TWI344000B - Antioxidant compositions - Google Patents

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1344000 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 [0001]本發明係概括地有關抗氧化物感測器領域，且 更特別者，有關直接測量親水性和疏水性兩種抗氧化物的 抗氧化物感測器和方法。 【先前技術】 [0002] 本申請案主張2〇〇4年8月26日提出申請的美 國專利中請序號]〇/648，G47號之優先權，且為該專利申請 :的部份連續案。於沒有限制本發明範圍之下，就關聯於 抗氧化物感測器技術與偵檢方法方面說明其背景。 [0003] 生物系統已經發展出抗氧化系統以對抗自由基 和其他原-氧化性物種之影響。抗氧化物為一種在以相較於 可氧化性受質較為低的濃度存在之時可以明顯地延緩或防 止遠可氧化物受質的氧化之任何物質。有作為抗氧化物的 酵^ ’例如超氧化物歧化酶（super〇xlde如刪叫和過氧化 風酶（catalase)，彼等係由許多種生物所編碼者。諸如维生 素C和植物苯龄等物質都是透過食物導到生物系統内的抗 乳化物。已經有提出者此等物質的天然發生含量都不足以 t身體内產生或在正常食物中攝取到。因為在水果或蔬菜 缺乏此等抗氧化物及/或食物中的水果和藉菜因為現代的 :工而缺乏彼等的抗氧化物，所以正常食物内不能提供足 盘的抗氧化物。不過’〖常食物可以改良現代的生活型態 與西方食品的不良組成’以最實際方式增補身體所需要的 1344000 抗氧化物。為了補充正常食物，需要測 〜哪兄tm内所包括 的諸成分所具抗氧化物能力。 [0004] 有數種實驗室方法已經發展 ⑺木'則定物質驟 減自由基之能力或測定其抗氧化物能力；每一此等檢定法 都會在下文中詳細說明。簡略地說，此等檢定：二法 TEac、19F-NMR、TRAP、FRAP、以勞光 A 其 笙九為基礎的方法、 夕牛鉬錯合物偵檢、與0RAC，所有彼等 J次邵疋袄出來測量 勿質驟滅自由基物種的能力之某些方面。 — 、 Γ tfij马母一種方 法的簡略說明，包括彼等固有的優點與缺點。 [0005] TEAC檢定法。Tro〗ox®當量抗氧化物能力 (Trolox® Equivalent Anti〇xidant Capachy) (teac)檢定法 係以下述觀察為基礎：當2,2’_畊基雙_(3·乙基笨畊噻唑啉 -6-磺酸）（ABTS)在過氧化酶和過氧化氫的存在中或在羥 基過氧基、纟元氧基、和無機根的存在中溫浸之時，會產 生稍彳政更穩疋的ABTS . +根陽離子。從將ABTS、變性肌紅 蛋白（metmyoglobin)、緩衝劑 '和過氧化氫加在一起之時刻 起，即隨著時間測量在734奈米波長的紅外輻射吸光度。 於ABTS根陽離子開始形成之時，吸光度會增加。於添加 過氧化氫之前加入抗氧化物之時，抗氧化物會清除過氧化 氣所形成的自由根，延遲ABTS . +根陽離子之形成，因而誘 ‘出吸光度抑制百分比之增加。於此檢定法中的測量單位 為TEAC ’其為具有對1 〇毫莫耳/升的受檢驗物質的溶液之 田里抗氧化物能力之Tr〇1〇x⑧濃度（毫莫耳/升）。 [0006]該TEAC檢定法係偵檢可以溶解化的水溶性藥 物所具抗氧化能力。此外，由於TEAC檢定法具有偵檢其 成刀的貝獻之能力，因此丁EAC檢定法可以用來測量系統 的抗氧化能力。TEAC檢定法可以用於藥理學研究與營養學 研九之中。但是因為樣品中所含的過氧化酶會產生較高的 吸光度值且所檢驗的化學物也可能在734奈米吸收，所以 TEAC檢定法得用途受到限制。且因為有來自相當低濃度的 H2〇2所導致的抗氧化樣品與藥劑之間的直接交互作用，所 γ TEAC檢定法不能保證樣品抗氧化物直接驟滅自由基之 心異|±。TEAC檢定法也會受到樣品稀釋度所影響，而在較 低樣品濃度之時產生TEAC值之增加。 )9 [_7] F_NMR檢定法。另依種方法係使用 F-NMR(核磁共振），其中係使用I9f_nmr偵檢經說化的芳 族胺。芳族胺會與麵基根快速反應而形成多種經經基化產 物的混合物。經氣化的摘檢劑，經基笨基）_三氟乙醯 胺，會因經基根作用+以分冑而產生三1乙醯胺， CFWONH2 ’（TFAM) ’以及他種產物。TFAM可用來測定一 物質保護經氟化债檢劑對抗經基根作用之能力。若樣品可

以良好地保4經氟化偵檢劑對抗自由基作用之時，則打AM 尖峰下的面積會小於必jτ ώ ,，， ·<方、物貝不旎良好地保護經氟化偵檢劑之 二所得面積。將多種藥劑混合在一起，且使用麵取得測 量值。測量尖峰的面積’然後針對諸含氣物種的總漠度歸 -化：該^MR檢定法為一種簡單的方法，可以測量低 刀子里生物为子的抗氧化性質’不過’只有在涉及經基之 時才會出現指巾’於該方法中要使用放射性氣且臟設備 1344000 的購買與操作都極為昂貴。

[〇〇〇8] TRAP檢定法。可氣化的有機化合物之水分散液 於使用水溶性偶氮化合物，2,2，_偶氮_雙_(2_胖基丙烷鹽酸 鹽）（ANAP)，予以過氧化之時，可以用固定的速率，心，輕 易且可重現地起始，此為總自由基-陷獲抗氧化參數（T〇taI

Radical-Trapping Antioxidant parameter) (TRAP)法之基 礎 [RAP仏疋法係使用氧探針（〇xygen probe)偵檢可過氧 化血毁的氧氣攝取被抑制的之時間長度，且將此值稱為 TRAP。在此方法中，於天然抗氧化物已經耗乏之後的第二 誘導期内係使用Tr〇lox®作為抗氧化物對照樣。該第二誘導 期係用來計具R,值，其則用來計算丁RAp值。丁RAp直係經 報告為經陷獲的過氧根莫耳數每升液體。 [0009]可惜地，TRAP檢定法值只能測量持續時間而 限制其對於高處理量分析的可用性。阻止最大氧氣攝取所 花的時間，不可能容易且準確地測量，某些種抗氧化物的 每莫耳總自由基陷獲能力係決定於彼等的起始濃度；且不 是測量實際的抑制程度。TRAP檢定法係耗時者，因為，於 只有一個反應容器之下，一次只能檢驗—種樣品。而traP 檢定法比TEAC法較具特異性，係因為TRAp檢定法需要高 血漿稀釋水平來產生所需的延 短快速鏈反應所需的脂質鏈長 麻油酸（linoleic acid)，可以補 一步研究之下 來源（Ghiselli 滯期’且完成此之過程會縮 度之故。有提出經由添加亞 你鏈長度的縮短，不過於進 顯示出亞麻油酸的添加也會導入其他誤差 A.; Serafini M.; Maiani 〇.； Azzini E- 1344000

Ferro-Luzzi A;· A fluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability. Free Radic. Biol. Med. 1995 Jan; 18: 29-36)。於TRAP法檢定系統中，某些種抗氧 化物例如維生素C的總過氧基根-陷獲能力係與起始濃度有 相關聯者。 [0010]修改的TRAP檢定法。修改的TRAP檢定法可 矯正來自血漿蛋白質或樣品稀釋之干擾（GhiseUi等人，上 文）。修改的TRAP檢定法間接地測量由ABAP所產生的過

乳基根作用對於蛋白質/9 -邊紅蛋白（冷_phycoerythrin)( /3 -PE)所具螢光性質和血漿保護召_pe的能力之影響。保護作 用係經由使用硫酸銨與超離心將蛋白質從血漿沉澱出而完 成的。修改的TRAP檢定法係經由將多種藥劑一起添加到石 英螢光計吸光匣之中且保持在37。C下5分鐘而實施的。於 添加ABAP之後，測量495奈米的螢光且每隔5分鐘監測 一次。如同原始的以氧氣探針為基底的方法一般，修改的 TRAP檢定法會產生因為ABAp的熱分解所導致的線性螢光 遞減。總保濩期係在添加任何抗氧化性化合物之後之延滯 期所表出，不過，其中假設總血漿抗氧化能力係直接關聯 於該延滯期的長度。修改的TRAp檢定法係經由將抗氧化性 化合物所產生的延滯期與已知濃度的丁Γ〇ι〇χ⑧溶液所產生 的延滯期相比較而定量分析的。 [00 ] 1 ]修改的TRAP檢定法不能測量由ABAP所觸發 的血漿斷裂脂質過氧化鏈之能力 否有涉及脂質可溶性抗氧化物以 ，不過，對於在TRAP中是 及脂質可溶性抗氧化物的 9 1344000 涉及程度’尚未完全確定。此種修改的TRAp檢定法一此只 能處置4至8份血聚樣品。 [〇〇12] FRAP檢定法。血漿鐵還原能力（Feme

Reduemg Ability 〇f Plasma) (FRAp)檢定法係由 Benzie 和 str㈣所開發且在1996年發表，且係在C0BAS fara „

光譜光度測定分析儀進行的。每一天都要重新製備FRAp 藥劑與所有的溶液。將FRAP溶液加熱到37。〇。讀取對照 樣讀值，然後讀取抗氧化物樣品且加入水。從起始反應後 的0.5秒起始，於實驗的持續期内每隔I 5秒讀取讀值。要 測定吸光度差值時，係計算對照樣的吸光度測量值到最後 測量值的改變，然後關聯於併行檢驗的標準鐵（11)溶液所得 吸光度之改變。FRAP檢定法不具濃度相關性，相對於從原 始所來的結果之預期線性趨勢沒有顯示出偏差之處。

[0013] FRAP檢定法具有某些項已知的問題，亦即， 於系統内沒有導入自由基。FRAP檢定法係使用氧化/還原 反應來測量樣品將鐵（ΠΙ)還原成為鐵（Π)之能力。一抗氧化 物以與一還原劑在氧化/還原反應中的相同方式供給電子， 所以假設FRAP檢定法為一種評定抗氧化能力之方法。不 過，FRAP檢定法不能直接測量一潛在抗氧化物所具抗氧 化能力。此外’由於系統内沒有導入自由基，因此沒有針 對不同類型的自由基比較抗氧化能力之方式^ FRAp檢定 法對於能夠與鐵（II)和含SH基的化合物都能反應之某些種 抗氧化物例如抗壞血酸不能準確地測量其抗氧化能力。 FRAP檢定法沒有考慮到抑制作用的量；因此，FRAp檢 ]0 1344000 定法遺漏掉總抗氧化能力的一項重要成分。FRAP檢定法和 TEAC檢定法不能準確地測定抗氧化能力之事實可經由從 兩種檢定法所得結果的比較沒有表現出線性相關性之事實 顯示出。 以螢光為 根據下述發現：y^藻紅蛋白的愛 / *元β因過乳基和羥基根作 用所造成的破壞而隨著發生變化。 Ρ澡紅蛋白法係使用

Perk in-Elmer MPF44B φ ^ + 蛍光光°a先度計來偵檢螢光。得到相 對於時間的營井消丨| γ古0 /古田 蛍九冽里值且使用此值經由觀察相對於一對昭 樣要多長時間才會出現一“平 戶' d 而測定出—抗負物 戶:提供的保護量。於此等間接性，以勞光為基礎的方法之 ::若吸光度水平保持相同’化學物八 更 的時間的“孚T百如” , 于〜D令更長 … ’則化學物即可稱為比化學物B可更 “几自由基的破壞作用且因 物。 ~ 撞更強的抗氧化 [0015]螢光方法提供一 量分柄屮血_十* 便用j里樣品即可快速地定 里刀析出血7是或其他升物體液中非·血 疋 方法且業經用來分枳^ π疋 几孔化物的含量之 J +刀析血漿、蛋白質、 相關物質、維生辛和# $ 、神經傳遞質和 土不和彼寻的衍生物，盥 化潛在性。不過，节 、他化學物之抗氧 、δ亥間接性螢井方本 如’此等檢定法係測旦 3者某些問題。例 從例如，冷-ΡΕ，的女 減4貝速率而不是 既不能提供測定脂，容. 制百分比螢光方法 心伽，合性抗虱化物的貢獻 血清中所含蛋白質對 。仏，也不能測定 一化能力的貢獻部份之方法。 以4〇〇〇 [0016]峨翻錯合物檢定法（PCA)。磷鉬錯合物的形成類 似於FRAP法。PCA法係以鉬（VI)還原成為鉬（力之後吸光 度的變化為基礎。要將鉬（VI)還原成為鉬（v)，必須存在著 還原性物種像，例如，抗氧化物。樣品係在使用之前一刻 才k由浴解在恰當的溶劑之内而製備的。對水可溶解的化 合物，係使用水。對於可以溶解在有機溶劑内的物質，係 使用乙醇、甲醇、二甲亞楓、或己院，係以從以文獻為基 礎的消光係數定出的正確濃度使用。於研磨和冷凍之後， 將種樣。口浴解’且於需要時實施萃取。然後將一份樣品與 3鉬的藥劑溶液混合。於一溫浸和冷冷卻期之後，使用， :如UV-可視光光譜光度計相對於—空白樣採取吸光度測 量值。於未知樣品中’將有機和水可溶解的抗氧化能力分 別以α·生m抗壞血酸的當量表出。抗氧化能力係以碟 翻錯合物的莫耳吸光係數之比較為基礎進行定量分析。莫 耳吸光係數愈接近！，抗氧化物為愈加。❹法對於在從 25-37。(：下測定較為強的抗氧化物例如维生素e係一種良 好、簡單的方法。此方法為可用來測定總抗氧化潛在性的 其他方法之不昂貴的替代方法。 [⑻ΠΗ專統嶋C檢定法。氧自由基吸收能力（〇rac) ^係使用藻紅蛋白，螢光性蛋白質的化學性質。⑽Μ檢定 沄不同於Glazer法之處在於於ORAC沬士及收c也 士入 决中係將反應驅動到 凡王而，如稍早所敘述者，Gia -^ 忐係者重於以平頂期所 報。出者。ORAC法可以使用經由用 心移除調蛋白質所得處理’接者超離 貝所侍的血清。於此檢定法中使用過氣自由 12 1344000 基產生劑’ 2,2’·偶氮-雙-(2-胖基丙烷）二鹽酸鹽（AAPH)。 [0018]傳統〇RAC檢定法偵檢係使用，例如， Peikin~Elme]· LS-5螢光光譜光度計實施直到發生零螢光為 止。將藥劑添加到光析槽内，且接著添加AApH，將反應混 合物溫浸於37。(：下，且每5分鐘採取螢光測量值直到反應 完成。將結果報告為〇RAC值，其指的是在抗氧化物存在 中/5 -PE的驟滅曲線下之淨保護面積。〇rac值係經由將樣 。口曲線下的面積除以Tr〇1〇x⑧曲線下的面積而計算出者，兩 面積都經由減除空白樣曲線下的面積予以校正過。一 〇rac 早位係經指定為由最後濃度A 1 // M Trolox®所提供的淨 呆蒦面積於將樣曲線下的面積與⑧曲線下的面積 相比較之時，其結果係給為Trolox®當量。 [0019]自動化0RAC方法係使用，例如，c〇BAs η離心分析儀。於添加起始劑之後’於ο 5秒後且在起始讀 取後每2分鐘採取螢光測量值。c〇BAs FARA Η裝配著一 離％機’其可用於樣品的旋動與混合。⑶BAS FARA 每 次能夠處置多達30份樣品且其結果係使用曲線下面基報告 以測定出ORAC值’如同在原始方法中一般者。 FARAII方法業經有效地廣泛用於評定每一樣品基質。 + [0020] ORAC法可以進一步經由使用螢光素鹽取代冷_ 冰、蛋白予以仏改。召。栗紅蛋白因為離析程序之故而為約 3〇%’、4度者且每-不相同批料都不一致。經測定過者，由於 對過氧自由基的可變異性反應性，沒-藻紅蛋白也會隨著每 -不相同批料產生不-致性。而且U紅蛋白於暴露於 1344000 激發光某一段時間之後可能被光漂白。由於非特異性蛋白 貝…口之故，点-澡紅蛋白會與可能影響穩定性的多元笨酚 交互作用。此外’ ^藻紅蛋白也比螢光素遠較為昂責。義 於此等理由，都使用螢光素取代尽-藻紅蛋白。 土 _21] ORAC方法經由導入在5〇%丙酮·水混合物 iw機甲基化石-環糊精（沒_cyclodextrin)(RMCD)予以調整以 求肊夠刀析月曰洛性杬氧化物樣品。此丙酮··水混合物可以 使脂溶性抗氧化物可溶於磷酸鹽緩衝液之内。該〇rAC、、 為-種簡[敏感、且可靠的抗氧化物和血清或其他生: 體液所具過氧自由基吸收能力之方法。血清的㈣由機。及 收能力也已經使㈣0RAC法成功地實施過。〇rac⑼法 可以使用96·孔盤以營光計微滴板同時實施許多樣品的動 力學分析且減低所需的血清樣品量。〇Rac法於其分析上所 具獨特之處在於其經由測量曲線下面積而在單一量中考虎 到抑制時㈤與抑制程度。〇RAC法不會受到稀釋所影響。； ，用/3-蕩紅蛋白的⑽AS FARA „自動化檢定法相對於 RAP和TEAC檢定法進行比較，顯示出在與teac 之間沒有線性相關性，進—步指示出TEAC㈣法不能準 確地測定出一樣品的抗氧化能力。不過，在〇心與 ::倒有微弱的線型相關聯’此顯示出F R A p檢定法對於測 又潛在性抗氧化物所具抗氧化能力的低精確性。 [0022]至此已經評論過數種測定物質所具抗氧化潛在 性所用的方法。所有此等方法都具有其效益，不過彼；也 具有限制。此等方法的高成本（包括設備、彼等之中有某些已 14 1^44000 經不再製造-藥劑、人事成本等）使彼等不敷構成抗氧化物工 業的大部份小公司所實際使用。 [〇〇23]其他方法包括，例如，核發給Fang的美國專利 第5,5 1 8,59G 揭不出機油和湖滑劑所用的電化學感測器。 。之 敏感且快速的電化學感測器經由測定油調酉己 物中殘留的抗氧化物和抗磨耗劑_彳agen〇的含量而 :測機油的惡〖，特別是抗氧化性質。該電化學感測器為 -種二-或三·電極型電化學電池，具有在電極表面上的導電 丨電解貝液體或嘁膠狀中間才目。機油惡化程度係經由測量 …由的抗氧化此力或抗磨耗能力而監測的。該電化學感湏 器也可用來監測含有電活性添加劑之其他㈣劑和經類。 該電化學感測器可用來在原位(in_situ)實施測量，而不需要 對該油施以任何化學或物理預處理。 [0〇24]抗氧化物感測器的另一例子為在核發认 Η却s的美國專利第6,㈣，415耗中所顯示者，該專利㈣ 出-中測量-流體樣品内的氧化性或抗氧化性分析物所用 的裝置和方法。唁获罢6 u '-政置包括一可棄置性電化學電池例如 層電化學電池，发中奘右At糾、丄 _ “宁衣有此夠與分析物進行氧化還原反應 之藥劑。當該裝署芬古土 置矛方法用於丨交反應性分析物之時，以 使用裒置内的電阻型加熱元件或使用裝在該電化學電池内 的放熱性材料來對樣品加孰。^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 在該藥劑與該分析物之門㈣有述利用加熱來加速 刀析物之間的礼化還原反應，此舉有助

