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TW202521697A - 用於抑制血管生成素樣3（angptl3）蛋白表達的組合物和方法 - Google Patents

用於抑制血管生成素樣3（angptl3）蛋白表達的組合物和方法 Download PDF

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TW202521697A
TW202521697A TW114106156A TW114106156A TW202521697A TW 202521697 A TW202521697 A TW 202521697A TW 114106156 A TW114106156 A TW 114106156A TW 114106156 A TW114106156 A TW 114106156A TW 202521697 A TW202521697 A TW 202521697A
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舒東旭
鵬程 邵
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大陸商上海舶望製藥有限公司
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Abstract

提供了可用於降低血管生成素樣3（ANGPTL3）基因的表達以及用於治療ANGPTL3相關疾病和病症的組合物及方法。提供了可用於降低細胞和對象中ANGPTL3表達的ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸藥劑、包含ANGPTL3 dsRNA藥劑的組合物、以及包含ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的組合物。

Description

用於抑制血管生成素樣3（ANGPTL3）蛋白表達的組合物和方法
本發明部分地涉及可用於抑制血管生成素樣3（ANGPTL3）蛋白表達的組合物和方法。
血管生成素樣蛋白3（ANGPTL3）是主要在肝細胞中表達的分泌蛋白（Conklin et al. Identification of a mammalian angiopoietin-related protein expressed specifically in liver. Genomics 1999, 62:477–482）。它是脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）和內皮脂肪酶（endothelial lipase，EL）的抑制劑。通過對LPL和EL的抑制的作用，ANGPTL3降低了甘油三酯（TG）的水解，特別是在肌肉和脂肪組織中（Kersten S. Physiological regulation of lipoprotein lipase. Biochem Biophys Acta 2014; 1841:919–933。Shimamura et al. Angiopoietin-like protein3 regulates plasma HDL cholesterol through suppression of endothelial lipase. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27:366–372）。因此，對ANGPTL3的抑制使LPL和EL活性脫抑制，這導致TG和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的降低。對ANGPTL3的抑制還可能通過EL介導的VLDL過程導致低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的降低（Adam, et al. Angiopoietin-like protein3 governs LDL-cholesterol levels through endothelial lipase-dependent VLDL clearance. J Lipid Res 2020; 61:1271–1286）。還值得注意的是，目前降低LDL-C的治療，例如他汀類和PCSK9抑制劑是LDL-R依賴性的，並且對具有低或無殘留LDL-R活性的患者無效。通過抑制ANGPTL3而降低LDL-C是LDL-R非依賴性的，這可以是用於管理具有低LDL-R活性或無LDL-R活性的患者的脂質的有效的治療方法。
高脂血症與包括高血壓、動脈粥樣硬化、心臟病、糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）的疾病密切相關。研究顯示在人中喪失ANGPTL3的功能突變具有有益效果。ANGPTL3功能的純合喪失導致家族性組合性低脂血症，其特徵在於甘油三酯、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）膽固醇和LDL-C的血漿水平低以及冠狀動脈疾病的風險降低（Romeo et el., Rare loss-of-function mutations in ANGPTL family members contribute to plasma triglyceride levels in humans., J. Clin. Invest., 2009, 119:70–79；Musunuru, et al., Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia., N Engl J Med, 2010, 363:2220–2227）。ANGPTL3已作爲用於治療由高脂血症引起的疾病的有前景的藥物靶標而出現，其中治療模式包括正在開發的抗體、反義寡核苷酸（ASO）和siRNA。siRNA，特別是與GalNAc綴合的siRNA已被證明是安全、有效且具有長活性期間的。因此，需要用於治療多種疾病和病症的新的ANGPTL3 siRNA藥劑。
根據本發明的一個方面，提供了用於抑制血管生成素樣3（ANGPTL3）表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑，dsRNA藥劑包含有義鏈和反義鏈，反義鏈中的第2至18位核苷酸包含ANGPTL3 RNA轉錄物的互補區，其中互補區包含與表1至5之一中列出的反義序列之一相差0、1、2或3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且任選地包含靶向配體。在一些實施方案中，ANGPTL3 RNA轉錄物的互補區包含與表1至5之一中列出的反義序列之一相差不超過3個核苷酸的至少15、16、17、18或19個連續核苷酸。在某些實施方案中，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 235的任一個靶區域至少基本上互補，並且在表1至5的任一個中提供。在一些實施方案中，dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 235的任一個靶區域完全互補，並且在表1至5的任一個中提供。在一些實施方案中，dsRNA藥劑包含表1至5的任一個中所示的有義鏈序列，其中有義鏈序列與dsRNA藥劑中的反義鏈序列至少基本上互補。在某些實施方案中，dsRNA藥劑包含表1至5的任一個中所示的有義鏈序列，其中有義鏈序列與dsRNA藥劑中的反義鏈序列完全互補。在一些實施方案中，dsRNA藥劑包含表1至5的任一個中所示的反義鏈序列。在一些實施方案中，dsRNA藥劑包含在表1至5的任一個中的雙鏈體序列所示的序列。在一些實施方案中，dsRNA的反義鏈由以下核苷酸序列II組成： ，其中z 1選自c、g、a或u，z 2是核苷酸序列IV。在某些實施方案中，z 1是u。在某些實施方案中，核苷酸序列IV的長度爲0至15個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列IV選自 或 。在某些實施方案中，核苷酸序列IV的長度爲1、2、3或4個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列IV選自 或 。在某些實施方案中，dsRNA的反義鏈由以下核苷酸序列II’組成： ，其中z 1選自c、g、a或u，z 2’是核苷酸序列IV’。在某些實施方案中，z 1是u。在某些實施方案中，核苷酸序列IV’的長度爲0至15個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列IV’的長度爲1、2、3或4個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列IV’選自 或 。在一些實施方案中，dsRNA的有義鏈由以下核苷酸序列III組成： ，其中z 3是核苷酸序列V，z 4選自c、g、a或u。在某些實施方案中，z 4是a。在某些實施方案中，核苷酸序列V的長度爲0至15個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列V選自 或 。在某些實施方案中，核苷酸序列V的長度爲1、2、3或4個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列V選自 或 。在某些實施方案中，dsRNA的有義鏈由以下核苷酸序列III’組成： ，其中z 3’是核苷酸序列V’，z 4選自c、g、a或u。在某些實施方案中，z 4是a。在某些實施方案中，核苷酸序列V’的長度爲1、2、3或4個核苷酸。在某些實施方案中，核苷酸序列V’選自 或 。在一些實施方案中，z 1是與z 4互補的核苷酸。在一些實施方案中，z 2是與z 3互補的核苷酸序列。在一些實施方案中，z 2’是與z 3’互補的核苷酸序列。在一些實施方案中，dsRNA藥劑包含有義鏈和反義鏈，其中dsRNA的反義鏈由如上所述的核苷酸序列II或II’組成，其中有義鏈的長度不超過30個核苷酸，其包含含有至少15、16、17、18或19個核苷酸的反義鏈的互補區。在一些實施方案中，dsRNA藥劑包含有義鏈和反義鏈，其中dsRNA的有義鏈由核苷酸序列III組成，並且dsRNA的反義鏈由核苷酸序列II組成，其中核苷酸序列II和III如上所述。在一些實施方案中，dsRNA藥劑包含有義鏈和反義鏈，其中dsRNA的有義鏈由核苷酸序列III’組成並且dsRNA的反義鏈由核苷酸序列II’組成，其中核苷酸序列II’和III’如上所述。
在一些實施方案中，dsRNA包含有義鏈和反義鏈，反義鏈包含含有至少15個連續核苷酸的互補區，所述連續核苷酸與選自以下的任一種核苷酸序列相差0、1、2或3個核苷酸：
在某些實施方案中，有義鏈和反義鏈包含選自以下的核苷酸序列：
在一些實施方案中，dsRNA藥劑包含至少一個經修飾核苷酸。在某些實施方案中，反義鏈的所有或基本上所有核苷酸均是經修飾核苷酸。在一些實施方案中，所述至少一個經修飾核苷酸包括：2’-O-甲基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脫氧核苷酸、2’3’-seco核苷酸模擬物、鎖核苷酸、解鎖核酸核苷酸（unlocked nucleic acid nucleotide，UNA）、乙二醇核酸核苷酸（glycol nucleic acid nucleotide，GNA）、2’-F-阿拉伯糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2’-Ome核苷酸、反向2’-脫氧核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、和3’-OMe核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團的核苷酸、或者與膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、亞磷醯胺、或包含非天然鹼基的核苷酸。在一些實施方案中，dsRNA藥劑在引導鏈的5’末端包含E-乙烯基膦酸酯核苷酸。在某些實施方案中，dsRNA藥劑包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方案中，有義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，反義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，有義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施方案中，反義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方案中，有義鏈和反義鏈的所有或基本上所有核苷酸均是經修飾核苷酸。在一些實施方案中，經修飾的有義鏈是表2至5之一中所示的經修飾的有義鏈序列。在一些實施方案中，經修飾的反義鏈是表2至5之一中所示的經修飾的反義鏈序列。在某些實施方案中，有義鏈與反義鏈互補或基本上互補，並且互補區的長度爲16至23個核苷酸。在一些實施方案中，互補區的長度爲19至21個核苷酸。在某些實施方案中，互補區的長度爲14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過30個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過25個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過23個核苷酸。在一些實施方案中，每條鏈的長度不超過21個核苷酸。在某些實施方案中，dsRNA藥劑包含至少一個經修飾核苷酸並且還包含一個或更多個靶向基團或連接基團。在一些實施方案中，所述一個或更多個靶向基團或連接基團與有義鏈綴合。在一些實施方案中，靶向基團或連接基團包含N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）。在一些實施方案中，靶向基團具有以下結構： 。
在某些實施方案中，dsRNA藥劑包含與有義鏈的5’末端綴合的靶向基團。在一些實施方案中，dsRNA藥劑包含與有義鏈的3’末端綴合的靶向基團。在一些實施方案中，反義鏈在3’末端包含一個反向無鹼基殘基。在某些實施方案中，有義鏈在3’或/和5’末端包含一個或兩個反向無鹼基殘基。在一些實施方案中，dsRNA藥劑具有兩個平末端。在一些實施方案中，至少一條鏈包含具有至少1個核苷酸的3’突出端。在一些實施方案中，至少一條鏈包含具有至少2個核苷酸的3’突出端。在某些實施方案中，dsRNA包含選自以下的雙鏈體： 。
在某些實施方案中，dsRNA包含選自以下的雙鏈體： 。
在某些實施方案中，dsRNA包含選自以下的雙鏈體： 。在某些實施方案中，dsRNA的有義鏈和反義鏈包含選自以下的核苷酸序列和修飾： 。
根據本發明的一個方面，提供了組合物，其包含本發明的上述dsRNA藥劑方面的任何實施方案。在某些實施方案中，組合物還包含可藥用載體。在一些實施方案中，組合物還包含一種或更多種另外的治療劑。在某些實施方案中，組合物被包裝在藥盒、容器、包裝、分配器、預填充注射器或小瓶中。在一些實施方案中，組合物被配製成用於皮下施用或被配製成用於靜脈內（IV）施用。
根據本發明的另一個方面，提供了細胞，其包含本發明的上述dsRNA藥劑方面的任何實施方案。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞，任選地是人細胞。
根據本發明的另一個方面，提供了抑制細胞中ANGPTL3基因的表達的方法，所述方法包括：（i）製備包含有效量的本發明的上述dsRNA藥劑方面的任何實施方案或本發明的上述組合物的任何實施方案的細胞。在某些實施方案中，所述方法還包括：（ii）將製備的細胞維持足以獲得ANGPTL3基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制細胞中ANGPTL3基因的表達。在一些實施方案中，細胞在對象中並且將dsRNA藥劑皮下施用於該對象。在一些實施方案中，細胞在對象中並且通過IV施用將dsRNA藥劑施用於該對象。在某些實施方案中，所述方法還包括在將dsRNA藥劑施用於對象之後，評估對ANGPTL3基因的抑制，其中用於評估的手段包括：（i）確定對象中ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵，並且（ii）將所確定的生理特徵與ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與ANGPTL3相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較，其中該比較表明對象中ANGPTL3基因表達存在或不存在抑制中的一種或更多種。在一些實施方案中，所確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：對象的血清脂質水平、對象的血清HDL水平、對象的HDL:LDL比例、對象的血清甘油三酯水平和對象的肝中脂肪的量。在一些實施方案中，以下中的一種或更多種的降低表明對象中AGNPTL3基因表達的降低：對象的血清脂質水平、對象的血清HDL水平、對象的血清甘油三酯水平和對象的肝中脂肪的量。
根據本發明的另一個方面，提供了抑制對象中ANGPTL3基因的表達的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明的上述dsRNA藥劑方面的實施方案或本發明的上述組合物的實施方案。在一些實施方案中，將dsRNA藥劑皮下施用於對象。在某些實施方案中，通過IV施用將dsRNA藥劑施用於對象。在一些實施方案中，所述方法還包括：在施用dsRNA藥劑之後，評估對ANGPTL3基因的抑制，其中用於評估的手段包括：（i）確定對象中ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵，並且（ii）將所確定的生理特徵與ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或與ANGPTL3相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較，其中該比較表明對象中ANGPTL3基因表達存在或不存在抑制中的一種或更多種。在一些實施方案中，所確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：對象的血清脂質水平、對象的血清HDL水平、對象的HDL:LDL比例、對象的血清甘油三酯水平和對象的肝中脂肪的量。在某些實施方案中，以下中的一種或更多種的降低表明對象中AGNPTL3基因表達的降低：對象的血清脂質水平、對象的血清HDL水平、對象的血清甘油三酯水平和對象的肝中脂肪的量。
根據本發明的另一個方面，提供了治療與ANGPTL3蛋白的存在相關的疾病或病症的方法，所述方法包括：向對象施用有效量的本發明的任何上述dsRNA藥劑方面的實施方案或本發明任何上述組合物的實施方案，以抑制ANGPTL3基因表達。在一些實施方案中，所述疾病或病症是以下中的一種或更多種：高脂血症、高甘油三酯血症、異常的脂質和/或膽固醇代謝、純合和雜合家族性高膽固醇血症、他汀類抗性高膽固醇血症、心臟代謝疾病、肥胖、動脈粥樣硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、由高甘油三酯血症引起的胰腺炎。在一些實施方案中，所述方法還包括：向對象施用另外的治療方案。在一些實施方案中，另外的治療方案包括針對ANGPTL3相關疾病或病症的治療。在某些實施方案中，另外的治療方案包括：向對象施用一種或更多種本發明的ANGPTL3反義多核苷酸，向對象施用非ANGPTL3 dsRNA治療劑、以及對象中的行爲改變。在一些實施方案中，非ANGPTL3 dsRNA治療劑是以下中的一種或更多種：（i）他汀類；（ii）能夠降低PCSK9表達的PCSK9 siRNA分子、抗體和反義寡核苷酸（ASO）中的一種或更多種；（iii）能夠降低對象中脂質積累的治療劑，以及（iv）能夠降低對象中膽固醇水平和/或積累的治療劑。在一些實施方案中，將dsRNA藥劑皮下施用於對象。在某些實施方案中，通過IV施用將dsRNA藥劑施用於對象。在一些實施方案中，所述方法還包括確定所施用的雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑在對象中的效力。在一些實施方案中，確定治療在對象中的效力的手段包括：（i）確定對象中ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵，並且（ii）將所確定的生理特徵與ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵進行比較，其中該比較表明向對象施用雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑的效力的存在、不存在和水平中的一種或更多種。在一些實施方案中，所確定的生理特徵是：對象的血清脂質水平、對象的HDL水平、對象的HDL:LDL比例、對象的血清甘油三酯水平和對象的肝中脂肪的量。在某些實施方案中，以下中的一種或更多種的降低表明向對象施用雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑的效力的存在：對象的血清脂質水平、對象的血清HDL水平、對象的血清甘油三酯水平和對象的肝中脂肪的量。
根據本發明的另一個方面，提供了與對象中ANGPTL3蛋白的基線治療前水平相比降低對象中ANGPTL3蛋白水平的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明的任何上述dsRNA藥劑方面的實施方案或本發明的任何上述組合物的實施方案，以降低ANGPTL3基因表達的水平。在一些實施方案中，將dsRNA藥劑皮下施用於對象或通過IV施用而施用於對象。
根據本發明的另一個方面，提供了與對象中ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比，改變該對象中ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明的任何上述dsRNA藥劑方面的實施方案或本發明的任何上述組合物的實施方案，以改變對象中ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵。在一些實施方案中，將dsRNA藥劑皮下施用於對象或通過IV施用而施用於對象。在某些實施方案中，生理特徵是以下中的一種或更多種：對象的血清脂質水平、對象的HDL水平、對象的HDL:LDL比例、對象的血清甘油三酯水平和對象的肝中脂肪的量。
根據本發明的另一個方面，提供了用於在治療與ANGPTL3蛋白的存在相關的疾病或病症的方法中使用的上述dsRNA藥劑。在一些實施方案中，所述疾病或病症是以下中的一種或更多種：高脂血症、高甘油三酯血症、異常的脂質和/或膽固醇代謝、純合和雜合家族性高膽固醇血症、他汀類抗性高膽固醇血症、心臟代謝疾病、肥胖、動脈粥樣硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、由高甘油三酯血症引起的胰腺炎。
根據本發明的另一個方面，提供了用於抑制ANGPTL3蛋白表達的反義多核苷酸藥劑，所述藥劑包含10至30個連續核苷酸，其中連續核苷酸中的至少一個是經修飾核苷酸，並且其中藥劑的核苷酸序列在其全長上與SEQ ID NO: 235的核苷酸序列的等效區域具有約80%互補性。在一些實施方案中，等效區域是SEQ ID NO: 235的靶區域中的任一個，並且互補序列是表1至5之一中提供的序列。在某些實施方案中，反義多核苷酸藥劑包含表1至5之一中提供的反義序列之一。
根據本發明的另一個方面，提供了組合物，其包含任何上述反義多核苷酸藥劑的實施方案。在一些實施方案中，組合物還包含可藥用載體。在一些實施方案中，組合物還包含用於治療ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種另外的治療劑。在某些實施方案中，組合物被包裝在藥盒、容器、包裝、分配器、預填充注射器或小瓶中。在某些實施方案中，組合物被配製成用於皮下或IV施用。
根據本發明的另一個方面，提供了細胞，其包含任何上述反義多核苷酸藥劑的實施方案。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞，任選地是人細胞。
根據本發明的另一個方面，提供了抑制細胞中ANGPTL3基因的表達的方法，所述方法包括：（i）製備包含有效量的任何上述反義多核苷酸藥劑的實施方案的細胞。在一些實施方案中，所述方法還包括（ii）將（i）中製備的細胞維持足以獲得ANGPTL3基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制細胞中ANGPTL3基因的表達。
根據本發明的另一個方面，提供了抑制對象中ANGPTL3基因的表達的方法，所述方法包括向對象施用有效量的任何上述反義多核苷酸藥劑的實施方案。
根據本發明的另一個方面，治療與ANGPTL3蛋白的存在相關的疾病或病症的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明的任何上述反義多核苷酸藥劑的實施方案或任何上述組合物的實施方案，以抑制ANGPTL3基因表達。在某些實施方案中，所述疾病或病症是以下中的一種或更多種：高脂血症、高甘油三酯血症、異常的脂質和/或膽固醇代謝、純合和雜合家族性高膽固醇血症、他汀類抗性高膽固醇血症、心臟代謝疾病、肥胖、動脈粥樣硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、由高甘油三酯血症引起的胰腺炎。
根據本發明的另一個方面，提供了與對象中ANGPTL3蛋白的基線治療前水平相比降低對象中ANGPTL3蛋白水平的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明的任何上述反義多核苷酸藥劑的實施方案或任何上述組合物的實施方案，以降低ANGPTL3基因表達的水平。在某些實施方案中，將反義多核苷酸藥劑皮下或通過IV施用而施用於對象。
根據本發明的另一個方面，提供了用於抑制ANGPTL3基因表達的反義多核苷酸藥劑，所述藥劑包含10至30個連續核苷酸，其中連續核苷酸中的至少一個是經修飾核苷酸，並且其中藥劑的核苷酸序列在其全長上與SEQ ID NO: 235的核苷酸序列的等效區域具有約80%或約85%互補性。
根據本發明的另一個方面，提供了與對象中ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比，改變對象中ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵的方法，所述方法包括向對象施用有效量的本發明的任何上述反義多核苷酸藥劑的實施方案或任何上述組合物的實施方案，以改變對象中ANGPTL3疾病或病症的生理特徵。在一些實施方案中，將反義多核苷酸藥劑皮下或通過IV施用而施用於對象。在一些實施方案中，生理特徵是以下中的一種或更多種：對象的血清脂質水平、對象的HDL水平、對象的HDL:LDL比例、對象的血清甘油三酯水平和對象的肝中脂肪的量。
序列說明 SEQ ID NO: 1至117、484至514在表1中示出並且是有義鏈序列。 SEQ ID NO: 118至234、515至545在表1中示出並且是反義鏈序列。 SEQ ID NO: 235是智人（Homo sapiens）血管生成素樣3（ANGPTL3）mRNA[NCBI參考序列：NM_014495.4]： 。 SEQ ID NO: 236小家鼠（Mus musculus）血管生成素樣3（ANGPTL3），mRNA[NCBI參考序列：NM_013913.4] 。 SEQ ID NO: 237至336、546至605在表2中示出，其中化學修飾由以下表示：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；以及硫代磷酸酯：*。 SEQ ID NO: 337至390在表3中示出。遞送分子在每條有義鏈的3’末端表示爲“GLX-__”。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；以及硫代磷酸酯：*。 SEQ ID NO: 391至444、606至629在表4中示出。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*；以及Invab=反向無鹼基。 SEQ ID NO: 445至482在表5中示出。化學修飾用以下表示：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*；以及Invab=反向無鹼基。 SEQ ID NO: 483是預測的食蟹猴（Macaca fascicularis）血管生成素樣3（ANGPTL3），mRNA[NCBI參考序列：XM_005543185.2]： 。
