KR20030081339A - Ｅｒｃｃ１ 및 ｔｓ 발현을 기초로 한 화학요법 섭생을결정하는 방법 - Google Patents
Ｅｒｃｃ１ 및 ｔｓ 발현을 기초로 한 화학요법 섭생을결정하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 의료 분야, 특히 암 화학요법에 유용한 예후 방법에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 고정된 조직 또는 고정되고 파라핀 포매된 조직 내의 TS 발현 수준 및/또는ERCC1발현 수준을 평가하는 방법 및 환자의 종양 세포내 TS 및/또는ERCC1mRNA의 양을 검사하고 이 양을 이들 유전자에 대한 소정의 역치 발현 수준과 비교함으로써 5-FU 및 옥살리플라틴계 요법으로 처리하는 환자 종양의 예상되는 내성을 예측하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍ERCC1및 TS를 제공하고,ERCC1및 TS mRNA를 각각 검출하기 위해서 상기 프라이머를 사용하는 방법을 제공한다.
Description
정상 세포가 신생물 형질전환을 겪으면 악성 세포로 될 때 암은 발생한다. 형질전환된(악성) 세포는 세포 표현형을 지정하고 세포 증식을 저지하는 정상적인 생리학적 조절에서 벗어난다. 이로써 개체의 체내에 있는 형질전환된 세포는 증식하여 종양을 형성한다. 종양이 발견될 때 임상적 목표는 치료를 받고 있는 개체에 있어 정상 세포에 가해지는 임의의 손상을 완화시키면서 악성 세포를 선택적으로 파괴시키는 데 있다.
화학요법은 암 세포에 선택적으로 독성을 나타내는(세포 독성인) 약물을 사용하는 것을 기초로 한다. 핵산 합성, 단백질 합성 및 그 밖의 필수적인 대사 과정을 방해하는 약물을 비롯하여 몇가지 일반적 부류의 화학요법 약물이 개발되었다. 이것은 일반적으로 대사길항물질 약물이라 칭한다. 다른 부류의 화학요법 약물은 세포 DNA에 손상을 준다. 이러한 부류의 약물은 일반적으로 유전자독성 약물이라 칭한다.
그러나, 소정의 화학요법 약물 또는 약물의 병용에 대한 개별 신생물의 감수성은 치료의 시험 기간 후에만 정확히 평가할 수 있다. 성공적이지 못한 시험 기간에 투자된 시간은 공격적 악성 종양의 임상적 치료에 심각한 위험 부담을 주게 된다.
세포 DNA에 가해진 손상을 수복하는 것은 세포의 효소적 DNA 수복 세포소기관에 의해 이루어지는 중요한 생물학적 과정이다. 세포 게놈에서 수복되지 않은 손상 부위는 DNA 복제를 방해하고, 새로 합성된 DNA의 복제 충실도를 악화시키고/악화시키거나 세포 생존에 필요한 유전자의 발현을 방해할 수 있다. 따라서, 유전자독성 약물은 일반적으로 정지한 비분열 세포보다는 DNA 합성에 관여하는 활발한 분열 세포에 대해 독성이 더 큰 것으로 생각된다. 그러나, 많은 신체 조직의 정상 세포는 정지 상태에 있으며, 드물게는 세포 주기에 재진입하여 분열하기도 한다. 일반적으로 세포 분열 순환 사이의 보다 긴 시간은 일반적으로 화학요법 유전자독성에 의해 손상된 정상 세포내 DNA 손상의 수복을 위해 부여된다. 그 결과 암 세포를 치사시키기 위한 어느 정도의 선택성이 얻어진다. 다수의 치료법 섭생은 이러한 일반적 부류들 중 2 이상 부류에 속하는 화학요법 약물을 동시 투여함으로써 암 세포에 대한 선택성을 개선시키기 위한 시도를 반영한다.
고형 종양에서의 효과적인 화학요법은 제제의 병용을 요하는 경우가 많기 때문에, 각각의 단일 약물에 대한 내성 또는 감수성의 결정인자를 확인하고 정량하는 것이 개별적인 병용 화학요법을 설계하기 위한 중요한 도구가 되었다.
세포 DNA를 손상시키는 것으로 확인된 널리 사용되고 있는 유전자독성 항암 약물로는 시스플라틴(DDP)과 카르보플라틴이 있다. 시스플라틴 및/또는 카르보플라틴은 현재, 호흡관, 위장관 및 생식관의 암종 및 육종, 중추신경계의 암종과 육종, 그리고 머리 및 목의 편평상피세포 기원의 암종 및 육종을 비롯하여, 상피 및 간엽 기원의 선택된 다양한 신생물의 치료에 사용되고 있다. 시스플라틴을 다른 약물과 함께 병용하는 것은 현재 고환암의 치료에 바람직하며, 많은 실예에서 지속적인 완화 효과를 발휘한다(Loehrer 등, 1984, 100, Ann. Int. Med. 704). 시스플라틴(DDP)은 가닥내 부가물(adduct)의 형성을 통해 DNA 구조를 파괴한다. DDP와 같은 백금 제제에 대한 내성은 백금 부가물에 대한 강화된 내성, 증가된 약물 축적 또는 강화된 DNA 수복에 기인되었다.
1,2-디아미노시클로헥산 고리를 보유하는 또 다른 백금계 화학요법 제제인 옥살리플라틴은 시험관내와 생체내에서 항종양 효능을 나타내었다. 이러한 부피가 큰 담체 기가 백금-DNA 부가물을 유도할 것으로 생각되며, 이 백금-DNA 부가물은 다른 백금 제제로부터 형성된 부가물보다 세포 독성이 더 크고 DNA 복제를 방해하는 데 효과가 더 크다. 최근의 데이터에 의하면, 비일치(mismatch) 수복 시스템(MMR)의 결함뿐 아니라 DNA 손상 부위를 지나서 DNA를 합성하는 복제 복합체의 증가된 성능(강화된 복제 바이패스)은 시스플라틴에 대한 내성을 유발하지만,옥살리플라틴에 대한 내성을 유발하지 않는 것으로 나타났다(Raymond 등, Semin Oncol 25, Suppl 5:4-12, 1998).
백금 제제에 의해 형성된 것과 같은 부피가 큰 DNA 부가물의 절제 수복은 DNA 손상 인식 및 절제에 관여하는 유전자에 의해 매개되는 것으로 보인다(Cleaver 등, Carcinogenesis 11:875-883(1990); Hoeijmakers 등, Cancer Cells 2:311-320(1990); Shivji 등, Cell 69:367-374(1992)). 실제로, 효소적 DNA 수복 세포소기관 중 하나 이상의 구성요소에 있어 유전적 결함이 있는 세포는 시스플라틴에 매우 민감하다(Fraval 등(1978), 51 Mutat. Res. 121, Beck and Brubaker(1973), 116 J. Bacteriol 1247).
절제 수복 상호 보완(Excision Repair Cross-Complementing;ERCC1) 유전자는 DNA 부가물의 수복에 있어서 필수적이다. 인간ERCC1유전자는 클로닝되었다(Westerveld 등, Nature(London) 310:425-428(1984); Tanaka 등, Nature 348:73-76(1990); 기탁 번호 XM_009432, 서열 번호: 10으로 표시하여 본 명세서에 참고 인용함). 이러한 유전자에서 결함이 있는 돌연변이 인간 및 햄스터 세포주를 사용한 몇몇 연구와 인간 종양 조직에서의 연구에 의하면,ERCC1에 의해 암호화된 생성물은 백금-DNA 부가물의 절제 수복에 관여하는 것으로 확인된다(Dabholkar 등, J. Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517(1992); Dijt 등, Cancer Res. 48:6058-6062(1988); Hansson 등, Nucleic Acids Res. 18:35-40(1990)).
ERCC1가 DNA-수복 결함 CHO 세포로 형질감염된 경우,ERCC1은 백금-DNA 부가물을 수복할 수 있는 성능에 의해 백금계 화학요법에 대한 세포 내성을 부여한다 (Hansson 등, Nucleic Acids Res. 18:35-40(1990)). 현재 용인되고 있는 절제 수복 모델은 손상 인식/절제 단계가 절제 수복 과정의 속도 결정 단계임을 제시한다.
백금계 요법을 치료받고 있는 암 환자의 악성 세포에서ERCC1과 같은 절제 수복 유전자의 상대적 발현 수준을 조사하였다(Dabholkar 등, J. Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517(1992)). 위암 환자에서의ERCC1과발현은 백금계 및 대사길항물질계 화학요법 섭생(시스플라틴/플루오로우라실)으로 치료할 때 종양 반응과 최종 생존율에 부정적인 영향을 주는 것으로 보고되었다(Metzger 등, J. Clin. Oncol. 16:309, 1998). 따라서, 종양내의ERCC1발현 수준은, 백금계 화학요법을 단독으로 이용하는 것과, 이를 대사길항물질계 화학요법과 병용하는 것 중 어느 것이 암 환자의 치료에 효과적인 지를 결정하는 데 있어서 주된 예후 요인이 될 수 있다.
대사길항물질 세포 독성 화학요법 화합물에는 핵산 합성, 단백질 합성, 및 그밖의 필수적인 대사 과정을 방해하는 약물이 포함된다. 예를 들어, 5-플루오로우라실(5-FU)은 위장관암 및 유방암과 같은 주요 암을 비롯하여 많은 상이한 유형의 암 치료에 매우 널리 사용되는 약물이다(Moertel, C.G. New Engl. J. Med., 330:1136-1142, 1994). 단일 제제로서 5-FU가 40년 이상 동안 결장직장암의 표준적인 1차적 요법이었으나, 최근에는 5-FU와 CPT-11을 병용하는 것이 진보된 결장직장암의 대안적인 1차적 요법으로서 도입되었다(Saltz 등, Irinotecan Study Group. New England Journal of Medicine 343:905-14, 2000). 5-FU와 옥살리플라틴의 병용은 결장직장암에서 높은 반응 속도를 생성하였다(Raymond 등, Semin. Oncol., 25:4-12, 1998). 그러므로, 5-FU는 여전히 현행 화학요법 섭생의 중심적인 성분으로 유지되고 있기 때문에 앞으로 수년간은 암 치료에 사용될 것으로 보인다. 게다가, CRT-11 또는 옥살리플라틴과의 병용 요법이 과도한 독성을 나타낼 가능성이 있는 환자에 대해서는 단일 제제의 5-FU 요법이 계속 이용될 것이다.
5-FU는 환자 중 소수만이 요법에 유리한 반응을 경험한다는 점에서 대부분의 항암 약물의 전형을 보인다. 대규모의 무작위적인 임상 시험에 의하면, 전이성 결장직장암 환자를 위한 단일 약제로서 사용한 5-FU에 대한 종양의 전체 반응 속도는 15∼20% 범위인 것으로 나타났다(Moertel, C.G. 등, New Engl. J. Med., 330:1136-1142, 1994). 전술한 다른 화학요법 제제와 병용할 경우 5-FU계 섭생에 대한 종양 반응 속도는 약 40%로 증가하였다. 그럼에도 불구하고, 치료된 환자의 대부분은 5-FU계 화학요법을 치료받는 것으로부터 확실한 이익을 얻지 못하고, 심각한 위험, 불쾌감 및 비용 문제를 겪게 된다. 치료 전에 개체내 종양의 반응성을 예측하는 신뢰할만한 수단이 없기 때문에, 대부분이 불만족스러운 결과를 얻는다는 것을 충분히 인식하면서도 표준 임상 실시 과정은 모든 환자에게 5-FU계 치료를 행하여 왔다.
수년에 걸쳐 5-FU의 작용 메카니즘과 대사 경로에 대한 연구가 집중적으로 이루어져 약물의 항암 활성의 가장 중요한 생화학적 결정인자를 확인하게 되었다. 궁극적인 목적은 (a) 세포내 대사 및 생화학 작용을 조절하고, (b) 요법을 행하기 전에 환자가 약물에 대해 어떠한 반응을 나타낼 지(또는 나타내지 않을 지)를 예측하기 위해 환자의 종양 내의 반응 결정인자를 측정함으로써 5-FU의 임상적 효능을 개선시키는 것이었다.
