ES2595059T3

ES2595059T3 - Métodos para la producción a escala industrial de preparados terapéuticos del Factor H del complemento a partir de plasma humano

Info

Publication number: ES2595059T3
Application number: ES08716651.8T
Authority: ES
Inventors: Uwe Liebing; Hermann Karges
Original assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Current assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Priority date: 2007-03-20
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2016-12-27
Anticipated expiration: 2028-03-20
Also published as: EP2129686A1; EP2129686B1; WO2008113589A1

Abstract

Un método para la purificación de Factor H del complemento en una solución que comprende los pasos de: a) proporcionar una fracción que comprende Factor H del complemento mediante la precipitación fraccionada a gran escala de suero o plasma humano con etanol, donde mediante dicho proceso de precipitación fraccionada a gran escala se produce al menos una proteína farmacéutica adicional que se puede obtener comercialmente; b) purificar adicionalmente el Factor H del complemento mediante al menos un método de purificación seleccionado del grupo siguiente: I. Cromatografía de afinidad de heparina II. Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) III. Cromatografía de intercambio aniónico (AEC) IV. Cromatografía de intercambio catiónico (CEC) V. Cromatografía de hidroxiapatita (HAC) VI. Cromatografía de inmunoafinidad c) tratar la fracción que contiene el Factor H del complemento al menos una vez antes, durante o después del paso b) de dicho proceso de purificación con un método de desactivación y/o eliminación de virus/patógenos; donde la purificación del Factor H del complemento comprende los siguientes pasos del proceso: I. una cromatografía de intercambio aniónico inicial II. seguida de una cromatografía de interacción hidrófoba III. seguida de pasteurización IV. seguida de una cromatografía de afinidad de heparina V. seguida de nanofiltración.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para la produccion a escala industrial de preparados terapeuticos del Factor H del complemento a partir de plasma humano

Descripcion

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a procesos de produccion industrial a gran escala de preparados del Factor H del complemento derivados de plasma humano para uso terapeutico.

Antecedentes de la invencion

Entre los expertos se considera que el Factor H del complemento desempena una funcion central en ciertas enfermedades poco habituales pero graves asociadas con la activacion del complemento mediante la via alternativa [“Membranoproliferative Glomerulonephritis type II (Dense Deposit Disease): An Update”, J Am Soc Nephrol 16: 1392-1404, 2005; “Complement and diseases: Defective alternative pathway control results in kidney and eye diseases”; P.F. Zipfel et al. / Molecular Immunology 43 (2006) 97-106]. En la bibliograffa se han descrito ejemplos de pacientes afectados que han sido tratados con exito con plasma fresco congelado para sustituir Factor H del complemento ausente o disfuncional [Licht et al. American Journal of Kidney diseases, Vol. 45, N.° 2 (febrero), 2005: pag. 415-421 / “Successful plasma therapy in hemolytic uremic syndrome with complement Factor H deficiency”, S. Nathanson, V. Fremeaux-Bacchi, G. Deschenes, Pediatric Nephrology Vol. 16 N^ 7, (2001) pag. 554-556 / Nephrol. Dial. Transplant. 2002, 17: 684]. A pesar de ello, este tratamiento con plasma fresco congelado se relaciona con ciertas desventajas, p. ej., el gran volumen necesario para infundir la cantidad deseada de Factor H del complemento, el riesgo de reacciones alergicas asociado con la gran cantidad de protemas inherentes infundidas y el riesgo de transmitir patogenos de transmision sangumea.

A dfa de hoy, no existe ninguna composicion farmaceutica que comprenda un concentrado del Factor H del complemento que permita la sustitucion del Factor H del complemento de un modo mas conveniente, mejor tolerado (menos volumen, menos impurezas) y mas seguro (menor riesgo de transmitir patogenos de transmision sangumea). Ademas, un concentrado del Factor H del complemento permitina disponer de una dosis mas elevada, lo cual podna suponer ventajas en ciertos casos. Por consiguiente, es claramente evidente que existe una demanda por un concentrado del Factor H del complemento de este tipo para uso terapeutico.

