TW202444900A - 具有增加的酮還原酶活性的突變型酮還原酶以及涉及其的方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及在位置 241 處具有至少一個突變的突變型酮還原酶、編碼該突變型酮還原酶之核酸、包含該核酸之載體、用該突變型酮還原酶來酶催化還原酮且形成手性醇之方法、該突變型酮還原酶用於還原酮且形成手性醇之用途以及該方法用於製備醫藥活性絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶抑制劑之用途。
Description
本發明涉及在位置 241 處具有至少一個突變之突變型酮還原酶、編碼該突變型酮還原酶之核酸、包含該核酸之載體，用該突變型酮還原酶來酶催化還原酮及形成手性醇之方法、以及該突變型酮還原酶用於製備醫藥活性絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶抑制劑之用途。
酮還原酶係屬於氧化還原酶組之酶的子類，即催化氧化還原反應以允許電子自所謂的電子供體分子轉移至電子受體分子的酶。
酮還原酶之子類具有催化所需酮向其對應二級醇的不對稱還原之特殊能力。在此還原反應期間，藉由將氫化物加成到酮基之羰基原子，電子轉移至酮基 (C=O)。此外，質子被轉移至羰基之氧。此反應通常需要氫化物供體作為輔因子，諸如 NADH 或 NADPH，其可原位再生並質子化酮還原酶之活性位點中之胺基酸殘基。
到目前為止，酮還原酶亦通常用於前手性酮化合物的酶促還原，且因此用於製備各種醫藥化合物的中間體，諸如例如用於製備下式之絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶抑制劑
如例如在 PCT 國際申請案 WO 2008/006040 A1 中所說明。蛋白激酶抑制劑可用於例如治療過度增生性疾病，諸如哺乳動物的癌症及發炎。
一種特別有前景的絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶抑制劑為臨床 AKT 抑制劑候選藥物帕他色替 (ipatasertib) (CAS 編號1001264-89-6)，其具有式 X。
本發明的目的係設計相對於野生型酮還原酶，尤其是
鮭色鎖擲酵母的酮還原酶，尤其是 SEQ ID NO: 1 的酮還原酶，具有增加的酮還原酶活性的改良突變型酮還原酶。此等突變體可用於生產手性醇，諸如式 I 的手性醇，包括其在規模擴大過程中的生產。
令人驚訝地，已發現包含與 SEQ ID NO: 1 (來自
鮭色鎖擲酵母的酮還原酶；在 UniProt 中被稱為 Q9UUN9) 之胺基酸序列為至少 80% 相同之胺基酸序列的突變型酮還原酶，並且相對於 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列具有至少一個胺基酸取代，其中在對應於 SEQ ID NO: 1 的位置 241 之位置處之胺基酸被取代，相對於野生型酮還原酶，特別地
鮭色鎖擲酵母的酮還原酶，尤其是 SEQ ID NO: 1 的酮還原酶，顯示出增加之酮還原酶活性。
如實施例中所示，在 SEQ ID NO: 1 (在 UniProt 中被稱為 Q9UUN9) 中定義之來自
鮭色鎖擲酵母之野生型酮還原酶之位置 241 處引入之取代向突變體賦予相對於野生型酶增加之活性。如表 1 所示，用 Met、Asn、Arg、Trp、Ile 或 Lys 取代位置 241 處之亮胺酸增加了酮還原酶活性。此外，當與其他位點處，即位置 97、174、238、242 及/或 245 (見表 2) 或特別是 97、241 及 245 (見表 4) 處之取代組合時，進一步取代特別是用 Ala、Cys、Tyr、Val、Gln、Phe、His、Gly、Asp、Ser 及 Thr 取代的情況下，可證明活性之增加。在位置 242 及 245 處之取代被證明與進一步增加酶活性特別相關 (見表 4 至 7)，藉由用 Trp 取代位置 97 處之 Phe 可進一步增加酶活性 (見表 8 及 9)。本發明人鑑定了可進一步有助於增加酮還原酶活性之其他取代，即位置 134、174、224、228、234、238、246、316 及/或 342 處之彼等取代 (見表 10 至 20)。可以證實，在不同之時間點、溫度及共受質濃度下，存在增加之酶活性 (見表 22 至 24)。野生型酶之高非鏡像選擇性在不同規模及具有不同回收系統之突變體中得以保持 (見表 25 至 27)。證實了不同真菌物種之酮還原酶之還原酶效能及非鏡像選擇性 (見表 21)。
此外，已經發現此種酮還原酶對催化酮之酶促還原及手性醇之形成具有高活性。
此外，已經發現，相較於野生型酮還原酶，本發明之突變型酮還原酶在酮之酶促還原中顯示出增加之轉化。
特別地，已經發現利用本發明之突變型酮還原酶來酶催化還原下式 I 之酮
其中 R
1為 C
1-4-烷基且 R
2為氫或 C
1-4-烷基，特別是甲基或乙基，尤其是甲基
形成下式 II 之手性醇
其中 R
1及 R
2如上所述，具有高鏡像異構物或非鏡像異構物超越。因此，根據本發明之酮還原酶對於製備手性醇關鍵中間體非常有用，特別是對於製備下式之絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶抑制劑中之關鍵中間體非常有用
如例如在 PCT 國際申請案 WO 2008/006040 A1 中所說明。
因此，在第一態樣中，本發明涉及一種相對於野生型酮還原酶具有增加的酮還原酶活性的突變型酮還原酶，
其中該突變型酮還原酶包含與 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列 (來自
鮭色鎖擲酵母之酮還原酶；UniProt ID：Q9UUN9) 至少 80% 相同之胺基酸序列；且
其中突變型酮還原酶相對於 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列具有至少一個胺基酸取代，其中在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經取代。
本文所使用的術語「酮還原酶」意指能夠不對稱地催化酮還原成對應之手性、非外消旋二級醇之任何蛋白質，特別是二級醇之純鏡像異構物及非鏡像異構物。
本文所使用的術語「酮」具有前手性酮官能基之受質，其可包含另外的手性中心。
本文所使用的術語 C
1-4-烷基意指針對 R
1取代基，1 至 4 個碳原子之單價直鏈或支鏈飽和烴基，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、或三級丁基，較佳為三級丁基。
本文所使用的術語 C
1-4-烷基意指針對 R
2取代基，1 至 4 個碳原子之一價直鏈飽和烴基，諸如甲基、乙基、正丙基、或正丁基，較佳為甲基。
本文使用的術語「野生型酮還原酶」意指自然界中本身存在的任何酮還原酶。本文使用的術語「突變型酮還原酶」意指任何酮還原酶，其源自對應的野生型酮還原酶並且與此類野生型酮還原酶相比其胺基酸序列已被修飾。例如，此可包括在一個或多個位置處一個或多個胺基酸的引入、缺失、取代或翻譯後突變。較佳地，突變型酮還原酶就胺基酸取代而言不同於野生型酮還原酶。在胺基酸序列中產生突變，諸如胺基酸取代的方法係熟習此項技術者眾所習知的。例如，此種突變可能已經在核酸水平上被引入，導致所需突變胺基酸序列的表現。因此，合適的方法是熟習此項技術者眾所習知的，並且在下文中例如在根據本發明第二態樣的核酸的上下文中部分地描述。
根據第一態樣的合適的突變型酮還原酶可源自任何生物體的野生型酮還原酶。已經發現，使用來自生物體之野生型酮還原酶具有已證實之活性，該生物體為諸如
樹幹畢赤酵母、葡萄牙棒孢酵母、季也蒙畢赤酵母、華盛頓腥擲孢菌、南極枝孢菌、長孢洛德酵母、富氏酸酵母菌、或皺波褶尾菌。特別較佳的是
鮭色鎖擲酵母酮還原酶，在 UniProt 中被稱為 Q9UUN9。
本申請案還揭示了除
鮭色鎖擲酵母之外之生物體之野生型酮還原酶之突變體，其中針對
鮭色鎖擲酵母鑑定之及/或在本申請案中定義之突變中之任一者或其組合可被引入其他生物體之對應位置處。該生物體可以是例如
樹幹畢赤酵母、葡萄牙棒孢酵母、季也蒙畢赤酵母、華盛頓腥擲孢菌、南極枝孢菌、長孢洛德酵母、富氏酸酵母菌、或皺波褶尾菌。對應的位置可藉由例如熟練從業者已知之序列比對及同源區之鑑定來鑑定。來自不同真菌物種之酮還原酶相較於來自
鮭色鎖擲酵母之野生型酮還原酶 (SEQ ID NO: 1；UniProt ID：Q9UUN9) 之還原酶效能及非鏡像選擇性示於表 21 中。
根據本發明，突變型酮還原酶為酮還原酶活性的。此意味著突變型酮還原酶能夠在合適的條件下將前手性酮轉化為對應的二級醇，如上文及下文所詳述。用於確定酮還原酶活性的方法描述於本文中，並在實例中給出。
相對於野生型酮還原酶，根據第一態樣的突變型酮還原酶顯示出增加的酮還原酶活性。
活性可以在酶測定中確定，測量隨時間推移受質的消耗或產物的產生。存在測量受質及產物濃度的許多不同方法，並且許多酶可用熟習此項技術者已知的若干種不同反式進行測定。
確定根據本發明的突變型酮還原酶或野生型酮還原酶的酶活性的方法是熟習此項技術者眾所習知的。示例性方法亦在實例中描述。為了確定根據第一態樣的突變型酮還原酶相對於野生型酮還原酶是否顯示出增加的酮還原酶活性，使用相同的方法測量兩種酮還原酶的酮還原酶活性。
例如，確定酮還原酶的酶活性的方法通常可基於螢光或比色測定。此外，確定酮還原酶的酶催化活性的方法通常可包括檢測形成的產物、消耗的受質的濃度，或檢測反應所需的形成或消耗的輔因子，諸如 NAD
+、NADH、NADP
+或 NADPH 的濃度。
例如，相對於野生型酮還原酶，根據第一態樣的顯示酮還原酶活性增加的突變型酮還原酶顯示出酮還原酶活性增加超多於一倍。熟習此項技術者已知統計程序來評估酶活性的一個值相對於另一個值是否增加，諸如學生 t-檢驗或卡方檢驗。對熟習此項技術者而言，顯而易見的是在分析資料時必需減去任何背景訊號。
此外，根據本發明第一態樣的突變型酮還原酶包含與 SEQ ID NO: 1 (
鮭色鎖擲酵母酮還原酶，在 UniProt 中被稱為 Q9UUN9) 的胺基酸序列至少 80% 相同的胺基酸序列。因此，SEQ ID NO: 1 的胺基酸序列來源於
鮭色鎖擲酵母酮還原酶，其在 UniProtKB 中被稱為 Q9UUN9。
本文使用的術語「序列同一性」描述兩個不同序列之間完全匹配的字符的百分比。
例如，本文使用的術語「與 SEQ ID NO: 1 的胺基酸序列至少 80% 相同」意指本發明的突變型酮還原酶的胺基酸序列具有的胺基酸序列的特徵在於，在 100 個胺基酸的一段內，至少 80 個胺基酸殘基與 SEQ ID NO: 1 的對應序列的序列相同。
突變型酮還原酶亦可包含與 SEQ ID NO: 1 (
鮭色鎖擲酵母酮還原酶，在 UniProt 中被稱為 Q9UUN9) 的胺基酸序列至少 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列。
根據本發明的序列同一性可以例如藉由序列比較形式的序列比對方法來確定。序列比對的方法是熟習此項技術者眾所習知的，且包括各種程式及比對演算法。此外，NCBI 基本局部比對搜索工具 (BLAST) 可自若干來源獲得，包括國家生物技術信息中心 (NCBI，Bethesda，MD) 及網際網路，用於與序列分析程式 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx 連接。根據本發明的突變體相對於例如 SEQ ID NO: 1 的胺基酸序列的同一性百分比通常使用具有標准設置的 NCBI Blast blastp 來表徵。替代地，可以使用具有標准設置的軟體 GENEious 來確定序列同一性。比對結果可以例如自軟體 CLC Main Workbench (21 版本)，使用具有自由端隙的全域比對方案作為比對類型且使用 Blosum62 作為成本矩陣來得到。
根據本發明的突變型酮還原酶相對於 SEQ ID NO: 1 的胺基酸序列具有至少一個胺基酸取代。此外，相對於 SEQ ID NO: 1 的胺基酸序列，根據本發明的突變型酮還原酶可以具有至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸取代。
尤其是，根據本發明之突變型酮還原酶相對於 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列具有至少一個胺基酸取代，其中在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 之位置處之胺基酸被取代。
用於製備根據本發明第一態樣的突變型酮還原酶的方法是熟習此項技術者眾所習知的。例如，根據第一態樣的突變型酮還原酶可以藉由使用熟習此項技術者已知的適於製備重組酶的任何方法來製備，諸如在細胞培養物中重組表現突變型酮還原酶的經修飾的核酸，然後進行蛋白質分離及純化。
較佳地，在第一態樣之突變型酮還原酶中，其中在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 之位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)、經 Asn 取代 (Asn241)、經 Arg 取代 (Arg241)、經 Trp 取代 (Trp241)、經 Ile 取代 (Ile241)、經 Lys 取代 (Lys241)、經 His 取代 (His241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Gly 取代 (Gly241)、經 Asp 取代 (Asp241)、經 Ser 取代 (Ser241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Ala 取代 (Ala241)、經 Val 取代 (Val241)、或經 Phe 取代 (Phe241)。
較佳地，在第一態樣之突變型酮還原酶中，在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 之位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Ser 取代 (Ser241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Val 取代 (Val241)、或經 Ala 取代 (Ala241)，更佳地經 Met 取代 (Met241)。
若根據第一態樣的突變型酮還原酶相對於 SEQ ID NO: 1 的胺基酸序列具有多於一個胺基酸取代，諸如相對於 SEQ ID NO: 1 的胺基酸序列具有兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸取代，則本發明的第一態樣的突變型酮還原酶的胺基酸序列除了在 SEQ ID NO: 1 的位置 241 處的取代之外，較佳地還包括在對應於位置 242 及/或 245 的位置處的取代。
因此，在第一態樣之突變型酮還原酶之較佳實施例中，具有至少在以下位置處之取代：
- 241 及 242；或
- 241 及 245；或
- 241、242 及 245。
在第一態樣之突變型酮還原酶之一更佳實施例中，至少具有以下取代：
