.7g，67%)。MS(m/z)：220(M+H)+。
製備21 (±)-3-(碘甲基)-4-苯亞胺基-四氫呋喃-3-甲酸甲酯
將(±)-4-苯胺基-2,5-二氫呋喃-3-甲酸甲酯(3.6g，16.4mmol)及18-冠-6(4.8g，18mmol)於甲苯(15mL)中的溶液添加至第三丁醇鉀(2.0g，17.8mmol)及甲苯(15mL)的混合物中。所得混合物在室溫攪拌30分鐘。添加二碘甲烷(4mL)且在室溫攪拌反應物隔夜。添加水(50mL)且用乙醚(2×50mL)萃取。收集有機萃取物且用鹽水(50mL)洗。有機萃取物經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮。所得粗物質在矽膠上進行急驟層析，用0%至60% EtOAc於庚烷中之梯度溶離，得到標題化合物(1.0g，17%)。MS(m/z)：359(M+H)+。
製備22 (±)-5-側氧基四氫哌喃-3-甲酸甲酯
將氫化三正丁基錫(1.12mL，4.18mmol)、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)(35mg，0.21mmol)及甲苯(10mL)的混合物加熱至回流。歷經三小時逐滴添加(±)-3-(碘甲基)-4-苯亞胺基-四氫呋喃-3-甲酸甲酯(1.0g，2.78mmol)於甲苯(50mL)中的溶液。所得混合物在回流下攪拌3小時。在減壓下濃縮反應物。所得粗物質用0%至80% EtOAc/庚烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到標題化合物(0.37g，84%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 4.09-3.99(m,4H),3.72(s,3H),3.16(m,1H),2.82(dd,J=7.2,16.9Hz,1H),2.66(dd,J=6.3,16.9Hz,1H)。
製備23 (±)-反-5-(苯甲基胺基)四氫哌喃-3-甲酸甲酯
將三乙醯氧基硼氫化鈉(0.96g，4.53mmol)添加至(±)-5-側氧基四氫哌喃-3-甲酸甲酯(0.33g，2.08mmol)、苯甲胺(0.31mL，2.84mmol)及1,2-二氯乙烷(5mL)的混合物中。所得混合物在室溫下攪拌2.5小時。添加碳酸氫鈉飽和水溶液(10mL)；用DCM(3×10mL)萃取；分離有機層；用鹽水(10mL)洗滌；經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮。所得粗物質用0%至60% EtOAc/庚烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到標題化合物(0.085g，16%產率)。MS(m/z)：250(M+H)+。
製備24 (±)-反-5-胺基四氫哌喃-3-甲酸甲酯
將10%鈀/碳(0.07g，0.66mmol)添加至(±)-反-5-(苯甲基胺基)四氫哌喃-3-甲酸甲酯(0.085g，0.34mmol)及乙醇(8mL)。用氫氣沖洗混合物且所得混合物在室溫下、在氫氣(1atm)下攪拌隔夜。過濾混合物且在減壓下濃縮，得到標題化合物(0.045g，83%產率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 3.82-3.77(m,2H),3.68(m,4H),3.38-3.31(m,1H),3.11-3.08(m,1H),2.85-2.80(m,1H),2.17-2.11(m,1H),1.78-1.71(m,3H)。
製備25 (±)-反-5-[[(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]胺基]四氫哌喃-3-甲酸甲酯
將EDCI(0.087g，0.45mmol)添加至(-)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸(0.087g，0.29mmol)、(±)-反-5-胺基四氫哌喃-3-甲酸甲酯(0.045g，0.28mmol)、HOBT(9mg，0.06mmol)、三乙胺(0.15mL，1.08mmol)於DCM(5mL)中的混合物中。所得混合物在室溫下攪拌3小時。所得混合物用5%至100% EtOAc/庚烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到標題化合物(0.085g，66%)。MS(m/z)：439(M+H)+。