反應性分析物的電化學測量。 、X

[0025]取後，美國專利第2⑽镜揭示出間接 15 1344000 測$親脂性抗氧化物活性之方法。其令揭示出使用親脂性 自由基產生劑與可氧化的親脂性指示劑來測量樣品的脂質 區劃（npid c〇mpartment)内的脂質抗氧化物活性之選擇性方 法。該發明據稱可以準確且有效率地測定一樣品在脂質區 劃與水性區割中的總抗氧化物活性。該發明的方法可以用 來診斷和對抗一患者因$允 人 u體内所含過多自由基所產生的失調 症。在該發明的方法中使用藥劑也可以提供於—套组檢定 法中。不過，係使用標準營光探針間接測量氧自由基吸收 能力（〇XygenRadiealAbs。⑽neeCapae]ty)(⑽ac)值。 【發明内容】 發明簡述 []本&月包括抗氧化物感測器與直接測量總樣品 抗乳化物含量和抗氧化物對總樣品抗氧化物狀態的影響之 方法。本發明也包括可〇μ 士 1 θ 有效夏的抗氧化物給個體用 乂…優徤康所用之組成物和方法。本文中所揭 二方法可於實時(一)同時且直接地谓檢-樣^ 二力。本案發明人察覺技藝中具有兩種人造的相 相谷之抗乳化類項（親脂性和疏脂性）且分開 ::二者’技藝通常也間接地，亦即，使用可偵'檢的報Ϊ 者刀子㈣〇咖崎cule)，；則量自由基的存在。 :::本發明係經由使用一種快速、不貴且直 二=決先前技藝偵、檢器的限制。為了解決此、 本案發明人開發出本文中所揭示的氧自由 16 1344000 (ORAC(〇))裝置與方法。經由使用該（〇raC(o))裝置，本案 發明人能夠，第一次地’同時且實時地，測量親脂性和疏 脂性兩種抗氧化物對於溶氧含量的影響。使用（ORAC(o))檢 疋法’本案發明人也可以開發出一中增效性抗氧化物組成 物’其可以單獨地使用或或者與一或更多種抗氧化物增強 劑（anti-oxidant potentiators)組合地使用。 [0028]更特別者，本發明包括一種直接偵檢親脂性和 疏脂性兩種抗氧化物的抗氧化活性所用之裝置，該裝置包 括一溶氧感測器與一樣品和一氧自由基敏感性分子在溶劑/ 水/界面活性劑混合物内流體溝通；其中該氧自由基敏感性 感測器同時偵檢在該溶劑/水/界面活性劑混合物内的該親 脂性和疏脂性兩種抗氧化物。該氧自由基敏感性分子可為 能夠與氧反應的分子，例如具有共軛雙鍵的分子；或為含 氮或硫的化合物。氧自由基敏感性分子的例子包括，例如 螢光素、石-藻紅蛋白（召_PE)、穀胱甘肽_s_轉移酶、亞麻油 酸或彼等的組合。氧自由基含量係使用氧感測器測定，例 如電化學氧感測器、化學發光氧感測器、表面電漿子共振 氧感測器、紅外線氧感測器、電容偶合氧感測器、染料-偶 合纖維光學氧感測器或高光譜氧感測器。溶氧計或溶氧感 測器可以線内（in-line)配置用於高處理量分析，可以作為〆 單一樣品偵檢器及/或經調整用於診所或甚至家庭中使用。 溶劑可為有機溶劑，例如丙酮。該界面活性劑可為清潔劑 (detergent) ’例如非離子性清潔劑例如吐溫_2(^於溶劑/水/ 界面活性劑混合物内的容劑通常為該溶劑7水/界面活性劑 17 混合物的至少約lf) 面活性劑混合物内的水二積％ ’例如33%。於溶劑/水/界 物的至少約1〇至9〇體=為該溶劑/水/界面活性劑混合 只面活性兩丨、、s —積％，例如33至67%。於溶劑/水/ ' η心合物内的界面活性劑（或清潔劑）通常為q :容 劑/水/界面活性劑 …丨)通韦為 ^ ^ k ^ 勺至少約〇· 1至1 〇體積％且可以經

由浴％在水中貯左4 tA % 、 。於一特別實施例中，溶劑/7jC /界面 活性劑比例為約i: i : h [、]4裝置可以進-步包括-或更多個處理器，例 ㈣該偵檢器、捕捉數據、儲存數據、根據數據 ^或貢錢據庫實施計算、及/或將數據或數據摘要顯示成 、α圖解、圖表和類似者之形式等之電腦。該處理器/電腦 也可乂連接且甚至於控制與氧感測器和溶劑/水/界面活性 «““物呈机體相通的流體系統。本發明係測量曲線下面 責（）°亥面積將接文抗氧化能力檢驗的樣品所具活性所 ‘致的相對氧 >肖失率關聯到因—已知標準品所具活性之結 果所觀察到的相對氧消失率。使用本發明，與本文中所述 ^可以同日寸地直接測量有包括親脂性和疏脂性兩種 抗氧化物的溶液内之溶氧含量。計算AUC的公式之一例子 可為： AUCsmp-AUCblnk 7r~ X 10⑻(毫克/克）X [TRLX(微莫耳/毫升)] ORAC(o)= AUCtrlx-AUCblnk —~ 一 — ――____________________ [SMP(毫克/毫升)] 中AUCsmp為樣品的曲線下面積值； 18 1344000 其中AUCblnk為空白樣的曲線下面積值； 其中AUCTRLK為Trolox®的曲線下面積值； 其中SMP為樣品。 [003 0]本發明也包括一種直接測定抗 几孔化活性的方 法，包括下述諸步驟：於一或更多種抗氧化物和氧自由美 目標物的存在中測定於經溶解在溶劑/水/界面活性劑混2 物中的檢驗溶液内之溶氧含量，其中係侦用 τ你便用礼偵檢器測量 水溶性與脂溶性的抗氧化物活性。溶氧自由基含量可以 用氧偵檢器予以測定，例如使用電化學氧感測器、化學發 光氧感測器、表面電漿子共振氧感測器 '紅外線氧减測器、 電容偶合氧感測器、染料·偶合纖維光學氧感測器或高光譜 氧感測器。抗氧化物活性可以在約37。c下測量。自由美起 始劑的例子包括，例如，2,2’_偶氮_雙_[2_(5_甲基·2•咪:啉 -2-基）丙烷]二鹽酸鹽、2,2，_偶氮_雙_(2_脒基丙烷）二鹽酸 ι)(ΑΑΡΗ)、2,2 -偶氮-雙-(2-胖基丙院）[2-(N-硬脂基）胖基 丙烷]二鹽酸鹽（SA-1)、2,2’-偶氮_(2_(2·咪唑咐_2_基）丙 烧）-[2-[2-(4-正辛基）咪唑啉_2_基]丙烷]二鹽酸鹽）（c_8)、 2,2’-偶氮-雙_(4_甲氧基·2 4_二甲基戊腈）（Me〇 AMvN)、 2,2’-偶氮-雙气24_二甲基戊腈）（amvn)、偶氮二異丁腈、 2,2’-偶氮-雙_(2_甲基丙酸酯）（damp)、和2,2，-偶氮-雙_(2- 胖基丙烧）、彼等的鹽類、混合物或等效物。該偵檢器甚至 可為可棄置式者。 [〇〇3 1 ]本發明也包括_種食物補充品，其包括經離析 且純化過的疏脂性抗氧化物與任何經離析且純化過的親脂 19 1344000 性抗氧化物，其中該組合後 . 欠曰]&月曰性抗孔化物和親 氧化物具有大於6,000微τ 1〇Χ⑧當量（ΤΕ)/克之溶氣 值。fa於此技者都可察覺出此 丄/ Λ J表為液體當量，例 如M00微莫耳Tr〇i〇x⑧當量1J 如里（丁£)/笔升。疏脂性抗氧化物和 親月曰性抗氧化物係隨時間釋放者且可能包括一或更多 生素E諸如選自〇-、石_、占·' 、 Ύ ·、〔 -、7] -、Χ\\·、 “生“分’與和r-生育三烯醇類 —rlen帅彼等的衍生物’彼等的藥學上可接受之鹽

類，與彼等的組合β親脂性抗氧化物的例子包括樹皮酮 (quercetln)、堪非醇（kae唯叫、楊梅黃嗣（myncetin)'三 經基黃酮（aplg_)和彼等的衍生物，類似物，彼等的藥學 上可接受之鹽類，與彼等的組合。

[0032]該包括任何經離析且純化過的疏脂性抗氧化物 與任何經離析且純化過的親脂性抗氧化物之食物補充品也 可以包括二或更多種必需㈣，例如，半乳糖、半乳糖胺、 葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、乙醒基化甘露糖、N_乙酿基 神經胺糖酸、岩藻糖、N-乙酿基半乳糖胺、N 糖胺、及/或木糖。於-具體實例中，該補充品也包 素C來源，例如具有高含量天然、生物可利用的維生素c 之植物來源例如澳洲卡卡杜李樹（rem /er心μ,7山⑽σ)。於另一特殊具體實例令，該维生素c為一 種來自維生素C之植物來源例如野生_澳洲卡卡杜李樹 (rermha/M/eri/hfln山β㈣）之抗氧化活性增強劑，其比果園 生長的卡卡杜李樹具有較高百分比的維生素c。該補充品也 20 1344000 可以包括一或更多種原-生物素（pro-biotics)，例如來自乳桿 菌 M (Laciobacilhis sp.)和雙歧_ 桿菌屬（Bifidobacterium sp ) 者。該補充品可經壓縮以提供通常為氧不可穿透的表面， 例如一經滾筒壓縮的粒子、膠囊、片劑、小片、錠、泡騰 片劑或彼等的組合。 [0033] 作為與前文所述〇RAC(0)裝置和方法的比較點 者，該經離析且純化過的疏脂性抗氧化物與親脂性抗氧化 物係具有大於7,000微莫耳Trolox®當量（TE)/克之抗氧化 ORAC(fl-lipo)值。本發明係用於開放標記研究中以測量有 服用在其食物中的包括本發明抗氧化物的抗氧化物/糖營養 物（glyconutiient)摻合物的每一個體之抗氧化物含量。於提 供給患者之時，該親脂性和疏脂性兩種抗氧化物可提供以 ORAC (冷-PE)所測量較累積患者群數的平均基線抗氧化物 含里更向13%之平均增加。 [0034] 本發明也包括許多種組成物。本文中所揭示的 諸組成物係以下述察覺為基礎：目前可取得之食物補充品 不能將親脂性和疏脂性兩種抗氧化物組合呈使其可測量到 的活性超過從個別成分所預期者。使用本發明裝置和方法 之下’本案發明人能夠開發出增效性組合，其中不僅包括 親月曰性和疏脂性兩種抗氧化物，而且也可添加具有抗氧化 物活性的增強劑。 [0035] 類黃酮類如槲皮酮已經在最近顯示出可透過基 因的抗氧化物回應要素而增加穀胱甘肽合成中的速率限制 11酵素’ 7 -穀胺醞基半胱胺酸合成酶，所含重鏈之轉錄。 21 1344000 所增加的轉錄隨後經轉譯而在組織培養細胞中增加還原型 (活性）縠胱甘肽的細胞内含量。槲皮酮為紅酒、葡萄皮、和 洋蔥的主要成分。從得自紅酒、葡萄皮、和洋蔥的槲皮酮 之研究推測出對徤康的有益效應。一項研究顯示所有攝入 的槲皮酮都會在餐後兩小時代謝（European Researeh 〇n

Functional Effects of Dietary Antioxidants，September 25-28， 2002, Cambridge，UK)。於飲用中等量的紅酒之對象體内發 現貫質減低的LDL氧化之後’研究人員認定該等保護性效 應非常可能歸因於槲皮酮和其代謝物的活性。槲皮酮也經 _ 證明可增強紅血球的穩定性。 [0036]本案發明人察覺由於許多且多樣性影響氧化性 壓力的因素所致，抗氧化補充需要針對個體的需要和化學 而里身疋造。再者，也察覺出需要多種生育酚的組合來滿 足夕個體的不同樣需要。多種生育酚的組合係需要者，因 為某些抗氧化物會被身體所“選擇”之故。舉例而言，在北美 '川“勿中佔夕里的維生素E形式為厂生育酚，其普遍出現 方、植物油以及;^大豆和玉米衍生的產品之中。不過，身體 主要保邊的疋α -生育酚。一種依賴α _生育酚轉移蛋白的特 ，方法經發現可調節體内的生育酚濃度。與先前技藝抗 氧化物組成物不相同者’本發明係使用混合生育酚來提供 身體許多種形式的维生素Ε，以促成最優量的每一種形式： 選擇、保留和使用。“ ^ 再者，掩f皮酮和混合生育酚的增效性 組合可提彳ϋ | @ μ 、 &廣夕數組的抗氧化物營養素最優選擇，彼 寺可根據個體的需要而不相同。 22 1344000 [0037]本帛發明人更經由添加有助於強化此等抗氧化 物所具活性之化合物以尋求使增效性槲皮酮和混合生育酚 組合所具活性進一步最大化。—種此等強化劑為維生素匸。 維生素C具有歸諸於其本身的明顯抗氧化活性以及數種非 抗氧化性營養功能。有許多係歸因於維生素C的前-抗氧化 物性質（pr〇-〇X1dant propenies)，尤其是在過渡金屬的存在 中之時。維生素C的前-抗氧化物性質可能不是完全破壞性 者。不過’其他㈣究者斷言彼等發現維生素c表現得像 一種抗氧化物，甚至於有未結合金屬之時也一樣。 [〇〇38]其他抗氡化活性增強劑包括天然萃取物，例如 葡萄子萃取物和綠茶萃取物^於一項研究中，綠茶展現出 強力的試管内（ln vitro)抗突變生成活性 acuity)且可以抑制大鼠結腸内的致癌劑_誘發贅瘤前病灶 的發展。綠茶也可以明顯地抑制腸息肉之形成。所以，本 案發明人不僅將經純化且離析出的來自天然物之抗氧化物 的增效性組合，例如槲皮酮與生育酚，予以組合，而且也 進一步添加可增加此等藥劑的可偵檢性抗氧化活性之增強 劑。 [〇㈣]更特別者，該等組成物都是—種食物補充品， 其中包含著一營養學上有效量的二或更多種必需餹類；一 經離析且純化過的疏脂性氧自由基驟滅劑；和一經離析且 純化過的親脂性氧自由基驟滅劑，其中該經組合的疏脂性 :親脂性氧自由基驟滅劑具有大於M⑽微莫耳⑧當 置（ΤΕ)/克之氧自由基驟滅劑值。於—檢定法中，將該疏脂 23 1344000 性和親脂性氡自由基驟滅劑提供給患者之時， J 提供以 ORAC (fI-lip〇)所測量較患者群數的基線抗氧化物含量 ^ 13%之平均增加。該疏脂性和親脂性氧自由基驟滅劑係經7 裝起來以供長期釋放使用，且可以包括一戎 、匕 4更夕種下列維 生素£分子：α-、冷-、5-、£-、γ.、广 ζ …χΠ_、 =、和（7-生育盼，與《_、万_、（5_、和1生育三烯醇類， 彼等的類似物’彼等的藥學上可接受之鹽類， 、 η興彼寺的組 合。該親脂性氧自由基驟滅劑可包括一或更多種下列者. 黃酮、槲皮酮、堪非醇、楊梅黃酮、三羥基黃_和彼等的 衍生物，類似物，藥學上可接受之鹽類，與彼等的組人 遠補充品可進一步包括一或更多種選自半乳糖、葡萄糖、 甘露糖、Ν-乙醯基神經胺糖酸、岩藻糖、Ν_乙酿基半乳糖 胺、Ν-乙醯基葡萄糖胺和木糖，及彼等的衍生物，類似物， 藥學上可接受之鹽類’與彼等的組合所構成的群組中之酿 類。 發明之詳細說明 _ [〇〇4 1 ]雖然於下文中要詳細論者為本發明多種具體實 例的製造和使用’不過應該理解者，本發明係提供可以在 廣多種特定領域中具體實現的許多可應用的創新概念。本 文中所討論的諸特定具體實例僅用以示範說明製造和使用 本發明的特定方式而不適用以設定本發明的範圍。 ， [0042]為了幫助對本發明的了解，下面要定義許多術 語’本文中所定義的術語具有為熟諸本發明相關聯的領域 24 1344000 中之人士普遍了解的意義。諸如“a”、 “an”和“the”等樹諸 無意只有指稱單數實體，而是包括一總體類別，其中町以 使用—特定例子作為示範者。本文中的術語係用來説明本 發明的特定具體實例，不過，除了在申請專利範圍中所述 出者以外’彼等的使用不是用來限定本發明。 [0043] 本發明係，部份地，以下述認知為基礎：技藝 具有兩種人造的相互不相容之抗氧化類項且分開地測量彼 等。再者，技藝通常也間接地，亦即，使用報導者分子’ 測里自由基的存在。本發明提供一種裝置和方法，其不僅 可同時’而且可直接地偵檢一樣品的總抗氧化物活性。 [0044] 如本文中所使用者’“抗氧化物”指的是可延 遲或阻止一可氧化的目標分子發生氧化之任何分子。抗氧 化物係經由下述而作用者：清除生物學上重要的反應性自 由基或其他反應性氧物種（例如’ 02-、H202、H〇a、ferryl、 過氧基、過氧亞硝酸根、和烧氧基）；阻止氧自由基的形成； 或將自由基或其他反應性氧物種催化地轉化成為較低反應 性的物種。抗氧化物通常分為兩類：（丨）脂質（親脂性或疏脂 性）*k氧化物；和（2)水性（疏脂性或親水性）抗氧化物。脂質 抗氧化物的例子包括’但是不限定於，類胡蘿葡素（例如， 葉κ素、玉米貫質、/3 -隱黃質、番莊紅素、α __胡蘿蔔素、 和冷-胡蘿蔔素），彼等也位於核心脂質區劃之中，與生育齡 類（例如，維生素Ε、α -生育酚、r -生育酚、和5 _生育酚）， 彼4係位於脂質區劃的介面之處，與類視黃質類 (retinoids)(例如，維生素a、視黃醇、和棕櫚酸視黃醇酯） 25 1344000 以及脂肪可溶性多苯酚，例如槲皮酮。水性抗氧 ，抗壞血酸和其經氧化形式，"脫 ，膽紅 化物的例 子包括’但是不限定於γ丹矬礼儿爪 氫抗壞血酸”，尿酸和其經氧化形式，“尿囊素 素，白蛋白和維生素c以及水溶性的多苯酚例如兒茶素 (catechin)，彼等對磷脂質膜具有高親和性，異黃酮和原花 青素類（procyanidins)。 [0045] —種普遍用來偵檢相對氧自由基含量和抗氧化 能力的方法為氧自由基吸收能力(〇RAc)檢定法。於已知的 ORAC型檢定法之中，抗氧化值係經由測量氧自由基對，例 如螢光素或其他可偵檢的分子的影響而間接測量的，此等 分子有可能是也有可能不是可被該特別氧自由基氧化的良 子目枯物通* ’在將抗氧化物添加到檢驗樣品中之時， 相對於沒有使用抗氧化物處理的樣品（亦即，對照樣品），可 ^檢驗樣品中看到-自由基’例如超氧化物、或非自 2型反應性氧㈣，例如過氧化氣，的量上有可谓檢的 不過’此專間接方法係透過中間體(例如，榮光f、 紅蛋白（pE)、等）於該自由基對於 2 抗氧化物狀態的變化”匕等饭-下測！而監測 :M ^ AA ^ ^ 戶斤用的對照樣都是ρ 4〇 /又勺氧自由基產生劑與用來 已知抗氧化物D j里且作為樣品的標準品之 [_6]如本文中所使用者術語“自^ 有至少-個未配對電子的分子。大背：心的是含 電子，且彼等的共價鍵通常 ：：P含有偶數個 、有的電子對。此等鍵的 26 1344000 劈斷會產生兩個分開的自由基’各自具有（除了任何經配對 的電子以外）一個未配對電子。自由基可為荷電者或為中性 者’都具有高反應性且都經常為短壽命者。自由基合彼此