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)、經 Asn 取代 (Asn241)、經 Arg 取代 (Arg241)、經 Trp 取代 (Trp241)、經 Ile 取代 (Ile241)、經 Lys 取代 (Lys241)、經 His 取代 (His241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Gly 取代 (Gly241)、經 Asp 取代 (Asp241)、經 Ser 取代 (Ser 241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Ala 取代 (Ala241)、經 Val 取代 (Val241) 或經 Phe 取代 (Phe241)，較佳經 Met 取代 (Met241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Ser 取代 (Ser 241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Val 取代 (Val241) 或經 Ala 取代 (Ala241)，更佳經 Met 取代 (Met241)；且/或
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 242 的位置處之胺基酸經 Trp 取代 (Trp242)、經 Phe 取代 (Phe242)、經 Ile 取代 (Ile242)、經 Tyr 取代 (Tyr242)；經 Cys 取代 (Cys242)；經 Val 取代 (Val242)、經 Leu 取代 (Leu242)、經 Pro 取代 (Pro242)、經 Ala 取代 (Ala242)、經 Gln 取代 (Gln242)、或經 Ser 取代 (Ser242)，較佳地經 Trp 取代 (Trp242)、經 Phe 取代 (Phe242)、經 Ile 取代 (Ile242)、或經 Tyr 取代 (Tyr242)，更佳地經 Trp 取代 (Trp242) 或經 Ile 取代 (Ile242)，最佳地經 Trp 取代 (Trp242)；且/或
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 245 的位置處之胺基酸經 Ser 取代 (Ser245)、經 Thr 取代 (Thr245)、經 Asn 取代 (Asn245)、經 Met 取代 (Met245)、經 Asp 取代 (Asp245)、經 Trp 取代 (Trp245)、經 Phe 取代 (Phe245)、經 Glu 取代 (Glu245)、經 Cys 取代 (Cys245) 或經 His 取代 (His245)，較佳地經 Ser 取代 (Ser245)、經 Thr 取代 (Thr245) 或經 Asn 取代 (Asn245)，更佳地經 Ser 取代 (Ser245) 或經 Thr 取代 (Thr245)，最佳地經 Ser 取代 (Ser245)。
更佳地，本發明的突變型酮還原酶的特徵在於
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)；且
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 242 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp242)；且
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 245 的位置處之胺基酸係經 Ser 取代 (Ser245)。
替代地或另外，若根據第一態樣的突變型酮還原酶相對於 SEQ ID NO: 1 的胺基酸序列具有多於一個胺基酸取代，諸如相對於 SEQ ID NO: 1 的胺基酸序列具有三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸取代，則本發明的第一態樣的突變型酮還原酶的胺基酸序列除了在 SEQ ID NO: 1 的位置 241 處的取代之外，較佳地還包括在對應於位置 97、134、135、174、224、228、234、238、242、245、246、316 及/或 342，特別是位置 97、134、224、238、242 及/或 245 的位置處的取代。
因此，在第一態樣的突變型酮還原酶的較佳實施例中
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 97 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp97)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 134 的位置處之胺基酸經 Val 取代 (Val 134)、經 Cys 取代 (Cys 134)、經 Ala 取代 (Ala 134)、經 Gln 取代 (Gln134)、或經 Met 取代 (Met134)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 135 的位置處之胺基酸係經 Cys 取代 (Cys135) 或經 Thr 取代 (Thr135)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 174 的位置處之胺基酸經 Thr 取代 (Thr174)、經 Val 取代 (Val 174)、經 Met 取代 (Met174)、經 Tyr 取代 (Tyr174)、經 Ala 取代 (Ala174)、經 Ile 取代 (Ile174)、經 Lys 取代 (Ly174)、經 Arg 取代 (Arg174)、經 Asn 取代 (Asn174)、經 Ser 取代 (Ser174)、或經 Gln 取代 (Gln174)，較佳地經 Ala 取代 (Ala174)、經 Val 取代 (Val174)、或經 Ile 取代 (Ile174)、或未經取代，且/或
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 224 的位置處之胺基酸係經 Ala 取代 (Ala224)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 228 的位置處之胺基酸係經 Lys 取代 (Lys228)、經 Gln 取代 (Gln228) 或經 Arg 取代 (Arg228)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 234 的位置處之胺基酸係經 Asp 取代 (Asp234)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 238 的位置處之胺基酸係經 Lys 取代 (Lys238)、經 Arg 取代 (Arg238)、經 Leu 取代 (Leu238)、經 Gly 取代 (Gly238)、經 His 取代 (His238)、經 Asn 取代 (Asn238)、經 Trp 取代 (Trp238)、經 Asp 取代 (Asp238)、經 Thr 取代 (Thr238)、經 Ser 取代 (Ser238)、經 Gln 取代 (Gln238)、或經 Tyr 取代 (Tyr238)，較佳地經 Lys 取代 (Lys238)、經 Arg 取代 (Arg238)、經 Leu 取代 (Leu238)、或經 Gly 取代 (Gly238)，更佳地經 Lys 取代 (Lys238) 或經 Arg 取代 (Arg238)，最佳地經 Lys 取代 (Lys238)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸經 Met 取代 (Met241)、經 Asn 取代 (Asn241)、經 Arg 取代 (Arg241)、經 Trp 取代 (Trp241)、經 Ile 取代 (Ile241)、經 Lys 取代 (Lys241)、經 His 取代 (His241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Gly 取代 (241Gly)、經 Asp 取代 (Asp241)、經 Ser 取代 (Ser 241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Ala 取代 (Ala241)、經 Val 取代 (Val241)、或經 Phe 取代 (Phe241)，較佳地經 Met 取代 (Met241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Ser 取代 (Ser 241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Val 取代 (Val241)、或經 Ala 取代 (Ala241)，更佳地經 Met 取代 (Met241)，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 242 的位置處之胺基酸經 Trp 取代 (Trp242)、經 Phe 取代 (Phe242)、經 Ile 取代 (Ile242)、經 Tyr 取代 (Tyr242)；經 Cys 取代 (Cys242)；經 Val 取代 (242Val)、經 Leu 取代 (Leu242)、經 Pro 取代 (Pro242)、經 Ala 取代 (Ala242)、經 Gln 取代 (Gln242)、或經 Ser 取代 (Ser242)，較佳地經 Trp 取代 (Trp242)、經 Phe 取代 (Phe242)、經 Ile 取代 (Ile242)、或經 Tyr 取代 (Tyr242)，更佳地經 Trp 取代 (Trp242) 或經 Ile 取代 (Ile242)，最佳地經 Trp 取代 (Trp242)，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 245 的位置處之胺基酸經 Ser 取代 (Ser245)、經 Thr 取代 (Thr245)、經 Asn 取代 (Asn245)、經 Met 取代 (Met245)、經 Asp 取代 (Asp245)、經 Trp 取代 (Trp245)、經 Phe 取代 (Phe245)、經 Cys 取代 (Cys245) 或經 His 取代 (His245)，較佳地經 Ser 取代 (Ser245)、經 Thr 取代 (Thr245) 或經 Asn 取代 (Asn245)，更佳地經 Ser 取代 (Ser245) 或經 Thr 取代 (Thr245)，最佳地經 Ser 取代 (Ser245)，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 246 的位置處之胺基酸係經 Gly 取代 (Gly246)、經 Lys 取代 (Lys246)，較佳地經 Gly 取代 (Gly246)，或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 316 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met316)、或未經取代，且/或
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 342 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met342)、或未經取代。
在第一態樣的突變型酮還原酶的進一步較佳實施例中
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 97 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp97)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 134 的位置處之胺基酸係經 Val 取代 (Val134)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 224 的位置處之胺基酸係經 Ala 取代 (Ala 224)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 238 的位置處之胺基酸係經 Lys 取代 (Lys238)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 242 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp242)，且/或
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 245 的位置處之胺基酸係經 Ser 取代 (Ser245)。
在第一態樣的突變型酮還原酶的再更佳實施例中
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 242 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp242)，且
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 245 的位置處之胺基酸係經 Ser 取代 (Ser245)，且
視情況其中
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 97 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp97)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 134 的位置處之胺基酸係經 Val 取代 (Val134)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 224 的位置處之胺基酸係經 Ala 取代 (Ala 224)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 238 的位置處之胺基酸係經 Lys 取代 (Lys238)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 246 的位置處之胺基酸係經 Gly 取代 (Gly246)、或未經取代，
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 316 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met316)、或未經取代，且/或
- 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 342 的位置處之胺基酸係經 met 取代 (Met342)、或未經取代。
尤佳的突變型酮還原酶至少由以下突變來定義：
- 突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Met241、Trp242 及 Ser245；或
- 突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Met241、Trp242、Ser245、Met316 及 Met342；或
- 突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Lys238、Met241、Trp242、Ser245、Met316 及 Met342；或
- 突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Lys238、Met241、Trp242、Ser245、Gly246、Met316 及 Met342；或
- 突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Ala224、Lys238、Met241、Trp242、Ser245、Gly246、Met316 及 Met342；或
