TWI281394B - Hair growth stimulant, hair fostering shampoo, and hair fitness/tension improving agent - Google Patents

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A7 1281394 ___________ 五、發明說明（丨） 技術領域 本發明係關於一種育毛料。再者，本發明係關於一種 配合於育毛料之細胞賦活劑及毛髮強度、彈性改善劑。 背景技術 被稱爲高齡社會、壓力社會之現代社會中發生了種種 脫毛之要因。故良好育毛料之開發被旺盛的進行著。 育毛料給予毛髮之效果有比如以下之例子。發毛誘導 效果（發毛促進效果、成長期誘導效果）、使毛髮變粗之效 果、毛髮成長期延長效果、5α-還原酶抑制效果、血液循環 促進效果、殺菌效果、頭皮屑防止效果、保濕效果、抗氧 化效果等。 雖然竭力的進行育毛料之開發，但先前之育毛料中對 於脫毛防止、發毛效果等之育毛作用並不夠。其原因係脫 毛的原因很多，且發毛之機制又很複雜。 先前之育毛料係僅對所謂「發毛」或「脫毛」之現象 加以檢討所開發者，探求其機制來開發之育毛料很少。 其中一大原因係由於對著重於機制之育毛效果能簡便 的進行檢定之育毛藥劑檢定方法還沒有充份確立。特別是 用以確認毛髮成長期延長效果等之育毛藥劑檢定方法之確 立很難，其結果爲先前很多之育毛料並不是著眼於成長期 延長效果，而是著眼於在毛周期之毛髮成長期對毛髮進行 誘導之生髮誘導效果所開發。 是以，本發明者等確立了於活體外(in vitro)進行之簡 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1281394

