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TW202342522A - 臨床人類ｉｇｇ產品之親和層析生產 - Google Patents

臨床人類ｉｇｇ產品之親和層析生產 Download PDF

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TW202342522A
TW202342522A TW112108082A TW112108082A TW202342522A TW 202342522 A TW202342522 A TW 202342522A TW 112108082 A TW112108082 A TW 112108082A TW 112108082 A TW112108082 A TW 112108082A TW 202342522 A TW202342522 A TW 202342522A
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TW
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igg
protein
affinity
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chromatography medium
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Application number
TW112108082A
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English (en)
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克瑞斯恩 佛德勒
馬丁 普爾特歇爾
露西亞 葛諾爾
Original Assignee
日商武田藥品工業股份有限公司
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Abstract

本發明提供了一種自含有IgG之起始材料製備IgG調配物之親和層析方法，該調配物包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4中之一或多者。本發明之方法包括使該含有IgG之起始材料與第一層析介質接觸，該第一層析介質包括結合有蛋白A之第一固體支持物，從而形成具有蛋白A結合親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，並且形成包括不與蛋白A結合之IgG亞類的第一穿流；並且使第一穿流與第一親和配位體層析介質接觸，該第一親和配位體層析介質包括第二固體支持物，該第二固體支持物具有與其結合之具有IgG結合親和力之第一親和配位體，從而形成第一親和配位體結合之IgG亞類及包括未與該第一親和配位體結合之IgG亞類結合的IgG亞類的第二穿流。

Description

臨床人類IGG產品之親和層析生產
來自人類血漿之免疫球蛋白產品於1952年首次用於治療免疫缺陷。最初，肌肉內或皮下投與IgG為首選方法。但是，為了注射有效治療各種疾病所必需之更大量IgG，開發了具有較低濃度IgG (50 mg/mL)之靜脈內投與產品。通常，靜脈內免疫球蛋白(IVIG)包含來自一千多名獻血者血漿之彙集免疫球蛋白G (IgG)免疫球蛋白。通常含有超過95%的具有完整Fc依賴性效應子功能之未修飾IgG，及僅痕量之免疫球蛋白A (IgA)或免疫球蛋白M (IgM)，IVIG為無菌、純化IgG產品，該等產品主要用於治療三大類醫學狀況：1. 具有較低抗體水準之免疫缺陷，例如X連鎖無γ球蛋白血症、低γ球蛋白血症(原發性免疫缺陷)及獲得性免疫受損狀況(繼發性免疫缺陷)；2. 炎症性及自體免疫性疾病；3. 急性感染。
許多IVIG商業供應商提供各種IVIG產品。與重新溶解後僅含有溶解狀態中之50 mg/mL蛋白之舊凍乾IVIG產品相比，最新發展係不同體積及濃度之高度純化及濃縮人類IgG抗體之即用型無菌液體製劑。由於諸如IVIG之IgG產品由匯集人類血漿製造，因此供體血液中之病原體污染(尤其已知會導致人類各種疾病之病毒)係生產製程中之嚴重問題。IgG產品之另一個重要考慮因素係其在儲存期間之穩定性，尤其作為即用型製劑之穩定性。與IVIG相比，皮下投與之免疫球蛋白製劑具有可居家治療且副作用較小之優點。
在關於血清及血漿蛋白之製備及性質所公開之一系列論文的第四部分中，Cohn等人(J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475)首先描述了血漿蛋白之醇分級方法(方法6)，該方法允許分離富含來自人類血漿之IgG的級分。幾年後，Oncley等人(J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550)藉由公開導致分離出更純IgG製劑之方法(方法9)而擴展了Cohn方法。
此等方法雖然為整個血漿源性血液因子產業奠定了基礎，但無法提供具有用於治療包括川崎症候群、免疫性血小板減少性紫癜及原發性免疫缺陷在內之多種免疫相關疾病之足夠高濃度的IgG製劑。因此，開發了採用諸如離子交換層析之各種技術的其他方法，以提供更高純度及更高濃度IgG調配物。Hoppe等人(Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752)及Falksveden(瑞典專利第348942號)以及Falksveden及Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)最早將離子交換層析用於此用途。
各種現代方法採用與管柱層析結合的沉澱步驟，例如辛酸鹽沉澱(Lebing等人，Vox Sang 2003 (84): 193-201)及Cohn級分(I+)II+III乙醇沉澱(Tanaka等人，Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30)。最近，Teschner等人(Vox Sang, 2007 (92):42-55)描述了一種生產10% IVIG產品之方法，其中首先自匯集血漿中移除低溫沉澱物，然後進行經改良之Cohn-Oncley冷乙醇分級，然後進行中間物之S/D處理、離子交換層析、奈米過濾及視情況超濾/滲濾。
儘管此等IgG分離方法提供了純度、安全性及產率，但自血漿中回收之IgG之產率仍然可以提高。例如，Teschner等人報導他們的方法導致IgG產率增加65% (Teschner等人，同上)。儘管比先前採用之方法有所改進，但是此IgG回收量仍然代表在分離過程中存在於彙集血漿級分中之IgG至少損失約三分之一。
由於可用於製造血漿源性產品之血漿供應有限，可以藉由將純化整合至單個框架中來達成自共同起始血漿池中分離幾種血液蛋白。例如，IgG通常藉由形成Cohn級分II+III沉澱物或Kistler-Nitschmann沉澱物A來富集，然後將其相應上清液用於生產α-1-抗胰蛋白酶及白蛋白。類似地，已經描述了幾種用於自IgG免疫球蛋白製造過程中形成之副產物製造其他血漿蛋白諸如因子H的方法，包括WO 2008/113589及WO 2011/011753。
因此，需要製造治療性IgG產品之經改進及更有效方法。
此外，仍然需要產生適合於皮下及/或肌肉內投與之高濃度IgG製劑的方法。
大多數蛋白純化方法都涉及某種形式之層析，其中溶解狀態中之分子(移動相)基於與固體材料(固定相)之化學或物理相互作用的差異來進行分離。凝膠過濾(亦稱為尺寸排阻層析或SEC)使用多孔樹脂材料基於尺寸(亦即物理排阻)來分離分子。在離子交換層析中，根據分子與固相材料之整體離子相互作用(亦即非特異性相互作用)之強度來分離分子。親和層析方法廣泛用於蛋白純化，然而，該方法尚未用於血漿蛋白諸如IgG之大規模、工業規模純化。
親和層析(亦稱為親和純化)依賴於分子之間的特異性結合相互作用。特定配位體被化學固定或「偶合」至固體支持物上，以使得當複雜混合物穿過管柱時，具有針對配位體之特異性結合親和力的彼等分子變得結合。在其他樣品成分被洗掉後，將結合分子自支持物上剝離，從而使其自原始樣品中純化出來。
一系列可用於生產及純化蛋白之親和配位體在此項技術中為已知的。蛋白A及蛋白G為純化人類抗體中最常用捕獲蛋白。然而，蛋白A及蛋白G有幾個缺點，包括其較高成本、較低穩定性、以及藉由水解及釋放肽片段而污染產品之可能性。通常，蛋白A及/或蛋白G衍生親和樹脂不能有效結合人類IgG級分之所有IgG亞類。因此，需要一種有效、較佳緊湊的方法，該方法藉由基於互補結合原理將蛋白A或蛋白G衍生樹脂與一或多種IgG結合樹脂組合，從而允許結合更廣泛範圍之人類IgG亞類。
本發明藉由提供用於生產IgG之高效、有效層析方法來滿足此等及其他需求，在一個實施例中，該方法避免了血漿產品領域中目前標準的嚴格、耗時乙醇分級製程。
仍然需要自原料中純化IgG的更高效、快速及高產製程。由於單個IgG同功型之特徵在於對其偶聯表位之不同親和力，因此允許輕鬆捕獲及/或純化一或多種同型之方法將使得治療性IgG製劑中之特定同型之親和力得以增強並利用。本發明藉由提供對含有一或多種IgG同功型之原料進行IgG特異性親和層析的新方法來提供此等及其他優點。
非常意外地，本發明者已經發現，藉由對血漿產物起始材料例如低溫上清液執行兩個或兩個以上親和力捕獲層析步驟，可以以快速、高效及高產方式生產具有與血漿IgG亞型分佈幾乎一致的IgG亞型概況的高純度(例如，＞80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%) IgG產品。因此，本發明提供了一種用於生產具有與目前經批准、市售IgG調配物基本一致的IgG亞型概況、雜質概況及其組合的IgG調配物之方法，並且無需訴諸經典血漿分級技術(例如，Cohn分級)。此意外發現代表了自大量血漿中分離IgG級分領域中之重大進步。
在一個示例性實施例中，提供了一種包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質的IgG水溶液，其中IgG水溶液包含小於約0.0025 E/mg總IgG，較佳小於約0.0020 E/mg總IgG，更佳小於約0.0015 E/mg總IgG，最佳小於約0.0012 E/mg總IgG之活性的因子XI作為雜質。在另一示例性實施例中，提供了包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質的IgG水溶液，其中IgG水溶液包含小於約3.5 µg/mg總IgG，較佳小於約3.0 µg/mg總IgG，更佳小於約2.5 µg/mg總IgG，最佳小於約2.2 µg/mg總IgG之水準的補體C3作為雜質。在示例性實施例中，提供了一種包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質的IgG水溶液，其中IgG水溶液包含補體C3及因子XI作為雜質，其中補體C3以小於約3.5 µg/mg總IgG，較佳小於約3.0 µg/mg總IgG，更佳小於約2.5 µg/mg總IgG，最佳小於約2.2 µg/mg總IgG之水準存在，並且其中因子XI以小於約0.0025 E/mg總IgG，較佳小於約0.0020 E/mg總IgG，更佳小於約0.0015 E/mg總IgG，且最佳小於約0.0012 E/mg總IgG之活性包含在內。在示例性實施例中，提供了一種包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質的IgG水溶液，其中補體C3以小於約2.5 µg/mg總IgG之水準存在，並且其中因子XI以小於約0.0015 E/mg總IgG之活性存在。
本發明之一個實施例係關於一種親和層析方法，該方法自含有IgG之起始材料製備IgG調配物，該調配物包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4中之一或多者之任意組合。在一個示例性實施例中，該方法提供了具有預定IgG亞型模式/比率、預定雜質模式及其組合之IgG調配物。在一個示例性實施例中，模式/比率與血漿IgG亞型分佈之模式/比率基本一致。
既令人驚訝又出乎意料地，第二管柱，亦即蛋白A管柱之後的管柱，結合了大部分未結合至蛋白A管柱上的IgG亞型。在一個示例性實施例中，第二管柱上之介質為抗體。示例性抗體包括彼等能夠結合至一或多個IgG亞類之共同區域之抗體。抗體可以為全長單株抗體或抗體片段(例如，Fab、Fab2、單鏈、駱駝科動物抗體片段或肽)。在一個示例性實施例中，該管柱為CaptureSelect™ CH1-XL親和基質(ThermoFisher)，或具有類似IgG結合選擇性之管柱。
本發明之另一個意外結果係發明者發現，可以對結合至管柱上之蛋白材料進行管柱上溶劑/去污劑病毒滅活(SD_VI)步驟，而不會對該過程之分離方面之保真度產生有害影響。藉由將SD_VI步驟直接併入已建立之單元操作中，而不是作為獨立步驟對自層析介質中分離之材料來執行，該發現進一步增強本發明製程之有效性及緊湊性，尤其相對於此項技術中標準的分級程序而言。事實上，更意外地，將管柱上SD_VI步驟併入純化中時IgG調配物之純度得以提高，因為預計該步驟不會產生除了病毒滅活之外的效果。SD_VI步驟消耗或移除病毒源性雜質之外的雜質。
在示例性實施例中，SD_VI步驟消耗或移除白蛋白、載脂蛋白A-I、補體C3、血紅素結合素、纖維蛋白原、補體C4-B、補體C1s次組分、補體C1r次組分、載脂蛋白B-100、α-2-巨球蛋白中之至少一或多者。在一個示例性實施例中，此等雜質存在於來自SD_VI步驟之洗滌液中。
在各種實施例中，SD_VI步驟在將靶治療性蛋白(例如，IgG)捕獲在層析介質上並產生穿流的IQEQ步驟之後，並且在自層析介質溶析靶治療性蛋白之前執行。
本發明之示例性方法可依序進行，或作為使用兩種或兩種以上不同IgG結合親和樹脂之陣列(串聯陣列)的單個單元操作來進行或在允許全自動連續層析之滑行裝置上進行。該原理不限於IgG，亦可用於純化其他蛋白，例如血漿蛋白，例如白蛋白、A1PI、FVIII等。
本文所述之本發明之示例性實施例提供以下優點：與使用單一蛋白A或蛋白G衍生純化、或另一種IgG結合親和純化的方法相比，自具有廣泛範圍之IgG亞類組成的原料例如血漿及/或血漿級分(例如低溫沉澱物上清液)中純化免疫球蛋白例如人類IgG級分係更好的。所獲得IgG亞類組成之較高純度有利於顯著減少單元操作，以便將經純化之IgG產品最終製成可投與藥物。
示例性方法包括(a)使含有IgG之起始材料與第一層析介質接觸，該第一層析介質包含結合有蛋白A之第一固體支持物，從而形成具有蛋白A結合親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，並形成包含不與蛋白A結合之IgG亞類的第一穿流；(b)使第一穿流與第一親和配位體層析介質接觸，該介質包含第二固體支持物，該第二固體支持物具有與其結合之具有IgG結合親和力之第一親和配位體，從而形成第一親和配位體結合之IgG亞類及包含不與第一親和配位體結合IgG亞類結合之IgG亞類的第二穿流；(c)自第一層析介質溶析蛋白A結合級分，從而形成第一溶析液並將第一溶析液與第一親和配位體層析介質接觸，從而形成第二親和配位體結合IgG亞類，及第二穿流；及(d)自第一親和配位體管柱溶析選自第一親和配位體結合之IgG亞類、第二親和配位體結合之IgG亞類及其組合之成員，從而形成第二溶析液。
示例性親和配位體層析介質包括VHH抗體片段。
在一個示例性實施例中，該方法進一步包括(e)第一穿流及第二溶析液在第一親和配位體層析介質上合併。
在一個示例性實施例中，該方法包括(f)使(d)之第二溶析液與第二親和配位體層析介質接觸，該第二親和配位體層析介質包含第三固體支持物，該第三固體支持物具有與其結合之具有IgG親和力之第二親和配位體，從而形成第三親和配位體結合IgG亞類及包含未結合至第二親和配位體層析介質之第四IgG亞類的第二穿流；及(g)自第二親和配位體層析介質溶析選自第二親和配位體結合之IgG亞類、第四IgG亞類及其組合之成員，從而形成第三溶析液。
在一個示例性實施例中，該方法在(g)之前包括(h)在第二親和配位體層析介質上合併第一穿流及第二溶析液。
