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TWI327598B - Methods for determining a chemotherapeutic regimen comprising 5-fluorouracil, oxaliplatin, or combination thereof for treating a tumor in a patient - Google Patents

Methods for determining a chemotherapeutic regimen comprising 5-fluorouracil, oxaliplatin, or combination thereof for treating a tumor in a patient Download PDF

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TWI327598B
TWI327598B TW095115425A TW95115425A TWI327598B TW I327598 B TWI327598 B TW I327598B TW 095115425 A TW095115425 A TW 095115425A TW 95115425 A TW95115425 A TW 95115425A TW I327598 B TWI327598 B TW I327598B
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D Danenberg Kathleen
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Response Genetics Inc
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Publication date
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Description

1327598 九、發明說明： ^ 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於可用在醫學上，特別是用在癌症之化學治 * 療上的預後方法。更特定而言’本發明係關於評估患者的 腫瘤細胞基因表現。藉著檢查在人類中，由涉及核甞酸合 成和DNA複製之基因表現的mRNA，來測定腫瘤細胞對細 胞毒性之化學治療劑的抵抗力，尤其是抗代謝物，和以鉑 酸鹽化製劑之方式’損害DNA的製劑。 【先前技術】 當正常細胞經歷贅生轉化，並變成惡性細胞時，便發生 癌症。轉化的（惡性的）細胞逃脫指定細胞表現型並限制細 胞增疫之正常生理學的控制。因此，在個人身體中的轉化 細胞增殖’形成腫瘤^當發現腫瘤時，在個體經歷治療 時，臨床的目標是選擇性地破壞惡性細胞，同時減輕對正 常細胞引起的任何危害。 • 化學治療係以使用選擇性地對癌症細胞有毒的（細胞毒 性的）藥物為基礎。已經發展出數種化學治療藥物的總 類’包括干擾核酸合成、蛋白質合成和其他攸關生命之代 謝過程的藥物。通常將這些稱為抗代謝藥物。其他種類的 化子療藥物則對細胞的與傷害。通常將這類藥物 稱為基因毒的。 然而，彺往僅可在治療的試驗期間之後，精確地評估個 體贅生物對想要之化學治療藥物或藥物組合的感受性。投 貝在失敗之試驗期間上的時間，在侵略性惡性之臨床管理
O:\104M04657.DOC 1327598 上，提出重大的風險。 細胞DNA損傷的修補，是由細胞的酵素DNA修補機制進 行的重要生物學過程。在細胞基因組中未被修補的損傷， 可阻礙DNA複製、傷害新合成之DNA的複製忠實性，並/ 或妨礙細胞存活所需之基因的表現。因此，認為基因毒的 藥物通常對忙於DNA合成的主動分裂之細胞，比對靜止 的、未分裂的細胞更具毒性。許多身體組織的正常細胞是 靜止的，且不常交付再度_進入細胞循環和分裂。在細胞 分裂循環之間的大多數時間，通常足以修補在正常細胞 中’經由化學治療之基因毒素施與的Dna損傷。結果，達 到殺死癌症細胞的某些選擇性。許多治療的療程反映企圖 藉著共同投與屬於二或多種這些總類的化學治療藥物，來 改良對癌症細胞的選擇性。 因為在固體腫瘤中有效的化學治療’通常需要製劑的組 合，所以確認和定量每個單一藥物之抵抗力或敏感性的決 定因素’已經成為設計個別化學治療組合的重要工具。 已經顯示損害細胞DNA之廣泛使用的基因毒性抗癌症藥 物為順氣氨鉑（cisplatin)(DDP)和卡鉑（carboplatin)。順氣 氨鉑和/或卡鉑，目前用於上皮和間葉來源之選擇、多樣 性贅生物的治療上’包括呼吸、胃腸和生殖道、中樞神經 系統，以及頭和頸部之鱗狀來源的癌和肉瘤。目前最好將 順氯氨鉑與其他製劑混合，以便管理睪丸癌，並在許多案 例中，產生持續的減輕（Loehrer等人，1984，1〇〇 Ann. Int. Med. 704)。順氣氨鉑（DDP)經由形成股内的加合物而瓦解
O:\I04U04657.DOC 1327598 DNA結構。已經將對諸如DDP之類鉑製劑的抵抗力，歸因 於增強對鉑加合物的耐受性，降低藥物的堆積或增強DNA 修補。 奥沙利鉑，另一種以鉑為基礎的化學治療劑，攜帶1，2-二胺基環己烷環，已經在活體外和在活體内顯示出抗-腫 瘤的效力。認為該龐大的載體基團導致鉑-DNA加合物， 其比由其他鉑製劑所形成的加合物更具細胞毒性，且在阻 斷DNA複製上更有效。最近的數據已經顯示，在誤配修補 系統（MMR)中的缺陷，以及增加複製複合物，超過損傷之 DNA位置合成DNA的能力（提高複製旁道），導致對順氯氨 钻，但不對奥沙利钻的抵抗力（Raymond等人，Semin Oncol 25，附錄 5:4-12, 1998)。 龐大DNA加合物的切除修補，像是由鉑製劑形成的那 些，似乎由涉及DNA損傷認知和切除的基因調節。Cleaver 等人，Carcinogenesis 1 1:875-882 (1990) ; Hoeijmakers 等 人，Cancer Cells 2: 31 1-320 (1990); Shivji 等人，Cell 69:3 67-3 74 (1992)。確實，在酵素DNA修補機制的一或多 個元件中帶有遺傳缺陷的細胞，對於順氣氨鉑是極度敏感 的。Fraval 等人（1978)，51 Mutat. Res· 121，Beck 和 Brubaker (1973)，116 J. Bacteriol 1247。 切除修補交叉-互補（ERCC1)基因，在DNA加合物的修補 中是必要的。已經選殖了人類ERCC 1基因。Westerveld等 人，Nature (London) 3 10:425-428 (1984) ; Tanaka 等人， Nature 348:73-76(1990)(登錄編號 XM_009432，以引用的
O:\104\104657.DOC ⑤ 1327598 方式併入本文中，為序列識別10號）。使用在該基因上有 缺陷之突變種人類和倉鼠細胞株的數項研究，以及對人類 腫瘤組織的研究，指出由ERCC1編碼的產物，涉及鉑. DNA加合物的切除修補。Dabholkar等人，J. Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517 (1992) ; Dijt等人，Cancer Res· 48..6058-6062 (1988) ; Hansson等人，Nucleic Acids Res. 18:35-40 (1990)。 當轉移感染到DNA-修補缺陷的CHO細胞内時，ERCC1 藉著它修補鉑-DNA加合物的能力，賦與細胞對以鉑為基 礎之化學治療的抵抗力》Hansson等人，Nucleic Acids Res. 18:35-40 (1990)。目前接受的切除修補模式，提出損傷認 知/切除步驟為切除修補過程的速度限制。 已經在得自接受以鉑為基礎之治療的患者的惡性細胞 中，檢查諸如ERCC 1之類切除修補基因的相對表現程度。 Dabholkar 等人，J_ Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517 (1992)。已經報告了當以混合的以始為基礎和以抗代謝物 為基礎之化學治療療程（順氣氨韵/氣尿喷咬）治療時， ERCC 1在胃癌患者中的過度表現，對腫瘤反應和最後的存 活有負面的影響（Metzger等人，J. Clin Oncol 16:309, 1998)。因此，ERCC1表現的腫瘤内含量，可能是決定以 鉑為基礎之化學治療（單獨或與以抗代謝物為基礎之治療 併用），是否將有效地治療癌症患者的主要預後因素。 抗代謝物的細胞毒性化學治療化合物，包括干擾核酸合 成、蛋白質合成，及其他攸關生命之代謝過程的藥物。例
O:\104\104657.DOC 1327598 如5-氣尿嘧啶（5_FU)是極廣泛使用的藥物，用來治療許多 不同類型的癌症，包括大多數的癌症，像是胃腸道和乳房 的那些（Moertel，C.G. New Engl. J. Med.，330:1136-1142, 1994)。5-FU作為單一製劑已經持續了 4〇年以上，為結直 腸癌的第一線治療，但最近已經引入與CPT-11的組 合，作為末期結直腸癌的另一種第一線治療（Saltz等人， Irinotecan Study Group. New England Journal of Medicine. 343:905-14，2000)» 5-FU與奧沙利銘的組合，已經在結直 勝癌產生高反應速率（Raymond等人，Semin. Oncol.，25:4-12，1998)。因此，很可能將在癌症的治療上使用5_fu許多 年’因為它依然是目前化學治療療程的主要組份。此外， 對於連續使用單一製劑5-FU治療的患者而言，與CPT-11或 奥沙利鉑的組合治療可能是極有毒的。 5-FU是大多數抗-癌藥物的代表，因為僅有少數患者對 該治療體驗到有利的反應。大量的隨機臨床試驗，已經顯 示對患有轉移性結直腸癌的患者而言，腫瘤對於作為單一 製劑之5-FU的整體反應比例是在15-20%的範圍内（Moertel， C.G. New Engl. J. Med.，330:1136-1 142，1994)。當與上文 提及的其他化學治療劑混合時，已經使對以5-FU為基礎之 療程的腫瘤反應比例增加至幾乎40%。儘管如此，大多數 經過治療的患者，並未從接受以5-FU為基礎之化學治療中 獲得有形的益處，但卻遭受到重大的風險、不適和費用。 因為在治療之前，沒有可靠的方法來預估個體腫瘤的反應 性，標準的臨床慣例是使所有的患者都遭遇以5-FU為基礎