五、發明說明（x ) 便檢疋毛髮成長期延長效果之育毛藥劑檢定方法，並且使 用該育毛_檢定方法，龍了具有毛髮顧期延長效果 之成份。並且發現1 2亥成份具有賦予毛髮強度及彈力、賦 予毛髮膨鬆感之未意料到之效果，而完成了本發明。 本發明之目的如下述。 1·提供一種育毛料、育毛洗髮精，其具有毛髮成長期 延長效果，並可以賦予毛髮強度及彈力、賦予毛髮膨鬆感 〇 提供作配合於毛髮化粧料之細胞賦活劑、毛髮強度 、彈力改善劑。 發明之揭示 本發明如下。 (1) 一種育毛料，係含有N-甲基牛磺酸。 (2) —種育毛洗髮精，係含有N_甲基牛磺酸。 (3) —種細胞賦活劑，係以N-甲基牛磺酸爲有效成份 〇 (4) 一種毛髮強度、彈力改善劑，係以N_甲基牛磺酸 爲有效成份。 圖式之簡單說明 圖1係表示外毛根鞘細胞增殖度之圖。 圖2係表示毛髮之扭矩增加之圖。 -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1281394 五、發明說明（乃） 用以實施發明之最佳形態 以下詳述關於本發明之構成。 本發明所使用之N-甲基牛磺酸係以 hnch3ch2ch2so3h之分子式所表示之化合物，到目前爲 止其毛髮成長期延長效果、賦予毛髮強度及彈力之效果已 被確認，而未被用於育毛料之用途。 本發明中之「育毛料」係指以養毛爲目的之毛髮關連 製品。 本發明中之育毛料利用後述之育毛藥劑檢定方法，至 少可以確認其藉維持或促進毛囊上皮系細胞之分裂增殖活 性以維持或延長毛髮成長期之效果。 本發明之育毛洗髮精係於上述育毛料中以洗淨成份(界面 活性劑等）配合，以當成育毛毛髮洗淨料使用之較佳態樣。 又，細胞賦活劑、毛髮強度、彈力改善劑係配合於上 述育毛料之個別藥劑。 本發明之育毛料對因爲在毛根附近毛囊上皮系細胞之 增殖減緩而使成長期減短，致使休止期毛髮較成長期毛髮 之比例爲多所造成之脫毛症特別有效。 本發明之育毛料藉與其他具個別效能之育毛劑組合使 用，於脫毛症中，可提升總合性與相乘性的效果。 N-甲基牛磺酸在育毛料之配合量爲發揮本發明之效果 ’係對應於育毛料之具體形態被適宜決定。 其配合量對於育毛料全量通常爲0.00001〜20質量％， 較佳爲0.01〜10.0質量％。 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I,——-------AW--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1281394 五、發明說明（+ ) 未滿0.00001質量％之配合量下，基於毛囊纖維細胞 增殖活性作用及毛根鞘細胞增殖活性作用之毛髮成長期延 長效果不能充份發揮。 配合超過20質量％時，效果不會隨配合量增加而對應增 大。再者，對目的劑型之調製產生妨礙之傾向會變得顯著。 本發明之育毛料具有良好之基於毛囊纖維細胞增殖活性 作用及毛根鞘細胞增殖活性作用之毛髮成長期延長效果。 故，對因爲在毛根附近毛囊上皮系細胞之增殖減緩使 成長期減短，致使休止期毛髮較成長期毛髮之比例爲多所 造成之脫毛症特別有效。 又，藉將N-甲基牛磺酸與其他具個別效能之育毛成份 組合使用，可提升相乘性的育毛效果。 本發明中，確認毛髮成長期延長效果（毛周期中成長 期之維持或延長作用）之方法不特別限定。在活體外（in vitro)之特定方法或在活體內（in vivo)之特定方法皆可使用 ，但若考量其簡便性及有效性，以使用在活體外之特定方 法爲較佳。 以下將簡單說明關於在活體外特定毛髪成長期延長效 果之毛囊纖維上皮培養細胞增殖效果之方法。 , 該方法係藉使毛囊上皮系培養細胞於無血淸培養基中 接觸對象物質，以特定該細胞是否有增殖活性及其強弱之 方法。 係一種藉該特定方法，以評價於毛周期中使成長期延 長之效果之育毛藥劑檢定方法。 6 ---------f--------π---------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1281394 A7 ___B7___ 五、發明說明（匕/ ) 亦即，係一種活體外之育毛藥劑檢定方法，其著眼於 直接相關於毛髮伸長之毛囊上皮系細胞’並藉使用其培養 細胞以特定毛周期中成長期延長之效果。 該育毛藥劑檢定方法中係使對象物質接觸由動物(包含 人類)之毛囊上皮系細胞離析得到之培養細胞「毛囊上皮系 培養細胞」，並特定該培養細胞是否增殖及其強弱。 毛囊上皮系細胞特別指毛根附近之外毛根鞘細胞及母 質細胞等之細胞，內側之毛乳頭細胞是除外的。 毛周期之成長期爲毛髮伸長的時期(毛囊上皮系細胞進 行分裂並增殖之時期）。該時期一但趨緩，則成爲退化期與 休止期，毛髮成長就休止了。 即，能使毛周期中之成長期延長之物質可維持毛囊上 皮系細胞之分裂及增殖活性。藉此，防止毛髮演變至毛周 期中之退化期及休止期以防止脫毛。 亦即，本發明之育毛料具有促進或維持毛囊上皮系細 胞增殖的持續效果。 再者，也有其他活體外的育毛藥劑檢定方法，比如有 使對象物質對動物的毛乳頭細胞作用，以判定其增殖效果 之方法等。 . 於活體內，毛囊上皮系細胞之增殖效果之特定方法， 比如，有對裸大鼠投予對象物質，並對該裸大鼠體表發毛 部位之狀態進行特定，以檢定對象物質在毛周期之成長期 延長效果之方法等。 亦即，此育毛藥劑檢定方法係使用原則上爲無毛，但 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1·——·---------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1281394 A7 —-------B7_ 五、發明說明（U ) 具有在其體表上隨時間發毛部位會移動之特徵性發毛之裸 力鼠’藉由特定其發毛部位之範圍及發毛部位之移動速度 以檢定毛周期中成長期長度。 本發明之育毛料只要是可適用於頭皮頭髮之劑型則不 特別限定。比如可選擇液狀、乳液、軟膏等。 本發明之育毛料，比如可應用於生髮藥水(hair tcmic) 、髮膏、髮慕絲（登錄商標）、洗髮精、潤絲精、乳霜、乳 液、面膜等之製品。 育毛料之較佳製品形態爲育毛洗髮精或育毛潤絲精。 藉著每日使用配合有洗淨成份（比如界面活性劑）之育毛洗 髮精，育毛之效果易發揮，且，可賦予毛髮強度與彈力， 給予毛髮膨鬆感。 本發明之育毛料只要在不損害本發明效果之範圍內， 可與化粧品、準醫藥品、醫藥品之一般配合成份依須要來 配合。一般配合成份，比如有粉末成份、液體油脂、固體 油脂、蠟、碳氫化合物油、高級脂肪酸、高級醇、酯類油 、矽酮油、陰離子界面活性劑、陽離子界面活性劑、兩性 界面活性劑、非離子界面活性劑、保濕劑、水溶性高分子 、增稠劑、皮膜劑、紫外線吸收劑、金屬離子封鎖劑、低 級醇、多元醇、糖、胺基酸、有機胺類、高分子乳液、pH 調整劑、皮膚營養劑、維他命、抗氧化劑、抗氧化佐劑、 香料、水等。 具體而言，列舉可配合之成份如下。依照須要，可配 合下述成份之任意一種或至少兩種，對應於目的劑型以常 法製造。 8 尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --- -------------------訂---------^^^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1281394 五、發明說明（q) 無機粉末： 滑石、高嶺土、雲母、絹雲母(sericite)、白雲母、金 雲母、合成雲母、紅雲母、黑雲母、蛭石、碳酸鎂、碳酸 鈣、矽酸鋁、矽酸鋇、矽酸鈣、矽酸鎂、矽酸緦、鎢酸金 屬鹽、氧化鎂、二氧化矽、沸石、硫酸鋇、燒成硫酸鈣(燒 石膏）、磷酸鈣、氟磷灰石、羥基磷灰石、陶瓷粉末、金屬 肥皂(例如肉豆蔻酸鋅、棕櫚酸鈣、硬脂酸鋁）、氮化硼。 有機粉末： 聚醯胺樹脂粉末（尼龍粉末）、聚乙烯粉末、聚甲基丙 烯酸甲酯粉末、聚苯乙烯粉末、苯乙烯及丙烯酸之共聚合 物樹脂粉末、苯并鳥糞胺樹脂粉末、聚四氟乙烯粉末、纖 維素粉末。 無機顏料： 無機白色顏料(二氧化鈦、氧化鋅）、無機紅色系顧料{ 氧化鐵(鐵丹）、鈦酸鐵}、無機褐色系顏料(γ 一氧化鐵）、 無機黃色系顏料(黃氧化鐵、黃土）、無機黑色系顏料(萬氧 化鐵、低次氧化鈦）、無機紫色系顏料（芒果紫、鈷紫）、 ‘無機綠色系顏料（氧化鉻、氫氧化鉻、鈦酸鈷）、無機嫛色 系顏料(群青、深藍）、真珠顏料(氧化鈦被覆之雲母、氧化 鈦被覆之氧代氯化鉍、氧化鈦被覆之滑石、著色氧化鈦被 覆之雲母、氧代氯化鉍、魚鱗箔);金屬粉末顏料(鋁粉、铜 粉） 9 -------------------ιπ·-------I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） A7 1281394 五、發明說明（分） 有機顏料： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 紅色201號、紅色202號、紅色204號、紅色205號 、紅色220號、紅色226號、紅色228號、紅色405號、 橙色203號、橙色204號、黃色205號、黃色401號及藍 色404號等、紅色3號、紅色104號、紅色106號、紅色 227號、紅色230號、紅色401號、紅色505號、橙色205 號、黃色4號、黃色5號、黃色202號、黃色203號、綠 色3號、藍色1號、天然色素(葉綠素、β-胡蘿蔔素）。 液體油脂： 鍔梨油、山茶油、龜油、昆士蘭果油、玉米油、薄荷 油、橄欖油、菜籽油、卵黃油、芝麻油、杏仁油、小麥胚 芽油、山茶花油、篦麻子油、亞麻仁油、葵花油、綿實油 、蓴麻油、大豆油、落花生油、茶實油、榧油、米糠油、 中國桐油、日本桐油、荷荷巴油、胚芽油、三甘油。 固體油脂： 可可脂、椰子油、馬脂、硬化椰子油、棕櫚油、牛脂 、羊脂、硬化牛脂、棕櫚核油、豬脂、牛骨脂、木蠘核油 .、硬化油、牛蹄脂、木蠟、硬化篦麻油。 鱲類： 堂癒、小燭樹繼、綿廳、巴西掠欄纖、月桂子繼、蟲 虫魚餘臟、褐煤癒、糖嫩、含水羊毛脂、木棉繼、醋酸含 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公爱)一 1281394 A7 ---—____B7 五、發明說明（5 ) 水羊毛脂、液狀含水羊毛脂、甘蔗蠟、含水羊毛脂脂肪酸 異丙酯、月桂酸己酯、還原含水羊毛脂、喬喬巴蠘、硬質 含水羊毛脂、蟲膠蠘、POE含水羊毛脂醇醚、poe含水羊 毛脂醇乙酸、POE膽固醇醚、含水羊毛脂脂肪酸聚乙二醇 、POE加氫POE含水羊毛脂醇醚。 碳氫化物油： 液體石蠟、地蠟、角鯊烷、鯊肝油烷、石蠟、精製 地蠟、角鯊烯、凡士林、微晶性蠘。 高級脂肪酸： 月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、辣木子油酸、 油酸、十一烷烯酸、妥爾油脂肪酸、異硬脂酸、亞麻仁油 酸、亞油烯酸、二十烷五烯酸（EPA)、二十二烷六烯酸 (DHA) 〇 高級醇： 直鏈醇（月桂醇、鯨蠛醇、硬脂醇、木辣子醇、肉豆寇 醇、油烯醇、十六烷基硬脂醇）、支鏈醇(鯊肝醇、2-癸基 ,四癸醇、含水羊毛脂醇、膽固醇、植物甾醇、己基十二醇 、異硬脂醇、辛基十二醇）。 酯油： 肉豆蔻酸異丙酯、辛酸十六酯、肉豆蔻酸辛基十二酯 11 本紙張尺度適用中國國家標準（〇\JS)A4規格（210 X 297公釐） ---I---------------訂---------^^^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1281394 五、發明說明（) 、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、肉豆蔻酸肉 豆蔻酯、油烯酸癸酯、二甲基辛酸己基癸酯、乳酸十六酯 、乳酸肉豆蔻酯、醋酸含水羊毛酯、硬脂酸異十六酯、異 硬脂酸異十六酯、12-羥基硬脂酸膽固醇酯、二一 2-乙基 己酸乙二醇、二戊赤蘚醇脂肪酸酯、單異硬脂酸N-烷二 醇、二癸酸新戊二醇、蘋果酸二異硬脂醇、二一 2-庚基十 一酸甘油、三-2-乙基己酸三羥甲基丙烷、三異硬脂酸三 羥甲基丙烷、四一2-乙基己酸戊赤蘚醇、三一2—乙基己 酸甘油、三辛酸甘油、三異棕櫚酸甘油、三異硬脂酸三羥 甲基丙烷、十六基-2-乙基己酸酯、2-乙基己基棕櫚酸 酯、三異肉豆蔻酸甘油、三-2-庚基十一酸甘油酯、篦麻 子油脂肪酸甲酯、油烯酸油酯、乙醯甘油酯、棕櫚酸2-庚基十一酯、己二酸二異丁酯、N-月桂基一 L 一谷氨酸一 2—辛基十二烷基酯、己二酸二2-庚基十一酯、乙基月桂 酸酯、癸二酸二一 2-乙基己酯、肉豆蔻酸2-己基癸酯、 棕櫚酸2-己基癸酯、己二酸2-己基癸酯、癸二酸二異丙 酯、琥珀酸2-乙基己酯、檸檬酸三乙酯。 矽酮油： 鏈狀聚矽氧烷(二甲基聚矽氧烷、甲基苯基聚矽氧烷、 二苯基聚矽氧烷）、環狀聚矽氧烷（八甲基環四矽氧烷、十 甲基環戊矽氧烷、十二甲基環己矽氧烷）、形成有3維網狀 構造之矽酮樹脂、矽酮橡膠、各種變性聚矽氧烷(胺基變性 聚矽氧烷、聚醚變性聚矽氧烷、烷基變性聚矽氧烷、氟變 性聚矽氧烷）。 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1281394 _B7__ 五、發明說明（ti ) 陰離子界面活性劑： 脂肪酸肥皂（月桂酸鈉、棕櫚酸鈉）、高級烷基硫酸酯 鹽（月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鉀）、烷基醚硫酸酯鹽(POE 一月桂基硫酸三乙醇胺、POE-月桂基硫酸鈉）、N—醯基 肌氨酸（月桂基肌氨酸鈉）、高級脂肪酸醯胺磺酸鹽(N-肉 豆蔻醯基-N-甲基牛磺酸鈉、椰子油脂肪酸甲基牛磺醯 胺酸鈉、月桂基甲基牛磺醯胺酸鈉）、磷酸酯鹽(POE-油烯 基醚磷酸鈉、POE-硬脂基醚磷酸）、磺基琥珀酸鹽（二-2 -乙基己基磺基琥珀酸鈉、單月桂醯基單乙醇胺聚氧化乙 烯磺基琥珀酸鈉、月桂基聚丙二醇磺基琥珀酸鈉）、烷基苯 磺酸鹽(直鏈十二基苯磺酸鈉、直鏈十二基苯磺酸三乙醇胺 、直鏈十二基苯磺酸）、高級脂肪酸酯硫酸酯鹽(硬化椰子 油脂肪酸甘油硫酸鈉）、N-醯基谷氨酸鹽(N-月桂醯基谷 氨酸單鈉、N-硬脂醯基谷氨酸二鈉、N-肉豆蔻醯基-L -谷氨酸單鈉）、硫酸化油（礦化篦麻油）、POE-烷基醚羧 酸、POE-烷基烯丙基醚羧酸、α-烯烴磺酸鹽、高級脂肪 酸酯磺酸鹽、二級醇硫酸酯鹽、高級脂肪酸烷醯基醯胺硫 酸酯鹽、月桂醯基單乙醇醯胺琥珀酸鈉、Ν-棕櫚醯基天 門冬酸二三乙醇胺、酪蛋白鈉。 陽離子界面活性劑： 烷基三甲基銨鹽(氯化硬脂基三甲基銨、氯化月桂基三 甲基銨）、烷基吡啶鑰鹽(氯化十六基吡啶鑰）、氯化二硬脂 基二甲基銨二烷基二甲基銨鹽、氯化聚(Ν，Ν’ —二甲基一 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1281394 —^___Β7_____ 五、發明說明（丨少） 3,5〜甲撐呃啶鑰）、烷基四級銨鹽、烷基二甲基苄基銨鹽 、烷基異喹啉鎗鹽、二烷基嗎啉鎗鹽、ΡΟΕ-烷基胺、烷 基胺鹽、聚胺脂肪酸衍生物、戊醇脂肪酸衍生物、氯化苄 烷錢、氯化苄乙氧銨。 兩性界面活性劑： 咪唑啉系兩性界面活性劑(2 -十一基— Ν，Ν，Ν-（羥基 乙基竣基甲基）—2-味哩琳納、2 —挪子基—2 —味哩琳錄 氫氧化物-1-羧基乙氧基2鈉鹽）、甜菜鹼系界面活性劑 (2-十七基- Ν-羧基曱基-Ν-羥基乙基咪唑啉錄甜菜鹼 、月桂基二甲基胺基醋酸甜菜鹼、烷基甜菜鹼、醯胺基甜 菜鹼、磺基甜菜鹼）。 親油性非離子界面活性劑： 山梨糖醇酐脂肪酸酯類（山梨糖醇酐單油酸酯、山梨糖 醇酐單異硬脂酸酯、山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐 單棕櫚酸酯、山梨糖醇酐單硬脂酯、山梨糖醇酐倍半油酸 酯、山梨糖醇酐三油酸酯、五-2-乙基己酸二甘油山梨糖 醇酐、四-2-乙基己酸二甘油山梨糖醇酐）、甘油多甘油 脂肪酸類(單綿實油脂肪酸甘油、單麥角酸甘油、倍半油酸 甘油、單硬脂酸甘油、α，α'一油烯酸焦谷氨酸甘油、單硬 脂酸甘油蘋果酸）、丙二醇脂肪酸酯類(單硬脂酸丙二醇);硬 化篦麻油衍生物、甘油烷基醚。 14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-n i an n n 一 一 · ϋ n ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ I A7 1281394 ____B7___ 五、發明說明（〇 ) 親水性非離子界面活性劑： POE-山梨糖醇酐脂肪酸酯類(POE-山梨糖醇酐單油 酸酯、POE-山梨糖醇酐單硬脂酸酯、poe-山梨四油酸 酯）、POE-山梨糖醇脂肪酸酯類(POE-山梨糖醇單月桂 酸酯、POE -山梨糖醇單油酸酯、POE-山梨糖醇五油酸 酯、POE -山梨糖醇單硬脂酸酯）、POE 一甘油脂肪酸酯 類(POE-甘油單硬脂酸酯、POE-甘油單異硬脂酸酯、 POE-甘油三異硬脂酸酯等之POE-單油酸酯）、POE-脂 肪酸酯類(POE -二硬脂酸酯、POE-單二油酸酯、二硬脂 酸乙二醇）、POE—烷基醚類(POE-月桂醚、POE—油烯醚 、POE-硬脂醚、POE—辣木子油醚、POE—2—辛基十二 醚、POE—膽巢院醇醚、普盧蘭尼克(pluronic)類(如普盧蘭 尼克）、POE · POP—烷基醚類(POE · POP-鯨蠘醚、POE • P0P-2-癸基四癸醚、POE · POP-單丁醚、POE · POP 一加氫含水羊毛脂、POE · POP —甘油醚）、四POE ·四 POP-乙烯二胺縮合物類(二氧代丁內酯）、POE—篦麻油硬 化篦麻油衍生物(POE-篦麻油、POE-硬化篦麻油、POE -硬化篦麻油單異硬脂酸酯、POE-硬化篦麻油三異硬脂 酸酯、POE-硬化篦麻油單焦谷氨酸單異硬脂酸二酯、 POE-硬化箆麻油順丁烯二酸）、POE-蜜蠟•含水羊毛脂 衍生物(POE-山梨糖醇酐蜜鱲）、烷基醇醯胺(椰子油脂肪酸 二乙醇醯胺、月桂酸單乙醇醯胺、脂肪酸異丙醇醯胺）、POE 一丙二醇脂肪酸酯、POE-烷基胺、POE-脂肪酸醯胺、蔗 糖脂肪酸酯、烷基乙氧基二甲基胺氧化物、三油烯基磷酸。 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1·— ϋ ϋ ϋ n 一 -OJI ϋ I n ·ϋ ϋ n n I A7 1281394 五、發明说明（IV ) 保濕劑： 聚乙二醇、丙二醇、甘油、1，3— 丁二醇、木糖醇、山 梨糖醇、麥芽糖醇、軟骨素硫酸、透明質酸、黏液素硫酸 、卡洛寧酸、成形不全膠原、膽固醇基- 12-羥基硬脂酸 酯、乳酸鈉、膽汁酸鹽、dl-吡咯烷酮羧酸鹽、短鏈可溶 性膠原、二甘油(EO)PO加成物、十六夜薔薇萃取物、西洋 小紫羅藍草萃取物、木樨萃取物。 天然之水溶性高分子： 植物系高分子{阿拉伯膠、西黃耆膠、半乳聚糖、瓜爾 膠、甘露膠、刺梧桐膠、角叉菜膠、果膠、洋菜膠、溫梓 子(quince seed)(木瓜）、藻脂膠狀物(褐藻精）、澱粉(米、 玉米、馬鈴薯、小麥）、甘草酸}、微生物系高分子（（夾)氧 雜憩膠、葡聚糖、琥珀聚糖、黏稠性多糖(pullulan)、動物 系高分子(膠原蛋白、酪蛋白、淸蛋白、明膠）。 半合成之水溶性高分子： 澱粉系高分子（羧基甲基澱粉、甲基羥基丙基澱粉）、 纖維素系高分子（甲基纖維素、乙基纖維素、甲基羥基丙基 ,纖維素、羥基乙基纖維素、纖維素硫酸鈉、經基丙基纖維 素、羧基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉、結晶纖維素、 纖維素粉末）、褐藻酸系高分子（藻褐酸鈉、褐藻酸丙二醇 酯）。 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