本發明部分地包括RNAi藥劑，例如但不限於的雙鏈（ds）RNAi藥劑，其能夠抑制血管生成素樣3（ANGPTL3）基因表達。本發明部分地還包括包含ANGPTL3 RNAi藥劑的組合物和該組合物的使用方法。本文中公開的ANGPTL3 RNAi藥劑可與遞送化合物連接以用於遞送至細胞，包括遞送至肝細胞。本發明的藥物組合物可包含至少一種ds ANGPTL3藥劑和遞送化合物。在本發明的組合物和方法的一些實施方案中，遞送化合物是包含GalNAc的遞送化合物。遞送至細胞的ANGPTL3 RNAi藥劑能夠抑制ANGPTL3基因表達，從而降低該基因的ANGPTL3蛋白產物在細胞中的活性。本發明的dsRNAi藥劑可用於治療ANGPTL3相關疾病和病症。
在本發明的一些實施方案中，在細胞或對象中降低ANGPTL3表達分別在細胞或對象中治療與ANGPTL3表達相關的疾病或病症。可通過降低ANGPTL3活性來治療的疾病和病症的一些非限制性實例是：高脂血症、高甘油三酯血症、異常的脂質和/或膽固醇代謝、純合和雜合家族性高膽固醇血症、他汀類抗性高膽固醇血症、心臟代謝疾病、肥胖、動脈粥樣硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、由高甘油三酯血症引起的胰腺炎、或其中降低ANGPTL3蛋白水平和活性在醫學上有益的其他疾病。
以下描述了如何製備和使用包含ANGPTL3單鏈（ssRNA）和dsRNA藥劑的組合物來抑制ANGPTL3基因表達，以及用於治療由ANGPTL3基因表達引起或由ANGPTL3基因表達調節的疾病和病症的組合物和方法。術語“RNAi”也是本領域已知的，並且可稱爲“siRNA”。
本文中使用的術語“RNAi”是指包含RNA並通過RNA誘導的沉默複合物（RNA-induced silencing complex，RISC）途徑介導RNA轉錄物的靶向切割的藥劑。如本領域已知的，RNAi靶區域是指在基因轉錄期間形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續部分，包括爲初級轉錄產物的RNA加工產物的信使RNA（messenger RNA，mRNA）。序列的靶標部分將至少足夠長以在該部分處或該部分附近用作RNAi定向切割的底物。靶序列可以是8至30個核苷酸長（包括端點）、10至30個核苷酸長（包括端點）、12至25個核苷酸長（包括端點）、15至23個核苷酸長（包括端點）、16至23個核苷酸長（包括端點），或18至23個核苷酸長（包括端點），包括每個規定範圍內的所有較短長度。在本發明的一些實施方案中，靶序列爲9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個核苷酸長。在某些實施方案中，靶序列爲9至26個核苷酸長（包括端點），包括其間的所有子範圍和整數。例如，儘管不旨在限制，在本發明的某些實施方案中，靶序列是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長，其中該序列與ANGPTL3基因的RNA轉錄物的至少一部分完全或至少基本上互補。本發明的一些方面包括藥物組合物，其包含一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑和可藥用載體。在本發明的某些實施方案中，如本文中所述的ANGPTL3 RNAi抑制ANGPTL3蛋白的表達。
本文中使用的“dsRNA藥劑”意指包含能夠以序列特異性方式降解或抑制靶mRNA的信使RNA（mRNA）轉錄物之翻譯的RNA或RNA樣（例如，經化學修飾的RNA）寡核苷酸分子的組合物。雖然不希望受特定理論的限制，但本發明的dsRNA藥劑可通過RNA干擾機制（即，通過與哺乳動物細胞的RNA干擾途徑機制（RNA誘導的沉默複合物或RISC）相互作用來誘導RNA干擾），或通過任何替代機制或途徑發揮作用。用於使植物、無脊椎動物和脊椎動物細胞中的基因沉默的方法是本領域公知的[參見，例如，（Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485；Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363；Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309；和Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188）]，其各自的公開內容通過引用整體併入本文。]。本領域已知的基因沉默程序可與本文中提供的公開內容聯合使用以抑制ANGPTL3的表達。
本文中公開的dsRNA藥劑由有義鏈和反義鏈構成，並且包括但不限於：短干擾RNA（short interfering RNA，siRNA）、RNAi藥劑、微RNA（micro RNA，miRNA）、短髮夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）、和切丁酶底物（dicer substrate）。本文中所述的dsRNA藥劑的反義鏈與被靶向的mRNA至少部分互補。本領域理解不同長度的dsRNA雙鏈體結構可用於抑制靶基因表達。例如，已知具有19、20、21、22和23個鹼基對的雙鏈體結構的dsRNA有效誘導RNA干擾（Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）。本領域還已知較短或較長的RNA雙鏈體結構也有效誘導RNA干擾。在本發明的某些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA分別可包含長度爲最小21 nt的至少一條鏈，或者與表1至5中所示的dsRNA相比，可具有基於表1至5的任一個中所示的序列之一在一端或兩端减去1、2、3或4個核苷酸也可有效的較短雙鏈體。在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑可具有來自表1至5的一個或更多個序列的至少15、16、17、18、19、20或更多個連續核苷酸的部分序列，並且它們抑制ANGPTL3基因的表達的能力與包含完整序列的dsRNA產生的抑制水平相差不超過5、10、15、20、25或30%，所述完整序列在本文中也稱爲“親本”序列。
本發明的組合物和方法的某些實施方案在組合物中包含單鏈RNA和/或施用於對象。例如，反義鏈例如表1至5的任一個中列出的反義鏈可以是施用於對象的組合物或在施用於對象的組合物中，以降低對象中ANGPTL3多肽的活性和/或ANGPTL3基因的表達。表1至5示出了某些ANGPTL3 dsRNA藥劑反義鏈和有義鏈核心延伸鹼基序列。可包含在本發明的某些組合物中和/或在本發明的某些方法中施用的單鏈反義分子在本文中稱爲“單鏈反義藥劑”或“反義多核苷酸藥劑”。可包含在本發明的某些組合物中和/或在本發明的某些方法中施用的單鏈有義分子在本文中稱爲“單鏈有義藥劑”或“有義多核苷酸藥劑”。本文中使用的術語“鹼基序列”是指沒有化學修飾或遞送化合物的多核苷酸序列。例如，表1中示出的有義鏈 （SEQ ID NO: 2）是表3中SEQ ID NO: 337和表4中SEQ ID NO: 391的鹼基序列，其中SEQ ID NO: 337和SEQ ID NO: 391與它們的化學修飾和遞送化合物一起被示出。本文中公開的序列可被分配標識符。例如，單鏈有義序列可用“有義鏈SS#”來標識；單鏈反義序列可用“反義鏈AS#”來標識，以及包含有義鏈和反義鏈的雙鏈體可用“雙鏈體AD#/AV#”來標識。
表1包括有義鏈和反義鏈，並且提供了由表1中同一行上的有義鏈和反義鏈形成的雙鏈體的標識號。有義鏈SEQ ID NO: 69至117在第1、2、3和21位包含隨機核鹼基（n）。反義鏈SEQ ID NO: 186至234在第1、19、20和21位的位置包含隨機核鹼基（n）。在本發明的某些實施方案中，反義序列在該反義序列第1位包含核鹼基u或核鹼基a。在本發明的某些實施方案中，反義序列在該反義序列第1位包含核鹼基u。在表1中示出的序列中，“n”可以是核鹼基a、u、c、g和t中的任一種，並且可針對有義鏈和反義鏈獨立地選擇。如在有義鏈和反義鏈中的“n”的上下文中使用的，應理解，選擇並包含在有義鏈中的位置中的核鹼基“n”與該有義鏈配對的反義鏈中的“n”是不同的核鹼基，但通常與相反鏈中匹配位置處的核鹼基“n”互補。本文中使用的術語有義鏈和反義鏈中的“匹配位置”是當兩條鏈是雙鏈體的鏈時在每條鏈中“配對”的位置。例如，在21個核鹼基有義鏈和21個核鹼基反義鏈中，該有義鏈第1位的核鹼基和該反義鏈中第21位的核鹼基處於“匹配位置”。在另一個非限制性實例中，在23個核鹼基有義鏈和23個核鹼基反義鏈中，該有義鏈的核鹼基2和該反義鏈第22位的核鹼基處於匹配位置。在另一個非限制性實例中，在18個核鹼基有義鏈和18個核鹼基反義鏈中，該有義鏈第1位的核鹼基和該反義鏈中的核鹼基18處於匹配位置，並且該有義鏈中的核鹼基4和該反義鏈中的核鹼基15處於匹配位置。本領域技術人員將理解如何識別是或將是雙鏈體的鏈和配對的鏈的有義鏈和反義鏈中的匹配位置。
雖然（n）可以是a、u、c、g或t中的任一種，但有義鏈第1位的“n”通常與反義鏈第21位的（n）互補。在兩個非限制性實例中，（1）如果有義鏈第1位是“g”，則反義鏈第21位是“c”；以及（2）如果有義鏈第1位是“a”，則反義鏈第21位是“u”或“t”。這種類型的互補匹配配對適用於有義鏈第2位和反義鏈第20位的（n）；有義鏈第21位和反義鏈第1位的（n）。應理解，雖然n可以是這些位置上的任何核苷酸，但有義鏈和反義鏈的核苷酸通常仍是互補的（匹配），然而，在某些實施方案中，它們可具有錯配。例如，雖然不旨在進行限制，但在一些實施方案中，“n”可以是“隨機的”，意指可以但不必須是互補的。在某些實施方案中，“n”是互補的。作爲一個非限制性實例，反義鏈第1位的“n”是“u”，並且有義鏈第21位的“n”是“a”。
表1中的最後一列表示包含同一表行中的有義序列和反義序列的雙鏈體的雙鏈體AD#/AV#。例如，表1公開了被分配雙鏈體AD# AD00007的雙鏈體，其包含有義鏈SEQ ID NO: 6和反義鏈SEQ ID NO: 123。因此，表1中的每一行標識了本發明的雙鏈體，其各自包含同一行中示出的有義序列和反義序列，其中針對各雙鏈體分配的標識符在該行的最後一列中示出。
在本發明的方法的一些實施方案中，將包含表1中示出的多核苷酸序列的RNAi藥劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，施用於對象的RNAi藥劑包含是包含表1中所示的鹼基序列中的至少一個的雙鏈體，其包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個序列修飾。在本發明的方法的一些實施方案中，將包含表1中示出的多核苷酸序列的RNAi藥劑與遞送分子連接，所述遞送分子的一個非限制性實例是包含GalNAc化合物的遞送化合物。 表1：未經修飾的ANGPTL3 RNAi藥劑反義鏈和有義鏈序列。所有序列均顯示爲5’至3’方向。雙鏈體AD#和AV#是分配至表中同一行中兩條鏈的雙鏈體的編號。
有義鏈 SEQ ID NO 反義鏈 SEQ ID NO 雙鏈體 AD#/AV#
guuaaagacuuuguccauaaa 1 uuuauggacaaagucuuuaac 118 AD00001
gaaagacuuuguccauaagaa 2 uucuuauggacaaagucuuuc 119 AD00002
gaaugacauauuucaaaaaca 3 uguuuuugaaauaugucauuc 120 AD00004
gaaacucaacauauuugauca 4 ugaucaaauauguugaguuuc 121 AD00005
gaacucaacauauuugaucaa 5 uugaucaaauauguugaguuc 122 AD00006
guugaucagucuuuuuaugaa 6 uucauaaaaagacugaucaac 123 AD00007
ggaucagucuuuuuaugauca 7 ugaucauaaaaagacugaucc 124 AD00008
gaagaacuacauauaaacuaa 8 uuaguuuauauguaguucuuc 125 AD00009
gcuacauauaaacuacaagua 9 uacuuguaguuuauauguagc 126 AD00010
gaagagguaaagaauauguca 10 ugacauauucuuuaccucuuc 127 AD00011
gagguaaagaauaugucacua 11 uagugacauauucuuuaccuc 128 AD00012
guaugucacuugaacucaaca 12 uguugaguucaagugacauac 129 AD00013
gacucaaaacuugaaagccua 13 uaggcuuucaaguuuugaguc 130 AD00014
gaacuugaaagccuccuagaa 14 uucuaggaggcuuucaaguuc 131 AD00015
ggaaaaaauucuacuucaaca 15 uguugaaguagaauuuuuucc 132 AD00016
ggaagagcaacuaacuaacua 16 uaguuaguuaguugcucuucc 133 AD00017
guucaagaacccacagaaaua 17 uauuucuguggguucuugaac 134 AD00018
gucaagaacccacagaaauua 18 uaauuucuguggguucuugac 135 AD00019
gucucuaucuuccaagccaaa 19 uuuggcuuggaagauagagac 136 AD00020
gcaagaacuacucccuuucua 20 uagaaagggaguaguucuugc 137 AD00021
gcaacucucaaguuuuucaua 21 uaugaaaaacuugagaguugc 138 AD00022
gacucucaaguuuuucaugua 22 uacaugaaaaacuugagaguc 139 AD00023
gcucucaaguuuuucauguca 23 ugacaugaaaaacuugagagc 140 AD00024
gcucaaguuuuucaugucuaa 24 uuagacaugaaaaacuugagc 141 AD00025
gucaaguuuuucaugucuaca 25 uguagacaugaaaaacuugac 142 AD00026
guuuucaugucuacugugaua 26 uaucacaguagacaugaaaac 143 AD00027
gucaugucuacugugauguua 27 uaacaucacaguagacaugac 144 AD00028
guggacauuaauucaacauca 28 ugauguugaauuaauguccac 145 AD00029
gaacaucgaauagauggauca 29 ugauccaucuauucgauguuc 146 AD00030
ggaauagauggaucacaaaaa 30 uuuuugugauccaucuauucc 147 AD00031
gauagauggaucacaaaacua 31 uaguuuugugauccaucuauc 148 AD00032
guggaucacaaaacuucaaua 32 uauugaaguuuugugauccac 149 AD00033
gcaaaacuucaaugaaacgua 33 uacguuucauugaaguuuugc 150 AD00034
ggggagaacuacaaauaugga 34 uccauauuuguaguucucccc 151 AD00035
gagagaagauauacuccauaa 35 uuauggaguauaucuucucuc 152 AD00036
ggagaagauauacuccauaga 36 ucuauggaguauaucuucucc 153 AD00037
gagauauacuccauagugaaa 37 uuucacuauggaguauaucuc 154 AD00038
gucuuuuuacuugggaaauca 38 ugauuucccaaguaaaaagac 155 AD00039
gaugaugaguguggagaaaaa 39 uuuuucuccacacucaucauc 156 AD00040
ggaaaacaaccuaaaugguaa 40 uuaccauuuagguuguuuucc 157 AD00041
gaauggaagguuauacucuaa 41 uuagaguauaaccuuccauuc 158 AD00042
ggguuauacucuauaaaauca 42 ugauuuuauagaguauaaccc 159 AD00043
gucacaaaacuucaaugaaaa 43 uuuucauugaaguuuugugac 160 AD00044
gcuugaaagccuccuagaaga 44 ucuucuaggaggcuuucaagc 161 AD00045
gugaacucaacucaaaacuua 45 uaaguuuugaguugaguucac 162 AD00046
gggacauuaauucaacaucga 46 ucgauguugaauuaauguccc 163 AD00047
ggacauuaauucaacaucgaa 47 uucgauguugaauuaaugucc 164 AD00048
guaauucaacaucgaauagaa 48 uucuauucgauguugaauuac 165 AD00049
gaagggccaaauuaaugacaa 49 uugucauuaauuuggcccuuc 166 AD00050
aagggccaaauuaaugacaua 50 uaugucauuaauuuggcccuu 167 AD00132
gaaagauuuuguccauaagaa 51 uucuuauggacaaaaucuuuc 168 AD00178
gcaaaaucaagauuugcuaua 52 uauagcaaaucuugauuuugc 169 AD00179
guuaaagauuuuguccauaaa 53 uuuauggacaaaaucuuuaac 170 AD00180
gaaaccaacuacacgcuacaa 54 uuguagcguguaguugguuuc 171 AD00181
gaagcucaacauauuugauca 55 ugaucaaauauguugagcuuc 172 AD00182
gagcucaacauauuugaucaa 56 uugaucaaauauguugagcuc 173 AD00183
guauuugaucagucuuuuuaa 57 uuaaaaagacugaucaaauac 174 AD00184
gcacccagaaguaacaucaca 58 ugugauguuacuucugggugc 175 AD00185
guaaagauuuuguccauaaga 59 ucuuauggacaaaaucuuuac 176 AD00186
gcaguccauggacauuaauua 60 uaauuaauguccauggacugc 177 AD00187
gaaagacuuuguccauaagaa 61 uucuuauggacaaagucuuuc 178 AD00102
cuuaaagacuuuguccauaaa 62 uuuauggacaaagucuuuaag 179 AD00180-1
gaaaccaacuauacgcuacaa 63 uuguagcguauaguugguuuc 180 AD00181-1
gaaacucaacauauuugauca 64 ugaucaaauauguugaguuuc 181 AD00103
gaacucaacauauuugaucaa 65 uugaucaaauauguugaguuc 182 AD00183-1
acacccagaaguaacuucaca 66 ugugaaguuacuucugggugu 183 AD00185-1
guaaagacuuuguccauaaga 67 ucuuauggacaaagucuuuac 184 AD00186-1
guaguccauggacauuaauua 68 uaauuaauguccauggacuac 185 AD00187-1
nnnaaagacuuuguccauaan 69 nuuauggacaaagucuuunnn 186 AD00001-1
nnnagacuuuguccauaagan 70 nucuuauggacaaagucunnn 187 AD00002-1
nnnugacauauuucaaaaacn 71 nguuuuugaaauaugucannn 188 AD00004-1
nnnacucaacauauuugaucn 72 ngaucaaauauguugagunnn 189 AD00005-1
nnncucaacauauuugaucan 73 nugaucaaauauguugagnnn 190 AD00006-1
nnngaucagucuuuuuaugan 74 nucauaaaaagacugaucnnn 191 AD00007-1
nnnucagucuuuuuaugaucn 75 ngaucauaaaaagacugannn 192 AD00008-1
nnngaacuacauauaaacuan 76 nuaguuuauauguaguucnnn 193 AD00009-1
nnnacauauaaacuacaagun 77 nacuuguaguuuauaugunnn 194 AD00010-1
nnngagguaaagaauaugucn 78 ngacauauucuuuaccucnnn 195 AD00011-1
nnnguaaagaauaugucacun 79 nagugacauauucuuuacnnn 196 AD00012-1
nnnugucacuugaacucaacn 80 nguugaguucaagugacannn 197 AD00013-1
nnnucaaaacuugaaagccun 81 naggcuuucaaguuuugannn 198 AD00014-1
nnncuugaaagccuccuagan 82 nucuaggaggcuuucaagnnn 199 AD00015-1
nnnaaaaauucuacuucaacn 83 nguugaaguagaauuuuunnn 200 AD00016-1
nnnagagcaacuaacuaacun 84 naguuaguuaguugcucunnn 201 AD00017-1
nnncaagaacccacagaaaun 85 nauuucuguggguucuugnnn 202 AD00018-1
nnnaagaacccacagaaauun 86 naauuucuguggguucuunnn 203 AD00019-1
nnnucuaucuuccaagccaan 87 nuuggcuuggaagauagannn 204 AD00020-1
nnnagaacuacucccuuucun 88 nagaaagggaguaguucunnn 205 AD00021-1
nnnacucucaaguuuuucaun 89 naugaaaaacuugagagunnn 206 AD00022-1
nnnucucaaguuuuucaugun 90 nacaugaaaaacuugagannn 207 AD00023-1
nnncucaaguuuuucaugucn 91 ngacaugaaaaacuugagnnn 208 AD00024-1
nnncaaguuuuucaugucuan 92 nuagacaugaaaaacuugnnn 209 AD00025-1
nnnaaguuuuucaugucuacn 93 nguagacaugaaaaacuunnn 210 AD00026-1
nnnuucaugucuacugugaun 94 naucacaguagacaugaannn 211 AD00027-1
nnnaugucuacugugauguun 95 naacaucacaguagacaunnn 212 AD00028-1
nnngacauuaauucaacaucn 96 ngauguugaauuaaugucnnn 213 AD00029-1
nnncaucgaauagauggaucn 97 ngauccaucuauucgaugnnn 214 AD00030-1
nnnauagauggaucacaaaan 98 nuuuugugauccaucuaunnn 215 AD00031-1
nnnagauggaucacaaaacun 99 naguuuugugauccaucunnn 216 AD00032-1
nnngaucacaaaacuucaaun 100 nauugaaguuuugugaucnnn 217 AD00033-1
nnnaaacuucaaugaaacgun 101 nacguuucauugaaguuunnn 218 AD00034-1
nnngagaacuacaaauauggn 102 nccauauuuguaguucucnnn 219 AD00035-1
nnnagaagauauacuccauan 103 nuauggaguauaucuucunnn 220 AD00036-1
nnngaagauauacuccauagn 104 ncuauggaguauaucuucnnn 221 AD00037-1
nnnauauacuccauagugaan 105 nuucacuauggaguauaunnn 222 AD00038-1
nnnuuuuuacuugggaaaucn 106 ngauuucccaaguaaaaannn 223 AD00039-1
nnngaugaguguggagaaaan 107 nuuuucuccacacucaucnnn 224 AD00040-1
nnnaaacaaccuaaaugguan 108 nuaccauuuagguuguuunnn 225 AD00041-1
nnnuggaagguuauacucuan 109 nuagaguauaaccuuccannn 226 AD00042-1
nnnuuauacucuauaaaaucn 110 ngauuuuauagaguauaannn 227 AD00043-1
nnnacaaaacuucaaugaaan 111 nuuucauugaaguuuugunnn 228 AD00044-1
nnnugaaagccuccuagaagn 112 ncuucuaggaggcuuucannn 229 AD00045-1
nnnaacucaacucaaaacuun 113 naaguuuugaguugaguunnn 230 AD00046-1
nnnacauuaauucaacaucgn 114 ncgauguugaauuaaugunnn 231 AD00047-1
nnncauuaauucaacaucgan 115 nucgauguugaauuaaugnnn 232 AD00048-1
nnnauucaacaucgaauagan 116 nucuauucgauguugaaunnn 233 AD00049-1
nnngggccaaauuaaugacan 117 nugucauuaauuuggcccnnn 234 AD00050-1
gaauggaagguuauacucuau 484 auagaguauaaccuuccauuc 515 AV01087
gaauggaagguuauacucuac 485 guagaguauaaccuuccauuc 516 AV01088
gaauggaagguuauacucuag 486 cuagaguauaaccuuccauuc 517 AV01089
ggaagguuauacucuaa 487 uuagaguauaaccuucc 518 AV01090
uggaagguuauacucua 488 uagaguauaaccuucca 519 AV01320
uggaagguuauacucuaa 489 uuagaguauaaccuucca 520 AV01091
auggaagguuauacucuaa 490 uuagaguauaaccuuccau 521 AV01092
uuggaagguuauacucuaa 491 uuagaguauaaccuuccaa 522 AV01093
guggaagguuauacucuaa 492 uuagaguauaaccuuccac 523 AV01094
cuggaagguuauacucuaa 493 uuagaguauaaccuuccag 524 AV01095
aauggaagguuauacucuaa 494 uuagaguauaaccuuccauu 525 AV01096
uauggaagguuauacucuaa 495 uuagaguauaaccuuccaua 526 AV01097
gauggaagguuauacucuaa 496 uuagaguauaaccuuccauc 527 AV01098
cauggaagguuauacucuaa 497 uuagaguauaaccuuccaug 528 AV01099
caauggaagguuauacucuaa 498 uuagaguauaaccuuccauug 529 AV01100