化合或者與具有未配對電子的原子化合。 ^ I r- ^ /、凡5·分子的 :應之中’自由基會企圖使彼等自身的電子結構變得完 全，產生新的自由基，此等新的自由基會繼續與复他八: 反應而造出-鏈型反應。自由基鍵型反應在物質於高:下 的分解及於聚合中都具有特別重要性。於身體内，：：化 的自由基會促成組織的傷害。熱，紫外光、和電離性輕射 全部都會產生自由美。 自由基自由基係經由氧化性機制的二次效 H產生的^量的自由基可能會壓倒天然保護性酵素例 如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、和過氧化酶。自由義例 ==氫(HA) I基根(〇H ·)、獨線氧(A)、超氧陰離 、：0 2 )、乳化氮自由基(N0.)、過氧自由基(R〇〇 、過氧亞石肖酸根（〇N〇〇 -)可處於脂質區劃或水區割之 二=化性營養素(例如’維生素…、w 了以減低此等效應。 狀或非产2 2文中所用者’ ‘‘脂質區劃’，#的是具有環 醇類、㈣和彼等的衍生物’例如脂肪酸、 二=、‘碟脂質類'…類、類…類 ，為兩s㈣和脂溶性維生素類。某些脂質通常可分 =二單純脂質類和複雜脂質類，例如甘油三酸酷類 成月曰肪和油類、4 、甘油的脂肪酸酯類、蠟類、長鏈醇的脂肪 27 1344000 酸酯類與類固醇類例如膽固醇和麥角固醇。複雜脂質類包 括，例如，磷脂（phosphatides)和磷脂質（phosphohpids)(含 Θ的月曰貝）糖脂質（含_類的脂質），和神經銷脂質（含神經 鞘胺醇的脂質）。 [0048]如本文中所使用者，術語“脂質”包括脂肪或 似脂肪物質。該術語為描述性而非諸如蛋白質或醣類之化 學名稱。脂質包括真脂肪（亦即，脂肪酸和甘油的酯類）'類 脂（lipoids)(亦即，磷脂質類、腦苷脂類、蠟類）和固醇類（亦

即，膽固酵、麥角固醇脂質可為透過諸如自身氧化等機 制的氧化反應目標。如本文中所使用者，“脂肪酸”指的 是一組，例如，在長度和氧化狀態上會變異的荷負電，通 常為線型的烴鍵。脂肪酸的烴鏈。通f，脂肪酸具有一荷 負電部份（例如’在其叛基端），和—“尾，，部份，其可決定 脂肪酸的水溶度和親兩性特性。，脂肪酸為包括生物 膜的碟脂質之脂肪成分’彼等係、用以.儲存能量於細胞内部

或用以在血流内傳送脂肪。如本文十所使用者’“磷脂質” 指的是包括至少一種下列側基之任何類別的磷酸醇：脂肪 酸、醇和含氮驗。 ,如本文中所使用者，“脂肪，，或‘‘脂肪類” ，是彳何種脂肪酸的甘油基酯，例如脂肪酸的單醯基 曰 4基甘油和二醯基甘油等形式。甘油三酸鲳類指 。。舻、祷電且70全疏脂性的彼等分子，例如環原型分子 μ 甘’由和—醯基甘油磷脂質合成中的代謝中， 三醯基甘，、丄 油形式則為用來將化學能量以無水 '緊密狀態 28 存起來之脂肽八2 類，，拃自、^ 刀子。如本文中所使用者，“脂溶性維生素 龙 、尺例如，常見的脂溶性維生素包括維生素（Α)(視 S )、維生 地a (例如，維生素D3(膽鈣化固醇））、維生素E、 、 素K和類似者。 或“[〇t〇5〇] *本文中所使用者，片語“脂質抗氧化活性” 自一脂：抗氧化能力，，係、可互相交換地使用者且指的是來 .樣°°所含脂質區劃之抗氧化能力的測量。如本文中所 使用者，K t五“ y T ^ 係。 °。 7性抗氧化活性”或“水性抗氧化能力” 糸Υ互相交換地使用者且指的是來自一樣品所含水性區劃 化t氧化旎力的測量。如本文中所使用者，片語‘‘總抗氧 匕f眭或總抗氧化能力”係可互相交換地使用者且指 <自樣σσ所含脂質部份和水性部份兩者之抗氧化能 力的測量。 [005 1 ]如本文中所使用者，片語“水性區劃，，指的是 机體樣品中不會與脂質區劃相互作用之部份。水性區劃 包括生物液樣品例如血液、血漿、血清、糞便、腦脊髓液、 ^ ^間貝液、淋巴液和滑液。例如，一流體樣品的水性 區劃例如血清可能不僅包括血液凝結且離心移除掉血球和 凝結要素之後的留下來的液體部份，而且也包括其他化合 物例如：蛋白質，例如白蛋白和球蛋白；抗體；酵素；少 量的營樣性有機物質，例如胺基酸和葡萄冑；無機物質例 如鈉、氣化物、硫酸鹽、磷酸鹽、鈣、鉀、碳酸氫鹽、鎂、 碘、鋅、和鐵；少量的廢棄物，例如，尿素、尿醆、黃嘌 呤、肌酸酐、肌醆、膽色素和氨；以及微量的氣體例如氧 29 1344000 氣和二氧化碳。該流體樣品也可以為非生物樣品，例如， 化學調配物、合成組成物，或食品和化妝品。 [0052] 如本文中所使用者，術語"樣品，，指的是液體 或流體生物樣品’或固體生物樣品，於其中可以使用自由 基產生劑（例如親脂性自由基產生劑或親水性自由基產生劑） 產生自由基且可以使用本發明（〇RAC(〇))偵檢器和方法偵 檢該自由基。生物樣品包括，例如，血液 '血聚、血清、 腦脊趙液、尿液、羊水、間質液、和滑液。固體生物樣品 包或’例如，組織、細胞、組織培養物、固定化細胞、細 φ 胞上澄液、或甚至於組織或細胞物質的部份（或萃取物）。術 語“樣品”也包括非生物樣品例如化學溶液、合成組成 物、和食品。如本文中所使用者，術語“相對〇rac(〇)” 與ORAC(o)指的是相同的值，其經測量成為微莫耳 Trolox®當量/克或毫升。負的〇RAC(〇)值反映出比使用空白 樣所得者較低的自由基驟滅活性’表明—組成物為原-抗氧 化物，亦即，會促進氧化，而非作用為抗氧化物的藥劑。 [0053] 如本文中所使用者，月語“自由基產生劑，，& # “自由基起始物”係可互相交換地使用者且指的是會產生 自由基的藥劑、化合物或分子。自由基產生劑能夠產生可 測量水平的自由基，例如，抗氧化物或可氧化性指示劑能 夠與自由基交互作用以產生可測量或可偵檢的輸出值之水 平。自由基產生劑的例子包括，例如，偶氮自由基產生劑， ， 其可在已知的固定速率之下產生一量的自由基。偶氮自& 基產生？=)彳的例子包括，例如，2，2 ’ -偶氮-雙-(4 -甲氧其_ 2 4 - 30 1344000

〜曱基戊腈）（Me〇-AMvN (Λ 2,2 -偶氮-雙-(2,4-二曱基戊臏）

Umvn)、偶氮二異丁 _ ， 土戍腩） (r. '腈、2,2’-偶氮-雙-(2-曱基丙酸酯） (Damp)、和 2,2，-偶氮.雙 « . n _ (2-脒基丙貌）、2,2’-偶氣-雙-[2-(5- 甲基-2-咪唑啉-2-基）丙烷 離子 ]—成3文皿、鐵、抗壞血酸和金屬 [005 4]如本文中％^^ ,^ 使用者，“對象”指的是任何活的 生物體。術語“對象，，白# Ί _、U θ q ]魚、哺乳動物、爬蟲 頒鳥類、触和類似者。且栌也丨工a , 靈長類例……仙 包括：人類，非人類 如牛:二:：他類人猿與狼子物種1場動物例 电一 山平和馬；馴養的哺乳動物例如狗和貓： 汽驗室動物包括嚆齒類例* 頰例如小鼠、大鼠和天竺屬，與類似 者。該術語不表明一特&丨μ 、 ，·！的年齡或性別。例如，其預計 括成年與新生的對象，以刀Α 及月。兒，不論是雄的或雌的。 [005 5]如本文中所伟 ” Μ吏用者，片語“自由基伴隨失調 症 指的是從自由基的產座+ 座生或暴硌於自由基所導致的病理 學狀況。如本文中所侦用本 者’術語“自由基伴隨失調症” 包括來自自由基的傷害係 & 彳糸助成疾病狀態的病理之病理學狀 '^或”中於杈服自*基抑制劑（例士。，去鐵胺 (deSferrri〇Xamine))’清除劑（例如，生㈣、穀胱甘肽），或 催化劑（例如’ SOD、過氫仆# ^、 ， 、乳化虱酗）後，顯示出可經由減輕徵 候、增加存活率、或在伴嗜 Λ .,, di At 牡保濩上或預防病理學狀態上提供可 偵檢的臨床效益，等彦4 ·5Γ & 座生可偵檢的效益之病理學狀態。自 由基㈣失調症之例子包括，但是不限定m性再注 輸傷害、炎性疾病、系統性紅斑狼瘡、心肌梗塞、中風、 31 1344000 f生出血脊索創傷、克隆氏症（Crohn，s disease)、自體 免疫性疾病(例如，風濕性關節炎、糖尿病)、白内障形成、 年齡相關性斑狀變f、阿兹海默爾氏症(AL—s 咖）葡萄膜炎、氣腫、胃潰癌、氧中毒、贅瘤、非所 欲細胞调亡與輕射病。

[005 6]如本文中所使用者’術語“氧化性壓力，，指的 疋由氧自由基在一對象體内產生的傷害之水平。傷害水平 決疋於反應性氧物種如何快速地產生且隨後被抗氧化物所 抑活化以及修復的處所和速度。如本文中所使用者，關聯 於氧化狀態和氧化性壓力的術語“偏離” （devjati〇n或 deviate)係可互相交換地使用者且指的是一樣品的抗氧化活 性之變化。氧化狀態之變化可能為相對於一已知正常值的 抗氧化物活性之增加、減少、提高或壓制。例如，在一樣 品的脂質區劃、一樣品的水性區劃、或同時在—樣品的脂 質和水性區劃兩者等之内的抗氧化物活性之增加或減少。