5-FU계 요법에 대한 종양 반응 예측 분야에 있어서의 최초 연구는 결장직장암에 존재하는 5-FU의 표적 효소인 티미딜레이트 신타제(TS)에 집중되었다(Kaneda 등, J. Biol. Chem. 265(33), 20277-20284(1990); 기탁 번호 NM_001071, 본 명세서에서 서열 번호: 1로 참고 인용함). 문헌[Leichman 등, J. Clin. Oncol., 15:3223-3229, 1997]은 결장직장암으로부터 취한 치료전 생검에서 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이TS유전자 발현과 5-FU에 대한 종양 반응을 서로 연관시키기 위한 예후적 임상 시험을 수행하였다. 이 연구에 의하면, (1) 이들 종양에서는TS유전자 발현 수준이 50배 정도로 크다는 것, 및 (2) 반응성 종양과 비반응성 종양간에TS유전자 발현 수준이 현저하게 큰 차이를 보인다는 것을 알게 되었다. 반응성 군의TS발현 범위(0.5∼4.1 x 10-3, 내부 대조예과 비교)는 비반응성 군의TS발현 범위(1.6∼23.0 x 10-3, 내부 대조예과 비교)보다 더 좁았다. 이 연구자들은 형성되는 "비반응성 컷오프" 역치인TS발현 수준을 측정하였으며, 이 값을 초과하는 사람은 비반응자뿐이었다. 따라서, 이러한 "비반응성 컷오프" 역치 이상으로TS를 발현하는 환자는 요법 수행 전에 비반응자로서 양성적인 것으로 확인될 수 있었다. "비반응성" 분류는 <50% 종양 수축을 나타내는 모든 요법 반응, >25% 종양 증가를 유도하는 점진적인 성장 및 <50% 수축, 무변화 또는 <25% 증가를 나타내는 비진행성 종양을 포함하였다. 이들 종양은 최고의TS발현 수준을 나타내었다. 따라서,높은TS발현은 특별한 내성 종양인 것으로 확인된다. 특정한 역치 이상의TS발현 수준으로는 5-FU에 반응하지 않는 종양 부분집단이 확인되는 한편, 이 역치보다 낮은TS발현 수준으로는 현저히 더 높은 반응 속도가 예측된다.
흥미롭게도, Papamichael 등은 옥살리플라틴이 병용 치료에서 5-FU에 대한 동화작용 경로를 강화시킨다는 사실을 발견하였다(Br. J. Cancer, 78(Suppl. 2), 98p. 12, 1998; Oncologist 1999; 4(6):478-87). 이는 5-FU 및 옥살리플라틴 병용 화학요법의 암 치료에 있어서의 효능을 입증할 수 있다. 게다가, 5-FU계 및 백금계 화학요법은, 각각TS및ERCC1발현 수준에 좌우되는 것으로 알려져 있기 때문에, 5-FU계 및 백금계 화학요법을 예측하기 위해 환자에서 취한 종양 조직 샘플로부터ERCC1발현 및TS발현을 정확하게 측정하는 것이 특히 중요하다.
대부분의 환자에서 취한 병리 샘플은 통상적으로 조직학적 분석과 후속 기록 보관을 허용하기 위해 고정되고 파라핀 포매된다(FPE). 따라서, 대부분의 생검 조직 샘플은 유전자 발현의 분석에 사용될 수 없는데, 왜냐하면 그러한 연구는 유전자 발현의 정확한 측정이 이루어질 수 있도록 RNA의 높은 완전성을 필요로 하기 때문이다. 현재 유전자 발현 수준은 단백질 발현 수준을 모니터하기 위한 면역조직화학적 염색을 이용함으로써 그러한 고정되고 포매된 샘플 내에서 정성적으로만 모니터할 수 있다.
지금까지,ERCC1및TS발현의 연구를 비롯하여 정량적 유전자 발현 연구는 신선한 조직 또는 동결된 조직으로부터 얻은 RNA의 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 증폭에 국한되었다. 미국 특허 제5,705,336호(Reed 등)에는 난소 종양조직에서 얻은ERCC1mRNA를 정량하고, 이 조직이 백금계 화학요법에 민감한 지를 결정하는 방법이 개시되어 있다. Leichman 등의 문헌에서와 같이 마찬가지로 Reed 등의 문헌에서도 동결된 종양 생검으로부터 mRNA를 정량한다.
Leichman 등의 문헌과 Reed 등의 문헌에 설명된 바와 같이, 의료 전문가가 동결된 조직을 사용하는 데에는 큰 불편함이 있다. 임의의 RNA계 정량 유전자 마커 측정검사를 계획할 때에는 조직 및 후속 mRNA 분해를 막기 위해 생검을 신속하게 옮기는 것이 주된 문제이다. 생검을 실시하는 의료 전문가는, 조직 샘플을 받자마자 바로 RNA 추출 프로토콜을 수행할 수 있는 설비가 갖추어진 시설로 그 조직을 급히 옮겨야 한다. 이러한 시설을 이용할 수 없다면, 임상의는 mRNA 분해를 막기 위해 샘플을 재빨리 동결시켜야 한다. 진단 시설에서 조직 및 RNA가 분해되기 전에 유용한 RNA 추출 프로토콜을 수행하기 위해서는, 멀리 떨어져 있을 수도 있는 진단 시설에 조직 샘플이 도달할 때까지 이를 동결된 상태로 유지하여야 한다. 액체 질소 및 드라이 아이스가 채워진 특수한 이동 수단을 사용하여 운송 중에 동결된 조직의 완전성을 유지하는 데만도 많은 비용이 든다.
통상적인 생검은 일반적으로 기질 조직과 종양 조직의 이종 혼합물을 포함한다. 신선한 조직이나 동결된 조직과는 달리 FPE 생검 조직 샘플은 쉽게 현미 해부되어 기질 조직과 종양 조직으로 단리되며, 따라서 신선한 조직 또는 동결된 조직을 사용하는 것 이상으로 이점을 제공한다. 그러나, 고정된 조직, 특히 고정되고 파라핀 포매된 조직으로부터 RNA를 단리하는 것은 고도로 분해된 RNA를 생성시키는데, 이러한 RNA는 일반적으로 유전자 발현 연구에 적용할 수 없는 것으로 생각된다.
생물학적 샘플로부터 RNA를 정제하기 위한 기법은 이미 다수가 있지만, 그 어느 것도 FPE 샘플로부터 RNA를 단리하기에는 적절치 않다. 예를 들어, Chomczynski(미국 특허 제5,346,994호)에는 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트를 사용한 액체상 분리를 기초로 하여 조직으로부터 RNA를 정제하는 방법이 기술되어 있다. 생물학적 샘플은 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트의 수용액 중에서 균질화시키고, 이후에는 이 균질물을 클로로포름과 혼합한다. 이를 원심분리한 후, 균질물은 유기상, 중간상 및 수상으로 분리한다. 단백질은 유기상에 모이고, DNA는 중간상에 모이며, RNA는 수상에 모인다. RNA는 수상으로부터 침전시킬 수 있다. 그러나, 유감스럽게도 이 방법은 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 조직 샘플에는 적용될 수 없다.
RNA를 단리하기 위한 다른 공지된 기법은, 예를 들어 문헌[Sambrook, J 등, 1989, pp. 7.3-7.24] 및 문헌[Ausubel, F.M. 등, 1994, pp. 4.0.3-4.4.7]에 기술되어 있는 바와 같이, 전형적으로 구아니딘 염 또는 페놀 추출을 이용한다. 마찬가지로, 공지된 방법 중 어떠한 것도 파라핀 포매된 조직 샘플로부터 RNA를 단리하는 데 있어서 재현 가능한 정량적 결과를 제공하지 못한다.
따라서, 파라핀 포매된 조직으로부터 RNA를 단리하기 위한 기법은 종양 조직에서의 유전자 발현 연구에 특히 필요한데, 왜냐하면 특정 수용체 또는 효소의 발현 수준이 특정 치료의 성공 가능성을 결정하는 데 이용될 수 있기 때문이다.
옥살리플라틴의 내성 또는 민감성에 대한 분자적 예측 마커는 현재까지 결정하지 않고 있다. 옥살리플라틴/5-FU계 요법의 성공 가능성을 결정하기 위해서는 이러한 마커가 필요하다. 본 발명자들은 본 출원에서 절제 수복 유전자인ERCC1의 종양내 mRNA 발현과 티미딜레이트 신타제 유전자(TS)의 종양내 mRNA 발현 두가지와 5-FU/옥살리플라틴 병용 화학요법을 받고 있는 종양 환자에서의 임상적 결과에 대하여 유의적인 역의 상관관계가 있음을 보고한다.
따라서, 본 발명의 목적은 제안된 유전자독성 암 요법에 대한 조기 예후를 제공하기 위해 종양 조직으로부터ERCC1및/또는TSmRNA를 정량하는 방법을 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 목적은 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 조직에서ERCC1및/또는TS수준을 평가하는 방법 및 환자의 종양 세포내의ERCC1및/또는TSmRNA의 양을 조사하고, 상기 양을 소정의 역치 발현 수준과 비교함으로써 5-FU 및 옥살리플라틴을 사용한 치료에 대한 환자 종양의 가능한 내성을 예측하기 위한 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 의료 분야, 특히 암 화학요법에 유용한 예후 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 환자에 있어 종양 세포 유전자 발현의 평가에 관한 것이다. 세포 독성 화학요법 제제, 특히 대사길항물질 및 백금화 제제의 방식으로 DNA를 손상시키는 제제에 대한 종양 세포의 내성은 인간에 있어 뉴클레오티드 합성 및 DNA 수복에 관여하는 유전자로부터 발현된 mRNA를 조사함으로써 측정검사된다.
도 1은 5-FU 및 옥살리플라틴 요법 섭생을 치료받아 높은(약 7.5 ×10-3배 이상의 β-악틴 유전자 발현; n = 7) 보정된TS발현 수준과 낮은(약 7.5 ×10-3배 미만의 β-악틴 유전자 발현; n = 43) 보정된TS발현 수준으로 환자를 유지하는 결장직장 선암 종양의 생존 개월 수 및 평가된 생존 확률을 나타내는 그래프이다.
도 2는 5-FU 및 옥살리플라틴 요법 섭생을 치료받아 높은(약 4.9 ×10-3배 이상의 β-악틴 유전자 발현; n = 10) 보정된ERCC1발현 수준과 낮은(약 4.9 ×10-3배 미만의 β-악틴 유전자 발현; n = 40) 보정된ERCC1발현 수준으로 환자를 유지하는 결장직장 선암 종양의 생존 개월 수 및 평가된 생존 확률을 나타내는 그래프이다.
도 3은 5-FU 및 옥살리플라틴 요법 섭생을 치료받아 높은(TS발현 약 7.5 ×10-3배 이상의 β-악틴 유전자 발현 및ERCC1약 4.9 ×10-3배 이상의 β-악틴 유전자 발현; n = 14) 보정된TS및ERCC1발현 수준과 낮은(TS발현 약 7.5 ×10-3배 미만의 β-악틴 유전자 발현 및ERCC1약 4.9 ×10-3배 미만의 β-악틴 유전자 발현; n = 36) 보정된TS및ERCC1발현 수준으로 환자를 유지하는 결장직장 선암 종양의 생존 개월 수 및 평가된 생존 확률을 나타내는 그래프이다.
도 4는 단일변량(univariate) 분석에 의해 분석된ERCC1및TS발현에 상대적인 옥살리플라틴/5-FU 치료된 결장직장 암 환자의 생존을 나타내는 표이다.
도 5는 층화(stratified) 분석에 의해 분석된ERCC1및TS발현에 상대적인 옥살리플라틴/5-FU 처리된 결장직장 암 환자의 생존을 나타내는 표이다.
도 6은ERCC1및TS발현에 관하여 5-FU 및 옥살리플라틴 화학요법 섭생으로 처리된 환자를 유지하는 결장직장 선암 종양의 반응을 나타내는 그래프이다. 환자는 진행하는 질병(PD)을 지닌 환자, 부분적인 반응(PR)을 지닌 환자 및 안정한 반응(SD)을 지닌 환자로 분류한다.TS및ERCC1발현 수준이 모두 낮은 환자는 가장 최적의 반응을 나타낸다.
도 7은 내부 대조 유전자에 상대적인 ERCC1 발현을 계산하는 방법을 예시하는 차트이다. 상기 차트는 2가지 시험 샘플(미지 샘플 1 및 2)에 의해 얻어지는 데이타를 함유하고, 미보정된 유전자 발현 데이타(UGE)를 측정하는 방법을 예시하고 있다. 또한, 상기 차트는 TaqMan(등록상표) 기구에 의해 발생된 UGE를 TaqMan(등록상표) 기법에 의해 측정되는 공지된 상대적ERCC1값으로 표준화시키는 방법을 예시하고 있다. 이것은 UGE를 보정 인자 K ERCC1 에 곱함으로써 달성된다. 도형에서 내부 대조 유전자는 β-악틴이고, 보정기 RNA는 Human Liver Total RNA(Stratagene, Cat.#735017)이다.
