TWI308871B - Preparation of alkali soluble polysaccharides from panax quinquefolium, process for making and use in enhancing immunity of the same - Google Patents

Description

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V 九、發明說明： 發明所屬之技術領域 本發明係關於一種西洋签私、，六wΑ丨 裡四年參鹼/备性多醣製劑，其製備方 •法及提昇免疫力的用途，尤其指從西洋蔘(細αχ棒押/o"Mm) .根部殘心—驗性水溶液萃取出來的西洋蔘驗溶性多醋製 劑。 先前技術 • A ^ {Panax ginseng C. A. Meyer)^ ® ^ ^ {Panax 同屬五加科cefle)植物，兩者的根部 在亞洲尤其是中國有長久的藥用歷史，也都被中醫和傳統 醫學認為是相當安全而有效的高貴藥材。中國人歷來很重 視人蔘的治療、補益功效，人蔘被認為具有大補元氣、大 補虛損、促進新陳代謝及血液循環、強身健體的功效。人 蔘適合老人、病後虛弱的人士使用。目前也有許多學術文 φ 獻提到人蔘對免疫反應的影響，例如人蔘能夠提高服用者 對外來感染的抵抗力 '減少不良的過敏反應、抑制體内腫 瘤的生長，也從細胞的層次觀察到人蔘對基本免疫因子的 調控現象。 西洋蔘一般被認為和人蔘有類似的效果，但兩者還是 屬於不同的植物。中醫認為兩者在療效上有相當大的差 別。西洋蔘主要出產於美國、加拿大等地，以美國威斯康 辛州所出產的西洋蔘質優且量多。西洋蔘性寒涼，所以最 適合「熱氣」時飲用。花旗蔘能夠益氣降火、解酒清熱、 1308871 提神健脾開胃，適合工作繁忙引致睡眠不足之人服用。 傳統上大都認為人蔘和西洋蔘中的有效成分是人蔘皂 苷（Ginsenosides)，早期大部分學術研究都以人蔘皂苷為主 要研究對象。近來才有一些學者開始注意人蔘中各種多醣 ，成分的生理活性，其中曰本共立藥科大學（Kyoritsu College of Pharmacy)的Tomada教授研究室做了一系列有關人蔘 {Panax ginseng C. A. Meyer) ^ m % 5 以熱水萃取的人 I 蔘液中萃取純化出兩種酸性多醣Ginsenan PA和Ginsenan PB [Tomoda et al., 1993, Biol Pharm. Bull., 16, 22-25.; Tomoda et al., 1994, Biol Pharm. Bull., 17, 1287-1291.] » ^ 成分分析得知，Ginsenan PA和Ginsenan PB的分子量分別 為 160,000 和 55,000。Ginsenan PA 的單聽組成為 21.3% arabinose, 53.4% galactose, 2.0% rhamnose, 16.0% galacturomic acid 和 2.7% glucuronic acid，其組成比例為 11:22:1:6:1。Ginsenan PB 的單醣組成為 ii_〇% arabin〇se， 鲁 32.2% galactose, 8.1% rhamnose, 39.9% galacturomic acid 和5.0% glucuronic acid，其組成比例為3:7:2:8:1。根據實 驗結果’這兩種多醣都有明顯的提升免疫活性的效果。 日本的北里研究所（Kitasato Institute)的東洋醫學綜合 研究所的Yamada研究困隊，從人蔘c.儿 Μβγα)的葉片和根部中分離出多個多醣成分，並詳細比較 其中結構和活性的差異[Gao et al.，1989, Planta Mediea，55, 9-12·】。從中國大陸所得到的人蔘的葉片和根部，先以酒精 萃取去除人蔘皂苷的成分’再用水萃取殘渣，水萃後的殘 1308871