n n n ϋ ϋ I n I ϋ n Βϋ H ϋ I A7 1281394 ____B7_— ----- 五、發明說明（\<) 合成之水溶性高分子·· ％ 乙燏基系高分子(聚乙烯醇、聚乙烯甲基聚乙比 咯烷酮、羧基乙烯基聚合物）、聚氧化乙烯系高分子（聚乙 二醇20,000、40,000、60,000之聚氧化乙儲聚氧化丙稀共 聚物）、丙烯酸系高分子（聚丙烯酸鈉、聚乙基丙烯酸酯、 聚丙烯醯胺）、聚乙烯亞胺、陽離子聚合物。 增稠劑： 阿拉伯樹膠、角叉菜膠、刺梧桐膠、西黃耆膠、角叉 藻膠、溫椁子（木瓜）、酪蛋白、葡聚糖、明膠、果酸鈉、 精胺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、CMC、羥基乙基纖 維素、羥基丙基纖維素、PVA、PVM、PVP、聚丙烯酸鈉 、羧基乙烯基聚合物、刺槐豆膠、瓜爾膠、羅望子膠、二 烷基二甲基銨硫酸纖維素、（夾）氧雜憩膠、矽酸鋁鎂、膨 潤土、針鈉鈣石、矽酸AlMg(beagum)、拉波耐特(laponite) 、無水砂酸。 紫外線吸收劑： 苯甲酸系紫外線吸收劑（對胺基苯甲酸（以下略稱爲 PABA)、PABA單甘油酯、N，N—二丙氧基paba乙酯、 N，N—二乙氧基PABA乙酯、N，N —二甲基PABA乙酯、 N，N—二甲基PABA 丁酯）、憩酸系紫外線吸收劑單孟 (homomenthyl)基-N-乙醯基憩酸酯）、水楊酸系紫外線吸 收劑(戊基水楊酸酯、孟基水楊酸酯、單孟基水楊酸醋1辛 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) -------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i-ϋ ·ϋ ϋ· n n 一 ον I ϋ I ϋ ϋ ϋ ϋ« ϋ— A7 1281394 __B7___ 五、發明說明（A ) 基水楊酸酯、苯基水楊酸酯、苄基水楊酸酯、對異丙醇苯 基水楊酸酯）、桂皮酸系紫外線吸收劑（辛基桂皮酸酯、乙 基一 4 一異丙基桂皮酸酯、甲基一 2,5-二異丙基桂皮酸酯 、乙基一 2,4 一二異丙基桂皮酸酯、甲基一 2,4 一二異丙基 桂皮酸酯、丙基-對甲氧基桂皮酸酯、異丙基-對甲氧基 桂皮酸酯、異戊基-對甲氧基桂皮酸酯、辛基-對甲氧基 桂皮酸酯(2-乙基己基-對甲氧基桂皮酸酯、2-乙氧基乙 基-對甲氧基桂皮酸酯、環己基-對甲氧基桂皮酸酯、乙 基一 α-氰基一 β-苯基桂皮酸酯、2-乙基己基一 α-氰基 一 β-苯基桂皮酸酯、甘油單一 2-乙基己醯基一二對甲氧 基桂皮酸酯）、二苯甲酮系紫外線吸收劑(2,4-二羥基二苯 甲酮、2,2’一二羥基一 4 —甲氧基二苯甲酮、2,2’一二羥基 —4,4’一二甲氧基二苯甲酮、2,2’，4,4’一四羥基二苯甲酮、 2 —經基一 4 一甲氧基一苯甲嗣、2 —經基一 4 —甲氧基一 4’ 一甲基二苯甲酮、2—羥基一 4一甲氧基二苯甲酮一5—磺酸 鹽、4一苯基二苯甲酮、2—乙基己基一 4’一苯基一二苯甲 酮一 2-羧酸酯、2-羥基—4一正辛氧基二苯甲酮、4—羥 基—3 —竣基二苯甲酮）、3 —(4’ —甲基苯亞甲基）一d，l—樟 腦、3 —苯亞甲基一 d，l—樟腦;2-苯基—5—甲基苯并腭、 2,2’一羥基一 5 -甲基苯基苯并三唑、2-（2’一羥基一 5’一 特辛基苯基)苯并三唑、2-（2,-羥基-5’-甲基苯基苯并 三口坐、二卞連氮（dibenzaladine)、二對甲氧苯基甲院、4一 甲氧基一 4’一特丁基苯甲醯基甲烷、5 —（3,3—二甲基一 2 — 降冰片亞甲基）一 3 —戊烷一 2-酮。 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 震------- —訂-------- A7 1281394 __B7____ 五、發明說明（\1 ) 金屬離子封鎖劑： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 一羥基乙烷一 U —二磷酸、1 —羥基乙烷一 U’ —二 磷酸四鈉鹽、依地酸二鈉、依地酸三鈉、依地酸四鈉、檸 檬酸鈉、多磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡萄糖酸、磷酸、檸檬酸 、抗壞血酸、琥珀酸、依地酸、乙撐二胺羥基乙基三醋酸 3鈉。 低級醇： 乙醇、丙醇、異丙醇、異丁醇、特丁醇。 多元醇： 2元醇（乙二醇、丙二醇、三甲二醇、1，2—丁二醇、 U — 丁二醇、四甲二醇、2,3 — 丁二醇、五甲二醇、2—丁 烯一1，4 一二醇、己二醇、.辛二醇）、3元醇（甘油、三羥甲 基丙烷）、4元醇（1，2,6-己烷三醇等之戊赤蘚醇）、5元醇( 木糖醇）、6元醇（山梨糖醇、甘露醇）、多元醇聚合物(二乙 二醇、二丙二醇、三乙二醇、聚丙二醇、四乙二醇、二甘 油、聚乙二醇、三甘油、四甘油、聚甘油）、2元之醇烷醚 類（乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚、乙二醇單丁醚、乙二醇 ，單苯醚、乙二醇單己醚、乙二醇單2—甲基己醚、乙二醇 異戊醚、乙二醇苄醚、乙二醇異丙醚、乙二醇二甲醚、乙 二醇二乙醚、乙二醇丁醚）、2元醇烷醚類(二乙二醇單基醚 、二乙二醇單乙醚、二乙二醇單丁醚、二乙二醇二甲醚、 二乙二醇二乙醚、二乙二醇丁醚、二乙二醇甲基乙醚、三 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1281394 五、發明說明) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 乙二醇單甲醚、三乙二醇單乙醚、丁二醇單甲醚、丁二醇 單乙醚、丁二醇單丁醚、丁二醇異丙醚、二丙二醇甲醚、 二丙二醇乙醚、二丙二醇丁醚）、2元醇醚酯（乙二醇單甲醚 乙酯、乙二醇單乙醚乙酯、乙二醇單丁醚乙酯、乙二醇單 苯醚乙酯、乙二醇二己二酯、乙二醇二丁二酯、二乙二醇 單乙醚乙酯、二乙二醇單丁醚乙酯、丙二醇單甲醚乙酯、 丙二醇單乙醚乙酯、丙二醇單丙醚乙酯、丙二醇單苯醚乙 酯）、甘油單烷醚（二甲苯醇、鯊油醇、鯊肝醇）、糖醇（山梨 糖醇、麥芽醇、麥芽三醇、甘露醇、蔗糖、赤蘚醇、葡萄 糖、果糖、澱粉分解糖、麥芽糖、木糖、澱粉分解還原醇) 、甘油酯、四氫糠醇、POE-四氫糠醇、POP—丁醚、POP • POE—丁醚、三聚氧丙烯甘油醚、POP—甘油醚、POP — 甘油醚磷酸、POP · POE-戊烷赤蘚醇醚、聚甘油。 單糖：