O:\104M04657.DOC 1327598 的治療，完全承認大部份將體驗不令人滿意的結果。 在數年内，已經徹底地研究5-FU的作用機制和代謝路 徑，確認最重要的藥物之抗-腫瘤活性的生化決定因素。 最終的目標是藉著a)其細胞内代謝和生化的調節，和b)藉 著在治療之前測量在患者腫瘤中的反應決定因素，預測該 患者對藥物最可能的反應（或無反應），來改良5-FU的臨床 效力。 首先在結直腸癌中，從事預測對以5-FU為基礎之治療的 腫瘤反應區域集中在其標靶酵素，胸:y：酸合成酶（ts)的研 究。亦已經選殖 TS。（Kaneda 等人，J. Biol.Chem. 265(33)， 20277-20284 (1990);登錄編號 ΝΜ_001071，以引用的方 式併入本文中’為序列識別11號）。Leichman等人 (Leichman等人，J. Clin Oncol” 15: 3223-3229，1997)進行 預期的臨床試驗，在得自結直腸癌的治療-前生檢中，藉 由RT-PCR決定’使腫瘤對5-FU的反應與TS基因表現發生 關連。該研究顯示：1)在這些腫瘤中，有5〇_倍大範圍的 TS基因表現程度’以及2)在起反應和不起反應的腫瘤之 間，ts基因表現的顯著差異程度。起反應群的TS程度範 圍（0.5-4.1 X 1 〇·3，相對於内部對照組），比不起反應群的 (1.6-23·0 Χ 1(Γ3，相對於内部對照組）更窄。研究者定出結 果的TS表現程度之"不_反應截止"閾值，只有不反應者在 其之上。因此，在治療之前，肯定地確認具有在該"不-反 應截止閾值以上之丁8表現的患者為不_反應者。"無反應" 分類包括所有具有<5〇%腫瘤縮小、正在進行之生長，導
O:\104\104657.DOC •10· 1327598 致>25%腫瘤增加，以及非-進行性腫瘤，有<50%縮小、無 改變或<25%增加的治療反應。這些腫瘤具有最高的TS程 度。因此，高TS表現主要確認有抵抗力的腫瘤。在某些閾 值以上的TS表現程度，確認出對5-FU不起反應的腫瘤亞 組，另一方面，低於該數目的TS表現程度，預測可察覺的 較高反應速度。 有趣的是，Papamichael等人已經認定在混合治療中，奥 沙利鉑促進5-FU的合成代謝路徑。Br. J. Cancer，78(附錄 2)，98 第 12 頁，1998 ； Oncologist 1999; 4(6):478-87 ° 這可 支持5-FU和奥沙利鉑組合治療在治療癌症上的效力。然 而，因為已知以5-FU為基礎和以鉑為基礎之化學治療分別 依賴TS和ERCC1表現程度，所以精確地決定衍生自患者之 腫瘤組織試樣的ERCC1表現和TS表現是特別重要的，以便 預測以5-FU為基礎和以鉑為基礎之化學治療。 例行地固定大多數患者衍生的病理學試樣，並以石蠟包 埋（FPE)，容許進行組織學分析和後續的檔案儲存。因 此，大多數的生檢組織試樣不能用來進行基因表現的測 定，因為這類研究需要高度完整的RNA，而得以進行基因 表現的精確測量。目前，僅藉著使用免疫組織化學染色， 監視蛋白質表現程度，在這類經過固定和包埋的試樣中， 定性地監視基因的表現程度。 直到現在，定量基因表現研究，包括ERCC1和TS表現的 那些，已經受限於得自新鮮或冷凍組織之RNA的逆轉錄聚 合酶連鎖反應（RT-PCR)擴大作用。Reed等人的美國專利第 O:\104\104657.DOC -11 - 1327598 5,705,336號揭示定量得自卵巢腫瘤組織之ERCCl mRNA， 並決定該組織是否將會對以鉑為基礎之化學治療敏感的方 法。如同在Leichman等人中的，Reed等人定量了得自冷康 腫瘤生檢的mRNA。 按照在Leichman等人和Reed等人中的描述，使用冷來組 織，由健康照顧專家提出了實質上的不便。當計劃任何以 RNA為基礎的定量遺傳標記測定時，快速的生檢遞送以避 免組織和後續的mRNA降解是主要的憂慮》健康照顧專家 進行生檢’必須匆忙地將組織試樣遞送至裝設有在收到組 織試樣時立刻進行RNA萃取草案的設備。如果不能獲得這 類的设備’臨床醫師必須迅速地冷柬該試樣，以避免 mRNA降解。為了在組織和RNA降解之前，使診斷設備得 以進行有用的RNA萃取草案，組織試樣必須維持冷凍，直 到其到達診斷設備為止，然而可能是遙遠的。在運送期間 使用裝配有液態氮和乾冰的專門信差，維持冷凍組織的完 整，僅獲得相當大的花費。 例行的生檢通常包括基質和腫瘤組織的異種混合物。不 像新鮮或冷凍的組織，可輕易地顯微解剖FpE生檢組織試 樣，並分離成基質和腫瘤組織，並因此提供勝過使用新鮮 或冷凍組織的優點。然而，從經過固定的組織中分離 RNA，且特別是經過固定和石蠟包埋的組織，導致高度降 解的RNA，通f認為它不能應用於基因表現的研究。 存有許多從生物試樣中純化題的技術，但沒有任何一 種可確實從FPE試樣中分離驗。例如，ChGmezynski(美
O:\104\104657.DOC
•12· 1327598 國專利第5,346,994號）描述了以液相分離為基礎，使用齡 和異硫代氰酸脈，從組織中純化繼的方法。在盼和異硫 代氰酸胍的水溶液中，將生物試樣均質化，並隨後將句聚 與氣仿混合。接著離心’勻漿分離成有機相、中間相和液 相。蛋白質螯合在有機相中，DNA在中間相，而rna在液 相中。可使RNA從液相中沉澱。不幸的是，該方法不能應 用在經過固定和石蠟包埋（FPE)的組織試樣上。 其他已知的分離RNA之技術，通常利用胍鹽或酚萃取， 如同在例如Sambrook，J·等人（1989)第7 3 7 24頁，以及在 Ausubel，F_M.等人（1994)第4〇3_4 4 7頁中描述的。再一 次，沒有任何已知的技術，對從錢包埋之組織試樣中分 離RNA，提供可再現的定量結果。 因此，從石蠟包埋的組織中分離RNA，對於研究在腫瘤 組織中的基因表現，是特別需要的，因為可使用某些受體 或酵素的表現程度，來決定特定治療成功的可能性。 尚未疋出對奥沙利鉑之抵抗力或敏感性的分子預測標 記。對於這類標記有需纟，以便決定以奧沙利翻/5_Fu為 基礎之治療成功的可能性。我們在此報告了切除修補基因 ERCC1之腫瘤内mRNA表現，和胸替酸合成酶基因（Ts)之 腫瘤内mRNA表現兩者，與患有腫瘤之患者經歷5_ρυ/奥沙 利鉑组合的化學治療之臨床成果，具有明顯的反向關連。 因此本發明的目標是提供定量得自腫瘤組織之ercC 1 及/或TS mRNA的方法，以便提供建議之基因毒性癌症治 療的早期預後《本發明的目標亦藉著檢查在患者腫瘤細胞
O:\104U04657.DOC ⑤ -13- 1327598 中之ERCC1及/或TS mRNA的含量，並與預定的閾表現程 度相比較，提供在經過固定和石蠟包埋（FPE)之組織中， 評估ERCC1及/或TS含量的方法，並預測患者腫瘤對利用 5-FU和奥沙利鉑之治療可能的抵抗力。 【發明内容】 在本發明的一項觀點中，提供評估獲自經過固定或經過 固定和石蠟包埋（FPE)之腫瘤細胞的ERCC1 mRNA之表現 程度的方法。 在本發明的另一項觀點中，提供評估獲自經過固定或經 過固定和石蠟包埋（FPE)之腫瘤細胞的TS mRNA之表現程 度的方法。 在本發明的另一項觀點中，提供相對於得自經過固定和 石蠟包埋（FPE)之組織試樣的内部對照組，定量ERCC1 mRNA表現的方法。該方法包括從該試樣中分離總 mRNA，並定出相對於内部對照組基因之mRNA含量的 ERCC1 mRNA含量。 在本發明的另一項觀點中，提供相對於得自經過固定和 石蠟包埋（FPE)之組織試樣的内部對照組，定量TS mRNA 表現的方法。該方法包括從該試樣中分離總mRNA，並定 出相對於内部對照組基因之mRNA含量的TS mRNA含量。 在本發明該項觀點的具體實施例中，提供具有ERCC1-5 04F(序列識別1號）或ERCC1-5 74R(序列識別2號）之序列， 以及實質上與其相同之序列的寡核苷酸引子。本發明亦提 供具有在嚴格條件下，與序列識別1號或序列識別2號，或 O:\104\104657.DOC 14 其互補物雜交之序列的寡核苷酸引子。 在本發明該項觀點的另一個具體實施例中，提供具有 心咖（序列識別3號）或(序列識別4號）之序列， 以及實質上與其相同之序列的寡核誓酸引子。本發明亦提 供具有在嚴格條件下，與序列識別3號或序列識別4號，或 其互補物雜交之序列的寡核甞酸引子。 在本發月的另項觀點中，提供為患者決定以5 FU和奥 沙利鉑為基礎之化學治療療程的方法，包括從經過固定和 石躐包埋（FPE)之腫瘤試#巾分離麗，定出在該試樣中 ERCC1的基因表現程度；將在該試樣中的赃〇基因表現 程度與ERCC1基因的預定閾值相比較；並以ercci基因表 現程度與預定閾值比較的結果為基礎，來決定化學治療療 程。 在本發明的另一項觀點中，提供為患者決定以5 FU和奥 /y利鉑為基礎之化學治療療程的方法，包括從經過固定和 石蠟包埋（FPE)之腫瘤試樣中分離RNA;定出在該試樣中 TS的基因表現程度；將在該試樣中的丁§基因表現程度與 ts基因的預定閾值相比較；並以Ts基因表現程度與預定 閾值比較的結果為基礎，來決定化學治療療程。 在本發明的另一項觀點中，提供為患者決定以5-FU和奥 沙利鉑為基礎之化學治療療程的方法，包括從經過固定和 石蠟包埋（FPE)之腫瘤試樣中分離RNA ;定出在該試樣中 TS和ERCC1的基因表現程度；將在該試樣中的ts和 ERCC1基因表現程度分別與T^ERCC1基因的預定閾值相
OA104M04657.DOC •15· 1327598 比較；並以TS和ERCC1基因表現程度與預定閾值比較的結 果為基礎，來決定化學治療療程。 本發明更進一步係關於對藉著前-TaqMan®技術學分 析，得自試樣之相對於内部對照組的已知ERCC1和TS表現 程度，將在組織試樣中使用TaqMan®技術學分析，相對於 内部對照組基因的ERCC1和TS之未修正基因表現（UGE)標 準化的方法。 【實施方式】 本發明一部份在於發現TS和ERCC1 mRNA之含量分別與 對5-FU和奥沙利鉑製劑的抵抗力有關。認為表現出高程度 之TS及/或ERCC1 mRNA的腫瘤可能對以韵為基礎之化學 治療有抵抗力。相反的，那些表現出低含量之以和ERCC1 mRNA的腫瘤，可能對以鉑為基礎的化學治療是敏感的。 藉著將其與預定之閾表現值相比較，來判斷患者腫瘤的TS 和ERCC1 mRNA表現狀態。 本發明提供在經過固定或經過固定和石蠟包埋（FPE)之 組織中，相對於内部對照組之基因表現’定量TS及/或 ERCC 1 mRNA表現的方法。本發明者已發展出寡核甞酸引 子’其容許在已經固定或已經固定並以石蠟包埋之組織 中，精確評估TS和ERCC1的基因表現。本發明之寡核苷酸 引子ERCC1-504F(序列識別1號）、ERCC1-574R(序列識別2 號），或實質上與其相同的寡核苷酸引子’最好是與從經 過固定和石蠟包埋（FPE)之腫瘤試樣中萃取出的RNA—起 使用。本發明亦提供募核甞酸引子，TS-763F(序列識別3 O:\104\104657.DOC •16- 1327598 號）和TS-825R(序列識別4號），或實質上與其相同的寡核苷 I引子，最好是與從經過固定和石蠟包埋（FpE)之腫瘤試 樣中萃取出的RNA —起使用。然後可使用該TS及/或 ERCC1基因表現的測量值，進行以鉑為基礎之化學治療的 預後。 本發明之具體實施例首先涉及從FPE試樣中萃取RNA的 可罪方法，而其次是藉著使用寡核甞酸引子對，最好是寡 核穿酸引子對ERCC1-504F(序列識別i號）和ERCC1_ 574R(序列識別2號），或實質上與其相同的寡核苷酸，進 行逆轉錄酶聚合酶連鎖反應，來決定在試樣中ERCCi mRNA的内含量。 當在本文中，在核酸前後文中使用"實質上相同的"時， 意指在嚴格的條件下與標靶雜交，並亦意指核酸斷片或其 互補股，當進行比較時，在利用適當的核苷酸插入和删除 而適當地排列時，在至少大約6〇%的核苷酸中，代表性的 疋至少大約70%，更具代表性的是至少大約8〇% ,通常是 至少大約90%，而更常見的是至少大約95 98%的核苷酸中 是相同的。當雜交作用比全然缺乏專一性更具選擇性時， 出現選擇性雜交作用。參見Kanehisa， Nucleic Acids Res., 12:203-213 (1984) »