在各種實施例中，該方法在(b)之前包括(i)使第一層析介質與緩衝液/去污劑混合物接觸，該混合物不會自第一層析介質中溶析具有蛋白A結合親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分。
在一些實施例中，該方法在(g)之前包括(j)，使第二親和配位體層析介質與緩衝液/去污劑混合物接觸，該混合物不自第二親和配位體層析介質溶析第二親和配位體結合之IgG亞類。
本發明之一個示例性態樣係關於一種親和層析方法，該方法自缺乏蛋白A結合IgG亞類之血漿源性IgG溶液中製備富含具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類的IgG調配物。該方法包括(a)使缺乏蛋白A結合IgG亞類之IgG溶液與第一親和配位體層析介質接觸，該介質包含第一固體支持物，該第一固體支持物具有與其結合之具有IgG結合親和力之第一親和配位體，從而形成具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之第一結合級分及第一穿流；及(b)溶析具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之第一結合級分，從而形成包含富含具有低蛋白A結合之第一IgG亞類之IgG調配物的第一溶析液。
在一個示例性實施例中，該方法進一步在(b)之前包括(c)，使具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之第一結合級分與緩衝液/去污劑溶液接觸，並且隨後自第一親和配位體層析介質中移除去污劑溶液。
在一個示例性實施例中，該方法進一步在(b)之後包括(d)，使第一溶析液與第二層析介質接觸，該第二層析介質包括固體支持物，該固體支持物具有與其結合之親和配位體，該配位體對具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類具有親和力，從而形成具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類之第一結合級分；及(e)自第二層析介質溶析具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類之第一結合級分，從而形成第二溶析液。
在一些實施例中，該方法進一步在(e)之前包括(f)，使具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類之第一結合級分與緩衝液/去污劑溶液接觸，並且隨後自第一層析介質中移除去污劑溶液。
在各種實施例中，該方法進一步在(a)之前包括(g)，使血漿源性IgG溶液與包含結合至固體支持物上之蛋白A之蛋白A層析介質接觸，形成對蛋白A具有高親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，及富含具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之IgG調配物。
在一個示例性實施例中，該方法進一步包括(h)自蛋白A層析介質溶析對蛋白A具有高親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，形成第三溶析液。
示例性方法包括合併第一溶析液、第二溶析液及第三溶析液中之兩者或兩者以上的步驟。
根據以下詳細描述、附圖及申請專利範圍，將明瞭本發明之其他態樣及優點。
A. 介紹
本文提供了使用包含至少一種基於親和配位體之親和層析方法的製程自原料中純化一或多種IgG同功型之示例性實施例。本發明之示例性IgG製劑由含有IgG之起始材料例如低溫沉澱物上清液製備，並提供包含經純化免疫球蛋白之IgG調配物。
示例性方法包括(a)使含有IgG之起始材料與第一層析介質接觸，該第一層析介質包含結合有蛋白A之第一固體支持物，從而形成具有蛋白A結合親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，並形成包含不與蛋白A結合之IgG亞類的第一穿流；(b)使第一穿流與第一親和配位體層析介質接觸，該介質包含第二固體支持物，該第二固體支持物具有與其結合的具有針對選定免疫球蛋白之結合親和力之第一親和配位體，從而形成第一親和配位體結合之IgG亞類及包含不與第一親和配位體結合之IgG亞類的第二穿流；(c)自第一層析介質溶析蛋白A結合級分，從而形成第一溶析液並將第一溶析液與第一親和配位體層析介質接觸，從而形成第二親和配位體結合IgG亞類，及第二穿流；及(d)自第一親和配位體管柱溶析選自第一親和配位體結合之IgG亞類、第二親和配位體結合之IgG亞類及其組合之成員，從而形成第二溶析液。
基於蛋白A之層析介質不能以類似效率結合所有亞類之IgG。在示例性實施例中，本發明提供使用基於親和配位體之親和樹脂自血漿起始材料中分離及/或純化IgG級分及IgG亞型之方法及系統。用於本發明之示例性樹脂包括最近開發用於抗體融合蛋白純化之樹脂。彼等樹脂在不同位點(模式)結合IgG，因此可用於補充及增強蛋白A樹脂之使用，或克服基於蛋白A之樹脂之缺點。
此外，本發明之基於親和層析之方法可以以連續或半連續模式來編排，從而實現高通量。
示例性實施例包括專用洗滌步驟及管柱上溶劑/去污劑、病毒滅活步驟(「管柱上」SD_VI處理)，從而與傳統IgG分級及純化相比，減少了單元操作之總數。管柱上SD_VI步驟可以在陣列中之任何管柱或超過一個管柱上執行。
本發明之示例性製程包括至少兩個病毒滅活/消除步驟(例如專用SD_VI、酸性保持步驟、奈米過濾35 nm)。
在各種實施例中，本發明亦提供了使用本發明之方法及/或系統產生之IgG製劑。 B. 定義
儘管本文使用之術語被視為普通熟習此項技術者所熟知，但本文闡述定義以有助於解釋本文所揭示之標的物。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習本文揭示之標的物所屬之技術者通常所理解相同的含義。儘管與本文所述之方法、裝置及材料類似或等效之方法、裝置及材料可用於本文揭示之標的物之實踐或測試，但本文描述代表性方法、裝置及材料。
當在本申請案(包括申請專利範圍)中使用時，術語「一個(種)(a/an)」及「該」係指「一或多個(種)」。當在申請專利範圍及/或說明書中與術語「包括」一起使用時，措詞「一個(種)(a/an)」之使用可能表示「一個(種)」，但它亦與「一或多個(種)」、「至少一個(種)」及「一個(種)或一個(種)以上」之含義一致。
對本揭示案之單數特徵或限制之所有提及應包括相應複數特徵或限制，反之亦然，除非另有說明或在進行提及之上下文中明確暗示相反。
如本文所用之方法或製程步驟之所有組合可以以任何順序執行，除非另有說明或在產生所提及組合之上下文中明確暗示相反。
本揭示案之方法及裝置，包括其組件，可以包括本文描述之實施例之基本要素及限制以及本文描述或在其他方面有用的任何附加或可選組件或限制、由上述項目組成或基本上由上述項目組成。
除非另有說明，否則在說明書及申請專利範圍中使用之所有表示物理尺寸、成分之數量、性質諸如反應條件等之數字應理解為在所有情況下由術語「約」來限定。因此，除非有相反指示，否則本說明書及申請專利範圍中給出之數值參數為近似值，它們可以根據本文揭示之標的物尋求獲得之期望性質而變化。
如本文所用，範圍可以表示為自「約」一個特定值，及/或至「約」另一個特定值。亦應當理解，存在許多本文揭示之值，並且除了該值本身之外，每個值在本文中亦被揭示為「約」彼特定值。例如，如果揭示值「10」，則亦揭示「約10」。亦應當理解，亦揭示了兩個特定單元之間的每個單元。例如，如果揭示了10及15，則亦揭示了11、12、13及14。
為了清楚起見，沒有示出及描述本文描述之實行方案之所有常規特徵。可以理解，在任何此類實際實行方案之開發中，為了達成開發人員之特定目標，例如順應應用相關之限制及業務相關之限制，做出了許多實行方案特定決策，並且此等特定目標將在各個實行方案之間，以及在開發人員之間有所不同。此外，應當理解，此開發工作可能為複雜且耗時的，但是對於受益於本揭示案之普通熟習此項技術者而言，仍然為工程設計之例行任務。
在不脫離示例性實施例之精神及範圍的情況下，可以對本揭示案中闡述之示例性實施例進行許多修改及變化，此對熟習此項技術者而言為顯而易見的。本文所述之具體示例性實施例僅以示例方式提供，並且本揭示案僅受所附申請專利範圍之條款以及此等申請專利範圍有權享有之均等物之全部範圍限制。
除非另有定義，本文使用之所有技術及科學術語具有與普通熟習此項技術者(例如，在細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術及生物化學中)通常所理解相同的含義。標準技術用於分子、遺傳及生化方法(一般參見Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.及Ausubel等人 Short Protocols in Molecular Biology (1999)第4版，John Wiley & Sons, Inc.，其以引用方式併入本文)及化學方法。此外，對於標準免疫學技術，參考Harlow及Lane, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, N.Y.。
如本文所用之術語「含IgG起始材料」包括血漿、非低溫血漿、用於血漿分級過程之級分，例如Cohn級分，及重組IgG製劑，以及用於所揭示製程的包括一或多種IgG之其他原料來源。在一些實施例中，該術語係指含有人類IgG之起始材料，但本發明不限於使用含有人類源性IgG之起始材料。
如本文所用之術語「低蛋白A結合親和力」係指不結合至包含固定化蛋白A之層析介質或容易自該介質上洗掉之Ig物質。具有低蛋白A結合親和力之示例性物質係其中結合級分在高於5之pH下基本上完全自蛋白A管柱溶析，溶析液具有大於約5mS/cm之電導率，或其組合的物質。
如本文所用，「抗體」係指基本上由一或多個免疫球蛋白基因或其片段編碼之多肽，其特異性結合並識別分析物(抗原)。公認免疫球蛋白基因包括卡帕(kappa)、蘭姆達(lambda)、阿爾法(alpha)、伽瑪(gamma)、德爾塔(delta)、伊普西隆(epsilon)及茉(mu)恆定區基因，以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為卡帕或蘭姆達。重鏈分為伽瑪、茉、阿爾法、德爾塔或伊普西隆，它們又分別定義了免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。
示例性免疫球蛋白(抗體)結構單元由兩對多肽鏈組成，每對具有一條「輕鏈」(約25 kD)及一條「重鏈」(約50-70 kD)。每條鏈之N末端定義了約100至110個或更多個胺基酸之可變區，其主要負責抗原識別。術語可變輕鏈(V L)及可變重鏈(V H)分別指此等輕鏈及重鏈。
術語「抗體」及「免疫球蛋白」可互換使用，在一些實施例中係指包含藉由二硫鍵來互連之至少兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L)的蛋白。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區(本文中縮寫為CH)組成。在一些抗體例如天然存在之IgG抗體中，重鏈恆定區由鉸鏈及三個結構域CHL CH2及CH3組成。在一些抗體例如天然存在之IgG抗體中，各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域(本文中縮寫為CL)組成。VH區及VL區可進一步再分成稱為互補決定區(CDR)之高變區，其穿插有稱為構架區(FR)之較保守的區。各VH及VL由三個CDR及四個FR組成，自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。重鏈及輕鏈之可變區包含與抗原相互作用之結合結構域。重鏈可能有或沒有C末端離胺酸。術語「抗體」可包括雙特異性抗體或多特異性抗體。示例性親和配位體為抗體或其片段。
示例性抗體(免疫球蛋白)包括人類IgA、IgD、IgG、IgE或IgM。抗體可以為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4抗體。在一些實施例中，如本文所用，「IgG」具有天然存在之IgG抗體之結構，亦即，它具有與相同亞類之天然存在之IgG抗體相同數量之重鏈及輕鏈以及二硫鍵。例如，IgG抗體可能由兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)組成，其中兩條HC及LC分別由天然存在之Ig抗體中出現之相同數量及位置之二硫橋鍵連接(除非抗體已發生突變以修飾二硫橋鍵)。
免疫球蛋白可以來自任何通常已知同功型，包括但不限於IgA、分泌型IgA、IgG及IgM。IgG同功型在某些物種中分為亞類：在人類中分為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，並且在小鼠中分為IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。免疫球蛋白，例如IgG1，存在於幾種同種異型中，它們最多在幾個胺基酸上彼此不同。「抗體」包括例如天然存在及非天然存在之抗體；單株抗體及多株抗體；嵌合抗體及人源化抗體；人類及非人類抗體以及全合成抗體。
駱駝科動物抗體有時用於親和純化程序。很大一部分駱駝科動物抗體為單結構域抗體，它們藉由沒有輕鏈的單個重鏈結合結構域與其抗原相互作用。該結構域亦稱為「VHH」或「VHH抗體」或「VHH結構域」。重組VHH抗體呈現最小尺寸之完整抗原結合結構域。VL結構域之不存在允許VHH抗體獲得比與VL結構域締合之VH結構域更高的結構撓性。此外，VHH之互補決定區(CDR)，尤其CDR3，在統計學上比習知VH-VL抗體更長(Muyldermans S., J. Biotechnol., 2001, 74, 277-302)。
示例性親和配位體為VHH配位體。「VHH配位體」係指源自駱駝科動物之單結構域重鏈抗體或抗體片段。一般而言，VHH配位體具有源自天然缺乏輕鏈之免疫球蛋白之重鏈，該重鏈連接在一起形成多價單一多肽，該多肽保留了母體完整免疫球蛋白之抗原結合親和力，但其尺寸小得多，因此免疫原性更少。VHH配位體在例如Frenken等人, J. Biotechnol. 78:11-21 (2000)、van der Linden等人, Biochem Biophys. Acta. 1431: 37-46 (1999)、Spinelli等人, Biochemistry 39:1217-1222 (2000)、美國專利申請公開案第20030078402號、第2004/0142432號及美國專利第6,399,763號及第6,670,453號中詳細描述。
在本發明方法中用作層析親和配位體之示例性VHH抗體(及片段)包括彼等對至少一種IgG同功型具有親和力之抗體。在本發明之方法中使用之示例性VHH抗體對至少第一IgG同功型之選擇性高於對第二IgG同功型之選擇性。
術語抗體、其片段(或親和配位體，如本文使用)之「抗原結合部分」係指保留特異性結合至抗原之能力的抗體之一或多個片段。已經表明抗體之抗原結合功能可以藉由全長抗體之片段來執行。術語抗體之「抗原結合部分」中涵蓋的結合片段之實例包括：(i) Fab片段(來自木瓜蛋白酶裂解之片段)或由VL、VH、LC及CH1結構域組成之類似單價片段；(ii) F(ab')2片段(來自胃蛋白酶裂解之片段)或包含兩個在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接之Fab片段之類似二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段，(v) dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341:544-546)，其由VH結構域組成；(vi)分離之互補決定區(CDR)及(vii)可以視情況地藉由合成連接子連接的兩個或兩個以上分離CDR之組合。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH由不同基因編碼，但是它們可以使用重組方法藉由合成連接子來連接，該連接子使它們能夠製成單個蛋白鏈，其中VL及VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見，例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426；及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此類單鏈抗體亦意欲包含在術語抗體之「抗原結合部分」內。此等抗體片段可使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，並且該等片段可以與完整抗體相同之方式針對效用來進行篩選。抗原結合片段可藉由重組DNA技術或藉由抗體之酶促或化學裂解來產生。