三碳糖(D-甘油醛、二羥基丙酮）、四碳糖(D-赤蘚糖 、D-赤蘚酮糖、D-蘇糖、赤蘚醇）、五碳糖(L一阿拉伯 糖、D-木糖、L一來蘇糖、D-阿拉伯糖、D-核糖、D-木酮糖、L 一木酮糖）、六碳糖(D-葡萄糖、塔羅糖、D-阿洛酮糖、D-半乳糖、D-果糖、L一半乳糖、L一甘露糖 、D-塔蓋糖）、七碳糖(庚醛糖、庚酮糖）、八碳糖(辛酮糖 等）、去氧糖(2 -去氧一 D—核糖、6 -去氧一 L 一半乳糖、6 一去氧一 L一甘露糖）、胺糖(D-葡萄糖胺、D-半乳糖胺 、唾液酸、胺醛酸、胞壁酸）、糖醛酸(D-葡萄糖醛酸、D 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1281394 _JB7 五、發明說明（) 一甘露糖醛酸、L一古洛糖醛酸、D-半乳糖醛酸、L一艾 杜糖醛酸）。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 寡糖： 蔗糖、傘形酮、乳糖、車前糖、異木質糖類、α，α -特里哈糖、棉子糖、木質糖類、昂埤利新糖(umbilidne)、 水蘇糖、毛蕊花糖。 多糖： 纖維素、溫梓子、軟骨硫酸、澱粉、半乳聚糖、硫酸 皮膚素、糖原、阿拉伯樹膠、硫酸乙醯肝素、透明質酸、 西黃耆膠、硫酸角質素、軟骨素、（夾）氧雜憩膠、硫酸黏 液素、瓜爾地膠、葡聚糖、角質硫酸、刺槐豆膠、丁二基 聚糖、卡洛寧酸。 胺基酸： 中性胺基酸（異白胺酸、半胱胺酸）、鹼性胺基酸（羥 基離胺酸）。 胺基酸衍生物： 醯基肌氨酸鈉（月桂基肌氨酸鈉）、醯基谷氨酸鹽、醯 基β-丙胺酸鈉、谷胱胺肽、吡咯烷酮碳酸。 有機胺： 單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、嗎啉、三異丙醇胺 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1281394 五、發明說明（户Ο 、2—胺基一 2 -甲基一 1，3 —丙二醇、2—胺基一 2—甲基一 1 一丙醇。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 高分子乳液： 丙烯酸樹脂乳液、聚丙烯酸乙酯乳液、丙烯酸樹脂液 、聚丙烯烷基酯乳劑、聚醋酸乙烯樹脂乳劑、天然橡膠乳 膠(latex) 〇 pH調整劑： 乳酸-乳酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、琥珀酸-琥珀酸 鈉等之緩衝劑。 維生素： 維生素A、Bl、B2、B6、C、E及其衍生物、泛酸及 其衍生物、生物素等。 抗氧化劑： 生育酚類、二丁基羥基甲苯、丁基羥苯甲醚、沒食子 酸酯類。 抗氧化輔助劑： 磷酸、檸檬酸、抗壞血酸、順丁烯二酸、丙二酸、琥 珀酸、甲酸、腦磷脂、六偏磷酸、植酸、乙烯二胺四醋酸。 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