本發明的該具體實施例尚涉及首先藉著使用寡核苷酸引 子對，最好是寡核苷酸引子對TS_763F(序列識別3號）和 TS-825R(序列識別4號）’或實質上與其相同的寡核甞酸， 進行逆轉錄酶聚合酶連鎖反應，定出在試樣中之Ts mRNA
O:\104\104657.DOC ⑤ -17- U2/598 的内含量。藉著任何從這類試樣中分離mRNA的方法，如 同在1999年12月2G日建檔之美國專利第G9/469 338號中描 述的並王4以引用的方式併入本文中從細胞中萃 取 RNA。
可對得自患者的任何類型之組織應用該方法。為了檢查 腫瘤組織的抵抗力，最好檢查腫餘織。在較佳的具體實 施例中’亦檢查-部份得自患者，並從其_獲得腫瘤的正 常組織。此時’預期其正常組織對以鉑為基礎的化學治療 化合物是有抵抗力的，也就是顯示出高程度之以及/或 ERCC1基因表現’但預期其腫瘤對這類化合物是敏感的， 也就是顯示出低程度之丁8及/或ERCC1基因表現的患者， 可利用較咼含量的化學治療組合來治療。 本發明之方法可應用在各式各樣的腫瘤類型上。這容許 預備個別的"腫瘤表現輪廓"，藉此決定在個別患者試樣中 之TS和ERCC1的表現程度’並預測對各種化學治療劑的反
應。本發明之方法最好應用在固體腫瘤上，最佳的是結直 腸腺癌之腫瘤。 如同在本文中之定義’關於ERCC 1表現的”預定之閾值 "’為某種ERCC 1表現程度，已經發現在該值以上的腫瘤 可能對以5-FU及/或奥沙利鉑為基礎之化學治療療程是有 抵抗力的。可能在對以5-FU及/或奥沙利鉑為基礎之化學 治療療程敏感的腫瘤中發現低於該閾值之表現程度。 ERCC1之相對表現的範圍’以ERCC1 : β-肌動蛋白的比例 表示’其中對以鉑為基礎之化學治療療程起反應的腫瘤， O:\104\104657.DOC -18- 1327598 低於大約4.9 χ ι〇-3。 不對以鉑為基礎之化學治療療程起反 應的腫瘤，具有在士&, 在大、，勺4.9 χ 1〇·3以上的ERCC1 : β·肌動蛋 白比例之相對表現。
5在本文中之定義，關於ts表現的"預定之閾值"，為 某種表現程度’已經發現在該值以上的腫瘤可能對以5· 和奥^利鉑為基礎之化學治療療程是有抵抗力 的。可能在對以5刊或5刊和奧沙利始為基礎之化學治療 療程敏感的腫瘤中發現低於該閾值之表現程度。TS之相對 表現的範圍，以TS:卜肌動蛋白的比例表示，其中對以5_ FU或5 FUi奥"利翻為基礎之化學治療療程起反應的腫 瘤，低於大約7.5 χ 1〇·3 ^不對以5_FU*5_FU和奥沙利鉑為 基礎之化學治療療程起反應的腫瘤，具有在大約7 5 χ ι〇·3 以上的TS . β-肌動蛋白比例之相對表現。
在進行本發明之方法時，測定在患者腫瘤試樣中的 ERCC1表現程度或TS表現程度，以便預測以5_Fl^a奥沙利 鉑為基礎之化學治療療程的效力。並在本發明之方法中， 測疋在患者腫瘤§式樣中的Ts表現程度，以便預測以5_fu為 基礎之化學治療療程的效力。此外，在本發明之方法中， 測定在患者腫瘤試樣中的ERCC1表現程度，以便預測以奥 沙利始為基礎之化學治療療程的效力。或者，測定在患者 腫瘤試樣中的ERCC1表現程度和TS表現程度，以便預測混 合的以5-FU和奥沙利鉑為基礎之化學治療療程的效力。 在進行本發明之具體實施例的方法時，最好從患者中分 離腫瘤細胞。以手術方式從患者中切除固體或淋巴腫瘤， O:\104\104657.DOC -19- 1327598 或其一部份，或藉著例行的生檢獲得。藉著任何在此項技 藝中代表性的方法，例如Sambrook，Fischer和Maniatis， Molecular Cloning，a laboratory manual(第 2 版），Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York (1989)，從冷練 或新鮮的試樣中分離，並從細胞中萃取RNA。最好是小心 地取得’以避免在萃取過程中RNA的降解。
然而’通常將在生檢之後從患者_獲得的試樣固定，通 常是藉著例如福馬林（甲醛）或戊二醛，或藉著酒精浸泡。 經過固定的生物試樣通常被脫水，並包埋在石蠟中，或其 他熟諳此藝者已知的固體支撐物。參見pienat等人，Ann
Pathol 2001 jan; 21(1):29-47。在本方法中亦可使用未經包 埋但經過固定的組織，以及經過固定和包埋的組織。想像 包埋經過岐之組織的固體支撐物，是可利用有機溶劑移 除的，例如容許進行經保存之組織的後續再水合作用。
藉著如同在1999年12月20日建檔之美國專利申請案第 09/469,338號中描述的任何方法，從FpE細胞中萃取 RNA，以引用的方式併人本文中。按照在本文中的描述， 經過固定和石蠛包埋（FPE)的組織試樣，意指 檔的組織試樣。可從存檔的病理學試樣或生檢試樣中分^ RNA ’首先將其脫石壤。代表性的脫石堰方法涉及以有機 溶劑’例如像是二甲苯，沖洗石壞化的試樣。可利用低碳 數酒精的含水溶液，將脫錢的試#再水合。適當的低 數酒精，包括例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。例:，可 用逐漸降低濃度之低碳數酒精系溶液的連續沖洗，將脫石
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然 堰的試樣再水合。或者， 後從試樣中萃取RNA。 將試樣同時脫石蠟和再水合 闕卒取，可使用機铖、超音波或其他均質化的工 具，將經過固定或經過固定和稅石犧的試樣均質化。可在 包括促溶劑的溶液中將再水合的试樣均質化，像是硫代氱 酸飯（亦以異硫代氰⑽販售）。在含有有效含#之❹ 劑，像是鈒化合物的促溶溶液中，將均質化的試樣加鼓至
範圍在大約5〇至大約峨的溫度。較佳的促溶劑為硫代 氰酸飯。 選擇"有效濃度的促溶劑”’使得以比在缺乏促溶劑之下 分離的含量，更多大約10_倍的含量，從石蠟包埋的試樣 中純化出RNA。促溶劑包括例如：鈒化合物、脲、甲醯 胺、碘化鉀、硫代氰酸鉀和類似化合物。對本發明之方法 而5，較佳的促溶劑為鈒化合物，像是異硫代氰酸鍁（亦 以硫代氰酸鈒販售）和鈒鹽酸鹽。許多陰離子抗衡離子是 φ 有用的，且熟諳此藝者可製備許多帶有這類適當陰離子的 鍁鹽。在本發明中所使用之觚溶液的有效濃度，通常具有 範圍在大約1至大約5M的濃度，而最佳的值約為4M。如果 RNA業已在溶液中，則瓠溶液可具有較高的濃度，使得在 試樣中的終濃度達到大約1至大約5M的範圍。亦最好利用 適當的生化緩衝溶液，像是Tris_Cl，將觚溶液緩衝至大約 3至大約6的pH值’更佳的是大約4。促溶劑亦可含有還原 劑’像是二硫蘇糖醇（DTT)和β-巯基乙醇（BME)。促溶溶液 亦可含有RN Α酶抑制劑。 O:\104\104657.DOC 21
(D 1327598 然後從促溶溶液中，藉著例如酚氣仿萃取作用、離子交 換層析法，或尺寸-排阻層析法，回收RNA。然後可使用 萃取、電泳、層析、沉澱技術，或其他適當的技術，進一 步純化RNA。 最好使用，例如此項技藝中共通的逆轉錄酶聚合酶連鎖 反應（RT-PCR)方法，完成得自從新鮮、冷凍或經過固定之 試樣中純化的總mRNA之TS或ERCC1 mRNA的定量。其他 定量TS或ERCC 1 mRNA的方法，包括例如使用分子信號 燈，以及在複數PCR中有用的其他已標示探針。此外，本 發明想像經由使用不含PCR之系統，使用例如螢光標示之 探針，類似Invader®測定（Third Wave Technologies，Inc.) 的那些，來定量TS及/或ERCC1 mRNA。最佳的是，使用 以螢光為基礎的即時檢測方法（ABI PRISM 7700或7900序 列檢測系統[TaqMan®]，Applied Biosystems，Foster City, CA.)，或類似的系統，像是由Heid等人（Genome Res 1996; 6:986-994)和 Gibson等人（Genome Res 1996; 6: 995-1001)描 述的，進行TS及/或ERCC1 cDNA和内部對照組，或基本的 基因（例如β-肌動蛋白）的定量。以（：0或”循環閾"表示ABI 7700 (TaqMan®儀器）的輸出。關於TaqMan®系統，高度表 現的基因在試樣中具有較高數目的標靶分子，比具有較少 標靶分子之相對上較低表現的基因（較高的Ct)，利用更少 的PCR循環產生信號（較低的Ct)。
當在本文中使用"基本的"基因或"内部對照組"時，意指 包括任何在組成上或全體表現的基因，其存在得以評估TS O:\104\104657.DOC -22- 1327598 及/或ERCCl mRNA含量。這類評估包括決定基因轉錄的 全部組成含量，並控制在RNA回收上的變化。"基本的••基 因或"内部對照組"可包括，但不限於環非林（cyclophilin) 基因、β-肌動蛋白基因、鐵傳遞蛋白受體基因、GAPDH基 因及其類似物。最佳的是，内部對照組基因是β-肌動蛋白 基因，如同由 Eads 等人，Cancer Research 1999; 59:2302-2306描述的。 控制在RNA回收上的變化，需要使用”校準者RNA"。" 校準者RNA"意指任何可利用之來源的預先精確定量之對 照組RAN。在定量ERCC1時，最好是使用人類肝臟總RNA (8訌&1&§61^,目錄第735017號），而在定量丁8時，最好是使 用得自 Applied Biosystems 的萬能 PE RNA ;目錄第 4307281 號，批號3617812014。 當在本文中使用"未修正的基因表現（UGE)"時，意指相 對於由TaqMan®儀器產生之内部對照組基因的TS及/或 ERCC1表現之數量輸出。在實例3和4中出示用來決定UGE 的等式，並利用在圖7和8中的試樣計算解釋之。 本發明進一步的觀點提供利用衍生自非-TaqMan®技術 之”已知的相對基因表現"值，將從TaqMan®儀器獲得之未 修正基因表現（UGE)值標準化的方法。最好是利用已知的 非-TaqMan®衍生之相對TS及/或ERCC1 : β-肌動蛋白表現 值，將得自組織試樣之TaqMan®衍生的TS及/或ERCC 1 UGE值，對試樣標準化。 