[go: up one dir, main page]

TW202503065A - 生產重組ａａｖ顆粒製劑之方法 - Google Patents

生產重組ａａｖ顆粒製劑之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202503065A
TW202503065A TW113110368A TW113110368A TW202503065A TW 202503065 A TW202503065 A TW 202503065A TW 113110368 A TW113110368 A TW 113110368A TW 113110368 A TW113110368 A TW 113110368A TW 202503065 A TW202503065 A TW 202503065A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
aav
adeno
associated virus
gene
raavp
Prior art date
Application number
TW113110368A
Other languages
English (en)
Inventor
茱利亞 伊曼奈克
斯帆 馬克特
Original Assignee
瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 filed Critical 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Publication of TW202503065A publication Critical patent/TW202503065A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0016—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the nucleic acid is delivered as a 'naked' nucleic acid, i.e. not combined with an entity such as a cationic lipid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

在本文中所報導的係一種生產重組腺相關病毒顆粒製劑 (rAAVp) 之方法，其包含培養哺乳動物細胞之步驟，該哺乳動物細胞包含針對間隔在兩個 AAV 反向末端重複序列 (ITR) 之間的非腺相關病毒基因、腺相關病毒 rep 基因、腺相關病毒 cap 基因、腺相關病毒 E1A 基因、腺相關病毒 E1B 基因、腺相關病毒 E2A 基因、腺相關病毒 E4orf6 及腺相關病毒 VA RNA 基因之表現匣，並由此生產該 rAAVp，其中該培養係在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下。藉由在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下的該培養所生產之該 rAAVp 的產量係高於藉由在 pH 7.0 至 pH 7.2 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp 的產量，且藉由在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下的該培養所生產之該 rAAVp 相較於藉由在 pH 7.0 至 pH 7.2 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp，具有較高的完整顆粒百分比。

Description

生產重組　AAV　顆粒製劑之方法
本發明處於基因治療的領域。更具體而言，本發明涉及一種在哺乳動物細胞、特別是 CHO 及 HEK 細胞中、在本領域通常使用的較高 pH 值下產生包含治療性轉殖基因的重組腺相關病毒顆粒之方法。
基因療法為新穎的治療方法帶來了前所未有的機會。基於藉由共表現正確的基因來拯救功能突變的概念，為了使生物學功能得以恢復，需要使用病毒載體來確保治療性基因的適當遞送。在這種情況下，重組腺相關病毒 (rAAV) 是使用最廣泛的載體。
病毒的生物處理非常複雜，並且在上游處理以及下游處理兩者中都需要有系統且協調的步驟。然而，使用傳統培養製程來生產治療性病毒並不支持有效的商業製造策略。與治療性生物分子 (諸如例如抗體) 相比，病毒的尺寸較大，這一點甚至更加明顯。此外，病毒要複雜得多。
治療性病毒的生物製造過程需要將治療性轉殖基因插入至重組 AAV 殼體殼 (全 rAAV 顆粒，即包含殼體化核酸的重組 AAV 顆粒)。然而，亦可能產生一定百分比的不包含所需轉殖基因的 rAAV (空重組 AAV 顆粒，即不包含殼體化核酸的 rAAV 顆粒)，以及部分填充的 rAAV (部分填充的重組 AAV 顆粒)。
本發明至少部分地基於以下發現：當在升高的 pH 值諸如 pH 7.4-7.6 下進行培養時，產生重組腺相關病毒顆粒的哺乳動物細胞的生產力可以增加。
本發明至少部分地基於以下發現：當在升高的 pH 值諸如 pH 7.4-7.6 下進行培養時，從對產生該重組腺相關病毒顆粒的哺乳動物細胞的培養獲得的完整重組 AAV 顆粒的分數可以增加。
本發明至少包含以下實施例： 1.     一種生產重組腺相關病毒顆粒製劑 (rAAVp) 之方法，其包含培養哺乳動物細胞之步驟，該哺乳動物細胞包含針對間隔在兩個 AAV 反向末端重複序列 (ITR) 之間的非腺相關病毒基因、針對腺相關病毒 rep 基因、針對腺相關病毒 cap 基因、針對腺相關病毒 E1A 基因、針對腺相關病毒 E1B 基因、針對腺相關病毒 E2A 基因、針對腺相關病毒 E4orf6 及視情況針對腺相關病毒 VA RNA 基因之表現匣，並由此生產 rAAVp， 其中該培養係在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下。 2.     一種生產重組腺相關病毒顆粒製劑 (rAAVp) 之方法，其包含培養 HEK 細胞之步驟，該 HEK 細胞包含針對間隔在兩個 AAV 反向末端重複序列 (ITR) 之間的非腺相關病毒基因、針對腺相關病毒 rep 基因、針對腺相關病毒 cap 基因、針對腺相關病毒 E2A 基因、針對腺相關病毒 E4orf6 及視情況針對腺相關病毒 VA RNA 基因之表現匣，並由此生產 rAAVp， 其中該培養係在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下。 3.     如實施例 1 或 2 中任一項之方法，其中哺乳動物細胞為 HEK293 細胞。 4.     如實施例 1 至 3 中任一項之方法，其中藉由在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp 的基因體滴度係高於藉由在 pH 7.0 至 pH 7.2 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp 的殼體滴度。 5.     如實施例 4 之方法，其中基因體滴度高至少 1.5 倍。 6.     如實施例 4 至 5 中任一項之方法，其中基因體滴度高至少 2 倍。 7.     如實施例 4 至 6 中任一項之方法，其中基因體滴度高至少 6 倍。 8.     如實施例 4 至 7 中任一項之方法，其中基因體滴度高至少 10 倍。 9.     如實施例 1 至 8 中任一項之方法，其中藉由在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp 的殼體滴度係高於藉由在 pH 7.0 至 pH 7.2 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp 的殼體滴度。 10.   如實施例 9 之方法，其中殼體滴度高至少 1.5 倍。 11.   如實施例 9 至 10 中任一項之方法，其中殼體滴度高至少 2 倍。 12.   如實施例 9 至 11 中任一項之方法，其中殼體滴度高至少 3 倍。 13.   如實施例 1 至 12 中任一項之方法，其中藉由在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp 的基因體滴度及殼體滴度係高於藉由在 pH 7.0 至 pH 7.2 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp 的基因體滴度及殼體滴度。 14.   如實施例 13 之方法，其中基因體滴度及殼體滴度高至少 1.5 倍。 15.   如實施例 13 至 14 中任一項之方法，其中基因體滴度及殼體滴度高至少 2 倍。 16.   如實施例 13 至 15 中任一項之方法，其中基因體滴度及殼體滴度高至少 3 倍。 17.   如實施例 13 至 16 中任一項之方法，其中基因體滴度高至少 4 倍並且殼體滴度高至少 2 倍。 18.   如實施例 13 至 17 中任一項之方法，其中基因體滴度高至少 6 倍並且殼體滴度高至少 2 倍。 19.   如實施例 1 至 20 中任一項之方法，其中，藉由在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp 相較於藉由在 pH 7.0 至 pH 7.2 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp，具有較高的完整顆粒百分比。 20.   如實施例 19 之方法，其中完整顆粒的百分比高至少 1.5 倍。 21.   如實施例 19 至 20 中任一項之方法，其中完整顆粒的百分比高至少 2 倍。 22.   如實施例 19 至 21 中任一項之方法，其中完整顆粒的百分比高至少 4 倍。 23.   如實施例 1 至 22 中任一項之方法，其中 rAAVp 為治療性 rAAVp。 24.   如實施例 1 至 23 中任一項之方法，其中 rAAVp 用於將轉錄成具有治療性效果的多肽的核酸轉移至標靶細胞中。 25.   如實施例 1 至 24 中任一項之方法，其中 rAAVp 用於將具有治療性效果的核酸轉移至標靶細胞中。 26.   如實施例 1 至 25 中任一項之方法，其中 rAAVp 包含重組腺相關病毒顆粒 (rAAV)，該等 rAAV 包含間隔在兩個腺相關病毒反向末端重複序列之間的至少一個編碼核酸序列。 27.   如實施例 1 至 26 中任一項之方法，其中 rAAVp 中的 rAAV 衍生自選自由以下所組成之群組的野生型 AAV 顆粒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV 2i8、AAV rh.74、AAV rh.10 及 AAV 7m8 以及其變異體。 28.   如實施例 1 至 27 中任一項之方法，其中 rAAV 係屬於血清型 AAV2 或其變異體。 29.   如實施例 1 至 28 中任一項之方法，其中 rAAV 包含野生型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11 或 AAV12 的一個或兩個 ITR 序列。 30.   如實施例 1 至 29 中任一項之方法，其中培養涵蓋接種生物反應器及收穫 rAAVp。 31.   如實施例 1 至 30 中任一項之方法，其中培養以接種生物反應器開始。 32.   如實施例 1 至 31 中任一項之方法，其中，在接種生物反應器之後，將針對間隔在兩個 AAV ITR 之間的非腺相關病毒基因、針對腺相關病毒 rep 基因、針對腺相關病毒 cap 基因、針對腺相關病毒 E2A 基因、針對腺相關病毒 E4orf6 及針對腺相關病毒 VA RNA 基因之表現匣中之一者或多者或全部引入至哺乳動物細胞或 HEK 細胞中。 33.   如實施例 1 至 32 中任一項之方法，其中，在接種生物反應器之後，將針對間隔在兩個 AAV ITR 之間的非腺相關病毒基因、針對腺相關病毒 rep 基因、針對腺相關病毒 cap 基因、針對腺相關病毒 E2A 基因、針對腺相關病毒 E4orf6 及視情況針對腺相關病毒 VA RNA 基因之表現匣中之一者或多者或全部引入至哺乳動物細胞或 HEK 細胞中，由此將最多三個質體共轉染到哺乳動物細胞中，其中質體中之一者包含針對間隔在兩個 AAV ITR 之間的非腺相關病毒基因的表現匣，質體中之一者包含針對 rep 及 cap 基因的表現匣，且質體中之一者包含針對腺病毒 E2A、E4orf6 及 VA RNA 基因的表現匣。 34.   如實施例 1 至 33 中任一項之方法，其中，在接種生物反應器之後，誘導間隔在兩個 AAV ITR 之間的非腺相關病毒基因、腺相關病毒 rep 基因、腺相關病毒 cap 基因、腺相關病毒 E2A 基因、腺相關病毒 E4orf6 及視情況之腺相關病毒 VA RNA 基因中之一者或多者或全部之表現。 35.   如實施例 32 至 33 中任一項之方法，其中引入係在接種生物反應器之後約 16 至 32 小時。 36.   如實施例 34 之方法，其中誘導係在接種生物反應器之後約 16 至 32 小時。 37.   如實施例 35 至 36 中任一項之方法，其中引入或誘導係在接種生物反應器之後約 24 小時。 38.   如實施例 1 至 37 中任一項之方法，其中該方法進一步包含在培養步驟之後的從細胞及/或培養基分離 rAAV 及視情況純化 rAAV 之步驟。 39.   如實施例 38 之方法，其中純化是藉由一個或多個管柱層析步驟及/或 CsCl 或碘克沙醇梯度離心步驟進行。 40.   如實施例 38 或 39 之方法，其中第一層析步驟為親和力層析步驟。 41.   如實施例 38 至 40 中任一項之方法，其中純化是藉由一系列層析步驟進行，其中首先為親和力層析，接以陰離子交換層析或陽離子交換層析，以及視情況之粒徑篩析層析。 42.   一種醫藥組成物，其包含以如實施例 1 至 41 中任一項之方法所獲得之 rAAVp。 43.   一種醫藥組成物，其包含以如實施例 1 至 41 中任一項之方法所獲得之 rAAVp 以及醫藥上可接受之賦形劑。 44.   一種如實施例 1 至 41 中任一項之方法用於增加重組生產之 rAAVp 的產量之用途。 45.一種如實施例 1 至 41 中任一項之方法用於增加 rAAVp 中的完整顆粒百分比之用途。
除所描繪及要求保護的各種實施例之外，本文所揭示之主題還涉及具有本文所揭示及要求保護的特徵的其他組合的其他實施例。因此，本文所呈現之特定特徵可在本文所揭示之標的範圍內以其他方式彼此組合，使得本文所揭示之主題包括本文所揭示之特徵的任何合適的組合。出於說明和描述的目的，已經提供了本文所揭示之主題的特定實施例的前述描述。其並非旨在窮舉或將本文所揭示之標的限制為所揭示的那些實施例。
本發明至少部分地基於以下發現：當在升高的 pH 值諸如 pH 7.4-7.6 下進行培養時，產生重組腺相關病毒顆粒的哺乳動物細胞的生產力可以增加。
定義
除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。
用於進行本發明的有用方法和技術描述於例如 Ausubel, F.M.(編), Current Protocols in Molecular Biology, 第 I 至 III 卷 (1997)；Glover, N.D., 及 Hames, B.D., 編, DNA Cloning: A Practical Approach, 第 I 及 II 卷 (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I.(編), Animal Cell Culture – a practical approach, IRL Press Limited (1986)；Watson, J.D., 等人, Recombinant DNA, 第二版, CHSL Press (1992)；Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987)；Celis, J., 編, Cell Biology, 第二版, Academic Press (1998)；Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 第二版, Alan R. Liss, Inc., N.Y.(1987)。該等文獻的內容藉由引用併入本文。