1281394 五、發明說明（A) 其他可搭配之成份： 防腐劑（對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丁酯）、消 炎劑(甘草酸衍生物、次甘草酸衍生物、水楊酸衍生物、曰 扁柏醇、氧化鋅、木香素）、美白劑（胎盤萃取物、虎耳草 萃取物、熊果苷）、各種萃取物（黃皮、黃連、紫根、芍藥 、當藥、銀杏、聖紫、枇杷、薑、蘆薈、錢葵、鳶尾、葡 萄、意以仁、絲瓜、百合、番紅花、川芎、生薑、弟切草 、洋蔥、大蒜、辣椒、陳皮、當歸、海藻）、賦活劑（蜂王 乳、感光素、膽固醇衍生物）、血液循環促進劑（壬酸香草 基醯胺、菸鹼酸苯甲酸酯、菸鹼酸β一丁氧基乙酯、辣椒素 、薑油酮、莞青素、魚石脂、單寧酸、α —龍腦醇、菸鹼 酸生育酚'肌醇六菸鹼酸、環扁桃酯、桂皮離胺酸、咔唑 啉、乙醯膽鹼、戊脈安(verapamil)、頂花防己鹼、γ-谷維 醇）、抗皮脂溢劑(硫黃、二甲基噻憩）、抗發炎劑(凝血酸、 硫基牛磺酸、次牛磺酸）。 實施例 以下將以實施例進一步對本發明具體說明。本發明不 限定於以下之實施例。以下之實施例中以「％」所表示內 容量者只要不特別指明則意指質量％。 「實施例1」 對Ν-甲基牛磺酸之毛髮成長期延長作用進行評價。首 先說明關於活體外細胞增殖試驗。 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-------- A7 1281394 ___B7_ 五、發明說明（yr) <使用毛囊上皮系培養細胞之細胞增殖試驗〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A.人類毛囊上皮系細胞 1.人類毛囊上皮系細胞之採取 由外科手術副產物得到之人類男性頭皮，於實體顯微 鏡下機械性的採取處於毛周期中成長期之毛囊。將該成長 期之毛囊以含有1000U/ml迪斯佩斯（dispase) ·膠原酶 0.2%之道魯貝克(Dulbecco)之改變MEM(DMEM)於37°C下 處理30分鐘，並以注射針之尖端除去真皮鞘或真皮乳頭、 毛球部上皮組織，再以含有胰蛋白酶0.05% ·乙二胺四乙 酸二鈉0.02%之磷酸緩衝液[PBS(-):㈠意指不含鈣離子或鎂 離子]於37°C下處理5分鐘。 接著，將毛囊靜置於以膠原（第I型)覆膜之培養基中 ，進行外殖片培養。 再者，此時之培養基係採用無血淸培養基[角質細胞 生長培養基(Keratinocyte Growth Medium，KGM)]，亦可使 用角質細胞無血淸培養基（Keratinocyte Serum Free Medium) 〇 培養4〜5日後，於可確認毛囊附著於培養皿及細胞增 殖之時點進行培養基之更換，以後每兩日進行培養基之更 換。 將此種方式增殖之細胞以胰蛋白酶0.05wt%-乙二胺四 乙酸二鈉〇·〇2%於37°C下處理5分鐘後，以等量之胰蛋白 酶抑制劑0.1%使反應中止，施以離心處理(80〇xg、5分鐘) 來進行細胞之回收。 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1281394 五、發明說明（八） 接著，使細胞懸浮於上述無血淸培養基，以密度5000 細胞/cm2接種於以膠原(第I型)覆膜之培養基，隔2日進 行培養基更換直到細胞融合。再次以胰蛋白酶〇.〇5wt%-乙 二胺四乙酸二鈉0.02%於37°C下處理5分鐘後，以等量之 胰蛋白酶抑制劑0.1%使反應中止，施以離心處理（800Xg 、5分鐘），並於依此得到之人類毛囊上皮系細胞中添加細 胞凍結液(賽耳邦卡:代亞托隆製），並調整至濃度爲l.OxlO6 細胞/ml，於各凍結管中逐一加入Ι.ΟχΙΟ6個細胞，將其凍 結保存。又，該等細胞數係以血球計數板算出。 2.對象物質之分析