當在本文中使用”修正的相對ERCC1表現"時，意指標準 O:\104\104657.DOC -23 - 1327598 化的ERCC1表現，藉此將UGE乘以ERCC1特定的修正因子 (KERCC1) ’產生可.與相對於内部對照組基因之已知範圍的 ERCC 1表現程度相比較的值。實例3和圖7詳細地解釋了這 些計算。這些數值容許定出特定試樣的"修正之相對 ERCC 1表現''是否落在"預定閾"值以上或以下。對冷-肌動 蛋白值之修正的相對ERCC1表現之預定閾值是大約4 9χ1〇· 3。ERCC1特定的KERCC1 ’内部對照組β·肌動蛋白和校準者 人類肝臟總RNA (Stratagene，目錄第735017號）為1.54 χ 10_3。 ”已知的相對基因表現"值係衍生自先前分析的組織試 樣，並以標靶基因對在組成上表現的内部對照組基因（例 如β-肌動蛋白、GAPDH等等）之RT-PCR信號的比例為基 礎。這類組織試樣最好是以福馬林固定，並以石蠟包埋 (FPE)的試樣’且根據在實例1和在丨999年12月20曰建標之 美國專利申請案第09/469，33 8號中描述的草案，從其中萃 取RNA ’全部以引用的方式併入本文中。欲相對於内部對 照組來定量基因表現’使用此項技藝中已知的標準定量 RT-PCR技術。執行固定次數循環的前-TaqMan®技術pCR 反應（也就是30次），並對每個試樣報告終點值。然後以 ERCC1表現對β-肌動蛋白表現的比例報告這些值《參見 Reed等人的美國專利第5,705,336號。 可對β-肌動蛋白以外的内部對照組基因，以及/或與人類 肝臟總RNA (Stratagene,目錄第735017號）不同的校準者 RNA定出KERCC1。欲如此進行，必須對業已相對於特定之
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1327598 内部對照組基因決定其ERCC1表現程度（也就是·，已知的相 對基因表現”）的組織試樣，校準内部對照組基因和校準者 RNA »這類組織試樣最好是以福馬林固定，並以石蠟包埋 (FPE)的試樣’並根據在實例1和在1999年12月20日建;^之 美國專利申請案第09/469,338號中描述的草案，從其中萃 取RNA，全部以引用的方式併入本文中。可使用此項技藝 中已熟知的標準前-TaqMan®、定量RT-PCR技術進行這類 決定。在這類決定時’這類試樣具有Ercci"已知的相對 基因表現"值，可按照在實例3中的描述，用來決定新的内 部對照組及/或校準者RNA特有的新KERCC1。 當在本文中使用"修正的相對TS表現"時，意指標準化的 TS表現，藉此將UGE乘以TS特定的修正因子（kts)，產生 可與相對於内部對照組基因之已知範圍的TS表現程度相比 較的值。實例4和圖8詳細地解釋了這些計算。這些數值容 許定出特定試樣的"經過修正之相對TS表現"是否落在"預 定閾"值以上或以下。對β_肌動蛋白值之修正的相對Ts表 現的預定閾值是大約7.5 x 1〇-3 ^ TS特定的Kts，内部對照 組β-肌動蛋白和校準者萬能的PE RNA (得自AppUed Biosystems,目錄第 43〇7281 號，批號 3617812〇14),為 12.6 X 10·3。 可對β-肌動蛋白以外的内部對照組基因，及/或與萬能的 PE RNA(付自 Applied Bi〇systems，目錄第 4307281 號，批 號3617812〇14)不同的校準者RNA定出KTS。欲如此進行， 必須對業已相對於特定之内部對照組基因定出其TS表現程
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-25- 1327598 度（也就是"已知的相對基因表現"或"先前公告的的組織 試樣’校準内部對照組基因和校準者RNA。這類組織試樣 最好疋以福馬林固定’並以石螺*包埋（FPE)的試樣’並根 據在實例1和在1999年12月20曰建檔之美國專利申請案第 09/469,338號中描述的草案，從其中萃取rNa，全部以引 用的方式併入本文中。可使用此項技藝中已熟知的標準 前-TaqMan®、定量RT-PCR技術進行這類決定。在這類決 定時’這類試樣具有TS”已知的相對基因表現"值，可按照 在實例4中的描述，用來決定新的内部對照組及/或校準者 RNA特有的新KTS。 "先前公告的"相對基因表現結果，是以標靶基因對在組 成上表現之基因（β-肌動蛋白）的RT-PCR信號比例為基礎。 在别-TagMan®技術研究中，執行固定次數循環的pCR反應 (也就是30次）’並對每個試樣報告終點值。然後以ErcC1 或ts表現對β-肌動蛋白表現的比例報告這些值。Salonga 等人，Clinical Cancer Research, 6:1322-1327，2000，全部 以引用的方式併入本文中。 本發明之方法可應用在各式各樣的組織和腫瘤類型上， 並因此可用來評估患者的臨床治療，並作為範圍包括乳 房、頭和頸部、肺臟、食道、結直腸及其他癌症的診斷或 預後工具。在較佳的具體實施例中，本方法可用於結直腸 腺癌的預後。 在化學治療前處理腫瘤生檢，通常僅獲得經過固定和石 蠟包埋（FPE)的組織，一般僅含有極少量的異質組織。這 •26-
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1327598 類FPE試樣輕易地服從顯微解剖，而得以在未受基質組織 污染的腫瘤組織中定出TS及/或ERCC1的基因表現《此 外，可在在生檢組織試樣中的基質和腫瘤組織之間進行比 較’因為這類試樣通常含有兩種類型的組織。 一般而言’可使用任何位在ERCC1基因區側面的寡核甞 酸對，如同在序列識別1〇號中所示，來進行本發明之方 法。在嚴格條件下與ERCC1基因區雜交，可在本發明中用 來將產物擴大的引子’在20-1000個鹼基對之間，較佳的 是50-100個鹼基對’最好是低於ι00個鹼基對。 本發明提供特定的寡核甞酸引子對，以及實質上與其相 同的寡核甞酸引子’其容許使用FPE組織，特別精確地評 估ERCC 1表現。最好是寡核芬酸引子’ ERCC1-5 04F(序列 識別1说）和ERCC1(序列識別2號）（在本文中亦稱為寡核菩 酸引子對ERCC1) ’以及實質上與其相同的募核甞酸引 子。已經顯示寡核甞酸引子ERCC1-504F(序列識別丨號）和 ERCC1 (序列識別2號），可使用經由任何的mRNA分離方 法’例如像是在實例1中描述的，從FPE細胞中萃取的 RNA，特別有效地測量ERCC 1 mRNA之含量。 此外，可使用任何位在TS基因區側面的寡核甞酸對，如 同在序列識別11號中所示，來進行本發明之方法。在嚴格 條件下與TS基因區雜交，可在本發明中用來將產物擴大的 引子，在20-1000個鹼基對之間，最好是5〇_1〇〇個鹼基對， 更佳的是低於1 〇〇個鹼基對。 本發明提供特定的寡核苷酸引子對，以及實質上與其相 O:\104\104657.DOC •27· 1327598 ， 同的寡核芬酸引子，其容許在FPE組織中特別精確地評估 • TS的表現。最好是寡核苷酸引子，TS-763F(序列識別3號） 和TS(序列識別4號），（在本文中亦稱為寡核苷酸引子對 TS)，以及實質上與其相同的寡核苷酸引子。已經顯示寡 核甞酸引子TS-763F(序列識別3號）和TS(序列識別4號），使 用經由任何的mRNA分離方法，例如像是在實例丨中描述
的，從FPE細胞中萃取的rnA，特別有效地測量ts mRNA 之含量。 本發明包括實質上相同的寡核苷酸，其在嚴格的條件 (如同在本文中之定義）下，與ERCC1_504F(序列識別i 號），其互補物，或ERCC1_574R(序列識別2號）或其互補物 的全部或部份寡核甞酸引子序列，或TS-763F(序列識別3 號）’其互補物，或TS_825R(序列識別4號）或其互補物的寡 核芬酸引子序列雜交。 在嚴格的雜交條件下，僅有高度互補的，也就是如同在 • 本文中之定義，實質上類似的核酸序列發生雜交。這類條 件最好防止在20個相鄰核甞酸當中有4或更多個誤配，更 佳的是在20個相鄰核甞酸當中有2或更多個誤配，最佳的 是在20個相鄰核芬酸當中有1或多個誤配之核酸的雜交作 用。 核酸的雜交部份，長度通常是至少大約10個（例如15個） 核甘I。雜父核酸的雜交部份與寡核苷酸引子ERCCh 5(MF(序列識別丨號），其互補物或ercc卜$观(序列識別 2號）或其互補物，或寡核苷酸引子TS-763F(序列識別3
O:\104\104657.DOC ⑧ •28- 1327598 號），其互補物，或TS-825R(序列識別，或其互補物全部 或部份的序列，至少有大約80%，較佳的是至少大約 95% ’或最佳的是大約98%相同。 —
以下定義寡核嘗酸引子與核酸試樣在嚴格條件下的雜 交。以解鏈溫度（Tm)表示核酸雙股或雜化物的穩定性，其 為探針從標靶DNA中解離的溫度》使用該解鏈溫度來定義 所需的嚴格度條件》如果待確認之序列與探針實質上相 同，但非完全相同，此時先利用特定濃度的鹽（例如ssc或 SSPE)建立僅發生同種雜交的最低溫度是有用的。然後假 定1%誤配的結果是Tm降低1。〇，因此降低在雜交反應中的 最終沖洗溫度（例如，如果尋找與探針具有>95%同一性的 序列’便降低5°C的最終沖洗溫度）。實際上，每1%誤配可 在Tm上產生在〇.5°C到1.5°C之間的改變。
嚴格條件涉及在68 °C下，在5x SSC/5x登哈特氏 (Denhart’s)溶液/1.0% SDS下雜交，並在室溫下以〇 2 χ SSC/0.1% SDS沖洗。中等嚴格的條件包括在大約42t：下以 3 χ S S C沖洗。改變鹽濃度和溫度的參數，以便在引子與標 乾核酸之間達到最適切的同一性值。關於這類條件的額外 指導可在此項技藝中輕易地獲得，例如Sarnbro〇k， Fischer 和 Maniatis，Molecular Cloning，a laboratory manual(第 2 版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) ’ 以及F.M. Ausubel等人編輯，Current Protocols in