使用重組 DNA 技術能產生核酸衍生物。此類衍生物可例如在個別或數個核苷酸位置藉由取代、改變、交換、缺失或插入而修飾。修飾或衍生化可例如藉由定點誘變的方式進行。此類修飾可容易地由熟習此項技術者進行 (參見例如 Sambrook, J. 等人, Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA；Hames, B.D., 及 Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization – a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England)。
亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一個細胞」包括複數個此類細胞及熟習此項技術者已知之其等效物，諸如此類。同樣，術語「一」 (或「一種」)、「一個或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。亦應注意，術語「包含」、「包括」及「具有」可互換使用。
術語「約」表示所接之數值 +/-20% 的範圍。在某些實施例中，術語約表示其後所接之數值 +/-10% 的範圍。在某些實施例中，術語約表示其後所接之數值 +/-5% 的範圍。
如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有 (having、has)」、「可」、「含有」及其變體意欲為不排除其他行為或結構之可能性之開放式連接詞 (open-ended transitional phrase)、術語、或字。術語「包含」亦包括術語「由…組成」。本揭示亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或元件、「由其組成」及「基本上由其組成」之本文所呈現之實施例或元件，無論是否明確陳述。
術語「空重組 AAV 顆粒」及「空 rAAV」可以互換使用，表示由腺相關殼體多肽組成的蛋白殼，其中沒有殼體化/包裝的功能性核酸 (rAAV = 重組腺相關病毒顆粒)。亦即，空 rAAV 可以不含殼體化核酸或包含根本不轉錄或不轉錄成功能性轉錄本的核酸或其部分。因此，空的 rAAV 不會將編碼功能性蛋白質之核酸或被轉錄成所關注之功能性轉錄本的核酸轉移到標靶細胞中。在所有態樣及實施例的某些實施例中，所關注之功能性蛋白質或功能性轉錄本具有治療效果。
術語「內源性」表示某物是自然發生的，例如，細胞內或自然產生的，例如由細胞產生的。
術語「外源性」表示某物，例如核苷酸序列，不源自其存在的同一實體。例如，如果核酸已藉由 DNA 遞送方法，諸如例如藉由轉染、電穿孔或轉導引入到該細胞中，則該核酸對於特定細胞是外源性的。同樣，如果核酸不是源自相同的 AAV 顆粒或血清型，則該核酸對於 AAV 顆粒是外源性的。因此，外源性核苷酸序列是人工序列，可以呈分離的形式或在細胞或 rAAV 內，其中人工序列可以源自例如不同來源的子序列的組合，例如重組酶辨識序列與 SV40 啟動子及綠色螢光蛋白編碼序列的組合，或來自第一血清型的 AAV ITR 與第二血清型的殼體多肽的組合，或 AAV ITR 與非 AAV 核酸的組合；或源自序列 (例如僅編碼膜結合受體或 cDNA 的胞外結構域的序列) 的某些部分的缺失；或源自內源性核酸序列中核鹼基的突變。這並不排除「外源性」核苷酸序列可以具有鹼基組成相同的「內源性」對應物，但該序列藉由其與外源性調控元件 (諸如外源性分泌訊號或啟動子) 組合而變成「外源性」序列。
術語「完整重組 AAV 顆粒」或「完整 rAAV」可互換使用，表示由腺相關殼體多肽組成的蛋白殼及其中殼體化/包裝的功能性核酸序列形成的非共價錯合物。亦即，完整 rAAV 包含轉錄成功能性轉錄本的核酸。因此，完整 rAAV 會將編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄本的核酸轉移到標靶細胞中。在某些實施例中，功能性核酸包含至少一個間隔在兩個腺相關病毒反向末端重複序列 (ITR) 之間的編碼核酸序列。
術語「滿空比」表示樣品中或重組 AAV 顆粒製劑 (rAAVp) 中完整重組 AAV 顆粒 (完整 rAAV) 的數量與重組 AAV 顆粒的總數 (完整 rAAV 及空 rAAV 的總和) 的數學比率。由於完整 rAAV 的數量至多可以與 rAAV 的總數相同，因此比率至多可以為 1。通常，該比率小於 1，並表現為百分比。藉由判定樣品或製劑中兩個 AAV ITR 之間間隔的核酸序列的數量來判定完整 rAAV 的數量。這可以藉由 PCR，尤其是數字微滴 PCR (ddPCR) 或定量 PCR (qPCR) 來完成。rAAV 的總數是藉由判定樣品或製劑中腺相關殼體多肽形成的蛋白殼的數量來判定的。這可以藉由 ELISA，尤其是藉由殼體多肽特異性 ELISA 來完成。
術語「體外」表示此類的人工環境，或者在此類人工環境內執行的製程或反應。
術語「體內」表示化合物的天然環境（例如動物或細胞），或者在其天然環境內執行的製程或反應。
術語「重組 AAV 載體」或「轉殖基因」在本文中可互換使用，表示衍生自腺相關病毒的野生型基因體的核酸，其中除了 ITR (腺相關病毒反向末端重複序列) 序列之外，所有內源性 AAV 核酸被一種或多種外源性核酸替換。 例如，此類外源性核酸可以是轉錄成所關注轉錄本的核酸或編碼治療性蛋白質的核酸或治療性核酸。通常，對於重組 AAV 載體，保留野生型 AAV 基因體的一個或兩個 ITR 序列。因此，重組 AAV 載體可以與野生型 AAV 載體區分開，因為病毒基因體的全部或至少一部分已被關於病毒的非天然 (即外源性) 核酸替換。因此，非天然核酸的整合將 AAV 載體定義為「重組」載體。必須指出的是，重組 AAV 載體中的 ITR 的血清型不需要與形成包含該重組 AAV 載體的重組 AAV 顆粒的殼的腺相關殼體多肽的血清型相同。
原則上，任何非 AAV 核酸都可以包裝到由腺相關殼體多肽組成的殼中，產生「重組 AAV 顆粒」，例如用於隨後離體、活體外或活體內的感染 (轉導)。
如本文所用，術語「血清型」用於基於形成相應 AAV 顆粒的蛋白殼 (殼體) 的多肽的胺基酸序列對不同的野生型及重組 AAV 顆粒進行分類。最初，血清學獨特性是基於抗體對一個 AAV 顆粒與對另一個 AAV 顆粒之間相比缺乏交叉反應性所判定。此類交叉反應性之差異通常是由於殼體多肽序列及相應的抗原決定基之差異 (例如，由於 AAV 血清型之 VP1、VP2 及/或 VP3 序列差異)。雖然包括殼體變異體之 AAV 變異體可能在血清學上與參考或野生型 AAV 或其他 AAV 血清型沒有差異，但與參考或野生型或其他 AAV 血清型相比，其有至少一個胺基酸殘基不同。
在傳統定義下，血清型代表所關注病毒已針對所有存在及特徵血清型之特異性血清進行中和活性測試，且未發現中和所關注病毒的抗體。隨著發現更多天然病毒分離株及/或產生殼體突變體，與目前存在之任何血清型可能存在或不存在血清學差異。因此，在新 AAV 顆粒不具有血清學差異的情況下，此種新 AAV 顆粒為對應野生型血清型的亞組或變異體。在許多情況下，尚未對具有殼體序列修飾之突變病毒進行中和活性的血清學測試以判定其是否屬於根據傳統血清型定義的另一種血清型。
術語「載體」表示較大核酸 (例如重組質體) 的部分，其最終直接或以單股形式或以 RNA 形式包裝或封裝或殼體化到由腺相關病毒殼體多肽組成的蛋白殼中以形成重組 AAV 顆粒。在其中重組質體用於構建或製備重組 AAV 顆粒的情況下，病毒顆粒不包括未對應於該重組質體之載體部分的「質體」部分。例如，在 rAAV 的情況下，重組載體包含間隔在兩個 AAV ITR 之間的重組質體的該部分。重組質體的非載體部分稱為「質體主鏈」。質體主鏈對於質體的選殖及擴增非常重要，這是繁殖及重組病毒生產所需的過程，但本身並不包裝或封裝或殼體化到重組 AAV 顆粒中。因此，「載體」是指由腺相關病毒殼體多肽組成的蛋白殼包裝或封裝或殼體化的核酸，即在 rAAV 中。
生產 rAAV 顆粒之一般方法
WO 1999/11764 報導了產生重組 AAV 載體的高滴度無輔助製劑之方法。在生物反應器中懸浮生長的未進一步定義的 AAV 生產細胞，在不同 pH 值、1.5 L 規模的低血清培養基中，以 10 的感染複數 (MOI) 感染 5 型腺病毒 (Ad5)。在培養物 pH 為 7.2 時，獲得 4.7 E+12 個總顆粒；在培養物 pH 為 7.4 時，獲得 1.95 E+13 個總顆粒；在培養物 pH 為 7.6 時，獲得 1.84 E+13 個總顆粒；以及在培養物 pH 為 8.0 時，獲得 1.63 E+13 個總顆粒。培養在 1.5 L 生物反應器中進行，並且因此，可以計算培養體積 (標稱值的 75%) 約為 1.125 L。因此，總顆粒數分別對應於 4.2 E+09 vp/mL (pH 7.2)、1.7 E+10 vp/mL (pH 7.4)、1.6 E+10 vp/mL (pH 7.6) 以及 1.5 E+10 vp/mL (pH 8)。
WO 2000/14205 報導了藉由與腺病毒輔助病毒共感染在稱為 JL-14 細胞的非限定細胞類型中產生 AAV 顆粒，其中在 pH 值為 7.4 時，AAV 顆粒的數量 (細胞內及分泌的 AAV 顆粒的總和) 最高，在 pH 值為 8 時，AAV 顆粒的感染性最高，以及在 pH 為 7.6 時，AAV 顆粒數量與感染性的比率最高。培養在體積為 1.5 L 的培養基中進行，並且因此，總顆粒數分別對應於 3.0 E+09 vp/mL (pH 7.2)、1.3 E+10 vp/mL (pH 7.4)、1.2 E+10 vp/mL (pH 7.6)、3.3 E+9 vp/mL (pH 7.8) 以及 1.1 E+10 vp/mL (pH 8)。基於所提供的感染性資料，可以假設由此產生的 rAAV 顆粒的滿/空比低於 1%。
這是基於對從 WO 2000/14205 的圖 2B 及 3B (感染後 3 天) 的資料進行的以下計算：
第 3 天 pH 總 DRP (=vp) =＞ vp/mL
7.2 4.50 E+12 3.00 E+09
7.4 1.95 E+13 1.30 E+10
7.6 1.85 E+13 1.23 E+10
7.8 5.00 E+12 3.33 E+09
8 1.65 E+13 1.10 E+10
第 3 天 pH 總 RU =＞ RU/mL = RU/mL / vp/mL
7.2 2.00 E+09 1.33 E+06 0.044%
7.4 7.40 E+09 4.93 E+06 0.038%
7.6 5.00 E+09 3.33 E+06 0.027%
7.8 2.75 E+09 1.83 E+06 0.055%
8 7.50 E+09 5.00 E+06 0.045%
Piras, B.A., 等人(Mol. Ther. Meth. Clin.Dev.3 (2016) 16015) 比較了轉染後第 3、5、6 及 7 天細胞培養基及溶胞產物中 AAV8 的分佈，並且發現病毒生產到第 6 天不斷增加，培養基中病毒顆粒的比例從第 3 天的 76% 增加到第 7 天的 94%。更大規模的生產表明，培養基及溶胞產物中滿空 AAV 顆粒的比率相似，並且轉染後第 6 天收穫的 AAV 與第 3 天收穫的 AAV 相比，在小鼠中提供了相同的功能。當培養從第 3 天 (溶胞產物及培養基中的殼體總數分別為 1.1 × 1 E+13 ± 9.2 × 1 E+11 及 3.6 × 1 E+13 ± 2.5 × 1 E+12) 到第 5 天 (溶胞產物及培養基中的殼體總數分別為 6.7 × 1 E+12 ± 6.7 × 1 E+11 及 4.5 × 1 E+13 ± 2.6 × 1 E+12)、第 6 天 (溶胞產物及培養基中的殼體總數分別為 5.0×1 E+12 ± 1.9×1 E+11 及 5.3×1 E+13 ± 3.3×1 E+12) 以及第 7 天 (溶胞產物及培養基中的殼體總數分別為 3.0 × 1 E+12 ± 1.3 × 1 E+10 及 5.0 × 1 E+13 ± 1.9 × 1 E+12) 延長時，AAV-FVIII 的產量增加。Piras 等人使用在 Dulbecco 改良 Eagle 培養基中培養的貼壁 HEK293T/17 細胞，該培養基含有補充有 2 mmol/l GlutaMAX (Life Technologies, Grand Island, NY) 的 10% 胎牛血清。在以 7.26×1 E+04 個細胞/cm 2的密度接種細胞 1 天後，使用 PEIpro(TM) (Polyplus-transfection SA, Illkirch, France) 藉由雙質體轉染產生 AAV。
Powers, A.D., 等人(Hum.Gene Ther.Meth.27 (2016) 112-121) 報導了在 iCELLis(R) 固定床生物反應器中藉由瞬時轉染生產 AAV hFIX 顆粒的開發及優化。獲得每平方公尺固定床的病毒顆粒產量高達 9 E+14 個。接種 HEK293T/17 細胞後第 3 天，在 IMDM (Lonza) 或補充有 10% FBS 及 6mM GlutaMAX(TM) 的 DMEM 中使用聚乙烯亞胺 (PEIpro(TM) 轉染試劑目錄號 115-375；Polyplus)，質體 scAAV- LP1-hFIXco-helpv3 及質體 CR21+LTAAV help 2-8 分別以 3:1 之質體質量比轉染容器。PEI 及 DNA 溶液以 2:1 之比率組合。
Poulain, A., 等人(j.Biotechnol.255 (2017) 16-27 報導了使用質體載體及 cumate 基因開關從穩定的 CHO 細胞池中快速生產蛋白質。使用來自 Polyplus-Transfection (Illkirch，France) 的線性聚乙烯亞胺 (PEIpro(TM)) 轉染細胞。轉染當天，將細胞以 2 × 1 E+06 個細胞/mL 的密度懸浮在 CD DG44 培養基 (Life Technologies Inc., Burlington, ON, Canada) 中，該培養基補充有 4 mM 麩醯胺酸及 0.1% Kolliphor® P 188。將細胞混懸液分佈在 6 孔板中 (1.8 mL/孔)。DNA:PEIpro(TM) 錯合物以 1:5 (w:w) 之比率製備，每孔總共 2 μg DNA，轉染於 100 μL 完全培養基中。
WO 2017/096039 報導了在適合臨床使用的無血清懸浮細胞培養系統中生產重組 AAV 載體的可擴展方法。rAAV 載體的生產是使用三重轉染在含有 HEK293F 細胞的生物反應器中進行的，細胞密度為 1 E+06 個細胞/mL (1.000.000 個細胞/mL)，質體比率為 1:1:1，並使用基於 PEI 的轉染試劑 (PEI/DNA 重量比為 2:1，其中 ½ 的 PEI 為游離 PEI)，溫度為 37℃ 並且 pH 值為 7.2。
Nyamay’antu, A., 等人(Cell Gen.Ther.Ins.4 (2018) 71-79) 報導稱，PEI 由於其經濟實惠且 DNA 遞送效率高，在無血清培養基中生長的貼壁細胞及懸浮細胞兩者中得到廣泛使用。PEIpro(TM) 適合各種病毒 (尤其是 AAV 顆粒) 的小規模到大規模生產。在使用 HEK293 或 HEK293T 的攪拌槽生物反應器中，可獲得 0.8-1.5 E+09-E+10 vg/mL 範圍內的細胞滴度。
