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TWI526687B - 生物標記 - Google Patents

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TWI526687B
TWI526687B TW098114096A TW98114096A TWI526687B TW I526687 B TWI526687 B TW I526687B TW 098114096 A TW098114096 A TW 098114096A TW 98114096 A TW98114096 A TW 98114096A TW I526687 B TWI526687 B TW I526687B
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維托 葛那諾
艾絲特 馬若
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Description

生物標記
本發明大體係關於活體外診斷之方法，特定言之，係關於選自由纖維母細胞生長因子23(FGF23)、無機磷(P)、無機磷與總鈣之乘積(P×tCa)、骨橋蛋白(OPN)及甲狀旁腺激素(PTH)組成之群之化合物用作生物標記之用途。該等生物標記可用以監測纖維母細胞生長因子受體(FGFR)激酶活性之調節、尤其其抑制及/或FGFR抑制之繼發效應的出現。
纖維母細胞生長因子(FGF)家族及其信號轉導受體與控制蠕蟲至人類之有機體之生長及維持之關鍵過程(發育、血管生成、代謝)之多種生物活性(增殖、存活、細胞凋亡、分化、活動力)相關。已鑑別22種不同FGF，此等FGF皆共有具有15-65%序列一致性之保守性120個胺基酸核心域。FGF藉由結合及活化4種皆以若干同功異型物存在之RTK之家族(FGFR1至FGFR4)來調節細胞反應(Lee PL等人，Science 245:57-60(1989)；Givol D等人，FASEB J. 6:3362-9(1992)；Jaye M等人，EMBO J . 7:963-9(1988)；Ornitz DM ＆ Itoh,Genome Biol . 2(2001))。配體結合誘導受體二聚事件及激酶之活化，引起下游分子磷酸化及/或募集及細胞內信號轉導路徑之活化。
已藉由對小鼠模型之特定發育系統、表現模式及基因靶向方法進行分析來研究FGF/FGFR之生物作用。此等研究已證實其涉及多種生物功能，包括血管生成及傷口癒合、發育及代謝。多種人類顱縫早閉症候群及骨骼發育不良與FGFR1、FGFR2及FGFR3中之特定功能獲得型突變有關，此等突變引起頭顱、指(趾)及骨骼發育嚴重受損。Webster MK ＆ Donoghue DJ,Trends Genet . 1997 13:178-82(1997)；Wilkie AO,Hum. Mol. Genet . 6:1647-56(1997)。
流行病研究已報導FGF/FGFR在人類癌症中發生遺傳變異及/或受到異常表現：FGFR1易位至其他基因及與其他基因融合引起FGFR1激酶之組成性活化，導致8p11骨髓增生症(MacDonald D ＆ Cross NC,Pathobiology 74:81-8(2007))。14q32反覆性染色體易位於免疫球蛋白重鏈開關區內導致FGFR3在多發性骨髓瘤中受到失調之過度表現(Chesi M等人，Nature Genetics 16:260-264(1997)；Chesi M等人，Blood 97:729-736(2001))。已報導乳房腫瘤中FGFR1、FGFR2及FGFR4之基因擴增及蛋白質過度表現(Adnane J等人，Oncogene 6:659-63(1991)；Jaakkola S等人，Int. J. Cancer 54:378-82(1993)；Penault-Llorca F等人，Int. J. Cancer 61:170-6(1995)；Reis-Filho JS等人，Clin. Cancer Res. 12:6652-62(2006))。已知胃癌(Jang JH等人，Cancer Res. 61:3541-3(2001))及子宮內膜癌(Pollock PM等人，Oncogene (2007年5月21日))中FGFR2之體細胞活化性突變且已鑑別膀胱癌中引起受體之配體非依賴性組成性活化之FGFR3之特定結構域之體細胞突變(Cappellen D等人，Nature Genetics 23:18-20(1999)；Billerey C等人，Am. J . Pathol. 158(6):1955-9(2001))。此外，已發現此癌症類型中FGFR3、mRNA及蛋白質之過度表現(Gomez-Roman JJ等人，Clin. Cancer Res. 11(2 Pt 1):459-65(2005))。
因此，能夠抑制FGFR之激酶活性之化合物為治療FGFR信號轉導失調之人類癌症之可能候選者。
FGFR酪胺酸激酶之小分子量抑制劑之效用業已驗證(參見Brown,A.P等人(2005),Toxicol. Pathol. 33，第449-455頁；Xin,X.等人(2006),Clin. Cancer Res. ，第12(16)卷，第4908-4915頁；Trudel,S.等人(2005),Blood ，第105(7)卷，第2941-2948頁)。
然而，測定該等抑制劑在動物模型中之治療功效相當麻煩，此係因為其涉及(例如)量測腫瘤生長、FGF受體之自體磷酸化之抑制及/或信號轉導級聯之下游分子(諸如Erk1/2)之磷酸化。雖然此等方法適於臨床前配置，但對於臨床研究而言，以簡單直接方式中測定治療功效之非侵入性方法合乎需要。
此外，用FGFR酪胺酸激酶抑制劑PD176067對大鼠及犬之非臨床毒性研究引起軟組織礦化。由於此不良效應之出現，故斷定需要進一步研究以判定該藥劑是否具有用於治療癌症之潛能(參見Brown,A.P等人(2005),Toxicol. Pathol. 33，第449-455頁)。
異位礦化(磷酸鈣鹽不當沈積於軟組織及血管系統中)可導致發病及致死(London GM等人，Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2005,14:525-531)。
因此，在此項技術中對適用於指示FGFR抑制劑之治療功效的生物標記、可靠方法及相應套組存在需要。此外，預測FGFR抑制劑投與後之不良繼發效應、尤其異位礦化之方法極有用。
意外發現選自由纖維母細胞生長因子23(FGF23)、無機磷(P)、無機磷與總鈣之乘積(P×tCa)、骨橋蛋白(OPN)及甲狀旁腺激素(PTH)組成之群的化合物為有用生物標記，其允許監測纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑之活性且此外可適用於預測FGFR抑制之繼發效應、尤其異位礦化之出現。
特定而言，本發明提供FGF23用作生物標記之用途。FGFR抑制後，得到抗腫瘤活性，抗腫瘤活性亦體現為FGF23之增加。FGF23增加之程度與所用抑制劑之劑量相關。在某些劑量下，偵測到繼發效應、尤其軟組織及血管礦化。由於此雙重內涵，故可將FGF23視為FGFR抑制劑之藥效學標記。鑑別及驗證容許監測藥物之生物活性的藥效學生物標記適用於劑量選擇及治療最佳化。
此外，對預測及監測繼纖維母細胞生長因子受體調節後之異位礦化之潛在生物標記的總體分析展示，選自由FGF23、P、P×tCa、OPN及PTH組成之群的化合物確認為異位礦化之預測性標記。
因此，在第一態樣中本發明提供選自由FGF23、P，P×tCa、OPN及PTH組成之群之化合物用作生物標記、尤其用於FGFR之激酶活性調節之生物標記的用途。
在一實施例中，該化合物用以監測纖維母細胞生長因子受體激酶活性之抑制。較佳地，該化合物為FGF23。
本發明進一步提供選自由纖維母細胞生長因子23(FGF23)、無機磷(P)、無機磷與總鈣之乘積(P×tCa)、骨橋蛋白(OPN)及甲狀旁腺激素(PTH)組成之群之化合物用作預防繼發效應、尤其異位礦化之安全標記之用途。較佳地，該化合物為FGF23。
在另一態樣中，本發明提供一種測定FGFR激酶活性之調節、尤其激酶活性之抑制的方法，該方法包含以下步驟：
a)向個體投與FGFR抑制劑；
b)提供該個體之樣品；
c)測定該樣品中FGF23之含量；及
d)比較該樣品中FGF23之該含量與參考含量，其中參考含量為在開始用FGFR抑制劑治療之前個體中之FGF23含量。
此外，提供測定FGFR抑制劑之治療功效之方法，該方法包含以上方法之步驟a)至d)，其中參考含量為在開始用FGFR抑制劑治療之前個體中之FGF23含量。
