CN120835797A - 用于产生重组aav颗粒制备物的方法 - Google Patents

Abstract

本文报导了一种用于产生重组腺相关病毒颗粒制备物(rAAVp)的方法，所述方法包括以下步骤：培养哺乳动物细胞，并由此产生所述rAAVp，所述哺乳动物细胞包含针对以下各项的表达盒：插在两个AAV反向末端重复序列(ITR)之间的非腺相关病毒基因；腺相关病毒rep基因；腺相关病毒cap基因；腺相关病毒E1A基因；腺相关病毒E1B基因；腺相关病毒E2A基因；腺相关病毒E4orf6；和腺相关病毒VA RNA基因，其中所述培养是在pH 7.4至pH 7.6的范围内且包括端值的pH值下进行。通过在pH 7.4至pH 7.6的范围内且包括端值的pH值下进行的所述培养产生的所述rAAVp的产率高于通过在pH 7.0至pH 7.2的范围内且包括端值的pH值下进行的培养产生的rAAVp的产率，并且通过在pH 7.4至pH 7.6的范围内且包括端值的pH值下进行的所述培养产生的所述rAAVp比通过在pH 7.0至pH 7.2的范围内且包括端值的pH值下进行的培养产生的rAAVp具有更高的完整颗粒百分比。

Description

用于产生重组 AAV 颗粒制备物的方法

本发明属于基因疗法领域。更具体地，本发明涉及一种用于在哺乳动物细胞、特别是 CHO 和 HEK 细胞中，在比本领域通常使用的 pH 值更高的 pH 值下产生包含治疗性转基因的重组腺相关病毒颗粒的方法。

背景技术

基因疗法为新颖治疗方法带来了前所未有的机遇。基于通过共表达正确的基因来拯救功能突变的概念，为了使生物学功能得以恢复，需要使用病毒载体来确保治疗基因的正确递送。在这种背景下，重组腺相关病毒 (rAAV) 是使用最广泛的载体。

病毒的生物处理非常复杂，并且在上游处理以及下游处理两者中都需要有系统且协调的步骤。然而，使用传统培养方法来产生治疗性病毒无法支持有效的商业制造策略。与治疗性生物分子（诸如例如抗体）相比，病毒的大小较大，使得这一点甚至更加明显。另外，病毒要复杂得多。

治疗性病毒的生物制造过程需要将治疗性转基因插入至重组 AAV 衣壳壳（完整rAAV 颗粒，即包含经衣壳化的核酸的重组 AAV 颗粒）。然而，也可能产生一定百分比的不含有所需转基因的 rAAV（空重组 AAV 颗粒，即不包含经衣壳化的核酸的 rAAV 颗粒），以及部分填充的 rAAV（部分填充的重组 AAV 颗粒）。

发明内容

本发明至少部分地基于以下发现：当在升高的 pH 值诸如 pH 7.4-7.6 下进行培养时，产生重组腺相关病毒颗粒的哺乳动物细胞的产生力可以增加。

本发明至少部分地基于以下发现：当在升高的 pH 值诸如 pH 7.4-7.6 下进行培养时，从对产生所述重组腺相关病毒颗粒的哺乳动物细胞的培养获得的完整重组 AAV 颗粒的分数可以增加。

本发明至少包括以下实施例：

1.一种用于产生重组腺相关病毒颗粒制备物 (rAAVp) 的方法，所述方法包括以下步驟：培养哺乳动物细胞的步骤，并由此产生所述 rAAVp，所述哺乳动物细胞包含针对插在两个 AAV 反向末端重复序列 (ITR) 之间的非腺相关病毒基因、针对腺相关病毒 rep基因、针对腺相关病毒 cap 基因、针对腺相关病毒 E1A 基因、针对腺相关病毒 E1B 基因、针对腺相关病毒 E2A 基因、针对腺相关病毒 E4orf6 以及任选的针对腺相关病毒 VA RNA基因的表达盒，

其中所述培养是在 pH 7.4 至 pH 7.6 的范围内且包括端值的 pH 值下进行。

2.一种用于产生重组腺相关病毒颗粒制备物 (rAAVp) 的方法，所述方法包括以下步驟：培养 HEK 细胞的步骤，并由此产生所述 rAAVp，所述 HEK 细胞包含针对插在两个AAV 反向末端重复序列 (ITR) 之间的非腺相关病毒基因、针对腺相关病毒 rep 基因、针对腺相关病毒 cap 基因、针对腺相关病毒 E2A 基因、针对腺相关病毒 E4orf6 以及任选的针对腺相关病毒 VA RNA 基因的表达盒，

其中所述培养是在 pH 7.4 至 pH 7.6 的范围内且包括端值的 pH 值下进行。

3.根据实施例 1 或 2 中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为 HEK293细胞。

4.根据实施例 1 至 3 中任一项所述的方法，其中通过在 pH 7.4 至 pH 7.6 的范围内且包括端值的 pH 值下进行的所述培养产生的 rAAVp 的基因组滴度高于通过在pH 7.0 至 pH 7.2 的范围内且包括端值的 pH 值下进行的培养产生的 rAAVp 的衣壳滴度。

5.根据实施例 4 所述的方法，其中基因组滴度为至少 1.5 倍高。

6.根据实施例 4 至 5 中任一项所述的方法，其中基因组滴度为至少 2 倍高。

7.根据实施例 4 至 6 中任一项所述的方法，其中基因组滴度为至少 6 倍高。

8.根据实施例 4 至 7 中任一项所述的方法，其中基因组滴度为至少 10 倍高。

9.根据实施例 1 至 8 中任一项所述的方法，其中通过在 pH 7.4 至 pH 7.6 的范围内且包括端值的 pH 值下进行的所述培养产生的 rAAVp 的衣壳滴度高于通过在 pH7.0 至 pH 7.2 的范围内且包括端值的 pH 值下进行的培养产生的 rAAVp 的衣壳滴度。

10.根据实施例 9 所述的方法，其中衣壳滴度为至少 1.5 倍高。

11.根据实施例 9 至 10 中任一项所述的方法，其中衣壳滴度为至少 2 倍高。

12.根据实施例 9 至 11 中任一项所述的方法，其中衣壳滴度为至少 3 倍高。

13.根据实施例 1 至 12 中任一项所述的方法，其中通过在 pH 7.4 至 pH 7.6的范围内且包括端值的 pH 值下进行的所述培养产生的 rAAVp 的基因组滴度和衣壳滴度高于通过在 pH 7.0 至 pH 7.2 的范围内且包括端值的 pH 值下进行的培养产生的rAAVp 的基因组滴度和衣壳滴度。

14.根据实施例 13 所述的方法，其中基因组滴度和衣壳滴度为至少 1.5 倍高。

15.根据实施例 13 至 14 中任一项所述的方法，其中基因组滴度和衣壳滴度为至少 2 倍高。

16.根据实施例 13 至 15 中任一项所述的方法，其中基因组滴度和衣壳滴度为至少 3 倍高。

17.根据实施例 13 至 16 中任一项所述的方法，其中基因组滴度为至少 4 倍高并且衣壳滴度为至少 2 倍高。

18.根据实施例 13 至 17 中任一项所述的方法，其中基因组滴度为至少 6 倍高并且衣壳滴度为至少 2 倍高。

19.根据实施例 1 至 20 中任一项所述的方法，其中通过在 pH 7.4 至 pH 7.6的范围内且包括端值的 pH 值下进行的所述培养产生的所述 rAAVp 比通过在 pH 7.0 至pH 7.2 的范围内且包括端值的 pH 值下进行的培养产生的 rAAVp 具有更高的完整颗粒百分比。

20.根据实施例 19 所述的方法，其中完整颗粒百分比为至少 1.5 倍高。

21.根据实施例 19 至 20 中任一项所述的方法，其中完整颗粒百分比为至少 2倍高。

22.根据实施例 19 至 21 中任一项所述的方法，其中完整颗粒百分比为至少 4倍高。

23.根据实施例 1 至 22 中任一项所述的方法，其中所述 rAAVp 为治疗性rAAVp。

24.根据实施例 1 至 23 中任一项所述的方法，其中所述 rAAVp 用于将转录成具有治疗性效果的多肽的核酸转移至靶细胞中。

25.根据实施例 1 至 24 中任一项所述的方法，其中所述 rAAVp 用于将具有治疗性效果的核酸转移至靶细胞中。

26.根据实施例 1 至 25 中任一项所述的方法，其中所述 rAAVp 包含重组腺相关病毒颗粒 (rAAV)，所述 rAAV 包含至少一个插在两个腺相关病毒反向末端重复序列之间的编码核酸序列。

27.根据实施例 1 至 26 中任一项所述的方法，其中所述 rAAVp 中的 rAAV 衍生自选自由以下项组成的组的野生型 AAV 颗粒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV 2i8、AAV rh.74、AAV rh.10 和 AAV 7m8 及其变体。

28.根据实施例 1 至 27 中任一项所述的方法，其中 rAAV 具有血清型 AAV2 或其变体。

29.根据实施例 1 至 28 中任一项所述的方法，其中 rAAV 包含野生型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11 或 AAV12 的一个或两个 ITR序列。

30.根据实施例 1 至 29 中任一项所述的方法，其中培养包括对生物反应器进行接种和收获 rAAVp。

31.根据实施例 1 至 30 中任一项所述的方法，其中培养以对生物反应器进行接种开始。

32.根据实施例 1 至 31 中任一项所述的方法，其中在对所述生物反应器进行接种之后，将针对插在两个 AAV ITR 之间的所述非腺相关病毒基因、针对所述腺相关病毒rep 基因、针对所述腺相关病毒 cap 基因、针对所述腺相关病毒 E2A 基因、针对所述腺相关病毒 E4orf6 和针对所述腺相关病毒 VA RNA 基因的所述表达盒中的一者或多者或全部引入至所述哺乳动物细胞或 HEK 细胞中。

33.根据实施例 1 至 32 中任一项所述的方法，其中在对所述生物反应器进行接种之后，将针对插在两个 AAV ITR 之间的所述非腺相关病毒基因、针对所述腺相关病毒rep 基因、针对所述腺相关病毒 cap 基因、针对所述腺相关病毒 E2A 基因、针对所述腺相关病毒 E4orf6 和任选的针对所述腺相关病毒 VA RNA 基因的所述表达盒中的一者或多者或全部引入至所述哺乳动物细胞或 HEK 细胞中，由此将最多三种颗粒共转染到所述哺乳动物细胞中，其中质粒中的一者包含针对插在两个 AAV ITR 之间的所述非腺相关病毒基因的表达盒，质粒中的一者包含针对 rep 和 cap 基因的表达盒，并且质粒中的一者包含针对腺病毒 E2A、E4orf6 和 VA RNA 基因的表达盒。

34.根据实施例 1 至 33 中任一项所述的方法，其中在对所述生物反应器进行接种之后，诱导插在两个 AAV ITR 之间的所述非腺相关病毒基因、所述腺相关病毒 rep 基因、所述腺相关病毒 cap 基因、所述腺相关病毒 E2A 基因、所述腺相关病毒 E4orf6 和任选的所述腺相关病毒 VA RNA 基因中的一者或多者或全部的表达。

35.根据实施例 32 至 33 中任一项所述的方法，其中所述引入在对所述生物反应器进行接种之后约 16 至 32 小时进行。

36.根据实施例 34 所述的方法，其中所述诱导在对所述生物反应器进行接种之后约 16 至 32 小时进行。

37.根据实施例 35 至 36 中任一项所述的方法，其中所述引入或诱导在对所述生物反应器进行接种之后约 24 小时进行。

38.根据实施例 1 至 37 中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在培养步骤之后的从细胞和/或培养基分离所述 rAAV 以及任选地纯化所述 rAAV 的步骤。

39.根据实施例 38 所述的方法，其中所述纯化通过一个或多个柱层析步骤和/或CsCl 或碘克沙醇梯度离心步骤进行。

40.根据实施例 38 或 39 所述的方法，其中第一层析步骤为亲和层析步骤。

41.根据实施例 38 至 40 中任一项所述的方法，其中所述纯化通过一系列层析步骤进行，其中首先是亲和层析，之后是阴离子交换层析或阳离子交换层析，以及任选的尺寸排阻层析。