如本文所用，術語「超濾(UF)」涵蓋多種膜過濾方法，其中靜水壓力迫使液體抵靠半透膜。懸浮固體及高分子量之溶質得以保留，而水及低分子量溶質穿過膜。該分離過程常用於純化及濃縮大分子(10 3-10 6Da)溶液，尤其蛋白溶液。根據所保留分子之大小，可以使用多種超濾膜。超濾藉由1與1000 kDa之間之膜孔徑及0.01與10巴之間之操作壓力來表徵，特別適用於自小分子例如糖及鹽中分離膠體例如蛋白。
如本文所用，術語「滲濾」使用與超濾相同之膜進行並且為切向流過濾。在滲濾過程中，將緩衝液引入循環罐，同時自單元操作中移除濾液。在產品處於滲餘物(例如IgG)中之製程中，滲濾將產品池中之成分沖洗到濾液中，從而交換緩衝液並降低不需要之物質之濃度。
術語「層析」係指將所關注之蛋白(例如，抗體)與存在於混合物中之其他分子(例如，污染物)分離之技術。通常，由於混合物之各個分子在移動相的影響下穿過固定介質遷移之速率不同，或在結合及溶析過程中，所關注之蛋白與其他分子(例如污染物)分離。術語「基質」或「層析基質」在本文中可互換使用，並且係指在分離過程中將所關注之蛋白(例如，含有Fc區之蛋白，例如免疫球蛋白)與混合物中存在之其他分子分離的任何種類之吸附劑、樹脂或固相。非限制性實例包括顆粒狀、整體狀或纖維狀樹脂以及可放入管柱或濾筒中之膜。形成基質之材料之實例包括多醣(例如瓊脂糖及纖維素)；及其他機械穩定之基質，例如二氧化矽(例如，可控孔隙玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯醯胺、陶瓷顆粒及上述任何物質之衍生物。適用於本揭示案之方法之典型基質類型之實例為陽離子交換樹脂、親和樹脂、陰離子交換樹脂或混合模式樹脂。「配位體」為連接至層析基質並決定基質結合性質之官能基。「配位體」之實例包括但不限於離子交換基團、疏水相互作用基團、親水相互作用基團、親硫相互作用基團、金屬親和基團、親和配位體、生物親和基團及混合模式基團(上述之組合)。可用於本文之一些較佳配位體包括但不限於強陽離子交換基團，例如磺丙基、磺酸；強陰離子交換基團，如三甲基氯化銨；弱陽離子交換基團，如羧酸；弱陰離子交換基團，諸如N5N二乙胺基或DEAE；疏水相互作用基團，例如苯基、丁基、丙基、己基；及親和配位體，例如蛋白A、蛋白G及蛋白L。
術語「親和層析」係指一種蛋白分離技術，其中所關注之蛋白(例如，所關注之含有Fc區之蛋白或抗體)特異性結合至對所關注之蛋白具有特異性之配位體。此配位體通常稱為親和或生物特異性配位體。在一些實施例中，親和配位體(例如，蛋白A或其功能變體)共價連接至層析基質材料，並且當溶液接觸層析基質時，可被溶解狀態中的所關注之蛋白所接近。所關注之蛋白通常在層析步驟期間保留其對親和配位體之特異性結合親和力，而混合物中之其他溶質及/或蛋白不會明顯或特異性地結合至配位體。所關注之蛋白與固定化配位體之結合允許污染蛋白或蛋白雜質穿過層析基質，而所關注之蛋白仍然與固相材料上之固定化配位體特異性結合。然後在合適條件(例如，低pH、高pH、高鹽、競爭配位體等)下，自固定化配位體中以活性形式移除特異性結合的所關注蛋白，並使其與溶析緩衝液一起穿過層析管柱，不含先前允許穿過管柱之污染蛋白或蛋白雜質。任何組分都可以用作純化其各自特異性結合蛋白例如抗體的配位體。然而，在根據本揭示案之各種方法中，蛋白A、G、A/G及/或L用作含有Fc區之靶蛋白之配位體。普通熟習此項技術者可以容易地確定用於自親和配位體(例如，蛋白A)溶析靶蛋白(例如，含有Fc區之蛋白)之條件。在一些實施例中，蛋白G或蛋白L或其功能變體可用作生物特異性配位體。在一些實施例中，生物特異性配位體諸如蛋白A在5-9之pH範圍內用於結合含有Fc區之蛋白，洗滌或再平衡生物特異性配位體/靶蛋白偶聯物，隨後用含有至少一種鹽的具有約為或低於4之pH值之緩衝液來溶析。
術語「親和配位體」係指能夠捕獲一或多種IgG物質之配位體。示例性親和配位體為物種混合物中之一種IgG物質選擇性的，並且使用包含親和配位體之管柱、過濾器或其他介質提供了一種方法，藉由該方法可以自含有一或多種IgG物質之混合物中純化一或多種IgG物質。示例性親和配位體為VHH抗體或其片段。
如本文可互換使用之術語「純化」、「分離」或「隔離」係指增加來自包含所關注蛋白及一或多種雜質之組成物或樣品的所關注蛋白之純度。通常，藉由自組成物中移除(完全或部分)至少一種雜質來增加所關注蛋白之純度。「純化」及其等同物係指為了將治療性蛋白與一或多種其他雜質(例如，大塊雜質)或存在於含有治療性蛋白之流體中之成分(例如，血漿、Cohn級分、液體培養基蛋白或哺乳動物細胞中存在或分泌之一或多種其他成分(例如，DNA、RNA、其他蛋白、內毒素、病毒等))分離，所執行的一或多個步驟。例如，可以在初始捕獲步驟期間或之後進行純化。可以使用結合治療性蛋白或污染物之樹脂、膜或任何其他固體支持物進行純化(例如，藉由使用親和層析、疏水相互作用層析、陰離子或陽離子交換層析或分子篩層析)。可以使用至少一個層析管柱及/或層析膜(例如，本文所述之任何層析管柱或層析膜)自含有治療性蛋白之流體中純化治療性蛋白。
例如，可以藉由移除污染性非免疫球蛋白的蛋白來純化免疫球蛋白；它們亦藉由移除IgG以外之免疫球蛋白來進行純化。移除非免疫球蛋白的蛋白及/或移除IgG以外之免疫球蛋白導致原料中所需IgG之百分比增加。純度可以藉由此項技術中已知或本文描述之標準檢定來量測，其實例包括SDS-PAGE，繼之以考馬斯藍染色以及層析方法(例如，在HPLC系統上之尺寸排阻層析(SEC))。IgG樣品之純度可以在例如使用Kodak Image Station 1000或等效系統來掃描後，自SDS PAGE凝膠計算，或在Shimadzu HPLC系統上藉由軟體來分析SEC層析圖。如果樣品至少90%、95%或99%不含除了所需產物(例如免疫球蛋白)以外的成分，則該樣品被視為純的。
較佳地，該方法產生至少80%、85%、90%、95%或99%或更高純度之Ig製劑。「純」係指其中污染性非Ig蛋白得以減少的一或多種Ig同功型之製劑，或者它係指其中污染性第二同功型Ig基本上不存在的第一Ig同功型之製劑。在一個示例性實施例中，本發明提供了一種IgG亞型製劑，相對於僅使用蛋白A來純化之亞型之製劑而言，該製劑富含該亞型。
術語「捕獲」係指為了相對於含有蛋白之混合物，例如含有IgG之起始材料中存在的一或多種其他成分，部分純化或分離(例如，以重量計，至少或約5%，例如，至少或約10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、至少約95%或至少約99%純)，視情況濃縮，並視情況穩定化治療性蛋白而進行的步驟。通常，捕獲使用結合治療性蛋白之樹脂來進行(例如，藉由使用親和層析)。自液體中捕獲治療性蛋白之非限制性方法在本文中有所描述，並且其他方法在此項技術中為已知的。可以使用至少一個層析管柱及/或層析膜(例如，本文所述之任何層析管柱及/或層析膜)自液體介質中捕獲治療性蛋白。在一個示例性實施例中，本發明提供了一種藉由在親和柱(蛋白A除外)上捕獲一或多種所需同功型及/或亞型或除了需要富集之同功型及/或亞型以外的一或多種同功型及/或亞型來使製劑富含所選Ig同功型或IgG亞型的方法。
本文所用之術語「緩衝液」係指如下物質，由於其在溶液中之存在，使必須添加以引起pH值之單位變化的酸或鹼之量得以增加。緩衝溶液藉由其酸-鹼偶聯成分之作用來抵抗pH值之變化。與生物試劑一起使用之緩衝溶液通常能夠維持恆定氫離子濃度，使得溶液之pH值在生理範圍內。傳統緩衝液成分包括但不限於有機及無機鹽、酸及鹼。
如本文所用之與層析相關之術語「層析管柱」或「管柱」係指填充有層析基質或樹脂之容器，其通常呈圓柱體或空心柱之形式。層析基質或樹脂係提供用於純化之物理及/或化學性質之材料。
本文所用之術語「穿流」或「穿流模式」係指其中污染物在層析過程中自混合物中移除的一般純化方法，因為它們通常在與管柱中之層析介質結合的情況下被層析過程保留。因為所關注蛋白不與層析介質(通常管柱中之層析介質)結合(或與污染物相比，其不太強地結合)，而是徑直流過以待收集，所以其得以純化。「穿流」亦指自該層析模式收集之液體。在含有所關注蛋白之液體介質自管柱中流過後，視情況地將結合至管柱上之雜質「剝離」或自管柱中移除，使得管柱可以再生以便用於另一次層析運行。此方法不同於「結合及溶析」或「結合及溶析模式」，其中所關注之靶蛋白保留在管柱內之層析介質上，並且雜質徑直流過管柱。然後，該過程涉及使用不同管柱條件對所關注之蛋白進行特異性溶析，此等條件會干擾所關注之蛋白與管柱中之通常為樹脂之層析介質的結合。
術語「精製」為技術術語，並且係指為了自含有接近最終所需純度之治療性蛋白之流體中移除殘留痕量或少量污染物或雜質而進行的步驟。例如，可以藉由使含有IgG之流體穿過層析管柱或膜吸收器來進行精製，此等層析管柱或膜吸收器選擇性地結合至含有靶治療蛋白之流體中存在之IgG (靶治療蛋白)或少量污染物或雜質。在此實例中，層析管柱或膜吸收器之溶析液/濾液含有治療性蛋白。
如本文所用，術語「污染物」或「雜質」以其最廣泛含義使用以涵蓋混合物中之任何不需要成分或化合物。污染物蛋白包括但不限於由供體或宿主細胞天然產生之彼等，以及與所關注蛋白相關或衍生自所關注蛋白之蛋白(例如，蛋白水解片段)及其他製程相關污染物。在某些實施例中，污染物沉澱物使用例如離心、無菌過濾、深度過濾及切向流過濾的另一種方法自細胞培養物中分離出來。在各種實施例中，污染物係需要藉由實施本發明之方法來製造一種製劑而在該製劑中富集之同功型或IgG亞型以外的Ig同功型或及IgG亞型。在所揭示製程中消除或移除之示例性污染物包括白蛋白、載脂蛋白A-I、補體C3、血紅素結合素、纖維蛋白原、補體C4-B、補體C1s次組分、補體C1r次組分、載脂蛋白B-100、α-2-巨球蛋白中之一或多者。在一個示例性實施例中，此等污染物在管柱上溶劑/去污劑步驟期間被移除。
術語「加載緩衝液」係指為了製備混合物或其他樣品並將其加載至層析單元中而使用的緩衝液。
如本文所用，「溶析液」係指自層析管柱或層析膜中流出之液體，其含有可偵測量之蛋白。
如本文所用，「治療性藥物物質」係指包含蛋白例如IgG之物質，該蛋白藉由本發明之方法自污染性蛋白、脂質及核酸(例如，存在於液體培養基中或來自宿主細胞(例如，來自哺乳動物、酵母或細菌宿主細胞)之污染性蛋白、脂質及核酸及生物污染物(例如，病毒及細菌污染物))中充分富集、純化或分離。可將示例性治療藥物物質配製成藥劑而無需任何進一步實質性純化及/或淨化步驟。
術語「單元操作」係指可以在自原料製造治療性蛋白藥物物質之本發明製程中執行之功能步驟。例如，單元操作可以係過濾(例如，自含有治療性蛋白之流體中移除污染物細菌、酵母病毒或分枝桿菌及/或特定物質)、捕獲、層析、純化、保持或儲存、精製、病毒滅活、調節含有治療性蛋白之液體之離子濃度及/或pH值，及/或移除不需要之鹽。
在一些實施例中，本文揭示之層析系統在滑行裝置上。如本文所用，「滑行裝置」係指可用作本文所述系統之平台或支持物的三維實體結構。如果滑行裝置包括一或多個能夠運動之結構(例如，輪子、輥輪或類似結構)，則滑行裝置可以賦予系統或其一部分移動性。
術語「多管柱層析系統」或「MCCS」係指具有總共兩個或兩個以上互連或切換層析管柱及/或層析膜的系統。多管柱層析系統之非限制性實例係週期性逆流層析系統(PCC)，其包含總共兩個或兩個以上互連或切換層析管柱及/或層析膜。多管柱層析系統之其他實例在本文中描述並且在此項技術中為已知的。本發明之示例性MCCS包括與親和配位體管柱流體連接之蛋白A管柱，該親和配位體管柱本身可以直接或間接與一或多個另外親和配位體管柱流體連接。
在一些實施例中，該等方法及系統具有加載至第一管柱上之原料中所含蛋白之量之至少約40%、50%、55%或60%及最多約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或至少約99%的來自所需蛋白例如IgG或另一種選定Ig同功型或IgG亞型之原料之回收率。在一些實施例中，純化回收率為至少約60%至約70%。在一個示例性實施例中，純化回收率為加載至第一管柱上之原料中所含蛋白之量之至少約98%或至少約99%。在各種實施例中，IgG純化回收率為加載至第一管柱上之原料中所含IgG之量之至少約98%或至少約99%。在一個示例性實施例中，IgG1、IgG2、IgG3及/或IgG4中之一或多者之純化回收率為加載至第一管柱上之原料中所含相關IgG之量之至少約98%或至少約99%。
如本文所用，術語「混合」描述藉由任何形式之攪動引起兩種或兩種以上不同化合物或物質在溶液或懸浮液中之分佈的行為。本申請案中使用之術語「混合」所引起的所有成分在溶液或懸浮液中完全均勻分佈為不需要的。
如本文所用，術語「溶劑」包括能夠溶解或分散一或多種其他物質之任何液體物質。溶劑可以在性質上為無機物，諸如水，或其可以為有機液體，諸如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。如術語「溶劑去污劑處理」中所用，溶劑表示有機溶劑(例如磷酸三正丁酯)，其為用於滅活溶液中脂質包膜病毒之溶劑去污劑混合物之一部分。示例性溶劑/去污劑過程在管柱上進行並且除病毒源性污染物以外亦移除血漿蛋白污染物例如上面提到之彼等病毒源性。
如本文所用，術語「去污劑」在本申請案中可與術語「表面活性劑(surfactant/surface acting agent)」互換使用。表面活性劑通常為兩親，亦即包含疏水基團(「尾部」)及親水基團(「頭部」)的有機化合物，從而使得表面活性劑可溶於有機溶劑及水。表面活性劑可以根據其頭部是否存在正式帶電基團進行分類。非離子表面活性劑之頭部沒有電荷基團，而離子表面活性劑之頭部帶有淨電荷。兩性離子表面活性劑之頭部具有兩個帶相反電荷之基團。常見表面活性劑之一些實例包括：陰離子(基於硫酸根、磺酸根或羧酸根陰離子)：全氟辛酸鹽(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂基硫酸銨及其他烷基硫酸鹽、月桂醇聚醚硫酸鈉(亦稱為月桂基醚硫酸鈉，或SLES)、烷基苯磺酸鹽；陽離子(基於季銨陽離子)：鯨蠟基三甲基溴化銨(CTAB)又名十六烷基三甲基溴化銨及其他烷基三甲基銨鹽、氯化鯨蠟基吡啶鎓(CPC)、聚乙氧基化牛脂胺(POEA)、苯紮氯銨(BAC)、芐索氯銨(BZT)；長鏈脂肪酸及其鹽類：包括辛酸鹽、辛酸、庚酸鹽、己酸、庚酸、壬酸、癸酸等；兩性離子(兩性)：十二烷基甜菜鹼；椰油醯胺丙基甜菜鹼；椰油醯兩性基甘胺酸鹽；非離子：烷基聚(環氧乙烷)、烷基酚聚(環氧乙烷)、聚(環氧乙烷)及聚(環氧丙烷)之共聚物(商業上稱為泊洛沙姆(Poloxamer)或泊洛沙胺(Poloxamine))、烷基多葡糖苷，包括辛基葡糖苷、癸基麥芽糖苷、脂肪醇(例如鯨蠟醇及油醇)、椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA、聚山梨酯(吐溫20、吐溫80等)、Triton去污劑及十二烷基二甲基氧化胺。在一個示例性實施例中，去污劑與溶劑組合，並且該組合用於在本發明之方法中對蛋白製劑進行病毒滅活步驟。在各種實施例中，當本發明之製劑處於本發明之方法中使用之層析管柱上時，發生該病毒滅活步驟。
如本文所用，「蛋白A」係指親和配位體，其為最初在金黃色葡萄球菌之細胞壁中發現之49 kDa表面蛋白。該蛋白結合免疫球蛋白，並包含五個同源Ig結合結構域。包括固定化蛋白A之親和層析介質在此項技術中為已知的。如熟習此項技術者所理解，在被視為本發明之範圍內的本文揭示之方法之變型中，可以使用代替或附加於蛋白A的其他親和配位體，例如蛋白G、蛋白A/G及蛋白L。本揭示案之彼等明確揭示蛋白A之部分亦與其中使用代替或附加於蛋白A的蛋白G、蛋白A/G及/或蛋白L中之一或多者之實施例相關。