此外，提供測定FGFR抑制劑之一或多種繼發效應之方法，該方法包含以上方法之步驟a)至d)，其中參考含量為在開始用FGFR抑制劑治療之前個體中之FGF23含量。
本文中所揭示之該等方法可用選自由P、P×tCa、OPN及PTH組成之群的任一種化合物類似地執行。
本發明在臨床配置中尤其適用於劑量選擇、時程選擇、患者選擇及治療最佳化。
以下將更詳細描述本發明。顯然不同實施例、優選項及範圍可任意組合。此外，視具體實施例而定，可不應用所選定義、實施例或範圍。
在第一態樣中，本發明提供選自由纖維母細胞生長因子23(FGF23)、無機磷(P)、無機磷與總鈣之乘積(P×tCa)、骨橋蛋白(OPN)及甲狀旁腺激素(PTH)組成之群的化合物用作生物標記、尤其用於纖維母細胞生長因子受體(FGFR)激酶活性之調節、較佳抑制之生物標記之用途。該化合物較佳為FGF23。
纖維母細胞生長因子23(FGF23)已為人所知。其被視為具有廣泛生物活性之纖維母細胞生長因子家族之成員。該蛋白質之序列及/或該蛋白質之編碼序列可自此項技術中已知之公用資料庫檢索。人類FGF23在此項技術中亦稱為ADHR；HYPF；HPDR2；PHPTC。測定方法已知於此領域中且特定描述於下文中。
術語「無機磷」(P)已知於此領域中且特定指無機磷之血液含量，且血清中之「無機磷」可(例如)藉由紫外線方法、使用(例如)來自RANDOX Laboratories LTD,UK之套組及臨床化學分析器(諸如HITACHI 717分析器(Roche Diagnostics))量測。
術語「總鈣」(tCa)已知於此領域中且特定指總鈣之血液含量，且血清中之「總鈣」可(例如)藉由紫外線方法、使用(例如)來自RANDOX Laboratories LTD之套組及臨床化學分析器(諸如HITACHI 717分析器)量測。
術語「無機磷與總鈣之乘積」(P×tCa)已知於此領域中且特定而言，係藉由無機磷(P)含量值(mg/dL)乘以之總鈣(tCa)含量值(mg/dL)所獲得。
亦稱為分泌磷蛋白1、骨唾液酸蛋白I或早期T-淋巴細胞活化因子1之骨橋蛋白(OPN)已為人所知。其被視為細胞外結構蛋白質。人類骨橋蛋白在此項技術中已知為SPP1。骨橋蛋白可(例如)使用套組(諸如骨橋蛋白(大鼠)EIA套組(Osteopontin(rat)EIA Kit),Assay Designs,Inc.,USA)、依循製造商說明書來量測。
甲狀旁腺激素(PTH)或副甲狀腺素已為人所知。其被視為涉及調節血液中鈣含量之激素。PTH可(例如)使用固相放射免疫檢定(諸如獲自Immutopics,Inc.,USA之固相放射免疫檢定)來測定。
特定而言，FGFR之抑制可藉由測定一或多種上述化合物、較佳FGF23在樣品中之含量來評估。藉此，可評定FGFR抑制劑之治療功效。
如本文所用之術語「纖維母細胞生長因子受體抑制物」或「FGFR抑制劑」係指能阻斷纖維母細胞生長因子受體之激酶活性的分子。此等分子可為諸如抗體之大分子或小分子量化合物。
在本文所揭示之用途及方法的一較佳實施例中，FGFR抑制劑為小分子量化合物。小分子量FGFR抑制劑之實例包括(但不限於)：PD176067、PD173074、化合物A、TKI258或化合物B.PD176067(參見Brown,CL等人，(2005),Toxicol.Pathol，第33卷，第449-455頁)。PD173074為來自Parke Davis之FGF-R抑制劑(參見Mohammadi等人，EMBO J.17：5896-5904)，其特異性及效能已確定。其具有式：
TKI258先前稱為CHIR258且揭示於WO 02/22598實例109以及Xin,X.等人，(2006),Clin.Cancer Res.，第12(16)卷，第4908-4915頁；Trudel,S.等人，(2005),Blood，第105(7)卷，第2941-2948頁中。化合物A為(例如)以3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基胺基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲揭示於WO 06/000420實例145中之pan-FGFR抑制劑。化合物B為[4,5']聯嘧啶基-6,4'-二胺之衍生物。其結構描述於WO 08/008747中(表1中之化合物編號4)。此等化合物可如此等參考文獻所揭示或藉由類似於此等參考文獻中所述之程序製備。
在本文所揭示之方法及用途之一較佳實施例中，FGFR抑制劑為呈游離鹼或合適鹽形式之化合物A。
如本文所用之「治療功效」係指諸如增生性疾病及非癌症病症之人類惡性疾病或病狀之治療、預防或進程延遲。在增生性疾病之情況下，治療功效係指(例如)化合物減小腫瘤尺寸或中止腫瘤生長之能力。
疾病可為(但不限於)良性或惡性增生性疾病，例如癌症，例如腫瘤及/或轉移(不論位於何處)。在一較佳實施例中，本發明之方法的增生性疾病為癌症。較佳地，該癌症係由FGFR信號轉導失調所引起或與FGFR信號轉導失調相關。
增生性疾病包括(但不限於)具有突變FGFR3及/或高FGFR3表現之膀胱癌、子宮頸癌或口腔鱗狀細胞癌(Cappellen等人，Nature Genetics 1999,23;19-20；van Rhijn等人，Cancer Research 2001,61:1265-1268；Billerey等人，Am. J. Pathol. 2001,158:1955-1959；Gomez-Roman等人，Clin. Can. Res. 2005,11:459-465；Tomlinson等人，J. Pathol. 2007 213:91-8；WO 2004/085676)；具有t(4,14)染色體易位之多發性骨髓瘤(Chesi等人，Nature Genetics 1997,16:260-264；Richelda等人，Blood 1997,90:4061-4070；Sibley等人，BJH 2002,118:514-520；Santra等人，Blood 2003,101:2374-2476)；具有FGFR1、FGFR2或FGFR4之基因擴增及/或蛋白質過度表現之乳癌(Elbauomi Elsheikh等人，Breast Cancer Research 2007,9(2)；Penault-Llorca等人，Int J Cancer 1995；Theillet等人，Genes Chrom. Cancer 1993；Adnane等人，Oncogene 1991；Jaakola等人，Int J Cancer 1993)；具有FGFR2突變之子宮內膜癌(Pollock,Oncogene 2007,1-5)；具有FGFR3或FGFR4或FGF配體之高表現之肝細胞癌(Tsou,Genomics 1998,50:331-40；Hu等人，Carcinogenesis 1996,17:931-8；Qui.World J. Gastroentero1. 2005,11:5266-72；Hu等人，Cancer Letters 2007,252:36-42)；具有11q13擴增子(其含有FGF3、FGF4及FGF19基因座)之擴增的任何癌症類型，例如乳癌、肝細胞癌(Berns EM等人，Gene 1995,159:11-8；Hu等人，Cancer Letters 2007,252:36-42)；具有異常FGFR1融合蛋白之EMS脊髓增生病(MacDonald,Cross Pathobiology 2007,74:81-88)；具有異常FGFR3融合蛋白之淋巴瘤(Yagasaki等人，Cancer Res . 2001,61:8371-4)；具有FGFR1異常表現或突變之神經膠質母細胞瘤(Yamaguchi等人，PNAS 1994,91:484-488；Yamada等人，Glia 1999,28:66-76)；具有FGFR2突變或過度表現或FGFR3突變之胃癌(Nakamura等人，Gastroentoerology 2006,131:1530-1541；Takeda等人，Clin. Can. Res. 2007,13:3051-7；Jang等人，Cancer Res . 2001,61:3541-3)；具有異常FGFR1或FGFR4表現之胰腺癌(Kobrin等人，Cancer Research 1993；Yamanaka等人，Cancer Research 1993；Shah等人，Oncogene 2002)；具有FGFR1、FGFR4或FGF配體之異常表現之前列腺癌(Giri等人，Clin. Cancer Res. 1999；Dorkin等人，Oncogene 1999,18:2755-61；Valve等人，Lab. Invest. 2001,81:815-26；Wang,Clin. Cancer Res. 2004,10:6169-78)；伴有異常FGFR4之垂體腫瘤(Abbas等人，J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997,82:1160-6)；及因FGF/FGFR亦涉及血管生成而需要血管生成之任何癌症(參見例如Presta等人，Cytokine & Growth Factors Reviews 16 ,159-178(2005))。