- 留物再用0.5M NaOH水溶液萃取，可從人蔘葉片中分離出 水溶性多醣GL-2和鹼溶性多醣GLA-2，及從人蓁根部可分 離出水溶性多醣GR-2和鹼溶性多醣GRA-2。這四種多賭 再依照組成單醣的酸性成份多寡，再做進一步的分離純 •化’可得到許多不同的多醣成分，其中幾種多醣成分都具 有特殊生理活性’如GL-3具有最強的抗補體活性 (Anti-Complementary-Effect)、GL-BIII 具有明顯保護黏膜 • 細胞，減少胃潰瘍發生機率的效果。然而根據Yaniada團隊 所發表的文獻[Sun et al·，1991，J. Ethnopharmacol.，31， 101-107.] ’ 從人蔘Λ/e少er)所萃取的驗 溶性多醣產率非常的低，鹼溶性多醣（GRA_2)產率只有 0.49%(重量百分比;）’每100公克的人蔘只能萃取出〇 49 公克的鹼溶性多醣。雖然GRA-2在老鼠實驗中具有非常明 顯的抑制胃潰瘍的活性，但因為產率實在太低，難以生產 足夠的鹼溶性多醣，以供後續實驗而沒有做進一步的深入 • 探討’該團隊後續的研究大都偏向於人蔘葉片所萃取出的 多醣部份。 中國大陸的白求恩醫科大學的研究團隊從西洋蔘 中分離出一種水溶性多醣PPq_丄[Ma et al., 1997, Baiqiuen Yike Daxue Xuebao, 23, 236-238.; Zhu et al.，1997，Zhongguo Yaolixue Tongbao，13，76-78.1，這種 多醣能刺激老鼠的脾臟淋巴球產生細胞激素，促進白血球 的轉化增生，進而提高免疫能力。 加拿大的一家生技公司C.V. Technologies也致力於研 1308871 .. 究西洋蔘多醣的免疫活性，該公司從西洋蔘萃取水溶性多 醣成分 CVT-E002【Shan et al” 2002, US patent 6,432,454】，再從CVT-002多醣中分離純化出PQ2, PQ223 等成分。這些成分都有明顯增強免疫活性的能力。從老鼠 的臨床前研究可以發現，這些水溶性多醣成分可以刺激脾 臟淋巴細胞分化成為免疫B細胞，使B細胞產生大量的抗 體。增加血清中免疫球蛋白如IgG的數量同時也會刺激巨 嗤細胞產生各種細胞激素（Cytokine)如IL-1，IL-6和TNF-α等。該公司認為西洋蔘水溶性多醣的這些正面提高免疫 活性的能力，可用來幫助人類抵抗外來的感染或一些和自 體免疫有關的疾病。該公司取得美國專利US6,432,454，並 已將西洋蔘水溶性多醣CVT_E〇〇2開發成預防感冒的健康 食扣COLD-fX®，在歐美市場有不錯的反應，目前cVTE〇〇2 在美國和加拿大同時進行人體臨床實驗。 西洋蔘有很大一部分被用來萃取皂苷及水溶性多醋等 成分，這些加工萃取西洋蔘的工廠，會產生很多的蔘渣 (ginsengmarc)。1〇〇公斤乾的西洋蔘切片經乙醇和熱水分 別萃取皂苷和水溶性多醣之後，會產生大約50公斤的西洋 蔘渣。這些蔘渣傳統上被認為是低價值的副產物，到目前 為止，就發明人所知，並沒有任何的文獻或專利提到西洋 蔘渣具有任何醫療上的應用價值，西洋蔘渣通常被萃取工 廠S作動物飼料添加物出售，一公斤的蔘渣售價口 元左右。 ^ ^ 1308871

發明内容 本發明的一主要目的在提供一種為從佔西洋蔘乾重 50/。的西洋萎)查萃取出具有藥效的部份的技術。 本發明揭露了一種新的鹼溶性多醣製劑，是從西洋蔘 (7>抓似gw叫we/o/iMw)的根部利用鹼性水溶液萃取及進一 步純化而獲得。本發明亦揭露了生產該西洋蔘鹼溶性多醣 製劑的方法，以及該西洋蔘鹼溶性多醣製劑在醫療上的應 • 用。西洋蔘的根部的切片經過熱水及/或醇類萃取後的蔘 渣，利用鹼性水溶液加以萃取並進一步純化的多醣製劑， 經實驗證明具有顯著的提升免疫力的效果^在低劑量的多 醣製劑下就能顯著的提高免疫細胞的活性。在臨床上將可 用來治療或預防和免疫方面有關的疾病，例如感冒、愛滋 病和癌症等。 本發明的較佳實施態樣包括（但不限於）下列項目： 1.一種製備西洋蔘鹼溶性多醣製劑的方法，包含下列 φ 步驟： A) 以一驗性水溶液年取一西洋蔘（戶㊇㈣“吻如㈣根 部殘渣’其中該西洋蔘根部殘渣包含以一極性溶劑萃取西 洋蔘根部之人蔘t苷及水溶性多醣，和經由固液分離該糨 性溶劑萃取混合物所產生之殘渣部份； B) 固液分離步驟A)所獲得的驗性水溶液萃取渡合物， 以得到一含有鹼溶性多醣的液體部份；及 C) 純化該含有鹼溶性多醣的液體部份，以獲得一中性 的驗溶性多醣製劑。 1308871 2. 如第1項的方法’其中步驟c)的純化包含下列步驟： 藉由加入一酸而中和步驟B)的液體部份； 乾燥所獲得中和的液體，而獲得一中性的鹼溶性多醣 製劑。 3. 如第1項的方法’其中步驟c)的純化包含下列步驟： 加入CrC3醇至該步驟B)的液體部份，於是產生鹼溶 性多醣的沈澱； • 藉由固液分離手段取得該鹼溶性多醣的沈澱； 將該驗性溶多醣的沈澱與選自醇或水，Cl_C3 醇的混合溶劑混合’而獲得鹼溶液多醣增濃的混合物； 藉由加入一酸而中和鹼溶液多醣增濃的混合物； 藉由固液分離手段從被中和的混合物取出鹼溶性多餹 固體；及 乾燥該鹼溶性多醣固體而獲得一中性的鹼溶性多聽製 劑。 φ 4.如第3項的方法，其中該CVC3醇為乙醇。 5. 如第1項的方法，其中步驟C)的純化包含下列步驟： 以一分子篩過濾步驟B)的液體部份以獲得的分子質量 大於3〇〇〇道耳吞的部份； 藉由加入一酸而中和該分子質量大於30〇〇道耳吞的 部份；及 乾燥該中和的分子質量大於3000道耳吞的部份而赛 得一中性的鹼溶性多醣製劑。 6, 如第1項的方法，其中步驟C)的純化包含下列步驟 10 1308871 以一分子篩過濾步驟B)的液體部份以獲得的分子質量 大於10000道耳吞的部份； 藉由加入一酸而中和該分子質量大於10000道耳吞的 部份；及 •乾燥該中和的分子質量大於10000道耳吞的部份而獲 得一中性的驗溶性多酶製劑。 7. 如第1項的方法’其中步驟c)的純化包含下列步驟： • 以一分子篩過濾步驟3)的液體部份以獲得的分子質量 大於3000道耳吞的部份； 將該分子質量大於3000道耳吞的部份與水混合； 再以一分子篩過濾該分子質量大於3〇〇〇道耳吞的部 份與水的混合物，以獲得第二次過攄的分子質量大於3〇〇〇 道耳呑的部份； 藉由加入一酸而中和該第二次過濾的分子質量大於 3 000道耳呑的部份；及 • 乾燥該中和的分子質量大於3000道耳吞的部份而獲 得一中性的驗溶性多醣製劑。 8. 如第1項的方法，其中步驟C)的純化包含下列步驟： 以一分子篩過濾步驟B)的液體部份以獲得的分子質量 大於10000道耳吞的部份； 將該分子質量大於10000道耳呑的部份與水混合； 再以一分子篩過濾該分子質量大於1〇〇〇〇道耳吞的部 份與水的混合物，以獲得第二次過濾的分子質量大於ι〇_ 道耳呑的部份； 1308871