[0057]如本文中所使用者，術語“必需醣類，，係用以 定義在細胞糖蛋白所含寡醣鏈中場出現的單II類且彼等可 廉 能不能透過食物或不能在人體内的生物化學製造所輕易得 到者（參看，例如，Harper’s Biochemistry (Murray et a 1,, 1996) (列出 8 種））與 Principles of Biochemistry，Vol Π (Zubay et al·，1 995)(列出I 1種））。雖然在自然界中已經發現有超過 2 0 0種單酿，不過此等1 1種經認為是對哺乳動物維持良好 徤康具有重要性者：半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酿基 神經胺糖酸、岩藻糖、N -乙醯基半乳糖胺、N -乙醯基葡萄 32 1344000 糖胺 '木糖、艾杜糖酸酸、阿拉伯糖和葡萄糖搭酸。此等 酿類的構造都是熟知者（參看，例如，加州，5—叫 (Stryer，1995)和 Merck Index，12〜Editi〇n，1996)。 ^ [0058]如本文中所使用者，術語“營養學上有效量” :用以定義會在哺乳動物體内提供有效益的營養學效應之 里。例如’由於對於含有維生素_和礦物質，食物補充品之 營養學回應係隨各哺乳動物而變異者，因此應該了解者， 維生素和礦物質的營養學上有效量也都分別會變異。同樣 2 ’缺乏必需胺基酸、維生素心鐵、项、維生素、礦物 S、_類、脂質和類似者也都已知會影響生理學功能與細 胞：能者。本文中所揭示的抗氧化物和醣類之營養學上有 效量係用以保存或增高此等重要營養素在，例如尋求彼等 :!物中對此等營養補充品之維持或增高的人類食物中的 :二如&，雖然-哺乳動物可能需要-在一界定量中所 別維生素乂礦物質量[不過另一哺乳動物可能需 型。$同界疋！中所含的相同特別維生素和礦物質量 /0059]如本文中所使用者，術語“藥學上可接受之 ^係™此等鹽，於完善醫學判斷的範圍之内，都 低等動物的組織之内、之上與-起使用而 的合理效益/風險比例二=回應：類似者且有相稱 -7,其"目關部份^ 用方式併入本文）。適當的鹽類可 33 1344000 以在本發明化合物的最後離析和純化之中製備或者分開地 經由將一游離鹼官能與適當的有機酸反應而製備成。代表 性酸加成鹽包括’但是不限定於，乙酸鹽、己二酸鹽、海 蕩酸鹽、檸檬酸鹽、天冬胺酸鹽、苯曱酸鹽 '苯項酸鹽、 硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽 '二葡萄糖酸 鹽、甘油碌酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、反丁浠二 酸鹽、氫氣酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙院續酸鹽 (經乙磺酸鹽）、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲烷磺酸鹽、於鹼 酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸 鹽、3-笨基丙酸鹽、苦味酸鹽、三曱基乙酸鹽、丙酸鹽、丁 二酸鹽 '酒石酸鹽、硫氰酸鹽、磷酸鹽、縠胺酸、碳酸氫 鹽 '對·曱苯磺酸鹽、和十一烷酸鹽。用為四級化劑 (quaternizing agent)的鹼性含氮基之例子包括：低碳數烷基 i化物（曱基、乙基、丙基和丁基的氣化物，溴化物和蛾化 物）；二烷基硫酸酯（二曱基、二乙基、二丁基、和二戊基的 硫酸酷）；長鏈鹵化物（癸基、月桂基 '肉笪蔻基 '和硬脂基 的氣化物，溴化物和碘化物）；芳基烷基鹵化物（苯曱基和苯 乙基的溴化物）與類似者。可以用來形成藥學上可接受之酸 加成鹽的酸之例子包括無機酸，例如，鹽酸、氫演酸、硫 酸和磷酸’與諸如草酸、順丁烯二酸、丁二酸和檸檬酸等 有機酸。也可以在本發明所揭示的抗氧化性化合物之最後 離析與純化中使用適當的鹼例如藥學上可接受之金屬陽離 子之氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽或使用氨或有機一級、 二級或三級胺於原位〇n Situ)製備鹼加成鹽。藥學上可接受 34 1344000 之鹽包括，但是不限定於，與其他一 者，以驗金屬或鹼 土金屬為基底的鹽類例如鐘、納、 納钟、鈣、鎂和鋁等的鹽 和類似者以及無毒性的四級氨和舱 叹荀^月欠％離子類包括，與其他 一起者，銨、四甲基銨、四乙基錢 一 ^ 甲基銨、二甲基銨、 三曱基銨、三乙基銨、二乙基銨、知 牙乙基敍％•之鹽。可以 用來形成驗加成鹽的代表性有機胺包括伸乙基二胺、乙醇 胺、二乙醇胺、六氫毗啶、六氫毗阱和類似者。 [0060]如本文中所使用者，…吾‘‘增強劑” ⑽tenhtoO係指可直接或間接作用以增加或增強本發明疏 脂性和親脂性抗氧化物所具活性之—或更多種藥劑。一種 此等增強劑為維生素C’其可用來再活化或再利用抗氧化物 2本身具有㈣的抗氧化活性。維生素C的原.抗氧化性 貝業經在過渡金屬的存在中觀察到。其他抗氧化活性增強 劑包括天然萃取物’例如葡萄子萃取物和綠茶萃取物。於 -研究中’綠茶展現出強力的試管内(in w抗突變生成活 性且可以抑制動物模型内的致癌劑-誘發贅瘤前病灶的發 展。因此’增強劑會增強或甚至於增效得自天然來源的經 純化且離析出的抗氧化物，例如槲皮_和混合生育酚。 [0061]如本文中所使用者’術語“糖營養性” (^iyC〇nutntl〇nal)或“糖營養素”得指在自然界中合成且為 多種溝通和信號型分子的生物化學合成所需的複雜碳水化 口物或糖類或簡單糖類，彼等溝通和信號型分子可能為在 間質細胞液内呈游離形式，於細胞對細胞的溝通心有活 性(亦即’細胞介素]長因子、等）’或用以構成包括具有 35 1344000 細胞膜的高度特異性分子活性之集中處的分子組態(亦即， 受體部位、離子傳送通道、抗原鑑別、和類似者)。 [0062] 本文中所使用纟，術語“植物營養性” (Phytonutn.onal)^ ^ ^ ^ ^ 勒現的經產生用以保護植物細胞之天然合成分子。植物營 養素主要具有抗氧化物、自由基清除劑和保命微營養素: 性。此等透過食物補充的分子係存在於成熟的植物組織 中’且大部份集’於種子被臈與包圍種子的果實組織之 中方、甫礼動物組織之中，此等於食物中供給的分子且 使細胞微環境中的生物化學、免疫學和生理學最優化：活 性。 / [_3]如本文中所使用者’術語“植物萃取物，，和 稱在措Γ取物”（herba】extract)係可以互相交換使用來指 W取出Μ中產生且可以使用水 '極性溶劑、或石油溶 :二出，並具有某種程度的有益健康或治療活性之植物 之C:草t藥劑可能具有毒性，尤其是經濃縮 k在彼等以“治療疾病與促進良 俗醫筚，，形4. m 民訏徤康所用的民 -:、开"'用於茶和泥敷劑(pouhice)中的更傳 之 寸’通常都是安全者。如本文中所 體強壯筚” π u , 術浯卓本身 觀察到^以咸rrbody-t咖gageni)指的是經本案發明人 織和膠原_雄庶中 鹿所坆成的對於彈性Μ 減少或消=如從皮膚充實和彈性的恢復而有效地 不宜要辛Ί、下垂、或色素沉者以及減損化妝外觀的 要素之逆回等所證明者之物質。 36 1344000 於本發明食物補充品令所包括的碳水化合物可 "、成廣多種天然和合成來源取得，例如取自灌木、樹木、 植物酵母困、真菌、徵菌、樹膠、樹脂、激粉和纖㈣ 衍生物與天然黏液素等來源者。特定言之’某些天然來源 :二⑷木或樹木滲出液，其中包含阿膠、刺梧桐膠、 黃智膠或蓋提膠；⑻海產膠’其包括瓊脂、海藻、鹿角菜 膠二⑷種子勝’其包括苦阿爾勝(guar)、刺槐豆膠，或洋 車j ()植物卒取物’包括果膠或乙醯基化聚甘露糖丨 ;殿粉和纖維素衍生物例如經乙基殿粉（hetastarch)、趟甲基 纖維素、乙基4继雄去、&工# " -絨，准素羥丙基f基纖維素、f基纖維素、 氧化 '戡、隹素’與极生物膠，其包含葡聚糖、黃原膠㈤峨an)。 不過’應該察覺者’本發明組成物無意受到獲得個別碳水 化合物的來源所限制。 〜[〇〇65]本發明醣類可呈單·、寡-及/或更多醣類形式出 現方、自然界中。因此’本發明組成物可能含有呈彼等的單 體型、寡聚物型及，或聚合物型等形式之醜類。對於醣類的 已知天㈣源及彼等的料之名單，請參考美國專利^ 第US2GG3G7277G號，其相關部份以引用方式併於本文。 “ [〇〇,66] ‘如本文中所使用者，術語“碳水化合物”係與 錄類、多醜類，，、“寡醣類，，和“糖類，，可 彼等的定義都是喑於# , 、反水化合物化學技藝者所熟知者◊雖 然本發明組成物意欲包括至少兩種或更多種必需聽類，不 過必須提及者該膽可呈單醣、寡醣及/或更多醋之形式，例 如’含有石黃箸膠和苦阿爾膠的組成物即視為含有半乳糖越 37 1344000 馱、唾液酸、甘露糖和半乳糖者。所以， 給物補充品内的特別膠 、！ 制在-所 個別聰類之含量。…即可控制食物補充品中的 [0〇67]如本文中所使用者—五 生素E之混合物，，俜 。。-兩種形式的維 卜'…用以况明至少兩種選“-H、 ^ ' 7] - - xil- > Yi9 Λ · 、和σ •生育酚，與H _、 D 7 _生育三稀醇類，盘彼g 育酚之、、曰人私 ^“的組合或衍生物之中的生 月酞之-合物。於一具體實例中 素Ε之·、β人此” 主ν兩種形式的維生 素…合物’為至少兩種選“ 酉分之中的生育齡之混合物。於另且^ f 生育 種形式的維…Π :—具體貫例中’“至少兩 京之此合物為《 ·、H、和 齡的混合物。“至少兩種形式 月 ^ A _ 土 I ϋ之此合物可以 L 例如，VITAECAPSH_ ;得自 He如 P〇ratl〇n，或者得自 c〇gnis c〇rp。⑽叫K_kee，叫。 ⑶vITA0L⑧F_35〇M為在商業上可以得自c〇細者且含有 天然來源的α_生育酚與得自食用植物油的混合生育酚。在 本發明抗氧化物组成物φa 4工μ 切，且成物中所包括的特別生育酚混合物係經 由進行ORAC(o)抗氧化物測定而測定出者。 [0068]生育酚的鹽類或衍生物包括藥學上可接受之琏 例如乙酸鹽、硫酸鹽、丁二酸鹽、於驗酸鹽、脲基甲酸鹽： %I鹽、酷、或齒化衍生物；酿類、立體異構物；和類似 者本勒明/函盖在6-烈g芋環及/或側鏈中有取代基、加成， H艾更的維生f E衍生物之使用’但是其限制條件為 該等衍生物必須保留住維生素E的抗氧化活性。例如，生 38 1344000 育齡和彼聳μ i ,, 及寺的何生物可以經由烷基、雙鍵和其他的取代基 " 牙位置與在環和側鏈上的變異而變異。“院基，，岛— 3厌和氫的環狀、分支型或直鏈型化學基，例如曱基、 丁基和辛I。烷基可為不含取代機或含有一或更多個取代 基，例如ώ素、垸氧基、酿氧基、胺基、經基 碎 竣基或笨曱基者。院基可為飽和者或在—或數個位置有不 飽和者。典型者，烧基係、包括1至8個碳，！至6個，或} 至4個碳原子。其他的生育齡可以經由對環結構或側鍵社 合各種其他部份體，例如含有氧、氮、碳及聰而構： 出。生育酚衍生物也經由將原型生育酚例如α _、万_、占、 和r-生育紛的側鏈長度改變而製成。生育齡也可以在環結 構和側鏈中的鍵之立體化學與飽和度予以變異。 [0069]其他的生育盼衍生物，包括前體華物 (PK)drugs) ’可以經由將糖或其他部份體結合到側鏈或環結 構上而製A。混合生育酚包括’但是不限定於，單一生育 S分的立體異構物（例如，^生育紛的+和_立體異構物；⑴月

表明消旋混合物）或構造上不相同的哇古A j的生月酚之混合物（例 如，（2 -加7 -生育齡）。 [0070"·然本發明包括上述1丨種必需醣類，不過必須 提及者其他醜類、營養化合物或生物活性或惰性化合物都 可以包括在本發明食品補充物之中。+贫廿 τ 此寺其他營養化合物 包括下列中的一或更多者：植物營表去 養素、山樂複合物、植 物萃取物、草本萃取物、植物部份灿 月丑、早本成分、維生素 或礦物質。此等營養化合物可以添Λ f丨士 加到本發明食品補充物 39 1344000 之中，或者可以將彼等分開地提供給正服用該食物補充品 之哺乳動4勿。例如’接受本發明含糖營養素劑型的人也可 以在相同劑型内或另外的劑型内接受植物營養素。惰性化 合物可以包括調味料、填充料、潤滑劑、緩衝劑、：膠、 黏合劑、賦形劑' 載劑及/或有助於本發明食物補充品的調 配或投服之其他此等化合物。本發明所有的含糖營養素食 物補充品’即使是含有其他化合物、§劑或其他物質者： 都可以直接得自 Mannatech，Inc. (Coppeii，Tex )。

[0071]纟發明包括直接且同時測量—包括疏脂性及/ 或親水性兩種抗氧化物的組成物所具氧自由基吸收能力 (ORAC)所用之裝置與方法。使用術語“ 〇RAc⑷，，係^為

該檢定法係經由於氧自由基吸收能力檢定法中直接追蹤氧 的消失而直接測量一樣品中的氧含量（ORAC(0))來測量抗 氧化物驟滅自由基的能力之故。現有的工業標準檢定法例 如〇RAC(fl)和0RAC( θ _PE)，係經由測量一營光化合物（勞 光素或沒-蕩紅蛋白）在暴露於氧自由基之後的螢光發射之 降解而間接地測量抗氧化能力。此等檢定法對於親水性抗 氧化物可以良好地操作，但是對於疏脂性抗氧化物或疏脂 性抗氧化物和親水性抗氧化物的混合物之測量則僅具有限 的效用性。另外，不同於已知的0RAc(n)和〇RAC(々 _pE) 系統者，本文中所揭示的〇RAC(0)適合用於簡化與製造可 棄置式感測器。該系統強到足以用來製造診所或甚至家庭 用系統以讓使用者立即用來評定來自生物樣品的氧化能 力。 40 ^υυ〇

[Q()72] 〇RAC(0)裴置。圖1為一 〇RAC(o)直接抗氧化 物1置10之圖示。如所繪示者，該裝置1 〇具有三個基本 俎件.一偵檢器系統丨2、一流體系統丨4、與一數據處理器 系、’充1 6，彼等可以互連以提供數據捕捉、流體和樣品控制 从及數據處理。偵檢器系統1 2具有一氧感測器1 8，其係透 過一或更多條導管2〇與流體系統14呈流體相通。流過該 或更多條導管20的流體系使用一或更多個閥22予以控 制，彼％閥22可以使用人工控制及/或在數據處理系統i 6 勺拴制之下予以控制。於操作中，使樣品24進入系統該流 狃系統且導引到偵檢器1 8之内，且在數據捕捉之後輸送到 疋棄物儲存26處。流體系統丨4也可以包括一或更多份溶 液28 ’彼等溶液係經由泵、真空或壓力，例如加壓惰性氣 ^導引通過流體系統1 4。流體系統14内的溶液28通常 係経預先混合或平衡過，如在本發明中所用者，通常可包 ’合劑、一清潔劑或者水：清潔劑混合物、—氧 自 j^· /X PO . 。。 抗氧化目標物、等，且可以在輸送到氧

^檢^ 34之前於混合室3Q混合。流體系統的選擇係決定 j所需或所選的自動化程度，如諳於此技者所知悉者。樣 :24可以與校準氧感測器18利的溶液先混合或甚至於 可在混合室30預先混合。 ίυϋ73]本發明所用氧偵 似益i S的例子包括此門 …。’月冻劑的存在中偵檢溶氧之任何溶氧感測器 〆：’則益的例子包括’例如，電化學氧感測器、化學 乳感測器、表面電聚子共振氧感測器、紅外線氧感測 41 1344000

電容偶合氧感測器、染料-偶合纖維光學氧感測器或高光譜 氧感測器。於一特定實施例中，該溶氧感測器為一 YSI

5300A 生物氧感測器（YSi· USA)、SPREETA 感測器（Texas Instruments)、PASCO PS2 108 (Pasco, USA)、和類似者。於 一實施例中’溶氧感測器具有下述規格：範圍：〇_2〇毫克/ 升；準確度：整個標度的±10% ;解析度：〇.(H毫克/升：最 大樣品率·· 20 sps ;樣品漏缺率：2 sps ;回應率：60秒鐘 内98% ;溫度範圍·· 0-50°c ;溫度補償：ι〇·4(Γ(：;陰極： 舶，陽極.Ag/AgCl ;膜：1毫升石夕，且可以配合製造商’ 例如，Dissolved Oxygen EZ (Pasco, USA) ’ 所提供的電腦軟 體使用。該系統也可以包括與流體系統相通的pH、〇rp、 導電係數、或濁度等感測器。 [0074]於操作中，本文中所揭示的〇rac(〇)系 照下述使用：使用者採集樣品且將樣品溶解在〇RAC(〇)^ 劑套組之内（乾的或液體者）或使用〇RAC(〇)溶劑套組將^

溶解。將一 ORAC(0)感測器，例如，手持式表面電漿子# 振氧感測器（參看，例如，丁exas Instruments dpreeta感須 器)暴露於-或更多份校準標準品且接著暴露於使用者相 品。該氧感測器係連接到—處理器，該處理器估測來自喬 測器上的"ί貞檢表面之輪中B is AiL ^ m * 4Ϊ且徒供使用者一讀出值。該驾 出值可以顯示在一螢慕之卜，而丨w _ 之上歹]印出及一 /或傳送到處il 器。該使用者樣品可為尿液、唾 。“文空凌、淚液、黏膜分泌物、 汗液、血液（或血液產品）、组織 , )、-丑Α翼便、或疑為具有氧自由