aaauggaagguuauacucuaa 499 uuagaguauaaccuuccauuu 530 AV01101
uaauggaagguuauacucuaa 500 uuagaguauaaccuuccauua 531 AV01102
aaaauggaagguuauacucuaa 501 uuagaguauaaccuuccauuuu 532 AV01103
caaaauggaagguuauacucuaa 502 uuagaguauaaccuuccauuuug 533 AV01104
ucaaaauggaagguuauacucuaa 503 uuagaguauaaccuuccauuuuga 534 AV01105
cucaaaauggaagguuauacucuaa 504 uuagaguauaaccuuccauuuugag 535 AV01106
ucucaaaauggaagguuauacucuaa 505 uuagaguauaaccuuccauuuugaga 536 AV01107
uggaagucucaaaauggaagguuauacucuaa 506 uuagaguauaaccuuccauuuugagacuucca 537 AV01108
gaauggaagguuauacucuaa 507 uuagaguauaaccuuccauucuu 538 AV01109
gaauggaagguuauacucuaa 508 uuagaguauaaccuuccauucga 539 AV01110
gaauggaagguuauacucuaa 509 uuagaguauaaccuuccauuc 540 AV01111
gaauggaagguuauacucuaa 510 uuagaguauaaccuuccauuc 541 AV01112
gaauggaagguuauacucuaa 511 uuagaguauaaccuuccauuc 542 AV01113
gaauggaagguuauauucuaa 512 uuagaguauaaccuuccauuc 543 AV01114
gaauggaagguuauacucuga 513 ucagaguauaaccuuccauuc 544 AV01115
gaauggaagguuauacucuaa 514 uuagaguauaaccuuccauuc 545 AV01116
表2示出了某些經化學修飾的本發明的ANGPTL3 RNAi藥劑反義鏈序列和有義鏈序列。在本發明的方法的一些實施方案中，將具有表2中示出的多核苷酸序列的RNAi藥劑施用於細胞和/或對象。在本發明的方法的一些實施方案中，將具有表2中示出的多核苷酸序列的RNAi藥劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，施用於對象的RNAi藥劑包含是在表2的行中第一列標識的雙鏈體，並且包含分別在表2的同一行中第三列和第六列中的有義鏈序列和反義鏈序列中顯示的序列修飾。在本發明的方法的一些實施方案中，表2中示出的序列可與能夠將RNAi藥劑遞送至對象中的細胞和/或組織的化合物連接（在本文中也稱爲“與……綴合”）。可在本發明的某些實施方案中使用的遞送化合物的一個非限制性實例是包含GalNAc的化合物。在表2中，第一列表示如表1中示出的鹼基序列的雙鏈體AD#/AV#。雙鏈體AD#/AV#標識了鹼基序列，並且顯示的有義鏈和反義鏈包含鹼基序列但具有表2的同一行中示出的指示的化學修飾。例如，表1示出了鹼基單鏈序列SEQ ID NO: 1（有義）和SEQ ID NO: 118（反義），其一起是標識爲雙鏈體AD# AD00001的雙鏈體，並且表2列出了雙鏈體AD# AD00001，其表示SEQ ID NO: 237和SEQ ID NO: 287的雙鏈體分別包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 118的鹼基序列，但具有分別在第三列和第六列中示出的有義序列和反義序列中顯示的化學修飾。表2第二列中的“有義鏈SS#”是針對同一行中第3列示出的有義序列（包含修飾）分配的標識符。表2第五列中的“反義鏈AS#”是針對第六列中示出的反義序列（包含修飾）分配的標識符。 表2：提供了經化學修飾的ANGPTL3 RNAi藥劑反義鏈和有義鏈序列。所有序列均顯示爲5’至3’。這些序列用於本文中所述的某些體外測試研究。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*
表3示出了某些經化學修飾的本發明的ANGPTL3 RNAi藥劑反義鏈序列和有義鏈序列。在本發明的方法的一些實施方案中，將表3中示出的RNAi藥劑施用於細胞和/或對象。在本發明的方法的一些實施方案中，將具有表3中示出的多核苷酸序列的RNAi藥劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，施用於對象的RNAi藥劑包含是在表3的行中第一列標識的雙鏈體，並且包含分別在表3的同一行中第三列和第六列中的有義鏈序列和反義鏈序列中顯示的序列修飾和/或遞送化合物。這些序列用於本文中別處所述的某些體內測試研究。在本發明的方法的一些實施方案中，表3中示出的序列可與用於遞送的化合物連接（在本文中也稱爲“與……綴合”），所述用於遞送的化合物的一個非限制性實例是包含GalNAc的化合物，其中遞送化合物在表3中在第三列的有義鏈上標識爲“GLX-n”。如本文中所用和表3中所示，“GLX-n”用於表示所連接的包含GalNAc的化合物是以下化合物中的任一種： ， 其各自的結構在本文中別處提供。表3的第一列提供了分配至該表的行中的有義序列和反義序列的雙鏈體的雙鏈體AD#。例如，雙鏈體AD# AD00102是有義鏈SEQ ID NO: 337和反義鏈SEQ ID NO: 364的雙鏈體。表3中的每一行提供了有義鏈和反義鏈，並且公開了示出的有義鏈和反義鏈的雙鏈體。表3第二列中的“有義鏈SS#”是針對同一行中第3列示出的有義序列（包含修飾）分配的標識符。表3第五列中的“反義鏈AS#”是針對第六列中示出的反義序列（包含修飾）分配的標識符。某些所連接的包含GalNAc的GLO化合物的標識符顯示爲GLO-0，並且應理解，另一種GLO-n或GLS-n化合物可替換爲GLO-0所示的化合物，其中所得化合物包括在本發明的方法和/或組合物的實施方案中。 表3提供了經化學修飾的ANGPTL3 RNAi藥劑反義鏈和有義鏈序列。所有序列均顯示爲5’至3’。這些序列用於本文中別處所述的某些體內測試研究。體內研究中使用的遞送分子在每條有義鏈的3’末端表示爲“GLO-0”。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*
表4示出了某些經化學修飾的本發明的ANGPTL3 RNAi藥劑反義鏈序列和有義鏈序列。在本發明的方法的一些實施方案中，將具有表4中示出的多核苷酸序列的RNAi藥劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，施用於對象的RNAi藥劑包含是在表4的行中第一列標識的雙鏈體，並且包含分別在表4的同一行中第三列和第六列中的有義鏈序列和反義鏈序列中顯示的序列修飾和/或遞送化合物。在本發明的方法的一些實施方案中，表4中示出的序列可連接與能夠將RNAi藥劑遞送至對象中的細胞和/或組織的化合物。可在本發明的某些實施方案中使用的遞送化合物的一個非限制性實例是包含GalNAc的化合物。在表4中，術語“GLX-n”表示如示出的有義鏈中包含GalNAc的化合物。在表4中，GLX-n用於表示所連接的包含GalNAc的化合物是以下化合物中的任一種： ， 其各自的結構在本文中別處提供。表4的第一列雙鏈體AD#表示對應於表3中示出的雙鏈體。雙鏈體AD#標識了表3的雙鏈體序列，其表示表4中的有義序列、反義序列和雙鏈體序列與具有表3中的相同雙鏈體AD#的那些具有相同的鹼基序列，但表4中的序列和雙鏈體與表3中示出的相應序列和雙鏈體相比具有不同的化學修飾和/或遞送化合物。例如，表3中示出的SEQ ID NO: 337（有義）、SEQ ID NO: 364（反義）、以及它們的雙鏈體如雙鏈體AD# AD00102分別與如表4中示出的SEQ ID NO: 391、SEQ ID NO: 418和AD# AD00102-1具有相同的鹼基序列，其中化學修飾和/或遞送化合物如各表中所示。 表4 經化學修飾的ANGPTL3 RNAi藥劑反義鏈和有義鏈序列。序列用於本文中別處所述的某些體內研究。所有序列均顯示爲5’至3’。化學修飾表示爲：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*；Invab=反向無鹼基。
表5示出了某些經化學修飾的本發明的ANGPTL3 RNAi藥劑反義鏈序列和有義鏈序列。在本發明的方法的一些實施方案中，將具有表5中示出的多核苷酸序列的RNAi藥劑施用於對象。在本發明的一些實施方案中，施用於對象的RNAi藥劑包含是在表5的行中第一列標識的雙鏈體，並且包含分別在表5的同一行中第三列和第六列中的有義鏈序列和反義鏈序列中顯示的序列修飾和/或遞送化合物。在本發明的方法的一些實施方案中，表5中示出的序列可連接與能夠將RNAi藥劑遞送至對象中的細胞和/或組織的化合物。可在本發明的某些實施方案中使用的遞送化合物的一個非限制性實例是包含GalNAc的化合物。在表5中，術語“GLO-0”和“GLS-5”各自表示與如示出的有義鏈連接的不同的包含GalNAc的化合物。應理解，另一種GLO-n或GLS-n化合物可替換爲GLO-0所示的化合物，其中所得化合物包括在本發明的方法和/或組合物的實施方案中。類似地，另一種GLS-n或GLO-n化合物可替換顯示爲GLS-5的化合物，其中所得化合物包括在本發明的方法和/或組合物的實施方案中。應理解，本發明的某些實施方案包括本發明的RNAi藥劑，其具有表5中示出的序列，但與以下包含GalNAc的化合物中的任一種連接： ， 其各自的結構在本文中別處提供。表5的第一列標識了雙鏈體AD#編號：AD00178至AD# AD00187，其中各行中的編號標識了雙鏈體，其包含分別在同一行的第三列和第六列中示出的有義鏈和反義鏈，並且包含修飾並且具有在有義鏈上連接的3’ GLO或GLS遞送化合物。雙鏈體AD# AD00178至AD00187與小鼠ANGPTL3 mRNA序列完全互補，但與人ANGPTL3 mRNA序列有0或1個錯配。
表5的第一列標識了雙鏈體AD#編號：AD00179-1、AD00180-1、AD00181-1、AD00103-1、AD00183-1、AD00184-1、AD00185-1、AD00186-1和AD00187-1，其中各行中的編號標識了雙鏈體，其包含分別在同一行的第三列和第六列中示出的有義鏈和反義鏈，並且包含修飾並且具有在有義鏈上連接的5’或3’ GLS-n或GLO-n遞送化合物。修飾用以下表示：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*；Invab=反向無鹼基。雙鏈體AD00179-1、AD00180-1、AD00181-1、AD00103-1、AD00183-1、AD00184-1、AD00185-1、AD00186-1和AD00187-1與人ANGPTL3 mRNA序列完全互補，但與小鼠ANGPTL3 mRNA序列有0或1個錯配。 表5提供了經化學修飾的ANGPTL3 RNAi藥劑反義鏈和有義鏈序列。這些序列用於本文中別處所述的一些體內研究。所有序列均顯示爲5’至3’。修飾用以下表示：大寫字母：2’-氟；小寫字母：2’-OMe；硫代磷酸酯：*；Invab=反向無鹼基 錯配
本領域技術人員已知，針對dsRNA中的效力，錯配是可耐受的，尤其是在dsRNA的末端區域內的錯配。某些錯配的耐受性更好，例如針對效力，具有擺動鹼基對G:U和A:C的錯配的耐受性更好（Du et el., A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites. Nucleic Acids Res. 2005 Mar 21;33(5):1671-7. Doi: 10.1093/nar/gki312. Nucleic Acids Res. 2005;33(11):3698）。本發明的方法和化合物的一些實施方案，ANGPTL3 dsRNA藥劑可包含與ANGPTL3靶序列的一個或更多個錯配。在一些實施方案中，本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑不包含錯配。在某些實施方案中，本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑包含不超過1個錯配。在一些實施方案中，本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑包含不超過2個錯配。在某些實施方案中，本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑包含不超過3個錯配。在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑的反義鏈包含與ANGPTL3靶序列的錯配，其不位於互補區中心。在一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑的反義鏈包含1、2、3、4或更多個錯配，其在來自互補區的5’或3’末端之一或二者的最後5、4、3、2或1個核苷酸內。本文中所述的方法和/或本領域已知的方法可用於確定包含與ANGPTL3靶序列的錯配的ANGPTL3 dsRNA藥劑是否有效抑制ANGPTL3基因的表達。 互補性
除非另有說明，否則本文中使用的術語“互補”在用於描述與第二核苷酸序列（例如，ANGPTL3 dsRNA藥劑反義鏈或單鏈反義多核苷酸）相關的第一核苷酸序列（例如，ANGPTL3 dsRNA藥劑有義鏈或靶向ANGPTL3 mRNA）時，意指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交[在哺乳動物生理條件（或類似的體外條件）下形成鹼基對氫鍵]並在某些條件下形成雙鏈體或雙螺旋結構的能力。其他條件也可適用，例如可在生物體內遇到的生理相關條件。本領域技術人員將能夠根據雜交核苷酸的最終應用來確定最適合於測試兩個序列的互補性的一組條件。至少在滿足上述雜交要求的程度上，互補序列包含沃森-克裏克（Watson-Crick）鹼基對或非沃森-克裏克鹼基對，並且包含天然或經修飾核苷酸或核苷酸模擬物。序列同一性或互補性與修飾無關。
互補序列，例如在如本文中所述的ANGPTL3 dsRNA內的互補序列，其包含在一個或兩個核苷酸序列的全長上包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的鹼基配對。這樣的序列在本文中可被稱爲相對於彼此“完全互補”。應理解，在一些實施方案中，當兩個寡核苷酸被設計成在雜交之後形成一個或更多個單鏈突出端時，這樣的突出端在本文中不被認爲是關於確定的互補性的錯配。例如，ANGPTL3 dsRNA藥劑包含一個長度爲19個核苷酸的寡核苷酸和另一個長度爲20個核苷酸的寡核苷酸，其中較長的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補的19個核苷酸的序列，出於本文中所述的目的，其也可被稱爲“完全互補”。因此，本文中使用的“完全互補”意指第一多核苷酸的連續序列中的所有（100%）鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中相同數目的鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
本文中使用的術語“基本上互補”意指在雜交的核鹼基序列對中，第一多核苷酸的連續序列中至少約85%但不是全部的鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中的相同數目的鹼基雜交。術語“基本上互補”可用於提及第一序列相對於第二序列，如果這兩個序列在雜交成多至15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個鹼基對（bp）的雙鏈體時包含一個或更多個（例如至少1、2、3、4或5個）錯配鹼基對，則同時保留在與它們的最終應用（例如，通過RISC途徑抑制ANGPTL3基因表達）最相關的條件下雜交的能力。術語“部分互補”在本文中可用於提及核鹼基序列的雜交對，其中第一多核苷酸的連續序列中的至少75%但不是全部的鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中的相同數目的鹼基雜交。在一些實施方案中，“部分互補”意指第一多核苷酸的連續序列中的至少76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中的相同數目的鹼基雜交。
術語“互補”、“完全互補”、“基本上互補”和“部分互補”在本文中用於提及ANGPTL3 dsRNA藥劑的有義鏈與反義鏈之間、ANGPTL3 dsRNA藥劑的反義鏈與靶ANGPTL3 mRNA的序列之間、或在單鏈反義寡核苷酸與靶ANGPTL3 mRNA的序列之間的鹼基匹配。應理解，術語“ANGPTL3 dsRNA藥劑的反義鏈”可以指“ANGPTL3反義多核苷酸藥劑”的相同序列。
本文中使用的提及核酸序列時使用的術語“基本上相同”或“基本同一性”意指包含與參考序列相比具有至少約85%序列同一性或更多，優選至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的序列的核酸序列。序列同一性的百分比是通過在比較窗口中比較兩個最佳比對的序列來確定的。百分比通過以下來計算：確定兩個序列中出現相同核酸鹼基的位置的數目以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗口中位置的總數目，並將結果乘以100，以得到序列同一性的百分比。本文中公開的發明涵蓋與本文中（例如，表1至5中）公開的那些基本上相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，本文中公開的序列與本文中（例如，表1至5中）公開的那些完全相同，或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
本文中使用的術語“包含序列的鏈”意指包含核苷酸鏈的寡核苷酸，其由使用標準核苷酸命名法提及的序列描述。本文中使用的術語“雙鏈RNA”或“dsRNA”是指包含RNA分子或分子複合物的RNAi，所述RNA分子或分子複合物具有包含兩條反平行且基本上或完全互補的核酸鏈的雜交雙鏈體區，其被稱爲相對於靶ANGPTL3 RNA具有“有義”和“反義”取向。雙鏈體區可以是允許通過RISC途徑特異性降解所期望的靶ANGPTL3 RNA的任何長度，但長度通常爲9至30個鹼基對，例如長度爲15至30個鹼基對。考慮到9至30個鹼基對之間的雙鏈體，該雙鏈體可以是該範圍內的任何長度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，以及其之間的任何子範圍，包括但不限於15至30個鹼基對、15至26個鹼基對、15至23個鹼基對、15至22個鹼基對、15至21個鹼基對、15至20個鹼基對、15至19個鹼基對、15至18個鹼基對、15至17個鹼基對、18至30個鹼基對、18至26個鹼基對、18至23個鹼基對、18至22個鹼基對、18至21個鹼基對、18至20個鹼基對、19至30個鹼基對、19至26個鹼基對、19至23個鹼基對、19至22個鹼基對、19至21個鹼基對、19至20個鹼基對、20至30個鹼基對、20至26個鹼基對、20至25個鹼基對、20至24個鹼基對、20至23個鹼基對、20至22個鹼基對、20至21個鹼基對、21至30個鹼基對、21至26個鹼基對、21至25個鹼基對、21至24個鹼基對、21至23個鹼基對、或21至22個鹼基對。通過用切丁酶和類似酶處理而在細胞中產生的ANGPTL3 dsRNA藥劑的長度通常爲19至22個鹼基對。ANGPTL3 dsDNA藥劑的雙鏈體區的一條鏈包含與靶ANGPTL3 RNA的區域基本上互補的序列。形成雙鏈體結構的兩條鏈可來自具有至少一個自身互補區的單個RNA分子，或者可由兩個或更多個單獨的RNA分子形成。當雙鏈體區由單個分子的兩條鏈形成時，該分子可具有由形成雙鏈體結構的一條鏈的3’末端與相應另一條鏈的5’末端之間的單鏈核苷酸鏈（本文中稱爲“髮夾環”）分離的雙鏈體區。在本發明的一些實施方案中，髮夾環包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個未配對的核苷酸。當ANGPTL3 dsRNA藥劑的兩條基本上互補的鏈由單獨的RNA分子構成時，那些分子不需要但可以共價連接。當兩條鏈通過除了髮夾環之外的方式共價連接時，連接結構被稱爲“接頭”。術語“siRNA”在本文中還用於指如本文中所述的dsRNA藥劑。
在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑可包含在dsRNA藥劑的一個或兩個末端具有沒有未配對的核苷酸或核苷酸類似物的有義序列和反義序列。沒有未配對核苷酸的末端被稱爲“平末端”並且沒有核苷酸突出端。如果dsRNA藥劑的兩端均是平末端，則dsRNA被稱爲“平末端的”。在本發明的一些實施方案中，dsRNA藥劑的第一末端是平末端，在一些實施方案中，dsRNA藥劑的第二末端是平末端，並且在本發明的某些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑的兩端均是平末端。
在本發明的dsRNA藥劑的一些實施方案中，dsRNA不具有一個或兩個平末端。在這樣的情况下，在dsRNA藥劑的鏈的末端有至少一個未配對核苷酸。例如，當dsRNA的一條鏈的3’末端延伸超出另一條鏈的5’末端時，或反之亦然，則存在核苷酸突出端。dsRNA可包含具有至少1、2、3、4、5、6或更多個核苷酸的突出端。核苷酸突出端可包含以下或由以下組成：核苷酸/核苷類似物，包括脫氧核苷酸/核苷。應理解，在一些實施方案中，核苷酸突出端在dsRNA藥劑的有義鏈上、在dsRNA藥劑的反義鏈上、或在dsRNA藥劑的兩端，並且突出端的核苷酸可存在於dsRNA的反義鏈或有義鏈的5’末端、3’末端或兩端。在本發明的某些實施方案中，突出端中的一個或更多個核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
本文中使用的術語“反義鏈”或“引導鏈”是指包含與ANGPTL3靶序列基本上互補的區域的ANGPTL3 dsRNA藥劑的鏈。本文中使用的術語“有義鏈”或“隨從鏈”是指包含與ANGPTL3 dsRNA藥劑的反義鏈的區域基本上互補之區域的ANGPTL3 dsRNA藥劑的鏈。 修飾
在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 RNAi藥劑的RNA被化學修飾以增强穩定性和/或一種或更多種其他有益特徵。在本發明的某些實施方案中，核酸可通過本領域已充分建立的方法來合成和/或修飾，例如，在“Current protocols in Nucleic Acid Chemistry," Beaucage, S. L. et al. (編輯), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA中描述的那些，其通過引用併入本文。可存在於本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑的某些實施方案中的修飾包括，例如：（a）末端修飾，例如，5’末端修飾（磷酸化、綴合、反向連接等）、3’末端修飾（綴合、DNA核苷酸、反向連接等）；（b）鹼基修飾，例如，用穩定鹼基、去穩定鹼基或具有擴展的夥伴庫（repertoire of partners）的鹼基對的鹼基替代，移除鹼基（無鹼基核苷酸）或者綴合的鹼基；（c）糖修飾（例如，在第2’位或第4’位）或替代糖；以及（d）骨架修飾，包括修飾或替代磷酸二酯鍵聯。在本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和ANGPTL3有義多核苷酸的某些實施方案中可用的RNA化合物的一些具體實例包括但不限於包含經修飾骨架或非天然核苷間鍵聯的RNA。作爲一個非限制性實例，具有經修飾骨架的RNA在骨架中可不具有磷原子。在其核苷間骨架中不具有磷原子的RNA可被稱爲寡核苷。在本發明的某些實施方案中，經修飾RNA在其核苷間骨架中具有磷原子。
應理解，術語“RNA分子”或“RNA”或“核糖核酸分子”不僅涵蓋如在自然界中表達或發現的RNA分子，還涵蓋包含如本文中所述或本領域已知的一種或更多種核糖核苷酸/核糖核苷類似物或衍生物的RNA的類似物和衍生物。術語“核糖核苷”和“核糖核苷酸”在本文中可互換使用。RNA分子可在核鹼基結構或在核糖-磷酸骨架結構（例如，如下文中所述的）中進行修飾，並且包含核糖核苷類似物或衍生物的分子必須保留形成雙鏈體的能力。作爲一些非限制性實例，RNA分子還可包含至少一個經修飾核糖核苷，其包括但不限於2’-O-甲基修飾的核苷、包含5’硫代磷酸酯基團的核苷、與膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷、鎖核苷、無鹼基核苷、2’-脫氧-2’-氟修飾的核苷、2’-氨基修飾的核苷、2’-烷基修飾的核苷、嗎啉代核苷、氨基磷酸酯、或包含非天然鹼基的核苷、或者其任何組合。在本發明的一些實施方案中，RNA分子包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或高至ANGPTL3 dsRNA藥劑分子全長的核糖核苷，其爲經修飾核糖核苷。對於RNA分子中這樣的多個經修飾核糖核苷中的每個，修飾不必相同。
本發明的dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸在一些實施方案中可包含一種或更多種獨立選擇的經修飾核苷酸和/或一種或更多種獨立選擇的非磷酸二酯鍵聯。本文中使用的提及所選擇的元件（例如經修飾核苷酸、非磷酸二酯鍵聯等）時使用的術語“獨立選擇”意指兩個或更多個所選擇的元件可以但不必彼此相同。
本文中使用的“核苷酸鹼基”、“核苷酸”或“核鹼基”是雜環嘧啶或嘌呤化合物，其是所有核酸的標準成分，並且包括形成核苷酸腺嘌呤（a）、鳥嘌呤（g）、胞嘧啶（c）、胸腺嘧啶（t）和尿嘧啶（u）的鹼基。可進一步修飾核鹼基以包括但不旨在限制：通用鹼基、疏水鹼基、泛主鹼基（promiscuous base）、尺寸擴大的鹼基（size-expanded base）和氟化鹼基。術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”在本文中可用於指未經修飾核苷酸、經修飾核苷酸或替代物替代部分。本領域技術人員將認識到，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可被其他部分替代，而基本上不改變包含帶有這樣的替代部分的核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對特性。
在一個實施方案中，考慮用於本文中所述的方法和組合物的經修飾RNA是肽核酸（peptide nucleic acid，PNA），其具有形成所需雙鏈體結構的能力並且允許或介導靶RNA通過RISC途徑的特異性降解。在本發明的某些實施方案中，ANGPTL3 RNA干擾劑包括與靶ANGPTL3 RNA序列相互作用以指導靶ANGPTL3 RNA的切割的單鏈RNA。
經修飾的RNA骨架可包括例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包括3’-亞烷基膦酸酯的其他烷基膦酸酯、以及手性膦酸酯、次膦酸酯、包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、和具有正常3’-5’鍵聯的硼酸磷酸酯、其2’-5’連接的類似物、以及其中核苷單元的相鄰對連接在3’-5’到5’-3’或2’-5’到5’-2’的具有相反極性的那些。還包含多種鹽、混合鹽和游離酸形式。製備含磷鍵聯的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾的ANGPTL3 dsRNA藥劑、某些經修飾的ANGPTL3反義多核苷酸和/或某些經修飾的ANGPTL3有義多核苷酸。
其中不包含磷原子的經修飾RNA骨架具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵聯、或者一個或更多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵聯形成的骨架。這些包括具有以下的那些：嗎啉鍵聯（部分由核苷的糖部分形成）；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲乙醯（formacetyl）和硫甲乙醯骨架；亞甲基甲乙醯和硫甲乙醯骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺醯胺骨架；醯胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH 2組分部分的另一些。製備不包含磷原子的經修飾RNA骨架的手段是本領域常規實踐的，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾的ANGPTL3 dsRNA藥劑、某些經修飾的ANGPTL3反義多核苷酸和/或某些經修飾的ANGPTL3有義多核苷酸。