- 突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Val134、Ala224、Lys238、Met241、Trp242、Ser245、Gly246、Met316 及 Met342；或
- 突變型酮還原酶具有突變 Lys238、Met241、Trp242、Ser245；或
- 該突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Lys238、Met241、Trp242、Ser245。
可能存在進一步的突變，視情況如上文或下文所定義。
根據本發明第一態樣的突變型酮還原酶可進一步包含與 SEQ ID NO: 2 至 9 的胺基酸序列至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%、特別是 100% 相同的胺基酸序列。序列同一性及用於確定兩種蛋白質的胺基酸序列的序列同一性的方法係熟習此項技術者眾所習知的，並且在上文中亦有描述。
在第一態樣的突變型酮還原酶的另一較佳實施例中，突變型酮還原酶由以下組成或包含以下：與 SEQ ID NO: 2 至 9 中任一個的胺基酸序列至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%、特別是 100% 相同的胺基酸序列。
在第一態樣的突變型酮還原酶的較佳實施例中，酮還原酶活性相對於野生型酮還原酶增加了至少 1.01、2.0、5.0、10 或甚至 50 倍。用於確定蛋白質的酮還原酶活性的方法以及用於比較兩種或更多種蛋白質的酮還原酶活性的方法習熟習此項技術者眾所習知的，並且亦在上文中有所描述。
根據本發明第一態樣之突變型酮還原酶相對於野生型酮還原酶，在更高之受質負荷下，諸如 2 至 10% [w/w] 受質，以及在 1 至 2% [w/w] (s/e 5 – 10) 的突變型或野生型酮還原酶負荷下使用 2-丙醇作為輔因子回收系統以及在 0.1 – 0.2% [w/w] (s/e 50 – 100) 的負荷下使用葡萄糖/葡萄糖脫氫酶回收系統，可進一步具有增加之轉化。
本文所用的術語「轉化」意指由酮還原酶，諸如本發明的突變型酮還原酶或野生型酮還原酶誘導的任何受質向產物的轉化。此種轉化可進一步取決於各種反應參數，諸如溫度、壓力或所用受質或酮還原酶的量。合適的條件及方法描述於實例中。
較佳地，使用 2-丙醇作為輔因子回收系統，在 10% [w/w] 受質負荷及 2% [w/w] (s/e 5) 的突變型或野生型酮還原酶負荷下確定酮還原酶的轉化。在本文中，縮寫「s/e」係指「受質對酶」比率。s/e 5 意指每 1 g 酶使用 5 g 受質，即受質及酶以 5/1 的比率使用。
在第一態樣之突變型酮還原酶之另一較佳實施例中，使用 2-丙醇作為輔因子回收系統，突變型酮還原酶相對於野生型酮還原酶在 2 至 10% [w/w] 受質及1 至 2% [w/w] (s/e 5 – 10) 之突變型或野生型酮還原酶負荷下具有增加之轉化，特別是相較於野生型酮還原酶為至少 1.05、1.10、1.20、1.30、1.40、1.50、1.75、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或 10 倍的增加之轉化。可以應用替代性輔因子回收系統，諸如葡萄糖及葡萄糖脫氫酶。
在第一態樣之突變型酮還原酶之較佳實施例中，突變型酮還原酶能夠將酮不對稱還原成對應之手性、非外消旋二級醇，特別是二級醇之純鏡像異構物及非鏡像異構物。
在進一步較佳的實施例中，酮具有式 I
並且手性醇具有式 II
其中 R
1為 C
1-4-烷基且 R
2為氫或 C
1-4-烷基。
螺旋鍵
「
」
代表「
」或「
」，從而表明分子的手性。
在更佳的實施例中，R
1為三級丁基且 R
2為甲基。
突變型酮還原酶原則上可不對稱地催化手性醇，特別是式 II 的手性醇的 S-組態及 R-組態兩種組態的形成。
在一個較佳的實施例中，突變型酮還原酶催化式 IIa 的手性醇的 R-非鏡像異構物的形成
其中 R
1及 R
2如上所述，更佳地催化式 IIb 的手性醇的形成
手性醇的 R,R-非鏡像異構物的非鏡像異構物超越量可以達到至少 95%、96%、97%、98%、或 99%。
此外，根據本發明的第一態樣的突變型酮還原酶亦可與另外的肽或蛋白質組合成融合蛋白。因此，本發明進一步涉及包含本發明的突變型酮還原酶的融合蛋白。
融合蛋白可以進一步包含標籤。出於各種目的將標籤附接到蛋白質，例如為了便於純化、幫助蛋白質的正確折疊、防止蛋白質沉澱、改變色譜特性、修飾蛋白質或標記或標示蛋白質。通常使用高純度的酶會減少所需酶負荷。目前已知存在許多 (親和) 標籤或 (親和) 標記物。常用的標籤包括 Arg 標籤、His 標籤、Strep 標籤、Flag 標籤、T7 標籤、S 標籤、HAT 標籤、GST 標籤及 MBP 標籤。
在第二態樣中，本發明涉及編碼根據本發明的第一態樣的突變型酮還原酶的核酸。因此，本發明亦可涉及編碼包含根據本發明的第一態樣的突變型酮還原酶的融合蛋白的核酸。
本文使用的術語「核酸」通常指編碼本發明的突變型酮還原酶的任何核苷酸分子，並且可以具有可變長度。本發明的核酸的實例包括但不限於質體、載體或任何種類的 DNA 及/或 RNA 片段，它們可以藉由標準分子生物學方法分離，包括例如離子交換層析。本發明的核酸可用於特定細胞或生物體的轉染或轉導。
本發明的核酸分子可為 RNA 形式，例如 mRNA 或 cRNA，或者為 DNA 形式，包括例如 cDNA 及基因組 DNA，例如藉由選殖獲得或藉由化學合成技術或藉由其組合產生。DNA 可為三股、雙股或單股的。單鏈 DNA 可為編碼股，亦稱為有義股，或者可為非編碼股，亦稱為反義股。本文所用的核酸分子亦指單股及雙股 DNA、為單鏈及雙股 RNA 的混合物的 DNA 以及為單股及雙股區域的混合物的 RNA、包含 DNA 及 RNA 的雜交分子等等，所述雜交分子可為單股的，或者更典型地是為雙股的，或者為三股的，或者為單股及雙股區域的混合物。另外，如本文所用之核酸分子係指包含 RNA 或 DNA 或者 RNA 和 DNA 兩者之三股區。
另外，核酸可含有一種或多種經修飾的鹼基。此類核酸亦可含有修飾，例如在磷酸核糖主鏈中，以增加此類分子在生理環境中的穩定性及半衰期。因此，由於穩定性或其他原因，主鏈被修飾的 DNA 或 RNA 係「核酸分子」，如該特徵在本文中所指。此外，僅舉兩個實例，包含異常鹼基諸如肌苷或經修飾的鹼基諸如三苯甲基化鹼基的 DNA 或 RNA 係在本發明上下文中的核酸分子。應當理解，已經對 DNA 及 RNA 進行了各種各樣的修飾，其用於熟習此項技術者已知的許多有用的目的。本文使用的術語「核酸分子」包括核酸分子的此種化學、酶或代謝修飾形式，以及病毒及細胞 (尤其包括簡單及複雜細胞) 特有的 DNA 及 RNA 化學形式。
此外，編碼本發明的突變型酮還原酶的核酸分子可使用標準技術諸如標準選殖技術連接至任何所需序列諸如調控序列、前導序列、異源標記物序列或異源編碼序列功能性，以產生融合蛋白。
本發明的核酸最初可在體外或培養的細胞中形成，通常藉由核酸內切酶及/或核酸外切酶及/或聚合酶及/或連接酶及/或重組酶或熟習此項技術者已知的產生核酸的其他方法來操縱核酸。
本發明的核酸可包含於表現載體中，其中核酸可操作地連接至能夠促進核酸在宿主細胞中表現的啟動子序列。
在編碼第一態樣的突變型酮還原酶的核酸的較佳實施例中，其中突變型酮還原酶由以下組成或包含以下：與 SEQ ID NO: 2 至 9 中之任一者之胺基酸序列至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%、特定而言 100% 相同的胺基酸序列。
在第三態樣中，本發明涉及包含根據本發明的第二態樣的核酸的載體。因此，本發明亦可涉及包含編碼包含根據本發明的第一態樣的突變型酮還原酶的融合蛋白的核酸的載體。
如本文所用，術語「載體」通常指可用於表現細胞中的感興趣蛋白質的任何種類的核酸分子 (亦參見上文關於本發明核酸的細節)。特別地，本發明的載體可為熟習此項技術者已知的任何質體或載體，其適於表現特定宿主細胞中的蛋白質，所述宿主細胞包括但不限於哺乳動物細胞、細菌細胞及酵母細胞。本發明的載體亦可為編碼本發明的突變型酮還原酶且用於隨後選殖至相應載體中以確保表現的核酸。用於蛋白質表現的質體及載體係此項技術中眾所習知的，並且可商購自不同的供應商，包括例如 Promega (美國威斯康星州麥迪遜)、Qiagen (德國希爾登)、Invitrogen (美國加利福尼亞州卡爾斯巴德) 或 MoBiTec (德國)。蛋白質表現的方法是熟習此項技術者眾所習知的，例如在 Sambrook 等人，2000, Molecular Cloning: A laboratory manual, Third Edition。
載體另外可包括允許其在宿主細胞中複製的核酸序列，諸如複製起點、一個或多個治療基因及/或選擇性標記物基因以及此項技術中已知的其他遺傳因子，諸如指導編碼蛋白的轉錄、翻譯及/或分泌的調控因子。載體可用於轉導、轉化或感染細胞，從而使細胞表現除細胞天然核酸及/或蛋白質之外的核酸及/或蛋白質。載體視情況包括有助於達成核酸進入細胞的材料，諸如病毒顆粒、脂質體、蛋白質塗層等。藉由標準分子生物學技術，在此項技術中已知多種類型的合適表現載體用於蛋白質表現。此類載體選自習用載體類型，包括昆蟲，例如杆狀病毒表現，或酵母、真菌、細菌或病毒表現系統。其中許多類型係此項技術中已知的其他合適的載體亦可用於此目的。用於獲得此類載體的方法係眾所習知的 (參見，例如 Sambrook 等人，見上文)。
如上所述，編碼本發明的突變型酮還原酶的核酸可操作地連接至適於驅動宿主細胞中蛋白質的表現的序列，以確保蛋白質的表現。然而，在本發明內囊括要求保護的載體可代表中間產物，其隨後被選殖至合適的載體中以確保蛋白質的表現。本發明的載體可進一步包含所有種類的核酸序列，包括但不限於聚腺苷酸化訊號、剪接供體及剪接受體訊號、插入序列、轉錄增強子序列、翻譯增強子序列、藥物抗性基因等。視情況，藥物抗性基因可以可操作地連接至內部核糖體進入位點 (IRES)，其可為細胞週期特異性的或細胞週期非依賴性的。
本文所用的術語「可操作地連接」通常意指基因要素如此排列，使得它們針對其預期目的而協同發揮功能，例如轉錄藉由啟動子啟動，並藉由編碼本發明的突變型酮還原酶的 DNA 序列來進行。亦即，RNA 聚合酶將編碼突變型酮還原酶的序列轉錄成 mRNA，然後其被剪接並翻譯成蛋白質。
本發明上下文中使用的術語「啟動子序列」通常指可操作地連接至下游編碼序列的任何種類的調控 DNA 序列，其中該啟動子能夠結合 RNA 聚合酶並起始細胞中編碼的開讀框的轉錄，從而驅動該下游編碼序列的表現。本發明的啟動子序列可為熟習此項技術者已知的任何類型的啟動子序列，包括但不限於組成型啟動子、誘導型啟動子、細胞週期特異性啟動子及細胞類型特異性啟動子。
此外，本發明亦包括包含本發明的突變型酮還原酶或其融合蛋白、本發明的第二態樣的核酸或本發明的第三態樣的載體的宿主細胞。
本發明的「宿主細胞」可為適合在重組 DNA 技術總施用的任何種類的生物體，包括但不限於適合表現一種或多種重組蛋白的所有種類的細菌及酵母菌株。宿主細胞的實例包括，例如，各種枯草芽孢桿菌或
大腸桿菌菌株。多種
大腸桿菌細菌宿主細胞係熟習此項技術者已知的，包括但不限於諸如 DH5-α、HB101、MV1190、JM109、JM101、或 XL-1 藍等菌株，此些菌株可商購自不同的供應商，包括例如 Stratagene (美國加州)、Promega (美國威尼斯康州)、或 Qiagen (德國希爾登)。實例中還描述了特別合適的宿主細胞，即
大腸桿菌BL21 (DE3) 細胞。可用作宿主細胞的枯草芽孢桿菌菌株包括例如 1012 野生型：leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1 及 168 Marburg：trpC2 (Trp-)，它們可商購自 MoBiTec (德國)。
根據本發明的宿主細胞的培養係熟習此項技術者已知的常規程序。亦即，可將編碼本發明的突變型酮還原酶的核酸引入合適的宿主細胞中，以藉由重組方式產生相應的蛋白質。該等宿主細胞可為任何種類的合適細胞，較佳地細菌細胞諸如
大腸桿菌，其可以在培養物中培養。在第一步中，該方法可包括將相應的基因選殖至合適的載體中，諸如根據本發明的第二態樣的載體。載體廣泛用於基因選殖，並且可容易地引入，即轉染至已經使 DNA 瞬時滲透的細菌細胞中。蛋白質在相應的宿主細胞中表現後，可以收穫細胞並用作用於製備含有感興趣蛋白質的細胞提取物的起始材料。藉由裂解細胞獲得含有感興趣蛋白質的細胞提取物。藉由化學或機械細胞裂解製備細胞提取物的方法係熟習此項技術者眾所習知的，並且包括但不限於，例如低滲鹽處理、勻漿或超聲處理。
在第四態樣中，本發明涉及用於在本發明的突變型酮還原酶存在下酶催化還原酮及形成手性醇的方法。
在進一步較佳的實施例中，式 I 的酮
被還原，且式 II 的手性醇
或者，更佳地式 IIa 的手性醇
其中 R
1為 C
1-4-烷基且 R
2為氫或 C
1-4-烷基，被形成。
甚至更佳地，式 IIb 的手性醇
藉由不對稱地還原式 Ib 的酮而形成
。
較佳地，所得式 IIb 的手性醇為 (R, R)-非鏡像異構物。
突變型酮還原酶的酶催化還原通常在 NADH 或 NADPH 作為輔因子的存在下發生。更佳地，使用 NADP
+，且其還原形式 NADPH 原位再生。
氧化之輔因子通常用二級醇作為最終還原劑連續再生，即所謂共受質或原位輔因子回收系統，即葡萄糖脫氫酶及葡萄糖作為最終還原劑，此為本發明領域中具有通常知識者所公知的。
典型的共受質可選自 2-丙醇、2-丁醇、戊-1,4-二醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇、己-1,5-二醇、2-庚醇、或 2-辛醇，較佳地 2-丙醇。在進一步較佳的實施例中，當 2-丙醇用作共受質時形成的丙酮可自反應混合物中連續除去。
輔因子負荷，即受質 (酮) 與輔因子的比率 (s/c) 可以在 10 至 250 之間變化，較佳在 50 至 200 之間，最佳為 100。
在本發明的一個具體實施例中，酶催化還原在共受質存在下，即較佳在 2-丙醇存在下，在水性緩衝介質中進行。共受質的濃度通常在 5% [v/v] 至 20% [v/v] 的範圍內，較佳為 8% [v/v]。
在本發明的一個具體實施例中，酶催化還原在葡萄糖及葡萄糖脫氫酶的存在下，在水性緩衝介質中進行。葡萄糖的濃度通常在 0.2 M 至 2 M 的範圍內，分別相對於目標酮至少 1.1 當量。為了中和所形成的葡萄糖酸，需要添加鹼來持續調節至目標 pH 值。
合適的緩衝劑可選自酸性至中性緩衝劑，諸如 2-嗎啉-4-乙磺酸、乙酸銨、乙酸鹽、磷酸鹽、1,4-哌嗪二甲烷磺酸，其允許將反應的 pH 保持在 pH 6 與 pH 10 之間，特別是在 6.8 至 7.2 之間，更特別地在約 7.0 至 7.2 之間的範圍內。
受質負荷，即酮的負荷量可以在 1％ 與 20％ [w/w] 之間選擇，較佳為 10％ [w/w]，並且受質與酶的比率 (s/e) 取決於所應用之輔因子回收系統，分別為最終還原劑。在 2-丙醇作為最終還原劑的情況下，受質與酶的比率 (s/e) 可以在 4 與 50 之間，較佳在 4 與 10 之間選擇。在葡萄糖作為最終還原劑的情況下，受質與酶的比率 (s/e) 可以在 10 與 200 之間，較佳在 50 與 100 之間選擇。
反應溫度通常保持在 10℃ 與 50℃ 之間、較佳在 20℃ 與 35℃ 之間、更佳在 23℃ 與 30℃ 之間範圍內。
反應終止後，所得手性醇可以藉由萃取或較佳藉由過濾進行習用處理。
由根據本發明之酶促合成中形成之手性醇合成帕他色替可遵循 WO2008006040A1 第 42 頁之合成方案 3 及應用所屬技術領域中之普通技術之對應實例。
在第五態樣中，本發明涉及本發明之方法 (在突變型酮還原酶的存在下酮之酶促還原及手性醇之形成) 用於製備下式之絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶抑制劑之用途