基的其他生物樣品。於—恭A 力、，、粑例中，該樣品為一或更多種 42 1344000 以抽吸器，例如密閉式抽吸器收集的呼吸物（一或更多種呼 出物或呼出物）。由感測器偵檢到的數值甚至可以儲存於記 憶體内（揮發性、半永久性或永久性）以供後面參比或想對於 過去或未來數值進行比較而評定使用者氧化狀態。 [0075] 本發明用於抗氡化物活性的〇RAC(〇)檢定法所 含基本成分係利用既有的似-〇RAC方法，所以可以容易地 調適用於檢驗室而不需要大量的訓練、若有的話。簡略地 說，〇RAC(〇)係使用氧感測器，例如血聚氧感測器或可拆除 式氧感測器來測量原-抗氧化物活性，例如，經由直接測量 樣品溶液中的一或更多種氧自由基產生性分子的相對活性 且使用氧化驟滅劑（抗氧化物）作為標準品。必須提及者某些 藥劑’例如還原性或揮發性藥劑，可能在沒有自由基來源一’ 例如，AAPH,的存在下導致氧的吸收或產生，因而可能影 響溶液中的氧含量。使用本發明之下，諳於此技者可以經 由，例如’在添加自由基起始劑之前評估溶液中的樣品行 為，而區別樣品的自由基驟滅活性與非自由基驟滅活性。 必須注意I ’所檢驗的樣品所具自由基驟滅活性與非自由 基驟滅㈣’如使用本發明所測定者，係關聯於氧化狀態 者。乳自由基產生劑與氧自由基驟滅劑的相對活性可以 對於時間而滴定及/。戈 戎測里，如使用〇RA(：(fn、 RAC(fl hp〇) 0RAC(/3 pE)和類似者之間接式方法者。 [0076] 圖2為摘要 5〇。於""2之中，可拆二:法的基本步驟之流裎圖 混合物中平衡及/或校準且""劑/水/清潔劑 、里基線。灰一貫施例中，該溶 1344000 』/水“潔劑混合物為比例為i :：！的丙酮：水：吐，”〇 混合物。於步驟54中’使用—抗氧化物活性的基線測^作 為陽性對照和基線以與使用，例如，丁r〇】。x(g)作為抗氧化物 的抗氧化活性進行此較，。丨。χ⑧和相關分子的優點在於— :-批的此等維…衍生物較為穩定，具有較低的逐批 變異性且為合成型者’因而可提供可靠的抗氧化物活性濃 度。將步驟54的混合物在步驟56中與氧自由基目標物， 例如亞麻油酸，混合之後，於步驟5 8添加氧自由基產生劑。 之後進行檢定且，於步驟6〇中，經由測量溶氧相對於時間籲 的消失計算曲線下面積（AUC)，且將樣品的數值儲存起來。 於系列或併行之中，將一樣品溶解在溶劑/水/清潔劑混合物 中（步驟66) ’接著於步驟68中添加氧自由基目標物。一般 而言，通常在步驟56和68之中係使用相同類型的氧自由 基目標物，且於步驟5 8和7 2中使用相同類型的氧自由基 產生劑。於步驟72中，偵檢樣品的AUC，且將樣品的數值 儲存起來。至此，標準品與樣品的AUC都已經測定出，將 比等數值經由減掉空白樣的AUC而歸一化。然後使用經歸 一化的標準品與樣品的AUC進行比較且計算樣品中的抗氧 化物活性。 [0 0 7 7 ]下面的討論係用來幫助闡明本發明而不應該用 來限制其範圍。清潔劑吐溫20可能有助於亞麻油酸的分 放。亞麻油酸&供能吸收氧的雙鍵。T r ο 1 〇 X⑧為一種用為内 標準品的合成型抗氧化物。從所有樣品得到的數值都關聯 回到Trolox®的數值。氧自由基產生性分子：2 偶氣_雙 44 丄344000 •(2-脒基丙烷）二鹽酸鹽（ΑΛΡΗ)會與氧反應造出碳中心自由 基。由ΑΑΡΙ1產生的自由基會引起亞麻油酸的氛化。由於 亞麻油鲅氧化的結果，亞麻油酸的雙鍵會變成而與碳 中％自由基中的氧分子結合。氧碳針隨即讀取因為亞麻油 黾氧化所致從反應室移除氧的速率之測量值。偶氮自由美 可與亞麻油酸直接反應’造成亞麻油酸自由基的形成。亞 麻油酸自由基隨即與反應室内所含的氧反應而形成鲷。透 過所提出的任-機制’氧會隨著亞麻油酸的氧化而消耗。 抗氡化物可以經由阻止亞麻油酸的氧化而減緩反應室内的鲁 氧消耗。溶氧對時間標繪圖的曲線下面積之計算得到樣品 的4几氧化此力之量度值，如以其減緩亞麻油酸氧化的 所展現出者。 [0078]氧自由基產生劑。於本發0月⑽心。）檢定法 中，偶氮自由基產生劑係以已知濃度存在著以產生測量抗 ， 氧化活性所用白勺自由基。偶氮起始劑包括，例如，m偶 虱-雙-[2-(5-甲基_2_咪。坐咐_2基）丙烧]二鹽酸鹽、2,2、偶氮_ 雙-(2-胖基丙幻二鹽酸鹽）(AApH)、2,2，·偶I·雙♦胖基丙 · 烷）[2-(Ν-硬脂基）脒基丙烷]二鹽酸鹽⑽])、2,2，_偶氮 -(2-(2-咪哇啉-2-基）丙燒Η2_[2-(4_正辛基）味峻啉_2·基]丙 烷]二鹽酸鹽）（C-8)、2,2，-偶氮-雙-(4·曱氧基_2,4_二甲基戊 腈）（Me〇'AMVN)、2,2’-偶就-雙 _(2,4_ 二〒基戊腈） (AMVN)、偶虱二異丁腈、2,2，·偶氮-雙_(2·甲基丙酸酿）. (DAMP)、和2,2，-偶氮-雙·(2_胖基丙烷）。 ， [〇〇79]例如，自由基產生劑2,2，_偶氮-雙-(2-脒基丙烷） 45 1344000 —鹽酸鹽）（ΑΑΡΗ)會分解成分子氮和兩個碳自由基。該等碳 自由基會結合產生穩定的產物或與分子氧反應產生過氧自 由基。ΑΑΡΗ的半生期為約175小時（37°c，中性ρΗ)。所 以，在溶液中的前數個小時之内，自由基產生速率基本上 係固定者。因此之故’ ΑΑΡΗ常用於脂肪酸的水分散液内之 脂質過氧化；其可單獨地使用或與親脂性及/或疏脂性自由 基產生劑組合使用。由於本發明裝置係測量樣品中的總 氧，因此本文中所揭示的溶劑系統可促成親脂性及/或疏脂 性自由基產生劑任一者或兩者之使用。 [0080]溶劑系統。〇RAC(〇)所用的溶劑系統為三份式 系統，其中包括一溶劑、一水相和一清潔劑。例如，該溶 d可為述自醇類、胺類 '酯類、二醇越類、二醇類、祥 内及/或彼等的混合物。有機溶劑系統係經調配成有低於約 5〇%’約30或33%、低於2〇%且於某些情況中低於1〇%的 溶劑成分者。 該溶劑為丙酮、其可為 體積/體積％之間，水性部

[008 1 ]於一具體實例中， 〇1^(3(〇)溶劑系統的在約1〇與9〇 h為ORAC(o)a劑系統的在約！ 〇與9〇體積/體積％之間， 且該清潔劑為溶劑系統的從〇 〇〇1至9〇%。例如，〇rac(〇) 溶劑系統可為三分之-的水、三分之—的清潔劑（“三分之一 的溶劑），且樣品漢度為，例如，4克/毫升。然後使用相 同的溶劑稀釋。清潔杳彳可i 1 '、丨了為非離子性清潔劑例如吐溫⑧，（例 如’吐,皿@20) ’ BRIJ®、或TRIT〇N⑧；兩性離子型清潔劑 例如CHAPS® ’揚離子性μ劑；或陰離子性清潔劑例如 46 1344000 膽酸鹽、月兒氧膽酸鹽、十二炫基硫酸納、或吐溫"〇;或 界面活性劑。水對丙购對清潔劑的比例可以從介於約5%至 90%與約90%至5%之間。與〇RAC⑼採用一使用—半丙酮 和-半水的兩成分系統所不相同者，〇RAC(。）溶劑系統的清 潔劑可促成從整個樣品直接測量氧。一種變異形式為使用 經隨機曱基化的沒-環糊精之〇RAC(fl_lip〇)。 [0082] ORAC(o)檢定法的用途。〇RAC(〇)檢定法可以測 量生物樣品的總抗氧化活性，用以評估本發明營養補充品 所用成分，及甚至於檢驗和評估本發明競爭劑及/或食物補 _ 充品。對於生物樣品評估的用途，可為，例如，血清、脂 溶性血清部份、水溶性血清部份、尿液、脂溶性尿液部份、 水溶性尿液部份、LDL部份 '組織勾化物、抗氧化物補& 品、食物產。5、或防腐劑的品質管制，新的抗氧化物補充 品之開發’新的食物產品，新的防腐劑、或新的抗氧化物 ^ 治療之開發’食品製造和加工之品質管制，評估植物的抗 氧化活性’或監測化妝產品的抗氧化活性。 【實施方式】 [0083] 實施例；1 :使用ORAC(f丨）檢定法和〇rac(〇)檢 定法之比較。 [0084] 使用先前技術測量螢光的氧自由基吸收能力法 ORAC(fl) ’及使用本發明測量溶氧的方法（〇RAC(〇))分析一 ， 抗氧化物組成物所含諸成分的抗氧化活性。一產品的抗氧 ， 化活性為其保護系統對抗過氧自由基所引起的傷害之能 47 1344000 力0 [0085]用於比較的先前技藝測量抗氧化活性之方法。 對於ORAC(fl)檢定法，係採用〇u等氏的方法（〇u，b , Hampsch-Woodill, M. and Prior，R.L，j Agric F〇〇d ‘ 2001，49, 4619-4626)。與公開的〇11程序之差別包括軌道搖 動器之速度（Ou ’ 400 rpm ;本發明，28〇 rpm)，和離心速度 (Ou ’ I4,000 rpm ’ 15 分鐘；本發明，32〇〇 _，15 分鐘） 與檢定長度（Ou ’ 30分鐘；本發明，1〇〇分鐘）。螢光素、納 鹽係得自Aldrich (Milwaukee, WI)。對於〇u法，係將一標 鲁 準量的螢光素添加到要檢驗的抗氧化產品中，且測量起始 螢光素含量。添加自由基起始劑，且測量螢光消失的時間 和程度。Trolox®，6-羥基-2,5,7,8-四甲基剋_2_羧酸，為一 ， 種具有強抗氧化性質的維生素E之可穿透細胞的水溶性衍 生物。Trolox®可防止大鼠胸腺細胞内的過氧亞硝酸鹽-媒介 ‘ 的氧化性壓力與細胞凋亡，且為一種一批至一批都一致的 合成抗氧化物並用來作為標準品以與每一種樣品進行比 幸父。於計异每一樣品的ORAC(o)值之中所用空白樣（對照樣）_ 可包括在每一檢驗中。將螢光相對於時間標繪出。從每曲 、.泉減掉空白樣（對照樣）。將抗氧化物的淨曲線下面積與 Trolox®的淨曲線下面積相比較。淨曲線下面積愈大，樣品 中的各分子所具抗氧化能力愈大。所有的0RAC(fl)分析都 是在COBAS FARA II離心分析儀上實施（R〇che Diagn〇stk

System lnc” Branchburg，NJ ;激發波長=493 奈米且發射 濾光波長=515奈米）。將結果給成微莫耳ΤΓ〇1〇χ⑧當量每 48 1344000 見樣品。 [0086]測量抗氧化活性之方法。於操作中，係使用本 發明ORAC(o)檢定法來在含有與空氣平衡的氧之下針對一 目標分子（亞麻油酸）評定容易的抗氧化物組成、組合和類似 者。加入一自由基起始劑且測量氧消失的時間，得到消失 速率。使用Trolox®作為標準品，且檢定一空白樣作為對 照。標繪出溶氧量相對於時間之圖，以直接比較淨曲線下 面積。詳細方法如下面所述：緩衝劑（K2PH〇4(F w· 174 2)，

NaH2P04 (FW 120.0))係得自 Sigma ⑻ L〇uis，m〇)，亞麻油 酸 99%，Trolox® (6-羥基-2,5,7,8_ 四甲基剋 _2_ 羧酸）97%， 吐溫®20’和2,2，-偶氮-雙_(2_胖基丙烷）二鹽酸鹽97% (AAPH) ’ 都是得自 Aldrich (Milwaukee, WI)。HPLC 級丙酮 係得自F〗sher (Hampton, NH)。YSI 53〇〇a生物氧感測器係 得自YSI (Yellow Springs，0hlo)且根據製造商的指示使用。 [008 7] ORAC(o)法。使用下列儲備溶液。磷酸鹽緩衝液 的製備（75 mM，pH 7.4) ; 750 mM K2PH04 (F.W. 174.2);稱 取65.33克於500-毫升量瓶内，且添加dH2〇到標記處。濃 度為750 mM。將750 mM Κ：2ΡΗ〇4儲備溶液儲存在用溫度計 校準過的冰箱内（2至8。c)。目標溫度為4。c。75〇 mM NaH2P04 (F\W_ 120·0);稱取45 〇〇克於5〇〇毫升量瓶内， 且添加dH2〇到標記處。濃度為75〇 mM。將75〇 ν沾2Ρ〇4 i者備洛液儲存在用溫度計校準過的冰箱内（2至8。c)。目標 /皿度為4 C。將4〇毫升75〇 mM κ2ΡΗ04儲備溶液與1〇毫 升750 mM NaHjO4储備溶液混合（4對】比例）。如此得到 49 二二。二？備溶液緩衝液，儲備溶液儲存在用溫 稀箱内(2至8。°)。目標溫一使… 量二“ .9)以製備0RAC緩衝液的操作溶液，且測 PH值。其必須為7 4。 止。 ’、、覆瓜在至溫下直到要使用為 f〇〇88]吐溫製備。稱取1〇 + 凡07 土恤20，且加入90 兄老離子水。覆：g且權姓兮、β 儲傜…… “合物整個晚上。保存該吐溫 儲備洛液一個星期。保持在操作檯上。 [顯]溶劑製備。將25毫升丙酮、25毫升去離子水、 ^ 5 ^升吐溫2〇混合。使用此溶劑來製備樣品。在實施 ^之必須檢查探針是否有損壞，特別要注意膜，若 有需要時更換之。探斜你左 彳木針保存時必須將針尖置於去離子水 。此檢定必須只使用一探針與一反應室…小時要檢 定一空白棣和Tr〇I〇x⑧（濃度為1 〇微克/毫升或〇·㈣95微莫 耳/毫升）。 [009曲0]樣品的檢驗濃度為1〇微克/毫升。樣品濃度和 Trolox®濃度必須相同。 [〇〇91]㉟由稱取1毫克的樣品且添加1毫升的溶劑以 實施初始萃取進行稀釋液的製備。搖動1小時，將0.5毫升 該初始卒取溶液放到-坡璃閃料瓶之内，且接著添加 毫升的溶劑，製成第-稀釋液。將該第—稀釋液迴轉約3〇 秒^其Μ為（M毫克/毫升或1〇〇 ppm。取〇 5毫升該 稀釋液，放到另一個玻填閃禅管狀之内，然後添加4,5毫升 溶劑’迴轉約30秒鐘，而得〇·〇1毫克/毫升或心㈣之 50 1344000 濃度。將該等管平方致在4沱冰箱之内。於__ 3rc水浴内 使亞麻油酸解决，並且經…〇 8毫克亞麻油酸中添加 〇·18毫升吐溫儲備溶液，G 18毫升緩衝液和q料毫升去 離子水而製備亞麻油酸溶液（於最少的光之外使用羯片包 裹試管保存溶液。4 8小時製備新鮮的亞麻油酸溶液。要 製備氧自由基產生劑之時，稱取67.8毫克的AAPH，且將 其溶解在0.9毫升緩衝液之内。將該AApH保存在冰箱内， 一可供使用長it 8小時。搖動i小時。於所有時間内該 Τπ^οχ®溶液都必須冷藏保持。要開始測量抗氧化活性時， 於每一反應容器之内，添加丨86毫升緩衝液，2 36毫升水， 於保持在37Υ的閃爍管平内且搜# 3分鐘同時使反應基質 達到該溫度。添加〇·284毫升的樣品，且將探針尖放置到 合器之内但是不接觸到反應溶液，攪拌】分鐘。該測量最 好是在光密環境中進行。

[0092] 在數據採取之後，從該室取出探針，分別添加 0.3 57毫升的亞麻油酸，並將探針端立即放到室内。添加 〇. 3 5 7毫升的A ΑΡΗ溶液，並且小心但迅速地將探針放置到 溶液管内使得反應部份中沒有遺留氣泡，且沒有溶液達到 探針S上的溢流分水線。其次’將探針放置到溶液内並且 讀取一讀值。採取數據且計算抗氧化活性。 [0093] 於“三分之一溶劑”（也稱為〇rac(0)溶劑系 統）中製備濃度為1毫克/毫升的樣品。“三分之一溶劑，，為 等份數的水、丙酮和用水稀釋1 : 9的吐溫®2〇溶液。在室 溫下於一轨道搖動器上以280 rpm搖動樣品1小時。該樣品 51 1344000 為 " 溶液於使用該"三分之一溶劑，’進一步稀釋之後（通常到 1 〇微克/毫升）即可供分析所用。“三分之一溶劑”也用為空 白樣。 [0094] ORAC(o)檢定法係使用YSI 53〇〇a生物氧計進 行的。亞麻油酸係經由添加0· 1 8毫升的75 mM磷酸鹽緩衝 液（pH 7_4)、0.18毫升的10重量％吐溫®2〇儲備溶液、和〇 44 毫升的去離子水到70_8毫克的亞麻油酸中而製備的。aaph 係經由將0.9毫升的緩衝液添加到67.8毫克的AAPH而製 備的。於最後反應體積（5.21 8毫升）中，使用亞麻油酸（2 159 mM)作為自由基作用的目標物，且使用AAPH (9.00 mM)作 為過氧自由基產生劑。使用Trolox® (1〇微克/毫升）作為標 準品。每一秒鐘採取讀數直到觀察到〇讀值為止。 [0095] 計算ORAC(o)值（氧自由基吸收能力氧特異性 電極）所用的公式 AUCsmp-AUCblnk -----------x 1〇〇〇(毫克/克)x [TRLX(微莫耳/毫升)] ORAC(o)

AUCtrlx-AUCblnk [SMP(毫克/毫升)] [0096]另外，於評估液體配方時，可以用毫升來計算 〇RAC(0)。此計算得到稱為微莫耳丁⑺^^⑧當量每克樣品之 量。負的ORAC(o)值反映出比使用空白樣得到者較低的自 由基驟滅活性，表明該組成物為原-氧化物，亦即，可促進 氧化’而非作為抗氧化物之藥劑。〇RAC(o)檢定法的一項假 52 1344000 6又為氧不是被樣品所吸收或由樣品釋放出，不過，可以估 π出樣品的氧含量中之任何影響且用以補償到所計算的抗 氧化物值。 [0097] ORAC(0)與ORAC(fl)檢定法參數之比較。與 ORAC(fl)比較之下’ 〇Rac⑷的優點在於〇RAc⑷的直接 測ΐ抗氧化物潛力相對於〇RAC(f])的間接測量。〇RAc(fi) 為-種間#自由基偵檢方& ’因&其係依賴f光素(目標分 子）為要測量的唯一螢光性成分的假設之故。不過，有許多 種杬氧化性化合物都會自然地發螢光（例如藍莓”且出自自 由基反應的此等化合物之組合也會發出螢光。戶斤以，來自 樣品的螢光可能會扭曲以勞光為基礎的檢定法所得結果。 另-方面’ 〇RAC(。）方法為—種氧攝取量的直接測量亦 即’對變A自由I的氧之消I量所做的直接測量。此種抗 氧化能力的測量方法與氧是否接著到水-或脂溶性成分沒 有關聯。表】提出〇RAC(fl> 〇RAC(。）兩種方法的檢= 53 1344000 檢定中的檢定參數 溫度 ORAC(fl) 37°Γ 外〜〜干又 〇 ORAC(〇) ' 目標分子濃度 1·28 χ 10-2 Μ碟酸鹽緩衝液 37〇C ’ 21.59mM亞麻油酸，於】〇%吐 溫"^20、緩衝液與水的混合物中 (.18毫升，.18紊井，44客从、 樣品濃度 最初為500毫克/20毫升，使 用緩衝液將上澄液稀釋到10 微克/毫升 最初為1毫克/20毫升，稀釋到 10微克/毫升 樣品溶劑 丙酮/水，50/50體積/趙積在 磷酸鹽緩衝液中的稀釋液 水/丙酮/10重量％吐溫® 20， 體積/體積/體積（“三分之一溶 劑”）在“三分之一溶劑”中 的稀釋液 檢定用的緩衝液，濃度 75 mM 磷酸鹽，ΡΗ 7.4 75 mM 填酸鹽，pH 7.4 最後檢定體積 400微升 5.218毫升 空白樣(對照樣） 緩衝液 “三分之一溶劑” 標準品 62.5 //MTrolox®/緩衝液 1'1'〇1(«©10微克/毫升(38.755以 M)在“三分之一溶劑”中 測量樣品抗氧化能力之 方法 螢光產值，隨著其被自由基氧 化所致螢光減低值，抗氧化物 可保護及延遲減低 氧被自由基起始劑，與亞麻油 酸自由基所攝取；抗氧化物係 保護及減低氧攝取 ^ 1 : ORAC(fl)? 〇RAC(o)的檢定參數之比較~ [0098]本發明的一項獨具優點在於使用者不需要學習 新的技術或購買設備來將本方法裝置組裝到彼等的實驗室 環境中。例如’在測量樣品飽和度之時，本發明也使用許 多種在’例如’ 〇u等人所開發的充分建立好的間接測量系 統中所使用的相同緩衝劑、條件、萃取及/或分離步驟。〇u 等人係製備在丙酮/水（5〇 : 50，體積/體積）中濃度為5〇〇毫 克/20毫升的樣品，將彼等放置在旋轉搖動器上以4〇〇 rpnl 轉動1小時，用14,〇〇〇 rpm將彼等離心15分鐘，且使用75 mM碟酸鉀緩衝液（pH 7 4)將彼等稀釋（〇u，et al·， Development and Validation of Oxygen Radical Absorbance 54 l344〇〇〇 鵁 » 噶 %

