TW213952B - - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消费合作社印製 213^ Γν,： A6 ________B6 五、發明説明（/ ) 許多複雜硪水化合物•在生物識別程序中扮演一個中心 角色[G. E. Edelman，Spektrum Wiss. 1984 (6)，62]， 例如细胞-細胞識別、細胞生長及細胞分化。其偽構成血 液群決定子[V. Ginsburg，Adv. Enzymol. 2_6_，Π 9 7 2)， 131]並形成與腫瘤有關聯之抗原[G. M. W. Cook，E. W. Stoddart * "真核生物細胞之表面碩水化合物"，大學出版 社，倫敦，1973 ]。於植物界中，其可施加調節功能，猶 如激素[P. Albersheiin'A. G. Darvill，Spektrum Wiss. 1985 (11)，86]，並形成外源凝集素之结合位置[T. W. Radeiacher » R. B. Parekh » R. A, Dwek ， Ann. Rev. 碡 B i ochem * 5JL * (1988)，785] ° 改質糖，例如脱氣與氟化糖，及天然糖類之表異構物， 係代表深入研究此等交互作用之重要工具。蛋白質-碳水 化合物交互作用之一般規則，傜正好如專一酵素-受質交 互作用一樣，與此有關的令人感與趣之中心一樣多。因此 ，例如，關於酵素活性中心之資訊，可經由酵素受質之連 缅改質而得。再者，明確地對於脱氣糖苷待別感與趣•因 為其偽發生於許多抗生素中[T. Reichstein，E. Weiss， Ad v . Carbohydr . Chem. LL * (1962) · 65] 〇 2-脱氧糖苷之專一化學合成，是極為困難的 > 因為在位 置2上取代基之引導作用不存在•而且無長的合成順序， 故通常獲得 cc//S 混合物[J. Thiem，W. Klaffke， Top-Curr. Chem. 154，（1990)，285 ]。此外* 在此等合成中 ，經常必須竭力進行保護基化學，且這將伴隨合成步驟數 -3 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *裝. •訂· •綠· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐) 2139Γ.2 A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（/) 目上之相應增加，及産率上之降低。 .近年來，酵素之製備性利用•己漸增地使用在糖化學上 。高立體-與位置選擇性*且同時避免進行保護基化學， 可確保在與化學合成比較時*其産率通常是良好的。 半乳糖基轉移海EC 2.4. 1.22，會以位置-及立體專一性 方式，使半乳糖殘基轉移至末端N -乙醛基葡萄糖胺單位， 於α -乳清蛋白存在時，亦會轉移至末端葡萄糖。並形成 /3-(1-4)糖苷鏈結。此轉移海之專一性允許在相對較廣範 圍下進行，以在受體基質上之變化觀之[L. J. Berl iner » Μ .E. Davis* K.E. Ebner · T. A . Beyer > J.E. Bell， Mol. Cell. Biochem. （1984) * 37 ]，且其已可在一 些情況中進行此範圍之製備性用途[S. L. Haynie，C. Η. Wong'G. Μ. Whitesides* J. 0 r g. C h e m . > 4Z.' (1 9 8 2 ) · 5 416 ： S . David > C . A u g e > Pure A p p 1 . Chem. ，(1987 )· 1501 ； J. Thiem，W. Treder · T. Wiemann， Dechema 生物技術會議，D. Behrens 编箸，Verlag Chemie，Wein-heim，第 2卷（1988)，18 9； J. Thiem，T. V i e m a η n > Angew. Chem. » 102 . (1990) ， 78] 〇 一種關於半乳糖基化糖蛋白積木之酵素合成方法，俗描 述於 Offenlegungsschrift 39 27 801中，且於其中，半 乳糖基轉移海亦允許糖天門冬醛胺之合成。 目前己發現半乳糖基轉移海，令人驚訝地，亦能夠轉移 2-脱氧-D-半乳糖殘基·並接受其以式II尿嘧啶核苷5’-二 璘酸-2-脫氣-D-半乳糖之形式•作為供體受質。 -4 - {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •訂· •终· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)曱4規格（210x297公釐)