如例如在 PCT 國際申請案 WO 2008/006040 A1 中所說明。
特別地，A、R
1、R
2、R
5、及 R
10可以如 PCT 國際申請案 WO 2008/006040 A1 的請求項 1 中所定義：
R
1可為 H、甲基、乙基、乙烯基、CF
3、CHF
2、或 CH
2F；
R
2可為 H 或甲基；
R
5可為 H、甲基、乙基、或 CF
3；
R
10可為 H 或甲基；並且
A 可為
，
其中 G 為視情況被一至四個 R
9基團取代之苯基或視情況被鹵素取代之 5 至 6 員雜芳基；R
6及 R
7獨立地為 H、OCH
3、(C
3-C
6環烷基)-(CH
2)、(C
3-C
6環烷基)-(CH
2CH
2)、V-(CH
2)
0-1(其中 V 為 5 至 6 員雜芳基)、W-(CH
2)
1- 2(其中 W 為視情況被 F、Cl、Br、I、O-甲基、CF
3、或甲基取代之苯基)、視情況被 C
1-C
3烷基或 O(C
1-C
3烷基) 取代之 C
3-C
6-環烷基、羥基-(C
3-C
6-環烷基)、氟-(C
3-C
6-環烷基)、CH(CH
3)CH(OH)苯基、視情況被 F、OH、C
1-C
3烷基、環丙基甲基、或 C(=O)(C
1-C
3烷基) 取代之 4 至 6 員雜環、或視情況被獨立地選自 OH、側氧基、O(C
1-C
6-烷基)、CN、F、NH
2、NH(C
1-C
6-烷基)、N(C
1-C
6-烷基)
2、環丙基、苯基、咪唑基、哌啶基、吡咯啶基、嗎啉基、四氫呋喃基、氧雜環丁基、或四氫吡喃基中的一或多個基團取代之 C
1-C
6-烷基，或 R
6及 R
7與它們所附接的氮一起形成 4 至 7 員雜環，該雜環視情況被獨立地選自 OH、鹵素、側氧基、CF
3、CH
2CF
3、CH
2CH
2OH、O(C
1-C
3烷基)、C(=O)CH
3、NH
2、NHMe、N(Me)
2、S(O)
2CH
3、環丙基甲基、及 C
1-C
3烷基中的一或多個基團取代；R
a及 R
b為 H，或 R
a為 H，且 R
b及 R
6與它們所附接的原子一起形成具有一個或兩個環氮原子的 5 至 6 員雜環；R
c及 R
d為 H 或 Me，或 R
c及 R
d以及它們所附接的原子一起形成環丙基環；R
8為 H、Me、F、或 OH，或 R
8及 R
6與它們所附接的原子一起形成具有一個或兩個環氮原子的 5 至 6 員雜環狀環；各 R
9獨立地為鹵素、C
1-C
6-烷基、C
3-C
6-環烷基、O-(C
1-C
6-烷基)、CF
3、OCF
3、S(C
1-C
6-烷基)、CN、OCH
2-苯基、CH
2O-苯基、NH
2、NH-(C
1-C
6-烷基)、N-(C
1-C
6-烷基)
2、哌啶、吡咯啶、CH
2F、CHF
2、OCH
2F、OCHF
2、OH、SO
2(C
1-C
6-烷基)、C(O)NH
2、C(O)NH(C
1-C
6-烷基)、及 C(O)N(C
1-C
6-烷基)
2，且 m、n、及 p 獨立地為 0 或 1。
酶促還原對於臨床 AKT 抑制劑候選藥物帕他色替 (CAS 編號1001264-89-6)，其具有式 X，特別有前景。
關於本發明的使用，提及在本揭露的其他態樣的上下文中使用的術語、實例及具體實施例，它們亦適用於該態樣。特別地，根據本發明的突變型酮還原酶或其融合蛋白可如關於本發明的方法所詳述的那樣使用。
除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語以及任何縮寫字皆具有與一般熟習本發明之技術領域者通常所理解相同的含義。分子生物學中常用術語的定義可見於 Benjamin Lewin, Genes V，Oxford University Press 出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew 等人 (編輯)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd. 出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及 Robert A. Meyers (編輯)，Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference，由 VCH Publishers 出版，1995 (ISBN 1 -56081 -569-8)。
本發明並不限於本文所描述之特定方法、方案及試劑，因為它們可變。儘管類似或等效於本文所揭示之彼等的任意方法及材料皆可用於本發明之實踐，但較佳的方法及材料揭示於本文中。再者，本文所用之技術係僅用於揭示特定實施例之目的，而非試圖限制本發明之範疇。
如本文及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一個」、「一種」及「該」包括複數指示物，除非上下文另外明確指出。類似地，字詞「包含 (comprise)」、「含有 (contain)」及「涵蓋 (encompass)」應解釋為包含性而非排他性。類似地，詞語「或」旨在包括「及」，除非上下文另有明確指示。術語「複數個」係指兩個或更多個。
下面的附圖及實例旨在說明本發明的各種實施例。因此，所論述的具體修改不應被解釋為對本發明範圍進行限制。對於熟習此項技術者而言，顯而易見的係在不脫離本發明的範疇的情況下，可以進行各種等效形式、改變及修改，且因此應理解，此等等效實施例將被包括在本文中。
實例
實例
1
：
酶生產
深孔板培養：表現野生型及突變型酮還原酶之
大腸桿菌細胞以 96 深孔板形式培養用於篩選目的。藉由將新鮮的單個轉化株或甘油原種接種至含有 100 至 200 mg/L 胺苄青黴素之 500 µL Luria-Bertani (LB) 培養基中，然後在 28℃ 以 300 rpm 振盪孵育 18 小時 (Duetz 系統，Kuehner 振盪器，振盪直徑 5 cm)，來開始預培養。藉由將 8 至 25 µL 預培養物接種至補充有 100 至 200 mg/L 的胺苄青黴素的不含微量元素之 500 µl ZYM-5052 自動誘導培養基 (10 g/L 蛋白腖、5 g/L 酵母提取物、5 g/L 甘油、0.55 g/L 葡萄糖一水合物、2.1 g/L 乳糖一水合物、10.6 g/L 磷酸氫二鈉鹽、3.4 g/L 磷酸一氫鉀鹽、2.15 g/L 氯化銨、0.59 g/L 氯化鈉、0.663 g/L 硫酸銨、2 mM 硫酸鎂) 中，來開始主培養。將培養物在同一振盪器中於 20℃、300 rpm 下孵育 20 小時。在細胞收穫之前，測量 600 nm 處之光學細胞密度。
藉由添加 200 µL 裂解緩衝液 (0.1 M 磷酸鉀緩衝液，pH 7，2 mM MgCl
2，1 mg/mL 來自雞蛋清之溶菌酶，0.75 mg/mL 硫酸多黏菌素 B、及 0.2 mg/mL 脫氧核糖核酸酶 I) 來破碎細胞。將細胞懸浮液在 30℃ 以 300 rpm 振盪孵育 1 小時 (Duetz 系統，Kuehner 振盪器)，然後在 4℃ 以 3,220 g 離心 30 分鐘。將深孔板培養之細胞之上清液立即用於基於 UV 之活性測定或 10% [w/w] 受質負荷下之 0.2 mL 規模之生物催化反應。
搖瓶培養：將表現野生型及突變型酮還原酶之
大腸桿菌細胞在搖瓶中培養，≥ 1 mL 規模之生物催化反應。一個
大腸桿菌轉化株用於接種含有 100 mg/L 胺苄青黴素之 20 mL LB，然後在 37℃、180 rpm 下孵育過夜。使用預培養物 (5 mL) 來接種 2 L 錐形瓶，該錐形瓶含有含 100 mg/L 胺苄青黴素之 500 mL Terrific Broth (TB) 培養基，然後在 37℃、180 rpm 下孵育，直至 OD 600 nm 達到 0.6 至 0.8。在添加1 mM 異丙基 β-D-1-硫代半乳糖苷 (IPTG) 後，將培養物在 25 或 30℃ 孵育 24 小時。藉由在 4℃、9,300 g 下離心 45分鐘來收穫細胞。將沉澱球稱重並重新懸浮於 2 mM 磷酸鉀緩衝液 (pH 7) 中，該緩衝液含有 0.04 mM MgCl
2，生物量與緩衝液之比為 1:2。對細胞進行超聲處理，並在 4℃、30,000 g 下離心 20 分鐘。收集上清液用於冷凍乾燥。
使用設啶在-85℃ 及 0.14 毫巴下之 Alpha 2-4 LDplus (Christ) 將細胞裂解物冷凍乾燥過夜。冷凍乾燥的裂解物立即用於生物催化反應或儲存在 -20℃。
實例
2
：
酶活性及選擇性之測定
小規模反應中的紫外線篩選
使用分光光度計在 96 孔 Greiner 微量滴定板中測量還原酶活性。反應在總體積為 200 µL 之容器中進行，其中含有：(1) 178 µL 的 0.1 M 磷酸鉀緩衝液，pH 7，含有 2 mM MgCl
2及 0.01 mg/mL NADP
+(以鈉鹽形式)；(2) 6 µL 的澄清的裂解物 (純的或在 0.1 M 磷酸鉀緩衝液，pH 7 中稀釋，其含 2 mM MgCl
2，最終裂解物濃度為 3%、1.5%、1%、0.5%、或 0.25% [v/v][v/v])；及 (3) 16 µL 的在 2-丙醇 [v/v] 中含有 1.25 mg/mL 式
Ib的酮之儲備溶液。
該測定在 432 rpm 之軌道振盪下進行，並且溫度在 28℃ 與 32℃ 之間波動 (室溫加上由振盪引起之 5℃)。在 340 nm 處跟蹤式
Ib的酮之消耗，並每 5 分鐘記錄一次，持續 80 分鐘。線性範圍內之斜率 [∆A/min]) 用於超過親代 (FIOP) 之倍數增加計算。親代可為野生型 (FIOWT) 或不同的變體。下表顯示了相較於野生型，各種單一及多個突變體之 FIOWT 或 FIOP 值。hits 的式
IIb的手性醇 (R,R-反式醇) 之非鏡像異構物超越 (
de) 值係藉由紫外線篩選測定樣品之 HPLC-UV 分析進行驗證 (參見部分：受質及產物的 HPLC 分析)。在表1 至 20 中顯示之所有突變體，式
IIb的手性醇之
de≥ 99.5%。
表 1：具有在位置 241 處的單一突變的變體 (單點突變形成)
| AA | FIOWT |
| F - Phe | 1.00 |
| I - Ile | 1.16 |
| K - Lys | 1.20 |
| L - Leu (野生型) | 1.00 |
| M - Met | 1.22 |
| N - Asn | 1.14 |
| R - Arg | 1.20 |
| W - Trp | 1.20 |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 2：具有在位置 241 處的突變及至少一個進一步突變的變體 (組合位點突變形成)
| Phe 97 | Leu 174 | Ala 238 | Leu 241 | Met 242 | Glu 245 | FIOWT |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | M - Met | W - Trp | S - Ser | 5.0 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | A - Ala | W - Trp | S - Ser | 4.9 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | C - Cys | W - Trp | S - Ser | 4.8 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | Y - Tyr | W - Trp | S - Ser | 4.3 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | V - Val | Y - Tyr | T - Thr | 3.4 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | Q - Gln | M - Met | N - Asn | 2.9 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | W - Trp | V - Val | W - Trp | 2.7 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | F - Phe | Y - Tyr | T - Thr | 2.6 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | H - His | F - Phe | S - Ser | 2.4 |
| W - Trp | L -Leu | R - Arg | G - Gly | M - Met | W - Trp | 3.1 |
| W – Trp | W - Trp | K - Lys | D - Asp | I - Ile | F - Phe | 2.9 |
| W - Trp | I -Ile | W - Trp | S - Ser | P - Pro | N - Asn | 2.7 |
| W – Trp | L - Leu | L - Leu | T - Thr | F - Phe | C - Cys | 2.6 |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 3：具有在位置 241 處的突變以及在位置 97、242、及 245 上的突變的變體 (組合位點突變形成)
| Phe 97 | Leu 241 | Met 242 | Glu 245 | FIOWT |
| W - Trp | M - Met | W - Trp | S - Ser | 8.3 |
| W - Trp | Q - Gln | W - Trp | S - Ser | 8.0 |
| W - Trp | S - Ser | W - Trp | S - Ser | 7.4 |
| W - Trp | A - Ala | W - Trp | S - Ser | 7.2 |
| W - Trp | T - Thr | W - Trp | S - Ser | 6.1 |
| W - Trp | C - Cys | W - Trp | S - Ser | 5.8 |
| W - Trp | V - Val | W - Trp | S - Ser | 5.4 |
| W - Trp | Y - Tyr | W - Trp | S - Ser | 5.1 |
| W - Trp | L - Leu | W - Trp | T - Thr | 4.7 |
| W - Trp | V - Val | Y - Tyr | T - Thr | 4.2 |
| W - Trp | C - Cys | W - Trp | T - Thr | 4.1 |
| W - Trp | Q - Gln | W - Trp | T - Thr | 3.7 |
| W - Trp | T - Thr | F - Phe | T - Thr | 3.3 |
| W - Trp | A - Ala | W - Trp | T - Thr | 3.2 |
| 使用 1.5% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 4：具有在位置 242 處的單一突變的變體 (單點突變形成)
| AA | FIOWT |
| F - Phe | 2.63 |
| I - Ile | 1.22 |
| M - Met (野生型) | 1.00 |
| W - Trp | 1.66 |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 5：具有在位置 242 處的突變及至少一個進一步突變的變體 (組合位點突變形成)