도 8은 내부 대조 유전자에 상대적인TS발현을 계산하는 방법을 예시하는 차트이다. 상기 차트는 2가지 시험 샘플(미지 샘플 1 및 2)에 의해 얻어지는 테이타를 함유하고, 미보정된 유전자 발현 테이타(UGE)를 측정하는 방법을 예시하고 있다. 또한, 상기 차트는 TaqMan(등록상표) 기구에 의해 발생된 UGE를 기존 공개된TS값으로 표준화시키는 방법을 예시하고 있다. 이것은 UGE를 보정 인자 K TS 에 곱함으로써 달성된다. 도형에서 내부 대조 유전자는 β-악틴이고, 보정기 RNA는 어플라이드 바이오시스템즈로부터 시판되고 있는 Universal PE RNA; Cat #4307281, lot #3617812014이다.
도 9는TS발현에 관한 옥살리플라틴/5-FU에 대한 결장직장 암 환자의 종양 반응을 나타내는 표이다.
발명에 관한 상세한 설명
본 발명은 부분적으로TS및ERCC1mRNA의 양이 각기 5-FU 및 옥살리플라틴 제제에 대한 내성과 상관있다는 발견에 관한 것이다. 고 수준의TS및/또는ERCC1mRNA를 발현하는 종양은 백금계 화학요법에 대한 내성이 생기기 쉬운 것으로 고려된다. 역으로, 이러한 저 양의TS및ERCC1mRNA를 발현하는 종양은 백금계 화학요법에 대해 민감성이 되기 쉽다. 환자의 종양TS및ERCC1mRNA 발현 상태는 그것을 소정의 역치 발현 수준과 비교함으로써 판단된다.
본 발명은 내부 대조의 유전자 발현에 상대적인 고정되거나 또는 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 조직 내TS및/또는ERCC1mRNA 발현의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 고정되거나 또는 고정되고 포매된 조직 내TS및ERCC1유전자 발현의 정확한 평가를 할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 개발하였다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머, ERCC1-504F(서열 번호: 1), ERCC1-574R(서열 번호: 2) 또는 이들과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 종양 샘플로부터 추출한 RNA와 함께 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 종양 샘플로부터 추출한 RNA와 함께 사용하는 것이 바람직한 올리고뉴클레오티드 프라이머, TS-763F(서열 번호: 3), TS-825R(서열 번호: 4) 또는 이들과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공한다. 따라서,TS및/또는ERCC1유전자 발현의 이러한 측정은 백금계 화학요법의 예후에 사용할 수 있다.
본 발명의 이러한 실시양태는 첫째로, FPE 샘플로부터의 신뢰성 있는 RNA 추출 벙법 및 둘째로, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하기 위하여 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 ERCC1-504F(서열 번호: 1) 및 ERCC1-574R(서열 번호: 2), 또는 이들과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 샘플 내ERCC1mRNA 함량을 측정하는 방법을 수반한다.
본 명세서에서 사용되는 핵산 문맥에서 "실질적으로 동일한"이란, 엄격한 조건 하에서 표적에 대한 하이브리드화를 의미하며, 또한 핵산 세그먼트 또는 그것의 상보 가닥을 비교하였을 때, 뉴클레오티드의 약 60% 이상, 통상적으로는 약 70% 이상, 보다 통상적으로는 약 80% 이상, 일반적으로 뉴클레오티드의 약 90% 이상 보다 일반적으로 약 95 내지 98% 이상이, 적당한 뉴클레오티드 삽입 및 결실로 적절하게 정렬하였을 때 동일하다는 것을 의미한다. 선택적 하이브리드화는 하이브리드화가특이성의 전체적 결여보다 더 민감성일 때 존재한다(Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12: 203-213(1984) 참조).
또한, 본 발명의 이러한 실시양태는 첫째로, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하기 위하여 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 TS-763F(서열 번호: 3) 및 TS-825R(서열 번호: 4),또는 이들과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 샘플 내ERCC1mRNA 함량을 측정하는 방법을 수반한다. RNA는 본 명세서에서 그 전체를 참고 인용하는, 1999년 12월 20일 출원된 미국 특허 출원 제09/469,338호에 기재되어 있는 바와 같은 그러한 샘플로부터의 mRNA 분리 방법 중 임의의 방법에 의해 FPE 세포로부터 추출한다.
본 발명은 환자로부터 임의 유형의 조직에 적용할 수 있다. 종양 조직의 내성의 조사를 위하여, 종양 조직을 실험하는 것이 바람직할 수 있다.바람직한 실시양태에서, 종양이 얻어지는 환자로부터의 정상 조직 일부도 조사한다. 그 다음, 정상 조직이 백금계 화학요법 화합물에 내성일 것으로 예상되지만, 즉 고 수준의TS및/또는ERCC1유전자 발현을 나타내지만, 종양이 그러한 화합물에 민감성일 것으로 예상되는, 즉 저 수준의TS및/또는ERCC1유전자 발현을 나타내는 환자는 더 많은 양의 화학요법 조성물로 치료할 수 있다.
본 발명의 방법은 광범위한 종양 유형에 걸쳐서 적용할 수 있다. 이는 개별 "종양 발현 프로필"을 제조할 수 있게 하며, 이로써TS및/또는ERCC1의 발현 수준이 개별 환자 샘플에서 결정되고, 다양한 화학요법 제제에 대한 반응이 예측된다.바람직하게는, 본 발명의 방법은 고형 종양, 보다 바람직하게는 결장직장 선암 종양에 적용한다.
ERCC1발현에 관하여 본 명세서에 정의되어 있는 바와 같이, "소정의 역치 수준(predetermined threshold level)"은 종양이 5-FU 및/또는 옥살리플라틴계 화학요법 섭생에 내성이 되기 쉬운 것으로 밝혀진ERCC1발현 수준 이상이다. 이 역치 수준 이하의 발현 수준은 5-FU 및/또는 옥살리플라틴계 화학요법 섭생에 민감성인 종양에서 발견되기 쉽다. 백금계 화학요법 섭생에 반응하는 종양 중에서ERCC1:β-악틴의 비율로서 표현되는ERCC1의 상대적 발현 범위는 약 4.9 x 10-3미만이다. 백금계 화학요법 섭생에 반응하지 않는 종양은ERCC1:β-악틴의 상대적 발현 비율이 약 4.9 x 10-3이상이다.
TS에 관하여 본 명세서에서 정의하는 바와 같이, "소정의 역치 수준"은 종양이 5-FU와 5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법 섭생에 내성이 되기 쉬운 것으로 밝혀진TS발현 수치 이상이다. 이 역치 수준 이하의 발현 수치는 5-FU 또는 5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법 섭생에 민감성인 종양에서 발견되기 쉽다. 5-FU 또는 5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법 섭생에 반응하는 종양 중에서,TS:β-악틴의 비율로서 표현되는TS의 상대적 발현 범위는 약 7.5 x 10-3미만이다. 5-FU 또는 5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법 섭생에 반응하지 않는 종양은TS:β-악틴의 상대적 발현 비율이 약 7.5 x 10-3이상이다.
본 발명의 방법을 수행함에 있어서,ERCC1발현 수준 또는TS발현 수준을 환자 종양 샘플에서 분석하여 5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법 섭생의 효능을 예측한다. 또한, 본 발명의 방법에서TS발현 수준을 환자 종양 샘플에서 분석하여 5-FU계 화학요법 섭생의 효능을 예측한다. 또한, 본 발명의 방법에서ERCC1발현 수준을 환자 종양 샘플에서 분석하여 옥살리플라틴계 화학요법 섭생의 효능을 예측한다. 대안으로,ERCC1발현 수준과TS발현 수준을 환자 종양 샘플에서 분석하여 조합된 5-FU 및 옥살리플라틴게 화학요법 섭생의 효능을 예측한다.
본 발명의 이 실시양태의 방법을 수행하여, 종양 세포를 환자로부터 단리하는 것이 바람직하다. 고형 또는 림프구 종양 또는 이들의 일부는 환자로부터 수술로 절단하거나 일상 생검에 의해 얻는다. 냉동 또는 새로운 샘플로부터 단리한 RNA는 당업계에서 임의의 통상의 방법, 예컨대 문헌(Sambrook, Fisher and Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual, (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989))의 방법에 의해 세포로부터 추출한다. 추출 과정 동안 RNA의 분해를 피하기 위하여 신중을 기하는 것이 바람직하다.
그러나, 생검 후 환자로부터 얻은 조직은 종종 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 또는 글루터알데히드에 의해, 또는 예컨대 알콜 함침에 의해 고정한다. 고정된 생물학적 샘플은 종종 당업자에게 공지된 파라핀 또는 기타 고상 지지체에서 탈수되고 포매된다(Plenat 등, Ann Pathol 2001 Jan; 21(1):29-47 참조). 비포매되고 고정된 조직뿐만 아니라, 고정되고 포매된 조직도 본 발명에서 사용할 수 있다. 고정된 조직을 포매시키기 위한 고상 지지체는 유기 용매로 제거 가능할 수 있도록, 예컨대 보존된 조직의 후속 재탈수를 할 수 있도록 계획한다.
RNA는 본 명세서에서 그 전체를 참고로 인용한 1999년 12월 20일에 출원한 미국 특허 출원 제09/469,338호에 기재된 바와 같은 임의의 방법에 의해 FPE 세포로부터 추출한다. 본 명세서에서 기재된 바와 같은 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 조직 샘플은 저장 가능하거나 기록상의 조직 샘플로 언급한다. RNA는 우선 탈파라핀화된 기록상의 병리학적 샘플 또는 생검 샘플로부터 단리할 수 있다, 예시적인 탈파라핀화 방법은, 예컨대 크실렌과 같은 유기 용매로 파라핀화된 샘플을 세척하는 단계를 수반한다. 탈파라핀화된 샘플은 저급 알콜의 수용액으로 재수화할 수 있다. 적당한 저급 알콜의 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올이 있다. 탈파라핀화된 샘플은, 예컨대 농도를 감소시킨 저급 알콜 용액으로 연속 세척하면서 탈수화할 수 있다. 대안으로, 샘플은 동시에 탈파라핀화되고 재수화된다. 그 다음, RNA는 샘플로부터 추출된다.
RNA 추출을 위하여, 고정되거나 또는 고정되고 탈파라핀화된 샘플은 균질화의 기계적, 음파 또는 다른 수단을 사용하여 균질화될 수 있다. 재수화 샘플은 무카오트로픽 제제, 예컨대 구아니디늄 티오시아네이트(또한, 구아니디늄 이소티오시아테이트로서 시판됨)을 포함하는 용액 중에서 균질화될 수 있다. 균질화된 샘플은 구아니디늄 화합물과 같은 카오트로픽 제제의 유효량을 포함하는 카오트로픽 용액 중에서 약 50 내지 약 100℃ 범위 온도로 가열한다. 바람직한 카오트로픽 제제는 구아니디늄 티오시아네이트이다.
"카오트로픽 제제(chaotropic agent)의 유효 농도"는 RNA가 카오트로픽 제제의 부재 중에 분리된 약 10 배 이상의 양으로 파라핀 포매된 샘플로부터 정제되도록 선택된다. 카오트로픽 제제의 예로는 구아니디늄 화합물, 우레아, 포름아미드, 요오드화칼륨, 칼륨 티오시아네이트 및 유사 화합물이 있다. 본 발명의 방법에 바람직한 카오트로픽 제제는 구아니디늄 화합물, 예컨대 구아니디늄 이소티오시아네이트(또한, 구아니디듐 티오시아네이트로서 시판됨) 및 구아니디늄 염산염이다. 다수의 음이온성 반대 이온이 유용하고, 당업자라면 이러한 적절한 음이온으로 다수의 구아니디늄 염을 제조할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 사용되는 구아니디늄 용액이 유효 농도는 약 1 내지 약 5 M 범위, 바람직하게는 약 4 M의 값의 농도를 가진다. RNA가 이미 용액 중에 있다면, 구아니디늄 용액은 샘플에서 달성되는 최종 농도가 약 1 내지 약 5 M이도록 고농도일 수 있다. 또한, 구아니디늄 용액은 트리스-Cl과 같은 적당한 생화학적 완충액으로 약 3 내지 약 6, 보다 바람직햐게는 약 4의 pH로 완충되는 것이 바람직하다. 또한, 카오트로픽 용액은 디티오트레이톨(DTT) 및 β-메르캅토에탄올(BME)과 같은 환원제를 함유할 수 있다. 또한, 카오트로픽 용액은 RNAse 억제제를 함유할 수 있다.