製備26 (±)-反-3-(二苯甲基胺基)環己烷甲酸甲酯
將碳酸鉀(3.53g，25.6mmol)及苯甲基溴(1.9mL，15.9mmol)添加至(±)-反-3-胺基環己烷甲酸甲酯(1.07g，6.8mmol)於乙腈(40mL)中的混合物中。所得混合物加熱至80℃且攪拌5小時。冷卻混合物且添加乙腈(40mL)。經由矽藻土過濾且在減壓下濃縮濾液。所得粗物質用0%至20% EtOAc/己烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到標題化合物(1.6g，70%)。MS(m/z)：338(M+H)+。
製備27 (±)-2-[反-3-(二苯甲基胺基)環己基]丙-2-醇
將溴化甲基鎂(3.0M於乙醚中的溶液，16mL，48mmol)添加至(±)-反-3-(二苯甲基胺基)環己烷甲酸甲酯(1.6g，4.7mmol)及THF(50mL)的混合物中，在0℃維持。允許反應物升溫至室溫且攪拌隔夜。添加水(25mL)且經由矽藻土過濾。收集含水濾液。所得含水物質用EtOAc(50mL)萃取。收集有機萃取物；經Na2SO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮。添加EtOAc(50mL)；用NH4Cl飽和水溶液(2×25mL)洗滌；經Na2SO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮，得到標題化合物(1.1g，69%)。MS(m/z)：338(M+H)+。
製備28 2-[(1S,3S)-3-(二苯甲基胺基)環己基]丙-2-醇
將(±)-2-[反-3-(二苯甲基胺基)環己基]丙-2-醇(1.1g，3.26mmol)溶解於乙醇(13mg/mL)中。該物質使用12%(0.1%二甲基乙基胺/i-PrOH)/CO2(scf)作為移動相，在220nm及70毫升/分鐘的流速下，進行對掌性SFC(Chiralpak IA,2cm×15cm)。收集且合併所溶離的第一溶離份且在減壓下濃縮，得到標題化合物(0.54g，49%)，ee=>99%。MS(m/z)：338(M+H)+。使用10%(0.1%二甲基乙基胺/i-PrOH)/CO2(scf)作為移動相，在220nm及3毫升/分鐘流速下，進行SFC 分析方法(Chiralpak IA,(15cm×0.46cm)。
製備29 2-[(1S,3S)-3-胺基環己基]丙-2-醇鹽酸鹽
在ParrTM振盪容器中，將氫氧化鈀(20%/碳，0.51g，3.7mmol)添加至2-[(1S,3S)-3-(二苯甲基胺基)環己基]丙-2-醇(0.54g，1.6mmol)於MeOH(20mL)中的混合物中。用氫氣沖洗且將容器加壓至414kPa。在室溫下振盪混合物4天。經由矽藻土過濾混合物且在減壓下濃縮濾液。將混合物在乙醚(25mL)及DCM(25mL)中稀釋。添加HCl(4.0M於1,4-二噁烷中的溶液，0.8mL)且在減壓下濃縮，得到標題化合物(0.24g，77%)。MS(m/z)：158(M+H)+。
製備30 N-[(1RS,2RS,4SR,6RS)-6-(羥基甲基)降冰片烷-2-基]胺基甲酸第三丁酯
將(乙醯丙酮酸根)二羰基銠(10mg，0.03mmol)、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵(27mg，0.05mmol)、雙環[2.2.1]庚-2-烯-5-甲酸甲酯(2.5g，11.9mmol)及第三丁醇(25mL)合併於機械攪拌器的PARRTM高壓釜中。使用合成氣(一氧化碳與氫氣的1：1混合物，310kPa)沖洗容器且加壓。攪拌隔夜。在減壓下濃縮混合物。在DCM(29mL)及MeOH(2.9mL)中稀釋。添加硼氫化鈉(0.26g，6.9mmol)且在室溫下攪拌20分鐘。添加DCM(60mL)且用碳酸鈉飽和水溶液(2x25mL)及鹽水(25mL)洗滌。有機層經Na2SO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃 縮。所得粗物質用30% DCM、30%第三丁基甲基醚及40%己烷的溶液溶離，進行矽膠急驟層析，得到呈非對映異構體混合物形式之標題化合物(0.58g，21%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 4.71-4.59(m,1H),3.92-3.81(m,1H),3.46-3.45(m,2H),2.36(d,J=3.0Hz,1H),2.21-2.05(m,3H),1.55(br s,1H),1.49-1.25(m,12H),1.16-1.09(m,1H),0.68(ddd,J=12.9,4.5,2.4Hz,1H)。