藉由加入—酸而中和該第二次過濾的分子質量大於 10000道耳吞的部份；及 乾燥該中和的分子質量大於1 0000道耳呑的部份而獲 得一中性的鹼溶性多醣製劑。 9.如第5、6、7或8項的方法，其中該乾燥為噴霧乾 燥或冷凍乾燥。 1 〇.如第1項的方法，其中該中性的鹼溶性多醣製劑 • 具有一介於5,0〇〇至1，〇〇〇,〇〇〇的分子量。 11. 如第10項的方法，其中該中性的鹼溶性多醣製劑 =有兩主要部份，第—部份具有約10 000的分子量及第二 部份具有約900,000的分子量。 一 12. 如第11項的方法，其中該卡性的驗溶性多酶製劑 的第一部份的含量大於第二部份。 13. 如第11項的方法’其進一步包含分離該中性的鹼 溶性多醣製劑的第一部份及第二部份，其中該第一部份或 鲁第二部份被作為該中性的鹼溶性多醣製劑。 3 14. 如第1項的方法，其中該西洋蔘根部殘渣包含以 水、甲料乙醇或它們的混合物萃取西_蔘根部一次 次所產生之殘渣部份。 落夕 ,π η π·令低部緣渣包含 ⑽代以水萃取西洋蔘根部二次所產生之殘邊部份。 Κ如第i項的方法’其中步驟Α)的萃取 、w 8〇°C進行。 、'皿 17·如第16項的方法，其中步驟A)的驗性水溶液具 12 1308871 . 一不小於12的pH值。 18. 如第16項的方法，其中步驟a)的鹼性水溶液為 0.4-10 g/LNaOH水溶液’及該萃取係於室溫進行〇 $ 時。 19. 種西洋蔘鹼溶性多醣製劑，其係如前述第】至 項中任一項所述的方法製備者。 20. 一種具有提昇免疫力的組合物，其包含—提昇免疫 力有效量作為有效成分的如第19項所述的西洋篆驗溶性 多醣製劑。 實施方式 本發明揭露了一種從西洋蔘根部的殘邊製備出中性的 驗冷ί生夕聽製劑的方法，及對該製劑進行對於刺激免疫細 胞的增生的實驗’例如人類周邊血單核細胞(Human p—heral Bl00d MononucIear Ceu，pBMCs)，以評估該製 φ 劑提升免疫力的活性。 本發明亦包括對該製劑進行基本的分子量分析，從其 中刀離出不同的分子量部份或單醣，以及評估該不同的分 子量部伤或單醣提升免疫活性的能力。 從西洋筹根部萃取純化西洋蔘皂苷和水溶性多醣，已 經是非常成熟的技術，例如前述美國專利6,432,454。該專 利内容藉由參考方式被併入本案。北美和中國大陸有許多 生產西洋蔘萃取物的公司。萃取西洋蔘水溶性多醣通常是 採用熱水萃取，萃取西洋蔘皂苷則通常使用不同比例的水/ 13 乙醇混合溶劑來萃取純化。適用於本發明作為起始原料的 西、洋篆根㈣訪4絲何6知^法萃取西洋蔘水溶性 多膽及西洋蔘皂苷後殘留的西洋蔘根部殘渣。 實驗 本發明將從加拿大購買的乾燥西洋蔘根部切# 40公 斤，以400公升純水90〇c萃取i小時，殘留的幕片再用 320 A升純水9〇£>c萃取i小時，兩次萃取合併，即得到富 含西洋蔘皂苷和水溶性多醣的萃取液，經過兩次熱水萃取 後殘留的蔘澳收集後，經過⑽。c烘乾，粉碎後過一 6〇網 目的4 ’可得到 '約20公斤的乾燥西洋蔘渣粉末保存備用。 田含西洋蔘皂苷和水溶性多醣的萃取液喷霧乾燥後得 到約5公斤西洋蔘皂苷和水溶性多醣的混合物在經過不 同濃度的酒精濃度萃取，照一般已習知的純化流程，純化 後得到西洋蔘總皂# SA1 ’富含人蔘皂苷Rbi細We Rbl)的西洋蔘皂苷SA2，富含人蔘皂苷 的西洋蔘皂苷SA3，以及西洋蔘水溶性多醣SB4。將SA1， SA2, SA3, SB4溶於適量的甲醇中，再以Rp_ci8管柱進行 HPLC分析。從分析結果得知SA1含有7〇%以上的西洋蔘 總皂苷，SA2所含有的皂苷成分中，RM佔總皂苷成分的 80.1%; SA3所含有的皂苷成分中，以佔總皂苷成分的 而水溶性多醣SB4的總皂苷含量則在1%以下。 從刖述備用的乾燥西洋蔘渣粉末製備中性的鹼溶性多 醣製劑（以下簡稱ST-GRAPs)的實驗室製造流程如圖j所 1308871 不。用兩種不同的萃取條件萃取其中所含的鹼溶性多酷。 萃取條件a.是較溫和的萃取條件，用%(w/v)的氬氧化 鈉’室溫攪拌1小時萃取。萃取條件b.是較劇烈的萃取條 件’用1 % (w/v)的氫氧化鈉，6〇。(：攪拌1小時萃取。強驗 • 萃取後用離心機作固液分離，離心機轉速3000轉，1〇分 鐘。離心後取上清液，下層污泥狀固體棄置。上清液加入 等體積的95%藥用酒精，使鹼溶性多醣體脫水形成膠體。 φ 因為酒精和水混合會同時產生許多氣泡，氣泡黏附在多醣 膠體上，使膠體會懸浮於酒精水溶液上層。靜置後將多醣 膠體輕輕倒出，棄置下層的酒精水溶液。倒出的透明膠體 利用快速攪拌讓黏附在膠體上的氣泡逸出，使多醣膠體可 以再溶液中沉澱，用離心機離心，轉速3〇〇〇轉，i 〇分鐘。 收集沉澱的米白色沉澱物，棄置上層液。米白色多醣沉澱 物再加入60%的酒精水溶液，攪拌清洗後加入3NHc丨調整 pH值到中性（pH=6.8〜7)，調整pH值之後再用離心機離心， • 轉速3000轉，10分鐘，收集白色的鹼溶性多醣沉澱。白 色的多醣沉澱用50〇C烘箱隔夜烘乾後，得到淺黃色薄片， 再用小型粉碎機將薄片打成粉狀，過篩（1〇〇網目），得到 ST-GRAPs的半成口口口。ST_GRAPs的半成品再經過水溶解， 確認水溶液pH為中性後，用普通濾紙抽氣過濾去除不溶顆 粒。澄清濾液在加入等體積的95%藥用酒精，收集沉澱物 乾燥後，得到中性西洋蔘鹼溶性多醣製劑（ST_GRAPs)成品。 經過較溫和萃取條件（前述萃取條件a)及上述純化步 驟後，每100公克的西洋蔘渣可分離出約6公克st_GRAPs 15 is 1308871 . -成品SB1 (產量。經過較劇烈萃取條件（前述萃取條件 b)後經上述酒精純化步驟，每丨〇〇公克的西洋蔘渣可分離 出約14公克ST-GRAPs成品SB2 (產量14%)。 本發明從西洋蓁渣所純化的中性鹼溶性多醣製劑的產 蓋依不同純化步驟約在6〜15 %左右，比之前日本北里研究 所從人蔘（户㈣以c汷蔘渣所分離的鹼溶性 多醣（GRA-2)產率〇·49%，明顯的高出許多（12〜3〇倍）。西 鲁 斗卷（Panax quinquefolium)和 k 春、panax ginseng c. Α, 是不同種類的植物，在中醫的藥效上也有明顯的不 同，本發明也發現了西洋蔘蔘渣含有比人蔘蔘渣高出以倍 以上的驗溶性多醋β 以上已從西洋蔘根部的熱水萃取液純化出西洋蔘水溶 性多醣SB4，熱水萃取後的西洋蔘渣用鹼水溶液萃取得到 ST-GRAPs成品SB1和SB2 ’共三種多醣體。將sbi，8幻， SB4這三種多醣製劑分別用膠體過濾層析（Gpc)作分子量 • 分佈分析’用聚環氧乙烷（P〇lyethyleneoxide，pE〇)作為分 子量對照標準品。分析結果如圖2a，2b及2c所示，在圖 2a及2b中可以明顯看出ST_GRAPs的SB1和sB2具有相 似的分子量分布，兩者的分子量分布圖譜在滯留時間145 和1 8分鐘左右有明顯的波峰，所對應的分子量分別為 900,000和10,000左右，SB2的高分子量波峰（滯留時間 ==14.5)面積要比SB1的高分子量波峰（滯留時間=145)面積 小，表示SB2的平均分子量略小於SB1的平均分子量 一 可能是因A Φ洋蔘渣所含的驗溶性多醣經過較劇烈的萃=

