TW202539735A

TW202539735A - 一種包含特異性結合ｄｌｌ３和ｃｄ３的雙特異性抗體的醫藥組成物

Info

Publication number: TW202539735A
Application number: TW113149971A
Authority: TW
Inventors: 劉玥; 楊健健; 田晨敏
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2023-12-22
Filing date: 2024-12-20
Publication date: 2025-10-16

Abstract

本揭露涉及一種包含特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的醫藥組成物。具體而言，本揭露涉及一種醫藥組成物，包含特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體和緩衝劑。

Description

一種包含特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的醫藥組成物

本揭露屬於生物技術藥物製劑領域，具體涉及一種包含特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的醫藥組成物。

這裡的陳述僅提供與本揭露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。

小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)屬一種比較惡性的肺癌類型，占所有肺癌病例的10%-15%。小細胞肺癌的腫瘤生長速度快，容易轉移，5年生存率低於7%。小細胞肺癌的治療藥物比較局限，主要是化藥，如用鉑類/依託泊苷聯用化療。小細胞肺癌病人對化療初期響應良好，但極易產生耐藥和復發。近幾年的免疫治療，如PD-L1抗體和PD1抗體，對SCLC患者有一定的效果，但是有效率約為15%。目前仍然還沒有開發出特異性的靶向治療藥物。

DLL3是一種抑制Notch的配體，在正常狀態下，DLL3處於高爾基體上，在癌細胞中(如小細胞肺癌細胞)，DLL3會表達在細胞表面，DLL3以順式方式結合Notch，阻礙了細胞和細胞結合以及Notch在目標細胞的內吞，從而抑制了Notch信號通路，促進腫瘤細胞的生長。DLL3主要表達於神經或者神經內分泌腫瘤，包括小細胞肺癌、大細胞神經內分泌癌、胃腸道神經內分泌瘤、小細胞膀胱癌、多形性膠質細胞瘤、轉移性去勢性前列腺癌、黑色素瘤等，尤其是SCLC，超過80%的SCLC有DLL3的陽性表達，而正常肺癌組織及癌旁組織中不表達。這種表達的差異性使得DLL3成為治療SCLC的一種極具潛力的治療靶點。

CD3是一種表達於T細胞上的同種型或異型二聚體抗原。功能性CD3由四條不同鏈：ε、ζ、δ及γ中的兩者進行二聚體結合來形成。CD3二聚體排列包括γ/ε、δ/ε及ζ/ζ。CD3與T細胞受體複合物(TCR)結合且為T細胞活化所必需。因此，已提出使用活化T細胞的抗CD3抗體用於治療癌症。然而，抗CD3抗體的給藥可能會觸發T細胞活化和相關的細胞因子釋放，過度的細胞因子釋放導致重度細胞因子釋放綜合症(CRS)，其是抗CD3抗體在臨床用藥中的重要挑戰。

本揭露提供了一種特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的醫藥組成物及其用途。

在一個方面，本揭露提供一種醫藥組成物，包含特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體和緩衝劑。

在一個方面，本揭露提供一種醫藥組成物，包含特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體和緩衝劑，其中，

該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體包含一條具有式I所示結構的第一鏈和一條具有式II所示結構的第二鏈，

式I：[DLL3-VL]-[連接子1]-[CD3-VH]-[連接子2]-[Fc1]，

式II：[CD3-VL]-[連接子3]-[DLL3-VH]-[連接子2]-[Fc2]，

該DLL3-VH具有：包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的DLL3-HCDR1，包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的DLL3-HCDR2和包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的DLL3-HCDR3；和該DLL3-VL具有：包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列的DLL3-LCDR1，包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列的DLL3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的DLL3-LCDR3；和

該CD3-VH具有：包含SEQ ID NO：56的胺基酸序列的CD3-HCDR1，包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列的CD3-HCDR2，和包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列的CD3-HCDR3；和該CD3-VL具有：包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列的CD3-LCDR1，包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列的CD3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列的CD3-LCDR3；

其中，式I和式II所示的結構是從N端至C端排列的；該連接子1、連接子2和連接子3是相同或不同的肽連接子；該Fc1和該Fc2是能夠以杵臼技術相互締合的Fc區結構序列；

該緩衝劑為組胺酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑、枸櫞酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑或磷酸鹽緩衝劑。

在一些實施方式中，如前所述的緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑、組胺酸-醋酸組胺酸緩衝劑或枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽緩衝劑。

在一些實施方式中，如前任一項所述的該緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物的pH為4.5至6.0；較佳地，該醫藥組成物的pH為4.5至5.5；更佳地，該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH為約4.5。在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH為4.5。在一些實施方案中，該醫藥組成物的PH為約5.5。在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH為5.5。在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH為約5.0。在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH為5.0。

在一些實施方案中，該任一項所述的醫藥組成物的pH為4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0，或者為這些點值之間的任意範圍。當本揭露中提及點值時，應當理解該點值包含了誤差範圍。這種誤差範圍是由於實驗室環境、人員操作、儀器、方法學、測量誤差等因素所致。以pH為例，當測值為約5.0時，應當理解其包含了誤差範圍。作為一個示例，採用工業用pH計測量製劑時，“約5.0”表示5.0±0.2(即pH為4.8至5.2)。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至250mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至150mg/mL。在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為5mg/mL至150mg/mL。在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至120mg/mL。在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至100mg/mL。在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為5mg/mL至100mg/mL。在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為70mg/mL至70mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為70mg/mL至150mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為80mg/mL至120mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為90mg/mL至110mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至20mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至10mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為4mg/mL至6mg/mL。

在一些實施方案中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為約1mg/mL。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為約5mg/mL。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為5mg/mL。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為約70mg/mL。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為70mg/mL。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為約100mg/mL。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為100mg/mL。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為約150mg/mL。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為150mg/mL。

在一些實施方案中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、105mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL、200mg/mL、210mg/mL、220mg/mL、230mg/mL、240mg/mL或250mg/mL，或者為這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，該醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為約1mg/mL、約4mg/mL、約5mg/mL、約6mg/mL、約10mg/mL、約20mg/mL、約30mg/mL、約40mg/mL、約45mg/mL、約50mg/mL、約55mg/mL、約60mg/mL、約65mg/mL、約70mg/mL、約75mg/mL、約80mg/mL、約85mg/mL、約90mg/mL、約95mg/mL、約100mg/mL、約105mg/mL、約110mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL、約140mg/mL、約150mg/mL、約160mg/mL、約170mg/mL、約180mg/mL、約190mg/mL、約200mg/mL、約210mg/mL、約220mg/mL、約230mg/mL、約240mg/mL或約250mg/mL。

在一些實施方案中，如前一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含表面活性劑。在一些實施方案中，該表面活性劑是非離子表面活性劑。在一些實施方案中，該表面活性劑選自泊洛沙姆(例如P188)、聚山梨酯(例如聚山梨酯20、聚山梨酯80)、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖甙鈉、月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆蔻基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉豆蔻基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉豆蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯與丙烯二醇的共聚物等。

在一些實施方式中，如前該表面活性劑為聚山梨酯或泊洛沙姆。在一些實施方式中，該表面活性劑為聚山梨酯。在一些實施方式中，該表面活性劑為聚山梨酯80或泊洛沙姆188(P188)。在一些實施方式中，該表面活性劑為聚山梨酯80。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該聚山梨酯80的濃度為0.01mg/mL至1.0mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80的濃度為0.1mg/mL至1.0mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80的濃度為0.2mg/mL至0.6mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80的濃度為0.3mg/mL至0.5mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80的濃度為約0.1mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80的濃度為0.1mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80的濃度為約0.4mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80的濃度為0.4mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80的濃度為約1.0mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80的濃度為1.0mg/mL。在一些實施方案中，該聚山梨酯80濃度為0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1.0mg/mL，或者為這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，該聚山梨酯80濃度為約0.01mg/mL、約0.05mg/mL、約0.1mg/mL、約0.15mg/mL、約0.2mg/mL、約0.3mg/mL、約0.4mg/mL、約0.5mg/mL、約0.6mg/mL、約0.7mg/mL、約0.8mg/mL、約0.9mg/mL或約1.0mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該泊洛沙姆188的濃度為0.5mg/mL至5mg/mL。在一些實施方案中，該泊洛沙姆188的濃度為1mg/mL至3mg/mL。在一些實施方案中，該泊洛沙姆188的濃度為1.5mg/mL至2.5mg/mL。在一些實施方案中，該泊洛沙姆188的濃度為1.8mg/mL至2.2mg/mL。在一些實施方案中，該泊洛沙姆188的濃度為約2mg/mL。在一些實施方案中，該泊洛沙姆188的濃度為2mg/mL。在一些實施方案中，該泊洛沙姆188濃度為0.5mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2mg/mL、2.1mg/mL、2.2mg/mL、2.3mg/mL、2.4mg/mL、2.5mg/mL、2.6mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL或5.0mg/mL，或者為這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，該泊洛沙姆188濃度為約0.5mg/mL、約0.8mg/mL、約0.9mg/mL、約1mg/mL、約1.5mg/mL、約1.6mg/mL、約1.7mg/mL、約1.8mg/mL、約1.9mg/mL、約2mg/mL、約2.1mg/mL、約2.2mg/mL、約2.3mg/mL、約2.4mg/mL、約2.5mg/mL、約2.6mg/mL、約2.8mg/mL、約3mg/mL、約3.5mg/mL、約4mg/mL、約4.5mg/mL或約5.0mg/mL。

在一些實施方案中，如前任一項所述的醫藥組成物，其包含糖。在一些實施方案中，該糖選自常規組成物(CH₂O)_n及其衍生物，包括單糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、還原性糖、非還原性糖等等。該糖可選自蔗糖，海藻糖，葡萄糖，乳糖，果糖，麥芽糖，右旋糖苷，甘油，赤藻糖醇，丙三醇，阿拉伯糖醇，sylitol，山梨糖醇，甘露醇，密二糖，松三糖，蜜三糖，甘露三糖，水蘇糖，麥芽糖，乳果糖，麥芽酮糖，山梨醇，麥芽糖醇，乳糖醇，異-麥芽酮糖等。