Koo, T., 等人(Nat. Commun.9 (2018) 1855) 報導稱，CRISPR-LbCpf1 可預防老年性黃斑部病變小鼠模型中的脈絡膜新生血管形成。為了產生 AAV 載體，將它們在 AAV9 殼體中進行假型化。以 pAAV-ITR-LbCpf1-crRNA、編碼 AAV2rep 及 AAV9cap 的 pAAV2/9 以及輔助質體轉染 HEK293T 細胞 (ATCC，CRL-3216)。在含有 2% FBS 的 DMEM 中培養 HEK293T 細胞。使用 PEI 與 PEIpro(TM) 共沉澱 (Polyplus 轉染) 並在 HEK293T 細胞中以 1:1:1 的莫耳比以質體三重轉染產生重組假型 AAV 載體原液。孵育 72 h 後，裂解細胞並以碘克沙醇逐步梯度超速離心純化顆粒。
來自 AAV2 的 Rep 蛋白通常且幾乎專門用於生產衍生自 AAV1 至 AAV13 血清型的 rAAV (Daya, S., 及 Berns, K.I., Clin.Microbiol.Rev. 21 (2008) 583-593；Zincarelli, C., 等人，Mol.Ther.16 (2008) 1073-1080)。
WO 2019/094253 報導了製備病毒載體的手段與方法及其用途。在 pH 值為 7.23 的生物反應器中培養貼壁的 HEK293 細胞，並以 PEI/DNA 以重量計約 1:1 的 PEI-質體比進行三重轉染 (質體比 1:1:1)。
Collaud, F. 等人(Mol.Ther.Meth.Clin.Dev.12 (2019) 157-174) 報導，對於貼壁 HEK293 細胞，針對 (單股) 及 (自互補) AAV，rAAV8 顆粒的滴度分別為 6.0 ± 1.89 E+04 vg/細胞及 1.77 ± 1.37 E+04 vg/細胞。亦報導了一種基於懸浮培養的 HEK293 細胞之三重轉染的完全可擴展之方法。直接在 10 L 生物反應器中以聚乙烯亞胺 (PEIpro(TM), Polyplus) 進行 HEK293 細胞之三重轉染。藉由溫和的去污劑裂解，然後藉由 AVB Sepharose 親和管柱純化，從上清液及細胞兩者中回收 AAV 載體。然後濃縮純化的載體並測試品質及效力。沒有提供有關 pH 值及獲得的滴度的資訊。
Nyamay’antu, A., 等人(Cell Gen.Ther.Ins.6 (2020) 655-661) 報導稱，遞送過程的效率對於獲得大量生產細胞至關重要。在現有的轉染方法中，使用基於 PEI 的轉染試劑在基因療法中占主導地位，因為它結合了貼壁細胞及懸浮細胞的轉染的經濟性及相容性。與用於病毒載體製造的黃金標準 PEIpro(TM) 相比，當每種轉染試劑在建議條件下使用時，FectoVIR(TM)-AAV 被發現可顯著提高 rAAV2-GFP 的懸浮細胞中病毒基因體生產及包裝效率兩者的 rAAV2 產量，分別是與 PEIMax(TM) 相比的最多 10 倍以及與 PEIpro(TM) 相比的最多 2 倍。更詳細地說，在建議條件下使用相應的轉染試劑轉染懸浮 HEK293T 細胞。轉染後 72 小時收穫 rAAV2-GFP。使用 VectoVIR(TM) 獲得的滴度在 1 E+04 至 4.5 E+04 vg/細胞的範圍內，取決於對應於 1 E+12 vg/mL 所使用的絡合體積 (1%-10%)。各自的功能滴度約為 2-8 E+08 TU/mL。結果幾乎與所使用的培養基無關。
在題為「Optimization of AAV production for high-yielding and scalable GMP processes with Catalent」的部落格文章 (www.polyplus-transfection.com) 中，使用兩种血清型 AAV9 (1:1 及 2:1) 及 AAV2 (3:1.5 及 5:2.5) 測試了不同的轉染試劑與 DNA 之比率。AAV2 載體產量沒有受到明顯影響，與 PEIpro(TM) 相比，具有 FectoVIR(TM)-AAV 的載體基因體滴度增加了 4-5 倍並且病毒顆粒滴度增加了 3-6 倍。這些結果表明，產量的增加可能因 AAV 血清型而異。在一項比較額外的 AAV2 及 AAV5 載體 (不同於先前的 AAV2 及 AAV5 載體) 並使用 DoE 方法進行最佳化的進一步研究中，進行了不同轉染試劑與 DNA 比率 (3:2、3:1.5) 及質體 DNA 莫耳比 (1:1:1、2:1:2、1:2:1) 的實驗。與 PEIpro(TM) 相比，觀察到含有 FectoVIR(TM)-AAV 的載體基因體滴度中 AAV2 增加了 3-5 倍並且 AAV5 增加了 1.1-1.6 倍。AAV2 的病毒顆粒滴度增加了 3.5-4.5 倍並且 AAV5 的病毒顆粒滴度增加了 2.5-3.75 倍。使用 2:1 及 1.5:1 的試劑與 DNA 比率以及 1:1:1 至 2:1:2 至 1:2:1 的質體比率。用 VectoVIR(TM) 獲得的滴度在 4 E+11 至 1 E+12 vg/mL 的範圍內。
Rossi, A. 及 Peigné, C-M. (細胞培養皿文章，2021 年 5 月 17 日) 指出，AAV 生產滴度通常約為 1 E+11 至 1 E+12 (以 vg/mL 計) 以及 1 E+08 至 1 E+09 TU/mL。
為了正確看待這些數字，重要的是要記住，即使使用相同的生產過程，兩種 AAV 血清型很可能不會產生相同的產量。
更詳細地說，AAV 產量根據血清型及所關注基因而變化。通常，為了增加給定 AAV 的產量，需要優化直接影響產量的參數：質體 DNA、轉染試劑、細胞及培養基。例如，基於 PEI 的轉染過程可將 DNA 量減少 10 倍，並可用於轉染在存在或不存在血清的情況下生長的細胞。
Wosnitzka, K., 等人(Cell Gen.Ther.Ins.7 (2021) 1-7) 報導稱，物理滴度分析顯示，與 PEIpro(TM) 相比，當使用 FectoVIR(TM)-AAV 轉染試劑時，每毫升細胞培養物中的病毒顆粒 (VP) 及病毒基因體 (VG) 兩者中增加了 3 倍。
Porte, M., 等人(海報題為「Next-Generation Transfection Reagent for Large Scale AAV Manufacturing」，Polyplus，Illkirch，France) 報導了使用其他基於PEI 的試劑 (1.5 μg/百萬個細胞，比率 DNA : PEI 為 1 μg : 4 μL) 及 FectoVIR(TM)-AAV (1 μg/百萬個細胞，比率 DNA : 試劑為 1 μg : 1 µL) 之最佳條件，遵循每種試劑的建議方案轉染懸浮-HEK293T 細胞。使用 FectoVIR(TM) 及基於 PEI 的轉染試劑分別獲得約 5 E+11 vg/mL 與 1.5 E+11 vg/mL 之滴度，分別具有 20% 與約 13.5% 之包裝效率。
重組細胞
通常，為了高效且大規模生產 rAAV，使用表現並且如果可能的話亦分泌該 rAAV 的細胞。此種細胞被稱為「重組生產細胞」或簡稱「生產細胞」。
為產生重組生產細胞，用生產該 rAAV 所需之核酸 (包括所需 AAV 輔助功能) 轉染合適的哺乳動物細胞。
通常，為表現編碼序列 (即開放讀序框架)，需額外的調控元件，諸如啟動子及多腺苷酸化訊號 (序列)。因此，對於功能性轉錄，開放讀序框架必須且可操作地連接至該額外的調控元件。此可藉由將該等部分組合到所謂的表現匣中來達成。表現匣在哺乳動物細胞中具有功能而所需的最小調控元件為在該哺乳動物細胞中具有功能的啟動子，其位於開放讀序框架的上游 (即 5')，以及在該哺乳動物細胞中具有功能的多腺苷酸化訊號 (序列)，其位於開放讀序框架的下游 (即 3')。此外，終止子序列可能存在於多腺苷酸化訊號 (序列) 的 3' 端。為達到表現，啟動子、開放讀序框架/編碼區及多腺苷酸化訊號序列須以可操作地連接的形式排列。
同樣地，被轉錄成非蛋白質編碼 RNA 的核酸稱為「RNA 基因」。對於 RNA 基因的表現，亦需要額外的調控元件，諸如啟動子及轉錄終止訊號或多腺苷酸化訊號 (序列)。這些元件的性質及定位取決於所欲驅動表現 RNA 基因的 RNA 聚合酶。因此，RNA 基因通常亦被整合到表現卡匣中。
如果為 rAAV (它由不同的 (單體) 殼體多肽以及其中衣殼化的單股 DNA 分子組成，且它亦需要其他病毒輔助功能來生產及殼體化)，則需要許多表現匣，其包含之開放讀序框架/編碼序列是不同的。在此種情況下，對於每個轉殖基因，對於形成 rAAV 之殼體的多肽，至少需要用於所需病毒輔助功能之表現匣。因此，至少對於每個輔助功能 E1A、E1B、E2A、E4orf6、rep 及 cap 基因都需要單獨的表現匣。HEK293 細胞組成型地表現 E1A 及 E1B 輔助功能。
腺相關病毒 (AAV)
對於 AAV 及腺病毒或皰疹病毒輔助功能的一般回顧，參見 Berns 及 Bohensky, Advances in Virus Research, Academic Press., 32 (1987) 243-306。AAV 的基因體係在 Srivastava 等人，J. Virol.，45 (1983) 555-564 中描述。在 US 4,797,368 中，描述針對構建重組 AAV 載體的設計考慮 (亦參見 WO 93/24641)。描述 AAV 載體的額外的參考文獻為：West 等人，Virol.160 (1987) 38-47；Kotin, Hum.Gene Ther.5 (1994) 793-801；以及 Muzyczka J. Clin.Invest.94 (1994) 1351。重組 AAV 載體的建構描述於以下參考文獻中：US 5,173,414；Lebkowski 等人，Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 3988-3996；Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 3251-3260；Tratschin 等人，Mol.Cell.Biol., 4 (1994) 2072-2081；Hermonat 及 Muzyczka Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6466-6470；Samulski 等人J. Virol.63 (1989) 3822-3828。
AAV 是一種複製缺陷型細小病毒。其只能在細胞中複製，其中某些病毒功能由共同感染之輔助病毒提供，諸如腺病毒、皰疹病毒以及在某些情況下，痘病毒例如牛痘。儘管如此，只要存在適當的輔助病毒功能，AAV 幾乎可在任何人類、猿類或囓齒動物來源之細胞株中複製。
如果不存在輔助病毒基因，AAV 會在其宿主細胞中建立潛伏期。其基因體整合到 19 號染色體 [(Chr) 19 (q13.4)] 中的特定位點，其稱為腺相關病毒整合位點 1 (AAVS1)。對於特定的血清型 (例如 AAV2)，已發現其他整合位點，例如，舉例而言，在染色體 5 [(Chr) 5 (p13.3)] 上，稱為 AAVS2，以及在染色體 3 [(Chr) 3 (p24.3)] 上，稱為 AAVS3。
AAV 係歸類成不同的血清型。這些已根據參數進行分配，例如紅血球凝集、致腫瘤性及 DNA 序列同源性。目前為止，已鑑別出 12 多種不同的血清型及一百多種對應於不同 AAV 演化枝的序列。
殼體蛋白的類型及對稱性決定相應 AAV 的組織向性。例如，AAV2、AAV4 及 AAV5 對視網膜具特異性，AAV2、AAV5、AAV8、AAV9 及 AAV-rh.10 對腦具特異性，AAV1、AAV2、AAV6、AAV8 及 AAV9 對心臟組織具特異性，AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 及 AAV10 對肝臟具特異性，AAV1、AAV2、AAV5 及 AAV9 對肺具特異性。
假型分型 (Pseudotyping) 表示一種包含 AAV 基因體在各種血清型之間交叉包裝的方法，即基因體以不同來源的殼體蛋白包裝。
野生型 AAV 基因體的大小約為 4.7 kb。AAV 基因體進一步包含名為 rep 及 cap 的兩個重疊基因，其包含多個開放讀序框架 (參見，例如，Srivastava 等人，J. Viral.，45 (1983) 555-564；Hermonat 等人，J. Viral.51 (1984) 329-339；Tratschin 等人，J. Virol., 51 (1984) 611-619)。Rep 蛋白編碼開放讀序框架提供四種不同大小的蛋白，稱為 Rep78、Rep68、Rep52 及 Rep40。這些蛋白涉及 AAV 的複製、修復及整合。Cap 蛋白編碼開放讀序框架提供四種蛋白質，稱為 VP1、VP2、VP3 及 AAP。VP1、VP2 及 VP3 為 AAV 顆粒之蛋白質殼體的一部分。組合之 rep 及 cap 開放讀序框架在其 5' 及 3' 末端的側翼為所謂的反向末端重複序列 (ITR)。針對複製，除 Rep 及 Cap 蛋白外，AAV 亦需要基因 E1A、E1B、E4orf6、E2A 及 VA 之產物或另一種輔助病毒之對應因子。
例如，在血清型 2 (AAV2) 的 AAV 的情況下，每個 ITR 的長度為 145 個核苷酸，且位於約 4470 個核苷酸之編碼序列區的側翼。ITR 的 145 個核苷酸中，有 125 個核苷酸具有回文序列且可形成 T 形髮夾結構。此種結構在病毒複製過程中具有引子的功能。剩餘之 20 個未配對的核苷酸以 D 序列表示。
野生型 AAV 基因體包含三個轉錄啟動子 P5、P19 及 P40 (Laughlin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 5567-5571) 用於 rep 及 cap 基因的表現。
ITR 序列必須與編碼區以順式存在。ITR 提供具功能之複製起點 (ori)、整合到標靶細胞之基因體所需的訊號，以及自宿主細胞染色體或重組質體中之有效切除及修復。ITR 進一步包含類複製起始元件，例如 Rep 蛋白結合位點 (RBS) 及末端解析位點 (TRS)。已經發現 ITR 本身可以具有轉錄啟動子的功能 (Flotte 等人，J. Biol.Chem.268 (1993) 3781-3790；Flotte 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 (1993) 10163-10167)。
對於複製及殼體化病毒單股 DNA 基因體，分別需要 rep 及 cap 基因產物的反式結構。
rep 基因座包含兩個內部啟動子，稱為 P5 及 P19。其包含四種蛋白質的開放讀序框架。啟動子 P5 係可操作地連接至提供編碼 Rep 蛋白 Rep78 (阻滯細胞週期的染色質切口酶) 之非經剪接 4.2 kb mRNA 及編碼 Rep 蛋白 Rep68 (位點特異性核酸內切酶) 之經剪接 3.9 kb mRNA 的核酸序列。啟動子 P19 係可操作地連接至提供編碼 Rep 蛋白 Rep52 之非經剪接 mRNA 及編碼 Rep 蛋白 Rep40 之經剪接 3.3kb mRNA (用於積累及包裝的 DNA 解旋酶) 的核酸序列。
兩個較大的 Rep 蛋白 (Rep78 及 Rep68) 對 AAV 雙股 DNA 複製為必要，而較小的 Rep 蛋白 (Rep52 及 Rep40) 似對子代、以及單股 DNA 積累為必要 (Chejanovsky & Carter, Virology 173 (1989) 120-128)。
較大的 Rep 蛋白 Rep68 及 Rep78 可特異性地結合至 AAV ITR 的髮夾構型。其表現出確定的酶活性，其為解決 AAV 末端複製所需。Rep78 或 Rep68 的表現可足以形成感染性顆粒 (Holscher, C., 等人J. Virol.68 (1994) 7169-7177 及 69 (1995) 6880-6885)。
人們認為所有 Rep 蛋白，主要是 Rep78 及 Rep68，都表現出調控活性，諸如 AAV 基因的誘導及抑制以及對細胞生長的抑制作用 (Tratschin 等人，Mol.Cell.Biol.6 (1986) 2884-2894；Labow 等人，Mol.Cell.Biol., 7 (1987) 1320-1325；Khleif 等人，Virology, 181 (1991) 738-741)。