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條件導致分子量斷鏈，而SB1的溫和萃取條件能保存較完 整的多醣結構。西洋蔘水溶性多醣製劑SB4的分子量分布 則和ST-GRAPs有明顯的不同。如圖2c所示，SB4的最大 分子量小於500,000，且分子量分布非常寬廣，沒有明顯的 波峰。SB4分子量廣泛分布在1〇〇〇〜1〇〇 〇〇〇之間由此分 子量的分析來看，西洋蔘根部所含的水溶性多醣製劑和西 洋蔘造所含的鹼溶性多醣製劑具有非常不同的分子量分 布，鹼溶性多醣製劑和水溶性多醣製劑應該是兩類具有不 同多醣組成的多醣製劑。 為了比較西洋蔘所萃取出來的各種製劑對免疫調控的 活性，本發明利用體外培養之免疫細胞，針對西洋蔘所萃 取純化的六種不同之西洋蔘萃取製劑，SA1 (西洋蔘總皂 苷）、SA2 (富含人蔘皂苷ginsenoside Rbl的西洋蔘皂苷）、 SA3 (富含人蔘皂苷ginsenoside Re的西洋蔘皂皆）、SB1 (經 由溫和條件萃取的西洋蔘驗溶性多酷）、SB2 (經劇烈條件所 萃取的西洋蔘鹼溶性多醣）及SB4 (西洋蔘水溶性多醣），進 行初步的免疫調節活性檢測。以不同濃度之各萃取製劍 (SA1，SA2, SA3, SB1，SB2, SB4; 0~200 Kg/mL)，佐以市售 已知之免疫促進劑與抑制劑，處理體外培養之人類免疫細 胞，測試其免疫調節活性及有效濃度。本實驗以三個健康 受試者血液檢體之免疫細胞，以不同濃度之各萃取成份處 理後，佐以市售已知之免疫促進劑與抑制劑，偵測其細胞 活性、細胞存活率、及作用時間範圍，以評估各萃取成份 之免疫調控活性。 17 免疫細胞（人類周邊jk單核細胞）之分離 實驗步驟： 1. 在室溫無菌環境下將購得之7.5 mL白血球濃厚液 置於離心管中’加22.5 mL緩衝液（Hank's balanced salt solution ; HBSS)稀释血球，混合均勻後緩慢注入 到有 15 mL Ficoll-Paque Plus (Density = 1.077 士 0.001 g/mL)的離心管内，進行離心。 2. 收集中間之人類周邊血單核細胞層’並加入適量的 HBSS緩衝液稀釋’經離心洗去Ficoll-Paque Plus溶 液。 3‘ 加入9 mL無菌水將紅血球漲破後，迅速加入i mL 之1 OX HBSS混勻，以維持細胞滲透壓。 4 · 離心去除上清’加入適量培養基使細胞均勻懸浮後， 進行細胞計數。 細胞增生狀況測試 使用96井盤（well plate)，每個井分注2 X 1〇5個細胞， 並加入不同濃度之各萃取製劑，使製劑最終濃度分別為 3-125、6·25、12.5、25、50、100、200 pg/mL。每種細胞 不同的藥物及濃度各做四重複，並以植物凝集素 (phytoagglutinin; PHA)及環孢靈（cyclosporin A, Cyclo A) 分別做為正對照組與負對照組，培養72小時後，利用WST_ i 方法，檢測不同濃度之各萃取成份是否影響體外培養之人 類週邊血單核球細胞（PBMCs)之細胞存活率，同時探對 1308871 .