在一些實施方式中，如前該糖為蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨糖醇。在一些實施方式中，該糖為蔗糖。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該糖的濃度為10mg/mL至120mg/mL。在一些實施方式中，該糖的濃度為30mg/mL至100mg/mL。在一些實施方式中，該糖的濃度為64mg/mL至96mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為68mg/mL至92mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為72mg/mL至88mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為約30mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為約80mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為約100mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度非限制性實施包括10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、37.5mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、64mg/mL、65mg/mL、68mg/mL、70mg/mL、72mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、88mg/mL、90mg/mL、92mg/mL、95mg/mL、96mg/mL、100mg/mL或120mg/mL，以及這些點值之間的任一範圍。在一些實施方案中，該糖的濃度為30mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為80mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為100mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度非限制性實施包括約10mg/mL、約20mg/mL、約30mg/mL、約35mg/mL、約37.5mg/mL、約40mg/mL、約45mg/mL、約50mg/mL、約55mg/mL、約60mg/mL、約64mg/mL、約65mg/mL、約68mg/mL、約70mg/mL、約72mg/mL、約75mg/mL、約80mg/mL、約85mg/mL、約88mg/mL、約90mg/mL、約92mg/mL、約95mg/mL、約96mg/mL、約100mg/mL或約120mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該蔗糖的濃度為10mg/mL至120mg/mL。在一些實施方式中，該蔗糖的濃度為30mg/mL至100mg/mL。在一些實施方式中，該蔗糖的濃度為64mg/mL至96mg/mL。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度為68mg/mL至92mg/mL。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度為72mg/mL至88mg/mL。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度為約30mg/mL。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度為約80mg/mL。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度為約100mg/mL。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度非限制性實施包括10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、37.5mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、64mg/mL、65mg/mL、68mg/mL、70mg/mL、72mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、88mg/mL、90mg/mL、92mg/mL、95mg/mL、96mg/mL、100mg/mL或120mg/mL，以及這些點值之間的任一範圍。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度為30mg/mL。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度為80mg/mL。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度為100mg/mL。在一些實施方案中，該蔗糖的濃度非限制性實施包括約10mg/mL、約20mg/mL、約30mg/mL、約35mg/mL、約37.5mg/mL、約40mg/mL、約45mg/mL、約50mg/mL、約55mg/mL、約60mg/mL、約64mg/mL、約65mg/mL、約68mg/mL、約70mg/mL、約72mg/mL、約75mg/mL、約80mg/mL、約85mg/mL、約88mg/mL、約90mg/mL、約92mg/mL、約95mg/mL、約96mg/mL、約100mg/mL或約120mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑的濃度為5mM至100mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為10mM至50mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為10mM至30mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為15mM至25mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為24mM至36mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為27mM至33mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為14mM至22mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為16mM至20mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為約30mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為約18mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、 21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、27mM、30mM、33mM、36mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM，以及這些點值之間的任一範圍。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為30mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為18mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約11mM、約12mM、約13mM、約14mM、約15mM、約16mM、約17mM、約18mM、約19mM、約20mM、約21mM、約22mM、約23mM、約24mM、約25mM、約27mM、約30mM、約33mM、約36mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM或約100mM。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為5mM至100mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為10mM至50mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為10mM至30mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為15mM至25mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為24mM至36mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為27mM至33mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為14mM至22mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為16mM至20mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為約30mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為約18mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、 25mM、27mM、30mM、33mM、36mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM，以及這些點值之間的任一範圍。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為30mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為18mM。在一些實施方案中，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的濃度為約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約11mM、約12mM、約13mM、約14mM、約15mM、約16mM、約17mM、約18mM、約19mM、約20mM、約21mM、約22mM、約23mM、約24mM、約25mM、約27mM、約30mM、約33mM、約36mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM或約100mM。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含輔料；較佳地，該輔料為二水合乙二胺四乙酸二鈉、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)、鹽酸精胺酸、甘胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、谷胺酸、天冬胺酸、氯化鈉或氯化鈣；更佳地，該輔料為二水合乙二胺四乙酸二鈉。本揭露中乙二胺四乙酸二鈉或二水合乙二胺四乙酸二鈉含二水，簡稱EDTA-2Na，CAS號為：6381-92-6。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為0.01mg/mL至1mg/mL；較佳地，輔料的濃度為0.01mg/mL至0.5mg/mL；更佳地，輔料的濃度為0.08mg/mL至0.12mg/mL。在一些實施方案中，該輔料的濃度為0.01mg/mL至0.2mg/mL。在一些實施方案中，該輔料的濃度為0.01mg/mL至0.12mg/mL。在一些實施方案中，該輔料的濃度為0.01mg/mL至0.1mg/mL。在一些實施方案中，該輔料的濃度為0.09mg/mL至0.11mg/mL。在一些實施方案中，該輔料的濃度為約0.01mg/mL。在一些實施方案中，該輔料的濃度為約0.1mg/mL。在一些實施方案中，該輔料的濃度為約1mg/mL。在一些實施方案中，該輔料的濃度為0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.11mg/mL、0.12mg/mL、0.13mg/mL、0.14mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL，以及這些點值之間的任一範圍。在一些實施方案中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為0.01mg/mL。在一些實施方案中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為0.1mg/mL。在一些實施方案中，如請任一項所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為1mg/mL。在一些實施方案中，該輔料的濃度為約0.01mg/mL、約0.03mg/mL、約0.05mg/mL、約0.08mg/mL、約0.09mg/mL、約0.1mg/mL、約0.11mg/mL、約0.12mg/mL、約0.13mg/mL、約0.14mg/mL、約0.15mg/mL、約0.2mg/mL、約0.3mg/mL、約0.4mg/mL、約0.5mg/mL、約0.6mg/mL、約0.7mg/mL、約0.8mg/mL、約0.9mg/mL或約1mg/mL。

在一些實施方案中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中該輔料為0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為0.01mg/mL至0.5mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為0.01mg/mL至0.2mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為0.01mg/mL至0.12mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為0.01mg/mL至0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為0.08mg/mL至0.12mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為0.09mg/mL至0.11mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為約0.01mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為約1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.11mg/mL、0.12mg/mL、0.13mg/mL、0.14mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL，以及這些點值之間的任一範圍。在一些實施方案中，該輔料為0.01mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該乙二胺四乙酸二鈉的濃度為約0.01mg/mL、約0.03mg/mL、約0.05mg/mL、約0.08mg/mL、約0.09mg/mL、約0.1mg/mL、約0.11mg/mL、約0.12mg/mL、約0.13mg/mL、約0.14mg/mL、約0.15mg/mL、約0.2mg/mL、約0.3mg/mL、約0.4mg/mL、約0.5mg/mL、約0.6mg/mL、約0.7mg/mL、約0.8mg/mL、約0.9mg/mL或約1mg/mL。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體中：

該DLL3-VH包含如SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，和該DLL3-VL包含如SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列；和

該CD3-VH包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列，和該CD3-VL包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。

該DLL3-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：33所示，和該DLL3-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：42所示；和

該CD3-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：62所示，和該CD3-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，其中該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體中該Fc1的胺基酸序列如SEQ ID NO：64所示；和該Fc2的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體中該Fc1的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示；和該Fc2的胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體中，該連接子1、連接子2和連接子3均為本領域已知的肽連接子，只要雙特異性抗體能夠展現出期望的抗原結合活性。例如，肽連接子可以是包含1-50或3-20個胺基酸殘基的柔性肽。在一些實施方案中，該肽連接子的長度為1-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，該連接子1具有如序列通式(GGGS)nGm所示的結構，其中n是1-5，較佳為1、2或3；m為1-10，較佳為4、5、6、7或8。在一些實施方案中，該連接子1的序列為GGGSGGGG(SEQ ID NO：68)。在一些實施方案中，該連接子2具有序列通式Gm所示的結構，其中m為1-10，較佳為1-5，更佳為1、2或3。在一些實施方案中，連接子2的序列為G(SEQ ID NO：69)。在一些實施方案中，該連接子3具有如序列通式(GGGGS)nGm所示的結構，其中n是1-5，較佳為1、2或3；m為1-10，較佳為4、5、6、7或8。在一些實施方案中，連接子3的序列為GGGGSGGGG(SEQ ID NO：70)。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體中該連接子1、連接子2和連接子3相同或不同，胺基酸序列各自獨立地選自SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體中該連接子1、連接子2和連接子3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70。

式I即鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示，和式II即鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：

(a)1mg/mL至250mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.01mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)10mg/mL至120mg/mL的糖，和

(d)5mM至100mM的緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至6.0。

(a)1mg/mL至250mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.01mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)10mg/mL至120mg/mL的糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)5mM至100mM的緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至6.0。

(a)1mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，和

(d)10mM至50mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑、組胺酸-酯酸組胺酸緩衝劑或枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.5至5.5。

(a)1mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至50mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑、組胺酸-醋酸組胺酸緩衝劑或枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.5至5.5。

(a)1mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或1mg/mL至3mg/mL泊洛沙姆 188，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，和

(d)10mM至50mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.5至5.5。

(a)1mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或1mg/mL至3mg/mL泊洛沙姆188，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至50mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.5至5.5。

(a)70mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.2mg/mL至0.6mg/mL的聚山梨酯80或1mg/mL至3mg/mL泊洛沙姆188，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，和

(d)10mM至30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.5至5.5。

(a)70mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.2mg/mL至0.6mg/mL的聚山梨酯80或1mg/mL至3mg/mL泊洛沙姆188，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至0.5mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.5至5.5。

(a)80mg/mL至120mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.3mg/mL至0.5mg/mL的聚山梨酯80或1.5mg/mL至2.5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，和

(d)15mM至25mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)80mg/mL至120mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.3mg/mL至0.5mg/mL的聚山梨酯80或1.5mg/mL至2.5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.08mg/mL至0.12mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)15mM至25mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)1mg/mL至250mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.01mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80，

(c)10mg/mL至120mg/mL的糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)5mM至100mM的緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至6.0。

(a)1mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(a)1mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，和

(a)70mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.2mg/mL至0.6mg/mL的聚山梨酯80，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至0.5mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(a)80mg/mL至120mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.3mg/mL至0.5mg/mL的聚山梨酯80，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.08mg/mL至0.12mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(a)1mg/mL至250mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)10mg/mL至120mg/mL的糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)5mM至100mM的緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至6.0。

(a)1mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)1mg/mL至3mg/mL泊洛沙姆188，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(a)70mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)1mg/mL至3mg/mL泊洛沙姆188，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至0.5mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(a)80mg/mL至120mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)1.5mg/mL至2.5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.08mg/mL至0.12mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(a)約100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，

(d)約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)約30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)約100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，

(d)約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)約30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為約5.0。

(a)100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)80mg/mL的蔗糖，

(d)0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)約100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，

(d)約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)約18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)80mg/mL的蔗糖，

(d)0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)約100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，

(d)約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)約18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為約5.0。

(a)100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)80mg/mL的蔗糖，

(d)0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為5.0。

在一些實施方式中，如前任一項該醫藥組成物，其包含如下組分：

(a)約100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，和

(d)約30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)80mg/mL的蔗糖，和

(d)30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)約100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，和

(d)約18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)80mg/mL的蔗糖，和

(d)18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)約100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，和

(d)約18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為約5.0。

(a)100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)80mg/mL的蔗糖，和

(d)18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為5.0。

(a)約100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約2mg/mL的泊洛沙姆188，

(c)約80mg/mL的蔗糖，

(d)約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)約18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為約5.5。

(a)100mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)2mg/mL的泊洛沙姆188，

(c)80mg/mL的蔗糖，

(d)0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為5.5。

(a)約70mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約2mg/mL的泊洛沙姆188，

(c)約80mg/mL的蔗糖，

(d)約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(a)70mg/mL的特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)2mg/mL的泊洛沙姆188，

(c)80mg/mL的蔗糖，

(d)0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為5.5。

(a)1mg/mL至20mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.01mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)10mg/mL至120mg/mL的糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)5mM至100mM的緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至6.0；

(a)1mg/mL至10mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至50mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑、組胺酸-醋酸組胺酸緩衝劑或枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至5.5。

(a)1mg/mL至10mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至50mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至5.5。

(a)4mg/mL至6mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.2mg/mL至0.6mg/mL的聚山梨酯80或1mg/mL至3mg/mL泊洛沙姆188，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至0.5mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至5.5。

(a)4mg/mL至6mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.3mg/mL至0.5mg/mL的聚山梨酯80，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.08mg/mL至0.12mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)15mM至25mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.8至5.2。

(a)約5mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，

(d)約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(a)5mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)80mg/mL的蔗糖，

(d)0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該醫藥組成物的pH為5.0。

所屬技術領域中具有通常知識者應當理解，當參考數值範圍、截止值或特定值使用時，“約”可以表示在1個或多於1個標準偏差之內。或者，“約”可以表示相差最高達20%的範圍(即±20%)。由於本文所用的許多數值是藉由實驗確定的，因此所屬技術領域中具有通常知識者應當理解，此類確定可以在不同實驗之間有差異並且通常在不同實驗之間有差異。由於這種內在差異，認為本文所用的值不應受到過度限制。因此，術語“約”用於涵蓋與指定值相差±20%或更小的變化、±10%或更小的變化、±5%或更小的變化、±1%或更小的變化、±0.5%或更小的變化、或者±0.1%或更小的變化。

在一個方面，本揭露提供一種製備凍乾製劑的方法，其中包括將如前任一項所述的醫藥組成物進行冷凍乾燥的步驟。

在一個方面，本揭露提供一種凍乾製劑，該製劑藉由如前所述的方法獲得的。

在一個方面，本揭露提供的如前任一項所述的醫藥組成物，其為皮下注射製劑、靜脈注射製劑、腹腔注射製劑或肌肉注射製劑。在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液，其為皮下注射製劑。

在一些實施方案中，如前任一項所述的醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液，其適用於皮下注射、靜脈注射、腹腔注射或肌肉注射。在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液，其適用於皮下注射。

在一些實施方案中，如前任一項所述的醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液，其用於製備皮下注射、靜脈注射、腹腔注射或肌肉注射的藥物。在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液，其用於製備皮下注射的藥物。