重組過表現 Rep78 造成具減少之細胞生長的表型，係由於誘導 DNA 損傷。由此宿主細胞在 S 期阻滯，從而促進病毒的潛伏感染 (Berthet, C. 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102 (2005) 13634-13639)。
Tratschin 等人報導稱，P5 啟動子受到 Rep78 或 Rep68 的負自動調控 (Tratschin 等人，Mol.Cell.Biol.6 (1986) 2884-2894)。由於表現 Rep 蛋白的毒性作用，在 AAV 穩定整合後，已報導某些細胞株僅具非常低的表現 (參見，例如，Mendelson 等人，Virol.166 (1988) 154-165)。
cap 基因座包含一個啟動子，稱為 P40。啟動子 P40 係可操作地連接至提供 2.6 kb mRNA 的核酸序列，該 mRNA 藉由選擇性剪接及使用選擇性起始密碼子而編碼 Cap 蛋白 VP1 (87 kDa，非經剪接 mRNA 轉錄本)、VP2 (72 kDa，來自經剪接 mRNA 轉錄本) 及 VP3 (61 kDa，來自替代的起始密碼子)。VP1 到 VP3 構成病毒殼體的構建塊。殼體具有與細胞表面受體結合並允許病毒在細胞內運輸的功能。VP3 約佔病毒顆粒蛋白總量的 90%。儘管如此，所有三種蛋白質對於生產有效之殼體皆為必要。
據報導，將所有三種殼體蛋白 VP1 到 VP3 不活化可防止積累單股子代 AAV DNA。VP1 胺基末端之突變 (「Lip-陰性」或「Inf-陰性」) 仍允許將單股 DNA 組裝成病毒顆粒，從而大幅度降低感染滴度。
AAP 開放讀序框架編碼組裝活化蛋白 (AAP)。其大小約為 22 kDa，可將天然 VP 蛋白運輸到核仁區進行殼體組裝。此開放讀序框架位於 VP3 蛋白編碼序列的上游。
在單一 AAV 顆粒中，僅包含一個單股 DNA 分子。其可能為「正」股或「負」股。含有 DNA 分子的 AAV 顆粒具有感染性。在經感染的細胞內，親代感染單股 DNA 被轉變為雙股 DNA，該雙股 DNA 隨後被擴增。擴增產生出大量雙股 DNA 分子，其中單股被置換並包裝成殼體。
腺相關病毒 (AAV) 載體可轉導分裂細胞及休眠細胞。可假設使用 AAV 載體導入標靶細胞的轉基因將長期表現。使用 AAV 載體的一個缺點是可導入細胞的轉基因大小有限制。
細小病毒顆粒，包括 AAV 血清型及其變異體，提供了將編碼蛋白質的核酸離體、活體外及活體內遞送至細胞中的手段，使得受感染的細胞表現所編碼的蛋白質。AAV 係用為基因治療載體的病毒，因其可穿透細胞並導入核酸/基因物質，使得核酸/基因物質可在受感染的細胞中穩定地維持。由於 AAV 與人類之致病性疾病無關，因此 AAV 能夠將異源多核苷酸序列 (例如治療性蛋白質及藥劑) 遞送至人類病患，而不會引起實質性之 AAV 相關發病機制或疾病。
用作進行高效基因遞送之媒劑的 AAV 顆粒具有許多適用於此類應用的所欲特徵，包括對分裂細胞及非分裂細胞的向性。早期臨床經驗亦證實這些載體並無持續的毒性，且引起很小的免疫反應很小或檢測不到免疫反應。已知 AAV 在活體內及活體外經由受體介導的胞吞作用或胞吞轉送作用感染各種細胞類型。這些載體系統已在人類中進行測試，該等載體標靶至視網膜上皮、肝臟、骨骼肌、氣管、大腦、關節及造血幹細胞。
重組 AAV 顆粒通常不包括與發病機制相關的病毒基因。此種顆粒通常包含基因體，其中野生型 AAV 基因 (例如 rep 及/或 cap 基因) 中的一個或多個已全部或部分缺失，但保留至少一個功能性側翼 ITR 序列，此為修復、複製及將重組載體包裝成 rAAV 所必需。因此，AAV 載體包括複製及包裝所需的順式序列 (即功能性 ITR 序列)。
重組 AAV 顆粒及其方法及用途可以基於任何野生型 AAV 基因體或血清型或其組合。作為非限制性實例，rAAV 可基於任何野生型 AAV 基因體，即包含相應的 ITR 序列，諸如，例如，AAV1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-2i8、AAV-rh.74、AAV-rh.10 或 AAV-7m8。此種顆粒可基於相同或者彼此不同的病毒株或血清型 (或亞群或變異體)。作為非限制性實例，基於一種野生型基因體的 rAAV 可與包裝載體之一種或多種殼體蛋白相同或不同。此外，重組 AAV 載體可基於與包裝載體之一種或多種 AAV 殼體蛋白不同的 AAV (例如 AAV2 ) 野生型血清型基因體。例如，AAV 載體可基於 AAV2，而三種殼體蛋白中的至少一種可為例如 AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV-rh.74、AAV-rh.10 或 AAV-7m8 或其變異體。AAV 變異體包括 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV-rh.74、AAV-rh.10 及 AAV 7m8 殼體的變異體及嵌合體。
在本發明之所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒衍生自選自由以下所組成之群組的野生型 AAV 顆粒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV-rh.74、AAV-rh.10 及 AAV 7m8，及其變異體 (例如，殼體變異體，諸如胺基酸插入、加入、取代及缺失)，例如，如 WO 2013/158879、WO 2015/013313 及 US 2013/0059732 (揭示 LK01、LK02、LK03 等) 中所述。
在本發明之所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 包含與野生型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV-rh.10、AAV-rh.74 或 AAV-7m8 殼體序列具有 70% 或更高序列同一性的具有胺基酸序列之殼體多肽。
在本發明之所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒包含與野生型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11 或 AAV12 ITR 序列具有 70% 或更高序列同一性的一個或兩個 ITR 序列。
可將重組 AAV 顆粒併入醫藥組成物中。此種醫藥組成物尤其可用於以活體內或離體向個體投予及遞送。在某些實施例中，醫藥組成物含有醫藥上可接受之載劑或賦形劑。此種類賦形劑包括本身不誘導對接受該組合物的個體有害之免疫反應的任何藥劑，且其投予不產生過度毒性。
US 5,998,205、US 6,228,646、US 6,093,699、US 6,100,242、WO 94/17810 及 WO 94/23744 中已描述用於產生腺病毒載體的方案，該等文獻的全部內容藉由引用併入本文。
重組腺相關病毒顆粒 (rAAV 顆粒)
本領域已知用於產生重組 AAV 顆粒的不同方法。例如，用包含質體的 AAV 載體及包含 AAV 輔助序列 (rep 及 cap) 的質體進行轉染並結合與一種 AAV 輔助病毒 (例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒) 共感染，或用包含質體、AAV 輔助質體 (包含 rep 及 cap) 及輔助功能質體的重組 AAV 載體進行轉染。產生 rAAV 的非限制性方法描述於例如 US 6,001,650、US 6,004,797、WO 2017/096039 及 WO 2018/226887 中。在生產 rAAV (即在細胞培養系統中產生顆粒) 後，可從宿主細胞及/或細胞培養上清液中獲得 rAAV 並進行純化。
為產生重組 AAV 顆粒，需在單一哺乳動物細胞中表現 Rep 及 Cap 蛋白、輔助蛋白 E1A、E1B、E2A 及 E4orf6 以及視情況之腺病毒 VA RNA。輔助蛋白 E1A、E1B、E2A 及 E4orf6 可以使用任何啟動子表現，如 Matsushita 等人(Gene Ther.5 (1998) 938-945) 所示，尤其是 CMV IE 啟動子。因此，任何啟動子都可以可操作地連接至該等基因以進行功能性表現。
通常，為生產 rAAV，將不同的互補質體共轉染到宿主細胞中。質體之一者包含夾在兩個順式作用 AAV ITR 之間的轉基因。子代重組基因體之複製及後續包裝所需之缺少的 AAV 元件 (即 Rep 及 Cap 蛋白的開放讀序框架) 以反式包含在第二質體中。過表現 Rep 蛋白造成對細胞生長的抑制作用 (Li, J., 等人，J. Virol.71 (1997) 5236-5243)。此外，rAAV 生產需要包含輔助病毒基因的第三質體，即來自腺病毒的 E1、E4orf6、E2A 及 VA。
為減少所需質體的數量，rep、cap 及腺病毒輔助基因可組合在單一質體上。
或者，宿主細胞可已穩定表現 E1 基因產物。此種細胞為 HEK293 細胞。標示為 293 的人類胚胎腎殖株係在 1977 年藉由將腺病毒 DNA 整合到人類胚胎腎細胞 (HEK 細胞) 中所產生的 (Graham, F.L., 等人，J. Gen.Virol.36 (1977) 59-74)。HEK293 細胞株包含腺病毒血清型 5 基因體之鹼基對 1 至 4344。此涵蓋 E1A 及 E1B 基因以及腺病毒包裝訊號 (Louis, N. 等人，Virology 233 (1997) 423-429)。
當使用 HEK293 細胞時，缺失的 E2A、E4orf6 及 VA 基因可以藉由與腺病毒共感染或藉由與表現 E2A、E4orf6 及 VA 的質體共轉染來引入 (參見，例如，Samulski, R.J., 等人，J. Virol.63 (1989) 3822-3828；Allen, J.M., 等人，J. Virol.71 (1997) 6816-6822；Tamayose, K., 等人，Hum.Gene Ther.7 (1996) 507-513；Flotte, T.R., 等人，Gene Ther.2 (1995) 29-37；Conway, J.E., 等人，J. Virol.71 (1997) 8780-8789；Chiorini, J.A., 等人，Hum.Gene Ther.6 (1995) 1531-1541；Ferrari, F.K., 等人，J. Virol.70 (1996) 3227-3234；Salvetti, A., 等人，Hum.Gene Ther.9 (1998) 695-706；Xiao, X., 等人，J. Virol.72 (1998) 2224-2232；Grimm, D., 等人，Hum.Gene Ther.9 (1998) 2745-2760；Zhang, X., 等人，Hum.Gene Ther.10 (1999) 2527-2537)。或者，可以使用腺病毒/AAV 或單純皰疹病毒/AAV 雜合載體 (參見，例如，Conway, J.E., 等人，J. Virol.71 (1997) 8780-8789；Johnston, K.M., 等人，Hum. Gene Ther.8 (1997) 359-370；Thrasher, A.J., 等人，Gene Ther.2 (1995) 481-485；Fisher, J.K., 等人，Hum.Gene Ther.7 (1996) 2079-2087；Johnston, K.M., 等人，Hum.Gene Ther.8 (1997) 359-370)。
為限制轉殖基因對特定組織的活性 (即限制作用位點)，可將轉殖基因可操作地連接至可誘導或組織特異性啟動子 (參見，例如，Yang, Y., 等人，Hum.Gene.Ther.6 (1995) 1203-1213)。
E1A 及 E1B (開放讀序框架) 之編碼序列可源自人類腺病毒，諸如，舉例而言，特別是人類腺病毒血清型 2 或血清型 5。人類 Ad5 (腺病毒血清型 5) 的示例性序列在 GenBank 條目 X02996、AC_000008 中找到，而人類 Ad2 的示例性序列在 GenBank 條目 AC_000007 中找到。核苷酸 505 至 3522 包含編碼人類腺病毒血清型 5 之 E1A 及 E1B 的核酸序列。EP 1 230 354 中所報導的質體 pSTK146 以及 WO 2007/056994 中所報導的質體 pGS119 及 pGS122 亦可用作 E1A 及 E1B 開放讀序框架的來源。
E1A 為腺病毒 DNA 進入細胞核後所表現的第一個病毒輔助基因。E1A 基因編碼 12S 及 13S 蛋白，其係基於相同之 E1A mRNA 的選擇性剪接。表現 12S 及 13S 蛋白使活化其他病毒功能 E1B、E2、E3 及 E4。此外，表現 12S 及 13S 蛋白迫使細胞進入細胞週期的 S 期。如果只表現 E1A 衍生的蛋白質，細胞將會死亡 (細胞凋亡)。
E1B 為第二個表現的病毒輔助基因。其被 E1A 衍生的蛋白質 12S 及 13S 活化。E1B 基因衍生之 mRNA 可以以兩種不同的方式剪接，產生第一個 55 kDa 轉錄本及第二個 19 kDa 轉錄本。E1B 55 kDa 蛋白參與調節細胞週期、防止在感染晚期之細胞 mRNA 的運輸以及防止 E1A 誘導的細胞凋亡。E1B 19 kDa 蛋白參與防止 E1A 誘導的細胞凋亡。
E2 基因編碼不同的蛋白質。E2A 轉錄本編碼單股結合蛋白 (SSBP)，其為 AAV 複製所必要者。
此外，E4 基因亦編碼數種蛋白質。E4 基因衍生的 34 kDa 蛋白 (E4orf6) 與 E1B 55 kDa 蛋白一起阻止細胞 mRNA 在細胞質中的積累，亦促進病毒 RNA 自細胞核運輸到細胞質中。
病毒相關 RNA (VA RNA) 為調節轉譯之腺病毒 (Ad) 的非編碼 RNA。腺病毒基因體包含兩個獨立的拷貝：VAI (VA RNAI) 及 VAII (VA RNAII)。兩者均由 RNA 聚合酶 III 轉錄 (參見，例如 Machitani, M. 等人，J. Contr.Rel.154 (2011) 285-289)，該 RNA 聚合酶 III 來自 2 型聚合酶 III 啟動子。對於重組 AAV 顆粒生產，腺病毒 VA RNA 基因可由任何啟動子驅動。
Ma, Y. 及 Mathews, M.B. 使用系統發育方法研究腺病毒相關 RNA 的結構、功能及進化(J. Virol.70 (1996) 5083-5099)。他們根據 47 種已知人類腺病毒血清型，提供其比對及共有 VA RNA 序列。該揭露在此經由引用整體併入本申請案。
VA RNA、VAI 及 VAII 係由 157-160 個核苷酸 (nt) 所組成。
根據血清型，腺病毒含有一個或兩個 VA RNA 基因。咸認為 VA RNAI 係主要的前病毒，而 VA RNAII 可部分地彌補 VA RNAI 之缺失 (Vachon, V.K. 及 Conn, G.L., Virus Res. 212 (2016) 39-52)。
雖然 VA RNA 非必要，但其經由克服細胞抗病毒機制在有效的病毒生長中仍扮演重要角色。亦即，雖然 VA RNA 對於病毒生長非必要，但在載體生成的起始步驟期間，VA RNA 缺失之腺病毒無法生長，其中每個細胞僅存在數個病毒基因體拷貝，可能是因為未充分地表現阻斷細胞抗病毒機制之 VA RNA 以外的病毒基因 (參見 Maekawa, A., 等人Nature Sci.Rep.3 (2013) 1136)。
Maekawa, A., 等人(Nature Sci.Rep.3 (2013) 1136) 報導缺乏病毒相關 RNA 基因之腺病毒載體的高效生產，該腺病毒載體干擾細胞 RNAi 機制，其中組成型地表現及高度表現翻轉酶重組酶之經感染 HEK293 細胞經由 FLP 重組酶介導切除 VA RNA 基因座，以獲得 VA RNA 缺失之腺病毒。
人類腺病毒 2 VA RNAI 對應於 GenBank 條目 AC_000007 序列的核苷酸 10586-10810。人類腺病毒 5 VA RNAI 對應於 GenBank 條目 AC_000008 序列的核苷酸 10579-10820。
重組 AAV 顆粒生產之概述
進入宿主細胞核後，AAV 可以遵循其生命週期的兩種不同且可互換的途徑之一：裂解途徑或溶原途徑。前者在感染輔助病毒 (諸如 Ad 或單純皰疹病毒 (HSV)) 的細胞中發育，而後者在不存在輔助病毒的情況下在宿主細胞中建立。
當潛伏感染的細胞被輔助病毒過度感染時，AAV 基因表現程序被活化，導致 AAV Rep 介導的原病毒 DNA 從宿主細胞染色體的拯救 (即切除)，然後複製及包裝病毒基因體。最後，在輔助病毒誘導的細胞裂解後，新組裝的病毒體 (顆粒) 被釋放。因此，AAV 生命週期的裂解階段被誘導。
因此，在存在 Ad 輔助功能的情況下，rAAV 載體藉由從質體主鏈中拯救出來、複製並包裝到預製的 AAV 殼體中作為單股分子而進行野生型 AAV 裂解過程 (Gonçalves, M.A.F.V., Virol.J., 2 (2005) 43)。
重組 AAV 顆粒的生成涉及用所需的轉殖基因替換大部分 AAV 野生型基因體，並提供在單獨的質體上反式包裝病毒所必需的病毒基因。一旦所有成分一起轉染到包裝細胞株中，重組 AAV 顆粒就會使用細胞的細胞機器進行組裝。病毒組裝及封裝的過程大約需要兩天，之後細胞被裂解以釋放 rAAV 以進一步純化及濃縮 (https://old.abmgood.com/marketing/knowledge_base/Adeno_Associated_Virus_Production_and_Modification_of_AAV.php)。
儘管在血清型之間觀察到了主要差異，但 AAV 並未非常有效地從細胞中釋放 (參見，例如，Strobel, B., 等人，Lamla T. Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.Hum.Gene Ther.Methods 26 (2015) 147-157)。收穫培養物時，通常會採用細胞破碎方法來回收細胞中捕獲的載體。
歷史上，rAAV 的製造是藉由包含 rep 及 cap ORF 的質體以及側翼為 ITR 的所關注基因的質體的雙轉染來進行的。然後，輔助病毒，通常是腺病毒，被共同感染 (參見，例如，Aponte-Ubillus, J.J., 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 102 (2018) 1045-1054；Muzyczka, N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158 (1992) 97-129)。在這種情況下，輔助病毒與最終產物的分離很困難，但卻是避免注射到患者體內後誘導發炎反應的關鍵因素 (參見，例如，Schnell, M.A., 等人，Mol.Ther.3 (2001) 708-722.)。因此，現在 rAAV 的生產藉由利用三重轉染轉向無腺病毒之方法 (參見，例如，Large, E.E., 等人，Viruses 13 (2021) 1336)。為此，需要三個組件：一個編碼不帶 ITR 的 Rep 及 Cap 基因的質體，第二個帶有側翼為 ITR 的所關注轉殖基因的質體，以及提供輔助病毒輔助基因的輔助質體 (參見，例如，Aponte-Ubillus, J.J.,等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 102 (2018) 1045-1054；Farris, K.D. 及 Pintel, D.J., Hum.Gene Ther.19 (2008) 1421-1427；Grimm, D., 等人，Hum.Gene Ther.9 (1998) 2745-2760；Ferrari, F.K., 等人，Nat. Med.3 (1997) 1295-1297)。例如，腺病毒輔助體攜帶所需的最少腺病毒基因 E2A、E4 及 VA。值得注意的是，人類胚胎腎細胞 293 (HEK293) 組成型表現腺病毒基因 E1A/B，這亦是生產 rAAV 所必需的。因此，HEK293 細胞是 rAAV 及製造的經典生產細胞。其他細胞類型需要補充 E1A/B。
Carter 等人已經表明可刪除野生型 AAV 基因體中的整個 rep 及 cap 開放讀序框架並以轉基因替換 (Carter, B. J.，「Handbook of Parvoviruses」，P. Tijssen 編，CRC Press，第 155-168 頁 (1990))。此外，據報導，須維持 ITR 以保留複製、修復、包裝及將轉基因整合到標靶細胞之基因體中的功能。
當包含相應病毒輔助基因之細胞被 AAV 載體轉導時，或者反之亦然，當包含整合之 AAV 前病毒的細胞以合適之輔助病毒轉導時，AAV 前病毒被活化並再次進入裂解感染週期 (Clark, K.R., 等人，Hum.Gene Ther.6 (1995) 1329-1341；Samulski, R.J., Curr.Opin.Genet.Dev.3 (1993) 74-80)。
生產細胞含有 rep 及 cap 基因序列，以及在例如經由藥物選擇所保留的一個或多個質體上側翼為 ITR 序列的轉殖基因匣。這些細胞株中 rAAV 之生產通常發生在它們經感染所需之輔助功能之後。因此，將細胞用具有複製能力的腺病毒 (通為是野生型 Ad5) 或包含相應輔助基因的質體感染，以提供輔助病毒蛋白並啟動 rAAV 生產。包裝細胞株不同於生產細胞株，因為其僅含有 rep 及 cap 基因。
更一般地，用 DNA 轉染或轉導以重組生產 AAV 顆粒的細胞可稱為「重組細胞」。此種細胞例如可為任何哺乳動物細胞，其已被作為編碼包裝蛋白 (諸如 AAV 包裝蛋白) 之核酸 (質體)、編碼輔助蛋白之核酸 (質體) 以及編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸 (質體) (亦即置於兩個 AAV ITR 之間的轉基因) 的受體。該術語包括已經轉導或經轉染之原始細胞的子代。應當理解，由於自然、偶然或特意之突變，單一親代細胞的子代在形態學或基因體或總核酸互補方面不一定與原始親代完全相同。
許多適用於維持細胞存活率或提供細胞生長及/或增殖的細胞生長培養基為可商購獲得的。此類培養基的實例包括無血清真核生長培養基，例如用於維持存活率或提供哺乳動物 (例如人類) 細胞生長的培養基。非限制性實例包括 Ham's F12 或 F12K培養基 (Sigma-Aldrich)、FreeStyle (FS) F17培養基 (Thermo-Fisher Scientific)、MEM、DMEM、RPMI-1640 (Thermo-Fisher Scientific) 及其混合物。此類培養基可補充有維生素及/或微量礦物質及/或鹽及/或胺基酸，諸如哺乳動物 (例如人類) 細胞的必需胺基酸。
為生產 rAAV，將三個質體共轉染到哺乳動物細胞中。轉基因質體編碼在 AAV ITR 之間選殖的表現卡匣，而藉由共轉染第二包裝質體 (rep/cap 質體) 以反式提供 rep 及 cap 基因以確保 AAV 複製及包裝。第三質體，亦稱為輔助質體，含有最少的輔助病毒因子 (通常為腺病毒 E2A、E4orf6 及 VA 基因)，但缺乏 AAV ITR。
本領域已報導將 DNA 轉移到哺乳動物細胞中的多種方法。這些方法在根據本發明之方法中都是有用的。在所有態樣及實施例的某些實施例中，使用電穿孔、核轉染或顯微注射進行核酸轉移/轉染。在所有態樣及實施例的某些實施例中，使用無機物質 (例如，舉例而言，磷酸鈣/DNA 共沉澱)、陽離子聚合物 (例如，舉例而言，聚乙烯亞胺、DEAE-葡聚醣) 或陽離子脂質 (脂質體) 進行核酸轉移/轉染。磷酸鈣及聚乙烯亞胺為用於大規模核酸轉移的最常用轉染試劑 (參見，例如，Baldi 等人，Biotechnol.Lett.29 (2007) 677-684)，其中聚乙烯亞胺為較佳。
在無血清的懸浮培養物中生長並使用 PEI 作為轉染試劑改善轉染條件的效率及重現性，允許使用搖瓶、波動或攪拌罐生物反應器即時放大 AAV 生產。
該組成物亦可以包含另外的質體或/及細胞。此種質體及細胞可與游離的 PEI 接觸。
除 PEI 以外，丙戊酸 (VPA) 可用於改善轉染效率。VPA 為分支短鏈脂肪酸，並抑制組蛋白脫乙醯酶活性。由於該原因，它通常作為重組蛋白生產的增強劑加入至哺乳動物細胞培養物中。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，所編碼之 AAV 包裝蛋白包括 AAV rep 及/或 AAV cap。在所有態樣及實施例的某些實施例中，此種 AAV 包裝蛋白包括任何 AAV 血清型的 AAV rep 及/或 AAV cap 蛋白。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，所編碼之輔助蛋白包括腺病毒 E1A 及 E1B、腺病毒 E2 及/或 E4、VA RNA 及/或非 AAV 輔助蛋白。
可使用培養真核細胞的常用條件進行培養，即約 37℃、95% 濕度及 8 vol.-% CO 2。可在含血清或無血清培養基中進行貼附培養或懸浮培養。懸浮培養可在任何發酵容器中進行，諸如，舉例而言，在攪拌釜反應器、波反應器、搖動反應器、振動器容器或旋轉容器或所謂的滾瓶中進行。可分別以高通量形式及篩選進行轉染，例如在 96 或 384 孔形式中進行。
如本發明之方法可包括任何血清型的 AAV 顆粒或其變異體。在所有態樣及實施例的某些實施例中，重組 AAV 顆粒包含以下中的任一者：AAV 血清型 1-12、AAV VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白，或經修飾或變變體 AAV VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白，或野生型 AAV VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白。在所有態樣及實施例的某些實施例中，AAV 顆粒包含 AAV 血清型或 AAV 假型，其中 AAV 假型包括不同於 ITR 血清型的 AAV 殼體血清型。
表現控制元件包括組成型或可調節控制元件，諸如組織特異性表現控制元件或啟動子。
ITR 可為 AAV2 或 AAV6 或 AAV8 或 AAV9 血清型中的任一者，或其組合。AAV 顆粒可包括與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11、AAV12、AAV 2i8、AAV rh.10、AAV rh.74 或 AAV 7m8 VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白具有 75% 或更多序列同一性的任何 VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白，或包含選自以下之任一者的經修飾或變異體 VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV-2i8、AAV-rh.10、AAV-rh.74 及 AAV-7m8 AAV 血清型。
在產生重組病毒 (例如，AAV) 顆粒之後，如果需要，可使用各種習用方法從宿主細胞中純化及/或分離病毒 (例如，rAAV) 顆粒。此類方法包括管柱層析、CsCl 梯度、碘克沙醇 (iodixanol) 梯度等。
例如，可使用複數個管柱純化步驟，例如在陰離子交換管柱、親和性管柱及/或陽離子交換管柱上的純化。(參見，例如 WO 02/12455 及 US 2003/0207439)。或者或此外，可使用碘克沙醇或 CsCl 梯度步驟 (參見，例如 US 2012/0135515；及 US 2013/0072548)。此外，如果使用感染性病毒來表現包裝及/或輔助蛋白，則可使用各種方法將殘留病毒去活化。例如，可經由加熱到約 60℃ 的溫度例如 20 分鐘或更長時間將腺病毒去活化。此種處理有效地去活化輔助病毒，因為 AAV 是熱穩定的，而輔助腺病毒是熱不穩定的。
rAAV 生產及純化系統的目標是達成以最大限度降低/控制生產相關所產生雜質的策略，諸如蛋白質、核酸及載體相關雜質，包括野生型/假野生型 AAV 物種 (wtAAV) 及 AAV 封裝之殘留 DNA 雜質。
考量 rAAV 僅占生物質的小級分，rAAV 需純化到一定程度之純度才能用作臨床人類基因治療產品 (參見，例如 Smith P.H. 等人，Mo.Therapy 7 (2003) 8348；Chadeuf G. 等人，Mo.Therapy 12 (2005) 744；來自 CHMP 基因治療專家小組會議報告，歐洲藥品管理局 EMEA/CHMP 2005, 183989/2004)。
在根據本發明之方法之所有態樣及實施例的某些實施例中，作為起始步驟，通常為收獲產生 rAAV 顆粒的培養細胞，視情況地與收穫細胞培養上清液 (培養基) 結合，其中已培養產生重組 AAV 顆粒的細胞 (懸浮或貼附)。可按原樣使用、適當使用、裂解或濃縮使用收穫之細胞及視情況的細胞培養上清液。此外，如果使用感染以表現輔助功能，則可將殘留的輔助病毒去活化。例如，可經由加熱到約 60℃ 的溫度例如 20 分鐘或更長時間將腺病毒去活化，這僅去活化輔助病毒，因為 AAV 是熱穩定的，而輔助腺病毒是熱不穩定的。
可以使用本領域現有之方法，諸如，例如去污劑裂解或凍融循環，裂解收穫的培養液中的細胞，以釋放 rAAV 顆粒。在細胞裂解過程中同時或隨後在細胞裂解之後，加入核酸酶 (例如 benzonase) 以降解汙染 DNA。通常，將所得溶胞產物澄清以移除細胞碎片 (例如藉由過濾或離心)，以得到澄清之細胞裂解液。在一特定實例中，將溶胞產物以微米孔徑的過濾器 (諸如 0.1-10.0 µm 孔徑的過濾器，例如 0.45 µm 及/或孔徑 0.2 µm 的過濾器) 過濾，以產生澄清的溶胞產物。
溶胞產物 (視情況澄清溶胞產物) 含有重組 AAV 顆粒 (包括完整及空 rAAV) 及生產/程序相關雜質，諸如來自宿主細胞的可溶細胞組分，這些組分尤其可包括細胞蛋白質、脂質及/或核酸及細胞培養基組分。然後將視情況澄清之溶胞產物進行純化步驟，使用層析從雜質中純化 rAAV (包含 rAAV 載體)。在第一層析步驟之前，可用合適的緩衝液稀釋或濃縮澄清溶胞產物。
在細胞裂解、視情況澄清及視情況稀釋或濃縮之後，可使用複數個後續及順序層析步驟來純化 rAAV。
第一層析步較佳地為使用 AAV 親和力層析配體的親和力層析步驟。
若第一層析步驟為親和力層析，則第二層層析步驟可為陰離子交換層析。因此，在所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 經由親和力層析純化，然後經由陰離子交換層析或/及陽離子交換層析或/及粒徑篩析層析以任何順序或序列或組合純化。
例如，在下游處理期間，從完整殼體中去除空殼體係基於它們在陰離子交換層析中的不同等電點 (pI)。所有血清型的平均 pI 計算值對於完整殼體為 5.9，並且對於空殼體為 6.3 (Venkatakrishnan, B. 等人，J. Virol.87 (2013) 4974-4984)。
陽離子交換層析的作用是將 AAV 顆粒與存在於澄清溶胞產物及/或親和力或粒徑篩析層析之管柱洗出液中的細胞及其他組分分離。能以廣 pH 範圍結合 rAAV 之強力陽離子交換樹脂的實例包括但不限於任何基於磺酸之樹脂，如存在磺酸鹽官能基團 (包括經芳基及烷基取代之磺酸鹽) 之樹脂，諸如磺丙基或磺乙基樹脂所示。代表性基質包括但不限於 POROS HS、POROS HS 50、POROS XS、POROS SP 及 POROS S (強力陽離子交換劑可自 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 獲得)。其他實例包括 Capto S、Capto S ImpAct、Capto S ImpRes (強力陽離子交換劑可自 GE Healthcare, Marlborough, MA, USA 獲得)，而商業 DOWEX®、AMBERLITE® 及 AMBERLYST® 系列樹脂可自 Aldrich Chemical Company (Milliwaukee, WI, USA) 獲得。弱陽離子交換樹脂包括但不限於任何基於羧酸的樹脂。例示性陽離子交換樹脂包括羧甲基 (CM)、磷 (基於磷酸官能基團)、甲基磺酸 (S) 及磺丙基 (SP) 樹脂。
陰離子交換層析的作用是將 rAAV 與存在於澄清溶胞產物及/或來自親和力或陽離子交換或粒徑篩析層析之管柱洗出液中的蛋白質、細胞及其他組分分離。陰離子交換層析亦可用於減少並由此控制洗出液中空 rAAV 的量。例如，可用包含適當濃度 (例如，約 100-125 mM，諸如 110-115 mM) 之 NaCl 溶液洗滌其上結合完整及空 rAAV 的陰離子交換管柱，且可在沒有顯著沖提完整 rAAV 的流動中沖提一部分空 rAAV 。隨後，可使用包含更高濃度 (例如，約 130-300 mM NaCl) 之 NaCl 溶液沖提與陰離子交換管柱結合的完整 rAAV，由此產生管柱洗出液，該管柱洗出液具有減少量或耗竭量之空 rAAV 且成比例增加量之完整 rAAV，該完整 rAAV 包含 rAAV 載體。
例示性陰離子交換樹脂包括但不限於基於聚胺樹脂及其他樹脂的陰離子交換樹脂。強力陰離子交換樹脂的實例包括通常基於季銨化氮原子的陰離子交換樹脂，包括但不限於季銨鹽樹脂，例如三烷基芐基銨樹脂。合適的交換層析材料包括但不限於 MACRO PREP Q (強力陰離子交換劑可自 BioRad, Hercules, CA, USA 獲得)；UNOSPHERE Q (強力陰離子交換劑可自 BioRad, Hercules, CA, USA 獲得)；POROS 50HQ (強力陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)；POROS XQ (強力陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 獲得)；POROS SOD (弱陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 獲得)；POROS 50PI (弱陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 獲得)；Capto Q、Capto XQ、Capto Q ImpRes 及 SOURCE 30Q (強力陰離子交換劑可自GE healthcare, Marlborough, MA, USA 獲得)；DEAE SEPHAROSE (弱陰離子交換劑可自 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA 獲得)；Q SEPHAROSE (強力陰離子交換劑可自 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA 獲得)。另外的例示性陰離子交換樹脂包括胺基乙基 (AE)、二乙基胺基乙基 (DEAE)、二乙基胺基丙基 (DEPE) 及季胺基乙基 (QAE)。
用於治療人類疾病之純化重組 AAV 顆粒作為產品的商業製造方法應達成以下目標：1) 一致的顆粒純度、效力及安全性；2) 製造方法的可擴展性；3) 可接受的製造成本。
WO 2019/006390 報導純化重組 AAV 顆粒的例示性方法。
用於判定含有轉殖基因之 rAAV 顆粒的感染滴度之方法為本領域所習知 (參見，例如 Zhen 等人，Hum.Gene Ther.15 (2004) 709)。用於測定具包裝轉殖基因之空 rAAV 及完整 rAAV 之方法為習知 (參見，例如 Grimm 等人，Gene Therapy 6 (1999) 1322-1330；Sommer 等人，Malec.Ther.7 (2003) 122-128)。
為判定降解/變性殼體的存在或數量，可對純化的 rAAV 進行 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該凝膠電泳由能夠分離三種殼體蛋白之的任何凝膠 (例如梯度凝膠) 所組成，然後運行凝膠直到樣品分離，並將凝膠轉印到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。然後將抗 AAV 殼體抗體作為結合至變性殼體蛋白的初級抗體 (參見，例如 Wobus 等人，J. Viral.74 (2000) 9281-9293)。結合至初級抗體的二級抗體包含檢測初級抗體的方式。使用半定量檢測初級抗體與二級抗體之間的結合以判定殼體的數量。另一種方法是使用具 SEC 管柱的分析級 HPLC 或分析級超速離心機。
具體實施方式
本發明至少部分地基於以下發現：當在升高的 pH 值諸如 pH 7.4-7.6 下進行培養時，產生重組腺相關病毒顆粒的哺乳動物細胞的生產力可以增加。
儘管轉染參數、DNA/試劑比、轉染時的 VCD 及複合時間的優化可以提高 rAAV 生產力，但此種提高遠遠被根據本發明的 pH 值所具有的效果所超越。
下面，每個表中的參考值，即基值，由標識符「(100%)」表示。
已發現，對於在 HEK293 細胞中瞬時產生 rAAV 顆粒，將培養 pH 值從通常使用的 pH 7.2 增加到 pH 值 7.4 或者甚至 7.6 會增加顆粒產量以及基因體產量。由於基因體產量的增加高於滴度產量的增加，滿空比亦得到改善。
例如，對於使用懸浮生長的 HEK293 細胞在無血清培養基中瞬時生產 rAAV2 顆粒而言，將培養 pH 值從通常使用的 pH 7.2 增加到 pH 值 7.4 或者甚至 7.6 會增加顆粒產量 3 倍以上以及基因體產量 10 倍以上。
下表提供了適合在無血清培養基中懸浮生長的 HEK293 細胞的示例性資料，顯示了根據本發明之方法的效果 (亦參見圖 1、2 及 3)。可以看出，如果培養 pH 值從 pH 7.2 增加到 pH 7.4 或 pH 7.6，則基因體滴度 (vg/mL) 增加 10 倍以上。同時，殼體滴度 (vp/mL) 增加 2 至 3 倍。因此，當殼體滴度的增加低於基因體滴度的增加時，滿空比增加 4 倍以上。
pH 值 ( 轉染後 72 小時收穫 ) vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
7.0 4.23 E+08 88% 8.10 E+09 32% 4.96% 263% #1 #1
7.2 (100%) 4.80 E+08 100% 2.50 E+10 100% 1.89% 100% #1 #2
7.4 8.95 E+09 1865% 9.60 E+10 384% 8.53% 452% #1 #3
7.6 5.33 E+09 1110% 5.90 E+10 236% 8.28% 439% #1 #4
對於 pH 7.2、pH 7.4 及 pH 7.6，產量與培養時間無關，而在 pH 值為 7.0 時，產量隨著培養時間的增加而降低。這顯示於下表中。因此，與 pH 7 或 pH 7.2 相比，在 pH 值為 7.4 及 7.6 時，該過程更加穩健，且產率更高。
pH 7.0 vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
轉染後 72 小時收穫 (100%) 4.23 E+08 100% 8.10 E+09 100% 5.22% 100% #1 #1
轉染後 96 小時收穫 2.04 E+08 48% 5.50 E+09 68% 3.71% 71% #1 #1
轉染後 120 小時收穫 1.30 E+08 31% 4.60 E+09 57% 2.83% 54% #1 #1
pH 7.2 vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
轉染後 72 小時收穫 (100%) 4.80 E+08 100% 2.50 E+10 100% 1.92% 100% #1 #2
轉染後 96 小時收穫 5.01 E+08 104% 2.30 E+10 92% 2.18% 113% #1 #2
轉染後 120 小時收穫 3.75 E+08 78% 2.40 E+10 96% 1.56% 81% #1 #2
pH 7.4 vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
轉染後 72 小時收穫 (100%) 8.95 E+09 100% 9.60 E+10 100% 9.33% 100% #1 #3
轉染後 96 小時收穫 8.86 E+09 99% 9.40 E+10 98% 9.43% 101% #1 #3
轉染後 120 小時收穫 9.02 E+09 101% 9.60 E+10 100% 9.39% 101% #1 #3
pH 7.6 vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
轉染後 72 小時收穫 (100%) 5.33 E+09 100% 5.90 E+10 100% 9.03% 100% #1 #4
轉染後 96 小時收穫 5.10 E+09 96% 5.90 E+10 100% 8.64% 96% #1 #4
轉染後 120 小時收穫 5.15 E+09 97% 5.80 E+10 98% 8.87% 98% #1 #4
pH 值從 pH 7.2 變化到 pH 7.4 或 pH 7.6 的效果遠遠超過藉由優化製程條件 (諸如例如改變轉染試劑或添加饋料) 所獲得的滴度增加，如下表所示。第三資料行顯示了培養 pH 值、轉染試劑及饋料添加的伴隨變化所導致的滴度增加。
轉染後 72h 收穫 vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
pH 7.2 ，以 PEI 轉染，無饋料 (100%) 4.80 E+08 100% 2.50 E+10 100% 1.92% 100% #1 #2
pH 7.2 ，以 FectoVIR(TM) 轉染，饋料 9.39 E+08 195% 1.20 E+10 48% 7.83% 407% #3 #5
pH 7.4 ，以 FectoVIR(TM) 轉染，饋料 (#3#1 、 #3#2 、 #4#1 、 #4#2 的平均值 ) 1.22 E+10 2539% 1.15 E+11 460% 10.62% 553%
為了直接比較，在優化的轉染試劑條件下培養 pH 值的變化以及添加饋料所導致的滴度增加如下表所示。
vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
pH 7.2 ，以 FectoVIR(TM) 轉染，饋料 (100%) 9.39 E+08 100% 1.20 E+10 100% 7.83% 100% #3 #5
pH 7.4 ，以 FectoVIR(TM) 轉染，饋料 (#3#1 、 #3#2 、 #4#1 、 #4#2 的平均值 ) 1.22 E+10 1299% 1.15 E+11 958% 10.62% 136%
藉由優化培養條件，在 pH 值為 7.2 時培養變得不太穩健。然而，在 pH 值為 7.4 時，該過程仍保持其穩健性。亦即，藉由將 pH 值從 pH 7.2 增加到 pH 7.4，可以抵消由於反應條件的最佳化而導致的製程穩健性的損失。這顯示於下表中。
pH 7.2 ，以 FectoVIR(TM) 轉染，饋料 vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
轉染後 72 小時收穫 (100%) 9.39 E+08 100% 1.20 E+10 100% 7.83% 100% #3 #5
轉染後 96 小時收穫 5.35 E+08 57% 6.40 E+09 53% 8.36% 107% #3 #5
pH 7.4 ，以 FectoVIR(TM) 轉染，饋料 vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
轉染後 72 小時收穫 (100%) (#3#1 、 #3#2 、 #4#1 、 #4#2 的平均值 ) 1.22 E+10 100% 1.15 E+11 100% 10.62% 100%
轉染後 96 小時收穫 1.10 E+10 90% 9.90 E+10 86% 11.08% 104% #4 #2
例如，對於在如上所述的優化條件下使用市售 HEK 293 Expi 細胞在無血清培養基中瞬時產生 rAAV2 顆粒而言，顆粒產量可進一步增加約 1.7 倍，並且基因體產量可進一步增加約 1.8 倍，即 80%。該資料顯示於下表中。
pH 7.4 ，以 FectoVIR(TM) 轉染，饋料 vg/mL ( 絕對 ) vg/mL ( 相對 ) vp/mL ( 絕對 ) vp/mL ( 相對 ) 滿 / 空比 ( 絕對 ) 滿 / 空比 ( 相對 ) 設置 運行
無血清混懸液 HEK293 轉染後 72 小時收穫 (100%) (#3#1 、 #3#2 、 #4#1 、 #4#2 的平均值 ) 1.22 E+10 100% 1.15 E+11 100% 10.60% 100%
商業 HEK 293 過期轉染後 72 小時收穫 (#3#3 、 #3#4 、 #4#3 、 #4#4 的平均值 ) 2.21 E+10 181% 1.98 E+11 172% 11.20% 106%
***
提供實例及圖式以幫助理解本發明，但本發明之真實範圍在所附申請專利範圍中闡明。應當理解的是，在不脫離本發明之精神的前提下，可以對所提出的步驟進行修改。 ***
實例
材料
細胞株
使用可商購獲得的 HEK293 細胞，用於使用用三種質體進行的瞬時轉染來生產 AAV 顆粒。
培養材料
根據供應商的操作說明使用培養基及補充劑。培養基及饋料在 4℃ 下在黑暗中儲存，並根據製造商的說明進行消耗。校正劑在室溫下儲存 (葡萄糖溶液；碳酸鈉溶液；消泡劑溶液)。
實例 1
HEK293 細胞之培養及重組 AAV 製劑之生產
通常，培養方法改編自標準方案 (參見，例如，Lindl, T., 「Zell- und Gewebekultur: Einführung in die Grundlagen sowie ausgewählte Methoden und Anwendungen」, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, 2002) 及相應的供應商的操作說明。
預培養
將 HEK 細胞解凍，並在搖瓶中在 37℃、85% 濕度、5% pCO2 及 120 rpm 搖動頻率下在培養基中繁殖兩至三週。細胞每三至四天發生分裂，並在培養基中擴增至生產培養的接種所需之體積。
生產培養
為了生產重組 AAV 顆粒，在指定條件下以分批或饋料分批製程在各自的反應器中培養各自的預培養 HEK293 細胞。
第 1 組 – rAAV 顆粒製劑，其顆粒包含衍生自 AAV2 血清型的殼體變異體及治療性轉殖基因：反應器：Ambr250 細胞株：適應無血清培養基之 HEK293 混懸液 培養基：HEK ViP NB + 8 mM 麩醯胺酸 + 胰島素 饋料：無 (批次) 溫度 37℃ 速度：約 450 rpm 接種後培養時間：144 小時 轉染：瞬時；三個質體；比率約 1:2.5:2 (轉殖基因：rep/cap：輔助) 轉染：接種後約 24 小時 轉染試劑：PEIpro(TM) 轉染試劑:DNA 比率：約 2:1 DNA 濃度：約 3 µg/mL 轉染 VCD：約 30 E+05 個細胞/mL 轉染：轉染混合於 ⅓ 新鮮培養基中 裂解：無
設置 運行 轉染後時間 pH 基因體滴度 [vg/mL] 殼體滴度 [vp/mL] 滿 / 空 [ ％ ]
#1 #1 72 7 4.23 E+08 8.10 E+09 5.22
#1 #1 96 7 2.04 E+08 5.50 E+09 3.71
#1 #1 120 7 1.30 E+08 4.60 E+09 2.83
#1 #2 72 7.2 4.80 E+08 2.50 E+10 1.92
#1 #2 96 7.2 5.01 E+08 2.30 E+10 2.18
#1 #2 120 7.2 3.75 E+08 2.40 E+10 1.56
#1 #3 72 7.4 8.95 E+09 9.60 E+10 9.33
#1 #3 96 7.4 8.86 E+09 9.40 E+10 9.43
#1 #3 120 7.4 9.02 E+09 9.60 E+10 9.39
#1 #4 72 7.6 5.33 E+09 5.90 E+10 9.03
#1 #4 96 7.6 5.10 E+09 5.90 E+10 8.64
#1 #4 120 7.6 5.15 E+09 5.80 E+10 8.87
第 2 組 - rAAV 顆粒製劑，其顆粒包含衍生自 AAV2 血清型的殼體變異體及治療性轉殖基因：反應器：Ambr250 細胞株：適應無血清培養基之 HEK293 混懸液 培養基：HEK ViP NB + 8 mM 麩醯胺酸 + 胰島素 饋料：無 (批次) 溫度 37℃ 速度：約 450 rpm 接種後培養時間：120 小時 轉染：瞬時；三個質體；比率約 1:2.5:2 (轉殖基因：rep/cap：輔助) 轉染：接種後約 24 小時 轉染試劑：PEIpro(TM) 轉染試劑:DNA 比率：約 2:1 DNA 濃度：約 3 µg/mL 轉染 VCD：約 30 E+05 個細胞/mL 轉染：轉染混合於 ⅓ 新鮮培養基中 裂解：無
設置 運行 轉染後時間 pH 基因體滴度 [vg/mL] 殼體滴度 [vp/mL] 滿 / 空 [ ％ ]
#2 #1 96 7 4.00 E+08 5.50 E+09 7.27
#2 #2 96 7.4 7.70 E+09 9.90 E+10 7.78
第 3 組及第 4 組 - DoE ：
rAAV 顆粒製劑：1) 其顆粒包含衍生自 AAV2 血清型的殼體變異體及治療性轉殖基因；2) 其顆粒包含 AAV2 野生型殼體及綠色螢光蛋白 (GFP) 轉殖基因： 反應器：Ambr15 細胞株：1) 適應無血清培養基之 HEK293 混懸液；2) HEK293 過期 培養基：HEK ViP NB + 8 mM 麩醯胺酸 + 胰島素 饋料：1) 無 (批次)；2) 轉染後的培養基及葡萄糖饋料 溫度 37℃ 速度：約 450 rpm 接種後培養時間：120 小時 轉染：瞬時；三個質體；比率 1) 約 1:2.5:2 或 2) 約 1:1:1 (轉殖基因：rep/cap：輔助) 轉染：接種後 24 小時 轉染試劑：1) PEI + 游離 PEI + 丙戊酸；2) FectoVIR(TM)-AAV 轉染試劑:DNA 比率：1) 約 2.5:1；2) 約 1.5:1 DNA 濃度：1) 約 3 µg/mL；2) 約 2 µg/mL 轉染 VCD：約 30 E+05 個細胞/mL 轉染：轉染混合於 ⅓ 新鮮培養基中 裂解：1) 不是；2) 是
設置 運行 轉染後時間 pH AAV 細胞株 比率 饋料 裂解 轉染 質體濃度 [µg/mL] 試劑 /DNA 比率 基因體滴度 [vg/mL] 殼體滴度 [vp/mL] 滿 / 空 [ ％ ]
#3 #1 72 7.4 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.18 E+10 1.1 E+11 10.75
#3 #1 96 7.4 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.05 E+10 9.4 E+10 11.20
#3 #2 72 7.4 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.24 E+10 1.1 E+11 11.28
#3 #2 96 7.4 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.19 E+10 9.9 E+10 12.04
#3 #3 72 7.4 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 2.07 E+10 1.7 E+11 12.19
#3 #3 96 7.4 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 2.06 E+10 1.6 E+11 12.87
#3 #4 72 7.4 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 2.29 E+10 2.0 E+11 11.47
#3 #4 96 7.4 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 2.52 E+10 1.9 E+11 13.27
#3 #5 72 7.2 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 9.39 E+08 1.2 E+10 7.83
#3 #5 96 7.2 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 5.35 E+08 6.4 E+09 8.36
#3 #6 72 7.0 1) 1) 1) 1) 1) 2) 1) 2) 6.29 E+08 4.4 E+09 14.30
#3 #6 96 7.0 1) 1) 1) 1) 1) 2) 1) 2) 3.46 E+08 2.5 E+09 13.85
#3 #7 72 7.2 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.39 E+10 1.1 E+11 12.61
#3 #7 96 7.2 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.60 E+10 1.0 E+11 16.01
#3 #8 72 7.0 1) 2) 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1.94 E+10 1.0 E+11 19.43
#3 #8 96 7.0 1) 2) 1) 1) 1) 2) 1) 2) 2.01 E+10 9.0 E+10 22.30
#3 #9 72 7.4 1) 2) 2) 2) 1) 1) 2) 1) 5.66 E+09 6.6 E+10 8.57
#3 #9 72 7.4 1) 2) 2) 2) 2) 1) 2) 1) 1.43 E+10 9.7 E+10 14.76
#3 #10 72 7.0 2) 1) 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1.88 E+09 1.6 E+10 11.73
#3 #10 96 7.0 2) 1) 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1.67 E+09 1.7 E+10 9.82
#3 #11 72 7.4 2) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 6.81 E+09 4.7 E+10 14.48
#3 #11 96 7.4 2) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 4.43 E+09 6.7 E+10 6.61
#3 #12 72 7.4 2) 1) 2) 2) 1) 1) 2) 1) 2.29 E+09 3.3 E+10 6.95
#3 #12 72 7.4 2) 1) 2) 2) 2) 1) 2) 1) 8.27 E+10 5.9 E+11 14.01
設置 運行 轉染後時間 pH AAV 細胞株 比率 饋料 裂解 轉染 質體濃度 [µg/mL] 試劑 /DNA 比率 基因體滴度 [vg/mL] 殼體滴度 [vp/mL] 滿 / 空 [ ％ ]
#4 #1 72 7.4 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.11 E+10 1.1 E+11 10.13
#4 #1 96 7.4 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.01 E+10 9.3 E+10 10.82
#4 #2 72 7.4 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.34 E+10 1.3 E+11 10.32
#4 #2 96 7.4 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1.13 E+10 1.1 E+11 10.26
#4 #3 72 7.4 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 2.26 E+10 2.2 E+11 10.28
#4 #3 96 7.4 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 2.45 E+10 2.1 E+11 11.65
#4 #4 72 7.4 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 2.20 E+10 2.0 E+11 10.98
#4 #4 96 7.4 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 2.27 E+10 2.4 E+11 9.44
#4 #5 72 7.4 1) 1) 2) 2) 1) 1) 2) 1) 2.52 E+09 6.2 E+10 4.07
#4 #5 72 7.4 1) 1) 2) 2) 2) 1) 2) 1) 4.61 E+09 7.9 E+10 5.84
#4 #6 72 7.0 2) 2) 2) 1) 1) 1) 2) 1) 1.14 E+08 6.2 E+08 18.45
#4 #6 72 7.0 2) 2) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 1.52 E+09 1.9 E+10 7.98
#4 #7 72 7.0 2) 2) 1) 1) 1) 2) 1) 2) 1.25 E+09 1.2 E+10 10.45
#4 #7 96 7.0 2) 2) 1) 1) 1) 2) 1) 2) 5.48 E+08 7.6 E+09 7.21
#4 #8 72 7.0 1) 1) 2) 1) 1) 1) 2) 1) 7.44 E+08 7.6 E+09 9.79
#4 #8 72 7.0 1) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2.84 E+09 5.0 E+10 5.68
#4 #9 72 7.4 2) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 4.35 E+09 5.0 E+10 8.70
#4 #9 96 7.4 2) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 6.60 E+09 7.1 E+10 9.30
#4 #10 72 7.0 2) 1) 2) 1) 1) 1) 2) 1) 1.10 E+09 1.4 E+10 7.86
#4 #10 72 7.0 2) 1) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 4.31 E+09 7.7 E+10 5.60
#4 #11 72 7.0 1) 2) 2) 1) 1) 1) 2) 1) 未判定 4.3 E+09 未判定
#4 #11 72 7.0 1) 2) 2) 1) 2) 1) 2) 1) 未判定 4.6 E+10 未判定
#4 #12 72 7.4 2) 2) 2) 2) 1) 1) 2) 1) 4.26 E+09 2.0 E+10 21.31
#4 #12 72 7.4 2) 2) 2) 2) 2) 1) 2) 1) 6.86 E+09 8.2 E+10 8.36
實例 2
裂解
如果該過程中包含裂解，則如下進行：為了將 AAV 顆粒釋放到細胞培養液中，將 5% (v/v) 裂解緩衝液 (10% Triton CG 110，40 mM MgCl 2) 加入至培養液中。另外，加入 100 U/ml BenzonaseTM 核酸酶 (Merck)。然後將細胞培養液在 37℃ 在攪拌下孵育約一小時，無需通氣及 pH 控制。各自孵育後，加入 5M NaCl 溶液並將溶胞產物無菌過濾。
實例 3
AAV 顆粒純化
對於親和力層析步驟，在 Äkta Avant 25 層析系統上使用包含來自 Thermo Fisher 的 10.5 mL AAVX 樹脂的管柱。該系統以約 300 cm/h 之流速運轉。用緩衝液 A (1x PBS，pH 7.4，0.001% Pluronic F-68) 平衡後，將 200 mL 裂解培養液施加至管柱，然後分別地用平衡緩衝液及 0.5 M NaCl (pH 6.0) 進行 2 次洗滌步驟。AAV 顆粒用 0.1 M 檸檬酸鈉溶液 (pH 2.4) 沖提。藉由加入 2 M Tris (pH 10) 將洗出液之 pH 調節至 pH 7.5。
步驟 緩衝液 管柱體積 [CV]
平衡 1xPBS，pH 7.4 3
負載 溶胞產物  
洗滌 I 1xPBS，pH 7.4 4
洗滌 II 0.5 M 氯化鈉 pH 6.0 4
洗滌 III 1xPBS，pH 7.4 4
沖提 0.1 M 檸檬酸鈉 pH 2.4 3
實例 4
分析方法
用於總滴度判定的酶聯免疫吸附測定 (ELISA)
對於 AAV 殼體滴度判定，根據製造商的說明使用來自 PROGEN 的套組 (目錄號 PRAAV8)。
簡而言之，該測定為一種使用重組 AAV 殼體特異性抗體及生物素標記的檢測抗體作為捕獲抗體的夾心 ELISA。
將預塗之多滴度板 (MTP) 的孔分別地與 100 µL 標準品、樣品或對照品在 4℃ 下孵育過夜。次日，用如套組中提供之 ASSB 緩衝液 (1x) 將孔洗滌三次。此後，每孔加入 100 µL 包含生物素化檢測抗體 (根據製造商的說明稀釋) 的溶液，並在室溫下在搖動的情況下孵育兩小時。然後，用如套組中提供之 ASSB 緩衝液 (1x) 將孔洗滌三次。在下一步驟中，將 100 µl 包含與鏈黴親和素結合的辣根過氧化物酶的溶液加入至每個孔中，並在室溫下在搖動的情況下孵育 30 分鐘。然後，用如套組中提供之 ASSB 緩衝液 (1x) 將孔洗滌三次。對於呈色反應，將 100 µL 根據製造商的說明製備的包含 ABTS 的溶液加入至每個孔中並在搖動的情況下孵育。使用 MTP-ELISA-Reader Versa Max (Molecular Devices) 在 405 nm 判定顏色強度，參考波長為 490 nm，直至空白與具有最高濃度的標準品之間的消光差異達到約 1.5。
每個樣品、標準品及對照品都重複測量兩次。
基於藉由 4 參數擬合判定的標準曲線計算殼體的量 (殼體/mL)，例如根據 WiemerRodbard 演算法，使用標準品的平均值。
用於基因體滴度判定的數字微滴聚合酶鏈反應 (ddPCR) 用於酶促樣品處理之試劑： 1) DNA 酶 I 緩衝液 (NEB)：100 mM Tris-HCl，pH 7.6，25 mM MgSO 4，5 mM CaCl 22) DNA 酶 I (NEB)：0.2 U/µL 3) 蛋白酶 K (NEB；大約 20 mg/mL = 800 U/mL)：16 U / mL 4) 蛋白酶 K 緩衝液 (BioRad)：400 mM Tris-HCl，20 mM EDTA，2000 mM NaCl，1 % SDS，pH 8 5) 十二烷基硫酸鈉 (SDS) 溶液：10 % (w/v) 酶促樣品處理： -混合 30 µL H2O、5 µL DNase I 緩衝液、5 µL DNase I、10 µL 樣品 -在 37℃ 下孵育 30 分鐘。 -加熱至 75℃ 持續 15 分鐘，以獲得經孵育的 DNase I-Mix -短暫的冷卻及離心 -混合 42 µL H2O + 2 µL 蛋白酶 K + 5 µL 蛋白酶 K 緩衝液 + 1 µL 10 % SDS 溶液，並加入經孵育的 DNase I-Mix -在 50℃ 下孵育 60 分鐘 -加熱至 95℃ 持續 15 分鐘。 -冷卻至 4℃ ddPCR：
對於病毒基因體滴定，進行了雙鏈化 ddPCR 測定。引子及探針係針對所使用之 CMV 啟動子並針對 polyA/3'UTR 序列設計。根據下表 (微滴數字 PCR 引導 - Bio-Rad) 製備 PCR 預混液。
組分 每孔體積 [µL] 最終濃度
Supermix (2x) 11 1x
20 µM CMV 正向引子 0.99 900 nM
20 µM CMV 反向引子 0.99 900 nM
20 µM CMV 探針 0.275 250 nM
模板 5.5 -
水 0.99 -
總計 22  
將經製備的預混液移液至 96 孔板中，每孔 16.5 µL。然後，進行預處理樣品的稀釋系列：使用 LoRentention Tips 將 10 µL 樣品轉移至 LoBind 管中的 90 µL 水中，並充分混合。此後，在數個稀釋步驟中將 5.5 µL 樣品加入至 96 孔板中的預混液溶液中。將板在 180℃ 下密封，以 2,200 rpm 渦旋 1 分鐘。並以 1,000 rpm 再離心 1 分鐘。使用自動微滴生成器裝置 (從每孔中取出 20 µL PCR 混合物)，每孔產生多達 20,000 個微滴，並轉移至另一個 96 孔板中。在 180℃ 下密封微滴板後，進行 PCR 運轉。相應的條件顯示於下表中。
週期數 變性 退火 最終伸長 結束
1 94℃，10 分鐘。      
39 94℃，30 秒。 58°C，1 分鐘。    
1     98℃，10 分鐘。 12℃ 恆定
在微滴讀數儀中，測量每個微滴的螢光訊號。QuantaSoft 軟體處理讀數儀資料並計算標靶序列的每 20 µL 孔的拷貝數。初始樣品滴度可以用以下方程式判定：
圖 1第 1 組收穫樣品中基因體滴度的可視化 (轉染後 120 小時收穫，無裂解)。 圖 2第 1 組收穫樣品中殼體滴度的可視化 (轉染後 120 小時收穫，無裂解)。 圖 3第 1 組收穫樣品中滿空比的可視化 (轉染後 120 小時收穫，無裂解)。

Claims (14)

  1. 一種生產重組腺相關病毒顆粒製劑 (rAAVp) 之方法，其包含培養 HEK293 細胞之步驟，該 HEK293 細胞包含針對間隔在兩個 AAV 反向末端重複序列 (ITR) 之間的非腺相關病毒基因、腺相關病毒 rep 基因、腺相關病毒 cap 基因、腺相關病毒 E1A 基因、腺相關病毒 E1B 基因、腺相關病毒 E2A 基因、腺相關病毒 E4orf6 及視情況之腺相關病毒 VA RNA 基因之表現匣，並由此生產該 rAAVp， 其中該培養係在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下。
  2. 如請求項 1 之方法，其中藉由在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下的該培養所生產之該 rAAVp 的產量係高於藉由在 pH 7.0 至 pH 7.2 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp 的產量。
  3. 如請求項 1 至 2 中任一項之方法，其中，藉由在 pH 7.4 至 pH 7.6 且含端值的範圍內之 pH 值下的該培養所生產之該 rAAVp 相較於藉由在 pH 7.0 至 pH 7.2 且含端值的範圍內之 pH 值下的培養所生產之 rAAVp，具有較高的完整顆粒百分比。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該 rAAVp 為治療性 rAAVp。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中該 rAAVp 包含重組腺相關病毒顆粒 (rAAV)，該等 rAAV 包含間隔在兩個腺相關病毒反向末端重複序列之間的至少一個編碼核酸序列。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之方法，其中該 rAAV 係屬於血清型 AAV2 或其變異體。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之方法，其中該培養涵蓋接種生物反應器及收穫該 rAAVp。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其中，在接種該生物反應器之後，將針對間隔在兩個 AAV ITR 之間的該非腺相關病毒基因、針對該腺相關病毒 rep 基因、針對該腺相關病毒 cap 基因、針對該腺相關病毒 E2A 基因、針對該腺相關病毒 E4orf6 及視情況針對該腺相關病毒 VA RNA 基因之該等表現匣中之一者或多者或全部引入至哺乳動物細胞中。
  9. 如請求項 1 至 8 中任一項之方法，其中該方法進一步包含在該培養步驟之後的從該等細胞及/或培養基分離該 rAAV 及視情況純化該 rAAV 之步驟。
  10. 如請求項 9 之方法，其中該純化是藉由一系列層析步驟進行，其中首先為親和力層析，接以陰離子交換層析或陽離子交換層析，以及視情況之粒徑篩析層析。
  11. 一種醫藥組成物，其包含以如請求項 1 至 10 中任一項之方法所獲得之 rAAVp。
  12. 一種醫藥組成物，其包含以如請求項 1 至 10 中任一項之方法所獲得之 rAAVp 以及醫藥上可接受之賦形劑。
  13. 一種如請求項 1 至 10 中任一項之方法用於增加重組生產之 rAAVp 的產量之用途。
  14. 一種如請求項 1 至 10 中任一項之方法用於增加 rAAVp 中的完整顆粒百分比之用途。
TW113110368A 2023-03-21 2024-03-20 生產重組ａａｖ顆粒製劑之方法 TW202503065A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP23163162.3 2023-03-21
EP23163162 2023-03-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202503065A true TW202503065A (zh) 2025-01-16

Family

ID=85724795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW113110368A TW202503065A (zh) 2023-03-21 2024-03-20 生產重組ａａｖ顆粒製劑之方法

Country Status (8)

Country Link
KR (1) KR20250162543A (zh)
CN (1) CN120835797A (zh)
AR (1) AR132189A1 (zh)
AU (1) AU2024239386A1 (zh)
IL (1) IL323167A (zh)
MX (1) MX2025010665A (zh)
TW (1) TW202503065A (zh)
WO (1) WO2024194280A1 (zh)

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US6093699A (en) 1987-07-09 2000-07-25 The University Of Manitoba Method for gene therapy involving suppression of an immune response
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
WO1994017810A1 (en) 1993-02-12 1994-08-18 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
WO1994023744A1 (en) 1993-04-16 1994-10-27 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
CA2188575A1 (en) 1995-02-28 1996-09-06 H. Kirk Hammond Gene transfer-mediated angiogenesis therapy
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
AU2319497A (en) 1996-03-07 1997-09-22 Regents Of The University Of California, The Helper-free, totally defective adenovirus for gene therapy
CA2682108C (en) 1997-09-05 2013-12-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
PT1109892E (pt) 1998-09-04 2009-02-17 Targeted Genetics Corp Métodos para produzir preparações de vectores de aav recombinantes libertados, de título elevado, isentas de vírus auxiliares
DE19955558C2 (de) 1999-11-18 2003-03-20 Stefan Kochanek Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren
US6593123B1 (en) 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
JP4559429B2 (ja) 2003-05-21 2010-10-06 ジェンザイム・コーポレーション 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法
DE102005054628A1 (de) 2005-11-16 2007-05-24 Cevec Pharmaceuticals Gmbh Verfahren zur Herstellung von permanenten humanen Zelllinien
WO2011094198A1 (en) 2010-01-28 2011-08-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Research Institute, Abramson Research Center A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy
EP2748185A1 (en) 2011-08-24 2014-07-02 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University New aav capsid proteins for nucleic acid transfer
CA2870736C (en) 2012-04-18 2021-11-02 The Children's Hospital Of Philadelphia Composition and methods for highly efficient gene transfer using aav capsid variants
PH12016500162B1 (en) 2013-07-22 2024-02-21 Childrens Hospital Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene trnsfer to cells, organs, and tissues
MX2018006682A (es) 2015-12-01 2018-09-26 Spark Therapeutics Inc Metodos escalables para producir vector viral adenoasociado (aav) recombinante en un sistema de cultivo celular en suspension libre de suero adecuado para su uso clinico.
CA3066358A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Spark Therapeutics, Inc. Enhancing agents for improved cell transfection and/or raav vector production
CN111032176A (zh) 2017-06-30 2020-04-17 星火治疗有限公司 Aav载体柱纯化方法
MX2020004830A (es) 2017-11-08 2020-11-11 Avexis Inc Medios y metodo para preparar vectores virales y usos de los mismos.

Also Published As

Publication number Publication date
AU2024239386A1 (en) 2025-08-14
MX2025010665A (es) 2025-10-01
WO2024194280A1 (en) 2024-09-26
CN120835797A (zh) 2025-10-24
KR20250162543A (ko) 2025-11-18
AR132189A1 (es) 2025-06-04
IL323167A (en) 2025-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6165752B2 (ja) アデノ随伴ウイルスの産生のための細胞株
Chiorini et al. Cloning of adeno-associated virus type 4 (AAV4) and generation of recombinant AAV4 particles
Mietzsch et al. OneBac: platform for scalable and high-titer production of adeno-associated virus serotype 1–12 vectors for gene therapy
US20220162642A1 (en) Plasmid system
JP2006223315A (ja) Ａａｖベクター産生のための高効率ヘルパー系
EP0842287B1 (en) High efficiency helper system for aav vector production
CN106884014B (zh) 腺相关病毒反向末端重复序列突变体及其应用
US7091029B2 (en) High titer recombinant AAV production
EP4229071A1 (en) Plasmid system
EP4229205B1 (en) Nucleic acid constructs for va rna transcription
US20250263746A1 (en) Method for producing recombinant aav particles
TW202503065A (zh) 生產重組ａａｖ顆粒製劑之方法
WO2025168663A1 (en) Method for producing recombinant adeno-associated viral particles
CN118974274A (zh) 用于确定aav基因组的方法
TW202405182A (zh) 生產重組ａａｖ顆粒之方法