此外，疾病可為非癌症病症，諸如(但不限於)具有FGFR3活化突變之良性皮膚腫瘤(Logie等人，Hum. Mol. Genet. 2005；Hafner等人，The Journal of Clin. Inv. 2006,116:2201-2207)；由FGFR突變引起之骨骼病症，包括軟骨發育不全、軟骨生成減退、伴有發育延遲及黑棘皮病之嚴重軟骨發育不全(SADDAN)、致死性骨發育不良(TD)(Webster等人，Trends Genetics 13(5):178-182(1997)；Tavormina等人，Am. J. Hum. Genet. 1999,64:722-731)；馬克冠狀顱縫早閉(muenke coronal craniosynostosis)(Bellus等人，Nature Genetics 1996,14:174-176；Muenke等人，Am. J. Hum. Genet. 1997,60:555-564)；伴有黑棘皮病之克魯仲症候群(crouzon syndrome)(Meyers等人，Nature Genetics 1995,11:462-464)；普費佛症候群(Pfeiffer syndrome)之家族性與偶發性形式(Galvin等人，PNAS USA 1996,93:7894-7899；Schell等人，Hum. Mol. Gen. 1995,4:323-328)；與FGF23誤義突變相關、與磷酸鹽體內恆定之改變相關之病症，如低磷酸鹽血症或高磷酸鹽血症，例如ADHR(體染色體顯性低磷酸鹽血症性佝僂病)(ADHR Consortium,Nat. Genet. 2000 26(3):345-8)；XLH(性聯遺傳低磷酸鹽佝僂病)(一種與PHEX基因之失活突變相關之性聯顯性病症)(White等人，Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 1996,81:4075-4080；Quarles,Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab . 2003,285:E1-E9,2003;doi:10.1152/ajpendo.00016.2003 0193-1849/03)；TIO(腫瘤誘發之骨軟化病)(後天分離磷酸鹽消耗症)(Shimada等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 May 22;98(11):6500-5)；骨纖維發育不良(FD)(X. Yu等人，Cytokine & Growth Factor Reviews 2005,16 ,221-232及X. Yu等人，Therapeutic Apheresis and Dialysis 2005,9 (4),308-312)；及與FGF23活性降低相關之腫瘤樣鈣質沈著(Larsson等人，Endocrinology 2005 Sep;146(9):3883-91)。
已發現FGFR活性之抑制可代表治療T細胞介導之發炎或自體免疫疾病之方法，例如治療包括(但不限於)以下之T細胞介導之發炎或自體免疫疾病之方法：類風濕性關節炎(RA)、II型膠原蛋白關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性紅斑狼瘡症(SLE)、牛皮癬、幼年發作型糖尿病、休格連氏病(Sjogren's disease)、甲狀腺疾病、肉狀瘤病、自體免疫葡萄膜炎、發炎性腸病(克羅恩氏結腸炎(Crohn's colitis)及潰瘍性結腸炎)、乳糜瀉及重症肌無力(參見WO 2004/110487)。
由FGFR3突變引起之病症亦描述於WO 03/023004及WO 02/102972中。
在另一實施例中，一或多種選自由FGF23、P、P×tCa、OPN及PTH組成之群的化合物(較佳FGF23)可用作安全標記，以預測FGFR抑制劑之一或多種繼發效應，尤其異位礦化。較佳地，FGF23用作預測一或多種繼發效應之安全標記。
如本文所用之術語「繼發效應」係指可能傷害個體之不良效應。該效應對於上述之主要或治療效應而言為繼發性的。其可能由FGFR調節劑之不適當或不正確劑量或程序引起，但亦可能與FGFR抑制劑之作用機制有關(如在異位礦化之情況)。
異位礦化為諸如(但不限於)主動脈、心臟、肺、胃、腸、腎臟及骨骼肌之軟組織中發生之不當生物礦化。在鈣化之情況，通常包括羥基磷灰石之磷酸鈣鹽沈積，而且發現草酸鈣及磷酸八鈣(Giachelli CM,(1999),Am. J Pathol. ，第154(3)卷，第671-675頁)。異位礦化通常與細胞死亡相關。當其在心血管組織中發生時，其導致臨床症狀；在動脈中，鈣化與動脈粥樣硬化斑塊負荷有關，且增加心肌梗塞之風險以及增加血管成形術後解剖的風險。
在第二態樣中，本發明提供一種測定FGFR激酶活性之調節、較佳抑制的方法，該方法包含以下步驟：
a)提供該個體之樣品；
c)確定該樣品之FGF23含量；且
d)比較該樣品之FGF23含量與參考含量。
該方法(例如)適用於測定FGFR抑制劑之治療功效及/或測定FGFR抑制劑之一或多種繼發效應。
本文所揭示之方法的個體較佳為哺乳動物、更佳齧齒動物(諸如小鼠或大鼠)、犬、豬或人類。
本發明進一步提供一種測定FGFR抑制劑之治療功效的方法，該方法包含本文所揭示之方法的步驟a)至d)，其中個體為大鼠且參考含量為745pg/ml。
此外，本發明提供一種測定FGFR抑制劑之一或多種繼發效應之方法，該方法包含本文所揭示之方法的步驟a)至d)，其中個體為大鼠且參考含量為1371pg/ml。
本發明之方法中所提及之「參考含量」可藉由在開始用FGFR抑制化合物治療之前測定個體中FGF23之含量來確立，亦即藉由測定個體之基線含量來確立。因此，在一替代實施例中，該方法進一步包含量測個體中FGF23之基線含量的步驟。另一替代方法為測定健康對照個體或健康對照組中或經非治療性化合物治療之患有相同或類似增生疾病之對照個體或對照組中FGF23之含量。參考含量較佳亦可來源於文獻。
個體之樣品較佳來源於血液(例如血漿或血清)或尿液。然而，該方法亦可實施於其他身體組織或其衍生物，諸如細胞溶胞產物。應瞭解，本發明之方法係離體實施。
本發明提供一種測定FGFR之激酶活性之調節、較佳抑制的離體方法，該方法包含以下步驟：
a)在FGFR抑制劑治療開始之前測定一患者之樣品中的FGF23含量(個體參考含量)；
b)在該患者接受該FGFR抑制劑治療之後測定其樣品中的FGF23含量。
其中步驟b)之FGF23含量增加超過個體參考含量指示發生FGFR激酶活性之調節、較佳抑制。
在一較佳實施例中，患者為癌症患者。在一較佳實施例中，該患者之癌症係由FGFR信號轉導失調所引起或與FGFR信號轉導失調相關。更佳地，癌症為實體腫瘤，較佳包括(但不限於)膀胱癌、黑色素瘤及腎臟癌。
儘管FGF23增加之程度視每種個別FGFR抑制劑之性質、劑量及治療方式而變化，但使用FGF23作為生物標記為監測患者對FGFR抑制劑治療之反應提供可靠、便利且非侵入性方法。此外，醫生可依據FGF23之增加值更好作出預後、調整劑量、轉換為其他治療或緊密監測及避免因治療所致之繼發效應。
較佳地，與個體參考含量相比，步驟b)之FGF23含量增加至少1.2倍，更佳至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少2倍、至少2.5倍。對於有效FGFR抑制劑(諸如化合物A)而言，FGF23含量可增加至少2.5倍、至少3倍、4倍或甚至高於4倍。
FGFR抑制劑治療後之FGF23含量之增加通常在特定FGFR抑制劑之第一標準劑量之後觀測到。關於特定FGFR抑制劑之標準劑量之資訊通常可見於含有特定FGFR抑制劑作為API之藥物的標籤上。通常，FGFR抑制劑濃度一經達到其穩定狀態，便量測FGF23含量。對經400mg或500mg TKI258治療之黑色素瘤患者及轉移性腎細胞癌患者之初步觀測指示FGF23之峰值出現於第一治療週期約第15日。因此在一較佳實施例中，本發明之方法包含在該患者接受該FGFR抑制劑治療至少5日、較佳至少5日但不超過30日、較佳至少10日但不超過25日、至少10日但不超過20日之後測定其樣品的FGF23含量。