42.一种药物组合物，其包含通过根据实施例 1 至 41 中任一项所述的方法获得的 rAAVp。

43.一种药物组合物，其包含通过根据实施例 1 至 41 中任一项所述的方法获得的 rAAVp，以及药用赋形剂。

44.根据实施例 1 至 41 中任一项所述的方法用于增加重组产生的 rAAVp 的产率的用途。

45.根据实施例 1 至 41 中任一项所述的方法用于增加 rAAVp 中的完整颗粒百分比的用途。

除了所描绘和要求保护的各种实施例之外，所公开的主题还涉及具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。因此，本文所呈现的特定特征可以在所公开的主题的范围内以其他方式彼此组合，使得所公开的主题包括本文所公开的特征的任何合适的组合。出于图示和描述的目的，已经呈现了所公开主题的具体实施例的前文描述。其并不旨在穷举或将所公开的主题限制为所公开的那些实施例。

附图说明

图 1第 1 组收获样品中基因组滴度的可视化（转染后 120 小时收获，无裂解）。

图 2第 1 组收获样品中衣壳滴度的可视化（转染后 120 小时收获，无裂解）。

图 3第 1 组收获样品中完整与空颗粒比率的可视化（转染后 120 小时收获，无裂解）。

具体实施方式

本发明至少部分地基于以下发现：当在升高的 pH 值诸如 pH 7.4-7.6 下进行培养时，产生重组腺相关病毒颗粒的哺乳动物细胞的产生力可以增加。

定义

除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。

可用于实施本发明的方法和技术描述于：例如 Ausubel, F.M.（编辑），CurrentProtocols in Molecular Biology，第 I 卷至第 III 卷 (1997)；Glover, N.D.和Hames,B.D.编辑，DNA Cloning: A Practical Approach，第 I 卷和第 II 卷 (1985), OxfordUniversity Press；Freshney, R.I.（编辑），Animal Cell Culture – a practicalapproach, IRL Press Limited (1986)；Watson, J.D.等人，Recombinant DNA，第二版，CHSL Press (1992)；Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers(1987)；Celis, J.编辑，Cell Biology，第二版，Academic Press (1998)；Freshney,R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique，第二版，Alan R.Liss, Inc., N.Y.(1987)。这些文献的内容通过引用并入本文。

使用重组 DNA 技术能够生成核酸的衍生物。此类衍生物可例如在一个或几个核苷酸位置处通过取代、改变、交换、缺失或插入来修饰。修饰或衍生化可以例如借助定点诱变来进行。此类修饰可以由本领域技术人员容易地进行（参见例如，Sambrook, J.等人，Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York, USA；Hames, B.D.和Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization –a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England）。

必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞和本领域技术人员已知的其等同物，诸如此类。同样，术语“一个/一种”、“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意的是，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。

术语“约”表示所接的数值的 +/- 20% 的范围。在某些实施例中，术语约表示其后所接的数值的 +/-10% 的范围。在某些实施例中，术语约表示其后所接的数值的 +/-5% 的范围。

本文所使用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“具备”、“可以”，“含有”及其变体旨在是开放式的过渡性短语、术语或词语，并不排除额外行为或结构的可能性。术语“包括”还涵盖术语“包含……”。本公开还考虑了无论是否明确提出地“包括”本文中呈现的实施例或元件、“由其组成”和“基本上由其组成”的其他实施例。

术语“空重组 AAV 颗粒”和“空 rAAV”可以互换使用，表示由腺相关衣壳多肽构成的蛋白壳，其中没有经衣壳化/包装的功能性核酸（rAAV = 重组腺相关病毒颗粒）。即，空rAAV 可以不含经衣壳化的核酸或包含一点不转录或不转录成功能性转录物的核酸或其部分。因此，空 rAAV 不会将编码功能性蛋白质的核酸或被转录成目标功能性转录物的核酸转移到靶细胞中。在所有方面和实施例的某些实施例中，功能性蛋白质或目标功能性转录物具有治疗性效果。

术语“内源性”表示某物是例如在细胞内自然产生的或例如由细胞自然产生的。

术语“外源性”表示某物（例如核苷酸序列）不源自其所存在的同一实体。例如，如果核酸已通过 DNA 递送方法，诸如例如通过转染、电穿孔或转导引入到特定细胞中，则该核酸对于所述细胞是外源性的。同样，如果核酸不是源自相同的 AAV 颗粒或血清型，则该核酸对于 AAV 颗粒是外源性的。因此，外源性核苷酸序列是人工序列，可以呈分离的形式或在细胞或 rAAV 内，其中人工序列可以源自例如不同来源的子序列的组合，例如重组酶识别序列与 SV40 启动子和绿色荧光蛋白编码序列的组合，或来自第一血清型的 AAV ITR与第二血清型的衣壳多肽的组合，或 AAV ITR 与非 AAV 核酸的组合；或源自序列（例如仅编码膜结合受体或 cDNA 的胞外结构域的序列）的部分的缺失；或源自内源性核酸序列中核碱基的突变。这并不排除“外源性”核苷酸序列可以具有碱基组成相同的“内源性”对应物，但该序列通过其与外源性调控元件（诸如外源性分泌信号或启动子）组合而变成“外源性”序列。

术语“完整重组 AAV 颗粒”或“完整 rAAV”可互换使用，表示由腺相关衣壳多肽构成的蛋白壳和其中经衣壳化/包装的功能性核酸序列形成的非共价复合物。即，完整 rAAV包含转录成功能性转录物的核酸。因此，完整 rAAV 的功能是将编码蛋白质的核酸或被转录成目标转录物的核酸转移到靶细胞中。在某些实施例中，功能性核酸包含至少一个插在两个腺相关病毒反向末端重复序列 (ITR) 之间的编码核酸序列。

术语“完整与空颗粒比率”表示样品中或重组 AAV 颗粒制备物 (rAAVp) 中完整重组 AAV 颗粒（完整 rAAV）的数量与重组 AAV 颗粒的总数（完整 rAAV 和空 rAAV 的总和）的数学比率。由于完整 rAAV 的数量至多可以与 rAAV 的总数相同，因此比率至多可以为 1。通常，该比率小于 1，并表示为百分比。通过确定样品或制备物中插在两个 AAV ITR之间的核酸序列的数量来确定完整 rAAV 的数量。这可以通过 PCR，尤其是数字微滴 PCR(ddPCR) 或定量 PCR (qPCR) 来完成。rAAV 的总数是通过确定样品或制备物中腺相关衣壳多肽形成的蛋白壳的数量来确定的。这可以通过 ELISA，尤其是通过衣壳多肽特异性ELISA 来完成。

术语“体外”表示人工环境本身或在此类人工环境中执行的过程或反应。

术语“体内”表示化合物的自然环境（例如，动物或细胞）,或者在其自然环境内执行的过程或反应。

术语“重组 AAV 载体”或“转基因”在本文中可互换使用，表示衍生自腺相关病毒的野生型基因组的核酸，其中除了 ITR（腺相关病毒反向末端重复序列）序列之外，所有内源性 AAV 核酸被一种或多种外源性核酸替换。例如，此类外源性核酸可以是转录成目标转录物的核酸或编码治疗性蛋白质的核酸或治疗性核酸。通常，对于重组 AAV 载体，保留野生型 AAV 基因组的一个或两个 ITR 序列。因此，重组 AAV 载体可以与野生型 AAV 载体区分开，因为病毒基因组的全部或至少一部分已被关于病毒的非天然（即外源性）核酸替换。因此，非天然核酸的掺入将 AAV 载体定义为“重组”载体。必须指出的是，重组 AAV 载体中的 ITR 的血清型不需要与形成包含所述重组 AAV 载体的重组 AAV 颗粒的壳的腺相关衣壳多肽的血清型相同。

原则上，任何非 AAV 核酸都可以包装到由腺相关衣壳多肽构成的壳中，产生“重组 AAV 颗粒”，例如用于随后离体、体外或体内的感染（转导）。

如本文所用，术语“血清型”用于基于形成相应 AAV 颗粒的蛋白壳（衣壳）的多肽的氨基酸序列对不同的野生型和重组 AAV 颗粒进行分类。最初，血清学独特性是基于抗体对一个 AAV 颗粒与对另一个 AAV 颗粒之间相比缺乏交叉反应性所确定。此类交叉反应性差异通常是由于衣壳多肽序列和相应的抗原决定基的差异（例如，由于 AAV 血清型的VP1、VP2 和/或 VP3 序列差异）。虽然包括衣壳变体的 AAV 变体可能在血清学上与参考或野生型 AAV 或其他 AAV 血清型没有差异，但与参考或野生型或其他 AAV 血清型相比，其有至少一个氨基酸残基不同。

在传统定义下，血清型是指已经针对血清测试了目标病毒，该血清对所有现有的和经表征的血清型具有特异性以用于中和活性，并且没有发现中和目标病毒的抗体。随着发现更多天然存在的病毒分离物和/或生成衣壳突变体，与当前存在的血清型中的任一者可能存在或可能不存在血清学差异。因此，在新 AAV 颗粒不具有血清学差异的情况下，该新 AAV 颗粒将为对应野生型血清型的亚组或变体。在许多情况下，尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒执行中和活性的血清学测试，以确定它们是否具有根据血清型的传统定义的另一种血清型。

术语“载体”表示较大核酸（例如重组质粒）的部分，其最终直接或以单链形式或以RNA 形式包装或封装或经衣壳化到由腺相关病毒衣壳多肽构成的蛋白壳中以形成重组AAV 颗粒。在其中重组质粒用于构建或制备重组 AAV 颗粒的情况下，病毒颗粒不包括未对应于该重组质粒的载体部分的“质粒”部分。例如，在 rAAV 的情况下，重组载体包含插在两个 AAV ITR 之间的重组质粒的该部分。重组质粒的非载体部分称为“质粒主链”。质粒主链对于质粒的克隆和扩增非常重要，这是繁殖和重组病毒产生所需的过程，但本身并不包装或封装或经衣壳化到重组 AAV 颗粒中。因此，“载体”是指由腺相关病毒衣壳多肽所构成的蛋白壳包装或封装或衣壳化的核酸，即在 rAAV 中。

用于产生 rAAV 颗粒的一般方法

WO 1999/11764 报导了用于生成重组 AAV 载体的高滴度无辅助制备物的方法。在不同 pH 值下于 1.5 L 规模的低血清培养基中，用 5 型腺病毒 (Ad5) 以 10 的感染复数 (MOI) 感染在生物反应器中悬浮生长的未进一步定义的 AAV 生产细胞。在培养物pH 为 7.2 时，获得 4.7 E+12 个总颗粒；在培养物 pH 为 7.4 时，获得 1.95 E+13 个总颗粒；在培养物 pH 为 7.6 时，获得 1.84 E+13 个总颗粒；并且在培养物 pH 为 8.0 时，获得 1.63 E+13 个总颗粒。培养在 1.5 L 生物反应器中进行，并且因此，可以计算培养体积（标称值的 75%）为约 1.125 L。因此，总颗粒数分别对应于 4.2 E+09 vp/mL (pH 7.2)、1.7 E+10 vp/mL (pH 7.4)、1.6 E+10 vp/mL (pH 7.6) 以及 1.5 E+10 vp/mL (pH 8)。

WO 2000/14205 报导了通过与腺病毒辅助病毒共感染在称为 JL-14 细胞的非限定细胞类型中产生 AAV 颗粒，其中在 pH 值为 7.4 时，AAV 颗粒的数量（细胞内和分泌的AAV 颗粒的总和）最高，在 pH 值为 8 时，AAV 颗粒的感染性最高，并且在 pH 为 7.6 时，AAV 颗粒数量与感染性的比率最高。培养在体积为 1.5 L 的培养基中进行，并且因此，总颗粒数分别对应于 3.0 E+09 vp/mL (pH 7.2)、1.3 E+10 vp/mL (pH 7.4)、1.2 E+10 vp/mL (pH 7.6)、3.3 E+9 vp/mL (pH 7.8) 和 1.1 E+10 vp/mL (pH 8)。基于所提供的感染性资料，可以假设由此产生的 rAAV 颗粒的完整/空颗粒比率低于 1%。