| Phe 97 | Leu 174 | Ala 238 | Leu 241 | Met 242 | Gln 245 | FIOWT |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | L - Leu | P - Pro | T - Thr | 2.1 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | L - Leu | A - Ala | T - Thr | 1.9 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | V - Val | Y - Tyr | T - Thr | 3.4 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | W -Trp | V - Val | W - Trp | 2.7 |
| W - Trp | L - Leu | N - Asn | R - Arg | L - Leu | Q - Gln | 2.7 |
| W - Trp | L - Leu | L - Leu | T- Thr | F - Phe | C - Cys | 2.6 |
| W - Trp | L - Leu | N - Asn | R - Arg | L - Leu | Q - Gln | 2.7 |
| W - Trp | K - Lys | G - Gly | T - Thr | C - Cys | T - Thr | 1.6 |
| W - Trp | L - Leu | A - Ala | L - Leu | C - Cys | W - Trp | 1.5 |
| W - Trp | C - Cys | L - Leu | N - Asn | Q - Gln | N - Asn | 1.4 |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 6：具有在位置 245 處的單一突變的變體 (單點突變形成)
| AA | FIOWT |
| C - Cys | 1.12 |
| H - His | 1.38 |
| N - Asn | 2.35 |
| Q - Gln (野生型) | 1.00 |
| S - Ser | 1.35 |
| T - Thr | 3.55 |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 7：具有在位置 245 處的突變及至少一個進一步突變的變體 (組合位點突變形成)
| Phe 97 | Leu 174 | Ala 238 | Leu 241 | Met 242 | Gln 245 | FIOWT | |
| W - Trp | I - Ile | K - Lys | H - His | W - Trp | D - Asp | 3.4 | |
| W - Trp | L - Leu | R - Arg | G - Gly | M - Met | W - Trp | 3.1 | |
| W - Trp | W - Trp | K - Lys | D - Asp | I - Ile | F - Phe | 2.9 | |
| W - Trp | L - Leu | L - Leu | T - Thr | F - Phe | C - Cys | 2.6 | |
| W - Trp | Q - Gln | D - Asp | R - Arg | I - Ile | M - Met | 2.0 | |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 | |||||||
表 8：具有在位置 97 處的單一突變的變體 (單點突變形成)
| AA | FIOWT |
| F- Phe (野生型) | 1.00 |
| W - Trp | 1.41 |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 9a：具有在位置 97 處的單一突變及至少一個進一步突變的變體 (組合位點突變形成)
E00158 包含以下突變：
W97_K238_M241_W242_S245_M316_M342
使用 0.25% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。
| Phe 97 | Ala 238 | Leu 241 | Met 242 | Gln 245 | FIO ( 相對於 E00158) | FIOWT [ 計算值 ] |
| F - Phe | K - Lys | M - Met | W -Trp | S - Ser | 0.78 | 17.3 |
| W - Trp | K - Lys | M - Met | W -Trp | S - Ser | 0.97 | 21.5 |
表 9b：具有在位置 97 處的單一突變、His 標籤及至少三個進一步突變的變體 (組合位點突變形成)
a從 FIOP 估算的值
| 97 | 134 | 224 | 238 | 241 | 242 | 245 | 246 | 316 | 342 | FIOP | FIOWT a | |
| WT | F | T | S | A | L | M | Q | Y | L | T | 1.0 | 1 |
| E00128 | W | T | S | A | M | W | S | Y | L | T | 8.0 | 8 |
| E00144 | W | T | S | A | M | W | S | Y | M | M | 1.1 | 9 |
| E00158 | W | T | S | K | M | W | S | Y | M | M | 2.5 | 22 |
| E00174 | W | T | S | K | M | W | S | G | M | M | 1.1 | 24 |
| E00184 | W | T | A | K | M | W | S | G | M | M | 1.2 | 29 |
| E00184 | W | V | A | K | M | W | S | G | M | M | 2.0 | 58 |
表 9c：具有在位置 97 處的單一突變、His 標籤及至少一個三個突變的變體之動力學特性 (組合位點突變形成)
[a]未達到基質飽和
| 變體 | app. K M[µM] | app. k cat[min -1] | app. k cat/ K M[min -1mM -1] | rel. k cat |
| WT | 11.9 ± 1.1 | 0.49 ± 0.02 | 41 | 1 |
| E00128 | 162.8 ± 7.8 | 5.8 ± 0.1 | 35.5 | 12 |
| E00144 | 175.2 ± 9.9 | 6.2 ± 0.2 | 35.6 | 13 |
| E00158 | 299.7 ± 7.9 | 15.3 ± 0.4 | 51.2 | 31 |
| E00174 [a] | 1668 ± 103 | 45.8 ± 2.4 | 27.5 | 94 |
| E00184 | 471.7 ± 34.6 | 21.3 ± 1.0 | 45.2 | 43 |
| E00184 | 143.5 ± 5.5 | 31.5 ± 0.8 | 219.7 | 64 |
表 10：具有在突變體 E00184 中在位置 134 處的單一突變的變體 (E00184 的單點突變形成)
E00184 包含以下突變：
W97_A224_K238_M241_W242_S245_G246_M316_M342
使用 0.25% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。
| Thr 134 | FIOP ( 相對於 E00184) | FIOWT [ 計算值 ] |
| T - Thr | 1.0 | 29.0 |
| V - Val | 2.0 | 58.0 |
| C - Cys | 1.3 | 37.7 |
| A - Ala | 1.2 | 34.8 |
| Q - Gln | 1.1 | 31.9 |
| M - Met | 1.1 | 31.9 |
表 11：具有在突變體 E00184 中在位置 134 及 135 處的突變的變體(E00184 的雙位點突變形成)
E00184 包含以下突變：
W97_A224_K238_M241_W242_S245_G246_M316_M342
使用 0.25% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。
| Thr 134 | Val 135 | FIOP ( 相對於 E00184) | FIOWT [ 計算值 ] |
| V - Val | V - Val | 2.0 | 58.0 |
| V - Val | C - Cys | 1.5 | 43.5 |
| V - Val | T - Thr | 1.5 | 43.5 |
表 12：具有在位置 174 處的單一突變的變體 (單點突變形成)
| AA | FIOWT |
| A - Ala | 1.29 |
| I - Ile | 1.04 |
| L - Leu (野生型) | 1.00 |
| T - Thr | 1.01 |
| V - Val | 1.09 |
| Y - Tyr | 1.19 |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 13：具有在位置 174 處的突變及至少一個進一步突變的變體 (組合位點突變形成)
| Phe 97 | Leu 174 | Ala 238 | Leu 241 | Met 242 | Gln 245 | FIOWT |
| W - Trp | N - Asn | A - Ala | L - Leu | M - Met | T - Thr | 2.7 |
| W - Trp | S - Ser | A - Ala | L - Leu | M - Met | N - Asn | 2.3 |
| W - Trp | Q - Gln | A - Ala | L - Leu | A - Ala | T - Thr | 1.9 |
| W - Trp | T - Thr | Y - Tyr | W - Trp | M - Met | Q - Gln | 2.8 |
| W - Trp | V - Val | Y - Tyr | L - Leu | M - Met | Q - Gln | 2.8 |
| W - Trp | M - Met | L - Leu | R - Arg | M - Met | Q - Gln | 2.4 |
| W - Trp | Y - Tyr | K - Lys | N - Asn | M - Met | Q - Gln | 2.2 |
| W - Trp | A - Ala | L - Leu | M - Met | M - Met | Q - Gln | 2.1 |
| W - Trp | I - Ile | N - Asn | L - Leu | M - Met | Q - Gln | 2.1 |
| W - Trp | T - Thr | R - Arg | M - Met | M - Met | Q - Gln | 2.0 |
| W - Trp | K - Lys | Y - Tyr | Q - Gln | M - Met | Q - Gln | 2.0 |
| W - Trp | R - Arg | H - His | R - Arg | M - Met | Q - Gln | 1.8 |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 14：具有在突變體 E00174 中在位置 224 處的單一突變的變體 (突變體 E00174 的單點突變形成)
E00174 包含以下突變：
W97_K238_M241_W242_S245_G246_M316_M342
使用 0.25% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。
| Ser 224 | FIOP ( 相對於 E00174) | FIOWT [ 計算值 ] |
| S - Ser | 1.0 | 24.4 |
| A - Ala | 1.2 | 29.0 |
表 15：具有在突變體 E00158 中在位置 228 處的單一突變的變體 (突變體 E00158 的單點突變形成)
E00158 包含以下突變：
W97_K238_M241_W242_S245_M316_M342
使用 0.25% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。
| Met 228 | FIOP ( 相對於 E00158) | FIOWT [ 計算值 ] |
| M - Met | 1.00 | 22.2 |
| K - Lys | 1.08 | 24.0 |
| Q - Gln | 1.14 | 25.3 |
| R - Arg | 1.37 | 30.4 |
表 16：具有在突變體 E00158 中在位置 234 處的單一突變的變體 (突變體 E00158 的單點突變形成)
E00158 包含以下突變：
W97_K238_M241_W242_S245_M316_M342
使用 0.25% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。
| Glu 234 | FIOP ( 相對於 E00158) | FIOWT [ 計算值 ] |
| E - Glu | 1.0 | 22.2 |
| D - Asp | 1.1 | 24.0 |
表 17：在突變體 E00144 中在位置 238 處的變體 (突變體 E00144 的單點突變形成)
E00144 包含以下突變：
W97_M241_W242_S245_M316_M342
使用 0.25% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。
| Ala 238 | FIOP ( 相對於 E00144) | FIOWT [ 計算值 ] |
| A - Ala | 1.0 | 9.0 |
| K - Lys | 2.5 | 22.2 |
| G - Gly | 1.9 | 17.3 |
| R - Arg | 1.7 | 15.3 |
表 18：具有在位置 238 處的突變及至少一個進一步突變的變體 (組合位點突變形成)
| Phe 97 | Leu 174 | Ala 238 | Leu 241 | Met 242 | Gln 245 | FIOWT |
| W - Trp | L - Leu | K - Lys | N - Asn | I - Ile | Q - Gln | 3.0 |
| W - Trp | L - Leu | N - Asn | R - Arg | L - Leu | Q - Gln | 2.7 |
| W - Trp | L - Leu | L - Leu | L - Leu | M - Met | Q - Gln | 2.6 |
| W - Trp | L - Leu | H - His | H - His | I - Ile | Q - Gln | 2.4 |
| W - Trp | L - Leu | N - Asn | K - Lys | I - Ile | Q - Gln | 1.7 |
| W - Trp | V - Val | Y - Tyr | L - Leu | M - Met | Q - Gln | 2.8 |