Molecular Biology，John Wiley and Sons (1994)。 在本文中揭示的寡核苷酸引子能夠容許在經過固定或經 O:\104\104657.DOC -29· 過固疋和石蟻包埋的組織中’以及冷凍或新鮮的組織中， 精確地評估TS及/4ERCC1的基因表現 。這不顧衍生自FPE 試樣的RNA，相對於新鮮或冷凍組織是較破碎的事實。因 此本發明之方法適用於在FPE組織中測定TS及/或ERCC1 的基因表現程度’而先前並未出現可使用經過固定之組織 來測定TS及/或ERCC1之基因表現的方法。 可用來與以5-FU和奥沙利鉑為基礎之化學治療混合的基 因毒製劑’是形成持久的基因組傷害且在癌症之臨床 官理上用來作為化學治療製劑的那些。基因毒素-誘導之 DNA損傷的細胞修補速率，以及經由細胞分裂週期的細胞 生長速率，影響基因毒素治療的成果。在細胞基因組中未 修補的傷害可阻礙DNA複製，減損新合成之DNA的複製忠 實性’或妨礙細胞存活所需之基因的表現。因此，基因毒 性製劑之細胞毒性（促成細胞死亡的傾向）的決定因子’是 由其形成之基因組損傷對細胞修補的抵抗力。形成持久之 基因組傷害的基因毒性製劑，例如停留在基因組中，直到 細胞交付細胞周期為止的傷害，通常是比形成暫時性、容 易修補之基因組傷害的製劑更有效的細胞毒素。 在美國專利第4,169,846號中描述了基因毒素，奥沙利 舶’也就是順-草酸并（oxalato)(反-uj-環己烷二胺）鉑 (II)。相關的專利包括：美國專利第5,29〇,961號；美國專 利第5,298,642號；美國專利第5,338,874號；美國專利第 5,420,319 號和 PCT/IB/00614。奧沙利鉑屬於鉑（11)_反_12_ 二胺基環己烧複合物的種類，其目前正在充份發展中。該 O:\104\104657.DOC -30- 1327598 複合物，或"一"複合物正在進行臨床試驗，並對黑色素瘤 和卵巢子呂、月和腸等等的腫瘤特別有效。其他可用來 增補以5-FU和奥沙利鉑為基礎之化學治療的化合物，亦可 包括奥沙利鉑的類似成員，像是"一"複合物，以及形成共 價DNA加合物的那些。在較佳的具體實施例中，本發明使 用之增補性的鉑化合物為奥沙利銘。 目前可由鉑配位化合物管理的腫瘤，包括睪丸、子宮内 膜、子宮頸、胃、鱗狀細胞、腎上腺和小細胞肺癌，連同 神經管胚細胞瘤和神經胚細胞瘤。 如此描述本發明，藉著下文提供的實驗性實例解釋本發 明之實％。熟練的從業者將瞭解可以各種方式修改在解釋 之實例中使用的材料和方法。認為這類修改將落在本發明 的範圍内。 實例 實例1
從FPE組織中分離rna 藉著下列的共同程序從石蠛包埋的組織中萃取rna。 A.切片的脫石蠛和水合作用： (1) 將一部份大約10 μΜ的切片放在丨5毫升塑膠離心管 中 〇 (2) 加入600微升二甲笨，並在室溫（約略2〇至25〇c )下劇 烈地振盪該混合物大約10分鐘。 (3) 在室溫下，以台面離心機的最高速（約1〇2〇〇〇{) χ g) 離心試樣大約7分鐘。
O:\104\104657.DOC 1327598 (4) 重覆步驟2和3，直到大部份的石蠟已經溶解。通常 需要二或多次’依據在原始試樣部份中所含有的石蠟含量 而定》 (5) 藉著與低破數酒精，最好是10Q。/。乙醇（大約600微升） 一起劇烈地振盈大約3分鐘，移除二甲苯溶液。 (6) 像在步驟（3)中一樣，離心試管大約7分鐘《慢慢地倒 出上清液並拋棄。小球變成白色的。 (7) 利用連續更加稀釋的乙醇溶液，重覆步驟5和6:首 先利用大約95%乙醇，然後以大約80〇/〇，最後利用大約 70%乙醇。 (8) 像在步驟（3)中一樣’在室溫下離心試樣7分鐘。拋棄 上清液’並容許小球在室溫下乾燥大約5分鐘。
Β.利用酚-氣仿分離RNA (1)加入400微升包括0.5%肌氨酸和8微升二硫蘇糖醇的 異硫代氰酸脈溶液。 ⑺然後利用組織均化器（uitra-Turrax, IKA-Works，Inc.， Wilmington, NC)將試樣均質化大約2至3分鐘，同時從低速 (速度1)逐漸增加速度至高速（速度5)。 (3) 然後加熱試樣至大約95°C持續大約5-20分鐘。在加熱 至95 °C之前’最好以細口徑的針頭刺穿含有試樣之試管的 蓋子。或者，可利用塑膠夾子或實驗室薄膜固定蓋子。 (4) 然後利用50微升pH 4.0之2M醋酸鈉和600微升酚/氣仿 /異戊醇（10:1.93:0.036)(藉著混合18毫升酚與3.6毫升1:49 之異戊醇：氯仿溶液新近製備的）萃取試樣。劇烈地振盈 •32·
O:\104\104657.DOC ⑧ 1327598 該溶液大約10秒鐘，然後在冰上冷卻大約15分鐘。 (5) 以最高速離心該溶液大約7分鐘。將上方的（液）相移 至新試管中。 (6) 在-20°C下，以大約10微升的肝糖，並以400微升異丙 醇使RNA沉澱30分鐘。 (7) 在台面離心機中，以最高速離心大約7分鐘，使RNA 形成小球；慢慢地倒出上清液並拋棄；並以大約500微升 約70至75%之乙醇沖洗小球。 (8) 再度以最高速離心試樣7分鐘。慢慢地倒出上清液， 並將小球風乾。然後將小球溶解於適當的緩衝溶液中，進 行進一步的實驗（例如50 pi. 5 mM Tris氣，pH 8.0)。 實例2
mRNA逆轉錄作用和PCR 逆轉錄作用：按照在實例1中的解釋，以及先前在1999 年12月20日建檔之美國專利申請案第09/469,338號中描述 的，全部以引用的方式併入本文中，從經過顯微解剖或未 經顯微解剖之福馬林固定、石蠟包埋（FPE)的組織中分離 RNA。在利用乙醇沉澱和離心之後，將RNA小球溶解於50 微升pH 8·0之5 mM Tris/Cl中。M-MLV逆轉錄酶將在脫氧 核苷酸的存在下，延伸與單-股RNA或DNA模板雜交的寡 核甞酸引子，產生互補的股。利用隨機的六聚體和得自 Life Technologies的M-MLV逆轉錄酶逆向轉錄所得的 RNA。藉著將25微升RNA溶液與25.5微升"逆轉錄混合物 ”（參見下文）混合，完成逆轉錄作用。將該反應放在熱循環
O:\104\104657.DOC -33- ⑧ 1327598 器中，在26°C下8分鐘（使隨機的六聚體與RNA結合），在42 °C下45分鐘（進行M-MLV逆轉錄酵素反應），並在95°C下5 分鐘（進行DNA酶的熱失活作用）。 "逆轉錄混合物"由10微升5X缓衝溶液（250 mM Tris-HCl， pH 8.3, 375 mM KC1，15 mM MgCl2)、0.5微升隨機的六聚 體（50 O.D.溶解於 550微升 10 mM Tris-HCl，pH 7.5)、5微升 10 mM dNTPs (dATP、dGTP、dCTP和 dTTP)、5微升 0.1M DTT、1.25 微升 BSA (3 毫克/毫升，在10 mM Tris-HCl pH 7.5中）、1.25微升RNA防護24,800單位/毫升（RNA酶抑制 劑）（豬 27-0816 號，Amersham Pharmacia)和 2.5微升 MMLV 200單位/微升（Life Tech目錄第28025-02號）所組成。 反應組份的終濃度為：50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KC1，3 mM MgCl2，1.0 mM dNTP，1.0 mM DTT，0.00375毫 克/毫升BSA, 0.62單位/微升RNA防護和10單位/微升 MMLV。 mRNA表現的PCR定量。按照Heid等人（Genome Res 1996; 6: 986-994) ; Gibson等人（Genome Res 1996; 6:995-1001)的描述，使用以螢光為基礎之即時檢測法（ABI PRISM 7700 或 7900 序列檢測系統[TaqMan®]，Applied Biosystems，Foster City，CA)進行 ERCC1 cDNA和内部對照 組或基本基因（例如β-肌動蛋白）cDNA的定量。簡言之，該 方法使用雙重標示的螢光團TaqMan®寡核甞酸探針 (ERCCl-530Tc(序列識別 5號），Tm=70°C ; TS-781(序列識 別6號）、β-肌動蛋白-611(序列識別7號），其專一地黏接在 O:\104\104657.DOC -34· 前進和逆向引子内）。在含有反應混合物的加蓋孔中以激 光刺激，引起3'中止劑（quencher)染料（TAMRA)的發射， 直到該探針在PCR延伸期間，被DNA聚合酶的5'至1核酸 酶活性切開，引起5'報告者染料（6FAM)的釋放為止。如此 產生的擴大區，引起螢光信號的發射，其可由TaqMan®的 CCD(電荷-偶聯裝置）偵測攝影機檢測到，且在PCR反應之 純指數期中，在閾循環處產生的信號量，反映出感興趣序 列的起始副本數目。將感興趣序列的起始副本數目與内部 對照組基因的起始副本數目相比較，提供相對的基因表現 程度。TaqMan®分析，產生以在兩個絕對測量值之間的比 例（感興趣基因/内部對照組基因）表示的值。 PCR反應混合物由0.5微升的逆轉錄反應所組成，含有按 照上述製備的cDNA，寡核甞酸引子ERCC1-504F(序列識 別1號；Tm=59°C )和ERCC卜574R(序列識別2號；Tm=58 °C)，或寡核甞酸引子TS-763F(序列識別3號）和TS-825R(序 列識別4號）各600 nM，200 nM TaqMan®探針（序列識別5 號或序列識別6號）’ 5單位AmpliTaq Gold聚合酶，dATP、 dCTP、dGTP各 200 ρΜ，400 μΜ dTTP，5.5 mM MgCl2， 以及含有參考染料的1 x Taqman緩衝溶液A，至低於或等 於25微升之終體積（所有試劑均得自Applied Biosystems， Foster City，CA)。循環條件為95°C 10分鐘，接著是95°C 15 秒和60°C 1分鐘的45次循環。用來定量内部對照組基因β-肌動蛋白的寡核苷酸是β-肌動蛋白-592F(序列識別8號）和 β-肌動蛋白-651R(序列識別9號）。 O:\104\104657.DOC •35· 1327598 實例3 定出ERCC1的未修正基因表現（UGE) 進行兩對平行反應《"試驗"反應和"校準"反應，圖7， ERCC 1擴大反應和β-肌動蛋白内部對照組擴大反應是試驗 反應。在校準者RNA模板上進行獨立的ERCC1和β-肌動蛋 白擴大反應，並稱之為校準反應。TaqMan®儀器將產生四 個不同的循環閾（Ct)值：得自試驗反應的CtERcc丨和， 以及仔自校準反應的CtERCC丨和Ctp·肌動蛋6。根據下式定出兩 個反應之Ct值上的差異： △ CtK*=CtERCC1-Ctp.w 蛋白(得自”試驗"反應) 校準者=CtERCC1-Ctp^to蛋白(4自”；^準"反應) 下一個步驟涉及根據下式使數字2舉起負的Act : 2 (得自"試驗"反應） 2 (得自"校準"反應） 然後為了從TaqMan®儀器中獲得ERCC1的未修正基因表 現’進行下列的計算： ERCC1的未修正基因 表現（UGE)=2-a ct /2_δ Ct ’ 试驗 校準者 利用已知的相對ERCC 1表現程度，將UGE標準化 標準化計算需要UGE與ERCC1和特定校準者RNA特有之 修正因子（KERCC1)的乘法》亦可對任何内部對照組基因， 以及任何預先精確定量的校準者RNA，定出修正因子 KERCC1»内部對照組基因最好使用卜肌動蛋白，而預先精 確定量的校準者RNA則使用人類肝臟總RNA (stratagene， 目錄第735〇17號）。給予這些試劑等於丨Μ χ 1〇-3的修正因 O:\104\104657.DOC -36· ⑧ 1327598 子κ ERCCl ° 使用由Applied Biosystems，TaqMan®製造者，在使用者 公報#2中描述的和上述的ACt法之修改，完成標準化。欲 進行該程序，使用上述的TaqMan®方法學，就ERCC1表現 分析6個不同受試組織的UGE。使用内部對照組基因β-肌 動蛋白，和校準者RNA，人類肝臟總RNA (Stratagene,目 錄第735017號）。 將每個試樣AG221、AG222、AG252、成人肺臟、 PC3、AdCol的已知之相對ERCC1表現程度，除以其相對 應的TaqMan®衍生之UGE，產生未平均的修正因子K。