A B 五、發明説明（) 因此，本發明傜關於合成式I化合物之方法

y 其中X為OH或HH-乙基，且Y為OH或 0 -NH-C-CH, COOH -&H-: NH, 天門冬II胺if基

其包括反應式I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 化合物

Y

III .訂. 其中取代基X為0H或-f丨H-Ac，且Y為0H或 -nh-c-ch2-ch-nh2

0 t〇OH 於半a糖基鞞移薛存在下進行，當取代基X為羥基時，此 反應傜於乳糖上，藉肋於輔薛乳清蛋白進行。 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） •線. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ____B6 五、發明説明（4) 本發明偽以其較佳具髏簧施例詳述於後文。本發明偽進 一步定義於申請專利範圍之内容中。 半乳糖基轉移酶EC 2.4.1.22，亦稱為乳糖合成_，可 接受式II尿嘧啶核苷5'-二磷酸-2-脱氧-D-半亂糖（UDP-2D G a 1 )作為供體受質，以將2 -脱氣半乳糖，以/3 (1 , 4 )糖苷 鏡结轉移至末端N-乙醒基《萄糖胺、天門冬胺薛基-N-乙 醒基葡萄糖胺或«萄糖殘基。 根據本發明之方法*可以所謂”一鍋程序（one-pot process)” 開始 。所 謂一鍋程序偽意謂所有涉及之受質 及所有 涉及之酵素，均一起放置在一個反慝混合物中。當然，亦 可連缠進行後文指定之反應。然而，當上述反應物保持為 完整混合物時，一鍋程序經証實較具經濟效益。 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 UDP-2D-GalUI)可有利地當場製自2-脱氧蕕萄糖6-磷酸 :2-脱氣葡萄糖6-磷酸偽被磷酸葡萄糖變化海EC 2.7,5. 1 ，異構化成2-脱氣《萄糖卜磷酸。於尿嘧啶核苷-5 二磷 酸葡萄糖焦磷酸化酶EC 2. 7. 7. 9存在下，將2-脱氧葡萄糖 卜磷酸與尿嘧啶核苷5 三磷酸（UTP)反應，而得尿嘧啶核 苷5 I-二磷酸-2-脱氣《萄糖。此焦磷酸與無機焦礤酸海EC 3.6. 1 . 1·之水解作用，會使經由尿嘧啶核苷-5 | -二磷酸葡 萄糖焦磔酸化海所催化之反應，改變成所需産物之方向上 。尿嘧啶核苷5二磋酸-2-脱氣葡萄糖，傜被尿嘧啶-5 ’-二磷酸半乳糖4-表異構海EC 5.1. 3.2表異構化成式II之 UDP-2D-Gal，其可進行轉移反應至N-乙醯基葡萄糖胺，或 於α-乳清蛋白存在下，轉移至葡萄糖。 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐) A6 B6 經 濟 部 中 央 標 準 局 員 工 消 費 合 作 杜 印 製 五、發明説明（) 於此反應中形成之尿嘧啶核苷5’-二磷酸（UDP)，較佳係 經由使用成ifij酶ec 2TT7T74〇i必,而磷酸化成u tp 〇 磷酸烯酵丙酮酸（PEP)偽作為磷酸供體使用。此UTP可再一 次進行此反慝*而形成其核苷酸-糖尿嘧啶核苷5’-二璘酸 2 -脱氧葡萄糖。由於輔因子DTP偽連續再生，故其僅需要 以催化置採用。 此反應順序較佳俗使用以改質磺水化合物為基礎之載鱧 進行，例如，使用绖固定在活化CH-®Sepharose 4B上之 酵素[親和性層析，原理與方法，Pharmacia ]。此固定化 作用使其能夠再使用此酵累於進一步反應混合物中。 三羥甲基胺基甲烷缓衝液（100 mM，pH 7.0-8.0，較佳 為PH 7.5)俗作為反應媒質使用。將混合物在28-35t下 ，較佳為30它下，培育5 - 10天，較佳為7天，接著於凝膠 離子交換劑（苯乙烯/二乙烯基苯共聚物，交聯度8% > 上，例如® Dowex 1X8 (對離子：C1-)，然後在多孔性、 親水性及完全不含電荷之聚丙烯醇胺凝膠上•例如©Bio-Gel P2， 藉層析單離此産物。 作為上述反應之起始物質使用之2-脱氧葡萄糖6 -璘酸， 係預先製自2-脱氣《萄糖。此反應係藉己糖激海EC 3.6. 1 . 1催化，且需要腺苷5〜三磷酸（ATP)，作為輔因子。所 形成之腺苷5 二璘酸（ADP)，傜以類似上述UTP之再生作 用，於丙酮酸擻海存在下，使用磷酸烯醇丙酮酸（PEP)進 行磷酸化。此己糖激海與丙_酸激海，較佳係被固定在醋 酸乙烯酯與二甲基乙烯脲之球狀、巨孔性珠粒聚合體上， -7 - {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· •訂· .線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） i 五、發明説明（{?) A6 B6 經 濟 部 中 央 標 準 局 負 工 消 費 合 作 社 印 製