對上述過程所得到毛囊上皮系細胞之纖維芽細胞混入 率(FB混入率）進行測定(3000倍、5視野），並將結果FB 混入率爲3%以上者由分析之對象中除外。 並且，將該毛囊上皮系細胞接種於培養瓶後，以胰蛋 白酶0.05wt%及乙二胺四乙酸二鈉0·〇2%於37°C下處理5 分鐘後，以等量之胰蛋白酶抑制劑〇_1%使反應中止，將系 統以1500rpm離心5分鐘，除去上澄部，對殘渣中添加 KGM培養液20ml，以調製細胞懸濁液。 以0.2ml/井之比例，接種於96井淺盤(第I型膠原覆 膜淺盤:法爾康社製)（l.OxlO4個細胞/孔），於室溫下放置約 2〇分鐘直到細胞沉到井之底部。之後於37°C、5%二氧化 碳下進行1日培養，以得到所欲之人類毛囊上皮系細胞。 25 冢紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮1 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

n I n n n 一 -OJa ϋ ϋ n ·ϋ ϋ ϋ I A7 1281394 五、發明說明（7穴） B.大鼠毛囊h皮系細胞 1.大鼠毛囊上皮系細胞之採取 (1)毛囊之採取 對大鼠新生兒(3〜4日齡)進行背部皮膚之採取，將所採 得之背部皮膚2片逐一浸泡於含1%PSF之PBS(-)。之後， 以解剖用剪刀除去皮膚脂肪層以下之皮下脂肪或皮膜等。 接著，再將該背部皮膚浸泡於含1%PSF之PBS(-)，再於含 0.25%胰蛋白酶之PBS㈠(含乙二胺四乙酸二鈉0.02%，以 下同）中於4°C浸泡一晚。 於胰蛋白酶溶液中浸泡後，將背部皮膚之真皮層及表 皮層以小鉗子剝開，將真皮層移至含有〇·35%膠原酶之哈 姆氏（Ham’s)F12培養基[組成(mg/ml):l_丙氨酸（8.9)、1-精 氨酸(氯化氫:211)、1-天冬醯胺（13.2)、1-天冬氨酸（13.3)、 1-半胱氨酸（氯化氫：31.5)、1-谷氨酸（14.7)、1-谷氨醯胺 (146)、甘氨酸（7.5)、1-組氨酸（氯化氫·_19)、1-異白氨酸 (3.9)、1-白氨酸（13.1)、1-離氨酸（氯化氫：36·5) ' 1-甲硫氨 酸(4.5)、1-苯丙氨酸（5.0)、脯氨酸（34.5)、1·絲氨酸（1〇.5) 、1-蘇氨酸（11.9)、1-色氨酸(2.0)、1-酪氨酸（5.4)、1-纈氨 酸（11.7)、生物素（0.0073)、膽鹼（氯：14·0)、維生素 Β12(1·36)、葉酸（1.32)、肌醇（18.0)、菸鹼醯胺(0.037)、泛 酸(鈣:0.477)、維生素Β6(氯化氫:0.062)、維生素Β2(〇.〇38) 、維生素Bl(氯化氫:0.337)、氯化鈣(2Η2Ο:44·0)、5水合硫 酸銅(0.0025)、7水合硫酸鐵(0.834)、氯化鉀(224.0)、氯化 鎂（6Η2〇:122)，”Proc· Natl. Acad. Sci. USA、53、 26 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

immmm n n ϋ n 一 一口、a ϋ 1^1 I ϋ ϋ· I 本紙張f度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐i ' A7 1281394 _ B7_ 五、發明說明（/) 288(1965)”，以下同]之100mm培養皿，並以剪刀裁斷。將 含有此裁斷物之培養基於37°C進行35分鐘之含浸(60rpm)。 含浸後，進行吸取直到該膠原酶反應物中看不見塊狀 物爲止，再將其移入50ml之離心管，添加含有去氧核糖核 酸酶（10000單位)之哈姆氏F12培養基，並放置5分鐘。 放置後，再將所得懸濁液吸取後’以尼龍篩網(Nytex 157mesh)過濾之，並移至50ml之離心管。將懸濁液分成兩 份，分別以PBS㈠稀釋懸濁液使容量成爲30ml ’接著將已 稀釋之懸濁液以離心(4°C、400rpm、5分鐘)處理。離心後 將上澄液除去並將脂肪由系統中去除。接著對殘渣添加 PB.S㈠25ml使懸濁後，再進行離心[(4t：、400rpm、5分鐘 )x3次]。由該離心所得到之殘渣即大鼠背部皮膚中之毛囊。 (2)毛囊上皮系細胞之採取 對由上述操作所得到之毛囊中添加含有0.25%胰蛋白 酶之PBS(-)5ml，並將細胞懸濁液於37°C下培養5分鐘。 培養終了後，添加5ml之等量胎牛血淸(FBS)及哈姆氏 F12培養基，將細胞懸濁液以細胞過濾器（ΙΟΟμηι ，納基社 製)過濾後，放入50ml離心管，將該細胞懸濁液以離心處 理(4°C、1500rpm、5 分鐘）。 自系統中除去上澄液，得到之殘渣即爲所欲之毛囊上 皮細胞。 於該毛囊上皮細胞中添加細胞凍結液（賽耳邦卡:代亞 托隆製），並調整至濃度爲1.5X107個細胞/ml，於各凍結管 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — — — — — — — — — A7 1281394 ---------- -B7____ 五、發明說明（>/W ) 中各加入1·5χ107個細胞，並以凍結保存。又，該等細胞 數係以血球計數計算出。 2·毛囊細胞之前培養 爲將可能混入系統之纖維芽細胞從系統中儘可能除去 ’乃將上述過程所得到之毛囊上皮系細胞進行前培養。 以下說明其步驟。 於37°C之恆溫槽，將上述過程得到之凍結細胞融解。 接著添加FAD培養液10ml [於哈姆氏F12培養液(後述)與 MEN培養液之容量比爲3:1之混合物中，含有胰島素 (5.(^g/ml)、氫皮質酮（0.45pg/ml)、表皮生長因子 (epidermal growth factor, EGF)(l〇.〇ng/ml)、霍亂毒素（10-9M)及胎牛血淸（10%)之培養液，以下同]，將細胞溶液稀釋 並對系統施以離心處理（l〇°C以下、1500rpm、5分）。離心 後，除去上澄液，於系統中加入FAD培養液10ml，反覆 吸取直到看不見細胞塊爲止。 所得到之細胞數以血球計數板算出，並以FAD培養液 將濃度調整爲2.5xl05細胞/ml。將細胞接種於已覆有I型 膠原酶之75cm3之培養瓶中，並將其以37°C、5%二氧化碳 下培養一晚。 培養後，將系統以PBS(-)l〇ml洗淨兩次，再添加含有 〇·25%胰蛋白酶之PBS㈠2ml，將其於37°C、5%二氧化碳 下培養4分鐘。接著，於系統中添加胎牛血淸(FBS)2ml， 輕輕的搖動一次後將上澄液除去，將混入系統之纖維芽細 胞除去。 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