本揭露還提供用作藥物的如前任一項所述的醫藥組成物，或如前任一項所述的凍乾製劑，或如前任一項所述的注射製劑。在一些實施方案中，該藥物用於治療腫瘤或癌症。

本揭露還提供一種治療腫瘤或癌症的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如前任一項所述的醫藥組成物，或如前任一項所述的凍乾製劑，或如前任一項所述的注射製劑。

在一個方面，本揭露提供如前任一項所述的組成物，或如前任一項所述的凍乾製劑，或前任一項所述的注射製劑在製備用於治療腫瘤或癌症的藥物中的用途。

在一些實施方式中，如前任一項所述的腫瘤或癌症選自：肺癌、小細胞肺癌、大細胞肺癌、頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、咽鱗癌、口腔鱗癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、乳腺癌、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、大細胞肺癌、三陰性乳腺癌和淋巴瘤。

在一些實施方式中，如前任一項所述的腫瘤或癌症是實體瘤。

在一些實施方式中，如前任一項所述的腫瘤或癌症是肺癌。

在一些實施方式中，如前任一項所述的腫瘤或癌症是小細胞肺癌。

在一些實施方案中，如前任一項所述的治療腫瘤或癌症的方法，其進一步包括使用第二治療劑。在一些實施方案中，該第二治療劑包括抗腫瘤藥劑、放射療法、抗體藥物綴合物、雙特異性抗體、與抗腫瘤藥劑綴合的雙特異性抗體、免疫檢查點抑制劑或其組合。

在一些實施方案中，如前所述的治療腫瘤或癌症的方法，其中該第二治療劑與本揭露任一項所述的雙特異性抗體製劑同時施用、序貫施用或分開施用。

本揭露提供的雙特異性抗體製劑，具有治療活性、安全性、藥物代謝動力學特性和成藥性(如穩定性)好的特點。

圖1顯示DLL3-CD3雙特異性抗體的Format3的結構示意圖。

圖2A顯示雙特異性抗體與DLL1結合的實驗結果。結果顯示，本揭露的DLL3-CD3雙特異性抗體不結合DLL1。

圖2B顯示雙特異性抗體與DLL4結合的實驗結果。結果顯示，本揭露的DLL3-CD3雙特異性抗體不結合DLL4。

圖3顯示雙特異性抗體對細胞的殺傷作用實驗結果。結果顯示，本揭露的雙特異性抗體對不表達DLL3的H460細胞無殺傷作用。

圖4A顯示雙特異性抗體對T細胞的激活的實驗結果，結果顯示本揭露的雙特異性抗體在表達DLL3的DLL3/H82細胞存在時，具有明顯的激活T細胞的作用。

圖4B顯示，當存在不表達DLL3的陰性細胞H460時，本揭露的雙特異性抗體不會激活T細胞。

圖5A顯示雙特異性抗體的細胞因子釋放的實驗結果，結果顯示，在H1184細胞存在的情況下，本揭露的雙特異性抗體刺激PBMC細胞分泌的IFNγ的含量非常低。

圖5B顯示，在H1184細胞存在的情況下，本揭露的雙特異性抗體刺激PBMC細胞分泌的IL-6的含量非常低。

術語

本文所用的術語只是為了描述實施方案的目的，並非旨在進行限制。除非另外定義，本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本揭露所屬領域中具有通常知識者通常所理解的相同意義。

除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。除非另有說明，“包含”包括了“由......組成”。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

術語”和/或”，例如“X和/或Y”應當理解為意指“X和Y”或“X或Y”並且應當被用來提供對兩種含義或任一含義的明確支持。

除非被指定為來自非人物種(例如，“小鼠DLL3”、“小鼠DLL3片段”、“猴DLL3”、“猴DLL3片段”等)，否則如本文使用的“DLL3”和“DLL3片段”是指眾所周知的人DLL3蛋白或其片段。

除非被指定為來自非人物種(例如，“小鼠CD3”、“小鼠CD3片段”、“猴CD3”、“猴CD3片段”等)，否則如本文使用的“CD3”和“CD3片段”是指眾所周知的人CD3蛋白或其片段。

術語“胺基酸”是指天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構(即與氫、羧基、胺基和R基團結合的α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有修飾的R基團(例如，正亮胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構，但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化學化合物。

術語“胺基酸突變”包括胺基酸取代，缺失，插入和修飾。可以進行取代、缺失、插入和修飾的任意組合來實現最終構建體，只要最終構建體擁有期望的特性，例如降低或對Fc受體的結合。胺基酸序列缺失和插入包括在多肽鏈的胺基端和/或羧基端的缺失和插入。具體的胺基酸突變可以是胺基酸取代。在一個實施方式中，胺基酸突變是非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。胺基酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種天然胺基酸的衍生物(例如4-羥脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥賴胺酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變。遺傳方法可以包括定點誘變、PCR，基因合成等。預計基因工程以外的改變胺基酸側鏈基團的方法，如化學修飾也是可用的。本文中可使用各種名稱來指示同一胺基酸突變。本文中，可採用位置+胺基酸殘基的方式表示特定位點的胺基酸殘基，例如366W，則表示在366位點上的胺基酸殘基為W。T366W則表示第366位點上的胺基酸殘基由原來的T突變為了W。

術語“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗體片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。根據上下文，所屬技術領域中具有通常知識者能夠確定“抗體”所指的具體含義。

“天然抗體”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫鍵結合的兩條輕鏈和兩條重鏈構成。從N端至C端，每條重鏈具有一個可變區(VH，又稱作可變重域、重鏈可變區)，接著是三個恆定域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N端至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL，又稱作可變輕域，或輕鏈可變域)，接著是一個恆定輕域(輕鏈恆定區、CL)。術語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文可互換使用，指具有與天然抗體結構基本類似的結構或具有含有如本文所限定的Fc區的重鏈的抗體。

術語“雙特異性抗體”指能夠對兩個不同抗原或同一抗原的至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗體(包括抗體或其抗原結合片段，如單鏈抗體)。現有技術已揭露了各種結構的雙特異性抗體，根據IgG分子的完整性可分為IgG樣雙特異性抗體和抗體片段型雙特異性抗體；根據抗原結合區域的數量，可分為二價、三價、四價或更多價的雙特異性抗體，根據結構左右是否對稱，可分為對稱結構雙特異性抗體和不對稱結構雙特異性抗體。其中，基於抗體片段的雙特異性抗體，例如缺乏Fc片段的Fab片段，其藉由將2個或多個Fab片段結合在一個分子中形成雙特異性抗體，其具有較低的免疫原性，且分子量小，具有較高的腫瘤組織滲透性，該類型的典型的抗體結構如F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab等雙特異性抗體；IgG樣雙特異性抗體(例如具有Fc片段)，這類抗體相對分子量較大，Fc片段有助於抗體後期的純化，並提高其溶解性、穩定性，Fc部分還可能會與受體FcRn結合，增加抗體血清半衰期，典型的雙特異性抗體結構模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、Fc△Adp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、 CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等雙特異性抗體(參見Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585-608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019 Feb 11；2019：4516041)。

可以藉由各種公知方案來確定CDR的胺基酸序列邊界，例如：“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則、“ABM”編號規則、“contact”編號規則(參見Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGebTics(IMGT)編號規則(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018 Oct 16；9：2278)等；各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領域中具有通常知識者熟知的。本揭露的編號規則如下表1中所示。

表1. CDR編號系統之間的關係

除非另有說明，本揭露實施方案中的可變區和CDR序列均適用“Kabat”編號規則。

術語“抗體片段”或“抗原結合片段”指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，該部分保留了完整抗體的抗原結合能力。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab′)₂、單域抗體、單鏈Fab(scFab)、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

術語“Fc區”或“片段可結晶區”用於定義抗體重鏈的C末端區域，包括天然Fc區和改造的Fc區。在一些實施方式中，Fc區包含了相同或不同的兩個亞基。在一些實施方式中，人IgG重鏈的Fc區定義為從Cys226位置處的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。用於本文所述抗體的合適天然序列Fc區包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。除非另有說明，Fc區的編號規則為EU索引。

術語“嵌合”抗體指抗體中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩餘部分自不同來源或物種衍生的抗體。

術語“人源化”抗體是保留非人抗體的反應性同時在人中具有較低免疫原性的抗體。例如，可以藉由保留非人CDR區並用其人對應物(即，恆定區以及可變區的框架區部分)替換抗體的其餘部分來實現。

術語“親和力”是指分子(例如，抗體)的單個結合部位與其結合配體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總體的強度。除非另外指明，如本文所用，“結合親和力”是指內部結合親和力，其反映出結合對(例如，抗體與抗原)的成員之間1：1相互作用。分子X對其配體Y的親和力通常可以由平衡解離常數(KD)表示。親和力可以藉由本領域已知的常規方法(包括本文所述的那些)測量。術語“kassoc”或“ka”指特定抗體-抗原相互作用的締合(association)速率，而如本文所使用的術語“kdis”或“kd”意在是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文所使用的，術語“KD”指平衡解離常數，其獲得自kd與ka的比率(即kd/ka)並且表示為莫耳濃度(M)。可以使用本領域已知的方法測定抗體的KD值，例如表面電漿共振法、ELISA或溶液平衡滴定法(SET)。

術語“單株抗體”指基本上均質的抗體的群，即在該群中包含的抗體分子的胺基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突變以外。相比之下，多株抗體製劑通常包含在其可變結構域具有不同胺基酸序列的多種不同抗體，其通常特異性針對不同表位。在一些實施方式中，本揭露提供的抗體是單株抗體。

術語“抗原”是指能夠由抗原結合分子(例如抗體)的選擇性結合劑所結合的分子或分子部分。抗原可具有一個或多個能夠與不同的抗原結合分子(例如抗體)相互作用的表位。

術語“表位”指能夠與抗體或其抗原結合片段特異性結合的抗原上的區域(area或region)。表位可以由連續胺基酸(線性表位)形成或包含非連續胺基酸(構象表位)，例如因抗原的折疊(即藉由蛋白質性質的抗原的三級折疊)而使得非連續的胺基酸在空間上得以接近。構象表位和線性表位的差別在於：在變性溶劑的存在下，抗體對構象表位的結合喪失。表位包含處於獨特空間構象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10個胺基酸。篩選結合特定表位的抗體(即那些結合相同表位的)可以使用本領域例行方法來進行，例如但不限於丙胺酸掃描，肽印跡(見Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)，肽切割分析，表位切除，表位提取，抗原的化學修飾(見Prot.Sci.9(2000)487-496)，和交叉阻斷(見“Antibodies”，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY))。

術語“能夠特異性結合”、“特異性結合”或“結合”是指相比其他抗原或表位，抗原結合分子能夠以更高的親和力結合至某個抗原或表位。通常，抗體以約1×10^-7M或更小(例如約1×10^-8M或更小)的平衡解離常數(KD)結合抗原或表位。在一些實施方式中，抗體與抗原結合的KD為該抗體結合至非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10%或更低(例如1%)。可使用已知的方法來測量KD，例如藉由FACS或表面電漿共振測定法所測量的。然而，特異性結合至抗原或其表位的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性，例如，對來自其它物種(同源)(諸如人或猴，例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相應抗原具有交叉反應性。

術語“不結合”是指抗原結合分子不能夠以上述特異性結合的方式結合至某個抗原或其表位。例如，當抗體以約1×10^-6M或更大的平衡解離常數(KD)結合抗原或其表位。

術語“抗原結合模塊”指特異性結合目標抗原的多肽分子。具體的抗原結合模塊包括抗體的抗原結合域，例如包含重鏈可變區和輕鏈可變區。術語“特異性結合CD3的抗原結合模塊”是指能夠以足夠的親和力結合CD3或其表位的模塊，使得含有該模塊的分子可用作靶向CD3的診斷劑和/或治療劑。例如，特異性結合CD3的抗原結合模塊具有以下的平衡解離常數(KD)：<約10nM，其是藉由表面電漿共振測定法測量的。抗原結合模塊包括如本文定義的抗體片段，例如Fab，經替換的Fab或scFv。