此聚合匾已使用環氧乙烷基改質過，例如VA -環氣樹脂（ R i ede 卜de Haen ) 〇 除非另有述及，否則所有起始化合物，例如半乳糖基轉 移海或式III化合物，均可市購而得，或以多位不同作者 之論文為基礎，以化學合成而得[D.E. Cowley, L. Hough ，C . N . Peach，Carbohy dr · Res . L9.( 1971 ) 231 ; M· S p i -no 1 a » R . W . Jean 1 02 » J. Biol. Chem. 245 ( 1 970) 4158 ;H. K u η z · H· Wa 1 dma η n * Angew. Chem. 1 985 ) 885] 。若使用天門冬胺醛基-N-乙醯基葡萄糖胺，作為受體基 質*則此反應係按Offenlegungsschrift 39 27 801中所 4 述進行。 此反應之進展，傜藉薄層層析偵測。在移除核苷酸璘酸 後，藉離子交換層析，例如，在Dowex 1X8(對離子：C1-)上進行，及使用例如Bio_Gel P2進行凝膠層析，單離最 後産物而得30-40%産率。 進一步藉助於下述實例，說明本發明。 啻例 1)2-脱氧-D-昵喃葡糖基-6-磷酸（2)之合成 1.1)己糖激海（1)與丙酮酸激海（II)於VA-環氣樹脂上之固 定化作用。 供I用之固定化作用緩衝液：HEPES 300mH pH7.5 葡萄糖 25mM

ADP ΙΟπΜ (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· .訂· •綠. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210X297公釐）

供II用之固定化作用缓衝液：HEPES 300mM pH7.5

MgCU 30mM

ADP lOmM 藉通入氛氣中，從缓衝液中移除氣。將0.5克部份之Va-環氣樹脂，懸浮在此特定缓衝液中，然後小心施加真空， 以使流體充滿載體之孔隙。添加己糖激海（100〇 U)與丙_ 酸激海（1000 U)，並將混合物留在振盪器中2天。於過濾 及洗滌後，此固定化酵素立即可供使用。 活性産率：70-80% 1.2) 2-脱氧-D-哌喃葡糖基6-磷酸（2) 將2-脱氣葡萄糖（1.395毫克，2.4毫莫耳）、丙酮酸礎 酸烯醇酯（536毫克，2· 6毫莫耳 >、氛化鎂（95毫克，24 毫莫耳）、氮化鉀（300毫克，100毫莫耳）及腺苷三磷酸 (12毫克，20微莫耳），溶於40毫升脱氣水中，並將pH值 調整至7.5。添加已固定在V A-環氣樹脂上之己糖擻誨與丙 酮薛激誨，然後將混合物留在振盪器上。4天後，先質不 再能被薄層餍析測得。 TLC檢査：正-丙醇/乙醇/水 5:3:2

Ri(l) ： 0.65 Rf(2) ： 0.S3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於一支DEAE-激雒素管柱（3x30公分）上，藉層析單離 2，該管柱已預先使用30diM重碩酸納溶液進行平衡。在以 200毫升水洗滌後，於2毫升/分鐘流速下，使用重磺酸納 梯度掖（0-0.2 M)溶離，金部體積為2升。合併含有此産物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐) 2139i 五、發明説明（g 之溶離份（於约30mM KlUHCOs下· 2份溶離物 數次，以移除重磺酸銨。 産率：80% A6 B6 並凍乾 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2)2-乙醛胺基-2-脱氣-4-0-( 2-脱氣-/3 -D- 哌喃來蘇己糖 基）-D-哌喃葡糖之製備 培養緩衝液：tris l〇〇mM PH7 .5 MnCU 5mM MgCU 1 0 m Μ KC 1 3〇mM NaN3 « 0 . 02% 將2-脱氣葡萄糖6-磷酸（2 •60毫克.190微某耳）、 乙鞺基葡萄糖胺（6.71毫克，321微莫耳）. ，5微莫耳）、PEP( 44毫克，210微莫耳） 二磷酸（0.1毫克）及牛血清蛋白（BSA, 5 10毫升脱氣缓衝液中。連績添加下列酵素： ' UDPC( 2毫克 、葡萄糖1 ,6-笔：克），溶於 璘酸葡萄糖變位海 50U UDP-葡萄糖焦磷酸化海 ίου 無機焦磷酸誨 30U UDP-半乳糖4-表異構海 5U 半乳糖基轉移酶 1U 丙酮酸撖海 100U 並將混合物在30T：下培育7天 0 "10 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） (請先閱讀背面之：;i意事項再填寫本頁) •襄·

A B 五、發明説明（1) TLC檢査：正-丙醇/醋酸/水85:12:3

Rf ( N-乙醯基葡萄糖胺）：0.50 Rf ( 2-脱氣葡萄糖）：0.68 Rf ( 2 脫氣胺基乳糖> :0. 32 .此轉化作用，可藉Fiske-Subbarow方法之修正法，藉磔 酸測定進行定量[T.G· Cooper，"Biochemische /\「beits- roethoden" > Valter de Gruyter > Berlin 1981 » 533 '或 藉两酮薛之酵累測定[R. Czok’ W. Lamprecht，"Methoden der enzymatischen Ana lyse 1 H . U. Bergmeyer 编著，