这是基于对从 WO 2000/14205 的图 2B 和图 3B（感染后 3 天）的数据进行的以下计算：

Piras, B.A., 等人 (Mol. Ther. Meth. Clin. Dev.3 (2016) 16015) 比较了转染后第 3、5、6 和 7 天细胞培养基和裂解物中 AAV8 的分布，并且发现病毒产生到第 6天不断增加，培养基中病毒颗粒的比例从第 3 天的 76% 增加到第 7 天的 94%。更大规模的产生表明，培养基和裂解物中完整与空 AAV 颗粒的比率相似，并且转染后第 6 天收获的 AAV 与第 3 天收获的 AAV 相比，在小鼠中提供了相同的功能。当培养从第 3 天（裂解物和培养基中的衣壳总数分别为 1.1 × 1 E+13 ± 9.2 × 1 E+11 和 3.6 × 1 E+13± 2.5 × 1 E+12）到第 5 天（裂解物和培养基中的衣壳总数分别为 6.7 × 1 E+12 ±6.7 × 1 E+11 和 4.5 × 1 E+13 ± 2.6 × 1 E+12）、第 6 天（裂解物和培养基中的衣壳总数分别为 5.0×1 E+12 ± 1.9×1 E+11 和 5.3×1 E+13 ± 3.3×1 E+12）以及第7 天（裂解物和培养基中的衣壳总数分别为 3.0 × 1 E+12 ± 1.3 × 1 E+10 和 5.0× 1 E+13 ± 1.9 × 1 E+12）延长时，AAV-FVIII 表现出产量的增加。Piras 等人采用在Dulbecco 改良 Eagle 培养基中培养的贴壁 HEK293T/17 细胞，该培养基含有补充有 2mmol/l GlutaMAX (Life Technologies, Grand Island, NY) 的 10% 胎牛血清。在以7.26×1 E+04 个细胞/cm² 的密度接种细胞 1 天后，使用 PEIpro(TM) (Polyplus-transfection SA, Illkirch, France) 通过双质粒转染产生 AAV。

Powers, A.D., 等人 (Hum. Gene Ther. Meth. 27 (2016) 112-121) 报导了在iCELLis(R) 固定床生物反应器中通过瞬时转染产生 AAV hFIX 颗粒的开发和优化。获得每平方米固定床的病毒颗粒产率高达 9 E+14 个。接种 HEK293T/17 细胞后第 3 天，在IMDM (Lonza) 或补充有 10% FBS 和 6 mM GlutaMAX(TM) 的 DMEM 中使用聚乙烯亚胺(PEIpro(TM) 转染试剂目录号 115-375；Polyplus)，以质粒 scAAV- LP1-hFIXco-helpv3和质粒 CR21+LTAAV help 2-8 以分别为 3:1 的质粒质量比转染容器。PEI 和 DNA 溶液以 2:1 的比率合并。

Poulain, A., 等人 (j.Biotechnol. 255 (2017) 16-27 报导了使用质粒载体和 cumate 基因开关从稳定的 CHO 细胞池中快速产生蛋白质。使用来自 Polyplus-Transfection (Illkirch，France) 的线性聚乙烯亚胺 (PEIpro(TM)) 转染细胞。转染当天，将细胞以 2 × 1 E+06 个细胞/mL 的密度悬浮在 CD DG44 培养基 (LifeTechnologies Inc., Burlington, ON, Canada) 中，该培养基补充有 4 mM 谷氨酰胺和0.1% Kolliphor® P 188。将细胞悬浮液分布在 6 孔板中（1.8 mL/孔）。DNA:PEIpro(TM)复合物以 1:5 (w:w) 的比率制备，其中每孔总共 2 μg DNA 以在 100 μL 完全培养基中转染。

WO 2017/096039 报导了用于在适合临床使用的无血清悬浮细胞培养系统中产生重组 AAV 载体的可扩展方法。rAAV 载体的产生是使用三重转染在含有 HEK293F 细胞的生物反应器中进行的，细胞密度为 1 E+06 个细胞/mL（1.000.000 个细胞/mL），质粒比率为 1:1:1，并使用基于 PEI 的转染试剂（PEI/DNA 重量比为 2:1，其中 ½ 的 PEI 为游离PEI），温度为 37℃ 并且 pH 值为 7.2。

Nyamay’antu, A., 等人 (Cell Gen. Ther. Ins.4 (2018) 71-79) 报导称，PEI由于其可购性且 DNA 递送效率高，在无血清培养基中生长的贴壁细胞和悬浮细胞两者中得到广泛使用。PEIpro(TM) 适合各种病毒（尤其是 AAV 颗粒）的小规模到大规模产生。在使用 HEK293 或 HEK293T 的搅拌槽生物反应器中，可获得在 0.8-1.5 E+09-E+10 vg/mL范围内的细胞滴度。

Koo, T., 等人 (Nat. Commun. 9 (2018) 1855) 报导称，CRISPR-LbCpf1 可预防年龄相关性黄斑变性小鼠模型中的脉络膜新生血管形成。为了产生 AAV 载体，将它们在AAV9 衣壳中进行假型化。用 pAAV-ITR-LbCpf1-crRNA、编码 AAV2rep 和 AAV9cap 的pAAV2/9 以及辅助质粒转染 HEK293T 细胞 (ATCC，CRL-3216)。在含有 2% FBS 的 DMEM中培养 HEK293T 细胞。使用 PEI 与 PEIpro(TM) 共沉淀（Polyplus 转染）并在 HEK293T细胞中以 1:1:1 的摩尔比以质粒三重转染产生重组假型化 AAV 载体原液。孵育 72 h后，裂解细胞并通过碘克沙醇逐步梯度超速离心纯化颗粒。

来自 AAV2 的 Rep 蛋白通常且几乎专门用于产生来源于血清型 AAV1 至 AAV13的 rAAV（Daya, S., 和 Berns, K.I., Clin. Microbiol. Rev. 21 (2008) 583-593；Zincarelli, C., 等人, Mol. Ther. 16 (2008) 1073-1080）。

WO 2019/094253 报导了用于制备病毒载体的手段和方法及其用途。在 pH 值为7.23 的生物反应器中培养贴壁 HEK293 细胞，并用 PEI/DNA 以按重量计约 1:1 的 PEI-质粒比进行三重转染（质粒比 1:1:1）。

Collaud, F. 等人 (Mol. Ther. Meth. Clin. Dev.12 (2019) 157-174) 报导，对于贴壁 HEK293 细胞，针对（单链）和（自互补）AAV，rAAV8 颗粒的滴度分别为 6.0 ±1.89 E+04 vg/细胞和 1.77 ± 1.37 E+04 vg/细胞。还报导了一种基于对在悬浮液中培养的 HEK293 细胞进行三重转染的完全可扩展的方法。直接在 10 L 生物反应器中用聚乙烯亚胺 (PEIpro(TM), Polyplus) 进行 HEK293 细胞的三重转染。通过温和的去污剂裂解，之后通过 AVB Sepharose 亲和柱纯化，从上清液和细胞两者中回收 AAV 载体。然后浓缩纯化的载体并测试质量和效力。没有提供有关 pH 值和获得的滴度的信息。

Nyamay’antu, A., 等人 (Cell Gen. Ther. Ins.6 (2020) 655-661) 报导称，递送过程的效率对于获得大量生产细胞至关重要。在现有的转染方法中，使用基于 PEI 的转染试剂在基因疗法中占主导地位，因为它结合了贴壁细胞和悬浮细胞的转染的经济性和兼容性。与用于病毒载体制造的黄金标准 PEIpro(TM) 相比，当每种转染试剂在建议条件下使用时，FectoVIR(TM)-AAV 被发现可显著提高 rAAV2-GFP 的悬浮细胞中病毒基因组产生和包装效率两者的 rAAV2 生产率，分别是与 PEIMax(TM) 相比的最多 10 倍以及与PEIpro(TM) 相比的最多 2 倍。更详细地，在建议条件下使用相应的转染试剂转染悬浮HEK293T 细胞。转染后 72 小时收获 rAAV2-GFP。使用 VectoVIR(TM) 获得的滴度在 1 E+04 至 4.5 E+04 vg/细胞的范围内，取决于对应于 1 E+12 vg/mL 的所用复合体积 (1%-10%)。相应的功能滴度为约 2-8 E+08 TU/mL。结果几乎与所使用的培养基无关。

在题为“Optimization of AAV production for high-yielding and scalableGMP processes with Catalent”的博文 (www.polyplus-transfection.com) 中，使用两种血清型 AAV9（1:1 和 2:1）和 AAV2（3:1.5 和 5:2.5）测试了不同的转染试剂与 DNA 的比率。AAV2 载体产率没有受到明显影响，与 PEIpro(TM) 相比，具有 FectoVIR(TM)-AAV的载体基因组滴度增加至 4-5 倍并且病毒颗粒滴度增加至 3-6 倍。这些结果表明，产率的增加可能因 AAV 血清型而异。在一项比较额外的 AAV2 和 AAV5 载体（不同于先前的AAV2 和 AAV5 载体）并使用 DoE 方法进行优化的进一步研究中，进行了不同转染试剂与DNA 比率 (3:2、3:1.5) 和质粒 DNA 摩尔比 (1:1:1、2:1:2、1:2:1) 的实验。与 PEIpro(TM) 相比，观察到含有 FectoVIR(TM)-AAV 的载体基因组滴度中 AAV2 增加至 3-5 倍并且 AAV5 增加至 1.1-1.6 倍。AAV2 的病毒颗粒滴度增加至 3.5-4.5 倍并且 AAV5 的病毒颗粒滴度增加至 2.5-3.75 倍。使用 2:1 和 1.5:1 的试剂与 DNA 比率以及 1:1:1 至2:1:2 至 1:2:1 的质粒比率。用 VectoVIR(TM) 获得的滴度在 4 E+11 至 1 E+12 vg/mL的范围内。

Rossi, A. 和 Peigné, C-M. (Cell Culture Dish Article, 2021 年 5 月 17日) 指出，AAV 产生滴度通常为约 1 E+11 至 1 E+12（以 vg/mL 计）以及 1 E+08 至 1 E+09 TU/mL。

为了正确看待这些数字，重要的是要记住，即使使用相同的产生过程，两种 AAV血清型很可能不会产生相同的产率。

更详细地，AAV 生产率根据血清型和目标基因而变化。通常，为了增加给定 AAV的产率，需要优化直接影响产率的参数：质粒 DNA、转染试剂、细胞和培养基。例如，基于PEI 的转染过程可将 DNA 量减少 10 倍，并可用于转染在存在或不存在血清的情况下生长的细胞。

Wosnitzka, K., 等人 (Cell Gen. Ther. Ins.7 (2021) 1-7) 报导称，物理滴度分析显示，与 PEIpro(TM) 相比，当使用 FectoVIR(TM)-AAV 转染试剂时，每毫升细胞培养物中的病毒颗粒 (VP) 和病毒基因组 (VG) 两者中均增加至 3 倍。

Porte, M., 等人（海报题为“Next-Generation Transfection Reagent forLarge Scale AAV Manufacturing”, Polyplus, Illkirch, France）报导了使用其他基于PEI 的试剂（1.5 μg/百万个细胞，比率 DNA: PEI 为 1 μg: 4 μL）和 FectoVIR(TM)-AAV（1 μg/百万个细胞，比率 DNA:试剂为 1 μg: 1 µL）的最佳条件，遵循每种试剂的建议方案转染悬浮-HEK293T 细胞。使用 FectoVIR(TM) 和基于 PEI 的转染试剂分别获得约 5 E+11 vg/mL 与 1.5 E+11 vg/mL 的滴度，分别具有 20% 与约 13.5% 的包装效率。