κ未平均的=已知的值/UGE 接下來，平均所有的K值，定出ERCC1，得自校準者 RNA之人類肝臟總RNA (Stratagene，目錄第735017號）和β-肌動蛋白特有的單一 KERCC1修正因子。 因此，欲在未知的組織試樣中，以與前-TaqMan® ERCCl表現研究一致的規模，定出修正的相對ERCCl表 現，僅將衍生自TaqMan®裝置的未修正基因表現數據 (UGE)乘以使用相同内部對照組基因和校準者RNA所提供 之特有的修正因子KercCI。 修正的相對ERCCl表現=UGE X KERCC1 可使用任何預先精確定量之校準者RNA或内部對照組基 因，來決定KERCC1。 可按照在上文方法中的描述，利用已 知的相對ERCC1表現程度對試樣校準預先精確定量之RNA 有希望的來源，或可現在對先前校準之校準者RNA，像是 O:\104\104657.DOC -37- 1327598 上述的人類肝臟總！^八（8的13呂61^，目錄第73 5017號）進 行校準。 例如’如果對不同的内部對照組基因及/或不同的校準 者RNA疋出後續的kercc〖’必須就其相對於業已決定之特 有的内部對照組基因之ERCC1表現程度，對組織試樣校準 内部對照組基因和校準者RNA兩者。可使用此項技藝中已 熟知的標準前-TaqMan®、定量RT-PCR技術，進行這類決 定。將這些試樣的已知表現程度除以其相對應的Uge值， 疋出該試樣的K值。然後依據已知的試樣數目平均該κ 值’疋出不同的内部對照組基因及/或校準者RNA所特有 的新 Kercci。 實例4 定出TS的未修正基因表現（UGE) 進行兩對平行反應。”試驗"反應和"校準”反應。圖8， TS擴大反應和β-肌動蛋白内部對照組擴大反應是試驗反 應。在校準者RNA模板上進行獨立的TS和β-肌動蛋白擴大 反應’並稱之為校準反應。TaqMan®儀器將產生四個不同 的循環閾（Ct)值：得自試驗反應的CtTS和Ctp.肌動* ό，以及 得自校準反應的CtTS和Ctp·肌動。根據下式定出兩個反應 之Ct值上的差異： △Ct试驗=CtTS-Ctp-肌動(得自"試驗"反應） △ Ct校準* =CtTS-Ctp·肌t» * 6 (得自"校準"反應） 下一個步驟涉及根據下式使數字2舉起負的Act，根據 下式： O:\104\104657.DOC -38- 1327598 τ (得自"試驗"反應） 2'ACt«^^ (得自"校準"反應） 然後為了從TaqMan®儀器中獲得TS的未修正基因表現， 進行下列的計算： TS的未修正基因表現（UGE)=2—A cttt ·/2·Δ cttt 两β 校準老 利用已知的相對TS表現程度，將UGE標準化 標準化計算需要UGE與TS和特定校準者RNA特有之修正 因子（KTS)的乘法。亦可對任何内部對照組基因，以及任何 預先精確定量之校準者RNA，定出修正因子kts。内部對 照組基因最好使用β-肌動蛋白’而預先精確定量的校準者 RNA貝|J使用萬能的PE RNA ;目錄第4307281號，批號 3617812014，得自 Applied Biosystems。給予這些試劑等 於12.6 X ΙΟ*3的修正因子KTS。 使用由Applied Biosystems，TaqMan®製造者，在使用者 公報#2中描述的和上述的法之修改，完成標準化。欲 進行該程序，使用上述的TaqMan®方法學，就TS表現分析 6個不同的先前公告之受試組織的UGE。在Salonga等人，
Clinical Cancer Research，6:1322-1327，2000 中描述 了這些 組織試樣’全部以引用的方式併入本文中。使用内部對照 組基因β-肌動蛋白和校準者RNA，萬能的PE RNA (目錄第 4307281 说’批號 3617812014，得自 Applied Biosystems)。 將每個試樣 L7、L91、L121、L150、L220、L164之先前 已公告的相對TS表現程度，除以其相對應的TaqMan®衍生 之UGE ’產生未平均的修正因子k。Salonga等人，Clinical -39-
O:\104\104657.DOC (§) 1327598
Cancer Research, 6:1322-1327，2000，全部以引用的方式 併入本文中。
K未平均的=已知的值/UGE 接下來，平均所有的K值，定出TS，Applied Biosystems 萬能的PE RNA ;目錄第4307281號，批號36 178 12014，校 準者RNA和β-肌動蛋白特有的單一 KERCC：1修正因子。 因此，欲在未知的組織試樣中，以與前-TaqMan® TS表 現研究一致的規模，定出修正的相對TS表現，僅將衍生自 TaqMan®裝置的未修正基因表現數據（UGE)乘以使用相同 内部對照組基因和校準者RNA所提供之特有的修正因子 Kts。
修正的相對TS表現=UGE X KTS 可使用任何精確地預先-定量之校準者RNA或内部對照 組基因，來決定KTS。可按照在上文方法中的描述，利用 已知的相對ERCC1表現程度對試樣校準預先精確定量之 RNA有希望的來源，或可現在對先前校準之校準者RNA， 像是上述得自Applied Biosystems之萬能的PE RNA ;目錄 第4307281號，批號3617812014進行校準。 例如，如果對不同的内部對照組基因及/或不同的校準 者RNA定出後續的KTS，必須就其相對於業已決定或公告 之特有的内部對照組基因之TS表現程度，對組織試樣校準 内部對照組基因和校準者RNA兩者。可使用此項技藝中已 熟知的標準前-TaqMan®、定量RT-PCR技術，進行這類決 定。將這些試樣的已知表現程度除以其相對應的UGE值，
O:\104\104657.DOC -40- ⑤ 1327598 定出該試樣的κ值。然後依據已知的試樣數目平均該κ 值，定出不同的内部對照組基因及/或校準者RN Α所特有 的新Kfs。 實例5 患者的選擇和化學治療 所有的患者均登記在3C-98-3的同情草案中，在 University of
Southern California Medical Center，從 1998-2000，並 接受奥沙利鉑/5-FU混合治療療程^ 13〇毫克/平方公尺奥沙 利鉑加5-FU的連續輸液。所有的患者對於先前利用5_?1;的 治療均告失敗，且60❶/。（30/50)對於利用伊利替康 (irinotecanXCPT]丨）之額外的第二線治療亦告失敗。所有 的患者在參加該草案時均顯示在第汉期結直腸癌的主動疾 病。 臨床評估和反應基準 在化學治療期間’每週記錄關於實行狀態、體重、腹 痛、完整的血液計數和幻青肌㈣’以及血中尿素氣含量 的汗估。使用電腦斷層攝影(CT)測量腫瘤負荷。在參加草 案時需要可二次元測量的腫瘤質量。藉著其腫瘤負荷在至 ^週中減少咖或更多的㈣患者，分類成對治療有反 從Η二反應者包括穩定的疾病或癌症進行的那些。以 從開始利用5-FU/奥沙利鉑治瘁到 來計算存活。檢查在最後的二=原因之死亡的天數 者。 追蹤調查評估時仍活著的患
〇：\104\1〇4657.D〇C ⑧ -41 - 1327598 統計分析
TaqMan®分析產生以在兩個絕對測量值之間的比例（感 興趣之基因.内部參考基因）表示的值。使用Mann-Whitney檢定和Kruskal-Wallis檢定來評估TS與ERCC1表現 (作為連續變數）與患者人口統計學的關連。Zar， Biostatistical Analysis. Prentice-Hall, Inc Englewood Cliffs, N.J. (1974),分別在第 109-114 頁和第 139-142 頁》 改編 Miller和 Sigmund (Biometrics 38:1011-1.016，1982)， 以及 Halpern (Biometrics 38:1017-1023，1982)的最大化 γ 2 檢定法，決定在低和高的TS與ERCC1表現亞組内二分患者 之最佳截止閾值。使用Pearson的最大化；^ 2檢定，評估在 二分的分子標記和對化學治療的反應之間的關連，Zar，
Biostatistical分析。Prentice-Hall，Inc Englewood Cliffs, N.J. (1974)，第59-68頁。使用風險比例計算死亡的相對危 險。Schulman，Infection Control & Hospital Epidemiology, 18:65-73, 1997。這些計算以Pike估計為基礎，使用觀察到 和預期到的事件數目，以對數-等級檢定統計量進行計算 (Pike, J R Stat Soc Series A 135:201-203，1972)。欲決定 p 值’其將被解釋為以最大化χ2分析技藝為基礎之關連的 優勢測量值，在無關連的假定下，使用1〇〇〇靴環法（bootstrap-like)模擬 來評估 最大化 ％ 2 統計量 的分布 （Haipern，
Biometrics 38:1017-1023, 1982)。將顯著水準設定為 p<0.05 ° 可用於反應和存活評估的人口統計學和患者
O:\104\104657.DOC ⑧ -42- 1327598 在本研究中總共評估50位患者，由14位（28%)女性和％ 位（72%)男性所組成，中間年齡為59(最小：34 ;最大：82) 歲。該組的種族背景包括39位白種人，ό位拉丁美洲裔，3 位亞裔和2位非裔美國人。5〇位患者均可評估以表現和 ERCC1表現程度與存活的關連。45位（9〇%)是可評估的， 藉著上文提及的基準，測試該分子參數與反應的關連。 TS表現程度和ERCC1表現程度 從顯微解剖的FPE預先處理之腫瘤試樣中分離總 mRNA ’並使用定量rt-pcR測量ERCC1 : β-肌動蛋白及/ 或TS : β-肌動蛋白的相對mRNA表現程度。從這類試樣中 分離mRNA的方法，描述在實例1中和1999年12月2〇日建檔 之美國專利申請案第09/469,338號中，全部以引用的方式 併入本文中。使用以逆轉錄/聚合酶連鎖反應（RT/PCR)為 基礎的測定系統，評估ERCC1和β_肌動蛋白的表現程度， 如同在實例2中的描述。分別按照在實例3和4中的描述， 定出修正的相對ERCC1及/或TS表現。 在所有50個進行分析的試樣中，TS基因表現是可檢測 的。中間的經過修正之TS表現，相對於基本的基因p_肌動 蛋白’是3.4 X 1〇-3(最低：〇.18 x 10-3 ;最高：u 5 X 1〇-3)，在 47個（94%)進行分析的試樣中，經過修正之ERcC1基因表 現是可檢測的。中間的經過修正之ErCC1基因表現為2 53 X 10 (最低.〇_〇〇;最南：14.61 X 1〇_3)。當藉由性別、年 齡和種族起源加以分析時，在經過修正之TS和ERCC j mRNA表現中並未發現任何顯著差異。 O:\104\104657.DOC 43 ⑧ 1327598 存活與ts表現的關係