在每日經400mg TKI258治療之患者的情況下，FGF23之含量可增加至1.96倍及2.1倍。
在一較佳實施例中，FGFR抑制劑為化合物A或其任何醫藥學上可接受之鹽。在一較佳實施例中，FGFR抑制劑為TKI258或其任何醫藥學上可接受之鹽。
在一態樣中，本發明提供FGFR抑制劑之用途，係用於製造供治療患者之增生性疾病之用的藥物，其中該增生性疾病較佳為癌症，更佳為FGFR信號轉導失調之癌症，其中該患者在服用該FGFR受體抑制劑之後具有增加之FGF23含量。或者，本發明提供一種治療患者之增生性疾病之方法，其中該增生性疾病較佳為癌症，更佳為FGFR信號轉導失調之癌症，該方法包含向該患者投與FGFR抑制劑之步驟，其中該患者在服用該FGFR受體抑制劑之後具有增加之FGF23含量。FGFR抑制劑治療後之FGF23含量之增加通常在特定FGFR抑制劑之第一標準劑量之後觀測到。通常，FGFR抑制劑濃度一經達到其穩定狀態，便量測FGF23含量。因此，使用FGF23作為生物標記容許依據患者對FGFR抑制劑之反應將患者、尤其FGFR信號轉導失調之癌症患者分級。
本申請案提供一種篩檢患者以測定患者是否受益於FGFR抑制劑治療之方法，該方法包含以下步驟：(a)給予患者FGFR抑制劑治療一段時間；(b)在該治療之後量測該患者之樣品中之FGF23含量；(c)比較獲自步驟(b)之FGF23值與個體參考含量(在該FGFR抑制劑治療開始之前該患者中之FGF23含量)且判定該患者是否應繼續該FGFR抑制劑治療。
如本文所用之術語「一段時間」係指相對短時間，通常不超過30日，更可能不超過15日，可能不超過一週。在此「試驗」期期間，根據標準方案或甚至以高劑量或高頻率投藥方案或兩者給予患者該FGFR抑制劑治療。
患者通常患有可由FGFR信號轉導失調所引起或與FGFR信號轉導失調相關之病狀，在大多數情況下，患者患有可由FGFR信號轉導失調所引起或與FGFR信號轉導失調相關之癌症。
與個體參考含量相比，FGF23通常增加至少1.2倍，較佳至少1.3倍或至少1.5倍。當FGFR抑制劑為TKI258時，情況通常且較佳如此。
對於有效FGFR抑制劑而言，可預期FGF23之較大增加。在化合物A之情況下，增加至少1.3倍、較佳至少1.5倍、更佳至少2倍、更佳至少3倍。
FGFR抑制劑較佳選自由PD176067、PD173074、化合物A(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基胺基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲)、TKI258及化合物B([4,5']聯嘧啶基-6,4'-二胺之衍生物)組成之群。
在一較佳實施例中，FGFR抑制劑為化合物A或其任何醫藥學上可接受之鹽。在一較佳實施例中，FGFR抑制劑為TKI258或其任何醫藥學上可接受之鹽。
為偵測之目的，可進一步處理樣品，例如可使用熟習此項技術者熟知之技術分離蛋白質。
通常，FGF23之含量係藉由用適用於偵測之藥劑量測個體之該樣品中多肽FGF23之存在來測定。用於偵測本發明之多肽的較佳藥劑為能夠結合對應於本發明之標記的多肽之抗體、較佳具有可偵測標記之抗體。抗體可為多株抗體，或更佳為單株抗體。可使用完整抗體或其片段，例如Fab或F(ab')2 。
在另一實施例中，可(例如)藉由測定相應RNA之含量來偵測樣品中之FGF23編碼序列之表現。合適偵測劑為探針(一種與靶核酸序列互補之短核酸序列)。
在本發明之一較佳實施例中，偵測FGF23多肽。
偵測劑可為直接或間接偵測的且較佳將其標記。關於探針或抗體之術語「標記」意欲涵蓋藉由將可偵測物質與探針或抗體偶合(亦即物理連接)來將探針或抗體直接標記，以及藉由與經直接標記之另一種試劑反應來將探針或抗體間接標記。間接標記之實例包括使用螢光標記之二次抗體偵測一次抗體及用生物素將DNA探針末端標記以便可用螢光標記之抗生蛋白鏈菌素偵測其。
標記可為習知標記，例如生物素或酶(諸如鹼性磷酸酶(AP)、辣根過氧化酶(HRP)或過氧化酶(POD))或螢光分子，例如螢光染料(諸如異硫氰酸螢光素)。
在本發明之一較佳實施例中，偵測劑包含抗體(包括抗體衍生物或其片段)，例如識別FGF23之抗體(例如識別帶有標記之FGF23之抗體)。在另一態樣中，使用FGF23特異性抗體測定FGF23之含量。
偵測劑(例如帶有標記之抗體)可根據習知方法偵測，例如經由螢光量測或酶偵測方法偵測，該等方法包括檢定領域習知之彼等方法，例如免疫檢定，諸如酶聯免疫檢定(ELISA)；基於螢光之檢定，諸如解離增強鑭系元素螢光免疫檢定(DELFIA)；或放射檢定，諸如放射免疫檢定(RIA)。其他合適實例包括(但不限於)EIA及西方墨點分析(Western blot analysis)。熟習此項技術者可易於調整已知之蛋白質/抗體偵測方法以便用於測定FGF23含量。
應瞭解，本文所揭示之方法可用選自由P、P×tCa、OPN及PTH組成之群的化合物類似地進行。
在一較佳實施例中，將兩種或兩種以上選自由FGF23、P、P×tCa、OPN及PTH組成之群的化合物，最佳將FGF23與一或多種選自由P、P×tCa、OPN及PTH組成之群的化合物組合用於本文所揭示之方法中。藉由使用多種生物標記，增強測定FGFR抑制劑之治療功效及/或一或多種繼發效應之精確性。
當將一或多種選自由FGF23、P、P×tCa、OPN、PTH組成之群的化合物用作安全生物標記時，以上所述之測定FGFR抑制劑之一或多種繼發效應的方法可進一步包含以下步驟：
e)使一或多種選自由FGF23、P、P×tCa、OPN、PTH組成之群的化合物之含量與一或多種繼發效應關聯；且
f)測定該(等)化合物之含量，高於此含量則相對於所用治療發生繼發效應。
較佳地，當與參考含量相比時FGF23、P、P×tCa、OPN之含量增加。
較佳地，當與參考含量相比時PTH之含量降低。
在另一態樣中，本發明提供一種測定患有FGFR相關病症之個體對FGFR抑制劑之治療性治療之反應性的方法，該方法包含測定個體之血漿或血清中一或多種選自由FGF23、P、P×tCa、OPN、PTH組成之群之化合物、較佳FGF23之含量之步驟。
如本文所用之「治療性治療」係指FGFR相關病症、較佳增生性疾病、更佳癌症之治療、預防或進程延遲。
在另一態樣中，本發明提供一種診斷性套組，其包含如下所述之要素a)至d)。詳言之，本發明係關於一種較佳在個體之樣品中測定FGFR抑制劑之功效及/或FGFR抑制劑之繼發效應的套組，該套組包含：
a)視情況呈經標記形式之識別一或多種選自由FGF23、P、P×tCa、OPN及PTH組成之群之化合物之分子或其部分；
b)視情況使用說明書；
c)視情況偵測裝置；及
d)視情況固相。
此外，提供該套組用於較佳在個體之樣品中測定FGFR抑制劑之功效及/或FGFR抑制劑之繼發效應的用途。
在一較佳實施例中，本發明提供一種診斷性套組，該套組包含：
a)視情況呈經標記形式之識別FGF23或其部分之分子；
b)至少一種能夠偵測選自由無機磷(P)、磷與總鈣之乘積(P×tCa)、骨橋蛋白(OPN)及甲狀旁腺激素(PTH)組成之群之第二生物標記之試劑；
c)視情況使用說明書；
d)視情況偵測裝置；及
e)視情況固相。
此外，本發明提供如上所述之套組在個體之樣品中測定FGFR抑制劑之功效及/或FGFR抑制劑之繼發效應的用途。
在一較佳實施例中，套組包含至少一種能夠偵測作為無機磷(P)之第二生物標記之試劑。
為更充分說明本發明之較佳實施例，提供以下實例。如隨附申請專利範圍所定義，此等實例決不應視為限制本發明之範疇。
實例1
化合物A對腫瘤同種移植物的劑量依賴性抑制作用；FGF23作為生物標記以監測纖維母細胞生長因子受體激酶活性之抑制。
1.1方法
動物 。實驗係在獲自實驗動物中心(Laboratory Animal Services,Novartis Pharma AG,Basel,Switzerland)之雌性HsdNpa：無胸腺裸nu小鼠(HsdNpa:Athymic Nude-nu mice)中進行。在OHC條件下、以12小時暗、12小時亮條件(開燈：6 AM，關燈：6 PM)將該等動物飼養於Makrolon III型籠中(每籠最多10個動物)。動物隨意饋食食物及水。實驗依據巴塞爾州獸醫局(Basel Cantonal Veterinary Office)批准之許可證第1762號及許可證第1763號進行。所有侵入性程序均在福侖(Forene)麻醉下進行。
裸小鼠中NIH3T3/FGFR3 S249C 腫瘤同種移植模型之建立。 NIH3T3/FGFR3S249C 模型經驗證並表徵可用作皮下鼠腫瘤模型用於FGFR抑制劑之活體內分布描述。親本NIH3T3細胞株最初係藉由使小鼠胚胎纖維母細胞永生化而得到。NIH3T3/FGFR3S249C 細胞係藉由用表現具有活化突變S249C之FGFR3之反轉錄病毒載體感染親本NIH3T3纖維母細胞而產生。G418抗性NIH3T3S249C 細胞庫經建立並表徵可用於FGFR3表現及酪胺酸磷酸化。為產生同種移植物，將再懸浮於PBS中之5×105 個NIH3T3/FGFR3S249C 細胞皮下注入裸小鼠中(0.2毫升/小鼠)。