n ·ϋ n n n 1—^OJ· ϋ I n n I ϋ n I 秦 1281394 A7 _B7 _—_ 五、發明說明（>1 ) ϊ 接著，於系統中添加KGM培養液15ml[係於表皮角化 細胞基礎培養液(Keratinocyto growth medium):Keratinocyto basal medium]{KBM培養液(改變MCDB153培養液:庫羅尼 弟克思社製）}中，添加牛腦下垂體萃取液 (ΒΡΕ)(0·4νο1%)、胰島素(0·5μηι/ιη1)、氫皮質酮(〇_ 5μηι/ηι1) 、h-EGF(0.1ng/ml)以下同]，以37°C、5%二氧化碳下培養 三日。 3.對象物質之分析 測定上述過程所得到之植入有毛囊上皮系細胞之培養 瓶中的纖維芽細胞之混入率(FB混入率）（3000倍、5視野) ，並將結果FB混入率爲3%以上者由分析之對象中除去。 將系統以PBS㈠10ml洗淨兩次，添加含有0.25%胰蛋 白酶之PBS(-)2m卜以37°C培養3分鐘。 接著，爲利用上皮系細胞與纖維芽細胞對於胰蛋白酶 反應性不同之特性而從纖維中除去纖維芽細胞，乃將胰蛋 白酶除去，再次添加含有〇·25%胰蛋白酶之PBS㈠2ml，以 37°C、20rpm振盪5分鐘。 接著，以顯微鏡確認細胞剝落物後，添加含有 ,10%FBS之DMEM培養液10m卜於50ml離心管內進行吸 取，將系統以1500rpm離心5分鐘。 除去上澄液，添加KGM培養液20ml，進行吸取直到 細胞塊消失爲止。 將懸濁液以細胞過濾器(strainer) (ΙΟΟμπι，納基社製) 29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — — — — — — — — A7 1281394 ______B7____ 五、發明說明（>S) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 過濾後，放入50ml離心管，以血球計數板算出懸濁液中之 活細胞數，再於系統中添加KGM培養液，以調整細胞濃 度使爲5.〇xl〇4細胞/ml。 接著，以0.2ml/井之比例，接種於96井淺盤(第Ϊ型 膠原覆膜淺盤:法爾康社製)（l.OxlO4細胞/井），於室溫下放 置20分鐘直到細胞沉到井之底部。 之後，於37。(：、5%二氧化碳下進行1日培養，以得 到所欲之大鼠毛囊上皮系培養細胞。 C.試驗培養某之調製 (1) 添加對象物質培養液之調製 稱取N-甲基牛磺酸約1.5mg，以KBM培養液調製使 成爲1%濃度之溶液，並以0.45μιη過濾器過濾滅囷。 接著，於ΚΒΜ培養液中，添加10000倍量之上述溶 液[對象物質:l.〇xl(T5%]。 (2) 控制組培養液之調製 以KBM培養液作爲負控制組。 正控制組之培養液，係使用於負控制組之KBM培養 液中添加有細胞增殖因子之胰島素（5mg/ml)2pl、氫皮質酮 (0.5mg/ml) 2μ1所成之培養液。 I對象物質培養液之更梅 將上述Α、Β中調製人類毛囊上皮系培養細胞與大鼠 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1281394 五、發明說明（>f ) 毛囊上皮系培養細胞之96井淺盤中之KGM培養液，與添 加對象物質之培養液及控制組培養液(200μ1/井)交換，交換 後以37°C、5%二氧化碳培養2曰。 培養液之交換如下。在不傷害附著於底面之細胞下， 很小心的將井內之KGM培養液以抽吸器(aspirtor)抽出， 再迅速的將已添加對象物質之培養液等由井之兩端加入。 E.細胞增殖之測定 將阿拉瑪藍(alamar blue:法拉馬生物科學社製）以對培 養液之量(容量)爲1/10之量加入，於37°C(5%二氧化碳)下 培養6小時。 培養後，以微淺盤讀取器(Micro plate reader:拜爾瑞 得社製)測定系統於595nm及570nm之吸光度，再依以下 之算式算出細胞增殖度。 (對象試料之細胞增殖度)=(對象試料之阿拉瑪藍還原 率)/(負控制組之阿拉瑪藍還原率)xl00(%) 再以下述計算式判定N-甲基牛磺酸對毛囊上皮系細胞 之增殖促進作用。 (對象試料之細胞增殖促進指標)=((對象試料之細胞增 殖度Η負控制組之阿拉瑪藍還原率))/((正控制組之阿拉 瑪藍還原率Η負控制組之阿拉瑪藍還原率 「結果」 所判定之Ν-甲基牛磺酸之上述細胞增殖促進作用，在 來自人類之毛囊上皮系培養細胞爲〇·64，在來自大鼠之毛 31 本紙張尺度適i中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

emKm n n ϋ n 一-OJI n I ϋ ϋ ϋ n n I A7 1281394 五、發明說明（浐） 囊上皮系培養細胞爲0.62。 負控制組爲0，正控制組爲1。 依此結果，可以對N-甲基牛磺酸對毛囊上皮系培養細 胞之良好增殖活性明白的判明。亦即，可以明白的斷定N_ 甲基牛磺酸具有毛髮成長期延長活性。 「實施例2」 對N-甲基牛磺酸之不死外毛根鞘細胞增殖作用進行評 價。首先，對不死外毛根鞘細胞增殖試驗作說明。 <不死外毛根鞘細胞增殖試驗> 「不死外毛根鞘細胞之培養」 於實體顯微鏡下將人類頭皮中之毛囊以剪刀離析出來 。將毛囊由皮脂腺下部切離，以膠原酶及迪斯佩斯進行酵 素處理。 將毛球部份以剪刀切離除去，將毛幹以小鉗子分離。 將毛幹以胰蛋白酶處理，再以胰蛋白酶抑制劑停止反應。 離心，除去上澄液，回收外毛根鞘細胞。 將回收之細胞以表皮角化細胞基礎培養液(KGM培養 液)接種於覆有膠原酶之培養瓶中，於二氧化碳培養箱中進 行培養。 病毒及導入基因 採用之病毒係腺病毒載體之ΛΕ1/Χ之E1A區以欠缺 複製開始點之SV40之大T抗原基因置換（Doren and 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

I I I I A7 1281394 __B7__ 五、發明說明（Μ )

Gluzman，1984;Mol· Cell. Biol. 4，1653-1656)者0 T抗原某因之導入 將培養至約50%細胞選殖體匯集之繼代弟1代之培養 外毛根鞘細胞以K-SFM洗淨後，以1，1〇或30ΜΟΙ(感染多 樣性，multiplicity of infection)之量添加上述病毒使其感染 〇 之後’與普通細胞一樣繼繪繼代培養’當達到普通細 胞之增殖停止之繼代數後，進行選殖。 選殖係將細胞再接種，使於直徑爲l〇cm左右之玻璃 器皿中達103〜104個，將增殖良好，且細胞形態與普通細 胞酶有不同者以分注器之尖端挑取，並移至24井淺盤培養 ，選擇在此時點增殖亦爲良好之細胞。 又，將被選擇之細胞株與普通細胞同樣繼續進行繼代 培養。 其結果，沒有以病毒感染之外毛根鞘細胞增殖至繼代 5代左右增殖就停止了。 而導入T抗原之毛乳頭細胞其選殖後增殖至繼代7代 時看起來增殖已停止，但若又繼續培養，可看出好像又再 度開始增殖。 因此被推測是可能在繼代7代之危機處產生了什麼變 異，而變成了不死細胞。選殖時，雖選出數個選殖體，但 得到超越危機期而能繼續增殖之細胞株選殖體爲一個。 細胞增殖評價 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I n n n n ϋ n 一〔OJβ ϋ ϋ n ·ϋ ·ϋ n 1 A7 1281394 ______ —__B7_ 五、發明說明（γ) 將外毛根鞘細胞以PBS㈠洗淨2次。以胰蛋白酶進行 酵素處理，使細胞分離。 以胰蛋白酶抑制劑使反應停止，離心後將上澄液除去 ’以回收外毛根鞘細胞。加入KGM培養液以調製細胞懸 浮液。 將細胞接種於覆有膠原之24孔培養淺盤，於二氧化碳 培養箱中培養。 隔曰，以添加有被測物質之培養液交換。培養4曰後 ，將細胞以PBS㈠洗淨，以胰蛋白酶將細胞分離。以此狀 態將細胞依每一淺盤冷凍之。 受檢物質之調製 將受檢物質N-甲基牛磺酸以表皮角化細胞基礎培養液 (KGM培養液)調製使成爲50mM，並進行過濾滅菌。將此 原液以KBM培養液稀釋，使受檢物質之濃度爲1〇ηΜ、 ΙμΜ、ΙΟΟμΜ、10mM。以僅有KBM培養液者作爲負控制 組。 細胞去氧核糖核酸(DNA)測定 細胞解凍後，於各孔中加入Hoechst33258，以超音波 將細胞破碎。將其移入比色杯中，於激發波長356nm、螢 光波長460nm下測定螢光強度。以負控制組之螢光強度爲 當作100，計算去氧核糖核酸之相對値以算出細胞增殖度。 圖1表示結果。由結果，可了解N-甲基牛磺酸具有不 死外毛根鞘細胞活性化作用。 34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