製備31 [(1RS,2RS,4SR,6RS)-6-胺基降冰片烷-2-基]甲醇鹽酸鹽
將HCl(4.0M於1,4-二噁烷中的溶液，2.1mL，8.3mmol)添加至N-[(1RS,2RS,4SR,6RS)-6-(羥基甲基)降冰片烷-2-基]胺基甲酸第三丁酯(0.2g，0.83mmol)於DCM(8mL)中的在0℃維持的混合物中。允許所得混合物升溫至室溫且攪拌3小時。在減壓下濃縮混合物，得到標題化合物(0.15g，100%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.17-8.02(m,3H),4.93-4.90(br,1H),3.47-3.45(m,1H),3.19-3.15(m,2H),2.31(m,1H),2.14-2.12(m,1H),2.01-1.94(m,1H),1.92-1.88(m,1H),1.44-1.35(m,2H),1.22(m,1H),1.04-0.98(m,2H)。
製備32 ((順-4-((第三丁氧基羰基)胺基)環己基)甲基)(胺磺醯基)胺基甲酸第三丁酯
將偶氮二甲酸二異丙酯(1.6mL，7.8mmol)添加至順-4-(羥甲基)環己基胺基甲酸第三丁酯(1.5g，6.5mmol)、N-胺磺醯基胺基甲酸第三丁酯(1.9g，9.8mmol)、三苯膦(2.1g，7.8mmol)及EtOAc(33mL)的混合物中。在室溫下攪拌隔夜。添加水(50mL)；用EtOAc(2×50mL)萃取；收集有機萃取物。有機萃取物用鹽水(25mL)洗滌；經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮。所得粗物質用10%至80% EtOAc/己烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到標題化合物(1.78g，67%)。MS(m/z)：430(M+Na)+。
製備33 順-1-胺基-4-[(胺磺醯基胺基)甲基]環己烷鹽酸鹽
將HCl(4.0M於1,4-二噁烷中的溶液，15mL，60mmol)添加至((順-4-((第三丁氧基羰基)胺基)環己基)甲基)(胺磺醯基)胺基甲酸第三丁酯(1.78g，4.37mmol)中。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。在減壓下濃縮。在MeOH(10mL)中稀釋且逐滴添加乙醚(150mL)，同時劇烈攪拌。所得白色沈澱物藉由真空過濾收集，得到標題化合物(0.68g，56%)。MS(m/z)：208(M+H)+。
製備34 (1RS,3RS)-3-((S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基喹啉-2-基)哌啶-4-甲醯胺基)環己烷-1-甲酸甲酯
將三乙胺(0.9mL，7mmol)添加至(-)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸(0.8g，3mmol)、(±)-反-3-胺基環己烷甲酸甲酯鹽酸鹽(0.5g，3mmol)、BOP(2.0g，3mmol)及DMF(5mL)的混合物中。所得混合物在室溫下攪拌隔夜。添加碳酸氫鈉飽和水溶液(20mL)且用EtOAc萃取(2×25mL)。收集有機萃取物；用鹽水(25mL)洗滌；經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且濃縮。所得粗物質用10%至90% EtOAc/己烷梯度溶離，進行矽膠急驟層析，得到標題化合物(1.00g，80%)。MS(m/z)：438(M+H)+。
實例1 (S)-N-((2S,4S)-2-(羥基甲基)四氫-2H-哌喃-4-基)-3,3-二甲基-1-(8-甲基喹啉-2-基)哌啶-4-甲醯胺
將苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽(153g，293mmol)於DMF(152mL)中的漿液添加至(-)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸(76.0g，245mmol)、((2S,4S)-4-胺基四氫-2H-哌喃-2-基)甲醇鹽酸鹽(72%純，57.37g，246mmol)、三乙胺(153mL，1.10mol)及DMF(380mL)的冷(10℃)混合物中，同時維持內部反應溫度低於20℃。其後允許混合物升溫至室溫且攪拌30分鐘。攪拌的同時，將混合物傾倒入冰水(1.5L)中。用DCM(2×600mL)萃取混合物且合併之有機萃取物用NaCl半飽和水溶液(1.0L)洗滌。有機溶液經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮濾液，得到濕潤固體。濕潤固體用水濕磨且藉由過濾分離固體。固體再次用水(1.5L)濕磨且藉由過濾分離固體。用水(2×250mL)洗滌固體。將此第一批分離 固體擱置。收集含水洗滌液；用DCM(2×800mL)萃取；合併DCM萃取物。將第一批分離固體添加至合併之DCM萃取物中且用HCl水溶液(2.5M，2×800mL)洗滌。分離水層且添加50% NaOH水溶液至水層中直至pH達到12而誘發沈澱。過濾混合物以收集所得固體。用水(2×300mL)沖洗固體。在真空烘箱中、在50℃乾燥固體3小時。將固體溶解於MeOH(1.2L)中；添加巰基丙基介孔性二氧化矽清除樹脂(1.2mmol/g，715m2/g，54μm平均粒度)；且在50℃攪拌隔夜。過濾以移除固體，收集濾液。用1：1 CH2Cl2：MeOH(2×500mL)沖洗固體。合併濾液且在減壓下濃縮，得到白色固體。用TBME(1.5L)濕磨固體，且收集固體。使固體在熱EtOH(1.8L)中結晶。在真空烘箱中、在50℃乾燥固體2.5小時，得到呈白色結晶固體狀之標題化合物(76.7g，76%)。LC/MS(ESI)：412[M+H]+。
表1中的以下實例可基本上藉由製備34的程序、使用適當的起始胺替代(±)-反-3-胺基環己烷甲酸甲酯鹽酸鹽及適當的起始羧酸替代(-)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸來製備。
純化方法(Purif Meth)：A=粗產物用EtOAc/己烷梯度溶離、藉由矽膠正相管柱層析加以純化。B=粗產物用乙腈及水的梯度溶離、藉由C18逆相管柱層析加以純化。C=使用15% IPA/CO2作為移動相，在70mL/min流速下，藉由使用Chiralpak AS-H(21×150mm)的對掌性 管柱層析純化粗產物。
實例13 (4S)-N-[(1S,3S)-3-(1-羥基-1-甲基-乙基)環己基]-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲醯胺
將N,N-二異丙基乙胺(0.7mL，4mmol)及HATU(0.31g，0.8mmol)添加至(-)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸(0.2g，0.67mmol)、2-[(1S,3S)-3-胺基環己基]丙-2-醇鹽酸鹽(0.13g，0.67mmol)及DMF(5mL)的混合物中。所得混合物在室溫下攪拌45分鐘。所得反應混合物用5%至80%ACN/水梯度溶離，進行C18逆相急驟層析，得到標題化合物(0.26g，88%)。MS(m/z)：438(M+H)+。
使用適當的起始羧酸替代(-)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸，基本上藉由實例13的程序來製備表2中的以下實例。
使用適當的起始胺替代(±)-反-5-胺基四氫哌喃-3-甲酸甲酯及適當的起始羧酸替代(-)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸，基本上藉由製備25的程序來製備表3中的以下實例。
純化方法：A=粗產物用EtOAc/己烷梯度溶離、藉由矽膠正相管柱層析加以純化。C=使用25% EtOH(0.2% IPAm)/CO2(scf)作為移動相，在70mL/min流速下，藉由使用對掌性SFC(Chiralcel OD-H,21×250mm)的對掌性管柱層析法純化粗產物。