裸小鼠中RT112/luc1腫瘤異種移植模型之建立。 表現高野生型FGFR3含量之親本RT-112人類膀胱移行細胞癌細胞株最初在1973(Marshall等人，1977,Masters等人，1986)來源於患有未經治療之原發性膀胱癌的雌性患者(組織學G2級，未記錄階段)。用於此研究之RT112細胞之原液小瓶係獲自DSMZ ACC #418。
將細胞培養於補充有10%胎牛血清(Fetal Calf Serum)、1%丙酮酸鈉及1% L-麩胺醯胺之MEM培養基中。細胞培養試劑購自BioConcept(Allschwil,Switzerland)。
將親本RT112細胞株用反轉錄病毒表現載體pLNCX2/luc1感染且G418抗性細胞庫經建立並表徵可用於螢光素酶表現。CMV驅動之螢光素酶表現允許在注射D-螢光素之後使用Xenogen IVISTM 攝影機偵測腫瘤。
RT112/luc1異種移植腫瘤係藉由於含有50%基質膠(Matrigel)(BD #356234)之100μl HBSS(Sigma #H8264)中之5×106 個細胞皮下注射於右腹側而建立。
抗腫瘤活性之評估 。對於NIH3T3/FGFR3S249C 模型而言，當平均腫瘤體積達到約100mm3 時開始治療。每隔一定時間監測腫瘤生長及體重。用測徑規人工量測腫瘤尺寸。使用式(W×L×H×π/6)估算腫瘤體積，其中寬度(W)、長度(L)及高度(H)為三個最大直徑。
對於RT112/luc1模型而言，當平均腫瘤體積約180mm3 時開始治療且每日治療小鼠歷時14日。每週兩次記錄體重及腫瘤體積。腫瘤體積係用測徑規量測且根據式長度×直徑2 ×π/6測定。
統計分析 。適當時，結果以平均值±SEM提供。藉由ANOVA、配合事後杜奈特氏檢驗法(post hoc Dunnett's test)分析腫瘤及體重資料以便將治療組與對照組比較。事後杜開檢驗法(post hoc Tukey test)係用於組內比較。實驗起始與結束之間組內體重變化之顯著性水準係使用成對t檢驗法測定。使用GraphPad prism 4.02(GraphPad Software)進行統計分析。
作為抗腫瘤功效之度量，% T/C值係在治療起始後之特定日期根據下式計算：(經治療動物之平均腫瘤體積變化/對照動物之平均腫瘤體積變化)×100。適當時，退化%係根據式(平均腫瘤體積變化/平均初始腫瘤體積)×100計算。
化合物調配及動物治療。 將化合物A於PEG300/D5W(2:1v/v，D5W=水中之5%葡萄糖)中調配為懸浮液且藉由管飼法每日施用。媒劑由PEG300/D5W組成。施用體積為10ml/kg。
用於離體分析之組織處理。 實驗結束時，在化合物最後投與之後2小時，收集腫瘤樣品及血液。
將腫瘤樣品解剖且於液N2 中快速冷凍。使用擺動式研磨機(RETSCH MM200)粉碎腫瘤物質。將研磨罐及球於乾冰上冷卻半小時，之後添加經冷凍腫瘤樣品。將擺動式研磨機在100%之強度下操作20秒。將腫瘤粉末轉移至14mL聚丙烯中(所有步驟均在乾冰上操作)且儲存於-80℃下直至使用。
稱取50mg腫瘤粉末之等分試樣，置於冰上且立即以1:10(w/v)之比率再懸浮於冰冷卻之溶解緩衝液(50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、1mM EGTA、5mM EDTA、1%曲拉通(Triton)、2mM釩酸鈉(NaVanadate)、1mM PMSF及蛋白酶抑制劑混合物Roche #11873580001)中。允許溶解於冰上進行30min，將溶胞產物藉由以12000 x g離心15min澄清且使用DC蛋白質檢定試劑(Bio Rad #500-0116)及BSA標準測定蛋白質濃度。
用23號針將血液由腔靜脈收集至含有70μl 1000IU/ml肝素溶液之1ml注射器中。接著將血液於冰上儲存30min直至離心(10,000g，5min)且接著收集血漿。
免疫沈澱及西方墨點分析 。等量蛋白質溶解物用蛋白質A-瓊脂糖凝膠(sepharose)預先澄清，之後與1μg α-FGFR3抗體(兔多株抗體，Sigma #F3922)於冰上培育2h。免疫複合物用蛋白質A-瓊脂糖凝膠收集且用溶解緩衝液洗3次。所結合之蛋白質於樣品緩衝液(20% SDS、20%甘油、160mM Tris pH 6.8、4% β-巰基乙醇、0.04%溴酚藍)中沸騰而釋放。
使樣品進行SDS-PAGE且將蛋白質塗抹於PVDF膜上。濾膜用PBS/O中之20%馬血清、0.02% Tween 20阻斷1h且在室溫下添加1:1000稀釋之抗磷酸化酪胺酸(anti-pTyrosine)抗體4G10(Upstate)歷時2h。蛋白質使用SuperSignalWest Dura長期受質偵測系統(Extended Duration Substrate detection system)(Pierce #34075)以過氧化酶偶合之抗小鼠抗體(Amersham #NA931V)呈現。此外，膜在60℃於62.5mM Tris-HCl pH 6.8；2% SDS；1/125 β-巰基乙醇中洗提30min，用α-FGFR3抗體(兔多株抗體，Sigma #F3922)、然後過氧化酶偶合之抗兔抗體(Amersham #NA934V)再探測。蛋白質如上所述呈現。
FGF23 ELISA檢定。為監測血漿或血清樣品中之FGF23含量，使用KAINOS Laboratories,Inc.,Japan之FGF23 ELISA檢定(目錄號CY-4000)。簡言之，使用結合全長FGF-23之兩種特異性鼠類單株抗體：第一種抗體係固著於微量滴定板孔中用於捕捉，第二種抗體係與HRP(辣根過氧化酶)接合用於偵測。在第一反應中，將血漿或血清樣品添加於塗有抗FGF23抗體之微量滴定孔中以允許結合。洗滌孔以移除未結合之FGF23及其他組份。在第二反應中，固著之FGF23與HRP標記之抗體培育以形成「三明治」複合物。此ELISA檢定經驗證可用以監測小鼠、大鼠及犬之血清及血漿中之FGF23。
1.2結果及論述
化合物A在NIH3T3/FGFR3 S249C 模型中之活性。 評估化合物A在皮下NIH3T3/FGFR3S249C 模型中之抗腫瘤效應。測試10mg/kg、30mg/kg及50mg/kg之劑量。當所估計之平均腫瘤尺寸達到100mm3 時(第0日)開始治療，動物治療8日。在治療第8日藉由單因子ANOVA(one-way ANOVA)評估腫瘤尺寸及體重。與媒劑治療之動物相比，在所有劑量水準下均觀測到統計上顯著之抗腫瘤效應(ANOVA事後杜奈特氏檢驗法)，其中在10mg/kg及30mg/kg下T/C值分別為34%及4%且在50mg/kg下腫瘤退化40%(表1，圖1)。在治療期間，兩種最高劑量水準獲得統計上不太顯著之體重增加。然而，在媒劑治療組及10mg/kg治療組中所觀測之額外體重增加至少部分地藉由腫瘤質量說明。
經化合物A治療後、FGFR3酪胺酸磷酸化之藥效學。 在最後給藥之後2h(在先前藥物動力學研究所確立之tmax間隔時間內)將以10mg/kg、30mg/kg或50mg/kg每日1次治療或經媒劑治療之動物的NIH3T3/FGFR3S249C 腫瘤解剖。對NIH3T3/FGFR3S249C 所植入之腫瘤的離體分析證明，FGFR3 Tyr-磷酸化受到劑量依賴性抑制，而總受體含量保持恆定(圖2)。此藥效學效與抗腫瘤效應相關(圖1)。
化合物A在RT112/luc1模型中之活性。 在每日經口投與裸小鼠50mg/kg及75mg/kg兩種不同劑量水準下評估化合物A之抗腫瘤活性。兩種劑量產生統計上顯著之腫瘤退化(p<0.01，ANOVA事後杜奈特氏檢驗法)。化合物A在50mg/kg及75mg/kg下之退化值分別為67%及74%(表2，圖3)。如實驗過程中媒劑組及50毫克/公斤/日之化合物A組之體重之統計顯著增加所證明，治療經充分耐受。儘管統計上不顯著，但75mg/kg化合物A治療組展示微小的體重減少。與媒劑對照組相比，發現75mg/kg化合物A治療組之體重增加顯著不同(p<0.01，ANOVA，事後杜奈特氏檢驗法)。此外，與所有其他組相比，75mg/kg化合物A治療組展示統計上顯著不同之體重變化(p<0.05，ANOVA，事後杜開檢驗法)。
裸小鼠之血漿樣品中之FGF23含量。 作為1.1章節中所述之研究的部分，在最後給藥之後兩小時測定經50或75毫克/公斤/化合物A每日1次治療或經媒劑治療之小鼠之血漿樣品中之FGF23含量。與媒劑治療組相比，用化合物A治療之小鼠展示增加之血漿FGF23含量(圖4)，此與在兩種化合物劑量下所觀測之抗腫瘤功效效應相關(圖3)。