그 다음, RNA는 카오트로픽 용액으로부터, 예컨대 페놀 클로로포름 추출, 이온 교환 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 회수한다. 그 다음, RNA는 추출, 전기영동, 크로마토그래피, 침전 또는 다른 적당한 기법을 사용하여 더 정제할 수 있다.
새롭거나 냉동되거나 고정된 것으로부터 정제된 전체 mRNA로부터TS또는ERCClmRNA의 정량화는, 예컨대 당업계에서 통상적인 역전사 효소 폴리머라제 연쇄반응(RT-PCR) 방법을 이용하여 수행하는 것이 바람직하다.TS또는ERCClmRNA의 정량화의 다른 방법의 예로는 멀티플렉스 PCR에 유용한 분자 비콘 및 다른 표지된 프로브의 사용이 있다. 또한, 본 발명은 예를 들면, Invander(등록 상표) 분석(써드 웨이브 테크놀로지즈 인코포레이티드(Third Wave Technologies, Inc))의 것과 유사한 형광 표지된 프로브를 사용하는 PCR-유리 시스템의 사용을 통하여TS및/또는ERCClmRNA의 정량화를 파악한다.TS및/또는ERCClcDNA 및 내부 대조 또는 하우스 키핑 유전자(예컨대, β-악틴)의 정량화는 형광에 기초한 실시간 검출 방법(ABI PRISM 7700 또는 7900 Sequence Detection System[TaqMan(등록상표)], 미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 또는 문헌(Heid 등, Genome Res 1996; 6:986-994; 및 Gibson 등, Genome Res 1996; 6:995-1001)에 기재된 바와 같이 유사한 시스템을 사용하여 수행한다.
ABI 7700(TaqMan(등록 상표) 기구)의 출력은 Ct 또는 "주기 역치"로 표현된다. TaqMan(등록 상표) 시스템으로, 샘플 내 더 많은 수의 표적 분자를 가진 고도로 발현된 유전자는 더 적은 표적 분자를 가진 더 낮은 상대적 발현의 유전자(고 Ct)보다 더 적은 PCR 주기를 가진 시그널(저 Ct)을 발생한다.
본 명세서에서 사용되는 "하우스 키핑" 유전자 또는 "내부 대조" 유전자는 그 존재가TS및/또는ERCC1mRNA 수준의 평가를 가능하게 하는 임의의 구조적으로 또는 전체적으로 발현된 유전자를 포함하는 것을 의미한다. 그러한 평가는 유전자 전사의 전체 구조적 수준 및 RNA 회수 변수에 대한 대조의 측정을 포함한다. "하우스 키핑" 유전자 또는 "내부 대조" 유전자로는 시클로필린 유전자, β-악틴 유전자, 트랜스페린 수용체 유전자, GAPDH 유전자 등이 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 내부 대조 유전자는 문헌(Eads 등, Cancer Research 1999: 59: 2302-2306)에 기재되어 있는 바와 같은 β-악틴 유전자인 것이 가장 바람직하다.
RNA 회수 변수에 대한 조절은 "보정기 RNA"의 사용을 요한다. "보정기(calibrator) RNA"는 정확하게 예비 정량화된 대조 RNA의 임의의 입수 가능한 공급원인 것으로 의도한다. 사람 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)를ERCC1및 유니버설 RE RNA를 정량화하는 데 사용하고, 어플라이드 바이오시스템즈 제품의 Cat #4307281, 로트 #3617812014는TS를 정량화하는 데 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 "미보정된 유전자 발현(UGE)"은 TaqMan(등록 상표) 기구에 의해 발생된 내부 대조 유전자에 상대적인TS및/또는ERCC1발현의 수치 출력을 의미한다. UGE를 측정하는 데 사용되는 수학식은 실시예 3 및 4에 나타내며, 도 7 및 8에 샘플 계산을 예시하였다.
본 발명의 다른 양태는 TaqMan(등록상표) 장치에서 얻은 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) 값을 비-TaqMan(등록상표) 기술에서 유도된 "공지된 상대적 유전자 발현" 값으로 표준화시키는 방법을 제공한다. TaqMan(등록상표)에서 유도된 조직 샘플로부터의TS및/또는ERCC1UGE 값을 공지된 비-TaqMan(등록상표)에서 유도된 상대적TS및ERCC1: β-악틴 발현 값을 가진 샘플에 대해 표준화한다.
본 명세서에 사용되는 "보정된 상대적ERCC1발현"이란 표현은 UGE에ERCC1특이적 보정인자(K ERCC1 )를 곱하여 표준화시킨ERCC1발현을 말하며, 내부 대조 유전자에 상대적인 공지 범위의ERCC1발현 수준과 비교할 수 있는 값이다. 실시예 3 및 도 7은 이 계산 방법을 상세히 설명한다. 이들 수치 값으로부터 특정 샘플의 "보정된 상대적ERCC1발현"이 "소정의 역치" 수준 이상인지 또는 이하인지를 결정할 수 있다. β-악틴 수준에 대한 보정된 상대적ERCC1발현의 소정 역치 수준은 약 4.9×10-3이다.ERCC1, 내부 대조 β-악틴 및 보정용 휴먼 리버 토탈 RNA(Humam Liver Total RNA; Stratagene; Cat. #735017)에 특이적인 K ERCC1 는 1.54×10-3이다.
"공지된 상대적 유전자 발현" 값은 이미 분석된 조직 샘플에서 유도된 것이고 구성적으로 발현된 내부 대조 유전자(예컨대, β-악틴, GAPDH 등)에 대한 표적 유전자의 RT-PCR 신호 비를 기초로 한다. 그러한 조직 샘플은 포르말린 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 샘플이 바람직하고 그 샘플로부터 실시예 1과 본 명세서에 그 전문을 참고 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999. 12. 20자 출원)에 기재된 프로토콜에 따라 RNA를 추출한다. 내부 대조예에 상대적인 유전자 발현을 정량 분석하기 위해서는, 당해 기술 분야에 공지된 RT-PCR 정량 분석 기술을 이용한다. 정해진 회수(즉, 30회)의 주기 동안 표준 Pre-TaqMan(등록상표) 기술 PCR 반응을 수행하고 각 샘플에 대해 최종 값을 기록한다. 이어서 이들 값을 β-악틴 발현에 대한ERCC1발현 비로 기록한다. 미국 특허 제5,705,336호(Reed 등) 참조을 참조할 수 있다.
K ERCC1 는 β-악틴 이외의 다른 내부 대조 유전자 및/또는 휴먼 리버 토탈 RNA(Stratagene, Cat. #735017) 이외의 다른 보정기 RNA에 대하여 측정할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 특정 내부 대조 유전자에 상대적인ERCC1발현 수준이 이미 결정된 조직 샘플(즉, "공지된 상대적 유전자 발현")에 대해 내부 대조 유전자와 보정기 RNA 둘 다에 대해 보정이 이루어져야 한다. 그러한 조직 샘플은 포르말린 고정 및 파라핀 포매된(FPE) 샘플이 바람직하고 그 샘플로부터 실시예 1과 본 명세서에 그 전문을 참고 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999. 12. 20자 출원)에 기재된 프로토콜에 따라 RNA를 추출한다. 그러한 결정은 당해 기술 분야에 공지된 RT-PCR 정량 분석 기술인 표준 Pre-TaqMan(등록상표)을 사용하여 수행할 수 있다. 그러한 측정을 할 때, 그 샘플은 실시예 3에 설명된 바와 같이 새로운 내부 대조예 및/또는 보정기 RNA에 대해 특이적인 새로운 K ERCC1 를 결정하는 데 유용한ERCC1의 "공지된 상대적 유전자 표현" 수준을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 "보정된 상대적TS발현"이란 표현은 UGE에TS특이적 보정인자(K TS )를 곱하여 표준화시킨TS발현을 말하며, 내부 대조 유전자에 상대적인 공지된 범위의TS발현 수준과 비교할 수 있는 값이다. 실시예 4 및 도 8은 이 계산 방법을 상세히 설명한다. 이들 수치 값으로부터 특정 샘플의 "보정된 상대적TS발현"이 "소정의 역치" 수준 이상인지 또는 이하인지를 결정할 수 있다. β-악틴 수준에 대한 보정된 상대적TS발현의 소정의 역치 수준은 약 7.5×10-3이다.TS, 내부 대조 β-악틴 및 보정기 유니버설 RE RNA(Applied Biosystems; Cat#4307281, lot #3617812014)에 대한 특이적 K TS 는 12.6×10-3이다.
K TS 는 β-악틴 이외의 다른 내부 대조 유전자 및/또는 유니버설 RE RNA(Applied Biosystems; Cat #4307281, lot #3617812014) 이외의 다른 보정기 RNA에 대하여 측정할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 특정 내부 대조 유전자에 상대적인TS발현 수준이 이미 결정된 조직 샘플(즉, "공지된 상대적 유전자 발현" 또는 "이미 공지된")에 대해 내부 대조 유전자와 보정기 RNA 둘 다에 대해 보정이 이루어져야 한다. 그러한 조직 샘플은 포르말린 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 샘플이 바람직하고 그 샘플로부터 실시예 1과 본 명세서에 그 전문을 참고 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999. 12. 20자 출원)에 기재된 프로토콜에 따라 RNA를 추출한다. 그러한 결정은 당해 기술 분야에 공지된 RT-PCR 정량 분석 기술인 표준 Pre-TaqMan(등록상표)을 사용하여 수행할 수 있다. 그러한 결정을 할 때, 그 샘플은 실시예 4에 설명된 바와 같이 새로운 내부 대조예 및/또는 보정기 RNA에 대해 특이적인 새로운 K TS 를 결정하는 데 유용한TS의 "공지된 상대적 유전자 발현" 수준을 갖는다.
"이미 공지된" 상대적 유전자 표현 결과는 구성적 발현 유전자(β-악틴)에 대한 표적 유전자의 RT-PCR 신호의 비에 기초한 것이다. Pre-TaqMan(등록상표) 기술 연구에 있어서, PCR 반응은 정해진 회수(즉, 30회)의 주기 동안 PCR 반응을 수행하고 각 샘플에 대해 최종 값을 기록한다. 이어서 이들 값을 β-악틴 발현에 대한ERCC1또는TS발현 비로 기록한다. 살롱가(Salonga) 등의 문헌[ClinicalCancer Reseach, 6:1322-1327, 2000; 그 전문을 본 명세서에 참고 인용함]을 참조할 수 있다.
본 발명의 방법은 광범위한 조직 및 종양 종류에 적용할 수 있으므로, 환자의 임상 치료의 평가에, 그리고 가슴, 머리, 목, 폐, 식도, 결장 등을 비롯한 암 종류의 진단 또는 예측 기구로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 결장직장 선암의 예측에 적용된다.
사전 화학요법 처리된 종양의 생검은 통상, 일반적으로 극소량의 이종 조직을 함유하는 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 조직으로서만 가능하다. 그러한 FPE 샘플은 용이하게 현미 해부할 수 있으므로,TS및/또는 ERCC1 유전자 발현은 기질(stromal) 조직으로 오염되지 않은 종양 조직에서 결정할 수 있다. 또한, 생검 조직 샘플 내의 기질 조직과 종양 조직 간의 비교를 행할 수 있는데, 그러한 샘플은 대개 두 가지 형태의 조직을 모두 포함하기 때문이다.
일반적으로, 서열 번호: 10에 표시된 바와 같은ERCC1유전자 영역의 측면에 위치하는 임의의 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 본 발명의 방법을 수행할 수 있다. 엄격한 조건하에 본 발명에 사용하기 위한ERCC1유전자 영역에 하이브리드화하는 프라이머는 20 내지 1000개의 염기쌍, 바람직하게는 50 내지 100개의 염기쌍, 가장 바람직하게는 100개 이하의 염기쌍을 가진 생성물을 증폭시킬 것이다.
본 발명은 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 및 그것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하여 FPE 조직을 사용하는ERCC1발현의 특히 정밀한 평가가 가능하다. 바람직한 것은 올리고뉴클레오티드 프라이머ERCC1-504F(서열 번호: 1) 및ERCC1(서열 번호: 2)(본 명세서에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍ERCC1으로 칭하기도 함) 및 이들과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머ERCC1-504F(서열 번호: 1) 및ERCC1(서열 번호: 2)는 임의의 mRNA 분리 방법, 예컨대 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법으로 FPE 세포에서 추출한 RNA를 사용하여ERCC1mRNA 수준을 측정하는 데 특히 효과적인 것으로 확인되었다.