| W - Trp | V - Val | Q - Gln | H - His | M - Met | Q - Gln | 2.3 |
| W - Trp | T - Thr | R - Arg | M - Met | M - Met | Q - Gln | 2.0 |
| W - Trp | V - Val | T - Thr | L - Leu | M - Met | Q - Gln | 1.8 |
| W - Trp | V - Val | S - Ser | L - Leu | M - Met | Q - Gln | 1.8 |
| W - Trp | L - Leu | L - Leu | M - Met | M - Met | Q - Gln | 1.8 |
| W - Trp | I - Ile | G - Gly | C - Cys | Y - Tyr | T - Thr | 2.4 |
| W - Trp | M - Met | D - Asp | A - Ala | M - Met | T - Thr | 2.3 |
| W - Trp | I - Ile | W - Trp | S - Ser | P - Pro | N - Asn | 1.8 |
| 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
表 19：在突變體 E00158 中在位置 246 處的變體 (突變體 E00158 的單點突變形成)
E00158 包含以下突變：
W97_K238_M241_W242_S245_M316_M342
使用 0.25% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。
| Tyr 246 | FIOP ( 相對於 E00158) | FIOWT [ 計算值 ] |
| Y - Tyr | 1.0 | 22.2 |
| G - Gly | 1.1 | 24.4 |
| K - Lys | 1.1 | 24 |
表 20：具有在位置 316 及 342 處的突變及至少一個進一步突變的變體 (組合位點突變形成)
| Phe 97 | Leu 241 | Met 242 | Gln 245 | FIOWT 無表面殘基突變 (Leu316_Thr342) | FIOWT 具有表面殘基突變 (Met316_Met342) |
| F - Phe | L - Leu | M - Met | Q - Gln | 1.0 | 1.4 |
| F - Phe | L - Leu | M - Met | T - Thr | 3.8 | 5.1 |
| W - Trp | M - Met | W - Trp | S - Ser | 8.0 | 8.5 |
| W - Trp | C - Cys | W - Trp | S - Ser | 5.8 | 6.6 |
| W - Trp | Y - Tyr | W - Trp | S - Ser | 5.1 | 5.6 |
| W - Trp | V - Val | Y - Tyr | T - Thr | 4.2 | 4.9 |
| 使用 1.5% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
受質及產物的
HPLC
分析
確定非鏡像異構物超越 (
de)
的非手性方法：根據受質濃度，以方便的比率用 HPLC 級甲醇淬滅反應混合物。蛋白質沉澱後，將樣品在 4°C、3,300 g 下離心 10 分鐘。使用以下方法中之一種，在 Agilent 1290 HPLC 系統上，藉由 HPLC-UV 在 260 nm 下分析上清液：
i. Kinetex XB-C18 管柱 (50 mm x 4.6 mm, 2.6 µm)，分別用水及甲醇作為溶劑 A 及 B。將管柱在 50℃ 加熱，流速為 0.8 mL/min，並且注射體積為 2 µL。應用了以下梯度：0 至 0.1 分鐘，B = 50%；0.1 至 4 分鐘，B = 50 至 58%；4 – 4.1 分鐘，B = 58 至 95%；4.1 – 4.6 分鐘，B = 95%；4.6 至 4.7 分鐘，B = 95 至 50%；4.7 至 5 分鐘，B = 50%，5 至 5.1 分鐘，B = 50 至 95%；5.1 至 5.4 分鐘，B = 95%；5.4 至 5.5 分鐘，B = 95 至 50%；及 5.5 至 5.9 分鐘，B = 50%。
ii. Agilent InfinityLab Poroshell 120 Eclipse EC-C18 管柱 (50 mm x 3.0 mm x 2.7 µm)，分別用水及甲醇作為溶劑 A 及 B。將管柱在 50℃ 加熱，流速為 0.8 mL/min，並且注射體積為 2 µL。應用了以下梯度：0 – 0.1 min，B = 40%；0.1 – 6 min，B = 40 – 52.7%；6 – 6.2 min，B = 52.7 – 95%；6.2 – 7.2 min，B = 95%；7.2 – 8 min，B = 95 – 40%；8 – 9 min，B = 40%。
iii. Kinetex EVO-C18 管柱 (50 mm x 4.6 mm, 5 µm)，分別用水及甲醇作為溶劑 A 及 B。將管柱在 40°C 加熱，流速為 2 mL/min，並且注射體積為 1 µL。應用以下等度方法：0 至 7.5 分鐘，B = 40%。
方法 i 或 ii 在紫外測定篩選或 0.2 mL 規模的生物催化反應後使用。在HPLC-UV分析之前，將對應於式
Ib的酮、式
IIb的手性醇及源自式
Ib的酮之 (R,S)-順式醇產物之標準品作為樣品進行處理。為了快速驗證紫外測定樣品之選擇性，根據醇產物之相對峰面積 (面積%，縮寫為 a%) 估算非鏡像異構物超越 (
de) 值。在 0.2 mL 規模的生物催化反應之情況下，使用式
IIb的手性醇的校準曲線計算轉化。方法 iii 應用於 ≥ 1 mL 規模的反應。轉化及非鏡像異構物超越值係由相對峰面積確定。
表 21：來自不同真菌物種之酮還原酶相較於 SEQ ID NO: 1 (UniProt ID: Q9UUN9) 對式
Ib的酮之還原酶效能及非鏡像選擇性
| 真菌物種 | NCBI/ UniProt ID | FIO SEQ ID NO: 1 | de [%] (IIb) |
| 樹幹畢赤酵母 | ABN64930 | 2.60 | 98.0 |
| 葡萄牙棒孢酵母 | EEQ37269 | 2.10 | 93.5 |
| 季也蒙畢赤酵母 | EDK39148 | 1.60 | 42.8 |
| 鮭色鎖擲酵母 | Q9UUN9 | 1.00 | 99.9 |
| 華盛頓腥擲孢菌 | PWN99435 | 0.34 | 98.8 |
| 南極枝孢菌 | OQO01855 | 0.30 | 97.4 |
| 長孢洛德酵母 | EDK47269 | 0.28 | 95.9 |
| 富氏酸酵母菌 | KYG41666 | 0.26 | 98.4 |
| 皺波褶尾菌 | KII83904 | 0.20 | 97.9 |
| 空載體 (陰性對照) | n.a. | 0.02 - 0.05 | n.d. |
| n.a. 不適用；n.d.，未確定 使用 3% [v/v] 裂解物進行 UV 篩選測定。 |
使用裂解物在
10% [w/w]
受質負荷下進行
0.2 mL
規模的反應
反應在 Eppendorf 管中進行，並含有 20 mg 的式 Ib 的酮、0.1 M 磷酸鉀緩衝液 pH 7.2、2 mM MgCl
2、0.1% NADP
+二鈉鹽 (s/c = 100)、相當於 3.5 mg/mL 總蛋白 (藉由 BCA 測定來確定) 之澄清的裂解物及 8% 至 20% [v/v] 2-丙醇。反應在溫度為 25 至 30℃ 之熱混合器中進行，並以 1,000 rpm 振盪。給定時間後，用 HPLC 級甲醇淬滅反應，達到 100 之最終稀釋因子，並離心。藉由 HPLC-UV (260 nm) 分析上清液。在表 22 至 24 中所示之所有突變體情況下，產物式 IIb 的手性醇之非鏡像異構物超越 ≥ 99.5%。
表 22：酮還原酶突變體在不同時間點對式 Ib 的酮之轉化
| 突變 | 在 28°C 利用 8% [v/v] 2- 丙醇的轉化 [a%] | ||
| 2 h | 4 h | 24 h | |
| 無 (野生型) | 2.8 | 4.7 | 18.4 |
| Trp97_Met241_Trp242_Ser245 (E00128) | 8.3 | 12.6 | 39.6 |
| Trp97_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00144) | 9.9 | 14.2 | 43.1 |
| Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00158) | 16.6 | 24.3 | 70.2 |
表 23：酮還原酶突變體在不同溫度對式 Ib 的酮之轉化
| 突變 | 在 24 小時後利用 8% [v/v] 2- 丙醇的轉化 [a%] | ||
| 20°C | 25°C | 28°C | |
| 無 (野生型) | 9.1 | 15.6 | 20.0 |
| Trp97_Met241_Trp242_Ser245 (E00128) | 20.8 | 35.2 | 42.8 |
| Trp97_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00144) | 27.2 | 40.0 | 47.8 |
| Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00158) | 40.7 | 63.3 | 71.2 |
表 24：酮還原酶突變體在不同 2-丙醇濃度下對式 Ib 的酮之轉化
| 突變 | 在 25℃ 24 小時後的轉化 [a%] 2- 丙醇濃度 | ||
| 8% [v/v] | 12% [v/v] | 16% [v/v] | |
| 無 (野生型) | 18.7 | 19.4 | 19.9 |
| Lys238_Asn245 (E00179) | 44.1 | 29.2 | 21.5 |
| Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00158) | 51.9 | 49.5 | 25.9 |
| Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Gly246_Met316_Met342 (E00174) | 52.2 | 65.5 | 40.2 |
| Trp97_Ala224_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Gly246_Met316_Met342 (E00184) | 55.5 | 70.2 | 41.6 |
使用冷凍乾燥的裂解物在
10% [w/w]
受質負荷下進行
1 mL
規模的反應
反應在 Eppendorf 管中進行，並且含有 0.1 g 式 Ib 的酮、0.1 M 磷酸鉀緩衝液 pH 7.2、2 mM MgCl
2、0.1% NADP
+二鈉鹽 (s/c = 100)、8% [v/v] 2-丙醇及冷凍乾燥的裂解物，源自不同的受質與酶 (s/e) 比率的選定變體及對照。反應在 23 至 30℃ 進行，並以 1,500 rpm 振盪。給定時間後，用 HPLC 級甲醇淬滅反應並藉由 HPLC-UV (260 nm) 進行分析。
表 25：1 mL 規模的反應中酮還原酶突變體對式 Ib 的酮的轉化及非鏡像選擇性
*20 h
| 突變 | s/e | 在 30℃ 的轉化 [a%] | de [%] (IIb) | |
| 4 h | 24 h | 24 h | ||
| 無 | 10 | 5 | 35 | 99.5 |
| Lys238_Asn245 (E00179) | 10 | 25 | 26 | 99.5 |
| Trp97_Met241_Trp242_Ser245 (E00128) | 5 | 26 | 62* | 99.5* |
| Trp97_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00144) | 5 | 28 | 58* | 99.5* |
| Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00158) | 10 | 29 | 53 | 99.5 |
| Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Gly246_Met316_Met342 (E00174) | 10 | 45 | 89 | 99.5 |
| Trp97_Ala224_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Gly246_Met316_Met342 (E00184) | 10 | 29 | 80 | 99.5 |
| Trp97_Thr134_Ala224_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Gly246_Met316_Met342 (E00185) | 10 | 51 | 96 | 99.5 |
實例
3
：
製備規模的生物催化反應
使用
2-
丙醇作為最終還原劑在
10% [w/w]
受質負荷下進行
20 mL
規模的反應
反應在具有磁力攪拌的 Scott 燒瓶中進行，並且含有 2.0 g 式 Ib 的酮、0.1 M 磷酸鉀緩衝液 pH 7.2、2 mM MgCl
2、0.1% NADP
+二鈉鹽 (s/c = 100)、8% [v/v] 2-丙醇及冷凍乾燥的裂解物，源自不同的受質與酶 (s/e) 比率的選定變體及對照。攪拌反應在 23 至 30℃ 進行。給定時間後，用 HPLC 級甲醇 (0.95 mL) 淬滅反應樣品 (0.05 mL)，並藉由 HPLC-UV (260 nm) 進行分析。
表 26：使用 2-丙醇作為最終還原劑在 20 mL 規模的反應中酮還原酶突變體對式 Ib 的酮的轉化及非鏡像選擇性
| 突變 | s/e | 在 30℃ 的轉化 [a%] | de [%] (IIb) | |
| 18 h | 46 h | 46 h | ||
| Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00158) | 5 | 75 | 93 | 99.5 |
| Trp97_Lys238_Gln241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00159) | 5 | 56 | 66 | 99.5 |
| Trp97_Gly238_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342 (E00160) | 5 | 55 | 70 | 99.5 |
使用葡萄糖作為最終還原劑在
10% [w/w]
受質負荷下進行
20 mL
規模的反應
反應在具有頂部攪拌的 pH-Stat 中進行，並且含有 2 g 式 Ib 的酮、0.1 M 磷酸鉀緩衝液 pH 7.2、2 mM MgCl
2、0.1% NADP
+二鈉鹽 (s/c = 100)、8% [v/v] 2-丙醇及冷凍乾燥的裂解物，源自不同的受質與酶 (s/e) 比率的選定變體及對照。攪拌反應在 23 至 30℃ 進行，並藉由添加 1 M NaOH 保持 pH 恆定。給定時間後，用 HPLC 級甲醇 (0.95 mL) 淬滅反應樣品 (0.05 mL) 並藉由 HPLC-UV (260 nm) 進行分析。
表 27：使用葡萄糖作為最終還原劑在 20 mL 規模的反應中酮還原酶突變體對式 Ib 的酮的轉化及非鏡像選擇性