結論。 所提供之實驗資料證明，活體內抑制FGFR3且在兩個鼠類腫瘤模型中產生統計上顯著之抗腫瘤效應的化合物A之劑量亦以劑量依賴性方式引起血漿FGF23之含量增加。
實例2 大鼠機理研究 2.1方法
動物 。實驗係在獲自Charles River Laboratories Germany GmbH,Research Models and Services,Sulzfeld,Germany之雄性Crl:WI(Han)大鼠(給藥起始時為14-17週齡)中進行。在最佳衛生條件(OHC)下、以12小時暗、12小時亮之條件將該等動物飼養於Makrolon IV型籠中。粒狀標準飲食及水隨意提供。此研究依照瑞士動物福利法(Swiss Animal Welfare Law)且特別依據‘KantonalesBaselland'(巴塞爾州獸醫局)之動物許可證第5075號進行。
化合物調配及動物治療 。將化合物A於乙酸-乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)/PEG300(2:1v/v)中調配為溶液且藉由管飼法每日施用。媒劑由乙酸-乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)/PEG300(2:1v/v)組成。施用體積為5ml/kg。
研究設計 。以1日、3日、7日及15日10mg/kg之劑量或以1日、3日及6日20mg/kg之劑量將化合物A每日1次經口投與各組10隻雄性大鼠。以20mg/kg治療之動物在第6次投與之後因嚴重體重減少而不得不提前終止。對照動物1日、3日、7日及15日接受媒劑。將接受化合物A(3日、7日及15日劑量：10mg/kg；1日及3日劑量：20mg/kg)或煤劑之其他組(各組10隻雄性大鼠)引入以進一步研究治療相關效應且監測4日、7日或14日恢復之後、所選臨床化學參數之變化。
2.2結果及論述
與FGFR抑制相關之組織病理學發現。 將以10mg/kg/日及20mg/kg/日給藥之動物治療3日之後偵測到生長板增厚。此為抑制FGFR3(很可能為軟骨細胞中之FGFR3)之結果。實際上，因肥大區之尺寸增加所致的生長板增厚先前已展示亦存在於FGFR3靶向破壞(亦即缺乏FGFR3表現)之小鼠純合子中(Colvin等人，Nature Genetics 1996,12:390-397)。此觀測證明FGFR3起調節生長板增大之作用。因此，與生長板相關之發現視為FGFR抑制劑之藥理學指示且為FGFR抑制劑之功效(亦即FGFR3之抑制)之指示。在以10毫克/公斤/日治療之動物中、在15日治療及4日恢復期之後且在以20毫克/公斤/日治療之動物中、在3日治療及4日恢復期(延遲效應)之後且在以20毫克/公斤/日治療6日之動物中注意到骨重塑事件之跡象。在以20毫克/公斤/日治療3日之動物中、在4個恢復日之後及在以20毫克/公斤/每日1次劑量之化合物A治療6日之後偵測到軟組織/血管礦化。在以10毫克/公斤/每日1次化合物A所投組中並未觀測到此發現。
臨床化學參數。 量測無機磷(P)、無機磷與總鈣之乘積(P×tCa)、甲狀旁腺激素(PTH)、骨橋蛋白(OPN)及FGF23旨在評估其作為標記以預測及監測藥理學(生長板增厚)及病理學(骨重塑及異位礦化)事件之開始的效用。在圖5、圖6、圖7及圖8中以散布圖分別說明血清中P、tCa、其乘積及FGF23之含量的變化。各圖(灰度方格表示單個動物)以標記之外周濃度(Y軸)與化合物A劑量(X軸)之函數關係報導。不同灰影與特定治療時期相關。使用Spotfire 8.2呈現資料。
生物標記驗證之方法 。藉由受試者操作特徵(ROC)分析法對大鼠探索性研究中所量測之選定標記之效能進行量化評估，該分析法為一種常用於評估醫藥測試、容許藉由量測ROC曲線下之面積(AUC)來測定所給檢定之診斷能力的方法。Swets JA,Science. 240:1285-93(1988)；Swets JA等人，Scientific American. 283:82-7(2000)。
選定生物標記效能之評估 。標記效能(AUC)之評級(藉由對獲自治療期之資料應用ROC分析法獲得)報導於表3中。
考量延遲之病理效應，使用ROC分析對FGF23之效能進行其他評估。該分析容許對此標記之藥理學及安全臨限值進行測定(表4)。藥理學臨限值為745pg/mL，其表示FGF23含量，大於該含量即可在此分析所考量之治療期間觀測到生長板增厚。安全臨限值為1371pg/mL，其表示在此分析所考量之治療期間所允許、確保不存在延遲之病理效應(骨重塑及異位礦化)之最高FGF23含量。
結論 。在此研究之背景下所量測之大鼠之臨床參數中，發現若干者為合適藥效標記。如藉由表3中所報導之相應AUC值所證實，此等標記呈現良好至極高之效能水準。此外，如表4所示，此研究證實FGF23為監測生長板增厚之開始(治療功效/藥理學)及預防骨重塑及異位礦化之開始(安全/病理學)的預測性生物標記。已確立FGF23在此特定研究之背景下及分析中所考量之治療之背景下之藥理學及安全臨限值。
實例3 化合物A誘導犬中之FGF23 3.1方法
動物 。實驗係在犬中進行：
動物種類及品系：米格魯犬(Dog,Beagle)
研究動物數量：8
年齡：13至18月(給藥開始時)。
體重範圍：7kg至11kg(給藥開始時)。
供應者獸醫治療：抗寄生蟲治療及抗以下各者之疫苗接種：犬瘟熱、犬傳染性肝炎、副流行性感冒、鉤端螺旋體病、小病毒、腺病毒、狂犬病。
化合物調配及動物治療 。將化合物A於0.5% HPMC603中調配為懸浮液且藉由經口管飼法每日施用1次。媒劑由0.5% HPMC603組成。施用體積為2ml/kg。
研究設計： 如下所示將犬用媒劑或化合物A治療：
用於離體分析之血液取樣 。在給藥期結束時，在化合物最後投與之後1小時，將取自頸靜脈(vena jugularis)或前臂頭靜脈(vena cephalica antebrachii)之全部血液收集至塗有EDTA之管中且維持於冰水上直至進一步加工。將樣本離心且將血漿轉移至Eppendorf管中且置於乾冰上。
FGF23 ELISA檢定 。為監測血漿樣品中之FGF23含量，使用KAINOS Laboratories,Inc.,Japan之FGF23 ELISA檢定(目錄號CY-4000)。簡言之，使用結合全長FGF-23之兩種特異性鼠類單株抗體：第一種抗體係固著於微量滴定板孔上用於捕捉且第二種抗體係與HRP(辣根過氧化酶)接合用於偵測。在第一反應中，將血漿樣品添加於塗有抗FGF23抗體之微量滴定板孔中以容許結合。洗滌孔以移除未結合之FGF23及其他組份。在第二反應中，將經固著之FGF23用經HRP標記之抗體培育以形成「夾心」複合物。
3.2結果及論述
犬之血漿樣品中之FGF23含量 。與媒劑治療組相比，用化合物A治療之犬展示一般具有劑量依賴性的血漿FGF23含量增加(表2)。第2組之劑量比例性增幅降低可藉由3毫克/公斤/日給藥期間之適應機制闡明。或者，10日給藥後之3日停藥可引起FGF23減少。
結論。 所提供之實驗資料證實化合物A引起犬血漿FGF23之含量增加。
實例4 量測經TKI258治療之黑色素瘤癌症患者之血漿樣品中的FGF23 4.1方法
化合物： TKI258為在細胞檢定中分別以166nM、78nM及55nM之IC50值抑制FGFR1、FGFR2及FGFR3之多激酶抑制劑。
患者及治療： 每日用以指定劑量經口投與之TKI258治療轉移性黑色素瘤患者。在指定日及週期進行血液取樣。量測血漿中之FGF23含量。針對C1D1所給之值為基線值。
FGF23 ELISA檢定 。為監測患者之FGF23血漿樣品，如實例3中所述使用KAINOS Laboratories,Inc.,Japan之FGF23 ELISA檢定(目錄號CY-4000)。
4.2結果及論述
來自3個不同患者之FGF23資料展示於表3中。
以200mg TKI258治療之患者A在整個治療中展示類似FGF23含量。在經400mg TKI258治療之患者B及C中，FGF23含量分別增加至基本含量之1.96倍及2.1倍。
實例5： 量測經TKI258治療之黑色素瘤癌症患者之血漿樣品中的FGF23 5.1方法
方法： 以200毫克/日、300毫克/日、400毫克/日或500毫克/日、依每日1次連續給藥時程經口治療患者。在400毫克/日下定義MTD。收集43個患者之血漿樣品。藉由LC/MS/MS量測血漿TKI258濃度。藉由ELISA評估血漿FGF23。
FGF23 ELISA檢定。 為監測患者之FGF23血漿樣品，如以上實例中所述使用KAINOS Laboratories,Inc.,Japan之FGF23 ELISA檢定(目錄號CY-4000)。