重组细胞

通常，为了高效且大规模产生 rAAV，使用表达并且如果可能的话还分泌所述rAAV 的细胞。此种细胞被称为“重组生产细胞”或简称“生产细胞”。

为生成重组生产细胞，用产生所述 rAAV 所需的核酸（包括所需 AAV 辅助功能）转染合适的哺乳动物细胞。

通常，为表达编码序列（即开放阅读框），需额外的调控元件，诸如启动子和多腺苷酸化信号（序列）。因此，对于功能性转录，开放阅读框必须且可操作地连接至所述额外的调控元件。这可通过将这些部分组合到所谓的表达盒中来实现。表达盒在哺乳动物细胞中具有功能而所需的最小调控元件为在所述哺乳动物细胞中具有功能的启动子，其位于开放阅读框的上游（即 5'），以及在该哺乳动物细胞中具有功能的多腺苷酸化信号（序列），其位于开放阅读框的下游（即 3'）。另外，终止子序列可能存在于多腺苷酸化信号（序列） 的 3'端。为了表达，启动子、开放阅读框/编码区和多腺苷酸化信号序列须以可操作地连接的形式排列。

同样地，被转录成非蛋白质编码 RNA 的核酸称为“RNA 基因”。另外，对于 RNA 基因的表达，还需要额外的调控元件，诸如启动子和转录终止信号或多腺苷酸化信号（序列）。此类元件的性质和定位取决于旨在驱动表达 RNA 基因的 RNA 聚合酶。因此，RNA 基因通常也整合到表达盒中。

如果为 rAAV（它由不同的（单体）衣壳多肽以及其中的经衣壳化的单链 DNA 分子构成，且它另外需要其他病毒辅助功能来产生和经衣壳化），则需要许多表达盒，这些表达盒包含的开放阅读框/编码序列是不同的。在此种情况下，对于每个转基因，对于形成 rAAV的衣壳的多肽，至少需要用于所需病毒辅助功能的表达盒。因此，至少对于每个辅助功能E1A、E1B、E2A、E4orf6、rep 和 cap 基因都需要单独的表达盒。HEK293 细胞组成型地表达E1A 和 E1B 辅助功能。

腺相关病毒 (AAV)

对于 AAV 和腺病毒或疱疹病毒辅助功能的一般综述，参见 Berns 和 Bohensky,Advances in Virus Research, Academic Press., 32 (1987) 243-306。Srivastava 等人, J. Virol., 45 (1983) 555-564 中描述了 AAV 的基因组。US 4,797,368 中描述了构建重组 AAV 载体的设计考虑（也参见 WO 93/24641）。描述 AAV 载体的另外的参考文献为 West 等人, Virol. 160 (1987) 38-47；Kotin, Hum. Gene Ther. 5 (1994) 793-801；以及 Muzyczka J. Clin. Invest. 94 (1994) 1351。重组 AAV 载体的构建描述于以下文献：US 5,173,414；Lebkowski 等人, Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 3988-3996；Tratschin 等人, Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 3251-3260；Tratschin 等人, Mol.Cell. Biol., 4 (1994) 2072-2081；Hermonat 和 Muzyczka Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81 (1984) 6466-6470；Samulski 等人 J. Virol. 63 (1989) 3822-3828。

AAV 是一种复制缺陷型细小病毒。它只能在细胞中复制，其中某些病毒功能由共感染的辅助病毒提供，诸如腺病毒、疱疹病毒以及在一些情况下的痘病毒，诸如牛痘。尽管如此，只要存在适当的辅助病毒功能，AAV 几乎可以在人类、猿猴或啮齿动物来源的任何细胞系中复制。

如果不存在辅助病毒基因，则 AAV 在其宿主细胞中建立潜伏期。其基因组整合到19 号染色体中的特定位点 [(Chr) 19 (q13.4)]，称为腺相关病毒整合位点 1 (AAVS1)。对于特定血清型，诸如 AAV2，已发现其他整合位点，诸如例如在 5 号染色体上 [(Chr) 5(p13.3)]，称为 AAVS2，以及在 3 号染色体上 [(Chr) 3 (p24.3)]，称为 AAVS3。

AAV 分为不同的血清型。这些是基于参数诸如血凝、致瘤性和 DNA 序列同源性进行分配的。迄今为止，已鉴定出 12 多个不同的血清型和 100 多个对应于 AAV 不同分支的序列。

衣壳蛋白的类型和对称性决定相应 AAV 的组织向性。例如，AAV2、AAV4 和 AAV5对视网膜具有特异性，AAV2、AAV5、AAV8、AAV9 和 AAV-rh.10 对脑具有特异性，AAV1、AAV2、AAV6、AAV8 和 AAV9 对心脏组织具有特异性，AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 和AAV10 对肝脏具有特异性，AAV1、AAV2、AAV5 和 AAV9 对肺具有特异性。

假型化表示一种包括 AAV 基因组在各种血清型之间交叉包装的方法，即用不同来源的衣壳蛋白包装基因组。

野生型 AAV 基因组具有约 4.7 kb 的大小。AAV 基因组进一步包含两个重叠基因，称为 rep 和 cap，其包含多个开放阅读框（参见，例如，Srivastava 等人, J. Viral.,45 (1983) 555-564；Hermonat 等人, J. Viral.51 (1984) 329-339；Tratschin 等人，J.Virol., 51 (1984) 611-619)。编码 Rep 蛋白的开放阅读框提供了四种不同大小的蛋白质，它们被称为 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40。这些涉及 AAV 的复制、拯救和整合。编码Cap 蛋白的开放阅读框提供四种蛋白质，它们称为 VP1、VP2、VP3 和 AAP。VP1、VP2 和 VP3是 AAV 颗粒的蛋白质衣壳的一部分。组合的 rep 和 cap 开放阅读框在其 5' 端和 3'端处侧接有所谓的反向末端重复序列 (ITR)。为了复制，AAV 除了 Rep 和 Cap 蛋白之外还需要腺病毒的基因 E1A、E1B、E4orf6、E2A 和 VA 的产物或另一种辅助病毒的对应因子。

例如，在血清型 2 (AAV2) 的 AAV 的情况下，ITR 各自具有 145 个核苷酸的长度并且侧接约 4470 个核苷酸的编码序列区。ITR 的 145 个核苷酸中，有 125 个核苷酸具有回文序列并且可形成 T 形发夹结构。该结构在病毒复制期间具有引物的功能。其余20 个非配对核苷酸表示为 D 序列。

野生型 AAV 基因组含有三个转录启动子 P5、P19 和 P40（Laughlin 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 5567-5571）以用于表达 rep 和 cap 基因。

ITR 序列必须以顺式存在于编码区。ITR 提供功能性复制起点 (ori)、整合到靶细胞基因组中所需的信号，以及从宿主细胞染色体或重组质粒的高效切除和拯救。ITR 进一步包含复制起点样元件，诸如 Rep 蛋白结合位点 (RBS) 和末端解析位点 (TRS)。已经发现 ITR 本身可以具有转录启动子的功能（Flotte 等人, J. Biol. Chem. 268 (1993)3781-3790；Flotte 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1993) 10163-10167）。

对于病毒单链 DNA 基因组的分别复制和衣壳化，需要 rep 和 cap 基因产物的反式组织。

rep 基因座包含两个内部启动子，称为 P5 和 P19。其包含四种蛋白质的开放阅读框。启动子 P5 可操作地连接至核酸序列，该核酸序列提供编码 Rep 蛋白 Rep78（阻滞细胞周期的染色质切口酶）的非剪接的 4.2 kb mRNA 和编码 Rep 蛋白 Rep68（位点特异性核酸内切酶）的剪接的 3.9 kb mRNA。启动子 P19 可操作地连接至核酸序列，该核酸序列提供编码 Rep 蛋白 Rep52 的非剪接的 mRNA 和编码 Rep 蛋白 Rep40（用于积累和包装的 DNA 解旋酶）的剪接的 3.3 kb mRNA。

两个较大的 Rep 蛋白 Rep78 和 Rep68 对于 AAV 双链体 DNA 复制至关重要，而较小的 Rep 蛋白 Rep52 和 Rep40 似乎对于后代及单链 DNA 积累至关重要(Chejanovsky & Carter, Virology 173 (1989) 120-128)。

较大的 Rep 蛋白 Rep68 和 Rep78 可特异性地结合至 AAV ITR 的发夹构象。它们表现出确定的酶活性，这是解决 AAV 末端复制所需的。Rep78 或 Rep68 的表达可足以形成感染性颗粒（Holscher, C., 等人 J. Virol. 68 (1994) 7169-7177 和 69 (1995)6880-6885）。

认为所有 Rep 蛋白，主要是 Rep78 和 Rep68，都表现出调控活性，诸如 AAV 基因的诱导和抑制以及对细胞生长的抑制作用（Tratschin 等人, Mol. Cell. Biol. 6(1986) 2884-2894；Labow 等人, Mol. Cell. Biol., 7 (1987) 1320-1325；Khleif 等人, Virology, 181 (1991) 738-741）。

Rep78 的重组过表达产生由诱导 DNA 损伤引起的细胞生长减少的表型。由此，宿主细胞被阻滞在 S 期，从而促进病毒的潜伏感染（Berthet, C. 等人, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 102 (2005) 13634-13639）。

Tratschin 等人报导称，P5 启动子受到 Rep78 或 Rep68 的负自动调控（Tratschin 等人, Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894）。由于 Rep 蛋白表达的毒性作用，据报导，在 AAV 稳定整合后，针对某些细胞系的表达仅非常低（参见例如 Mendelson等人, Virol. 166 (1988) 154-165）。

cap 基因座包含一个启动子，称为 P40。启动子 P40 可操作地连接至提供 2.6kb mRNA 的核酸序列，该核酸序列通过选择性剪接和使用替代起始密码子编码 Cap 蛋白VP1（87 kDa，非剪接的 mRNA 转录物）、VP2（72 kDa，来自剪接的 mRNA 转录物）和 VP3（61kDa，来自替代起始密码子）。VP1 至 VP3 构成病毒衣壳的结构单元。衣壳具有与细胞表面受体结合并允许病毒的细胞内运输的功能。VP3 占病毒颗粒总蛋白的约 90%。然而，所有三种蛋白质对于有效衣壳生产都是必需的。

据报导，所有三种衣壳蛋白 VP1 至 VP3 的失活可防止单链子代 AAV DNA 的积累。VP1 氨基末端的突变（“Lip 阴性”或“Inf 阴性”）仍然允许单链 DNA 组装成病毒颗粒，由此大大降低感染滴度。

AAP 开放阅读框编码组装活化蛋白 (AAP)。它具有约 22 kDa 的大小，并将天然VP 蛋白转运到核仁区进行衣壳组装。该开放阅读框位于 VP3 蛋白编码序列的上游。

在单个 AAV 颗粒中，仅含有一个单链 DNA 分子。这可以是“正”链或“负”链。含有DNA 分子的 AAV 颗粒具有感染性。在经感染的细胞内，亲本感染单链 DNA 被转化为双链DNA，该双链 DNA 随后被扩增。扩增产生大量双链 DNA 分子，由其置换单链并包装到衣壳中。

腺相关病毒 (AAV) 载体可转导分裂细胞和休眠细胞。可以假设，使用 AAV 载体引入至靶细胞的转基因将长期表达。使用 AAV 载体的一个缺点是可引入至细胞的转基因的大小受到限制。

细小病毒颗粒，包括 AAV 血清型及其变体，提供了将编码蛋白质的核酸离体、体外和体内递送至细胞中的工具，使得受感染的细胞表达经编码的蛋白质。AAV 是可用作基因疗法载体的病毒，因为它们可以穿透细胞并引入核酸/遗传物质，使得核酸/遗传物质可以稳定地维持在受感染细胞中。由于 AAV 与人类的致病性疾病无关，因此 AAV 能够将异源多核苷酸序列（例如治疗性蛋白质和药剂）递送至人类患者，而不会引起实质性的 AAV相关发病机制或疾病。