또한, 서열 번호: 11에 나타낸 바와 같이TS유전자 영역의 측면에 위치하는 임의의 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 본 발명의 방법을 수행할 수 있다. 엄격한 조건하에 본 발명에 사용하기 위한TS유전자 영역에 하이브리드화하는 프라이머는 20 내지 1000개의 염기쌍, 바람직하게는 50 내지 100개의 염기쌍, 가장 바람직하게는 100개 이하의 염기쌍을 가진 생성물을 증폭시킨다.
본 발명은 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 및 그것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하여 FPE 조직 내에서의TS발현의 특히 정밀한 평가가 가능하다. 바람직한 것은 올리고뉴클레오티드 프라이머TS-763F(서열 번호: 3) 및TS(서열 번호: 4)(본 명세서에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍TS로 칭하기도 함) 및 이들과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머TS-763F(서열 번호: 3) 및TS(서열 번호: 4)는 임의의 mRNA 분리 방법, 예컨대 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법으로 FPE 세포에서 추출한 RNA를 사용하여TSmRNA 수준을 측정하는 데 특히 효과적인 것으로 확인되었다.
본 발명은 엄격한 조건(이하에 규정함)하에서ERCC1-504F(서열 번호: 1)의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 전부 또는 일부 또는 이것의 상보체,ERCC1-574R(서열 번호: 2) 또는 이것의 상보체,TS-763F(서열 번호: 3)의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 또는 이것의 상보체, 또는TS-825R(서열 번호: 4) 또는 이것의 상보체에 하이브리드화하는 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
엄격한 하이브리드화 조건하에서, 상보성이 높은, 즉 본 명세서에서 실질적으로 유사하다고 표현한 핵산 서열만이 하이브리드화한다. 그러한 조건은 바람직하게는 20개의 연속 뉴클레오티드 중 4개 이상의 비일치를, 더 바람직하게는 20개의 연속 뉴클레오티드 중 2개 이상의 비일치를, 가장 바람직하게는 20개의 연속 뉴클레오티드 중 1개 이상의 비일치를 가진 핵산의 하이브리드화를 방지하는 것이 좋다.
핵산의 하이브리드화 부분은 전형적으로 약 10개 이상(예컨대, 15개)의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 약 80% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 또는 가장 바람직하게는 약 98% 이상이 올리고뉴클레오티드 프라이머 ERCC1-504F(서열 번호: 1) 또는 그것의 상보체, ERCC1-574R(서열 번호: 2) 또는 그것의 상보체, 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머 TS-763F(서열 번호: 3) 또는 그것의 상보체, 또는 TS-825R(서열 번호: 4) 또는 그것의 상보체의 일부 또는 전부의 서열과 동일하다.
엄격한 조건하에 핵산 샘플에 올리고뉴클레오티드 프라이머를 하이브리드화하는 것은 이하에 설명한다. 핵산 이중 가닥 또는 하이브리드 안정성은 융점(Tm)으로 표시하는데, 이것은 탐침이 표적 DNA로부터 분리되는 온도이다. 이 융점을 이용하여 필요한 엄격한 조건을 규정한다. 서열이 동일(동일하다기보다는 탐침과 실질적으로 동일)하면, 우선 특정 농도의 염(예컨대, SSC 또는 SSPE)에 의해 상동성 하이브리드화만이 일어나는 최저 온도를 설정하는 데 유용하다. 1%의 비일치가 Tm을 1℃ 감소시킨다고 가정하면, 이에 따라 하이브리드화 반응 시의 최종 세정물의 온도가 감소한다(예를 들면, 탐침과 95% 이상 상동성을 가진 서열을 목적으로 하면, 최종 세정물 온도는 5℃ 저하된다). 실제로, Tm의 변화는 비일치 1%당 0.5℃ 내지 1.5℃일 수 있다.
엄격한 조건은 68℃, 5×SSC/5×덴하르트 용액/1.0% SDS에서의 하이브리드화, 및 실온, 0.2×SSC/0.1% SDS에서의 세정을 포함한다. 중간정도의 엄격한 조건은 42℃, 3×SSC에서의 세정을 포함한다. 염 농도 및 온도 파라미터를 변화시켜 프라이머와 표적 핵산 간의 최적의 동일성 수준을 달성한다. 그러한 조건에 대한 추가의 안내는 당업계에서 용이하게 입수할 수 있다[참조: Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual, (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989) and F. M. Ausubel et al eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons(1994)].
본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 고정되거나 또는 고정되고 파라핀 포매된 조직은 물론 동결되거나 또는 새로운 조직에서TS및/또는ERCC1유전자 발현의 정밀한 평가를 할 수 있다. 이것은, FPE 샘플에서 유도된 RNA가 새로운 조직 또는 동결 조직에 비해 더 단편화된다는 사실에도 불구한 것이다. 즉, 본 발명은 고정 조직을 사용하여TS및/또는ERCC1유전자 발현을 분석할 기존의 방법이 없었던 FPE 조직에서TS및/또는ERCC1유전자 발현 수준을 분석하는 데 사용하기에 적합하다.
5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법에 병용할 수 있는 유전자독성 물질은 지속성 게놈성 병변을 형성하는 것으로, 암의 임상적 치료에 있어 화학요법 제제로서 사용하는 데 바람직하다. 유전자독성 유도된 DNA 손상의 세포 회복 속도와, 세포 분화 주기를 통한 세포 성장 속도는 유전자독소 요법의 성과에 영향을 미친다. 세포 게놈의 회복되지 않은 병변은 DNA 복제를 저해하거나, 새로 합성된 DNA의 복제 신뢰도를 손상시키거나, 세포 생존에 필요한 유전자 발현을 방해할 수 있다. 즉, 유전자독성 제제의 세포독성(세포 사멸에 기여하는 성향)의 결정인자 중 하나는 그것으로부터 형성된 게놈성 병변의 세포 회복에 대한 저항성이다. 지속성 게놈 병변, 예컨대 적어도 세포가 세포 주기에 전념할 때까지 게놈 내에서 유지되는 병변을 형성하는 유전자독성 제제는 일시적으로 용이하게 회복된 게놈성 병변을 형성하는 제제보다 일반적으로 더 효과적인 세포독소이다.
유전자독소인 옥살리플라틴, 즉 시스-옥살레이토(트랜스-1-1,2-시클로헥산디아민) 백금(II)는 미국 특허 제4,169,846호에 기재되어 있다. 관련 특허에는 미국 특허 제5,290,961호, 제5,298,642호, 제5,338,874호, 제5,420,319호 및 PCT/IB/00614가 포함된다. 옥살리플라틴은 현재 완전 개발 상태에 있는 백금(II)-트랜스-1,2-디아미노시클로헥산 착물 부류에 속한다. 그 착물, 또는 "dach" 착물은 임상 시험 중인데, 난소, 자궁, 위 및 장 등의 흑색종 및 종양에 대해 특히 효과적이다. 5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법을 보조하는 데 사용할 수 있는 다른 화합물은 또한 옥살리플라틴의 유사체, 예컨대 "dach" 착물 및 공유결합 DNA 부가물을 형성하는 것들을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 사용된 보조용 백금 화합물은 옥살리플라틴이다.
백금 배위결합 화합물에 의해 현재 치료 가능한 종양에는 수모세포종 및 신경세포종과 함께, 고환암, 자궁내막암, 자궁경관암, 위암, 편평상피 세포암, 부신 피질암 및 소세포 폐암이 포함된다.
지금까지 본 발명을 기술하였으며, 본 발명의 실시는 후술하는 실시예에 의해 예시될 것이다. 당업자는 예시된 실시예에 사용된 물질 및 방법을 다양하게 변형 실시할 수 있을 것이다. 이러한 변형 실시는 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.
발명의 개요
본 발명의 한 양태에서, 본 발명은 고정되거나 또는 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 종양 세포로부터 얻어지는ERCC1mRNA의 발현 수준을 평가하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 고정되거나 또는 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 종양 세포로부터 얻어지는TSmRNA의 발현 수준을 평가하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 조직 샘플로부터 내부 대조예에 상대적인ERCC1mRNA 발현의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 샘플로부터 총 mRNA를 단리하는 단계 및 내부 대조 유전자의 mRNA의 양에 상대적인ERCC1mRNA의 정량을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 조직 샘플로부터 내부 대조예에 상대적인TSmRNA 발현의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 샘플로부터 총 mRNA를 단리하는 단계 및 내부 대조 유전자의 mRNA에 상대적인TSmRNA의 정량을 측정하는 단계를 포함한다.
이러한 본 발명 양태의 실시양태에서, 본 발명은 ERCC1-504F(서열 번호: 1) 또는 ERCC1-57R(서열 번호: 2)의 서열 및 이 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공한다. 또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2 또는 이들의 상보체로 하이브리드화되는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공한다.
이러한 본 발명의 양태의 실시양태에서, 본 발명은 TS-763F(서열 번호: 3) 또는 TS-825R(서열 번호: 4)의 서열 및 이 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공한다. 또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4 또는 이들의 상보체로 히브리드화되는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 환자에 대하여 5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법의 섭생을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 종양 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계, 샘플내ERCC1의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계, 샘플내ERCC1유전자 발현 수준을ERCC1유전자에 대한 소정의 역치 수준과 비교하는 단계, 및ERCC1유전자 발현 수준을 소정의 역치 수준과 비교한 결과를 기초로 한 화학요법의 섭생을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 환자에 대하여 5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법의 섭생을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 종양 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계, 샘플내TS의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계, 샘플내TS유전자 발현 수준을TS유전자에 대한 소정의 역치 수준과 비교하는 단계, 및TS유전자 발현 수준을 소정의 수준과 비교한 결과를 기초로 한 화학요법의 섭생을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 환자에 대하여 5-FU 및 옥살리플라틴계 화학요법의 섭생을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 종양 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계, 샘플내TS및ERCC1유전자 발현 수준을 측정하는 단계, 샘플내TS및ERCC1유전자 발현 수준을 각각의TS및ERCC1유전자에 대한 소정의 역치 수준과 비교하는 단계, 및TS및ERCC1유전자 발현 수준을 소정의 역치 수준과 비교하는 결과를 기초로 한 화학요법의 샙생을 결정하는 단계를 포함한다.
추가로, 본 발명은 TaqMan(등록상표) 기법을 이용하여 분석한 조직 샘플내 내부 대조 유전자에 상대적인ERCC1및TS의 미보정된 유전자 발현(UGE)을 TaqMan(등록상표) 기법에 의해 분석된 샘플내 내부 대조예에 상대적인 공지된 ERCC 및TS발현 수준으로 표준화시키는 방법에 관한 것이다.
실시예 1
RNA는 하기 일반적인 절차에 의해 파라핀 포매된 조직으로부터 추출한다.
FPE 조직으로부터 RNA의 단리
A. 절편의 파라핀 제거 및 수화:
(1) 약 10 μM의 절편부를 1.5 ml 들이 플라스틱 원심분리 튜브내에 위치시킨다.
(2) 크실렌 600 ㎕를 첨가하고, 혼합물은 실온(약 20 내지 25℃)에서 10분 동안 강하게 진탕시킨다.
(3) 상기 샘플은 실온에서 벤치 탑 원심분리의 최고 속도(약 10 내지 20,000 x g)로 약 7분 동안 원심분리한다.
(4) 대부분의 파라핀이 용해될 때까지 상기 (2) 및 (3) 단계를 반복한다. 일반적으로 최초 샘플부내에 포함된 파라핀의 양에 따라 2회 또는 그 이상의 반복 수행이 필요하다.
(5) 상기 크실렌 용액은 저급 알콜, 바람직하게는 100% 에탄올(약 600 ㎕)과 함께 약 3분 동안 강하게 진탕시킨다.
(6) 상기 튜브는 상기 (3) 단계에서와 동일하게 약 7분 동안 원심분리시킨다. 상청액은 경사분리하여 폐기시킨다. 얻은 펠릿은 백색이다.
(7) 상기 단계 (5) 및 (6)은 더 묽은 에탄올 용액과 함께 연속하여 반복 수행한다: 먼저, 약 95% 에탄올을 이용하고, 그 다음으로 약 80% 에탄올을 이용하고, 최종적으로 약 70% 에탄올을 이용한다.