5.2結果及論述
獲自經200mg、300mg、400mg或500mg日劑量之TKI258治療之患者的FGF23資料展示於圖9中。資料以指定數量之患者之平均值提供。在連續每日400mg或500mg給藥之後，平均血漿曝露(AUC24hr)分別為約3000ng/mL*h及4100ng/mL*h。在400mg或小於400mg之劑量下未觀測到TKI258血漿曝露之積累，而在每日500mg劑量後第15日觀測到高達2.5倍之積累。在第一治療週期結束時，平均血漿FGF23含量比基線增加68%，而在第一治療週期之第15日增幅為63%。經400mg TKI258治療之一個患者展示在第一週期第15日血漿FGF23比基線增加98%(由40pg/ml之基線含量增至約80pg/ml)。在第一週期第15日來自同一患者之腫瘤活組織檢查展示藉由免疫組織化學所分析之顯著pFGFR抑制(圖10)。此結果表明TKI258治療後之血漿FGF23之誘導與腫瘤組織中之FGFR靶向抑制關聯。
結論： 血漿FGF23之誘導表明可以400毫克/日及大於400毫克/日之劑量抑制FGFR。
實例6： 在I期臨床試驗中量測獲自經TKI258治療之轉移性腎細胞癌(mRCC)患者之血漿樣品中的FGF23 6.1方法
患者及治療：此I期之主要目的為測定以重複之28日週期、依給藥5日/停藥2日之時程經口投與之TKI258在標準療法難治癒之mRCC患者中之最大耐受劑量(MTD)。使用兩參數貝葉斯邏輯回歸模型(two-parameter Bayesian logistic regression model)及至少21個患者之安全資料測定MTD。
FGF23 ELISA檢定 。為監測患者之FGF23血漿樣品，如以上實例中所述使用KAINOS Laboratories,Inc.,Japan之FGF23 ELISA檢定(目錄號CY-4000)。
6.2結果及論述
結果： I期研究正在進行。至2008年12月，已登記11個患者(9個雄性，2個雌性)，中值年齡：55歲(29-66歲)。4個患者已以500毫克/日(起始劑量)治療：2個正處在在第7週期(C)；1個患者因PD而停止且1個患者因竇性心搏過緩而停止。5個患者接受600毫克/日：2個DLT(G4高血壓及G3疲勞患者停止)，導致所有患者劑量降低至500毫克/日；2個患者處於C5及C4中，1個患者因PD而停止。兩個患者剛進入500mg擴展組(extension cohort)。其他毒性包括疲勞、噁心、嘔吐、腹瀉、嗜中性球減少症、毛囊炎及眩暈。PK資料展示CMax 範圍(180ng/mL-487ng/mL，n=8)及AUC範圍(2200ng/mL*h-8251ng/mL*h)。初步生物標記資料指示患者具有高基線VEGF(506±203pg/ml，n=6)及bFGF(220±185pg/ml，n=6)含量，其可反映以上抗VEGF藥劑無效。在第一500毫克/日給藥組患者中觀測到血漿FGF23含量之誘導(FGFR抑制之藥效學生物標記)(經TKI258治療之個別RCC患者之FGF23資料展示於圖11中)。經由1例微小反應(在C4為-17%)、4例穩定疾病及1例某些靶病灶(淋巴結及腎上腺腫塊)之顯著收縮/壞死觀測到初步功效跡象。
結論：
在具有一些臨床受益跡象之預治療重度mRCC患者中TKI258 500毫克/日似乎為可行時程。一些經治療患者具有明顯增加之FGF23含量，而一些患者不具有彼增加。對於具有增加之FGF23的患者而言，FGF23含量之峰值似乎出現於約第1週期第15日。與基線含量相比，FGF23之含量以1.35-1.75之範圍增加。
實例7：
TKI258誘導大鼠中之FGF23與RT112皮下腫瘤異種移植物中之FGFR3抑制相關
7.1方法
動物 。實驗係在雌性Rowett大鼠Hsd:RH-Foxlrnu中進行。此等無胸腺裸大鼠獲自Harlan(The Netherlands)。
化合物調配及動物治療。 將TKI258調配於乙酸-乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)/PEG300(2:1v/v)中且藉由管飼法每日施用。媒劑由乙酸-乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)/PEG300(2:1v/v)組成。施用體積為5ml/kg。
研究設計： 藉由將含有50%基質膠(BD #356234)之100μl HBSS(Sigma #H8264)中之1×106 個RT112細胞皮下注入右腹側來將RT112異種移植物皮下植入大鼠。當腫瘤達到400mm3 之平均體積時，大鼠經由單一經口投與途徑接受10mg/kg、25mg/kg或50mg/kg之TKI258或媒劑。
用於離體分析之血液及組織取樣。 在化合物投與後3h、7h及24h舌下抽取血液樣品。由各血液樣品製備血漿及血清。在相同時點，將腫瘤解剖且於液氮中快速冷凍。
RT112腫瘤異種移植物之離體分析： RT112膀胱癌細胞表現高FGFR3含量，FGFR3在此等細胞中之活性可藉由量測FRS2酪胺酸(FGFR之受質)磷酸化之變化來監測。使用擺動式研磨機(RETSCH，MM2或MM200)粉碎腫瘤物質。將腫瘤粉末(50mg)之等分試樣溶解於含有50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、1mM EGTA、5mM EDTA、1%曲拉通、2mM釩酸鈉、1mM PMSF及蛋白酶抑制劑混合液Roche #11873580001之冰冷溶解緩衝液中。藉由在12000 x g下離心15min使溶胞產物澄清且使用DC蛋白質檢定試劑(Bio Rad #500-0116)及BSA標準測定蛋白質濃度。使全部細胞溶胞產物經受SDS-PAGE且蛋白質塗於PVDF膜上。將濾膜於5% BSA中阻斷且在4℃下用一次抗體p-FRS2(Tyr196)：Cell Signaling #3864；β-微管蛋白：Sigma #T4026進一步培育隔夜。使用SuperSignalWest Dura持久性受質偵測系統(Pierce #34075)、用過氧化酶偶合之抗小鼠或抗兔AB呈現蛋白質。
FGF23 ELISA檢定。 為監測血清樣品中之FGF23含量，如以上實例中所述使用KAINOS Laboratories,Inc.,Japan之FGF23 ELISA檢定(目錄號CY-4000)。
7.2結果及論述
向大鼠投與TKI258後、RT112異種移植物中FRS2酪胺酸磷酸化之調節。 FRS2為FGFR之受質，該受質在酪胺酸殘基上藉由活化FGFR磷酸化且因此可用作FGFR活性之指示。對經10mg/kg、25mg/kg或50mg/kg TKI258或媒劑治療之動物、在治療之後3h解剖的RT112腫瘤之分析表明TKI258以劑量依賴性方式抑制FRS2酪胺酸磷酸化(圖12)。
Rowett大鼠之血清樣品中之FGF23含量。 給藥後24小時，測定經TKI258或媒劑治療之大鼠之血清樣品中的FGF23含量。與媒劑治療組相比，經TKI258治療之大鼠展示血清FGF23含量之劑量依賴性增加(圖13)，其具有統計顯著性(p<0.01，ANOVA事後杜奈特氏檢驗法)。資料以平均值±SEM提供。
結論。 所提供之實驗資料證實，如藉由FRS2酪胺酸磷酸化之抑制所判定，活體內抑制FGFR3的TKI258之劑量亦引起血清FGF23含量以劑量依賴性方式增加。
實例8： PD173074誘導大鼠中之FGF23且與化合物A及TKI258之比較 8.1方法 動物 。實驗係在雌性wistar大鼠furth WF/Ico中進行化合物調配及動物治療。
將PD173074、化合物A及TKI258於NMP(1-甲基-2-吡咯啶酮)/PEG300 1:9(1ml NMP+9ml PEG300)中調配為溶液且藉由管飼法每日施用。施用體積為5ml/kg。
研究設計： 單一經口投與PD173074(50mg/kg)、化合物A(10mg/kg)或TKI258(50mg/kg)或媒劑來治療大鼠。
用於離體分析之血液及組織取樣。 化合物投與之後24h抽取血液樣品。由各血液樣品製備血漿以及血清樣品。
FGF23 ELISA檢定 。為監測血清樣品中之FGF23含量，如以上實例中所指示使用KAINOS Laboratories,Inc.,Japan之FGF23 ELISA檢定(目錄號CY-4000)。
8.2結果及論述
wister大鼠之血清樣品中之FGF23含量。 與媒劑治療組相比，經PD173074或化合物A或TKI258治療之大鼠展示血清FGF23含量之統計顯著增加(圖14)(p<0.01，ANOVA事後杜奈特氏檢驗法)。資料以平均值±SEM提供。