關於50位進行分析的患者’中間的追蹤調 ! (95% C.I.: 1.8，21.2)，中間存活為 8 4個 4，12.3)。使用7.5父1〇-3之丁8閾值，43位 (86°/❶）患者具有低的修正TS表現程度，且7位（14%)患者具 有咼的修正TS表現程度。使用對數·等級檢定，評估在修 正之TS基因表現和存活之間的關連。在圖1中提供個別的 存活曲線’並顯示在低的修正TS表現組中之中間存活為 10.2個月（95% C.I.: 7.4，15_1)，且在高的修正TS表現組中 之中間存活為1.5個月（95% C.I.: 1.1，2.1) (P<〇.〇〇1;對數 等級檢定）。至於具有$75 X 1〇-3之修正TS表現的患者， 與高表現組的〇.〇〇相比較，存活6個月的或然率為〇 77。在 單變为析中（ρ<0·001，圖4)，具有>7.5 X 1〇·3之修正TS含量 的患者’與TS含量$ 7.5 X 1〇·3的患者相比較，具有8 4 (95% CI: 2.63，27.13)倍增加的死亡相對危險。 存活與ERCC1表現的關係 使用4.9 X 10 3作為閾值，40位（80%)患者具有低的修正 ERCC1表現’而10位（20%)具有高的修正ERCC1表現。圖2 展示估計之存活或然率對修正之ERCC1表現程度的Kaplan Meier作圖’並顯示低表現者組的中間存活為ι〇_2個月 (95% C.I.: 7_8，15.1)，而高表現者組為 1.9個月（95% c.I.: 1.1，4.9)(Ρ<〇.〇〇1‘；對數等級檢定）。至於修正erccI表現 S4.9 X 10·3的患者，與修正ERCC1表現>4.9 X 1〇_3之患者 的0_ 16相比較’存活6個月的或然率為〇 76。在單變分析中 O:\104\104657.DOC • 44 - 1327598 (ρ<0·001，圖4)，具有>4.9 χ 1〇-3之修正ERCC1含量的患 者，與ERCC1含量S 4.9 X 10·3的患者相比較，具有4.8 (95% CI: 2.09, 15.88)倍增加的死亡相對危險。 存活與混合之ERCC1和TS表現的關係 在36位（72%)患者中檢測到低的修正TS和ERCC1表現程 度，而有14位（28%)患者具有高的修正TS及/或ERCC1表現 程度。具有低表現程度之兩種基因的患者，具有明顯較優 異的存活。低的修正TS和ERCC 1表現者的中間存活為丨i. i 個月（95% C.I.: 8_4, 17.5)，而高的修正TS及/或ERCC1表現 者為1.9個月（95% C.I.: 1.1，4·9)(Ρ<0·001;對數等級檢定； 圖3)。兩種基因皆為低的修正表現程度之患者，與至少一 個基因TS或ERCC1為南修正表現程度之患者的〇. 1 〇相比 較，存活6個月的或然率為0.85。至少一個基因（TS或 ERCC1)具有增加之修正表現的患者，與在腫瘤中兩種基 因皆顯示低表現程度的患者相比較，死亡的相對危險為 7.12 (95% C.I·: 2.60，19·52)(Ρ<〇.〇〇ι;圖 4)。藉著統計分 析顯示，TS和ERCC1 mRNA表現是彼此獨立的（圖5)β 反應與TS和ERCC 1基因表現程度的關連 對45位可測量的患者而言， 中間的修正TS表現程度為
O:\104\104657.DOC •45· 1327598
Fisher’s精確檢定；圖9)。 對45位可測量的患者而言，中間的修正£11(；：(：1表現程度 為2.7\1〇(最低.〇〇〇,最高：1461乂1〇_3)，與全部5〇 位〜者團隊並無顯著差異。然而，Ercci表現程度與對 化學治療之反應，在統計學上沒有重大的關連（ρ=〇 29 ; Fisher's精確檢定）。 【圖式簡單說明】
圖1為顯示接受5-FU和奥沙利鉑之治療療程，並具有高 (大約7.5 X 10·3倍以上的卜肌動蛋白基因表現；n=7)和低 (大約7.5 X 10-3倍以下0的_肌動蛋白基因表現；n=43)經過 修正之TS表現程度的結直腸腺癌腫瘤之患者，其估計之存 活或然率和存活月數的圖表。 圖2為顯示接受5_FU和奧沙利銘之治療療程並具有高 (大約（9 X 1〇、以上的β-肌動蛋白基因表現；η=ι〇)和低 (大約4.9 X 10·3倍以下的p_肌動蛋白基因表現；n=4〇)經過
修正之ERCC1表現程度的結直腸腺癌腫瘤之患者，其估計 之存活或然率和存活月數的圖表。 圖3為顯示接受5刊和奧沙利麵之治療療程，並具有高 (TS表現為大約7.5 χ 1()·3倍以上的卜肌動蛋白基因表現^ 且ERCC1為大約4.9 χ 1〇·3倍以上的β·肌動蛋白基因表現； η=14Μ(Τα^Μ7·5 χ…心下的β•肌動蛋白基 因表現’且ERCCi為大約4.9 χ 1〇·3倍以下㈣肌動蛋白基 :表現^寧過修正之T_RCC1表現程度的結直腸 腺癌腫瘤之患者，其估計之存活或然率和存活月數的圖
O:\104\104657.DOC • 46 · 1327598 表。 圖4為顯示與藉著單變（univariate)分析分析之ERCC 1和 TS表現有關的奥沙利鉑/5-FU治療之結直腸癌患者存活的 表。 圖5為顯示與藉著分層（stratified)分析分析之ERCC1和TS 表現有關的奥沙利鉑/5-FU治療之結直腸癌患者存活的 表。 圖6為顯示利用5-FU和奥沙利鉑化學治療療程的結直腸 腺癌腫瘤患者之反應的圖表。將患者分類成進行性疾病 (PD)、部份的反應（PR)和穩定的疾病（SD)。具有低程度之 TS和ERCC1表現的患者具有最佳的反應。 圖7為解釋如何相對於内部對照組基因來計算ERCC 1表 現的圖表。圖表含有利用兩個受試試樣（未知物1和2)所獲 得的數據，並解釋如何決定未修正的基因表現數據 (UGE) 〇圖表亦解釋如何利用藉著前-TaqMan®技術決定之 已知的相對ERCC 1值，將藉著TaqMan®儀器產生的UGE標 準化。這可藉著將UGE乘以修正因子KERCC1而完成。在圖 中的内部對照組基因為β-肌動蛋白，且校準者RNA為人類 肝臟總^^八（8打&1&吕61^，目錄第73 5017號）。 圖8為解釋如何相對於内部對照組基因來計算TS表現的 圖表。圖表含有利用兩個受試試樣（未知物1和2)所獲得的 數攄，並解釋如何決定未修正的基因表現數據（UGE)。圖 表亦解釋如何利用先前公告的TS值，將藉著TaqMan®儀器 產生之UGE標準化。這可藉著將UGE乘以修正因子KTS而 O:\104\104657.DOC -47- 1327598
完成。在圖中的内部對照組基因為β-肌動蛋白，且校準者 RNA為萬能的PE RNA ;目錄第4307281號，批號 3617812014，得自 Applied Biosystems。 圖9為顯示結直腸癌患者對奥沙利鉑/5-FU處理之腫瘤反 應相對於TS表現的表。 O:\104\104657.DOC - 48 - ⑤ 1327598 序列一覽表 «110» Kathleen Danenberg·等人 <12〇>根據ERCCI和TS表現決定化學治療療程之方《 <130> 11220-119
<140>待指派 <141> 2001-03-09 <160> 11 <17〇> FastSEQ for Windows Version 4.0 <2X0> 1 <211> 21 <2X2> DNA <213>人造的彦列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 1 gggaatttgg cgacgcaatt c <210> 2 <2X1> 18 \2X2> DNA <213 >人造的序列 21 <220> <223>寡核铱酸引子
<400> 2 gcggaggctg aggaacga <2X0> 3 <211> 17 <212> DKA <213>人造的序列 <220> <223>寡核站酸引子 αβ <400> 3 ggcctcggtg tgccttt <210> 4 <2X1> 21 <212> BNA <2工3>人造的序列 <220> <223>寡核:y：酸引子 17 <400> 4 gatgtgcgca atcatgtacg t <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213>人造的序列
O:\104\104657.DOC ⑧ 1327598 <220» <223»寡核砮酸探針 <400> 5 csLC^QgtQCt, ct^scccagc <2Χ〇> β <211> 22 <2X2> DNA <213>人造的序列 <220> <223>寡核If酸引子
<400> € aacatcgcca gctacgccct gc <210> 7 <2XX> 18 <2X2^ DNA <213»人逡的序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 7 accaccacgg ccgagcgg 22 18 <2X0> 8 <2XX> 1β <212> DNA <213»人造的序列
<220» <223»寡核替酸探針 <400> Θ tgagcgcggc tacagctt <210» 9 <211> 22 <212> DNA <213>人造的序列 <220» <223>寡核站酸引子 <400> 9 tccttaatgt cacgcacgat tt X8 22 <210» 10 <211> 1097 <212> DNA <213>人頦 <400» 10 aagtgctgcg agccctgggc cacgctggcc gtgctggcag tgggccgcct cgatccctct 60 gcagtctttc ccttgaggct ccaagaccag caggtgaggc ctcgcggcgc tgaaaccgtg 120 aggcccggac caeaggetcc «gatggaccc tgggaaggac aaagaggggg tgccccagcc 180 ctcagggccg ccagcaagga agaaatttgt gatacccctc gacgaggatg aggtecctcc 240 tgga^tggcc aagcccttat tccgatctae acagagcctt cccactgtgg ac«cctcggc 300 ccaggcggcc cctcagaccc acgccgaata tgccatctca cagcctctgg aaggggctgg 360 ggccacgtgc cccacagggt cagagcccct ggcaggagag acgcccaacc aggccetgaa 420 acccgs99ca aaatccaaca gcatcautgt gagccc^cgg c&s^ggsgca «tcccgtact 480 gaa9ttcgt9 cgcaatgugc cctgggaatt tggcgacgta attccegact atgtgctggg 540 ccagagcacc tgtgccccgt tcctcagcct ccgctaccac aacctgcacc cagact&cat 600