(8) 상기 샘플은 상기 (3) 단계에서와 동일하게 실온에서 7분 동안 원심분리한다. 상청액은 폐기하고, 펠릿은 실온에서 약 5분 동안 건조한다.
B. 페놀-클로로포름을 이용하는 RNA 단리
(1) 0.5% 사르코신을 포함하는 구아니딘 이소시아네이트 용액 400 ㎕ 및 디티오트레이톨 8 ㎕를 첨가한다.
(2) 이어서, 상기 샘플은 조직 균질화기(울트라-투랙스; 미국 노스캐롤라이나 윌밍톤 소재의 이카-웍스 인크.)를 이용하여 약 2 내지 3분 동안 균질화하는데, 균질화는 저속(제1속)으로부터 고속(제5속)으로 속도를 증가시키면서 수행한다.
(3) 이어서, 상기 샘플은 약 95℃에서 약 5 내지 20분 동안 가열한다. 95℃로 가열하기 이전에, 상기 샘플을 함유하는 튜브의 캡은 미세 게이지 바늘을 이용하여 천공하여두는 것이 바람직하다. 대안으로, 상기 캡은 플라스틱 클램프 또는 실험실용 필름을 이용하여 고정시켜둘 수도 있다.
(4) 이어서, 상기 샘플은 pH 4.0에서 2M 나트륨 아세테이트 50 ㎕ 및 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(10:1.93:0.036)(페놀 18 ml와 1:49의 이소아밀 알콜:클로로포름 용액 3.6 ml를 혼합하여 새로 제조함) 600 ㎕를 이용하여 추출한다. 상기 용액은 약 10초 동안 강하게 진탕한 후, 얼음 위에서 약 15분 동안 냉각한다.
(5) 상기 용액은 최대 속도로 약 7분 동안 원심분리한다. 상부 (수성) 상은 새로운 튜브에 이전한다.
(6) 상기 RNA는 글리코겐 약 10 ㎕ 및 이소프로판올 400 ㎕를 이용하여 -20℃에서 30분 동안 침전시킨다.
(7) 상기 RNA는 벤치탑 원심분리에서 최대 속도로 약 7분 동안 원심분리하여 펠릿화하고; 상청액은 경사분리하여 폐기하고; 펠릿은 약 70 내지 75% 에탄올 약 500 ㎕를 이용하여 세척한다.
(8) 상기 샘플은 최대 속도로 7분 동안 재차 원심분리한다. 상청액은 경사분리하고, 펠릿은 공기 건조한다. 이어서, 펠릿은 후속 실험을 위해서 적합한 완충액(예를 들어, 50 pI, 5 mM 트리스 클로라이드, pH 8.0)에 용해시켜 둔다.
실시예 2
mRNA 역전사 및 PCR
역전사:RNA는 실시예 1 및 본원에 전적으로 참고 인용하는 미국 출원 09/469,338호(1999년 12월 20일 출원)에서 예시한 바와 같이, 현미 해부되거나 또는 현미 해부되지 않은 포르말린 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 조직으로부터 분리하였다. 에탄올 침전 및 원심분리후, RNA 펠릿은 pH 8.0에서 5 mM 트리스/Cl 50 ㎕ 내에 용해시켰다. M-MLV 역전사효소는 데옥시뉴클레오티드의 존재 하에서 단일 가닥 RNA 또는 DNA 주형에 하이브리드화된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장시켜 상보성 가닥을 생성할 것이다. 생성된 RNA는 라이프 테크놀로지스의 랜덤 헥사머 및 M-MLV 역전사효소를 이용하여 역전사시켰다. 역전사는 "역전사 혼합물" 25.5 ㎕와 RNA 용액 25 ㎕를 혼합하여 수행하였다(하기 참조). 반응물은 (RNA에 대한 랜덤 헥사머의 결합을 위해) 26℃에서 8분 동안, (M-MLV 역전사 효소 반응을 위해) 95℃에서 5분 동안 및 (DNAse의 열 불활성화를 위해) 95℃에서 5분 동안 열사이클러 내에 위치시켰다.
"역전사 혼합물"은 5X 완충액(250 mM 트리스-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) 10 ㎕, 랜덤 헥사머(50 O.D. 10 mM 트리스-HCl pH 7.5 550 ㎕) 0.5 ㎕, 10 mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 5 ㎕, 0.1 M DTT 5 ㎕, BSA(10 mM 트리스-HCl pH 7.5내의 3 mg/ml) 1.25 ㎕, RNA 가드 24,800 U/ml(RNase 억제제)(Porcine #27-0816, 아메르샴 파마시아) 1.25 ㎕ 및 MMLV 200 U/㎕(라이프 테크카탈로그#28025-02) 2.5 ㎕로 구성된다.
반응 성분의 최종 농도는 50 mM 트리스-HCl pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 1.0 mM dNTP, 1.0 mM DTT, 0.00375 mg/ml BSA, 0.62 U/㎕ RNA 가드 및 10 U/㎕ MMLV이다.
mRNA 발현의 PCR 정량:ERCC1 cDNA 및 내부 대조 유전자 또는 하우스 키핑 유전자(예를 들어, β-악틴) cDNA의 정량은 형광 기초한 실시간 검출법(ABI PRISM 7700 또는 7900 서열 검출 시스템(Taqman; 등록상표), 미국 캘리포니아 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 수행하였다[참조: Heid 등, Genome Res 6: 986-994 (1996); Gibson 등, Genome Res 6: 995-1001 (1996)]. 개략적으로, 이 방법은 순방향 및 역방향 프라이머 내에서 특이적으로 어닐링하는 이중 표지된 형광발생 TaqMan(등록상표) 올리고뉴클레오티드 프로브(ERCC1-530Tc(서열 번호: 5), Tm=70℃; TS-781(서열 번호: 6), β-악틴-611(서열 번호: 7))를 이용한다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 캡핑된 웰내에서 레이저 자극은, PCR 연장중 상기 프로브가 DNA 폴리머라제의 5'→3'뉴클레아제 활성에 의해 절단될 때 까지 3' 켄처(quencher) 염료(TAMRA)의 방출을 유발하여 5' 리포터 염료(6FAM)의 방출을 유발하였다. 따라서, 앰플리콘의 제조는 TaqMan(등록상표)의 CCD(전하-커플링된 장치) 검출 카메라에 의해 검출되는 형광 신호의 방출을 유발하며, 전적으로 PCR 반응의 대수기내 한계 주기에서 생성된 신호의 양은 소정 서열의 초기 사본수를 반영한다. 소정 서열의 초기 사본수와 내부 대조 유전자의 초기 사본수의 비교는 상대적 유전자 발현 수준을 제공한다. TaqMan(등록상표)은 두개의 절대 측정값(소정의 유전자/내부 대조 유전자) 사이의 비로서 표현된 수득률을 분석한다.
상기 PCR 반응 혼합물은 상기한 바와 같이 제조한 cDNA, 각각 600 nM의 올리고뉴클레오티드 프라이머 ERCC1-540F(서열 번호: 1, Tm=59℃) 및 ERCC1-574R(서열 번호: 2, Tm=58℃) 또는 올리고뉴클리오티드 프라이머 TS-763F(서열 번호: 3) 및 TS-825R(서열 번호: 4), 200 nM TaqMan(등록상표) 프로브(서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6), 5 U 앰플리택 골드 폴리머라제, 200 μM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 400 μM dTTP, 5.5 mM MgCl2및 참조 염료를 함유하는 1 x TaqMan(등록상표) 완충액을 함유하며, 최종 부피는 25 ㎕ 이하이다(모든 시약은 미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템즈에서 제조한 것임). 사이클링 조건은 95℃에서 10분, 이어서 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분 동안 45 주기가었다. 내부 대조 유전자 β-악틴을 정량하기 위해 사용한 올리고뉴클레오티드는 β-악틴-592F(서열 번호: 8) 및 β-악틴-651R(서열 번호: 9)이었다.
실시예 3
ERCC1에 대한 미보정된 유전자 발현(UGE)의 측정
두 쌍의 평행 반응, 즉 "시험" 반응 및 "보정(calibration)" 반응을 수행하였다(참조: 도 7). ERCC1 증폭 반응 및 β-악틴 내부 대조 증폭 반응은 시험 반응이다. 별개의 ERCC1 및 β-악틴 증폭 반응은 보정기 RNA 주형 상에서 수행하였으며, 이를 보정 반응으로 칭한다. TaqMan(등록상표) 장치는 4개의 상이한 주기역치(Ct): 시험 반응으로부터 CtERCC1및 Ctβ-악틴및 보정 반응으로부터 CtERCC1및 Ctβ-악틴를 산출할 것이다. 두개의 반응에서 Ct값의 차이는 하기 수학식에 따라 결정된다.
ΔCt시험= Ct ERCC1 - Ctβ-악틴("시험" 반응으로부터)
ΔCt보정기= Ct ERCC1 - Ctβ-악틴("보정" 반응으로부터)
다음 단계는 하기 수학식에 따라 2에 음의 ΔCt 값만큼 제곱하는 것과 관계된다.
2-ΔCt 시험("시험" 반응으로부터)
2-ΔCt 보정기("보정" 반응으로부터)
이어서, TaqMan(등록상표) 장치로부터ERCC1에 대한 미보정된 유전자 발현을 획득하기 위해, 하기 수학식에 따른 계산을 수행하였다:
ERCC1에 대한 미보정된 유전자 발현(UGE) = 2-ΔCt 테스트/2-ΔCt 보정기
공지된 상대적
ERCC1
발현 수준을 이용하는 UGE의 표준화
표준화 계산은 UGE와 ERCC1에 특이적인 보정 인자(K ERCC1 ) 및 특정 보정기 RNA를 곱하는 것을 포함한다. 또한, 보정 인자 K ERCC1 은 임의의 내부 대조 유전자 및 정확히 미리 정량된 보정기 RNA에 대해 결정할 수도 있다. 상기 내부 대조 유전자β-악틴 및 정확히 미리 정량된 보정기 RNA, 인간 간 전체 RNA(스트라타진, 카탈로그 #735017)을 사용하였다. 이들 시약에 있어서, 보정 인자 K ERCC1 은 1.54 x 10-3이었다.
표준화는 TaqMan(등록상표)의 제조사인 어플라이드 바이오시스템즈의 사용자 지침 #2에 기술되어 있고, 상기한 ΔCt 방법을 변형하여 수행하였다. 이러한 절차를 수행하기 위해, 6개의 상이한 테스트 조직의 UGE는 상기한 바와 같은 TaqMan(등록상표) 방법을 이용하여 ERCC1 발현에 대해 분석하였다. 상기 내부 대조 유전자 β-악틴 및 보정기 RNA, 인간 간 전체 RNA(스트라타진, 카탈로그 #735017)을 사용하였다.
각각의 샘플 AG221, AG222, AG252, 성인 폐, AdCol에 대한 공지된 상대적 ERCC1 발현 수준은 그의 상응하는 TaqMan(등록상표) 유도된 UGE로 나누어 비평균화된 보정 인자 K를 산출하였다.
K비평균= 공지된 값/UGE
이어서, 모든 K 값은 평균화하여 보정기 RNA 및 β-악틴으로부터 ERCC1, 인간 간 전체 RNA(스트라타진, 카탈로그 #735017)를 결정하였다.
따라서, 미지의 조직 샘플에 대해 Pre-aqMan(등록상표)ERCC1발현 연구와 일치하는 스케일로 보정된 상대적ERCC1발현을 결정하기 위해, 동일한 내부 대조 유전자 및 보정기 RNA를 이용하고 TaqMan(등록상표) 장치로부터 유도되는 미보정된 유전자 발현 데이타(UGE)와 K ERCC1 특이적 보정 인자를 곱하기만 하면 된다.
보정된 상대적ERCC1발현 = UGE x K ERCC1
K ERCC1 은 임의의 정확하게 미리 정량된 보정기 RNA 또는 내부 대조 유전자를 이용하여 결정할 수 있다. 정확하게 미리 정량된 RNA의 추가 공급원은 상기 방법에서 기술한 바와 같이 공지된 상대적 ERCC1 발현 수준을 가진 샘플에 대해 보정하거나, 인간 간 전체 RNA(스트라타진, 카탈로그 #735017)와 같은 이미 보정된 보정기 RNA에 대해 보정할 수 있다.