術語“連接子”指連接兩個多肽片段的連接單元。在本文中，同一結構式中出現的連接子可以是相同或不同的。連接子可以是肽連接子，其包含一個或多個胺基酸，典型的包含約1-30個、2-24個或3-15個胺基酸。應用於本文的連接子可以是相同或不同的。當“-”出現在結構式中，其表示兩側的單元直接藉由共價鍵連接。

“Tm”是溶解變性溫度(內源螢光)。當蛋白質變性(加熱或變性劑作用)時，三級結構打開，芳香族胺基酸微環境發生變化，導致發射螢光光譜改變。本揭露中，Tm1是指螢光變化到最大值的一半時的溫度。

“Tonset”是變性起始溫度。意指蛋白質開始變性時的溫度，即螢光值開始變化時的溫度。

“Tagg”是聚集起始溫度。藉由靜態光散射，在266nm和473nm兩個波長下檢測聚集體，監測到樣品開始聚集時的溫度。Tagg 266指的是266nm下監測到聚集起始溫度。

應當理解，儘管本揭露中沒有提供具體的編碼核苷酸序列，所屬技術領域中具有通常知識者根據密碼子規則和宿主密碼子偏好性，能夠在胺基酸序列的基礎上確定對應的編碼核苷酸序列。

術語“融合”或“連接”是指部件(例如抗原結合模塊和Fc結構域)直接地或經由連接子共價連接。

術語“載體”意指能夠轉運與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接附加的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，例如腺相關病毒載體(AAV或AAV2)，其中另外的DNA區段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。術語“表達載體”或“表達構建體”是指適用於對宿主細胞進行轉化且含有指導及/或控制(連同宿主細胞一起)與其可操作地連接的一個或多個異源編碼區的表達的核酸序列的載體。表達構建體可以包括但不限於影響或控制轉錄、轉譯且在存在內含子時影響與其可操作地連接的編碼區的RNA剪接的序列。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。

術語“受試者”或“個體”包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如哺乳動物和非哺乳動物)例如非人靈長類(例如，食蟹猴)、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非明確指出，否則該術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。如本文所使用的，術語“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些實施方案中，個體或受試者是人。

“施用”或“給予”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。

術語“樣本”是指從受試者分離的類似流體、細胞、或組織的採集物，以及存在於受試者體內的流體、細胞或組織。示例性樣本為生物流體，諸如血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、排泄物、痰、分泌組織和器官的黏膜分泌物、陰道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體、由支氣管灌洗液收集的流體、滑液、與受試者或生物來源接觸的液體溶液，例如細胞和器官培養基(包括細胞或器官條件培養基)、灌洗液等，組織活檢樣本、細針穿刺、手術切除的組織、器官培養物或細胞培養物。

“治療(treatment或treat)”和“處理”(及其語法變型)指試圖施加至所治療個體的臨床干預，並且可以為了預防目的、或者在臨床病理學的過程期間進行實施。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或復發，減輕症狀，減輕/減少疾病的任何直接或間接病理後果，預防轉移，降低疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，和消退或改善的預後。

術語“復發(recurrence)”、“復發(relapse)”“復發(relapsed)”是指癌症或疾病在疾病消失的臨床評估之後的恢復。遠處癌轉移或局部復發的診斷可視為復發。

“有效量”一般是足以降低症狀的嚴重程度及/或頻率、消除這些症狀及/或潛在病因、預防症狀及/或其潛在病因出現及/或改良或改善由疾病狀態引起或與其相關的損傷的量。在一些實施例中，有效量是治療有效量或預防有效量。

“治療有效量”是足以治療疾病狀態或症狀、尤其與該疾病狀態相關的狀態或症狀，或者以其他方式預防、阻礙、延遲或逆轉該疾病狀態或以任何方式與該疾病相關的任何其他不理想症狀的進展的量。

“預防有效量”是當給予受試者時將具有預定預防效應，例如預防或延遲該疾病狀態的發作(或復發)，或者降低該疾病狀態或相關症狀的發作(或復發)可能性的量。完全治療或預防效未必在給予一個劑量之後便發生，可能在給予一系列劑量之後發生。因而，治療或預防有效量可以一次或多次給予的方式給予。“治療有效量”和“預防有效量”可取決於多種因素變化：諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及治療劑或治療劑組合在個體中引發期望的應答的能力。有效治療劑或治療劑組合的示例性指標包括例如受試者改善的健康狀況。

“緩衝劑”指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝劑。將pH控制在適當範圍中的緩衝劑的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝劑。

“組胺酸緩衝劑”是包含組胺酸的緩衝劑。組胺酸緩衝劑的實例包括組胺酸-鹽酸組胺酸，組胺酸-醋酸組胺酸，組胺酸-磷酸組胺酸，組胺酸-硫酸組胺酸等緩衝劑，較佳組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑可由組胺酸與鹽酸配製而成，或者由組胺酸與鹽酸組胺酸配製而成。

“枸櫞酸鹽緩衝劑”是包括枸櫞酸根離子的緩衝劑。枸櫞酸鹽緩衝劑的實例包括枸櫞酸-枸櫞酸鈉、枸櫞酸-枸櫞酸鉀、枸櫞酸-枸櫞酸鈣、枸櫞酸-枸櫞酸鎂等。較佳的枸櫞酸鹽緩衝劑是枸機酸-枸櫞酸鈉。

“琥珀酸鹽緩衝劑”是包括琥珀酸根離子的緩衝劑。琥珀酸鹽緩衝劑的實例包括琥珀酸-琥珀酸鈉鹽、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。較佳的琥珀酸鹽緩衝劑是琥珀酸-琥珀酸鈉鹽。示例性的，該琥珀酸-琥珀酸鈉可由琥珀酸與氫氧化鈉配製而成，或由琥珀酸與琥珀酸鈉鹽配製而成。

“磷酸鹽緩衝劑”是包括磷酸根離子的緩衝劑。磷酸鹽緩衝劑的實例包括檸檬酸-磷酸氫二鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-枸櫞酸等。較佳的磷酸鹽緩衝劑是檸檬酸-磷酸氫二鈉。

“醋酸鹽緩衝劑”是包括醋酸根離子的緩衝劑。醋酸鹽緩衝劑的實例包括醋酸-醋酸鈉、組胺酸-醋酸組胺酸、醋酸-醋酸鉀、醋酸-醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。較佳的醋酸鹽緩衝劑是醋酸-醋酸鈉。

“泊洛沙姆(poloxamer)”是α-氫-ω-羥基聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)a嵌段共聚物。由環氧丙烷和丙二醇反應，形成聚氧丙烯二醇，然後加入環氧乙烷形成嵌段共聚物。其中，a為氧乙烯的單元數，b為氧丙烯的單元數。泊洛沙姆的實施例包括但不限於泊洛沙姆188(P188或PF68)。具體地，泊洛沙姆188，在共聚物中氧乙烯單元(a)為75~85，氧丙烯單元(b)為25~30，氧乙烯(EO)含量79.9%~83.7%，平均分子量為7680~9510。

“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的醫藥組成物或液體或溶液製劑經真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或醫藥組成物。

本揭露所述的醫藥組成物能夠達到一種穩定的效果：其中的抗體在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性的醫藥組成物，較佳地，醫藥組成物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於醫藥組成物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。

穩定的製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少1個月、至少3個月、較佳6個月、更佳1年，且甚至更佳地多達2年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃的溫度保存包括1個月、3個月或6個月在內的時段後表現出期望的特徵。還包括40℃的溫度保存包括4週、1個月、3個月或6個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的例子：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、較佳不超過約5%的抗體發生聚集或降解。藉由視覺分析，製劑是淡黃色近無色澄明液體或者無色澄明液體，或澄清至稍微乳白色。該製劑的濃度、pH、重量、分子滲透壓具有不超過±10%變化，較佳不超過±5%的變化。該製劑通常形成不超過約10%、較佳不超過約5%的聚集。

如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，抗體沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。蛋白構象的變化可以藉由螢光光譜法(其確定蛋白三級結構)和藉由FTIR光譜法(其確定蛋白二級結構)來評價。

如果抗體沒有顯示出顯著的化學改變，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如尺寸排阻色譜法和CE-SDS等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。

如果抗體在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的生物活性”。

取代、插入和刪除變體

在某些實施方案中，提供了具有一處或多處胺基酸取代的抗原結合分子變體。可以在CDR和FR進行取代。保守取代在表2中在“較佳的取代”的標題下顯示。更實質的變化在表2中在“示例性取代”的標題下提供，並且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步描述的。可以將胺基酸取代引入感興趣的抗體中，並且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

表2. 胺基酸的取代

依照常見的側鏈特性，胺基酸可以如下分組：

(1)疏水性的：正亮胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性，親水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)鹼性的：His，Lys，Arg；

(5)影響鏈取向的殘基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守取代會是指用一個類別的成員替換另一個類別的成員。

一類取代變體涉及取代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個CDR殘基。一般地，經選擇用於進一步研究的所得變體相對於親本抗體會具有某些生物學特性(例如升高的親和力，降低的免疫原性)的改變(例如改善)，和/或會基本上保留親本抗體的某些生物學特性。一種示例性的取代變體是親和力成熟的抗體，可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術(如本文所述的那些技術)，便利地產生該抗體。簡言之，將一個或多個CDR殘基突變，並將變體抗體在噬菌體上展示，並對其篩選特定的生物學活性(例如結合親和力)。可以對CDR做出改變(例如取代)，例如以改善抗體親和力。可以對CDR“熱點”，即在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的密碼子所編碼的殘基，和/或接觸抗原的殘基做出此類改變，同時對所得的變體VH或VL測試結合親和力。在親和力成熟的一些實施方案中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸指導的誘變)的任一種，將多樣性引入所選擇用於成熟的可變基因中。然後，創建次級文庫。然後，篩選文庫以鑑定具有期望的親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法涉及CDR定向的方法，其中將幾個CDR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可以例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特異性鑑定涉及抗原結合的CDR殘基。

在某些實施方案中，取代、插入或缺失可以在一個或多個CDR內發生，只要此類變化不實質性降低抗體結合抗原的能力。例如，可以對CDR做出保守變化(例如保守取代，如本文中提供的)，其不實質性降低結合親和力。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實施方案中，每個CDR是未改變的，或者含有不超過1、2或3處胺基酸取代。

一種可用於鑑定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域的方法稱作“丙胺酸掃描誘變”。在這種方法中，鑑定一個殘基或殘基組(例如帶電荷的殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，並且替換為中性或帶負電荷的胺基酸(例如，Ala或聚丙胺酸)，以確定該抗體與抗原的相互作用是否受影響。可以在對初始取代顯示功能敏感性的胺基酸位置引入進一步的取代。此外，可藉由研究抗原-抗體複合物的晶體結構來鑑定抗體與抗原間的接觸點。這些接觸殘基及鄰近殘基可以作為取代候選物被打靶或消除。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。

胺基酸序列插入包括：在胺基和/或羧基端融合1個殘基或長度為100或更多個殘基的多肽；和單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。在末端插入的例子包括具有N端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體包括，在抗體的N或C端融合有酶(或延長抗體的血清半衰期的多肽)的融合物。

Fc區的改造

在一個方面，本揭露的雙特異性抗體的Fc區包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代減少其與Fc受體的結合，例如其與Fcγ受體的結合，並且降低或消除效應子功能。天然IgG Fc區，具體地是IgG₁ Fc區或IgG₄ Fc區，可能導致本揭露的雙特異性抗體靶向表達Fc受體的細胞，而不是表達抗原的細胞。本揭露改造的Fc區表現出降低的對Fc受體的結合親和力和/或降低的效應子功能。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對Fc受體的結合親和力下降50%、80%、90%或95%以上。在一些實施方案中，該Fc受體是Fcγ受體。在一些實施方案中，該Fc受體是人Fcγ受體，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIB、FcγRIIIa。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對補體，如C1q的結合親和力也降低。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力不降低。在一些實施例中，改造的Fc區具有降低的效應子功能，該降低的效應子功能可以包括但不限於以下中的一個或多個：降低的補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、降低的抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、減少的細胞因子分泌、減少的免疫複合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、減少的與NK細胞的結合、減少的與巨噬細胞的結合、減少的與單核細胞的結合、減少的與多形核細胞的結合、減少的直接信號傳導誘導性細胞凋亡、降低的樹突細胞成熟或減少的T細胞引發。對於IgG1 Fc區，在238、265、269、270、297、327和329等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。在一些實施方案中，該Fc區是人 IgG1 Fc區，並且在234和235位置的胺基酸殘基為A，編號依據為EU索引。對於IgG₄ Fc區，在228等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。