Capacity Assay for Lipophilic Antioxidant Using Randomly Methylated-/? - Cyclodextrin as the Solubility Enhancer, J. Agric. Food Chem. 2002, 50，1815-1821)。本案發明人發現 在Ου條件（〇RAC(fl)條件）之下有許多種試驗樣品不能溶 解’更可溶性成分會取代較不溶性成分。結果，只有在 ORAC(fl)條件之下溶解化的樣品部份才包括在orac^】）；^ 品和測量之中。所以，根據〇RAC(fl)方法所製作的用於分 析的上澄溶液不可能代表實際樣品的總抗氧化活性。由於 樣品在ORAC(fl)緩衝液中的溶液經常不能反映出樣品的含 量，因此使用ORAC(fl)所得結果可能會有扭曲。 [0099]樣品溶解的問題已察覺出且觀察到混合生育酚 對於使用ORAC (fl)對槲皮酮和混合生育酚的混合物進行抗 氧化測量之缺乏貢獻。如圖7中所顯示者，使用〇RAC(〇) 系統時’ 5微克/毫升的槲皮酮和5微克/毫升的混合生育酚 的組合所得之抗氧化效應相比於各成分在1 〇微克/毫升分 別所得者。相異者，間接〇RAC(fl)系統對於相同的組合肥 有顯示出超越槲皮_單獨者之值的進一步效果（參看圖 1 1 )。來自此種與混合生育酚的組合之活性缺乏以及飽和度 問題在〇RAC(o)法中都不存在，係因為樣品濃度更為稀且 因為樣品所用溶劑包含著丙酮、水與清潔劑以穩定化樣品 的所有成分之故。在樣品所用溶劑中包含吐溫®2〇之舉可促 成來自混合生育酚的活性之偵檢。作為對Trd〇x⑧活性之對 …、者，圖7顯示出所顯示者，5微克/毫升的槲皮酮和5微 克7毫升的混合生育酚的組合相比於各成分在1〇微克/毫升 55 1344000 分別所得者，不過也包括Trolox®對照樣且展示出ORAC(o) 偵檢出隨著時間殘留在樣品中的氡自由基含量之能力。 [0100] ORAC(o)相對於昂貴的ORAC(fl)提供明顯的節 省（自動化者約$250,000 ;非自動化者約$50,000)。相異者， 本文中所揭示的ORAC(o)裝置係利用現成的（off-the-shelf) 氧感測器系統，其可以容易地微小化及/或自動化，以開發 出來用大型螢光劑偵檢系統所具價格的一部分銷售給醫生 診所及甚至於家庭。認證，如由the Association fo Official Analytical Chemicals (AOAC)規範對單一檢驗室所進行 者，提供表2，3和4中所顯示出的結果。 表2.精確度（可童複性）的5天實驗 曲線下面積 第1天 202.655447939563 第2天 212.901122995373 第3天 187.01466464995 第4天 202.856617129109 第5天(第2分析物） 213.124092629655 5天平均值 203.710389068730 標準偏差 10.649840914564 相對標準偏差 5.23% HORRAT 1.981060606061 [0101]每一天的數值為3個濃度為10微克/毫升的槲 皮酮樣品之平均值。HORRAT值為在所觀測到的RSDr值與 由諳於此技者所知悉的Horwitz方程式所預測的RSDr值之 間的比例，且經視為一種方法針對其精確性的可接受性之 56 1344000 指標。於一單一檢驗室績效研究之中，在0.5與2.0之間的 一串HORRAT比例表明一種方法的可接受之精確度。5-天 實驗的HORRAT值為1.98。表3中提供出呈線型範圍的分 析範圍之測定。 表3.分析範圍之測定 樣品(微克/毫升） 曲線下面積 1 124.567114093960 10 209.388111888112 100 693.611111111111 500 2327.96518987343 1000 2870.09540636041 y= 2.8335x + 332.16 ；對於 1-1000 標繪圖 R2 = 0.9231 y= 4.3353X + 176.66 ；對於 0-5 00 標繪圖 R2 = 0.9967 [0102]隨著樣品濃度接近1000微克/毫升，線型完整 性出現遞減情況。在分析範圍的測定呈線型範圍之下，測 定高達500微克/毫升的不定濃度之曲線下面積值。表4提 供單日結果的精確度結果。 表4.精確度（可重複性）的^ ‘曰實驗 曲線下面積 第1回 207.369402985075 第2回 198.18118466899 第3回 205.035211267606 第4回 201.586572438162 第5回 202.110714285714 5回平均值 202.856617128109 標準偏差 3.505016471434 相對標準偏差 1.73% HORRAT 0.654480870834 57 1344000 [0103]單曰精確度實驗包括5個分開的濃度為1 〇微克 /毫升的槲皮酮樣品之檢定。表4的0RAC(0)方法所得 HORRAT 值微 0.65448。 [0104]使用〇RAC(o)檢定法來使實施例2中所述抗氧 化物組成物中的諸成分予以最優化。該組成物的一具體實 例具有以重量比例計算的：槲皮酮，49.1 8% ;混合生育酚， 3 2.79% ;葡萄皮萃取物，9.84% ;綠茶萃取物，6.56% ;和 卡卡杜李，1.64%，使用〇RAC(o)得到17,254微莫耳Trolox® 當量每克之抗氧化值。相同的組成物使用ORAC(fl)得到 5，281微莫耳Trolox®當量每克之抗氧化值。此等數據證實 因為間接ORAC(fl)法的限制，ORAC(o)與ORAC(fl)兩種測 量抗氧化活性的方法所得結果不相同。 不里咋双τ王机軋化物組成物

[〇1〇5]實施例2

[0〗06]根據本發明食物補充品，將5種成分混配成 抗氧化物組成物，每一種都是來自世界各區的著名長壽 之食物。本案發明人係根據對已知為長壽的區域中的食 所作詳盡調查而選擇諸成分。本案發明人發察出此等區 内的食物富含黃醇和生育酚。本案發明人進一步發覺某』 天然化合物會與可以使彼等的抗氧化活性再活化之分= 利地交互作用，例如維生素Ce事實上，精深的研究I心 生素c在’例如’ α.生育酴，的再生中之作用（pizz〇⑽扣 Murray, Textbook 〇f Natural Medicine, 1999, 2nd York，ChurchUl Livingston)。 ， ， 58 1344000 [0 1 07]根據此份研究，本案發明人將經離析且純化過 的來自天然和其他來源的萃取物，其中包括將高比例的得 自各處長壽人士區的生物可利用性化合物混配到一調配物 之内。於本發明一實施例之中，選用下列基本成分：黃醇、 思合生育盼、葡萄皮萃取物、綠茶萃取物、或卡卡杜李， 彼等都是厄瓜多爾國内Vilcabamba的Andean村，嗔:什米爾 境内 Karakoram Range 中的 Huza地區，或前 USSR的

Georgian State 境内 Abkhazia 等地’例如在 Leaf A.，Launois J. “A Scientist Visits Some of the World’s Oldest People,，，

National Geographic. 1973 January 中所載者；以及在義大利 薩丁 尼亞島（Koenig R. “Sardinia’s Mysterious Male Methuselahs，” Science. 2001，March 16),和澳洲等地的人士 之著名食物。 [0 1 08]本發明組成物展現出一種增效性抗氧化活性。 於不希望受到理論所約束之下’該抗氧化組成物所含各種 成分具有保護細胞内細胞溶質、細胞膜、和細胞外流體之 /舌性使付整個身體都被保護住β例如，卡卡杜李成分具有 高天然維生素C含量，其可進入細胞内，為親水性者，且 可用來保護細胞溶質；葡萄皮萃取物和綠茶萃取物都是親 水性者，不能進入細胞内而可用來保護細胞外液體；且混 合生育酚為親脂性者，且與同時為親水性和親脂性的黃醇 類（例如槲皮酮）一起保護細胞膜。另外，食物中，或甚至於 在其食物補充品之中’ &包括的任何纖維可提供足夠的排 泄所用載體。 59 1344000 [οι 09]增效性抗氧化組成物的成分◎在可用到本發明 〇RAC(〇)裝置和方法之下，本案發明人即可測量親脂性和疏 月曰陡兩種抗氧化物與有助於増強此等藥劑的抗氧化活性所 用藥劑，例如維生素c和類似者等的組合之總抗氡化活性。 使用〇RAC(0)系、統，可開發出具有增效活十生的抗氧化組成 物其諸包括類黃醇類，例如槲皮酮，至少兩種形式的維 生素E之混合物，與選用的，葡萄皮萃取物、綠茶萃取物 和澳洲卡卡杜李。於槲皮酮對多維生素E形式混合物的重 量匕例為40/60至90/1 〇%之時可特別地觀察到增效性。該 組成物的一具體實例包括以重量比例計算的：槲皮酮， 49.18%;混合生育盼，32 79%;葡萄皮萃取物，9 84%;綠 茶萃取物，6.56% ;和卡卡杜李，丨64〇/〇。 [0110]圖6為一圖解，顯示出包括槲皮酮、混合生育 酴與生育酚/槲皮酮混合物以及合成抗氧化物標準品 Tr〇l〇x®(H〇ffman-LaRoche)的 0RAC⑷檢定結果。 [〇丨丨1 ]類黃醇類例如槲皮酮。該組成物所含類黃醇類 可為貫酮、黃醇、異黃酮 '異黃醇，彼等的類似物，彼等 的藥學上可接受之鹽或彼等的混合物。黃醇的例子包括樹 皮酮、堪非醇、和楊梅黃酮。該組成物中所包括的特定類 黃酮類或類黃酮類似物或鹽係經由實施〇RAC(〇)抗氧化 物測定而決定的。在槲皮酮活性的8〇%内之活性即預計可 提供一類似物。提到類黃酮，特別者槲皮酮，也打算提及 其糖苷配基或糖苷，此處該糖為例如，阿拉伯糖、鼠李糖、 半乳糖或葡萄糖。槲皮酮的鼠李糖糖苷稱為芸香苷（uhn) 1344000 或槲皮苷，而揚梅黃酮的鼠李糖糖苷稱為楊梅苷 (myricitrin)。槲皮酮的類似物包括在3、5、7、3 ’、和4’ 諸位置中的一或更多個之上包括-OH基以外的一取代基知 彼等化合物。其他取代基包括··少於5個碳原子的烷基、 乙醯基、硫氫基、或丙二醯基。對於槲皮酮的類似物，只 有一或二個位置含有-OH基以外取代基。 [0 1 1 2]類黃酮類例如槲皮酮可輕易地於試管内合成。 不過，類黃酮類（包括槲皮酮）係存在於天然發生的食物且可 從彼等食物離析與純化出’特別是水果和蔬菜，例如蘋果、 梨子、葡萄、洋蔥、紅葡萄酒、甜椒、紅醋栗、黑茶蘼子、 檸檬、櫻桃、蔓越橘、醋栗、番茄、橄欖、蘿蔔、球莖甘 藍、辣根、馬鈴薯、和龍鬚菜。槲皮酮可得自pharmnne (Florida，NY)。 [0113] 卡卡杜李。澳洲卡卡杜李（Terminalia ferdianadiana)含有約5%維生素C與廣多種成分，如由Ηριχ 層析譜所展示者（沒有顯示出數據）。此等成分據信包括黃酮 類與類黃酮類。該HPLC層析譜係使用曱醇和水萃取卡卡杜 李粉末所得樣品在逆相C1S管柱上以〇.1%三氟乙酸和1〇〇% 甲醇的梯度用丨毫升/分的流速溶析而得者。其條件係經開 發以分離類黃酮類及分離維生素c<)吸光度係在245奈米測 量。 [0114] 從卡卡杜李果仁取出果肉和果皮且製成在水中 的水液將忒漿液冷凍乾燥和研磨。用於本發明的抗氧化 組成物之時，稱取合意量的冷凍乾燥物質。卡卡杜李在本 61 1344000 發明組成物中的含量為從〇%至87 9%，或於另一具體實例 中’約2重量％。 [0115] 葡萄皮萃取物。葡萄皮萃取物是從葡萄皮製出 者’且含有30_82 %的多笨酚並可得自Po丨yphenohcs， Madera, CA ； Hunan Kinglong, Bio-Resource Co. Ltd,

Changsha Economic Development Zone，China ;獲得自

Pharmline，Florida，NY。 [0116] 綠茶萃取物。綠茶萃取物為從茶樹（Camenia sinensis)葉子的萃取物，含有35-95%的多苯盼類，且可以 得自 Amax NutraSource Inc·，Eugene，0R ; Blue Calif〇rnia， Rancho Santa Margarita，CA，·或者得自 PL Th〇mas & c〇 , Morristown, N.J. o [01 1 7]其他成分.本發明抗氧化物組成物可包括一或 更多種無毒性、藥學上可接受之載劑，例如乳糖' 澱粉、 蔗糖、葡萄糖、曱基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸 鈣、甘露醇、山梨醇 '環糊精、環糊精衍生物、或類似者。 使用此等一或更多種載劑，可以容易地調配膠囊或片劑， 且可以使其洛液呑％或咀嚼。片劑可包含適當的載劑、黏 合劑、潤滑劑、稀釋劑、崩解劑、著色劑、調味劑、流動 誘導劑、或熔化劑。片劑可經由壓縮或模塑，@需要使用 —或更多種加添的成分予以製造成。壓製片劑可經由將漿 活〖生成分壓縮成自由流動性形式（例如粉末、顆粒），視需要 混合黏合劑（例如，明膠、羥丙基甲基纖維素），澗滑劑，惰 性稀釋劑，防腐劑，崩解劑(例如，澱粉乙醇酸酯鈉、交聯 62 1344000 羧甲基纖維素），界面活性劑或分散劑。適當的黏合劑包括 激粉，明膠，天㈣類例如葡萄I◎•乳糖，玉米甜味劑， 天然和合成樹膠例如阿膠、黃¥膠、或海藻酸納，幾甲基 纖維素，t乙二醇，壞類，或類似者β此等劑型中所使用 的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、笨甲酸鈉、 乙酸鈉、氣化鈉、或類似者。崩解劑包括，例如，观粉、 甲基纖維f、瓊脂、膨潤土、黃原膠、或類似者。模塑片 背J可、·’呈由在適古的機器内將一包括使用惰性液體稀釋劑 濕潤的粉末活性劑模塑而製造成， % [011 8]膠囊或片劑可以視需要塗覆或刻劃且可以調配 成提供抗氧化物組成物的緩慢_或快速_釋放。藥劑的控制釋 放所用的計時釋放型組成物通常包含使用可抗拒腸溶性降 解或朋解一段所選時間的材料予以混合或塗覆脂藥劑粒 子^藥劑的釋放可以經由瀝濾、浸蝕、破裂、擴散或類似 的作用而發生。 [〇 119]載劑可以促進抗氧化物穩定性以及提供時間性 _ 釋放。可以使用一種稱為AMBROTOSE® Phyto Formula的 植物碳水化合物與抗氧化物組成物混配。此種組合可以延 長抗氧化物組成物的擱置壽命（shelf life)及提供時間釋放 型形式。AMBROTOSE® Phyto Formula 含有，約 30/30/20/19/1重量/重量比例的阿拉伯膠（阿膠）、黃原膠、 黃蓍膠、嘉提膠（可得自TicGum)和產薈凝膠萃取物（例如’ 葉内凝膠 ’ Crrington Labs，Irving, TX, MANAPOL®粉末或 類似產品）。AMBROTOSE® Phyto Formula係與本發明抗氡 63 1344000 化物組成物以2 : 1至丨：2的重量比例摻合。於另一具體 實例中，AMBRO丁0SE® Phyt0 F〇_】a係與本發明抗氧^物 組成物以2 : I的重量比例摻合。 [0 1 20]膠囊或片劑可進一步包含依照特定配方而定為 少於約0.1%至90%的重量百分比之植物成分。於載劑的情 況中，載劑本身通常對於組成物的營養意義沒有影響，不 過’此等載劑對於營養有效量的本發明的釋放時機、位置 與釋放量型可具有明顯影響，，一或更多種本發明抗 氧化物可在一或更多個大丸劑中釋放出以在一系列釋放事 件中定加所偵檢到的在例如’血液或尿液，中之抗氧化物 含量。於另一具體實例中，該抗氧化物可以略為均勻地釋 放出’或者甚至可以提供成梯度形式以定加在血液或尿液 含量中。事實上，本發明甚至可以包括在消化中於不同的 時間及/或不同位置釋放出疏脂性和親脂性抗氧化物。例 如，可以將一種抗氧化物裝在泡騰性載劑之上，而將一種 不同的抗氧化物提供成由，例如胃酸或在腸道内釋放所用。 [0121]調配程序。一種調配滾筒壓緊抗氧化物組成物 之方法包括將AMBROTOSE® Phyto Formula與本文中所敛 述的氧化物組成物播合。江所得摻合物轉移到滚筒壓緊機 且於滾筒之間壓緊形成一壓緊物。施加到摻合物上的壓力 可增強成分之間的物理黏著。隨後將該壓緊物輾軋形成粒 狀物。然後將粒狀物形成合意的劑型，例如膠囊或片劑。 於一實施例中，可以使用一 Fitzpatrick ChilS〇nat〇r Model 4LX10D滾筒壓緊機，其輥在跨面及垂直於轉動之方向上有 64 1344000 缺口’且其具有1〇噸之固定力，與約0.093的Fitzmill篩。 該滾筒壓緊裝置可 1古1 _ Μ 衣夏j具有可變的轉動速度，施力，與間隙寬 度等此力例如，可為一種Gerteis Polygran乾式滾筒壓緊 系統（Gerteis，Germany)。滾筒壓緊係經由將摻合物通過兩 相對轉動的滾筒之間對摻合物均勻地施加壓力而發生作用 的由滾筒施加到摻合物上的壓力將摻合物壓縮成一壓緊 物’例如一片或帶，其典型地經輾軋以製成顆粒。或者， 可以視需要經由重擊、研磨或過篩而達到造粒。篩選出具 有# 2 0 - 8 0網目的顆粒。 [0122]抗氧化物組成物與 ambROTOSE® Phyto