是否能促進或抑制細胞之增生。 WST-l Assay—細胞存活率與增生反應測定 利用細胞粒線體内脫氫酶（dehydrogenase)之活性，測 得細胞數目及活性。粒線體為呼吸作用之處，有許多由脫 .氫酶所催化之還原反應發生，細胞之呼吸作用越旺盛則脫 氫酶之活性會越高。WST-1 (4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetra-zolio]-l, 3-benzene disulfonate) ’於細胞内可受粒線體内脫氫酶除去 B 氫離子，形成水溶性formazan，如圖3所示，在波長45〇 nm 有很強之吸光值，而細胞活性越高或細胞數目越多，所i 現的顏色也越深，故可以WST-l偵測細胞之活性及細胞數 目’也因為所產生的formazan為水溶性，於懸浮性細胞株 或貼附型細胞株皆適用’在靈敏度與分析上也較為準確。 統計方法 統計三個健康人體細胞的實驗結果，標準化後，叶算 φ 其平均值、標準偏差’分析各組是否具有統計上的意義（p 值大於0.05不具統計意義，p值小於〇.〇5方具統計意義， * : P < 0.05，" ： p < 0.01)，並製圖如後所示。以公式：（加 藥組-空白控制組）/空白控制組*100%所求得之促進百分 比則製表附於圖下（如圖4〜圖9)。 結果與討論 每一組實驗中，PHA和Cyclo. A都被加入作為正對照 組和負對照組’在實際數據中可以看到PHA明顯提高的免 疫細胞PBMCs的細胞活性，平均可增加細胞活性達 1308871 胞活性有抑制效果， 實驗都可以看到非常 71.8% ’而作為負對照組的Cycl〇. A則明顯對pBMCs的細 ’平均可抑制細胞活性達56.4% ^各組 腎一致的結果，證實本實驗所施行的這 個免疫自b力調控實驗是明破有效的方法。 如圖4和圖5所示，SA1(西洋蔘總皂苷）、sa2(富含 人蔘皂苷ginSenoside Rbl的西洋蔘皂苷）對pBMCs的細胞 活性具有促進作用，和空白控制組比較，# sai添加濃度 為 25 us/mT. Bi· , ηίτ、，土 λα /〇、/-—.、.