在本發明的某些實施方案中，RNA模擬物包含在ANGPTL3 dsRNA、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸中，例如但不限於：用新的基團替代核苷酸單元的糖和核苷間鍵聯，即骨架。在這樣的實施方案中，維持鹼基單元用於與適當的ANGPTL3核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物，已顯示具有優異的雜交特性的RNA模擬物，被稱爲肽核酸（PNA）。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被包含醯胺的骨架，特別是氨基乙基甘氨酸骨架替代。核鹼基被保留並且與骨架醯胺部分的氮雜氮原子直接或間接結合。製備RNA模擬物的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾的ANGPTL3 dsRNA藥劑。
本發明的一些實施方案包括具有硫代磷酸酯骨架的RNA和具有雜原子骨架的寡核苷，並且特別地是--CH 2--NH--CH 2-、--CH 2--N(CH 3)--O--CH 2--[被稱爲亞甲基（甲基亞氨基）或MMI骨架]、--CH 2--O--N(CH 3)--CH 2--、-CH 2--N(CH 3)--N(CH 3)--CH 2--和--N(CH 3)--CH 2----[其中天然磷酸二酯骨架表示爲--O--P--O--CH 2--]。製備具有硫代磷酸酯骨架的RNA和具有雜原子骨架的寡核苷的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾的ANGPTL3 dsRNA藥劑、某些ANGPTL3反義多核苷酸和/或某些ANGPTL3有義多核苷酸。
經修飾RNA也可包含一個或更多個經取代的糖部分。本發明的ANGPTL3 dsRNA、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸可在第2’位包含以下中的一種：OH；F；O--、S--或N-烷基；O--、S--或N-烯基；O--、S-或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是經取代或未經取代的C 1至C 10烷基或C 2至C 10烯基和炔基。一些示例性的合適的修飾包括O[(CH 2) nO] mCH 3、O(CH 2) nOCH 3、O(CH 2) nNH 2、O(CH 2) nCH 3、O(CH 2) nONH 2和O(CH 2) nON[(CH 2) nCH 3)] 2，其中n和m爲1至約10。在另一些實施方案中，dsRNA在第2’位包含以下中的一種：C 1至C 10低級烷基、經取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH 3、OCN、Cl、Br、CN、CF 3、OCF 3、SOCH 3、SO 2CH 3、ONO 2、NO 2、N 3、NH 2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、經取代的甲矽烷基、RNA切割基團、報導基團、嵌入劑、用於改善ANGPTL3 dsRNA藥劑的藥代動力學特性的基團，或用於改善ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸的藥效學特性的基團，以及具有類似特性的另一些取代基。在一些實施方案中，修飾包括2’-甲氧基乙氧基（2’-O--CH 2CH 2OCH 3，也稱爲2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504），即烷氧基-烷氧基。另一個示例性修飾是如下文實施例中所述的2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH 2) 2ON(CH 3) 2基團，也稱爲2’-DMAOE；以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基（在本領域中也稱爲2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE），即2’-O--CH 2-O--CH 2--N(CH 2) 2。製備經修飾RNA（例如所述的那些）的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾的ANGPTL3 dsRNA藥劑。
另一些修飾包括2’-甲氧基（2’-OCH 3）、2’-氨基丙氧基（2’-OCH 2CH 2CH 2NH 2）和2’-氟（2’-F）。也可在本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸的RNA上的其他位置進行類似的修飾，特別是在3’末端核苷酸上的糖或者2’-5’連接的ANGPTL3 dsRNA、ANGPTL3反義多核苷酸或ANGPTL3有義多核苷酸中的糖的第3’位，以及5’末端核苷酸的第5’位。ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸也可具有糖模擬物，例如替代呋喃戊糖的環丁基部分。製備經修飾RNA（例如所述的那些）的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾的ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸。
在一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸可包含核鹼基（在本領域中通常簡稱爲“鹼基”）修飾或替換。本文中使用的“未經修飾的”或“天然的”核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。經修飾核鹼基包括另一些合成和天然核鹼基，例如5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物和另一些烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基衍生物和另一些烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和另一些8-替換的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代特別是5-溴、5-三氟甲基和另一些5-替換的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。可包括在本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑的某些實施方案中的另外的核鹼基是本領域已知的，參見例如：Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. Ed. Wiley-VCH, 2008；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 第858至859頁, Kroschwitz, J. L, Ed. John Wiley & Sons, 1990, English et al., Angewandte Chemie, 國際版, 1991, 30, 613, Sanghvi, Y S., 第15章, dsRNA Research and Applications, 第289至302頁, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC出版, 1993。製備包含核鹼基修飾和/或替換（例如本文中所述的那些）的dsRNA、ANGPTL3反義鏈多核苷酸和/或ANGPTL3有義鏈多核苷酸的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾的ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3有義多核苷酸和/或ANGPTL3反義多核苷酸。
本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸的某些實施方案包括經修飾以包含一種或更多種鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）的RNA。鎖核酸是具有經修飾核糖部分的核苷酸，其包含連接2’和4’碳的額外的橋聯。這種結構有效地將核糖“鎖”在3’-endo結構構象中。在本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸中添加鎖核酸可提高血清中的穩定性，並降低脫靶效應（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook, O R. et al., (2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。製備包含鎖核酸的dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸的手段在本領域中常規實施，並且這樣的方法可用於製備本發明的某些經修飾的ANGPTL3 dsRNA藥劑。
本發明的ANGPTL3 dsRNA化合物、有義多核苷酸和/或反義多核苷酸的某些實施方案包括至少一個經修飾核苷酸，其中所述至少一個經修飾核苷酸包括：2’-O-甲基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脫氧核苷酸、2’3’-seco核苷酸模擬物、鎖核苷酸、2’-F-阿拉伯糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、和3’-OMe核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團的核苷酸、或者與膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、氨基磷酸酯、或包含非天然鹼基的核苷酸。在一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA化合物在本文中也稱爲引導鏈的反義鏈的5’末端包含E-乙烯基膦酸酯核苷酸。
本發明的ANGPTL3 dsRNA化合物、有義多核苷酸的3’和5’末端以及/或反義多核苷酸的3’末端的某些實施方案包括至少一個經修飾核苷酸，其中所述至少一個經修飾核苷酸包括：無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2’-Ome核苷酸、反向2’-脫氧核苷酸。本領域技術人員已知，在寡核苷酸的末端包含無鹼基或反向無鹼基核苷酸增强了穩定性（Czauderna et al. Structural variations and stabilizing modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2003;31(11):2705-2716. doi:10.1093/nar/gkg393）。
本發明的ANGPTL3 dsRNA化合物、反義多核苷酸的某些實施方案包括至少一個經修飾核苷酸，其中所述至少一個經修飾核苷酸包括解鎖核酸核苷酸（UNA）或/和乙二醇核酸核苷酸（GNA）。本領域技術人員已知，UNA和GNA是熱不穩定的化學修飾，其可顯著改善siRNA化合物的脫靶譜（Janas, et al., Selection of GalNAc-conjugated siRNAs with limited off-target-driven rat hepatotoxicity. Nat Commun. 2018;9(1):723. doi:10.1038/s41467-018-02989-4；Laursen et al., Utilization of unlocked nucleic acid (UNA) to enhance siRNA performance in vitro and in vivo. Mol BioSyst. 2010;6:862–70）。
可包含在本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸的某些實施方案的RNA中的另一種修飾包括分別將增强ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸的一種或更多種特徵的一個或更多個配體、部分或綴合物與RNA化學連接。可增强的特徵的一些非限制性實例是：ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸活性；細胞分布；ANGPTL3 dsRNA藥劑的遞送；ANGPTL3 dsRNA藥劑的藥代動力學特性；和ANGPTL3 dsRNA藥劑的細胞攝取。在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑包含一個或更多個靶向基團或連接基團，其在本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑的某些實施方案中與有義鏈綴合。靶向基團的一個非限制性實例是包含N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）的化合物。術語“靶向基團”、“靶向劑”、“連接劑”、“靶向化合物”和“靶向配體”在本文中可互換使用。在本發明的某些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑包含與有義鏈的5’末端綴合的靶向化合物。在本發明的某些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑包含與有義鏈的3’末端綴合的靶向化合物。在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑包含含有GalNAc的靶向基團。在本發明的某些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑不包含與有義鏈的3’末端和5’末端之一或二者綴合的靶向化合物。在本發明的某些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑不包含與有義鏈的5’末端和3’末端之一或二者綴合的包含GalNAc的靶向化合物。
另外的靶向劑和連接劑是本領域公知的，例如，可用於本發明的某些實施方案的靶向劑和連接劑包括但不限於脂質部分，例如：膽固醇部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）；膽酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）；硫醚，例如 beryl-S-三苯甲基硫醇（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309；Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）；硫膽固醇（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）；脂肪族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）；磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）；多胺或聚乙二醇鏈（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）；或金剛烷乙酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）；棕櫚基部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）；或者十八胺或己基氨基-羰基氧基膽固醇部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）。
包含ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3反義多核苷酸和/或ANGPTL3有義多核苷酸的組合物的某些實施方案可包括改變ANGPTL3 dsRNA藥劑的分布、靶向等的配體。在包含本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑的組合物的一些實施方案中，配體提高對所選靶標（例如，分子、細胞或細胞類型、區室例如細胞或器官區室、組織、器官或身體的區域）的親和力，例如與沒有這樣的配體的種類相比。可用於本發明的組合物和/或方法的配體可以是天然存在的物質，例如：蛋白質（例如，人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、低密度脂蛋白（LDL）或球蛋白）；碳水化合物（例如，右旋糖酐、短梗黴聚糖（pullulan）、甲殼素、殼聚糖、菊粉、環糊精或透明質酸）；或脂質。配體也可以是重組分子或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸或聚胺。聚氨基酸的一些實例是聚賴氨酸（polylysine，PLL）、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙醇酸)共聚物、二乙烯醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物（HMPA）、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的實例包括：聚乙烯亞胺、聚賴氨酸（PLL）、精胺、亞精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模擬物聚胺、樹狀體聚胺、精氨酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺的季鹽或α螺旋肽。
本發明的組合物和/或方法中包含的配體可包含靶向基團，其的一些非限制性實例是細胞或組織靶向劑，例如凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如，與特定細胞類型（例如腎細胞或肝細胞）結合的抗體。靶向基團可以是促甲狀腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺多價甘露糖、多價岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸酯、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂質、膽固醇、甾體、膽汁酸、葉酸、維生素B12、維生素A、生物素、或者RGD肽或RGD肽模擬物。
配體的另一些實例包括染料、嵌入劑（例如，吖啶）、交聯劑（例如，補骨脂素、絲裂黴素C）、卟啉（TPPC4、德卟啉（texaphyrin）、Sapphyrin）、多環芳烴（例如，吩嗪、二氫吩嗪）、人工核酸內切酶（例如，EDTA）、親脂性分子，例如膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪）和肽綴合物（例如，觸足肽（antennapedia peptide）、Tat肽）、烷化劑、磷酸鹽/酯、氨基、巰基、PEG（例如，PEG-40K）、MPEG、[MPEG] 2、聚氨基、烷基、經取代的烷基、放射性標記的標志物、酶、半抗原（例如，生物素）、轉運/吸收促進劑（例如，阿司匹林、維生素E、葉酸）、合成核糖核酸酶（例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑綴合物、四氮雜大環的Eu3+複合物）、二硝基苯基、HRP或AP。
本發明的組合物和/或方法中包含的配體可以是蛋白質（例如糖蛋白）、或肽（例如對共配體具有特定親和力的分子）、或抗體（例如與特定細胞類型（例如癌細胞、內皮細胞、心肌細胞或骨細胞）結合的抗體）。可用於本發明的組合物和/或方法的一個實施方案的配體可以是激素或激素受體。可用於本發明的組合物和/或方法的一個實施方案的配體可以是脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺多價甘露糖、或多價岩藻糖。可用於本發明的組合物和/或方法的一個實施方案的配體可以是物質，其可例如通過破壞細胞的細胞骨架，例如通過破壞細胞的微管、微絲和/或中間絲來提高細胞對ANGPTL3 dsRNA藥劑的攝取。這種類型的物質的一些非限制性實例是：紫杉醇、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑（nocodazole）、japlakinolide、拉春庫林A（latrunculin A）、鬼筆環肽（phalloidin）、swinholide A、茚滿新鹼（indanocine）和myoservin。
在一些實施方案中，與本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑連接的配體作爲藥代動力學（PK）調節劑發揮作用。可用於本發明的組合物和方法的PK調節劑的實例包括但不限於：親脂類（lipophile）、膽汁酸、類固醇、磷脂類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素、膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生（naproxen）、布洛芬（ibuprofen）、維生素E、生物素、結合血清蛋白的適配體等。還已知包含許多硫代磷酸酯鍵聯的寡核苷酸與血清蛋白結合，因此在本發明的組合物和/或方法中也可使用在骨架中包含多個硫代磷酸酯鍵聯的短寡核苷酸，例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基的寡核苷酸作爲配體。 ANGPTL3 dsRNA 藥劑組合物
在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑在組合物中。本發明的組合物可包含一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑和任選的可藥用載體、遞送劑、靶向劑、可檢測標記等中的一種或更多種。根據本發明的方法的一些實施方案，可用的靶向劑的一個非限制性實例是將本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑定向至和/或定向入待處理細胞中的藥劑。靶向劑的選擇將取决於如下這樣的要素：ANGPTL3相關疾病或病症的性質，以及所靶向的細胞類型。在一個非限制性實例中，在本發明的一些實施方案中，可期望將ANGPTL3 dsRNA藥劑靶向至和/或靶向入肝細胞中。應理解，在本發明的方法的一些實施方案中，治療劑包含僅具有遞送劑（例如包含N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）的遞送劑）的ANGPTL3 dsRNA藥劑，而沒有任何另外的連接元件。例如，在本發明的一些方面中，ANGPTL3 dsRNA藥劑可與包含GalNAc的遞送化合物連接，並且被包含在包含可藥用載體的組合物中，並且在沒有與ANGPTL3 dsRNA藥劑連接的任何可檢測標記或靶向劑等的情况下被施用於細胞或對象。
在本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑與以下一種或更多種一起施用和/或與以下一種或更多種連接的情况下：遞送劑、靶向劑、標記劑等，本領域技術人員將意識到並且能夠選擇和使用用於本發明方法的合適藥劑。標記劑可用於本發明的某些方法中以確定細胞和組織中ANGPTL3 dsRNA藥劑的位置，並且可用於確定已在本發明的方法中施用的包含ANGPTL3 dsRNA藥劑的治療組合物的細胞、組織或器官位置。用於連接和使用標記劑例如酶標記、染料、放射性標記等的方法是本領域中公知的。應理解，在本發明的組合物和方法的一些實施方案中，標記劑與ANGPTL3 dsRNA藥劑中包含的有義多核苷酸和反義多核苷酸之一或二者連接。 ANGPTL3 dsRNA 藥劑和 ANGPTL3 反義多核苷酸藥劑的遞送
本發明的方法的某些實施方案包括將ANGPTL3 dsRNA藥劑遞送到細胞中。本文中使用的術語“遞送”意指促進或影響細胞攝取或吸收。對ANGPTL3 dsRNA藥劑的吸收或攝取可通過獨立的擴散或活性細胞過程，或者通過使用可與本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑締合的遞送劑、靶向劑等而發生。適用於本發明方法的遞送手段包括但不限於：體內遞送，其中將ANGPTL3 dsRNA藥劑注射到組織部位或全身施用。在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑與遞送劑連接。
可用於將ANGPTL3 dsRNA藥劑遞送至細胞、組織和/或對象的方法的一些非限制性實例包括：ANGPTL3 dsRNA-GalNAc綴合物、SAMiRNA技術、基於LNP的遞送方法和裸RNA遞送。這些和另一些遞送方法已在本領域中成功用於遞送治療性RNAi藥劑以用於治療多種疾病和病症，例如但不限於：肝病、急性間歇性卟啉病（acute intermittent porphyria，AIP）、血友病、肺纖維化等。多種遞送手段的細節在以下出版物中找到，例如：Nikam, R.R. & K. R. Gore (2018) Nucleic Acid Ther, 28 (4), 209-224 Aug 2018；Springer A.D. & S.F. Dowdy (2018) Nucleic Acid Ther. Jun 1; 28(3): 109–118；Lee, K. et al., (2018) Arch Pharm Res, 41(9), 867-874；和Nair, J.K. et al., (2014) J. Am. Chem. Soc. 136:16958-16961，其各自的內容通過引用併入本文。
本發明的一些實施方案包括使用脂質納米粒（lipid nanoparticle，LNP）將本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑遞送至細胞、組織和/或對象。LNP通常用於體內遞送ANGPTL3 dsRNA藥劑，包括治療性ANGPTL3 dsRNA藥劑。使用LNP或另一些遞送劑的一個益處是當使用LNP或另一些遞送劑將其遞送至對象時，ANGPTL3 RNA藥劑的穩定性提高。在本發明的一些實施方案中，LNP包括負載有本發明的一種或更多種ANGPTL3 RNAi分子的陽離子LNP。將包含ANGPTL3 RNAi分子的LNP施用於對象，LNP及其所連接的ANGPTL3 RNAi分子通過胞吞作用被細胞攝取，它們的存在導致介導RNAi的RNAi觸發分子的釋放。
可用於本發明的實施方案中以將本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑遞送至細胞、組織和/或對象的遞送劑的另一個非限制性實例是，包含與本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑連接的GalNAc並將ANGPTL3 dsRNA藥劑遞送至細胞、組織和/或對象的藥劑。在PCT申請WO2020191183A1中公開了可用於本發明的方法和組合物的某些實施方案中的某些另外的包含GalNAc的遞送劑的一些實例。可用於本發明的組合物和方法以將ANGPTL3 dsRNA藥劑遞送至細胞的GalNAc靶向配體的一個非限制性實例是靶向配體簇。本文中呈現的靶向配體簇的一些實例被稱爲：具有磷酸二酯鍵聯（GLO）的GalNAc配體和具有硫代磷酸酯鍵聯（GLS）的GalNAc配體。術語“GLX-n”可在本文中用於表示所連接的包含GalNAc的化合物是以下化合物中的任一種： ， 其各自的結構在下文示出，其中下文是GalNAc靶向配體與本發明的RNAi藥劑的連接位置，其在各自的最右側（用“ ⌇”示出）。應理解，本發明的任何RNAi和dsRNA分子可連接與以下連接： ， GLO-1至GLO-16並且GLS-1至GLS-16結構。 。
在本發明的一些實施方案中，體內遞送也可通過β-葡聚糖遞送系統，例如在美國專利No. 5,032,401和5,607,677以及美國公開No. 2005/0281781中描述的那些，其在此通過引用整體併入。也可使用本領域已知的方法例如電穿孔和脂質轉染將ANGPTL3 RNAi藥劑體外引入到細胞中。在本發明的方法的某些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA在沒有靶向劑的情况下被遞送。這些RNA可作爲“裸”RNA分子遞送。作爲一個非限制性實例，本發明的ANGPTL3 dsRNA可在包含RNAi藥劑但不包含靶向劑（例如GalNAc靶向化合物）的藥物組合物中施用於對象以治療對象中的ANGPTL3相關疾病或病症，例如肝病。