Formula的經滾筒壓緊組合所具較長的擱置壽命據認為是 暴露於氧的氧化物組成物表面積之量減少所致。經滾筒壓 緊的組合也在膠囊或片劑製造程序中消除掉賦形劑填充劑 之需要。AMBROTOSE® Phyto Formula與本文中所叙述的氧 化物組成物的組合所具其他效益包括：提供不可溶的纖 維’其可在消化道中用為未配對電子的匯（sink);及提供單 醋用以在自由基所傷害的細胞之修復中矯正促成細胞媒介 /冓通所用的細胞糖形式（glyC〇f〇rms)之結構。 [0 1 23]劑量《可用於服用本發明組成物的投服調配物 包括具有 100、200、300、400、500、600、700' 800、900 或1 〇〇〇毫克的抗氧化物組成物脂膠囊或片劑。於一具體實 例中，在該組成物中沒有添加填充劑、載劑、或安定劑。 於另一具體實例中，係將AMBROTOSE® Phyto Formula與 本發明抗氧化物組成物以2 : 1、I : 1或1 : 2的重量比例 65 1344000 摻合。於另一具體實例中’係將AMBROTOSE® Phyto Formula與本發明抗氧化物組成物以2 : 1的重量比例摻合。 於另一具體實例中’一膠囊或片劑提供500毫克與 AMBROTOSE® Phyto Formula摻合的抗氧化物組成物。對於 此具體實例’可以每日服用兩粒片劑或膠囊。可以施加恰 當的塗層以稱加適口性或延遲吸收。 [0124]圖8和圖9顯示出使用〇RAC(o)方法測量抗氧 化能力時變異槲皮酮對混合生育酚的比例所得淨曲線下面 積（AUC)。所檢定的每一種百分比之總樣品濃度（q + MT) 都是10微克/毫升。例如，於〇%槲皮酮時，混合生育酚的 濃度為1 0微克/毫升，且樣品至中沒有槲皮酮。於1 〇%槲皮 _時’樣品具有1微克/毫升的槲皮酮和9微克/毫升的混合 生育酚。於20。/。槲皮酮時，樣品具有2微克/毫升的槲皮酮 和8微克/毫升的混合生育紛。在4〇與1 〇〇%槲皮酮之間可 以輕易地觀察到增效性，且在從40至90%槲皮酮時可最輕 易地觀察到。直線代表加成效應，亦即於1 〇%槲皮酮之時， 該直線代表90%單獨的混合生育酚之活性與1 〇%單獨的槲 皮酮之活性的和。 [01 25]本發明組成物的基本抗氧化物成分（類黃酮 類’由槲皮酮所代表，與一至少兩種維生素E的混合物）包 括以重量計算從]2.1 %至1〇〇%、30%至85%，或於另一具 體實例中’約82%的該5種成分。於一具體實例中，槲皮 酮的量為5種成分總重量的49·丨8%，且諸維生素e形式的 量為 32.79%。 66 1344000 [0126] 本發明組成物的次級成分（或增強劑）（葡萄皮萃 取物、綠茶萃取物、和卡卡杜李）構成5種成分總重量的從 〇%至87.9%，15%至70%，或約ι8%β如圖10中所顯示者， 於49.18%槲皮酮、32.79%混合生育酚、和1.64。/。卡卡杜李 的存在中定出葡萄皮萃取物和綠茶萃取物的最優比例。葡 萄皮萃取物對綠茶萃取物的最優比例為60/40至80/20。於 一具體實例中，葡萄皮萃取物為抗氧化物組成物總重量的 9.84%且綠茶萃取物為6.56%。卡卡杜李 «山·α„α)係以在從約〇%至87 9%之間的量，或於另一 具體貫例中約2 %量提供作為組成物的成分。於圖1 〇的具 體實例中’卡卡杜李為組成物的丨64〇/〇。 [0127] ORAC(o)檢定法顯示出具有下列重量比例的抗 氧化物摻合物：槲皮酮’ 49.18% ;混合生育酚，32.79% ; 葡萄皮萃取物’ 9,84% ;綠茶萃取物，6.56% ;和卡卡杜李， 1.64% ’具有1 7,254微莫耳Trolox®當量/克的抗氧化活性。

[0128] AMBROTOSE AOTM 的穩定性。AMBROTOSE AO ’一種 AMBROTOSE®(Mannatech，USA)與本發明抗氧 化物調配物以2 : 1重量比例的摻合物，業經在加速穩定性 條件（40 ° C ’ 75%相對溼度）下顯示出可以保持其活性到等同 於約6個月的擱置壽命。 [0129] ORAC(o)檢定法相較於〇RAC(fl)檢定法的確 認。圖1 1為ORAC(o)結果的圖，其中顯示出α-生育酚在以 不同的比例與槲皮酮混合之時對Α0活性沒有貢獻。該圖顯 示出在標準丙酮：水溶液中進行〇RAC(fl)檢定中正比於槲 67 1344000 皮_濃度的MJC之線性増力"對於A〇活性的貢獻之缺乏 可能是因為生育紛不能溶解於丙酮：水之中所致。 [0130]圖12Α和12Β為使用混合生育酚所得

〇RAC(fl-HP〇)結果及使用溶劑/水/清潔劑溶液來溶解樣品 且積檢親脂性和疏脂性兩種抗氧化物能力所得相對auc結 果。於圖ιι(上面）中，顯示出使用標準〇rac⑼方法來偵 檢親脂性她的AQ貢獻之時對於α_生育料能彳貞檢到統 計學上明顯的活性。如θ 12Α中所顯示者，在公開的 〇RAC(fl-nP〇)方法（丙_ :水）與丙酮：水：吐溫·2〇之間比 較對〇：-生育酚的ORAC (fMip0) AUC且偵檢到在 ORAC(n-lipo)檢定的AUC上有大幅增加。圖丨^展現出使 用已知的ORAC(fl-lipo)方法於將槲皮酮與混合生育酚組合 之時沒有偵檢到增效性，因為其結果係依循一通過橫座標 的直線’表明使用此檢定係缺乏增效性者。 [0131]根據對文獻與其中所推薦的方法之研究，使用 邊已知檢定法得到

此等結果係不令人驚訝者。所謂的，，高_〇RAC食品，，的 評定之現行標準（參看www.ars.usda.pnvU^出該標準係測量 與疏脂性抗氧化物隔開且分別的親脂性抗氧化物所具抗氧 化’曰力本發明免除掉此種二方性（dichotomy)之需要，其 為在將試管ORAC值關聯到對血清0RAC值的影響之時， 可能導致研究者所觀察到的不相關性之二分性。在相較於 ORAC(fl)測而測量血清中的抗氧化效應之時，USDA的加 Agncuhural Research Service 發現，例如，於試管 orac 68 1344000 才W疋中’菠菜的評分低於草莓，不過對於企清ORAC值的 衫摹則菠菜高於草莓。使用本文中所述及的本發明與組成 物之下，本案發明人經由開發出一種可促成各具不相同溶 解性的諸抗氧化物之間的交互作用之系統，更佳地反映出 人體内的抗氧化物所具活性而糾正此種不關聯性。間接性 ORAc(fi)方法及/或ORAC(fMip〇)方法都不能測量總抗氧 化物活性且不能彳貞檢到某些食物的增效性效應。 [0132]圖13為使用α-生育酚於變異的清潔劑用量以 顯不其對AUC測量的影響之下所得0RAC(n)的AUC結果 之圖。於此檢定中，係使用以其完全的三分支一之三分支 一溶劑及使用含有較少量的吐溫_2〇之混合物。圖丨4為對 溶解於兩種不相同的溶劑：水對清潔劑比例之混合物中具 有固定比例的槲皮酮：α -生育酚測量抗氧化物活性之 ORAC(fi)檢定結果圖。圖13和圖14中的結果顯示出清潔 劑（吐溫-20)不會造成AUC的增加，所以〇RAC(f])活性偵檢 相對於標準丙酮：水混合物係增加的。 [〇〗33]實施例3。抗氧化增效性與增強性之〇rac(〇) 偵檢p [0134]為了顯示出〇RAC(〇)檢定法能夠同時偵檢親脂 性和疏脂性兩種抗氧化物之活性，乃進行一系列的研究以 顯示出已知濃度的親脂性和疏脂性兩種抗氧化物之特定組 合之效應以及比等在添加，例如，葡萄子萃取物和綠茶萃 取物，相對於單獨的葡萄子萃取物和綠茶萃取物之増強 性。圖15為一使用不同比例的槲皮酮和混合生育酚所得 69 1344000 ORAC(o)值之圖。圖丨6為顯示出使用不同比例的葡萄子萃 取物（GES)和綠茶萃取物（GTE)所得〇rac(〇)值之圖。於針 對抗氧化物活性決定出GSE與GTE的最大比例之後，將兩 者與最優比例的槲皮酮和混合生育酚混配。圖17為顯示出 ， 使用最大的槲皮酮：混合生育酚與葡萄皮萃取物和綠茶萃 取物比例之組合所# 0RAC⑷值之圖。可以發現經混配的 樹皮酮和混合生育lGSE、GTE可使該補充品的抗氧化潛 力達到最大。 [0135]實施例4 : AMBR〇T〇SE a〇TM在少數健康個鲁 體、開放標記研究、非-無效對照劑對照中之抗氧化效應。 [〇 1 36]抗氧化物係經定義為可以延遲或阻止生物基質 的氧化之任何物質。有豐富的包含抗氧化物的水果和蔬菜 之食物業經與減少的經認為是氧化性壓力的結果之病理學 狀況發生率相關聯。不$，使用經離析的抗氧化性化合物 的補充於許多情況中時常證明不能有效地改善健康且於 其他情況中’甚至於具有危險性丨’3’4。已經有提出高水果 和蔬菜㈣量所具抗氧化效益可能不能完全從單一抗氧化 · 物所導致，而是來自此等食物中所含多種不同的抗氧化物 之組合所具協同作用5.6。此種對於單一抗氧化物之專注為 科學家尚要使用營養補充品複製富含抗氧化物的食物所具 保護效用之一項可能解釋7。 [0137]最近的研究推測出糖營養性（GN)補充品，提供 ， 糖的營養補充品，可以支持細胞溝通和免疫功能，°同時# 有試管内（in v〗tr0)和活體内（in viv〇)抗氧化性質。在含有 70 1344000 ⑽補充品的培養基内生長的大鼠肝細胞顯示出相對於對昭 樣較為高的還原榖胱甘肽含量，由是證明有增加的抗氧化 保護作用8。 [0138] —試驗性臨床研究食用gn補充品的人士體内 的氧化泣壓力之生物標記有減低且其氧化性防紫的生物標 記有增加。於在正常食物中每曰添加2克的GN補充品之後 的76天之内’觀察到在總鐵結合性能力與葉酸有明顯的增 加，且在銅/血黎銅藍蛋白比例觀察到明顯的減低。此外， 也觀察到可推測出血清烯醛類、高半胱胺酸、8_羥基脫氧鳥 苷（8-OHdG)與總膽固醇之減低，與氧自由基吸收能力 (ORAC；s _PE)之傾向 9。 [0139]最近的研究證明有廣泛為的營養素（有些為已 知者，但是仍#其他者&尚未鑑定者）可促成水果和蔬菜的 抗氧化活性丨。·"—…。某些已知的有效益抗氧化物包 括多苯酚’和維生素C與E6。某些食物和飲料，包括葡萄（和 紅葡萄酒）、綠茶、和澳洲卡卡杜李 介r山心㈣α)，和有相當高含量的此等抗氧化物^ , ls. ΐό。 [0 140]此研究係測量由將GN補充品混配一從綠茶、 葡萄、混合生育酚、槲皮酮和澳洲卡卡杜李衍生的摻合物 所得新穎營養補充品所提供的抗氧化保護作用。 [0141]方法，血液樣品係由 c〇ver-Tek，Inc，Da]Us， TX所收集。所有的血液樣品和尿液樣品都是由Gen〇x Corporation，Baltimore，MD所分析，且所有的統計學分析 都是由 Decision Analyst，Arlington，TX 所實施的。 71 1344000 [〇 142]已經有許多種用於檢驗樣品的抗氧化潛力之方 法發表出來17。本研究所使用的檢驗為測量完全血液的 ORAC β -ΡΕ。此方法係使用召_藻紅蛋白，一種螢光探針，來 測疋血清樣品的抗氧化性清除能力’尤其是針對過氣自由 基’且與已知的標準-品-，--订〇1-0讀7--相-比-較一。--其'绪-果-係_表為_ 微莫耳Trolox當量（ΤΕ)/克18。研究中所使用的其他標準化 刀析技術為尿液脂質氫過氧化物和烯醛類，彼等間接地關 聯於對脂質的自由基傷害之量，以及尿液8_〇HdG，其間接 地關聯於DNA傷害，等之測量。 [0M3]此研究中所使用的抗氧化性營養補充品， AMBR〇TOSE a〇tm，係使用下列成分經試管内評估所發展 出者：槲皮酮、混合生育酚、葡萄萃取物、綠茶萃取物、 和澳洲卡卡杜李。每一種成分的試管内抗氧化值都是使用 標準⑽ACnM (其使用—不相同的螢光素探針）測定的。 諸成分的混合物所具抗氧化值係使用一種新開發出的方法 予^収1方法係直接測量溶氧，GRAC。。由於脂溶性和 j溶性抗氧化物在活體内係協同作用纟，因此能夠同時測 量脂溶性和水溶性化合物的貢獻與交互作用之〇rac。為一 種相對於以營光為基底的方法（⑽A。、⑽ac_和〇rac t^改良。此等方法，最多，係測量單獨的脂溶性化合 :或單獨的水洛性化合物之活性。所以⑽A。。係提供對水 矛月曰/合f生兩種成分的摻合物户斤具總試管内抗氧化活性 之更準確測疋。將水溶性和脂溶性兩種成分混配且使用 ORAC。進行評定以建立最大增效性與摻合物的最優試管内 72 1344000 ORAC0 值。 [0144]將所得摻合物與Ambrotose®複合物以1 : 2的 比例滾筒壓緊而造出Ambrotose a〇tm。於Ambr〇t〇se⑧中的 許多種天然樹膠業經用來控制化合物的釋放以提供持續的 輸送。此特殊產品的開發為另一發表的主題且為一美國專 利申請。

[0 145]此研究經設計用來經由使用標準化檢驗測定不 同量的Ambrotose AO®所具活體内抗氧化活性，其中係以 血清〇RACipe直接測定及以尿液氫過氧化物、烯醛和 8-OHdG 4的分析間接測定β ρΓ〗〇Γ and cao於最近推測需要 的是一組檢驗而非任合一單獨檢驗，因為某些病理學狀 況，例如腎衰竭，可能將任何一檢驗變更到與氧化性壓力 十分不相關之程度之故22。

[0146]從所有的參與者都收到通知同意書。有12個健 康的男丨生和女性成人志願者加入，他們都沒有服用會干擾 研究的營養補充品或任何藥物。讓研究對象，年齡為22_61 歲的四個男人和8個女人，食用遞增量的抗氧化物補充品。 為了評估〇RACtPE隨時間的變異性及試驗實驗結果的可 複製性，乃從額外一個沒有服用補充品的對象採取血液和 尿液樣品。於研究中，參與者繼續彼等正常的研究前每曰 例行事項與食物。表3提供有關研究對象的資料。 73 1344000

[〇147] 12個研究對象在前2週沒有食用補 洗清期之後及2週结束於 | °°之起始 之後都貫施早晨禁食血清〇R 八 補充口口 π URAC〃 ·ΡΕ分析和尿液分 品使用的前14天（第]如p，、私μ 啊補充 (第1期間）所使用的量為每天5GG毫克Π 粒膠幻，第：個14天_第2期間）每天Μ扣粒膠 囊），即在第二個14天期間（第3期間）每天1‘5克（3粒膠 囊）。此外，以三重複樣分析沒有食用補充品的個體之血液 和尿液樣品以檢驗分析的精蜂度。血液和尿液樣品係由獨 立的篇血技士收集’立即包裝在乾冰中且輸送到當地的醫 院檢驗室進行製備。然後將製備好的血清和尿液樣品至於 乾冰中！仪運送到Genox根據GenGX的程序進行獨立分析 23。之後將所有的樣品都貯存在乾冰中放在以麵，且於研 究完結時同時全部完成〇 R A ^ p e和尿液測量以以減低任 何分析藥劑變異性。 [〇148]結果·· 基線數攄的百分#化率。 74 1344000 表6給出服用Ambrotose AOTM的12個參與者所得ORAC^s -PE值和對基線的百分變化率。基線為2-週洗清後，服用500 毫克2週後的第1期間，服用1 .〇克2週後的第2期間，與 服用1.5克2週後的第3期間。於運送到Genox的過程中， 某些第2期間樣品的血清管瓶標記脫離掉。對於此期間只 能對3個參與者特定地指定ORACtPE值而對其餘的研究參 與者或額外的非研究個體則不能指定ORAC tPE值。