的活性增生曲線非常相似。另外在圖6中可以看出，SA3 (富 • 含人蔘皂苷ginsen〇sideRe的西洋蔘皂苷）的添加濃度低於 50 pg/mL時，對細胞活性沒有明顯的促進作用，要到極高 濃度200 pg/mL才會有明顯的促進作用，促進百分比 40.86%，只達到PHA的促進百分比66 〇8%的〇 62倍左右。 結合這三張圖的結果可以看出，西洋蔘皂苷中主要的兩種 成分人蔘皂苷Rbl和Re’對免疫促進效果較明顯是人蔘皂 苷Rbl，而人蔘皂苷Re則幾乎沒有促進免疫的效果。這部 分的實驗證實西洋蔘皂苦萃取物可以刺激免疫細胞增生並 提高免疫細胞的活性’其主要有效的皂苷成分為人篆息苦

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Rbl。免疫細胞活性在皂苷低濃度（3 125〜25叫/瓜“時，逐 漸隨著皂苷添加濃度增加而上升，當皂苷添加濃度超過 5〇Mg/mL，細胞活性則出現明顯下降的情況。 圖7和圖8則是本發明所揭露的中性鹼溶性多醣製劑 - ST-GRAPs對免疫細胞刺激增生的實驗結果，圖7是添加經 由溫和條件萃取的ST-GRAPs製劑SB1，在三個不同受試 者的週邊血單核球細胞（PBMCs )之細胞存活率實驗中都 • 出現非常一致的結果^ SB1可以明顯刺激免疫細胞增生， 且免疫細胞增生活性和SB1的添加量成正相關。添加濃度 高達200 pg/mL也不會造成細胞的死亡，和人蔘皂苷RM 添加濃度超過50 pg/mL即造成細胞死亡有很明顯的差別。 SB 1添加濃度為25 pg/mL時，細胞活性的促進百分比為 162.21%，比PHA的促進效果高出2. π倍，和西洋蔘皂苷 的促進效果相當。當SB1的添加濃度到達2〇〇叫/〇1[時， 細胞活性促進百分比可達到PHA的3.95倍。圖8是添加經 φ 由劇烈條件萃取的ST-GRAPs製劑SB2。基本上SB2對免 疫細胞活性促進的趨勢和SB 1相同。活性隨著SB2的添加 濃度添加而上升。但SB2在低濃度的促進效果略低於SB1， SB2添加濃度為25 pg/mL時，細胞活性的促進百分比為 59.63%，只有PHA促進效果的〇 73倍。SB2添加濃度為 2〇〇0§/1111^時，細胞活性的促進百分比為24〇.13<)/。，達到 PHA促進效果的2.96倍。SB2的促進免疫細胞活性的效果 明顯比SB 1低’這可能是因為經過較高溫度和較高濃度氫 氧化納水溶液萃取，造成西洋蔘鹼溶性多醣的分子結構變 1308871

V 化。這點也可以從GPC分子量分析得到印證， 在之刖的實驗數據（圖2)中，就可以看出SB2的分子量分布 和SB1有所不同，多醣分子經過劇烈條件萃取而導致分子 量變小。 • 以上實驗結果顯示本發明的ST-GRAPs是一種有效的 免疫細胞活性促進劑，在體外實驗證實ST-GRAPS可以明 顯提面人類週邊血單核球細胞（PBMCS)的活性。 • 圖9的實驗中採用的添加物的西洋蔘水溶性多醣 SB4’從人蔘或西洋蔘的熱水萃取物中可以純化出多種水溶 性多醣，也是目前許多研究團隊研究的方向。加拿大的一 家生技公司C. V. Technologies從西洋蔘萃取水溶性多醣成 分CVT-E002，並成功的將CVT_E〇〇2開發為提高免疫力、 預防流感的健康食品（US patent 6,432,454)，也正進行相關 的一些臨床實驗。本發明利用自行從西洋蔘熱水萃取物所 純化的西洋蔘水溶性多醣SB4，進行同樣的體外刺激人類 • 週邊血單核球細胞（PBMCs)活性的實驗。在圖9中可以 看出SB4在很低的濃度就可以明顯提高免疫細胞的活性， SB4添加濃度為3.125 pg/mL時，細胞活性的促進百分比為 158.86%，達到PHA促進效果的1.95倍，添加濃度超過625 Hg/mL時’免疫細胞活性即開始隨著SB4的添加濃度增加 而明顯下降，這種超過某個添加濃度免疫細胞活性反而隨 著添加濃度增加而降低的情況，和添加人蔘息普Re的實驗 中’所觀察到的情況相似。這可能是過高的藥物濃度造成 部分細胞被毒殺而死亡’或細胞被過度刺激生長過甚導致 22 1308871 膂 死亡。 综合以上的實驗結果可以發現，Sai，SA2, SBl, SB2, SB4在體外實驗中都具有明顯促進人類免疫細胞活性的效 果。在西洋蔘皂苷萃取物SA1和SA2實驗中，促進免疫細 胞活性的效果在添加濃度在25 pg/mL達到最大值，然後促 進效果隨濃度增加而降低。在西洋蔘水溶性多醣SB4實驗 中，促進免疫細胞活性的效果在極低添加濃度3 125 pg/mL 時就達到最大值，然後隨添加濃度增加快速降低。本發明 所揭露的西洋蔘鹼溶性多醣製劑SB1，SB2的實驗中，免疫 細胞增生活性和添加濃度成正相關，即使添加濃度高達2〇〇 Kg/mL也不會造成免疫細胞的死亡。這三種不同的實驗結 果可忐代表了运二種西洋蔘萃取物製劑有其不同的刺激免 疫細胞增生機制。之前所有西洋蔘功效的研究大都集中於 傳統熱水煎煮所可以溶出的西洋蔘皂普和水溶性多醣，經 過熱水萃取後的蔘渣在各國專利及研究文獻上沒有看到有 任何的利用研究。本發明從西洋蔘渣製備出鹼溶性多醣製 劑，並證明其具有很高的潛力被開發作為免疫促進的藥物 或健康食品’將可用來預防或治療免疫相關疾病如如一般 感冒、流行性感冒、愛滋病和癌症等。 本發明亦提出一種從西洋蔘渣製備中性的鹼溶性多醣 製劑ST-GRAPi放大量產製程。如圖所示，3〇〇公克 的乾燥西洋蔘〉査粉，採用溫和的室溫萃取條件用1 $公升 0·1 %(w/v)的氫氧化鈉，室溫攪拌25〇〇卬瓜，i小時萃取。 用離心和過濾去除〇45 μιη以上的固體顆粒後，先用分子 23 1308871 量10,00〇超過濾系統（分割（Cut-off) = 1 〇,〇〇〇 Da (道耳呑）） 將澄清的萃取液濃縮10倍，再用9倍濃縮液體積的純水稀 釋後進行第二次超過濾’洗去氫氧化鈉、鹽類和其他分子 量小於10,000的小分子。超過濾後的濃縮液再用少量的鹽 酸將pH值調回中性（PH= 6.8〜7_0)’冷凍乾燥後粉碎過筛 (100網目）得到鹼溶性多醣製劑ST_GRAPs的成品28.8公 克，產率9.6%。此量產製程可以避免使用沉澱多醣所需的 /酉精’避免回收酒精和節省生產成本，同時避免過多的醆 類（NaCl)殘留在鹼溶性多醣製劑ST_GRAPs的成品中。 圖式簡單說明 圖1顯示依本發明方法從乾燥西洋蔘渣粉末製備中性 的驗溶性多醣製劑的實驗室製造流程圖。 圖2a顯示依圖！的本發明製造流程用〇 l %(w/v)的氫 氧化鈉及室溫攪拌1小時萃取條件所製備的中性西洋蔘鹼 鲁溶性多酷製冑SB1的膝體過滤層析（Gpc)分子量分佈圖。 圖孔顯示依圖1的本發明製造流程用1.0。/。（w/v)的氫 氧化鈉及60°C攪拌1小時萃取條件所製備的中性西洋蔘鹼 溶性多酷製劑SB2的膠體過滤層析（Gpc)分子量分佈圖。 圖2c顯示依習知方法從西洋篆根部的熱水萃取液純化 出西洋蔘水溶性多醣SB4的膠體過濾層析（GPC)分子量分 佈圖。 圖3顯示WST-1 -tetra-zolio]- 1 (4-[3-(4.1odophenyl)-2-(4-nitrophenyl).2H-5 24 1308871 .