Verlag Chemie，Veiriheim，1ί)74’ 第 2卷，第 2販，]4g]] « C， 按下述進行處理，使用陰離子交換劑（D 〇 w e >c U 8 , C 1 -形式> *及接著在B i 〇-Ge 1 P2上進行凝膠層析，以移除陰 離子性成仿。將含有産物之溶離份凍乾，則造成最後産物 ，為一種吸濃性白色物質，熔點為]36*C。其不可能獲得 令人滿意之兀素分析’因為其具有確疋之水含最。共沸 乾燥（溶於無水甲酵中，並使用無水苯澴縮數次）造成分 析级純物質。 産率：40% ( 19毫克） 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 {請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) .打· ,终， iH-NMR(250 MHZ, D2〇>:5=5.26(d, 1H, H-], α~式）， 2.18(m, 1H, H-2'e), 2.09 (s, 3H, NHAC), 1.76 ppmfni ,1 Η , H-2 ' a ) 〇 H - 1 (. /3 -式）與H - 1 '之is號估被H D 0 is號覆蓋：. 13C-NMR (63 !丨Hz, H2〇,内標準：二氧陸圜）： -11 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） ......... ... 21〔亦、' A6 B6 五、發明説明) 5=173.31 (NH-CO-CHs). 99.42 (C-l'), 93.93 (C-l,^· 式），89.59 (C-l, ct-式），77.87 (C-4, cc-式 K 77.44 (c-4, /3-式 >,74.65 (C-5，），73.79 (C-5, /3-式）， 71.48 (C-3, /3-式），69.17 (C-5, α-式），68.30 (03 α-式、，66.72 (C-3，）， 65.73 (C-4，l, 60.43 (C_6，）， 59.18 (C-6), 55.29 (C-2, /3-式），52.80 (C-2， a-式 ),32.54 (C-2，），21.25 (NHC〇-CH3，yS-式），20.97 ppm (N H C 0 - C H s，a -式）。 Ci4H2eH03〇 (367.35) FAB-MS ： M+l = 368 m Ms = 390 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) *^· •訂. .線. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐）

Claims (1)

1. 、‘' 公令 r 取 ———' « ί修玉本ϊΐθ叫曰 :L_ i補无 ' A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 專？I」审請茱第80108747雯 ROC Patent Appln. N〇.801CE7^7 修正之申請專利範圍中文本一挎#一 Amended Claims in Chinese 一三 π c 1 了 (民國82年3月丨p曰送呈）‘ * Marcn 1553 ) •—蓬合成式I化合物之方法 i Submitted on

   中X為0HISNH-AC，且Y為0H或 NH-C-C P p〇OH -CH:-C3-NH2 (天門冬薛胺藍基 I化合物 其S括反應式

   0-UOP 舆式111化合物

   經濟部中央標準局R工消费合作社印52 丨1! 其中取代基X為0H或-NH-Ac，且Y為0H或 -NH-^-Ca2-<p-NB^, 0 COOH 於半乳薄基轉移薛EC 2.4.1.22 存在下逭行，當取代基X為 差基蒔，此反應係於乳糖上，藉肋於輔转乳清蛋白進行s -13 - (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本1) __ ___ _ 本紙張尺度適用中8國家標準（CNS)甲4规格(210 X 297 )

   2. 根據申諸專利範圍第丨項之方法，其中化合物傜當 場製自2-脱氣葡萄糖6-碟酸，且其合成所需之丙酮酸激 海EC 2.7.1.40較佳傜以固定.化形式使用。 3. 根據申請毒利範圍第2項之方法·其中供2-脱氣葡萄糖 6-璘酸合成用之己糖激海EC 3.6.1.1，偽以固定化形式 使用。 .· » 4. 根栋申請專利範圍第2或3項之方法，其中供固定物用之 軾體·為已使用環氣乙烷基團改質過之醋酸乙烯酯與二 甲基乙烯脲之球狀、巨孔性珠粒聚合體。 5. 稂據申請專利範圍第1項之方法，其中^將所有涉及之 受質與所有涉及之酵素，一起放在一値反應混合物中。 6. 根據申請專利範圍第1.至3.項中任一項之方法，其中反應媒 質具有7-8之pH值。 7. 根據申謓專利範圍第1.至3.項中任一項之方法，其中反應溫 度為28-35 Ό。 8 .根據申請專利範圍第1.至3.項中任一項之方法，其中.反應係 持續5-10天。 ......................................................51..............................訂 (¾先閲讀背面之注意事項再滇寫本頁) 經濟部屮央it準局Η工消贽合作社印製 本纸張尺度適用中國Β家樣準（CNS)甲4規格（210x297公釐）