예를 들어, 후속 K ERCC1 이 상이한 내부 대조 유전자 및/또는 상이한 보정기 RNA에 대해 측정되는 경우, 내부 대조 유전자 및 보정기 RNA 둘 다를 특정 내부 대조 유전자에 대한 ERCC1 발현 수준이 이미 결정된 조직 샘플에 대해 보정하여야만 한다. 이러한 결정은 표준 Pre-aqMan(등록상표), 당업계에 널리 공지된 정량적 RT-PCR 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 이들 샘플에 대한 공지된 발현 수준은 그들의 상응하는 UGE 수준으로 나누어 상기 샘플의 K를 결정한다. 이어서, K 값은 공지된 샘플의 수에 따라 평균화하여 상이한 내부 대조 유전자 및/또는 보정기 RNA에 특징적인 새로운 K ERCC1 을 측정한다.
실시예 4
TS
에 대한 미보정 유전자 발현(UGE)의 결정
두쌍의 반응을 나란히 수행한다. "시험" 반응 및 "보정" 반응. (도 8)TS증폭 반응 및 β-악틴 내부 대조 증폭 반응이 시험 반응이다.TS및 β-악틴 증폭 반응을 검정 DNA 주형 상에서 실시하고, 이를 보정 반응이라 부른다. TaqMan(등록 상표) 장치는 4개의 다른 주기 역치(Ct)를 산출할 것이다: 시험 반응으로부터 Ct TS 및 Ctβ-악틴및 보정 반응으로부터 Ct TS 및 Ctβ-악틴. 두 반응에 대한 Ct값의 차이는 하기 식에 따라 결정된다.
△Ct시험= Ct TS -Ctβ-악틴("시험" 반응으로부터)
△Ct보정= Ct TS -Ctβ-악틴("보정" 반응으로부터)
다음 단계는 하기 식에 따라 숫자 2를 -△Ct승하는 것을 포함한다.
2-△Ct 시험 ("시험" 반응으로부터)
2-△Ct 보정("보정" 반응으로부터)
TaqMan(등록 상표) 장치로부터TS에 대한 미보정된 유전자 발현을 얻기 위하여 다음 보정을 실시한다.
TS에 대한 미보정된 유전자 발현(UGE) = 2-△Ct 시험/2-△Ct 보정
공지된 상대적
TS
발현 수준을 사용한 UGE의 표준화
표준화 보정은 특정한 보정기 RNA 및TS에 특이적인 보정인자(K TS )를 UGE에 곱해야 한다. 또한, 임의의 내부 대조 유전자 및 임의의 정확하게 예비정량된 보정기 DNA에 대하여 보정인자 K TS 를 결정할 수 있다. 내부 대조 유전자 β-악틴 및 정확하게 예비정량된 보정기 RNA, 유니버설 PE RNA; 어플라이드 바이오시스템즈로부터 Cat #4307281, 로트 # 3617812014를 사용한다. 이들 시약이 주어지는 경우 보정인자 K TS 는 12.6 x 10-3이다.
표준화는 유저 불레틴 #2에서 TaqMan(등록 상표) 제조사인 어플라이드 바이오시스템즈에 의해 기술된 상기 △Ct 방법의 변법을 사용하여 수행된다. 이 절차를 수행하기 위하여, 전술한 TaqMan(등록 상표) 방법을 사용하여TS발현에 대하여 이미 공지된 6개의 다른 시험 조직의 UGE를 분석하였다. 이 조직 샘플은 문헌[Salonga, 등, Clinical Cancer Research, 6:1322-1327, 2000]에 기재되어 있으며, 이 문헌은 그 전체로서 본 명세서에 참고로 포함된다. 내부 대조 유전자 β-악틴 및 보정기 RNA, 유니버설 PE RNA; 어플라이드 바이오시스템즈사의 Cat #4307281, 로트 #3617812014가 사용되었다.
샘플 L7, L91, L121, L150, L220, L164 각각의 이미 공지된 상대적TS발현 수준을 그에 상응하는 TaqMan(등록 상표) 유래의 UGE로 나누어 미평균화된(unaveraged) 보정인자 K를 산출하였다. 문헌[Salonga 등, Clinical Cancer Research, 6:1322-1327, 2000]은 그 전체로서 본 명세서에 참고로 포함된다.
K미평균화= 공지된 값/UGE
다음으로, 모든 K값을 평균하여TS, 어플라이드 시스템즈 유니버설 PE RNA; Cat #4307281, 로트 #3617812014 보정기 RNA 및 β-악틴에 대하여 특이적인 하나의 KERCC1보정인자를 결정하였다.
그러므로, 프리-TaqMan(등록 상표)TS발현 연구와 일치하는 스케일로 미지의 조직 샘플내에서 보정된 상대적TS발현을 결정하기 위해서는, 그 내부 대조 유전자 및 보정기 RNA가 주어진 경우에 K TS 특이적 보정인자와, TaqMan(등록 상표) 장치로부터 유도된 미보정 유전자 발현 데이타(UGE)를 곱하기만 하면 된다.
보정된 상대적TS발현 = UGE x K TS
K TS 는 임의의 정확하게 예비정량된 보정기 RNA 또는 내부 대조 유전자를 사용하여 결정될 수 있다. 정확하게 예비정량된 RNA의 추가 공급원은 전술한 방법에 기재된 공지된 상대적ERCC1발현 수준을 가진 샘플에 대하여 보정할 수 있고, 현재는 전술한 어플라이드 바이오시스템즈사의 유니버설 PE RNA; Cat #4307281, 로트 #3517812014와 같이 이미 보정된 보정기 RNA에 대하여 보정될 수 있다.
예를 들어, 다른 내부 대조 유전자 및/또는 다른 보정기 RNA에 대한 후속적 K TS 가 결정된다면, 특정 내부 대조 유전자에 대한TS발현 수준이 이미 공지되었거나 결정된 조직 샘플에 대하여 보정기 RNA 및 내부 대조 유전자 모두를 보정해야 한다. 이러한 결정법은 당업계에 공지된 정량적 RT-PCR 기법, 표준 Pre-TaqMan(등록 상표)에 의해 이루어질 수 있다. 이들 샘플에 대하여 공지된 발현 수준을 그에 상응하는 UGE 수준으로 나누어 샘플의 K를 결정한다. 이어서, 공지된 샘플의 개수에 따라 K값의 평균을 구하여, 상이한 내부 대조 유전자 및/또는 보정기 RNA에 대해 특이적인 신규 K TS 를 결정한다.
실시예 5
환자 선택 및 화학요법 치료
모든 환자들은 유니버시티 오브 써던 캘리포니아 메디칼 센터의 특별 프로토콜 3C-98-3에 등록하였고, 다음의 옥살리플라틴/5-FU 병용 치료 요법을 받았다: 130 mg/m2옥살리플라틴 + 5-FU의 연속 주입. 모든 환자는 5-FU를 사용한 사전 치료에 실패하였고, 60%(30/50)는 이리노테칸(CPT-1)을 사용한 추가의 제2선 치료에 실패하였다. 모든 환자는 프로토콜 시작시에 IV기 결장직장암의 활발한 질병 상태를 나타내었다.
임상 평가 및 반응 기준
화학요법시에, 기능 상태, 중량, 복통, 전혈 측정 및 혈청 크레아티닌 및 혈중 우레아 질소 수준에 대하여 매주 평가를 기록하였다. 컴퓨터 단층촬영법(CT)을 사용해서 종양의 질량(burden)을 측정하였다. 프로토콜 시작시에 2차원적으로 측정가능한 종양의 질량이 필요하였다. 치료에 대한 응답자는 최소한 6주동안 종양의 질량이 50% 감소된 환자로서 분류되었다. 비응답자는 안정된 질병 상태 또는 진행성 암을 가진 환자를 포함하였다. 임의의 원인에 의한 사망에 대하여 5-FU/옥살리플라틴을 사용한 화학요법 개시시로부터의 날수로서 생존을 평가하였다. 마지막 후속 평가에서 생존한 환자는 그 시점에서 검사하였다.
통계적 분석
TaqMan(등록 상표) 분석은 2개의 절대 측정치의 비율(소정의 유전자:내부 대조 유전자)로서 표현되는 수준을 산출한다. 만-위트니(Mann-Whitney) 테스트 및 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 시험을 사용해서,TS및ERCC1발현(연속 변수로서)과 환자 통계학과의 연관성을 평가하였다. 문헌[Zar, Biostatistical Analysis. Prentice-Hall, Inc Englewood Cliffs, N.J. (1974), pp. 109-114 and 139-142] 참조. 밀러와 지그문드(Biometrics 38: 1011-1016, 1982) 및 할퍼른(Biometrics 38: 1017-1023, 1982)의 최대 카이 제곱법은 환자를 낮고, 그리고 높은TS및ERCC1발현 소그룹으로 이분하기에 최적인 컷오프 역치를 결정하기에 적합하였다. 피어슨의 카이 제곱 시험을 사용해서 이분화된 분자 마커들과 화학요법 간의 연관성을 평가하였다. 문헌[Zar, Biostatitical Analysis. Prentice-Hall, Inc Englewood Cliffs, N.J.(1974), pp.59-68]을 참조할 수 있다. 위험율을 사용하여 상대적 사망 위험을 계산하였다. 문헌[Schulman, Infection Control & Hospital Epidemiology, 18:65-73, 1997] 참조. 이들 계산은 로그순위 검정(log-rank test) 통계학에서 계산된 바와 같이, 현상(event)의 실측치와 예상치를 사용하는 피크(Pike) 평가에 기초하였다. 문헌[Pike, J R Stat Soc Series A 135:201-203, 1972]. 최대 카이 제곱 분석법에 기초한 연관성의 강도를 측정함으로써 해석되는 P 값을 결정하기 위해, 1000 부트-스트랩 유형 모의실험을 사용하여, 아무런 상관성이 없다는 가정하에 최대 카이 제곱 통계의 분포를 평가하였다. 문헌[Halpern, Biometrics 38:1017-1023, 1982]. 유의 수준은 p < 0.05로 설정하였다.
반응 및 생존 평가가 가능한 환자 및 인구통계학
이 연구에서는, 중간 연령 59세(최연소: 34세; 최고령: 83세)의 여성14명(28%) 및 남성 36명(72%)으로 이루어진 총 50명의 환자를 평가하였다. 이 그룹의 인종 백그라운드는 코카시안 39명, 히스패닉 6명, 아시안 3명, 그리고 아프리카계 아메리칸 2명을 포함하였다. 50명의 환자 모두에 대해TS발현과ERCC1발현 수준을 생존과 연관지어 평가할 수 있었다. 45명(90%)은 전술한 기준에 의해 이 분자 파라미터와 반응과의 연관성을 평가할 수 있었다.
TS
발현 수준 및
ERCC1
발현 수준
현미 해부된 FPE 전처리 종양 샘플로부터 전체 mRNA를 분리하고, 정량적 RT-PCR을 사용해서ERCC1:β-악틴 및/또는TS:β-악틴의 상대적 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 이러한 샘플로부터 mRNA를 단리하는 방법은 실시예 1 및 미국 특허 출원 09/469,338(1999년 12월 20일 출원됨)에 기재되어 있는데, 이 문헌은 그 전체로서 본 명세서에서 참고로 포함된다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 역전사/폴리머라제 연쇄 반응(RT/PCR)계 분석 시스템을 사용하여ERCC1및 β-악틴의 발현 수준을 결정하였다. 실시예 3, 4 각각에 기재된 바와 같이, 보정된 상대적ERCC1및/또는TS발현을 결정하였다.
TS유전자 발현은 분석된 50개의 샘플 모두에서 검출되었다. 하우스키핑 유전자인 β-악틴에 대하여 보정된TS발현의 중간값은 3.4 x 10-3이었다(최소: 0.18 x 10-3; 최대: 11.5 x 10-3). 보정된ERCC1유전자 발현은 분석된 47개 샘플(94%)에서 검출가능하였다. 보정된ERCC1유전자 발현의 중간값은 2.53 x 10-3이었다(최소:0.00; 최대: 14.61 x 10-3). 성, 연령 및 인종 기원에 의해 분석하였을 때, 보정된TS및ERCC1mRNA 발현에 있어서 유의적인 차이는 발견되지 않았다.