實例18 (S)-N-((3RS,5SR)-5-(羥基甲基)四氫-2H-哌喃-3-基)-3,3-二甲基-1-(8-甲基喹啉-2-基)哌啶-4-甲醯胺
將5N NaOH水溶液(0.5mL)添加至(3RS,5RS)-5-((4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]胺基]四氫哌喃-3-甲酸甲酯(0.085g，0.19mmol)、MeOH(2mL)及THF(2mL)的混合物中。所得混合物在室溫下攪拌1小時。添加5N HCl水溶液(0.5mL)且濃縮。粗混合物於THF(6mL)中稀釋且冷卻至0℃。逐滴添加甲硼烷-THF複合物於THF(0.15mL，0.3mmol)中的2M溶液。使混合物緩慢升溫至室溫，且在室溫下攪拌隔夜。添加碳酸氫鈉飽和水溶液(10mL)且用EtOAc (3×10mL)萃取混合物。收集有機萃取物；用鹽水(10mL)洗滌；經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮。所得粗物質用100% EtOAc溶離，進行矽膠急驟層析，得到標題化合物(0.046g，59%產率，經歷2個步驟)。MS(m/z)：411(M+H)+。
實例19 甲基(1RS,3RS)-3-((S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]胺基]環己烷甲酸
將5N NaOH水溶液(2.2mL)添加至(±)-反-[[(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]胺基]環己烷-3-甲酸甲酯(1.0g，2.2mmol)、MeOH(2mL)及THF(8mL)的混合物中。所得混合物在室溫下攪拌隔夜。添加5N HCl水溶液(2.2mL)以將pH調節至6.5。用EtOAc(2×25mL)萃取且收集有機萃取物。用鹽水(25mL)洗滌有機萃取物；經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮，得到標題化合物(0.935g，98%)。MS(m/z)：424(M+H)+。
實例20 (S)-N-((1RS,3RS)-3-(乙基胺甲醯基)環己基)-3,3-二甲基-1-(8-甲基喹啉-2-基)哌啶-4-甲醯胺
將三乙胺(0.7mL，5mmol)添加至(±)-反-3-[[(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]胺基]環己烷甲酸(0.9g，2mmol)、乙 胺(2mL，3mmol)、BOP(1.0g，3mmol)及DMF(4mL)的混合物中。所得混合物在室溫下攪拌3小時。添加碳酸氫鈉飽和水溶液(20mL)。用EtOAc(2×50mL)萃取所得混合物。收集有機萃取物；用鹽水(3×25mL)洗滌；經MgSO4乾燥；過濾；收集濾液；且在減壓下濃縮。所得物質用20%至80%乙腈(0.1%甲酸)/水(0.1%甲酸)梯度溶離，進行C18矽膠逆相急驟層析，得到標題化合物(0.25g，30%)。MS(m/z)：450(M+H)+。
生物學分析 人類mPGES-1酶抑制分析
將人類mPGES-1(InvitrogenTM(目錄號97002RG，純系ID 6374722))次選殖入pcDNA3.1中且短暫表現於293E細胞中。微粒體係利用細胞集結粒，根據公開的方法製備(Oullet等人，Purification and characterization of recombinant microsomal prostaglandin E synthase-1,Protein Expression and Purification,26，第489-495頁(2002)；及Thoren等人，Human Microsomal Prostanglandin E Synthase-1,J.Biol Chem.278(25)第22199-22209頁(2003))。簡言之，將集結粒引入均質化緩衝液(15mM Tris-HCl pH 8.0；0.25M蔗糖；0.1mM EDTA；1mM麩胱甘肽)中且在冰上音波處理5×30秒。均質物在4℃以5,000×g離心10分鐘。傾析上清液部分且裝載至Beckman Quick-Seal®管中且在4℃以150,000×g離心90分鐘。藉由傾析來丟棄上清液部分且將集結粒再懸浮於分析緩衝液(10mM磷酸鈉pH 7.0；10%甘油；2.5mM麩胱甘肽；完全蛋白酶抑制劑Cocktail(Roche))中。使用Pierce Coomassie PlusTM試劑測定蛋白質濃度。