本文所用術語「不明顯溶析」係指當固定在層析介質上之蛋白質與水溶液(例如緩衝液、溶劑/去污劑或其他混合物)接觸時該水溶液之如下性質，亦即沒有或僅極少量蛋白質藉由該溶液自層析介質上溶析出來。在示例性實施例中，小於約5%、小於約3%、小於約1%或小於約0.1%之蛋白質藉由溶液自層析介質溶析。不明顯溶析蛋白質之示例性溶液係溶劑/去污劑溶液。未藉由溶劑/去污劑溶液自層析介質溶析之示例性蛋白質係IgG。在示例性實施例中，「不明顯溶析」係指小於約5%之固定在層析介質上之IgG藉由與溶劑/去污劑溶液接觸而自層析介質溶析。
本文中標有符號「x」之表項指示相關成分未分析。 C. 縮寫詞
BDS，原料藥；CRS，低溫上清液(在COHN分級中第一次沉澱後之上清液)；CV，管柱體積；DFM，資料檔案管理(協議系統)；E，溶析級分；EDTA，乙二胺四乙酸；EtOH，乙醇；Fc，抗體FC結構域；FT，穿流；HPLC，高效液相層析；IgG，免疫γ球蛋白；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、免疫γ球蛋白亞類1 – 4；IQEQ，平衡緩衝液(示例性IQEQ允許在吸收IgG後，進一步純化來自一或多個親和管柱之穿流之血漿蛋白；例如，10mM乙酸鈉、10mM TrisHCl、120mM NaCl，pH 7.2)；MAB，單株抗體；MWCO，截留分子量；SD_VI，溶劑去污劑-病毒滅活，例如，10 mM乙酸鈉、10 mM TrisHCl、120 mM NaCl及SD_VI_MIX Triton X 10.55 g/聚山梨酯80 3.21 g/TnBP 2.91 g/kg緩衝液)；SEC，尺寸排阻層析；TnBP，磷酸三正丁酯；vWF，von-Willebrand-Factor；W，洗滌級分；WB，蛋白印跡；WSD，洗滌溶劑/去污劑。 C. 實施例
在一個示例性實施例中，本發明係關於一種自原料例如含有IgG之起始材料來製備IgG調配物的親和層析方法，該調配物包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4中之一或多者。該方法包括(a)使原料與第一層析介質接觸，該第一層析介質包含結合有蛋白A之第一固體支持物，從而形成具有蛋白A結合親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，並形成包含不與蛋白A結合之IgG亞類的第一穿流；(b)使第一穿流與第一親和配位體層析介質接觸，該介質包含第二固體支持物，該第二固體支持物具有與其結合的具有IgG結合親和力之第一親和配位體，從而形成第一親和配位體結合之IgG亞類及包含不與第一親和配位體結合IgG亞類結合之IgG亞類的第二穿流；(c)自第一層析介質溶析蛋白A結合級分，從而形成第一溶析液並將第一溶析液與第一親和配位體層析介質接觸，從而形成第二親和配位體結合IgG亞類，及第二穿流；及(d)自第一親和配位體管柱溶析選自第一親和配位體結合之IgG亞類、第二親和配位體結合之IgG亞類及其組合之成員，從而形成第二溶析液。
在一個示例性實施例中，該方法進一步包括(e)第一穿流及第二溶析液在第一親和配位體層析介質上合併。
在一個示例性實施例中，該方法包括(f)使(d)之第二溶析液與第二親和配位體層析介質接觸，該第二親和配位體層析介質包含第三固體支持物，該第三固體支持物具有與其結合之具有IgG親和力之第二親和配位體，從而形成第三親和配位體結合IgG亞類及包含未結合至第二親和配位體層析介質之第四IgG亞類的第二穿流；及(g)自第二親和配位體層析介質溶析選自第二親和配位體結合之IgG亞類、第四IgG亞類及其組合之成員，從而形成第三溶析液。
在一個示例性實施例中，該方法在(g)之前包括(h)在第二親和配位體層析介質上合併第一穿流及第二溶析液。
在各種實施例中，該方法在(b)之前包括(i)使第一層析介質與緩衝液/去污劑混合物接觸，該混合物不會自第一層析介質中溶析具有蛋白A結合親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分。
在一些實施例中，該方法在(g)之前包括(j)，使第二親和配位體層析介質與緩衝液/去污劑混合物接觸，該混合物不自第二親和配位體層析介質溶析第二親和配位體結合之IgG亞類。
示例性實施例包括專用洗滌步驟及管柱上溶劑/去污劑、病毒滅活步驟(「管柱上」SD_VI處理)，從而與傳統IgG分級及純化相比，減少了單元操作之總數。管柱上SD_VI步驟可以在陣列中之任何管柱或超過一個管柱上執行。在各種實施例中，藉由將SD_VI步驟直接併入已建立之單元操作中，而不是作為獨立步驟對自層析介質中分離之材料來執行，管柱上SD_VI進一步增強本發明製程之有效性及緊湊性，尤其相對於此項技術中標準的分級程序而言。事實上，更意外地，將管柱上SD_VI步驟併入純化中時IgG調配物之純度得以提高，因為預計該步驟不會產生除了病毒滅活之外的效果。SD_VI步驟消耗或移除病毒源性雜質之外的雜質。
在各種實施例中，SD_VI步驟在將靶治療性蛋白(例如，IgG)捕獲在層析介質上並產生穿流的IQEQ步驟之後，並且在自層析介質溶析靶治療性蛋白之前執行。
在示例性實施例中，SD_VI步驟消耗或移除白蛋白、載脂蛋白A-I、補體C3、血紅素結合素、纖維蛋白原、補體C4-B、補體C1s次組分、補體C1r次組分、載脂蛋白B-100、α-2-巨球蛋白中之至少一者。在一個示例性實施例中，此等雜質存在於來自SD_VI步驟之洗滌液中。
在一個示例性實施例中，緩衝液/去污劑混合物包括乙酸鹽、Tris、Triton X、磷酸三(正丁基)酯(TnBP)。
在一個示例性實施例中，緩衝液/去污劑混合物包括具有約10 mM乙酸鈉、約10 mM TrisHCl及約120 mM NaCl之緩衝液成分，以及每kg緩衝溶液具有約10.55 g Triton X、3.21 g聚山梨酯80及約2.91 g TnBP之去污劑成分。
本發明之方法及系統提供其中IgG含量相對於原料得以顯著富集之調配物。
在一個示例性實施例中，調配物中之IgG佔本發明IgG調配物蛋白含量之至少約90% wt/wt。
在一個示例性實施例中，調配物中之IgG1佔調配物蛋白含量之約40%至約90% wt/wt。
在一個示例性實施例中，調配物中之IgG2佔調配物蛋白含量之約15%至約55% wt/wt。
在一個示例性實施例中，調配物中之IgG3佔調配物蛋白含量之約0.5%至約50% wt/wt。
在一個示例性實施例中，調配物中之IgG4佔調配物蛋白含量之約0.1%至約20% wt/wt。
本發明之示例性方法提供了高純度IgG調配物。在各種實施例中，本發明提供了一種IgG同功型之高純度調配物。
在一個示例性實施例中，調配物中之白蛋白之量小於約5 g/L，例如小於約2 g/L、小於約1 g/L、小於約0.4 g/L、小於約0.2 g/L、小於約0.1 g/L或小於約0.05 g/L之調配物。
在一個示例性實施例中，調配物中之因子XI活性小於約0.01 E/mLt，例如小於約0.005 E/mLt，例如小於約0.001 E/mLt。
在一個示例性實施例中，調配物中存在之α-2-巨球蛋白之量小於約0.2 g/L，例如小於約0.1 g/L，例如小於約0.05 g/L之調配物。
在一個示例性實施例中，調配物中存在之轉鐵蛋白之量小於約0.4 g/L小於約0.2 g/L，例如小於約0.09 g/L之調配物。
在一個示例性實施例中，調配物之PL1活性小於約10 nm/mL min。
在一個示例性實施例中，調配物中存在之纖維蛋白原之量小於約60 μg/mL，小於約35 μg/mL，例如小於約13 μg/mL之調配物。
在一個示例性實施例中，含有IgG之起始材料為低溫上清液。
在一個示例性實施例中，選自包含具有蛋白A之第一固體支持物之第一層析介質、包含結合有具有IgG結合親和力之第一親和配位體之第二固體支持物的第一親和配位體層析介質及其組合之成員包含在單獨管柱中。
在一個示例性實施例中，本發明提供了一種系統及使用該系統之方法，其中包含蛋白A、一或多種親和配位體層析介質及其組合的層析管柱中之兩者或兩者以上在管柱陣列內流體連通，並且該等管柱中之兩者或兩者以上包含第二層析介質及第二親和配位體層析介質。此等管柱視情況地藉由流體入口、流體出口及將來自一或多個管柱之一或多個出口連接至一或多個管柱之一或多個入口的管道來流體偶合。陣列中之管柱可以串聯、並聯或以此等配置之組合來流體連通。
在一個示例性實施例中，第一管柱之出口與第二管柱之入口流體連通，允許來自第一管柱之溶析液直接加載至第二管柱之入口，並因此加載至其中包含之層析介質上。
在一個示例性實施例中，具有蛋白A之管柱之出口與第一親和配位體層析介質之入口流體連通。
在一個示例性實施例中，包含結合有第一親和配位體之第二層析介質之管柱之出口與包含第二親和配位體層析介質之管柱之入口流體連通。
在各種實施例中，第一管柱之出口可切換地與一或多個第二管柱之入口連通。在一個示例性實施例中，一或多個第一管柱之出口可切換地與一或多個第二管柱之入口連通。
在一個示例性實施例中，缺乏蛋白A結合IgG亞類之IgG溶液包含選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其組合之成員。
在另一個示例性實施例中，第一層析介質對人類IgG抗體之CH1結構域具有選擇性親和力。
在一個示例性實施例中，第一層析介質對選自IgG1及IgG3之成員之CH1結構域具有選擇性親和力，該選擇性親和力大於對選自IgG2及IgG4之成員之CH1結構域之選擇性親和力。
在一個示例性實施例中，自第一層析介質、第一親和配位體層析介質及/或第二親和配位體層析介質溶析使用包含甘胺酸之溶析劑。
在一個示例性實施例中，甘胺酸濃度為約50 mM至約150 mM。在一個示例性實施例中，甘胺酸濃度為約130 mM。
其他溶析劑可用於本發明，包括但不限於檸檬酸鹽、乙酸鹽、MES、pH低於4.0之HCl及其組合。
本發明之一個示例性實施例係關於一種親和層析方法，該方法自缺乏蛋白A結合IgG亞類之血漿源性IgG溶液中製備富含至少具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類的IgG調配物。該方法包括(a)使缺乏蛋白A結合IgG亞類之IgG溶液與第一親和配位體層析介質接觸，該介質包含第一固體支持物，該第一固體支持物具有與其結合之具有IgG結合親和力之第一親和配位體，從而形成具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之第一結合級分及第一穿流；及(b)溶析具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之第一結合級分，形成包含富含具有低蛋白A結合之第一IgG亞類之IgG調配物的第一溶析液。
缺乏蛋白A結合IgG亞類之示例性源性IgG溶液藉由以下方法來製備：使含有IgG之起始材料穿過包含蛋白A之層析介質，使具有蛋白A親和力之一或多個IgG亞類結合，並且通常在穿流中，自層析介質收集對蛋白A沒有足夠親和力以便在此過程中保持與蛋白A結合的彼等IgG亞類。
在一個示例性實施例中，該方法進一步在(b)之前包括(c)，使具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之第一結合級分與緩衝液/去污劑溶液接觸，並且隨後自第一親和配位體層析介質中移除去污劑溶液。
在一個示例性實施例中，該方法進一步在(b)之後包括(d)，使第一溶析液與第二層析介質接觸，該第二層析介質包括固體支持物，該固體支持物具有與其結合之親和配位體，該配位體對具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類具有親和力，從而形成具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類之第一結合級分；及(e)自第二層析介質溶析具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類之第一結合級分，從而形成第二溶析液。
在一些實施例中，該方法進一步在(e)之前包括(f)，使具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類之第一結合級分與緩衝液/去污劑溶液接觸，並且隨後自第一層析介質中移除去污劑溶液。
在各種實施例中，該方法進一步在(a)之前包括(g)，使血漿源性IgG溶液與包含結合至固體支持物上之蛋白A之蛋白A層析介質接觸，形成對蛋白A具有高親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，及富含具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之IgG調配物。
在一個示例性實施例中，該方法進一步包括(h)自蛋白A層析介質溶析對蛋白A具有高親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，形成第三溶析液。
示例性方法包括合併第一溶析液、第二溶析液及第三溶析液中之兩者或兩者以上之步驟。
本發明之示例性方法使用串聯之兩個、三個或更多個管柱。將起始蛋白混合物應用於第一管柱(例如，蛋白A)之入口，然後使預選體積之洗滌溶液穿過該管柱，移除未結合之IgG及雜質，並且在一些實施例中，使混合物中之蛋白群體前進穿過第一管柱並進入一或多個後續管柱。視情況地收集離開最終管柱之穿流。在洗滌循環之後，溶析劑，在一些實施例中弱酸性溶析劑進入第一管柱之入口，將結合至層析介質之蛋白群體溶析至第二管柱中，使結合至第二柱管中之層析介質之蛋白群體穿過裝置之末端，或者在一些實施例中，進入填充有第三層析介質之第三管柱，諸如此類。在溶析步驟中，將與第一管柱中之層析介質(例如，第二親和配位體介質)結合之蛋白群體自該介質中解吸，進入第二管柱中並與第二管柱中之第二層析介質結合。吸附至第二介質上之蛋白亦如此，在存在第三管柱之實施例中其被解吸並進入第三管柱，在不存在第三管柱之彼等實施例中視情況地在第二管柱之末端處得以收集，或在第三管柱之末端處得以收集。視情況地對第三管柱及後續管柱重複上述過程。
在一個示例性實施例中，來自每個管柱或管柱之子集的穿流及/或溶析液可以在加載至後續管柱上之前單獨收集或匯集。使用串聯管柱之組合及一或多個單獨管柱之實施例亦在本發明之範圍內。
本文亦提供了藉由本發明之方法製備之IgG調配物。在一個示例性實施例中，調配物具有與人類血漿基本一致之IgG亞型概況。在一個示例性實施例中，調配物具有與人類血漿基本一致之雜質概況。在一個示例性實施例中，調配物具有與商業多株IgG調配物例如Gammagard液體、Kiovig、Cuvitru基本一致之IgG亞型概況及雜質概況。
根據本發明之IgG水溶液可以藉由一或多個離子交換步驟並藉由將其配製成最終醫藥學上可接受之調配物來進一步處理。
在一個示例性實施例中，提供了一種包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質的IgG水溶液，其中IgG水溶液包含小於約0.0025 E/mg總IgG，較佳小於約0.0020 E/mg總IgG，更佳小於約0.0015 E/mg總IgG，最佳小於約0.0012 E/mg總IgG之活性的因子XI作為雜質。
在示例性實施例中，提供了包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質的IgG水溶液，其中IgG水溶液包含小於約3.5 µg/mg總IgG，較佳小於約3.0 µg/mg總IgG，更佳小於約2.5 µg/mg總IgG，最佳小於約2.2 µg/mg總IgG之水準的補體C3作為雜質。
在示例性實施例中，提供了一種包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質的IgG水溶液，其中IgG水溶液包含補體C3及因子XI作為雜質，其中補體C3以小於約3.5 µg/mg總IgG，較佳小於約3.0 µg/mg總IgG，更佳小於約2.5 µg/mg總IgG，最佳小於約2.2 µg/mg總IgG之水準存在，並且其中因子XI以小於約0.0025 E/mg總IgG，較佳小於約0.0020 E/mg總IgG，更佳小於約0.0015 E/mg總IgG，最佳小於約0.0012 E/mg總IgG之活性存在。在示例性實施例中，提供了一種包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質的IgG水溶液，其中IgG水溶液包含補體C3及因子XI作為雜質，其中補體C3以小於約2.5 µg/mg總IgG之水準包存在，並且其中因子XI以小於約0.0015 E/mg總IgG之活性存在。