當雙特異性抗體包含與Fc區的兩個亞基融合的不同結合模塊，可能導致不期望的同源二聚化。為了提高產率和純度，因此在本揭露的雙特異性抗體的Fc區中引入促進異源二聚化的修飾將是有利的。在一些實施方式中，本揭露的Fc區包含根據杵臼(knob-into-hole，KIH)技術的改造，該方法涉及在第一亞基的界面處引入凸起結構(knob)以及在第二亞基的界面處引入孔結構(hole)。使得該凸起結構可以定位在孔結構中，促進異源二聚體的形成並抑制同源二聚體的產生。凸起結構是藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)取代來自第一亞基的界面的小胺基酸側鏈而構建的。而孔結構是藉由用較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)取代大胺基酸側鏈而在第二亞基的界面中創建的。凸起結構和孔結構藉由改變編碼多肽的核酸來製備，可選的胺基酸取代如下表所示：

表3. KIH突變組合

除了杵臼技術外，用於修飾重鏈的CH3結構域以實現異源二聚化的其他技術也是本領域中已知的，例如WO1996027011A1、WO1998050431、EP1870459、WO2007110205、WO2009089004、WO2010129304、WO201190754、WO2011143545、WO2012058768、WO2013157954和WO2013096291。

Fc區的C末端可以是以胺基酸殘基PGK結束的完整C末端；也可以是截短的C末端，例如在該截短的C末端中去除了一個或兩個C末端胺基酸殘基。在一個較佳的方面中，重鏈的C末端是以PG結束的縮短的C末端。因此，在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括去除了所有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括沒有去除K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物具有帶有和不帶有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體混合物的抗體群體。

重組方法

雙特異性抗體可以使用重組方法來產生。對於這些方法，提供編碼雙特異性抗體的一個或更多個分離的核酸。

在天然抗體、天然抗體片段或具有同源二聚體重鏈的雙特異性抗體的情況下，需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段，一個用於重鏈或其片段。此類核酸編碼包含抗體VL的胺基酸序列和/或包含抗體VH的胺基酸序列(例如抗體的輕鏈和/或重鏈)。這些核酸可以在相同的表達載體上或在不同的表達載體上。

在具有異二聚體重鏈的雙特異性抗體的情況下，需要例如四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於包含第一異源單體Fc區多肽的第一重鏈，一個用於第二輕鏈，並且一個用於包含第二異源單體Fc區多肽的第二重鏈。這四個核酸可包含在一個或更多個核酸分子或表達載體中，通常這些核酸位於兩個或三個表達載體上，即一個載體可包含這些核酸中的多於一個。

在一個實施方案中，本揭露提供了編碼如前所述的抗體的分離的核酸。此類核酸可以獨立地編碼前述的任一多肽鏈。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的一種或多種載體(例如表達載體)。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一個實施方案中，提供製備雙特異性抗體的方法，其中該方法包括，在適合抗體表達的條件下，培養包含編碼該抗體的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

為了重組產生雙特異性抗體，將編碼蛋白的核酸分離並插入一個或更多個載體中，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸可以使用常規程序容易地分離和測序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)，或者藉由重組方法產生或藉由化學合成獲得。

用於選殖或表達編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別是當抗體不需要糖基化和Fc效應子功能時。在表達後，抗體可以在可溶級分中從細菌細胞糊狀物分離，並且可進一步純化。

除了原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是用於編碼抗體的載體的合適的選殖或表達宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途徑已經“人源化”，導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。適於表達(糖基化)抗體的合適的宿主細胞也可源自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)；無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑑定了許多杆狀病毒株，其可與昆蟲細胞聯合使用，特別是用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染；還可利用植物細胞培養物作為宿主，例如US5959177、US 6040498、US6420548、US 7125978和US6417429；也可將脊椎動物細胞用作宿主，例如適應於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。適宜的哺乳動物宿主細胞系的其它例子是經SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293或293T細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞；MRC 5細胞；和FS4細胞。其它適宜的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞；以及骨髓瘤細胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(編)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268頁。

實施例與測試例

以下結合實施例和測試例進一步描述本揭露，但這些實施例和測試例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例和測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

一、特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的製備

實施例1. DLL3抗原及檢測用蛋白和穩轉細胞株的製備

1.1 高表達DLL3的細胞株構建

包含SEQ ID NO：1-2的pCDH慢病毒表達載體質粒(由GENEWIZ公司合成)，pCDH質粒分別與pVSVG，pCMV慢病毒包裝載體用Lipofectamine 3000(Invitrogen,L3000015)轉染試劑轉染至293T細胞(中科院細胞庫，GNHu17)中，收集含有病毒的培養基上清，過濾並進行超高速離心，棄去上清後，用0.2mL無菌PBS重新懸浮。使用濃縮後的病毒分別感染中國倉鼠卵巢細胞CHO-s(Invitrogen,R80007)，DMS53(ATCC,CRL-2062)和H82(ATCC,HTB-175)，經嘌呤黴素(puromycin)篩選兩至三週，再進行FACS單細胞分選。將挑選出的單株細胞株擴大培養，凍存，以便後續實驗。

包含表達LUC和GFP基因的pCDH-CMV-MCS-EF1-puro慢病毒表達載體質粒(由GENEWIZ公司合成)，pCDH質粒分別與pVSVG，pCMV慢病毒包裝載體用Lipofectamine 3000(Invitrogen,L3000015)轉染試劑轉染至293T細胞(中科院細胞庫，GNHu17)中，收集含有病毒的培養基上清，過濾並進行超高速離心，棄去上清後，用0.2mL無菌PBS重新懸浮。使用濃縮後的病毒分別感染SHP77(ATCC,CRL-2195)，H1184(ATCC，CRL-5858)，H460(中國科學院細胞庫，TCHu205)經嘌呤黴素(puromycin)篩選兩至三週，再進行FACS單細胞分選。將挑選出的單株細胞株擴大培養，凍存，以便後續實驗。

使用的相關蛋白序列如下：

1.人DLL3全長蛋白(SEQ ID NO：1)：

2.食蟹猴DLL3全長蛋白(SEQ ID NO：2)：

3.大鼠DLL3全長蛋白(SEQ ID NO：3)：

4.小鼠DLL3全長蛋白(SEQ ID NO：4)：

5.人DLL1全長蛋白(SEQ ID NO：5)：

6.人DLL4全長蛋白(SEQ ID NO：6)：

1. 2抗原的製備

以人DLL3(Uniprot,Q9NYJ7)、食蟹猴DLL3(Uniprot,A0A2K5WSR4)和小鼠DLL3(Uniprot,O88516)序列為模板，設計含有不同標簽的人DLL3 ECD融合蛋白，分別選殖到pTT5載體上，經293E細胞表達後，獲得抗原。相關蛋白胺基酸序列如下：

1. His-hDLL3(ECD)(SEQ ID NO：7)：備註：點劃線為信號肽序列，單劃線為his標簽和連接子，雙劃線為DLL3胞外區。

2. Fc-hDLL3(ECD)(SEQ ID NO：8)：備註：點劃線為信號肽序列，單劃線為Fc標簽和連接子，雙劃線為DLL3胞外區。

3. hDLL3(ECD)-strep twin(SEQ ID NO：9)：

備註：點劃線為信號肽序列，雙劃線為DLL3胞外區，單劃線為strep twin標簽。

4. cynoDLL3(ECD)-strep twin(SEQ ID NO：10)：備註：點劃線為信號肽序列，雙劃線為DLL3胞外區，單劃線為strep twin標簽。

5. mouDLL3(ECD)-strep twin(SEQ ID NO：11)：

實施例2. 抗人DLL3抗體的製備

藉由融合瘤技術製備針對人DLL3的單株抗體，免疫方式如下：

第一組，以His-hDLL3(ECD)(SEQ ID NO：7)為免疫原，用TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)佐劑交叉免疫。抗原與佐劑(TiterMax® Gold Adjuvant)比例為1：1，抗原與佐劑(Thermo Imject® Alum)比例為3：1，50μg/隻/次(首次免疫)，25μg/隻/次(加強免疫)。用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。

第二組小鼠的免疫抗原為DLL3-CHO-s細胞和Fc-hDLL3(ECD)(SEQ ID NO：8)，免疫方式為細胞和蛋白抗原交替免疫。細胞免疫按照每隻小鼠腹膜內注射0.1mL生理鹽水稀釋至10⁸/mL濃度的細胞液。Fc-hDLL3(ECD)抗原用TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)佐劑交叉免疫。抗原與佐劑(TiterMax® Gold Adjuvant)比例為1：1，抗原與佐劑(Thermo Imject® Alum)比例為3：1，50μg/隻/次 (首次免疫)，25μg/隻/次(加強免疫)。用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。

採用優化的電融合方法將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到融合瘤細胞。根據融合瘤細胞生長密度，用結合DLL3蛋白的ELISA方法和結合DLL3 CHO-s細胞FACS方法進行融合瘤培養上清檢測。選擇結合人DLL3蛋白，猴DLL3蛋白以及DLL3 CHO-s細胞，同時不結合野生型CHO-s細胞的株及時進行凍存擴增保種和一到二次亞選殖直至獲得單細胞株。藉由以上實驗篩選得到融合瘤株mAb6。

將融合瘤株擴培養，提取RNA，利用mouse-Ig的簡併引子進行反轉錄擴增(RT-PCR)，最後得到抗體的可變區序列。

mAb6重鏈可變區(SEQ ID NO：12)：

mAb6輕鏈可變區(SEQ ID NO：13)：

表4. 抗體的CDR

將鼠抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區分別選殖到包含SEQ ID NO：20所示的人IgG1重鏈恆定區和SEQ ID NO：21所示的κ輕鏈恆定區的pTT5載體質粒，然後轉染HEK293細胞，得到了抗DLL3的嵌合抗體M6CHI。

人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：20)：

人κ輕鏈恆定區(hκ)(SEQ ID NO：21)：

實施例3. 抗DLL3單株抗體的人源化

藉由比對Kabat人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫，分別挑選同源性高的重、輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別嫁接(graft)到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 的可變區序列。並對可變區的某些胺基酸進行胺基酸取代，再與恆定區重組(示例性的，與SEQ ID NO：20所示的人IgG1重鏈恆定區和SEQ ID NO：21所示的人κ輕鏈恆定區)，獲得全長的人源化抗體。

mAb6抗體的人種系輕鏈模版為IGKV1-16*01或IGKV3-20*02和IGKJ4*01，人種系重鏈模版為IGHV1-3*01、IGHV7-4-1*02或IGHV3-73*01和IGHJ6*01。視需要地，對人源化抗體的輕鏈可變區上第1、36、42、43、44、46、52、56、69、71、79、85和/或94位的胺基酸殘基進行取代；和/或對人源化抗體的重鏈可變區上第1、27、30、38、43、48、67、68、69、71、73、75、76、93、56、58和/或5位的胺基酸殘基進行取代。

表5. mAb6鼠源抗體的人源化模板及相應點突變

獲得的hu6人源化抗體可變區的序列如下：

hu6 VH1(SEQ ID NO：22)

hu6 VH2(SEQ ID NO：23)

hu6 VH3(SEQ ID NO：24)

hu6 VH4(SEQ ID NO：25)

hu6 VH5(SEQ ID NO：26)

hu6 VH6(SEQ ID NO：27)

hu6 VH7(SEQ ID NO：28)

hu6VH8(SEQ ID NO：29)(Graft IGHV1-3*01)

hu6VH9(SEQ ID NO：30)(Graft IGHV7-4-1*02)

hu6VH10(SEQ ID NO：31)(Graft IGHV3-73*01)

hu6VH11(SEQ ID NO：32)

hu6VH12(SEQ ID NO：33)

hu6VH13(SEQ ID NO：34)

hu6VH14(SEQ ID NO：35)

hu6VH15(SEQ ID NO：36)

hu6 VL1(SEQ ID NO：37)

hu6 VL2(SEQ ID NO：38)

hu6 VL3(SEQ ID NO：39)

hu6 VL4(SEQ ID NO：40)

hu6VL5(SEQ ID NO：41)(Graft IGKV1-16*01)

hu6VL6(SEQ ID NO：42)

hu6VL7(SEQ ID NO：43)

hu6VL8(SEQ ID NO：44)

hu6VL9(SEQ ID NO：45)

hu6VL10(SEQ ID NO：46)

hu6VL11(SEQ ID NO：47)Graft(IGKV3-20*02)+D56E EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASQGISGNMGWYQQKPGQAPRLLIYHGANLEE GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCVQYAQFPYTFGGGTKVEIK

備註：單下劃線部分為CDR，雙下劃線處為胺基酸取代位點，其餘部分為FR區，下同。

mAb6的人源化抗體的CDR如下：

表6. mAb6人源化抗體的CDR

表7. mAb6的人源化抗體

表8. mAb6的人源化抗體

分別選殖、表達、純化上述抗體，經蛋白結合實驗(測試例3)、細胞結合實驗(測試例2)、Biacore(測試例1)，最終選出活性較好的人源化抗體。示例性的人源化抗體的重、輕鏈胺基酸序列如下：

Hu6(也稱hu6L4H12)重鏈(SEQ ID NO：54)：

Hu6(也稱hu6L4H12)輕鏈(SEQ ID NO：55)：備註：序列中下劃線部分為可變區，斜體部分為恆定區。

實施例4. 抗DLL3-CD3雙特異性抗體的製備

4.1 本揭露使用的CD3抗體

本揭露的CD3結合部分可以來源於任意適宜的抗體。具體的，本揭露的實施例採用的是S107E，其可變區及CDR序列如下：

表9. S107E的CDR

S107E可變區序列如下：

>S107E-VH(SEQ ID NO：62)

>S107E-VL(SEQ ID NO：63) 備註：下劃線部分為CDR。

4.2 本揭露的DLL3-CD3雙特異性抗體的結構

本揭露的DLL3-CD3雙特異性抗體分子包含兩條鏈，具體結構如下：

鏈1結構：[VL(anti-DLL3)]-連接子1-[VH(anti-CD3)]-連接子2-[Fc(Knob,L234A，L235A，G237A，Y349C，T366W)]；

鏈2結構：[VL(anti-CD3)]-連接子3-[VH(anti-DLL3)]-連接子2-[Fc(hole,L234A，L235A，G237A，S354C，T366S，L368A，Y407V)]；

其示意圖如圖1所示。

雙特異性抗體分子兩條鏈的Fc區為能夠以杵臼技術相互締合的Fc區。示例性的，鏈1的Fc區為具有根據杵臼技術的凸起結構(如SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：66)，鏈2的Fc區為具有根據杵臼技術的孔結構(如SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：67)。

相關序列如下：

>IgG1Fc(Knob,L234A/L235A/S354C/T366W)(SEQ ID NO：64)

>IgG1Fc(Hole,L234A,L235A,Y349C,T366S,L368A,Y407V)(SEQ ID NO：65)

>Fc Knob(L234A，L235A，G237A，Y349C，T366W)(SEQ ID NO：66)

>Fc hole(L234A,L235A，G237A，S354C，T366S，L368A，Y407V)(SEQ ID NO：67)

>連接子1(SEQ ID NO：68)GGGSGGGG

>連接子2(SEQ ID NO：69)G

>連接子3(SEQ ID NO：70)GGGGSGGGG。

基於mAb6人源化抗體胺基酸序列，構建了如下所示的雙特異性抗體：

hu6(D56E)-S107E-diabody

鏈1：hu6-VL(D56E)-連接子1-S107E-連接子2-VH-Fc knob；(SEQ ID NO：71)

鏈2：CD3VL-連接子3-hu6VH-連接子2-Fc hole；(SEQ ID NO：72)備註：hu6(D56E)-S107E-diabody表示該分子採用hu6(D56E)人源化抗體的可變區作為DLL3結合域，S107E的可變區作為CD3結合域，採用diabody作為分子結構。

>鏈1(SEQ ID NO：71)

>鏈2(SEQ ID NO：72)

本揭露中使用的對照分子AMG-75，其參考WO2017021349製備。對照分子的序列如下：

AMG-757(SEQ ID NO：73)：

測試例

測試例1：Biacore抗體親和力測定

用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556，Cytiva)親和捕獲待測抗體18秒，然後於芯片表面流經抗原人DLL3(ACRO，DLL3-H52H4)，食蟹猴DLL3(KACTUS，DLL-RM103)，小鼠DLL3(KACTUS，DLL-MM103)，人CD3D&3E(ACRO，CDD-H52W1)和猴CD3D&3E(ACRO，CDD-C52W4)180秒，然後解離600秒。用Biacore 8K(Cytiva)儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用10mM甘胺酸-鹽酸溶液(pH 1.5，Cat.# BR-1003-54，Cytiva)將芯片洗淨再生。數據擬合模型採用1：1 Model。結果見表10和表11。

表10. 抗體與人DLL3的親和力(基於株6)

表11. 雙特異性抗體hu6(D56E)-S107E-diabody與不同種屬抗原的親和力

結果顯示，本揭露的特異性結合DLL3的人源化抗體，嵌合抗體與人DLL3均具有良好親和力；雙特異性抗體與人和食蟹猴的DLL3和CD3均具有良好的親和力。

測試例2：DLL3細胞水平的FACS結合實驗

將表達DLL3的小細胞肺癌細胞系H1184(ATCC，貨號CRL-5858)，DLL3/H82，DLL3/SHP77，hDLL3/CHO-s，cynoDLL3/CHO-s細胞，表達CD3的細胞Jurkat(ATCC，TIB-152)用FACS緩衝液(1%BSA+pH 7.4 PBS)製備成1×10⁶/mL的細胞懸液，100μL/孔加入96孔圓底板中。300g離心5分鐘，去除上清。加入不同濃度待測抗體，100μL/孔。放於4℃冰箱中避光孵育1小時。300g離心洗滌3次後，加入工作濃度的APC anti-human IgG Fc(BioLegend，410712)或者PE F(ab')2-羊抗人IgG(invitrogen,H10104)，放於4℃冰箱中避光孵育40分鐘。300g離心洗滌3次後，在Invitrogen流式細胞儀上檢測幾何平均數螢光強度，計算抗體對表達DLL3的細胞的結合EC₅₀值。結果見表12和表13。

表12. 抗體與表達人DLL3的H1184細胞的結合活性

表13. 雙特異性抗體與細胞的結合活性

結果顯示，本揭露的抗DLL3人源化抗體與表達人DLL3的細胞具有良好結合能力；雙特異性抗體對表達人和食蟹猴的DLL3細胞以及CD3的細胞有良好的結合能力。

測試例3：DLL3蛋白水平的ELISA結合實驗

將streptavidin(abcam，ab136200，1μg/ml)包板，100μL/孔，4℃過夜。用PBST溶液(PBS含0.1%吐溫20)250μL/孔，洗板3次。5%牛奶封閉，250μL/孔，37℃封閉2小時。用PBST溶液250μL/孔，洗板3次。加入生物素化的DLL3抗原(1μg/mL)(SEQ ID NO：9)，37℃孵育1小時。使用PBST溶液250μL/孔，洗板3次。配製抗體(最高濃度400nM，4倍梯度稀釋)，37℃孵育1小時。使用PBST溶液250μL/孔，洗板6次。加入工作濃度的human IgG(H+L)-HRP(Jackson,109-035-003，1：4000稀釋)抗體，100μL/孔，37℃孵育1小時。使用PBST溶液 250μL/孔，洗板6次。加入TMB(KPL,5120-0077)顯色液100μL/孔，室溫顯色5-10分鐘。加入1M H₂SO₄，100μL/孔，中止顯色，酶標儀(Molecular Devices,VERSA max)450nm讀數。

表14. 雙特異性抗體與人DLL3蛋白的結合活性

結果顯示，本揭露的雙特異性抗體對人DLL3蛋白有良好的親和力。

測試例4：DLL1和DLL4蛋白的ELISA結合實驗

將DLL1(ACRO，DL1-H52H8，1μg/mL)和DLL4(ACRO，DL4-H5227，1μg/mL)包板，100μL/孔，4℃過夜。用PBST溶液(PBS含0.1%吐溫20)250μL/孔，洗板3次。5%牛奶封閉，250μL/孔，37℃封閉2小時。用PBST溶液250μL/孔，洗板3次。加入待檢測抗體(最高濃度100nM，4倍梯度稀釋)，37℃孵育1小時。使用PBST溶液250μL/孔，洗板6次。加入工作濃度的human IgG(H+L)-HRP(Jackson,109-035-003，1：4000稀釋)抗體，100μL/孔，37℃孵育1小時。使用PBST溶液250μL/孔，洗板6次。加入TMB(KPL，5120-0077)顯色液100μL/孔，室溫顯色5-10分鐘。加入1M H₂SO₄，100μL/孔，中止顯色，酶標儀(Molecular Devices,VERSA max)450nm讀數，結果見圖2A及圖2B。

結果顯示，本揭露的雙特異性抗體未檢測到結合人DLL1和DLL4蛋白。

測試例5. 本揭露的雙特異性抗體對細胞的殺傷活性

本測試例研究了雙特異性抗體作為T細胞銜接分子對腫瘤細胞的殺傷活性。用表達LUC-GFP的SHP77、H1184和H460穩轉細胞系作為靶細胞來檢測本揭露的雙特異性抗體的靶點特異性細胞毒活性。

SHP77/lucG細胞培養在1640+10% FBS+10μg/mL嘌呤黴素(puromycin)完全培養基中，一週傳代2-3次。H1184/lucG細胞培養在1640+5% FBS+10μg/mL嘌呤黴素(puromycin)完全培養基中，一週傳代1次。H460/lucG細胞培養在1640+10% FBS完全培養基中，一週傳代2-3次。凍存PBMC(妙順生物)復蘇後用1640+10% FBS完全培養基重新懸浮，置於T75培養瓶培養4小時(密度為2E6 cells/mL)。PBMC收集離心後用1640+10% FBS重新懸浮、計數，調整細胞數為1.5E6 cells/mL。將上述PBMC懸液和靶細胞懸液按照等體積混合，每孔加入100μL確保E：T Ratio為10：1。另外設置PBMC ONLY組，將上述PBMC懸液和1640+10% FBS完全培養基按照等體積混合。抗體用1640+10% FBS培養基稀釋，起始濃度為600nM(6x終濃度)，5倍稀釋，9個劑量點，每孔加入20μL。處理好的細胞放在37℃，5% CO₂的培養箱培養48小時。取出培養板，1000rpm離心3分鐘，吸取50μL上清於新的3788板中用於檢測細胞因子檢測，-20℃保存。在培養板中加入50μL ONE-GloTMLuciferase(Promega，E6120)，室溫孵育5分鐘後，用Vendor檢測Luminescence，計算抗體在不同濃度下的殺傷作用。使用Graphpad Prism8.0軟體根據抗體的對數濃度和信號值做出量效曲線圖，得出抗體介導殺傷的IC50。將只有靶細胞、PBMC不加抗體的孔設為0%抑制，計算抗體的最大抑制率Imax。結果見表15及圖3。