結論。 所提供之實驗資料證實FGFR抑制劑PD173074、化合物A或TKI258引起大鼠血清FGF23含量增加。
圖1為展示具有NIH3T3/FGFR3S249C 皮下腫瘤之雌性無胸腺裸小鼠在經化合物A治療期間之腫瘤體積[mm3 ]之變化的曲線圖。白色圓形：化合物A，0mg/kg，每日1次，經口；黑色圓形：化合物A，10mg/kg，每日1次，經口；灰色圓形：化合物A，30mg/kg，每日1次，經口；黑色三角形：化合物A，50mg/kg，每日1次，經口；
圖2為展示腫瘤之離體分析的照片。在化合物最後投與之後2h解剖腫瘤。溶解腫瘤組織且將FGFR3用特異性抗體免疫沈澱。將免疫複合物藉由SDS-PAGE拆分，塗於PVDF膜上且用抗-pTyr抗體探測以監測FGFR3酪胺酸磷酸化。將膜洗提且用抗-FGFR3抗體再探測以監測總FGFR3蛋白質含量；
圖3為展示具有RT112/螢光素酶1皮下異種移植物之雌性無胸腺裸小鼠在經化合物A治療期間以[mm3 ]計之腫瘤體積之變化的曲線圖。白色圓形：媒劑，10mg/kg，每日1次，經口；白色正方形：化合物A，50mg/kg，每日1次，經口；黑色三角形：化合物A，75mg/kg，每日1次，經口；
圖4為展示在將化合物A或媒劑對照物依指定劑量及14日(n=6)時程最後投與具有RT112/螢光素酶1皮下異種移植物之雌性無胸腺小鼠後2h所回收之血漿樣品中之FGF23含量的條形圖。FGF23含量係使用來自Kainos之FGF23 ELISA套組(目錄號CY-4000)監測且以pg/mL表示。資料以平均值±SD提供；
圖5為如實例2中所述之無機磷(P)含量[mg/dl]之散布圖；
圖6為血清總鈣(tCa)含量[mg/dl]之散布圖；
圖7為血清P×tCa乘積含量[mg2 /dl2 ]之散布圖；
圖8為血清FGF23含量[pg/ml]之散布圖；
圖9為展示治療前或經200毫克/日、300毫克/日、400毫克/日或500毫克/日之TKI258依每日1次連續劑量經口治療之黑色素瘤患者在第1週期第15日及第1週期第26日之血漿樣品中之FGF23含量之條形圖。FGF23含量係使用來自Kainos之FGF23 ELISA套組(目錄號CY-4000)監測且以pg/mL表示。資料以平均值±SD提供；
圖10展示如藉由用識別磷酸化且活化FGFR之抗體進行免疫組織化學法所分析、經400mg之TKI258治療之黑色素瘤患者在第1週期第15日之腫瘤活組織檢查切片之照片；
圖11為展示8個不同腎細胞癌患者在基線時(C1D1)及經500mg TKI258治療後在C1D15及C1D26時之FGF23含量(以超過基線之誘導倍數表示，此基線指定為1)之曲線圖；
圖12為展示RT112腫瘤異種移植物之離體分析的照片。在投與化合物之後3h解剖腫瘤。將腫瘤組織溶解且藉由西方墨點法、使用Cell Signaling之抗體(#3864)分析FRS2酪胺酸磷酸化程度，該抗體當FRS2在Tyr196上磷酸化時偵測FRS2。作為負載對照物，使用偵測β-微管蛋白之獲自Sigma(#T4026)之抗體探測膜；
圖13為展示經指定經口劑量之TKI258治療之大鼠且在TKI258或媒劑對照物治療之後24h藉由舌下抽血獲得之血清樣品中FGF23含量之條形圖。FGF23含量係使用來自Kainos之FGF23 ELISA套組(目錄號CY-4000)監測且以pg/mL表示。資料以n=4之平均值±SD提供。藉由單因子Anova事後杜奈特氏檢驗法將資料與媒劑作比較；及
圖14為展示經指定經口劑量之指定化合物治療之大鼠且在化合物療投與後24h藉由舌下抽血獲得之血清樣品中FGF23含量之條形圖。FGF23含量係使用來自Kainos之FGF23 ELISA套組(目錄號CY-4000)監測且以pg/mL表示。資料以n=6之平均值±SD提供。
(無元件符號說明)

Claims (17)

  1. 一種識別為無機磷(P)或磷與總鈣(P×tCa)之乘積的分子的用途，其係作為監測FGFR激酶活性抑制之生物標記。
  2. 如請求項1之用途，其中該分子識別為無機磷(P)。
  3. 如請求項1或2之用途，其係用於測定FGFR抑制劑之治療功效及/或一或多種繼發效應。
  4. 如請求項3之用途，其中該治療功效選自由增生性疾病及/或非癌症病症之治療、預防或進程延遲組成之群，其中該非癌症病症係選自由以下組成之群：具有FGFR3活化突變之良性皮膚腫瘤；由FGFR突變引起之骨骼病症，包括軟骨發育不全，軟骨生成減退，伴有發育延遲及黑棘皮病之嚴重軟骨發育不全(SADDAN)，致死性骨發育不良(TD)，馬克冠狀顱縫早閉，伴有黑棘皮病之克魯仲症候群，普費佛症候群(Pfeiffer syndrome)之家族性形式，普費佛症候群之偶發性形式；與磷酸鹽體內恆定之改變相關之病症，包括低磷酸鹽血症及高磷酸鹽血症，包括與FGF23誤義突變相關之ADHR(體染色體顯性低磷酸鹽血症性佝僂病)， XLH(性聯遺傳低磷酸鹽佝僂病)(一種與PHEX基因之失活突變相關之性聯顯性病症)，TIO(腫瘤誘發之骨軟化病)(後天分離磷酸鹽消耗症)；骨纖維發育不良(FD)；及與FGF23活性降低相關之腫瘤樣鈣質沈著。
  5. 如請求項3之用途，其中該繼發效應為異位礦化。
  6. 如請求項3之用途，其中該FGFR抑制劑為大分子。
  7. 如請求項3之用途，其中該FGFR抑制劑為小分子量化合物。
  8. 如請求項3之用途，其中該FGFR抑制劑為3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基胺基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲或TKI258，或其任何醫藥學上可接受之鹽。
  9. 如請求項3之用途，其中該FGFR抑制劑為3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基胺基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲，或其任何醫藥學上可接受之鹽。
  10. 一種測定纖維母細胞生長因子受體(FGFR)激酶活性之抑制的方法，該方法包含以下步驟：a)向個體投與FGFR抑制劑；b)提供該個體之樣品；c)確定該樣品之無機磷(P)含量；及d)比較該樣品之該無機磷(P)含量與參考含量。
  11. 一種測定FGFR抑制劑之抑制之方法，其包含請求項10之 步驟a)至c)，進一步包含以下步驟：e)使該無機磷(P)含量與一或多種繼發效應關聯；及f)測定該無機磷(P)含量，高於該含量發生相對於所用治療之繼發效應，其中該繼發效應係異位礦化。
  12. 如請求項10或11之方法，其中該FGFR抑制劑為大分子或小分子量化合物，尤其係3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基胺基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲或TKI258，或其任何醫藥學上可接受之鹽。
  13. 如請求項10或11之方法，其中該FGFR抑制劑為大分子或小分子量化合物，尤其係3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基胺基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲，或其任何醫藥學上可接受之鹽。
  14. 如請求項10或11之方法，其中與參考含量相比時，該無機磷(P)含量增加。
  15. 一種活體外(ex vivo)測定FGFR激酶活性之抑制的方法，該方法包含以下步驟：a)在FGFR抑制劑治療開始之前測定患者之樣品中的無機磷(P)含量(個體參考含量)；b)在該FGFR抑制劑治療之後測定該患者之樣品中的該無機磷(P)含量；其中步驟b)之該無機磷(P)含量增加超過該個體參考含量指示發生FGFR激酶活性之抑制。
  16. 如請求項15之方法，其中該FGFR抑制劑為3-(2,6-二氯- 3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基胺基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲或TKI258，或其任何醫藥學上可接受之鹽。
  17. 如請求項15或16之方法，其中該FGFR抑制劑為3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基胺基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲，或其任何醫藥學上可接受之鹽。
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