以下實例用於說明本發明之某些示例性實施例，不應被解釋為以任何方式限制本發明之範圍。評估了親和純化方法開發與當前可用IgG產品等效或更好的下一代人類IgG產品之能力。迄今為止，尚未大規模使用親和純化來代替分級，以便自含有IgG之起始材料中純化IgG或其他蛋白。 實例 實例 1 1.1 實驗概述
最初實驗用純化血漿源性多株IgG作為起始材料來進行。目的係以已在臨床應用中使用之確定IgG產品作為基準，快速收集資訊。
在第一次篩選中，第二親和純化步驟之幾個潛在候選物作為平行運行的獨立層析運行來評估。關於串聯方法，進一步如下所述來執行： 1. 用蛋白A衍生樹脂捕獲IgG之主要部分 2. 使用替代IgG結合親和樹脂來捕獲蛋白A捕獲物之穿流(FT)中存在之殘留IgG
在下一步驟中，選擇具有最佳結合性質(容量)之樹脂用於額外實驗設置。在此方法中，評估了自低溫上清液中捕獲IgG。
第一組實驗被設計來對在「串聯」陣列中用以捕獲全部系列之IgG亞類的蛋白A及樹脂之組合進行篩選。使用液體純化血漿源性多株IgG製劑作為起始材料。
第二組實驗被設計來直接使用經改良之Cohn低溫上清液作為起始材料來優化IgG亞類系列。 1.2 生物材料1. 純化之血漿源性多株IgG 2. 低溫上清液 1.3 緩衝液
用於實驗之所有緩衝液均在操作部門製備。緩衝液儲存在+2至+8℃。 1.4 樹脂之選擇
對於直接捕獲，Mab select PrismA (GE Healthcare)由於對氫氧化鈉具有高耐受性而被選中。
低溫上清液含有除FVIII及vWF外之所有凝血因子，低溫沉澱後它們會減少。此事實可能導致在樹脂上部分凝結及沉澱，因此需要有效再生及清潔程序。
經選擇用於捕獲殘留IgG亞群之樹脂為藉由Thermo Fisher提供之市售層析樹脂。 表 1. 為改良 IgG 捕獲而篩選之樹脂之清單
樹脂
1. CaptureSelect™ FcXL親和基質
2. CaptureSelect™ CH1-XL親和基質
3. CaptureSelect™ KappaXL親和基質
4. CaptureSelect™ IgG-Fc (ms)親和基質
5. CaptureSelect™ LC- Lambda (Hu)親和基質
6.CaptureSelect™ KappaXP親和基質
7. CaptureSelect™ IgG3親和基質*
* 未在篩選階段應用，此歸因於Capture Select CH1-XL、FcXL及FcMS能夠結合純化多株IgG溶液中 ＞97%之IgG3。 1.5 單個單元操作 / 集群之評估 表 2. 篩選階段使用之緩衝液
編號： 緩衝液 ID 緩衝液組成物 pH 名稱
1. 平衡/稀釋緩衝液 10 mM乙酸鈉、10 mM TrisHCl、120 mM NaCl 7.2 IQEQ
2. 洗滌/SD_VI 管柱上緩衝液 10 mM乙酸鈉、10 mM TrisHCl、120 mM NaCl及SD_VI_MIX Triton X 10.55 g/聚山梨酯80 3.21 g / TnBP 2.91 g/kg緩衝液 7.2       IQEQ_VI
3. 溶析緩衝液1 100 mM甘胺酸 3.2. E1
4. 溶析緩衝液2 100 mM甘胺酸 2.7. E2
1.6 階段 1 之層析方案 (Prisma 親和 )
具有以下尺寸之層析管柱用於蛋白A捕獲步驟： 管柱：3.2 cm h = 7.5 cm   A= 8.04 cm 2V = 60.3 ml 表 3. 層析方案 IG_MAX
層析步驟 緩衝液 / 樣品 入口閥 CV 流量 (ml/min) 出口閥 級分
平衡 IQEQ A1 2 10 -- 廢物
樹脂活化 100mM甘胺酸pH 2.7 B1 3 10 -- 廢物
平衡 IQEQ A1 5 10 -- 廢物
樣品應用 --- S1 mL 10 1 FT
洗滌1再平衡 IQEQ A1 2 10 1 FT
SD_VI管柱上 IQEQ_VI A2 4 4.0 2 WSD
洗滌2 IQEQ A1 10 10 3 W2
溶析1 E1 B1 4 5 4 E1
溶析2 E2 B2 4 5 5 E2
再處理 IQEQ A1 4 10 -- 廢物
1.7 篩選階段 / 實驗之結果 a. 含有純化 IgG 之起始材料對 MAb Select PrismA 之親和力
蛋白A捕獲管柱上之層析運行如先前在階段1之層析方案中概述來執行，計算出之管柱負載為30 mg IgG/ml樹脂。
在 圖 1中，顯示了穿流UV概況。在使用含有IgG之起始材料的該實驗設置中，低消光提供了關於人類IgG高結合效率之資訊。
使用含IgG之起始材料的PrismA運行之穿流級分(UV 280信號)。
將此穿流級分加以收集並用作進一步篩選對免疫球蛋白亞群具有不同特異性之親和樹脂的負載，如樹脂之選擇中所述。 1.8     MabSelect PrismA 樹脂之負載及穿流 (FT) 級分之 IgG 含量及亞類分佈 表 4.運行 IGR01： 「穿流 (FT) 」中之 IgG1 、 IgG2 、 IgG3 及 IgG4
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
負載 [mg] 1218.5 547.1 52.03 65.42
FT [mg] 18.6 ＜0.1 33.4 ＜0.1
FT 中之 % 2 1.5 ＜0.1 64.2 ＜0.1
. 1基於比率，其中IgG3為1部分 / 比率以IgG3之x倍部分給出 . 2在PrismA穿流中發現之IgG亞類之百分比 在Mab Select PrismA之穿流中僅發現大量IgG3。 實例 2 2.1 階段 2( 樹脂篩選 ) 之層析方案
具有以下尺寸之層析管柱用於使用蛋白A捕獲穿流之樹脂篩選運行： 管柱：10 cm h = 3至4 cm A = 0.79 cm 2V= 3.5至4.5 ml
此等運行之層析程序列出於樹脂篩選運行之層析程序下。 2.2 樹脂篩選運行之層析程序 表 5. 樹脂篩選之層析方案
層析步驟 緩衝液 / 樣品 入口閥 CV 流量 (ml/min) 出口閥 級分
平衡 IQEQ A1 --- 0.30 -- 廢物
樹脂活化 E2 B1 5 0.30 -- 廢物
平衡 IQEQ A1 10 0.30 -- 廢物
樣品應用 變數1 S1 45 – 50 mL 0.30 1 FT
洗滌1再平衡 IQEQ A1 5 0.30 1 FT
SD_VI管柱上 IQEQ_VI A2 10 60 min 2 WSD
洗滌2 IQEQ A1 20 0.79 3 W2
溶析1 E1 B1 10 0.30 4 E1
再處理 IQEQ A1 10 0.79 -- 廢物
2.3     Capture Select 穿流評估 UV 280nm 信號
圖 2顯示了經過篩選之樹脂之穿流概況。對於例如抗蘭姆達或抗CH1-XL，觀察到不同UV 280信號高度。較低穿流UV水準導致較高UV溶析峰。 2.4  Capture Select 溶析液評估 UV280nm 信號
圖3顯示經過篩選之樹脂之溶析概況。觀察到不同UV280信號高度及面積。Capture Select CH1-XL顯示出最高峰及最大峰面積。
基於此等資料，對CaptureSelect樹脂進行了排序。最有效樹脂為CaptureSelect CH1-XL。 2.5 資料評估 a. 含有純化 IgG 之起始材料之 PrismA 穿流之 Capture Select 親和溶析液之峰面積總結
表6顯示了所測試之不同親和管柱之峰面積(UV280nm)。Protein A樹脂之分析結果列出於MabSelect PrismA樹脂之負載及穿流(FT)級分之IgG含量及亞類分佈下 。IgG2及IgG4幾乎定量捕獲，IgG1及IgG3之捕獲效率較低。此等亞型被第二樹脂捕獲。CaptureSelect CH1-XL經鑑定為結合Mab Select PrismA穿流之大部分殘留IgG亞種。該樹脂作為第二管柱引入以運行後續實驗。 表 6. 層析圖評估 ( 峰面積 )
管柱 II 之樹脂 運行 ID 結果 / 排序 峰面積 峰值最大值 (280nm)
CaptureSelect™ FcXL FcXL 3 1100 600
CaptureSelect™ CH1-XL CH1_XL 1 1909 1021
CaptureSelect™ KappaXL KappaXL 5 972 504
CaptureSelect™ IgG-Fc (ms) FcMS 4 1037 752
CaptureSelect™ LC-lambda (Hu) Lambda 6 865 266
CaptureSelect™ KappaXP親和力 Kappa_XP_P 2 1192 865
實例 3 3.1  Capture Select 樹脂結合 Mab Select PrismA 穿流中剩餘 IgG 亞類之評估
在下表中，總結了使用不同Capture Select管柱自Mab select PrismA之穿流級分中回收IgG1及IgG3。僅列出穿流及溶析級分。部分可能在穿流級分(低於偵測限)及洗滌及溶析後級分(未分析)中。 表 7. Capture Select CH1 XL 運行編號： CH1XL
IgG1 IgG1 IgG3 IgG3
負載 2.97 mg 100% 5.33 mg 100%
FT 低於偵測限 n.a 低於偵測限 n.a
溶析液 2.54 mg 85.4% 3.77 mg 70.8%
n.a =不適用 表 8. Capture Select KAPPA XL 運行編號： KAPPA XL
IgG1 IgG1 IgG3 IgG3
負載 2.38 mg 100% 4.27 mg 100%
FT 低於偵測限 n.a 0.94 mg 22.1%
溶析液 低於偵測限 n.a 1.28 mg 30.0%
n.a =不適用 表 9. Capture Select LC_LAMBDA(Hu) 運行編號： LAMBDA(Hu)
IgG1 IgG1 IgG3 IgG3
負載 2.88 mg 100% 5.17 mg 100%
FT 低於偵測限 n.a 1.88 mg 36.3%
溶析液 1.66 mg 57.7% 1.19 mg 22.9%
n.a =不適用 表 10. Capture Select FcXL 運行編號： FcXL
IgG1 IgG1 IgG3 IgG3
負載 2.52 mg 100% 4.52 mg 100%
FT 低於偵測限 n.a 0.02 mg 2.8%
溶析液 2.17 mg 86.0% 2.94 mg 65.0%
n.a =不適用 表 11. Capture Select KAPPA XP 運行編號： KAPPA_XP_P
IgG1 IgG1 IgG3 IgG3
負載 2.90 mg 100% 5.20 mg 100%
FT 低於偵測限 n.a 1.53 mg 29.4%
溶析液 2.96 mg 102.0% 2.89 mg 55.7%
n.a =不適用 表 12. Capture Select FcMS 運行編號： FcMS
IgG1 IgG1 IgG3 IgG3
負載 2.37 mg 100% 4.25 mg 100%
FT 低於偵測限 n.a 0.12 mg 2.8%
溶析液 1.91 mg 80.7% 2.88 mg 67.8%
n.a =不適用 實例 4 4.1 變體 IGC02 a.    IGC02 中使用之緩衝液組成物 表 13. 緩衝液組成物
緩衝液 緩衝液 ID 緩衝液組成物 pH 名稱
1. 平衡/稀釋緩衝液 10 mM乙酸鈉，10mM TrisHCl，120 mM NaCl          7.2 IQEQ
2. 洗滌/SD_VI 管柱上緩衝液 10 mM乙酸鈉，10mM TrisHCl，120 mM NaCl  + SD_VI_MIX Triton X 10.55/聚山梨酯80 3.21/TnBP 2.91 7.2       IQEQ_VI
3. 溶析緩衝液1 100 mM甘胺酸 3.2 E1
4. 溶析緩衝液2 100 mM甘胺酸 2.7. E2
4.2     IGC02 運行
IGC02分兩個步驟進行 – 首先在MAB Select PrismA上進行親和，作為第二步驟，將MAB Select PrismA穿流應用至Capture Select CH1_XL上。
來自Cohn分級過程之低溫上清液在實驗前未經任何進一步處理而被引入純化過程。 a. 第一步驟
用IQEQ緩衝液將MAB-Select PrismA (GE Healthcare，目錄號：17-5498-02, ID:3.2 cm h = 7.5 cm   A = 8.04 cm 2V = 60.3 ml)平衡後，將低溫上清液應用至管柱上，接觸時間約為6 min。
加載後，使用2 CV緩衝液IQEQ進行第一次洗滌，以移除樹脂中未結合之蛋白(添加至穿流中)。藉由應用IQEQ_VI緩衝液來進行SD_VI管柱上處理，該緩衝液含有1 kg IQEQ緩衝液中之10.55 g Triton X-100、3.21 g聚山梨酯80及2.91 g TnBP之去污劑組成物(對應於1%/0.3%/0.3%之Triton X100/聚山梨酯80/TnBP)。藉由在4 CV內以4 ml/min之流速將結合蛋白與IQEQ_VI緩衝液接觸至少約60分鐘來運行管柱上SD_VI。視情況地收集洗滌液用於分析。
洗滌2使用IQEQ緩衝液來進行，以進一步消除雜質，並以10 CV及10 ml/min之流速清洗SD_VI試劑。視情況地收集洗滌液用於分析。
藉由應用5 CV之E1緩衝液(100 mM甘胺酸，pH 3.2)，進行溶析。使用E2緩衝液(100 mM甘胺酸，pH 2.7)執行清潔程序(剝離)之第一步驟。
在4 CV之IQEQ緩衝液之再平衡後，管柱得以再生並儲存。
再生程序及儲存在再生程序中進行了描述。 實例 5 5.1 管柱MAB Select PrismA GE Healthcare，目錄號：17-5498-02 批號：10264190 ID: 3.2 cm   h = 7.5 cm   A= 8.04 cm 2V = 60.3 ml (目標) 表 14. 層析方案
層析步驟 緩衝液 / 樣品 入口閥 CV 流量 (ml/min) 出口閥 級分
平衡 IQEQ A1 2 10 -- 廢物
樹脂活化 100mM甘胺酸，pH 2.7 B1 3 10 -- 廢物
平衡 IQEQ A1 5 10 -- 廢物
樣品應用 --- S1 mL 10 1 FT
洗滌1再平衡 IQEQ A1 2 10 1 FT
SD_VI管柱上 IQEQ_VI A2 4 4.0 2 WSD
洗滌2 IQEQ A1 10 10 3 W2
溶析1 E1 B1 4 5 4 E1
溶析2 E2 B2 4 5 5 E2
再處理 IQEQ A1 4 10 -- 廢物
a. 層析圖 IGC02
參見 圖 4。 5.1 第二步驟 IGC01S
用IQEQ緩衝液將Capture Select CH1-XL (Thermo Fisher，目錄號：2943452050, ID: 1.0 cm h = 3.8 cm A = 0.79 cm 2V = 3.0 ml)平衡後，將MAB Select PrismA穿流(IGC02)應用至管柱上，接觸時間約為10 min。
加載後，使用5 CV緩衝液IQEQ進行第一次洗滌，以移除樹脂中未結合之蛋白(添加至穿流中)。藉由應用IQEQ_VI緩衝液來進行SD_VI管柱上處理，該緩衝液含有1 kg IQEQ緩衝液中之10.55 g Triton X-100、3.21 g聚山梨酯80及2.91 g TnBP之去污劑組成物。藉由在10 CV (100 min)內以0.3 ml/min之流速將結合蛋白與IQEQ_VI緩衝液接觸至少60分鐘，進行SD_VI管柱上。
洗滌2使用IQEQ緩衝液進行，以進一步消除雜質，並以20 CV及0.8 ml/min之流速清洗SD_VI試劑。
藉由應用10 CV之E2緩衝液(100 mM甘胺酸，pH 2.7)，進行溶析。
在10 CV之IQEQ緩衝液之再平衡後，管柱得以再生並儲存。
再生程序及儲存在再生程序中進行了描述。 5.2 管柱Capture Select CH1XL Thermo Fisher，目錄號：2943452050 批號： 170426-01 ID: 10 cm   h = 3.8 cm     A = 0.79 cm²   V = 3.0 ml 表 15. 層析方案