表15. 雙特異性抗體hu6(D56E)-S107E-diabody對不同靶細胞的細胞毒活性

結果顯示，本揭露的雙特異性抗體對表達DLL3的細胞SHP77和H1184有較強的殺傷作用；而對不表達DLL3的H460細胞無殺傷作用(圖3)。

測試例6. 本揭露的雙特異性抗體的體外T細胞激活活性

H82/DLL3細胞培養在1640+10% FBS完全培養基中，一週傳代2-3次，傳代比例1：3左右。H460細胞培養在1640+10% FBS完全培養基中，一週傳代2-3次，傳代比例1：10左右。Jurkat Lucia^TM NFAT細胞(InvivoGen)培養在1640+10% FBS+100μg/ml zeocin(InvivoGen,ant-zn-1)完全培養基中，一週傳代2-3次，傳代比例1：10左右。收集Jurkat Lucia^TM NFAT細胞，1000rpm離心3分鐘，重新懸浮、計數，調整細胞數為1E6 cells/mL。收集靶細胞H82/DLL3細胞，1000rpm離心3分鐘，重新懸浮、計數，調整細胞數為2E5 cells/mL。收集H82/DLL3和H460細胞，1000rpm離心3分鐘，重新懸浮、計數，調整細胞數為4E5 cells/mL。將上述Jurkat Lucia^TM NFAT和靶細胞按照等體積混合，每孔加入100μL，確保H82/DLL3細胞E：T Ratio為5：1，H82/DLL3和H460細胞E：T Ratio為2.5：1。抗體用1640+10% FBS培養基稀釋，起始濃度為600nM(6×終濃度)，5倍稀釋，9個劑量點，每孔加入20μL。處理好的細胞放在37℃，5% CO₂的培養箱培養5小時。用25mL的ddH₂O溶解QUANTI-Luc^TM Gold試劑(Invivogen,rep-qlcg5)。加入50μL QUANTI-Luc^TM Gold，室溫孵育5分鐘後，用Vendor檢測Luminescence，計算抗體在不同濃度下對Jurkat Lucia^TM NFAT細胞的激活作用。使用Graphpad Prism8.0軟體做圖，結果見圖4A至圖4B和表16。

激活倍數的公式N=待測抗體的螢光讀值/陰性孔的螢光讀值

表16. 雙特異性抗體對T細胞的激活結果

結果顯示，本揭露的雙特異性抗體只有在存在表達DLL3的DLL3/H82細胞時，才會激活T細胞；當存在不表達DLL3的陰性細胞H460時，不會激活T細胞。

測試例7. 本揭露的雙特異性抗體的細胞因子釋放水平

1.本揭露的雙特異性抗體的細胞因子IFNγ釋放水平

使用HTRF法檢測在DLL3/CD3雙抗在H1184細胞存在的情況下，分別刺激PBMC中細胞因子IFNγ分泌情況。

取出細胞殺傷實驗中(測試例5)收集的凍存於-20℃冰箱的上清，常溫解凍，震盪混勻。使用無菌水溶解IFNγ標準品粉末，使用1640+10% FBS培養基稀釋標準品至需要的濃度。取出要檢測IFNγ的試劑盒(CISBIO,62HIFNGPEG)，平衡試劑盒至常溫，使用detection buffer稀釋試劑盒中的兩個檢測抗體(20倍稀釋)。取16μL細胞上清(10倍稀釋用於IFNγ檢測)及IFNγ標準品於96孔板中，加入4μL稀釋好的對應的檢測抗體；震盪混勻，1000rpm離心1分鐘，常溫孵育過夜。取出孵育過夜的樣品，1000rpm離心1分鐘，使用PHERAstar多功能酶標儀讀取665nm和620nm的吸收值。用Graphpad Prism 8分析數據，結果見圖5A。

結果顯示，本揭露的雙特異性抗體釋放IFNγ的水平非常低。

2.本揭露的雙特異性抗體的細胞因子IL-6釋放水平

使用ELISA法檢測在DLL3/CD3雙抗在H1184細胞存在的況下，刺激PBMC中細胞因子IL-6分泌的情況。

取出細胞殺傷實驗中(測試例5)收集的凍存於-20℃冰箱的上清，常溫解凍，震盪混勻，樣品使用樣品稀釋液稀釋5倍備用。細胞因子檢測前，取出IL-6 ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，EHC007.96)常溫平衡，根據說明書分別稀釋IL-6標準品和進行檢測測量OD450值，用Graphpad Prism 8分析數據。結果見圖5B。

結果顯示，本揭露的雙特異性抗體釋放IL6的水平非常低，說明本揭露的雙特異性抗體具有更好的安全性。

體內活性評價

測試例8. 本揭露的雙特異性抗體在SHP77皮下移植瘤模型中的藥效

本揭露採用重度聯合免疫缺陷NOG小鼠接種SHP-77細胞，接種後腹腔注射人PBMC，成瘤後分組給藥。

NOG小鼠，雌性，體重15-17g左右，購自維通利華。SHP-77細胞來自ATCC。人PBMCs購自於妙順(上海)生物科技有限公司，貨號：ID#A10S115034。

將SHP-77細胞(4×10⁶個/隻小鼠)100μL接種於NOG小鼠右肋部皮下。接種當天，復蘇凍存的hPBMC。接種第2天，每隻小鼠腹腔注射hPBMC 5×10⁶/100μL的細胞懸液。接種8天後，待腫瘤體積在~120mm³後去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為5組，每組8隻，當天開始給等莫耳量的抗體，給藥量如表32所示。藉由腹腔注射相應等莫耳量的抗體，每5天給藥1次，共給藥3次，給藥到第15天。每週測2次瘤體積，稱體重，記錄數據。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L_長×L_短 ²

相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T₀)/(C-C₀)×100%，其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T₀、C₀為實驗開始時的腫瘤體積。

抑瘤率TGI(%)=100-T/C(%)。

表17. 抗體在SHP77皮下移植瘤模型中的藥效(給藥後第15天)

結果顯示，本揭露的雙特異性抗體可以顯著抑制SHP-77移植瘤的生長。

測試例9. 本揭露的雙特異性抗體在H1184皮下移植瘤模型中的藥效

本揭露採用重度聯合免疫缺陷NOG小鼠接種H1184細胞，接種後腹腔注射人PBMC，成瘤後分組給藥。

NOG小鼠，雌性，體重15-17g左右，購自維通利華。H1184細胞來自ATCC。人PBMCs購自於妙順(上海)生物科技有限公司，貨號：ID#A10S115034。

將H1184細胞(3.5×10⁶個，含50%MatriGel)200μL/隻接種於NOG小鼠右肋部皮下。接種第11天，復蘇8支凍存hPBMC(ID#A10S115034)。接種第12天，每隻小鼠腹腔注射人PBMC 5×10⁶/100μL的細胞懸液。接種18天後，待腫瘤體積在~140mm³後去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為組，每組8隻，當天開始給等莫耳量的抗體，給藥量如表33所示。藉由腹腔注射抗體，共給藥4次，每週2次。每週測2次瘤體積，稱體重，記錄數據。

使用Excel統計軟體記錄數據：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT(每組動物數)計算；採用GraphPad Prism軟體作圖，採用Two-way ANOVA、One-way ANOVA、t-test對數據進行統計學分析。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L_長×L_短 ²

抑瘤率TGI(%)=100-T/C(%)。

表18. 抗體在H1184皮下移植瘤模型中的藥效(給藥後第15天)

結果顯示，本揭露的雙特異性抗體可以顯著抑制H1184移植瘤的生長。

二、製備實施例-特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體製劑

SEC分子排阻色譜法：

根據凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團尺寸間的相對關係而對溶質進行分離的分析的方法。

SEC%(SEC單體含量百分比)=A單體/A總×100%(A單體為樣品中主峰單體的峰面積，A總為所有峰面積之和)。△SEC%=穩定性實驗前製劑的SEC%-穩定性實驗後製劑的SEC%。

SEC測定用儀器：安捷倫HPLC 1260；

管柱：Waters，BioResolve^TM SEC mAb 200Å,2.5μm 7.8×300mm Column

NR-CE毛細管凝膠電泳：

將凝膠移到毛細管中作為支持介質進行的一種電泳，並在一定的電壓下根據樣品分子量的大小進行分離的方法。

NR-CE%(NR-CE主峰含量百分比)=A主峰/A總×100%(A主峰為樣品中主峰的峰面積，A總為所有峰面積之和)。△NR-CE%=穩定性實驗前製劑的NR-CE%-穩定性實驗後製劑的NR-CE%。

CE測定用儀器：Beckman毛細管電泳儀，型號PA800 plus

iCIEF全柱成像毛細管等電聚焦電泳：

根據蛋白質等電點pI不同進行分離的技術。

iCIEF%(iCIEF中性峰含量百分比)=A中性峰面積/A總面積×100%(A總面積為酸性峰、中性峰和鹼性峰面積之和)。△iCIEF%=穩定性實驗前製劑的iCIEF%-穩定性實驗後製劑的iCIEF%。

iCIEF測定用儀器：simple protein，型號Muarice。

IEC離子交換色譜：

以離子交換樹脂或化學鍵合離子交換劑為固定相，利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇性係數的差別而實現分離的色譜方法。

IEC%(IEC中性峰含量百分比)=A中性峰面積/A總面積×100%(A總面積為酸性峰、中性峰和鹼性峰面積之和)。△IEC%=穩定性實驗前製劑的IEC%-穩定性實驗後製劑的IEC%。

IEC測定用儀器：安捷倫HPLC 1260。

滲透壓測定：

冰點法測定滲透壓，以冰點下降值與溶液的莫耳濃度成正比例關係為基礎，採用高靈敏度感溫元件，測定溶液結冰點，藉由電量轉化為滲透壓。

滲透壓測定用儀器：羅澤Loser，型號OM815。

蛋白

以下實施例所採用的蛋白為特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體蛋白(hu6(D56E)-S107E-diabody，以下簡稱“蛋白”)。

融合蛋白的濃度測定用儀器：紫外可見分光光度計，型號：Nano Drop oneC，光程為1mm。

製劑實施例1. pH和緩衝體系篩選

用表19所示的緩衝體系製備70mg/mL蛋白、80mg/mL蔗糖、0.4mg/mL聚山梨酯80(PS80)的製劑。對樣品進行強制降解研究(40℃放置4週)，以SEC和IEC為評價指標，進一步考察不同pH和緩衝體系對蛋白穩定性的影響。

結果見表19。SEC數據顯示，△SEC在0.8%-3.2%範圍內，其中His-HCl體系(pH4.5-5.5)和His-AA體系(pH5.0)組較優。△IEC數據顯示，His- HCl(pH4.5-5.5)體系和CA體系(pH5.5)組較優。綜合△SEC和△IEC數據，較佳His-HCl體系(pH4.5-5.5)。

表19. pH和緩衝體系篩選結果

製劑實施例2. 蛋白濃度篩選

用18mM的His-HCl緩衝劑(pH 5.0)製備0.1mg/mL二水合乙二胺四乙酸二鈉(含二水，廠家：湖南爾康製藥股份有限公司，後簡稱EDTA-2Na，CAS：6381-92-6)、80mg/mL蔗糖、0.4mg/mL PS80和表20所示的蛋白濃度的製劑。對樣品進行強制降解研究(40℃放置4週)，以SEC和IEC為評價指標，考察不同蛋白濃度對蛋白穩定性的影響。

結果見表20。40℃放置4週，隨著蛋白濃度提高，△SEC略有增加趨勢，△IEC組間差異較小。

表20. 蛋白濃度篩選結果

製劑實施例3. EDTA-2Na濃度篩選

用18mM的His-HCl緩衝劑(pH 5.0)製備100mg/mL蛋白、80mg/mL蔗糖、0.4mg/mL PS80和表21所示的不同濃度EDTA-2Na的製劑。對樣品進行強制降解研究(40℃放置4週)，以SEC、NR-CE和IEC為評價指標，考察不同EDTA-2Na濃度對製劑穩定性的影響。

結果見表21。40℃放置4週，△SEC在0.7%-1.4%範圍內，含0.1mg/mL EDTA-2Na的製劑單體純度略優於其他組。△NR-CE和△IEC組間無顯著差異。

表21. EDTA-2Na濃度篩選結果

製劑實施例4. His-HCl緩衝體系離子濃度篩選

用表22所示的不同離子濃度的His-HCl緩衝劑(pH 5.0)製備100mg/mL蛋白、0.1mg/mL EDTA-2Na、80mg/mL蔗糖和0.4mg/mL PS80的製劑。對樣品進行強制降解研究(40℃放置4週)，以SEC、NR-CE和IEC為評價指標，考察不同組胺酸離子濃度對蛋白穩定性的影響。