除了本文中所述的某些遞送手段之外，應理解，RNAi遞送手段（例如但不限於本文中所述的那些和本領域中使用的那些）可與本文中所述的ANGPTL3 RNAi藥劑和治療方法的實施方案聯合使用。
本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑可以以有效降低細胞和/或對象中ANGPTL3多肽的水平和活性的量和方式施用於對象。在本發明的方法的一些實施方案中，將一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑施用於細胞和/或對象以治療與ANGPTL3表達和活性相關的疾病或病症。在一些實施方案中，本發明的方法包括向需要這樣的治療的對象施用一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑以降低對象中與ANGPTL3表達相關的疾病或病症。可施用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑以降低在體外、離體和體內細胞中的一種更多種中ANGPTL3表達和/或活性。
在本發明的一些實施方案中，通過將ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑遞送（例如引入）到細胞中來降低細胞中ANGPTL3多肽的水平，並且因此降低其活性。靶向劑和方法可用於幫助將ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑遞送至特定細胞類型、細胞亞型、器官、對象中的空間區域、和/或細胞中的亞細胞區域。ANGPTL3 dsRNA藥劑可在本發明的某些方法中單獨施用或與一種或更多種另外的ANGPTL3 dsRNA藥劑組合施用。在一些實施方案中，將2、3、4或更多種獨立選擇的ANGPTL3 dsRNA藥劑施用於對象。
在本發明的某些實施方案中，將ANGPTL3 dsRNA藥劑與用於治療ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種另外的治療方案聯合施用於對象以治療ANGPTL3相關疾病或病症。另外的治療方案的一些非限制性實例是：施用一種或更多種本發明的ANGPTL3反義多核苷酸、施用非ANGPTL3 dsRNA治療劑、以及行爲改變。可在以下中的一個或更多個時間施用另外的治療方案：在施用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑之前、與其同時和在其之後。應理解，本文中使用的與其同時爲在時間零的五分鐘內、在時間零的10分鐘內、在時間零的30分鐘內、在時間零的45分鐘內和在時間零的60分鐘內，其中“時間零”是將本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑施用於對象的時間。非ANGPTL3 dsRNA治療劑的一些非限制性實例是：一種或更多種他汀類；能夠降低前蛋白轉化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型（proprotein convertase subtilsin/kexin type 9，PCSK9）表達的siRNA分子或抗體或反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）中的一種或更多種（German CA, Shapiro MD. Small Interfering RNA Therapeutic Inclisiran: A New Approach to Targeting PCSK9. BioDrugs. 2020 Feb;34(1):1-9. Doi: 10.1007/s40259-019-00399-6. PMID: 31782112.）；能夠降低對象中的脂質積累的治療劑；以及能夠降低對象中的膽固醇水平和/或積累的治療劑。行爲改變的一些非限制性實例是：飲食方案、諮詢和運動方案。這些和其他治療劑和行爲改變在本領域中是已知的並且用於治療對象中的ANGPTL3疾病或病症，並且可與一種或更多種本發明的ATGPTL3 dsRNA藥劑的施用組合來施用於對象以治療ANGPTL3疾病或病症。施用於細胞或對象以治療ANGPTL3相關疾病或病症的本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑可與一種或更多種其他治療劑或活性以協同方式起作用，並提高一種或更多種治療劑或活性的有效性以及/或者提高ANGPTL3 dsRNA藥劑在治療ANGPTL3相關疾病或病症中的有效性。
可在ANGPTL3相關疾病或病症發作之前和/或當ANGPTL3相關疾病或病症存在時，包括在疾病或病症的早期階段、中期階段和晚期階段以及任意這些之前和之後的所有時間，使用包括施用ANGPTL3 dsRNA藥劑的本發明的治療方法。本發明的方法還可用於治療以下對象：其之前已經用一種或更多種其他治療劑和/或治療活性來治療ANGPTL3相關疾病或病症，其中所述其他治療劑和/或治療活性在治療對象中的ANGPTL3相關疾病或病症中不成功、具有最小的成功和/或不再成功。 編碼 dsRNA 的載體
在本發明的某些實施方案中，可使用載體將ANGPTL3 dsRNA藥劑遞送到細胞中。ANGPTL3 dsRNA藥劑轉錄單元可包含在DNA或RNA載體中。用於將序列遞送到細胞和/或對象中的這樣的編碼轉基因的載體的製備和使用是本領域公知的。載體可用於本發明的方法中，其導致ANGPTL3 dsRNA瞬時表達例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多小時、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周。瞬時表達的長度可使用基於元件的常規方法來確定，所述元件例如但不限於所選的特定載體構建體以及靶細胞和/或組織。這樣的轉基因可作爲線性構建體、環狀質粒或病毒載體引入，其可以是整合或非整合載體。還可構建轉基因以允許其作爲染色體外質粒遺傳（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
可從表達載體上的啓動子轉錄ANGPTL3 dsRNA藥劑的單獨的一個鏈或多個鏈。在待表達兩條單獨的鏈以產生例如dsRNA的情况下，可使用手段例如轉染或感染將兩種單獨的表達載體共引入至細胞。在某些實施方案中，本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑的每條單獨的鏈均可由兩種包含在同一表達載體上的啓動子轉錄。在本發明的某些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑表達爲通過接頭多核苷酸序列連接的反向重複多核苷酸，使得ANGPTL3 dsRNA藥劑具有莖和環結構。
RNA表達載體的一些非限制性實例是DNA質粒或病毒載體。可用於本發明的實施方案的表達載體可與真核細胞相容。真核細胞表達載體在本領域中常規使用並且可從許多商業來源獲得。ANGPTL3 dsRNA表達載體的遞送可以是全身性的，例如通過靜脈內或肌內施用，通過施用至從對象外植的靶細胞隨後再引入到對象中，或者通過允許引入到期望的靶細胞的任何其他手段。
可包括在方法的實施方案中的病毒載體系統包括但不限於：（a）腺病毒載體；（b）逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；（c）腺相關病毒載體；（d）單純疱疹病毒載體；（e）SV 40載體；（f）多瘤病毒載體；（g）乳頭瘤病毒載體；（h）小核糖核酸病毒載體；（i）痘病毒載體，例如天花，例如牛痘病毒載體或禽痘，例如金絲雀痘或鶏痘；以及（j）輔助依賴性或無腸（gutless）腺病毒。用於重組表達ANGPTL3 dsRNA藥劑的構建體可包含調節元件，例如啓動子、增强子等，其可被選擇以提供組成型或調節/誘導型表達。啓動子和增强子等的使用以及病毒載體系統在本領域中是常規的並且可與本文中所述的方法和組合物聯合使用。
本發明的某些實施方案包括用於將ANGPTL3 dsRNA藥劑遞送到細胞中的病毒載體的用途。許多基於腺病毒的遞送系統在本領域中常規用於遞送至例如肺、肝、中樞神經系統、內皮細胞和肌肉。可用於本發明的方法的病毒載體的一些非限制性實例是：AAV載體、痘病毒例如牛痘病毒、改良病毒安卡拉（Modified Virus Ankara，MVA）、NYVAC、禽痘例如鶏痘或金絲雀痘。
本發明的某些實施方案包括使用載體將ANGPTL3 dsRNA藥劑遞送到細胞中的方法，並且這樣的載體可在可藥用載體中，其可以但不必須包含其中嵌入了基因遞送載劑的緩慢釋放基質。在一些實施方案中，用於遞送ANGPTL3 dsRNA的載體可由重組細胞產生，並且本發明的藥物組合物可包含一種或更多種產生ANGPTL3 dsRNA遞送系統的細胞。 包含 ANGPTL3 dsRNA 或 ssRNA 藥劑的藥物組合物
本發明的某些實施方案包括包含ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑和可藥用載體的藥物組合物的用途。包含ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的藥物組合物可用於本發明的方法中以降低細胞中的ANGPTL3基因表達和ANGPTL3活性，並且可用於治療ANGPTL3相關疾病或病症。這樣的藥物組合物可基於遞送方式進行配製。針對遞送方式的製劑的一些非限制性實例是：配製成用於皮下遞送的組合物、配製成用於通過腸胃外遞送來全身施用的組合物、配製成用於靜脈內（IV）遞送的組合物、配製成用於鞘內遞送的組合物、配製成用於直接遞送至腦的組合物、等。可使用一種或更多種手段進行施用本發明的藥物組合物以將ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑遞送到細胞中，所述手段例如：表面（例如，通過經皮貼劑）；肺部，例如，通過吸入或吹入散劑或氣溶膠劑，包括通過霧化器；氣管內；鼻內；表皮和經皮；經口或腸胃外。腸胃外施用包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌內注射或輸注；皮下，例如，通過植入裝置；或顱內，例如，通過實質內（intraparenchymal）、鞘內或心室內（intraventricular）施用。也可將ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑直接遞送至靶組織，例如直接遞送至肝、直接遞送至腎等。應理解“遞送ANGPTL3 dsRNA藥劑”或“遞送ANGPTL3反義多核苷酸藥劑”到細胞中涵蓋分別直接遞送ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑，以及在細胞中從被遞送到細胞中的編碼載體表達ANGPTL3 dsRNA藥劑，或者通過使ANGPTL3 dsRNA或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑出現在細胞中的任何合適的手段。用於遞送抑制性RNA的製劑和手段的製備和使用是本領域公知且常規使用的。
本文中使用的“藥物組合物”包含藥理學有效量的本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑以及可藥用載體。術語“可藥用載體”是指用於施用治療劑的載體。這樣的載體包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術語特別地不包括細胞培養基。對於經口施用的藥物，可藥用載體包括但不限於可藥用賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、結合劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣以及乳糖，而玉米澱粉和藻酸是合適的崩解劑。結合劑可包括澱粉和明膠，而如果存在的話潤滑劑通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。如果期望，片劑可用材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯來包被，以延遲在胃腸道中的吸收。藥物製劑中包含的藥劑在下文中進一步描述。
本文中使用的術語例如：“藥理學有效量”、“治療有效量”和“有效量”是指本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑產生預期的藥理學、治療性或預防性結果的量。例如，如果在與疾病或病症相關的可測量參數降低至少10%時，給定的臨床治療被認爲是有效的，則用於治療該疾病或病症的藥物的治療有效量是必須使該參數降低至少10%的量。例如，治療有效量的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可將ANGPTL3多肽水平降低至少10%。 有效量
在一些方面中，本發明的方法包括使細胞與有效量的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑接觸以降低所接觸細胞中的ANGPTL3基因表達。本發明的方法的某些實施方案包括向對象施用有效量的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑以在對象中降低ANGPTL3基因表達和治療ANGPTL3相關疾病或病症。在降低ANGPTL3的表達和/或用於治療ANGPTL3相關疾病或病症方面使用的“有效量”是實現期望的生物學效應所必需或足夠的量。例如，治療ANGPTL3相關疾病或病症的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的有效量可以是進行以下所必需的量：（i）减緩或停止疾病或病症進展；或者（ii）逆轉、减輕或消除疾病或病症的一種或更多種症狀。在本發明的一些方面中，有效量是當施用於需要治療ANGPTL3相關疾病或病症的對象時，導致預防和/或治療疾病或病症的治療性響應的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的量。根據本發明的一些方面，有效量是當與用於ANGPTL3相關疾病或病症的另一種治療性治療組合或共施用時，導致預防和/或治療疾病或病症的治療性響應的本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的量。在本發明的一些實施方案中，用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑治療對象的生物學效應可以是改善和/或完全消除由ANGPTL3相關疾病或病症引起的症狀。在本發明的一些實施方案中，生物學效應是完全消除ANGPTL3相關疾病或病症，如例如通過表明對象沒有ANGPTL3相關疾病或病症的診斷測試所證明的。可檢測到的生理症狀的一個非限制性實例包括在施用本發明的藥劑之後對象的肝中的脂質積累降低。評估ANGPTL3相關疾病或病症的狀態的另外的本領域已知手段可用於確定本發明的藥劑和/或方法對ANGPTL3相關疾病或病症的影響。
通常，將在臨床試驗中確定用於將ANGPTL3多肽活性降低至治療ANGPTL3相關疾病或病症的水平的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的有效量，以在盲研究中建立測試群體相對於對照群體的有效劑量。在一些實施方案中，有效量將是導致期望響應的量，例如，在具有疾病或病症的細胞、組織和/或對象中减輕ANGPTL3相關疾病或病症的量。因此，治療可通過降低ANGPTL3多肽活性來治療的ANGPTL3相關疾病或病症的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的有效量可以是這樣的量：當施用時使對象中ANGPTL3多肽活性的量降低至小於在沒有施用ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的情况下細胞、組織和/或對象中存在的量的量。在本發明的某些方面中，在未接觸或施用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的細胞、組織和/或對象中存在的ANGPTL3多肽活性和/或ANGPTL3基因表達的水平被稱爲“對照”量。在本發明的方法的一些實施方案中，對象的對照量是對象的治療前的量，換言之，在施用ANGPTL3藥劑之前對象中的水平可以是該對象的對照水平，並且與將siRNA施用於對象之後對象中ANGPTL3多肽活性和/或ANGPTL3基因表達的水平進行比較。在治療ANGPTL3相關疾病或病症的情况下，期望響應可以是减輕或消除細胞、組織和/或對象中疾病或病症的一種或更多種症狀。降低或消除可以是暫時的，或可以是永久性的。應理解，可使用確定ANGPTL3多肽活性、ANGPTL3基因表達、症狀評價、臨床測試等的方法來監測ANGPTL3相關疾病或病症的狀態。在本發明的一些方面中，對治療ANGPTL3相關疾病或病症的期望響應延遲疾病或病症的發作或者甚至阻止疾病或病症的發作。
降低ANGPTL3多肽活性的化合物的有效量也可通過評估ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的施用對細胞或對象的生理效應（例如施用後ANGPTL3相關疾病或病症的减輕）來確定。對象的測定和/或症狀監測可用於確定可在本發明的藥物化合物中施用的本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的效力，並用於確定對治療的響應的存在或缺失。一個非限制性實例是一種或更多種本領域已知的血清脂質譜測試。另一個非限制性實例是一種或更多種本領域已知的肝功能測試，其可用於確定在使用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑治療對象之前和之後對象中的ANGPTL3相關肝疾病或病症的狀態。在另一個非限制性實例中，一種或更多種本領域已知的肝中膽固醇積累的測試，其用於確定對象中ANGPTL3相關疾病的狀態。在該實例中，該疾病包括膽固醇積累，並且該測試用於確定在使用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑治療對象之前和之後對象中的膽固醇水平。
本發明的一些實施方案包括通過評估和/或監測對象中ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種“生理特徵”，來確定施用於對象以治療ANGPTL3相關疾病或病症的本發明的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的效力的方法。ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵的一些非限制性實例是對象的血清脂質水平、對象的LDL水平、對象的HDL水平、對象的LDL:HDL比例、對象的甘油三酯水平、對象的肝中存在的脂肪、身體症狀等。確定這樣的生理特徵的標準手段是本領域已知的，並且包括但不限於血液測試、成像研究、身體檢查等。
應理解，施用於對象的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的量可至少部分地基於針對對象確定的疾病和/或病症狀態和/或生理特徵的這樣的確定來修改。治療的量可通過以下而變化：例如，通過提高或降低ANGPTL3-dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的量、通過改變分別施用的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的組成、通過改變施用途徑、通過改變給藥時間等。ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的有效量將隨以下而變化：所治療的特定病症、所治療的對象的年齡和身體狀况；病症的嚴重程度、治療的持續時間、並行治療（如果有的話）的性質、特定施用途徑以及保健醫生的知識和專長中的其他因素。例如，有效量可取决於有效治療ANGPTL3相關疾病或病症的ANGPTL3多肽活性和/或ANGPTL3基因表達的期望水平。本領域技術人員可憑經驗確定用於本發明方法的本發明的特定ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的有效量，而無需過度實驗。結合本文中提供的教導，通過從本發明的多種ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑以及權重因子（例如效力、相對生物利用度、患者體重、不良副作用的嚴重程度和優選的施用方式）中進行選擇，可計劃有效治療特定對象的有效預防性或治療性治療方案。如在本發明的一些實施方案中使用的，本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的有效量可以是當與細胞接觸時在細胞中產生期望生物學效應的量。
應認識到，ANGPTL3基因沉默可在組成型或通過基因組改造的任何表達ANGPTL3的細胞中並且通過任何適當的測定來確定。在本發明的一些實施方案中，通過施用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑，ANGPTL3基因表達降低至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在本發明的一些實施方案中，通過施用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑，ANGPTL3基因表達降低5%至10%、5%至25%、10%至50%、10%至75%、25%至75%、25%至100%、或50%至100%。 給藥
ANGPTL3 dsRNA藥劑和ANGPTL3反義多核苷酸藥劑以足以抑制ANGPTL3基因表達的劑量在藥物組合物中遞送。在本發明的某些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的劑量爲每天0.01至200.0毫克/接受者的千克體重，通常爲每天1至50 mg/千克體重、5至40 mg/kg體重、10至30 mg/kg體重、1至20 mg/kg體重、1至10 mg/kg體重、4至15 mg/kg體重，包括端點。例如，ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可以以以下量施用：每單劑量約0.01 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg, 2.6 mg/kg, 2.7 mg/kg, 2.8 mg/kg, 2.9 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.1 mg/kg, 3.2 mg/kg, 3.3 mg/kg, 3.4 mg/kg, 3.5 mg/kg, 3.6 mg/kg, 3.7 mg/kg, 3.8 mg/kg, 3.9 mg/kg, 4 mg/kg, 4.1 mg/kg, 4.2 mg/kg, 4.3 mg/kg, 4.4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 4.6 mg/kg, 4.7 mg/kg, 4.8 mg/kg, 4.9 mg/kg, 5 mg/kg, 5.1 mg/kg, 5.2 mg/kg, 5.3 mg/kg, 5.4 mg/kg, 5.5 mg/kg, 5.6 mg/kg, 5.7 mg/kg, 5.8 mg/kg, 5.9 mg/kg, 6 mg/kg, 6.1 mg/kg, 6.2 mg/kg, 6.3 mg/kg, 6.4 mg/kg, 6.5 mg/kg, 6.6 mg/kg, 6.7 mg/kg, 6.8 mg/kg, 6.9 mg/kg, 7 mg/kg, 7.1 mg/kg, 7.2 mg/kg, 7.3 mg/kg, 7.4 mg/kg, 7.5 mg/kg, 7.6 mg/kg, 7.7 mg/kg, 7.8 mg/kg, 7.9 mg/kg, 8 mg/kg, 8.1 mg/kg, 8.2 mg/kg, 8.3 mg/kg, 8.4 mg/kg, 8.5 mg/kg, 8.6 mg/kg, 8.7 mg/kg, 8.8 mg/kg, 8.9 mg/kg, 9 mg/kg, 9.1 mg/kg, 9.2 mg/kg, 9.3 mg/kg, 9.4 mg/kg, 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg, 至50 mg/kg體重。
在確定本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑的劑量和遞送時間時可考慮多種因素。遞送的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的絕對量將取决於多種因素，包括並行治療、劑量數和個體對象參數，包括年齡、身體狀况、體型和體重。這些是本領域普通技術人員公知的因素並且可僅施用常規實驗來解决。在一些實施方案中，可使用最大劑量，即根據合理的醫學判斷的最高安全劑量。
在一些實施方案中，本發明的方法可包括向對象施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個劑量的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑。在一些情况下，可至少每天、每隔一天、每周、每隔一周、每月等向對象施用藥物化合物（例如，包含ANGPTL3 dsRNA藥劑或包含ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的藥物化合物）。劑量可每天一次或每天多於一次地施用，例如在一個24小時期間內2、3、4、5或更多次地施用。本發明的藥物組合物可每天一次地施用，或者ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可在全天以適當的間隔以兩個、三個或更多個亞劑量來施用，或者甚至使用通過控釋製劑的連續輸注或遞送。在本發明的方法的一些實施方案中，將本發明的藥物組合物每天一次或更多次、每周一次或更多次、每月一次或更多次、或者每年一次或更多次地施用於對象。
在一些方面中，本發明的方法包括單獨，與一種或更多種其他ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑組合，和/或與施用於患有ANGPTL3相關疾病或病症的對象的其他藥物治療或治療活動或方案組合來施用藥物化合物。藥物化合物可在藥物組合物中施用。在本發明的方法中使用的藥物組合物可以是無菌的並且含有一定量的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑，所述量將ANGPTL3多肽的活性降低至足以在適合施用於對象的重量或體積單位下產生期望響應的水平。可根據不同參數，特別是根據使用的施用方式和對象的狀態來選擇向對象施用的包含降低ANGPTL3蛋白活性的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的藥物組合物的劑量。其他因素包括期望的治療時間。在對象的響應在施加的初始劑量下不足的情况下，可在患者耐受性允許的程度內采用較高劑量（或通過不同的更局部的遞送途徑以實際上更高的劑量）。 治療
可使用本發明的方法和ANGPTL3 dsRNA藥劑來治療ANGPTL3相關疾病和病症以抑制ANGPTL3表達，其中ANGPTL3多肽的水平和/或活性降低對治療疾病或病症有效。可用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑和本發明的治療方法來治療的疾病和病症的一些實例包括但不限於：高脂血症、高甘油三酯血症、異常的脂質和/或膽固醇代謝、純合和雜合家族性高膽固醇血症、他汀類抗性高膽固醇血症、心臟代謝疾病、肥胖、動脈粥樣硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病和由高甘油三酯血症引起的胰腺炎。這樣的疾病和病症在本文中可稱爲“ANGPTL3相關疾病和病症”以及“由ANGPTL3引起和/或調節的疾病和病症”。