層析步驟 緩衝液 / 樣品 入口閥 CV 流量 (ml/min) 出口閥 級分
平衡 IQEQ A1 --- 0.30 -- 廢物
樹脂活化 100mM甘胺酸，pH 2.7 B1 5 0.30 -- 廢物
平衡 IQEQ A1 10 0.30 -- 廢物
樣品應用 --- S1 45 - 50mL 0.30 1 FT
洗滌1再平衡 IQEQ A1 5 0.30 1 FT
SD_VI管柱上 IQEQ_VI A2 10 0.30 2 WSD
洗滌2 IQEQ A1 20 0.80 3 W2
溶析1 E2 B1 10 0.30 4 E1
再處理 IQEQ A1 10 1.00 -- 廢物
a. 層析圖 IGC01S
參見 圖 5。 5.3 運行 IGC02 之結果 表16. 「 PrismA 穿流 (FT) 」中之 IGC02 IgG1 、 IGg2 、 IgG3 及 IgG4
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
負載 [mg] 761.5 338.2 51.66 65.77
FT [mg] 34.43 x a 36.36 x a
FT 中之 % 2 4.5% x a 70.4% x a
. 1基於比率，其中IgG3為1部分 / 比率以IgG3之x倍部分給出 . 2在PrismA穿流中發現之IgG亞類之百分比 在Mab Select PrismA之穿流中僅發現大量IgG3。 x a低於偵測限之值 表17. Capture Select CH1_XL 上之 IgG1 及 IgG3
IgG1 mg IgG1 % IgG3 mg IgG3 %
負載 [mg] 5,8 100% 6,2 100%
FT [mg] x a x a x a x a
溶析液 3,0 51,6% 3,6 57,6%
x a低於偵測限之值 {注意：此管柱基本上捕獲了所有IgG1及IgG3} 實例 6 6.1 變體 IGC04 a. 實例 6 中使用之緩衝液組成物 表 18. 緩衝液組成物
緩衝液 緩衝液 ID 緩衝液組成物 pH 名稱
1. 平衡/稀釋緩衝液 10 mM乙酸鈉，10 mM TrisHCl，120 mM NaCl            7.2 IQEQ
2. 洗滌/SD_VI 管柱上緩衝液 10 mM乙酸鈉，10 mM TrisHCl，120 mM NaCl + SD_VI_MIX Triton X 10.55g/聚山梨酯80 3.21g / TnBP 2.91g /kg buffer 7.2       IQEQ_VI
3. 洗滌2高鹽 100 mM乙酸鈉，500 mM NaCl 0.05% 聚山梨酯 6.0 W2
4. 溶析緩衝液1 100 mM甘胺酸 3.2 E1
5. 溶析緩衝液2 100 mM甘胺酸 2.7 E2
6. 調整緩衝液 2 M乙酸鈉 6.1 調整
6.2     IGC04
來自Cohn之低溫上清液係純化過程之起始材料，在實驗前無需任何進一步處理。實驗在+2至+8℃下進行。
在平衡串聯的MAB-Select PrismA (GE Healthcare，目錄號：17-5498-02, ID:3.2 cm h = 7.5 cm   A = 8.04 cm 2V = 60.3 ml)及Capture Select CH1-XL Thermo Fisher，目錄號：2943452050) ID: 2.2 cm  h= 3.6 cm A= 3.81 cm² V= 13.7 ml(第一管柱之穿流直接加載至第二管柱)之後，將低溫上清液應用至管柱上，CH1-XL管柱之接觸時間約為6 min [2.3 ml/min]。
加載後，使用2 CV緩衝液IQEQ進行第一次洗滌，以移除樹脂中未結合之蛋白。藉由應用IQEQ_VI緩衝液來進行SD_VI管柱上處理，該緩衝液含有1 kg IQEQ緩衝液中之10.55 g Triton X-100、3.21 g聚山梨酯80及2.91 g TnBP之去污劑組成物(將去污劑組成物之成分混合約15分鐘；隨後在混合下添加至IQEQ緩衝液中)。藉由在4 CV內以4 ml/min之流速將結合蛋白與IQEQ_VI緩衝液接觸最少60分鐘來運行管柱上SD_VI。對於SD_VI步驟：將16.6g/Kg SD_VI_MIX 添加至10 mM乙酸鈉、10 mM TrisHCl、120 mM NaCl，pH 7.2。SD_VI_MIX係藉由按 10.55g Triton X100/3.21g聚山梨酯80 / 2.91g TnPB(磷酸三正丁酯)之比率混合去污劑/溶劑至少15min並在混合下將其添加至緩衝液來製備。
洗滌2使用W2緩衝液進行，以進一步消除雜質，並以5 CV及10 ml/min之流速洗掉SD_VI試劑。藉由以10 ml/min之流速應用6 CV之IQEQ緩衝液來執行第三個，亦即最後一個洗滌步驟。
藉由應用5 CV之E1緩衝液(100 mM甘胺酸，pH 3.2)，進行溶析。
使用E2緩衝液(100 mM甘胺酸，pH 2.7)執行清潔程序(剝離)之第一步驟。
在4 CV之IQEQ緩衝液之再平衡後，管柱得以再生並儲存。
CV為兩根管柱(CH1-XL及Capture Select CH1-XL)之總體積。 再生程序及儲存在再生程序中進行了描述。 實例 7
如下所述處理來自實例6 (IGC04)之溶析液。該實例被描述為實例6 - 變體 IGC04。 7.1 串聯管柱陣列 a. 管柱 1MAB Select Prism A GE Healthcare，目錄號：17-5498-02 批號： 10264190 ID: 3.2 cm   h = 7.5 cm   A = 8.04 cm²    V = 60.3 ml (目標) b. 管柱 2Capture Select CH1XL Thermo Fisher，目錄號：2943452050 批號： 170426-01 ID: 2.2 cm   h = 3.6 cm     A = 3.81 cm²   V = 13.7 ml 管柱體積1+2：74.0 ml   程式化：74.506(管柱1+2+連接 - 定義為1 CV) 表 19. 層析方案
層析步驟 緩衝液 / 樣品 入口閥 CV 流量 (ml/min) 出口閥 級分
平衡 IQEQ A1 2 10 -- 廢物
樹脂活化 100 mM甘胺酸，pH 2.7 B1 3 10 -- 廢物
平衡 IQEQ A1 5 10 -- 廢物
樣品應用 低溫上清液 S1 mL 2.5* 1 FT
洗滌1再平衡 IQEQ A1 2 2.5* 1 FT
SD_VI管柱上 IQEQ_VI A2 4 4.0 2 WSD
洗滌2 W2 A3 5 10 3 W2
洗滌3 IQEQ A1 6 10 4 W3
溶析1 E1 B1 5 5 5 E1
溶析2 E2 B2 5 5 6 剝離/E2
再處理 IQEQ A1 4 10 -- 廢物
管柱體積1+2：74.0 ml   程式化：74.506(管柱1+2+連接- 定義為1 CV) * 管柱上之接觸時間約為6 min 對級分WSD進行了採樣並且詳細分析。對W2及W3級分進行了採樣並在SDS PAGE銀染色中進行分析。 c. 層析圖 IGC04
參見 圖 6。 7.2 實例 7 之結果及資料 表 20. 如藉由免疫分析 (ELISA) 確定之 IgG 之濃度
級分 負載 FT 溶析液 剝離
IgG 濃度 4.92 mg/ml 0.23 mg/ml 8.70 mg/ml 0.03 mg/ml
表 21. 產率 IgG 亞類分佈負載與溶析液
亞類 範圍 負載 溶析液 步驟產率
IgG 1 50 – 70% 62.3% 65.8% 87.1%
IgG 2 26.7 – 37.3% 28.1% 28.2% 82.6%
IgG 3 ＞2.5% 6.4% 2.6% 34.0%
IgG 4 ＞2.5% 3.2% 3.4% 86.3%
IgA n.a 100% 12.0% 12.0%
IgG n.a 100% 92.9% 92.9%
IGM n.a 100% 22.5% 22.5%
n.a =不適用 產品 / 雜質概況
產生關於IMAX_FC_CRS_04 WSD (含有SD_VI試劑之洗滌緩衝液)及溶析液IMAX_FC_CRS_04 (串聯的兩個管柱MAB Select Prism A及Captur Select CH1_XL之溶析液)之蛋白概況的LC-MS資料，該溶析液代表親和純化後之中間產物級分。藉由RP-HPLC-ESI-MS/MS確定SD_VI管柱上病毒滅活洗滌級分之雜質概況，以及溶析液之產物/雜質概況。樣品用TCA來沉澱、還原、烷基化、用胰蛋白酶消化，隨後用與Eclipse Orbitrap聯用之Thermo UltiMate Cap-HPLC進行分析(RP-HPLC-ESI-MSMS分析)。使用「Proteome Discoverer」軟體分析資料。結果包括每個樣品之蛋白組成及相對蛋白豐度(無標記定量)。 結果
結果列於表22及表23中。所有偵測到的不同免疫球蛋白變體被合併至一個蛋白條目「免疫球蛋白」中，並總結了所有相應面積百分比值。登錄號來自UniProt KB。面積%值為0.00%表示可以偵測及識別蛋白，但相對量低於0.01%之臨限值 結論
級分IMAX_FC_CRS_04 WSD (「洗滌級分」)包含在管柱上SD_VI期間消除之雜質。「洗滌級分」樣品具有66.96%免疫球蛋白及33.04%其他蛋白之蛋白組成。可以偵測及識別150種不同蛋白。(表22)。WSD中之血清澱粉樣蛋白A-2蛋白、異戊二烯半胱胺酸氧化酶1、富含白胺酸之α-2醣蛋白、凝血因子XI、蛋白多醣4、羧肽酶B2、性激素結合球蛋白、脂聯素、透明質酸結合蛋白2、嗜中性球防禦素1、Ras相關蛋白Rap-1b、轉化生長因子-β誘導蛋白ig-h3、整合素β-3、備解素或羧肽酶N催化鏈基本上為0%。
「溶析液」樣品具有99.57%免疫球蛋白及0.43%其他蛋白之蛋白組成。可以偵測及識別26種不同蛋白。( 表 23)。溶析液代表高純度人類IgG池(＞99%)，與目前市售IgG產品相比具有更高品質。親和溶析液基本上含有0%之α-1-酸性醣蛋白2、      運甲狀腺素蛋白、載脂蛋白B-100、C4b結合蛋白α鏈、纖連蛋白、富含組胺酸之醣蛋白、補體C5或妊娠帶蛋白。 表 22. WSD ( 洗滌級分 ) 之雜質概況
登錄 描述 豐度 面積 %
免疫球蛋白 2,91E+10 66,96
P02768 白蛋白 3,69E+09 8,49
P02647 載脂蛋白A-I 1,36E+09 3,14
P01024 補體C3 9,86E+08 2,27
P00738 血紅素結合素 8,37E+08 1,93
P02679 纖維蛋白原γ鏈 4,54E+08 1,04
P0C0L5 補體C4-B 3,89E+08 0,89
P02675 纖維蛋白原β鏈 3,48E+08 0,80
P02671 纖維蛋白原α鏈 3,41E+08 0,78
P09871 補體C1s次組分 3,27E+08 0,75
P00736 補體C1r次組分 3,20E+08 0,74
P04114 載脂蛋白B-100 2,91E+08 0,67
P01023 α-2-巨球蛋白 2,49E+08 0,57
P02656 載脂蛋白C-III 2,26E+08 0,52
P02790 血色素結合蛋白 2,17E+08 0,50
P02652 載脂蛋白A-II 2,10E+08 0,48
P02787 血清轉鐵蛋白 2,08E+08 0,48
Q03591 補體因子H相關蛋白1 2,06E+08 0,48
P08603 補體因子H 1,86E+08 0,43
P01009 α-1-抗胰蛋白酶 1,55E+08 0,36
P02766 運甲狀腺素蛋白 1,37E+08 0,31
P10909 凝聚素 1,28E+08 0,30
O14791 載脂蛋白L1 1,27E+08 0,29
P08519 載脂蛋白(a) 1,13E+08 0,26
P04004 玻連蛋白 1,11E+08 0,25
Q4G0P3 腦積水誘導蛋白同系物 1,03E+08 0,24
P19823 間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H2 9,29E+07 0,21
Q15485 纖維膠凝蛋白-2 9,14E+07 0,21
P04003 C4b結合蛋白α鏈 8,80E+07 0,20
P00747 纖溶酶原 8,24E+07 0,19
P01031 補體C5 7,34E+07 0,17
P02649 載脂蛋白E 6,95E+07 0,16
P02760 蛋白AMBP 6,94E+07 0,16
P05155 血漿蛋白酶C1抑制劑 6,89E+07 0,16
P02743 血清澱粉樣蛋白P成分 6,68E+07 0,15
P01042 激肽原-1 6,51E+07 0,15
P19827 間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H1 6,37E+07 0,15
P02763 α-1-酸性醣蛋白1 6,28E+07 0,14
P00450 銅藍蛋白 6,20E+07 0,14
P05090 載脂蛋白D 6,15E+07 0,14
Q14624 間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 5,89E+07 0,14
O43866 CD5抗原樣 5,73E+07 0,13
P00739 血紅素結合素相關蛋白 4,62E+07 0,11
P05156 補體因子I 4,42E+07 0,10
P02765 α-2-HS-醣蛋白 4,42E+07 0,10
P07358 補體成分C8 β鏈 4,38E+07 0,10
P01011 α-1-抗胰凝乳蛋白酶 4,34E+07 0,10
P02655 載脂蛋白C-II 4,21E+07 0,10
P07360 補體成分C8 γ鏈 4,19E+07 0,10
P04196 富含組胺酸之醣蛋白 4,13E+07 0,10
P27169 血清對氧磷酶/芳基酯酶1 4,09E+07 0,09
P07357 補體成分C8 α鏈 3,99E+07 0,09
P02774 維生素D結合蛋白 3,86E+07 0,09
P02749 β-2-醣蛋白1 3,52E+07 0,08
Q15648 RNA聚合酶II轉錄次單元1之介質 3,34E+07 0,08
P19652 α-1-酸性醣蛋白2 3,33E+07 0,08
P0C0L4 補體C4-A 3,24E+07 0,07
P36980 補體因子H相關蛋白2 3,16E+07 0,07
P35542 血清澱粉樣蛋白A-4蛋白 2,93E+07 0,07
P00734 凝血酶原 2,88E+07 0,07
P02654 載脂蛋白C-I 2,79E+07 0,06
P02751 纖連蛋白 2,69E+07 0,06
P06396 凝溶膠蛋白 2,33E+07 0,05
P22792 羧肽酶N次單元2 2,29E+07 0,05
P06727 載脂蛋白A-IV 2,27E+07 0,05
P23142 纖蛋白-1 2,21E+07 0,05
P61626 溶菌酶C 2,19E+07 0,05
P04217 α-1B-醣蛋白 2,19E+07 0,05
P68871 血紅蛋白次單元β 2,10E+07 0,05
Q15166 血清對氧磷酶/內酯酶3 2,06E+07 0,05
P02753 視黃醇結合蛋白4 2,04E+07 0,05
P02748 補體成分C9 1,94E+07 0,04
O95445 載脂蛋白M 1,94E+07 0,04
P11226 甘露糖結合蛋白C 1,93E+07 0,04
P01008 抗凝血酶-III 1,86E+07 0,04
P01019 血管緊張素原 1,70E+07 0,04
P00751 補體因子B 1,70E+07 0,04
O75636 纖維膠凝蛋白-3 1,65E+07 0,04
P02746 補體C1q次組分次單元B 1,59E+07 0,04
P69905 血紅蛋白次單元α 1,57E+07 0,04
P48740 甘露聚醣結合凝集素絲胺酸蛋白酶1 1,56E+07 0,04
P03952 血漿激肽釋放酶 1,48E+07 0,03
P02747 補體C1q次組分次單元C 1,48E+07 0,03
P07225 維生素K依賴性蛋白S 1,41E+07 0,03