I H 1 n ϋ ϋ n^OJ· n ϋ n ϋ ϋ n I I A7 1281394 —__B7_ 五、發明說明（θ) 其次，對以毛髮成長期延長作用爲基礎之育毛效果進 行檢討。 [實施例3]液狀育毛料 將Ν-甲基牛磺酸0.8%、70%乙醇90%、油酸鈉0.05% 、十二烷基苯磺酸0.49%、硬化篦麻子油乙烯氧化物(40莫 耳)加成物0.5%及離子交換水(殘餘)混合攪拌之，並使其溶 解。 然後添加離子交換水（10%)混合之，以得到液狀之育毛 料。在該液狀育毛料之處方中，以除去Ν-甲基牛磺酸所調 整成之液狀劑作爲對照(比較例1)。 [實施例4]乳液狀育毛料 製作以下處方之乳液狀育毛料。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂----- 配合成分 配合量(質量％) (Α相） Ν-甲基牛磺酸 0.05 聚氧化乙烯(60莫耳)加成硬化篦麻子油 2.0 甘油 10.0 二丙二醇 10.0 1，3-丁二醇 5.0 聚乙二醇1500 5.0 (Β相） 鯨蠘基異辛酯 10.0 35 本紙張尺^適用中國國家標準（CNS)A4^T^10 X 297公« )" 配合量償量％) 5.0 1281394 A7 -----B7 五、發明說明（冰） 角鯊烷 5.0 凡士林 2.0 對羥基苯甲酸丙酯 2.0 (C相） 竣基乙烯聚合物1°/。水溶液 30.0 六偏磷酸蘇打 0,03 離子交換水 9.3 (D相） 離子交換水 4.5 (Ε相） 氫氧化鉀 0.12 離子交換水 5.0 〈製造法〉 將A相、B相分別於6(rcm熱溶解，混合並以均質混 合器處理作成膠體。將D相徐徐加入該膠體並以均質混合 器分散之。接著於其中加入已溶解之C相，最後再加入已 溶解之E相，用均質混合器乳化以調製油/水(0/w)乳液型 之育毛料。 [實施例5]乳霜狀育毛料 配合成分 (A相） 液體石蠛 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) t n ϋ 1 n ϋ n ^ 0 l^i ϋ ϋ ϋ ·ϋ 1« ϋ· 1281394 A7 _ -____ B7 發明說明 十八醇十六醇混合物 5.5 單硬脂酸甘油酯 3.0 ΕΟ(20莫耳)-2-辛基十二烷基醚 8.0 對羥基苯甲酸丙酯 0.3 香料 0.1 (B相） N-甲基牛磺酸 5.0 甘油 8.0 二丙二醇 20.0 聚乙二醇4000 5.0 十二烷基硫酸鈉 0.1 六偏磷酸蘇打 0.005 離子交換水 39.995 <製造法> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 參· 將A相、B相分別於60°c加熱溶解，混合，並以均質 混合器乳化，以得到乳霜狀之育毛料。 「育毛料之育毛作用之檢討」 爲調查上述得到之育毛料其防止掉毛、發毛效果等育 毛作用，用以下方法對人實施特立葛蘭（trichogram)之試驗 及實際使用測試。受測試料及對照試料爲實施例3〜5之本 發明之育毛料、7〇%乙醇、比較例1。 37 ΐ紙張尺度適用中關£^(CNS)A4;格⑵Q χ_〗97公爱5 1281394 A7 一_一 B7 五、發明說明（>ν) 試驗方法 將使用上述試料前後之拔去毛髮之毛根以顯微鏡觀察 ，由毛根之形態，計算成長已停止之毛髮之毛根「休止期 毛根」之數量，依其比例之增減來比較該等試料之育毛作 用。 亦即，將受測試料及對照試料分別於男性受測者10名 之頭皮上以1日2次、1次各2ml連續進行6個月之塗佈 ，於剛要塗佈前及6個月的塗佈剛結束後，將受測者每1 名各拔去1〇〇根毛髮’分別於顯微鏡下觀察毛根。試驗之 結果表示於「表1」。 表 1 試料 休止期毛根之比例 育毛效果之評價 (對象及育毛劑號碼) 20%以上減少(％) ±20%(%) 20%以上增加(％) 對象(70%乙醇） 10 50 40 無效 實施例3 50 40 10 有效 實施例4 40 40 20 有效 實施例5 60 30 10 有效 比較例1 20 40 40 無效 . 由結果，斷定本發明之育毛料有基於毛髮成長期延長 效果之育毛效果。 「實施例6」 毛髮強度、彈力改善劑」. 對由N-甲基牛磺酸所形成之毛髮之強度、彈力改善劑 38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂： A7 1281394 _ —_ B7 _ 五、發明說明“q) 之效果進行評價。首先說明試驗方法。 試驗試料 毛髮使用未經烫髮、染髮、漂白等化學性處理之19歲 女性之毛髮。毛髮先端約20cm以既定之洗髮液浸泡1小 時後’於流水中以1分鐘洗淨，並於通常環境下乾燥24小 時者作爲健常毛試料。上述健常毛以既定之漂白劑於室溫 下進行30分鐘之漂白處理，之後於流水中以1分鐘洗淨。 反覆進行4次漂白處理，洗淨後於通常環境下乾燥者作爲 漂白處理毛(BL處理）。 N-甲基牛磺酸處理 將1根毛髮於lmol/1之N-甲基牛磺酸水溶液20ml中浸 泡1晚，再於25°C · 50%RH環境下將試驗試料之毛髮乾燥。 扭矩之測定 使用卡特帖克社製之扭力試驗機KES-YN-1，於25t： • 50%RH環境下進行測定。 在進行N-甲基牛磺酸處理前進行測定，作爲控制組。 以扭轉角度土1080°、187秒之速度施予扭轉。 以扭轉角〜7200中，對扭轉角0之扭矩Tf增加 度B=tan(Tf/<9)作爲扭轉剛性B値，對以N-甲基牛磺酸水 溶液處理前後之B値之比進行評價。結果示於圖2。 由結果可知，經N-甲基牛磺酸處理之毛髮其扭矩增加 ，而對毛髮賦予了強度及彈力。 39 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

ϋ n I I I i n^-OJI ϋ n n 1· ϋ n n I

Claims (1)

1281394 B8 qS ή !ι C8 D8 ___ __L ,:.. … ---- 六、申請專利範圍 1·一種育毛料，係含有N-甲基牛磺酸做爲有效成份。 2. 如申請專利範圍第1項之育毛料，其中該N-甲基牛 磺酸’係做爲毛囊上皮系細胞賦活劑之有效成份。 3. —種育毛洗髮精，係含有N-甲基牛磺酸做爲有效成 份。 4·如申請專利範圍第3項之育毛洗髮精，其中該N-甲 基牛磺酸劑，係做爲毛囊上皮系細胞賦活劑之有效成份。 5·—種毛髮強度、彈力改善劑，係含有N-甲基牛磺酸 做爲有效成份。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，1T: 線丨一 1 度適$中國國家標準（CNS) A4規格(210 X 297公