V 3-benzene disulfonate)於細胞内受粒線體内脫氫酶除去氫 離子形成水溶性f〇rmazan的反應式。 圖4顯示添加SA1 (四洋蔘總皂苷）對體外培養小時 之人類PBMCs (週邊血單核球細胞）之細胞存活率的影響， • 其中同時顯示以免疫促進劑PHA(植物血球凝集素）與抑制 劑（cycl〇sporin A)為正及負對照組的結果。 圖5顯示添加SA2(富含人蔘皂苷RM)對體外培養μ 鲁小時之人類PBMCs (週邊血單核球細胞）之細胞存活率的影 響，其中同時顯示以免疫促進劑PHA(植物企球凝集素）與 抑制劑（cycl〇sporin A)為正及負對照組的結果。 圖6顯示添加SA3(富含人蔘皂苷Re)對體外培養 小時之人類PBMCs (週邊血單核球細胞）之細胞存活率的影 響，其中同時顯示以免疫促進劑PHA(植物血球凝集素）與 抑制劑（cyCi〇sporin A)為正及負對照組的結果。 圖7顯示添加圖2a的本發明的中性西洋蔘鹼溶性多醣 • 製劑SB1對髏外培養72小時之人類PBMCs (週邊血單核球 細胞）之細胞存活率的影響，其中同時顯示以免疫促進劑 PHA(植物血球凝集素）與抑制劑（cycl〇sp〇rin A)為正及負對 照組的結果。 圖8顯不添加圖2b的本發明的中性西洋蔘鹼溶性多醣 製劑SB2對體外培養72小時之人類pBMCs (週邊血單核球 細胞）之細胞存活率的影響，其中同時顯示以免疫促進劑 PHA(植物企球凝集素）與抑制劑（cyel〇sp〇rin A)為正及負對 照組的結果。 25 1308871 圖9顯示添加贐Λ 圖2C的習知西洋蔘水溶性多醣SB4對體 外培養72小時之人物 類PBMCs (週邊血單核球細胞）之細胞 存活率的影響，盆+ 凝集 ’ 丹干同時顯示以免疫促進劑PHA(植物血球 '、素）與抑制劑（eycl〇sporin A)為正及負對照組的結果。 圖 1 〇 _ 多醣製劑的放大量產製造流程圖 頌示依本發明方法從乾燥西洋蔘渣粉末製備中 性的鹼溶性

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Claims (1)