Q15113 前膠原C-內肽酶增強子1 1,34E+07 0,03
Q02985 補體因子H相關蛋白3 1,25E+07 0,03
P08697 α-2-抗纖溶酶 1,09E+07 0,03
P20851 C4b結合蛋白β鏈 1,01E+07 0,02
Q6ZRK6 含有捲曲螺旋結構域之蛋白73 9,44E+06 0,02
Q13790 載脂蛋白F 9,42E+06 0,02
P55056 載脂蛋白C-IV 9,09E+06 0,02
Q06033 間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H3 8,96E+06 0,02
P06681 補體C2 8,91E+06 0,02
O00187 甘露聚醣結合凝集素絲胺酸蛋白酶2 8,89E+06 0,02
P34096 核糖核酸酶4 8,83E+06 0,02
P20742 妊娠帶蛋白 8,77E+06 0,02
P02745 補體C1q次組分次單元A 8,73E+06 0,02
P43652 阿法明 8,46E+06 0,02
P29622 卡利司他汀 8,43E+06 0,02
Q16610 細胞外基質蛋白1 8,32E+06 0,02
P18428 脂多醣結合蛋白 8,06E+06 0,02
P05160 凝血因子XIII B鏈 8,04E+06 0,02
P60709 肌動蛋白，細胞質1 7,65E+06 0,02
P49908 硒蛋白P 7,37E+06 0,02
O00391 巰基氧化酶1 7,32E+06 0,02
P00488 凝血因子XIII A鏈 7,30E+06 0,02
P05546 肝素輔助因子2 7,04E+06 0,02
Q08380 半乳糖凝集素3結合蛋白 6,94E+06 0,02
P25311 鋅-α-2-醣蛋白 6,83E+06 0,02
Q92496 補體因子H相關蛋白4 6,34E+06 0,01
Q96PD5 N-乙醯胞壁醯-L-丙胺酸醯胺酶 6,24E+06 0,01
Q12805 含EGF之纖蛋白樣細胞外基質蛋白1 6,06E+06 0,01
P55058 磷脂轉移蛋白 5,63E+06 0,01
P13671 補體成分C6 5,27E+06 0,01
Q5TF21 蛋白SOGA3 5,06E+06 0,01
P00748 凝血因子XII 5,04E+06 0,01
P61769 β-2-微球蛋白 4,85E+06 0,01
P63267 肌動蛋白，γ-腸平滑肌 4,65E+06 0,01
P51884 基膜聚糖 4,00E+06 0,01
P01833 多聚免疫球蛋白受體 3,98E+06 0,01
P35858 胰島素樣生長因子結合蛋白複合物酸不穩定次單元 3,85E+06 0,01
O75015 低親和力免疫球蛋白γ Fc區受體III-B 3,60E+06 0,01
P36955 色素上皮衍生因子 3,58E+06 0,01
P10643 補體成分C7 3,43E+06 0,01
P22352 谷胱甘肽過氧化物酶3 3,26E+06 0,01
P04070 維生素K依賴性蛋白C 3,24E+06 0,01
P08514 整合素α-IIb 3,08E+06 0,01
Q96KN2 β-Ala-His二肽酶 3,03E+06 0,01
Q9NZP8 補體C1r次組分樣蛋白 2,91E+06 0,01
Q9BXR6 補體因子H相關蛋白5 2,63E+06 0,01
O75882 吸引素 2,55E+06 0,01
P11597 膽固醇酯轉移蛋白 2,53E+06 0,01
P02730 帶3陰離子轉運蛋白 2,48E+06 0,01
P12259 凝血因子V 2,48E+06 0,01
P03950 血管生成素 2,40E+06 0,01
總計： 4,35E+10 100,00
表 23. 親和溶析液 E1 之產物 / 雜質概況
登錄 描述 豐度 面積 %
  免疫球蛋白 1,81E+11 99,57
P0C0L5 補體C4-B 1,50E+08 0,08
P01024 補體C3 8,84E+07 0,05
P02768 白蛋白 8,25E+07 0,05
P02679 纖維蛋白原γ鏈 7,88E+07 0,04
P02675 纖維蛋白原β鏈 7,28E+07 0,04
P02671 纖維蛋白原α鏈 6,03E+07 0,03
O43866 CD5抗原樣 4,91E+07 0,03
P0C0L4 補體C4-A 2,23E+07 0,01
P00739 血紅素結合素相關蛋白 2,00E+07 0,01
P02745 補體C1q次組分次單元A 1,76E+07 0,01
P01833 多聚免疫球蛋白受體 1,72E+07 0,01
P01009 α-1-抗胰蛋白酶 1,67E+07 0,01
P02746 補體C1q次組分次單元B 1,60E+07 0,01
P02747 補體C1q次組分次單元C 1,47E+07 0,01
P02760 蛋白AMBP 1,38E+07 0,01
P01023 α-2-巨球蛋白 1,25E+07 0,01
P10909 凝聚素 1,00E+07 0,01
P00738 血紅素結合素 9,51E+06 0,01
總計： 1,81E+11 100,00
表 24. 親和溶析液 (LC-MS 運行 IMAX_FC_CRS_04) 之雜質概況
雜質 溶析液 負載
白蛋白 ＜0.359g/L x.
因子XI ＜0.01E/ml x.
α2-巨球蛋白 ＜0.0478g/L x.
轉鐵蛋白 ＜0.0897g/L x.
PL1活性 ＜10nm/ml min x.
纖維蛋白原 29.9µg/ml x.
Amidolyt S2222 ＜5nm/ml min 7.57
Amidolyt S2251 ＜5nm/ml min 5.91
Amidolyt S2288 ＜5nm/ml min VK＞30%
Amidolyt S2302 ＜5nm/ml min 6.86
C3 ELISA 18.0µg x.
#藉由ELISA來確定
a.       SDS PAGE 銀染概況
參見 圖 7。 實例 8 8.1 a. 實例 8 中使用之緩衝液組成物 表 25. 緩衝液組成物
緩衝液 緩衝液 ID 緩衝液組成物 pH 名稱
1. 平衡/稀釋緩衝液  10 mM乙酸鈉，10 mM TrisHCl，120 mM NaCl              7.2 IQEQ
2. 洗滌/SD_VI 管柱上緩衝液 10 mM乙酸鈉，10 mM TrisHCl，120 mM NaCl + SD_VI_MIX Triton X 10.55 g/聚山梨酯80 3.21 g / TnBP 2.91 g/kg緩衝液 7.2 IQEQ_VI
3. 洗滌2高鹽 100 mM乙酸鈉，500 mM NaCl 0.05% 聚山梨酯 6.0 W2
4. 溶析緩衝液1 100 mM甘胺酸 3.2 E1
5. 溶析緩衝液2 100 mM甘胺酸 2.7 E2
6. 調整緩衝液 2 M乙酸鈉 6.1 調整
8.1. 運行
來自Cohn分級過程之低溫上清液用作純化過程之起始材料，在實驗前無需任何進一步處理。在平衡串聯的MAB-Select PrismA (GE Healthcare，目錄號：17-5498-02, ID:3.2 cm h = 7.5 cm   A = 8.04 cm²    V = 60.3 ml)及Capture Select CH1-XL (Thermo Fisher，目錄號：2943452050, ID: 2.2 cm  h= 3.6 cm A= 3.81 cm² V= 13.7 ml)及Capture Select IgG3 (Thermo Fisher，目錄號：191304010, ID: 2.2 cm  h = 3.1 cm A = 3.81cm² V = 11.8 ml)之3個管柱的陣列之後，將低溫上清液應用至管柱上，CH1-XL管柱之接觸時間約為6 min [2.3 ml/min]。
加載後，使用2 CV緩衝液IQEQ進行第一次洗滌，以移除樹脂中未結合之蛋白。藉由應用IQEQ_VI緩衝液來進行SD_VI管柱上處理，該緩衝液含有1 kg IQEQ緩衝液中之10.55 g Triton X-100、3.21 g聚山梨酯80及2.91 g TnBP之去污劑組成物。藉由在4 CV內以4 ml/min之流速將結合蛋白與IQEQ_VI緩衝液接觸至少60分鐘，進行SD_VI管柱上。
洗滌2使用W2緩衝液進行，以進一步消除雜質，並以5 CV及10 ml/min之流速洗掉SD_VI試劑。藉由以10 ml/min之流速應用6 CV之IQEQ緩衝液來執行第三個，亦即最後一個洗滌步驟。
藉由應用5 CV之E1緩衝液(100 mM甘胺酸，pH 3.2)，進行溶析。使用E2緩衝液(100 mM甘胺酸，pH 2.7)執行清潔程序(剝離)之第一步驟。在4 CV之IQEQ緩衝液之再平衡後，管柱得以再生並儲存。 8.2     Tridem 管柱陣列： a. 管柱 1MAB Select Prism A GE Healthcare，目錄號：17-5498-02 批號： 10264190 ID: 3.2 cm   h = 7.5 cm   A = 8.04 cm²    V = 60.3 ml b. 管柱 2Capture Select CH1XL Thermo Fisher，目錄號：2943452050 批號： 170426-01 ID: 2.2 cm   h = 3.6 cm     A = 3.81 cm²   V = 13.7 ml c. 管柱3 Thermo Fisher，目錄號：191304010 批號： 151012-01 ID: 2.2 cm   h = 3.1 cm     A = 3.81 cm²   V = 11.8 ml 管柱體積1+2+3：85.8 ml   程式化：86.4(管柱1+2+3+連接) 8.3 層析圖
參見 圖 8。 8.4 運行結果及資料 a. 產率 IgG 亞類分佈負載與溶析液
Tridem陣列提供了一種高效方法，可將Cohn級分純化為與血漿IgG亞類分佈相當之IgG模式。IgG亞類之比率與商業IVIG產品中之模式幾乎相同。只有IgG4之量更高。SDS-PAGE銀染證實了親和溶析液之高純度。 表 26. 產率 IgG 亞類分佈負載與溶析液
亞類 接受 範圍 * 負載 溶析液 步驟產率
IgG 1 50 – 70% 56.8% 58.3% 90.9%
IgG 2 26.7 – 37.3% 31.6% 32.2% 89.7%
IgG 3 ＞2.5% 7.7% 5.6% 64.1%
IgG 4 ＞2.5% 3.9% 3.9% 87.5%
IgA n.a 100% 12.8% 12.8%
IgG n.a 100% 91.5% 91.5%
IGM n.a 100% 30.3% 30.3%
.* 參考，人類血清 b. 親和溶析液之雜質概況 表 27. 親和溶析液 (LC-MS 運行 IMAX_FC_CRS_06)* 之雜質概況
雜質 溶析液 負載
白蛋白 ＜0.335g/L x
因子XI ＜0.01E/ml 0.93E/ml
α2-巨球蛋白 ＜0.185g/L x
轉鐵蛋白 ＜0.0884g/L x
PL1活性 ＜10nm x
纖維蛋白原 13.0µg/ml x
Amidolyt S2222 ＜5nm/ml min 6.51nm/ml min
Amidolyt S2251 ＜5nm/ml min 5.56nm/ml min
Amidolyt S2288 ＜5nm/ml min 10.9nm/ml min
Amidolyt S2302 ＜5nm/ml min 7.45nm/ml min
C3 ELISA 4.8µg/ml x
*串聯的三個免疫親和管柱 b.    SDS PAGE 銀染概況
參見 圖 9。
IgG亞類之廣泛模式藉由使用串聯的兩個及/或三個包含互補免疫球蛋白結合樹脂之管柱之組合，自含有IgG之起始材料(低溫上清液，Gammagard液體)中獲得的。所得中間體(溶析液)之純度高得驚人，可與單株抗體純化中使用之親和純化步驟相媲美。 實例 9 9.1 裝備
對於此等實驗，使用了ÄKTA。該系統配備了能夠在線監測UV吸收(2 mm流動池)、電導率、壓力、溫度及pH值，並進行電子記錄之探針。層析單元使用系統軟體Unicorn 7.3來操作。 表 28. 層析滑行裝置
系統 ÄKTA Explorer 100
序列號 1867216
管道 1 mm Peek及1.25 mm (大約) PTFE
軟體 Unicorn 7.3
溫度[℃] 低溫+2至+8℃
位置 I131/BT-D/3/4-39
9.2 再生程序 a.       Capto Select PRISM A 通常使用 1 M NaOH 藉由應用 2 CV 進行再生，總時間為 30 分鐘。 表 29. STRIP PRISM A 後之再生序列 (100 mM 甘胺酸 pH 2.7)     CV ： 60 ml
層析步驟 緩衝液 / 樣品 入口閥 CV 流量 (ml/min) 出口閥 級分
平衡 IQEQ A1 2 10 -- 廢物
再生 1M NaOH S1 2 4 -- 廢物
平衡 IQEQ A1 5 10 -- 廢物
儲存 IQEQ_VI A2 5 10 --- 廢物
b.       Capture Select CH1-XL 使用 50%(w/w) 乙二醇、 10%(w/w) 乙醇胺、 0.1% 聚山梨酯 80 、 pH 8.5 (PDAM 緩衝液 ) 應用 4 CV 來再生，總時間為 60 分鐘。 表 30. STRIP CH1_XL 後之再生序列 (100mM 甘胺酸 pH 2.7) CV ： 15 ml
層析步驟 緩衝液 / 樣品 入口閥 CV 流量 (ml/min) 出口閥 級分
平衡 IQEQ A1 2 2 -- 廢物
再生 PDAM S1 4 1 -- 廢物
平衡 IQEQ A1 5 2 -- 廢物
儲存 IQEQ_VI A2 5 2 --- 廢物
在US 10,125,189 (皮下使用高濃度免疫球蛋白製劑之製備方法(Method to produce a highly concentrated immunoglobulin preparation for subcutaneous use))；US 9,468,675 (藉由精細二氧化矽處理移除絲胺酸蛋白酶(Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide))；US 8,993,734 (以提高之產率生產免疫球蛋白製劑之方法(Method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield))；US 9,782,477 (血漿中免疫球蛋白之I-IV-1級分沉澱(Fraction I-IV-1 precipitation of immunoglobins from plasma))；US 20150133636 (生物分子之純化(Purification of Biological Molecules))；US 20170218012 (治療性蛋白原料藥之集成連續製造(Integrated Continuous Manufacturing of Therapeutic Protein Drug Substances))中包括可與本文揭示之親和層析生產製程一起應用或另外應用之技術及製程。所有前述參考文獻均以引用方式整體併入本文。
儘管已經根據具體示例性實施例及實例描述了本發明，但是應當理解，本文所揭示之實施例僅用於說明目的，並且熟習此項技術者可以在不脫離所附申請專利範圍所闡明之本發明之精神及範圍的情況下進行各種修改及變更。 參考文獻
本文引用之所有參考文獻，包括以下參考文獻，並且包括但不限於以下或說明書其他部分中引用之所有專利案、專利申請案及非專利文獻，以引用方式整體併入本文。 1) DOI: 10.5772/36427 Affinity Chromatography for Purification of IgG from Human Plasma, Hofbauer L. et al. 2) US8945895B2 Methods of purifying recombinant ADAMTS13 and other proteins and compositions thereof. 3) WO2019133677 Adeno-associated virus purification methods.