O:\104\104657.DOC ⑧ 1327598 ccatgggcgg ctgcagagcc tggggaagaa cttcgccttg cgggtcctgc ttgtccaggt 660 ggatgtgaaa gatccccagc aggccctcaa ggagctggct aagatgtgta tcctggccga 720 ctgcacattg at^cctcgcct ggagccccga ggaagctggg cggtacctg? agacctacaa 780 ggcctatgag cagaaaccag cggacctcct gatggagaag ctagagcagg acttcgtctc 640 ccgggtgact gaatgtctga ccaccgtgaa gtcagtcaac aaaacggaca gtcagaccct 900 cctgaccaca tttgg&tctc tggaacagct catcgccgca tcaagagaag atctggccee 960 atgccc&ggc ctgggcccCc «9今aagcccg gaggctgttt gatgtcctgc acgagccctt 1020 cttgaaagta ccctgatgac cccagctgcc aaggaaaccc ccagtgtaat aataaatcgt 1080 cctcccaggc caggctc 1097 <210> 11 <211> 1536 <212> DNA <213>人類
<400> XI
9939999999 99&ccacttg gcctgcctcc gtcccgccgc gccacttggc ctgcctccgt 60 cccgccgcgc cacttcgcct gcctccgtcc cccgcccgcc gcgccatgcc tgtggccggc 3>20 tcggagctgc cgcgccggcc ctcgcccccc gccgcacagg agcgggacgc cgagccgcgt 1Θ0 ccgccgcacs gggagctgca gtacctgggg cagatccaac acatcccccg ctgcggcgtc 240 jiggaaggacg accgcacggg caccggcacc c^gtcggtat tcggcatgca ggcgcgctac 300 A9cctga9a9 atgaattccc tctgctgaca accaaacgtg tgttctggaa gggtgttttg 360 gaggagttgc tgtggtttat caagggatcc acaaatgcta aagagctgcc ttccaaggga 420 gtgaaaatct gggatgccaa tggatcccga gactttttgg acagcctggg attctccacc 480 agagaagaag gggacttggg cecagtttat ggcttccagt ggaggcattt tggggcagaa 540 tacagagata tggaatcaga ttattcagga cagggagttg accaactgca aagagtgatt 600 gacaccatca aaaccaaccc tgacgacaga Agaatcatca tgtgcgcttg gaaliccaaga 660 gatcttcetc tgatggcgct gcctccatgc catgccctct gccagttcta tgtggtgaac 720 agtgagctgt cctgccagct gtaccagaga tcgggagaca tgggcctcgg tgtgcctttc 780 aacatcgcca gctacgcccc gctcacgtac atgattgcgc acatcacggg cctgaagcca 040 ggtgacttta tacacacttt gggagatgca catatttacc tgaaccacat cgagccactg 900 aaaattcagc ttcagcgaga acceagacct ttcccaaagc tcaggattct tcgtfaaagtt 960 gagaaaattg atgacttcaa agctgaagac tttcagattg aagggtacaa tccgcuecca 1020 actattaaaa tggaaatggc tgtttagggt gctttcaaag gagcctgaag gatatcgtca 1080 gtctttaggg gttgggctgg atgccgaggt aaaagttctt tttgctctaa aagaaaaagg 1140 aactaggtca aaaatctgtc cgtgacctat cagttattaa tttttaagga tgttgccact 1200 ggcaaatgca actgtgccag ttccttccat aataaaaggc tttgagttaa ctcactgagg 1260 gtatctgaca atgctgaggt tatgaacaaa gtgaggagaa tgaaatgtat gtgctcttag 1320 caaaaacatg tatgtgcatt tcaatcccac gtacttataa agaaggttgg tgaatttcac 13Θ0 aagctatctt tggaacattc ctagaatatt ttaagaattt eaeaagctat tccctcaaat 1440 ctgagggagc tgagtaacac catcgatcat gatgtagagt gtggttatga actttatagt 1500 tgttttatat gttgctataa taaagaagtg ttctgc 153β >
O:\104\104657.DOC ⑤

Claims (1)

  1. ^095115425號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(99年2月 十、申請專利範圍：
    曰修(更)正本 么、告太 1 · 一種決定包括5-氟尿嘧啶、奥沙利鉑或其組合之化學治 療療程在患者中用來治療腫瘤的方法，其包括： (a) 從經過固定石臘包埋的腫瘤試樣中分離mRNA ; (b) 使用： (i) 在嚴格條件下，與切除修補交叉-互補（ERCC1) 基因之區域雜交的寡核苷酸引子對，或 (ii) 在嚴格條件下，與胸苷酸合成酶（TS)基因之區 域雜交的寡核甞酸引子對， 使該mRNA經歷擴大作用，獲得ERCC1或TS擴大試 樣， (c) 測量在經過擴大之試樣中TS或ERCC 1 mRNA的含 量； (d) 將得自步驟（c)之TS或ERCC1 mRNA的含量與内部對 照組基因之mRNA的含量相比較；並 (e) 以在經過擴大之試樣中TS及/或ERCC1 mRNA的含 量，以及以TS及/或ERCC1基因表現的預定閾值為基 礎，決定該化學治療療程。 2. 一種決定包括5-氟尿嘧啶、奥沙利鉑或其組合之化學治 療療程在患者中用來治療腫瘤的方法，其包括： (a) 從經過固定石臘包埋的腫瘤試樣中分離mRNA ; (b) 使用在嚴格條件下，與切除修補交叉-互補（ERCC1)基 因之區域雜交的寡核苷酸引子對，使該mRNA經歷 擴大作用，獲得經過擴大的試樣； 104657-990206.doc 1327598 (c) 測量在經過擴大之試樣中ERCCl mRNA的含量； (d) 將得自步驟（c)之ERCC1 mRNA的含量與内部對照組 基因之mRNA的含量相比較；並 (e) 以在經過擴大之試樣中ERCCl mRNA的含量，以及 以ERCC1基因表現的預定閾值為基礎，決定該化學 治療療程。 3. 一種決定包括5 -氟尿°密α定、奥沙利始或其組合之化學治 療療程在患者中用來治療腫瘤的方法，其包括： (a) 從經過固定石臘包埋的腫瘤試樣中分離mRNA ; φ (b) 使用在嚴格條件下，與胸甞酸合成酶（TS)基因之區 域雜交的寡核苷酸引子對，使該mRNA經歷擴大作 用，獲得經過擴大的試樣； (c) 測量在經過擴大之試樣中TS mRNA的含量； (d) 將得自步驟（c)之TS mRNA的含量與内部對照組基因 之mRNA的含量相比較；並 (e) 以在經過擴大之試樣中TS mRNA的含量，以及以TS 基因表現的預定閾值為基礎，決定該化學治療療 籲 程。 4. 一種決定包括5-氟尿嘧啶、奥沙利鉑或其組合之化學治 療療程在患者中用來治療腫瘤的方法，其包括： (a) 從經過固定石臘包埋的腫瘤試樣中分離mRNA ; (b) 使用： (i)在嚴格條件下，與切除修補交叉-互補（ERCCl) 基因之區域雜交的寡核苷酸引子對，及 104657-990206.doc 1327598 (η)在嚴格條件下’與胸苷酸合成酶（TS)基因之區 域雜交的寡核苷酸引子對， 使該mRNA經歷擴大作用，獲得ErCC1*ts擴大試 樣； (c) /則量在經過擴大之試樣中ts*ercci mRNA的含 量； (d) 將得自步驟（c)之T^〇ERCC1 mRNA的含量與内部對 照組基因之含量相比較；並 (e) 以在經過擴大之試樣中以及/或ercci mRNA的含 量’以及以TS及/或ERCC1基因表現的預定閾值為基 礎’決定該化學治療療程。 5. 根據申請專利範圍第1、2、3或4項中任一項之方法，其 中用於擴大該ERCC1基因之區域的該寡核奋酸引子對係 由具有SEQ ID NO: 1之序列或與其至少有8〇%相同之 序列的寡核苷酸，及具有SEQ ID N〇: 2之序列或與其 至少有8 0 %相同之序列的寡核苷酸所組成。 6. 根據申請專利範圍第丨、3或4項中任一項之方法，其中 用於擴大該TS基因之區域的該募核芬酸引子對係由具有 SEQ ID NO: 3之序歹或與其至少有8〇%相同之序列的 寡核嘗酸，及具有SEQ ID N〇: 4之序列或與其至少有 80%相同之序列的寡核：y：酸所組成。 7. 根據申請專利範圍第⑴項中任一項之方法，其中㈣ 瘤為結直腸腺癌腫瘤。 8. 根據申請專利範圍第丨至4項中任一項之方法，其中該内 104657-990206.doc 丄JZ/jyo 部對照組基因為β-肌動蛋白基因 9. ’其中該ERCC1基因表 因表現程度的4.9χ1〇_3 根據申請專利範圍第8項之方法 現之預定閾值約為Pi動蛋Μ 倍。 Α 10. 根據申明專利範圍第8項之方法’其中該TS基因表現之 預定閨值約為卜肌動蛋白基因表現程度的7,5χ1(Γ3倍。 104657-990206.doc
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