用作进行高效的基因递送的媒介物的 AAV 颗粒具有许多此类应用所需的特征，包括针对分裂和非分裂细胞的向性。关于这些载体的早期临床经验也表明没有持续的毒性，并且免疫应答小或无法检测到。已知 AAV 通过受体介导的内吞作用或通过转胞吞作用在体内和体外感染多种细胞类型。这些载体系统已在人类中靶向视网膜上皮、肝脏、骨骼肌、气道、脑、关节和造血干细胞进行了测试。

重组 AAV 颗粒通常不包含与发病机制相关联的病毒基因。此类颗粒通常包含基因组，其中野生型 AAV 基因（例如 rep 和/或 cap 基因）中的一个或多个已全部或部分缺失，但保留至少一个功能性侧翼 ITR 序列，这是拯救、复制和将重组载体包装成 rAAV 所必需的。因此，AAV 载体包含复制和包装所需的顺式序列（即功能性 ITR 序列）。

重组 AAV 颗粒及其方法和用途可以基于任何野生型 AAV 基因组或血清型或其组合。作为非限制性实例，rAAV 可基于任何野生型 AAV 基因组，即包含相应的 ITR 序列，诸如，例如，AAV1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-2i8、AAV-rh.74、AAV-rh.10 或 AAV-7m8。此类颗粒可以基于相同的株系或血清型（或亚组或变体），或彼此不同。作为非限制性实例，基于一种野生型基因组的 rAAV 可与包装载体的一种或多种衣壳蛋白相同或不同。此外，重组 AAV 载体可基于与包装载体的一种或多种 AAV 衣壳蛋白不同的 AAV（例如 AAV2）野生型血清型基因组。例如，AAV 载体基因组可以基于 AAV2，而三种衣壳蛋白中的至少一者可以为 AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV-rh.74、AAV-rh.10 或 AAV-7m8或其变体。AAV 变体包括 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV-rh.74、AAV-rh.10 和 AAV 7m8 衣壳的变体和嵌合体。

在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV 颗粒衍生自选自由以下项组成的组的野生型 AAV 颗粒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV-rh.74、AAV-rh.10 和 AAV 7m8，及其变体（例如，衣壳变体，诸如氨基酸插入、添加、取代和缺失），例如，如 WO 2013/158879、WO 2015/013313 和 US2013/0059732（公开了 LK01、LK02、LK03 等）中所述。

在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV 包含具有与野生型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV-rh.10、AAV-rh.74 或 AAV-7m8 衣壳序列具有 70% 或更高序列同一性的氨基酸序列的衣壳多肽。

在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV 颗粒包含与野生型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11 或 AAV12 ITR 序列具有 70%或更高序列同一性的一个或两个 ITR 序列。

可将重组 AAV 颗粒掺入药物组合物中。此类药物组合物尤其可用于体内或离体向受试者投予和递送。在某些实施例中，药物组合物含有药用载体或赋形剂。此类赋形剂包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的免疫应答并且可以在没有过度毒性的情况下施用的任何药物制剂。

用于生成腺病毒载体的方案已在 US 5,998,205；US 6,228,646；US 6,093,699；US 6,100,242；WO 94/17810 和 WO 94/23744 中描述，这些参考文献的全部内容通过引用并入本文。

重组腺相关病毒颗粒（rAAV 颗粒）

本领域已知用于产生重组 AAV 颗粒的不同方法。例如，用包含质粒的 AAV 载体和包含 AAV 辅助序列（rep 和 cap）的质粒结合与一种 AAV 辅助病毒（例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒）共感染进行转染，或用包含质粒、AAV 辅助质粒（包含 rep 和 cap）和辅助功能质粒的重组 AAV 载体进行转染。用于生成 rAAV 的非限制性方法描述于例如 US6,001,650、US 6,004,797、WO 2017/096039 和 WO 2018/226887 中。在产生 rAAV（即在细胞培养系统中生成颗粒）后，可从宿主细胞和/或细胞培养上清液中获得 rAAV 并进行纯化。

为生成重组 AAV 颗粒，需在单一哺乳动物细胞中表达 Rep 和 Cap 蛋白、辅助蛋白 E1A、E1B、E2A 和 E4orf6 以及任选的腺病毒 VA RNA。辅助蛋白 E1A、E1B、E2A 和E4orf6 可以使用任何启动子表达，如 Matsushita 等人 (Gene Ther. 5 (1998) 938-945) 所示，尤其是 CMV IE 启动子。因此，任何启动子都可以可操作地连接至所述基因以进行功能性表达。

通常，为产生 rAAV，将不同的互补质粒共转染到宿主细胞中。质粒中的一者包含夹在两个顺式作用 AAV ITR 之间的转基因。子代重组基因组的复制和后续包装所需的缺少的 AAV 组件（即 Rep 和 Cap 蛋白的开放阅读框）以反式包含在第二质粒中。过表达Rep 蛋白造成对细胞生长的抑制作用（Li, J., 等人, J. Virol. 71 (1997) 5236-5243）。另外，rAAV 产生需要包含辅助病毒基因的第三质粒，即来自腺病毒的 E1、E4orf6、E2A 和 VA。

为减少所需质粒的数量，可将 rep、cap 和腺病毒辅助基因组合在单一质粒上。

可替代地，宿主细胞可能已经稳定表达 E1 基因产物。此类细胞是 HEK293 细胞。表示为 293 的人胚胎肾克隆早在 1977 年通过将腺病毒 DNA 整合到人胚胎肾细胞（HEK细胞）中而生成（Graham, F.L., 等人, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74）。HEK293 细胞系包含腺病毒血清型 5 基因组的碱基对 1 至 4344。此包括 E1A 和 E1B 基因以及腺病毒包装信号（Louis, N., 等人, Virology 233 (1997) 423-429）。

当使用 HEK293 细胞时，缺失的 E2A、E4orf6 和 VA 基因可以通过与腺病毒共感染或通过与表达 E2A、E4orf6 和 VA 的质粒共转染来引入（参见，例如，Samulski, R.J.,等人, J. Virol. 63 (1989) 3822-3828；Allen, J.M., 等人, J. Virol. 71 (1997)6816-6822；Tamayose, K., 等人, Hum. Gene Ther. 7 (1996) 507-513；Flotte, T.R.,等人, Gene Ther. 2 (1995) 29-37；Conway, J.E., 等人, J. Virol. 71 (1997) 8780-8789；Chiorini, J.A., 等人, Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1531-1541；Ferrari, F.K.,等人, J. Virol. 70 (1996) 3227-3234；Salvetti, A., 等人, Hum. Gene Ther. 9(1998) 695-706；Xiao, X., 等人, J. Virol. 72 (1998) 2224-2232；Grimm, D., 等人,Hum. Gene Ther. 9 (1998) 2745-2760；Zhang, X., 等人, Hum. Gene Ther. 10 (1999)2527-2537）。可替代地，可以使用腺病毒/AAV 或单纯疱疹病毒/AAV 杂合载体（参见，例如，Conway, J.E., 等人, J. Virol. 71 (1997) 8780-8789；Johnston, K.M., 等人, Hum.Gene Ther. 8 (1997) 359-370；Thrasher, A.J., 等人, Gene Ther. 2 (1995) 481-485；Fisher, J.K., 等人, Hum. Gene Ther. 7 (1996) 2079-2087；Johnston, K.M., 等人, Hum. Gene Ther. 8 (1997) 359-370）。

为了将转基因活性限制在特定组织中，即限制作用位点，可以将转基因可操作地连接至诱导型或组织特异性启动子（参见，例如，Yang, Y. 等人 Hum. Gene.Ther. 6(1995) 1203-1213）。

E1A 和 E1B 的编码序列（开放阅读框）可以衍生自人腺病毒，诸如例如特别是人腺病毒血清型 2 或血清型 5。人 Ad5（腺病毒血清型 5）的示例性序列见于 GenBank 条目X02996、AC_000008，并且示例性人 Ad2 的序列见于 GenBank 条目 AC_000007。核苷酸505 至 3522 包含编码人腺病毒血清型 5 的 E1A 和 E1B 的核酸序列。如 EP 1 230 354中报告的质粒 pSTK146 以及如 WO 2007/056994 中报告的质粒 pGS119 和 pGS122 也可以用作 E1A 和 E1B 开放阅读框的来源。

E1A 是腺病毒 DNA 进入细胞核后表达的第一个病毒辅助基因。E1A 基因编码12S 和 13S 蛋白，它们通过选择性剪接基于相同的 E1A mRNA。12S 和 13S 蛋白的表达引起其他病毒功能 E1B、E2、E3 和 E4 的活化。另外，表达 12S 和 13S 蛋白迫使细胞进入细胞周期的 S 期。如果只表达 E1A 衍生的蛋白质，细胞将会死亡（细胞凋亡）。

E1B 是表达的第二个病毒辅助基因。它由 E1A 衍生的蛋白 12S 和 13S 活化。E1B 基因衍生的 mRNA 可以以两种不同的方式进行剪接，产生第一 55 kDa 转录物和第二19 kDa 转录物。E1B 55 kDa 蛋白参与调节细胞周期、阻止感染后期细胞 mRNA 的转运以及阻止 E1A 诱导的细胞凋亡。E1B 19 kDa 蛋白参与阻止 E1A 诱导的细胞凋亡。

E2 基因编码不同的蛋白质。E2A 转录物编码单链结合蛋白 (SSBP)，这对于 AAV复制至关重要

此外，E4 基因编码多种蛋白质。E4 基因衍生的 34 kDa 蛋白 (E4orf6) 与 E1B55 kDa 蛋白一起防止细胞 mRNA 在细胞质中积累，但也促进病毒 RNA 从细胞核转运到细胞质。

病毒相关 RNA (VA RNA) 为调控翻译的腺病毒 (Ad) 的非编码 RNA。腺病毒基因组包含两个独立的拷贝：VAI (VA RNAI) 和 VAII (VA RNAII)。两者均由 RNA 聚合酶 III转录（参见，例如 Machitani, M. 等人, J. Contr.Rel.154 (2011) 285-289），该 RNA 聚合酶 III 来自 2 型聚合酶 III 启动子。对于重组 AAV 颗粒产生，腺病毒 VA RNA 基因可由任何启动子驱动。

Ma, Y. 和 Mathews, M.B.(J. Virol. 70 (1996) 5083-5099) 使用系统发育方法研究了腺病毒相关 RNA 的结构、功能和进化。他们提供了基于 47 种已知人腺病毒血清型的比对以及共有 VA RNA 序列。所述公开内容通过引用以其整体随此并入本申请中。

VA RNA、VAI 和 VAII 由 157 至 160 个核苷酸 (nt) 组成。

根据血清型，腺病毒含有一个或两个 VA RNA 基因。VA RNAI 被认为发挥着主要的促病毒作用，而 VA RNAII 可以部分补偿 VA RNAI 的缺失（Vachon, V.K. 和 Conn,G.L., Virus Res. 212 (2016) 39-52）。

VA RNA 不是必需的，但通过克服细胞抗病毒机制，在高效病毒生长中发挥重要作用。也就是说，虽然 VA RNA 对于病毒生长不是必需的，但 VA RNA 缺失的腺病毒在载体生成的初始步骤期间无法生长，其中每个细胞仅存在病毒基因组的几个拷贝，可能是因为阻断细胞抗病毒机制的除 VA RNA 之外的病毒基因可能无法充分表达（参见 Maekawa, A.,等人 Nature Sci. Rep.3 (2013) 1136）。

Maekawa, A., 等人 (Nature Sci. Rep.3 (2013) 1136) 报告了缺乏扰乱细胞RNAi 机制的病毒相关 RNA 基因的腺病毒载体的高效产生，其中组成型和高表达翻转酶重组酶的 HEK293 细胞被感染，以通过 FLP 重组酶介导的切除 VA RNA 基因座获得 VA RNA缺失的腺病毒。