無
[ 圖 1]為蛋白A結合IgG亞類串聯管柱I (蛋白A及CH1-XL)之UV概況。 [ 圖 2]為IgG Capture Select樹脂上非蛋白A結合亞類之UV概況 - 疊加穿流(FT)。 [ 圖 3]為IgG Capture Select樹脂上非蛋白A結合亞類之UV概況疊加溶析峰。 [ 圖 4]為IGC02之層析圖。 [ 圖 5]為IGC01S之層析圖。 [ 圖 6]為IGC04之層析圖。 [ 圖 7]為IGC04銀染之SDS page銀染概況。 1.加載，低溫上清液，1:560稀釋。 2.穿流，1:500稀釋。 3.WSD，管柱上SD_VI，1:10稀釋。 4.洗滌2，1:5稀釋。 5.洗滌3，1:5稀釋。 6.溶析液，1:100稀釋。 7.溶析液，1:50稀釋。 8.剝離，1:10稀釋。NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi凝膠1.0 mm. 20孔目錄號WG1402BX10，非還原性SDS運行緩衝液LDS-SB:NP0007，將50 µl樣品添加至20 µl碘乙醯胺中，在+18至26℃下孵育30分鐘，+50 µl緩衝液LDS-SB:NP0007在70℃下孵育10分鐘。泳道8及9表明溶析液之純度高得驚人。 [ 圖 8]為IGC06之層析圖。電導率(紅色)：UV280 (藍色) UV254 (紫色) pH：綠色。 [ 圖 9]為IGC06銀染之SDS page銀染概況。1. 分子量標記。2. 空白3. 加載，低溫上清液，1:560稀釋。4. 穿流，1:500稀釋。5. WSD，管柱上SD_VI，1:10稀釋。6. 洗滌2，1:5稀釋。7. 洗滌3，1:5稀釋。8. 溶析，稀釋1:100 IgG級分。9. 溶析，稀釋1:50 IgG級分。10. 剝離，1:10稀釋。NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi凝膠1.0mm。20孔目錄號WG1402BX10。非還原性SDS運行緩衝液LDS-SB:NP0007。將50µl樣品添加至20µl碘乙醯胺中，在+18至26℃下孵育30分鐘。+50µl緩衝液LDS-SB:NP0007在70℃下孵育10分鐘。 [ 圖 10]為用於將測試材料(10%多株免疫球蛋白)加載至蛋白A管柱上之模型流程圖。 [ 圖 11]為顯示來自 圖 10之溶析液等分至單獨管柱中之模型流程圖，每個管柱含有單獨親和層析介質。分別收集來自此等管柱中每一者之溶析液。 [ 圖 12]為顯示加載至蛋白A管柱上之測試材料(低溫上清液)之模型流程圖。將來自該管柱之溶析液加載至親和層析介質(例如，Capture Select CH1-XL)之管柱中。 [ 圖 13]為顯示加載至示例性親和配位體層析介質(CH1-XL)上之低溫上清液之蛋白A層析之溶析液的模型流程圖。 [ 圖 14]為顯示加載至蛋白A及親和層析介質之串聯陣列上之低溫上清液的模型流程圖。加載低溫上清液後，對陣列執行洗滌步驟。溶析液包含廣泛範圍之IgG亞類。 [ 圖 15]為蛋白A、Capture Select CH1-XL及Capture Select IgG3之三管柱陣列(TRIDEM)之模型流程圖。將低溫沉澱物加載至陣列上，並執行洗滌步驟。溶析液包含廣泛範圍之IgG亞類。 [ 圖 16]為示例性串聯及三聯層析陣列之概覽。

Claims (44)

  1. 一種自含有IgG之起始材料製備IgG調配物之親和層析方法，該調配物包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4中之一或多者，該方法包括： (a) 將該含有IgG之起始材料與第一層析介質接觸，該第一層析介質包含結合有蛋白A之第一固體支持物，從而形成具有蛋白A結合親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，並形成包含不與蛋白A結合之IgG亞類的第一穿流； (b) 使該第一穿流與第一親和配位體層析介質接觸，該第一親和配位體層析介質包含第二固體支持物，該第二固體支持物具有與其結合之具有IgG結合親和力之第一親和配位體，從而形成第一親和配位體結合之IgG亞類及包含不與該第一親和配位體結合之IgG亞類結合的IgG亞類的第二穿流； (c) 自該第一層析介質溶析該蛋白A結合級分，從而形成第一溶析液並將該第一溶析液與該第一親和配位體層析介質接觸，從而形成第二親和配位體結合之IgG亞類，及第二穿流；及 (d) 自第一親和配位體管柱溶析選自該第一親和配位體結合之IgG亞類、該第二親和配位體結合之IgG亞類及其組合之成員，從而形成第二溶析液。
  2. 如請求項1之方法，其中該第一穿流及該第二溶析液在該第一親和配位體層析介質上合併。
  3. 如請求項2之方法，其進一步包括： (e) 使(d)之該第二溶析液與第二親和配位體層析介質接觸，該第二親和配位體層析介質包含第三固體支持物，該第三固體支持物具有與其結合之具有IgG親和力之第二親和配位體，從而形成第三親和配位體結合之IgG亞類及包含未結合至該第二親和配位體層析介質之第四IgG亞類的第二穿流；及 (f)  自該第二親和配位體層析介質溶析選自該第二親和配位體結合之IgG亞類、該第四IgG亞類及其組合之成員，從而形成第三溶析液。
  4. 如請求項3之方法，其中該第一穿流及該第二溶析液在該第二親和配位體層析介質上合併。
  5. 如請求項1之方法，其進一步 在(b)之前包括(g)，使該第一層析介質與緩衝液/去污劑混合物接觸，該緩衝液/去污劑混合物不會自該第一層析介質中溶析具有蛋白A結合親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分。
  6. 如請求項3之方法，其進一步 在(f)之前包括(h)，使該第二親和配位體層析介質與緩衝液/去污劑混合物接觸，該緩衝液/去污劑混合物 不會明顯地自該第二親和配位體層析介質 溶析該第二親和配位體結合之IgG亞類。
  7. 如請求項5或6之方法，其中該緩衝液/去污劑混合物包含乙酸鹽、Tris、Triton X、磷酸三(正丁基)酯(TnBP)。
  8. 如請求項7之方法，其中該緩衝液/去污劑混合物包含： 具有約10 mM乙酸鈉、約10 mM TrisHCl及約120 mM NaCl的緩衝液成分，及具有約10.55 g Triton X、3.21 g聚山梨酯80及約2.91 g TnBP / kg該緩衝溶液的去污劑成分(相對於1 kg緩衝液，約16.6 g SD_VI試劑)。
  9. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之IgG佔該調配物之蛋白含量之至少約90% (wt/wt)。
  10. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之IgG1佔該調配物之蛋白含量之約40%至約90% (wt/wt)。
  11. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之IgG1佔該調配物之蛋白含量之約50%至約70% (wt/wt)。
  12. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之IgG2佔該調配物之蛋白含量之約10%至約50% (wt/wt)。
  13. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之IgG2佔該調配物之蛋白含量之約27%至約37% (wt/wt)。
  14. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之IgG3佔該調配物之蛋白含量之約0.1%至約50% (wt/wt)。
  15. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之IgG3佔該調配物之蛋白含量之約0.5%至約8% (wt/wt)。
  16. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之IgG4佔該調配物之蛋白含量之約3%至約70% (wt/wt)。
  17. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之IgG4佔該調配物之蛋白含量之約0.5%至約8% (wt/wt)。
  18. 如前述請求項中任一項之方法，其中：  (i)         該調配物中之IgG1佔該調配物之蛋白含量之約50%至約70% (wt/wt)； (ii)        該調配物中之IgG2佔該調配物之蛋白含量之約27%至約37% (wt/wt)； (iii)       該調配物中之IgG3佔該調配物之蛋白含量之約2.5%至約8% (wt/wt)；及 (iv)       該調配物中之IgG4佔該調配物之蛋白含量之約3%至約70% (wt/wt)。
  19. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之白蛋白之量小於約5 g/L該調配物。
  20. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中之因子XI活性小於約0.01 E/mL。
  21. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中存在之α-2-巨球蛋白之量小於約0.2 g/L該調配物。
  22. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中存在之轉鐵蛋白之量小於約0.09 g/L該調配物。
  23. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物之PL1活性小於約10 nm/mL min。
  24. 如前述請求項中任一項之方法，其中該調配物中存在之纖維蛋白原之量小於約35 µg/mL該調配物。
  25. 如前述請求項中任一項之方法，其中該含有IgG之起始材料為低溫上清液。
  26. 如前述請求項中任一項之方法，其中選自該包含具有蛋白A之第一固體支持物之第一層析介質、該包含結合有具有IgG結合親和力之第一親和配位體之第二固體支持物的第一親和配位體層析介質及其組合的成員包含在單獨管柱中。
  27. 如請求項21之方法，其中該等管柱中之兩者或兩者以上在陣列內流體連通，並且其中該等管柱中之兩者或兩者以上包含第二層析介質及第二親和配位體層析介質。
  28. 如請求項22之方法，其中第一管柱之出口與第二管柱之入口流體連通。
  29. 如請求項23之方法，其中具有蛋白A之管柱之出口與該第一親和配位體層析介質之入口流體連通。
  30. 如請求項22之方法，其中含有該第二層析介質之管柱之出口與含有該第二親和配位體層析介質之管柱之入口流體連通。
  31. 如前述請求項中任一項之方法，其中缺乏蛋白A結合IgG亞類之該IgG溶液包含選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其組合之成員。
  32. 如前述請求項中任一項之方法，其中該第一層析介質對人類IgG抗體之CH1結構域具有選擇性親和力。
  33. 如前述請求項中任一項之方法，其中該第一層析介質對選自IgG1及IgG3之成員之CH1結構域具有選擇性親和力，該選擇性親和力大於對選自IgG2及IgG4之成員之CH1結構域之選擇性親和力。
  34. 如前述請求項中任一項之方法，其中自該第一層析介質、該第一親和配位體層析介質、該第二親和配位體層析介質溶析使用包含甘胺酸之溶析劑。
  35. 如請求項29之方法，其中該甘胺酸濃度為約50 mM至約150 mM。
  36. 一種自缺乏蛋白A結合IgG亞類之血漿源性IgG溶液中製備富含具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類的IgG調配物的親和層析方法，該方法包括： (a) 使缺乏蛋白A結合IgG亞類之該IgG溶液與第一親和配位體層析介質接觸，該第一親和配位體層析介質包含第一固體支持物，該第一固體支持物具有與其結合之具有IgG結合親和力之第一親和配位體，從而形成具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之第一結合級分及第一穿流；及 (b) 溶析該具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之第一結合級分，從而形成包含富含該具有低蛋白A結合之第一IgG亞類之IgG調配物的第一溶析液。
  37. 如請求項31之方法，其進一步 在(b)之前包括(c)，使該具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之第一結合級分與緩衝液/去污劑溶液接觸，並且隨後自該第一親和配位體層析介質中移除該去污劑溶液。
  38. 如請求項31之方法，其進一步 在(b)之後包括(d)，使該第一溶析液與第二層析介質接觸，該第二層析介質包含固體支持物，該固體支持物具有與其結合之親和配位體，該親和配位體對具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類具有親和力，從而形成具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類之第一結合級分；及 (e) 自該第二層析介質溶析該具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類之第一結合級分，從而形成第二溶析液。
  39. 如請求項33之方法，其進一步 在(e)之前包括(f)，使該具有低蛋白A結合親和力之第二IgG亞類之第一結合級分與緩衝液/去污劑溶液接觸，並且隨後自該第一層析介質中移除該去污劑溶液。
  40. 如請求項31之方法，其進一步 在(a)之前包括(g)，使血漿源性IgG溶液與包含結合至固體支持物上之蛋白A之蛋白A層析介質接觸，形成對蛋白A具有高親和力之IgG亞類之蛋白A結合級分，及該富含具有低蛋白A結合親和力之第一IgG亞類之IgG調配物。
  41. 如請求項31之方法，其進一步包括： (h) 自該蛋白A層析介質中溶析對蛋白A具有高親和力之IgG亞類之該蛋白A結合級分，形成第三溶析液。
  42. 如請求項31-36中任一項之方法，其進一步包括合併該第一溶析液、該第二溶析液及該第三溶析液中之兩者或兩者以上的步驟。
  43. 一種包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質之IgG水溶液，其中該IgG水溶液包含小於約0.0025 E/mg總IgG，較佳小於約0.0020 E/mg總IgG，更佳小於約0.0015 E/mg總IgG，且最佳小於約0.0012 E/mg總IgG之活性的因子XI作為雜質。
  44. 一種包含至少約99.5% IgG及小於約0.5%雜質之IgG水溶液，其中該IgG水溶液包含小於約3.5 µg/mg總IgG，較佳小於約3.0 µg/mg總IgG，更佳小於約2.5 µg/mg總IgG，最佳小於約2.2 µg/mg總IgG之水準的補體C3作為雜質。
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