在本發明的某些方面中，可在診斷ANGPTL3相關疾病或病症之前或之後的一個或更多個時間向對象施用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑。在本發明的一些方面中，對象處於患有或發生ANGPTL3相關疾病或病症的風險中。與發生ANGPTL3相關疾病或病症的對照風險相比，處於發生ANGPTL3相關疾病或病症的風險中的對象是具有提高的發生ANGPTL3相關疾病或病症的可能性的對象。在本發明的一些實施方案中，與對照風險水平相比，風險水平可以是統計學顯著的。處於風險中的對象可包括，例如，對象是或將是：具有先前存在的疾病和/或遺傳異常的對象，其使得對象比沒有先前存在的疾病或遺傳異常的對照對象更易患ANGPTL3相關疾病或病症；具有ANGPTL3相關疾病或病症的家族和/或個人病史的對象；以及先前已經治療過ANGPTL3相關疾病或病症的對象。應理解，使對象更易患ANGPTL3相關疾病或病症的先前存在的疾病和/或遺傳異常可以是先前已鑒定爲當存在時與更高的發生ANGPTL3相關疾病或病症的可能性具有相關關係的疾病和/或遺傳異常。
應理解，可基於個體對象的醫學狀况向對象施用ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑。例如，爲對象提供的醫療保健可評估從對象獲得的樣品中測量的脂質水平，並確定通過施用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑來降低對象的脂質水平的期望。在該實例中，可認爲脂質水平是ANGPTL3相關病症的生理特徵，即使對象未被診斷爲患有ANGPTL3相關疾病（例如本文公開的一種）。醫療保健提供者可監測對象脂質水平的變化，作爲所施用的本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的效力的量度。在一個非限制性實例中，可從對象獲得生物樣品，例如血液或血清樣品，並在樣品中確定對象的脂質水平。將ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑施用於對象，並且在施用之後從對象獲得血液或血清樣品，並使用樣品測定脂質水平，並將結果與對象的施用前（之前的）樣品中確定的結果進行比較。與施用前水平相比，後期樣品中對象的脂質水平降低表明施用的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑在降低對象中的脂質水平方面的效力。
本發明的方法的某些實施方案包括調節治療，所述治療包括至少部分地基於對由治療引起的對象的ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵中的一種或更多種中的變化的評估，向對象施用本發明的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑。例如，在本發明的一些實施方案中，可確定施用的本發明的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑對對象的作用，並用於幫助調節隨後施用於對象的本發明的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的量。在一個非限制性實例中，向對象施用本發明的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑，在施用之後確定對象的脂質水平，並且至少部分地基於所確定的水平，較高量的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑被確定爲是期望的，以提高所施用藥劑的生理效應，例如降低或進一步降低對象的脂質水平。在另一個非限制性實例中，向對象施用本發明的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑，在施用之後確定對象的脂質水平，並且至少部分地基於所確定的水平，較低量的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑被期望施用於對象。
因此，本發明的一些實施方案包括評估由對象的先前治療引起的一種或更多種生理特徵的變化，以調節隨後施用於對象的本發明的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的量。本發明的方法的一些實施方案包括1、2、3、4、5、6或更多次確定ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵，以評估和/或監測所施用的本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的效力，並且任選地使用所述確定來調節以下中的一項或更多項：本發明的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的劑量、施用方案和/或施用頻率，以治療對象中的ANGPTL3相關疾病或病症。在本發明的方法的一些實施方案中，向對象施用有效量的本發明的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的期望結果是：與針對對象確定的先前水平或與對照水平相比，對象的脂質水平、血清脂質水平、LDL水平、LDL:HDL比例、甘油三酯水平、對象肝中存在的脂肪等降低。
本文中使用的術語“治療”、“經治療”或“正在治療”當關於ANGPTL3相關疾病或病症使用時，可指降低對象發生ANGPTL3相關疾病或病症的可能性的預防性治療，並且還可指在對象已發生ANGPTL3相關疾病或病症之後的治療，以便與不存在降低ANGPTL3多肽在對象中的活性的治療的對象相比，消除或降低ANGPTL3相關疾病或病症的水平，防止ANGPTL3相關疾病或病症變得更晚期（例如，更嚴重）、和/或减緩對象中ANGPTL3相關疾病或病症的進展。
本發明的藥劑、組合物和方法的某些實施方案可用於抑制ANGPTL3基因表達。本文中使用的提及ANGPTL3基因的表達的術語“抑制”、“沉默”、“降低”、“下調”和“敲低”意指，分別與從ANGPTL3基因轉錄的RNA、表達的ANGPTL3的活性水平或從mRNA翻譯的ANGPTL3的水平的對照水平相比，當細胞、細胞群、組織、器官或對象與本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑接觸（例如，用其處理）時，如在轉錄ANGPTL3基因的細胞、細胞群、組織、器官或對象中通過以下中的一種或更多種測量的ANGPTL3基因的表達降低：從基因轉錄的RNA的水平，表達的ANGPTL3的活性水平，以及從mRNA翻譯的ANGPTL3多肽、蛋白質或蛋白質亞基的水平。在一些實施方案中，對照水平是未與ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑接觸（例如，用其處理）的細胞、組織、器官或對象中的水平。 施用方法
ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的多種施用途徑可用於本發明的方法中。選擇的特定遞送模式將至少部分取决於所治療的特定病症和治療效果所需的劑量。一般而言，本發明的方法可使用醫學上可接受的任何施用模式來實施，意指任何產生治療ANGPTL3相關疾病或病症的治療的有效水平而不引起臨床上不可接受的不良作用的方式。在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可通過經口、經腸、經粘膜、經皮和/或腸胃外途徑施用。術語“腸胃外”包括皮下、靜脈內、鞘內、肌內、腹膜內和胸骨內注射或輸注技術。其他途徑包括但不限於經鼻（例如，通過胃-鼻管）、經皮、經陰道、經直腸、舌下和吸入。本發明的遞送途徑可包括鞘內、心室內或顱內。在本發明的一些實施方案中，可將ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑置於緩慢釋放基質內並通過將該基質置於對象中來施用。在本發明的一些方面，可使用經靶向特定細胞或細胞器的遞送劑包被的納米粒將ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑遞送至對象細胞。多種遞送手段、方法、藥劑是本領域已知的。遞送方法和遞送劑的一些非限制性實例在本文中別處另外提供。在本發明的一些方面中，提及ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的術語“遞送”可意指向細胞或對象施用一種或更多種“裸”ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑序列，並且在本發明的某些方面中，“遞送”意指通過轉染方式向細胞或對象施用，將包含ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的細胞遞送至對象，將編碼ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的載體遞送到細胞和/或對象中，等。使用轉染方式遞送ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可包括向細胞和/或對象施用載體。
在本發明的一些方法中，一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可在製劑中施用，所述製劑可以以可藥用溶液施用，其可常規地包含可藥用濃度的鹽、緩衝劑、防腐劑、相容性載體、助劑和任選的其他治療成分。在本發明的一些實施方案中，ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可與其他治療劑一起配製以用於同時施用。根據本發明的方法，ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可在藥物組合物中施用。通常，藥物組合物包含ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑以及任選的可藥用載體。可藥用載體是本領域普通技術人員公知的。本文中使用的可藥用載體意指不干擾活性成分的生物活性有效性（例如ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑抑制細胞或對象中ANGPTL3基因表達的能力）的無毒材料。施用和遞送用於治療用途的dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的許多方法是本領域已知的，並且可用於本發明的方法中。
可藥用載體包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑和本領域公知的其他材料。示例性的可藥用載體在美國專利No. 5,211,657中被描述，並且其他是本領域技術人員已知的。這樣的製劑可常規地包含鹽、緩衝劑、防腐劑、相容性載體和任選的其他治療劑。當在醫學中使用時，鹽應該是可藥用的，但不可藥用鹽可方便地用於製備其可藥用鹽，並且不排除在本發明的範圍外。這樣的藥理學上和藥學上可接受的鹽包括但不限於由以下酸製備的那些：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。而且，可藥用鹽可被製備爲鹼金屬或鹼土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
本發明方法的一些實施方案包括直接向組織施用一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑。在一些實施方案中，施用化合物的組織是其中ANGPTL3相關疾病或病症存在或可能出現的組織，其一些非限制性實例是肝或腎。直接組織施用可通過直接注射或其他方式來實現。許多經口遞送的化合物自然地到達並穿過肝和腎，並且本發明的治療方法的一些實施方案包括向對象經口施用一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑。單獨或與其他治療劑聯合的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可施用一次，或者替代地它們可以以多次施用來施用。如果施用多次，則ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可通過不同途徑施用。例如，但不旨在是限制性的，第一次（或前幾次）施用可通過皮下方式進行，並且一次或更多次另外的施用可以是經口和/或全身施用。
對於期望全身施用ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的本發明的一些實施方案，ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑可被配製成用於通過注射（例如，通過推注或連續輸注）腸胃外施用。用於注射的製劑可以在有或無添加的防腐劑的情况下以單位劑型存在，例如在安瓿中或在多劑量容器中。ANGPTL3 dsRNA藥劑製劑（也被稱爲藥物組合物）可采用在油性或水性載劑中的如混懸劑、溶液劑或乳劑這樣的形式，並且可包含配製劑，例如混懸劑、穩定劑和/或分散劑。
用於腸胃外施用的製劑包括無菌水溶液或非水溶液劑、混懸劑和乳劑。非水性溶劑的一些實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油（例如橄欖油）和可注射有機酯（例如油酸乙酯）。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或混懸液，包括鹽水和緩衝介質。腸胃外載劑包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖（Ringer’s dextrose）、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化林格（lactated Ringer’s）、或不揮發性油（fixed oil）。靜脈內載劑包括流體和營養補充劑、電解質補充劑（例如基於林格葡萄糖的那些）等。還可存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。較低劑量將產生於其他施用形式，例如靜脈內施用。在對象的響應在施加的初始劑量下不足的情况下，可在患者耐受性允許的程度內采用較高劑量（或通過不同的更局部的遞送途徑以實際上更高的劑量）。根據需要，可使用每天多劑量以實現一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的適當全身或局部水平並且實現ANGPTL3蛋白活性的適當降低。
在另一些實施方案中，本發明的方法包括使用適用於植入接受者（例如對象）中的遞送載劑，例如生物相容性微粒、納米粒或植入物。根據該方法可用的示例性的生物蝕解性（bioerodible）植入物在PCT公開No. WO 95/24929（通過引用併入本文中）中被描述，其描述了用於包含生物大分子的生物相容的生物可降解的聚合物基質。
在本發明的方法中，非生物可降解和生物可降解的聚合物基質二者均可用於將一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑遞送至對象。在一些實施方案中，基質可以是生物可降解的。基質聚合物可以是天然或合成的聚合物。聚合物可基於期望釋放的時間來選擇，通常約數小時至一年或更長。通常，可使用在數小時至三到十二個月的時間內的釋放。聚合物任選爲在水中可吸收其重量的多至約90%的水凝膠形式，並且還任選與多價離子或其他聚合物交聯。
通常，在本發明的一些實施方案中，可以使用生物蝕解性植入物以擴散的方式或通過聚合物基質的降解來遞送ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑。用於這樣的用途的示例性合成聚合物是本領域公知的。可使用本領域已知的方法將生物可降解的聚合物和非生物可降解的聚合物用於遞送ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑。生物黏附性聚合物（例如，生物蝕解性水凝膠）（參見H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587，其教導通過引用併入本文）也可用於遞送用於治療ANGPTL3相關疾病或病症的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑。其他合適的遞送系統可包括定時釋放、延遲釋放或持續釋放遞送系統。這樣的系統可避免ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的重複施用，增加對象和醫療保健專業人員的方便。許多類型的釋放遞送系統是可用的並且是本領域普通技術人員已知的。（參見例如：美國專利No. 5,075,109；4,452,775；4,675,189；5,736,152；3,854,480；5,133,974；和5,407,686（其各自的教導通過引用併入本文）。此外，可使用基於泵的硬件遞送系統，其中一些適於植入。
長期持續釋放植入物的使用可適用於預防性治療對象和處於發生復發性ANGPTL3相關疾病或病症風險中的對象。本文中使用的長期釋放意指植入物被構建和布置爲在至少多至10天、20天、30天、60天、90天、六個月、一年或更長的時間內遞送治療水平的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑。長期持續釋放植入物是本領域普通技術人員公知的，並且包括上述一些釋放系統。
可通過將具有期望純度的分子或化合物與任選的可藥用載體、賦形劑或穩定劑混合[Remington's Pharmaceutical Sciences第21版, (2006)]以凍幹製劑或水溶液的形式製備ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑以用於儲存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在使用的劑量和濃度下對接受者是無毒的，並且包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑（例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲胺；苯扎氯銨，苄索氯銨；苯酚、丁基或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬複合物（例如，Zn-蛋白質複合物）；和/或非離子表面活性劑，例如TWEEN ®、PLURONICS ®或聚乙二醇（PEG）。 細胞、對象和對照
本發明的方法可與細胞、組織、器官和/或對象結合使用。在本發明的一些方面中，對象是人或脊椎動物哺乳動物，包括但不限於狗、猫、馬、牛、羊、小鼠、大鼠和靈長類，例如猴。因此，本發明可用於治療人和非人對象中的ANGPTL3相關疾病或病症。在本發明的一些方面中，對象可以是農場動物、動物園動物、家養動物或非家養動物，並且本發明的方法可用於獸醫預防和治療方案。在本發明的一些實施方案中，對象是人並且本發明的方法可用於人預防和治療方案。
可應用於本發明的對象的一些非限制性實例是被診斷爲患有、疑似患有或有風險患有與高於期望的ANGPTL3表達和/或活性（也稱爲“ANGPTL3表達水平升高”）相關的疾病或病症的對象。與高於期望水平的ANGPTL3表達和/或活性相關的疾病和病症的一些非限制性實例在本文中的別處描述。本發明的方法可應用於在治療時已被診斷爲患有與高於期望的ANGPTL3表達和/或活性相關的疾病或病症的對象，或者被認爲處於患有或發生與高於期望的ANGPTL3表達和/或活性相關的疾病或病症的風險中的對象。在本發明的一些方面中，與高於期望的ANGPTL3表達和/或活性水平相關的疾病或病症是急性疾病或病症，並且在本發明的某些方面中，與高於期望的ANGPTL3表達和/或活性水平相關的疾病或病症是慢性疾病或病症。
在一個非限制性實例中，將本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑施用於被診斷爲患有、疑似患有或有風險患有他汀類抗性高膽固醇血症的對象，所述高膽固醇血症是期望降低ANGPTL3表達的疾病。本發明的方法可應用於在治療時已被診斷爲患有該疾病或病症的對象，或者被認爲處於患有或發生該疾病或病症的風險中的對象。
在另一個非限制性實例中，將本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑施用於被診斷爲患有、疑似患有或有風險患有高脂血症的對象，所述高脂血症是期望降低ANGPTL3表達的疾病。本發明的方法可應用於在治療時已被診斷爲患有該疾病或病症的對象，或者被認爲處於患有或發生該疾病或病症的風險中的對象。
可應用於本發明方法的細胞包括爲體外、體內、離體細胞的細胞。細胞可在對象中、培養物中和/或混懸液中，或處於任何其他合適的狀態或條件。可應用於本發明方法的細胞可以是肝細胞（liver cell）、肝細胞（hepatocyte）、心肌細胞、胰細胞、心血管細胞、腎細胞或其他類型的脊椎動物細胞，包括人和非人哺乳動物細胞。在本發明的某些方面中，可應用於本發明方法的細胞是已知不是疾病細胞的健康正常細胞。在本發明的某些實施方案中，應用於本發明的方法和組合物的細胞是肝細胞（liver cell）、肝細胞（hepatocyte）、心肌細胞、胰細胞、心血管細胞和/或腎細胞。在本發明的某些方面中，對照細胞是正常細胞，但應理解，具有疾病或病症的細胞在特定情况下也可用作對照細胞，例如以比較具有疾病或病症的經處理的細胞與具有疾病或病症的未經處理的細胞的結果等。
根據本發明的方法，可確定ANGPTL3多肽活性的水平並將其與ANGPTL3多肽活性的對照水平進行比較。對照可以是預定值，其可采取多種形式。它可以是單個截止值，例如，中值或平均值。其可基於比較組，例如具有正常水平的ANGPTL3多肽和/或ANGPTL3多肽活性的組以及具有提高水平的ANGPTL3多肽和/或ANGPTL3多肽活性的組來建立。比較組的另一個非限制性實例可以是具有ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種症狀或者被診斷爲ANGPTL3相關疾病或病症的組；沒有該疾病或病症的一種或更多種症狀或者未被診斷爲該疾病或病症的組；已施用本發明的siRNA治療的對象的組；未施用本發明的siRNA治療的對象的組。通常，對照可基於適當年齡段中明顯健康的正常個體或明顯健康的細胞。應理解，根據本發明的對照除了預定值之外還可以是與實驗材料平行測試的材料的樣品。實例包括來自對照群體的樣品或待與實驗樣品平行測試的通過製造產生的對照樣品。在本發明的一些實施方案中，對照可包括未用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑接觸或處理的細胞或對象，並且在這樣的情况下，可將ANGPTL3多肽和/或ANGPTL3多肽活性的對照水平與在與本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑接觸的細胞或對象中的ANGPTL3多肽和/或ANGPTL3多肽活性的水平進行比較。
在本發明的一些實施方案中，針對對象確定的ANGPTL3多肽水平可以是針對被比較的針對同一對象在不同時間確定的ANGPTL3多肽水平的對照水平。在一個非限制性實例中，在從未施用本發明的ANGPTL3治療的對象中獲得的生物樣品中確定ANGPTL3的水平。在一些實施方案中，生物樣品是血清樣品。從對象中獲得的樣品中確定的ANGPTL3多肽的水平可用作對象的基線或對照值。在本發明的治療方法中在向對象施用一次或更多次ANGPTL3 dsRNA藥劑之後，可從對象中獲得一個或更多個另外的血清樣品，並且可將隨後的一個或更多個樣品中的ANGPTL3多肽的水平與對象的對照/基線水平進行比較。這樣的比較可用於評估對象中ANGPTL3相關疾病或病症的發作、進展或消退。例如，從對象中獲得的基線樣品中的ANGPTL3多肽的水平高於在向該對象施用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑之後從同一對象中獲得的水平，表明ANGPTL3相關疾病或病症的消退，並且表明所施用的本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑用於治療ANGPTL3相關疾病或病症的效力。
在本發明的一些方面中，針對對象確定的ANGPTL3多肽和/或ANGPTL3多肽活性的水平中的一種或更多種的值可用作用於在同一對象中稍後比較ANGPTL3多肽和/或ANGPTL3活性的水平的對照值，因此允許評估對象中“基線”ANGPTL3多肽活性的變化。因此，初始ANGPTL3多肽水平和/或初始ANGPTL3多肽活性水平可存在於對象中和/或在對象中確定，並且本發明的方法和化合物可用於降低對象中ANGPTL3多肽和/或ANGPTL3多肽活性的水平，其中初始水平用作該對象的對照水平。
使用本發明的方法，可將本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑和/或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑施用於對象。當與在先前時間點從對象中獲得的血清樣品中的ANGPTL3多肽的施用前水平相比、或與非接觸對照水平（例如對照血清樣品中的ANGPTL3多肽水平）相比，從對象中獲得的血清樣品中的ANGPTL3多肽水平降低至少0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多時，可評估本發明的施用和治療的效力。應理解，ANGPTL3多肽水平和ANGPTL3多肽活性水平二者均與ANGPTL3基因表達水平相關。本發明方法的某些實施方案包括向對象施用有效抑制ANGPTL3基因表達的量的本發明的ANGPTL3 dsRNA和/或ANGPTL3反義藥劑，並且從而在對象中降低ANGPTL3多肽水平並降低ANGPTL3多肽活性水平。
本發明的一些實施方案包括確定從一個或更多個對象中獲得的一個或更多個生物樣品中ANGPTL3多肽的存在、不存在和/或量（在本文中也稱爲水平）。該測定可用於評估本發明的治療方法的效力。例如，本發明的方法和組合物可用於確定生物樣品中ANGPTL3多肽的水平，所述生物樣品從先前用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑和/或ANGPTL3反義藥劑治療的對象中獲得。在從經治療對象中獲得的血清樣品中確定的ANGPTL3多肽水平與針對對象確定的ANGPTL3多肽的治療前水平相比、或與未接觸的對照生物樣品水平相比，低至少0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多，表明向對象施用的治療的效力水平。
在本發明的一些實施方案中，針對對象確定的ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵可以是針對被比較的針對同一對象在不同時間確定的生理特徵的對照確定。在一個非限制性實例中，在從未施用本發明的ANGPTL3治療的對象中獲得的生物樣品（例如血清樣品）中確定生理特徵例如脂質水平和/或HDL:LDL比例。在從對象中獲得的樣品中確定的脂質水平和/或HDL:LDL比例（和/或ANGPTL3疾病或病症的其他生理特徵）可用作對象的基線或對照值。在本發明的治療方法中在向對象施用一次或更多次ANGPTL3 dsRNA藥劑之後，可從對象中獲得一個或更多個另外的血清樣品，並且可將隨後的一個或更多個樣品中的脂質水平和/或HDL:LDL比例分別與對象的對照/基線水平和/或比例進行比較。這樣的比較可用於評估對象中ANGPTL3相關疾病或病症的發作、進展或消退。例如，從對象中獲得的基線樣品中的脂質水平高於在向該對象施用本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑之後從同一對象中獲得的樣品中確定的脂質水平，表明ANGPTL3相關疾病或病症的消退，並且表明所施用的本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑用於治療ANGPTL3相關疾病或病症的效力。
在本發明的一些方面中，針對對象確定的ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵的一種或更多種的值可用作用於在同一對象中稍後比較生理特徵的對照值，因此允許評估對象中“基線”生理特徵的變化。因此，初始生理特徵可存在於對象中和/或在對象中確定，並且本發明的方法和化合物可用於降低對象中ANGPTL3多肽和/或ANGPTL3多肽活性的水平，其中初始生理特徵確定用作該對象的對照。
使用本發明的方法，可將有效量的本發明的ANGPTL3 dsRNA藥劑和/或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑施用於對象以治療ANGPTL3疾病或病症。本發明的施用和治療的效力可通過確定ANGPTL3疾病或病症的一種或更多種生理特徵的變化來評估。在一個非限制性實例中，與在先前時間點從對象中獲得的血清樣品中的施用前脂質相比、或與非接觸對照水平（例如對照血清樣品中的脂質水平）相比，從對象中獲得的血清樣品中的脂質水平降低了至少0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。應理解，脂質水平、HDL水平、HDL:LDL比例、甘油三酯水平、對象的肝中脂肪的量各自與ANGPTL3基因表達水平相關。本發明方法的某些實施方案包括向對象施用有效量的本發明的ANGPTL3 dsRNA和/或ANGPTL3反義藥劑以抑制ANGPTL3基因表達，並且從而降低脂質水平、HDL水平、HDL:LDL比例、甘油三酯水平，對象的肝中脂肪的量，或者另外地積極影響對象中ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵。
本發明的一些實施方案包括使用例如但不限於以下方法來確定ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵的存在、不存在和/或變化：（1）評估從一個或更多個對象中獲得的一個或更多個生物樣品的生理特徵；（2）對對象進行成像（例如但不限於獲得肝成像）；以及（3）或者對象的身體檢查。該確定可用於評估本發明的治療方法的效力。 藥盒
藥盒也在本發明的範圍內，其包含一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑和/或ANGPTL3反義多核苷酸藥劑以及其在本發明方法中使用的說明書。本發明的藥盒可包含可用於治療ANGPTL3相關疾病或病症的ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3有義多核苷酸和ANGPTL3反義多核苷酸藥劑中的一種或更多種。包含一種或更多種ANGPTL3 dsRNA藥劑、ANGPTL3有義多核苷酸和ANGPTL3反義多核苷酸藥劑的藥盒可被製備用於本發明的治療方法。本發明藥盒的組分可包裝在水性介質中或以凍幹形式包裝。本發明的藥盒可包含載體，所述載體被分隔成其中嚴密封閉地容納一個或更多個容器裝置或一系列容器裝置，例如測試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器等。第一容器裝置或一系列容器裝置可包含一種或更多種化合物，例如ANGPTL3 dsRNA藥劑和/或ANGPTL3有義或反義多核苷酸藥劑。第二容器裝置或一系列容器裝置可以包含靶向劑、標記劑、遞送劑等，在本發明治療方法的一個實施方案中其可作爲待施用的ANGPTL3 dsRNA藥劑和/或ANGPTL3反義多核苷酸的一部分被包括在內。
本發明的藥盒還可包含說明書。說明書通常以書面形式，並爲實施通過藥盒實現的治療和基於該治療作出决定提供指導。
提供以下實施例以舉例說明本發明實踐的具體實例，並不旨在限制本發明的範圍。對本領域普通技術人員來說明顯的是，本發明將以多種組合物和方法應用。 實施例 實施例1. ANGPTL3 RNAi藥劑的合成。
上表2至5中示出的ANGPTL3 RNAi藥劑雙鏈體是根據以下一般程序合成的： 使用基於亞磷醯胺化學物質的充分確立的固相合成方法在寡核苷酸合成儀上合成siRNA的有義鏈序列和反義鏈序列。寡核苷酸鏈增長通過4步循環實現：脫保護、縮合、加帽和氧化或硫化步驟以用於添加每個核苷酸。合成是在由可控孔度玻璃（controlled pore glass）（CPG，1000 Å）製成的固體支持物上進行的。單體亞磷醯胺購自商業來源。根據本文中實施例2至3的程序合成具有GalNAc配體簇的亞磷醯胺（作爲非限制性實例的GLPA1和GLPA2）。對於用於體外篩選的siRNA（表2），以2 µmol規模進行合成，並且對於用於體內測試的siRNA（表3、4和5），以5 µmol或更大的規模進行合成。在GalNAc配體（作爲非限制性實例的GLO-0）連接在有義鏈的3’末端的情况下，使用GalNAc配體連接的CPG固體支持物。在GalNAc配體（作爲非限制性實例的GLS-1或GLS-2）連接在有義鏈的5’末端的情况下，使用GalNAc亞磷醯胺（作爲非限制性實例的GLPA1或GLPA2）用於最後的偶聯反應。二氯甲烷中的三氯乙酸（TCA）3%用於4,4’-二甲氧基三苯甲基保護基（DMT）的脫保護。5-乙硫基-1H-四唑用作活化劑。THF/Py/H 2O中的I 2和吡啶/MeCN中的苯乙醯二硫醚（PADS）分別用於氧化和硫化反應。在最終的固相合成步驟之後，切割固體支持物結合的低聚物，並通過用1:1體積的40重量%甲胺水溶液和28%氫氧化銨溶液處理來除去保護基團。爲了合成用於體外篩選的siRNA，將粗混合物濃縮。將剩餘的固體溶解在1.0 M NaOAc中，並添加冰冷的EtOH以沉澱出作爲鈉鹽的單鏈產物，其無需進一步純化即可用於退火。爲了合成用於體內測試的siRNA，通過離子對反相HPLC（ion pairing reversed phase HPLC，IP-RP-HPLC）來進一步純化粗單鏈產物。來自IP-RP-HPLC的經純化單鏈寡核苷酸產物通過溶解在1.0 M NaOAc中而轉化爲鈉鹽並且通過添加冰冷的EtOH沉澱。等摩爾互補有義鏈和反義鏈寡核苷酸的退火在水中進行，以形成雙鏈siRNA產物，將其凍幹以得到蓬鬆的白色固體。 表6. 表2中提供的siRNA的質量和純度信息 - 參見雙鏈體ID號。
雙鏈體ID AD# 有義鏈 反義鏈
計算的 質量 觀察到的質量 HPLC 純度 計算的 質量 觀察到的 質量 HPLC 純度
AD00001 6972.77 6973.28 90% 6941.70 6941.84 ＞80%
AD00002 7034.85 7035.29 92% 6894.64 6895.1 ＞80%
AD00003 6948.74 6949.23 86% 6980.75 6980.99 84%
AD00004 7002.85 7003.42 85% 6896.61 6897.16 ＞80%
AD00005 6955.78 6956.4 86% 6958.68 6959.34 ＞80%
AD00006 6955.79 6956.27 85% 6958.69 6959.2 ＞80%
AD00007 6943.68 6944.1 87% 6970.80 6971.41 ＞80%
AD00008 6942.70 6943.41 86% 6986.79 6986.93 ＞80%
AD00009 7025.89 7026.56 89% 6873.57 6874.09 82%
AD00010 6978.83 6979.2 85% 6935.66 6936.29 89%
AD00011 7137.95 7138.63 86% 6791.54 6792.11 88%
AD00012 7074.87 7075.56 87% 6854.62 6855.26 ＞80%
AD00013 6947.76 6948.47 86% 6996.73 6997.31 85%
AD00014 6993.82 6994.51 85% 6950.66 6950.84 85%
AD00015 7009.83 7010.53 84% 6949.67 6950.27 84%
AD00016 6978.83 6979.56 86% 6935.65 6936.25 ＞80%
AD00017 7056.91 7057.52 87% 6887.58 6888.14 85%
AD00018 7016.88 7017.58 86% 6927.62 6928.25 83%
AD00019 7016.90 7017.34 87% 6927.64 6928.46 85%
AD00020 6883.71 6884.18 85% 7075.82 7076.53 ＞80%
AD00021 6883.71 6884.16 88% 7075.80 7076.35 89%
AD00022 6885.68 6886.17 86% 7043.82 7044.36 89%
AD00023 6902.66 6903.06 89% 7026.84 7027.34 88%
AD00024 6878.62 6879.13 85% 7065.84 7066.38 88%
AD00025 6902.67 6903.06 87% 7026.83 7027.36 89%
AD00026 6902.66 6903.09 87% 7026.84 7027.36 87%
AD00027 6919.65 6920.09 89% 7009.83 7010.01 81%
AD00028 6958.69 6959.22 90% 6985.82 6986.45 88%
AD00029 6971.78 6972.48 88% 6957.69 6958.29 86%
AD00030 7073.88 7074.55 87% 6870.61 6871.25 86%
AD00031 7120.95 7121.52 86% 6808.54 6809.2 85%
AD00032 7057.88 7058.26 87% 6871.61 6872.22 88%
AD00033 6994.83 6995.26 85% 6934.67 6935.23 89%
AD00034 7017.86 7018.53 86% 6911.62 6912.2 87%
AD00035 7152.97 7153.65 88% 6806.57 6807.27 86%
AD00036 7057.89 7058.52 86% 6871.61 6872.78 ＞80%
AD00037 7073.90 7074.24 84% 6870.61 6871.2 88%
AD00038 7034.87 7035.46 86% 6894.64 6895.21 82%
AD00039 6942.68 6943.32 86% 6986.79 6987.38 86%
AD00040 7193.95 7194.55 85% 6750.52 6751 85%
AD00041 7080.94 7081.51 87% 6848.55 6849.29 81%
AD00042 7051.83 7052.46 86% 6877.67 6878.18 83%
AD00043 6972.79 6973.59 89% 6941.70 6942.23 81%
AD00044 7001.87 7002.43 89% 6912.61 6913.22 82%
AD00045 7025.84 7026.44 91% 6948.69 6949.15 82%
AD00046 6954.81 6955.27 86% 6974.68 6975.21 83%
AD00047 7010.83 7011.44 87% 6933.69 6934.26 85%
AD00048 6994.82 6995.43 88% 6934.66 6935.26 83%
AD00049 7018.86 7019.6 ＞80% 6895.62 6896.25 ＞80%
AD00050 7096.93 7096.96 ＞80% 6847.57 6848.13 ＞80%
實施例2. 中間體A和中間體B的製備。
如以下方案1所示，中間體A是通過用二氯甲烷（DCM）中的三氟甲磺酸三甲基甲矽烷基酯（TMSOTf）處理可商購的半乳糖胺五乙酸酯來合成的。隨後用Cbz保護的2-(2-氨基乙氧基)乙烷-1-醇進行糖基化，以得到化合物II。通過氫化除去Cbz保護基，以得到作爲三氟乙酸（TFA）鹽的中間體A。除了使用Cbz保護的2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙烷-1-醇作爲起始物質之外，基於相同的方案合成中間體B。 方案一
向化合物I（20.0 g，51.4 mmol）在100 mL 1,2-二氯乙烷（DCE）中的溶液中添加TMSOTf（17.1 g，77.2 mmol）。將所得反應溶液在60℃下攪拌2小時，並且然後在25℃下攪拌1小時。將經4 Å粉末分子篩（10 g）乾燥的在DCE（100 mL）中的Cbz保護的2-(2-氨基乙氧基)乙烷-1-醇（13.5 g，56.5 mmol）在N 2氣氛下在0℃下逐滴添加至上述反應溶液中。將所得反應混合物在N 2氣氛下在25℃下攪拌16小時。將反應混合物過濾並用飽和NaHCO 3（200 mL）、水（200 mL）和飽和鹽水（200 mL）洗滌。將有機層經無水Na 2SO 4乾燥，過濾並在在减壓下下濃縮，以得到粗產物，將其與2-甲基四氫呋喃/庚烷（5/3，v/v，1.80 L）一起研磨2小時。將所得混合物過濾並乾燥，以得到作爲白色固體的化合物II（15.0 g，50.3%產率）。
向經乾燥和氬氣吹掃的氫化瓶中小心地添加10% Pd/C（1.50 g），隨後添加10 mL四氫呋喃（THF），並且然後添加化合物II（15.0 g，26.4 mmol）在THF（300 mL）和TFA（三氟乙酸，3.00 g，26.4 mmol）中的溶液。將所得混合物脫氣並用H 2吹掃三次並在H 2（45 psi）氣氛下在25℃下攪拌3小時。薄層色譜（thin-layer chromatography）（TLC，溶劑：DCM:MeOH=10:1）表明化合物II已完全消耗。將反應混合物過濾並在减壓下濃縮。將剩餘物溶解在無水DCM（500 mL）中並濃縮。將該過程重複3次以得到作爲泡沫狀白色固體的中間體A（14.0 g，96.5%產率）。 。
中間體B是使用與用於中間體A的合成類似的程序來合成的。 。 C 20H 34N 2O 11的質量計算值：478.22；實測值：479.3（M+H +）。 實施例3. GalNAc配體簇亞磷醯胺GLPA1、GLPA2和GLPA15的合成。
根據以下方案2來製備GLPA1和GLPA2。從苄基保護的丙烷-1,3-二胺開始，將其用2-溴乙酸叔丁酯進行烷基化以得到三酯化合物I。通過氫化除去苄基保護基以得到仲胺化合物II。醯胺與6-羥基己酸偶聯得到化合物III。然後在二氧六環中的HCl處理後除去叔丁基保護基，以產生三酸化合物IV。在三酸化合物IV與中間體A或中間體B之間進行醯胺偶聯，以得到化合物Va或Vb。亞磷醯胺GLPA1或GLPA2是通過用2-氰乙基N,N-二異丙基氯亞磷醯胺和催化量的1H-四唑使化合物Va或Vb磷酸化來合成的。 方案二
向N-苄基-1,3-丙二胺（5.00 g，30.4 mmol）在二甲基甲醯胺（DMF，100 mL）中的溶液中添加2-溴乙酸叔丁酯（23.7 g，121 mmol），隨後逐滴添加二異丙基乙胺（DIEA，23.61 g，182 mmol）。將所得反應混合物在25℃至30℃下攪拌16小時。LCMS顯示N-苄基-1,3-丙二胺已完全消耗。將反應混合物用H 2O（500 mL）稀釋並用EtOAc（500 mL×2）萃取。將合併的有機物用飽和鹽水（1 L）洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾，並並在减壓下濃縮以得到粗產物，將其通過矽膠柱色譜（梯度：石油醚:乙酸乙酯爲20:1至5:1）純化。得到作爲無色油狀物的化合物I（12.1 g，78.4%產率）。 。
用氬氣吹掃經乾燥的氫化瓶三次。添加Pd/C（200 mg，10%），隨後添加MeOH（5 mL），並且然後添加化合物I（1.00 g，1.97 mmol）在MeOH（5 mL）中的溶液。將反應混合物在真空下脫氣並用H 2重新填充。將該過程重複三遍。將混合物在H 2（15 psi）氣氛下在25℃下攪拌12小時。LCMS顯示化合物I已完全消耗。在N 2氣氛下在减壓下過濾反應混合物。在减壓下濃縮濾液，以得到作爲黃色油狀物的化合物II（655 mg，79.7%產率），其無需進一步純化即可用於下一步。 。
將化合物II（655 mg，1.57 mmol）、6-羥基己酸（249 mg，1.89 mmol）、DIEA（1.02 g，7.86 mmol）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI，904 mg，4.72 mmol）和1-羥基苯并三唑（HOBt，637 mg，4.72 mmol）在DMF（6 mL）中的混合物脫氣並用N 2吹掃3次，並且然後在N 2氣氛下在25℃下攪拌3小時。LCMS表明期望的產物。將反應混合物用H 2O（10 mL）稀釋並用EtOAc 20 mL（10 mL×2）萃取。合併有機物並用飽和鹽水（20 mL）洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾，並濃縮以得到粗產物，將其通過矽膠柱色譜（梯度：石油醚:乙酸乙酯爲5:1至1:1）純化以得到作爲黃色油狀物的化合物III（650 mg，77.8%產率）。 。 C 27H 50N 2O 8的質量計算值：530.36；實測值：531.3（M+H +）。
將化合物III（5.5 g，10.3 mmol）在HCl/二氧六環（2 M，55 mL）中的混合物在25℃下攪拌3小時。LCMS顯示完全消耗化合物III。將反應混合物過濾，用EtOAc（50 mL）洗滌，並在减壓下乾燥，以得到粗產物。將其溶解在CH 3CN（50 mL）中，在真空下除去揮發物。將該過程重複3次，以得到作爲白色固體的化合物IV（2.05 g，54.5%產率）。 。
將化合物IV（500 mg，1.05 mmol）、中間體A（2.02 g，3.67 mmol）、DIEA（813 mg，6.30 mmol）、EDCI（704 mg，3.67 mmol）和HOBt（496 mg，3.67 mmol）在DMF（10 mL）中的混合物脫氣並用N 2吹掃3次，並且然後將混合物在N2氣氛下在25℃下攪拌3小時。LCMS表明期望的產物。將反應混合物通過添加H 2O（10 mL）來淬滅，用DCM（10 mL×2）萃取。將合併的有機物用10%檸檬酸（20 mL）萃取。將水相用飽和NaHCO 3溶液中和並用DCM（10 mL×2）再萃取。將有機物經硫酸鈉乾燥，過濾並在减壓下濃縮，以得到作爲白色固體的化合物Va（570 mg，0.281 mmol，26.8%產率）。 。
在環境溫度下在N 2下向化合物Va（260 mg，0.161 mmol）在無水DCM（5 mL）中的溶液中添加二異丙基銨四唑化物（30.3 mg，0.177 mmol），隨後逐滴添加3-雙(二異丙基氨基)膦醯氧基丙腈（194 mg，0.645 mmol）。將反應混合物在20℃至25℃下攪拌2小時。LCMS表明化合物Va已完全消耗。在冷却至-20℃之後，在0℃下將反應混合物添加至攪拌的鹽水/飽和NaHCO 3水溶液（1:1，5 mL）中。在攪拌1分鐘之後，添加DCM（5 mL）。分離層。將有機物用鹽水/飽和NaHCO 3水溶液（1:1，5 mL）洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾並濃縮至約1 mL體積。在攪拌的情况下將剩餘物溶液逐滴添加至20 mL甲基叔丁基醚（MTBE）中。這導致白色固體沉澱。將混合物離心，並收集固體。將固體重新溶解在1 mL DCM中並通過添加MTBE（20 mL）沉澱。通過離心再次分離固體。將收集的固體溶解在無水CH 3CN中。除去揮發物。將該過程再重複兩次，以得到作爲白色固體的GalNAc配體亞磷醯胺化合物GLPA1（153 mg，84.4 μmol）。 。
除了使用中間體B之外，使用相同的程序合成GalNAc配體亞磷醯胺化合物GLPA2。 。
根據以下方案3來製備GLPA15。 方案三
從仲胺化合物I（方案2中的化合物II）開始，引入Cbz保護以得到化合物II。通過用酸處理來除去化合物II的叔丁基，以得到三酸化合物III。化合物III與中間體A進行醯胺偶聯以得到化合物IV。通過氫化除去化合物IV的Cbz保護基，以得到仲胺化合物V，其與戊二酸酐反應以得到羧基化合物VI。化合物VI與呱啶-4-醇在醯胺偶聯反應條件下反應以得到化合物VII。通過用2-氰乙基N,N-二異丙基氯亞磷醯胺和催化量的1H-四唑處理化合物VII來合成亞磷醯胺化合物GLPA15。 。
在某些研究中，用於將包含GalNAc（本文中也稱爲GalNAc遞送化合物）的靶向基團與有義鏈的5’末端連接的方法包括使用合成過程在固相合成的最後的偶聯步驟中使用GalNAc亞磷醯胺（GLPA1），所述合成過程例如如果進行了向有義鏈的5’末端添加核苷酸的寡核苷酸鏈增長，則使用的過程。
在一些研究中，將包含GalNAc的靶向基團與有義鏈的3’末端連接的方法包括使用包含GLO-n的固體支持物（CPG）。在一些研究中，將包含GalNAc的靶向基團與有義鏈的3’末端連接的方法包括通過酯鍵將GalNAc靶向基團與CPG固體支持物連接，並在合成有義鏈時使用得到的具有所連接的GalNAc靶向基團的CPG，這導致GalNAc靶向基團連接在有義鏈的3’末端。 實施例4. ANGPTL3 siRNA雙鏈體的體外篩選
對Hep3B細胞進行胰蛋白酶消化並調節至適當的密度，並接種到96孔板中。使用Lipofectamine RNAiMax（Invitrogen-13778-150）根據製造商的建議遵循方案在接種的同時用測試siRNA或對照siRNA轉染細胞。siRNA以兩種濃度（0.2 nM和1.0 nM）一式三份地進行測試，而對照siRNA以從4.6 pM至10 nM進行3倍稀釋的8個濃度一式三份地進行測試。
將細胞在轉染之後孵育24小時。除去培養基，並收穫細胞用於RNA提取。通過RNeasy® 96 Kit（QIAGEN-74182）根據手册提取總RNA。
使用FastKing RT Kit（使用gDNA酶，Tiangen-KR116-02）根據手册合成cDNA。通過qPCR用TaqMan基因表達測定（ANGPTL3，Thermo，測定ID-Hs00205581_m1）來確定相對於GAPDH（TaqMan基因表達測定，Thermo，測定ID-Hs02786624_g1）的表達歸一化的人ANGPTL3 cDNA表達。通過比較siRNA與經PBS處理的樣品的ANGPTL3表達來計算抑制百分比。 表7提供了使用多種ANGPTL3 RNAi藥劑抑制ANGPTL3表達的體外研究的實驗結果。使用的雙鏈體序列對應於表2中示出的序列。這些siRNA的質量和純度信息在表6中提供。
雙鏈體 AD#/AV# 平均抑制%
1 nM 0.2 nM
平均 SD 平均 SD
AD00001 -5.19 5.52 -0.78 10.86
AD00002 12.15 5.42 -19.15 13.82
AD00003 62.73 4.90 25.33 6.36
AD00004 57.79 4.53 27.11 2.89
AD00005 15.53 5.08 -29.56 52.97
AD00006 41.97 4.52 12.94 2.66
AD00007 69.11 2.77 51.52 7.13
AD00008 0.82 6.73 -15.73 21.57
AD00009 56.00 5.01 21.08 3.43
AD00010 -3.40 10.63 -16.26 1.85
AD00011 23.78 3.25 -1.38 3.37
AD00012 -21.96 3.21 -15.78 3.86
AD00013 70.81 4.85 46.13 6.26
AD00014 70.20 4.65 32.31 9.84
AD00015 40.80 10.10 12.68 4.57
AD00016 6.87 9.41 -9.49 4.42
AD00017 30.80 7.22 13.91 5.95
AD00018 38.10 7.57 9.06 8.13
AD00019 19.58 9.07 3.75 8.63
AD00020 15.40 13.52 6.17 5.77
AD00021 28.15 7.00 19.27 2.01
AD00022 37.00 9.75 11.35 10.36
AD00023 65.04 4.58 34.56 5.92
AD00024 48.97 1.68 31.66 6.61
AD00025 61.31 1.68 19.91 2.19
AD00026 63.83 4.01 26.37 6.87
AD00027 61.27 4.59 46.87 4.54
AD00028 33.07 5.81 8.61 13.96
AD00029 60.69 4.00 39.93 2.51
AD00030 45.51 3.70 22.33 1.27
AD00031 54.39 3.11 25.73 3.89
AD00032 36.39 3.99 3.76 13.22
AD00033 68.59 3.52 33.45 10.79
AD00034 75.68 1.50 34.45 5.85
AD00035 49.84 4.63 10.10 3.16
AD00036 0.77 2.56 -9.31 7.84
AD00037 36.14 2.80 11.00 1.06
AD00038 12.46 7.03 6.59 5.32
AD00039 61.61 5.84 26.26 2.53
AD00040 79.03 1.57 48.36 2.65
AD00041 49.34 6.87 18.31 4.89
AD00042 89.60 1.39 75.58 2.05
AD00043 49.66 6.43 18.20 1.58
AD00044 64.20 3.93 28.78 1.80
AD00045 61.35 3.18 29.41 6.91
AD00046 58.59 2.08 13.60 1.45
AD00047 33.71 4.50 4.87 4.54
AD00048 46.07 5.28 20.77 9.12
AD00049 35.83 3.07 12.33 4.69
AD00050 40.56 5.91 23.04 6.28
AV01087 92.70 0.21 89.84 0.24
AV01088 89.22 0.46 80.21 3.75
AV01089 86.31 2.92 69.73 2.30
AV01091 83.55 1.69 62.86 1.78
AV01092 88.15 0.60 77.92 1.80
AV01093 83.68 5.04 69.18 3.90
AV01094 88.17 1.24 70.78 2.59
AV01095 86.05 1.80 65.41 2.88
AV01096 87.50 0.50 76.20 1.00
AV01097 94.68 0.31 90.56 0.91
AV01098 94.19 0.35 87.02 2.24
AV01099 90.29 1.30 85.08 1.39
AV01100 92.59 1.52 87.37 2.42
AV01101 93.55 0.64 89.64 0.64
AV01102 93.18 1.00 89.49 0.65
AV01103 95.83 0.46 92.55 0.38
AV01104 94.35 0.82 91.25 0.83
AV01105 90.25 0.76 84.18 3.34
AV01106 90.51 1.29 83.34 2.67
AV01107 89.69 1.12 79.67 0.52
AV01108 85.19 1.10 66.55 1.85
AV01109 93.62 1.44 89.83 0.67
AV01110 92.26 1.88 84.95 1.73
AV01111 91.76 2.29 87.96 0.48
AV01112 87.14 2.11 70.92 3.59
AV01113 92.81 0.27 82.52 0.99
AV01114 94.11 0.21 89.72 0.26
AV01115 91.31 0.64 76.63 2.43
AV01116 93.66 1.97 84.28 5.60
實施例5. ANGPTL3 siRNA雙鏈體的體內測試
爲了評估ANGPTL3 siRNA的體內活性，使用了經編碼人ANGPTL3基因的AAV感染的小鼠（每組4只小鼠）。在siRNA給藥之前14天，通過靜脈內施用25 μL編碼人ANGPTL3基因的腺相關病毒8（AAV8）載體的儲備溶液感染雌性C57BL/6J小鼠。在第0天，向小鼠皮下施用單一的3 mg/kg的ANGPTL3 siRNA藥劑或PBS。在第0天在siRNA給藥之前以及在第7天在終止時收集血液樣品。通過ELISA測定根據製造商推薦的方案（R&D Systems, Human Angiopoietin-like 3 Quantikine ELISA Kit）來測量人ANGPTL3蛋白濃度。通過比較經siRNA處理組與經PBS處理組的第7天小鼠血漿樣品中的人ANGPTL3水平來計算敲低百分比。化合物AD00112、AD00135和AD00143（表3）的敲低活性百分比分別爲91%、83%和84%。在本實施例中，所述化合物AD00112、AD00135和AD00143中的GLO-0是指Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958−16961中的化合物GalNAc3。 實施例6 ANGPTL3 siRNA雙鏈體的體內測試
在siRNA給藥之前14天，通過靜脈內施用編碼人ANGPTL3和螢光素酶基因的腺相關病毒8（AAV8）載體的溶液感染雌性C57BL/6J小鼠（每組4只）。在第0天，向小鼠皮下施用單一的3 mg/kg的ANGPTL3 siRNA藥劑或PBS。在第0天在siRNA給藥之前以及在第7天在終止時收集血液樣品。分離血清樣品並按照製造商推薦的方案測量血清樣品的螢光素酶活性。由於人ANGPTL3的表達水平與螢光素酶的表達水平相關，因此螢光素酶活性的測量是ANGPTL3表達的替代。ANGPTL3的剩餘百分比通過比較來自每只小鼠的siRNA處理前（第0天）和處理後（第7天）的樣品中的螢光素酶活性來計算，並通過在相同時間段期間來自對照處理的小鼠樣品中的螢光素酶活性的變化來歸一化。結果總結在表8中。在本實施例中，表3中所述化合物中的GLO-0是指Jayaprakash , et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958−16961中的化合物GalNAc3。 表8提供了使用多種ANGPTL3 RNAi藥劑抑制ANGPTL3表達的體內研究的實驗結果。使用的雙鏈體序列對應於表3和表4中示出的序列。
雙鏈體AD# 第7天, 相對於PBS(平均 ± SD) 雙鏈體 AD# 第7天, 相對於第0天剩餘的螢光素酶活性，通過PBS處理組中的變化歸一化(平均 ± SD)
PBS 1±0.21 AD00135-2 0.11±0.04
AD00108 0.2±0.06 AD00136 0.09±0.02
AD00108-1 0.24±0.03 AD00136-1 0.13±0.06
AD00112 0.13±0.04 AD00142 0.16±0.04
AD00112-1 0.18±0.02 AD00143 0.15±0.05
AD00133 0.13±0.02 AD00143-2 0.22±0.07
AD00134 0.17±0.03 AD00145 0.21±0.04
AD00135 0.13±0.06 AD00146 0.16±0.05
實施例7 ANGPTL3 siRNA雙鏈體的體內測試
在siRNA給藥之前14天，通過靜脈內施用編碼人ANGPTL3和螢光素酶基因的腺相關病毒8（AAV8）載體的溶液感染雌性C57BL/6J小鼠。在第0天，向小鼠皮下施用1、3或10 mg/kg的單劑量AD00112-2或PBS。在第0天在siRNA給藥之前以及在第7天在終止時收集血液樣品。分離血清樣品並按照製造商推薦的方案測量血清樣品的螢光素酶活性。由於人ANGPTL3的表達水平與螢光素酶的表達水平相關，因此螢光素酶活性的測量是ANGPTL3表達的替代。結果總結在表9中。 表9提供了體內研究的實驗結果。使用的雙鏈體序列對應於表4中示出的序列。
雙鏈體AD# 劑量 (mg/kg) 第7天, 相對於第0天剩餘的螢光素酶活性，通過PBS處理組中的變化歸一化(平均 ± SD)
AD00112-2 1 0.33 ± 0.06
AD00112-2 3 0.20 ± 0.09
AD00112-2 10 0.11 ± 0.03
實施例8 NHP PD模型中ANGPTL3 siRNA雙鏈體的體內測試
將雄性食蟹猴（13至22年齡，體重7至9千克，每組4只猴）納入研究。每只猴在第1天接受用4 mg/kg的在PBS中配製的測試物中的一種進行的皮下注射（siRNA給藥前）。在禁食過夜之後，在第-7（給藥前）、1（給藥前）、8、15、22、29、43和50天抽取血液樣品。通過ELISA方法測量血清中ANGPTL3蛋白濃度。用化合物AD00112、AD00135和AD00136給藥的組的ANGPTL3剩餘百分比（相對於第1天歸一化，siRNA給藥前）在圖1中示出。還測量了脂質譜。血清中HDL、LDL、TC（總膽固醇）和TG（甘油三酯）水平的變化百分比（相對於第1天歸一化，siRNA給藥前）分別在圖2、3、4和5中示出。對於用siRNA化合物給藥的所有三組中的猴，觀察到血清中ANGPTL3的顯著和持續降低（最高86%）。還觀察到TG的顯著降低（最高降低60%）和HDL-C和TC的適度降低。 實施例9 NHP疾病模型中ANGPTL3 siRNA雙鏈體的體內測試
篩選雄性食蟹猴（13至21年齡）的基線脂質譜，其包含HDL、LDL、TC（總膽固醇）和TG（甘油三酯）。選擇基線LDL（1.03至2.36 mmol/L）和TG（1.42至6.71 mmol/L）水平升高的二十只猴並隨機分爲2組，以在第0天接受單次皮下注射鹽水或10 mg/kg的AD00112-2。在禁食過夜之後，在第-10（給藥前）、-2（給藥前）、7、14、21、28、35和42天抽取血液樣品。通過ELISA方法測量血清中ANGPTL3蛋白濃度。用鹽水或10 mg/kg的化合物AD00112-2給藥的各組的ANGPTL3剩餘百分比（相對於基線歸一化，第-10和-2天的平均值）在圖6中示出。還測量了脂質譜。血清中HDL、LDL、TC（總膽固醇）和TG（甘油三酯）水平的變化百分比（相對於基線歸一化，siRNA給藥前）分別在圖7、8、9和10中示出。觀察到ANGPTL3濃度和TG水平的深度和持續降低。還觀察到HDL-C、LDL-C和TC水平的適度降低。 等同方案
雖然本文中已經描述並舉例說明了本發明的數個實施方案，但是本領域普通技術人員將容易想到用於執行本文所述功能和/或獲得本文所述結果和/或一個或更多個優點的多種其他方式和/或結構，並且每個這樣的變化和/或修改均被認爲在本發明的範圍內。更一般地，本領域技術人員將容易理解，本文中所述的所有參數、尺寸、材料和配置旨在是示例性的，並且實際的參數、尺寸、材料和/或配置將取决於使用本發明的教導的一個或更多個具體應用。本領域技術人員將認識到或僅使用常規實驗就能夠確定本文中所述的本發明具體實施方案的許多等同方案。因此，應理解，前述實施方案僅以實例的方式呈現，並且在所附權利要求書及其等同方案的範圍內，本發明可以以不同於具體描述且要求保護的方式來實施。本發明涉及本文中所述的每種單獨特徵、系統、物品、材料和/或方法。另外，如果這樣的特徵、系統、物品、材料和/或方法不相互不一致，則兩種或更多種這樣的特徵、系統、物品、材料和/或方法的任意組合均包括在本發明的範圍內。
本文中定義和使用的所有定義應理解爲優先於字典定義、通過引用併入的文件中的定義和/或所定義術語的一般含義。
除非明確地指出相反，否則如本文在說明書和權利要求書中使用的沒有數量詞修飾的名詞應理解成意指“至少一個/種”。
如本文在說明書和權利要求書中使用的短語“和/或”應理解爲意指如此連接的要素中的“一者或二者”，即要素在一些情况下聯合存在，而在另一些情况下分離存在。除非明確指出相反，否則除由“和/或”短語明確確定的要素之外可以任選地存在其他要素，不管與這些明確確定的要素相關還是不相關。
本申請中引用或參考的所有參考文獻、專利和專利申請以及出版物在此通過引用整體併入本文。
圖1是示出相對於第1天（在siRNA給藥之前）歸一化的猴血漿中ANG3的變化百分比的圖。
圖2是示出相對於第1天（在siRNA給藥之前）歸一化的猴血漿中HDL的變化百分比的圖。
圖3是示出相對於第1天（在siRNA給藥之前）歸一化的猴血漿中LDL的變化百分比的圖。
圖4是示出相對於第1天（在siRNA給藥之前）歸一化的猴血漿中總膽固醇（total cholesterol，TC）的變化百分比的圖。
圖5是示出相對於第1天（在siRNA給藥之前）歸一化的猴血漿中甘油三酯（TG）的變化百分比的圖。
圖6是示出相對於基線歸一化的猴血漿中ANG3的百分比變化的圖。
圖7是示出相對於基線（在siRNA給藥之前）歸一化的猴血漿中HDL的變化百分比的圖。
圖8是示出相對於基線（在siRNA給藥之前）歸一化的猴血漿中LDL的變化百分比的圖。
圖9是示出相對於基線（在siRNA給藥之前）歸一化的猴血漿中總膽固醇（TC）的變化百分比的圖。
圖10是示出相對於基線（在siRNA給藥之前）歸一化的猴血漿中甘油三酯（TG）的變化百分比的圖。
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Claims (93)

  1. 用於抑制血管生成素樣3（ANGPTL3）表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑，其中所述dsRNA藥劑包含有義鏈和反義鏈，所述反義鏈中的第2至18位核苷酸包含ANGPTL3 RNA轉錄物的互補區，其中所述互補區包含與表1至5之一中列出的反義序列之一相差0、1、2或3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且任選地包含靶向配體。
  2. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中ANGPTL3 RNA轉錄物的所述互補區包含與表1至5之一中列出的所述反義序列之一相差不超過3個核苷酸的至少15、16、17、18或19個連續核苷酸。
  3. 權利要求1或2所述的dsRNA藥劑，其中dsRNA的所述反義鏈與SEQ ID NO: 235的任一個靶區域至少基本上互補，並且在表1至5的任一個中提供。
  4. 權利要求3所述的dsRNA藥劑，其中dsRNA的所述反義鏈與SEQ ID NO: 235的任一個靶區域完全互補，並且在表1至5的任一個中提供。
  5. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述dsRNA藥劑包含表1至5的任一個中所示的有義鏈序列，其中所述有義鏈序列與所述dsRNA藥劑中的反義鏈序列至少基本上互補。
  6. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述dsRNA藥劑包含表1至5的任一個中所示的有義鏈序列，其中所述有義鏈序列與所述dsRNA藥劑中的反義鏈序列完全互補。
  7. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述dsRNA藥劑包含表1至5的任一個中所示的反義鏈序列。
  8. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述dsRNA藥劑包含表1至5的任一個中的雙鏈體序列所示的序列。
  9. 權利要求1所述的dsRNA，其中所述dsRNA藥劑包含至少一個經修飾核苷酸。
  10. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述反義鏈的所有或基本上所有核苷酸均是經修飾核苷酸。
  11. 權利要求5或6所述的dsRNA藥劑，其中至少一個經修飾核苷酸包括：2’-O-甲基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脫氧核苷酸、2’3’-seco核苷酸模擬物、鎖核苷酸、解鎖核酸核苷酸（UNA）、乙二醇核酸核苷酸（GNA）、2’-F-阿拉伯糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2’-Ome核苷酸、反向2’-脫氧核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、和3’-OMe核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團的核苷酸、或者與膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、氨基磷酸酯、或包含非天然鹼基的核苷酸。
  12. 權利要求9或10所述的dsRNA藥劑，其在引導鏈的5’末端包含E-乙烯基膦酸酯核苷酸。
  13. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述dsRNA藥劑包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  14. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述有義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  15. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述反義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  16. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述有義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  17. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述反義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  18. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述有義鏈和所述反義鏈的所有或基本上所有核苷酸均是經修飾核苷酸。
  19. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中經修飾的有義鏈是表2至5之一中所示的經修飾的有義鏈序列。
  20. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中經修飾的反義鏈是表2至5之一中所示的經修飾的反義鏈序列。
  21. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述有義鏈與所述反義鏈互補或基本上互補，並且所述互補區的長度爲16至23個核苷酸。
  22. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述互補區的長度爲19至21個核苷酸。
  23. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中每條鏈的長度不超過30個核苷酸。
  24. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中每條鏈的長度不超過25個核苷酸。
  25. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中每條鏈的長度不超過23個核苷酸。
  26. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述dsRNA藥劑包含至少一個經修飾核苷酸並且還包含一個或更多個靶向基團或連接基團。
  27. 權利要求26所述的dsRNA藥劑，其中所述一個或更多個靶向基團或連接基團與所述有義鏈綴合。
  28. 權利要求26或27所述的dsRNA藥劑，其中所述靶向基團或連接基團包含N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）。
  29. 權利要求26或27所述的dsRNA藥劑，其中所述靶向基團具有以下結構： 。
  30. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述dsRNA藥劑包含與所述有義鏈的5’末端綴合的靶向基團。
  31. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述dsRNA藥劑包含與所述有義鏈的3’末端綴合的靶向基團。
  32. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述反義鏈在3’末端包含一個反向無鹼基殘基。
  33. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述有義鏈在3’或/和5’末端包含一個或兩個反向無鹼基殘基。
  34. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中所述dsRNA藥劑具有兩個平末端。
  35. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中至少一條鏈包含具有至少1個核苷酸的3’突出端。
  36. 權利要求1所述的dsRNA藥劑，其中至少一條鏈包含具有至少2個核苷酸的3’突出端。
  37. 組合物，其包含權利要求1至36中任一項所述的dsRNA藥劑。
  38. 權利要求37所述的組合物，其還包含可藥用載體。
  39. 權利要求38所述的組合物，其還包含一種或更多種另外的治療劑。
  40. 權利要求39所述的組合物，其中所述組合物被包裝在藥盒、容器、包裝、分配器、預填充注射器或小瓶中。
  41. 權利要求37所述的組合物，其中所述組合物被配製成用於皮下施用或被配製成用於靜脈內（IV）施用。
  42. 細胞，其包含權利要求1至36中任一項所述的dsRNA藥劑。
  43. 權利要求42所述的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞，任選地是人細胞。
  44. 抑制細胞中ANGPTL3基因的表達的方法，所述方法包括： （i）製備包含有效量的權利要求1至36中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑或權利要求37至41中任一項所述的組合物的細胞。
  45. 權利要求44所述的方法，其還包括： （ii）將權利要求44（i）中製備的所述細胞維持足以獲得ANGPTL3基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制所述細胞中所述ANGPTL3基因的表達。
  46. 權利要求44所述的方法，其中所述細胞在對象中並且將所述dsRNA藥劑皮下施用於所述對象。
  47. 權利要求44所述的方法，其中所述細胞在對象中並且通過IV施用將所述dsRNA藥劑施用於所述對象。
  48. 權利要求46或47所述的方法，其還包括在將所述dsRNA藥劑施用於所述對象之後，評估對所述ANGPTL3基因的抑制，其中用於所述評估的手段包括： （i）確定所述對象中ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵，並且 （ii）將所確定的生理特徵與所述ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或者與所述ANGPTL3相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較， 其中所述比較表明所述對象中所述ANGPTL3基因的表達存在或不存在抑制中的一種或更多種。
  49. 權利要求48所述的方法，其中所確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：所述對象的血清脂質水平、所述對象的血清HDL水平、所述對象的HDL:LDL比例、所述對象的血清甘油三酯水平和所述對象的肝中脂肪的量。
  50. 權利要求49所述的方法，其中以下中的一種或更多種的降低表明所述對象中ANGPTL3基因表達的降低：所述對象的血清脂質水平、所述對象的血清HDL水平、所述對象的血清甘油三酯水平和所述對象的肝中脂肪的量。
  51. 抑制對象中ANGPTL3基因的表達的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的權利要求1至36中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑或權利要求37至41中任一項所述的組合物。
  52. 權利要求51所述的方法，其中將所述dsRNA藥劑皮下施用於所述對象。
  53. 權利要求51所述的方法，其中通過IV施用將所述dsRNA藥劑施用於所述對象。
  54. 權利要求51至53中任一項所述的方法，其還包括在施用所述dsRNA藥劑之後，評估對所述ANGPTL3基因的抑制，其中用於所述評估的手段包括： （i）確定所述對象中ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵，並且 （ii）將所確定的生理特徵與所述ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵和/或者與所述ANGPTL3相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較， 其中所述比較表明所述對象中所述ANGPTL3基因的表達存在或不存在抑制中的一種或更多種。
  55. 權利要求54所述的方法，其中所確定的生理特徵是以下中的一種或更多種：所述對象的血清脂質水平、所述對象的血清HDL水平、所述對象的HDL:LDL比例、所述對象的血清甘油三酯水平和所述對象的肝中脂肪的量。
  56. 權利要求55所述的方法，其中以下中的一種或更多種的降低表明所述對象中AGNPTL3基因表達的降低：所述對象的血清脂質水平、所述對象的血清HDL水平、所述對象的血清甘油三酯水平和所述對象的肝中脂肪的量。
  57. 治療與ANGPTL3蛋白的存在相關的疾病或病症的方法，所述方法包括向對象施用有效量的權利要求1至36中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑，或權利要求37至41中任一項所述的組合物，以抑制ANGPTL3基因表達。
  58. 權利要求57所述的方法，其中所述疾病或病症是以下中的一種或更多種：高脂血症、高甘油三酯血症、異常的脂質和/或膽固醇代謝、純合和雜合家族性高膽固醇血症、他汀類抗性高膽固醇血症、心臟代謝疾病、肥胖、動脈粥樣硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、由高甘油三酯血症引起的胰腺炎。
  59. 權利要求57所述的方法，其還包括向所述對象施用另外的治療方案。
  60. 權利要求59所述的方法，其中所述另外的治療方案包括：向所述對象施用一種或更多種本發明的ANGPTL3反義多核苷酸、向所述對象施用非ANGPTL3 dsRNA治療劑、以及所述對象中的行爲改變。
  61. 權利要求60所述的方法，其中所述非ANGPTL3 dsRNA治療劑是以下中的一種或更多種：（i）他汀類；（ii）能夠降低PCSK9表達的PCSK9 siRNA分子、抗體和反義寡核苷酸（ASO）中的一種或更多種；（iii）能夠降低對象中脂質積累的治療劑，以及（iv）能夠降低對象中膽固醇水平和/或積累的治療劑。
  62. 權利要求57所述的方法，其中將所述dsRNA藥劑皮下施用於所述對象。
  63. 權利要求57所述的方法，其中通過IV施用將所述dsRNA藥劑施用於所述對象。
  64. 權利要求57至63中任一項所述的方法，其還包括確定所施用的雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑在所述對象中的效力。
  65. 權利要求64所述的方法，其中確定治療在所述對象中的效力的手段包括： （i）確定所述對象中ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種生理特徵，並且 （ii）將所確定的生理特徵與所述ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵進行比較， 其中所述比較表明向所述對象施用所述雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑的效力的存在、不存在和水平中的一種或更多種。
  66. 權利要求65所述的方法，其中所確定的生理特徵是：所述對象的血清脂質水平、所述對象的HDL水平、所述對象的HDL:LDL比例、所述對象的血清甘油三酯水平和所述對象的肝中脂肪的量。
  67. 權利要求65所述的方法，其中以下中的一種或更多種的降低表明向所述對象施用所述雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑的效力的存在：所述對象的血清脂質水平、所述對象的血清HDL水平、所述對象的血清甘油三酯水平和所述對象的肝中脂肪的量。
  68. 與對象中ANGPTL3蛋白的基線治療前水平相比降低所述對象中ANGPTL3蛋白水平的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的權利要求1至36中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑，或權利要求37至41中任一項所述的組合物，以降低ANGPTL3基因表達的水平。
  69. 權利要求68所述的方法，其中將所述dsRNA藥劑皮下施用於所述對象或通過IV施用而施用於所述對象。
  70. 與對象中ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比，改變所述對象中所述ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的權利要求1至36中任一項所述的雙鏈核糖核酸（dsRNA）藥劑，或權利要求37至41中任一項所述的組合物，以改變所述對象中所述ANGPTL3相關疾病或病症的所述生理特徵。
  71. 權利要求70所述的方法，其中將所述dsRNA藥劑皮下施用於所述對象或通過IV施用而施用於所述對象。
  72. 權利要求70所述的方法，其中所述生理特徵是以下中的一種或更多種：所述對象的血清脂質水平、所述對象的HDL水平、所述對象的HDL:LDL比例、所述對象的血清甘油三酯水平和所述對象的肝中脂肪的量。
  73. 用於抑制ANGPTL3蛋白表達的反義多核苷酸藥劑，其中所述藥劑包含10至30個連續核苷酸，其中所述連續核苷酸中的至少一個是經修飾核苷酸，並且其中所述藥劑的核苷酸序列在其全長上與SEQ ID NO: 235的核苷酸序列的等效區域具有約80%互補性。
  74. 權利要求73所述的藥劑，其中所述等效區域是SEQ ID NO: 235的靶區域中的任一個，並且互補序列是表1至5之一中提供的序列。
  75. 權利要求73所述的藥劑，其中所述反義多核苷酸藥劑包含表1至5之一中提供的反義序列之一。
  76. 組合物，其包含權利要求73至75中任一項所述的反義多核苷酸藥劑。
  77. 權利要求76所述的組合物，其還包含可藥用載體。
  78. 權利要求76或77所述的組合物，其還包含用於治療ANGPTL3相關疾病或病症的一種或更多種另外的治療劑。
  79. 權利要求76所述的組合物，其中所述組合物被包裝在藥盒、容器、包裝、分配器、預填充注射器或小瓶中。
  80. 權利要求76所述的組合物，其中所述組合物被配製成用於皮下或IV施用。
  81. 細胞，其包含權利要求73至75中任一項所述的反義多核苷酸藥劑。
  82. 權利要求81所述的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞，任選地是人細胞。
  83. 抑制細胞中ANGPTL3基因的表達的方法，所述方法包括： （i）製備包含有效量的權利要求73至75中任一項所述的反義多核苷酸藥劑的細胞。
  84. 權利要求83所述的方法，其還包括： （ii）將（i）中製備的所述細胞維持足以獲得ANGPTL3基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制所述細胞中所述ANGPTL3基因的表達。
  85. 抑制對象中ANGPTL3基因的表達的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的權利要求73至75中任一項所述的反義多核苷酸藥劑或權利要求76至80所述的組合物。
  86. 治療與ANGPTL3蛋白的存在相關的疾病或病症的方法，所述方法包括向對象施用有效量的權利要求73至75中任一項所述的反義多核苷酸藥劑，或權利要求76至80中任一項所述的組合物，以抑制ANGPTL3基因表達。
  87. 權利要求86所述的方法，其中所述疾病或病症是以下中的一種或更多種：高脂血症、高甘油三酯血症、異常的脂質和/或膽固醇代謝、純合和雜合家族性高膽固醇血症、他汀類抗性高膽固醇血症、心臟代謝疾病、肥胖、動脈粥樣硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、由高甘油三酯血症引起的胰腺炎。
  88. 與對象中ANGPTL3蛋白的基線治療前水平相比降低所述對象中ANGPTL3蛋白水平的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的權利要求73至75中任一項所述的反義多核苷酸藥劑，或權利要求76至80中任一項所述的組合物，以降低ANGPTL3基因表達的水平。
  89. 權利要求86至88中任一項所述的方法，其中將所述反義多核苷酸藥劑皮下或通過IV施用而施用於所述對象。
  90. 用於抑制ANGPTL3基因表達的反義多核苷酸藥劑，其中所述藥劑包含10至30個連續核苷酸，其中所述連續核苷酸中的至少一個是經修飾核苷酸，並且其中所述藥劑的核苷酸序列在其全長上與SEQ ID NO: 235的核苷酸序列的等效區域具有約80%或約85%互補性。
  91. 與對象中ANGPTL3相關疾病或病症的基線治療前生理特徵相比，改變所述對象中所述ANGPTL3相關疾病或病症的生理特徵的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的權利要求73至75中任一項所述的反義多核苷酸藥劑，或權利要求76至80中任一項所述的組合物，以改變所述對象中所述ANGPTL3疾病或病症的所述生理特徵。
  92. 權利要求91所述的方法，其中將所述反義多核苷酸藥劑皮下或通過IV施用而施用於所述對象。
  93. 權利要求91所述的方法，其中所述生理特徵是以下中的一種或更多種：所述對象的血清脂質水平、所述對象的HDL水平、所述對象的HDL:LDL比例、所述對象的血清甘油三酯水平和所述對象的肝中脂肪的量。
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