人腺病毒 2 VA RNAI 对应于 GenBank 条目 AC_000007 序列的核苷酸 10586-10810。人腺病毒 5 VA RNAI 对应于 GenBank 条目 AC_000008 序列的核苷酸 10579-10820。

重组 AAV 颗粒产生的概述

进入宿主细胞核后，AAV 可以遵循其生命周期的两种不同且可互换的途径之一：裂解途径或溶原途径。前者在感染辅助病毒（诸如 Ad 或单纯疱疹病毒 (HSV)）的细胞中发育，而后者在不存在辅助病毒的情况下在宿主细胞中建立。

当潜伏感染的细胞被辅助病毒过度感染时，AAV 基因表达程序被活化，导致 AAVRep 介导的原病毒 DNA 从宿主细胞染色体的拯救（即切除），之后复制和包装病毒基因组。最后，在辅助病毒诱导的细胞裂解后，新组装的病毒体（颗粒）被释放。因此，AAV 生命周期的裂解期被诱导。

因此，在存在 Ad 辅助功能的情况下，rAAV 载体通过从质粒主链中拯救出来、复制并包装到预形成的 AAV 衣壳中作为单链分子而进行野生型 AAV 裂解过程 (Gonçalves, M.A.F.V., Virol. J., 2 (2005) 43)。

重组 AAV 颗粒的生成涉及用所需的转基因替换大部分 AAV 野生型基因组，并提供在单独的质粒上反式包装病毒所必需的病毒基因。一旦所有组分一起转染到包装细胞系中，重组 AAV 颗粒就会使用细胞的细胞机器被组装。病毒组装和封装的过程需要大约两天，之后细胞被裂解以释放 rAAV 以进一步纯化和浓缩 (https://old.abmgood.com/marketing/knowledge_base/Adeno_Associated_Virus_Production_and_Modification_of_AAV.php)。

尽管在血清型之间观察到了主要差异，但 AAV 并未非常有效地从细胞中释放（参见，例如，Strobel, B., 等人, Lamla T. Comparative Analysis of Cesium Chloride-and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated ViralVectors for Preclinical Applications.Hum. Gene Ther. Methods 26 (2015) 147-157）。收获培养物时，通常会应用细胞破碎方法来回收细胞中截留的载体。

历史上，rAAV 的制造是通过包含 rep 和 cap ORF 的质粒以及侧翼为 ITR 的目标基因的质粒的双转染来进行的。然后，共感染辅助病毒，通常是腺病毒（参见，例如Aponte-Ubillus, J.J., 等人, Appl. Microbiol. Biotechnol. 102 (2018) 1045-1054；Muzyczka, N., Curr. Top.Microbiol. Immunol. 158 (1992) 97-129）。在这种情况下，辅助病毒与最终产物的分离很困难，但却是避免注射到患者体内后诱导炎性反应的关键因素（参见，例如，Schnell, M.A., 等人, Mol. Ther. 3 (2001) 708-722.）。因此，现在 rAAV 的产生转向通过利用三重转染的无腺病毒方法（参见，例如，Large, E.E., 等人,Viruses 13 (2021) 1336）。为此，需要三个组成部分：一种编码 Rep 和 Cap 基因，但没有ITR 的质粒，带有目标转基因，其侧翼为 ITR 的第二种质粒，以及一种提供辅助病毒的辅助基因的辅助质粒（参见，例如，Aponte-Ubillus, J.J., 等人, Appl. Microbiol.Biotechnol. 102 (2018) 1045-1054；Farris, K.D. 和 Pintel, D.J., Hum. GeneTher. 19 (2008) 1421-1427；Grimm, D., 等人, Hum. Gene Ther. 9 (1998) 2745-2760；Ferrari, F.K., 等人, Nat. Med. 3 (1997) 1295-1297）。例如，腺病毒辅助体携带所需的最少腺病毒基因 E2A、E4 和 VA。值得注意的是，人胚胎肾细胞 293 (HEK293) 组成型表达腺病毒基因 E1A/B，这也是产生 rAAV 所必需的。因此，HEK293 细胞是 rAAV 和制造的经典生产细胞。其他细胞类型需要补充 E1A/B。

Carter 等人已经表明，野生型 AAV 基因组中的整个 rep 和 cap 开放阅读框可以缺失并用转基因替换（Carter, B. J., in "Handbook of Parvoviruses", P. Tijssen编辑, CRC Press, 第 155-168 页 (1990)）。此外，据报导，必须维持 ITR 以保留转基因的复制、拯救、包装和整合到靶细胞基因组中的功能。

当包含相应病毒辅助基因的细胞被 AAV 载体转导时，或者反之，当包含整合的AAV 原病毒的细胞被合适的辅助病毒转导时，则 AAV 原病毒被活化并再次进入裂解感染周期（Clark, K.R., 等人, Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341；Samulski, R.J.,Curr. Opin. Genet. Dev.3 (1993) 74-80)。

生产细胞含有 rep 和 cap 基因序列，以及侧翼为在例如经由药物选择所保留的一个或多个质粒上的 ITR 序列的转基因盒。这些细胞系中 rAAV 的产生通常发生在它们经感染所需的辅助功能之后。因此，将细胞用具有复制能力的腺病毒（通常是野生型 Ad5）或包含相应辅助基因的质粒感染，以提供辅助病毒蛋白并且启动 rAAV 产生。包装细胞系不同于生产细胞系，因为其仅含有 rep 和 cap 基因。

更一般而言，用 DNA 转染或转导以用于重组生产 AAV 颗粒的细胞可以称为“重组细胞”。此类细胞可为已被用作编码包装蛋白（诸如 AAV 包装蛋白）的核酸（质粒）、编码辅助蛋白的核酸（质粒）以及编码蛋白质或转录成目标转录物的核酸（质粒）（即放置在两个AAV ITR 之间的转基因）的受体的任何哺乳动物细胞。该术语包括已被转导或转染的原始细胞的后代。应当理解，由于自然、偶然或故意的突变，单个亲本细胞的后代在形态学或基因组或总核酸互补方面可能不一定与原始亲本完全相同。

许多适合维持细胞活力或提供细胞生长和/或增殖的细胞生长培养基是可商业获得的。此类培养基的实例包括无血清真核生长培养基，诸如用于维持哺乳动物（例如人）细胞活力或提供哺乳动物（例如人）细胞生长的培养基。非限制性实例包括 Ham's F12 或F12K 培养基 (Sigma-Aldrich)、FreeStyle (FS) F17 培养基 (Thermo-FisherScientific)、MEM、DMEM、RPMI-1640 (Thermo-Fisher Scientific) 及其混合物。此类培养基可以补充有维生素和/或微量矿物质和/或盐和/或氨基酸，诸如用于哺乳动物（例如，人）细胞的必需氨基酸。

为产生 rAAV，将三种质粒共转染到哺乳动物细胞中。转基因质粒编码在 AAV ITR之间克隆的表达盒，而通过共转染第二包装质粒（rep/cap 质粒）以反式提供 rep 和 cap基因，以确保 AAV 复制和包装。第三质粒，也称为辅助质粒，含有最少的辅助病毒因子（通常为腺病毒 E2A、E4orf6 和 VA 基因），但缺乏 AAV ITR。

本领域已报导用于将 DNA 转移到哺乳动物细胞中的多种方法。这些都可用于根据本发明的方法。在所有方面和实施例的某些实施例中，使用电穿孔、核转染或显微注射进行核酸转移/转染。在所有方面和实施例的某些实施例中，使用无机物质（诸如例如磷酸钙/DNA 共沉淀）、阳离子聚合物（诸如例如聚乙烯亚胺、DEAE-葡聚糖）或阳离子脂质（脂转染）进行核酸转移/转染。磷酸钙和聚乙烯亚胺是用于较大规模核酸转移的转染中最常用的试剂（参见，例如，Baldi 等人, Biotechnol. Lett.29 (2007) 677-684），其中优选聚乙烯亚胺。

在无血清的悬浮培养物中生长并且使用 PEI 作为转染试剂改善转染条件的效率和重现性，允许使用摇瓶、波浪式或搅拌罐生物反应器实时放大 AAV 生产。

该组合物可以进一步包含质粒或/和细胞。此类质粒和细胞可以与游离 PEI 接触。

除 PEI 以外，丙戊酸 (VPA) 可用于改善转染效率。VPA 为分支短链脂肪酸，并且抑制组蛋白脱乙酰酶活性。由于该原因，它通常作为重组蛋白生产的增强剂加入哺乳动物细胞培养物中。

在所有方面和实施例的某些实施例中，编码的 AAV 包装蛋白包括 AAV rep 和/或 AAV cap。在所有方面和实施例的某些实施例中，此类 AAV 包装蛋白包括任何 AAV 血清型的 AAV rep 和/或 AAV cap 蛋白。

在所有方面和实施例的某些实施例中，经编码的辅助蛋白包括腺病毒 E1A 和E1B、腺病毒 E2 和/或 E4、VA RNA 和/或非 AAV 辅助蛋白。

可以使用约 37℃、95% 湿度和 8 体积% CO₂ 的用于培养真核细胞的常用条件进行培养。培养可以在含血清或无血清培养基、贴壁培养物或悬浮培养物中进行。悬浮培养可以在任何发酵容器中进行，诸如例如在搅拌釜反应器、波动反应器、摇摆生物反应器、摇床容器或旋转容器或所谓的滚瓶中进行。转染可以分别以高通量格式和筛选进行，例如以 96或 384 孔格式进行。

根据本发明的方法可包括任何血清型的 AAV 颗粒或其变体。在所有方面和实施例的某些实施例中，重组 AAV 颗粒包含以下项中的任一者：AAV 血清型 1 至 12，AAVVP1、VP2 和/或 VP3 衣壳蛋白，或者经修饰的或变体 AAV VP1、VP2 和/或 VP3 衣壳蛋白，或者野生型 AAV VP1、VP2 和/或 VP3 衣壳蛋白。在所有方面和实施例的某些实施例中，AAV 颗粒包含 AAV 血清型或 AAV 假型，其中 AAV 假型包括不同于 ITR 血清型的 AAV衣壳血清型。

表达控制元件包括组成型或可调节控制元件，诸如组织特异性表达控制元件或启动子。

ITR 可以是 AAV2 或 AAV6 或 AAV8 或 AAV9 血清型中的任一者，或其组合。AAV颗粒可包含与 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11、AAV12、AAV 2i8、AAVrh.10、AAV rh.74 或 AAV 7m8 VP1、VP2 和/或 VP3 衣壳蛋白具有 75% 或更多序列同一性的任何 VP1、VP2 和/或 VP3 衣壳蛋白，或包含选自以下项中的任一者的经修饰或变体VP1、VP2 和/或 VP3 衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV-2i8、AAV-rh.10、AAV-rh.74 和 AAV-7m8 AAV 血清型。

在生产重组病毒（例如，AAV）颗粒后，如果期望，可以使用多种常规方法从宿主细胞中纯化和/或分离病毒（例如，rAAV）颗粒。此类方法包括柱色谱法、CsCl 梯度、碘克沙醇梯度等。

例如，可以使用多个柱纯化步骤，诸如通过阴离子交换柱、亲和柱和/或阳离子交换柱进行纯化。（参见，例如，WO 02/12455 和 US 2003/0207439）。可替代地或另外地，可以使用碘克沙醇或 CsCl 梯度步骤（参见，例如，US 2012/0135515；和 US 2013/0072548）。此外，如果使用感染性病毒来表达包装蛋白和/或辅助蛋白，则可以使用各种方法使残留病毒失活。例如，可经由加热到约 60℃ 的温度例如 20 分钟或更长时间来使腺病毒失活。这种处理有效地使辅助病毒失活，因为 AAV 是热稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的。

rAAV 产生和纯化系统的一个目标是实施策略，以最小化/控制生成产生相关杂质，诸如蛋白质、核酸和载体相关杂质，包括野生型/伪野生型 AAV 物种 (wtAAV) 和 AAV封装的残留 DNA 杂质。