TS
발현과 관련된 생존
이 연구에서 분석된 50명의 환자에 대한 10.5 개월의 후속 기간 중간값(95% C.I.: 1.8, 21.2)에서, 생존의 중간값은 8.4 개월이었다(95% C.I.:6.4, 12.3). 7.5 x 10-3의TS역치를 사용할 때, 43명의 환자(86%)는 낮은 보정된TS발현 수준을 가졌고, 7명의 환자(14%)는 높은 보정된TS발현 수준을 가졌다. 로그순위 검정을 이용하여, 보정된TS유전자 발현과 생존간의 관계를 평가하였다. 각각의 생존 곡선은 도 1에 제시되어 있으며, 낮은 보정된TS발현자 그룹은 10.2 개월의 생존 중간값(95% C.I.:7.4, 15.1)을 나타내고, 높은 보정된TS발현자 그룹은 1.5 개월(95% C.I.:1.1, 2.1)을 나타낸다(P<0.001; 로그순위 검정). 6개월에서의 생존 확률은 고발현자 그룹에 대한 0.00에 비해, 보정된TS발현 ≤7.5 x 10-3인 환자에 대해 0.77이었다. 단일변량 분석에서, 보정된TS수준 > 7.5 x 10-3인 환자는TS수준 ≤ 7.5 x 10-3인 환자에 비해 상대적 사망 위험이 8.4배(95% C.I.:2.63, 27.13) 높았다(p<0.001, 도 4).
ERCC1
발현과 관련된 생존
역치로서 4.9 x 10-3을 사용할 때, 40명(80%)은 낮은 보정된ERCC1발현을 가졌고, 10명(20%)은 높은 보정된ERCC1발현을 가졌다. 도 2는 생존 예상(평가) 확률 대 보정된ERCC1발현 수준의 카플란 메이어 플롯(Kaplan Meier Polt)을 도시하며, 저발현자 그룹에 대해 10.2 개월(95% C.I.: 7.8, 15.1)의 생존 중간값을 나타내고, 고발현자 그룹에 대해 1.9개월(95% C.I.:1.1, 4.9)의 생존 중간값을 나타낸다(P<0.001; 로그순위 검정). 6개월에서의 생존 확률은 보정된ERCC1발현 > 4.9 x 10-3를 가진 환자에 대하여 0.16인데 비해, 보정된ERCC1발현 ≤4.9 x 10-3을 가진 환자에 대하여 0.76이었다. 단일변량 분석에서, 보정된ERCC1수준 > 4.9 x 10-3을 가진 환자는 보정된ERCC1수준 ≤ 4.9 x 10-3을 가진 환자에 비해 상대적 사망 위험이 4.8배(95% C.I.: 2.09, 15.88) 높았다(p<0.001; 도 4).
ERCC1
및
TS
복합 발현과 관련된 생존
낮은 보정된TS및ERCC1발현 수준은 36명의 환자(72%)에서 검출되었고, 14명의 환자(28%)는 높은 보정된TS및/또는ERCC1발현 수준을 나타내었다. 상기 유전자 둘다에 대해 낮은 발현 수준을 가진 환자는 유의적인 탁월한 생존을 나타내었다. 생존 중간값은 낮은 보정된TS및ERCC1발현자에 대하여 11.1 개월(95% C.I.:8.4, 17.5)이었고, 높은 보정된TS및/또는ERCC1발현자에 대하여 1.9 개월(95% C.I.: 1.1, 4.9)이었다(P<0.001, 로그순위 검정; 도 3). 유전자 둘다에 대해 낮은 보정된 발현 수준을 가진 환자의 6개월에서의 생존 확률은 0.85인데 비해,TS또는ERCC1적어도 하나의 유전자에 대해 높은 보정된 발현 수준을 가진 환자의 경우 0.10이었다. 적어도 하나의 유전자(TS또는ERCC1)에 대하여 높은 보정된 발현을 가진 환자의 상대적 사망 위험은, 종양에서 두개의 유전자에 대해 낮은 발현 수준을 나타내는 환자에 비해, 7.12(95% C.I.:2.60, 19.52)였다(P<0.001; 도 4).TS및ERCC1mRNA 발현은 층화 분석에 의해 밝혀진 것과 같이 상호 독립적이다(도 5).
TS
및
ERCC1
유전자 발현 수준과 반응의 상관성
보정된TS발현 수준의 중간값은 45명의 측정가능한 환자에 대하여 3.4 x 10-3(최소: 0.18 x 10-3; 최대: 11.50 x 10-3)이었고, 전체 50명의 환자 집단과 동일하였다. 종양을TS저발현자 및TS고발현자로 분리하여 응답을 분석하였을 때, 일부 응답자 4명 중 3명(75%), 안정한 질병을 가진 환자 27명 중 26명(96%), 그리고 진행되는 질병을 가진 환자 14명 중 9명(64%)은 낮은 보정된TS발현을 나타내었다(P=0.02; Fisher's Exact Test; 도 9).
보정된ERCC1발현 수준의 중간값은 45명의 측정가능한 환자에 대하여 2.7 x 10-3(최소: 0.00; 최대: 14.61 x 10-3)이었고, 전체 50명의 환자 집단과 유의적인 차이는 없었다. 그러나,ERCC1발현 수준은 화학요법에 대한 반응에 관련해서는 통계학적으로 유의성이 없었다(p=0.29, Fisher's Exact Test).
Claims (24)
- 환자의 종양을 치료하기 위해서 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 이들의 배합물을 포함하는 화학요법 섭생을 결정하는 방법으로서,(a) 고정된 종양 샘플을 얻기 위해서, 종양의 조직 샘플을 얻고 샘플을 고정하는 단계,(b) 고정된 종양 샘플로부터 mRNA를 단리하는 단계,(c)ERCC1또는TS증폭된 샘플을 얻기 위해서, 엄격한 조건 하에ERCC1유전자의 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍, 또는 엄격한 조건 하에TS유전자의 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍을 사용하여 mRNA를 증폭 처리하는 단계,(d) 증폭된 샘플 내의TS또는ERCC1mRNA의 양을 측정하는 단계,(e) 단계(d)로부터 얻은TS또는ERCC1mRNA의 양을 내부 대조 유전자의 mRNA 양과 비교하는 단계, 및(f) 증폭된 샘플내의 TS 및/또는ERCC1mRNA의 양과TS및/또는ERCC1유전자 발현을 위한 역치 수준을 기초로 하여 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 이들의 배합물을 포함하는 화학요법 섭생을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 환자의 종양을 치료하기 위해서 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 이들의 배합물을 포함하는 화학요법 섭생을 결정하는 방법으로서,(a) 고정된 종양 샘플을 얻기 위해서, 종양의 조직 샘플을 얻고 샘플을 고정하는 단계,(b) 고정된 종양 샘플로부터 mRNA를 단리하는 단계,(c) 증폭된 샘플을 얻기 위해서, 엄격한 조건 하에ERCC1유전자의 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍을 사용하여 mRNA를 증폭 처리하는 단계,(d) 증폭된 샘플 내의ERCC1mRNA의 양을 측정하는 단계,(e) 단계(d)로부터 얻은ERCC1mRNA의 양을 내부 대조 유전자의 mRNA 양과 비교하는 단계, 및(f) 증폭된 샘플내의ERCC1mRNA의 양 및ERCC1유전자 발현을 위한 역치 수준을 기초로 하여 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 이들의 배합물을 포함하는 화학요법 섭생을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 환자의 종양을 치료하기 위해서 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 이들의 배합물을 포함하는 화학요법 섭생을 결정하는 방법으로서,(a) 고정된 종양 샘플을 얻기 위해서, 종양의 조직 샘플을 얻고 샘플을 고정하는 단계,(b) 고정된 종양 샘플로부터 mRNA를 단리하는 단계,(c) 증폭된 샘플을 얻기 위해서, 엄격한 조건 하에TS유전자의 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍을 사용하여 mRNA를 증폭 처리하는 단계,(d) 증폭된 샘플 내의TSmRNA의 양을 측정하는 단계,(e) 단계(d)로부터 얻은TSmRNA의 양을 내부 대조 유전자의 mRNA 양과 비교하는 단계, 및(f) 증폭된 샘플내의TSmRNA의 양 및TS유전자 발현을 위한 역치 수준을 기초로 하여 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 이들의 배합물을 포함하는 화학요법 섭생을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 환자의 종양을 치료하기 위해서 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 이들의 배합물을 포함하는 화학요법 섭생을 결정하는 방법으로서,(a) 고정된 종양 샘플을 얻기 위해서, 종양의 조직 샘플을 얻고 샘플을 고정하는 단계,(b) 고정된 종양 샘플로부터 mRNA를 단리하는 단계,(c)ERCC1및TS증폭된 샘플을 얻기 위해서, 엄격한 조건 하에ERCC1유전자의 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍, 및 엄격한 조건 하에TS유전자의 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍을 사용하여 mRNA를 증폭 처리하는 단계,(d) 증폭된 샘플 내의TS및ERCC1mRNA의 양을 측정하는 단계,(e) 단계(d)로부터 얻은TS및ERCC1mRNA의 양을 내부 대조 유전자의 mRNA 양과 비교하는 단계, 및(f) 증폭된 샘플내의TS및/또는ERCC1mRNA의 양과TS및/또는ERCC1유전자 발현을 위한 역치 수준을 기초로 하여 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 이들의 배합물을 포함하는 화학요법 섭생을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍ERCC1또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍으로 이루어지는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍으로 이루어진 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 종양이 결장직장 선암 종양인 방법.
- 제4항에 있어서, 프라이머는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍TS와 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍ERCC1로 모두 이루어지는 것인 방법.
- 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서,ERCC1유전자 발현의 역치 수준이 내부 대조 유전자 발현 수준의 약 4.9배인 방법.
- 제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서,TS유전자 발현의 역치 수준이 내부 대조 유전자 발현 수준의 약 7.5배인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 내부 대조 유전자가 β-악틴인 방법.
- 고정되고 파라핀 포매된 조직 샘플 내의ERCC1발현의 수준을 측정하는 방법으로서,(a) 탈파라핀화된 샘플을 얻기 위해서, 조직 샘플을 탈파라핀화시키는 단계,(b) 유효량의 카오트로픽(chaotropic) 제제의 존재 하에 탈파라핀화된 샘플로부터 mRNA를 단리하는 단계,(c) 증폭된 샘플을 얻기 위해서, 엄격한 조건 하에ERCC1유전자의 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍을 사용하여 mRNA를 증폭 처리하는 단계, 및(d) 내부 대조 유전자의 mRNA의 정량에 상대적인ERCC1mRNA의 정량을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍은 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍ERCC1또는 이것과 실질적으로 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍으로 이루어진 것인 방법.
- 고정되고 파라핀 포매된 조직 샘플 내의TS발현의 수준을 측정하는 방법으로서,(a) 탈파라핀화된 샘플을 얻기 위해서, 조직 샘플을 탈파라핀화시키는 단계,(b) 유효량의 카오트로픽 제제의 존재 하에 탈파라핀화된 샘플로부터 mRNA를 단리하는 단계,(c) 증폭된 샘플을 얻기 위해서, 엄격한 조건 하에TS유전자의 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍을 사용하여 mRNA를 증폭 처리하는 단계, 및(d) 내부 대조 유전자의 mRNA의 정량에 상대적인TSmRNA의 정량을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍은 올리고뉴클레오티드프라이머 쌍TS또는 이것과 실질적으로 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍으로 이루어지는 것인 방법.
- 제12항 또는 제14항에 있어서, 내부 대조 유전자가 β-악틴인 방법.
- 제12항 또는 제14항에 있어서, mRNA 단리는(a) 유효 농도의 카오트로픽 화합물을 포함하는 용액 중에서 조직 샘플을 약 75℃ 내지 약 100℃ 범위의 온도로 약 5 분 내지 약 120 분의 시간 동안 가열하는 과정, 및(b) 상기 mRNA를 카오트로픽 용액으로부터 회수하는 과정에 의해 수행되는 것인 방법.
- 서열 번호: 1의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
- 서열 번호: 2의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
- 서열 번호: 3의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
- 서열 번호: 4의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
- 올리고뉴클레오티드 쌍ERCC1또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 쌍을 포함하는ERCC1유전자의 발현을 검출하는 키트.
- 올리고뉴클레오티드 쌍TS또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 쌍을 포함하는TS유전자의 발현을 검출하는 키트.
- 올리고뉴클레오티드 쌍TS또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 쌍 및 올리고뉴클레오티드 쌍ERCC1또는 이것과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 쌍을 포함하는TS및ERCC1유전자의 발현을 검출하는 키트.
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Legal Events
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Patent event date: 20101201 Comment text: Written Judgment (Patent Court) Patent event code: PJ13021S01D Request date: 20100510 Decision date: 20101112 Appeal identifier: 2010201003233 Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal |