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TW202516009A - 抑制澱粉樣前體蛋白(app)表達的組合物和方法 - Google Patents

抑制澱粉樣前體蛋白(app)表達的組合物和方法 Download PDF

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TW202516009A
TW202516009A TW113138352A TW113138352A TW202516009A TW 202516009 A TW202516009 A TW 202516009A TW 113138352 A TW113138352 A TW 113138352A TW 113138352 A TW113138352 A TW 113138352A TW 202516009 A TW202516009 A TW 202516009A
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dsrna agent
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TW113138352A
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舒東旭
鵬程 邵
夏時偉
Original Assignee
大陸商上海舶望製藥有限公司
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Abstract

本發明提供了可用於降低澱粉樣蛋白前體(APP)基因表達和治療APP相關疾病和病症的組合物和方法。本發明提供了可用於降低細胞和受試者中APP表達的APPdsRNA劑、APP反義多核苷酸劑、包含APPdsRNA劑的組合物和包含APP反義多核苷酸劑的組合物。

Description

抑制澱粉樣前體蛋白(APP)表達的組合物和方法
本發明部分涉及可用於抑制澱粉樣蛋白前體（APP）基因表達的組合物和方法。
澱粉樣蛋白前體 (APP) 基因編碼一種在神經元和神經膠質細胞中表達的整合膜蛋白。雖然 APP 的主要功能尚不清楚，但 APP 是當前阿爾茨海默病 (AD)研究的主要興趣之一，因為 APP 的異常加工會導致神經毒性肽澱粉樣蛋白-β (Aβ) 的產生和積累。Aβ 由 β-澱粉樣蛋白前體 (APP) 生成，首先由 β-分泌酶，然後由 γ-分泌酶複合物依次裂解。除了與 AD 發病機制密切相關外，APP 還參與促進大腦發育和功能的各種細胞活動。抑制 APP 的表達和/或活性可阻斷或抑制Aβ 裂解形式的 APP 的產生和/或水平，可用於預防或治療各種 APP 相關疾病和病症，例如 AD、腦澱粉樣血管病 (CAA) 和早發性家族性阿爾茨海默病 (EOFAD 或 eFAD) 等。目前 APP 相關疾病和病症的治療選擇有限且大多無效。例如，許多 Aβ 導向免疫療法處於不同的開發階段，而許多人體 γ-分泌酶抑制劑項目因毒性而停止。迄今為止，已批准的 APP 相關疾病或障礙的藥物治療僅用於治療症狀，而非預防或治癒，並且此類治療的療效有限，尤其是當 APP 相關疾病或障礙在受影響的個體中發展時。
因此，針對 APP 的新型療法代表了一種新的降低 APP 水平和治療 APP 相關疾病（如阿爾茨海默病）的方法。
總體而言，本發明內容提供了新型 APP 基因特異性 RNAi 劑、包括 APP RNAi 劑的組合物以及使用本文所述的 APP RNAi 劑和包括 APP RNAi 劑的組合物在體外和/或體內抑制 APP 基因表達的方法。本文所述的 APP RNAi 劑可以選擇性地且有效地降低、抑制或沉默受試者（例如人類或動物受試者）中 APP 基因的表達。
根據本發明的一個方面，提供了一種用於抑制澱粉樣蛋白前體 (APP) 表達的雙鏈核糖核酸 (dsRNA) 劑，其中，所述 dsRNA 劑包括一條有義鏈和一條反義鏈，其中，所述有義鏈包含與 SEQ ID NO: 1、3 或 5 的核苷酸序列相差不超過 1、2 或 3 個核苷酸的至少 15 個連續核苷酸，並且所述反義鏈包含與 SEQ ID NO: 2、4 或 6 的核苷酸序列相差不超過 1、2 或 3 個核苷酸的至少 15 個連續核苷酸，其中，所述有義鏈和所述反義鏈可以部分、基本或完全互補。
在一些實施例中，APP mRNA 轉錄本是 SEQ ID NO: 1。
在一些實施例中，APP mRNA轉錄物的靶區域是SEQ ID NO:1中的以下任一核苷酸序列：378-398、383-403、391-411、472-492、499-519、535-555、536-556、537-557、539-559、542-562、561-581、684-704、723-743、724-744、725-745、808-828、809-829、810-830、811-831、812-832、813-833、814-834、817-837、868-888、1264-1284、1368-1388、1405-1425、1406-1426、1407-1427、1416-1436、1417-1437、1426-1446、1427-1447、1428-1448、1434-1454、1456-1476、1458-1478、1461-1481、1462-1482、1463-1483、1465-1485、1529-1549、1608-1628、1609-1629、1611-1631、1612-1632、1675-1695、1744-1764、1818-1838、1819-1839、1820-1840、1821-1841、1822-1842、1833-1853、1854-1874、1856-1876、1857-1877、1861-1881、1862-1882、1876-1896、1877-1897、1878-1898、1879-1899、1885-1905、1893-1913、1895-1915、1899-1919、1900-1920、1901-1921、1934-1954、1935-1955、2038-2058、2039-2059、2111-2131、2115-2135、2116-2136、2138-2158、2139-2159、2302-2322、2335-2355、2422-2442、2437-2457、2443-2463、2444-2464、2471-2491、2473-2493、2488-2508、2492-2512、2495-2515、2518-2538、2521-2541、2562-2582、2571-2591、2587-2607、2590-2610、2594-2614、2608-2628、2614-2634、2682-2702、2686-2706、2710-2730、2711-2731、2712-2732、2714-2734、2715-2735、2716-2736、2720-2740、2731-2751、2732-2752、2733-2753、2737-2757、2742-2762、2743-2763、2744-2764、2745-2765、2746-2766、2750-2770、2782-2802、1178-1198、1220-1240、1969-1989、2186-2206、2329-2349、373-393、384-404、385-405、390-410、392-412、393-413、428-448、498-518、501-521、519-539、520-540、540-560、541-561、543-563、544-564、633-653、634-654、635-655、643-663、695-715、720-740、721-741、726-746、728-748、804-824、805-825、871-891、895-915、996-1016、1315-1335、1374-1394、1408-1428、1411-1431、1415-1435、1423-1443、1424-1444、1425-1445、1432-1452、1457-1477、1459-1479、1460-1480、1761-1781、1779-1799、1816-1836、1825-1845、1841-1861、1849-1869、1852-1872、1853-1873、1869-1889、1879-1899、1881-1901、1882-1902、1892-1912、1894-1914、1896-1916、1901-1921、1902-1922、1904-1924、1933-1953、1936-1956、1983-2003、2040-2060、2112-2132、2116-2136、2117-2137、2140-2160、2142-2162、2289-2309、2292-2312、2296-2316、2297-2317、2304-2324、2341-2361、2421-2441、2423-2443、2424-2444、2427-2447、2428-2448、2430-2450、2435-2455、2479-2499、2487-2507、2494-2514、2498-2518、2515-2535、2517-2537、2520-2540、2559-2579、2560-2580、2561-2581、2564-2584、2567-2587、2570-2590、2572-2592、2573-2593、2574-2594、2577-2597、2585-2605、2586-2606、2597-2617、2598-2618、2599-2619、2601-2621、2604-2624、2605-2625、2615-2635、2616-2636、2617-2637、2618-2638、2637-2657、2656-2676、2657-2677、2658-2678、2659-2679、2662-2682、2690-2710、2691-2711、2695-2715、2697-2717、2699-2719、2700-2720、2701-2721、2705-2725、2708-2728、2709-2729、2713-2733、2718-2738、2721-2741、2724-2744、2725-2745、2726-2746、2730-2750、2734-2754、2735-2755、2739-2759、2748-2768、2751-2771、2753-2773、2754-2774、2755-2775、2756-2776、2780-2800、2782-2802、379-397、374-392、384-402、385-403、386-404、391-409、392-410、393-411、394-412、429-447、473-491、499-517、500-518、502-520、520-538、521-539、536-554、537-555、538-556、540-558、541-559、542-560、543-561、544-562、545-563、562-580、634-652、635-653、636-654、644-662、685-703、696-714、721-739、722-740、724-742、725-743、726-744、727-745、729-747、805-823、806-824、809-827、810-828、811-829、812-830、813-831、814-832、815-833、818-836、869-887、872-890、896-914、997-1015、1179-1197、1221-1239、1265-1283、1316-1334、1369-1387、1375-1393、1406-1424、1407-1425、1408-1426、1409-1427、1412-1430、1416-1434、1417-1435、1418-1436、1424-1442、1425-1443、1426-1444、1427-1445、1428-1446、1429-1447、1433-1451、1435-1453、1457-1475、1458-1476、1459-1477、1460-1478、1461-1479、1462-1480、1463-1481、1464-1482、1466-1484、1530-1548、1609-1627、1610-1628、1612-1630、1613-1631、1676-1694、1745-1763、1762-1780、1780-1798、1817-1835、1819-1837、1820-1838、1821-1839、1822-1840、1823-1841、1826-1844、1834-1852、1842-1860、1850-1868、1853-1871、1854-1872、1855-1873、1857-1875、1858-1876、1862-1880、1863-1881、1870-1888、1877-1895、1878-1896、1879-1897、1880-1898、1882-1900、1883-1901、1886-1904、1893-1911、1894-1912、1895-1913、1896-1914、1897-1915、1900-1918、1901-1919、1902-1920、1903-1921、1905-1923、1934-1952、1935-1953、1936-1954、1937-1955、1970-1988、1984-2002、2039-2057、2040-2058、2041-2059、2112-2130、2113-2131、2116-2134、2117-2135、2118-2136、2139-2157、2140-2158、2141-2159、2143-2161、2187-2205、2290-2308、2293-2311、2297-2315、2298-2316、2303-2321、2305-2323、2330-2348、2336-2354、2342-2360、2422-2440、2423-2441、2424-2442、2425-2443、2428-2446、2429-2447、2431-2449、2436-2454、2438-2456、2444-2462、2445-2463、2472-2490、2474-2492、2480-2498、2488-2506、2489-2507、2493-2511、2495-2513、2496-2514、2499-2517、2516-2534、2518-2536、2519-2537、2521-2539、2522-2540、2560-2578、2561-2579、2562-2580、2563-2581、2565-2583、2568-2586、2571-2589、2572-2590、2573-2591、2574-2592、2575-2593、2578-2596、2586-2604、2587-2605、2588-2606、2591-2609、2595-2613、2598-2616、2599-2617、2600-2618、2602-2620、2605-2623、2606-2624、2609-2627、2615-2633、2616-2634、2617-2635、2618-2636、2619-2637、2638-2656、2657-2675、2658-2676、2659-2677、2660-2678、2663-2681、2683-2701、2687-2705、2691-2709、2692-2710、2696-2714、2698-2716、2700-2718、2701-2719、2702-2720、2706-2724、2709-2727、2710-2728、2711-2729、2712-2730、2713-2731、2714-2732、2715-2733、2716-2734、2717-2735、2719-2737、2721-2739、2722-2740、2725-2743、2726-2744、2727-2745、2731-2749、2732-2750、2733-2751、2734-2752、2735-2753、2736-2754、2738-2756、2740-2758、2743-2761、2744-2762、2745-2763、2746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-2762、2734-2764、2737-2767、2738-2768、2739-2769、2740-2770、2741-2771、2743-2773、2745-2775、2746-2776、2748-2778、2749-2779、2750-2780、2751-2781、2775-2805或2777-2807。
在一些實施例中，dsRNA 劑包括形成雙鏈區的有義鏈和反義鏈，其中所述反義鏈包含與編碼 APP 的 mRNA 部分互補的區域，所述互補的區域包含至少 15、16、17、18 或 19 個連續核苷酸，所述連續核苷酸與以下SEQ ID NO:1中的任一核苷酸序列的互補序列相差不超過 0、1、2 或 3 個核苷酸：378-398、383-403、391-411、472-492、499-519、535-555、536-556、537-557、539-559、542-562、561-581、684-704、723-743、724-744、725-745、808-828、809-829、810-830、811-831、812-832、813-833、814-834、817-837、868-888、1264-1284、1368-1388、1405-1425、1406-1426、1407-1427、1416-1436、1417-1437、1426-1446、1427-1447、1428-1448、1434-1454、1456-1476、1458-1478、1461-1481、1462-1482、1463-1483、1465-1485、1529-1549、1608-1628、1609-1629、1611-1631、1612-1632、1675-1695、1744-1764、1818-1838、1819-1839、1820-1840、1821-1841、1822-1842、1833-1853、1854-1874、1856-1876、1857-1877、1861-1881、1862-1882、1876-1896、1877-1897、1878-1898、1879-1899、1885-1905、1893-1913、1895-1915、1899-1919、1900-1920、1901-1921、1934-1954、1935-1955、2038-2058、2039-2059、2111-2131、2115-2135、2116-2136、2138-2158、2139-2159、2302-2322、2335-2355、2422-2442、2437-2457、2443-2463、2444-2464、2471-2491、2473-2493、2488-2508、2492-2512、2495-2515、2518-2538、2521-2541、2562-2582、2571-2591、2587-2607、2590-2610、2594-2614、2608-2628、2614-2634、2682-2702、2686-2706、2710-2730、2711-2731、2712-2732、2714-2734、2715-2735、2716-2736、2720-2740、2731-2751、2732-2752、2733-2753、2737-2757、2742-2762、2743-2763、2744-2764、2745-2765、2746-2766、2750-2770、2782-2802、1178-1198、1220-1240、1969-1989、2186-2206、2329-2349、373-393、384-404、385-405、390-410、392-412、393-413、428-448、498-518、501-521、519-539、520-540、540-560、541-561、543-563、544-564、633-653、634-654、635-655、643-663、695-715、720-740、721-741、726-746、728-748、804-824、805-825、871-891、895-915、996-1016、1315-1335、1374-1394、1408-1428、1411-1431、1415-1435、1423-1443、1424-1444、1425-1445、1432-1452、1457-1477、1459-1479、1460-1480、1761-1781、1779-1799、1816-1836、1825-1845、1841-1861、1849-1869、1852-1872、1853-1873、1869-1889、1879-1899、1881-1901、1882-1902、1892-1912、1894-1914、1896-1916、1901-1921、1902-1922、1904-1924、1933-1953、1936-1956、1983-2003、2040-2060、2112-2132、2116-2136、2117-2137、2140-2160、2142-2162、2289-2309、2292-2312、2296-2316、2297-2317、2304-2324、2341-2361、2421-2441、2423-2443、2424-2444、2427-2447、2428-2448、2430-2450、2435-2455、2479-2499、2487-2507、2494-2514、2498-2518、2515-2535、2517-2537、2520-2540、2559-2579、2560-2580、2561-2581、2564-2584、2567-2587、2570-2590、2572-2592、2573-2593、2574-2594、2577-2597、2585-2605、2586-2606、2597-2617、2598-2618、2599-2619、2601-2621、2604-2624、2605-2625、2615-2635、2616-2636、2617-2637、2618-2638、2637-2657、2656-2676、2657-2677、2658-2678、2659-2679、2662-2682、2690-2710、2691-2711、2695-2715、2697-2717、2699-2719、2700-2720、2701-2721、2705-2725、2708-2728、2709-2729、2713-2733、2718-2738、2721-2741、2724-2744、2725-2745、2726-2746、2730-2750、2734-2754、2735-2755、2739-2759、2748-2768、2751-2771、2753-2773、2754-2774、2755-2775、2756-2776、2780-2800、2782-2802、379-397、374-392、384-402、385-403、386-404、391-409、392-410、393-411、394-412、429-447、473-491、499-517、500-518、502-520、520-538、521-539、536-554、537-555、538-556、540-558、541-559、542-560、543-561、544-562、545-563、562-580、634-652、635-653、636-654、644-662、685-703、696-714、721-739、722-740、724-742、725-743、726-744、727-745、729-747、805-823、806-824、809-827、810-828、811-829、812-830、813-831、814-832、815-833、818-836、869-887、872-890、896-914、997-1015、1179-1197、1221-1239、1265-1283、1316-1334、1369-1387、1375-1393、1406-1424、1407-1425、1408-1426、1409-1427、1412-1430、1416-1434、1417-1435、1418-1436、1424-1442、1425-1443、1426-1444、1427-1445、1428-1446、1429-1447、1433-1451、1435-1453、1457-1475、1458-1476、1459-1477、1460-1478、1461-1479、1462-1480、1463-1481、1464-1482、1466-1484、1530-1548、1609-1627、1610-1628、1612-1630、1613-1631、1676-1694、1745-1763、1762-1780、1780-1798、1817-1835、1819-1837、1820-1838、1821-1839、1822-1840、1823-1841、1826-1844、1834-1852、1842-1860、1850-1868、1853-1871、1854-1872、1855-1873、1857-1875、1858-1876、1862-1880、1863-1881、1870-1888、1877-1895、1878-1896、1879-1897、1880-1898、1882-1900、1883-1901、1886-1904、1893-1911、1894-1912、1895-1913、1896-1914、1897-1915、1900-1918、1901-1919、1902-1920、1903-1921、1905-1923、1934-1952、1935-1953、1936-1954、1937-1955、1970-1988、1984-2002、2039-2057、2040-2058、2041-2059、2112-2130、2113-2131、2116-2134、2117-2135、2118-2136、2139-2157、2140-2158、2141-2159、2143-2161、2187-2205、2290-2308、2293-2311、2297-2315、2298-2316、2303-2321、2305-2323、2330-2348、2336-2354、2342-2360、2422-2440、2423-2441、2424-2442、2425-2443、2428-2446、2429-2447、2431-2449、2436-2454、2438-2456、2444-2462、2445-2463、2472-2490、2474-2492、2480-2498、2488-2506、2489-2507、2493-2511、2495-2513、2496-2514、2499-2517、2516-2534、2518-2536、2519-2537、2521-2539、2522-2540、2560-2578、2561-2579、2562-2580、2563-2581、2565-2583、2568-2586、2571-2589、2572-2590、2573-2591、2574-2592、2575-2593、2578-2596、2586-2604、2587-2605、2588-2606、2591-2609、2595-2613、2598-2616、2599-2617、2600-2618、2602-2620、2605-2623、2606-2624、2609-2627、2615-2633、2616-2634、2617-2635、2618-2636、2619-2637、2638-2656、2657-2675、2658-2676、2659-2677、2660-2678、2663-2681、2683-2701、2687-2705、2691-2709、2692-2710、2696-2714、2698-2716、2700-2718、2701-2719、2702-2720、2706-2724、2709-2727、2710-2728、2711-2729、2712-2730、2713-2731、2714-2732、2715-2733、2716-2734、2717-2735、2719-2737、2721-2739、2722-2740、2725-2743、2726-2744、2727-2745、2731-2749、2732-2750、2733-2751、2734-2752、2735-2753、2736-2754、2738-2756、2740-2758、2743-2761、2744-2762、2745-2763、2746-2764、2747-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2764、2737-2767、2738-2768、2739-2769、2740-2770、2741-2771、2743-2773、2745-2775、2746-2776、2748-2778、2749-2779、2750-2780、2751-2781、2775-2805或2777-2807。
在一些實施例中，dsRNA劑包含形成雙鏈區的有義鏈和反義鏈，其中有義鏈包含與以下SEQ ID NO:1中的任一核苷酸序列相差不超過0、1、2或3個核苷酸的至少15、16、17、18、19、20 或 21 個連續核苷酸：378-398、383-403、391-411、472-492、499-519、535-555、536-556、537-557、539-559、542-562、561-581、684-704、723-743、724-744、725-745、808-828、809-829、810-830、811-831、812-832、813-833、814-834、817-837、868-888、1264-1284、1368-1388、1405-1425、1406-1426、1407-1427、1416-1436、1417-1437、1426-1446、1427-1447、1428-1448、1434-1454、1456-1476、1458-1478、1461-1481、1462-1482、1463-1483、1465-1485、1529-1549、1608-1628、1609-1629、1611-1631、1612-1632、1675-1695、1744-1764、1818-1838、1819-1839、1820-1840、1821-1841、1822-1842、1833-1853、1854-1874、1856-1876、1857-1877、1861-1881、1862-1882、1876-1896、1877-1897、1878-1898、1879-1899、1885-1905、1893-1913、1895-1915、1899-1919、1900-1920、1901-1921、1934-1954、1935-1955、2038-2058、2039-2059、2111-2131、2115-2135、2116-2136、2138-2158、2139-2159、2302-2322、2335-2355、2422-2442、2437-2457、2443-2463、2444-2464、2471-2491、2473-2493、2488-2508、2492-2512、2495-2515、2518-2538、2521-2541、2562-2582、2571-2591、2587-2607、2590-2610、2594-2614、2608-2628、2614-2634、2682-2702、2686-2706、2710-2730、2711-2731、2712-2732、2714-2734、2715-2735、2716-2736、2720-2740、2731-2751、2732-2752、2733-2753、2737-2757、2742-2762、2743-2763、2744-2764、2745-2765、2746-2766、2750-2770、2782-2802、1178-1198、1220-1240、1969-1989、2186-2206、2329-2349、373-393、384-404、385-405、390-410、392-412、393-413、428-448、498-518、501-521、519-539、520-540、540-560、541-561、543-563、544-564、633-653、634-654、635-655、643-663、695-715、720-740、721-741、726-746、728-748、804-824、805-825、871-891、895-915、996-1016、1315-1335、1374-1394、1408-1428、1411-1431、1415-1435、1423-1443、1424-1444、1425-1445、1432-1452、1457-1477、1459-1479、1460-1480、1761-1781、1779-1799、1816-1836、1825-1845、1841-1861、1849-1869、1852-1872、1853-1873、1869-1889、1879-1899、1881-1901、1882-1902、1892-1912、1894-1914、1896-1916、1901-1921、1902-1922、1904-1924、1933-1953、1936-1956、1983-2003、2040-2060、2112-2132、2116-2136、2117-2137、2140-2160、2142-2162、2289-2309、2292-2312、2296-2316、2297-2317、2304-2324、2341-2361、2421-2441、2423-2443、2424-2444、2427-2447、2428-2448、2430-2450、2435-2455、2479-2499、2487-2507、2494-2514、2498-2518、2515-2535、2517-2537、2520-2540、2559-2579、2560-2580、2561-2581、2564-2584、2567-2587、2570-2590、2572-2592、2573-2593、2574-2594、2577-2597、2585-2605、2586-2606、2597-2617、2598-2618、2599-2619、2601-2621、2604-2624、2605-2625、2615-2635、2616-2636、2617-2637、2618-2638、2637-2657、2656-2676、2657-2677、2658-2678、2659-2679、2662-2682、2690-2710、2691-2711、2695-2715、2697-2717、2699-2719、2700-2720、2701-2721、2705-2725、2708-2728、2709-2729、2713-2733、2718-2738、2721-2741、2724-2744、2725-2745、2726-2746、2730-2750、2734-2754、2735-2755、2739-2759、2748-2768、2751-2771、2753-2773、2754-2774、2755-2775、2756-2776、2780-2800、2782-2802、379-397、374-392、384-402、385-403、386-404、391-409、392-410、393-411、394-412、429-447、473-491、499-517、500-518、502-520、520-538、521-539、536-554、537-555、538-556、540-558、541-559、542-560、543-561、544-562、545-563、562-580、634-652、635-653、636-654、644-662、685-703、696-714、721-739、722-740、724-742、725-743、726-744、727-745、729-747、805-823、806-824、809-827、810-828、811-829、812-830、813-831、814-832、815-833、818-836、869-887、872-890、896-914、997-1015、1179-1197、1221-1239、1265-1283、1316-1334、1369-1387、1375-1393、1406-1424、1407-1425、1408-1426、1409-1427、1412-1430、1416-1434、1417-1435、1418-1436、1424-1442、1425-1443、1426-1444、1427-1445、1428-1446、1429-1447、1433-1451、1435-1453、1457-1475、1458-1476、1459-1477、1460-1478、1461-1479、1462-1480、1463-1481、1464-1482、1466-1484、1530-1548、1609-1627、1610-1628、1612-1630、1613-1631、1676-1694、1745-1763、1762-1780、1780-1798、1817-1835、1819-1837、1820-1838、1821-1839、1822-1840、1823-1841、1826-1844、1834-1852、1842-1860、1850-1868、1853-1871、1854-1872、1855-1873、1857-1875、1858-1876、1862-1880、1863-1881、1870-1888、1877-1895、1878-1896、1879-1897、1880-1898、1882-1900、1883-1901、1886-1904、1893-1911、1894-1912、1895-1913、1896-1914、1897-1915、1900-1918、1901-1919、1902-1920、1903-1921、1905-1923、1934-1952、1935-1953、1936-1954、1937-1955、1970-1988、1984-2002、2039-2057、2040-2058、2041-2059、2112-2130、2113-2131、2116-2134、2117-2135、2118-2136、2139-2157、2140-2158、2141-2159、2143-2161、2187-2205、2290-2308、2293-2311、2297-2315、2298-2316、2303-2321、2305-2323、2330-2348、2336-2354、2342-2360、2422-2440、2423-2441、2424-2442、2425-2443、2428-2446、2429-2447、2431-2449、2436-2454、2438-2456、2444-2462、2445-2463、2472-2490、2474-2492、2480-2498、2488-2506、2489-2507、2493-2511、2495-2513、2496-2514、2499-2517、2516-2534、2518-2536、2519-2537、2521-2539、2522-2540、2560-2578、2561-2579、2562-2580、2563-2581、2565-2583、2568-2586、2571-2589、2572-2590、2573-2591、2574-2592、2575-2593、2578-2596、2586-2604、2587-2605、2588-2606、2591-2609、2595-2613、2598-2616、2599-2617、2600-2618、2602-2620、2605-2623、2606-2624、2609-2627、2615-2633、2616-2634、2617-2635、2618-2636、2619-2637、2638-2656、2657-2675、2658-2676、2659-2677、2660-2678、2663-2681、2683-2701、2687-2705、2691-2709、2692-2710、2696-2714、2698-2716、2700-2718、2701-2719、2702-2720、2706-2724、2709-2727、2710-2728、2711-2729、2712-2730、2713-2731、2714-2732、2715-2733、2716-2734、2717-2735、2719-2737、2721-2739、2722-2740、2725-2743、2726-2744、2727-2745、2731-2749、2732-2750、2733-2751、2734-2752、2735-2753、2736-2754、2738-2756、2740-2758、2743-2761、2744-2762、2745-2763、2746-2764、2747-2765、2749-2767、2751-2769、2752-2770、2754-2772、2755-2773、2756-2774、2757-2775、2781-2799、2783-2801、376-400、371-395、381-405、382-406、383-407、388-412、389-413、390-414、391-415、426-450、470-494、496-520、497-521、499-523、517-541、518-542、533-557、534-558、535-559、537-561、538-562、539-563、540-564、541-565、542-566、559-583、631-655、632-656、633-657、641-665、682-706、693-717、718-742、719-743、721-745、722-746、723-747、724-748、726-750、802-826、803-827、806-830、807-831、808-832、809-833、810-834、811-835、812-836、815-839、866-890、869-893、893-917、994-1018、1176-1200、1218-1242、1262-1286、1313-1337、1366-1390、1372-1396、1403-1427、1404-1428、1405-1429、1406-1430、1409-1433、1413-1437、1414-1438、1415-1439、1421-1445、1422-1446、1423-1447、1424-1448、1425-1449、1426-1450、1430-1454、1432-1456、1454-1478、1455-1479、1456-1480、1457-1481、1458-1482、1459-1483、1460-1484、1461-1485、1463-1487、1527-1551、1606-1630、1607-1631、1609-1633、1610-1634、1673-1697、1742-1766、1759-1783、1777-1801、1814-1838、1816-1840、1817-1841、1818-1842、1819-1843、1820-1844、1823-1847、1831-1855、1839-1863、1847-1871、1850-1874、1851-1875、1852-1876、1854-1878、1855-1879、1859-1883、1860-1884、1867-1891、1874-1898、1875-1899、1876-1900、1877-1901、1879-1903、1880-1904、1883-1907、1890-1914、1891-1915、1892-1916、1893-1917、1894-1918、1897-1921、1898-1922、1899-1923、1900-1924、1902-1926、1931-1955、1932-1956、1933-1957、1934-1958、1967-1991、1981-2005、2036-2060、2037-2061、2038-2062、2109-2133、2110-2134、2113-2137、2114-2138、2115-2139、2136-2160、2137-2161、2138-2162、2140-2164、2184-2208、2287-2311、2290-2314、2294-2318、2295-2319、2300-2324、2302-2326、2327-2351、2333-2357、2339-2363、2419-2443、2420-2444、2421-2445、2422-2446、2425-2449、2426-2450、2428-2452、2433-2457、2435-2459、2441-2465、2442-2466、2469-2493、2471-2495、2477-2501、2485-2509、2486-2510、2490-2514、2492-2516、2493-2517、2496-2520、2513-2537、2515-2539、2516-2540、2518-2542、2519-2543、2557-2581、2558-2582、2559-2583、2560-2584、2562-2586、2565-2589、2568-2592、2569-2593、2570-2594、2571-2595、2572-2596、2575-2599、2583-2607、2584-2608、2585-2609、2588-2612、2592-2616、2595-2619、2596-2620、2597-2621、2599-2623、2602-2626、2603-2627、2606-2630、2612-2636、2613-2637、2614-2638、2615-2639、2616-2640、2635-2659、2654-2678、2655-2679、2656-2680、2657-2681、2660-2684、2680-2704、2684-2708、2688-2712、2689-2713、2693-2717、2695-2719、2697-2721、2698-2722、2699-2723、2703-2727、2706-2730、2707-2731、2708-2732、2709-2733、2710-2734、2711-2735、2712-2736、2713-2737、2714-2738、2716-2740、2718-2742、2719-2743、2722-2746、2723-2747、2724-2748、2728-2752、2729-2753、2730-2754、2731-2755、2732-2756、2733-2757、2735-2759、2737-2761、2740-2764、2741-2765、2742-2766、2743-2767、2744-2768、2746-2770、2748-2772、2749-2773、2751-2775、2752-2776、2753-2777、2754-2778、2778-2802、2780-2804、373-403、368-398、378-408、379-409、380-410、385-415、386-416、387-417、388-418、423-453、467-497、493-523、494-524、496-526、514-544、515-545、530-560、531-561、532-562、534-564、535-565、536-566、537-567、538-568、539-569、556-586、628-658、629-659、630-660、638-668、679-709、690-720、715-745、716-746、718-748、719-749、720-750、721-751、723-753、799-829、800-830、803-833、804-834、805-835、806-836、807-837、808-838、809-839、812-842、863-893、866-896、890-920、991-1021、1173-1203、1215-1245、1259-1289、1310-1340、1363-1393、1369-1399、1400-1430、1401-1431、1402-1432、1403-1433、1406-1436、1410-1440、1411-1441、1412-1442、1418-1448、1419-1449、1420-1450、1421-1451、1422-1452、1423-1453、1427-1457、1429-1459、1451-1481、1452-1482、1453-1483、1454-1484、1455-1485、1456-1486、1457-1487、1458-1488、1460-1490、1524-1554、1603-1633、1604-1634、1606-1636、1607-1637、1670-1700、1739-1769、1756-1786、1774-1804、1811-1841、1813-1843、1814-1844、1815-1845、1816-1846、1817-1847、1820-1850、1828-1858、1836-1866、1844-1874、1847-1877、1848-1878、1849-1879、1851-1881、1852-1882、1856-1886、1857-1887、1864-1894、1871-1901、1872-1902、1873-1903、1874-1904、1876-1906、1877-1907、1880-1910、1887-1917、1888-1918、1889-1919、1890-1920、1891-1921、1894-1924、1895-1925、1896-1926、1897-1927、1899-1929、1928-1958、1929-1959、1930-1960、1931-1961、1964-1994、1978-2008、2033-2063、2034-2064、2035-2065、2106-2136、2107-2137、2110-2140、2111-2141、2112-2142、2133-2163、2134-2164、2135-2165、2137-2167、2181-2211、2284-2314、2287-2317、2291-2321、2292-2322、2297-2327、2299-2329、2324-2354、2330-2360、2336-2366、2416-2446、2417-2447、2418-2448、2419-2449、2422-2452、2423-2453、2425-2455、2430-2460、2432-2462、2438-2468、2439-2469、2466-2496、2468-2498、2474-2504、2482-2512、2483-2513、2487-2517、2489-2519、2490-2520、2493-2523、2510-2540、2512-2542、2513-2543、2515-2545、2516-2546、2554-2584、2555-2585、2556-2586、2557-2587、2559-2589、2562-2592、2565-2595、2566-2596、2567-2597、2568-2598、2569-2599、2572-2602、2580-2610、2581-2611、2582-2612、2585-2615、2589-2619、2592-2622、2593-2623、2594-2624、2596-2626、2599-2629、2600-2630、2603-2633、2609-2639、2610-2640、2611-2641、2612-2642、2613-2643、2632-2662、2651-2681、2652-2682、2653-2683、2654-2684、2657-2687、2677-2707、2681-2711、2685-2715、2686-2716、2690-2720、2692-2722、2694-2724、2695-2725、2696-2726、2700-2730、2703-2733、2704-2734、2705-2735、2706-2736、2707-2737、2708-2738、2709-2739、2710-2740、2711-2741、2713-2743、2715-2745、2716-2746、2719-2749、2720-2750、2721-2751、2725-2755、2726-2756、2727-2757、2728-2758、2729-2759、2730-2760、2732-2762、2734-2764、2737-2767、2738-2768、2739-2769、2740-2770、2741-2771、2743-2773、2745-2775、2746-2776、2748-2778、2749-2779、2750-2780、2751-2781、2775-2805或2777-2807。
在一些實施例中，dsRNA 劑包括至少一個修飾核苷酸。在一些實施例中，至少一種修飾的核苷酸包括：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-脫氧核苷酸、2'3'-開環核苷酸模擬物、鎖核苷酸、解鎖核酸核苷酸（UNA） 、乙二醇核酸核苷酸（GNA）、2'-F-阿拉伯糖核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2'-OMe核苷酸、反向2'-脫氧核苷酸、異甘露醇核苷酸、 2'-氨基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸和3'-OMe核苷酸、包括5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸、5'-膦酸酯修飾的核苷酸、5'-磷酸酯或 5'-磷酸酯模擬物修飾的核苷酸，或與膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、亞磷醯胺或包括非天然鹼基的核苷酸。
在某些實施例中，有義鏈的所有或基本上所有核苷酸是修飾的核苷酸。在某些實施例中，反義鏈的所有或基本上所有核苷酸是修飾的核苷酸。在一些實施例中，有義鏈和反義鏈的所有或基本上所有核苷酸都是修飾核苷酸。在一些實施例中，反義鏈包含 15 個或更多個獨立地選自 2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸和 UNA 修飾核苷酸的修飾核苷酸，其中少於 6 個修飾核苷酸是 2'-氟核苷酸。在一些實施例中，反義鏈包含 3 個或 5 個 2'-氟核苷酸，優選地，反義鏈包含 5 個 2'-氟核苷酸。在一些實施例中，有義鏈包含 15 個或更多個獨立地選自 2'-O-甲基核苷酸和 2'-氟核苷酸的修飾核苷酸，其中少於 4 個修飾核苷酸是 2'-氟核苷酸。在某些實施例中，有義鏈包含 3 個 2'-氟核苷酸。在一些實施例中，反義鏈包含 15 個或更多個獨立地選自 2'-O-甲基核苷酸和 2'-氟核苷酸的修飾核苷酸，其中至少 14個修飾核苷酸是 2'-O-甲基核苷酸，並且從反義鏈5'端第一個匹配位置起算的位置2、5、7、12、14和/或16處的核苷酸獨立地為2'-氟核苷酸。在一些實施例中，反義鏈包含至少一個UNA修飾的核苷酸和5個2'-氟核苷酸。在一些實施例中，反義鏈包含從反義鏈5’端第一個匹配位置起算的位置7處的一個UNA修飾的核苷酸和位置2、5、12、14和16處5個2'-氟核苷酸，其餘為2'-O-甲基核苷酸。在一些實施例中，反義鏈包含從5’端第一個匹配位置起算的位置2、7、12、14和16處的5個2’-氟核苷酸，其餘為2’-O-甲基核苷酸。在一些實施例中，有義鏈包含15個或更多個獨立地選自2’-O-甲基核苷酸和2’-氟核苷酸的修飾核苷酸，優選地，其中至少18個修飾核苷酸為2’-O-甲基核苷酸，且從有義鏈3’端第一個匹配位置起算的位置9、11和/或13處的核苷酸為2’-氟核苷酸。
在一些實施例中，dsRNA 劑包含一個或多個用 5’-磷酸酯或 5’-磷酸酯模擬物修飾的核苷酸。在一些實施例中，磷酸酯模擬物是 5’-乙烯基膦酸酯 (VP)。在一些實施方案中，dsRNA 劑在引導鏈的 5΄ 端包含 E-乙烯基膦酸酯核苷酸。
在一些實施例中，dsRNA 劑包括至少一個修飾的核苷酸，並且還包括一個或多個靶向基團或連接基團。在一些實施例中，一個或多個靶向基團或連接基團靶向介導遞送至 CNS 組織的受體，例如親水性配體。在一些實施例中，一個或多個靶向基團或連接基團靶向腦組織，例如紋狀體。在一些實施例中，一個或多個靶向基團或連接基團與有義鏈結合。在一些實施例中，一個或多個靶向基團或連接基團與反義鏈結合。在一些實施例中，一個或多個靶向基團或連接基團與有義鏈末端綴合。在一些實施例中，一個或多個靶向基團或連接基團與反義鏈末端綴合。在一些實施例中，所述一個或多個靶向基團或連接基團與有義鏈的一個或多個內部位置綴合。在一些實施例中，所述一個或多個靶向基團或連接基團與反義鏈的一個或多個內部位置綴合。在一些實施例中，內部位置不包括有義鏈的切割位點區域。在一些實施例中，內部位置不包括反義鏈的切割位點區域。在一些實施例中，靶向基團或連接基團包括N-乙醯半乳糖胺( GalNAc) 。在一些實施例中，靶向基團具有如下式(X)的結構： 式（X）； 每個 n'' 獨立地選自 1 或 2。
在一些實施例中，靶向基團具有以下結構：
GLO-1 GLS-1*
GLO-2 GLS-2*
GLO-3 GLS-3*
GLO-4 GLS-4*
GLO-5 GLS-5*
GLO-6 GLS-6*
GLO-7 GLS-7*
GLO-8 GLS-8*
GLO-9 GLS-9*
GLO-10 GLS-10*
GLO-11 GLS-11*
GLO-12 GLS-12*
GLO-13 GLS-13*
GLO-14 GLS-14*
GLO-15 GLS-15*
GLO-16 GLS-16*
在某些實施例中，dsRNA 劑包括與有義鏈 5’末端綴合的靶向基團。在一些實施例中，dsRNA 劑包括與有義鏈 3’末端綴合的靶向基團。在一些實施例中，反義鏈在 3’末端包括一個反向無鹼基殘基。在某些實施例中，有義鏈在3’或/和 5’末端包括一個或兩個反向無鹼基殘基和/或一個或兩個imann殘基。在某些實施例中，有義鏈的每個末端包括一個反向無鹼基殘基。在某些實施例中，有義鏈的每個末端包括一個imann殘基。在一些實施例中，dsRNA 劑具有兩個平端。在一些實施例中，至少一條鏈包括至少 1 個核苷酸的 3’突出端。在一些實施例中，至少一條鏈包括至少 2 個核苷酸的 3’突出端。
在一些實施例中，dsRNA劑包括與有義鏈5’末端綴合的靶向基團，優選地，靶向基團為選自前述GLO-1至GLO-16和GLS-1*至GLS-16*中的任一種，更優選地，靶向基團為前述GLS-15*。在某些實施例中，dsRNA劑包括與有義鏈5’末端綴合的靶向基團。在某些實施例中，反義鏈在3’末端包括一個反向無鹼基殘基。在某些實施例中，有義鏈在3’或/和5’末端包括一個或兩個反向無鹼基殘基和/或一個或兩個imann殘基。在某些實施例中，有義鏈的3’和5’末端各自獨立地包括一個反向無鹼基殘基。在某些實施例中，有義鏈的3’和5’末端各自獨立地包含一個imann殘基。在某些實施例中，有義鏈在3’和5’末端包含兩個反向無鹼基殘基，並且3’或5’末端的殘基進一步與靶向基團結合，所述靶向基團優選為前述的GLS-15*。在某些實施例中，有義鏈在3’ -末端包含一個反向無鹼基殘基，並且5’ -末端進一步與靶向基團結合，所述靶向基團優選為前述的GLS-15*。在某些實施例中，有義鏈在3’和5’末端包含兩個imann殘基，並且3’或5’末端的殘基進一步與靶向基團結合，所述靶向基團優選為前述的GLS-15*。
在一些實施例中，dsRNA 劑包括至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵。在某些實施例中，有義鏈包括至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，反義鏈包括至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，有義鏈包括 1、2、3、4、5 或 6 個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，反義鏈包括 1、2、3、4、5 或 6 個硫代磷酸酯核苷間鍵。在某些實施例中，反義鏈包括 1、2、3、4、5 或 6 個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，反義鏈的5’端包括 2 個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，反義鏈的3’端包括 2個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，反義鏈的5’端和反義鏈的3’端獨立地包括 2個硫代磷酸酯核苷間鍵。
在一些實施例中，有義鏈和/或反義鏈的至少一個連接鍵是磷酸二酯(PO)鍵。在一些實施例中，有義鏈和/或反義鏈的至少一個連接鍵是修飾的鍵。在一些實施例中，有義鏈和/或反義鏈的至少一個連接鍵是硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，在有義鏈和/或反義鏈的5’端、3’端或兩端引入至少一個硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，在有義鏈和/或反義鏈的5’端、3’端或兩端獨立地引入1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，反義鏈的一端或兩端的至少末端兩個修飾或未修飾的核苷酸通過硫代磷酸酯鍵連接。在一些實施例中，反義鏈的一端或兩端的末端三個修飾或未修飾的核苷酸通過硫代磷酸酯鍵連接。在一些實施例中，有義鏈的一端或兩端的至少末端兩個修飾或未修飾的核苷酸通過硫代磷酸酯鍵連接。在一些實施例中，有義鏈的一端或兩端的末端三個修飾或未修飾的核苷酸通過硫代磷酸酯鍵連接。在一些實施例中，有義鏈5’端的末端三個修飾或未修飾的核苷酸通過硫代磷酸酯鍵連接，有義鏈3’端的末端兩個修飾或未修飾的核苷酸通過硫代磷酸酯鍵連接。在一些實施例中，一個或多個反向無鹼基殘基或一個或多個imann殘基通過硫代磷酸酯鍵結合到有義鏈的任一端或兩端。在一些實施例中，靶向基團進一步通過硫代磷酸酯鍵結合至有義鏈的任一端。在一些實施例中，靶向基團進一步通過硫代磷酸酯鍵結合至有義鏈的 5’端。
在某些實施例中，本發明的dsRNA 劑的有義鏈序列可以用式(I)表示: 5’-(N’ L) n’N’ LN’ LN’ N1N’ N2N’ N3N’ N4N’ LN’ FN’ LN’ N5N’ N6N’ LN’ LN’ L(N’ L) m’-3’(I)； 其中：每個N’ F代表2’-氟修飾的核苷酸；每個N’ N1、 N’ N2、 N’ N3、 N’ N4、 N’ N5、和 N’ N6獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸；每個N’ L獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸但不表示2’-氟修飾的核苷酸，並且m’和n’各自獨立地為0至7的整數。
在一些實施例中，每個N’ N1、N’ N2、N’ N3、N’ N4、N’ N5和N’ N6獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸或2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，每個N’ L獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，N’ N4和N’ N5各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸。
在一些實施例中，N’ N2和N’ N4各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸。
在一些實施例中，N’ N4和N’ N5各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，m’為2，並且每個N’ L、N’ N1、N’ N2、N’ N3和N’ N6獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，N’ N2和N’ N4各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，m’為4，並且每個N’ L、N’ N1、N’ N3、N’ N5和N’ N6獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，m’為4且n’為3。
在一些實施例中，m’為2且n’為3，或者m’為2且n’為4，m’為2且n’為5。
在一些實施例中，本發明的dsRNA 劑的反義鏈序列可以獨立地由式(II)表示： 3’-(N L) nN M1N LN M2N LN FN LN M3N LN M4N LN M5N M6N LN M7N M8N LN FN L-5’ (II)； 其中：每個N F表示2’-氟修飾的核苷酸；每個N M1、N M2、N M3、N M4、N M5、N M6、N M7和N M8獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸；每個N L獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸，但不是2’-氟修飾的核苷酸，並且n為0至7的整數。
在一些實施例中，每個N M1、N M2、N M3、N M4、N M5、N M6、N M7和N M8獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、UNA修飾的核苷酸或包含磷酸酯模擬物的核苷酸。
在一些實施例中，每個N L獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，修飾的核苷酸是上文中定義的修飾的核苷酸。
在一些實施例中，修飾的核苷酸是2’-OMe修飾的核苷酸、2’-氟修飾的核苷酸、UNA修飾的核苷酸或包含磷酸酯模擬物的核苷酸。
在一些實施例中，N M2、N M3和N M6各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸。
在一些實施例中，N M2、N M3和N M7各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，並且N M6表示UNA修飾的核苷酸。
在一些實施例中，N M2、N M3和N M6各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，並且每個N M1、N M4、N M5、N M7、N M8和N L獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，N M2、N M3和N M7各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，N M6表示UNA修飾的核苷酸，且每個N M1、N M4、N M5、N M8和N L獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，n為1，或n為2，或n為3。
在一些實施例中，N M6、N M3和N M2都是2’-氟修飾的核苷酸。
在一些實施例中，本發明的dsRNA雙鏈可以由式（III）表示，並且互補區域包含至少15個連續的核苷酸，其中， 有義鏈: 5’-(N’ L) n’N’ LN’ LN’ N1N’ N2N’ N3N’ N4N’ LN’ FN’ LN’ N5N’ N6N’ LN’ LN’ L(N’ L) m’-3’ 反義鏈: 3’-(N L) nN M1N LN M2N LN FN LN M3N LN M4N LN M5N M6N LN M7N M8N LN FN L-5’ (III)； 其中：每條鏈的長度約為17至約30個核苷酸； 每個N F和N’ F獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸；N M1、N M2、N M3、N M4、N M5、N M6、N M7、N M8、N’ N1、N’ N2、N’ N3、N’ N4、N’ N5、N’ N6和N Z各自獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸；每個N L和N’ L獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸但不表示2’-氟修飾的核苷酸，並且m’、n’和n各自獨立地為0至7的整數。
在一些實施例中，修飾的核苷酸是上面定義的修飾的核苷酸。
在一些實施例中，修飾的核苷酸是2’-OMe修飾的核苷酸、2’-氟修飾的核苷酸、UNA修飾的核苷酸或包含磷酸酯模擬物的核苷酸。
在一些實施例中，n’為1且m’為2，n’為2且m’為2，或者n’為1且m’為4，或者n’為3且m’為2，或者n’為3且m’為4，或者n’為4且m’為2，或者n’為5且m’為2。
在一些實施例中，每個N’ N1、N’ N2、N’ N3、N’ N4、N’ N5和N’ N6獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸或2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，每個N’ L獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，N’ N2和N’ N4各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸。
在一些實施例中，N’ N4和N’ N5各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸。
在一些實施例中，N’ N4和N’ N5各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，m’為2並且每個N’ L、N’ N1、N’ N2、N’ N3和N’ N6獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，N’ N2和N’ N4各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，m’為4並且每個N’ L、N’ N1、N’ N3、N’ N5和N’ N6獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，n為1，或n為2，或n為3。
在一些實施例中，每個N M1、N M2、N M3、N M4、N M5、N M6、N M7和N M8獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、UNA修飾的核苷酸或包含磷酸酯模擬物的核苷酸。
在一些實施例中，每個N L獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，N M2、N M3和N M6各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸；在某些實施例中，N M2、N M3和N M6均為2’-氟修飾的核苷酸。
在一些實施例中，N M2、N M3和N M7各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，並且N M6表示UNA修飾的核苷酸。
在一些實施例中，N M2、N M3和N M6各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，並且每個N M1、N M4、N M5、N M7、N M8和N L獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在一些實施例中，N M2、N M3和N M7各自獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸，N M6表示UNA修飾的核苷酸，並且每個N M1、N M4、N M5、N M8和N L獨立地表示2’-O-甲基核苷酸。
在式(II)或(III)的一些實施例中，反義鏈在3’末端包括一個反向無鹼基殘基。在式(I)或(III)的一些實施例中，有義鏈在3’或/和5’末端包括一個或兩個反向無鹼基殘基和/或一個或兩個imann殘基。在某些實施例中，有義鏈的3’和5’末端各自獨立地包括一個反向無鹼基殘基。在式(I)或(III)的一些實施例中，有義鏈的3’和5’末端各自獨立地包括一個imann殘基。在式(I)或(III)的一些實施例中，有義鏈在 3’末端包括一個反向的無鹼基殘基並且 5’末端進一步與介導向 CNS 組織或肝臟組織遞送的靶向基團（例如親水性配體）綴合，其任選地是前述的 GLS-15*。在式(I)或(III)的一些實施例中，有義鏈分別在3’和5’末端包括一個反向無鹼基殘基，並且3’或5’末端的任一殘基進一步與介導遞送至中樞神經系統組織或肝臟組織的靶向基團(例如，親水性配體)綴合，所述親水性配體任選地為前述的GLS-15*。在式(I)或(III)的一些實施例中，有義鏈分別在3’和5’末端包括一個imann殘基，並且3’或5’末端的任一殘基進一步與介導遞送至中樞神經系統組織或肝臟組織的靶向基團（例如親水性配體）綴合，所述親水性配體任選地為前述的GLS-15*。在某些實施例中，上述dsRNA劑具有兩個平端。在式(I)、(II)、或(III)的某些實施例中，至少一條鏈包括至少1個核苷酸的3’突出端。在式(I)、(II)、或(III)的某些實施例中，至少一條鏈包括至少2個核苷酸的3’突出端。
在式(I)、(II)、或(III)的一些實施例中，N M1、N M2、N M3、N M4、N M5、N M6、N M7、N M8、N’ N1、N’ N2、N’ N3、N’ N4、N’ N5、N’ N6、N’ L和N L各自獨立地通過磷酸二酯(PO)鍵與相鄰核苷酸連接。在式(I)、(II)、或(III)的一些實施例中，N M1、N M2、N M3、N M4、N M5、N M6、N M7、N M8、N M9、N’ N1、N’ N2、N’ N3、N’ N4、N’ N5、N’ N6、N’ L和N L中的至少一個通過硫代磷酸酯(PS)鍵與相鄰核苷酸連接。在包括反向無鹼基殘基、imann殘基和/或靶向基團的上述式(I)、(II)、或(III)的一些實施例中，鏈的每個末端的末端位置的1-10位置內的連接鍵獨立地包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯(PS)鍵。在包括反向無鹼基殘基、imann殘基和/或靶向基團的上述式(I)、(II)、或(III)的一些實施例中，鏈的每個末端的末端位置的1-5位置內的連接鍵獨立地包含1、2或3個硫代磷酸酯(PS)鍵。在包括反向無鹼基殘基、imann殘基和/或靶向基團的上述式(I)、(II)、或(III)的一些實施例中，鏈的每個末端的末端位置的1-3位置內的連接鍵獨立地包含1或2個硫代磷酸酯(PS)鍵。
在一些實施例中，修飾的有義鏈具有表 2-3 中任一個所示的修飾模式。在一些實施例中，修飾的反義鏈具有表 2-3 中任一個所示的修飾模式。
在一些實施例中，表 1 中的任一條有義鏈可按照前述式(I) 或 (III) 所示的模式進一步修飾。
在一些實施例中，表1中的任一條反義鏈可進一步按照前述式(II)或(III)所示的模式進行修飾。
在一些實施例中，表 1 中的任一個雙鏈體可按照上述式(III)所示的模式進行進一步修飾。
在一些實施方例中，dsRNA 劑的反義鏈長度獨立地為 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸。在一些實施例中，dsRNA 劑的有義鏈長度獨立地為 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48 或 49 個核苷酸。在一些實施例中，有義鏈和反義鏈的長度均為 23 個核苷酸。在一些實施例中，有義鏈和反義鏈的長度均為 21 個核苷酸。
在一些實施例中，本發明所述的 dsRNA 劑靶向表 1 中公開的 APP mRNA 轉錄物的相應部分和/或前述 APP mRNA轉錄物的靶區域。
在一些實施例中，dsRNA 劑包括形成雙鏈區域的有義鏈和反義鏈，其中所述反義鏈包含與編碼 APP 的 mRNA 互補的區域，所述區域包含與表 1-3 中列出的任一反義序列相差不超過 1、2 或 3 個核苷酸的至少 15 個連續核苷酸。在一些實施例中，dsRNA 劑包括形成雙鏈區域的有義鏈和反義鏈，其中所述反義鏈包含與編碼 APP 的 mRNA 互補的區域，所述互補的區域包含表 1-3 中列出的任一反義序列的至少 15 個連續核苷酸。
在一些實施例中，dsRNA 劑包括有義鏈和反義鏈，反義鏈中的核苷酸位置 2-18 包括與 APP RNA 轉錄本互補的區域，其中互補的區域包括與表 1-3 之一中列出的反義序列之一相差 0、1、2 或 3 個核苷酸的至少15、16、17、18、19、20或 21個連續核苷酸，並且任選地包括靶向配體。
在一些實施例中，dsRNA 劑的反義鏈至少基本上與 SEQ ID NO: 1 的靶區域中的任一個互補，並在表 1-3 的任一個中提供。在一些實施例中，dsRNA 劑的反義鏈與 SEQ ID NO: 1 的靶區域中的任一個完全互補，並在表 1-3 的任一個中提供。在一些實施例中，dsRNA 劑包括表 1-3 中任一個所述的有義鏈序列，其中有義鏈序列至少基本上與 dsRNA 劑中的反義鏈序列互補。在某些實施例中，dsRNA 劑包括表 1-3 中任一個所述的有義鏈序列，其中有義鏈序列與 dsRNA 劑中的反義鏈序列完全互補。在一些實施例中，dsRNA 劑包括表 1-3 中任一個所述的反義鏈序列。在一些實施例中，修飾的有義鏈是表 2-3 中任一個所述的修飾的有義鏈序列。在一些實施例中，修飾的反義鏈是表 2-3 中任一個所述的修飾的反義鏈序列。
根據本發明的一個方面，提供了一種組合物，其包括上述本發明 dsRNA 劑方面的任何實施例。在某些實施例中，該組合物還包括藥學上可接受的載體。在一些實施例中，該組合物還包括一種或多種額外的治療劑。在某些實施例中，該組合物包裝在試劑盒、容器、包裝、分配器、預填充注射器或小瓶中。在一些實施例中，該組合物配製用於皮下給藥、配製用於鞘內給藥或配製用於靜脈內 (IV) 給藥。
根據本發明的另一個方面，提供了一種細胞，其包括上述本發明 dsRNA 劑方面的任何實施例。在一些實施例中，該細胞是哺乳動物細胞，任選地是人類細胞。在一些實施例中，該細胞是神經元（例如，初級感覺神經元）。
根據本發明的另一個方面，提供了一種抑制細胞中 APP 基因表達的方法，該方法包括：(i)製備包含有效量的上述本發明 dsRNA 劑方面的任何實施例或上述本發明組合物的任何實施例的細胞。在某些實施例中，該方法還包括：(ii)維持製備的細胞足夠的時間以獲得 APP 基因的 mRNA 轉錄物的降解，從而抑制細胞中 APP 基因的表達。在一些實施例中，細胞在受試者體內，並且 dsRNA 劑通過皮下施用給受試者。在一些實施例中，細胞在受試者體內，並且 dsRNA 劑通過靜脈內施用給受試者。在一些實施例中，細胞在受試者體內，並且 dsRNA 劑通過鞘內施用給受試者。在某些實施例中，該方法還包括在向受試者施用 dsRNA 藥劑後評估APP 基因的抑制，其中評估方法包括：(i)確定受試者中 APP 相關疾病或病症的一個或多個生理特徵，以及(ii)將確定的生理特徵與 APP 相關疾病或病症的治療前生理特徵基線和/或 APP 相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較，其中比較表明受試者中存在或不存在 APP 基因表達的抑制。在一些實施例中，生理特徵是以下中的一個或多個：APP mRNA水平和APP蛋白水平（包括 APP 裂解產物）。 APP 表達的降低還可以通過測量 APP 生物活性的降低來間接評估，例如，以下一種或多種的降低：各種形式的 APP (例如，APPα、APPβ、 Aβ、 Aβ40 和/或 Aβ42 等)、APP C-末端片段 (CTF) 多肽 (例如，α-CTF 和/或 β-CTF)，和/或 MAPT 肽等。
本公開內容的另一個方面提供了一種用於識別受試者是否患有或有風險患上特徵為神經元細胞內體增大的疾病或病症並且為受試者選擇治療方法的方法，該方法包括：a)從受試者獲得核酸樣本；b)識別受試者是否具有與具有 APP 突變的神經元細胞內體增大相關的澱粉樣蛋白前體 (APP) 突變；以及c)選擇澱粉樣蛋白前體 (APP) 靶向雙鏈核糖核酸抑制 (dsRNAi) 劑以足以降低受試者神經元細胞中 APP 水平的量施用於受試者，從而識別受試者是否患有或有風險患上特徵為神經元細胞內體增大的疾病或病症並且為受試者選擇治療方法。
根據本發明的另一個方面，提供了一種抑制受試者體內APP基因表達的方法，該方法包括向受試者施用有效量的本發明上述 dsRNA 劑方面的實施例或本發明上述組合物的實施例。在一些實施例中，dsRNA 劑皮下施用給受試者。在某些實施例中，dsRNA 劑通過靜脈內施用給受試者。在一些實施例中，dsRNA 劑鞘內施用給受試者。在一些實施例中，該方法還包括：在施用 dsRNA 藥劑後評估 APP 基因的抑制，其中評估方法包括：(i) 確定受試者中 APP 相關疾病或病症的一個或多個生理特徵，以及 (ii) 將確定的生理特徵與 APP 相關疾病或病症的治療前生理特徵基線和/或 APP 相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較，其中比較表明受試者中APP 基因表達的抑制的存在或不存在中的一個或多個。在一些實施例中，可以基於與 APP 基因表達相關的任何變量的水平或水平變化來評估 APP 基因的表達，例如 APP mRNA 水平或 APP 蛋白水平（包括 APP 裂解產物）。 APP 表達的降低也可通過測量 APP 的生物活性的降低來間接評估，例如，各種形式的 APP (例如，APPα、APPβ、 Aβ、 Aβ40 和/或 Aβ42 等）、APP C-末端片段 (CTF) 多肽 (例如，α-CTF 和/或 β-CTF)和/或 MAPT 肽等。
根據本發明的另一個方面，提供了一種治療與 APP 蛋白的存在相關的疾病或病症的方法，該方法包括：向受試者施用有效量的本發明的任何上述 dsRNA 劑方面的實施例或本發明的任何上述組合物的實施例，以抑制 APP 基因表達。在一些實施例中，與 APP 相關的疾病、病症或病症選自：腦澱粉樣血管病 (CAA)、唐氏症 (DS) 和阿爾茨海默病 (AD)，包括遺傳性 CAA、早發性家族性阿爾茨海默病 (EOFAD 或 eFAD)、晚發性 AD (LOAD)，以及肌萎縮側索硬化症 (ALS)、額顳葉癡呆、亨廷頓病、帕金森病、脊髓小腦、朊病毒、拉福拉病、中風或與 APP 相關的其他神經退行性疾病或異常。
在一些實施例中，該方法還包括：向受試者施用額外的治療方案。在一些實施例中，額外的治療方案包括治療 APP 相關疾病或病症。在某些實施例中，額外的治療方案包括：向受試者施用本發明的一種或多種 APP 反義多核苷酸，向受試者施用非 APP dsRNA 治療劑，以及對受試者進行行為改變。在一些實施例中，非 APP dsRNA 治療劑是以下一種或多種：膽鹼酯酶抑制劑（例如多奈呱齊(donepezil)、利凡斯泰(rivastigmate）和加蘭他敏(galantamine)）、美金剛(memantine)、BACE1i、免疫療法、分泌酶抑制劑（例如，γ分泌酶抑制劑）、乙醯膽鹼酯酶抑制劑、NMDA受體拮抗劑、針對Abeta的抗體（例如，阿杜卡單抗(aducanumab)）、針對tau蛋白的藥劑、抗突觸核蛋白抗體、富馬酸鹽化合物、抗炎劑、抗脂肪變性劑、抗病毒劑和/或抗纖維化劑，或用於治療本文公開的或本領域已知的受試者的AD（包括EOFAD）和/或CAA的其他藥劑。在一些實施例中，dsRNA藥劑通過皮下施用於受試者。在某些實施例中，dsRNA藥劑通過靜脈內施用於受試者。在一些實施例中，dsRNA藥劑通過鞘內施用於受試者。在一些實施例中，dsRNA 藥劑和非 APP dsRNA 治療劑可同時和/或以相同組合施用，或者非 APP dsRNA 治療劑可作為單獨組合物的一部分施用或在不同時間和/或通過本領域已知或本文所述的另一種方法施用。在一些實施例中，該方法還包括確定施用的雙鏈核糖核酸 (dsRNA) 藥劑在受試者中的功效。在一些實施例中，確定治療在受試者中的功效的方法包括：(i)確定受試者的APP相關疾病或病症的一個或多個生理特徵，以及(ii)將確定的生理特徵與APP相關疾病或病症的治療前生理特徵基線進行比較，其中比較表明向受試者施用雙鏈核糖核酸(dsRNA)藥劑的存在、不存在和功效水平中的一個或多個。在一些實施例中，APP 基因的表達可以基於與 APP基因表達相關的任何變量的水平或水平變化來評估，例如受試者中的APP mRNA水平或 APP蛋白水平（包括 APP 裂解產物），或各種形式的 APP（例如，APPα、APPβ、 Aβ、 Aβ40 和/或 Aβ42 等）、APP C-末端片段 (CTF) 多肽（例如，α-CTF 和/或 β-CTF）和/或 MAPT 肽等。
根據本發明的另一個方面，提供了一種降低受試者體內 APP 蛋白水平的方法，該方法與受試者體內治療前的基線 APP 蛋白水平相比，包括向受試者施用有效量的本發明的任何上述 dsRNA 藥劑的實施例或本發明的任何上述組合物的實施例，以降低 APP 基因表達水平。在一些實施例中，dsRNA 藥劑通過皮下施用給受試者，或通過鞘內施用給受試者，或通過靜脈施用給受試者。
根據本發明的另一個方面，提供了一種改變受試者的 APP 相關疾病或病症的生理特徵的方法，該方法與受試者的 APP 相關疾病或病症的治療前生理特徵基線相比，包括向受試者施用有效量的本發明的任何上述 dsRNA 試劑的實施例或本發明的任何上述組合物的實施例，以改變受試者的 APP 相關疾病或病症的生理特徵。在一些實施例中，dsRNA 試劑皮下施用給受試者、鞘內施用給受試者或通過靜脈施用給受試者。在某些實施例中，所述生理特徵是下列中的一種或多種：受試者的 APP mRNA 水平或 APP 蛋白水平（包括 APP 裂解產物），或各種形式的 APP（例如 APPα、APPβ、 Aβ、 Aβ40 和/或 Aβ42 等）、APP C-末端片段 (CTF) 多肽（例如 α-CTF 和/或 β-CTF）和/或 MAPT 肽等。
根據本發明的另一個方面，提供了上述 dsRNA 劑用於治療與 APP 蛋白的存在相關的疾病或病症的方法。在一些實施例中，所述疾病或病症是以下中的一種或多種：腦澱粉樣血管病 (CAA)、唐氏症 (DS) 和阿爾茨海默病 (AD)，包括遺傳性 CAA、早發性家族性阿爾茨海默病 (EOFAD 或 eFAD)、晚發性AD (LOAD)，以及肌萎縮側索硬化症 (ALS)、額顳葉癡呆、亨廷頓病、帕金森病、脊髓小腦、朊病毒、拉福拉病、中風或與 APP 相關的其他神經退行性疾病或異常。
根據本發明的另一個方面，提供了一種用於抑制APP蛋白表達的反義多核苷酸藥劑，該藥劑包括10至30個連續的核苷酸，其中至少一個連續的核苷酸是修飾的核苷酸，並且其中該藥劑的核苷酸序列在其整個長度上與SEQ ID NO：1的核苷酸序列的等效區域約80％互補。在一些實施例中，等效區域是SEQ ID NO：1中的任一個靶區域，互補序列是表1-3之一中提供的序列。在某些實施例中，反義多核苷酸藥劑包括表1-3之一中提供的反義序列之一。
根據本發明的另一個方面，提供了一種包括上述任何反義多核苷酸劑的實施例的組合物。在一些實施例中，該組合物還包括藥學上可接受的載體。在一些實施例中，該組合物還包括一種或多種用於治療 APP 相關疾病或病症的額外治療劑。在某些實施例中，該組合物包裝在試劑盒、容器、包裝、分配器、預填充注射器或小瓶中。在某些實施例中，該組合物配製用於皮下、鞘內或靜脈內給藥。
根據本發明的另一個方面，提供了一種包括上述任一反義多核苷酸劑的實施例的細胞。在一些實施例中，所述細胞是哺乳動物細胞，任選地是人類細胞。
根據本發明的另一個方面，提供了一種抑制細胞中APP基因表達的方法，該方法包括：(i)製備包含有效量的上述任一反義多核苷酸劑的細胞。在一些實施例中，該方法還包括( ii)將(i)中製備的細胞維持足夠的時間以獲得APP基因的mRNA轉錄物的降解，從而抑制細胞中APP基因的表達。
根據本發明的另一個方面，提供了一種抑制受試者中 APP 基因表達的方法，該方法包括向受試者施用有效量的上述任何反義多核苷酸藥劑的實施例。
根據本發明的另一個方面，提供了一種治療與 APP 蛋白的存在相關的疾病或病症的方法，該方法包括向受試者施用有效量的上述任何一種反義多核苷酸劑的實施例或上述任何一種本發明的組合物的實施例，以抑制 APP 基因表達。在某些實施例中，所述疾病或病症是以下一種或多種：腦澱粉樣血管病 (CAA)、唐氏症 (DS) 和阿爾茨海默病 (AD)，包括遺傳性 CAA、早發性家族性阿爾茨海默病 (EOFAD 或 eFAD)、晚發性 AD (LOAD)，以及肌萎縮側索硬化症 (ALS)、額顳葉癡呆、亨廷頓病、帕金森病、脊髓小腦、朊病毒、拉福拉病(Lafora disease)、中風或與 APP 相關的其他神經退行性疾病或異常。
根據本發明的另一個方面，提供了一種降低受試者體內 APP 蛋白水平的方法，該方法包括向受試者施用有效量的上述任何反義多核苷酸藥劑的實施例或上述任何本發明組合物的實施例，與受試者體內治療前的基線水平相比，以降低 APP 基因表達水平。在某些實施例中，反義多核苷酸藥劑通過皮下、鞘內或靜脈內給藥的方式施用於受試者。
根據本發明的另一個方面，提供了一種用於抑制APP基因表達的反義多核苷酸藥劑，所述藥劑包括10至30個連續的核苷酸，其中至少一個連續的核苷酸是修飾的核苷酸，並且其中所述藥劑的核苷酸序列在其整個長度上與SEQ ID NO：1的核苷酸序列的等同區域約80％或約85％互補。
根據本發明的另一個方面，提供了一種改變受試者的 APP 相關疾病或病症的生理特徵的方法，該方法與受試者的 APP 相關疾病或病症的治療前生理特徵基線相比，包括向受試者施用有效量的上述任何反義多核苷酸藥劑的實施例或上述任何本發明組合物的實施例，以改變受試者的 APP 疾病或病症的生理特徵。在一些實施例中，反義多核苷酸藥劑通過皮下、鞘內或靜脈內施用給受試者。在一些實施例中，所述生理特徵是下列中的一種或多種：受試者的APP mRNA水平或APP蛋白水平（包括APP裂解產物），或各種形式的APP（例如，APPα、APPβ、 Aβ、 Aβ40和/或Aβ42等），APP C-末端片段（CTF）多肽（例如，α-CTF和/或β-CTF），和/或MAPT肽等。 序列的簡要說明
SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2 (反向互補) 是智人澱粉樣β前體蛋白 (APP) mRNA [NCBI 參考序列：NM_000484.4]。
SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4 (反向互補) 是預測的食蟹猴澱粉樣β蛋白前體 (APP) mRNA [NCBI 參考序列： XM_005548883.3]。
SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO: 6 (反向互補) 是預測的恒河猴澱粉樣蛋白β前體蛋白 (APP) mRNA [NCBI 參考序列：XM_015133068.2] 。
SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO: 8 (反向互補) 是大鼠澱粉樣β前體蛋白 (APP) mRNA [NCBI 參考序列: NM_019288.2]。
SEQ ID NO：9-524 ,1779-1832如表1所示，為有義鏈序列。
SEQ ID NO：525-1040, 1833-1886如表1所示，是反義鏈序列。
SEQ ID NO: 1041-1556如表 2 所示，為經過化學修飾的序列。
SEQ ID NO: 1557-1778 顯示於表 3 中。遞送分子在每條有義鏈的 3' 端或 5' 端指示為“GLX-__”。
本發明部分包括RNAi劑，例如但不限於雙鏈(ds)RNAi劑，其能夠抑制澱粉樣蛋白前體(APP)基因表達。本發明部分還包括包含APP RNAi劑的組合物以及該組合物的使用方法。本文公開的APP RNAi劑可以附著於遞送化合物以遞送至細胞，包括CNS(例如，腦)細胞、肝細胞。本發明的藥物組合物可以包括至少一種dsRNAi APP劑和遞送化合物。在本發明的組合物和方法的一些實施例中，遞送化合物是含GalNAc的遞送化合物。遞送至細胞的APP RNAi劑能夠抑制APP基因表達，從而降低該基因的APP蛋白產物在細胞中的活性。本發明的dsRNAi劑可用於治療APP相關疾病和病症。
在本發明的一些實施例中，降低細胞或受試者中的 APP 表達分別治療與細胞或受試者中的 APP 表達相關的疾病或病症。在一些實施例中，dsRNA 導致海馬、紋狀體、皮質、小腦、丘腦、下丘腦和脊髓中的一個或多個中的 APP 基因 mRNA 減少。可通過降低 APP 活性來治療的疾病和病症的非限制性例子有：腦澱粉樣血管病 (CAA)、唐氏症 (DS) 和阿爾茨海默病 (AD)，包括遺傳性 CAA、早發性家族性阿爾茨海默病 (EOFAD 或 eFAD)、晚發性 AD (LOAD)，以及肌萎縮側索硬化症 (ALS)、額顳葉癡呆、亨廷頓病、帕金森病、脊髓小腦、朊病毒、拉福拉病、中風，或降低 APP 蛋白的水平和活性在醫學上有益的其他疾病。
如本文所用，“G”、“C”、“A”和“U”通常分別代表含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作為鹼基的核苷酸。然而，應理解，術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指修飾的核苷酸（如下文進一步詳述）或替代替換部分。本領域技術人員理解，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分替換，而不會顯著改變包含帶有此類替換部分的核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對特性。例如，但不限於，包含肌苷作為鹼基的核苷酸可以與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸鹼基配對。因此，在本發明的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如肌苷的核苷酸替換。包含此類替換部分的序列是本發明的實施例。
如本文所用，“澱粉樣蛋白前體”與術語“APP”互換使用，是指編碼來自任何脊椎動物或哺乳動物來源的澱粉樣蛋白前體的天然基因，包括但不限於人類、牛、雞、齧齒動物、小鼠、大鼠、豬、綿羊、靈長類動物、猴子和豚鼠，除非另有說明。該術語還指保留天然 APP 的至少一種體內或體外活性的天然 APP 的片段和變體。人類 APP 基因參考序列的氨基酸和完整編碼序列可在例如 GenBank Ref Seq Accession No. NM_000484.4（SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2）中找到。人類 APP 基因的哺乳動物直系同源物可見於，例如，GenBank 參考序列號 XM_005548883.3，食蟹猴（SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4），GenBank 參考序列號 XM_015133068.2，恒河猴（SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6） ， GenBank 參考序列號 NM_019288.2，大鼠（SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8）。APP mRNA 序列的其他實例可利用公共數據庫（例如 GenBank、UniProt、Ensembl 和 OMIM）輕鬆獲得。
以下描述了如何製備和使用包含 APP 單鏈 (ssRNA) 和 dsRNA 劑的組合物來抑制 APP 基因表達，以及用於治療由 APP 基因表達引起或受其調節的疾病和病症的組合物和方法。術語“RNAi”在本領域中也是已知的，並且可以稱為“siRNA”。
如本文所用，術語“RNAi”是指包含 RNA 並通過 RNA 誘導沉默複合體 (RISC) 途徑介導 RNA 轉錄物的靶向切割的藥劑。如本領域所知，RNAi 靶區域是指在基因轉錄過程中形成的 mRNA 分子的核苷酸序列的連續部分，包括信使 RNA (mRNA)，它是 RNA 加工初級轉錄產物的產物。序列的靶部分將至少足夠長，以用作該部分或附近的 RNAi 指導切割的底物。靶序列的長度可為 8-30 個核苷酸（含端值）、10-30 個核苷酸（含端值）、12-25 個核苷酸（含端值）、15-23 個核苷酸（含端值）、16-23 個核苷酸（含端值）或 18-23 個核苷酸（含端值），包括每個所述範圍內的所有較短長度。在本發明的一些實施例中，靶序列的長度為 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或 26 個核苷酸。在某些實施例中，靶序列的長度為 9 至 26 個核苷酸（含端值），包括其間的所有子範圍和整數。例如，儘管並非旨在限制，但在本發明的某些實施例中，靶序列的長度為 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸，且該序列與 APP 基因的 RNA 轉錄物的至少一部分完全互補或至少基本互補。本發明的一些方面包括包含一種或多種 APP dsRNA 劑和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在本發明的某些實施例中，如本文所述的 APP RNAi 抑制 APP 蛋白的表達。
本文使用的“dsRNA 藥劑”是指含有 RNA 或 RNA 樣（例如，化學修飾的 RNA）寡核苷酸分子的組合物，該寡核苷酸分子能夠以序列特異性方式降解或抑制目標 mRNA 的信使 RNA (mRNA) 轉錄物的翻譯。儘管不希望局限於特定理論，但本發明的 dsRNA 藥劑可以通過 RNA 干擾機制（即通過與哺乳動物細胞的 RNA 干擾途徑機制（RNA 誘導的沉默複合物或 RISC）相互作用來誘導 RNA 干擾）或通過任何替代機制或途徑起作用。本領域中熟知用於沉默植物、無脊椎動物和脊椎動物細胞中的基因的方法是[參見例如(Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485; Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363; Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309; and Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)]，其中每一篇的公開內容均以引用的方式將其全文併入本文中。]本領域已知的基因沉默程序可與本文提供的公開內容結合使用，以抑制 APP 的表達。
本文公開的 dsRNA 劑由一條有義鏈和一條反義鏈組成，包括但不限於：短干擾 RNA (siRNA)、RNAi 劑、微 RNA (miRNA)、短髮夾 RNA (shRNA) 和切丁酶底物。本文描述的 dsRNA 劑的反義鏈至少部分與目標 mRNA 互補。本領域中已知不同長度的 dsRNA 雙鏈結構可用於抑制靶基因表達。例如，已知具有 19、20、21、22 和 23 個鹼基對的雙鏈結構的 dsRNA 可有效誘導 RNA 干擾 (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888)。本領域中還已知較短或較長的 RNA 雙鏈結構也可有效誘導 RNA 干擾。在一些實施例中，有義鏈和反義鏈的長度可以相同或不同。在一些實施例中，每條鏈的長度不超過40個核苷酸。在一些實施例中，每條鏈的長度不超過30個核苷酸。在一些實施例中，每條鏈的長度不超過25個核苷酸。在一些實施例中，每條鏈的長度不超過23個核苷酸。在一些實施例中，每條鏈的長度不超過21個核苷酸。在一些實施例中，RNAi劑的有義鏈和反義鏈的長度可以分別為15至49個核苷酸。在一些實施例中，反義鏈的長度獨立地為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，有義鏈的長度獨立地為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸。在一些實施例中，有義鏈和反義鏈的長度均為21個核苷酸。在一些實施例中，有義鏈與反義鏈互補或基本互補，互補區域的長度為15至23個核苷酸。在一些實施例中，互補區域的長度為19-21個核苷酸。在一些實施例中，互補區域的長度為 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸。在本發明的某些實施例中，APP dsRNA 可以包括至少一條長度至少為 21 nt 的鏈，或者可以具有基於表 1-3 中任一個中列出的序列之一的較短雙鏈體，但是與表 1-3 中列出的 dsRNA 相比，一端或兩端分別減少 1、2、3 或 4 個核苷酸也可能有效。在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑可具有來自表 1-3 中的一個或多個序列的至少 15、16、17、18、19、20 或更多個連續核苷酸的部分序列，並且其抑制 APP 基因表達的能力與包含完整序列的 dsRNA 產生的抑制水平相差不超過 5%、10%、15%、20%、25% 或 30%。表 1-3 中公開的有義序列、反義序列和雙鏈體可在本文中稱為”親本”序列，這意味著表 1-3 中公開的序列可如本文所述進行修飾、縮短、加長、包括替換等，所得序列在本發明的方法和組合物中保留其親本序列的全部或至少一部分功效。本發明的 dsRNA 中包含的有義鏈和反義鏈是獨立選擇的。如本文所用，術語“獨立選擇”是指可以獨立於其他元件的選擇來選擇兩個或更多個相似元件中的每一個。例如，雖然並非旨在限制，但在製備本發明的 dsRNA 時，可以選擇兩條鏈中的“元件”以包括在雙鏈中。一個選定的元件，即有義序列可以是 SEQ ID NO: 1041（如表 2 所示），而另一個選定的元件，即反義序列，可以是 SEQ ID NO: 1299，或者可以是與其母序列 SEQ ID NO: 1299 相比被修飾、縮短、加長和/或包括 1、2 或 3 個替換的 SEQ ID NO: 1299。應當理解，本發明的雙鏈不必同時包括表 1-3 中所示的雙鏈中成對的有義和反義序列。表中每個有義和反義鏈序列後面緊跟著其 SEQ ID NO。
本發明的組合物和方法的某些實施例包括組合物中和/或施用給受試者的單鏈RNA。例如，表1-3中任一表所列的反義鏈可以是組合物或施用給受試者的組合物，以降低受試者體內的APP多肽活性和/或APP基因的表達。表1顯示了某些APP dsRNA劑反義鏈和有義鏈核心延伸鹼基序列。可包括在本發明的某些組合物中和/或施用在本發明的某些方法中的單鏈反義分子在本文中稱為“單鏈反義劑”或“反義多核苷酸劑”。可包括在本發明的某些組合物中和/或施用在本發明的某些方法中的單鏈有義分子在本文中稱為“單鏈有義劑”或“有義多核苷酸劑”。術語“鹼基序列”在本文中用於指沒有化學修飾或遞送化合物的多核苷酸序列。例如，表 1 中所示的有義鏈 UUCCUGACAAGUGCAAAUUCA (SEQ ID NO: 15) 是表 2 中 SEQ ID NO: 1047 和表 3 中 SEQ ID NO: 1557 的鹼基序列，其中 SEQ ID NO: 1047 和 SEQ ID NO: 1557 顯示了它們的化學修飾和遞送化合物。本文公開的序列可以被分配標識符。例如，單鏈有義序列可以用“有義鏈 SS#”來標識；單鏈反義序列可以用“反義鏈 AS#”來標識，並且包括有義鏈和反義鏈的雙鏈可以用“雙鏈 AD#/AV#”來標識。
表 1 包括正鏈和反鏈，並提供了表 1 中同一行上由正鏈和反鏈形成的雙鏈的標識號。在本發明的某些實施例中，反義序列包括反義序列位置 1 處的核鹼基 u 或核鹼基 a。在本發明的某些實施例中，反義序列包括反義序列位置 1 處的核鹼基 u。如本文所用，正鏈和反義鏈中的術語“匹配位置”是當兩條鏈為雙鏈時每條鏈中“配對”的位置。例如，在 21 個核鹼基的正鏈和 21 個核鹼基的反義鏈中，正鏈位置 1 處的核鹼基和反義鏈位置 21 處的核鹼基處於“匹配位置”。在又一個非限制性示例中，在 23 個核鹼基的有義鏈和 23 個核鹼基的反義鏈中，有義鏈的核鹼基 2 和反義鏈的 22 位處於匹配位置。在又一個非限制性示例中，在 18 個核鹼基的有義鏈和 18 個核鹼基的反義鏈中，有義鏈的 1 位的核鹼基和反義鏈的 18 位的核鹼基處於匹配位置，有義鏈的4位核鹼基和反義鏈的15位核鹼基處於匹配位置。本領域技術人員將瞭解如何識別是或將是雙鏈和成對鏈的有義鏈和反義鏈中的匹配位置。
表 1 中的最後一列表示包含同一表行中的有義和反義序列的雙鏈的雙鏈 AV#。例如，表 1 公開了指定為雙鏈 AV# AV00622.um 的雙鏈，其包含有義鏈 SEQ ID NO: 9 和反義鏈 SEQ ID NO: 525。因此，表 1 中的每一行都標識了本發明的雙鏈，每個雙鏈都包含同一行中顯示的有義和反義序列，每個雙鏈的分配標識符顯示在行的第一列中。
在本發明的方法的一些實施例中，向受試者施用包含表 1-3 中任一個所示的多核苷酸序列的 RNAi 劑。在本發明的一些實施例中，向受試者施用的 RNAi 劑包括雙鏈體，該雙鏈體包括表 1 中列出的至少一個鹼基序列，包括 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或 24 個序列修飾。在本發明的方法的一些實施例中，將包含表 1-3 中任一個所示的多核苷酸序列的 RNAi 劑附著到遞送分子，遞送分子的非限制性實例是包含 GalNAc 化合物或 GLS-15* 化合物的遞送化合物。
表 1：未修飾的 APP RNAi 劑反義鏈和有義鏈序列。所有序列均以 5' 至 3' 方向顯示。雙鏈AV#是分配給表中同一行中兩條鏈的雙鏈的標識符。
雙鏈AV# 有義鏈 序列號. 反義鏈 序列號. 在NM_000484.4中的位置
AV00622.um CUACCCUGAACUGCAGAUCAA 9 UUGAUCUGCAGUUCAGGGUAG 525 378-398
AV00623.um CUGAACUGCAGAUCACCAAUA 10 UAUUGGUGAUCUGCAGUUCAG 526 383-403
AV00624.um CAGAUCACCAAUGUGGUAGAA 11 UUCUACCACAUUGGUGAUCUG 527 391-411
AV00625.um CAUCCCCACUUUGUGAUUCCA 12 UGGAAUCACAAAGUGGGGAUG 528 472-492
AV00626.um UGCUUAGUUGGUGAGUUUGUA 13 UACAAACUCACCAACUAAGCA 529 499-519
AV00627.um GUUCCUGACAAGUGCAAAUUA 14 UAAUUUGCACUUGUCAGGAAC 530 535-555
AV00628.um UUCCUGACAAGUGCAAAUUCA 15 UGAAUUUGCACUUGUCAGGAA 531 536-556
AV00629.um UCCUGACAAGUGCAAAUUCUA 16 UAGAAUUUGCACUUGUCAGGA 532 537-557
AV00630.um CUGACAAGUGCAAAUUCUUAA 17 UUAAGAAUUUGCACUUGUCAG 533 539-559
AV00631.um ACAAGUGCAAAUUCUUACACA 18 UGUGUAAGAAUUUGCACUUGU 534 542-562
AV00632.um CCAGGAGAGGAUGGAUGUUUA 19 UAAACAUCCAUCCUCUCCUGG 535 561-581
AV00633.um GUUCCGAGGGGUAGAGUUUGA 20 UCAAACUCUACCCCUCGGAAC 536 684-704
AV00634.um AGAAAGUGACAAUGUGGAUUA 21 UAAUCCACAUUGUCACUUUCU 537 723-743
AV00635.um GAAAGUGACAAUGUGGAUUCA 22 UGAAUCCACAUUGUCACUUUC 538 724-744
AV00636.um AAAGUGACAAUGUGGAUUCUA 23 UAGAAUCCACAUUGUCACUUU 539 725-745
AV00637.um GGGAGUGAAGACAAAGUAGUA 24 UACUACUUUGUCUUCACUCCC 540 808-828
AV00638.um GGAGUGAAGACAAAGUAGUAA 25 UUACUACUUUGUCUUCACUCC 541 809-829
AV00639.um GAGUGAAGACAAAGUAGUAGA 26 UCUACUACUUUGUCUUCACUC 542 810-830
AV00640.um AGUGAAGACAAAGUAGUAGAA 27 UUCUACUACUUUGUCUUCACU 543 811-831
AV00641.um GUGAAGACAAAGUAGUAGAAA 28 UUUCUACUACUUUGUCUUCAC 544 812-832
AV00642.um UGAAGACAAAGUAGUAGAAGA 29 UCUUCUACUACUUUGUCUUCA 545 813-833
AV00643.um GAAGACAAAGUAGUAGAAGUA 30 UACUUCUACUACUUUGUCUUC 546 814-834
AV00644.um GACAAAGUAGUAGAAGUAGCA 31 UGCUACUUCUACUACUUUGUC 547 817-837
AV00645.um GAAGAAGCCGAUGAUGACGAA 32 UUCGUCAUCAUCGGCUUCUUC 548 868-888
AV00646.um CCUGAUGCCGUUGACAAGUAA 33 UUACUUGUCAACGGCAUCAGG 549 1264-1284
AV00647.um GUCCCAGGUCAUGAGAGAAUA 34 UAUUCUCUCAUGACCUGGGAC 550 1368-1388
AV00648.um CAAGCAAAGAACUUGCCUAAA 35 UUUAGGCAAGUUCUUUGCUUG 551 1405-1425
AV00649.um AAGCAAAGAACUUGCCUAAAA 36 UUUUAGGCAAGUUCUUUGCUU 552 1406-1426
AV00650.um AGCAAAGAACUUGCCUAAAGA 37 UCUUUAGGCAAGUUCUUUGCU 553 1407-1427
AV00651.um CUUGCCUAAAGCUGAUAAGAA 38 UUCUUAUCAGCUUUAGGCAAG 554 1416-1436
AV00652.um UUGCCUAAAGCUGAUAAGAAA 39 UUUCUUAUCAGCUUUAGGCAA 555 1417-1437
AV00653.um GCUGAUAAGAAGGCAGUUAUA 40 UAUAACUGCCUUCUUAUCAGC 556 1426-1446
AV00654.um CUGAUAAGAAGGCAGUUAUCA 41 UGAUAACUGCCUUCUUAUCAG 557 1427-1447
AV00655.um UGAUAAGAAGGCAGUUAUCCA 42 UGGAUAACUGCCUUCUUAUCA 558 1428-1448
AV00656.um GAAGGCAGUUAUCCAGCAUUA 43 UAAUGCUGGAUAACUGCCUUC 559 1434-1454
AV00657.um CAGGAGAAAGUGGAAUCUUUA 44 UAAAGAUUCCACUUUCUCCUG 560 1456-1476
AV00658.um GGAGAAAGUGGAAUCUUUGGA 45 UCCAAAGAUUCCACUUUCUCC 561 1458-1478
AV00659.um GAAAGUGGAAUCUUUGGAACA 46 UGUUCCAAAGAUUCCACUUUC 562 1461-1481
AV00660.um AAAGUGGAAUCUUUGGAACAA 47 UUGUUCCAAAGAUUCCACUUU 563 1462-1482
AV00661.um GUGGAAUCUUUGGAACAGGAA 48 UUCCUGUUCCAAAGAUUCCAC 564 1465-1485
AV00662.um GAGUGGAAGCCAUGCUCAAUA 49 UAUUGAGCAUGGCUUCCACUC 565 1529-1549
AV00663.um GCCUCGUCACGUGUUCAAUAA 50 UUAUUGAACACGUGACGAGGC 566 1608-1628
AV00664.um CCUCGUCACGUGUUCAAUAUA 51 UAUAUUGAACACGUGACGAGG 567 1609-1629
AV00665.um UCGUCACGUGUUCAAUAUGCA 52 UGCAUAUUGAACACGUGACGA 568 1611-1631
AV00666.um CGUCACGUGUUCAAUAUGCUA 53 UAGCAUAUUGAACACGUGACG 569 1612-1632
AV00667.um CUAAAGCAUUUCGAGCAUGUA 54 UACAUGCUCGAAAUGCUUUAG 570 1675-1695
AV00668.um ACACACCUCCGUGUGAUUUAA 55 UUAAAUCACACGGAGGUGUGU 571 1744-1764
AV00669.um GGAGAUUCAGGAUGAAGUUGA 56 UCAACUUCAUCCUGAAUCUCC 572 1818-1838
AV00670.um GAGAUUCAGGAUGAAGUUGAA 57 UUCAACUUCAUCCUGAAUCUC 573 1819-1839
AV00671.um AGAUUCAGGAUGAAGUUGAUA 58 UAUCAACUUCAUCCUGAAUCU 574 1820-1840
AV00672.um GAUUCAGGAUGAAGUUGAUGA 59 UCAUCAACUUCAUCCUGAAUC 575 1821-1841
AV00673.um AUUCAGGAUGAAGUUGAUGAA 60 UUCAUCAACUUCAUCCUGAAU 576 1822-1842
AV00674.um AGUUGAUGAGCUGCUUCAGAA 61 UUCUGAAGCAGCUCAUCAACU 577 1833-1853
AV00675.um AGAGCAAAACUAUUCAGAUGA 62 UCAUCUGAAUAGUUUUGCUCU 578 1854-1874
AV00676.um AGCAAAACUAUUCAGAUGACA 63 UGUCAUCUGAAUAGUUUUGCU 579 1856-1876
AV00677.um AACUAUUCAGAUGACGUCUUA 64 UAAGACGUCAUCUGAAUAGUU 580 1861-1881
AV00678.um GUCUUGGCCAACAUGAUUAGA 65 UCUAAUCAUGUUGGCCAAGAC 581 1876-1896
AV00679.um UCUUGGCCAACAUGAUUAGUA 66 UACUAAUCAUGUUGGCCAAGA 582 1877-1897
AV00680.um CUUGGCCAACAUGAUUAGUGA 67 UCACUAAUCAUGUUGGCCAAG 583 1878-1898
AV00681.um AACAUGAUUAGUGAACCAAGA 68 UCUUGGUUCACUAAUCAUGUU 584 1885-1905
AV00682.um UAGUGAACCAAGGAUCAGUUA 69 UAACUGAUCCUUGGUUCACUA 585 1893-1913
AV00683.um GUGAACCAAGGAUCAGUUACA 70 UGUAACUGAUCCUUGGUUCAC 586 1895-1915
AV00684.um ACCAAGGAUCAGUUACGGAAA 71 UUUCCGUAACUGAUCCUUGGU 587 1899-1919
AV00685.um CCAAGGAUCAGUUACGGAAAA 72 UUUUCCGUAACUGAUCCUUGG 588 1900-1920
AV00686.um CAUCUUUGACCGAAACGAAAA 73 UUUUCGUUUCGGUCAAAGAUG 589 1934-1954
AV00687.um AUCUUUGACCGAAACGAAAAA 74 UUUUUCGUUUCGGUCAAAGAU 590 1935-1955
AV00688.um CCAGCCAACACAGAAAACGAA 75 UUCGUUUUCUGUGUUGGCUGG 591 2038-2058
AV00689.um CAGCCAACACAGAAAACGAAA 76 UUUCGUUUUCUGUGUUGGCUG 592 2039-2059
AV00690.um CAGGUUCUGGGUUGACAAAUA 77 UAUUUGUCAACCCAGAACCUG 593 2111-2131
AV00691.um UUCUGGGUUGACAAAUAUCAA 78 UUGAUAUUUGUCAACCCAGAA 594 2115-2135
AV00692.um CGGAGGAGAUCUCUGAAGUGA 79 UCACUUCAGAGAUCUCCUCCG 595 2138-2158
AV00693.um GGAGGAGAUCUCUGAAGUGAA 80 UUCACUUCAGAGAUCUCCUCC 596 2139-2159
AV00694.um AUCACCUUGGUGAUGCUGAAA 81 UUUCAGCAUCACCAAGGUGAU 597 2302-2322
AV00695.um ACAUCCAUUCAUCAUGGUGUA 82 UACACCAUGAUGAAUGGAUGU 598 2335-2355
AV00696.um GAAAAUCCAACCUACAAGUUA 83 UAACUUGUAGGUUGGAUUUUC 599 2422-2442
AV00697.um AAGUUCUUUGAGCAGAUGCAA 84 UUGCAUCUGCUCAAAGAACUU 600 2437-2457
AV00698.um UUUGAGCAGAUGCAGAACUAA 85 UUAGUUCUGCAUCUGCUCAAA 601 2443-2463
AV00699.um CCACAGCAGCCUCUGAAGUUA 86 UAACUUCAGAGGCUGCUGUGG 602 2471-2491
AV00700.um ACAGCAGCCUCUGAAGUUGGA 87 UCCAACUUCAGAGGCUGCUGU 603 2473-2493
AV00701.um GUUGGACAGCAAAACCAUUGA 88 UCAAUGGUUUUGCUGUCCAAC 604 2488-2508
AV00702.um GACAGCAAAACCAUUGCUUCA 89 UGAAGCAAUGGUUUUGCUGUC 605 2492-2512
AV00703.um AGCAAAACCAUUGCUUCACUA 90 UAGUGAAGCAAUGGUUUUGCU 606 2495-2515
AV00704.um CAUCGGUGUCCAUUUAUAGAA 91 UUCUAUAAAUGGACACCGAUG 607 2518-2538
AV00705.um CGGUGUCCAUUUAUAGAAUAA 92 UUAUUCUAUAAAUGGACACCG 608 2521-2541
AV00706.um UUUUAUGAUUUACUCAUUAUA 93 UAUAAUGAGUAAAUCAUAAAA 609 2562-2582
AV00707.um UUACUCAUUAUCGCCUUUUGA 94 UCAAAAGGCGAUAAUGAGUAA 610 2571-2591
AV00708.um UUUGACAGCUGUGCUGUAACA 95 UGUUACAGCACAGCUGUCAAA 611 2587-2607
AV00709.um GACAGCUGUGCUGUAACACAA 96 UUGUGUUACAGCACAGCUGUC 612 2590-2610
AV00710.um GCUGUGCUGUAACACAAGUAA 97 UUACUUGUGUUACAGCACAGC 613 2594-2614
AV00711.um CAAGUAGAUGCCUGAACUUGA 98 UCAAGUUCAGGCAUCUACUUG 614 2608-2628
AV00712.um GAUGCCUGAACUUGAAUUAAA 99 UUUAAUUCAAGUUCAGGCAUC 615 2614-2634
AV00713.um UACUACAUUAUUAAUGGGUUA 100 UAACCCAUUAAUAAUGUAGUA 616 2682-2702
AV00714.um ACAUUAUUAAUGGGUUUUGUA 101 UACAAAACCCAUUAAUAAUGU 617 2686-2706
AV00715.um UGUAAAGAAUUUAGCUGUAUA 102 UAUACAGCUAAAUUCUUUACA 618 2710-2730
AV00716.um GUAAAGAAUUUAGCUGUAUCA 103 UGAUACAGCUAAAUUCUUUAC 619 2711-2731
AV00717.um UAAAGAAUUUAGCUGUAUCAA 104 UUGAUACAGCUAAAUUCUUUA 620 2712-2732
AV00718.um AAGAAUUUAGCUGUAUCAAAA 105 UUUUGAUACAGCUAAAUUCUU 621 2714-2734
AV00719.um AGAAUUUAGCUGUAUCAAACA 106 UGUUUGAUACAGCUAAAUUCU 622 2715-2735
AV00720.um GAAUUUAGCUGUAUCAAACUA 107 UAGUUUGAUACAGCUAAAUUC 623 2716-2736
AV00721.um UUAGCUGUAUCAAACUAGUGA 108 UCACUAGUUUGAUACAGCUAA 624 2720-2740
AV00722.um AAACUAGUGCAUGAAUAGAUA 109 UAUCUAUUCAUGCACUAGUUU 625 2731-2751
AV00723.um AACUAGUGCAUGAAUAGAUUA 110 UAAUCUAUUCAUGCACUAGUU 626 2732-2752
AV00724.um ACUAGUGCAUGAAUAGAUUCA 111 UGAAUCUAUUCAUGCACUAGU 627 2733-2753
AV00725.um GUGCAUGAAUAGAUUCUCUCA 112 UGAGAGAAUCUAUUCAUGCAC 628 2737-2757
AV00726.um UGAAUAGAUUCUCUCCUGAUA 113 UAUCAGGAGAGAAUCUAUUCA 629 2742-2762
AV00727.um AAUAGAUUCUCUCCUGAUUAA 114 UUAAUCAGGAGAGAAUCUAUU 630 2744-2764
AV00728.um AUAGAUUCUCUCCUGAUUAUA 115 UAUAAUCAGGAGAGAAUCUAU 631 2745-2765
AV00729.um UAGAUUCUCUCCUGAUUAUUA 116 UAAUAAUCAGGAGAGAAUCUA 632 2746-2766
AV00730.um UUCUCUCCUGAUUAUUUAUCA 117 UGAUAAAUAAUCAGGAGAGAA 633 2750-2770
AV00731.um AGCCAGUUGUAUAUUAUUCUA 118 UAGAAUAAUAUACAACUGGCU 634 2782-2802
AV00799.um GCGCCAUGUCCCAAAGUUUAU 119 AUAAACUUUGGGACAUGGCGC 635 1178-1198
AV00800.um UUGCCCGAGAUCCUGUUAAAU 120 AUUUAACAGGAUCUCGGGCAA 636 1220-1240
AV00801.um CUUCCCGUGAAUGGAGAGUUU 121 AAACUCUCCAUUCACGGGAAG 637 1969-1989
AV00802.um CAGGAUAUGAAGUUCAUCAUU 122 AAUGAUGAACUUCAUAUCCUG 638 2186-2206
AV00803.um CAGUACACAUCCAUUCAUCAU 123 AUGAUGAAUGGAUGUGUACUG 639 2329-2349
AV04826.um CAAGUCUACCCUGAACUGCAA 124 UUGCAGUUCAGGGUAGACUUG 640 373-393
AV04827.um GGAACUGCAGAUCACCAAUGA 125 UCAUUGGUGAUCUGCAGUUCC 641 384-404
AV04828.um CAACUGCAGAUCACCAAUGUA 126 UACAUUGGUGAUCUGCAGUUG 642 385-405
AV04829.um CCAGAUCACCAAUGUGGUAGA 127 UCUACCACAUUGGUGAUCUGG 643 390-410
AV04830.um GGAUCACCAAUGUGGUAGAAA 128 UUUCUACCACAUUGGUGAUCC 644 392-412
AV04831.um CAUCACCAAUGUGGUAGAAGA 129 UCUUCUACCACAUUGGUGAUG 645 393-413
AV04832.um GCAUCCAGAACUGGUGCAAGA 130 UCUUGCACCAGUUCUGGAUGC 646 428-448
AV04833.um GUGCUUAGUUGGUGAGUUUGA 131 UCAAACUCACCAACUAAGCAC 647 498-518
AV04834.um GUUAGUUGGUGAGUUUGUAAA 132 UUUACAAACUCACCAACUAAC 648 501-521
AV04835.um GAGUGAUGCCCUUCUCGUUCA 133 UGAACGAGAAGGGCAUCACUC 649 519-539
AV04836.um GGUGAUGCCCUUCUCGUUCCA 134 UGGAACGAGAAGGGCAUCACC 650 520-540
AV04837.um GGACAAGUGCAAAUUCUUACA 135 UGUAAGAAUUUGCACUUGUCC 651 540-560
AV04838.um CACAAGUGCAAAUUCUUACAA 136 UUGUAAGAAUUUGCACUUGUG 652 541-561
AV04839.um GAAGUGCAAAUUCUUACACCA 137 UGGUGUAAGAAUUUGCACUUC 653 543-563
AV04840.um GAGUGCAAAUUCUUACACCAA 138 UUGGUGUAAGAAUUUGCACUC 654 544-564
AV04841.um CAGUACCAACUUGCAUGACUA 139 UAGUCAUGCAAGUUGGUACUG 655 633-653
AV04842.um GGUACCAACUUGCAUGACUAA 140 UUAGUCAUGCAAGUUGGUACC 656 634-654
AV04843.um CUACCAACUUGCAUGACUACA 141 UGUAGUCAUGCAAGUUGGUAG 657 635-655
AV04844.um GUGCAUGACUACGGCAUGUUA 142 UAACAUGCCGUAGUCAUGCAC 658 643-663
AV04845.um GAGAGUUUGUGUGUUGCCCAA 143 UUGGGCAACACACAAACUCUC 659 695-715
AV04846.um GGAAGAAAGUGACAAUGUGGA 144 UCCACAUUGUCACUUUCUUCC 660 720-740
AV04847.um CAAGAAAGUGACAAUGUGGAA 145 UUCCACAUUGUCACUUUCUUG 661 721-741
AV04848.um GAGUGACAAUGUGGAUUCUGA 146 UCAGAAUCCACAUUGUCACUC 662 726-746
AV04849.um CUGACAAUGUGGAUUCUGCUA 147 UAGCAGAAUCCACAUUGUCAG 663 728-748
AV04850.um GGAUGGGAGUGAAGACAAAGA 148 UCUUUGUCUUCACUCCCAUCC 664 804-824
AV04851.um CAUGGGAGUGAAGACAAAGUA 149 UACUUUGUCUUCACUCCCAUG 665 805-825
AV04852.um CAAGCCGAUGAUGACGAGGAA 150 UUCCUCGUCAUCAUCGGCUUG 666 871-891
AV04853.um CAGGAUGGUGAUGAGGUAGAA 151 UUCUACCUCAUCACCAUCCUG 667 895-915
AV04854.um GGUGGAAGAGGUGGUUCGAGA 152 UCUCGAACCACCUCUUCCACC 668 996-1016
AV04855.um CCCCAUUUCCAGAAAGCCAAA 153 UUUGGCUUUCUGGAAAUGGGG 669 1315-1335
AV04856.um CGUCAUGAGAGAAUGGGAAGA 154 UCUUCCCAUUCUCUCAUGACG 670 1374-1394
AV04857.um CCAAAGAACUUGCCUAAAGCA 155 UGCUUUAGGCAAGUUCUUUGG 671 1408-1428
AV04858.um GAGAACUUGCCUAAAGCUGAA 156 UUCAGCUUUAGGCAAGUUCUC 672 1411-1431
AV04859.um GCUUGCCUAAAGCUGAUAAGA 157 UCUUAUCAGCUUUAGGCAAGC 673 1415-1435
AV04860.um GAAGCUGAUAAGAAGGCAGUA 158 UACUGCCUUCUUAUCAGCUUC 674 1423-1443
AV04861.um GAGCUGAUAAGAAGGCAGUUA 159 UAACUGCCUUCUUAUCAGCUC 675 1424-1444
AV04862.um GGCUGAUAAGAAGGCAGUUAA 160 UUAACUGCCUUCUUAUCAGCC 676 1425-1445
AV04863.um GAGAAGGCAGUUAUCCAGCAA 161 UUGCUGGAUAACUGCCUUCUC 677 1432-1452
AV04864.um GGGAGAAAGUGGAAUCUUUGA 162 UCAAAGAUUCCACUUUCUCCC 678 1457-1477
AV04865.um CAGAAAGUGGAAUCUUUGGAA 163 UUCCAAAGAUUCCACUUUCUG 679 1459-1479
AV04866.um GGAAAGUGGAAUCUUUGGAAA 164 UUUCCAAAGAUUCCACUUUCC 680 1460-1480
AV04867.um GUAUGAGCGCAUGAAUCAGUA 165 UACUGAUUCAUGCGCUCAUAC 681 1761-1781
AV04868.um CUCUCUCUCCCUGCUCUACAA 166 UUGUAGAGCAGGGAGAGAGAG 682 1779-1799
AV04869.um CAGGAGAUUCAGGAUGAAGUA 167 UACUUCAUCCUGAAUCUCCUG 683 1816-1836
AV04870.um GAGGAUGAAGUUGAUGAGCUA 168 UAGCUCAUCAACUUCAUCCUC 684 1825-1845
AV04871.um GGCUGCUUCAGAAAGAGCAAA 169 UUUGCUCUUUCUGAAGCAGCC 685 1841-1861
AV04872.um GAGAAAGAGCAAAACUAUUCA 170 UGAAUAGUUUUGCUCUUUCUC 686 1849-1869
AV04873.um GAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 171 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUC 687 1852-1872
AV04874.um GAGAGCAAAACUAUUCAGAUA 172 UAUCUGAAUAGUUUUGCUCUC 688 1853-1873
AV04875.um GGAUGACGUCUUGGCCAACAA 173 UUGUUGGCCAAGACGUCAUCC 689 1869-1889
AV04876.um GUGGCCAACAUGAUUAGUGAA 174 UUCACUAAUCAUGUUGGCCAC 690 1879-1899
AV04877.um CGCCAACAUGAUUAGUGAACA 175 UGUUCACUAAUCAUGUUGGCG 691 1881-1901
AV04878.um CCCAACAUGAUUAGUGAACCA 176 UGGUUCACUAAUCAUGUUGGG 692 1882-1902
AV04879.um GUAGUGAACCAAGGAUCAGUA 177 UACUGAUCCUUGGUUCACUAC 693 1892-1912
AV04880.um GGUGAACCAAGGAUCAGUUAA 178 UUAACUGAUCCUUGGUUCACC 694 1894-1914
AV04881.um GGAACCAAGGAUCAGUUACGA 179 UCGUAACUGAUCCUUGGUUCC 695 1896-1916
AV04882.um GAAGGAUCAGUUACGGAAACA 180 UGUUUCCGUAACUGAUCCUUC 696 1901-1921
AV04883.um GAGGAUCAGUUACGGAAACGA 181 UCGUUUCCGUAACUGAUCCUC 697 1902-1922
AV04884.um CGAUCAGUUACGGAAACGAUA 182 UAUCGUUUCCGUAACUGAUCG 698 1904-1924
AV04885.um GCAUCUUUGACCGAAACGAAA 183 UUUCGUUUCGGUCAAAGAUGC 699 1933-1953
AV04886.um GCUUUGACCGAAACGAAAACA 184 UGUUUUCGUUUCGGUCAAAGC 700 1936-1956
AV04887.um GGAGUUCAGCCUGGACGAUCA 185 UGAUCGUCCAGGCUGAACUCC 701 1983-2003
AV04888.um GGCCAACACAGAAAACGAAGA 186 UCUUCGUUUUCUGUGUUGGCC 702 2040-2060
AV04889.um GGGUUCUGGGUUGACAAAUAA 187 UUAUUUGUCAACCCAGAACCC 703 2112-2132
AV04890.um GCUGGGUUGACAAAUAUCAAA 188 UUUGAUAUUUGUCAACCCAGC 704 2116-2136
AV04891.um GUGGGUUGACAAAUAUCAAGA 189 UCUUGAUAUUUGUCAACCCAC 705 2117-2137
AV04892.um CAGGAGAUCUCUGAAGUGAAA 190 UUUCACUUCAGAGAUCUCCUG 706 2140-2160
AV04893.um CGAGAUCUCUGAAGUGAAGAA 191 UUCUUCACUUCAGAGAUCUCG 707 2142-2162
AV04894.um CACAGUGAUCGUCAUCACCUA 192 UAGGUGAUGACGAUCACUGUG 708 2289-2309
AV04895.um GGUGAUCGUCAUCACCUUGGA 193 UCCAAGGUGAUGACGAUCACC 709 2292-2312
AV04896.um GUCGUCAUCACCUUGGUGAUA 194 UAUCACCAAGGUGAUGACGAC 710 2296-2316
AV04897.um GCGUCAUCACCUUGGUGAUGA 195 UCAUCACCAAGGUGAUGACGC 711 2297-2317
AV04898.um GACCUUGGUGAUGCUGAAGAA 196 UUCUUCAGCAUCACCAAGGUC 712 2304-2324
AV04899.um GUUCAUCAUGGUGUGGUGGAA 197 UUCCACCACACCAUGAUGAAC 713 2341-2361
AV04900.um GGAAAAUCCAACCUACAAGUA 198 UACUUGUAGGUUGGAUUUUCC 714 2421-2441
AV04901.um GAAAUCCAACCUACAAGUUCA 199 UGAACUUGUAGGUUGGAUUUC 715 2423-2443
AV04902.um GAAUCCAACCUACAAGUUCUA 200 UAGAACUUGUAGGUUGGAUUC 716 2424-2444
AV04903.um GCCAACCUACAAGUUCUUUGA 201 UCAAAGAACUUGUAGGUUGGC 717 2427-2447
AV04904.um GCAACCUACAAGUUCUUUGAA 202 UUCAAAGAACUUGUAGGUUGC 718 2428-2448
AV04905.um GACCUACAAGUUCUUUGAGCA 203 UGCUCAAAGAACUUGUAGGUC 719 2430-2450
AV04906.um GCAAGUUCUUUGAGCAGAUGA 204 UCAUCUGCUCAAAGAACUUGC 720 2435-2455
AV04907.um CCCUCUGAAGUUGGACAGCAA 205 UUGCUGUCCAACUUCAGAGGG 721 2479-2499
AV04908.um GGUUGGACAGCAAAACCAUUA 206 UAAUGGUUUUGCUGUCCAACC 722 2487-2507
AV04909.um GAGCAAAACCAUUGCUUCACA 207 UGUGAAGCAAUGGUUUUGCUC 723 2494-2514
AV04910.um GAAACCAUUGCUUCACUACCA 208 UGGUAGUGAAGCAAUGGUUUC 724 2498-2518
AV04911.um GCCCAUCGGUGUCCAUUUAUA 209 UAUAAAUGGACACCGAUGGGC 725 2515-2535
AV04912.um GCAUCGGUGUCCAUUUAUAGA 210 UCUAUAAAUGGACACCGAUGC 726 2517-2537
AV04913.um GCGGUGUCCAUUUAUAGAAUA 211 UAUUCUAUAAAUGGACACCGC 727 2520-2540
AV04914.um GCGUUUUAUGAUUUACUCAUA 212 UAUGAGUAAAUCAUAAAACGC 728 2559-2579
AV04915.um GGUUUUAUGAUUUACUCAUUA 213 UAAUGAGUAAAUCAUAAAACC 729 2560-2580
AV04916.um CUUUUAUGAUUUACUCAUUAA 214 UUAAUGAGUAAAUCAUAAAAG 730 2561-2581
AV04917.um GUAUGAUUUACUCAUUAUCGA 215 UCGAUAAUGAGUAAAUCAUAC 731 2564-2584
AV04918.um GGAUUUACUCAUUAUCGCCUA 216 UAGGCGAUAAUGAGUAAAUCC 732 2567-2587
AV04919.um GUUACUCAUUAUCGCCUUUUA 217 UAAAAGGCGAUAAUGAGUAAC 733 2570-2590
AV04920.um GACUCAUUAUCGCCUUUUGAA 218 UUCAAAAGGCGAUAAUGAGUC 734 2572-2592
AV04921.um GCUCAUUAUCGCCUUUUGACA 219 UGUCAAAAGGCGAUAAUGAGC 735 2573-2593
AV04922.um GUCAUUAUCGCCUUUUGACAA 220 UUGUCAAAAGGCGAUAAUGAC 736 2574-2594
AV04923.um GUUAUCGCCUUUUGACAGCUA 221 UAGCUGUCAAAAGGCGAUAAC 737 2577-2597
AV04924.um GUUUUGACAGCUGUGCUGUAA 222 UUACAGCACAGCUGUCAAAAC 738 2585-2605
AV04925.um GUUUGACAGCUGUGCUGUAAA 223 UUUACAGCACAGCUGUCAAAC 739 2586-2606
AV04926.um CUGCUGUAACACAAGUAGAUA 224 UAUCUACUUGUGUUACAGCAG 740 2597-2617
AV04927.um GGCUGUAACACAAGUAGAUGA 225 UCAUCUACUUGUGUUACAGCC 741 2598-2618
AV04928.um CCUGUAACACAAGUAGAUGCA 226 UGCAUCUACUUGUGUUACAGG 742 2599-2619
AV04929.um GGUAACACAAGUAGAUGCCUA 227 UAGGCAUCUACUUGUGUUACC 743 2601-2621
AV04930.um GACACAAGUAGAUGCCUGAAA 228 UUUCAGGCAUCUACUUGUGUC 744 2604-2624
AV04931.um GCACAAGUAGAUGCCUGAACA 229 UGUUCAGGCAUCUACUUGUGC 745 2605-2625
AV04932.um GUGCCUGAACUUGAAUUAAUA 230 UAUUAAUUCAAGUUCAGGCAC 746 2615-2635
AV04933.um GGCCUGAACUUGAAUUAAUCA 231 UGAUUAAUUCAAGUUCAGGCC 747 2616-2636
AV04934.um CCCUGAACUUGAAUUAAUCCA 232 UGGAUUAAUUCAAGUUCAGGG 748 2617-2637
AV04935.um GCUGAACUUGAAUUAAUCCAA 233 UUGGAUUAAUUCAAGUUCAGC 749 2618-2638
AV04936.um GCACAUCAGUAAUGUAUUCUA 234 UAGAAUACAUUACUGAUGUGC 750 2637-2657
AV04937.um GAUCUCUCUUUACAUUUUGGA 235 UCCAAAAUGUAAAGAGAGAUC 751 2656-2676
AV04938.um GUCUCUCUUUACAUUUUGGUA 236 UACCAAAAUGUAAAGAGAGAC 752 2657-2677
AV04939.um GCUCUCUUUACAUUUUGGUCA 237 UGACCAAAAUGUAAAGAGAGC 753 2658-2678
AV04940.um GUCUCUUUACAUUUUGGUCUA 238 UAGACCAAAAUGUAAAGAGAC 754 2659-2679
AV04941.um GCUUUACAUUUUGGUCUCUAA 239 UUAGAGACCAAAAUGUAAAGC 755 2662-2682
AV04942.um GAUUAAUGGGUUUUGUGUACA 240 UGUACACAAAACCCAUUAAUC 756 2690-2710
AV04943.um GUUAAUGGGUUUUGUGUACUA 241 UAGUACACAAAACCCAUUAAC 757 2691-2711
AV04944.um GUGGGUUUUGUGUACUGUAAA 242 UUUACAGUACACAAAACCCAC 758 2695-2715
AV04945.um CGGUUUUGUGUACUGUAAAGA 243 UCUUUACAGUACACAAAACCG 759 2697-2717
AV04946.um CUUUUGUGUACUGUAAAGAAA 244 UUUCUUUACAGUACACAAAAG 760 2699-2719
AV04947.um GUUUGUGUACUGUAAAGAAUA 245 UAUUCUUUACAGUACACAAAC 761 2700-2720
AV04948.um GUUGUGUACUGUAAAGAAUUA 246 UAAUUCUUUACAGUACACAAC 762 2701-2721
AV04949.um GGUACUGUAAAGAAUUUAGCA 247 UGCUAAAUUCUUUACAGUACC 763 2705-2725
AV04950.um GCUGUAAAGAAUUUAGCUGUA 248 UACAGCUAAAUUCUUUACAGC 764 2708-2728
AV04951.um GUGUAAAGAAUUUAGCUGUAA 249 UUACAGCUAAAUUCUUUACAC 765 2709-2729
AV04952.um GAAGAAUUUAGCUGUAUCAAA 250 UUUGAUACAGCUAAAUUCUUC 766 2713-2733
AV04953.um GUUUAGCUGUAUCAAACUAGA 251 UCUAGUUUGAUACAGCUAAAC 767 2718-2738
AV04954.um GAGCUGUAUCAAACUAGUGCA 252 UGCACUAGUUUGAUACAGCUC 768 2721-2741
AV04955.um GUGUAUCAAACUAGUGCAUGA 253 UCAUGCACUAGUUUGAUACAC 769 2724-2744
AV04956.um GGUAUCAAACUAGUGCAUGAA 254 UUCAUGCACUAGUUUGAUACC 770 2725-2745
AV04957.um CUAUCAAACUAGUGCAUGAAA 255 UUUCAUGCACUAGUUUGAUAG 771 2726-2746
AV04958.um GAAACUAGUGCAUGAAUAGAA 256 UUCUAUUCAUGCACUAGUUUC 772 2730-2750
AV04959.um GUAGUGCAUGAAUAGAUUCUA 257 UAGAAUCUAUUCAUGCACUAC 773 2734-2754
AV04960.um GAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 258 UGAGAAUCUAUUCAUGCACUC 774 2735-2755
AV04961.um CCAUGAAUAGAUUCUCUCCUA 259 UAGGAGAGAAUCUAUUCAUGG 775 2739-2759
AV04962.um CAUUCUCUCCUGAUUAUUUAA 260 UUAAAUAAUCAGGAGAGAAUG 776 2748-2768
AV04963.um GCUCUCCUGAUUAUUUAUCAA 261 UUGAUAAAUAAUCAGGAGAGC 777 2751-2771
AV04964.um GCUCCUGAUUAUUUAUCACAA 262 UUGUGAUAAAUAAUCAGGAGC 778 2753-2773
AV04965.um GUCCUGAUUAUUUAUCACAUA 263 UAUGUGAUAAAUAAUCAGGAC 779 2754-2774
AV04966.um GCCUGAUUAUUUAUCACAUAA 264 UUAUGUGAUAAAUAAUCAGGC 780 2755-2775
AV04967.um GCUGAUUAUUUAUCACAUAGA 265 UCUAUGUGAUAAAUAAUCAGC 781 2756-2776
AV04968.um GUAGCCAGUUGUAUAUUAUUA 266 UAAUAAUAUACAACUGGCUAC 782 2780-2800
AV00622-19-1.um ACCCUGAACUGCAGAUCAA 267 UUGAUCUGCAGUUCAGGGU 783 380-398
AV00623-19-1.um GAACUGCAGAUCACCAAUA 268 UAUUGGUGAUCUGCAGUUC 784 385-403
AV00624-19-1.um GAUCACCAAUGUGGUAGAA 269 UUCUACCACAUUGGUGAUC 785 393-411
AV00625-19-1.um UCCCCACUUUGUGAUUCCA 270 UGGAAUCACAAAGUGGGGA 786 474-492
AV00626-19-1.um CUUAGUUGGUGAGUUUGUA 271 UACAAACUCACCAACUAAG 787 501-519
AV00627-19-1.um UCCUGACAAGUGCAAAUUA 272 UAAUUUGCACUUGUCAGGA 788 537-555
AV00628-19-1.um CCUGACAAGUGCAAAUUCA 273 UGAAUUUGCACUUGUCAGG 789 538-556
AV00629-19-1.um CUGACAAGUGCAAAUUCUA 274 UAGAAUUUGCACUUGUCAG 790 539-557
AV00630-19-1.um GACAAGUGCAAAUUCUUAA 275 UUAAGAAUUUGCACUUGUC 791 541-559
AV00631-19-1.um AAGUGCAAAUUCUUACACA 276 UGUGUAAGAAUUUGCACUU 792 544-562
AV00632-19-1.um AGGAGAGGAUGGAUGUUUA 277 UAAACAUCCAUCCUCUCCU 793 563-581
AV00633-19-1.um UCCGAGGGGUAGAGUUUGA 278 UCAAACUCUACCCCUCGGA 794 686-704
AV00634-19-1.um AAAGUGACAAUGUGGAUUA 279 UAAUCCACAUUGUCACUUU 795 725-743
AV00635-19-1.um AAGUGACAAUGUGGAUUCA 280 UGAAUCCACAUUGUCACUU 796 726-744
AV00636-19-1.um AGUGACAAUGUGGAUUCUA 281 UAGAAUCCACAUUGUCACU 797 727-745
AV00637-19-1.um GAGUGAAGACAAAGUAGUA 282 UACUACUUUGUCUUCACUC 798 810-828
AV00638-19-1.um AGUGAAGACAAAGUAGUAA 283 UUACUACUUUGUCUUCACU 799 811-829
AV00639-19-1.um GUGAAGACAAAGUAGUAGA 284 UCUACUACUUUGUCUUCAC 800 812-830
AV00640-19-1.um UGAAGACAAAGUAGUAGAA 285 UUCUACUACUUUGUCUUCA 801 813-831
AV00641-19-1.um GAAGACAAAGUAGUAGAAA 286 UUUCUACUACUUUGUCUUC 802 814-832
AV00642-19-1.um AAGACAAAGUAGUAGAAGA 287 UCUUCUACUACUUUGUCUU 803 815-833
AV00643-19-1.um AGACAAAGUAGUAGAAGUA 288 UACUUCUACUACUUUGUCU 804 816-834
AV00644-19-1.um CAAAGUAGUAGAAGUAGCA 289 UGCUACUUCUACUACUUUG 805 819-837
AV00645-19-1.um AGAAGCCGAUGAUGACGAA 290 UUCGUCAUCAUCGGCUUCU 806 870-888
AV00646-19-1.um UGAUGCCGUUGACAAGUAA 291 UUACUUGUCAACGGCAUCA 807 1266-1284
AV00647-19-1.um CCCAGGUCAUGAGAGAAUA 292 UAUUCUCUCAUGACCUGGG 808 1370-1388
AV00648-19-1.um AGCAAAGAACUUGCCUAAA 293 UUUAGGCAAGUUCUUUGCU 809 1407-1425
AV00649-19-1.um GCAAAGAACUUGCCUAAAA 294 UUUUAGGCAAGUUCUUUGC 810 1408-1426
AV00650-19-1.um CAAAGAACUUGCCUAAAGA 295 UCUUUAGGCAAGUUCUUUG 811 1409-1427
AV00651-19-1.um UGCCUAAAGCUGAUAAGAA 296 UUCUUAUCAGCUUUAGGCA 812 1418-1436
AV00652-19-1.um GCCUAAAGCUGAUAAGAAA 297 UUUCUUAUCAGCUUUAGGC 813 1419-1437
AV00653-19-1.um UGAUAAGAAGGCAGUUAUA 298 UAUAACUGCCUUCUUAUCA 814 1428-1446
AV00654-19-1.um GAUAAGAAGGCAGUUAUCA 299 UGAUAACUGCCUUCUUAUC 815 1429-1447
AV00655-19-1.um AUAAGAAGGCAGUUAUCCA 300 UGGAUAACUGCCUUCUUAU 816 1430-1448
AV00656-19-1.um AGGCAGUUAUCCAGCAUUA 301 UAAUGCUGGAUAACUGCCU 817 1436-1454
AV00657-19-1.um GGAGAAAGUGGAAUCUUUA 302 UAAAGAUUCCACUUUCUCC 818 1458-1476
AV00658-19-1.um AGAAAGUGGAAUCUUUGGA 303 UCCAAAGAUUCCACUUUCU 819 1460-1478
AV00659-19-1.um AAGUGGAAUCUUUGGAACA 304 UGUUCCAAAGAUUCCACUU 820 1463-1481
AV00660-19-1.um AGUGGAAUCUUUGGAACAA 305 UUGUUCCAAAGAUUCCACU 821 1464-1482
AV00661-19-1.um GGAAUCUUUGGAACAGGAA 306 UUCCUGUUCCAAAGAUUCC 822 1467-1485
AV00662-19-1.um GUGGAAGCCAUGCUCAAUA 307 UAUUGAGCAUGGCUUCCAC 823 1531-1549
AV00663-19-1.um CUCGUCACGUGUUCAAUAA 308 UUAUUGAACACGUGACGAG 824 1610-1628
AV00664-19-1.um UCGUCACGUGUUCAAUAUA 309 UAUAUUGAACACGUGACGA 825 1611-1629
AV00665-19-1.um GUCACGUGUUCAAUAUGCA 310 UGCAUAUUGAACACGUGAC 826 1613-1631
AV00666-19-1.um UCACGUGUUCAAUAUGCUA 311 UAGCAUAUUGAACACGUGA 827 1614-1632
AV00667-19-1.um AAAGCAUUUCGAGCAUGUA 312 UACAUGCUCGAAAUGCUUU 828 1677-1695
AV00668-19-1.um ACACCUCCGUGUGAUUUAA 313 UUAAAUCACACGGAGGUGU 829 1746-1764
AV00669-19-1.um AGAUUCAGGAUGAAGUUGA 314 UCAACUUCAUCCUGAAUCU 830 1820-1838
AV00670-19-1.um GAUUCAGGAUGAAGUUGAA 315 UUCAACUUCAUCCUGAAUC 831 1821-1839
AV00671-19-1.um AUUCAGGAUGAAGUUGAUA 316 UAUCAACUUCAUCCUGAAU 832 1822-1840
AV00672-19-1.um UUCAGGAUGAAGUUGAUGA 317 UCAUCAACUUCAUCCUGAA 833 1823-1841
AV00673-19-1.um UCAGGAUGAAGUUGAUGAA 318 UUCAUCAACUUCAUCCUGA 834 1824-1842
AV00674-19-1.um UUGAUGAGCUGCUUCAGAA 319 UUCUGAAGCAGCUCAUCAA 835 1835-1853
AV00675-19-1.um AGCAAAACUAUUCAGAUGA 320 UCAUCUGAAUAGUUUUGCU 836 1856-1874
AV00676-19-1.um CAAAACUAUUCAGAUGACA 321 UGUCAUCUGAAUAGUUUUG 837 1858-1876
AV00677-19-1.um CUAUUCAGAUGACGUCUUA 322 UAAGACGUCAUCUGAAUAG 838 1863-1881
AV00678-19-1.um CUUGGCCAACAUGAUUAGA 323 UCUAAUCAUGUUGGCCAAG 839 1878-1896
AV00679-19-1.um UUGGCCAACAUGAUUAGUA 324 UACUAAUCAUGUUGGCCAA 840 1879-1897
AV00680-19-1.um UGGCCAACAUGAUUAGUGA 325 UCACUAAUCAUGUUGGCCA 841 1880-1898
AV00681-19-1.um CAUGAUUAGUGAACCAAGA 326 UCUUGGUUCACUAAUCAUG 842 1887-1905
AV00682-19-1.um GUGAACCAAGGAUCAGUUA 327 UAACUGAUCCUUGGUUCAC 843 1895-1913
AV00683-19-1.um GAACCAAGGAUCAGUUACA 328 UGUAACUGAUCCUUGGUUC 844 1897-1915
AV00684-19-1.um CAAGGAUCAGUUACGGAAA 329 UUUCCGUAACUGAUCCUUG 845 1901-1919
AV00685-19-1.um AAGGAUCAGUUACGGAAAA 330 UUUUCCGUAACUGAUCCUU 846 1902-1920
AV00686-19-1.um UCUUUGACCGAAACGAAAA 331 UUUUCGUUUCGGUCAAAGA 847 1936-1954
AV00687-19-1.um CUUUGACCGAAACGAAAAA 332 UUUUUCGUUUCGGUCAAAG 848 1937-1955
AV00688-19-1.um AGCCAACACAGAAAACGAA 333 UUCGUUUUCUGUGUUGGCU 849 2040-2058
AV00689-19-1.um GCCAACACAGAAAACGAAA 334 UUUCGUUUUCUGUGUUGGC 850 2041-2059
AV00690-19-1.um GGUUCUGGGUUGACAAAUA 335 UAUUUGUCAACCCAGAACC 851 2113-2131
AV00691-19-1.um CUGGGUUGACAAAUAUCAA 336 UUGAUAUUUGUCAACCCAG 852 2117-2135
AV00692-19-1.um GAGGAGAUCUCUGAAGUGA 337 UCACUUCAGAGAUCUCCUC 853 2140-2158
AV00693-19-1.um AGGAGAUCUCUGAAGUGAA 338 UUCACUUCAGAGAUCUCCU 854 2141-2159
AV00694-19-1.um CACCUUGGUGAUGCUGAAA 339 UUUCAGCAUCACCAAGGUG 855 2304-2322
AV00695-19-1.um AUCCAUUCAUCAUGGUGUA 340 UACACCAUGAUGAAUGGAU 856 2337-2355
AV00696-19-1.um AAAUCCAACCUACAAGUUA 341 UAACUUGUAGGUUGGAUUU 857 2424-2442
AV00697-19-1.um GUUCUUUGAGCAGAUGCAA 342 UUGCAUCUGCUCAAAGAAC 858 2439-2457
AV00698-19-1.um UGAGCAGAUGCAGAACUAA 343 UUAGUUCUGCAUCUGCUCA 859 2445-2463
AV00699-19-1.um ACAGCAGCCUCUGAAGUUA 344 UAACUUCAGAGGCUGCUGU 860 2473-2491
AV00700-19-1.um AGCAGCCUCUGAAGUUGGA 345 UCCAACUUCAGAGGCUGCU 861 2475-2493
AV00701-19-1.um UGGACAGCAAAACCAUUGA 346 UCAAUGGUUUUGCUGUCCA 862 2490-2508
AV00702-19-1.um CAGCAAAACCAUUGCUUCA 347 UGAAGCAAUGGUUUUGCUG 863 2494-2512
AV00703-19-1.um CAAAACCAUUGCUUCACUA 348 UAGUGAAGCAAUGGUUUUG 864 2497-2515
AV00704-19-1.um UCGGUGUCCAUUUAUAGAA 349 UUCUAUAAAUGGACACCGA 865 2520-2538
AV00705-19-1.um GUGUCCAUUUAUAGAAUAA 350 UUAUUCUAUAAAUGGACAC 866 2523-2541
AV00706-19-1.um UUAUGAUUUACUCAUUAUA 351 UAUAAUGAGUAAAUCAUAA 867 2564-2582
AV00707-19-1.um ACUCAUUAUCGCCUUUUGA 352 UCAAAAGGCGAUAAUGAGU 868 2573-2591
AV00708-19-1.um UGACAGCUGUGCUGUAACA 353 UGUUACAGCACAGCUGUCA 869 2589-2607
AV00709-19-1.um CAGCUGUGCUGUAACACAA 354 UUGUGUUACAGCACAGCUG 870 2592-2610
AV00710-19-1.um UGUGCUGUAACACAAGUAA 355 UUACUUGUGUUACAGCACA 871 2596-2614
AV00711-19-1.um AGUAGAUGCCUGAACUUGA 356 UCAAGUUCAGGCAUCUACU 872 2610-2628
AV00712-19-1.um UGCCUGAACUUGAAUUAAA 357 UUUAAUUCAAGUUCAGGCA 873 2616-2634
AV00713-19-1.um CUACAUUAUUAAUGGGUUA 358 UAACCCAUUAAUAAUGUAG 874 2684-2702
AV00714-19-1.um AUUAUUAAUGGGUUUUGUA 359 UACAAAACCCAUUAAUAAU 875 2688-2706
AV00715-19-1.um UAAAGAAUUUAGCUGUAUA 360 UAUACAGCUAAAUUCUUUA 876 2712-2730
AV00716-19-1.um AAAGAAUUUAGCUGUAUCA 361 UGAUACAGCUAAAUUCUUU 877 2713-2731
AV00717-19-1.um AAGAAUUUAGCUGUAUCAA 362 UUGAUACAGCUAAAUUCUU 878 2714-2732
AV00718-19-1.um GAAUUUAGCUGUAUCAAAA 363 UUUUGAUACAGCUAAAUUC 879 2716-2734
AV00719-19-1.um AAUUUAGCUGUAUCAAACA 364 UGUUUGAUACAGCUAAAUU 880 2717-2735
AV00720-19-1.um AUUUAGCUGUAUCAAACUA 365 UAGUUUGAUACAGCUAAAU 881 2718-2736
AV00721-19-1.um AGCUGUAUCAAACUAGUGA 366 UCACUAGUUUGAUACAGCU 882 2722-2740
AV00722-19-1.um ACUAGUGCAUGAAUAGAUA 367 UAUCUAUUCAUGCACUAGU 883 2733-2751
AV00723-19-1.um CUAGUGCAUGAAUAGAUUA 368 UAAUCUAUUCAUGCACUAG 884 2734-2752
AV00724-19-1.um UAGUGCAUGAAUAGAUUCA 369 UGAAUCUAUUCAUGCACUA 885 2735-2753
AV00725-19-1.um GCAUGAAUAGAUUCUCUCA 370 UGAGAGAAUCUAUUCAUGC 886 2739-2757
AV00726-19-1.um AAUAGAUUCUCUCCUGAUA 371 UAUCAGGAGAGAAUCUAUU 887 2744-2762
AV00727-19-1.um UAGAUUCUCUCCUGAUUAA 372 UUAAUCAGGAGAGAAUCUA 888 2746-2764
AV00728-19-1.um AGAUUCUCUCCUGAUUAUA 373 UAUAAUCAGGAGAGAAUCU 889 2747-2765
AV00729-19-1.um GAUUCUCUCCUGAUUAUUA 374 UAAUAAUCAGGAGAGAAUC 890 2748-2766
AV00730-19-1.um CUCUCCUGAUUAUUUAUCA 375 UGAUAAAUAAUCAGGAGAG 891 2752-2770
AV00731-19-1.um CCAGUUGUAUAUUAUUCUA 376 UAGAAUAAUAUACAACUGG 892 2784-2802
AV00799-19-1.um GCCAUGUCCCAAAGUUUAU 377 AUAAACUUUGGGACAUGGC 893 1180-1198
AV00800-19-1.um GCCCGAGAUCCUGUUAAAU 378 AUUUAACAGGAUCUCGGGC 894 1222-1240
AV00801-19-1.um UCCCGUGAAUGGAGAGUUU 379 AAACUCUCCAUUCACGGGA 895 1971-1989
AV00802-19-1.um GGAUAUGAAGUUCAUCAUU 380 AAUGAUGAACUUCAUAUCC 896 2188-2206
AV00803-19-1.um GUACACAUCCAUUCAUCAU 381 AUGAUGAAUGGAUGUGUAC 897 2331-2349
AV04826-19-1.um AGUCUACCCUGAACUGCAA 382 UUGCAGUUCAGGGUAGACU 898 375-393
AV04827-19-1.um AACUGCAGAUCACCAAUGA 383 UCAUUGGUGAUCUGCAGUU 899 386-404
AV04828-19-1.um ACUGCAGAUCACCAAUGUA 384 UACAUUGGUGAUCUGCAGU 900 387-405
AV04829-19-1.um AGAUCACCAAUGUGGUAGA 385 UCUACCACAUUGGUGAUCU 901 392-410
AV04830-19-1.um AUCACCAAUGUGGUAGAAA 386 UUUCUACCACAUUGGUGAU 902 394-412
AV04831-19-1.um UCACCAAUGUGGUAGAAGA 387 UCUUCUACCACAUUGGUGA 903 395-413
AV04832-19-1.um AUCCAGAACUGGUGCAAGA 388 UCUUGCACCAGUUCUGGAU 904 430-448
AV04833-19-1.um GCUUAGUUGGUGAGUUUGA 389 UCAAACUCACCAACUAAGC 905 500-518
AV04834-19-1.um UAGUUGGUGAGUUUGUAAA 390 UUUACAAACUCACCAACUA 906 503-521
AV04835-19-1.um GUGAUGCCCUUCUCGUUCA 391 UGAACGAGAAGGGCAUCAC 907 521-539
AV04836-19-1.um UGAUGCCCUUCUCGUUCCA 392 UGGAACGAGAAGGGCAUCA 908 522-540
AV04837-19-1.um ACAAGUGCAAAUUCUUACA 393 UGUAAGAAUUUGCACUUGU 909 542-560
AV04838-19-1.um CAAGUGCAAAUUCUUACAA 394 UUGUAAGAAUUUGCACUUG 910 543-561
AV04839-19-1.um AGUGCAAAUUCUUACACCA 395 UGGUGUAAGAAUUUGCACU 911 545-563
AV04840-19-1.um GUGCAAAUUCUUACACCAA 396 UUGGUGUAAGAAUUUGCAC 912 546-564
AV04841-19-1.um GUACCAACUUGCAUGACUA 397 UAGUCAUGCAAGUUGGUAC 913 635-653
AV04842-19-1.um UACCAACUUGCAUGACUAA 398 UUAGUCAUGCAAGUUGGUA 914 636-654
AV04843-19-1.um ACCAACUUGCAUGACUACA 399 UGUAGUCAUGCAAGUUGGU 915 637-655
AV04844-19-1.um GCAUGACUACGGCAUGUUA 400 UAACAUGCCGUAGUCAUGC 916 645-663
AV04845-19-1.um GAGUUUGUGUGUUGCCCAA 401 UUGGGCAACACACAAACUC 917 697-715
AV04846-19-1.um AAGAAAGUGACAAUGUGGA 402 UCCACAUUGUCACUUUCUU 918 722-740
AV04847-19-1.um AGAAAGUGACAAUGUGGAA 403 UUCCACAUUGUCACUUUCU 919 723-741
AV04848-19-1.um GUGACAAUGUGGAUUCUGA 404 UCAGAAUCCACAUUGUCAC 920 728-746
AV04849-19-1.um GACAAUGUGGAUUCUGCUA 405 UAGCAGAAUCCACAUUGUC 921 730-748
AV04850-19-1.um AUGGGAGUGAAGACAAAGA 406 UCUUUGUCUUCACUCCCAU 922 806-824
AV04851-19-1.um UGGGAGUGAAGACAAAGUA 407 UACUUUGUCUUCACUCCCA 923 807-825
AV04852-19-1.um AGCCGAUGAUGACGAGGAA 408 UUCCUCGUCAUCAUCGGCU 924 873-891
AV04853-19-1.um GGAUGGUGAUGAGGUAGAA 409 UUCUACCUCAUCACCAUCC 925 897-915
AV04854-19-1.um UGGAAGAGGUGGUUCGAGA 410 UCUCGAACCACCUCUUCCA 926 998-1016
AV04855-19-1.um CCAUUUCCAGAAAGCCAAA 411 UUUGGCUUUCUGGAAAUGG 927 1317-1335
AV04856-19-1.um UCAUGAGAGAAUGGGAAGA 412 UCUUCCCAUUCUCUCAUGA 928 1376-1394
AV04857-19-1.um AAAGAACUUGCCUAAAGCA 413 UGCUUUAGGCAAGUUCUUU 929 1410-1428
AV04858-19-1.um GAACUUGCCUAAAGCUGAA 414 UUCAGCUUUAGGCAAGUUC 930 1413-1431
AV04859-19-1.um UUGCCUAAAGCUGAUAAGA 415 UCUUAUCAGCUUUAGGCAA 931 1417-1435
AV04860-19-1.um AGCUGAUAAGAAGGCAGUA 416 UACUGCCUUCUUAUCAGCU 932 1425-1443
AV04861-19-1.um GCUGAUAAGAAGGCAGUUA 417 UAACUGCCUUCUUAUCAGC 933 1426-1444
AV04862-19-1.um CUGAUAAGAAGGCAGUUAA 418 UUAACUGCCUUCUUAUCAG 934 1427-1445
AV04863-19-1.um GAAGGCAGUUAUCCAGCAA 419 UUGCUGGAUAACUGCCUUC 935 1434-1452
AV04864-19-1.um GAGAAAGUGGAAUCUUUGA 420 UCAAAGAUUCCACUUUCUC 936 1459-1477
AV04865-19-1.um GAAAGUGGAAUCUUUGGAA 421 UUCCAAAGAUUCCACUUUC 937 1461-1479
AV04866-19-1.um AAAGUGGAAUCUUUGGAAA 422 UUUCCAAAGAUUCCACUUU 938 1462-1480
AV04867-19-1.um AUGAGCGCAUGAAUCAGUA 423 UACUGAUUCAUGCGCUCAU 939 1763-1781
AV04868-19-1.um CUCUCUCCCUGCUCUACAA 424 UUGUAGAGCAGGGAGAGAG 940 1781-1799
AV04869-19-1.um GGAGAUUCAGGAUGAAGUA 425 UACUUCAUCCUGAAUCUCC 941 1818-1836
AV04870-19-1.um GGAUGAAGUUGAUGAGCUA 426 UAGCUCAUCAACUUCAUCC 942 1827-1845
AV04871-19-1.um CUGCUUCAGAAAGAGCAAA 427 UUUGCUCUUUCUGAAGCAG 943 1843-1861
AV04872-19-1.um GAAAGAGCAAAACUAUUCA 428 UGAAUAGUUUUGCUCUUUC 944 1851-1869
AV04873-19-1.um AGAGCAAAACUAUUCAGAA 429 UUCUGAAUAGUUUUGCUCU 945 1854-1872
AV04874-19-1.um GAGCAAAACUAUUCAGAUA 430 UAUCUGAAUAGUUUUGCUC 946 1855-1873
AV04875-19-1.um AUGACGUCUUGGCCAACAA 431 UUGUUGGCCAAGACGUCAU 947 1871-1889
AV04876-19-1.um GGCCAACAUGAUUAGUGAA 432 UUCACUAAUCAUGUUGGCC 948 1881-1899
AV04877-19-1.um CCAACAUGAUUAGUGAACA 433 UGUUCACUAAUCAUGUUGG 949 1883-1901
AV04878-19-1.um CAACAUGAUUAGUGAACCA 434 UGGUUCACUAAUCAUGUUG 950 1884-1902
AV04879-19-1.um AGUGAACCAAGGAUCAGUA 435 UACUGAUCCUUGGUUCACU 951 1894-1912
AV04880-19-1.um UGAACCAAGGAUCAGUUAA 436 UUAACUGAUCCUUGGUUCA 952 1896-1914
AV04881-19-1.um AACCAAGGAUCAGUUACGA 437 UCGUAACUGAUCCUUGGUU 953 1898-1916
AV04882-19-1.um AGGAUCAGUUACGGAAACA 438 UGUUUCCGUAACUGAUCCU 954 1903-1921
AV04883-19-1.um GGAUCAGUUACGGAAACGA 439 UCGUUUCCGUAACUGAUCC 955 1904-1922
AV04884-19-1.um AUCAGUUACGGAAACGAUA 440 UAUCGUUUCCGUAACUGAU 956 1906-1924
AV04885-19-1.um AUCUUUGACCGAAACGAAA 441 UUUCGUUUCGGUCAAAGAU 957 1935-1953
AV04886-19-1.um UUUGACCGAAACGAAAACA 442 UGUUUUCGUUUCGGUCAAA 958 1938-1956
AV04887-19-1.um AGUUCAGCCUGGACGAUCA 443 UGAUCGUCCAGGCUGAACU 959 1985-2003
AV04888-19-1.um CCAACACAGAAAACGAAGA 444 UCUUCGUUUUCUGUGUUGG 960 2042-2060
AV04889-19-1.um GUUCUGGGUUGACAAAUAA 445 UUAUUUGUCAACCCAGAAC 961 2114-2132
AV04890-19-1.um UGGGUUGACAAAUAUCAAA 446 UUUGAUAUUUGUCAACCCA 962 2118-2136
AV04891-19-1.um GGGUUGACAAAUAUCAAGA 447 UCUUGAUAUUUGUCAACCC 963 2119-2137
AV04892-19-1.um GGAGAUCUCUGAAGUGAAA 448 UUUCACUUCAGAGAUCUCC 964 2142-2160
AV04893-19-1.um AGAUCUCUGAAGUGAAGAA 449 UUCUUCACUUCAGAGAUCU 965 2144-2162
AV04894-19-1.um CAGUGAUCGUCAUCACCUA 450 UAGGUGAUGACGAUCACUG 966 2291-2309
AV04895-19-1.um UGAUCGUCAUCACCUUGGA 451 UCCAAGGUGAUGACGAUCA 967 2294-2312
AV04896-19-1.um CGUCAUCACCUUGGUGAUA 452 UAUCACCAAGGUGAUGACG 968 2298-2316
AV04897-19-1.um GUCAUCACCUUGGUGAUGA 453 UCAUCACCAAGGUGAUGAC 969 2299-2317
AV04898-19-1.um CCUUGGUGAUGCUGAAGAA 454 UUCUUCAGCAUCACCAAGG 970 2306-2324
AV04899-19-1.um UCAUCAUGGUGUGGUGGAA 455 UUCCACCACACCAUGAUGA 971 2343-2361
AV04900-19-1.um AAAAUCCAACCUACAAGUA 456 UACUUGUAGGUUGGAUUUU 972 2423-2441
AV04901-19-1.um AAUCCAACCUACAAGUUCA 457 UGAACUUGUAGGUUGGAUU 973 2425-2443
AV04902-19-1.um AUCCAACCUACAAGUUCUA 458 UAGAACUUGUAGGUUGGAU 974 2426-2444
AV04903-19-1.um CAACCUACAAGUUCUUUGA 459 UCAAAGAACUUGUAGGUUG 975 2429-2447
AV04904-19-1.um AACCUACAAGUUCUUUGAA 460 UUCAAAGAACUUGUAGGUU 976 2430-2448
AV04905-19-1.um CCUACAAGUUCUUUGAGCA 461 UGCUCAAAGAACUUGUAGG 977 2432-2450
AV04906-19-1.um AAGUUCUUUGAGCAGAUGA 462 UCAUCUGCUCAAAGAACUU 978 2437-2455
AV04907-19-1.um CUCUGAAGUUGGACAGCAA 463 UUGCUGUCCAACUUCAGAG 979 2481-2499
AV04908-19-1.um UUGGACAGCAAAACCAUUA 464 UAAUGGUUUUGCUGUCCAA 980 2489-2507
AV04909-19-1.um GCAAAACCAUUGCUUCACA 465 UGUGAAGCAAUGGUUUUGC 981 2496-2514
AV04910-19-1.um AACCAUUGCUUCACUACCA 466 UGGUAGUGAAGCAAUGGUU 982 2500-2518
AV04911-19-1.um CCAUCGGUGUCCAUUUAUA 467 UAUAAAUGGACACCGAUGG 983 2517-2535
AV04912-19-1.um AUCGGUGUCCAUUUAUAGA 468 UCUAUAAAUGGACACCGAU 984 2519-2537
AV04913-19-1.um GGUGUCCAUUUAUAGAAUA 469 UAUUCUAUAAAUGGACACC 985 2522-2540
AV04914-19-1.um GUUUUAUGAUUUACUCAUA 470 UAUGAGUAAAUCAUAAAAC 986 2561-2579
AV04915-19-1.um UUUUAUGAUUUACUCAUUA 471 UAAUGAGUAAAUCAUAAAA 987 2562-2580
AV04916-19-1.um UUUAUGAUUUACUCAUUAA 472 UUAAUGAGUAAAUCAUAAA 988 2563-2581
AV04917-19-1.um AUGAUUUACUCAUUAUCGA 473 UCGAUAAUGAGUAAAUCAU 989 2566-2584
AV04918-19-1.um AUUUACUCAUUAUCGCCUA 474 UAGGCGAUAAUGAGUAAAU 990 2569-2587
AV04919-19-1.um UACUCAUUAUCGCCUUUUA 475 UAAAAGGCGAUAAUGAGUA 991 2572-2590
AV04920-19-1.um CUCAUUAUCGCCUUUUGAA 476 UUCAAAAGGCGAUAAUGAG 992 2574-2592
AV04921-19-1.um UCAUUAUCGCCUUUUGACA 477 UGUCAAAAGGCGAUAAUGA 993 2575-2593
AV04922-19-1.um CAUUAUCGCCUUUUGACAA 478 UUGUCAAAAGGCGAUAAUG 994 2576-2594
AV04923-19-1.um UAUCGCCUUUUGACAGCUA 479 UAGCUGUCAAAAGGCGAUA 995 2579-2597
AV04924-19-1.um UUUGACAGCUGUGCUGUAA 480 UUACAGCACAGCUGUCAAA 996 2587-2605
AV04925-19-1.um UUGACAGCUGUGCUGUAAA 481 UUUACAGCACAGCUGUCAA 997 2588-2606
AV04926-19-1.um GCUGUAACACAAGUAGAUA 482 UAUCUACUUGUGUUACAGC 998 2599-2617
AV04927-19-1.um CUGUAACACAAGUAGAUGA 483 UCAUCUACUUGUGUUACAG 999 2600-2618
AV04928-19-1.um UGUAACACAAGUAGAUGCA 484 UGCAUCUACUUGUGUUACA 1000 2601-2619
AV04929-19-1.um UAACACAAGUAGAUGCCUA 485 UAGGCAUCUACUUGUGUUA 1001 2603-2621
AV04930-19-1.um CACAAGUAGAUGCCUGAAA 486 UUUCAGGCAUCUACUUGUG 1002 2606-2624
AV04931-19-1.um ACAAGUAGAUGCCUGAACA 487 UGUUCAGGCAUCUACUUGU 1003 2607-2625
AV04932-19-1.um GCCUGAACUUGAAUUAAUA 488 UAUUAAUUCAAGUUCAGGC 1004 2617-2635
AV04933-19-1.um CCUGAACUUGAAUUAAUCA 489 UGAUUAAUUCAAGUUCAGG 1005 2618-2636
AV04934-19-1.um CUGAACUUGAAUUAAUCCA 490 UGGAUUAAUUCAAGUUCAG 1006 2619-2637
AV04935-19-1.um UGAACUUGAAUUAAUCCAA 491 UUGGAUUAAUUCAAGUUCA 1007 2620-2638
AV04936-19-1.um ACAUCAGUAAUGUAUUCUA 492 UAGAAUACAUUACUGAUGU 1008 2639-2657
AV04937-19-1.um UCUCUCUUUACAUUUUGGA 493 UCCAAAAUGUAAAGAGAGA 1009 2658-2676
AV04938-19-1.um CUCUCUUUACAUUUUGGUA 494 UACCAAAAUGUAAAGAGAG 1010 2659-2677
AV04939-19-1.um UCUCUUUACAUUUUGGUCA 495 UGACCAAAAUGUAAAGAGA 1011 2660-2678
AV04940-19-1.um CUCUUUACAUUUUGGUCUA 496 UAGACCAAAAUGUAAAGAG 1012 2661-2679
AV04941-19-1.um UUUACAUUUUGGUCUCUAA 497 UUAGAGACCAAAAUGUAAA 1013 2664-2682
AV04942-19-1.um UUAAUGGGUUUUGUGUACA 498 UGUACACAAAACCCAUUAA 1014 2692-2710
AV04943-19-1.um UAAUGGGUUUUGUGUACUA 499 UAGUACACAAAACCCAUUA 1015 2693-2711
AV04944-19-1.um GGGUUUUGUGUACUGUAAA 500 UUUACAGUACACAAAACCC 1016 2697-2715
AV04945-19-1.um GUUUUGUGUACUGUAAAGA 501 UCUUUACAGUACACAAAAC 1017 2699-2717
AV04946-19-1.um UUUGUGUACUGUAAAGAAA 502 UUUCUUUACAGUACACAAA 1018 2701-2719
AV04947-19-1.um UUGUGUACUGUAAAGAAUA 503 UAUUCUUUACAGUACACAA 1019 2702-2720
AV04948-19-1.um UGUGUACUGUAAAGAAUUA 504 UAAUUCUUUACAGUACACA 1020 2703-2721
AV04949-19-1.um UACUGUAAAGAAUUUAGCA 505 UGCUAAAUUCUUUACAGUA 1021 2707-2725
AV04950-19-1.um UGUAAAGAAUUUAGCUGUA 506 UACAGCUAAAUUCUUUACA 1022 2710-2728
AV04951-19-1.um GUAAAGAAUUUAGCUGUAA 507 UUACAGCUAAAUUCUUUAC 1023 2711-2729
AV04952-19-1.um AGAAUUUAGCUGUAUCAAA 508 UUUGAUACAGCUAAAUUCU 1024 2715-2733
AV04953-19-1.um UUAGCUGUAUCAAACUAGA 509 UCUAGUUUGAUACAGCUAA 1025 2720-2738
AV04954-19-1.um GCUGUAUCAAACUAGUGCA 510 UGCACUAGUUUGAUACAGC 1026 2723-2741
AV04955-19-1.um GUAUCAAACUAGUGCAUGA 511 UCAUGCACUAGUUUGAUAC 1027 2726-2744
AV04956-19-1.um UAUCAAACUAGUGCAUGAA 512 UUCAUGCACUAGUUUGAUA 1028 2727-2745
AV04957-19-1.um AUCAAACUAGUGCAUGAAA 513 UUUCAUGCACUAGUUUGAU 1029 2728-2746
AV04958-19-1.um AACUAGUGCAUGAAUAGAA 514 UUCUAUUCAUGCACUAGUU 1030 2732-2750
AV04959-19-1.um AGUGCAUGAAUAGAUUCUA 515 UAGAAUCUAUUCAUGCACU 1031 2736-2754
AV04960-19-1.um GUGCAUGAAUAGAUUCUCA 516 UGAGAAUCUAUUCAUGCAC 1032 2737-2755
AV04961-19-1.um AUGAAUAGAUUCUCUCCUA 517 UAGGAGAGAAUCUAUUCAU 1033 2741-2759
AV04962-19-1.um UUCUCUCCUGAUUAUUUAA 518 UUAAAUAAUCAGGAGAGAA 1034 2750-2768
AV04963-19-1.um UCUCCUGAUUAUUUAUCAA 519 UUGAUAAAUAAUCAGGAGA 1035 2753-2771
AV04964-19-1.um UCCUGAUUAUUUAUCACAA 520 UUGUGAUAAAUAAUCAGGA 1036 2755-2773
AV04965-19-1.um CCUGAUUAUUUAUCACAUA 521 UAUGUGAUAAAUAAUCAGG 1037 2756-2774
AV04966-19-1.um CUGAUUAUUUAUCACAUAA 522 UUAUGUGAUAAAUAAUCAG 1038 2757-2775
AV04967-19-1.um UGAUUAUUUAUCACAUAGA 523 UCUAUGUGAUAAAUAAUCA 1039 2758-2776
AV04968-19-1.um AGCCAGUUGUAUAUUAUUA 524 UAAUAAUAUACAACUGGCU 1040 2782-2800
AD00488.um GUCCUGACAAGUGCAAAUUCA 1779 UGAAUUUGCACUUGUCAGGAC 1833 536-556
AD00489.um CAAAGUGACAAUGUGGAUUCA 1780 UGAAUCCACAUUGUCACUUUG 1834 724-744
AD00490.um GGAAGACAAAGUAGUAGAAGA 1781 UCUUCUACUACUUUGUCUUCC 1835 813-833
AD00491.um GAGCAAAGAACUUGCCUAAAA 1782 UUUUAGGCAAGUUCUUUGCUC 1836 1406-1426
AD00492.um GAAGUGGAAUCUUUGGAACAA 1783 UUGUUCCAAAGAUUCCACUUC 1837 1462-1482
AD00493.um GCGUCACGUGUUCAAUAUGCA 1784 UGCAUAUUGAACACGUGACGC 1838 1611-1631
AD00494.um CAGAUUCAGGAUGAAGUUGAA 1785 UUCAACUUCAUCCUGAAUCUG 1839 1819-1839
AD00495.um GGCAAAACUAUUCAGAUGACA 1786 UGUCAUCUGAAUAGUUUUGCC 1840 1856-1876
AD00496.um GACUAUUCAGAUGACGUCUUA 1787 UAAGACGUCAUCUGAAUAGUC 1841 1861-1881
AD00497.um GUUGGCCAACAUGAUUAGUGA 1788 UCACUAAUCAUGUUGGCCAAC 1842 1878-1898
AD00498.um GCAAGGAUCAGUUACGGAAAA 1789 UUUUCCGUAACUGAUCCUUGC 1843 1900-1920
AD00499.um GUCUGGGUUGACAAAUAUCAA 1790 UUGAUAUUUGUCAACCCAGAC 1844 2115-2135
AD00500.um GUUGAGCAGAUGCAGAACUAA 1791 UUAGUUCUGCAUCUGCUCAAC 1845 2443-2463
AD00501.um GGAAUAGAUUCUCUCCUGAUA 1792 UAUCAGGAGAGAAUCUAUUCC 1846 2742-2762
AD00638.um GUGAACUGCAGAUCACCAAUA 1793 UAUUGGUGAUCUGCAGUUCAC 1847 383-403
AD00639.um GAUCCCCACUUUGUGAUUCCA 1794 UGGAAUCACAAAGUGGGGAUC 1848 472-492
AD00640.um GGCUUAGUUGGUGAGUUUGUA 1795 UACAAACUCACCAACUAAGCC 1849 499-519
AD00641.um GCCUGACAAGUGCAAAUUCUA 1796 UAGAAUUUGCACUUGUCAGGC 1850 537-557
AD00642.um GUGACAAGUGCAAAUUCUUAA 1797 UUAAGAAUUUGCACUUGUCAC 1851 539-559
AD00643.um GCAGGAGAGGAUGGAUGUUUA 1798 UAAACAUCCAUCCUCUCCUGC 1852 561-581
AD00644.um CGAGUGAAGACAAAGUAGUAA 1799 UUACUACUUUGUCUUCACUCG 1853 809-829
AD00645.um CAGUGAAGACAAAGUAGUAGA 1800 UCUACUACUUUGUCUUCACUG 1854 810-830
AD00646.um CAAGACAAAGUAGUAGAAGUA 1801 UACUUCUACUACUUUGUCUUG 1855 814-834
AD00647.um CACAAAGUAGUAGAAGUAGCA 1802 UGCUACUUCUACUACUUUGUG 1856 817-837
AD00648.um CAAGAAGCCGAUGAUGACGAA 1803 UUCGUCAUCAUCGGCUUCUUG 1857 868-888
AD00649.um GAAGCAAAGAACUUGCCUAAA 1804 UUUAGGCAAGUUCUUUGCUUC 1858 1405-1425
AD00650.um GGCAAAGAACUUGCCUAAAGA 1805 UCUUUAGGCAAGUUCUUUGCC 1859 1407-1427
AD00651.um CAAGGCAGUUAUCCAGCAUUA 1806 UAAUGCUGGAUAACUGCCUUG 1860 1434-1454
AD01990.um GUACCCUGAACUGCAGAUCAA 1807 UUGAUCUGCAGUUCAGGGUAC 1861 378-398
AD01991.um GAGAUCACCAAUGUGGUAGAA 1808 UUCUACCACAUUGGUGAUCUC 1862 391-411
AD01992.um CUUCCUGACAAGUGCAAAUUA 1809 UAAUUUGCACUUGUCAGGAAG 1863 535-555
AD01993.um GCAAGUGCAAAUUCUUACACA 1810 UGUGUAAGAAUUUGCACUUGC 1864 542-562
AD01994.um GGAAAGUGACAAUGUGGAUUA 1811 UAAUCCACAUUGUCACUUUCC 1865 723-743
AD01995.um CGGAGUGAAGACAAAGUAGUA 1812 UACUACUUUGUCUUCACUCCG 1866 808-828
AD01996.um GGUGAAGACAAAGUAGUAGAA 1813 UUCUACUACUUUGUCUUCACC 1867 811-831
AD01997.um GCUGAUGCCGUUGACAAGUAA 1814 UUACUUGUCAACGGCAUCAGC 1868 1264-1284
AD01998.um GUUGCCUAAAGCUGAUAAGAA 1815 UUCUUAUCAGCUUUAGGCAAC 1869 1416-1436
AD01999.um GUGCCUAAAGCUGAUAAGAAA 1816 UUUCUUAUCAGCUUUAGGCAC 1870 1417-1437
AD02000.um CCUGAUAAGAAGGCAGUUAUA 1817 UAUAACUGCCUUCUUAUCAGG 1871 1426-1446
AD02001.um GGAUAAGAAGGCAGUUAUCCA 1818 UGGAUAACUGCCUUCUUAUCC 1872 1428-1448
AD02002.um GAGGAGAAAGUGGAAUCUUUA 1819 UAAAGAUUCCACUUUCUCCUC 1873 1456-1476
AD02003.um GUUCAGGAUGAAGUUGAUGAA 1820 UUCAUCAACUUCAUCCUGAAC 1874 1822-1842
AD02004.um GGUUGAUGAGCUGCUUCAGAA 1821 UUCUGAAGCAGCUCAUCAACC 1875 1833-1853
AD02005.um GCCAAGGAUCAGUUACGGAAA 1822 UUUCCGUAACUGAUCCUUGGC 1876 1899-1919
AD02006.um GAUCUUUGACCGAAACGAAAA 1823 UUUUCGUUUCGGUCAAAGAUC 1877 1934-1954
AD02007.um GAGGUUCUGGGUUGACAAAUA 1824 UAUUUGUCAACCCAGAACCUC 1878 2111-2131
AD02008.um GCACAGCAGCCUCUGAAGUUA 1825 UAACUUCAGAGGCUGCUGUGC 1879 2471-2491
AD02860.um CUUCCGAGGGGUAGAGUUUGA 1826 UCAAACUCUACCCCUCGGAAG 1880 684-704
AD02861.um GAAGUGACAAUGUGGAUUCUA 1827 UAGAAUCCACAUUGUCACUUC 1881 725-745
AD02862.um CUGAAGACAAAGUAGUAGAAA 1828 UUUCUACUACUUUGUCUUCAG 1882 812-832
AD02863.um CAUUCAGGAUGAAGUUGAUGA 1829 UCAUCAACUUCAUCCUGAAUG 1883 1821-1841
AD02864.um GGAGCAAAACUAUUCAGAUGA 1830 UCAUCUGAAUAGUUUUGCUCC 1884 1854-1874
AD02865.um CGAGGAGAUCUCUGAAGUGAA 1831 UUCACUUCAGAGAUCUCCUCG 1885 2139-2159
AD02866.um CAAAAUCCAACCUACAAGUUA 1832 UAACUUGUAGGUUGGAUUUUG 1886 2422-2442
表 2 顯示了本發明的某些化學修飾的 APP RNAi 劑反義鏈和有義鏈序列。在本發明的方法的一些實施例中，將具有表 2 中所示的多核苷酸序列的 RNAi 劑施用於細胞和/或受試者。在本發明的方法的一些實施例中，將具有表 2 中所示的多核苷酸序列的 RNAi 劑施用於受試者。在本發明的一些實施例中，施用於受試者的 RNAi 劑包括表 2 中第一行中標識的雙鏈體，並且包括表 2 中同一行第三列和第六列中分別顯示的有義鏈和反義鏈序列中的序列修飾。在本發明的方法的一些實施例中，表 2 中所示的序列可以附著於（本文中也稱為“結合於”）能夠將 RNAi 劑遞送至受試者的細胞和/或組織的化合物。可用於本發明某些實施例的遞送化合物的非限制性示例是含GalNAc的化合物或含(GLS-15*)的化合物。在表2中，第一列表示表1中所示的鹼基序列的雙鏈AV#。表2公開了雙鏈AV#，還顯示了雙鏈的正義和反義序列中包含的化學修飾。例如，表 1 顯示了鹼基單鏈序列 SEQ ID NO: 9 (正義) 和 SEQ ID NO: 525 (反義)，它們一起構成標識為：雙鏈 AV# AV00622.um的雙鏈體，且表 2 列出了雙鏈 AV# AV00622，這表明 SEQ ID NO: 1041 和 SEQ ID NO: 1299 的雙鏈分別包含 SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 525 的鹼基序列，但分別具有第三列和第六列中所示的正義和反義序列中所示的化學修飾。表 2 第二列中的“正義鏈 SS#”是同一行第三列中所示的正義序列 (包括修飾) 的分配標識符。表 2 第五列中的“反義鏈 AS#”是第六列中所示的反義序列 (包括修飾) 的分配標識符。
表 2：經化學修飾的 APP RNAi 劑反義鏈和有義鏈序列。所有序列均以 5' 至 3' 表示。這些序列用於本文所述的某些體外測試研究。
雙鏈AV# 有義鏈 SS# 有義序列 序列號. 反義鏈AS# 反義序列 序列號.
AV00622 AV00622-SS c*u*acccugAfaCfuGfcagauca*a 1041 AV00622-AS u*Uf*gaucUfgcagUfuCfaGfggu*a*g 1299
AV00623 AV00623-SS c*u*gaacugCfaGfaUfcaccaau*a 1042 AV00623-AS u*Af*uuggUfgaucUfgCfaGfuuc*a*g 1300
AV00624 AV00624-SS c*a*gaucacCfaAfuGfugguaga*a 1043 AV00624-AS u*Uf*cuacCfacauUfgGfuGfauc*u*g 1301
AV00625 AV00625-SS c*a*uccccaCfuUfuGfugauucc*a 1044 AV00625-AS u*Gf*gaauCfacaaAfgUfgGfgga*u*g 1302
AV00626 AV00626-SS u*g*cuuaguUfgGfuGfaguuugu*a 1045 AV00626-AS u*Af*caaaCfucacCfaAfcUfaag*c*a 1303
AV00627 AV00627-SS g*u*uccugaCfaAfgUfgcaaauu*a 1046 AV00627-AS u*Af*auuuGfcacuUfgUfcAfgga*a*c 1304
AV00628 AV00628-SS u*u*ccugacAfaGfuGfcaaauuc*a 1047 AV00628-AS u*Gf*aauuUfgcacUfuGfuCfagg*a*a 1305
AV00629 AV00629-SS u*c*cugacaAfgUfgCfaaauucu*a 1048 AV00629-AS u*Af*gaauUfugcaCfuUfgUfcag*g*a 1306
AV00630 AV00630-SS c*u*gacaagUfgCfaAfauucuua*a 1049 AV00630-AS u*Uf*aagaAfuuugCfaCfuUfguc*a*g 1307
AV00631 AV00631-SS a*c*aagugcAfaAfuUfcuuacac*a 1050 AV00631-AS u*Gf*uguaAfgaauUfuGfcAfcuu*g*u 1308
AV00632 AV00632-SS c*c*aggagaGfgAfuGfgauguuu*a 1051 AV00632-AS u*Af*aacaUfccauCfcUfcUfccu*g*g 1309
AV00633 AV00633-SS g*u*uccgagGfgGfuAfgaguuug*a 1052 AV00633-AS u*Cf*aaacUfcuacCfcCfuCfgga*a*c 1310
AV00634 AV00634-SS a*g*aaagugAfcAfaUfguggauu*a 1053 AV00634-AS u*Af*auccAfcauuGfuCfaCfuuu*c*u 1311
AV00635 AV00635-SS g*a*aagugaCfaAfuGfuggauuc*a 1054 AV00635-AS u*Gf*aaucCfacauUfgUfcAfcuu*u*c 1312
AV00636 AV00636-SS a*a*agugacAfaUfgUfggauucu*a 1055 AV00636-AS u*Af*gaauCfcacaUfuGfuCfacu*u*u 1313
AV00637 AV00637-SS g*g*gagugaAfgAfcAfaaguagu*a 1056 AV00637-AS u*Af*cuacUfuuguCfuUfcAfcuc*c*c 1314
AV00638 AV00638-SS g*g*agugaaGfaCfaAfaguagua*a 1057 AV00638-AS u*Uf*acuaCfuuugUfcUfuCfacu*c*c 1315
AV00639 AV00639-SS g*a*gugaagAfcAfaAfguaguag*a 1058 AV00639-AS u*Cf*uacuAfcuuuGfuCfuUfcac*u*c 1316
AV00640 AV00640-SS a*g*ugaagaCfaAfaGfuaguaga*a 1059 AV00640-AS u*Uf*cuacUfacuuUfgUfcUfuca*c*u 1317
AV00641 AV00641-SS g*u*gaagacAfaAfgUfaguagaa*a 1060 AV00641-AS u*Uf*ucuaCfuacuUfuGfuCfuuc*a*c 1318
AV00642 AV00642-SS u*g*aagacaAfaGfuAfguagaag*a 1061 AV00642-AS u*Cf*uucuAfcuacUfuUfgUfcuu*c*a 1319
AV00643 AV00643-SS g*a*agacaaAfgUfaGfuagaagu*a 1062 AV00643-AS u*Af*cuucUfacuaCfuUfuGfucu*u*c 1320
AV00644 AV00644-SS g*a*caaaguAfgUfaGfaaguagc*a 1063 AV00644-AS u*Gf*cuacUfucuaCfuAfcUfuug*u*c 1321
AV00645 AV00645-SS g*a*agaagcCfgAfuGfaugacga*a 1064 AV00645-AS u*Uf*cgucAfucauCfgGfcUfucu*u*c 1322
AV00646 AV00646-SS c*c*ugaugcCfgUfuGfacaagua*a 1065 AV00646-AS u*Uf*acuuGfucaaCfgGfcAfuca*g*g 1323
AV00647 AV00647-SS g*u*cccaggUfcAfuGfagagaau*a 1066 AV00647-AS u*Af*uucuCfucauGfaCfcUfggg*a*c 1324
AV00648 AV00648-SS c*a*agcaaaGfaAfcUfugccuaa*a 1067 AV00648-AS u*Uf*uaggCfaaguUfcUfuUfgcu*u*g 1325
AV00649 AV00649-SS a*a*gcaaagAfaCfuUfgccuaaa*a 1068 AV00649-AS u*Uf*uuagGfcaagUfuCfuUfugc*u*u 1326
AV00650 AV00650-SS a*g*caaagaAfcUfuGfccuaaag*a 1069 AV00650-AS u*Cf*uuuaGfgcaaGfuUfcUfuug*c*u 1327
AV00651 AV00651-SS c*u*ugccuaAfaGfcUfgauaaga*a 1070 AV00651-AS u*Uf*cuuaUfcagcUfuUfaGfgca*a*g 1328
AV00652 AV00652-SS u*u*gccuaaAfgCfuGfauaagaa*a 1071 AV00652-AS u*Uf*ucuuAfucagCfuUfuAfggc*a*a 1329
AV00653 AV00653-SS g*c*ugauaaGfaAfgGfcaguuau*a 1072 AV00653-AS u*Af*uaacUfgccuUfcUfuAfuca*g*c 1330
AV00654 AV00654-SS c*u*gauaagAfaGfgCfaguuauc*a 1073 AV00654-AS u*Gf*auaaCfugccUfuCfuUfauc*a*g 1331
AV00655 AV00655-SS u*g*auaagaAfgGfcAfguuaucc*a 1074 AV00655-AS u*Gf*gauaAfcugcCfuUfcUfuau*c*a 1332
AV00656 AV00656-SS g*a*aggcagUfuAfuCfcagcauu*a 1075 AV00656-AS u*Af*augcUfggauAfaCfuGfccu*u*c 1333
AV00657 AV00657-SS c*a*ggagaaAfgUfgGfaaucuuu*a 1076 AV00657-AS u*Af*aagaUfuccaCfuUfuCfucc*u*g 1334
AV00658 AV00658-SS g*g*agaaagUfgGfaAfucuuugg*a 1077 AV00658-AS u*Cf*caaaGfauucCfaCfuUfucu*c*c 1335
AV00659 AV00659-SS g*a*aaguggAfaUfcUfuuggaac*a 1078 AV00659-AS u*Gf*uuccAfaagaUfuCfcAfcuu*u*c 1336
AV00660 AV00660-SS a*a*aguggaAfuCfuUfuggaaca*a 1079 AV00660-AS u*Uf*guucCfaaagAfuUfcCfacu*u*u 1337
AV00661 AV00661-SS g*u*ggaaucUfuUfgGfaacagga*a 1080 AV00661-AS u*Uf*ccugUfuccaAfaGfaUfucc*a*c 1338
AV00662 AV00662-SS g*a*guggaaGfcCfaUfgcucaau*a 1081 AV00662-AS u*Af*uugaGfcaugGfcUfuCfcac*u*c 1339
AV00663 AV00663-SS g*c*cucgucAfcGfuGfuucaaua*a 1082 AV00663-AS u*Uf*auugAfacacGfuGfaCfgag*g*c 1340
AV00664 AV00664-SS c*c*ucgucaCfgUfgUfucaauau*a 1083 AV00664-AS u*Af*uauuGfaacaCfgUfgAfcga*g*g 1341
AV00665 AV00665-SS u*c*gucacgUfgUfuCfaauaugc*a 1084 AV00665-AS u*Gf*cauaUfugaaCfaCfgUfgac*g*a 1342
AV00666 AV00666-SS c*g*ucacguGfuUfcAfauaugcu*a 1085 AV00666-AS u*Af*gcauAfuugaAfcAfcGfuga*c*g 1343
AV00667 AV00667-SS c*u*aaagcaUfuUfcGfagcaugu*a 1086 AV00667-AS u*Af*caugCfucgaAfaUfgCfuuu*a*g 1344
AV00668 AV00668-SS a*c*acaccuCfcGfuGfugauuua*a 1087 AV00668-AS u*Uf*aaauCfacacGfgAfgGfugu*g*u 1345
AV00669 AV00669-SS g*g*agauucAfgGfaUfgaaguug*a 1088 AV00669-AS u*Cf*aacuUfcaucCfuGfaAfucu*c*c 1346
AV00670 AV00670-SS g*a*gauucaGfgAfuGfaaguuga*a 1089 AV00670-AS u*Uf*caacUfucauCfcUfgAfauc*u*c 1347
AV00671 AV00671-SS a*g*auucagGfaUfgAfaguugau*a 1090 AV00671-AS u*Af*ucaaCfuucaUfcCfuGfaau*c*u 1348
AV00672 AV00672-SS g*a*uucaggAfuGfaAfguugaug*a 1091 AV00672-AS u*Cf*aucaAfcuucAfuCfcUfgaa*u*c 1349
AV00673 AV00673-SS a*u*ucaggaUfgAfaGfuugauga*a 1092 AV00673-AS u*Uf*caucAfacuuCfaUfcCfuga*a*u 1350
AV00674 AV00674-SS a*g*uugaugAfgCfuGfcuucaga*a 1093 AV00674-AS u*Uf*cugaAfgcagCfuCfaUfcaa*c*u 1351
AV00675 AV00675-SS a*g*agcaaaAfcUfaUfucagaug*a 1094 AV00675-AS u*Cf*aucuGfaauaGfuUfuUfgcu*c*u 1352
AV00676 AV00676-SS a*g*caaaacUfaUfuCfagaugac*a 1095 AV00676-AS u*Gf*ucauCfugaaUfaGfuUfuug*c*u 1353
AV00677 AV00677-SS a*a*cuauucAfgAfuGfacgucuu*a 1096 AV00677-AS u*Af*agacGfucauCfuGfaAfuag*u*u 1354
AV00678 AV00678-SS g*u*cuuggcCfaAfcAfugauuag*a 1097 AV00678-AS u*Cf*uaauCfauguUfgGfcCfaag*a*c 1355
AV00679 AV00679-SS u*c*uuggccAfaCfaUfgauuagu*a 1098 AV00679-AS u*Af*cuaaUfcaugUfuGfgCfcaa*g*a 1356
AV00680 AV00680-SS c*u*uggccaAfcAfuGfauuagug*a 1099 AV00680-AS u*Cf*acuaAfucauGfuUfgGfcca*a*g 1357
AV00681 AV00681-SS a*a*caugauUfaGfuGfaaccaag*a 1100 AV00681-AS u*Cf*uuggUfucacUfaAfuCfaug*u*u 1358
AV00682 AV00682-SS u*a*gugaacCfaAfgGfaucaguu*a 1101 AV00682-AS u*Af*acugAfuccuUfgGfuUfcac*u*a 1359
AV00683 AV00683-SS g*u*gaaccaAfgGfaUfcaguuac*a 1102 AV00683-AS u*Gf*uaacUfgaucCfuUfgGfuuc*a*c 1360
AV00684 AV00684-SS a*c*caaggaUfcAfgUfuacggaa*a 1103 AV00684-AS u*Uf*uccgUfaacuGfaUfcCfuug*g*u 1361
AV00685 AV00685-SS c*c*aaggauCfaGfuUfacggaaa*a 1104 AV00685-AS u*Uf*uuccGfuaacUfgAfuCfcuu*g*g 1362
AV00686 AV00686-SS c*a*ucuuugAfcCfgAfaacgaaa*a 1105 AV00686-AS u*Uf*uucgUfuucgGfuCfaAfaga*u*g 1363
AV00687 AV00687-SS a*u*cuuugaCfcGfaAfacgaaaa*a 1106 AV00687-AS u*Uf*uuucGfuuucGfgUfcAfaag*a*u 1364
AV00688 AV00688-SS c*c*agccaaCfaCfaGfaaaacga*a 1107 AV00688-AS u*Uf*cguuUfucugUfgUfuGfgcu*g*g 1365
AV00689 AV00689-SS c*a*gccaacAfcAfgAfaaacgaa*a 1108 AV00689-AS u*Uf*ucguUfuucuGfuGfuUfggc*u*g 1366
AV00690 AV00690-SS c*a*gguucuGfgGfuUfgacaaau*a 1109 AV00690-AS u*Af*uuugUfcaacCfcAfgAfacc*u*g 1367
AV00691 AV00691-SS u*u*cuggguUfgAfcAfaauauca*a 1110 AV00691-AS u*Uf*gauaUfuuguCfaAfcCfcag*a*a 1368
AV00692 AV00692-SS c*g*gaggagAfuCfuCfugaagug*a 1111 AV00692-AS u*Cf*acuuCfagagAfuCfuCfcuc*c*g 1369
AV00693 AV00693-SS g*g*aggagaUfcUfcUfgaaguga*a 1112 AV00693-AS u*Uf*cacuUfcagaGfaUfcUfccu*c*c 1370
AV00694 AV00694-SS a*u*caccuuGfgUfgAfugcugaa*a 1113 AV00694-AS u*Uf*ucagCfaucaCfcAfaGfgug*a*u 1371
AV00695 AV00695-SS a*c*auccauUfcAfuCfauggugu*a 1114 AV00695-AS u*Af*caccAfugauGfaAfuGfgau*g*u 1372
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AV04892 AV04892-SS c*a*ggagauCfuCfuGfaaguga*a*a 1222 AV04892-AS u*Uf*ucacUfucagAfgAfuCfucc*u*g 1480
AV04893 AV04893-SS c*g*agaucuCfuGfaAfgugaag*a*a 1223 AV04893-AS u*Uf*cuucAfcuucAfgAfgAfucu*c*g 1481
AV04894 AV04894-SS c*a*cagugaUfcGfuCfaucacc*u*a 1224 AV04894-AS u*Af*ggugAfugacGfaUfcAfcug*u*g 1482
AV04895 AV04895-SS g*g*ugaucgUfcAfuCfaccuug*g*a 1225 AV04895-AS u*Cf*caAfg(gUNA)ugauGfaCfgAfuca*c*c 1483
AV04896 AV04896-SS g*u*cgucauCfaCfcUfugguga*u*a 1226 AV04896-AS u*Af*ucacCfaaggUfgAfuGfacg*a*c 1484
AV04897 AV04897-SS g*c*gucaucAfcCfuUfggugau*g*a 1227 AV04897-AS u*Cf*auCfa(cUNA)caagGfuGfaUfgac*g*c 1485
AV04898 AV04898-SS g*a*ccuuggUfgAfuGfcugaag*a*a 1228 AV04898-AS u*Uf*cuucAfgcauCfaCfcAfagg*u*c 1486
AV04899 AV04899-SS g*u*ucaucaUfgGfuGfuggugg*a*a 1229 AV04899-AS u*Uf*ccAfc(cUNA)acacCfaUfgAfuga*a*c 1487
AV04900 AV04900-SS g*g*aaaaucCfaAfcCfuacaag*u*a 1230 AV04900-AS u*Af*cuugUfagguUfgGfaUfuuu*c*c 1488
AV04901 AV04901-SS g*a*aauccaAfcCfuAfcaaguu*c*a 1231 AV04901-AS u*Gf*aacuUfguagGfuUfgGfauu*u*c 1489
AV04902 AV04902-SS g*a*auccaaCfcUfaCfaaguuc*u*a 1232 AV04902-AS u*Af*gaacUfuguaGfgUfuGfgau*u*c 1490
AV04903 AV04903-SS g*c*caaccuAfcAfaGfuucuuu*g*a 1233 AV04903-AS u*Cf*aaagAfacuuGfuAfgGfuug*g*c 1491
AV04904 AV04904-SS g*c*aaccuaCfaAfgUfucuuug*a*a 1234 AV04904-AS u*Uf*caaaGfaacuUfgUfaGfguu*g*c 1492
AV04905 AV04905-SS g*a*ccuacaAfgUfuCfuuugag*c*a 1235 AV04905-AS u*Gf*cucaAfagaaCfuUfgUfagg*u*c 1493
AV04906 AV04906-SS g*c*aaguucUfuUfgAfgcagau*g*a 1236 AV04906-AS u*Cf*auCfu(gUNA)cucaAfaGfaAfcuu*g*c 1494
AV04907 AV04907-SS c*c*cucugaAfgUfuGfgacagc*a*a 1237 AV04907-AS u*Uf*gcUfg(uUNA)ccaaCfuUfcAfgag*g*g 1495
AV04908 AV04908-SS g*g*uuggacAfgCfaAfaaccau*u*a 1238 AV04908-AS u*Af*auggUfuuugCfuGfuCfcaa*c*c 1496
AV04909 AV04909-SS g*a*gcaaaaCfcAfuUfgcuuca*c*a 1239 AV04909-AS u*Gf*ugAfa(gUNA)caauGfgUfuUfugc*u*c 1497
AV04910 AV04910-SS g*a*aaccauUfgCfuUfcacuac*c*a 1240 AV04910-AS u*Gf*guAfg(uUNA)gaagCfaAfuGfguu*u*c 1498
AV04911 AV04911-SS g*c*ccaucgGfuGfuCfcauuua*u*a 1241 AV04911-AS u*Af*uaaaUfggacAfcCfgAfugg*g*c 1499
AV04912 AV04912-SS g*c*aucgguGfuCfcAfuuuaua*g*a 1242 AV04912-AS u*Cf*uauaAfauggAfcAfcCfgau*g*c 1500
AV04913 AV04913-SS g*c*ggugucCfaUfuUfauagaa*u*a 1243 AV04913-AS u*Af*uucuAfuaaaUfgGfaCfacc*g*c 1501
AV04914 AV04914-SS g*c*guuuuaUfgAfuUfuacuca*u*a 1244 AV04914-AS u*Af*ugagUfaaauCfaUfaAfaac*g*c 1502
AV04915 AV04915-SS g*g*uuuuauGfaUfuUfacucau*u*a 1245 AV04915-AS u*Af*augaGfuaaaUfcAfuAfaaa*c*c 1503
AV04916 AV04916-SS c*u*uuuaugAfuUfuAfcucauu*a*a 1246 AV04916-AS u*Uf*aaugAfguaaAfuCfaUfaaa*a*g 1504
AV04917 AV04917-SS g*u*augauuUfaCfuCfauuauc*g*a 1247 AV04917-AS u*Cf*gauaAfugagUfaAfaUfcau*a*c 1505
AV04918 AV04918-SS g*g*auuuacUfcAfuUfaucgcc*u*a 1248 AV04918-AS u*Af*ggCfg(aUNA)uaauGfaGfuAfaau*c*c 1506
AV04919 AV04919-SS g*u*uacucaUfuAfuCfgccuuu*u*a 1249 AV04919-AS u*Af*aaagGfcgauAfaUfgAfgua*a*c 1507
AV04920 AV04920-SS g*a*cucauuAfuCfgCfcuuuug*a*a 1250 AV04920-AS u*Uf*caaaAfggcgAfuAfaUfgag*u*c 1508
AV04921 AV04921-SS g*c*ucauuaUfcGfcCfuuuuga*c*a 1251 AV04921-AS u*Gf*ucaaAfaggcGfaUfaAfuga*g*c 1509
AV04922 AV04922-SS g*u*cauuauCfgCfcUfuuugac*a*a 1252 AV04922-AS u*Uf*gucaAfaaggCfgAfuAfaug*a*c 1510
AV04923 AV04923-SS g*u*uaucgcCfuUfuUfgacagc*u*a 1253 AV04923-AS u*Af*gcUfg(uUNA)caaaAfgGfcGfaua*a*c 1511
AV04924 AV04924-SS g*u*uuugacAfgCfuGfugcugu*a*a 1254 AV04924-AS u*Uf*acagCfacagCfuGfuCfaaa*a*c 1512
AV04925 AV04925-SS g*u*uugacaGfcUfgUfgcugua*a*a 1255 AV04925-AS u*Uf*uacaGfcacaGfcUfgUfcaa*a*c 1513
AV04926 AV04926-SS c*u*gcuguaAfcAfcAfaguaga*u*a 1256 AV04926-AS u*Af*ucuaCfuuguGfuUfaCfagc*a*g 1514
AV04927 AV04927-SS g*g*cuguaaCfaCfaAfguagau*g*a 1257 AV04927-AS u*Cf*aucuAfcuugUfgUfuAfcag*c*c 1515
AV04928 AV04928-SS c*c*uguaacAfcAfaGfuagaug*c*a 1258 AV04928-AS u*Gf*caucUfacuuGfuGfuUfaca*g*g 1516
AV04929 AV04929-SS g*g*uaacacAfaGfuAfgaugcc*u*a 1259 AV04929-AS u*Af*ggCfa(uUNA)cuacUfuGfuGfuua*c*c 1517
AV04930 AV04930-SS g*a*cacaagUfaGfaUfgccuga*a*a 1260 AV04930-AS u*Uf*ucAfg(gUNA)caucUfaCfuUfgug*u*c 1518
AV04931 AV04931-SS g*c*acaaguAfgAfuGfccugaa*c*a 1261 AV04931-AS u*Gf*uuCfa(gUNA)gcauCfuAfcUfugu*g*c 1519
AV04932 AV04932-SS g*u*gccugaAfcUfuGfaauuaa*u*a 1262 AV04932-AS u*Af*uuaaUfucaaGfuUfcAfggc*a*c 1520
AV04933 AV04933-SS g*g*ccugaaCfuUfgAfauuaau*c*a 1263 AV04933-AS u*Gf*auuaAfuucaAfgUfuCfagg*c*c 1521
AV04934 AV04934-SS c*c*cugaacUfuGfaAfuuaauc*c*a 1264 AV04934-AS u*Gf*gauuAfauucAfaGfuUfcag*g*g 1522
AV04935 AV04935-SS g*c*ugaacuUfgAfaUfuaaucc*a*a 1265 AV04935-AS u*Uf*ggauUfaauuCfaAfgUfuca*g*c 1523
AV04936 AV04936-SS g*c*acaucaGfuAfaUfguauuc*u*a 1266 AV04936-AS u*Af*gaauAfcauuAfcUfgAfugu*g*c 1524
AV04937 AV04937-SS g*a*ucucucUfuUfaCfauuuug*g*a 1267 AV04937-AS u*Cf*caaaAfuguaAfaGfaGfaga*u*c 1525
AV04938 AV04938-SS g*u*cucucuUfuAfcAfuuuugg*u*a 1268 AV04938-AS u*Af*ccaaAfauguAfaAfgAfgag*a*c 1526
AV04939 AV04939-SS g*c*ucucuuUfaCfaUfuuuggu*c*a 1269 AV04939-AS u*Gf*accaAfaaugUfaAfaGfaga*g*c 1527
AV04940 AV04940-SS g*u*cucuuuAfcAfuUfuugguc*u*a 1270 AV04940-AS u*Af*gaccAfaaauGfuAfaAfgag*a*c 1528
AV04941 AV04941-SS g*c*uuuacaUfuUfuGfgucucu*a*a 1271 AV04941-AS u*Uf*agagAfccaaAfaUfgUfaaa*g*c 1529
AV04942 AV04942-SS g*a*uuaaugGfgUfuUfugugua*c*a 1272 AV04942-AS u*Gf*uacaCfaaaaCfcCfaUfuaa*u*c 1530
AV04943 AV04943-SS g*u*uaauggGfuUfuUfguguac*u*a 1273 AV04943-AS u*Af*guacAfcaaaAfcCfcAfuua*a*c 1531
AV04944 AV04944-SS g*u*ggguuuUfgUfgUfacugua*a*a 1274 AV04944-AS u*Uf*uacaGfuacaCfaAfaAfccc*a*c 1532
AV04945 AV04945-SS c*g*guuuugUfgUfaCfuguaaa*g*a 1275 AV04945-AS u*Cf*uuuaCfaguaCfaCfaAfaac*c*g 1533
AV04946 AV04946-SS c*u*uuugugUfaCfuGfuaaaga*a*a 1276 AV04946-AS u*Uf*ucuuUfacagUfaCfaCfaaa*a*g 1534
AV04947 AV04947-SS g*u*uuguguAfcUfgUfaaagaa*u*a 1277 AV04947-AS u*Af*uucuUfuacaGfuAfcAfcaa*a*c 1535
AV04948 AV04948-SS g*u*uguguaCfuGfuAfaagaau*u*a 1278 AV04948-AS u*Af*auucUfuuacAfgUfaCfaca*a*c 1536
AV04949 AV04949-SS g*g*uacuguAfaAfgAfauuuag*c*a 1279 AV04949-AS u*Gf*cuaaAfuucuUfuAfcAfgua*c*c 1537
AV04950 AV04950-SS g*c*uguaaaGfaAfuUfuagcug*u*a 1280 AV04950-AS u*Af*cagcUfaaauUfcUfuUfaca*g*c 1538
AV04951 AV04951-SS g*u*guaaagAfaUfuUfagcugu*a*a 1281 AV04951-AS u*Uf*acagCfuaaaUfuCfuUfuac*a*c 1539
AV04952 AV04952-SS g*a*agaauuUfaGfcUfguauca*a*a 1282 AV04952-AS u*Uf*ugauAfcagcUfaAfaUfucu*u*c 1540
AV04953 AV04953-SS g*u*uuagcuGfuAfuCfaaacua*g*a 1283 AV04953-AS u*Cf*uaguUfugauAfcAfgCfuaa*a*c 1541
AV04954 AV04954-SS g*a*gcuguaUfcAfaAfcuagug*c*a 1284 AV04954-AS u*Gf*caCfu(aUNA)guuuGfaUfaCfagc*u*c 1542
AV04955 AV04955-SS g*u*guaucaAfaCfuAfgugcau*g*a 1285 AV04955-AS u*Cf*auGfc(aUNA)cuagUfuUfgAfuac*a*c 1543
AV04956 AV04956-SS g*g*uaucaaAfcUfaGfugcaug*a*a 1286 AV04956-AS u*Uf*caugCfacuaGfuUfuGfaua*c*c 1544
AV04957 AV04957-SS c*u*aucaaaCfuAfgUfgcauga*a*a 1287 AV04957-AS u*Uf*ucauGfcacuAfgUfuUfgau*a*g 1545
AV04958 AV04958-SS g*a*aacuagUfgCfaUfgaauag*a*a 1288 AV04958-AS u*Uf*cuauUfcaugCfaCfuAfguu*u*c 1546
AV04959 AV04959-SS g*u*agugcaUfgAfaUfagauuc*u*a 1289 AV04959-AS u*Af*gaauCfuauuCfaUfgCfacu*a*c 1547
AV04960 AV04960-SS g*a*gugcauGfaAfuAfgauucu*c*a 1290 AV04960-AS u*Gf*agaaUfcuauUfcAfuGfcac*u*c 1548
AV04961 AV04961-SS c*c*augaauAfgAfuUfcucucc*u*a 1291 AV04961-AS u*Af*ggAfg(aUNA)gaauCfuAfuUfcau*g*g 1549
AV04962 AV04962-SS c*a*uucucuCfcUfgAfuuauuu*a*a 1292 AV04962-AS u*Uf*aaauAfaucaGfgAfgAfgaa*u*g 1550
AV04963 AV04963-SS g*c*ucuccuGfaUfuAfuuuauc*a*a 1293 AV04963-AS u*Uf*gauaAfauaaUfcAfgGfaga*g*c 1551
AV04964 AV04964-SS g*c*uccugaUfuAfuUfuaucac*a*a 1294 AV04964-AS u*Uf*gugaUfaaauAfaUfcAfgga*g*c 1552
AV04965 AV04965-SS g*u*ccugauUfaUfuUfaucaca*u*a 1295 AV04965-AS u*Af*ugugAfuaaaUfaAfuCfagg*a*c 1553
AV04966 AV04966-SS g*c*cugauuAfuUfuAfucacau*a*a 1296 AV04966-AS u*Uf*auguGfauaaAfuAfaUfcag*g*c 1554
AV04967 AV04967-SS g*c*ugauuaUfuUfaUfcacaua*g*a 1297 AV04967-AS u*Cf*uaugUfgauaAfaUfaAfuca*g*c 1555
AV04968 AV04968-SS g*u*agccagUfuGfuAfuauuau*u*a 1298 AV04968-AS u*Af*auaaUfauacAfaCfuGfgcu*a*c 1556
表 3 顯示了本發明的某些化學修飾的 APP RNAi 劑反義鏈和有義鏈序列。在本發明的方法的一些實施例中，將表 3 中所示的 RNAi 劑施用於細胞和/或受試者。在本發明的方法的一些實施例中，將具有表 3 中所示的多核苷酸序列的 RNAi 劑施用於受試者。在本發明的一些實施例中，施用於受試者的 RNAi 劑包括表 3 中第一列的一行中標識的雙鏈體，並且包括表 3 中同一行的有義鏈和反義鏈序列中分別顯示的序列修飾和/或遞送化合物，表 3 中第三列和第六列。這些序列用於本文其他地方描述的某些 體內測試研究。在本發明的方法的一些實施例中，表 3 中所示的序列可以附著於（本文也稱為“結合於”）用於遞送的化合物，其非限制性示例是含 GalNAc 的化合物，其中遞送化合物在表 3 中第三列的有義鏈上標識為“GLX-n”。如本文所用，“GLX-n”用於表示“GLS-n*”或“GLO-n”遞送化合物（“X”可以是“S”或“O”），其可在合成過程中附著到寡核苷酸的 3' 端。如本文所用並在表 3 中所示，“GLX-n”用於表示所連接的含 GalNAc 化合物是化合物 GLS-1*、GLS-2*、GLS-3*、GLS-4*、GLS-5*、GLS-6*、GLS-7*、GLS-8*、GLS-9*、GLS-10*、GLS-11*、GLS-12*、GLS-13*、GLS-14*、GLS-15*、GLS-16*、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15 和 GLO-16 中的任一種，每種化合物的結構在本文其他地方提供。本領域技術人員將能夠製備和使用本發明的 dsRNA 化合物，其中所連接的遞送化合物是 GLS-1*、GLS-2*、GLS-3*、GLS-4*、GLS-5*、GLS-6*、GLS-7*、GLS-8*、GLS-9*、GLS-10*、GLS-11*、GLS-12*、GLS-13*、GLS-14*、GLS-15*、GLS-16*、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15 和 GLO-16 中的任一種。表 3 的第一列提供了分配給該行中有義和反義序列的雙鏈的雙鏈 AD#。例如，雙鏈 AD# AD00488 是有義鏈 SEQ ID NO: 1557 和反義鏈 SEQ ID NO: 1604 的雙鏈。表 3 中的每一行都提供了一條有義鏈和一條反義鏈，並公開了所示有義鏈和反義鏈的雙鏈。表 3 第二列中的“有義鏈 SS#”是同一行第 3 列中所示有義序列（包括修飾）的分配標識符。表 3 第五列中的“反義鏈 AS#”是第六列中所示反義序列（包括修飾）的分配標識符。某些附著有 GalNAc 的含有“GLO-n”或“GLS-n*”化合物的標識符顯示為 GLS-5* 或 GLS-15*，所得化合物包含在本發明的方法和/或組合物的實施例中。
表 3 提供了化學修飾的 APP RNAi 劑反義鏈和有義鏈序列。所有序列均以 5' 至 3' 表示。這些序列用於本文其他地方描述的某些體內測試研究。體內研究中使用的遞送分子在每個有義鏈的 3' 端或 5' 端表示為“GLO-n”或“GLS-n*”。
雙鏈AD# 有義鏈SS# 有義序列 序列號 反義鏈AS# 反義序列 序列號
AD00488 AD00488-SS (GLS-15*)(invab*)guccugacAfaGfuGfcaaauuca*(invab) 1557 AD00488-AS u*Gf*aauuUfgcacUfuGfuCfagg*a*c 1604
AD00489 AD00489-SS (GLS-15*)(invab*)caaagugaCfaAfuGfuggauuca*(invab) 1558 AD00489-AS u*Gf*aaucCfacauUfgUfcAfcuu*u*g 1605
AD00490 AD00490-SS (GLS-15*)(invab*)ggaagacaAfaGfuAfguagaaga*(invab) 1559 AD00490-AS u*Cf*uucuAfcuacUfuUfgUfcuu*c*c 1606
AD00491 AD00491-SS (GLS-15*)(invab*)gagcaaagAfaCfuUfgccuaaaa*(invab) 1560 AD00491-AS u*Uf*uuagGfcaagUfuCfuUfugc*u*c 1607
AD00492 AD00492-SS (GLS-15*)(invab*)gaaguggaAfuCfuUfuggaacaa*(invab) 1561 AD00492-AS u*Uf*guucCfaaagAfuUfcCfacu*u*c 1608
AD00493 AD00493-SS (GLS-15*)(invab*)gcgucacgUfgUfuCfaauaugca*(invab) 1562 AD00493-AS u*Gf*cauaUfugaaCfaCfgUfgac*g*c 1609
AD00494 AD00494-SS (GLS-15*)(invab*)cagauucaGfgAfuGfaaguugaa*(invab) 1563 AD00494-AS u*Uf*caacUfucauCfcUfgAfauc*u*g 1610
AD00495 AD00495-SS (GLS-15*)(invab*)ggcaaaacUfaUfuCfagaugaca*(invab) 1564 AD00495-AS u*Gf*ucauCfugaaUfaGfuUfuug*c*c 1611
AD00496 AD00496-SS (GLS-15*)(invab*)gacuauucAfgAfuGfacgucuua*(invab) 1565 AD00496-AS u*Af*agacGfucauCfuGfaAfuag*u*c 1612
AD00497 AD00497-SS (GLS-15*)(invab*)guuggccaAfcAfuGfauuaguga*(invab) 1566 AD00497-AS u*Cf*acuaAfucauGfuUfgGfcca*a*c 1613
AD00498 AD00498-SS (GLS-15*)(invab*)gcaaggauCfaGfuUfacggaaaa*(invab) 1567 AD00498-AS u*Uf*uuccGfuaacUfgAfuCfcuu*g*c 1614
AD00499 AD00499-SS (GLS-15*)(invab*)gucuggguUfgAfcAfaauaucaa*(invab) 1568 AD00499-AS u*Uf*gauaUfuuguCfaAfcCfcag*a*c 1615
AD00500 AD00500-SS (GLS-15*)(invab*)guugagcaGfaUfgCfagaacuaa*(invab) 1569 AD00500-AS u*Uf*aguuCfugcaUfcUfgCfuca*a*c 1616
AD00501 AD00501-SS (GLS-15*)(invab*)ggaauagaUfuCfuCfuccugaua*(invab) 1570 AD00501-AS u*Af*ucagGfagagAfaUfcUfauu*c*c 1617
AD00638 AD00638-SS (GLS-15*)(invab*)gugaacugCfaGfaUfcaccaaua*(invab) 1571 AD00638-AS u*Af*uuggUfgaucUfgCfaGfuuc*a*c 1618
AD00639 AD00639-SS (GLS-15*)(invab*)gauccccaCfuUfuGfugauucca*(invab) 1572 AD00639-AS u*Gf*gaauCfacaaAfgUfgGfgga*u*c 1619
AD00640 AD00640-SS (GLS-15*)(invab*)ggcuuaguUfgGfuGfaguuugua*(invab) 1573 AD00640-AS u*Af*caaaCfucacCfaAfcUfaag*c*c 1620
AD00641 AD00641-SS (GLS-15*)(invab*)gccugacaAfgUfgCfaaauucua*(invab) 1574 AD00641-AS u*Af*gaauUfugcaCfuUfgUfcag*g*c 1621
AD00642 AD00642-SS (GLS-15*)(invab*)gugacaagUfgCfaAfauucuuaa*(invab) 1575 AD00642-AS u*Uf*aagaAfuuugCfaCfuUfguc*a*c 1622
AD00643 AD00643-SS (GLS-15*)(invab*)gcaggagaGfgAfuGfgauguuua*(invab) 1576 AD00643-AS u*Af*aacaUfccauCfcUfcUfccu*g*c 1623
AD00644 AD00644-SS (GLS-15*)(invab*)cgagugaaGfaCfaAfaguaguaa*(invab) 1577 AD00644-AS u*Uf*acuaCfuuugUfcUfuCfacu*c*g 1624
AD00645 AD00645-SS (GLS-15*)(invab*)cagugaagAfcAfaAfguaguaga*(invab) 1578 AD00645-AS u*Cf*uacuAfcuuuGfuCfuUfcac*u*g 1625
AD00646 AD00646-SS (GLS-15*)(invab*)caagacaaAfgUfaGfuagaagua*(invab) 1579 AD00646-AS u*Af*cuucUfacuaCfuUfuGfucu*u*g 1626
AD00647 AD00647-SS (GLS-15*)(invab*)cacaaaguAfgUfaGfaaguagca*(invab) 1580 AD00647-AS u*Gf*cuacUfucuaCfuAfcUfuug*u*g 1627
AD00648 AD00648-SS (GLS-15*)(invab*)caagaagcCfgAfuGfaugacgaa*(invab) 1581 AD00648-AS u*Uf*cgucAfucauCfgGfcUfucu*u*g 1628
AD00649 AD00649-SS (GLS-15*)(invab*)gaagcaaaGfaAfcUfugccuaaa*(invab) 1582 AD00649-AS u*Uf*uaggCfaaguUfcUfuUfgcu*u*c 1629
AD00650 AD00650-SS (GLS-15*)(invab*)ggcaaagaAfcUfuGfccuaaaga*(invab) 1583 AD00650-AS u*Cf*uuuaGfgcaaGfuUfcUfuug*c*c 1630
AD00651 AD00651-SS (GLS-15*)(invab*)caaggcagUfuAfuCfcagcauua*(invab) 1584 AD00651-AS u*Af*augcUfggauAfaCfuGfccu*u*g 1631
AD01990 AD01990-SS (GLS-15*)(imann*)guacccugAfaCfuGfcagauca*a*(imann) 1585 AD01990-AS u*Uf*gaucUfgcagUfuCfaGfggu*a*c 1632
AD01991 AD01991-SS (GLS-15*)(imann*)gagaucacCfaAfuGfugguaga*a*(imann) 1586 AD01991-AS u*Uf*cuacCfacauUfgGfuGfauc*u*c 1633
AD01992 AD01992-SS (GLS-15*)(imann*)cuuccugaCfaAfgUfgcaaauu*a*(imann) 1587 AD01992-AS u*Af*auuuGfcacuUfgUfcAfgga*a*g 1634
AD01993 AD01993-SS (GLS-15*)(imann*)gcaagugcAfaAfuUfcuuacac*a*(imann) 1588 AD01993-AS u*Gf*uguaAfgaauUfuGfcAfcuu*g*c 1635
AD01994 AD01994-SS (GLS-15*)(imann*)ggaaagugAfcAfaUfguggauu*a*(imann) 1589 AD01994-AS u*Af*auccAfcauuGfuCfaCfuuu*c*c 1636
AD01995 AD01995-SS (GLS-15*)(imann*)cggagugaAfgAfcAfaaguagu*a*(imann) 1590 AD01995-AS u*Af*cuacUfuuguCfuUfcAfcuc*c*g 1637
AD01996 AD01996-SS (GLS-15*)(imann*)ggugaagaCfaAfaGfuaguaga*a*(imann) 1591 AD01996-AS u*Uf*cuacUfacuuUfgUfcUfuca*c*c 1638
AD01997 AD01997-SS (GLS-15*)(imann*)gcugaugcCfgUfuGfacaagua*a*(imann) 1592 AD01997-AS u*Uf*acuuGfucaaCfgGfcAfuca*g*c 1639
AD01998 AD01998-SS (GLS-15*)(imann*)guugccuaAfaGfcUfgauaaga*a*(imann) 1593 AD01998-AS u*Uf*cuuaUfcagcUfuUfaGfgca*a*c 1640
AD01999 AD01999-SS (GLS-15*)(imann*)gugccuaaAfgCfuGfauaagaa*a*(imann) 1594 AD01999-AS u*Uf*ucuuAfucagCfuUfuAfggc*a*c 1641
AD02000 AD02000-SS (GLS-15*)(imann*)ccugauaaGfaAfgGfcaguuau*a*(imann) 1595 AD02000-AS u*Af*uaacUfgccuUfcUfuAfuca*g*g 1642
AD02001 AD02001-SS (GLS-15*)(imann*)ggauaagaAfgGfcAfguuaucc*a*(imann) 1596 AD02001-AS u*Gf*gauaAfcugcCfuUfcUfuau*c*c 1643
AD02002 AD02002-SS (GLS-15*)(imann*)gaggagaaAfgUfgGfaaucuuu*a*(imann) 1597 AD02002-AS u*Af*aagaUfuccaCfuUfuCfucc*u*c 1644
AD02003 AD02003-SS (GLS-15*)(imann*)guucaggaUfgAfaGfuugauga*a*(imann) 1598 AD02003-AS u*Uf*caucAfacuuCfaUfcCfuga*a*c 1645
AD02004 AD02004-SS (GLS-15*)(imann*)gguugaugAfgCfuGfcuucaga*a*(imann) 1599 AD02004-AS u*Uf*cugaAfgcagCfuCfaUfcaa*c*c 1646
AD02005 AD02005-SS (GLS-15*)(imann*)gccaaggaUfcAfgUfuacggaa*a*(imann) 1600 AD02005-AS u*Uf*uccgUfaacuGfaUfcCfuug*g*c 1647
AD02006 AD02006-SS (GLS-15*)(imann*)gaucuuugAfcCfgAfaacgaaa*a*(imann) 1601 AD02006-AS u*Uf*uucgUfuucgGfuCfaAfaga*u*c 1648
AD02007 AD02007-SS (GLS-15*)(imann*)gagguucuGfgGfuUfgacaaau*a*(imann) 1602 AD02007-AS u*Af*uuugUfcaacCfcAfgAfacc*u*c 1649
AD02008 AD02008-SS (GLS-15*)(imann*)gcacagcaGfcCfuCfugaaguu*a*(imann) 1603 AD02008-AS u*Af*acuuCfagagGfcUfgCfugu*g*c 1650
AD02802 AD02802-SS (GLS-15*)c*aagucuaCfcCfuGfaacugca*a*(invab) 1651 AD02802-AS u*Uf*gcagUfucagGfgUfaGfacu*u*g 1715
AD02803 AD02803-SS (GLS-15*)c*cagaucaCfcAfaUfgugguag*a*(invab) 1652 AD02803-AS u*Cf*uaCfc(aUNA)cauuGfgUfgAfucu*g*g 1716
AD02804 AD02804-SS (GLS-15*)g*agugaugCfcCfuUfcucguuc*a*(invab) 1653 AD02804-AS u*Gf*aaCfg(aUNA)gaagGfgCfaUfcac*u*c 1717
AD02805 AD02805-SS (GLS-15*)g*guaccaaCfuUfgCfaugacua*a*(invab) 1654 AD02805-AS u*Uf*agucAfugcaAfgUfuGfgua*c*c 1718
AD02806 AD02806-SS (GLS-15*)g*agaguuuGfuGfuGfuugccca*a*(invab) 1655 AD02806-AS u*Uf*ggGfc(aUNA)acacAfcAfaAfcuc*u*c 1719
AD02807 AD02807-SS (GLS-15*)g*agugacaAfuGfuGfgauucug*a*(invab) 1656 AD02807-AS u*Cf*agaaUfccacAfuUfgUfcac*u*c 1720
AD02808 AD02808-SS (GLS-15*)g*gaugggaGfuGfaAfgacaaag*a*(invab) 1657 AD02808-AS u*Cf*uuugUfcuucAfcUfcCfcau*c*c 1721
AD02809 AD02809-SS (GLS-15*)c*aagccgaUfgAfuGfacgagga*a*(invab) 1658 AD02809-AS u*Uf*ccUfc(gUNA)ucauCfaUfcGfgcu*u*g 1722
AD02810 AD02810-SS (GLS-15*)g*agaacuuGfcCfuAfaagcuga*a*(invab) 1659 AD02810-AS u*Uf*cagcUfuuagGfcAfaGfuuc*u*c 1723
AD02811 AD02811-SS (GLS-15*)g*gaaagugGfaAfuCfuuuggaa*a*(invab) 1660 AD02811-AS u*Uf*uccaAfagauUfcCfaCfuuu*c*c 1724
AD02812 AD02812-SS (GLS-15*)g*aagagcaAfaAfcUfauucaga*a*(invab) 1661 AD02812-AS u*Uf*cugaAfuaguUfuUfgCfucu*u*c 1725
AD02813 AD02813-SS (GLS-15*)g*agagcaaAfaCfuAfuucagau*a*(invab) 1662 AD02813-AS u*Af*ucUfg(aUNA)auagUfuUfuGfcuc*u*c 1726
AD02814 AD02814-SS (GLS-15*)g*uagugaaCfcAfaGfgaucagu*a*(invab) 1663 AD02814-AS u*Af*cugaUfccuuGfgUfuCfacu*a*c 1727
AD02815 AD02815-SS (GLS-15*)g*aggaucaGfuUfaCfggaaacg*a*(invab) 1664 AD02815-AS u*Cf*guUfu(cUNA)cguaAfcUfgAfucc*u*c 1728
AD02816 AD02816-SS (GLS-15*)g*gaguucaGfcCfuGfgacgauc*a*(invab) 1665 AD02816-AS u*Gf*auCfg(uUNA)ccagGfcUfgAfacu*c*c 1729
AD02817 AD02817-SS (GLS-15*)g*gguucugGfgUfuGfacaaaua*a*(invab) 1666 AD02817-AS u*Uf*auuuGfucaaCfcCfaGfaac*c*c 1730
AD02818 AD02818-SS (GLS-15*)g*cuggguuGfaCfaAfauaucaa*a*(invab) 1667 AD02818-AS u*Uf*ugauAfuuugUfcAfaCfcca*g*c 1731
AD02819 AD02819-SS (GLS-15*)g*uggguugAfcAfaAfuaucaag*a*(invab) 1668 AD02819-AS u*Cf*uugaUfauuuGfuCfaAfccc*a*c 1732
AD02820 AD02820-SS (GLS-15*)c*aggagauCfuCfuGfaagugaa*a*(invab) 1669 AD02820-AS u*Uf*ucacUfucagAfgAfuCfucc*u*g 1733
AD02821 AD02821-SS (GLS-15*)c*acagugaUfcGfuCfaucaccu*a*(invab) 1670 AD02821-AS u*Af*ggugAfugacGfaUfcAfcug*u*g 1734
AD02822 AD02822-SS (GLS-15*)g*accuuggUfgAfuGfcugaaga*a*(invab) 1671 AD02822-AS u*Uf*cuucAfgcauCfaCfcAfagg*u*c 1735
AD02823 AD02823-SS (GLS-15*)g*gaaaaucCfaAfcCfuacaagu*a*(invab) 1672 AD02823-AS u*Af*cuugUfagguUfgGfaUfuuu*c*c 1736
AD02825 AD02825-SS (GLS-15*)g*aauccaaCfcUfaCfaaguucu*a*(invab) 1673 AD02825-AS u*Af*gaacUfuguaGfgUfuGfgau*u*c 1737
AD02826 AD02826-SS (GLS-15*)g*ccaaccuAfcAfaGfuucuuug*a*(invab) 1674 AD02826-AS u*Cf*aaagAfacuuGfuAfgGfuug*g*c 1738
AD02827 AD02827-SS (GLS-15*)g*caaguucUfuUfgAfgcagaug*a*(invab) 1675 AD02827-AS u*Cf*auCfu(gUNA)cucaAfaGfaAfcuu*g*c 1739
AD02828 AD02828-SS (GLS-15*)c*ccucugaAfgUfuGfgacagca*a*(invab) 1676 AD02828-AS u*Uf*gcUfg(uUNA)ccaaCfuUfcAfgag*g*g 1740
AD02829 AD02829-SS (GLS-15*)g*guuggacAfgCfaAfaaccauu*a*(invab) 1677 AD02829-AS u*Af*auggUfuuugCfuGfuCfcaa*c*c 1741
AD02830 AD02830-SS (GLS-15*)g*agcaaaaCfcAfuUfgcuucac*a*(invab) 1678 AD02830-AS u*Gf*ugAfa(gUNA)caauGfgUfuUfugc*u*c 1742
AD02831 AD02831-SS (GLS-15*)g*aaaccauUfgCfuUfcacuacc*a*(invab) 1679 AD02831-AS u*Gf*guAfg(uUNA)gaagCfaAfuGfguu*u*c 1743
AD02832 AD02832-SS (GLS-15*)g*caucgguGfuCfcAfuuuauag*a*(invab) 1680 AD02832-AS u*Cf*uauaAfauggAfcAfcCfgau*g*c 1744
AD02833 AD02833-SS (GLS-15*)g*cggugucCfaUfuUfauagaau*a*(invab) 1681 AD02833-AS u*Af*uucuAfuaaaUfgGfaCfacc*g*c 1745
AD02834 AD02834-SS (GLS-15*)g*cguuuuaUfgAfuUfuacucau*a*(invab) 1682 AD02834-AS u*Af*ugagUfaaauCfaUfaAfaac*g*c 1746
AD02835 AD02835-SS (GLS-15*)g*guuuuauGfaUfuUfacucauu*a*(invab) 1683 AD02835-AS u*Af*augaGfuaaaUfcAfuAfaaa*c*c 1747
AD02836 AD02836-SS (GLS-15*)c*uuuuaugAfuUfuAfcucauua*a*(invab) 1684 AD02836-AS u*Uf*aaugAfguaaAfuCfaUfaaa*a*g 1748
AD02837 AD02837-SS (GLS-15*)g*uaugauuUfaCfuCfauuaucg*a*(invab) 1685 AD02837-AS u*Cf*gauaAfugagUfaAfaUfcau*a*c 1749
AD02838 AD02838-SS (GLS-15*)g*gauuuacUfcAfuUfaucgccu*a*(invab) 1686 AD02838-AS u*Af*ggCfg(aUNA)uaauGfaGfuAfaau*c*c 1750
AD02839 AD02839-SS (GLS-15*)g*uuacucaUfuAfuCfgccuuuu*a*(invab) 1687 AD02839-AS u*Af*aaagGfcgauAfaUfgAfgua*a*c 1751
AD02840 AD02840-SS (GLS-15*)g*ucauuauCfgCfcUfuuugaca*a*(invab) 1688 AD02840-AS u*Uf*gucaAfaaggCfgAfuAfaug*a*c 1752
AD02841 AD02841-SS (GLS-15*)c*ugcuguaAfcAfcAfaguagau*a*(invab) 1689 AD02841-AS u*Af*ucuaCfuuguGfuUfaCfagc*a*g 1753
AD02842 AD02842-SS (GLS-15*)g*guaacacAfaGfuAfgaugccu*a*(invab) 1690 AD02842-AS u*Af*ggCfa(uUNA)cuacUfuGfuGfuua*c*c 1754
AD02843 AD02843-SS (GLS-15*)g*acacaagUfaGfaUfgccugaa*a*(invab) 1691 AD02843-AS u*Uf*ucAfg(gUNA)caucUfaCfuUfgug*u*c 1755
AD02844 AD02844-SS (GLS-15*)g*cacaaguAfgAfuGfccugaac*a*(invab) 1692 AD02844-AS u*Gf*uuCfa(gUNA)gcauCfuAfcUfugu*g*c 1756
AD02845 AD02845-SS (GLS-15*)g*ugccugaAfcUfuGfaauuaau*a*(invab) 1693 AD02845-AS u*Af*uuaaUfucaaGfuUfcAfggc*a*c 1757
AD02846 AD02846-SS (GLS-15*)g*gccugaaCfuUfgAfauuaauc*a*(invab) 1694 AD02846-AS u*Gf*auuaAfuucaAfgUfuCfagg*c*c 1758
AD02847 AD02847-SS (GLS-15*)g*cugaacuUfgAfaUfuaaucca*a*(invab) 1695 AD02847-AS u*Uf*ggauUfaauuCfaAfgUfuca*g*c 1759
AD02848 AD02848-SS (GLS-15*)g*cacaucaGfuAfaUfguauucu*a*(invab) 1696 AD02848-AS u*Af*gaauAfcauuAfcUfgAfugu*g*c 1760
AD02849 AD02849-SS (GLS-15*)g*ucucucuUfuAfcAfuuuuggu*a*(invab) 1697 AD02849-AS u*Af*ccaaAfauguAfaAfgAfgag*a*c 1761
AD02850 AD02850-SS (GLS-15*)g*ucucuuuAfcAfuUfuuggucu*a*(invab) 1698 AD02850-AS u*Af*gaCfc(aUNA)aaauGfuAfaAfgag*a*c 1762
AD02851 AD02851-SS (GLS-15*)g*cuuuacaUfuUfuGfgucucua*a*(invab) 1699 AD02851-AS u*Uf*agagAfccaaAfaUfgUfaaa*g*c 1763
AD02852 AD02852-SS (GLS-15*)g*uuaauggGfuUfuUfguguacu*a*(invab) 1700 AD02852-AS u*Af*guacAfcaaaAfcCfcAfuua*a*c 1764
AD02853 AD02853-SS (GLS-15*)g*uggguuuUfgUfgUfacuguaa*a*(invab) 1701 AD02853-AS u*Uf*uacaGfuacaCfaAfaAfccc*a*c 1765
AD02854 AD02854-SS (GLS-15*)c*uuuugugUfaCfuGfuaaagaa*a*(invab) 1702 AD02854-AS u*Uf*ucuuUfacagUfaCfaCfaaa*a*g 1766
AD02855 AD02855-SS (GLS-15*)g*uuuguguAfcUfgUfaaagaau*a*(invab) 1703 AD02855-AS u*Af*uucuUfuacaGfuAfcAfcaa*a*c 1767
AD02856 AD02856-SS (GLS-15*)g*uuguguaCfuGfuAfaagaauu*a*(invab) 1704 AD02856-AS u*Af*auUfc(uUNA)uuacAfgUfaCfaca*a*c 1768
AD02857 AD02857-SS (GLS-15*)c*auucucuCfcUfgAfuuauuua*a*(invab) 1705 AD02857-AS u*Uf*aaauAfaucaGfgAfgAfgaa*u*g 1769
AD02858 AD02858-SS (GLS-15*)g*cucuccuGfaUfuAfuuuauca*a*(invab) 1706 AD02858-AS u*Uf*gaUfa(aUNA)auaaUfcAfgGfaga*g*c 1770
AD02859 AD02859-SS (GLS-15*)g*uccugauUfaUfuUfaucacau*a*(invab) 1707 AD02859-AS u*Af*ugUfg(aUNA)uaaaUfaAfuCfagg*a*c 1771
AD02860 AD02860-SS (GLS-15*)c*uuccgagGfgGfuAfgaguuug*a*(invab) 1708 AD02860-AS u*Cf*aaacUfcuacCfcCfuCfgga*a*g 1772
AD02861 AD02861-SS (GLS-15*)g*aagugacAfaUfgUfggauucu*a*(invab) 1709 AD02861-AS u*Af*gaauCfcacaUfuGfuCfacu*u*c 1773
AD02862 AD02862-SS (GLS-15*)c*ugaagacAfaAfgUfaguagaa*a*(invab) 1710 AD02862-AS u*Uf*ucuaCfuacuUfuGfuCfuuc*a*g 1774
AD02863 AD02863-SS (GLS-15*)c*auucaggAfuGfaAfguugaug*a*(invab) 1711 AD02863-AS u*Cf*aucaAfcuucAfuCfcUfgaa*u*g 1775
AD02864 AD02864-SS (GLS-15*)g*gagcaaaAfcUfaUfucagaug*a*(invab) 1712 AD02864-AS u*Cf*aucuGfaauaGfuUfuUfgcu*c*c 1776
AD02865 AD02865-SS (GLS-15*)c*gaggagaUfcUfcUfgaaguga*a*(invab) 1713 AD02865-AS u*Uf*cacuUfcagaGfaUfcUfccu*c*g 1777
AD02866 AD02866-SS (GLS-15*)c*aaaauccAfaCfcUfacaaguu*a*(invab) 1714 AD02866-AS u*Af*acuuGfuaggUfuGfgAfuuu*u*g 1778
在本發明的某些實施例中，dsRNA（本文中也稱為“雙鏈體”）是表 1-3 之一中公開的 dsRNA。表 1-3 中的每一行都公開了包含該表行中的有義鏈序列和反義鏈序列的雙鏈體。除了表 1-3 中公開的雙鏈體之外，應理解的是，在一些實施例中，本發明的雙鏈體可以包括表 1-3 中所示的有義和反義序列，這些序列與表 1-3 中所示的序列相差零個、一個、兩個或三個核苷酸。因此，作為非限制性實例，在一些實施例中，本發明的雙鏈體中的反義鏈可以是SEQ ID NO：1605、1606、1607、1608、1609、1610、1611或1612，或者分別與SEQ ID NO：1605、1606、1607、1608、1609、1610、1611或1612中的核苷酸有零個、一個、兩個或三個不同的核苷酸。
應理解，本發明的雙鏈中的有義鏈序列和反義鏈序列可以獨立選擇。因此，本發明的 dsRNA 可以包括表 1-3 中一行中公開的雙鏈的有義鏈和反義鏈。或者，在本發明的 dsRNA 中，dsRNA 中所選的有義鏈和反義鏈中的一條或兩條可以包括表 1-3 中所示的序列，但有義鏈和反義鏈中的一條或兩條包括來自親本序列的 1、2、3 或更多個核鹼基取代。在一些實施例中，所選序列可以比其親本序列更長或更短。因此，本發明包括的 dsRNA 劑可以但不必包括表 1-3 中作為雙鏈公開的有義鏈和反義鏈對的精確序列。
在一些實施例中，dsRNA 劑包含有義鏈和反義鏈，反義鏈中的核苷酸位置 2 至 18 包含與 APP RNA 轉錄本互補的區域，其中互補區域包含至少 15 個連續核苷酸，這些核苷酸與表 1-3 之一中列出的反義序列之一相差 0、1、2 或 3 個核苷酸，並且任選包含靶向配體。在一些情況下，與 APP RNA 轉錄本互補的區域包含至少 15、16、17、18 或 19 個連續核苷酸，這些核苷酸與表 1-3 之一中列出的反義序列之一相差不超過 3 個核苷酸。在本發明的 dsRNA 劑的一些實施例中，dsRNA 的反義鏈至少基本與 SEQ ID NO: 1 的靶區域中的任一個互補，並在表 1-3 的任一個中提供。在一些實施例中，本發明的 dsRNA 劑的反義鏈與 SEQ ID NO: 1 的靶區域中的任一個完全互補，並在表1-3的任一個中提供。在一些實施例中，dsRNA 劑包括表1-3的任一個中列出的有義鏈序列，並且有義鏈序列至少基本與 dsRNA 劑中的反義鏈序列互補。在其它實施例中，本發明的 dsRNA 劑包括表 1-3 的任一個中列出的有義鏈序列，並且有義鏈序列與 dsRNA 劑中的反義鏈序列完全互補。在某些情況下，本發明的 dsRNA 劑包含表 1-3 中任一個所示的反義鏈序列。本發明的 dsRNA 劑的一些實施例包含表1-3 中任一個中公開為雙鏈體的有義和反義序列。如本文所述，應理解，本發明的雙鏈體中的有義和反義鏈可以獨立地被選擇。 錯配
本領域技術人員已知，dsRNA 中的錯配對於功效而言是可以容忍的，尤其是 dsRNA 末端區域的錯配。某些錯配的容忍度更高，例如擺動鹼基對 G:U 和 A:C 的錯配對於功效而言是可以容忍的（Du et el., A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites. Nucleic Acids Res. 2005 Mar 21;33(5):1671-7. Doi: 10.1093/nar/gki312. Nucleic Acids Res. 2005;33(11):3698）。在本發明的方法和化合物的一些實施例中，APP dsRNA 劑可能包含一個或多個與 APP 靶序列的錯配。在一些實施例中，本發明的APP dsRNA 劑不包括錯配。在某些實施例中，本發明的 APP dsRNA 劑包含不超過 1 個錯配。在一些實施例中，本發明的 APP dsRNA 劑包含不超過 2 個錯配。在某些實施例中，本發明的 APP dsRNA 劑包含不超過 3 個錯配。在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑的反義鏈包含與 APP 靶序列的錯配，這些錯配不位於互補區域的中心。在一些實施例中，APP dsRNA 劑的反義鏈包含 1、2、3、4 或更多個錯配，這些錯配位於互補區域的 5' 或 3' 端之一或兩者的最後 5、4、3、2 或 1 個核苷酸內。本文所述方法和/或本領域已知的方法可用於確定包含與 APP 靶序列錯配的 APP dsRNA 劑是否有效抑制 APP 基因的表達。 互補性
如本文所用，除非另有說明，術語“互補”在用於描述第一核苷酸序列(例如，APP dsRNA劑有義鏈或靶向APP mRNA)相對於第二核苷酸序列(例如，APP dsRNA劑反義鏈或單鏈反義多核苷酸)時，是指包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交[在哺乳動物生理條件下(或 體外類似條件下)形成鹼基對氫鍵]並在某些條件下形成雙鏈或雙螺旋結構的能力。可以應用其他條件，例如可能在生物體內遇到的生理相關條件。技術人員將能夠根據雜交核苷酸的最終應用確定最適合測試兩個序列互補性的條件集。互補序列包括沃森-克裡克鹼基對或非沃森-克裡克鹼基對，包括天然或修飾的核苷酸或核苷酸模擬物，至少在滿足上述雜交要求的範圍內。序列同一性或互補性與修飾無關。
互補序列，例如，在本文所述的 APP dsRNA 內，包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列的整個長度上的鹼基配對。本文中，此類序列可稱為彼此“完全互補”。應理解，在實施例中，當兩個寡核苷酸被設計為在雜交時形成一個或多個單鏈突出端時，此類突出端在本文的互補性確定方面不被視為錯配。例如，包含一個長度為 19 個核苷酸的寡核苷酸和另一個長度為 20 個核苷酸的寡核苷酸的 APP dsRNA 劑，其中較長的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補的 19 個核苷酸的序列，但出於本文所述目的，仍可稱為“完全互補”。因此，本文所用的“完全互補”是指第一個多核苷酸的連續序列中的所有鹼基（100%）將與第二個多核苷酸的連續序列中相同數量的鹼基雜交。連續序列可以包括第一個或第二個核苷酸序列的全部或部分。
本文所用的術語“基本上互補”是指在雜交的核鹼基序列對中，第一個多核苷酸的連續序列中至少約 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% (但不是全部) 的鹼基將與第二個多核苷酸的連續序列中相同數量的鹼基雜交。術語“基本上互補”可用於指第一序列相對於第二序列如果兩個序列在雜交形成多達 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個鹼基對 (bp) 的雙鏈體時包括一個或多個錯配的鹼基對，例如至少 1、2、3、4 或 5 個錯配的鹼基對，同時保持在與其最終應用最相關的條件下雜交的能力，例如，通過 RISC 途徑抑制 APP 基因表達。
術語“部分互補”在本文中可用於指雜交的核鹼基序列對，其中第一多核苷酸的連續序列中至少 75%（但不是全部）的鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中相同數量的鹼基雜交。在一些實施例中，“部分互補”是指第一多核苷酸的連續序列中至少 76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%的鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中相同數量的鹼基雜交。
本文使用的術語“互補”、“完全互補”、“基本互補”和“部分互補”是指 APP dsRNA 劑的正鏈和反義鏈之間、APP dsRNA 劑的反義鏈與靶 APP mRNA 序列之間或單鏈反義寡核苷酸與靶 APP mRNA 序列之間的鹼基匹配。應理解，術語“APP dsRNA 劑的反義鏈”可以指“APP 反義多核苷酸劑”的相同序列。
如本文所用，術語“基本相同”或“基本同一性”用於指代核酸序列時，是指包含與參考序列相比具有至少約 85％或更多序列同一性的序列的核酸序列，優選至少 90％、至少 91％、至少 92％、至少 93％、至少 94％、至少 95％、至少 96％、至少 97％、至少 98％或至少 99％的序列。通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列來確定序列同一性百分比。通過確定兩個序列中出現相同核酸鹼基的位置數以得出匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗口中的總位置數，並將結果乘以 100 以得出序列同一性百分比來計算百分比。本文所公開的發明涵蓋與本文（例如，在表 1-3 中）所公開的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。在一些實施例中，本文公開的序列與本文（例如表 1-3）公開的序列完全相同，或至少約 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。
本文所用的術語“包含序列的鏈”是指包含核苷酸鏈的寡核苷酸，該核苷酸鏈由使用標準核苷酸命名法所指的序列描述。本文所用的術語“雙鏈 RNA”或“dsRNA”是指包括具有雜交雙鏈區域的 RNA 分子或分子複合物的 RNAi，該雜交雙鏈區域包含兩個反向平行且基本上或完全互補的核酸鏈，其相對於靶APP RNA具有“有義”和“反義”方向。雙鏈區域可以是任何長度，只要允許通過 RISC 途徑特異性降解所需的靶 APP RNA，但通常長度範圍為 9 至 30 個鹼基對，例如長度為 15-30 個鹼基對。考慮到 9 至 30 個鹼基對之間的雙鏈體，該雙鏈體的長度可在該範圍內，例如，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30，以及其間的任何子範圍，包括但不限於，15-30個鹼基對、15-26個鹼基對、15-23個鹼基對、15-22個鹼基對、15-21個鹼基對、15-20個鹼基對、15-19個鹼基對、15-18個鹼基對、15-17個鹼基對、18-30個鹼基對、18-26個鹼基對、18-23個鹼基對、18-22個鹼基對、18-30個鹼基對、18-26個鹼基對、18-23個鹼基對、鹼基對、18-21鹼基對、18-20鹼基對、19-30鹼基對、19-26鹼基對、19-23鹼基對、19-22鹼基對、19-21鹼基對、19-20鹼基對、20-30鹼基對、20-26鹼基對、20-25鹼基對、20-24鹼基對、20-23鹼基對、20-22鹼基對、20-21鹼基對、21-30鹼基對、21-26鹼基對、21-25鹼基對、21-24鹼基對、21-23鹼基對或21-22鹼基對。通過用Dicer和類似酶加工在細胞中產生的APP dsRNA劑的長度通常在19-22鹼基對的範圍內。 APP dsDNA 劑的雙鏈區中的一條鏈包含與靶 APP RNA 的區域基本互補的序列。形成雙鏈結構的兩條鏈可來自具有至少一個自互補區域的單個 RNA 分子，或者可由兩個或更多個單獨的 RNA 分子形成。當雙鏈區由單個分子的兩條鏈形成時，該分子可具有由一條鏈的 3' 端和形成雙鏈結構的另一條鏈的 5' 端之間的單鏈核苷酸鏈（本文稱為“髮夾環”）隔開的雙鏈區。在本發明的一些實施例中，髮夾結構包含至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更多個未配對核苷酸。當 APP dsRNA 劑的兩條基本上互補的鏈由單獨的 RNA 分子組成時，這些分子不需要但可以共價連接。當兩條鏈通過髮夾環以外的方式共價連接時，連接結構稱為“接頭”。術語“siRNA ”也用於本文中指本文所述的 dsRNA 劑。
在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑可以包括在 dsRNA 劑的一端或兩端不具有未配對核苷酸或核苷酸類似物的有義和反義序列。沒有未配對核苷酸的末端稱為“平端”，並且沒有核苷酸突出。如果dsRNA劑的兩端都是平端，則dsRNA被稱為“平端”。在本發明的一些實施例中，dsRNA 劑的第一端是平端，在一些實施例中，dsRNA 劑的第二端是平端，並且在本發明的某些實施例中，APP dsRNA 劑的兩端都是平端。
在本發明的 dsRNA 試劑的一些實施例中，dsRNA 沒有一個或兩個平端。在這種情況下，dsRNA 試劑鏈的末端至少有一個未配對的核苷酸。例如，當dsRNA一條鏈的 3' 端延伸到另一條鏈的 5' 端之外，或反之亦然時，存在核苷酸突出端。dsRNA可以包含至少 1、2、3、4、5、6 或更多個核苷酸的突出端。核苷酸突出端可以包含或由核苷酸/核苷類似物（包括脫氧核苷酸/核苷）組成。應理解，在一些實施例中，核苷酸突出端位於dsRNA試劑的有義鏈上、dsRNA試劑的反義鏈上或dsRNA試劑的兩端，並且突出端的核苷酸可存在於dsRNA反義鏈或有義鏈的5'端、3'端或兩端。在本發明的某些實施例中，突出端中的一個或多個核苷酸被核苷硫代磷酸酯取代。
本文所用的術語“反義鏈”或“引導鏈”是指 APP dsRNA 劑的鏈，該鏈包括與 APP 靶序列基本互補的區域。本文所用的術語“有義鏈”或“過客鏈”是指 APP dsRNA 劑的鏈，該鏈包括與APP dsRNA 劑的反義鏈區域基本互補的區域。 修飾
在本發明的一些實施例中，APP RNAi劑的 RNA 經過化學修飾以增強穩定性和/或一種或多種其他有益特性。本發明的某些實施例中的核酸可通過本領域中已充分確立的方法合成和/或修飾，例如，在“Current protocols in Nucleic Acid Chemistry," Beaucage, S. L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA中所述，其通過引用併入本文。本發明的 APP dsRNA 劑的某些實施例中可存在的修飾包括，例如，(a)末端修飾，例如，5'末端修飾（磷酸化、綴合、反向連接等）3'末端修飾（綴合、DNA核苷酸、反向連接等），(b)鹼基修飾，例如，用穩定鹼基、不穩定鹼基或與擴展的配對物庫鹼基配對的鹼基替換、去除鹼基（無鹼基核苷酸）或結合鹼基，(c) 糖修飾（例如在 2' 位或 4' 位）或糖替換，以及 (d) 主鏈修飾，包括修飾或替換磷酸二酯鍵。可用於本發明的 APP dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和 APP 有義多核苷酸的某些實施例中的 RNA 化合物的具體例子包括但不限於包含修飾的主鏈或無天然核苷間鍵的 RNA。作為非限制性例子，具有修飾的主鏈的 RNA 可能在主鏈中不具有磷原子。在核苷間主鏈中不具有磷原子的 RNA 可稱為寡核苷。在本發明的某些實施例中，修飾的 RNA 在其核苷間主鏈中具有磷原子。
應理解的是，術語“RNA分子”或“RNA”或“核糖核酸分子”不僅涵蓋自然界中表達或發現的RNA分子，還包括包含一種或多種本文所述或本領域已知的核糖核苷酸/核糖核苷類似物或衍生物的RNA類似物和衍生物。術語“核糖核苷”和“核糖核苷酸”在本文中可互換使用。RNA分子可在核鹼基結構或核糖-磷酸骨架結構中進行修飾，例如如下所述，並且包含核糖核苷類似物或衍生物的分子必須保留形成雙鏈的能力。作為非限制性例子，RNA分子還可以包括至少一種修飾的核糖核苷，包括但不限於2'-O-甲基修飾的核苷、包含5'硫代磷酸酯基團的核苷、連接到膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團的末端核苷、鎖定核苷、無鹼基核苷、2'-脫氧-2'-氟修飾的核苷、2'-氨基修飾的核苷、2'-烷基修飾的核苷、嗎啉代核苷、氨基磷酸酯或包含非天然鹼基的核苷，或其任意組合。在本發明的一些實施例中，RNA 分子包含至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個或最多全長的 APP dsRNA 劑分子的核糖核苷，這些核糖核苷是修飾的核糖核苷。RNA 分子中這些多個修飾的核糖核苷中的每一個的修飾不必相同。
本發明的 dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸在一些實施例中可包含一個或多個獨立選擇的修飾核苷酸和/或一個或多個獨立選擇的非磷酸二酯鍵。本文所用的術語“核苷酸間鍵”、“核苷間鍵”、“鍵”、“骨架鍵”和“接頭”可互換使用，是指本發明的 dsRNA 骨架中的連接基團，其可具體指寡核苷酸鏈中未修飾或修飾核苷之間的鍵、和/或未修飾或修飾核苷與一個或多個殘基之間的鍵、和/或未修飾或修飾核苷與一個或多個靶向基團之間的鍵。在一些實施例中，所述連接可獨立地選自單鏈或雙鏈寡核苷酸的任意位置上的二核苷酸的磷酸二酯(PO)連接、硫代磷酸酯(PS)連接和/或二硫代磷酸酯(PS2)連接。本文中，關於選定元件(例如修飾的核苷酸、非磷酸二酯連接等)使用的術語“獨立地選定”是指兩個或多個選定元件可以但不必彼此相同。
如本文所用，“核苷酸鹼基”、“核苷酸”或“核鹼基”是雜環嘧啶或嘌呤化合物，是所有核酸的標準成分，包括形成核苷酸腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的鹼基。核鹼基可進一步修飾以包括（但不限於）：通用鹼基、疏水性鹼基、混雜鹼基、尺寸擴大的鹼基和氟化鹼基。術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”可在本文中用於指未修飾的核苷酸、修飾的核苷酸、核苷酸類似物、或替代取代部分。本領域技術人員將認識到，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可被其他部分取代，而不會顯著改變包含帶有此類替代部分的核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對特性。
如本文所用，“任選地”或“可選地”表示其後描述的事件或環境可以但不一定發生，包括該事件或環境發生或不發生的情況。例如，“C1-6烷基任選地被鹵素或氰基取代”表示鹵素或氰基可以但不一定存在，包括烷基被鹵素或氰基取代的情況和烷基不被鹵素和氰基取代的情況。
如本文所用，在本發明公開的化合物的化學結構中，鍵 表示未指定的構型，即如果化學結構中存在手性異構體，則鍵 可以是 “ ” 或 “ ” ，或者可以是 “ ” 和 “ ”兩種構型。儘管為了簡單起見，上述一些結構式被描繪為一些異構形式，但本發明可以包括所有異構體，例如互變異構體、旋轉異構體及其混合物。合適的手性化合物包括：幾何異構體、非對映異構體、外消旋體和對映異構體。
如本文所用，本發明公開內容的化學式中使用的" "或" "可以根據本文所述的發明範圍連接至任何一個或多個基團。
在一個實施例中，考慮用於本文所述方法和組合物的修飾 RNA 是肽核酸 (PNA)，其具有形成所需雙鏈結構的能力並且允許或介導靶 RNA 通過 RISC 途徑進行特異性降解。在本發明的某些實施例中，APP RNA 干擾劑包括與靶 APP RNA 序列相互作用以指導靶 APP RNA 切割的單鏈 RNA。
修飾的 RNA 主鏈可包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯（包括 3'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯）、亞膦酸酯、氨基磷酸酯（包括 3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯）、硫代磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常 3'-5' 鍵的硼磷酸酯、這類的 2'-5' 連接類似物、以及具有反轉極性的硼磷酸酯，其中相鄰的核苷單元對以 3'-5' 至 5'-3' 或 2'-5' 至 5'-2' 連接。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。製備含磷鍵的方法是本領域的常規做法，並且此類方法可以用於製備本發明的某些修飾的 APP dsRNA 劑、某些修飾的 APP 反義多核苷酸、和/或某些修飾的 APP 有義多核苷酸。
不含磷原子的修飾 RNA 主鏈具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成的主鏈。這些包括具有嗎啉鍵（部分由核苷的糖部分形成）的主鏈；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸和碸主鏈；甲醯和硫代甲醯主鏈；亞甲基甲醯和硫代甲醯主鏈；含烯烴主鏈；氨基磺酸鹽主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸鹽和磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；以及具有混合N、O、S 和 CH 2組成部分的其他主鏈。製備不包括磷原子的修飾 RNA 主鏈的方法是本領域的常規做法，並且此類方法可以用於製備本發明的某些修飾 APP dsRNA 劑、某些修飾 APP 反義多核苷酸、和/或某些修飾 APP 有義多核苷酸。
在本發明的某些實施例中，RNA 模擬物包括在 APP dsRNA、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸中，例如但不限於：用新基團替換核苷酸單元的糖和核苷間鍵，即主鏈。在此類實施例中，鹼基單元被保留以與適當的 APP 核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物，即已顯示具有優異雜交特性的 RNA 模擬物，被稱為肽核酸 (PNA)。在 PNA 化合物中，RNA 的糖主鏈被替換為含醯胺的主鏈，特別是氨基乙基甘氨酸主鏈。核鹼基被保留並直接或間接地與主鏈醯胺部分的氮雜氮原子結合。製備 RNA 模擬物的方法在本領域中是常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的 APP dsRNA 劑。
本發明的一些實施例包括具有硫代磷酸酯骨架的RNA和具有雜原子骨架的寡核苷，特別是-CH 2-NH-CH 2-、-CH 2-N(CH 3)-O-CH 2-[稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架]、-CH 2-ON(CH 3)-CH 2-、-CH 2-N(CH 3)-N(CH 3)-CH 2-和-N(CH 3)-CH 2-[其中天然磷酸二酯骨架表示為-O-P-O-CH 2-]。製備具有硫代磷酸酯骨架的RNAs和具有雜原子骨架的寡核苷的方法在本領域中是常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些經修飾的APPdsRNA劑、某些APP反義多核苷酸和/或某些APP有義多核苷酸。
經修飾的RNA還可含有一個或多個取代的糖部分。本發明的APP dsRNA、APP反義多核苷酸和/或APP有義多核苷酸可在2'位置包含下列之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可為取代或未取代的C 1至C 10烷基或C 2至C 10烯基和炔基。示例性的合適修飾包括O[(CH 2) nO] mCH 3、O(CH 2) nOCH 3、O(CH 2) nNH 2、O(CH 2) nCH 3、O(CH 2) nONH 2和O(CH 2) nON[(CH 2) nCH 3)] 2，其中n和m為1至約10。在其他實施例中，dsRNA在2'位置包括以下之一：C 1至C 10低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH 3、OCN、Cl、Br、CN、CF 3、OCF 3、SOCH 3、SO 2CH 3、ONO 2、NO 2、N 3、NH 2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的矽基、RNA切割基團、報告基團、嵌入劑、用於改善 APP dsRNA 藥劑的藥代動力學性質的基團、或用於改善 APP dsRNA 藥劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸的藥效學性質的基團，以及具有類似性質的其他取代基。在一些實施例中，修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH 2CH 2OCH 3，也稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)( Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)，即烷氧基-烷氧基。另一種示例性修飾是2'-二甲基氨基氧乙氧基，即O(CH 2) 2ON(CH 3) 2基團，也稱為2'-DMAOE，如下文實施例中所述，以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基（在本領域中也稱為2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE），即2'-O-CH 2-O-CH 2-N(CH 2) 2。製備所述修飾RNA的方法在本領域中是常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾 APP dsRNA 劑。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH 3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH 2CH 2CH 2NH 2)和2'-氟(2'-F)。還可在本發明的APP dsRNA劑、APP反義多核苷酸和/或APP有義多核苷酸的RNA上的其他位置進行類似修飾，特別是3'末端核苷酸上或2'-5'連接的APP dsRNA、APP反義多核苷酸或APP有義多核苷酸中的糖的3'位置，以及5'末端核苷酸的5'位置。APP dsRNA劑、APP反義多核苷酸和/或APP有義多核苷酸還可具有糖模擬物，例如用環丁基部分代替戊呋喃糖基糖。製備修飾的RNA(例如所描述的那些)的方法是本領域的常規實踐，並且此類方法可以用於製備本發明的某些修飾的APP dsRNA劑、APP反義多核苷酸、和/或APP有義多核苷酸。
在一些實施例中，APP dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸可以包括核鹼基（在本領域中通常簡稱為“鹼基”）修飾或取代。如本文所用，“未修飾”或“天然”核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤和鳥嘌呤，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。修飾的核鹼基包括其它合成和天然核鹼基，例如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶和胞嘧啶、5-炔丙基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵素、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵素(特別是5-溴)、 5-三氟甲基和其他 5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和 7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和 8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和 7-脫氮腺嘌呤以及 3-脫氮鳥嘌呤和 3-脫氮腺嘌呤。本領域已知可包含在本發明的 APP dsRNA 劑的某些實施例中的其它核鹼基，參見例如：Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. Ed. Wiley-VCH, 2008; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, Ed. John Wiley & Sons, 1990, English et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993。製備包含核鹼基修飾和/或取代（例如本文描述的那些）的 dsRNA、APP 反義鏈多核苷酸和/或 APP 有義鏈多核苷酸的方法在本領域中是常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的 APP dsRNA 劑、APP 有義多核苷酸和/或 APP 反義多核苷酸。
本發明的 APP dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸的某些實施例包括經修飾以包含一個或多個鎖定核酸 (LNA) 的 RNA。鎖定核酸是具有經修飾的核糖部分的核苷酸，該部分包含連接 2' 和 4' 碳的額外橋。該結構有效地將核糖“鎖定”在 3'-內結構構象中。在本發明的 APP dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸中添加鎖核酸可增加血清中的穩定性，並減少脫靶效應 (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, O R. et al., (2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。製備包含鎖核酸的 dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸的方法是本領域常規實踐的，並且此類方法可用於製備本發明的某些修飾的 APP dsRNA 劑。
本發明的APPdsRNA化合物、有義多核苷酸和/或反義多核苷酸的某些實施例包括至少一種修飾的核苷酸，其中所述至少一種修飾的核苷酸包括：2’-O-甲基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脫氧核苷酸、2’3’-seco核苷酸模擬物、鎖定核苷酸、2’-F-阿拉伯糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸和3’-OMe核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團的核苷酸、包含乙烯基膦酸酯的核苷酸、包含腺苷-乙二醇核酸（GNA）的核苷酸、包含胸苷-乙二醇核酸（GNA）S-異構體的核苷酸、包含2-羥甲基-四氫呋喃-5-磷酸的核苷酸、包含2’-脫氧胸苷-3’-磷酸的核苷酸、包含2’-脫氧鳥苷-3’-磷酸的核苷酸、包含2’-脫氧腺苷-3’-磷酸、包含2’-脫氧胞苷-3’-磷酸的核苷酸、包含2’-脫氧尿苷-3’-磷酸的核苷酸、或與膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、磷醯胺或包含非天然鹼基的核苷酸。在一些實施例中，APP dsRNA化合物在反義鏈的5΄-端包括E-乙烯基膦酸酯核苷酸，本文中也稱為引導鏈。
本發明的APP dsRNA化合物、有義多核苷酸的3'和5'端和/或反義多核苷酸的3'端的某些實施例包括至少一種修飾的核苷酸，其中所述至少一種修飾的核苷酸包括：無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、反向2'-OMe核苷酸、反向2'-脫氧核苷酸。本領域技術人員已知，在寡核苷酸末端包括無鹼基或反向無鹼基核苷酸可增強穩定性（Czauderna et al. Structural variations and stabilizing modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2003;31(11):2705-2716. doi:10.1093/nar/gkg393）。在一些實施例中，APP dsRNA 化合物在 3' 端或 5' 端，或 3' 端和 5' 端均包含一個或多個反向無鹼基殘基 (invab)。示例性的反向無鹼基殘基 (invab) 包括但不限於以下： 。
本發明的 APP dsRNA 化合物、有義多核苷酸的 3' 和 5' 端和/或反義多核苷酸的 3' 端的某些實施例包括至少一種修飾的核苷酸，其中所述至少一種修飾的核苷酸包括：異甘露醇核苷酸或所述異甘露醇核苷酸的立體異構體。異甘露醇核苷酸或所述異甘露醇核苷酸的立體異構體的具體實例包括但不限於： , , , , , , , ， , , 和 ，其中短語 “Olig”各自獨立地表示多核苷酸部分。示例性的異甘露醇殘基（imann）包括但不限於以下： 或者 。
在某些實施例中，異甘露醇核苷酸可以進一步綴合至一個或多個靶向基團或遞送分子，例如GalNAc部分。
本發明的反義多核苷酸APP dsRNA化合物的某些實施例包括至少一個修飾的核苷酸，其中所述至少一個修飾的核苷酸包括解鎖的核酸核苷酸(UNA)或/和乙二醇核酸核苷酸(GNA)。本領域技術人員已知，UNA和GNA是熱不穩定化學修飾，可以顯著改善siRNA化合物的脫靶特性(Janas等人，Selection of GalNAc-coupled siRNAs with limited off-target-driven rat hepatotoxicity. Nat Commun. 2018;9(1):723. doi:10.1038/s41467-018-02989-4; Laursen等人，Utilization of unlockednucleic acid (UNA) to boost siRNA performance in vitro and in vivo. Mol BioSyst. 2010;6:862–70)。
APP dsRNA 劑的某些實施例包括至少一個親脂性部分，其包括例如但不限於飽和或不飽和 C 16烴鏈（例如，線性 C16 烷基或烯基）。本申請提供了包括在dsRNA劑的任何位置中的親脂性部分。在一些實施例中，親脂性部分與雙鏈iRNA劑的核鹼基、糖部分或核苷間鍵結合。例如，C 16部分可以通過核糖核苷酸的2'-氧結合，如以下結構所示： 。
如本文所用，“親脂性”或“親脂性部分”廣義上指對脂質具有親和力的任何化合物或化學部分。表徵親脂性部分的親脂性的一種方法是通過辛醇-水分配係數logKow，其中Kow是平衡狀態下兩相系統中辛醇相中化學物質濃度與其水相中濃度之比。辛醇-水分配係數是物質的實驗室測量屬性。但是，也可以通過使用歸因於化學物質結構成分的係數來預測，這些係數是使用第一原理或經驗方法計算的（參見，例如，Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci.41:1407-21 (2001)，其通過引用整體併入本文）。它提供了一種熱力學測量方法，用於衡量物質傾向於非水或油性環境而非水（即其親水/親脂平衡）的傾向。原則上，當化學物質的 logKow 超過 0 時，該物質具有親脂性。
本發明的 APP dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸的某些實施例的 RNA 中可能包括的另一種修飾包括將一種或多種配體、部分或綴合物化學連接到 RNA，所述配體、部分或綴合物分別增強 APP dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸的一種或多種特性。可以增強的特性的非限制性示例是：APP dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸活性、細胞分佈、APP dsRNA 劑的遞送、APP dsRNA 劑的藥代動力學特性以及 APP dsRNA 劑的細胞攝取。在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑包含一個或多個靶向基團或連接基團，其在本發明的 APP dsRNA 劑的某些實施例中與有義鏈綴合。靶向基團的非限制性示例是包含 N-乙醯半乳糖胺 ( GalNAc)的化合物。術語“靶向基團”、“靶向劑”、“連接劑”、“靶向化合物”、“遞送分子”、“遞送化合物”和“靶向配體”在本文中可互換使用。在本發明的某些實施例中，APP dsRNA 劑包含與有義鏈 5'末端綴合的靶向化合物。在本發明的某些實施例中，APP dsRNA 劑包含與有義鏈 3'末端綴合的靶向化合物。在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑包含含有GalNAc 的靶向基團。在本發明的一些實施方案中，APP dsRNA 劑包含含有親脂性部分的靶向基團。在本發明的某些實施例中，APP dsRNA 劑不包括連接到有義鏈 3' 末端和 5' 末端之一端或兩端的靶向化合物。在本發明的某些實施例中，APP dsRNA 劑不包括連接到有義鏈 3' 末端和 5' 末端之一端或兩端的含有 GalNAc 的靶向化合物。
其它靶向劑和連接劑是本領域所熟知的，例如，可用於本發明某些實施例的靶向劑和連接劑包括但不限於脂質部分，例如膽固醇部分(Letsinger 等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86:6553-6556)、膽酸(Manoharan 等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4:1053-1060)、硫醚，例如，beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan 等，Ann.NY Acad.Sci.，1992，660:306-309 ；Manoharan 等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3:2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser此類多肽包括但不限於：多肽鏈，例如，十六烷基-異戊基-1，2-二羥基-2，3-二酮或十六烷基-2-酮殘基(Saison-Behmoaras 等，EMBO J，1991，10：1111-1118；Kabanov 等，FEBS Lett.，1990，259：327-330；Svinarchuk 等，Biochimie，1993，75：49-54)；多肽鏈，例如，十六烷基-異戊基-1，2-二-O-十六烷基-異戊基-1，2-二羥基-2，3-二酮或十六烷基-2-酮-3-磷酸三乙基銨(Manoharan 等，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651-3654；Shea 等，J. Mol. Biol. 2009，37：4771-4776)；以及多肽鏈，例如，十六烷基-異戊基-1，2-二-O-十六烷基-異戊基-1，2-二羥基-2，3-二酮或十六烷基-2-酮-3-磷酸三乙基銨(Steinrich 等，J. Mol. Biol. 2009，37：4771-4776)。此類多肽包括但不限於:環己烷(Manoharan et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al., Nucleosides&Nucleotides, 1995, 14:969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)、或十八胺或己氨基羰基氧膽固醇部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)。
包含 APP dsRNA 劑、APP 反義多核苷酸和/或 APP 有義多核苷酸的組合物的某些實施例可包含改變 APP dsRNA 劑的分佈、靶向等的配體。在包含本發明的 APP dsRNA 劑的組合物的一些實施例中，與不存在此類配體的物種相比，配體增加對選定靶標（例如分子、細胞或細胞類型、隔室（例如細胞或器官隔室）、組織、器官或身體區域）的親和力。可用於本發明的組合物和/或方法的配體可以是天然存在的物質，例如蛋白質（例如人血清白蛋白 (HSA)、低密度脂蛋白 (LDL) 或球蛋白）；碳水化合物（例如葡聚糖、普魯蘭多糖、幾丁質、殼聚糖、菊粉、環糊精或透明質酸）；或脂質。配體也可以是重組或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸或聚胺。聚氨基酸的例子是聚賴氨酸 (PLL)、聚 L-天冬氨酸、聚 L-谷氨酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙醇酸)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物 (HMPA)、聚乙二醇 (PEG)、聚乙烯醇 (PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪。多胺的例子包括：聚乙烯亞胺、聚賴氨酸 (PLL)、精胺、亞精胺、多胺、假肽多胺、肽模擬物多胺、樹枝狀多胺、精氨酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、多胺的季鹽或α螺旋肽。
本發明的組合物和/或方法中包含的配體可以包含靶向基團，其非限制性實例是細胞或組織靶向劑，例如凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如與特定細胞類型（例如 CNS 細胞或腎細胞或肝細胞）結合的抗體。靶向基團可以是促甲狀腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白 A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯葡糖胺多價甘露糖、多價岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、雙膦酸鹽、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素 B12、維生素 A、生物素或 RGD 肽或 RGD 肽模擬物。
配體的其它例子包括染料、插入劑(例如吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉(TPPC4、特克薩菲林、薩菲林)、多環芳烴(例如吩嗪、二氫吩嗪、菲咯啉、芘)、賴氨酸-酪氨酸-賴氨酸三肽、氨基糖苷、胍基氨基糖苷、人工內切酶(例如EDTA)、親脂性分子(例如膽固醇(及其硫代類似物)、膽酸、膽烷酸、石膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、雙氫睾酮、​​甘油(例如酯(例如單、雙或三脂肪酸酯，例如C10、 C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19 或 C20 脂肪酸)及其醚，例如 C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19 或 C20 烷基；例如 1,3-雙-O(十六烷基)甘油、1,3-雙-O(十八烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、硬脂酸(例如二硬脂酸甘油酯)、油酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯)石膽酸、O3-(油醯)膽烯酸、此類抑制劑包括但不限於：二甲氧基三苯甲基或吩惡嗪）和肽綴合物（例如，觸角足肽、Tat 肽）、烷化劑、磷酸鹽、氨基、巰基、PEG（例如，PEG-40K）、MPEG、[MPEG]2、多氨基、烷基、取代烷基、放射性標記物、酶、半抗原（例如，生物素）、轉運/吸收促進劑（例如，阿司匹林、萘普生、維生素 E、葉酸）、合成核糖核酸酶（例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑綴合物、四氮雜大環的 Eu3+ 複合物）、二硝基苯基、HRP 或 AP。
本發明的組合物和/或方法中包含的配體可以是蛋白質，例如糖蛋白或肽，例如對輔助配體具有特定親和力的分子，或抗體，例如與特定細胞類型（例如癌細胞、內皮細胞、心臟細胞或骨細胞）結合的抗體。在本發明的組合物和/或方法的實施例中有用的配體可以是激素或激素受體。在本發明的組合物和/或方法的實施例中有用的配體可以是脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯葡糖胺多價甘露糖或多價岩藻糖。在本發明的組合物和/或方法的實施例中有用的配體可以是能夠增加 APP dsRNA 劑進入細胞的物質，例如，通過破壞細胞的細胞骨架，例如，通過破壞細胞的微管、微絲和/或中間絲。這種類型的藥劑的非限制性例子是：紫衫烷類(taxon)、長春新鹼、長春花鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑(nocodazole)、茉莉花內酯(japlakinolide)、拉特庫林A (latrunculin A)、鬼筆環肽(phalloidin)、斯文霍利特A (swinholide A)、茚二酮(indanocine) 和肌保留素(myoservin)。
在一些實施例中，與本發明的 APP dsRNA 試劑連接的配體充當藥代動力學 (PK) 調節劑。可用於本發明的組合物和方法的PK調節劑的例子包括但不限於：親脂性物質、膽汁酸、類固醇、磷脂類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素、膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、維生素E、生物素、結合血清蛋白的適體等。還已知包含大量硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸可結合血清蛋白，因此主鏈中包含多個硫代磷酸酯鍵的短寡核苷酸（例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基的寡核苷酸）也可用作本發明的組合物和/或方法中的配體。 APP dsRNA 劑組合物
在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑存在於組合物中。本發明的組合物可以包括一種或多種 APP dsRNA 劑，以及可選的一種或多種藥學上可接受的載體、遞送劑、靶向劑、可檢測標記劑等。根據本發明方法的可能有用的靶向劑的一些實施例的非限制性例子是將本發明的 APP dsRNA 劑引導至待治療的細胞和/或引導至待治療的細胞中的靶向劑。靶向劑的選擇將取決於以下因素：APP 相關疾病或病症的性質，以及所靶向的細胞類型。在非限制性例子中，在本發明的一些實施例中，可能希望將 APP dsRNA 劑靶向肝細胞和/或引導至肝細胞中。在非限制性例子中，在本發明的一些實施例中，可能希望將 APP dsRNA 劑靶向腦細胞和/或引導至腦細胞中。在非限制性示例中，在本發明的一些實施例中，可能希望將 APP dsRNA 劑靶向和/或靶向脊柱細胞。應理解，在本發明的方法的一些實施例中，治療劑包括僅具有遞送劑的 APP dsRNA 劑，例如包含N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc)或親脂性部分的遞送劑，而沒有任何額外的附著元素。例如，在本發明的一些方面，APP dsRNA 劑可以附著於包含 GalNAc 的遞送化合物，並包含在包含藥學上可接受的載體的組合物中，並施用至細胞或受試者，而無需附著於 APP dsRNA 劑的任何可檢測標記劑或靶向劑等。
當本發明的 APP dsRNA 藥劑與一種或多種遞送劑、靶向劑、標記劑等一起施用和/或附著於一種或多種遞送劑、靶向劑、標記劑等時，本領域技術人員將瞭解並能夠選擇和使用適合於本發明方法的藥劑。標記劑可用於本發明的某些方法中以確定 APP dsRNA 藥劑在細胞和組織中的位置，並且可用於確定包含已在本發明方法中施用的 APP dsRNA 藥劑的治療組合物的細胞、組織或器官位置。連接和使用標記劑（例如酶標記、染料、放射性標記等）的程序是本領域眾所周知的。應當理解，在本發明的組合物和方法的一些實施例中，標記劑附著於 APP dsRNA 藥劑中包含的有義多核苷酸和反義多核苷酸中的一個或兩個。 APP dsRNA 藥劑和 APP 反義多核苷酸藥劑的遞送
本發明方法的某些實施例包括將 APP dsRNA 劑遞送到細胞中。本文所用的術語“遞送”是指促進或影響細胞的攝取或吸收。APP dsRNA 劑的吸收或攝取可通過無輔助擴散或活躍細胞的過程發生，或通過使用可能與本發明的 APP dsRNA 劑相關的遞送劑、靶向劑等發生。適用於本發明方法的遞送方式包括但不限於：體內遞送，其中將 APP dsRNA 劑注射到組織部位或全身施用。在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑連接到遞送劑上。
可用於將APP dsRNA劑遞送至細胞、組織和/或受試者的方法的非限制性實例包括： APP dsRNA -GalNAc 綴合物、SAMiRNA 技術、基於LNP的遞送方法和裸 RNA 遞送。這些和其他遞送方法已在本領域中成功用於遞送治療性 RNAi 劑以治療各種疾病和病症，例如但不限於：神經退行性疾病、肝病、急性間歇性紫質症 (AIP)、血友病、肺纖維化等。各種遞送方法的詳情可參見以下出版物：Nikam, RR & KR Gore (2018) Nucleic Acid Ther, 28 (4), 209-224 Aug 2018; Springer AD & SF Dowdy (2018) Nucleic Acid Ther. Jun 1; 28(3): 109–118; Lee, K. 等人，(2018) Arch Pharm Res, 41(9), 867-874；Nair, JK 等人，(2014) J. Am. Chem. Soc. 136:16958-16961；Imran Sajid M. 等人，(2023) Adv Drug Deliv Rev. 199:114968，以及 Padmakumar S. 等人，(2022) J Control Release. 352:121-145；其內容均通過引用併入本文中。
本發明的一些實施例包括使用脂質奈米顆粒 (LNP) 將本發明的 APP dsRNA 劑遞送至細胞、組織和/或受試者。LNP通常用於體內遞送APP dsRNA 劑，包括治療性APP dsRNA劑。使用 LNP 或其他遞送劑的一個好處是，當使用 LNP 或其他遞送劑將APP RNA 劑遞送至受試者時，其穩定性增加。在本發明的一些實施例中，LNP 包括載有本發明的一種或多種APP RNAi分子的陽離子LNP。將包含APP RNAi分子的 LNP施用至受試者，LNP及其附著的APP RNAi分子通過內吞作用被細胞吸收，它們的存在導致 RNAi 觸發分子的釋放，從而介導 RNAi。
本發明的一些實施例包括使用功能部分將本發明的APP dsRNA試劑遞送至細胞、組織和/或受試者。
功能部分是賦予 RNA 沉默劑一種或多種額外活性的分子。在某些實施例中，功能部分增強靶細胞（例如，神經元細胞）的細胞攝取。因此，本公開內容包括與另一部分（例如，非核酸部分，例如肽）、有機化合物（例如，染料）等綴合或未綴合（例如，在其 5' 和/或 3' 末端）的 RNA 沉默劑。綴合可以通過本領域已知的方法完成，例如，使用 Lambert 等人，Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001)（描述裝載到聚烷基氰基丙烯酸酯 (PACA) 奈米顆粒上的核酸）；Fattal 等人，J. Control Release 53(1-3): 137-43 (1998)（描述結合到奈米顆粒上的核酸）； Schwab 等人，Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994) (描述了與插入劑、疏水基團、聚陽離子或 PACA 奈米粒子連接的核酸）；和 Godard 等人，Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (描述了與奈米粒子連接的核酸）。
在某一實施例中，功能部分是疏水部分。在某一實施例中，疏水部分選自脂肪酸、類固醇、開環類固醇、脂質、神經節苷脂和核苷類似物、內源性大麻素和維生素。在某一實施例中，類固醇選自膽固醇和石膽酸 (LCA) 組成的組。在某一實施例中，脂肪酸選自二十碳五烯酸 (EPA)、二十二碳六烯酸 (DHA) 和二十二碳酸 (DCA) 組成的組。在某一實施例中，維生素選自膽鹼、維生素 A、維生素 E 及其衍生物或代謝物組成的組。在某一實施例中，維生素選自視黃酸和α-生育酚琥珀酸酯組成的組。
在某一實施例中，所公開的 RNA 沉默劑與親脂性部分結合。在一個實施例中，親脂性部分是包括陽離子基團的配體。在另一個實施例中，親脂性部分附著於 siRNA 的一條或兩條鏈。在示例性的實施例中，親脂性部分附著於 siRNA 的有義鏈的一端。在另一個示例性的實施例中，親脂性部分附著於有義鏈的 3'端。在某些實施例中，親脂性部分選自膽固醇、維生素 E、維生素 K、維生素 A、葉酸、陽離子染料 (例如 Cy3) 組成的組。在示例性的實施例中，親脂性部分是膽固醇。其他親脂性部分包括膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、雙氫睾酮、1，3-雙-O（十六烷基）甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-（油醯基）石膽酸、O3-（油醯基）膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩惡嗪。
在某些實施例中，功能部分可包含一個或多個與 RNA 沉默劑連接的配體，以改善穩定性、與靶核酸的雜交熱力學、靶向特定組織或細胞類型或細胞通透性，例如通過內吞依賴性或非內吞依賴性機制。配體和相關修飾還可增加序列特異性並因此減少異位靶向。連接的配體可包括一個或多個可用作嵌入劑的修飾鹼基或糖。這些可位於內部區域，例如 RNA 沉默劑/靶雙鏈的凸起中。嵌入劑可為芳香族化合物，例如多環芳香族化合物或雜環芳香族化合物。多環嵌入劑可具有堆疊能力，並且可包括具有 2、3 或 4 個稠合環的系統。本文所述的通用鹼基可包括在配體上。在一個實施例中，配體可以包括裂解基團，該裂解基團有助於通過裂解靶核酸來抑制靶基因。裂解基團可以是，例如，博來黴素（例如，博來黴素-A5、博來黴素-A2或博來黴素-B2）、芘、菲咯啉（例如，O-菲咯啉）、多胺、三肽（例如，lys-tyr-lys三肽）或金屬離子螯合基團。金屬離子螯合基團可以包括，例如，Lu(III)或EU(III)大環複合物、Zn(II)2,9-二甲基菲咯啉衍生物、 Cu(II)三聯吡啶或吖啶，其可以促進自由金屬離子（例如Lu(III)）在凸起部位選擇性裂解靶RNA。在一些實施例中，肽配體可與RNA沉默劑連接以促進靶RNA的裂解，例如在凸起區域。例如，1,8-二甲基-1,3,6,8,10,13-六氮雜環十四烷 (cyclam) 可以與肽 (例如通過氨基酸衍生物) 結合以促進靶 RNA 裂解。連接配體可以是氨基糖苷配體，其可以使 RNA 沉默劑具有改進的雜交特性或改進的序列特異性。示例性的氨基糖苷包括糖基化聚賴氨酸、半乳糖基化聚賴氨酸、新黴素 B、妥布黴素、卡那黴素 A 和氨基糖苷的吖啶結合物，例如新-N-吖啶、新-S-吖啶、新-C-吖啶、妥布-N-吖啶和卡那A-N-吖啶。使用吖啶類似物可以增加序列特異性。例如，與DNA相比，新黴素 B 對 RNA 具有高親和力，但序列特異性低。吖啶類似物新-5-吖啶對 HIV Rev 反應元件 (RRE) 具有增加的親和力。在一些實施例中，氨基糖苷配體的胍類似物 (胍基糖苷) 與RNA沉默劑結合。在胍基糖苷中，氨基酸上的胺基被交換為胍基。胍類似物的附著可增強 RNA 沉默劑的細胞通透性。束縛配體可以是聚精氨酸肽、類肽或肽模擬物，可增強寡核苷酸劑的細胞攝取。
示例性配體通過中間連接物直接或間接地與配體結合載體偶聯。在某些實施例中，偶聯是通過共價鍵進行的。在某些實施例中，配體通過中間連接物與載體連接。在某些實施例中，配體改變其所結合的 RNA 沉默劑的分佈、靶向或壽命。在某些實施例中，與不存在此類配體的種類相比，配體對選定靶標（例如分子、細胞或細胞類型、區室（例如細胞或器官區室）、組織、器官或身體區域）提供增強的親和力。
示例性配體可以改善運輸、雜交和特異性特性，還可以改善所得天然或修飾的 RNA 沉默劑或包含本文所述單體和/或天然或修飾的核糖核苷酸的任何組合的聚合物分子的核酸酶抗性。配體通常可以包括治療修飾劑，例如用於增強吸收；診斷化合物或報告基團，例如用於監測分佈；交聯劑；賦予核酸酶抗性的部分；以及天然或不常見的核鹼基。一般實例包括親脂性物質、脂質、類固醇（例如，烏蘇醇、海西皂苷、薯蕷皂苷）、萜烯（例如，三萜，例如，薩灑皂苷、弗裡德林、表弗裡德蘭醇衍生的石膽酸）、維生素（例如，葉酸、維生素 A、生物素、吡哆醛）、碳水化合物、蛋白質、蛋白質結合劑、整合素靶向分子、聚陽離子、肽、多胺和肽模擬物。配體可以包括天然存在的物質（例如，人血清白蛋白 (HSA)、低密度脂蛋白 (LDL) 或球蛋白）；碳水化合物（例如，葡聚糖、普魯蘭多糖、幾丁質、殼聚糖、菊粉、環糊精或透明質酸）；氨基酸或脂質。配體還可以是重組或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的例子包括聚賴氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙醇酸)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的例子包括：聚乙烯亞胺、聚賴氨酸(PLL)、精胺、亞精胺、聚胺、偽肽-聚胺、肽模擬物聚胺、樹枝狀聚胺、精氨酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺的季鹽或α螺旋肽。
配體還可以包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體，其與特定細胞類型（例如腎細胞）結合。靶向基團可以是促甲狀腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白 A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc) 或其衍生物、N-乙醯葡萄糖胺、多價甘露糖、多價岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、雙膦酸鹽、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素 B 12、生物素或 RGD 肽或 RGD 肽模擬物。配體的其它例子包括染料、插入劑(例如吖啶和取代的吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉(TPPC4、特克薩菲林、薩菲林)、多環芳烴(例如吩嗪、二氫吩嗪、菲咯啉、芘)、賴氨酸-酪氨酸-賴氨酸三肽、氨基糖苷、胍基氨基糖苷、人工內切酶(例如EDTA)、親脂性分子(例如膽固醇(及其硫代類似物)、膽酸、膽烷酸、石膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、雙氫睾酮、甘油(例如酯(例如單、雙或三脂肪酸酯，例如C10、C11、C12、C13、C14、 C15、C16、C17、C18、C19 或 C20 脂肪酸)及其醚，例如 C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19 或 C20 烷基；例如 l,3-雙-O(十六烷基)甘油、l,3-雙-O(十八烷基)甘油)、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、硬脂酸(例如二硬脂酸甘油酯)、油酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩惡嗪)和肽綴合物(例如所述配體包括但不限於：天線足肽、Tat肽）、烷化劑、磷酸酯、氨基、巰基、PEG（例如，PEG-40K）、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性標記物、酶、半抗原（例如，生物素）、轉運/吸收促進劑（例如，阿司匹林、萘普生、維生素E、葉酸）、合成核糖核酸酶（例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑綴合物、四氮雜大環的Eu3+複合物）、二硝基苯基、HRP或AP。在某些實施例中，配體是GalNAc或其衍生物。
配體可以是蛋白質，例如糖蛋白，或肽，例如對輔助配體具有特定親和力的分子，或抗體，例如與特定細胞類型（例如癌細胞、內皮細胞或骨細胞）結合的抗體。配體還可以包括激素和激素受體。它們還可以包括非肽類物質，例如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯葡萄糖胺多價甘露糖或多價岩藻糖。
在某些實施例中，功能部分與本公開的RNA沉默劑的5'端和/或3'端連接。在某些實施例中，功能部分與本公開的RNA沉默劑的反義鏈的5'端和/或3'端連接。在某些實施例中，功能部分與本公開的RNA沉默劑的有義鏈的5'端和/或3'端連接。在某些實施例中，功能部分與本公開的RNA沉默劑的有義鏈的3'端連接。
在某些實施例中，功能部分通過接頭與RNA沉默劑連接。在某些實施例中，功能部分通過接頭與反義鏈和/或有義鏈連接。在某些實施例中，功能部分通過接頭與有義鏈的3'端連接。在某些實施例中，接頭包括二價或三價接頭。在某些實施例中，接頭包括乙二醇鏈、烷基鏈、肽、RNA、DNA、磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、醯胺、氨基甲酸酯或其組合。
可用於本發明的實施例中以將本發明的 APP dsRNA 藥劑遞送至細胞、組織和/或受試者的遞送劑的另一個非限制性實例是包含 GalNAc 的藥劑，其連接至本發明的 APP dsRNA 藥劑並將 APP dsRNA 藥劑遞送至細胞、組織和/或受試者。可用於本發明的方法和組合物的某些實施例中的某些包含GalNAc的附加遞送劑的實例在 PCT 申請：WO2020191183A1 和 WO2023045995（全文併入本文）中公開。可用於本發明的組合物和方法的將APP dsRNA藥劑遞送至細胞的 GalNAc 靶向配體的一個非限制性實例是靶向配體簇。本文介紹的靶向配體簇的例子稱為：具有磷酸二酯連接的GalNAc配體 (GLO) 和具有硫代磷酸酯連接的GalNAc配體 (GLS)。術語“GLX-n”可以在此用於表示所連接的含GalNAc的化合物是化合物GLS-1*、GLS-2*、GLS-3*、GLS-4*、GLS-5*、GLS-6*、GLS-7*、GLS-8*、GLS-9*、GLS-10*、GLS-11*、GLS-12*、GLS-13*、GLS-14*、GLS-15*、GLS-16*、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15和GLO-16中的任一種，其中每種化合物的結構如下所示，下面顯示了GalNAc靶向配體的連接位置在本發明的每個RNAi劑的最右邊（以“ ⸾ ”顯示）。應當理解，本發明的任何 RNAi 和 dsRNA 分子均可連接至GLS-1*、GLS-2*、GLS-3*、GLS-4*、 GLS-5*、GLS-6*、GLS-7*、GLS-8*、GLS-9*、GLS-10*、GLS-11*、GLS-12*、GLS-13*、GLS-14*、GLS-15*、GLS-16*、GLO-1、GLO-2、GLO-3、GLO-4、GLO-5、GLO-6、GLO-7、GLO-8、GLO-9、GLO-10、GLO-11、GLO-12、GLO-13、GLO-14、GLO-15 和 GLO-16，GLO-1 至 GLO-16 和 GLS-1 至 GLS-16 結構如下所示。
GLO-1 GLS-1 *
GLO-2 GLS-2 *
GLO-3 GLS-3 *
GLO-4 GLS-4 *
GLO-5 GLS-5 *
GLO-6 GLS-6 *
GLO-7 GLS-7 *
GLO-8 GLS-8 *
GLO-9 GLS-9 *
GLO-10 GLS-10 *
GLO-11 GLS-11 *
GLO-12 GLS-12 *
GLO-13 GLS-13 *
GLO-14 GLS-14 *
GLO-15 GLS-15 *
GLO-16 GLS-16 *
在某些實施例中，上述異甘露醇核苷酸可以進一步與一種或多種GalNAc靶向配體綴合。與GalNAc靶向配體綴合的異甘露醇核苷酸的具體例子包括但不限於： ， ，其中短語“olig”各自獨立地表示多核苷酸部分。
在本發明的一些實施例中，體內遞送也可以通過β-葡聚糖遞送系統進行，例如美國專利號 5,032,401 和 5,607,677 以及美國公開號 2005/0281781 中描述的那些，這些專利在此通過引用整體併入本文。還可以使用本領域已知的方法（例如電穿孔和脂質轉染）將 APP RNAi 劑體外引入細胞。在本發明方法的某些實施例中，APP dsRNA 是在沒有靶向劑的情況下遞送的。這些 RNA 可以作為“裸露”RNA 分子遞送。作為非限制性實例，本發明的 APP dsRNA 可以以包含 RNAi 劑但不包括靶向劑（例如 GalNAc 靶向化合物）的藥物組合物的形式施用於受試者以治療受試者的 APP 相關疾病或病症（例如 AD）。
除了本文描述的某些遞送方法之外，應當理解，RNAi 遞送方法（例如但不限於本文描述的和本領域中使用的方法）可與本文描述的APP RNAi劑和治療方法的實施例結合使用。
本發明的 APP dsRNA 試劑可以以有效降低細胞和/或受試者中 APP 多肽的水平和活性的量和方式施用於受試者。在本發明方法的一些實施例中，將一種或多種 APP dsRNA 試劑施用於細胞和/或受試者以治療與 APP 表達和活性相關的疾病或病症。在一些實施例中，本發明的方法包括將一種或多種 APP dsRNA 試劑施用於需要此類治療的受試者以降低受試者中與 APP 表達相關的疾病或病症。可以施用本發明的 APP dsRNA 試劑或 APP 反義多核苷酸試劑以降低體外、離體和體內細胞中的一種或多種中的 APP 表達和/或活性。
在本發明的一些實施例中，通過將 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑遞送（例如引入）到細胞中來降低細胞中 APP 多肽的水平，從而降低其活性。靶向劑和方法可用於幫助將 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑遞送到受試者內的特定細胞類型、細胞亞型、器官、空間區域和/或細胞內的亞細胞區域。在本發明的某些方法中，可以單獨施用APP dsRNA 劑，也可以與一種或多種其他 APP dsRNA 劑組合施用。在一些實施例中，向受試者施用 2、3、4 或更多種獨立選擇的 APP dsRNA 劑。
在本發明的某些實施例中，將 APP dsRNA 藥劑與一種或多種用於治療 APP 相關疾病或病症的附加治療方案一起施用於受試者以治療 APP 相關疾病或病症。附加治療方案的非限制性示例為：施用一種或多種本發明的 APP 反義多核苷酸、施用非 APP dsRNA 治療劑和行為改變。附加治療方案可在以下一個或多個時間施用：施用本發明的 APP dsRNA 藥劑之前、同時和之後。應理解，本文使用的“同時”是指時間零起五分鐘內、時間零起十分鐘內、時間零起三十分鐘內、時間零起四十五分鐘內和時間零起六十分鐘內，其中“時間零”是指將本發明的 APP dsRNA 藥劑施用於受試者的時間。非 APP dsRNA 治療劑的非限制性實例為：膽鹼酯酶抑制劑（例如多奈呱齊、利凡斯的酯和加蘭他敏）、美金剛、BACE1i、免疫療法、分泌酶抑制劑（例如，γ 分泌酶抑制劑）、乙醯膽鹼酯酶抑制劑、NMDA 受體拮抗劑、針對 Abeta 的抗體（例如，aducanumab）、針對 tau 蛋白的藥劑、抗突觸核蛋白抗體、富馬酸鹽化合物、抗炎劑、抗脂肪變性劑、抗病毒劑和/或抗纖維化劑，或本文公開的或本領域已知的用於治療受試者的 AD（包括 EOFAD）和/或 CAA 的其他藥劑。行為改變的非限制性實例為：飲食方案、諮詢和鍛煉方案。這些和其他治療劑和行為改變是本領域已知的，用於治療受試者的 APP 相關疾病或病症，並且可以與本發明的一種或多種 APP dsRNA 藥劑聯合施用給受試者以治療 APP 相關疾病或病症。施用給細胞或受試者以治療 APP 相關疾病或病症的本發明的 APP dsRNA 藥劑可以與一種或多種其他治療劑或活性協同作用，並提高一種或多種治療劑或活性的有效性和/或提高 APP dsRNA 藥劑在治療 APP 相關疾病或病症方面的有效性。
本發明的治療方法包括施用 APP dsRNA 藥劑，可在 APP 相關疾病或病症發作之前和/或 APP 相關疾病或病症存在時使用，包括疾病或病症的早期、中期和晚期以及這些階段之前和之後的所有時間。本發明的方法還可用於治療之前已使用一種或多種其他治療藥劑和/或治療活動治療過 APP 相關疾病或病症的受試者，這些治療藥劑和/或治療活動在治療受試者的 APP 相關疾病或病症方面沒有成功、成功率很低和/或不再成功。 載體編碼的 dsRNA
在本發明的某些實施例中，可以使用載體將 APP dsRNA 劑遞送到細胞中。APP dsRNA 劑轉錄單位可以包含在 DNA 或 RNA 載體中。製備和使用編碼轉基因的載體將序列遞送到細胞和/或受試者中是本領域眾所周知的。載體可用於本發明的方法中，導致 APP dsRNA 的瞬時表達，例如至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多小時，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多周。瞬時表達的長度可以使用常規方法基於諸如但不限於所選特定載體構建體和靶細胞和/或組織的要素來確定。可以將此類轉基因作為線性構建體、環狀質粒或病毒載體引入，其可以是整合或非整合載體。還可以構建轉基因以允許其作為染色體外質粒遺傳（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
APP dsRNA 劑的單鏈或多鏈可從表達載體上的啟動子轉錄。當要表達兩條單獨的鏈以產生例如 dsRNA 時，可以使用諸如轉染或感染之類的方法將兩個單獨的表達載體共同引入細胞。在某些實施例中，本發明的 APP dsRNA 劑的每條單獨鏈可由包含在同一表達載體上的啟動子轉錄。在本發明的某些實施例中，APP dsRNA 劑表達為由接頭多核苷酸序列連接的反向重複多核苷酸，使得 APP dsRNA 劑具有莖和環結構。
RNA 表達載體的非限制性實例是 DNA 質粒或病毒載體。本發明實施例中有用的表達載體可與真核細胞相容。真核細胞表達載體在本領域中常規使用，並且可從許多商業來源獲得。APP dsRNA 表達載體的遞送可以是全身性的，例如通過靜脈內或肌肉內給藥，通過給藥至從受試者移出的靶細胞然後再引入受試者體內，或者通過允許引入所需靶細胞的任何其他方式。
可包含在該方法的實施例中的病毒載體系統包括但不限於：(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)SV 40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，例如正痘病毒載體或禽痘病毒載體，例如金絲雀痘病毒載體或雞痘病毒載體；以及(j)輔助依賴性或無腸腺病毒。用於重組表達APP dsRNA劑的構建體可包括調節元件，例如啟動子、增強子等，其可被選擇以提供組成性或受調節/誘導的表達。病毒載體系統、啟動子和增強子等的使用是本領域的常規技術，並且可以與本文描述的方法和組合物結合使用。
本發明的某些實施例包括使用病毒載體將 APP dsRNA 劑遞送到細胞中。本領域常規使用多種基於腺病毒的遞送系統來遞送到例如肺、肝、中樞神經系統、內皮細胞和肌肉。可用於本發明方法的病毒載體的非限制性實例是：AAV 載體、痘病毒（例如牛痘病毒）、改良安卡拉病毒 (MVA)、NYVAC、禽痘（例如雞痘或金絲雀痘）。
本發明的某些實施例包括使用載體將 APP dsRNA 劑遞送到細胞中的方法，並且此類載體可以位於藥學上可接受的載體中，該載體可以但不必包括嵌入基因遞送載體的緩釋基質。在一些實施例中，可以從重組細胞產生用於遞送 APP dsRNA 的載體，並且本發明的藥物組合物可以包括產生 APP dsRNA 遞送系統的一個或多個細胞。 含有 APP dsRNA 或 ssRNA 試劑的藥物組合物
本發明的某些實施例包括使用含有 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑和藥學上可接受的載體的藥物組合物。含有 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的藥物組合物可用於本發明的方法中以降低細胞中的 APP 基因表達和 APP 活性，並且可用於治療 APP 相關疾病或病症。此類藥物組合物可根據給藥方式配製。用於遞送方式的製劑的非限制性實例是：配製用於皮下遞送的組合物、配製用於鞘內遞送的組合物、配製用於通過腸胃外遞送全身施用的組合物、配製用於靜脈內 (IV) 遞送的組合物、配製用於直接遞送到腦中的組合物等。施用本發明的藥物組合物以將 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑遞送到細胞中可以使用一種或多種方法進行，例如：局部 (例如，通過透皮貼劑)、肺部，例如，通過吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括通過霧化器；腦室內、氣管內、鼻內、表皮和透皮、口服或腸胃外。腸胃外施用包括腦室內、靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；皮下，例如，通過植入裝置；或顱內，例如通過腦實質內、鞘內或腦室內給藥。APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑也可直接遞送至靶組織，例如直接遞送至肝臟、直接遞送至腎臟等。應理解，“遞送 APP dsRNA 劑”或“遞送 APP 反義多核苷酸劑”進入細胞分別包括直接遞送 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑以及從遞送至細胞的編碼載體在細胞中表達 APP dsRNA 劑，或通過任何合適的方式使 APP dsRNA 或 APP 反義多核苷酸劑存在於細胞中。製備和使用製劑和遞送抑制性 RNA 的方法是本領域眾所周知的並且常規使用的。
如本文所用，“藥物組合物”包括藥理學有效量的本發明的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑和藥學上可接受的載體。術語“藥學上可接受的載體”是指用於施用治療劑的載體。此類載體包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術語明確排除細胞培養基。對於口服給藥的藥物，藥學上可接受的載體包括但不限於藥學上可接受的賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣以及乳糖，而玉米澱粉和海藻酸是合適的崩解劑。黏合劑可以包括澱粉和明膠，而潤滑劑（如果存在）通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如果需要，片劑可以用諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之類的材料包衣，以延遲胃腸道的吸收。藥物製劑中包含的藥劑將在下文進一步描述。
本文使用的術語如：“藥理學有效量”、“治療有效量”和“有效量”是指本發明的 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑產生預期藥理學、治療或預防結果的量。例如，如果當與疾病或病症相關的可測量參數至少降低 10% 時，給定的臨床治療被認為是有效的，則用於治療該疾病或病症的藥物的治療有效量是使該參數至少降低 10% 所需的量。例如，APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑的治療有效量可以將 APP 蛋白水平降低至少 10%。 有效量
本發明的方法在某些方面包括使細胞與有效量的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑接觸，以減少所接觸細胞中的 APP 基因表達。本發明的方法的某些實施例包括向受試者施用有效量的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑，以減少受試者的 APP 基因表達並治療受試者的 APP 相關疾病或病症。用於減少 APP 表達和/或治療 APP 相關疾病或病症的“有效量”是實現所需生物效應所需或足夠的量。例如，治療 APP 相關疾病或病症的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的有效量可以是 (i) 減緩或停止疾病或病症進展；或 (ii) 逆轉、減少或消除疾病或病症的一種或多種症狀所需的量。在本發明的一些方面，有效量是當將 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑施用於需要治療 APP 相關疾病或病症的受試者時，產生預防和/或治療該疾病或病症的治療反應的量。根據本發明的一些方面，有效量是當將本發明的 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑與用於 APP 相關疾病或病症的另一種治療方法組合或共同施用於受試者時，產生預防和/或治療該疾病或病症的治療反應的量。在本發明的一些實施例中，用本發明的 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑治療受試者的生物學效應可以是改善和/或完全消除由 APP 相關疾病或病症引起的症狀。在本發明的一些實施例中，生物效應是 APP 相關疾病或病症的完全消除，例如，通過診斷測試表明受試者沒有 APP 相關疾病或病症。可以檢測到的生理症狀的非限制性示例包括施用本發明的藥劑後受試者肝臟中 APP 水平的降低。可以使用本領域已知的其他評估 APP 相關疾病或病症狀態的方法來確定本發明的藥劑和/或方法對 APP 相關疾病或病症的影響。
降低APP多肽活性至治療 APP 相關疾病或病症的水平的APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑的有效量，從而在盲法研究中確定測試人群與對照人群的有效劑量。在一些實施例中，有效量將導致期望的反應，例如，在患有疾病或病症的細胞、組織和/或受試者中減少 APP 相關疾病或病症的量。因此，治療可通過降低APP多肽活性來治療的 APP 相關疾病或病症的APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑的有效量可以是在施用時將受試者體內的APP多肽活性量降低至小於在未施用APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑的情況下細胞、組織和/或受試者中存在的量的量。在本發明的某些方面，未接觸或施用本發明的 APP dsRNA 藥劑或APP 反義多核苷酸藥劑的細胞、組織和/或受試者中存在的APP多肽活性和/或APP基因表達水平稱為“對照”量。在本發明方法的一些實施例中，受試者的對照量是受試者的治療前量，換句話說，受試者在施用 APP 藥劑之前的水平可以是該受試者的對照水平，並與向受試者施用 siRNA 後受試者體內的APP多肽活性和/或APP基因表達水平進行比較。在治療 APP 相關疾病或病症的情況下，期望的反應可能是減少或消除細胞、組織和/或受試者中疾病或病症的一種或多種症狀。減少或消除可能是暫時的，也可能是永久的。應當理解，可以使用確定APP多肽活性、 APP基因表達、症狀評估、臨床測試等方法來監測 APP 相關疾病或病症的狀態。在本發明的一些方面，對 APP 相關疾病或病症的治療的期望反應是延遲疾病或病症的發作或者甚至預防疾病或病症的發作。
還可以通過評估施用 APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑對細胞或受試者的生理效應（例如施用後 APP 相關疾病或病症的減少）來確定降低APP多肽活性的化合物的有效量。可以使用受試者的測定和/或症狀監測來確定本發明的 APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑（其可以以本發明的藥物化合物的形式施用）的功效，並確定對治療有無反應。非限制性實例是APPα、APPβ 和/或A β的一種或多種本領域已知的測試。
本發明的一些實施例包括確定向受試者施用的本發明的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的功效的方法，所述方法通過評估和/或監測受試者中 APP 相關疾病或病症的一個或多個“生理特徵”來確定。APP 相關疾病或病症的生理特徵的非限制性示例是 APP mRNA 水平、APP 蛋白水平（包括 APP 裂解產物）或各種形式的 APP（例如，APPα、APPβ、 Aβ、 Aβ40 和/或 Aβ42 等）、APP C-末端片段 (CTF) 多肽（例如，α-CTF 和/或 β-CTF）和/或 MAPT 肽等。確定此類生理特徵的標準方法是本領域已知的，包括但不限於血液測試、影像學研究、體檢等。
應理解，可以至少部分地基於對受試者的疾病和/或病症狀態和/或生理特徵的確定來修改向受試者施用的APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑的量。治療量可以例如通過增加或減少 APP-dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑的量、通過改變分別施用 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的組合物、通過改變施用途徑、通過改變給藥時間等來改變。APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑的有效量將隨著所治療的特定病症、所治療受試者的年齡和身體狀況、病症的嚴重程度、治療持續時間、併發療法的性質（如果有）、具體施用途徑以及健康從業者的知識和專長範圍內的其他因素而變化。例如，有效量可能取決於有效治療 APP 相關疾病或病症的所需 APP 多肽活性和/或 APP 基因表達水平。技術人員可以根據經驗確定用於本發明方法的特定 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的有效量，而無需過度實驗。結合本文提供的教導，通過從本發明的各種 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑中進行選擇，並權衡諸如效力、相對生物利用度、患者體重、不良副作用的嚴重程度和優選的給藥方式等因素，可以計劃有效治療特定受試者的有效預防或治療方案。如在本發明的實施例中所用，本發明的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的有效量可以是當與細胞接觸時在細胞中產生所需生物學效應的量。
應認識到，APP 基因沉默可在任何表達 APP 的細胞中確定，無論是組成型表達還是通過基因組工程表達，以及通過任何適當的測定。在本發明的一些實施例中，通過施用本發明的 APP dsRNA 劑，APP 基因表達減少至少 5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100%。在本發明的一些實施例中，通過施用本發明的 APP dsRNA 試劑，APP 基因表達減少了 5% 至 10%、5% 至 25%、10% 至 50%、10% 至 75%、25% 至 75%、25% 至 100% 或 50% 至 100%。 給藥
APP dsRNA 劑和 APP 反義多核苷酸劑以足以抑制 APP 基因表達的劑量在藥物組合物中遞送。在本發明的某些實施例中，APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的劑量在接受者每天每公斤體重 0.01 至 200.0 毫克的範圍內，通常在每天每公斤體重 1 至 50 毫克、5 至 40 毫克、10 至 30 毫克、1 至 20 毫克、1 至 10 毫克、4 至 15 毫克範圍內，包括每日劑量。例如，可以以下列量施用 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑：每單位體重劑量0.01 mg/kg，0.05 mg/kg，0.1 mg/kg，0.2 mg/kg，0.3 mg/kg，0.4 mg/kg，0.5 mg/kg，1 mg/kg，1.1 mg/kg，1.2 mg/kg，1.3 mg/kg，1.4 mg/kg，1.5 mg/kg，1.6 mg/kg，1.7 mg/kg，1.8 mg/kg，1.9 mg/kg，2 mg/kg，2.1 mg/kg，2.2 mg/kg，2.3 mg/kg，2.4 mg/kg，2.5 mg/kg，2.6 mg/kg，2.7 mg/kg，2.8 mg/kg，2.9 mg/kg，3.0 mg/kg，3.1 mg/kg，3.2 mg/kg，3.3 mg/kg，3.4 mg/kg，3.5 mg/kg，3.6 mg/kg，3.7 mg/kg，3.8 mg/kg，3.9 mg/kg，4 mg/kg，4.1 mg/kg，4.2 mg/kg，4.3 mg/kg，4.4 mg/kg，4.5 mg/kg，4.6 mg/kg，4.7 mg/kg，4.8 mg/kg，4.9 mg/kg，5 mg/kg，5.1 mg/kg，5.2 mg/kg，5.3 mg/kg，5.4 mg/kg，5.5 mg/kg，5.6 mg/kg，5.7 mg/kg，5.8 mg/kg，5.9 mg/kg，6 mg/kg，6.1 mg/kg，6.2 mg/kg，6.3 mg/kg，6.4 mg/kg，6.5 mg/kg，6.6 mg/kg，6.7 mg/kg，6.8 mg/kg，6.9 mg/kg，7 mg/kg，7.1 mg/kg，7.2 mg/kg，7.3 mg/kg，7.4 mg/kg，7.5 mg/kg，7.6 mg/kg，7.7 mg/kg，7.8 mg/kg，7.9 mg/kg，8 mg/kg，8.1 mg/kg，8.2 mg/kg，8.3 mg/kg，8.4 mg/kg，8.5 mg/kg，8.6 mg/kg，8.7 mg/kg，8.8 mg/kg，8.9 mg/kg，9 mg/kg，9.1 mg/kg，9.2 mg/kg，9.3 mg/kg，9.4 mg/kg，9.5 mg/kg，9.6 mg/kg，9.7 mg/kg，9.8 mg/kg，9.9 mg/kg，10 mg/kg，11 mg/kg，12 mg/kg，13mg/kg，14 mg/kg，15 mg/kg，16 mg/kg，17 mg/kg，18 mg/kg，19 mg/kg，20 mg/kg，21 mg/kg，22 mg/kg，23mg/kg，24 mg/kg，25 mg/kg，26 mg/kg，27 mg/kg，28 mg/kg，29 mg/kg，30 mg/kg，31 mg/kg，32 mg/kg，33mg/kg，34 mg/kg，35 mg/kg，36 mg/kg，37 mg/kg，38 mg/kg，39 mg/kg，40 mg/kg，41 mg/kg，42 mg/kg，43mg/kg，44 mg/kg，45 mg/kg，46 mg/kg，47 mg/kg，48 mg/kg，49 mg/kg，直至 50 mg/kg。
在確定本發明的 APP dsRNA 藥劑的劑量和給藥時間時，可以考慮各種因素。所給藥的APP dsRNA藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑的絕對量將取決於各種因素，包括同時治療、劑量數和個體受試者參數，包括年齡、身體狀況、體型和體重。這些是本領域普通技術人員所熟知的因素，只需常規實驗即可解決。在一些實施例中，可以使用最大劑量，即根據合理的醫學判斷的最高安全劑量。
在一些實施例中，本發明的方法可以包括向受試者施用 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多劑量的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑。在一些情況下，可以至少每天、每隔一天、每週、每隔一周、每月等向受試者施用藥物化合物（例如，包含APP dsRNA劑或包含 APP 反義多核苷酸劑）。劑量可以每天施用一次或每天施用多次，例如，在一個24小時內施用 2、3、4、5 或更多次。本發明的藥物組合物可以每天施用一次，或者 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑可以以兩、三或更多次亞劑量在一天中以適當的間隔施用，或者甚至使用連續輸注或通過控釋製劑遞送。在本發明方法的一些實施例中，每天一次或多次、每週一次或多次、每月一次或多次或每年一次或多次向受試者施用本發明的藥物組合物。
在某些方面，本發明的方法包括單獨施用一種藥物化合物，與一種或多種其他APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑聯合施用，和/或與施用給患有 APP 相關疾病或病症的受試者的其他藥物療法或治療活動或方案聯合施用。藥物化合物可以以藥物組合物的形式施用。本發明方法中使用的藥物組合物可以是無菌的，並且含有一定量的 APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑，其將降低 APP 多肽的活性至足以產生所需反應的水平，該水平以適合施用給受試者的重量或體積單位為單位。施用給受試者的包括 APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑以降低 APP 蛋白活性的藥物組合物的劑量可以根據不同的參數來選擇，特別是根據所使用的施用方式和受試者的狀態。其他因素包括所需的治療期。如果受試者對初始劑量的反應不夠，則可以在患者耐受範圍內採用更高劑量（或通過不同的、更局部的遞送途徑有效地提高劑量）。 治療
本文所用的“APP 相關疾病”、“APP 相關疾病和病症”和“由 APP 引起和/或調節的疾病和病症”旨在包括與 APP 基因或蛋白質相關的任何疾病。此類疾病可能由例如 APP 蛋白質的過量產生、APP 基因的突變、APP 蛋白質的異常裂解、APP 與其他蛋白質或其他內源性或外源性物質之間的異常相互作用引起。示例性的 APP 相關疾病包括但不限於：腦澱粉樣血管病 (CAA)、唐氏症 (DS) 和阿爾茨海默病 (AD)，包括遺傳性 CAA、早發性家族性阿爾茨海默病 (EOFAD 或 eFAD)、晚發性 AD (LOAD)，以及肌萎縮側索硬化症 (ALS)、額顳葉癡呆、亨廷頓病、帕金森病、脊髓小腦、朊病毒、拉福拉病、中風或其他與 APP 相關的神經退行性疾病或異常。
遺傳性 CAA (hCAA) 是一種血管蛋白病，澱粉樣蛋白治療假說相對簡單且可進行臨床測試。這是一種毀滅性的罕見疾病，目前尚無治療方法。目前已有生化和成像生物標記物可用於臨床驗證抗 APP siRNA 介導的 hCAA 治療。
考慮使用本公開內容的 RNAi 劑治療的一種特定類型的 hCAA 是“荷蘭型”AP hCAA，其患者人數估計有數百人，主要位於荷蘭和西澳大利亞。在 APP 相關疾病中，hCAA 的獨特之處在於其純血管性：在 CAA 中，澱粉樣纖維沉積在 CNS 實質和軟腦膜的動脈和毛細血管中，導致患有 CAA 的受試者因腦缺血和微出血而出現認知能力下降。超過 80% 的 AD 受試者存在 CAA（其中 25% 的 AD 受試者患有中度至重度 CAA），並且 CAA 的發病率隨著受試者年齡的增長而上升，70 歲以上的老年人發病率約為 50%。
以下是遺傳性CAA的典型表現：
- β澱粉樣蛋白——散發性CAA、HCHWA-荷蘭型和意大利型EOFAD、LOAD、21三體綜合征；
- ABri—英國家族性癡呆症；
- ADan—丹麥家族性癡呆症；
- 胱抑素C—HCHWA-冰島型（HCHWA-遺傳性腦出血伴澱粉樣變性）；
- 凝溶膠蛋白——家族性澱粉樣變性-芬蘭型；
- 朊病毒蛋白——朊病毒病；
- 轉甲狀腺素蛋白——遺傳性系統性澱粉樣變性。
如上所述，Aβ-hCAA（又名 APP-hCAA）是一種與腦出血相關的快速進展性癡呆疾病。CAA 的已知適應症包括 APP-hCAA 和散發性 CAA。其他可能的 CAA 適應症包括：與 EOFAD（PSEN1；APP；PSEN2）相關的 CAA；與唐氏症相關的 CAA；以及與晚發性阿爾茨海默病相關的 CAA（如上所述，這種疾病很常見）。
對於 APP-hCAA 而言，其患病率尚不清楚；然而，純APP-hCAA 比 EOFAD 少見（荷蘭型 hCAA（涉及 APP E693Q 突變）已在數百人中報道）。通常，APP-hCAA 症狀在 35-45 歲之間發作；APP-hCAA 通常在 2-5 年內發展為嚴重 CVA，導致因 CVA 死亡的高峰年齡為 55 歲。
散發性 CAA 作為一種指征表現出相對較高的患病率：它是老年人腦葉腦出血 (ICH) 的常見原因。它也是一種快速進展的疾病，在平均 5 年的隨訪期內，316 名患者中有 86 名 (36%) 出現復發性 ICH(Van Etten et al. 2016 Neurology）。一項研究觀察到散發性 CAA 的累積癡呆發病率為 1 年時為 14%，5 年時為 73%（Xiong et al. 2017 J Cerebr Blood Flow Metab）。散發性 CAA 也與 AD 廣泛重疊，因為已確定晚期 CAA 存在於大約 25% 的 AD 腦中；然而，實際上只有不到 50% 的 CAA 病例符合 AD 的病理標準。
在本發明的某些方面，可在診斷出 APP 相關疾病或病症之前或之後的一個或多個時間點向受試者施用本發明的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑。在本發明的某些方面，受試者處於患有或發展 APP 相關疾病或病症的風險中。處於發展 APP 相關疾病或病症風險中的受試者是與發展 APP 相關疾病或病症的對照風險相比具有發展 APP 相關疾病或病症的概率增加的受試者。在本發明的某些實施例中，風險水平與風險對照水平相比可能具有統計學顯著性。處於風險中的受試者可以包括，例如，是或將是具有預先存在的疾病和/或遺傳異常的受試者，這使得受試者比沒有預先存在的疾病或遺傳異常的對照受試者更容易患上 APP 相關疾病或病症；具有 APP 相關疾病或病症的家族和/或個人病史的受試者；以及之前已接受過 APP 相關疾病或病症治療的受試者。應理解，使受試者更易患 APP 相關疾病或病症的既存疾病和/或遺傳異常可以是之前已確定與患上 APP 相關疾病或病症的可能性較高具有關聯關係的疾病或遺傳異常。
應當理解，可以根據個體受試者的醫療狀況向受試者施用 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑。例如，為受試者提供的醫療保健可以評估從受試者獲得的樣本中測量的 APP 水平，並確定通過施用本發明的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑來降低受試者的 APP 水平是可取的。在這個例子中，APP 水平可以被認為是 APP 相關疾病的生理特徵，即使受試者未被診斷為患有本文公開的 APP 相關疾病。醫療保健提供者可以監測受試者的 APP 水平的變化，作為施用的本發明的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的功效的量度。在非限制性例子中，可以從受試者獲得生物樣本，例如血液或組織樣本，並在樣本中確定受試者的 APP 水平。將 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑施用於受試者，並在施藥後從受試者獲取血液樣本，使用該樣本確定 APP 水平，並將結果與受試者施藥前 (之前) 樣本中確定的結果進行比較。與施藥前水平相比，受試者後期樣本中的 APP 水平降低表明施用的 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑在降低受試者的A β水平方面有效。
本發明的某些方法實施例包括調整治療，包括向受試者施用本發明的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑，這至少部分基於對受試者因治療導致的 APP 相關疾病或病症的一種或多種生理特徵的變化的評估。例如，在本發明的一些實施例中，可以確定施用的本發明的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑對受試者的影響，並將其用於幫助調整隨後向受試者施用的本發明的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的量。在一個非限制性實例中，向受試者施用本發明的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑，在施用後測定受試者的 APP 水平，且至少部分地基於所測定的水平，確定需要更大量的dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑以增加所施用劑的生理效應，例如降低或進一步降低受試者的 APP 水平。在另一個非限制性實例中，向受試者施用本發明的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑，在施用後測定受試者的 APP 水平，並且至少部分地基於所測定的水平，需要向受試者施用較低量的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑。
因此，本發明的一些實施例包括評估受試者先前治療導致的一種或多種生理特徵的變化，以調整隨後向受試者施用的本發明的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的量。本發明的方法的一些實施例包括 1、2、3、4、5、6 或更多次 APP 相關疾病或病症的生理特徵測定，以評估和/或監測施用的本發明的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的功效，並且任選地使用這些測定來調整本發明的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的劑量、施用方案和/或施用頻率中的一種或多種，以治療受試者的 APP 相關疾病或病症。在本發明方法的一些實施例中，向受試者施用有效量的本發明的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的期望結果是與針對受試者確定的先前水平或對照水平相比，受試者的 APP mRNA 水平、受試者中的 APP 蛋白水平（包括 APP 裂解產物）或各種形式的 APP（例如，APPα、APPβ、 Aβ、 Aβ40 和/或 Aβ42 等）、APP C-末端片段 (CTF) 多肽（例如，α-CTF 和/或 β-CTF）和/或 MAPT 肽等降低。
如本文所用，當針對 APP 相關疾病或病症使用時，術語“治療”或“已治療”或“正在治療”可以指降低受試者罹患 APP 相關疾病或病症的可能性的預防性治療，也可以指在受試者罹患 APP 相關疾病或病症之後進行的治療，以便消除或降低 APP 相關疾病或病症的水平、防止 APP 相關疾病或病症變得更嚴重（例如，更嚴重）、和/或與未接受治療的受試者相比減緩受試者體內 APP 相關疾病或病症的進展，從而降低受試者體內 APP 多肽的活性。
本發明的藥劑、組合物和方法的某些實施例可用於抑制 APP 基因表達。如本文中關於 APP 基因表達所用的術語“抑制”、“沉默”、“降低”、“下調”和“敲減”是指當細胞、細胞群、組織、器官或受試者與本發明的 APP dsRNA 試劑或 APP 反義多核苷酸試劑接觸 (例如，用其處理) 時，與對照的 APP 基因轉錄的 RNA 水平、表達的 APP 活性水平或從 mRNA 翻譯的 APP 水平相比，APP 基因的表達降低，如以下一種或多種測量：所述細胞、細胞群、組織、器官或受試者中從基因轉錄的 RNA 水平、表達的 APP 活性水平和從 mRNA 翻譯的 APP 多肽、蛋白質或蛋白質亞基的水平分別降低。在一些實施例中，對照水平是未與 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑接觸（例如，用其處理）的細胞、組織、器官或受試者中的水平。 給藥方法
有多種 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的給藥途徑可用於本發明的方法。所選的具體給藥方式至少部分取決於所治療的具體病症和達到治療效果所需的劑量。一般而言，本發明的方法可使用醫學上可接受的任何給藥方式來實施，即任何可產生有效治療 APP 相關疾病或病症的水平且不會引起臨床上不可接受的不良反應的方式。在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑可通過口服、腸內、黏膜、皮下和/或腸外途徑給藥。術語“腸外”包括皮下、靜脈內、鞘內、肌肉內、腹膜內和胸骨內注射或輸注技術。其他途徑包括但不限於鼻腔（例如，通過胃鼻管）、皮膚、陰道、直腸、舌下和吸入。本發明的遞送途徑可以包括鞘內、腦室內或顱內。在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑可以放置在緩釋基質中並通過將基質放置在受試者體內來施用。在本發明的一些方面，可以使用塗有靶向特定細胞或細胞器的遞送劑的奈米顆粒將 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑遞送至受試者細胞。本領域已知各種遞送手段、方法、藥劑。本文其他地方還提供了遞送方法和遞送劑的非限制性示例。在本發明的一些方面，關於 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的術語“遞送”可以指向細胞或受試者施用一種或多種“裸露的” APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑序列，並且在本發明的某些方面，“遞送”指經由轉染手段向細胞或受試者施用、向受試者遞送包含 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的細胞、向細胞和/或受試者遞送編碼 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的載體等。使用轉染手段遞送 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑可以包括向細胞和/或受試者施用載體。
在本發明的一些方法中，一種或多種 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑可以以製劑形式施用，所述製劑可以以藥學上可接受的溶液形式施用，所述溶液通常可以含有藥學上可接受濃度的鹽、緩衝劑、防腐劑、相容載體、佐劑和任選的其他治療成分。在本發明的一些實施例中，APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑可以與另一種治療劑一起配製以同時施用。根據本發明的方法，APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑可以以藥物組合物形式施用。通常，藥物組合物包含 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑和任選的藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體是本領域普通技術人員所熟知的。如本文所用，藥學上可接受的載體是指不干擾活性成分的生物活性的有效性（例如，APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑抑制細胞或受試者中 APP 基因表達的能力）的無毒材料。本領域已知多種用於治療用途的 dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的給藥和遞送方法，並且可用於本發明的方法中。
藥學上可接受的載體包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑和本領域中眾所周知的其他材料。示例性的藥學上可接受的載體在美國專利號 5,211,657 中進行了描述，並且本領域技術人員已知其他載體。此類製劑通常可以含有鹽、緩衝劑、防腐劑、相容性載體和任選的其他治療劑。當用於藥物時，鹽應該是藥學上可接受的，但非藥學上可接受的鹽可以方便地用於製備其藥學上可接受的鹽，並且不排除在本發明的範圍之外。此類藥理學和藥學上可接受的鹽包括但不限於由以下酸製備的鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。此外，藥學上可接受的鹽可以製備為鹼金屬或鹼土鹽，例如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
本發明的方法的一些實施例包括將一種或多種 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑直接施用至組織。在一些實施例中，施用化合物的組織是存在或可能出現 APP 相關疾病或病症的組織，其非限制性實例是心臟。直接組織施用可通過直接注射或其他方式實現。許多口服遞送的化合物自然地到達並穿過肝臟和腎臟，本發明的治療方法的一些實施例包括向受試者口服施用一種或多種 APP dsRNA 藥劑。APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑，無論是單獨施用還是與其他治療劑聯合施用，都可以施用一次，或者可以分多次施用。如果多次施用，APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑可以通過不同的途徑施用。例如，儘管並非旨在限制，第一次（或前幾次）給藥可以通過皮下方式進行，並且一次或多次額外給藥可以是口服和/或全身給藥。
對於需要全身性施用 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑的本發明的實施例，APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑可配製成用於通過注射進行腸胃外施用，例如通過推注或連續輸注。注射製劑可以以單位劑量形式存在，例如安瓿瓶或多劑量容器，添加或不添加防腐劑。APP dsRNA 劑製劑（也稱為藥物組合物）可以採用油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液等形式，並且可以包含配製劑，例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。
用於腸外給藥的製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油（如橄欖油）和可注射有機酯（如油酸乙酯）。水性載體包括水、醇/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏溶液或不揮發性油。靜脈內載體包括液體和營養補充劑、電解質補充劑（如基於林格氏葡萄糖的補充劑）等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。其他給藥形式（如靜脈內給藥）的劑量會較低。如果受試者在初始劑量下反應不足，則可在患者耐受範圍內使用更高劑量（或通過不同的、更局部的遞送途徑有效使用更高劑量）。可根據需要每天使用多劑量，以達到一種或多種 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑的適當全身或局部水平，並實現 APP 蛋白活性的適當降低。
在其它實施例中，本發明的方法包括使用遞送載體，例如適合植入接受者（例如受試者）的生物相容性微粒、奈米顆粒或植入物。根據該方法可能有用的示例性生物可蝕性植入物在 PCT 公開號 WO 95/24929（通過引用併入本文）中進行了描述，該公開號描述了用於容納生物大分子的生物相容性、生物可降解的聚合物基質。
本發明的方法中，可以使用不可生物降解和可生物降解的聚合物基質來將一種或多種 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑遞送至受試者。在一些實施例中，基質可以是可生物降解的。基質聚合物可以是天然或合成聚合物。可以根據需要釋放的時間段來選擇聚合物，通常為幾小時到一年或更長時間。通常，可以使用幾小時到三到十二個月之間的釋放時間。聚合物可選地為水凝膠的形式，其可以吸收高達其重量的約 90% 的水，並且進一步可選地與多價離子或其他聚合物交聯。
一般而言，在本發明的一些實施例中，可以使用生物可蝕性植入物通過擴散或通過聚合物基質的降解來遞送 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑。用於此類用途的示例性合成聚合物在本領域中是眾所周知的。可以使用生物可降解聚合物和生物不可降解聚合物通過本領域已知的方法遞送 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑。生物黏附性聚合物如生物可蝕性水凝膠（參見 H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587，其教導通過引用併入本文）也可用於遞送 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑以治療 APP 相關疾病或病症。其他合適的遞送系統可以包括定時釋放、延遲釋放或持續釋放遞送系統。此類系統可避免重複施用 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑，從而為受試者和醫療保健專業人員增加便利性。許多類型的釋放遞送系統可供使用，並且為本領域的普通技術人員所知。（參見例如：美國專利號 5,075,109；4,452,775；4,675,189；5,736,152；3,854,480；5,133,974；和 5,407,686（每個專利的教導均通過引用併入本文）。此外，可使用基於泵的硬件遞送系統，其中一些適用於植入。
使用長期緩釋植入物可能適合於對受試者進行預防性治療，也適合於有患復發性 APP 相關疾病或病症風險的受試者。本文所用的長期釋放是指植入物的構造和佈置能夠遞送治療水平的 APP dsRNA 劑或 APP 反義多核苷酸劑至少長達 10 天、20 天、30 天、60 天、90 天、六個月、一年或更長時間。長期緩釋植入物是本領域普通技術人員所熟知的，包括上述一些釋放系統。
APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑的治療製劑可通過將具有所需純度的分子或化合物與可選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑混合來製備，以凍乾製劑或水溶液的形式儲存[Remington's Pharmaceutical Sciences第21版，(2006)]。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒，包括緩衝劑，例如磷酸酯、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；烷基對羥基苯甲酸酯例如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子例如鈉；金屬複合物（例如，Zn-蛋白質複合物）；和/或非離子表面活性劑，例如 TWEEN ®、PLURONICS ®或聚乙二醇（PEG）。 細胞、受試者和對照
本發明的方法可與細胞、組織、器官和/或受試者一起使用。在本發明的一些方面，受試者是人類或脊椎動物哺乳動物，包括但不限於狗、貓、馬、牛、山羊、小鼠、大鼠和靈長類動物，例如猴子。因此，本發明可用於治療人類和非人類受試者的 APP 相關疾病或病症。在本發明的一些方面，受試者可以是農場動物、動物園動物、家養動物或非家養動物，並且本發明的方法可用於獸醫預防和治療方案。在本發明的一些實施例中，受試者是人類，並且本發明的方法可用於人類預防和治療方案。
本發明可應用的受試者的非限制性實例是被診斷患有、懷疑患有或有患上與高於期望的 APP 表達和/或活性相關的疾病或病症的風險的受試者，所述疾病或病症也稱為“APP 表達水平升高”。與高於期望的 APP 表達和/或活性相關的疾病和病症的非限制性實例在本文其他地方描述。本發明的方法可應用於在治療時被診斷患有與高於期望的 APP 表達和/或活性相關的疾病或病症的受試者，或被認為有患上或發展與高於期望的 APP 表達和/或活性相關的疾病或病症的風險的受試者。在本發明的某些方面，與高於期望的 APP 表達和/或活性相關的疾病或病症是急性疾病或病症，而在本發明的某些方面，與高於期望的 APP 表達和/或活性相關的疾病或病症是慢性疾病或病症。
在一個非限制性實例中，將本發明的 APP dsRNA 藥劑施用於被診斷為、懷疑患有或有患 AD 風險的受試者，AD 是一種需要降低 APP 表達的疾病。本發明的方法可應用於在治療時被診斷為患有該疾病或病症的受試者，或被認為有患上或發展該疾病或病症的風險的受試者。
在另一個非限制性實例中，將本發明的 APP dsRNA 藥劑施用於被診斷為、懷疑患有或有患 AD 風險的受試者，AD 是一種需要降低 APP 表達的疾病。本發明的方法可應用於在治療時被診斷為患有該疾病或病症的受試者，或被認為有患或發展該疾病或病症風險的受試者。
可應用本發明方法的細胞包括體外、體內、離體細胞。細胞可以存在於受試者體內、培養物中和/或懸浮液中，或處於任何其他合適的狀態或條件中。可應用本發明方法的細胞可以是肝細胞、肝細胞、腦細胞、脊柱細胞、心臟細胞、胰腺細胞、心血管細胞、腎細胞或其他類型的脊椎動物細胞，包括人類和非人類哺乳動物細胞。在本發明的某些方面，可應用本發明方法的細胞是健康、正常細胞，其未知為疾病細胞。在本發明的某些實施例中，應用本發明方法和組合物的細胞是肝細胞、肝臟細胞、腦細胞、脊柱細胞、心臟細胞、胰腺細胞、心血管細胞和/或腎細胞。在本發明的某些方面，對照細胞是正常細胞，但應理解患有疾病或病症的細胞在特定情況下也可用作對照細胞，例如比較患有疾病或病症的治療細胞與患有該疾病或病症的未治療細胞的結果等。
根據本發明的方法，可以確定 APP 多肽活性水平並將其與 APP 多肽活性對照水平進行比較。對照可以是預定值，其可以採用多種形式。它可以是單個截止值，例如中位數或平均值。它可以基於比較組建立，例如具有正常水平的 APP 多肽和/或 APP 多肽活性的組和具有增加水平的 APP 多肽和/或 APP 多肽活性的組。比較組的另一個非限制性例子可以是具有一種或多種 APP 相關疾病或病症症狀或診斷的組；不具有一種或多種疾病或病症症狀或診斷的組；已施用本發明的 siRNA 治療的受試者組；未施用本發明的 siRNA 治療的受試者組。通常，對照可以基於適當年齡段的表面上健康的正常個體或表面上健康的細胞。應當理解，除了預定值之外，根據本發明的對照可以是與實驗材料並行測試的材料樣本。實例包括來自對照群體的樣品或通過製造產生的對照樣品，以與實驗樣品同時進行測試。在本發明的一些實施例中，對照可以包括未接觸或未用本發明的 APP dsRNA 劑處理的細胞或受試者，並且在這種情況下，可以將 APP 多肽和/或 APP 多肽活性的對照水平與接觸本發明的APP dsRNA 劑或APP 反義多核苷酸劑的細胞或受試者中的 APP 多肽和/或 APP 多肽活性水平進行比較。
在本發明的一些實施例中，針對受試者的 APP 多肽水平可以是對照水平與在不同時間針對同一受試者測定的 APP 多肽水平進行比較。在非限制性實例中，在從未接受本發明的 APP 治療的受試者獲得的生物樣品中測定 APP 水平。在一些實施例中，生物樣品是組織樣品。在從受試者獲得的樣品中測定的 APP 多肽水平可以用作受試者的基線或對照值。在本發明的治療方法中向受試者施用一次或多次 APP dsRNA 藥劑後，可以從受試者獲得一個或多個額外的組織樣品，並且可以將後續樣品中的 APP 多肽水平與受試者的對照/基線水平進行比較。這種比較可用於評估受試者中 APP 相關疾病或病症的發作、進展或消退。例如，從受試者獲得的基線樣本中的 APP 多肽水平高於在向同一受試者施用本發明的 APP dsRNA 試劑或 APP 反義多核苷酸試劑之後從該受試者獲得的水平，這指示 APP 相關疾病或狀況的消退並且指示施用的本發明的 APP dsRNA 試劑對於治療 APP 相關疾病或狀況的功效。
在本發明的某些方面，針對受試者確定的 APP 多肽水平和/或 APP 多肽活性中的一個或多個值可用作稍後比較同一受試者中 APP 多肽水平和/或 APP 活性的對照值，從而允許評估受試者中相對於“基線”APP 多肽活性的變化。因此，受試者中可能存在和/或確定初始 APP 多肽水平和/或初始 APP 多肽活性水平，並且本發明的方法和化合物可用於降低受試者中 APP 多肽水平和/或 APP 多肽活性，其中初始水平用作該受試者的對照水平。
使用本發明的方法，可將本發明的 APP dsRNA 劑和/或APP 反義多核苷酸劑施用於受試者。當從受試者獲得的組織樣本中的 APP 多肽水平與在先前時間點從受試者獲得的組織樣本中的 APP 多肽的施用前水平相比，或與非接觸對照水平（例如對照組織樣本中的 APP 多肽水平）相比，降低至少 0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或更多時，可評估本發明的施用和治療的有效性。應理解，APP 多肽的水平和 APP 多肽活性的水平都與 APP 基因表達的水平相關。本發明方法的某些實施例包括向受試者施用有效量的本發明的 APP dsRNA 和/或 APP 反義劑以抑制 APP基因表達並從而降低受試者的 APP 多肽水平和降低 APP 多肽活性水平。
本發明的一些實施例包括確定從一個或多個受試者獲得的一個或多個生物樣品中 APP 多肽的存在、不存在和/或量（本文中也稱為水平）。該確定可用於評估本發明的治療方法的功效。例如，本發明的方法和組合物可用於確定從先前用本發明的 APP dsRNA 劑和/或 APP 反義劑治療的受試者獲得的生物樣品中的 APP 多肽水平。從治療的受試者獲得的組織樣品中測定的 APP 多肽水平與為受試者確定的治療前 APP 多肽水平相比或與非接觸對照生物樣品水平相比低至少 0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或更多，表明向受試者施用的治療的功效水平。
在本發明的一些實施例中，為受試者確定的 APP 相關疾病或病症的生理特徵可以是對照測定，與同一受試者在不同時間的生理特徵測定進行比較。在非限制性示例中，在從未接受本發明的APP 治療的受試者獲得的生物樣品（例如組織樣品）中確定受試者的生理特徵，例如 APP mRNA 水平、APP 蛋白水平（包括 APP 裂解產物）或血漿或組織樣品中的各種形式的 APP（例如 APPα、APPβ、 Aβ 、 Aβ40和/或 Aβ42 等）、APP C-末端片段 (CTF) 多肽（例如 α-CTF 和/或 β-CTF）和/或 MAPT 肽。在從受試者獲得的樣品中確定的APP mRNA 水平（和/或 APP 疾病或病症的其他生理特徵）可以用作受試者的基線或對照值。在本發明的治療方法中，向受試者施用一次或多次 APP dsRNA 藥劑後，可從受試者獲取一個或多個額外的組織樣本，並將後續樣本中的 APP mRNA 水平和/或 APP 蛋白水平（包括 APP 裂解產物）分別與受試者的對照/基線水平和/或比率進行比較。此類比較可用於評估受試者中 APP 相關疾病或病症的發作、進展或消退。例如，從受試者獲得的基線樣本中的APP mRNA 水平高於在向受試者施用本發明的 APP dsRNA 藥劑或 APP 反義多核苷酸藥劑後從同一受試者獲得的樣本中測定的 APP mRNA 水平，表明 APP 相關疾病或病症消退，並表明施用的本發明的 APP dsRNA 藥劑對治療 APP 相關疾病或病症有效。
在本發明的某些方面，針對受試者確定的 APP 相關疾病或病症的一個或多個生理特徵值可用作對照值，以便以後比較同一受試者的生理特徵，從而允許評估受試者相對於“基線”生理特徵的變化。因此，受試者可能存在和/或確定初始生理特徵，並且本發明的方法和化合物可用於降低受試者的 APP 多肽和/或 APP 多肽活性水平，其中初始生理特徵測定值用作該受試者的對照。
使用本發明的方法，可以將本發明的 APP dsRNA 劑和/或APP 反義多核苷酸劑以有效量施用於受試者以治療 APP 疾病或病症。可以通過確定 APP 疾病或病症的一種或多種生理特徵的變化來評估本發明的施用和治療的有效性。在非限制性實例中，與在先前時間點從受試者獲得的組織樣本中的施用前 APP mRNA水平相比，或與非接觸對照水平（例如對照組織樣本中的 APP mRNA 水平）相比，從受試者獲得的組織樣本中的 APP mRNA 水平降低至少 0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或更多時。應理解的是，受試者的 APP mRNA 水平、APP 蛋白水平（包括 APP 裂解產物）或血漿或組織樣本中的各種形式的 APP（例如 APPα、APPβ、 Aβ、 Aβ40 和/或 Aβ42 等）、APP C-末端片段 (CTF) 多肽（例如 α-CTF 和/或 β-CTF）和/或 MAPT 肽均與 APP 基因表達水平相關。本發明方法的某些實施例包括向受試者施用本發明的 APP dsRNA 和/或 APP 反義劑，其量有效抑制 APP 基因表達，從而降低受試者的 APP mRNA 水平、APP 蛋白水平（包括 APP 裂解產物），或以其他方式對受試者的 APP 相關疾病或病症的生理特徵產生積極影響。
本發明的一些實施例包括使用以下方法確定 APP 相關疾病或病症的生理特徵的存在、不存在和/或變化，例如但不限於：(1) 評估從一個或多個受試者獲得的一個或多個生物樣本的生理特徵；(2) 對受試者進行成像（例如但不限於獲取肝臟圖像）；和 (3) 對受試者進行身體檢查。該確定結果可用於評估本發明的治療方法的有效性。 藥盒
本發明的範圍內還包括包含一種或多種 APP dsRNA 劑和/或 APP 反義多核苷酸劑及其在本發明方法中的使用說明的試劑盒。本發明的試劑盒可以包括一種或多種 APP dsRNA 劑、APP 有義多核苷酸和 APP 反義多核苷酸劑，它們可用於治療 APP 相關疾病或病症。可以製備包含一種或多種APP dsRNA 劑、APP 有義多核苷酸和 APP 反義多核苷酸劑的試劑盒以用於本發明的治療方法。本發明的試劑盒的組分可以包裝在水性介質中或凍乾形式中。本發明的試劑盒可以包括載體，該載體被分隔成多個容器裝置或一系列容器裝置，例如試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器等，並將它們緊密地限制在其中。第一容器裝置或一系列容器裝置可容納一種或多種化合物，例如APP dsRNA 劑和/或 APP 有義或反義多核苷酸劑。第二容器裝置或一系列容器裝置可容納靶向劑、標記劑、遞送劑等，它們可作為 APP dsRNA 劑和/或APP 反義多核苷酸的一部分包括在本發明治療方法的實施例中施用。
本發明的試劑盒還可包括說明書。說明書通常為書面形式，用於指導如何實施試劑盒所包含的治療以及根據該治療做出決定。
以下實施例用於說明本發明實踐的具體實例，並非旨在限制本發明的範圍。本領域的普通技術人員將明白，本發明將應用於各種組合物和方法。 具體實施例
實施例1.亞磷醯胺化合物1
在0-5 °C的 N 2氣氛下，向化合物B (500 mg, 1.11 mmol, 1.0 eq) 的 DCM (5.0 mL) 的溶液中添加化合物 D (607 mg, 3.34 mmol, 3.0 eq) 和 DIEA (432 mg, 3.34 mmol, 582 μL, 3.0 eq)，將混合物在 25 °C 下攪拌1.0 小時。LC-MS 顯示化合物 B 已完全消耗，LC-MS 上出現幾個新峰，檢測到約 70.9% 的所需化合物。將所得反應混合物冷卻至-20°C並倒入冷的（0-5°C）飽和NaHCO 3（5.0 mL）溶液中，用DCM（5.0 mL *2）萃取，將合併的有機層用冷的（0-5°C）飽和NaHCO 3/鹽水=1:1（5.0 mL/5.0 mL）洗滌，經Na 2SO 4乾燥並真空濃縮得到殘餘物（~5mL）。殘餘物經柱層析純化（鹼性Al 2O 3，石油醚/乙酸乙酯=10/1至5/1，0.1％Et 3N），得到化合物1（280mg，471μmol，產率42.3％），為白色固體。
1H NMR: EC10615-49-P1N (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.44 (br d, J=7.63 Hz, 2 H), 7.31 (br t, J=7.94 Hz, 6 H), 7.18 - 7.26 (m, 1 H), 6.89 (brd, J=8.00 Hz, 4 H), 4.08 - 4.13 (m, 1 H), 3.95 - 4.03 (m, 1 H), 3.84 - 3.93 (m, 1 H), 3.77 - 3.83 (m, 1 H), 3.74 (s, 6 H), 3.43 - 3.53 (m, 3 H), 3.38 (br d, J=6.75 Hz, 1 H), 2.94 - 3.04 (m, 1 H), 2.70 - 2.85 (m, 1 H), 1.09 - 1.15 (m, 12 H), 1.07 (br s, 3 H)。
實施例2.亞磷醯胺化合物2
將溶於吡啶（400 mL）的 DMTrCl（232 g，684 mmol，1.0 當量）加入溶於吡啶（600 mL）的異甘露醇化合物 A（100 g，684 mmol，1.0 當量）的溶液中，在 25 °C 下攪拌混合物 12 小時。LC-MS 顯示化合物 A 已完全消耗，檢測到一個具有所需質量的主峰。將所得反應混合物用水（500 mL）稀釋，用 DCM（500 mL *2）萃取，將合併的有機相用鹽水（500 mL）洗滌，經Na 2SO 4乾燥並真空濃縮以獲得殘餘物。殘餘物通過柱色譜法（DCM/MeOH=100/1至50/1，0.1%Et 3N）純化，得到化合物B（150g，48.9%收率），為黃色固體。
1H NMR: EC4783-404-P1B1_C (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.46 (br d, J=7.63 Hz, 2 H) 7.28 - 7.37 (m, 6 H) 7.19 - 7.25 (m, 1 H) 6.90 (br d, J=7.88 Hz, 4 H) 4.70 (d, J=6.50 Hz, 1 H) 3.99 - 4.09 (m, 6 H) 3.88 - 3.96 (m, 2 H) 3.83 (br dd, J=7.82, 6.94 Hz, 1 H) 3.74 (s, 6 H) 3.41 (br t, J=8.13 Hz, 1 H) 3.05 (t, J=8.44 Hz, 1 H) 2.85 (br t, J=7.50 Hz, 1 H)。
在25℃的N 2氣氛下，向化合物 B (80.0 g, 178 mmol, 1.0 eq) 的 DCM (800 mL) 溶液中逐滴加入 2H-四唑 (0.45 M, 436 mL, 1.1 eq)，然後將化合物 C (80.6 g, 267 mmol, 85.0 mL, 1.5 eq) 的 DCM (200 mL) 溶液逐滴加入混合物中。將反應混合物在 25°C 下攪拌 1.0 小時。LC-MS 顯示化合物 B 已完全消耗，檢測到一個具有所需質量的主峰。將所得反應混合物冷卻至-20°C並倒入冰冷的飽和NaHCO 3(500mL)中，用DCM(500mL*3)萃取，將合併的有機層用飽和NaHCO 3/鹽水=1:1(300mL/300mL)洗滌，經Na 2SO 4乾燥並在真空中濃縮(35°C)得到殘餘物(100mL)。殘餘物通過柱色譜純化(Al 2O 3，DCM/MeOH=100/1至50/1，0.1％Et 3N)得到化合物2(77g，119mmol，產率66.5％)，為白色固體。
1H NMR: EC4783-423-P1B1_C (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.22 (br d, J=7.50 Hz, 2 H) 7.05 - 7.14 (m, 6 H) 6.96 - 7.02 (m, 1 H) 6.67 (br dd, J=8.82, 1.81 Hz, 4 H) 3.95 - 4.07 (m, 2 H) 3.73 - 3.83 (m, 1 H) 3.62 - 3.72 (m, 2 H) 3.48 - 3.53 (m, 6 H) 3.27 - 3.37 (m, 3 H) 3.11 (s, 6 H) 2.82 (td, J=8.54, 2.31 Hz, 1 H) 2.47 - 2.63 (m, 3 H) 2.28 (br d, J=1.63 Hz, 3 H) 0.82 - 1.00 (m, 13 H)。
可以根據本文所述方法和/或現有技術（例如但不限於US426,220和WO02/36743）製備其他亞磷醯胺。
實施例3.包含本發明的亞磷醯胺單體的固體支持物的製備 代表大孔胺甲基聚乙烯樹脂載體部分
在氮氣保護下將二氯甲烷（19.50kg）加入50L玻璃反應釜中，開啟攪拌，控制溫度在20~30℃，將DMTr imann（1.47kg）、三乙胺（1.50kg）、4-二甲氨基吡啶（0.164kg）和琥珀酸酐（1.34kg）加入玻璃反應釜中，在20~30℃下保溫18h，取樣，終止反應。向反應體系中加入飽和碳酸氫鈉溶液（22.50kg），攪拌10~20min，分層。分離有機相，水相用二氯甲烷萃取兩次，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，真空濃縮，得殘餘物為灰色至類白色固體1.83kg。
將N，N-二甲基甲醯胺（23.50kg）加入100L玻璃釜中，攪拌，控制溫度為20~30℃，在氮氣保護下，將上步產物O-苯並三唑四甲基脲六氟磷酸酯（0.33kg）和N，N-二異丙基乙胺（0.13kg）通過固體加料漏斗加入上述100L玻璃釜中，攪拌10~30分鐘，卸料至50L鋅桶中待用。將大孔胺甲基樹脂(3.25 kg)(購自天津南開合成科技有限公司，批號HA2X1209，負載量0.48 mmol/g)通過固體進料漏斗加入上述100 L固相合成反應器中，控制溫度為20～30 ℃，將N，N-二甲基甲醯胺(21.00 kg+21.00 kg)和上一步鋅桶中的反應液加入固相合成反應器中，保溫反應，跟蹤固體負載至≥250umol/g，負載檢測方法為紫外。在氮氣壓力下過濾，用N，N-二甲基甲醯胺洗滌濾餅三次(26.00 kg+26.10 kg+26.00 kg)，將濾餅留在釜內。將CAP.A(50%乙腈和50%醋酐，4.40kg+4.42kg+4.30kg)和CAP.B(20%吡啶和30%N-甲基咪唑和50%乙腈，4.40kg+4.40kg+4.47kg)加入80L玻璃釜中，攪拌3~8min後使用。此操作重複三次，蓋上蓋子，將乙腈(18.00 kg+18.00 kg+18.00 kg+17.50 kg+17.50 kg)加入固相合成釜中。通氮氣鼓泡10~30min後壓濾。此操作重複四次，將固相合成釜中的濾餅用氮氣吹掃2~4h後轉入50L壓濾罐中。溫度控制在15~30℃，繼續乾燥，乾燥後得到黃色至白色固體產品，重量：3.516kg。
異甘露醇殘基可以通過本領域技術人員熟知的方法，例如反向無鹼基（invab）方法，添加到寡核苷酸鏈的5'-端或3'-端，並進一步添加到目標基團中。
實施例4. APP RNAi劑的合成。
上表 2-3 中所示的 APP RNAi 劑雙鏈體是按照以下一般程序合成的：
使用基於亞磷醯胺化學的成熟固相合成方法，在寡核苷酸合成儀上合成 siRNA 的有義鏈和反義鏈序列。寡核苷酸鏈的擴增通過 4 步循環實現：脫保護、偶聯、加帽和氧化或硫化步驟用於添加每個核苷酸。合成是在由可控孔徑玻璃 (CPG，1000 Å) 製成的固體載體上進行的。單體亞磷醯胺可以從商業來源購買，也可以是實施例 1-2 或 WO2023/045995 中的亞磷醯胺化合物。本文中的亞磷醯胺化合物可以作為單體核苷酸附著到 CPG 或聚苯乙烯固體載體的 3' 端。在附著在 5' 端的情況下，亞磷醯胺化合物可用於最終的偶聯反應，並且如果需要可以進一步與靶配體結合。
根據方案 1 和方案 2 中所示的方法或根據 WO2023/045995 中的方法合成具有 GalNAc 配體簇的亞磷醯胺（GLPA1、GLPA2 和 GLPA15 作為非限制性示例）。在 GalNAc 配體（GLS-5* 或 GLS-15* 作為非限制性示例）附著在有義鏈的 5' 端的情況下，GalNAc 亞磷醯胺（GLPA1、GLPA2 或 GLPA15 作為非限制性示例）用於最後的偶聯反應。二氯甲烷中的 3% 三氯乙酸 (TCA) 用於 4,4'-二甲氧基三苯甲基保護基 (DMT) 的脫保護。5-乙硫基-1H-四唑用作活化劑。 THF/Py/H 2O 中的I 2和吡啶/MeCN 中的苯乙醯二硫化物 (PADS) 分別用於氧化和硫化反應。在最後的固相合成步驟之後，裂解固體載體結合的低聚物，並通過用 1:1 體積的 40 wt.% 甲胺水溶液和 28% 氫氧化銨溶液處理去除保護基。對於用於體外篩選的 siRNA 的合成，將粗混合物濃縮。將剩餘固體溶解在1.0 M NaOAc中，並加入冰冷的 EtOH 以沉澱出作為鈉鹽的單鏈產物，其無需進一步純化即可用於退火。對於用於體內測試的多靶點分子的合成，粗單鏈產物通過離子配對反相高效液相色譜(IP-RP-HPLC) 進一步純化。來自IP-RP-HPLC的經純化單鏈寡核苷酸產物通過溶解在1.0M NaOAc中而轉化為鈉鹽並且通過添加冰冷的EtOH沉澱。等摩爾互補有義鏈和反義鏈寡核苷酸的退火在水中進行，以形成雙鏈siRNA產物，將其凍乾以得到蓬鬆的白色固體。
方案1
方案2
表4：核苷酸序列中使用的核苷酸單體的縮寫表示。應當理解，這些單體當存在於寡核苷酸中時，它們通過5'-3' 磷酸二酯鍵相互連接。並且應當理解，當核苷酸含有2'-氟修飾時，則氟取代親本核苷酸該位置處的羥基(即，它是2'-脫氧-2'-氟核苷酸)。還應當理解，所述縮寫對應於當在3'-末端核苷酸時省略3'-端的磷酸(即，它們是3'-OH)。技術人員將理解這些縮寫只是識別符號並且能夠確定包含這些縮寫的核苷酸序列的連接方式。
縮寫 核苷酸
A 腺苷-3'-磷酸酯
C 胞苷-3'-磷酸酯
G 鳥苷-3'-磷酸酯
T 5-甲基尿苷-3'-磷酸酯
U 尿苷-3'-磷酸酯
a 2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯
c 2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯
g 2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯
t 2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯
u 2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯
Af 2'-氟腺苷-3'-磷酸酯
Cf 2'-氟胞苷-3'-磷酸酯
Gf 2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯
Tf 2'-氟-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯
Uf 2'-氟尿苷-3'-磷酸酯
Af* 2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯
Cf* 2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯
Gf* 2'-氟鳥苷-3'-硫代磷酸酯
Tf* 2'-氟-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
Uf* 2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯
a* 2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯
c* 2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯
g* 2'-O-甲基鳥苷-3'-硫代磷酸酯
t* 2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
u* 2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
aUNA 2', 3'-seco-腺苷-3'-磷酸酯
cUNA 2', 3'-seco-胞苷-3'-磷酸酯
gUNA 2', 3'-seco-鳥苷-3'-磷酸酯
tUNA 2', 3'-seco-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯
uUNA 2', 3'- seco-尿苷-3'-磷酸酯
Vp 乙烯基-磷酸酯
Vpu*
invab 反向無鹼基-5'-磷酸酯。當位於鏈的 3' 末端時，通過其 3' 位置處的取代基(3'-3' 連接)與相鄰核苷酸連接；當位於鏈的5'末端時，通過其5'位置處的取代基(5'-5'核苷酸間連接)與相鄰核苷酸連接。還應當理解，當在 3'-末端位置時，縮寫對應的 invab省略了 5'-磷酸(即，它們是 5'-OH)。
invab* 反向無鹼基-5'-硫代磷酸酯。當位於鏈的 3' 末端時，通過其 3' 位置處的取代基(3'-3' 連接)與相鄰核苷酸連接；當位於鏈的5'末端時，通過其 5' 位置處的取代基(5'-5' 核苷酸間連接)與相鄰核苷酸連接。還應當理解，縮寫對應於invab*，當在3'-末端位置發現時，其省略了5'-硫代磷酸(即，它們是5'-OH)。
imann imann當在每條鏈的末端時： imann當位於每條鏈的中間時：
imann* 異甘露醇殘基-硫代磷酸酯
imann*當位於每條鏈的末端時 imann* 當位於每條鏈的中間時
實施例5. APP siRNA雙鏈體的體外篩選
1）     細胞及主要試劑
BE(2)C 細胞系（藥明提供）
Lipofectamine™ RNAiMAX 轉染試劑（Invitrogen -13778150）
TRIzol™ 試劑（Invitrogen - 15596018）
PrimeScript™ RT 試劑盒（帶 gDNA Eraser）（Perfect Real Time）（TaKaRa-RR047A）
TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa-RR820A)
2）     儀器
研究中使用的主要儀器是 QuantStudio(TM) 7 Flex System（Applied Biosystems）。
3）     引物
引物#3 ： 5'-3'
正向：TGACCATCCAGAACTGGTGC
反向：ACGGTGTGCCAGTGAAGATG
肌動蛋白：5'-3'
正向：GTGGACATCCGCAAAGAC
反向：AAAGGGTGTAACGCAACTAA
Lipofectamine™ RNAiMax (Invitrogen - 13778150 )反向轉染寡核苷酸。將 BE(2)C 細胞用胰蛋白酶消化並調整至適當密度，接種到 24 孔板中，1×10 5個細胞/孔。在接種的同時，使用 Lipofectamine RNAiMax (每孔 2uL) 將測試 siRNA 轉染到細胞中。在 1nM 和 0.2nM 測試 siRNA。使用 scramble siRNA 轉染的孔用作陰性對照。
轉染24小時後，棄去培養基，收穫細胞進行RNA提取。使用TRIzol™試劑（Invitrogen-15596018）按照說明書提取總RNA。
根據手冊使用 PrimeScript™ RT 試劑盒和 gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa-RR047A) 合成 cDNA。
APP cDNA 將通過 qPCR 檢測。同時檢測肌動蛋白 cDNA 作為內部對照。PCR 以 95 °C 進行 30 秒，然後以 95 °C 進行 10 秒，以 50 °C 進行 30 秒，共進行 40 個循環。
抑制率%=（對照相對量-樣品相對量）/對照相對量×100%
表5提供了使用各種APP RNAi劑抑制APP表達的體外研究實驗結果。所用的雙鏈序列與表 2 中所示的序列相對應。
雙鏈AV# 平均抑制率 % (平均值 ± SD)
1 nM 0.2 nM
AV00622 78.19±1.96 32.21±10.71
AV00623 83.64±1.16 50.22±3.13
AV00624 75.13±0.77 48.41±5.01
AV00625 78.09±0.99 51.03±1.51
AV00626 89.85±1.10 60.41±1.99
AV00627 76.10±1.22 52.07±2.99
AV00628 74.98±3.82 52.40±2.12
AV00629 87.34±0.88 63.93±1.72
AV00630 86.64±0.77 57.56±4.22
AV00631 80.76±2.13 54.19±3.00
AV00632 83.32±1.25 51.58±2.20
AV00633 47.61±4.16 37.67±8.72
AV00634 77.94±1.30 55.13±1.53
AV00635 77.95±1.45 54.78±3.06
AV00636 59.64±4.41 47.30±5.77
AV00637 81.59±2.26 53.26±3.62
AV00638 83.45±0.35 54.60±3.74
AV00639 74.37±2.36 57.81±6.20
AV00640 79.97±2.12 56.21±6.47
AV00642 77.79±0.23 60.38±2.90
AV00643 77.23±2.72 59.44±2.24
AV00644 77.48±2.66 54.73±8.32
AV00645 82.25±1.33 59.02±0.36
AV00646 77.31±3.86 43.50±3.83
AV00647 69.42±5.09 43.80±4.04
AV00648 78.35±1.59 49.96±6.85
AV00649 77.64±2.32 51.17±4.07
AV00650 80.1±2.07 52.32±2.77
AV00651 75.47±2.46 48.68±2.41
AV00652 77.55±1.6 49.10±6.57
AV00653 76.83±0.67 38.73±5.33
AV00654 58.84±3.00 16.99±1.28
AV00655 78.02±0.20 51.08±3.40
AV00656 75.99±1.24 43.71±6.65
AV00657 73.75±0.96 47.45±2.21
AV00658 63.43±6.84 21.48±16.08
AV00659 72.94±1.77 44.71±2.77
AV00660 78.04±1.87 46.47±6.76
AV00661 72.21±4.17 14.48±2.47
AV00662 63.91±2.68 7.88±4.18
AV00663 66.38±2.19 20.88±5.42
AV00664 59.08±4.17 15.43±5.50
AV00665 43.59±6.71 8.00±1.99
AV00666 58.33±5.20 25.21±1.88
AV00668 42.45±12.30 34.84±3.31
AV00669 60.86±1.57 2.76±5.89
AV00670 47.58±2.36 37.66±2.66
AV00671 24.87±4.55 10.4±21.85
AV00672 36.4±8.96 28.24±10.36
AV00673 58.76±1.95 49.57±3.37
AV00674 65.81±1.97 50.51±2.61
AV00675 61.01±1.81 45.34±1.82
AV00676 51.52±2.66 44.89±4.62
AV00677 51.25±2.94 32.27±7.46
AV00678 34.62±2.39 37.6±2.35
AV00679 44.25±2.14 40.38±2.72
AV00680 56.25±4.33 39.81±5.25
AV00681 39.13±4.38 33.18±6.28
AV00682 23.65±4.15 13.36±5.44
AV00683 61.6±4.42 34.46±11.16
AV00684 61.31±2.57 51.08±12.06
AV00685 67.97±1.78 45.47±2.51
AV00686 62.85±1.02 51.72±2.95
AV00687 54.69±2.01 48.94±2.55
AV00688 38.54±9.03 47.77±5.40
AV00689 47.22±1.54 40.17±3.32
AV00690 67.02±3.12 52.65±5.20
AV00691 67.83±2.22 54.40±3.58
AV00692 51.46±0.31 36.49±5.74
AV00693 57.86±4.68 37.52±2.27
AV00694 21.26±10.74 32.82±5.77
AV00695 32.99±8.82 25.99±3.59
AV00696 40.16±4.30 35.00±3.57
AV00697 52.96±3.02 43.18±8.75
AV00698 58.28±1.14 46.70±2.72
AV00699 60.08±3.29 52.13±2.50
AV00700 50.09±6.54 48.06±5.38
AV00701 65.17±3.37 28.24±6.70
AV00702 41.7±8.74 29.22±5.85
AV00703 59.69±1.08 39.41±5.04
AV00704 50.74±3.74 44.29±3.69
AV00705 47.31±7.05 46.4±11.02
AV00706 36.84±10.81 33.18±13.90
AV00707 43.98±6.58 32.2±2.89
AV00708 49.88±4.95 37.33±4.56
AV00709 54.35±1.40 32.6±8.33
AV00710 43.48±1.62 23.91±4.90
AV00711 56.3±4.11 28.61±3.64
AV00712 49.98±3.88 33.36±3.36
AV00713 47.35±7.62 30.83±6.35
AV00714 35.08±3.87 28.43±6.31
AV00715 44.43±4.86 42.22±5.04
AV00716 47.15±3.81 32.82±6.02
AV00717 38.39±1.91 22.86±12.85
AV00718 51.94±3.04 36.55±2.27
AV00719 49.64±6.83 20.77±7.00
AV00720 34.68±5.95 17.73±5.38
AV00721 38.54±4.76 33.4±18.98
AV00722 51.84±9.12 38.55±3.21
AV00723 55.24±0.72 35.96±1.61
AV00724 34.38±3.94 30.29±1.1
AV00725 54.78±1.46 32.83±6.34
AV00726 55.90±1.45 29.58±13.49
AV00727 58.73±0.79 41.05±2.82
AV00728 47.47±5.28 20.76±6.9
AV00729 50.47±8.59 40.28±10.26
AV00730 65.15±3.09 42.39±4.71
AV00731 60.06±1.58 39.22±5.8
AV00800 23.53±3.34 21.79±7.17
3）     引物
APP 引物#3 ： 5'-3'
正義：TGACCATCCAGAACTGGTGC
反義：ACGGTGTGCCAGTGAAGATG
GAPDH：5'-3'
正義：TCGTGGAAGGACTCATGACC
反義：TCAGCTCAGGGATGACCTTG
BE(2)C 細胞將按照下文所述，通過 Lipofectamine™ RNAiMax (Invitrogen -13778150) 反向轉染寡核苷酸。將 BE(2)C 細胞用胰蛋白酶消化並調整至適當密度，接種到 96 孔板中，1×10 4細胞/孔。在接種的同時，使用 Lipofectamine RNAiMax (0.3 uL/孔) 將測試 siRNA 轉染到細胞中。在 10 nM 和 1 nM 測試 siRNA。用scramble siRNA 轉染的孔用作陰性對照。
轉染後24小時，除去培養基，收穫細胞進行RNA提取。根據手冊提取總RNA。
APP mRNA 將作為總 RNA，並根據手冊使用 Hifair Advanced One Step RT-Qpcr SYBR Green Kit (YEASEN, 11175ES70) 進行 qPCR 檢測。
抑制率%=（對照相對量-樣品相對量）/對照相對量×100%
表 6 提供了使用各種 APP RNAi 劑抑制 APP 表達的體外研究實驗結果。所用的雙鏈序列與表 2 中所示的序列相對應。
雙鏈 AV# 平均抑制 % (Mean ± SD)
10 nM 1 nM
AV04826 73.84±4.76 45.51±9.67
AV04827 53.68±8.17 13.11±3.04
AV04828 52.88±3.53 13.34±15.82
AV04829 77.44±1.29 25.96±10.19
AV04830 32.04±3.36 -20.57±9.99
AV04831 66.06±5.76 23.34±4.3
AV04832 48.6±7.77 1.85±5.23
AV04833 13.48±12.01 -3.85±7.4
AV04834 49.23±8.14 37.38±13.51
AV04835 74.34±2.44 45.05±6.87
AV04836 23.28±8.79 3.7±3.34
AV04837 60.28±3.24 38.82±2.86
AV04838 54.29±3.14 28.11±7.61
AV04839 52.47±1.15 25.59±6.48
AV04840 55.21±9.26 43.44±2.91
AV04841 68.01±5.74 45.98±2.62
AV04842 77.63±2.73 52.3±6.9
AV04843 20.9±4.05 21.17±4.13
AV04844 53.11±5.5 18.47±4.82
AV04845 80.4±5.84 46.14±9.66
AV04846 53.03±7.84 16.16±5.19
AV04847 53.44±3.8 15.38±1.54
AV04848 67±6.35 40.67±4.73
AV04849 28.04±4.09 11.05±3.12
AV04850 59.15±3.12 47±16.98
AV04851 55.68±7.19 34.14±9.49
AV04852 72.19±3.67 45.11±9.06
AV04853 63.86±2.69 27.55±3.73
AV04854 33.99±7.09 9.56±4.55
AV04855 58.37±0.97 39.51±4.52
AV04856 34.1±5.04 18.99±7.47
AV04857 51.89±4.32 13.87±0.21
AV04858 79.13±1.38 56.39±2.67
AV04859 -5.9±26.69 3.22±2.02
AV04860 44.46±3.88 7.99±11.39
AV04861 48.72±7.11 14.44±10.48
AV04862 67.16±4.41 57.17±4.04
AV04863 57.72±6.1 47.79±5.91
AV04864 45.56±9.95 -8.79±4.11
AV04865 67.43±1.54 40.18±4.8
AV04866 78.11±1.53 65.45±1.32
AV04867 46.48±1.8 16.81±2.23
AV04868 43.45±3.39 4.83±14.75
AV04869 43.53±2.93 4.14±9.39
AV04870 63.58±3.9 50.25±6.51
AV04871 48±2.14 17.59±11.05
AV04872 52.59±5.28 33.83±9.32
AV04873 74.68±3.22 68.5±3.94
AV04874 84.39±2.79 73.09±0.94
AV04875 67.07±6.93 42.02±4.69
AV04876 57.41±8.57 23.62±2.99
AV04877 60.32±8.27 13.3±7.56
AV04878 71.62±6.04 34.19±2.85
AV04879 73.14±7.57 39.88±6.38
AV04880 25.05±9.11 11.25±7.94
AV04881 61.58±1.83 35.91±4.89
AV04882 11.39±5.47 12.52±10
AV04883 83.58±1.24 65.03±8.8
AV04884 61.67±4.35 23.69±3.86
AV04885 72.77±3.11 55.53±4.01
AV04886 37.89±10.09 23.55±5.14
AV04887 78.95±2.47 57.64±2.74
AV04888 56.04±6.44 26.94±7.31
AV04889 74.92±1.08 26.91±8.01
AV04890 41.14±5.86 26.02±10.6
AV04891 63.11±5.88 44.3±4.95
AV04892 70.94±2.38 50.18±6.39
AV04893 58.85±6.61 24.32±5.53
AV04894 70.05±2.54 30.56±1.11
AV04895 45.11±4.02 8.99±5.98
AV04896 17.34±6.63 7.19±5.92
AV04897 -1.55±2.83 1.83±5.66
AV04898 79.18±3.56 58.77±4.01
AV04899 55.64±6.25 24.32±2.65
AV04900 59.58±6.33 19.81±3.45
AV04901 76.34±7.5 63.04±3.81
AV04902 80.7±4.73 67.4±1.19
AV04903 78.8±4.88 58.27±0.96
AV04904 68.52±6.05 55.78±1.16
AV04905 56.6±1.35 20.25±0.55
AV04906 76.39±0.46 58.49±3.11
AV04907 75.48±2.03 63.65±4.53
AV04908 72.54±2.16 66.71±4.94
AV04909 71.55±7.29 74.9±4.82
AV04910 75.84±1.93 65.31±0.97
AV04911 70.76±0.63 59.97±0.35
AV04912 72.94±0.57 62.55±3.46
AV04913 70.21±2.21 70.95±4.39
AV04914 86.01±0.76 82.36±2.15
AV04915 78.55±1.67 75.64±1.87
AV04916 73.38±3.75 57.33±0.52
AV04917 80.13±2.98 70.14±0.06
AV04918 71.88±5.46 62.9±1.96
AV04919 79.02±2.33 70.34±2.55
AV04920 70.19±2.15 55.75±1.94
AV04921 67.61±1.92 50.27±5.33
AV04922 80.85±4.05 82.61±4.32
AV04923 69±1.25 56.73±2.69
AV04924 63.69±3.17 41.82±5.26
AV04925 67.97±6.02 49.35±5.58
AV04926 73.89±1.53 65.45±6.62
AV04927 71±1.41 48.27±3.94
AV04928 59.69±7.96 30.64±2.82
AV04929 67.58±3.3 60.74±6.56
AV04930 81.19±1.34 69.65±2.32
AV04931 78.23±2.27 58.76±2.61
AV04932 77.26±5.05 64.85±1.84
AV04933 82.06±2.82 68.61±1.77
AV04934 72.96±4.35 43.86±3.56
AV04935 73.97±6.35 60.3±2.68
AV04936 74.32±6.36 66.29±2.63
AV04937 64.3±2.35 32.5±3.28
AV04938 76.47±1.66 59.52±4.81
AV04939 70.31±1.34 48.46±6.12
AV04940 73.59±2.89 45.57±10.99
AV04941 77.84±3.93 65.18±4.56
AV04942 70.88±5.95 49.28±1.62
AV04943 71.85±2.19 60.51±6.63
AV04944 73.69±4.14 61.84±0.6
AV04945 70.66±5.62 44.52±3.79
AV04946 73.39±1.52 50.17±2.93
AV04947 66.29±1.52 67.2±3.86
AV04948 63.36±3.46 61.46±4.7
AV04949 54±3.62 28.64±3.7
AV04950 64.6±1.99 59.62±6.03
AV04951 67.61±3.27 55.87±4.95
AV04952 65.43±5.2 54.61±11.59
AV04953 65.66±0.77 46.42±1.03
AV04954 71.5±0.41 46.86±1.94
AV04955 68.14±2.34 41.26±1.12
AV04956 62.65±5.68 33.39±0.93
AV04957 58.46±5.47 24.81±4.14
AV04958 60.81±6.62 32.45±1.11
AV04959 66.98±3.56 51.7±2.41
AV04960 68.65±1.45 45±1.45
AV04961 67.51±2.72 38.56±5.94
AV04962 74.5±1.94 62.11±10.22
AV04963 69.27±0.9 63.2±4.89
AV04964 61.24±2.55 51.92±9.35
AV04965 66.77±2.82 62.7±5.66
AV04966 64.36±2.69 51.33±5.85
AV04967 60.23±1.79 44.49±6.61
AV04968 66.44±2.42 56.18±5.56
實施例6. APP siRNA雙鏈體內測試
第 1 天，雌性 C57BL/6J 小鼠（每組 3 隻）通過靜脈注射編碼人類 APP 和螢光素酶基因的腺相關病毒 8 (AAV8) 載體溶液感染。第 8 天，小鼠皮下注射單劑量 1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg 或10 mg/kg APP siRNA 試劑或 PBS。第 15 天收集肝組織樣本，通過 QPCR 方案定量 APP mRNA 水平。結果見表 7-13。所有測試的 APP RNAi 試劑在 APP 轉導小鼠中均表現出 APP 抑制作用。
表 7 提供了使用各種 APP RNAi 劑抑制 APP 表達的體內研究實驗結果。所用的雙鏈序列與表 3 中所示的序列相對應。
雙鏈AD# D15相對於對照組的剩餘百分比（平均值 ± SD） 劑量(mg/kg)
PBS 1±0.05 /
AD00499 0.09±0.01 3
AD00638 0.18±0.04 3
AD00639 0.35±0.02 3
AD00640 0.16±0.03 3
AD00641 0.31±0.06 3
AD00642 0.28±0.08 3
AD00643 0.20±0.10 3
AD00644 0.12±0.04 3
AD00645 0.25±0.05 3
AD00646 0.12±0.02 3
AD00647 0.31±0.05 3
AD00648 0.12±0.04 3
AD00649 0.36±0.14 3
AD00650 0.18±0.09 3
AD00651 0.23±0.08 3
表 8 提供了使用各種APP RNAi劑抑制APP表達的體內研究實驗結果。所用的雙鏈序列與表 3 中所示的序列相對應。
雙鏈AD# D15相對於對照組的剩餘百分比（平均值 ± SD） 劑量(mg/kg)
PBS 1.03±0.34 /
AD00488 0.32±0.17 3
AD00489 0.32±0.04 3
AD00490 0.17±0.1 3
AD00491 0.35±0.07 3
AD00492 0.16±0.08 3
AD00493 0.64±0.22 3
AD00494 0.13±0.03 3
AD00495 0.1±0.03 3
AD00496 0.23±0.12 3
AD00497 0.14±0.01 3
AD00498 0.24±0.18 3
AD00499 0.06±0.05 3
AD00500 0.09±0.05 3
AD00501 0.08±0.05 3
表 9 提供了使用各種 APP RNAi 劑抑制 APP 表達的體內研究實驗結果。所用的雙鏈序列與表 3 中所示的序列相對應。
雙鏈AD# D15 相對於對照組 的剩餘百分比（平均值 ± SD） 劑量(mg/kg)
PBS 1.01±0.18 /
AD00494 0.2±0.02 10
AD00495 0.16±0.06 10
AD00497 0.14±0.02 10
AD00500 0.07±0.03 10
AD00501 0.06±0.03 10
AD00644 0.02±0.01 10
AD00646 0.01±0.01 10
AD00648 0.03±0.04 10
AD01990 0.21±0.04 10
AD01991 0.33±0.02 10
AD01992 0.35±0.16 10
AD01993 0.22±0.09 10
AD01994 0.16±0.05 10
AD01995 0.16±0.08 10
AD01996 0.26±0.13 10
AD01997 0.22±0.04 10
AD01998 0.2±0.09 10
AD01999 0.2±0.07 10
AD02000 0.2±0.11 10
AD02001 0.09±0.07 10
AD02002 0.17±0.04 10
AD02003 0.26±0.11 10
AD02004 0.24±0.05 10
AD02005 0.29±0.26 10
AD02006 0.18±0.06 10
AD02007 0.12±0.06 10
AD02008 0.19±0.05 10
表 10 提供了使用各種 APP RNAi 劑抑制 APP 表達的體內研究實驗結果。所用的雙鏈序列與表 3 中所示的序列相對應。
雙鏈AD# D15相對於對照組的剩餘百分比 (平均值± SD) 劑量(mg/kg)
PBS 1.06±0.3 /
AD00494 0.3±0.1 2
AD00495 0.45±0.08 2
AD00497 0.42±0.05 2
AD00499 0.19±0.07 2
AD00500 0.33±0.09 2
AD00501 0.21±0.01 2
AD00644 0.13±0.03 2
AD00646 0.15±0 2
AD00648 0.27±0.04 2
AD01990 0.27±0.02 2
AD01994 0.17±0.01 2
AD01995 0.16±0.01 2
AD01998 0.2±0.03 2
AD01999 0.22±0.03 2
AD02000 0.34±0.04 2
AD02001 0.21±0.03 2
AD02002 0.61±0.11 2
AD02006 0.83±0.49 2
AD02007 0.16±0.03 2
AD02008 0.24±0.07 2
表 11 提供了使用各種 APP RNAi 劑抑制 APP 表達的體內研究實驗結果。所用的雙鏈序列與表 3 中所示的序列相對應。
雙鏈AD# D15相對於對照組的剩餘百分比 (平均值± SD) 劑量(mg/kg)
PBS 1.13±0.42 /
AD00644 0.05±0.02 1
AD00646 0.18±0.03 1
AD00648 0.07±0.04 1
AD00650 0.06±0.01 1
AD01994 0.89±0.47 1
AD01995 0.28±0.13 1
AD01997 0.76±0.59 1
AD02001 0.11±0.06 1
AD02002 0.59±0.21 1
AD02007 0.14±0.04 1
AD02008 0.23±0.11 1
表 12 提供了使用各種 APP RNAi 劑抑制 APP 表達的體內研究實驗結果。所用的雙鏈序列與表 3 中所示的序列相對應。
雙鏈AD# D15相對於對照組的剩餘百分比 (平均值± SD) 劑量(mg/kg)
PBS 1.07±0.24 /
AD02802 0.24±0.04 1
AD02803 0.67±0.15 1
AD02804 0.7±0.41 1
AD02807 0.76±0.1 1
AD02808 0.98±0.18 1
AD02809 0.88±0.3 1
AD02810 0.55±0.07 1
AD02812 0.38±0.06 1
AD02813 0.63±0.16 1
AD02814 0.47±0.06 1
AD02815 0.59±0.07 1
AD02816 0.44±0.19 1
AD02817 0.75±0.05 1
AD02819 0.69±0.02 1
AD02820 0.86±0.11 1
表 13 提供了使用各種 APP RNAi 劑抑制 APP 表達的體內研究實驗結果。所用的雙鏈序列與表 3 中所示的序列相對應。
雙鏈AD# D15相對於對照組的剩餘百分比 (平均值± SD) 劑量(mg/kg)
PBS 1.02±0.15 /
AD02822 0.45±0.09 1
AD02823 0.57±0.03 1
AD02824 0.21±0.03 1
AD02825 0.32±0.05 1
AD02826 0.33±0.01 1
AD02827 0.53±0.09 1
AD02828 0.23±0.04 1
AD02829 0.34±0.1 1
AD02830 0.13±0.01 1
AD02831 0.19±0.04 1
AD02832 0.16±0.02 1
AD02833 0.18±0.07 1
AD02834 0.25±0.03 1
AD02835 0.26±0.03 1
AD02836 0.46±0.03 1
AD02837 0.28±0.06 1
AD02838 0.39±0.06 1
AD02839 0.18±0.01 1
AD02840 0.17±0.02 1
AD02841 0.1±0.01 1
AD02842 0.34±0.07 1
AD02843 0.4±0.02 1
AD02844 0.33±0.04 1
AD02845 0.4±0.03 1
AD02846 0.18±0.03 1
AD02847 0.35±0.05 1
AD02848 0.28±0.08 1
AD02849 0.44±0.06 1
AD02850 0.48±0.11 1
AD02851 0.17±0.04 1
AD02852 0.38±0.06 1
AD02853 0.49±0.08 1
AD02854 0.5±0.06 1
AD02855 0.61±0.15 1
AD02856 0.43±0.02 1
AD02857 0.63±0.04 1
AD02858 0.52±0.1 1
AD02859 0.4±0.03 1
AD02860 0.9±0.17 1
AD02861 0.59±0.07 1
AD02862 0.48±0.07 1
AD02863 0.62±0.18 1
AD02864 0.56±0.03 1
AD02865 0.38±0.08 1
AD02866 0.99±0.14 1
等同物
儘管本文已描述和說明了本發明的幾個實施例，但本領域的普通技術人員將容易地設想出各種其他手段和/或結構，用於執行功能和/或獲得結果和/或本文所述的一個或多個優點，並且這些變化和/或修改中的每一個都被視為在本發明的範圍內。更一般地，本領域的技術人員將容易地理解，本文所述的所有參數、尺寸、材料和配置都旨在作為示例，並且實際參數、尺寸、材料和/或配置將取決於使用本發明教導的特定應用。本領域的技術人員將認識到，或能夠僅使用常規實驗就確定本文所述的本發明的具體實施例的許多等效物。因此，應理解，前述實施例僅以示例的方式呈現，並且在所附申請專利範圍及其等效物的範圍內；本發明可以以不同於具體描述和要求的方式實施。本發明針對本文所述的每個單獨的特徵、系統、物品、材料和/或方法。此外，兩個或多個這樣的特徵、系統、物品、材料和/或方法的任意組合（如果這些特徵、系統、物品、材料和/或方法不相互矛盾）均包括在本發明的範圍內。
本文定義和使用的所有定義應被理解為控制詞典定義、通過引用併入的文件中的定義和/或定義術語的通常含義。除數字表示外，複數和單數應被視為可以互換。
本說明書和權利要求書中所使用的不定冠詞“a”和“an”，除非另有明確說明，應理解為“至少一個”。
本文使用的術語“或”表示“和/或”，除非上下文明確排除，否則可與後者互換使用。說明書和權利要求書中使用的短語“和/或”應理解為表示如此結合的要素的“任一或兩者”，即，要素在某些情況下是連在一起的，而在其他情況下是分離地存在的。如果有兩個以上的要素並用逗號分隔，則“和/或”之前的逗號具有與“和/或”相同的含義，相應地表示“和”或“或”。除了“和/或”條款中明確標識的要素之外，還可以可選地存在其他要素，無論這些要素與明確標識的要素相關還是不相關，除非明確表明相反。
本申請中引用或提及的所有參考文獻、專利和專利申請和出版物均以引用的方式全文併入本文中。
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Claims (76)

  1. 一種用於抑制澱粉樣蛋白前體（APP）表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，其中所述dsRNA劑包括一條有義鏈和一條反義鏈，其中所述有義鏈包含與SEQ ID NO：1的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且所述反義鏈包含與SEQ ID NO：2的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，其中所述有義鏈和所述反義鏈可以部分、基本或完全互補。
  2. 如請求項1 所述的 dsRNA 試劑，其中所述反義鏈包含與編碼APP 的mRNA 互補的區域，該區域包含與表 1-3 中任一個中列出的反義序列之一相差不超過 1、2 或 3 個核苷酸的至少 15 個連續核苷酸。
  3. 如請求項1 所述的 dsRNA 試劑， 其中所述反義鏈包含與編碼APP 的mRNA 互補的區域，該區域包含來自表 1-3 中任一個所列出的反義序列中的任一個的至少 15 個連續核苷酸。
  4. 一種用於抑制澱粉樣蛋白前體（APP）表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，其中所述dsRNA劑包含有義鏈和反義鏈，反義鏈中的核苷酸位置2至18包含與APP RNA轉錄本互補的區域，其中所述互補區域包含與表1-3之一中所列的反義序列之一相差0、1、2或3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且任選地包含靶向配體。
  5. 如請求項4所述的dsRNA劑，其中與APP RNA轉錄本互補的區域包含與表1-3之一中列出的反義序列之一的相差不超過3個核苷酸的至少15、16、17、18或19個連續核苷酸。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的dsRNA劑，其中dsRNA的反義鏈與SEQ ID NO: 1的任一個靶區域基本上或完全互補，並且優選地所述dsRNA劑包含表1-3中任一個所述的反義鏈序列。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈序列至少基本上與所述dsRNA劑中的反義鏈序列互補或完全互補，優選地，其中所述dsRNA劑包含表1-3中任一個所述的有義鏈序列。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含表1-3任一個中作為雙鏈體序列列出的序列。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含至少一個修飾的核苷酸。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的dsRNA劑，其中有義鏈和/或反義鏈的所有或基本上所有核苷酸都是修飾的核苷酸。
  11. 一種用於抑制澱粉樣蛋白前體（APP）表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，其中所述dsRNA劑包括有義鏈和反義鏈，其中所述有義鏈與所述反義鏈互補，其中所述反義鏈包含與編碼APP的mRNA的部分互補的區域，其中每條鏈的長度為約15至約30個核苷酸，其中所述有義鏈序列可以用式（I）表示： 5’-(N’ L) n’N’ LN’ LN’ N1N’ N2N’ N3N’ N4N’ LN’ FN’ LN’ N5N’ N6N’ LN’ LN’ L(N’ L) m’-3’(I)； 其中：每個N’ F表示2'-氟修飾的核苷酸； 每個N’ N1、N’ N2、N’ N3、N’ N4、N’ N5和N’ N6獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸； 每個N’ L獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸，但不是2'-氟修飾的核苷酸； 並且m’和n’各自獨立地為0至7的整數。
  12. 一種用於抑制澱粉樣蛋白前體（APP）表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，其中所述dsRNA劑包括一條有義鏈和一條反義鏈，其中所述有義鏈與所述反義鏈互補，其中所述反義鏈包含與編碼APP的mRNA的部分互補的區域，其中每條鏈的長度約為18至約30個核苷酸，其中所述反義鏈序列可以用式（II）表示： 3’-(N L) nN M1N LN M2N LN FN LN M3N LN M4N LN M5N M6N LN M7N M8N LN FN L-5’(II)； 其中：每個N F代表一個2'-氟修飾的核苷酸； 每個N M1、N M2、N M3、N M4、N M5、N M6、N M7和N M8獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸； 每個N L獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸，但不是2'-氟修飾的核苷酸； 且n為0至7的整數。
  13. 一種用於抑制澱粉樣蛋白前體（APP）表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA）劑，其中所述dsRNA劑包括一條有義鏈和一條反義鏈，其中所述有義鏈和反義鏈形成dsRNA雙鏈體，其中所述有義鏈與反義鏈互補，其中所述反義鏈包含與編碼APP的mRNA互補的區域，其中所述互補區域包含至少15個連續的核苷酸，其中所述dsRNA雙鏈體由式（III）表示： 有義鏈: 5’-(N’ L) n’N’ LN’ LN’ N1N’ N2N’ N3N’ N4N’ LN’ FN’ LN’ N5N’ N6N’ LN’ LN’ L(N’ L) m’-3’ 反義鏈: 3’-(N L) nN M1N LN M2N LN FN LN M3N LN M4N LN M5N M6N LN M7N M8N LN FN L-5’ (III)； 其中： 每條鏈的長度獨立地為約17至約30個核苷酸； 每個N F和N’ F獨立地表示2’-氟修飾的核苷酸； 每個N M1、N M2、N M3、N M4、N M5、N M6、N M7、N M8、N’ N1、N’ N2、N’ N3、N’ N4、N’ N5和N’ N6各自獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸； 每個N L和N’ L獨立地表示修飾或未修飾的核苷酸，但不是2'-氟修飾的核苷酸； 且m’、n’和n各自獨立地為0至7的整數。
  14. 如請求項9-13中任一項所述的dsRNA劑，其中所述一個或多個修飾的核苷酸獨立地選自以下組成的組：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-脫氧核苷酸、2'3'-seco核苷酸模擬物、鎖核苷酸、解鎖核酸核苷酸（UNA）、乙二醇核酸核苷酸（GNA）、2'-F-阿拉伯糖核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向無鹼基核苷酸、異甘露醇核苷酸、反向2'-Oe核苷酸、反向2'-脫氧核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、3'-OMe核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸、5'-磷酸酯或 5'-磷酸酯模擬物修飾的核苷酸、連接至膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團的末端核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、磷酸醯胺酯或包含非天然鹼基的核苷酸。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的dsRNA劑，其包含位於引導鏈的5΄端的E-乙烯基膦酸酯核苷酸。
  16. 如請求項1-15中任一項所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵。
  17. 如請求項1-15中任一項所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵。
  18. 如請求項1-15中任一項所述的dsRNA劑，其中所述反義鏈包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵。
  19. 如請求項1-15中任一項所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵。
  20. 如請求項1-15中任一項所述的dsRNA劑，其中所述反義鏈包含1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯核苷間鍵。
  21. 如請求項1-20中任一項所述的dsRNA劑，其中所述修飾的有義鏈是表2-3之一中所示的修飾的有義鏈序列。
  22. 如請求項1-20中任一項所述的dsRNA劑，其中所述修飾的反義鏈是表2-3之一中所示的修飾的反義鏈序列。
  23. 如請求項1-22中任一項所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈與所述反義鏈互補或基本上互補，並且互補區域的長度在16至23個核苷酸之間。
  24. 如請求項1-23中任一項所述的dsRNA劑，其中互補區域的長度為19至21個核苷酸。
  25. 如請求項1-24中任一項所述的dsRNA劑，其中每條鏈的長度不超過30個核苷酸。
  26. 如請求項1-24中任一項所述的dsRNA劑，其中每條鏈的長度不超過25個核苷酸。
  27. 如請求項1-24中任一項所述的dsRNA劑，其中每條鏈的長度不超過23個核苷酸。
  28. 如請求項1-27中任一項所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑包含至少一個修飾的核苷酸並且還包含一個或多個靶向基團或連接基團。
  29. 如請求項28所述的dsRNA劑，其中一個或多個靶向基團或連接基團與有義鏈綴合。
  30. 如請求項28或29所述的dsRNA劑，其中所述靶向基團或連接基團包括N-乙醯半乳糖胺( GalNAc) 。
  31. 如請求項28或29所述的dsRNA劑，其中所述靶向基團具有以下結構： GLO-1 GLS-1 * GLO-2 GLS-2 * GLO-3 GLS-3 * GLO-4 GLS-4 * GLO-5 GLS-5 * GLO-6 GLS-6 * GLO-7 GLS-7 * GLO-8 GLS-8 * GLO-9 GLS-9 * GLO-10 GLS-10 * GLO-11 GLS-11 * GLO-12 GLS-12 * GLO-13 GLS-13 * GLO-14 GLS-14 * GLO-15 GLS-15 * GLO-16 GLS-16 *
  32. 如請求項1-31中任一項所述的 dsRNA 劑，其中所述 dsRNA 劑包含與有義鏈的 5' 末端綴合的靶向基團。
  33. 如請求項1-31中任一項所述的 dsRNA 劑，其中所述 dsRNA 劑包含與有義鏈的 3' 末端綴合的靶向基團。
  34. 如請求項1-31中任一項所述的dsRNA劑，其中所述反義鏈在3'末端包含一個反向無鹼基殘基。
  35. 如請求項1-31中任一項所述的dsRNA劑，其中所述有義鏈在3'或/和5'末端包含一個或兩個反向無鹼基殘基或imann殘基。
  36. 如請求項1-35中任一項所述的dsRNA劑，其中所述dsRNA劑具有兩個平端。
  37. 如請求項1-35中任一項所述的dsRNA劑，其中至少一條鏈包含至少1個核苷酸的3'突出端。
  38. 如請求項1-35中任一項所述的dsRNA劑，其中至少一條鏈包含至少2個核苷酸的3'突出端。
  39. 一種包含如請求項1-38中任一項所述dsRNA劑的組合物。
  40. 如請求項39所述的組合物，其還包含藥學上可接受的載體。
  41. 如請求項40所述的組合物，其還包含一種或多種另外的治療劑。
  42. 如請求項41所述的組合物，其中所述組合物被包裝在試劑盒、容器、包裝袋、分配器、預填充注射器或小瓶中。
  43. 如請求項39-42中任一項所述的組合物，其中所述組合物配製用於皮下給藥、配製用於鞘內給藥或配製用於靜脈內(IV)給藥。
  44. 一種包含如請求項1-38中任一項所述的dsRNA劑的細胞，任選地，所述細胞是哺乳動物細胞，任選地是人類細胞。
  45. 一種抑制細胞中APP基因表達的方法，其係包括： (i) 製備包含有效量的如請求項1-38任一項中所述的雙鏈核糖核酸(dsRNA)劑或如請求項39-43任一項中所述的組合物的細胞。
  46. 如請求項45所述的方法，其進一步包括： (ii) 維持請求項45(i) 製備的細胞足夠的時間以獲得 APP基因mRNA轉錄本的降解，從而抑制細胞中APP基因的表達。
  47. 如請求項45-46中任一項所述的方法，其中所述細胞位於受試者體內並且將所述dsRNA劑皮下施用於所述受試者。
  48. 如請求項45-46中任一項所述的方法，其中所述細胞位於受試者體內並且將所述dsRNA藥劑通過鞘內施用於所述受試者。
  49. 如請求項45-46中任一項所述的方法，其中所述細胞位於受試者體內並且通過靜脈內給藥將所述dsRNA劑施用於所述受試者。
  50. 如請求項47-49中任一項所述的方法，其進一步包括在向受試者施用所述dsRNA藥劑之後評估對APP基因的抑制，其中評估方法包括： (i)確定受試者的APP相關疾病或病症的一個或多個生理特徵，以及 (ii)將所確定的生理特徵與APP相關疾病或病症的治療前生理特徵基線和/或APP相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較， 所述比較表明受試者中APP基因表達的抑制存在或不存在中的一種或多種。
  51. 如請求項50所述的方法，其中，所確定的生理特徵是下列中的一種或多種：受試者的APP mRNA水平、APP蛋白水平、 APPα、APPβ、Aβ、Aβ40和/或Aβ42、α-CTF、β-CTF 、 MAPT肽和/或各種形式的APP裂解產物。
  52. 如請求項51所述的方法，其中受試者的APP mRNA水平、APP蛋白水平、APPα、APPβ、Aβ、Aβ40和/或Aβ42、α-CTF、β- CTF 、 MAPT肽和/或各種形式的APP裂解產物中的一種或多種的降低表明受試者的APP基因表達的降低。
  53. 一種抑制受試者中APP基因表達的方法，其係包括向所述受試者施用有效量的如請求項1-38中任一項所述的雙鏈核糖核酸(dsRNA)劑或如請求項39-43中任一項所述的組合物。
  54. 如請求項53所述的方法，其中所述dsRNA劑通過皮下施用於受試者。
  55. 如請求項53 所述的方法，其中所述 dsRNA 劑通過鞘內施用於受試者。
  56. 如請求項53 所述的方法，其中所述 dsRNA 劑通過 IV 給藥施用於受試者。
  57. 如請求項54-56中任一項所述的方法，其還包括在施用所述dsRNA劑之後評估對所述APP基因的抑制，其中評估的方法包括： (i)確定受試者的APP相關疾病或病症的一個或多個生理特徵，以及 (ii)將所確定的生理特徵與APP相關疾病或病症的治療前生理特徵基線和/或APP相關疾病或病症的對照生理特徵進行比較， 所述比較表明受試者中APP基因表達的抑制的存在或不存在中的一種或多種。
  58. 如請求項57所述的方法，其中，所確定的生理特徵是以下中的一種或多種：APP mRNA水平、APP蛋白水平、APPα、APPβ、Aβ、Aβ40和/或Aβ42、α-CTF、β-CTF 、 MAPT肽和/或各種形式的APP裂解產物。
  59. 如請求項58 所述的方法，其中受試者的 APP mRNA 水平、APP 蛋白水平、APPα、APPβ、Aβ、Aβ40 和/或 Aβ42、α-CTF、β-CTF 、 MAPT 肽和/或各種形式的 APP 裂解產物中的一種或多種的降低表明受試者的 APP 基因表達的降低。
  60. 一種治療與 APP 蛋白的存在相關的疾病或病症的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的如請求項1-38中任一項所述的雙鏈核糖核酸 (dsRNA) 劑或如請求項39-43 中任一項所述的組合物，以抑制 APP 基因表達。
  61. 如請求項60所述的方法，其中所述疾病或病症是下列中的一種或多種：腦澱粉樣血管病(CAA)、唐氏症(DS)和阿爾茨海默病(AD)，包括遺傳性CAA、早發性家族性阿爾茨海默病(EOFAD或eFAD)、晚發性AD(LOAD)，以及肌萎縮側索硬化症(ALS)、額顳葉癡呆、亨廷頓病、帕金森病、脊髓小腦、朊病毒、拉福拉病、中風，或與APP相關的其他神經退行性疾病或異常。
  62. 如請求項61所述的方法，其進一步包括向所述受試者施用另外的治療方案。
  63. 如請求項62所述的方法，其中所述另外的治療方案包括：向所述受試者施用本發明的一種或多種APP反義多核苷酸，向所述受試者施用非APP dsRNA治療劑，和對所述受試者進行行為改變。
  64. 如請求項63所述的方法，其中所述非APP dsRNA治療劑是以下中的一種或多種：膽鹼酯酶抑制劑(例如多奈呱齊、利凡斯的酯和加蘭他敏)、美金剛、BACE1i、免疫療法、分泌酶抑制劑(例如γ分泌酶抑制劑)、乙醯膽鹼酯酶抑制劑、NMDA受體拮抗劑、針對Abeta的抗體(例如aducanumab)、針對tau蛋白的藥劑、抗突觸核蛋白抗體、富馬酸鹽化合物、抗炎劑、抗脂肪變性劑、抗病毒劑和/或抗纖維化劑；或前述任意的組合。
  65. 如請求項60-64中任一項所述的方法，其中所述dsRNA劑皮下施用於受試者。
  66. 如請求項60-64中任一項所述的方法，其中將所述dsRNA劑通過鞘內施用於受試者。
  67. 如請求項60-64中任一項所述的方法，其中所述dsRNA劑通過IV給藥施用於受試者。
  68. 如請求項60-64中任一項所述的方法，其還包括確定施用的雙鏈核糖核酸(dsRNA)劑在受試者中的功效。
  69. 如請求項68所述的方法，其中確定所述治療在受試者中的功效的方法包括： (i)確定受試者的 APP 相關疾病或病症的一個或多個生理特徵，以及 (ii) 將確定的生理特徵與 APP 相關疾病或病症的治療前生理特徵基線進行比較； 其中，比較表明向受試者施用雙鏈核糖核酸 (dsRNA) 劑的功效的存在、不存在和水平中的一個或多個。
  70. 如請求項69所述的方法，其中所確定的生理特徵是：APP mRNA水平、APP蛋白水平、APPα、APPβ、Aβ、Aβ40和/或Aβ42、α-CTF、β-CTF 、 MAPT肽和/或各種形式的APP裂解產物。
  71. 如請求項69 所述的方法，其中 APP mRNA 水平、APP 蛋白水平、APPα、APPβ、Aβ、Aβ40 和/或 Aβ42、α-CTF、β-CTF 、 MAPT 肽和/或各種形式的APP裂解產物中的一種或多種的降低表明向受試者施用雙鏈核糖核酸 (dsRNA)劑具有功效。
  72. 一種與受試者體內APP 蛋白的基線治療前水平相比降低所述受試者體內APP蛋白水平的方法，其係包括向所述受試者施用有效量的如請求項1-38 中任一項所述的雙鏈核糖核酸 (dsRNA) 劑或如請求項39-43中任一項所述的組合物，以降低 APP 基因表達水平。
  73. 如請求項72所述的方法，其中所述dsRNA劑通過皮下施用給受試者、通過鞘內施用給受試者或者通過IV施用給受試者。
  74. 一種改變受試者的 APP 相關疾病或病症的生理特徵的方法，其中，與受試者的 APP 相關疾病或病症的治療前生理特徵基線相比，所述方法包括向受試者施用有效量的如請求項1-38 中任一項所述的雙鏈核糖核酸 (dsRNA) 試劑或如請求項39-43 中任一項所述的組合物，以改變受試者的APP相關疾病或病症的生理特徵。
  75. 如請求項74所述的方法，其中所述dsRNA劑通過皮下施用給受試者、通過鞘內施用給受試者或者通過IV施用給受試者。
  76. 如請求項74-75中任一項所述的方法，其中所述生理特徵是以下中的一種或多種：APP mRNA水平、APP蛋白水平、APPα、APPβ、Aβ、Aβ40和/或Aβ42、α-CTF、β-CTF 、 MAPT肽和/或各種形式的APP裂解產物。
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