表2. ORAC^pe值與對基線的百分變化率 ORAC 對基線的％變化3 i 對象 基線 第1期間 第2期間* 第3期間 第1期間 第2期間 第3期間 1 3300.3 5709.4 3117.8 73.0% -5.5% 2 3754.5 4618.6 6731.8 6189.0 23.0% 79.3% 64.8% 3 3695.0 3867.9 3995.7 4.7% 8.1% 4 3954.3 3199.1 2703.8 -19.1% -31.6% 5 3107.3 3295.2 4476.2 6.0% 44.1% 6 3313.0 5073.8 3156.6 53.1% -4.7% 7 3785.5 5069.9 4390.4 33.9% 16.0% 8 3341.2 4207.7 4003.2 25.9% 19.8% 9 7568.9 6053.2 8977.6 7734.1 -20.0% 18.6% 2.2% 10 4271.8 6132.5 6765.0 43.6% 54.8% 11 5619.2 6527.0 6420.0 6844.3 16.2% 14.3% 21.8% 12 5642.9 5025.4 4398.7 -10.9% -22.0%

[0149]原 ORAC數攄之統計分析。實施重複測量 ANOVA以測定在基線、第1期間、第2期間、和第3期間 的原ORAC數據之間是否有差異。於諸時間期之間整體地 有差異存在（F(3,24) = 4.02，p = .020)。此後的分析顯露出 第2期間對基線有明顯的不同（t(24) = -3.47，p = .002)。第 1期間明顯地不同於第2期間（t(24) = -2.77，p = .01 1)。第 2期間明顯地不同於第3期間（t(24) = 2.87，p = .009)。表6 75 1344000 顯示出每一時間期的平均值。 表6.每一時間掂的平均0見\(：^£值 時間期 對象數目 平均ORAC計分 基線 12 4279.5 847.9 第1期間 12 4898.3 699.1 第2期間 3 7376.5 3466.6 第3期間 12 4814.6 1053.1 [0150]相對於基線ORAC數攄的百分蠻化率之統計分 姓_。與上面所報告的分析中所使用之原數據（表6)不相同 φ 者，此處的分析係探討諸時間期之間表為相對於基線的百 分變化率之差異。進行重複測量ANOVA以評估在第1期 間、第2期間、與第3期間ORAC數據相對於基線的百分 變化率之間的差異。多項試驗（Omnibus test)得到沒有整體 統計意義（F(2,13) = 0.71，p = .510)。此外，此後的分析顯 露出諸期間之間沒有明顯的差異。表7顯示出每一時間期 的平均值，圖B中顯示出相應的框標繪圖。 _ · 表7.每一時間期的ORACape值相對於基線的百分變化率之框圊 時間期 對象數目 ORAC計分百分變化率脂平均值 土 第1期間 12 19.1% 18.1% 第2期間 3 37.4% 90.3% 第3期間 12 14.3% 19.0% [0 1 5 1 ]表8摘列出平均脂質氫過氧化物、總烯醛和 8-OHdG值。彼等都經由除以對相同樣品同時測量到的尿肌 酸酐以矯正尿濃度變異性。 76 1344000 表8.每一 2週期 間的平均尿生物標記 時間期 對象數目 氫過氧化物/肌酸酐 #ινί/(ΐ 克/¾ 升） 烯醛/肌酸酐 //M''(毫克''毫升） 8-OHdG/肌酸酐 (毫克/毫升)/(毫克/毫升） 基線 12 0.0920 0-0761 0.0724 第1期間 12 0.0800 0.0808 0.0861 第2期間 12 0.0782 0.0835 0.0740 第3期間 12 0.0764 0.0806 0.1025 [0152]空氣品質。空氣品質係已知會影響氧化性壓力 層次者。常見污染物，例如臭氧和二氧化氮的濃度增加， 空氣隨之減低。如此會導致ROS產生之更大潛在性24 ’ 25。 表 6 給出在研究對象所生活的達拉斯市沃思堡（the Dallas/Fort Worth) (DFW)區域中每2星期期間的平均美國 環境保護局（U.S. Environmental Protection Agency) (EPA) 空氣品質指數的摘要。EPA使用色碼於每一區域的空氣品 質輿圖：綠色：“良好”（〇-79份每十億份[ppb]臭氧）；黃色： “中等”（80-99 ppb);橘色：“對於敏感組不衛生”（100-124 ?卩1));紅色：“不衛生”（125-149 ??15);及紫色：“非常不 衛生”（大於150 ppb)。研究區域的每日EPA舆圖之數值係 經由對諸顏色指定數值：綠色：1 ;黃色：2 ;橘色：3 ;紅 色：4 ;和紫色：5且根據在公開的EPA輿圖上的每一顏色 之面積估算每一天的數值平均值。然後針對每一 2-週研究 期間將每曰數值平均起來（表9)。 表9.每一時間期的平均DFW EPA空氣品質指數 時間期 平均EPA空氣品質指數 基線 1.0(範圍 1.0-1.0) 第1期間 1.0(範圍 1.0-1.1) 第2期間 1.4(範圍 1.0-2.5) 第3期間 1.8 (範圍 1.0-2.5) 77 ^44000 “ [0153]如上面所概述者，容許在給第2期間種的研究 者指疋述值時有不準量（uncertainty)之下，計算出u 個研九參與者的最低可能平均〇rac"e。假設來自所屬的 標記不能鑑別的參與者之血清樣品具有最低的9個值並將 彼等值與3個已知值組合即得到最低可能平均值與因而得 到最保寸的對基線之變化率估計。9個最低的〇rac^pe值 為，4727.9、5233.9、5104.3、4599.9、5699.9、5364.8、3987.3、 79.7 # 45 84.9。在與3個從表5已知的第2期間值組合 之％，即可仔到1 2個研究參與者在第2期間中的平均〇RAc ^值：5467.70。此數值比4279.49之基線值較高27.8%。

〗54]讨淪。研究證明食用含有豐富水果和蔬菜 物可對抗氧化性壓力7 · 26. 27 份的水果和3-5份的蔬菜28。 國很少個人會食用所建議的每日用量 。食物準則主張每日食用 雖然有此種知識與建議， 的食2-4 在美

[0155]於一美國農業部（U.S, Department of AgncuU叫（USDA)監督的床研究中，研究人員發現增加的 水果和蔬菜用量，特別是從常用的每日5份增加到實驗性 每日份之時，於2週之後，明顯地增加血清〇rac"e :到高達13%'於現行研究中，使用每一種補充品用量所 得平均血清0RA〇-PE值之增加情形為：用5〇〇毫克時增加 19.1%，用L0克增加37.4%，及用15克增加14 3%。此等 數據可推測於健康人士中，導致血清〇Rac"e值相對於基 線的最大提高之最優量為1.〇克。使用1 〇克八㈣咖e △π所得27.8%增加率之保守性估計係對食用5份額外的 78 1344000 水果和蔬菜的個體所報告的13%之兩倍以上。 [0 1 5 6 ]尿液氫過氧化物/肌酸針值係隨著補充品用量 的增加而減低。每一用量的減低值分別為：500毫克的 ！·0克的15.0%’和丨.5克的17.〇%，可推測在所研 究的範圍之内’對抗脂質傷害的保護作用係隨著補充品用 量的增加而增加。 [0157] 目前還不清楚脂質氫過氧化物數據不能與 〇1^〇^^值正確地相關聯。血清0RACtpE值為血液有關 於其在測量之時驟滅自由基的能力之抗氧化性保護作用之 里度。尿月日貝氫過氧化物為過去某些時候的脂質氧化性傷 害之標記。實際的脂質傷害與尿液中脂質氫過氧化物的出 現之間的時間關係尚未清晰確定。可能者為此等時間差異 為過去造成此等變異之因。 [0158] 除了尿液脂質氫過氧化物之外，也於每一時間 期測量尿液8-OHdG和稀醛。沒有觀察到明顯差異且沒有任 何傾向。此再度地可關聯於在實際脂質和DNa傷害與尿液 中生物標記的出現之間的時間關係。 [0159] 生活在DFW區内的研究參與者。將對DFWm 公佈的EPA每曰空氣品質估測值對每一 2_週期間於以平 均。於研究過程中空氣品質逐漸變壞。此現象通常會預期 經由增加ROS而增高氧化性壓力且因而增加氧化性傷害的 生物標記，例如脂質氫過氧化物29 ^相反地，如從所測量到 的增加之血清ORAC值所明顯看出的有增加之保護作用。 此外，尿液脂質氫過氧化物值的向下趨勢和尿液8_〇HdG與 79 1344000 烯醛的穩定性都提供減低的氧化性傷害之證據。總而言 之，此等數據可推測出由補充品所提供的抗氧化性作用可 能大於實際上測量到的效用。 [0160]結論。雖然有建議個體根據公開的指引食用水 果和蔬菜，不過事實上為絕大多數都不如此做。此等初步 數據可推測含有可在最後產品中保持抗氧化活性的最優抗 氧化成分之營養補充品可增加徤康個體的抗氧化保護作 用，如從血清0RAC〃 ·ΡΕ所測量到者，且可減低脂質氧化性 傷害如由尿液脂質氫過氧化物所測量到者。由2星期之後 血清ORAG ·ΡΕ增加超過基線所展現的對健康者之保護作 用，於使用500毫克、〗，〇克和15克Ambr〇t〇seA〇TM之時， 大於么佈的於食物中添加水果和蔬菜食用2星期後所得數 據（19.1% '37.4%和 14.3%相對於 13%)。 [0161] 就我們所知，本研究為使用抗氧化補充品來探 纣健康人的四項抗氧化壓力測量且顯示出此等血清〇rac3 -PE的增加之第一個研究。雖然由〇RACtfpE值所建議的在 徤康對象之間的最優範圍為丨克每天，不過研究顯示具有 低血清ORAC值的個體可受益於高劑量的抗氧化物補充 。因此，患有增高的氧化性壓力或他種壓力的個體可從更 大的劑量獲益。 [0162] 雖然在抗氧化物摻合物調配之中係使用 ORAC(o)，不過於一獨立的檢驗室中係使用一種已經建立好 的方法’ ORAC tPE ’來分析人類臨床實驗血漿樣品。 Ambrotose ΑΟτΜ產品所具抗氧化效用性的活體内評估並不 80 1344000 是依賴ORAC(o)方法的使用。 [0】63]此等數據展現出本發明抗氧化物補充品可增加 消費者體内的抗氧化保護作用如由血清〇RAC(0 _pE)所測 $到者，且可減低脂質氧化性傷害如由尿液脂質氫過氧化 物所測量到者。 [0164]要了解者，本文中所說明的特別具體實例係以 不範說明性顯示出且不是用來限制本發明。本發明的主要 特點可以用於多種具體實例中而不違離本發明的範圍。諳 於此技者可以察覺出’或可以使用不超過例行性實驗即確修 定出，對本文中所述及的特定程序之眾多等效物。此等等 效物都視為係落於本發明的範圍之内且係由申請專利範圍 所涵蓋者。 [01 65] s兒明書内所提及的所有發表文章和專利申請都 指示出諳於本發明所相關的技藝者所具技術水平。所有發 表文章和專利申請都以每一個別發表文章和專利申請係經 特定地且個別地表明以引用方式併於本文中之程度以引用 方式併於本文。 擊 [0166]本文中所揭示且主張的所有組成物及/或方法 都可以在本揭示内容的觀點之下不必用到過多的實驗即可 作成與實施。雖然本發明的組成物和方法已經以其較佳具 體實例說明過，不過諳於此技者都了解可以對本文_所述 及的組成物及/或方法以及該方法的步驟或步驟順序給予多 種變異而不違離本發明的觀念、旨意和範圍。更特定言之， 要了解者為，於化學上和物理上有關聯的某些藥劑可以取 81 1344000 代本文中所述及的藥劑而達到相同或相似的結果。諳於此 技者所明瞭的所有此等類似的取代和修改都視為係落於如 後附申請專利範圍所界定的本發明旨意'範圍和觀念之内。 參考文獻 1. Koepke CM, Le L, McAnalley S, et al. Results of clinical trials with antioxidants: a review. GlycoScience &Nutrition (Official Publication of GlycoScience corn: The Nutrition Science Site). 2003;4(3): 1-7.

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89

Claims (1)

1. 申請專利範圍 1. 一種抗氧化食物補充品，其包括： 經離析且純化過的疏脂性抗氧化物與 經離析且純化過的親脂性抗氧化物， 其中該組合後的疏脂性抗氧化物和親脂性抗氧化物具 有大於6,000微莫耳Trolox當量（TE)/克之溶氧值。 2. 如申請專利範圍第！項之補充品，其中該疏脂性抗氧 化物和親脂性抗氧化物係按時間釋放者。 3. 如申專利&圍第i項之補充品’其中該疏脂性抗氧 化物係選自—或更多種維生t E所構成的群組之中，該維 生素 E 係選 “U_、e·、m_、xii_、 Xl2…和σ-生育盼，與a-、mT-生育三稀醇類 (t〇C〇trien〇ls) ’被等的類似物，彼等的藥學上可接受之醆 類，與彼等的組合所構成的群組之中。 风 4·如申w專利關第1項之補充品，其中該親脂性抗& 化物係選自獬皮_ 一⑽如）、堪非醇（k職pbi) 黃酮（myricetin)、三麵其主 梅 故丞汽酮（apigenin)和彼等的衍生物 類似物，彼等的筚擧p , ’ 樂予上可接文之鹽類，與彼等的組合 成的群組之中。 博 5 .如申請專利笳m货 摩已圍第1項之補充品，其進一步包括二 更多種必需醣類。 一或 士申。月專利把圍第i項之補充品，其進一步包括 更，種選自半乳糖、半乳糖胺1萄糖胺、葡萄糖、：！ 糖、乙醯基化甘露糠、n乙醯基神經胺糖酸、岩藻糠、 90 1344000 乙醯基半乳糖胺、N 乙s&基匍萄糖胺、和木糖所構成 組之中之醣類。 f 7.如申請專利益 钯固弟1項之補充品，其進一步包括一 生素C的植物來源。 术 申吻專利範圍帛7項之補充品，其中該維生素c 的植物來源包虹 〃 括澳洲卡卡杜李樹—… Jerdinandiana)。 7項之補充品，其中該維生素C -澳洲卡卡杜李樹（7>r/Wi•⑽心

   9.如申請專利範圍第 的植物來源包括抒生 ferdinandiana) ° W如甲請專利範圍第7項之補充品，其進一步包和 或更多種原-生物素(pro· — )。 丨1·如申請專利範圍帛7項之補充品，其進一步包招 或更多種選自乳桿菌屬(—//…久)和雙歧桿菌 (Bifid〇baCterium sp.)之中的原屯物素。 其中該補充品係 其中該補充品係 鍵、泡騰片劑或

   12·如申請專利範圍帛1項之補充品 經壓縮以提供通常為氧不可穿透的表面。 13.如申請專利範圍帛i項之補充品， 經滾筒壓縮的粒子、膠囊、片劑、小片、 彼等的組合。 14.如申請專利範圍帛"員之補充品，其中該經離析且 純化過的親脂性抗氧化物，纟中該疏脂性抗氧化物和親脂 性抗氧化物具有大於7〇〇〇微莫耳Tr〇1〇x當量（τε)/克之抗 氧化 ORAC(fUlip0)值。 91 1344000 15.如申請專利範圍第1項之補充品，其中該經離析且 純化過的親脂性抗氧化物，其中該疏脂性抗氧化物和親脂 性抗氧化物於提供給一患者之時，提供超過該患者的基線 抗氧化物含量更高13%之增加，其係用〇RAc(P-PE)測量。 16.—種食物補充品，其包括： 營養學上有效量的二或更多種必需醣類； 二離析且純化過的疏脂性氧自由基驟滅劑；與 經離析且純化過的親脂性氧自由基驟滅劑， 其中該組合後的疏脂性氧自由基驟滅劑和親脂性氧自鲁 由基驟滅劑具有大於6,〇〇〇微莫耳ΤΓ〇1〇χ當量（te)/克之氧 自由基驟滅劑值。 17.如申請專利範圍第16項之補充品，其中該疏脂性氧 自由基驟滅劑和親脂性氧自由基驟滅劑於提供給一患者之 時，提供M QRAC^_PE)測量為“該患者的 物含量更高13%之增加。 虱化 1广請專利範圍第16項之補充品，其中該疏脂性氧 二t基驟滅劑和親脂性氧自由基驟滅劑係經包裝用於延長 釋放。 K A丄β ”〜惘兄。口，具肀該疏脂性惫 自由基驟滅劑係選自一或更多種 虱 中錢生素E係選自α_、^… X11-、xi2-、和^生育酚，與口… 乃_、 烯醇類（tocotrienols)，彼等的鈾v d 月二 嵌寺的頰似物’彼等的藥學上可接受 與彼等的組合所構成的群组之中。 92 ▲ v/·又口 —專利範圍第16項之補充品，其中該親脂性 自由基驟滅杳彳H_ , 三、 …係選自頁酮類、槲皮酮、堪非醇、揚梅黃_、 成'貝鋼和彼等的衍生物’類似物’彼等的藥學上可接 又之風類，與彼等的組合所構成的群組之中。 1.如申凊專利範圍第16項之補充品，其進一步包括二 灵多種選ή t 、自+礼糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙醯基神經胺 和*糖、Ν·乙醯基半乳糖胺、冰乙醯基葡萄糖胺、 鹽：矛:皮等的何生物，類似物’彼等的藥學上可接受之 一’與彼等的組合所構成的群組之中之酷類。 $ 申明專利範圍第1 6項之補充品，其進一步包括丄 或更多種潠白主力丨地 v ^枯，、 糖酸、岩^ 葡萄糖、甘露糖、N-乙酿基神經胺 和木糖二、N_乙醯基半乳糖胺' 队乙醯基葡萄糖胺、 子口木糖和彼等的衍4 叹 鹽類，盘彼等的组人 物’彼等的藥學上可接受之 做寺的組合所堪4 W構成的群組之中之醣類。

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