在酶分析中，將微粒體在分析緩衝液中稀釋且將每孔14μL所得溶液添加至384孔分析盤中。在Tecan_MC384TM上產生化合物稀釋盤(Nunc目錄號249944)，且添加每孔4μL至分析盤中。前列腺素H2 (PGH2)在臨用前，置於分析緩衝液中稀釋且添加每孔14μL至分析盤中。最終濃度為6.55μg/mL微粒體及1.67μM PGH2。在室溫下培育1.5分鐘之後，每孔添加5μL含有1mg/mL SnCl2的0.5N HCl以中止反應。將5μL所中止的反應物轉移至含有45μL 0.1%甲酸的384孔盤中，並且在-80℃儲存盤。將盤裝運至Agilent Technologies，先前為Biocius Lifesciences(Wakefield,MA 01880)，以便對PGE2進行標準LC/MS分析。資料用於計算IC50(μM)。實例化合物以小於100nM的IC50 μM值抑制人類mPGES-1。實例1的例示性化合物以0.00193±0.00064的IC50 μM值(n=17)抑制人類mPGES-1。此結果表明實例1的例示性化合物為所分離之酶製劑中之mPGES-1酶的強抑制劑。
用於量測類二十烷酸選擇性的基於細胞之分析
自ATCC(CCL-185)獲得人類上皮肺癌瘤細胞株A549且在Kaighn的F12細胞培養基+10%胎牛血清(FBS)(接種培養基)中，在37℃、在標準的5% CO2增濕氛圍下維持。細胞每週以1：3繼代兩次。
在分析中，藉由用PBS洗滌一次，接著用胰蛋白酶/EDTA洗滌一次來釋放燒瓶中的細胞。在37℃維持3-5分鐘之後，將細胞懸浮於接種培養基中且25℃以2,000rpm離心5分鐘。抽吸上清液且將細胞集結粒再懸浮於F12K接種培養基中。藉由在血球計上對已在PBS及錐蟲藍(Trypan blue)中稀釋的細胞等分試樣進行計數來測定細胞數目。處理之前，將細胞以每孔40,000個塗鋪於96孔法爾康盤(Falcon plates)中24小時。在Screen Mates管中，化合物於DMSO中稀釋至最終濃度的100倍。自細胞移除培養基且向細胞中添加新鮮培養基(每孔90μL)。以每孔1μL(n=2)添加化合物，各得到七種濃度。細胞在37℃、5% CO2下用化合物預處理30分鐘。藉由添加在接種培養基中稀釋至10倍最終濃度的重組人類介白素(rhIL-1β)來誘導前列腺素E2產生。每孔添加10 μL等分試樣，得到0.1ng/mL的最終rhIL-1β濃度。處理時段為約18小時。移出條件培養基至v形底聚丙烯盤中。根據製造商方案(Cayman)藉由特定的酶免疫分析EIA來分析條件培養基中的PGE2及前列腺素I2(PGI2)的含量。簡言之，將條件培養基(1μL)添加至經捕捉抗體塗佈且含有製造商所供應之EIA緩衝液(49μL)的96孔盤之各孔中。用EIA緩衝液(50μL)稀釋示蹤劑。用EIA緩衝液(50μL)稀釋偵測抗體。盤用黏著性密封薄膜覆蓋且在室溫下、在定軌振盪器上以100rpm培育1小時。洗滌緩衝液在MILLIPORE純化水中稀釋，且使用洗盤器洗盤(5×350微升/孔)。受質(Ellman試劑)用MILLIPORE純化水稀釋，接著以每孔200μL添加至盤中。在室溫下，在定軌振盪器上以100rpm維持約90-120分鐘之後，在讀盤器上、在A412下讀盤。使用PGE2的標準曲線校準未知物。實例1的例示性化合物以0.00471μM±0.00301的IC50(n=2)抑制PGE2形成。
人類全血分析
收集正常自願供者的血液置於肝素鈉真空管中。選擇供者的部分依據為確認其在供給兩週內未服用NSAID、阿司匹林、Celebrex®或糖皮質激素。將所有管/供者血液彙集於250mL Corning圓錐形離心管中且在深孔聚丙烯盤中每孔分配436.5μL。化合物在DMSO中稀釋至最終濃度的100倍且一式兩份或一式三份添加4.5微升/孔以得到7點曲線。血液在37℃、5%CO2、在增濕氛圍中用化合物預處理，用MicroClime Environmental微定量盤蓋覆蓋，30分鐘後，每孔添加9μL 5mg/mL LPS(Sigma，血清型0111：B4)於1mg/mL BSA/PBS中的溶液，得到100μg/mL的最終LPS濃度。盤在37℃、5% CO2、在增濕氛圍中培育20-24小時。用鋁箔蓋將盤緊密密封且在冰上冷卻約1小時。接著，將盤在Eppendorf 5810R離心機中、在4℃、以1,800×g離心10分鐘。使用具有無菌過濾尖端的Rainin L200自細胞層移除血漿且轉移至 v形底聚丙烯盤中。定量轉移一百微升至Costar叢集管座中且每孔添加400μL MeOH中止試劑及內標物d 4-PGE2、d 4-PGF2α及d 4-TXA2β。使樣品渦旋5分鐘且在-20℃安置至少一小時。樣品在Eppendorf 5810R中以4000rpm離心10分鐘。