1. .1308871 月修正) 申請專利範圍：[丨ff HH 1 · 一種製備西洋蔘鹼溶性多醣製劑的方法了1含下列 步驟： A) 以pH值不小於12的一鹼性水溶液於室溫至8〇。匸 0 /〇㈣根部殘渣，其中該西洋寥根 部殘渣包含以水、甲醇或乙醇或它們的混合物萃取西洋蔘 根部之人蔘t普及水溶性多_，和經由固液分離該極性溶 劑萃取混合物所產生之殘渣部份； B) 固液分離步驟a)所獲得的鹼性水溶液萃取混合物， 以得到一含有鹼溶性多醣的液體部份；及 C) 純化該含有驗溶性多醣的液體部份，以獲得一中性 的鹼溶性多醣製劑， 其中步驟C)的純化選自下列⑴至（vi)所組成群組的純 化方法： 純化方法⑴包含下列步驟： 藉由加入一酸而中和步驟B)的液體部份； 乾燥所獲得中和的液體，而獲得一中性的驗溶性多醣 製劑； 純化方法（ii)包含下列步驟： 加入CrC3醇至該步驟B)的液體部份，於是產生鹼溶 性多醣的沈澱； 藉由固液分離手段取得該鹼溶性多醣的沈澱； 將該鹼性溶多醣的沈澱與選自Ci-Cs醇或水與（：1-(：3 醇的混合溶劑混合，而獲得驗溶液多聽增濃的混合物；

   27 1308871- 、 （2008年10月修正) 藉由加入一酸而中和鹼溶液多醣增濃的混合物； 藉由固液分離手段從被中和的混合物取出驗溶性多糖 围體；及 乾燥該鹼溶性多醣固體而獲得一中性的鹼溶性多醣製 劑； 純化方法（iii)包含下列步驟： 以一分子篩過濾步驟B)的液體部份以獲得的分子質量 大於3000道耳吞的部份； φ 藉由加入一酸而中和該分子質量大於3000道耳吞的 部份；及 乾燥該中和的分子質量大於3000道耳吞的部份而獲 得一中性的驗溶性多醣製劑； 純化方法（iv)包含下列步驟： 以一分子篩過濾步驟B)的液體部份以獲得的分子質量 大於10000道耳吞的部份； _ 藉由加入一酸而中和該分子質量大於10000道耳吞的 部份；及 乾燥該中和的分子質量大於10000道耳吞的部份而獲 得一中性的鹼溶性多醣製劑； 純化方法（v)包含下列步驟： 以一分子篩過濾步驟B)的液體部份以獲得的分子質量 大於3000道耳吞的部份； 將該分子質量大於3〇〇〇道耳吞的部份與水混合； 再以一分子篩過濾該分子質量大於3000道耳吞的部 28 1308871·. ^ . „ (2008 年 10 月修正) =二合物，以獲得第二次過遽的分子質 遺耳吞的部份； 藉由加入一酸而中和該第二次過遽的分子質量大於 3 000道耳吞的部份；及 、 乾燥該中和的分子質量大於3〇〇〇道 得一中性的驗溶性多糖製劑；及 ' 〇份而獲 純化方法（vi)包含下列步驟： U —分子步驟B)㈣體㈣ 大於10_道耳吞的部份； 獲得的刀子質量 將該分子質量大们〇_道耳吞的部 再以-分子筛過濾該分子質量大 〇 份與水的混合物，以獲得第二次過濾的=道耳吞的部 道耳吞的部份； 子質量大於10000 藉由加入一酸而中和該第二次 10000道耳吞的部份；及 刀子質量大於 乾燥該中和的分子質量大於 得一中性的驗溶性多醣製劑。 道耳吞的部份而獲 醇 2.如申請專職項时法，其中該Cl.c3醇為 乾燥:::乾:利範圍第1項的方法，該乾燥為 29 ㈣ 1308871·. 、 （2008年m月修正) 4. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該中性的鹼溶 梭多醣製劑具有一介於5,000至1,000,000的分子量。 5. 如申請專利範圍第4項的方法，其中該中性的驗溶 栈多醣製劑具有兩主要部份，第一部份具有約1〇 〇〇〇的分 子量及第二部份具有約900,000的分子量。 6.如申請專利範圍第5項的方法，其進一步包含分離 該中性的鹼溶性多醣製劑的第一部份及第二部份，其中該 第一部份或第二部份被作為該中性的鹼溶性多醣製劑。 7.如申請專利範圍f i項的方法，其中步驟a)的驗性 水溶液為0.4_10g/LNa〇I^溶液，及該西洋篆^^ 根部殘渣的萃取係於室溫進行〇 5_2小時。

   8· 一種包含西洋蔘驗溶性多醣 申請專利範圍第1至7項中任一項 的組合物，其係如前述 所述的方法製備者。 9.-種具有提昇免疫力的組合物，其包含〜提昇免疫力 量作為有效成分的如申請專利範圍第8項所 a 西洋蔘鹼溶性多醣的組合物。 、匕3 30 L 3 •1308871 ；'>.· (2008年10月修正) 彰ΗΦ 鹅 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0

   1.E+09 1.E+08 1.E+07 l.E+06 u|H :1.E+05 二 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01 1.E+00 N- 12 13 14 15 16 17 18 19 滯留時間(分鐘） 20 圖2a I ooooooooooo oooooooooo oooooooooo oooooooooo 0987654321

   9876543210 oooooooooo .E+.E+.E+.E+.E+.E+.E+.E+.E+.E+ 1± 1X 11 11 1111 111A 20 9 11 8 11 7 6 11 5 11 4 3 11 2 11 滯留時間(分鐘) 圖2b 置— ooooooooooo oooooooooo oooooooooo oooooooooo 0987654321

   14 15 16 17 18 19 20 1.E+09 1.E+08 1.E+07 1.E+06 1.E+05 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01 1.E+00 2 11 3 11 滯留時間(分鐘) 圖2c