考虑到 rAAV 仅占生物量的一小部分，rAAV 需要纯化至可以用作临床人类基因疗法产品的纯度水平（参见例如 Smith P.H. 等人, Mo.Therapy 7 (2003) 8348；ChadeufG. 等人, Mo.Therapy 12 (2005) 744; 来自 CHMP gene therapy expert groupmeeting 的报告, European Medicines Agency EMEA/CHMP 2005, 183989/2004）。

在根据本发明的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，作为初始步骤，通常收获产生 rAAV 颗粒的培养细胞，任选地将其与收获细胞培养物上清液（培养基）组合，在该细胞培养物上清液（培养基）中已经培养了产生重组 AAV 颗粒的细胞（悬浮细胞或贴壁细胞）。收获的细胞和任选的细胞培养物上清液可以按原样使用，视情况裂解或浓缩。此外，如果利用感染来表达辅助功能，则可以使残留的辅助病毒失活。例如，腺病毒可以通过加热至约 60℃ 的温度持续例如 20 分钟或更长时间来失活，这仅使辅助病毒失活，因为 AAV是热稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的。

可以使用本领域现有的方法，诸如，例如去污剂裂解或冻融循环，裂解收获的培养肉汤中的细胞，以释放 rAAV 颗粒。在细胞裂解期间同时或在细胞裂解之后，添加核酸酶（诸如例如 benzonase）以降解污染的 DNA。通常，对所得裂解物进行澄清以去除细胞碎片，例如通过过滤或离心去除，以得到澄清的细胞裂解物。在特定实例中，用微米直径孔径过滤器（诸如 0.1-10.0 μm 孔径过滤器，例如 0.45 μm 和/或孔径 0.2 μm 过滤器）过滤裂解物，以产生澄清的裂解物。

裂解物（任选澄清的裂解物）含有重组 AAV 颗粒（包括完整和空 rAAV）和产生/过程相关杂质，诸如来自宿主细胞的可溶性细胞组分，其尤其可以包括细胞蛋白、脂质和/或核酸，以及细胞培养基组分。然后将任选澄清的裂解物进行纯化步骤，使用层析从杂质中纯化 rAAV（包含 rAAV 载体）。在第一层析步骤之前，可以用适当的缓冲液稀释或浓缩澄清的裂解物。

在细胞裂解、任选的澄清和任选的稀释或浓缩之后，可使用多个后续和顺序层析步骤来纯化 rAAV。

第一色谱步骤优选地为使用 AAV 亲和色谱配体的亲和色谱步骤。

如果第一色谱法步骤是亲和色谱法，则第二色谱法步骤可以是阴离子交换色谱法。因此，在所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV 纯化经由亲和层析进行，随后经由阴离子交换层析或/和阳离子交换层析或/和体积排阻层析以任何顺序或序列或组合进行纯化。

例如，在下游加工期间，从完整的衣壳中去除空衣壳是基于它们在阴离子交换色谱中的不同等电点 (pI)。所有血清型的平均 pI 计算值对于完整的衣壳为 5.9，并且对于空衣壳为 6.3（Venkatakrishnan, B. 等人, J. Virol. 87 (2013) 4974-4984）。

阳离子交换层析的作用是将 AAV 颗粒与来自亲和层析或尺寸排阻层析的澄清的裂解物和/或柱洗脱液中存在的细胞和其他组分分离。能够在宽 pH 范围内结合 rAAV 的强阳离子交换树脂的实例包括但不限于由磺酸盐官能团的存在指示的任何基于磺酸的树脂，包括芳基和烷基取代的磺酸盐，诸如磺丙基或磺乙基树脂。代表性基质包括但不限于POROS HS、POROS HS 50、POROS XS、POROS SP 和 POROS S（强阳离子交换剂，可获自Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA）。另外的实例包括 Capto S、Capto S ImpAct、Capto S ImpRes（强阳离子交换剂，可获自 GE Healthcare,Marlborough, MA, USA），以及可获自 Aldrich Chemical Company (Milliwaukee, WI,USA) 的商用 DOWEX®、AMBERLITE® 和 AMBERLYST® 系列树脂。弱阳离子交换树脂包括但不限于任何基于羧酸的树脂。示例性的阳离子交换树脂包括羧甲基 (CM) 树脂、磷酸盐树脂（基于磷酸盐官能团）、甲基磺酸盐 (S) 树脂和磺丙基 (SP) 树脂。

阴离子交换层析的作用将 rAAV 与来自亲和或阳离子交换或尺寸排阻层析的澄清的裂解物和/或柱洗脱液中存在的蛋白质、细胞和其他组分分离。阴离子交换层析也可用于减少并由此控制洗脱液中空 rAAV 的量。例如，可用包含适当浓度（例如，约 100-125mM，诸如 110-115 mM）的 NaCl 溶液洗涤其上结合完整和空 rAAV 的阴离子交换柱，并且可在没有显著洗脱完整 rAAV 的流动中洗脱一部分空 rAAV 。随后，可使用包含更高浓度（例如，约 130-300 mM NaCl）的 NaCl 溶液洗脱与阴离子交换柱结合的完整 rAAV，由此产生柱洗脱液，该柱洗脱液具有减少量或耗竭量的空 rAAV 和成比例增加量的包含 rAAV 载体的完整 rAAV。

示例性阴离子交换树脂包括但不限于基于聚胺树脂和其他树脂的那些。强阴离子交换树脂的实例包括通常基于季铵化氮原子的那些，包括但不限于季铵盐树脂，诸如三烷基苄基铵树脂。合适的交换层析材料包括但不限于 MACRO PREP Q（强阴离子交换剂，可获自 BioRad, Hercules, CA, USA）；UNOSPHERE Q（强阴离子交换剂，可获自 BioRad,Hercules, CA, USA）；POROS 50HQ（强阴离子交换剂，可获自 Applied Biosystems,Foster City, CA, USA）；POROS XQ（强阴离子交换剂，可获自 Applied Biosystems,Foster City, CA, USA）；POROS SOD（弱阴离子交换剂，可获自 Applied Biosystems,Foster City, CA, USA）；POROS 50PI（弱阴离子交换剂，可获自 Applied Biosystems,Foster City, CA, USA）；Capto Q、Capto XQ、Capto Q ImpRes 和 SOURCE 30Q（强阴离子交换剂，可获自 GE healthcare, Marlborough, MA, USA）；DEAE SEPHAROSE（弱阴离子交换剂，可获自 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）；Q SEPHAROSE（强阴离子交换剂，可获自 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）。另外的示例性阴离子交换树脂包括氨基乙基 (AE)、二乙基氨基乙基 (DEAE)、二乙基氨基丙基 (DEPE) 和季氨基乙基 (QAE)。

纯化旨在作为治疗人类疾病的产品的重组 AAV 颗粒的商业制造过程应实现以下目标：1) 一致的颗粒纯度、效力和安全性；2) 制造过程可扩展性；以及 3) 可接受的制造成本。

WO 2019/006390 报告了重组 AAV 颗粒纯化的示例性过程。

确定含有转基因的 rAAV 颗粒的感染滴度的方法是本领域已知的（参见例如Zhen 等人, Hum. Gene Ther. 15 (2004) 709）。用于测定具有包装转基因的空 rAAV 和完整 rAAV 的方法是已知的（参见，例如 Grimm 等人, Gene Therapy 6 (1999) 1322-1330；Sommer 等人, Malec.Ther. 7 (2003) 122-128）。

为了确定降解/变性衣壳的存在或量，可以使经纯化的 rAAV 经历 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，该电泳由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶（例如梯度凝胶）组成，然后运行凝胶直到样品分离，并将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜上。然后将抗 AAV 衣壳抗体作为与变性衣壳蛋白结合的一抗（参见，例如，Wobus 等人, J. Viral.74 (2000) 9281-9293）。结合一抗的二抗含有用于检测一抗的工具。半定量检测一抗与二抗之间的结合以确定衣壳的量。另一种方法是使用 SEC 柱的分析型 HPLC 或分析型超速离心机。

本发明的具体实施方案的描述

本发明至少部分地基于以下发现：当在升高的 pH 值诸如 pH 7.4-7.6 下进行培养时，产生重组腺相关病毒颗粒的哺乳动物细胞的产生力可以增加。

尽管转染参数、DNA/试剂比、转染时的 VCD 和复合时间的优化可以提高 rAAV 生产力，但此种提高远远被根据本发明的 pH 值所具有的效果所超越。

下文中，每个表中的参考值，即基值，由标识符“(100%)”表示。

已发现，对于在 HEK293 细胞中瞬时产生 rAAV 颗粒，将培养 pH 值从通常使用的 pH 7.2 增加到 pH 值 7.4 或者甚至 7.6 会增加颗粒产率以及基因组产率。由于基因组产率的增加高于滴度产率的增加，完整与空颗粒比率也得到改善。

例如，对于使用悬浮生长的 HEK293 细胞在无血清培养基中瞬时产生 rAAV2 颗粒而言，将培养 pH 值从通常使用的 pH 7.2 增加到 pH 值 7.4 或者甚至 7.6 会使颗粒产率增加至 3 倍以上并使基因组产率增加至 10 倍以上。

下表提供了适于在无血清培养基中悬浮生长的 HEK293 细胞的示例性数据，显示了根据本发明的方法的效果（也参见图 1、图 2 和图 3）。可以看出，如果培养 pH 值从 pH7.2 增加到 pH 7.4 或 pH 7.6，则基因组滴度 (vg/mL) 增加至 10 倍以上。同时，衣壳滴度 (vp/mL) 增加至 2 至 3 倍。因此，当衣壳滴度的增加低于基因组滴度的增加时，完整与空颗粒比率增加至 4 倍以上。

对于 pH 7.2、pH 7.4 和 pH 7.6，产率与培养时间无关，而在 pH 值为 7.0 时，产率随着培养时间的增加而降低。这在下表中示出。因此，与 pH 7 或 pH 7.2 相比，在 pH值为 7.4 和 7.6 时，该过程更加稳健，且产率更高。

pH 值从 pH 7.2 变化到 pH 7.4 或 pH 7.6 的效果远远超过通过优化方法条件（诸如例如改变转染试剂或添加补料）所获得的滴度增加，如下表所示。第三数据行显示了通过培养 pH 值、转染试剂和补料添加的伴随变化引起的滴度增加。

为了直接比较，在优化的转染试剂条件下培养 pH 值的变化以及添加补料所引起的滴度增加如下表所示。

通过优化培养条件，在 pH 值为 7.2 时培养变得不太稳健。然而，在 pH 值为7.4 时，该过程仍保持其稳健性。即，通过将 pH 值从 pH 7.2 增加到 pH 7.4，可以抵消由于反应条件的优化而导致的方法稳健性的损失。这在下表中示出。

例如，对于在如上所述的优化条件下使用市售 HEK 293 Expi 细胞在无血清培养基中瞬时产生 rAAV2 颗粒而言，颗粒产率可进一步增加至约 1.7 倍，并且基因组产率可进一步增加至约 1.8 倍，即增加 80%。该数据显示于下表中。

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提供实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。

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实例

材料

细胞系

使用可商购获得的 HEK293 细胞，用于使用用三种质粒进行的瞬时转染来生产AAV 颗粒。

培养材料

根据供货商的操作说明使用培养基和补充剂。培养基和补料在 4℃ 下避光储存，并且根据制造商的说明进行消耗。校正剂储存于室温下（葡萄糖溶液；碳酸钠溶液；消泡剂溶液）。

实例 1

HEK293 细胞的培养和重组 AAV 制备物的产生

一般而言，培养方法改编自标准方案（参见，例如，Lindl, T., "Zell- undGewebekultur: Einführung in die Grundlagen sowie ausgewählte Methoden undAnwendungen", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, 2002）以及相应的供应商的操作说明。

预培养

将 HEK 细胞解冻，并且在摇瓶中在 37℃、85% 湿度、5% pCO2 和 120 rpm 振摇频率下在培养基中增殖二至三周。细胞每三至四天发生分裂，并且在培养基中扩增至生产培养的接种所需的体积。