| 突變 | s/e | 在 30℃ 的轉化 [a%] | de [%] (IIb) | |
| 2 h | 7 h | 7 h | ||
| Trp97_Lys238_Met241_Trp242_ Ser245_Met316_Met342 (E00158) | 5 | 75 | 100 | 99.5 |
使用
2-
丙醇作為最終還原劑的進行
100 mL
規模的反應
反應含有式 Ib 的酮 (10 g, 0.03 mol, 1 eq)、水 (39 mL)、1 M 磷酸鉀緩衝液 pH 7.2 (10 mL)、0.1 M MgCl
2.6H
2O (2 mL)、2-丙醇 (8 mL) 及 NADP
+(100 mg，0.004 eq，s/c = 100，先前溶解在 1 mL 中)。攪拌 5 分鐘後，藉由添加 E00185 冷凍乾燥的裂解物 (2 g，s/e = 5，先前溶解於 30 mL 水中) 開始反應，然後在 23℃ 及 N
2流下孵育 30 小時。完全還原 (＜ 1.0 a%
式 Ib 的酮 )後，藉由蒸發 (40℃，200 至 60 毫巴) 耗儘 2-丙醇，將懸浮液冷卻至室溫，過濾粗產物，用水 (兩次 25 mL)、庚烷 (兩次 25 mL) 洗滌，並乾燥至恆重 (40℃，＜ 10 毫巴)。在 254 nm 下使用配備有 Chiralpak IC-3 管柱 (150 mm x 4.6 mm, 3 µm) 之 Agilent 1290 HPLC 系統來確定 HPLC 產物純度 (以面積% 表示，縮寫為 a%)，該管柱係在 30℃ 加熱並且具有庚烷及含有 0.1% 二乙醇胺之乙醇分別作為溶劑 A 及 B。流速為 0.8 mL/min，並且注射體積為
5 µL。使用以下梯度：0 至 5 分鐘，B = 40%；5 至 15 分鐘，B = 100%；15 至 17 分鐘，B = 100%，17 至 17.1 分鐘，B: 40%。
分離出 9.5 g (94.2%) 淺米色粉末粗製產物，HPLC 純度為 99.7 a%
式 IIb 的手性醇(0.0 a% (S,S)-反式產物，＜ 0.02 a% 順式產物，0.2 a% 式 Ib 的酮)。
使用葡萄糖作為最終還原劑進行
100 mL
規模的反應
反應含有式 Ib 的酮 (10 g, 0.03 mol, 1 eq)、水 (34 mL)、1 M 磷酸鉀緩衝液 pH 7.2 (10 mL)、1 M D(+)-葡萄糖一水合物 (7.13 g, 1.2 eq, 36 mL)、0.1 M MgCl
2.6H
2O (2 mL)、2-丙醇 (8 mL) 及 NADP
+(100 mg, 0.004 eq, s/c = 100)、及來自 Codexis 公司的葡萄糖脫氫酶 GDH-105 (100 mg, s/e = 100)。攪拌 5 分鐘後，藉由添加 E00185 冷凍乾燥的裂解物 (0.2 g, s/e = 50) 來開始反應。藉由添加 1 M NaOH (Tritisol) (28.9 mL, 0.03 mol, 0.96 eq) 保持 pH 恆定。將反應懸浮液在 23℃ 孵育 27 小時以達成完全還原 (＜ 1.0 a%
式 Ib 的酮)。藉由蒸發 (40℃，200 至 60 毫巴) 耗盡 2-丙醇，將懸浮液冷卻至室溫，過濾粗產物，用水 (兩次 25 mL)、庚烷 (兩次 25 mL) 洗滌，並乾燥至恒重 (40℃，＜ 10 毫巴)。HPLC 產物純度 (以面積% 表示，縮寫為 a%) 如前一部分所述進行確定。
分離出 9.5 g (94.0%) 淺米色粉末粗製產物，HPLC 純度為 99.5 a%
式 IIb 的手性醇(0.0 a% (S,S)-反式產物，＜ 0.05 a% 順式產物，0.4 a% 式 Ib 的酮)。
序列SEQ ID NO: 1
長度：343
類型：蛋白質
生物體：
鮭色鎖擲酵母其他資訊：野生型
MAKIDNAVLPEGSLVLVTGANGFVASHVVEQLLEHGYKVRGTARSASKLANLQKRWDAKYPGRFETAVVEDMLKQGAYDEVIKGAAGVAHIASVVSFSNKYDEVVTPAIGGTLNALRAAAATPSVKRFVLTSSTVSALIPKPNVEGIYLDEKSWNLESIDKAKTLPESDPQKSLWVYAASKTEAELAAWKFMDENKPHFTLNAVLPNYTIGTIFDPETQSGSTSGWMMSLFNGEVSPALALMPPQYYVSAVDIGLLHLGCLVLPQIERRRVYGTAGTFDWNTVLATFRKLYPSKTFPADFPDQGQDLSKFDTAPSLEILKSLGRPGWRSIEESIKDLVGSETA
SEQ ID NO: 2
長度：343
類型：蛋白質
生物體：人工
其他資訊：E00128
突變：Trp97_Met241_Trp242_Ser245
MAKIDNAVLPEGSLVLVTGANGFVASHVVEQLLEHGYKVRGTARSASKLANLQKRWDAKYPGRFETAVVEDMLKQGAYDEVIKGAAGVAHIASVVSWSNKYDEVVTPAIGGTLNALRAAAATPSVKRFVLTSSTVSALIPKPNVEGIYLDEKSWNLESIDKAKTLPESDPQKSLWVYAASKTEAELAAWKFMDENKPHFTLNAVLPNYTIGTIFDPETQSGSTSGWMMSLFNGEVSPALAMWPPSYYVSAVDIGLLHLGCLVLPQIERRRVYGTAGTFDWNTVLATFRKLYPSKTFPADFPDQGQDLSKFDTAPSLEILKSLGRPGWRSIEESIKDLVGSETA
SEQ ID NO: 3
長度：343
類型：蛋白質
生物體：人工
其他資訊：E00144
突變：Trp97_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342
MAKIDNAVLPEGSLVLVTGANGFVASHVVEQLLEHGYKVRGTARSASKLANLQKRWDAKYPGRFETAVVEDMLKQGAYDEVIKGAAGVAHIASVVSWSNKYDEVVTPAIGGTLNALRAAAATPSVKRFVLTSSTVSALIPKPNVEGIYLDEKSWNLESIDKAKTLPESDPQKSLWVYAASKTEAELAAWKFMDENKPHFTLNAVLPNYTIGTIFDPETQSGSTSGWMMSLFNGEVSPALAMWPPSYYVSAVDIGLLHLGCLVLPQIERRRVYGTAGTFDWNTVLATFRKLYPSKTFPADFPDQGQDLSKFDTAPSMEILKSLGRPGWRSIEESIKDLVGSEMA
SEQ ID NO: 4
長度：343
類型：蛋白質
生物體：人工
其他資訊：RE1
突變：Lys238_Met241_Trp242_Ser245
MAKIDNAVLPEGSLVLVTGANGFVASHVVEQLLEHGYKVRGTARSASKLANLQKRWDAKYPGRFETAVVEDMLKQGAYDEVIKGAAGVAHIASVVSFSNKYDEVVTPAIGGTLNALRAAAATPSVKRFVLTSSTVSALIPKPNVEGIYLDEKSWNLESIDKAKTLPESDPQKSLWVYAASKTEAELAAWKFMDENKPHFTLNAVLPNYTIGTIFDPETQSGSTSGWMMSLFNGEVSPKLAMWPPSYYVSAVDIGLLHLGCLVLPQIERRRVYGTAGTFDWNTVLATFRKLYPSKTFPADFPDQGQDLSKFDTAPSLEILKSLGRPGWRSIEESIKDLVGSETA
SEQ ID NO: 5
長度：343
類型：蛋白質
生物體：人工
其他資訊：E00178
突變：Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245
MAKIDNAVLPEGSLVLVTGANGFVASHVVEQLLEHGYKVRGTARSASKLANLQKRWDAKYPGRFETAVVEDMLKQGAYDEVIKGAAGVAHIASVVSWSNKYDEVVTPAIGGTLNALRAAAATPSVKRFVLTSSTVSALIPKPNVEGIYLDEKSWNLESIDKAKTLPESDPQKSLWVYAASKTEAELAAWKFMDENKPHFTLNAVLPNYTIGTIFDPETQSGSTSGWMMSLFNGEVSPKLAMWPPSYYVSAVDIGLLHLGCLVLPQIERRRVYGTAGTFDWNTVLATFRKLYPSKTFPADFPDQGQDLSKFDTAPSLEILKSLGRPGWRSIEESIKDLVGSETA
SEQ ID NO: 6
長度：343
類型：蛋白質
生物體：人工
其他資訊：E00158
突變：Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Met316_Met342
MAKIDNAVLPEGSLVLVTGANGFVASHVVEQLLEHGYKVRGTARSASKLANLQKRWDAKYPGRFETAVVEDMLKQGAYDEVIKGAAGVAHIASVVSWSNKYDEVVTPAIGGTLNALRAAAATPSVKRFVLTSSTVSALIPKPNVEGIYLDEKSWNLESIDKAKTLPESDPQKSLWVYAASKTEAELAAWKFMDENKPHFTLNAVLPNYTIGTIFDPETQSGSTSGWMMSLFNGEVSPKLAMWPPSYYVSAVDIGLLHLGCLVLPQIERRRVYGTAGTFDWNTVLATFRKLYPSKTFPADFPDQGQDLSKFDTAPSMEILKSLGRPGWRSIEESIKDLVGSEMA
SEQ ID NO: 7
長度：343
類型：蛋白質
生物體：人工
其他資訊：E00174
突變：Trp97_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Gly246_Met316_Met342
MAKIDNAVLPEGSLVLVTGANGFVASHVVEQLLEHGYKVRGTARSASKLANLQKRWDAKYPGRFETAVVEDMLKQGAYDEVIKGAAGVAHIASVVSWSNKYDEVVTPAIGGTLNALRAAAATPSVKRFVLTSSTVSALIPKPNVEGIYLDEKSWNLESIDKAKTLPESDPQKSLWVYAASKTEAELAAWKFMDENKPHFTLNAVLPNYTIGTIFDPETQSGSTSGWMMSLFNGEVSPKLAMWPPSGYVSAVDIGLLHLGCLVLPQIERRRVYGTAGTFDWNTVLATFRKLYPSKTFPADFPDQGQDLSKFDTAPSMEILKSLGRPGWRSIEESIKDLVGSEMA
SEQ ID NO: 8
長度：343
類型：蛋白質
生物體：人工
其他資訊：E00184
突變： Trp97_Ala224_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Gly246_Met316_ Met342
MAKIDNAVLPEGSLVLVTGANGFVASHVVEQLLEHGYKVRGTARSASKLANLQKRWDAKYPGRFETAVVEDMLKQGAYDEVIKGAAGVAHIASVVSWSNKYDEVVTPAIGGTLNALRAAAATPSVKRFVLTSSTVSALIPKPNVEGIYLDEKSWNLESIDKAKTLPESDPQKSLWVYAASKTEAELAAWKFMDENKPHFTLNAVLPNYTIGTIFDPETQSGSTAGWMMSLFNGEVSPKLAMWPPSGYVSAVDIGLLHLGCLVLPQIERRRVYGTAGTFDWNTVLATFRKLYPSKTFPADFPDQGQDLSKFDTAPSMEILKSLGRPGWRSIEESIKDLVGSEMA
SEQ ID NO: 9
長度：343
類型：蛋白質
生物體：人工
其他資訊：E00185
突變： Trp97_Val134_Ala224_Lys238_Met241_Trp242_Ser245_Gly246_ Met316_Met342)
MAKIDNAVLPEGSLVLVTGANGFVASHVVEQLLEHGYKVRGTARSASKLANLQKRWDAKYPGRFETAVVEDMLKQGAYDEVIKGAAGVAHIASVVSWSNKYDEVVTPAIGGTLNALRAAAATPSVKRFVLTSSVVSALIPKPNVEGIYLDEKSWNLESIDKAKTLPESDPQKSLWVYAASKTEAELAAWKFMDENKPHFTLNAVLPNYTIGTIFDPETQSGSTAGWMMSLFNGEVSPKLAMWPPSGYVSAVDIGLLHLGCLVLPQIERRRVYGTAGTFDWNTVLATFRKLYPSKTFPADFPDQGQDLSKFDTAPSMEILKSLGRPGWRSIEESIKDLVGSEMA
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Claims (18)
- 一種相對於野生型酮還原酶具有增加的酮還原酶活性的突變型酮還原酶， 其中該突變型酮還原酶包含與 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列 (來自鮭色鎖擲酵母 ( Sporidiobolus salmonicolor) 的酮還原酶；UniProt ID: Q9UUN9) 至少 80% 相同之胺基酸序列；且 其中該突變型酮還原酶相對於 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列具有至少一個胺基酸取代，其中在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經取代。
- 如請求項 1 之突變型酮還原酶，其中在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)、經 Asn 取代 (Asn241)、經 Arg 取代 (Arg241)、經 Trp 取代 (Trp241)、經 Ile 取代 (Ile241)、經 Lys 取代 (Lys241)、經 His 取代 (His241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Gly 取代 (Gly241)、經 Asp 取代 (Asp241)、經 Ser 取代 (Ser 241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Ala 取代 (Ala241)、經 Val 取代 (Val241) 或經 Phe 取代 (Phe241)，較佳經 Met 取代 (Met241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Ser 取代 (Ser 241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Val 取代 (Val241) 或經 Ala 取代 (Ala241)，更佳經 Met 取代 (Met241)。