使用Waters HLB 30mg/床層96孔盤，在真空歧管上進行固相萃取：步驟1，基質用MeOH(1mL)洗滌，隨後用含有0.1%甲酸的水(1mL)洗滌；步驟2，將400μL樣品連同含有0.1%甲酸的水(900μL)一起塗覆且允許結合5分鐘；步驟3，基質用含有0.1%甲酸的水(600μL)洗滌，隨後用80/20水/MeOH(600μL)洗滌；步驟4，產物用2-500μL體積的EtOAc溶離；步驟5，樣品在氮氣下乾燥且用含有0.1%甲酸的75/25水/乙腈(50μL)復原。藉由LC/MS/MS分析產物。實例1在此分析中以0.00205±0.00082之IC50(n=11)抑制PGE2形成。此結果證明實例1抑制人類全血中的PGE2合成。

Claims (22)

  1. 一種式1化合物， 其中：R1為H或-CH3；R係選自： G係選自： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 一種式2化合物， 其中：R1為H或-CH3；R係選自： G係選自： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項1或2之化合物，其中： R1為H或-CH3；R係選自： G係選自： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  4. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中R係選自：
  5. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中R係選自：
  6. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中G為：
  7. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1為-CH3。
  8. 一種化合物，其為： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  9. 如請求項8之化合物，其為：
  10. 如請求項1、2及8中任一項之化合物，其中該醫藥學上可接受之鹽為鹽酸鹽。
  11. 一種醫藥學上可接受之組合物，其包含如請求項1至10中任一項之化合物，及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑中的至少一者。
  12. 一種如請求項11之醫藥學上可接受之組合物的用途，其用於製造供治療需要治療與關節炎或骨關節炎相關疼痛之患者之藥劑。
  13. 一種如請求項11之醫藥學上可接受之組合物的用途，其用於製造供治療需要治療與關節炎或骨關節炎相關發炎之患者之藥劑。
  14. 一種如請求項1至10中任一項之化合物的用途，其用於製造供治療需要治療與關節炎相關疼痛之患者之藥劑。
  15. 一種如請求項1至10中任一項之化合物的用途，其用於製造供治療需要治療與骨關節炎相關疼痛之患者之藥劑。
  16. 一種如請求項1至10中任一項之化合物的用途，其用於製造供治療需要治療與關節炎相關發炎之患者之藥劑。
  17. 一種如請求項1至10中任一項之化合物的用途，其用於製造供治療需要治療與骨關節炎相關發炎之患者之藥劑。
  18. 如請求項1、2、8及9中任一項之化合物，其用作藥劑。
  19. 如請求項1、2、8及9中任一項之化合物，其用於治療。
  20. 如請求項1、2、8及9中任一項之化合物，其用於治療關節炎或骨關節炎。
  21. 如請求項1、2、8及9中任一項之化合物，其用於治療與關節炎或骨關節炎相關的疼痛或發炎。
  22. 一種如請求項1至10中任一項之化合物的用途，其用於製造供治療關節炎或骨關節炎之藥劑。
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