生产培养

为了产生重组 AAV 颗粒，在指定条件下以分批或补料分批方法在相应的反应器中培养相应的预培养 HEK293 细胞。

第 1 组 – rAAV 颗粒制备物，其颗粒包含衍生自 AAV2 血清型的衣壳变体和治疗性转基因：

反应器：Ambr250

细胞系：适应无血清培养基的悬浮 HEK293

培养基：HEK ViP NB + 8 mM 谷氨酰胺 + 胰岛素

补料：无（分批）

温度 37℃

速度：约 450 rpm

接种后培养时间：144 小时

转染：瞬时；三种质粒；比率约 1:2.5:2（转基因:rep/cap:辅助）

转染：接种后约 24 小时

转染试剂：PEIpro(TM)

转染试剂:DNA 比率：约 2:1

DNA 浓度：约 3 µg/mL

转染 VCD：约 30 E+05 个细胞/mL

转染：转染混合于1/3 新鲜培养基中

裂解：无

第 2 组 - rAAV 颗粒制备物，其颗粒包含衍生自 AAV2 血清型的衣壳变体和治疗性转基因：

反应器：Ambr250

细胞系：适应无血清培养基的悬浮 HEK293

培养基：HEK ViP NB + 8 mM 谷氨酰胺 + 胰岛素

补料：无（分批）

温度 37℃

速度：约 450 rpm

接种后培养时间：120 小时

转染：瞬时；三种质粒；比率约 1:2.5:2（转基因:rep/cap:辅助）

转染：接种后约 24 小时

转染试剂：PEIpro(TM)

转染试剂:DNA 比率：约 2:1

DNA 浓度：约 3 µg/mL

转染 VCD：约 30 E+05 个细胞/mL

转染：转染混合于1/3新鲜培养基中

裂解：无

第 3 组和第 4 组 - DoE：

rAAV 颗粒制备物：1) 其颗粒包含衍生自 AAV2 血清型的衣壳变体和治疗性转基因；2) 其颗粒包含 AAV2 野生型衣壳和绿色荧光蛋白 (GFP) 转基因：

反应器：Ambr15

细胞系：1) 适应无血清培养基的悬浮 HEK293；2) HEK293 Expi

培养基：HEK ViP NB + 8 mM 谷氨酰胺 + 胰岛素

补料：1) 无（分批）；2) 转染后的培养基和葡萄糖补料

温度 37℃

速度：约 450 rpm

接种后培养时间：120 小时

转染：瞬时；三种质粒；比率 1) 约 1:2.5:2 或 2) 约 1:1:1（转基因:rep/cap:辅助）

转染：接种后 24 小时

转染试剂：1) PEI + 游离 PEI + 丙戊酸；2) FectoVIR(TM)-AAV

转染试剂:DNA 比率：1) 约 2.5:1；2) 约 1.5:1

DNA 浓度：1) 约 3 µg/mL；2) 约 2 µg/mL

转染 VCD：约 30 E+05 个细胞/mL

转染：转染混合于 1/3新鲜培养基中

裂解：1) 不是；2) 是

实例 2

裂解

如果该过程中报假裂解，则如下进行：为了将 AAV 颗粒释放到细胞培养肉汤中，将 5% (v/v) 裂解缓冲液 (10% Triton CG 110, 40 mM MgCl₂) 加入至培养肉汤中。另外，加入 100 U/ml BenzonaseTM 核酸酶 (Merck)。然后将细胞培养肉汤在 37℃ 在搅拌下孵育约一小时，无需通气和 pH 控制。进行相应孵育后，加入 5 M NaCl 溶液并将裂解物无菌过滤。

实例 3

AAV 颗粒纯化

对于亲和色谱步骤，在 Äkta Avant 25 色谱系统上使用包含获自 ThermoFisher 的 10.5 mL AAVX 树脂的柱。该系统以约 300 cm/h 的流速运行。用缓冲液 A (1xPBS, pH 7.4, 0.001% Pluronic F-68) 平衡后，将 200 mL 裂解培养肉汤施加至柱，之后分别用平衡缓冲液和 0.5 M NaCl (pH 6.0) 进行 2 次洗涤步骤。将 AAV 颗粒用 0.1 M柠檬酸钠溶液 (pH 2.4) 洗脱。通过加入 2 M Tris (pH 10)，将洗脱物的 pH 调节至 pH7.5。

实例 4

分析方法

用于总滴度确定的酶联免疫吸附测定 (ELISA)

对于 AAV 衣壳滴度确定，根据制造商的说明使用获自 PROGEN 的试剂盒（目录号PRAAV8）。

简而言之，该测定为一种使用重组 AAV 衣壳特异性抗体和生物素标记的检测抗体作为捕获抗体的夹心 ELISA。

将预包被的多滴度板 (MTP) 的孔分别与 100 µL 标准品、样品或对照品在 4℃孵育过夜。第二天，将孔用如试剂盒中提供的 ASSB 缓冲液 (1x) 洗涤三次。此后，每孔加入 100 µL 包含生物素化检测抗体（根据制造商的说明稀释）的溶液，并且在室温在振摇下孵育两小时。然后，将孔用如试剂盒中提供的 ASSB 缓冲液 (1x) 洗涤三次。在下一步骤中，将 100 µl 包含缀合至链霉抗生物素蛋白的辣根过氧化物酶的溶液加入每个孔中，并且在室温在振摇下孵育 30 分钟。然后，将孔用如试剂盒中提供的 ASSB 缓冲液 (1x) 洗涤三次。对于显色反应，将 100 µL 根据制造商的说明制备的包含 ABTS 的溶液加入每个孔中，并且在振摇下孵育。使用 MTP-ELISA-Reader Versa Max (Molecular Devices) 在405 nm 处（参考波长为 490 nm）判定颜色强度，直至空白与具有最高浓度的标准品之间的消光差异达到约 1.5。

每个样品、标准品和对照品均重复测量两次。

基于通过 4 参数拟合（例如根据 WiemerRodbard 算法）所确定的标准曲线，使用标准品的平均值来计算衣壳的量（衣壳/mL）。

用于基因组滴度确定的数字微滴聚合酶链式反应 (ddPCR)

用于酶促样品处理的试剂：

1) DNA 酶 I 缓冲液 (NEB)：100 mM Tris-HCl，pH 7.6，25 mM MgSO₄，5 mM CaCl₂

2) DNA 酶 I (NEB)：0.2 U/µL

3) 蛋白酶 K（NEB；大约 20 mg/mL = 800 U/mL）：16 U/mL

4) 蛋白酶 K 缓冲液 (BioRad)：400 mM Tris-HCl，20 mM EDTA，2000 mM NaCl，1% SDS，pH 8

5) 十二烷基硫酸钠 (SDS) 溶液：10% (w/v)

酶促样品处理：

- 混合 30 µL H2O、5 µL DNA 酶 I 缓冲液、5 µL DNA 酶 I、10 µL 样品

- 在 37℃ 孵育 30 分钟

- 加热至 75℃ 持续 15 分钟，以获得经孵育的 DNA 酶 I-混合物

- 短暂冷却并且离心

- 将 42 µL H2O + 2 µL 蛋白酶 K + 5 µL 蛋白酶 K 缓冲液 + 1 µL 10% SDS溶液混合，并且加入经孵育的 DNA 酶 I-混合物

- 在 50℃ 孵育 60 分钟

- 加热至 95℃ 持续 15 分钟

- 冷却至 4℃

ddPCR：

对于病毒基因组滴定，进行了双重 ddPCR 测定。针对所用的 CMV 启动子并且针对 polyA/3'UTR 序列设计引物和探针。根据下表（微滴式数字 PCR 指南 - Bio-Rad）制备PCR 主混物。

将制备的主混物移入 96 孔板中，每孔 16.5 µL。然后，对预处理样品进行系列稀释：使用 LoRentention Tips 将 10 µL 样品转移到 LoBind 管中的 90 µL 水中，并且诶充分混合。此后，通过几个稀释步骤将 5.5 µL 样品加入 96 孔板中的主混物溶液中。将板在 180℃ 密封，以 2,200 rpm 涡旋 1 分钟并以 1,000 rpm 再离心 1 分钟。使用自动液滴发生器装置从每个孔中取出 20 µL PCR 混合物，每孔生产多达 20,000 个液滴，并且转移到另一个 96 孔板中。在 180℃ 密封液滴板后，进行 PCR 运行。相应的条件显示于下表中。

在微滴分析仪中，测量每个微滴的荧光信号。QuantaSoft 软件处理读数仪数据并计算每 20 µL 孔靶序列的拷贝数。初始样品滴度可用以下公式确定：

Claims (14)

1.一种用于产生重组腺相关病毒颗粒制备物 (rAAVp) 的方法，所述方法包括以下步骤：培养 HEK293 细胞，并由此产生所述 rAAVp，所述 HEK293 细胞包含针对以下各项的表达盒：插在两个 AAV 反向末端重复序列 (ITR) 之间的非腺相关病毒基因；腺相关病毒rep 基因；腺相关病毒 cap 基因；腺相关病毒 E1A 基因；腺相关病毒 E1B 基因；腺相关病毒 E2A 基因；腺相关病毒 E4orf6；以及任选的腺相关病毒 VA RNA 基因，

其中所述培养是在 pH 7.4 至 pH 7.6 的范围内且包括端值的 pH 值下进行。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其中通过在 pH 7.4 至 pH 7.6 的范围内且包括端值的 pH 值下进行的所述培养产生的所述 rAAVp 的产率高于通过在 pH 7.0 至 pH 7.2的范围内且包括端值的 pH 值下进行的培养产生的 rAAVp 的产率。

3.根据权利要求 1 至 2 中任一项所述的方法，其中通过在 pH 7.4 至 pH 7.6 的范围内且包括端值的 pH 值下进行的所述培养产生的所述 rAAVp 比通过在 pH 7.0 至 pH7.2 的范围内且包括端值的 pH 值下进行的培养产生的 rAAVp 具有更高的完整颗粒百分比。

4.根据权利要求 1 至 3 中任一项所述的方法，其中所述 rAAVp 为治疗性 rAAVp。

5.根据权利要求 1 至 4 中任一项所述的方法，其中所述 rAAVp 包含重组腺相关病毒颗粒 (rAAV)，所述 rAAV 包含至少一个插在两个腺相关病毒反向末端重复序列之间的编码核酸序列。

6.根据权利要求 1 至 5 中任一项所述的方法，其中所述 rAAV 具有血清型 AAV2 或其变体。

7.根据权利要求 1 至 6 中任一项所述的方法，其中所述培养包括对生物反应器进行接种以及收获所述 rAAVp。

8.根据权利要求 1 至 7 中任一项所述的方法，其中在对所述生物反应器进行所述接种之后，将针对插在两个 AAV ITR 之间的所述非腺相关病毒基因、针对所述腺相关病毒rep 基因、针对所述腺相关病毒 cap 基因、针对所述腺相关病毒 E2A 基因、针对所述腺相关病毒 E4orf6 和任选的针对所述腺相关病毒 VA RNA 基因的所述表达盒中的一者或多者或全部引入至哺乳动物细胞中。

9.根据权利要求 1 至 8 中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在培养步骤之后的从细胞和/或培养基分离所述 rAAV 以及任选地纯化所述 rAAV 的步骤。

10.根据权利要求 9 所述的方法，其中所述纯化通过一系列层析步骤进行，其中首先是亲和层析，之后是阴离子交换层析或阳离子交换层析，以及任选的尺寸排阻层析。

11.一种药物组合物，其包含通过根据权利要求 1 至 10 中任一项所述的方法获得的rAAVp。

12.一种药物组合物，其包含：通过根据权利要求 1 至 10 中任一项所述的方法获得的 rAAVp，以及药用赋形剂。

13.根据权利要求 1 至 10 中任一项所述的方法用于增加重组产生的 rAAVp 的产率的用途。

14.根据权利要求 1 至 10 中任一项所述的方法用于增加 rAAVp 中的完整颗粒百分比的用途。