結果見表22。40℃放置4週，△SEC、△NR-CE和△IEC組間無顯著差異。

表22. His-HCl緩衝體系濃度篩選結果

製劑實施例5. 糖濃度篩選

用18mM的His-HCl緩衝劑(pH 5.0)製備100mg/mL蛋白、0.1mg/mL EDTA-2Na、0.4mg/mL PS80和表23所示的不同濃度蔗糖的製劑。對樣品進行強制降解研究(40℃放置4週)，以SEC、NR-CE和IEC為評價指標，考察不同濃度蔗糖對製劑穩定性的影響。

結果見表23。△SEC在0.7%-1.5%範圍內，含80mg/mL蔗糖的製劑單體純度略優於其他組。△NR-CE和△IEC組間無顯著差異。

表23. 蔗糖濃度篩選結果

糖作為生物藥常用輔料，本項目採用蔗糖作為滲透壓調節劑及穩定劑進行處方篩選，可滿足製劑要求。蔗糖濃度為80mg/mL時，實際測定製劑的滲透壓為292mOsm，接近等滲。因此，較佳蔗糖濃度為80mg/mL。

製劑實施例6. 表面活性劑種類篩選

用18mM的His-HCl緩衝劑(pH 5.5)製備70mg/mL蛋白、80mg/mL蔗糖和表24所示不同種類表面活性劑的製劑，包括PS80和泊洛沙姆188(P188)。對樣品進行強制降解研究(40℃放置4週)，以外觀、SEC、NR-CE和iCIEF為評價指標，考察不同種類表面活性劑對蛋白穩定性的影響。

結果見表24。外觀、△SEC、△NR-CE和△iCIEF數據顯示，40℃放置4週後，含不同種類表面活性劑的製劑外觀和純度項無顯著差異。

表24. 表面活性劑濃度篩選結果

製劑實施例7. 表面活性劑濃度篩選

用18mM的His-HCl緩衝劑(pH 5.0)製備100mg/mL蛋白、0.1mg/mL EDTA-2Na、80mg/mL蔗糖和表25所示不同濃度PS80的製劑。對樣品進行強制降解研究(40℃放置4週)，以外觀、SEC、NR-CE和IEC為評價指標，考察不同濃度表面活性劑對蛋白穩定性的影響。

結果見表25。外觀、△SEC、△NR-CE和△IEC數據顯示，40℃放置4週後，含不同濃度PS80的製劑外觀和純度項無顯著差異。

表25. 表面活性劑濃度篩選結果

製劑實施例8.處方確認

用18mM的His-HCl緩衝劑(pH 5.0)製備150mg/mL蛋白、0.1mg/mL EDTA-2Na、80mg/mL蔗糖和0.4mg/mL PS80的製劑。對樣品進行長期穩定性研究(5℃放置6個月)，以SEC和IEC為評價指標，考察該處方的蛋白穩定性。

結果見表26。5℃放置6個月，與第0天相比，SEC和IEC均無顯著變化，因此在該蛋白濃度條件下，蛋白穩定性良好。

表26. 蛋白濃度150mg/mL處方長期穩定性結果

製劑實施例9.處方確認

用18mM His-HCl緩衝劑(pH 5.0)製備100mg/mL蛋白、0.1mg/mL EDTA-2Na、0.4mg/mL PS80和80mg/mL蔗糖的製劑。對樣品進行長期穩定性研究，以SEC、NR-CE、IEC為評價指標，考察長期穩定性。

結果見表27。SEC、NR-CE和IEC數據顯示，5℃放置12個月後製劑純度項無顯著變化。

表27.長期穩定性結果

製劑實施例10.處方確認

用18mM His-HCl緩衝劑(pH 5.0)製備5mg/mL蛋白、0.1mg/mL EDTA-2Na、0.4mg/mL PS80和80mg/mL蔗糖的製劑。對樣品進行長期穩定性研究，以SEC、IEC為評價指標，考察長期穩定性。

結果見表28。SEC和IEC數據顯示，5℃放置6個月後製劑純度項無顯著變化。

表28.長期穩定性結果

雖然為了清楚的理解，已經借助於圖式和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本揭露的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的揭露內容藉由引用完整地清楚結合。

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Claims

一種醫藥組成物，包含特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體和緩衝劑，其中，

該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體包含一條具有式I所示結構的第一鏈和一條具有式II所示結構的第二鏈，

式I：[DLL3-VL]-[連接子1]-[CD3-VH]-[連接子2]-[Fc1]，

式II：[CD3-VL]-[連接子3]-[DLL3-VH]-[連接子2]-[Fc2]，

該DLL3-VH包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的DLL3-HCDR1，包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的DLL3-HCDR2和包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的DLL3-HCDR3；和該DLL3-VL具有：包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列的DLL3-LCDR1，包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列的DLL3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的DLL3-LCDR3；和

該CD3-VH包含SEQ ID NO：56的胺基酸序列的CD3-HCDR1，包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列的CD3-HCDR2，和包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列的CD3-HCDR3；和該CD3-VL具有：包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列的CD3-LCDR1，包含SEQID NO：60的胺基酸序列的CD3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列的CD3-LCDR3；

其中，式I和式II所示的結構是從N端至C端排列的；該連接子1、連接子2和連接子3是相同或不同的肽連接子；該Fc1和該Fc2是能夠以杵臼技術相互締合的Fc區結構序列；

該緩衝劑為組胺酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑、枸櫞酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑或磷酸鹽緩衝劑；

較佳地，該緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑、組胺酸-醋酸組胺酸緩衝劑或枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽緩衝劑；

更佳地，該緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物的pH為4.5至6.0；較佳地，該醫藥組成物的pH為4.5至5.5；更佳地，該醫藥組成物的pH為4.8至5.2；最佳地，該醫藥組成物的pH為約5.0。
如請求項1或2所述的醫藥組成物，其中該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至250mg/mL；

較佳地，該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至150mg/mL；

進一步佳地，該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為70mg/mL至150mg/mL；

更佳地，該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為80mg/mL至120mg/mL；

最佳地，該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為約100mg/mL。
如請求項1或2所述的醫藥組成物，其中該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至20mg/mL；

較佳地，該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為1mg/mL至10mg/mL；

更佳地，該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為4mg/mL至6mg/mL；

最佳地，該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體的濃度為約5mg/mL。
如請求項1至4中任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含表面活性劑；較佳地，該表面活性劑為聚山梨酯或泊洛沙姆；更佳地，該表面活性劑為聚山梨酯80或泊洛沙姆188；最佳地，該表面活性劑為聚山梨酯80。
如請求項5所述的醫藥組成物，其中該聚山梨酯80的濃度為0.01mg/mL至1.0mg/mL；較佳地，該聚山梨酯80的濃度為0.1mg/mL至1.0mg/mL；進一步佳地，該聚山梨酯80的濃度為0.2mg/mL至0.6mg/mL；更佳地，該聚山梨酯80的濃度為0.3mg/mL至0.5mg/mL；最佳地，該聚山梨酯80的濃度為約0.4mg/mL。
如請求項5所述的醫藥組成物，其中該泊洛沙姆188的濃度為0.5mg/mL至5.0mg/mL；較佳地，該泊洛沙姆188的濃度為1mg/mL至3mg/mL；更佳地，該泊洛沙姆188的濃度為1.5mg/mL至2.5mg/mL；最佳地，該泊洛沙姆188的濃度為約2.0mg/mL。
如請求項1至7中任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含糖；較佳地，該糖為蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨糖醇；更佳地，該糖為蔗糖。
如請求項8所述的醫藥組成物，其中該糖的濃度為10mg/mL至120mg/mL；較佳地，該糖的濃度為30mg/mL至100mg/mL；更佳地，該糖的濃度為64mg/mL至96mg/mL；最佳地，該糖的濃度為約80mg/mL。
如請求項1至9中任一項所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑的濃度為5mM至100mM；較佳地，該緩衝劑的濃度為10mM至50mM；進一步佳地，該緩衝劑的濃度為10mM至30mM；更佳地，該緩衝劑的濃度為15mM至25mM；最佳地，該緩衝劑的濃度為約18mM。
如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含輔料；較佳地，該輔料為二水合乙二胺四乙酸二鈉、DTPA、鹽酸精胺酸、甘胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、谷胺酸、天冬胺酸、氯化鈉或氯化鈣；更佳地，該輔料為二水合乙二胺四乙酸二鈉。
如請求項11所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為0.01mg/mL至1mg/mL；較佳地，該輔料的濃度為0.01mg/mL至0.5mg/mL；更佳地，該輔料的濃度為0.08mg/mL至0.12mg/mL；最佳地，該輔料的濃度為約0.1mg/mL。
如請求項1至12中任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體中，

該DLL3-VH包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列，和該DLL3-VL包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列；和

該CD3-VH包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列，和該CD3-VL包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。
如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體中該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構；

較佳地，該Fc1的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示；和該Fc2的胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示。
如請求項1至14中任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體中該連接子1、連接子2和連接子3相同或不同，各自獨立地選自SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70。
如請求項1至15中任一項所述的醫藥組成物，其中特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，其中

式I的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示，和式II的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示。
如請求項1所述的醫藥組成物，其包含如下組分：

(a)1mg/mL至250mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.01mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)10mg/mL至120mg/mL的糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)5mM至100mM的緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至6.0；

較佳地，該醫藥組成物包含如下組分：

(a)1mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或1mg/mL至3mg/mL泊洛沙姆188，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至50mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑、組胺酸-醋酸組胺酸緩衝劑或枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至5.5；

進一步佳地，該醫藥組成物包含如下組分：

(a)70mg/mL至150mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.2mg/mL至0.6mg/mL的聚山梨酯80或1mg/mL至3mg/mL泊洛沙姆188，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至0.5mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至5.5；

更佳地，該醫藥組成物包含如下組分：

(a)80mg/mL至120mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.3mg/mL至0.5mg/mL的聚山梨酯80或1.5mg/mL至2.5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.08mg/mL至0.12mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)15mM至25mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.8至5.2：

最佳地，該醫藥組成物包含如下組分：

(a)約100mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，

(d)約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)約18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該醫藥組成物的pH為約5.0。
如請求項1所述的醫藥組成物，其包含如下組分：

(a)1mg/mL至20mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.01mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)10mg/mL至120mg/mL的糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)5mM至100mM的緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至6.0；

較佳地，該醫藥組成物包含如下組分：

(a)1mg/mL至10mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80或0.5mg/mL至5mg/mL泊洛沙姆188，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至50mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑、組胺酸-醋酸組胺酸緩衝劑或枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至5.5；

進一步佳地，該醫藥組成物包含如下組分：

(a)1mg/mL至10mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.1mg/mL至1.0mg/mL的聚山梨酯80，

(c)30mg/mL至100mg/mL的蔗糖，

(d)0.01mg/mL至1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)10mM至50mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.5至5.5；

更佳地，該醫藥組成物包含如下組分：

(a)4mg/mL至6mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)0.3mg/mL至0.5mg/mL的聚山梨酯80，

(c)64mg/mL至96mg/mL的蔗糖，

(d)0.08mg/mL至0.12mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)15mM至25mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.8至5.2；

最佳地，該醫藥組成物包含如下組分：

(a)約5mg/mL的該特異性結合DLL3和CD3的雙特異性抗體，

(b)約0.4mg/mL的聚山梨酯80，

(c)約80mg/mL的蔗糖，

(d)約0.1mg/mL的二水合乙二胺四乙酸二鈉，和

(e)約18mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該醫藥組成物的pH為約5.0。
如請求項1至18中任一項所述的醫藥組成物，其為皮下注射製劑、靜脈注射製劑、腹腔注射製劑或肌肉注射製劑；較佳為皮下注射製劑。
一種製備凍乾製劑的方法，其中包括將如請求項1至18中任一項所述的醫藥組成物進行冷凍乾燥的步驟。
一種凍乾製劑，該製劑藉由如請求項20所述的方法獲得的。
一種如請求項1至19中任一項所述的醫藥組成物、或如請求項21所述的凍乾製劑在製備用於治療腫瘤或癌症的藥物中的用途；較佳地，其中該腫瘤或癌症選自：

肺癌、小細胞肺癌、大細胞肺癌、頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、咽鱗癌、口腔鱗癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、乳腺癌、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、大細胞肺癌、三陰性乳腺癌和淋巴瘤。