- 如請求項 1 或 2 之突變型酮還原酶，其中在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 - 241 及 242；或 - 241 及 245；或 - 241、242 及 245 的位置處之胺基酸係經取代， 較佳地其中 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)、經 Asn 取代 (Asn241)、經 Arg 取代 (Arg241)、經 Trp 取代 (Trp241)、經 Ile 取代 (Ile241)、經 Lys 取代 (Lys241)、經 His 取代 (His241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Gly 取代 (Gly241)、經 Asp 取代 (Asp241)、經 Ser 取代 (Ser 241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Ala 取代 (Ala241)、經 Val 取代 (Val241) 或經 Phe 取代 (Phe241)，較佳經 Met 取代 (Met241)、經 Gln 取代 (Gln241)、經 Cys 取代 (Cys241)、經 Tyr 取代 (Tyr241)、經 Ser 取代 (Ser 241)、經 Thr 取代 (Thr241)、經 Val 取代 (Val241) 或經 Ala 取代 (Ala241)，更佳經 Met 取代 (Met241)；且/或 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 242 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp242)、經 Phe 取代 (Phe242)、經 Ile 取代 (Ile242)、經 Tyr 取代 (Tyr242)、經 Cys 取代 (Cys242)、經 Val 取代 (Val242)、經 Leu 取代 (Leu242)、經 Pro 取代 (Pro242)、經 Ala 取代 (Ala242)、經 Gln 取代 (Gln242) 或經 Ser 取代 (Ser242)，較佳經 Trp 取代 (Trp242)、經 Phe 取代 (Phe242)、經 Ile 取代 (Ile242) 或經 Tyr 取代 (Tyr242)，更佳經 Trp 取代 (Trp242) 或經 Ile 取代 (Ile242)，最佳經 Trp 取代 (Trp242)；且/或 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 245 的位置處之胺基酸係經 Ser 取代 (Ser245)、經 Thr 取代 (Thr245)、經 Asn 取代 (Asn245)、經 Met 取代 (Met245)、經 Asp 取代 (Asp245)、經 Trp 取代 (Trp245)、經 Phe 取代 (Phe245)、經 Glu 取代 (Glu245)、經 Cys 取代 (Cys245) 或經 His 取代 (His245)，較佳經 Ser 取代 (Ser245)、經 Thr 取代 (Thr245) 或經 Asn 取代 (Asn245)，更佳經 Ser 取代 (Ser245) 或經 Thr 取代 (Thr245)，最佳經 Ser 取代 (Ser245)。
- 如請求項 1 至 3 中任一項之突變型酮還原酶，其中 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)；且 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 242 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp242)；且 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 245 的位置處之胺基酸係經 Ser 取代 (Ser245)。
- 如請求項 1 至 4 中任一項之突變型酮還原酶，其中 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 97 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp97)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 134 的位置處之胺基酸係經 Val 取代 (Val 134)、經 Cys 取代 (Cys 134)、經 Ala 取代 (Ala 134)、經 Gln 取代 (Gln134) 或經 Met 取代 (Met134)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 174 的位置處之胺基酸係經 Thr 取代 (Thr174)、經 Val 取代 (Val174)、經 Met 取代 (Met174)、經 Tyr 取代 (Tyr174)、經 Ala 取代 (Ala174)、經 Ile 取代 (Ile174)、經 Lys 取代 (Lys174)、經 Arg 取代 (Arg174)、經 Asn 取代 (Asn174)、經 Ser 取代 (Ser174) 或經 Gln 取代 (Gln174)，較佳經 Ala 取代 (Ala174)、經 Val 取代 (Val174) 或經 Ile 取代 (Ile174)、或未經取代，且/或 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 224 的位置處之胺基酸係經 Ala 取代 (Ala224)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 228 的位置處之胺基酸係經 Lys 取代 (Lys228)、經 Gln 取代 (Gln228) 或經 Arg 取代 (Arg228)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 234 的位置處之胺基酸係經 Asp 取代 (Asp234)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 238 的位置處之胺基酸係經 Lys 取代 (Lys238)、經 Arg 取代 (Arg238)、經 Leu 取代 (Leu238)、經 Gly 取代 (Gly238)、經 His 取代 (His238)、經 Asn 取代 (Asn238)、經 Trp 取代 (Trp238)、經 Asp 取代 (Asp238)、經 Thr 取代 (Thr238)、經 Ser 取代 (Ser238)、經 Gln 取代 (Gln238) 或經 Tyr 取代 (Tyr238)，較佳經 Lys 取代 (Lys238)、經 Arg 取代 (Arg238)、經 Leu 取代 (Leu238) 或經 Gly 取代 (Gly238)，更佳經 Lys 取代 (Lys238) 或經 Arg 取代 (Arg238)，最佳經 Lys 取代 (Lys238)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 246 的位置處之胺基酸係經 Gly 取代 (Gly246)、經 Lys 取代 (Lys246)、經 Met 取代 (Met246) 或經 Ser 取代 (Ser246)，較佳經 Gly 取代 (Gly246)、經 Lys 取代 (Lys246)，最佳經 Gly 取代 (Gly246)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 316 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met316)、或未經取代，且/或 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 342 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met342)、或未經取代。
- 如請求項 1 至 5 中任一項之突變型酮還原酶，其中 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 97 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp97)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 134 的位置處之胺基酸係經 Val 取代 (Val134)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 224 的位置處之胺基酸係經 Ala 取代 (Ala 224)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 238 的位置處之胺基酸係經 Lys 取代 (Lys238)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 242 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp242)，且/或 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 245 的位置處之胺基酸係經 Ser 取代 (Ser245)。
- 如請求項 1 至 6 中任一項之突變型酮還原酶，其中 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 241 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met241)， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 242 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp242)，且 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 245 的位置處之胺基酸係經 Ser 取代 (Ser245)，且 視情況其中 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 97 的位置處之胺基酸係經 Trp 取代 (Trp97)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 134 的位置處之胺基酸係經 Val 取代 (Val134)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 224 的位置處之胺基酸係經 Ala 取代 (Ala 224)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 238 的位置處之胺基酸係經 Lys 取代 (Lys238)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 246 的位置處之胺基酸係經 Gly 取代 (Gly246)、或未經取代， - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 316 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met316)、或未經取代，且/或 - 在對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 342 的位置處之胺基酸係經 Met 取代 (Met342)、或未經取代。
- 如請求項 1 至 7 中任一項之突變型酮還原酶，其中 - 該突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Met241、Trp242 及 Ser245；或 - 該突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Met241、Trp242、Ser245、Met316 及 Met342；或 - 該突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Lys238、Met241、Trp242、Ser245、Met316 及 Met342；或 - 該突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Lys238、Met241、Trp242、Ser245、Gly246、Met316 及 Met342；或 - 該突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Ala224、Lys238、Met241、Trp242、Ser245、Gly246、Met316 及 Met342；或 - 該突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Val134、Ala224、Lys238、Met241、Trp242、Ser245、Gly246、Met316 及 Met342；或 - 該突變型酮還原酶具有突變 Lys238、Met241、Trp242、Ser245；或 - 該突變型酮還原酶具有突變 Trp97、Lys238、Met241、Trp242、Ser245。
- 如請求項 1 至 8 中任一項之突變型酮還原酶，其中該突變型酮還原酶由以下組成或包含以下：與 SEQ ID NO: 2 至 9 中之任一者之胺基酸序列至少 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%、特定而言 100% 相同之胺基酸序列。
- 如請求項 1 至 9 中任一項之突變型酮還原酶，其中 - 該酮還原酶活性相對於該野生型酮還原酶增加至少 2.0、5.0 或 10 倍；且/或 - 使用 2-丙醇回收系統在 2 至 10% [w/w] 受質負荷 (substrate loading) 下及在 1 至 2% [w/w] 之突變型或野生型酮還原酶負荷下 (s/e 5 至 10)，該突變型酮還原酶相對於該野生型酮還原酶具有增加的轉化，特定而言至少 1.05、1.10、1.20、1.30、1.40、1.50、1.75、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 或 10 倍的增加的轉化；且/或 - 該突變型酮還原酶能夠將酮轉化為手性醇。
- 如請求項 10 之突變型酮還原酶，其中該酮具有式 I： 其中 R 1為 C 1-4-烷基且 R 2為氫或 C 1-4-烷基且所得手性醇具有式 II： 其中 R 1及 R 2係如上述。
- 如請求項 11 之突變型酮還原酶，其中該突變型酮還原酶具有將式 (II) 之酮轉化為具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 之鏡像異構物或非鏡像異構物過量的式 (I) 之手性醇的對應 R-鏡像異構物或 R-非鏡像異構物之潛力。
- 一種編碼如請求項 1 至 12 中任一項之突變型酮還原酶的核酸，其視情況包含在載體中。
- 一種在如請求項 1 至 12 之突變型酮還原酶的存在下酶催化還原酮且形成手性醇之方法。
- 如請求項 14 之方法，其中該酮具有式 I： 其中 R 1為 C 1-4-烷基且 R 2為氫或 C 1-4-烷基且所得手性醇具有式 II： 其中 R 1及 R 2係如上述。
- 如請求項 15 之方法，其中該所得手性醇為該對應 R-鏡像異構物或 R-非鏡像異構物。
- 一種如請求項 14 至 16 中任一項之方法用於製備下式之絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶抑制劑之用途： 其中 A、R 1、R 2、R 5及 R 10係如 PCT 國際申請案 WO 2008/006040 A1 之請求項 1 中所定義。
- 如請求項 17 之用途，其用於製備 。
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