Una fuente adecuada para la fabricacion de un concentrado del Factor H del complemento es el plasma sangumeo humano, en el que el Factor H del complemento se encuentra con una concentracion de aprox. 500 (200-600) mg/L. El plasma sangumeo humano se ha utilizado industrialmente durante decadas para la fabricacion de productos proteicos del plasma ampliamente establecidos y aceptados tales como, p. ej., albumina humana, preparados de inmunoglobulina (IgG), concentrados de factores de coagulacion (Factor de coagulacion VIII, Factor de coagulacion IX, complejo de protrombina, etc.) e inhibidores (Antitrombina, inhibidor C1, etc.). Durante el desarrollo de tales farmacos derivados del plasma, se han establecido metodos de fraccionamiento del plasma, que han proporcionado productos intermedios enriquecidos en ciertas fracciones proteicas, los cuales sirven entonces como material de partida para el producto proteico del plasma correspondiente. Se revisan los procesos habituales en, p. ej., Schultze HE, Heremans JF; Molecular Biology of Human Proteins. Volume I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; pags. 236-317, y en las figuras 1 y 2 se proporcionan representaciones esquematicas simplificadas de tales procesos. Estos tipos de tecnologfas de separacion permiten la fabricacion de varios productos proteicos del plasma terapeuticos procedentes de la misma fuente donante de plasma, lo cual proporciona ventajas desde el punto de vista economico en comparacion con la produccion de un unico producto proteico del plasma procedente de una unica fuente donante y, por consiguiente, se han adoptado como el estandar industrial en el fraccionamiento de plasma sangumeo.

Los procesos industriales modernos de fraccionamiento del plasma estan controlados por autoridades reguladoras (p. ej., FDA (siglas en ingles referentes a la Agencia de Alimentos y Medicamentos), EMEA (siglas en ingles referentes a la Agencia Europea de Medicamentos)) y deben cumplirse regulaciones estrictas (cGMP, siglas en ingles referentes a las buenas practicas de fabricacion actuales) en cuanto a la solidez de los procesos y la calidad constante de los productos farmaceuticos resultantes. Resulta complejo realizar cambios en los procesos de fabricacion autorizados en cuanto al tiempo y el esfuerzo que supone su validacion y, ademas, se corre el riesgo de que estos cambios afecten de forma negativa a la calidad del producto farmaceutico. Por lo tanto, en el desarrollo de procesos de fabricacion a escala industrial para nuevas protemas terapeuticas procedentes de plasma humano, como es el caso del Factor H del complemento, resulta deseable mantener la integridad de procesos ya existentes/autorizados.

La presente invencion proporciona metodos de extraccion del Factor H del complemento a partir de fracciones secundarias de procesos de fraccionamiento del plasma existentes/autorizados a escala industrial/gran escala y el

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procesamiento adicional para obtener preparados farmaceuticos a escala industrial/gran escala.

La expresion “escala industrial/gran escala”, respecto a la presente invencion, se refiere a un procedimiento de produccion basado en al menos 200 L de plasma, preferentemente al menos 500 L, aun mas preferentemente al menos 2000 L de plasma humano. Respecto a la produccion, los procesos reivindicados que parten de plasma humano deben basarse en el subfraccionamiento de intermedios industriales habituales obtenidos mediante los procesos de fraccionamiento del plasma mencionados anteriormente. El sobrenadante del precipitado en etanol al 8% (metodo de Cohn et al.; Schultze et al. (remffase mas arriba), pag. 251), el precipitado II+IlI (metodo de Oncley et al.; Schultze et al. (remftase mas arriba) pag. 253) o el precipitado B (metodo de Kistler y Nitschmann; Schultze et al. (remffase mas arriba), pag. 253) son ejemplos de una fuente de Factor H del complemento compatible con el fraccionamiento del plasma a escala industrial de un modo tal que el Factor H del complemento se encuentra enriquecido en fracciones secundarias que no afectan a procesos de fabricacion ya establecidos y autorizados de productos del plasma que estan siendo inspeccionados por las autoridades reguladoras farmaceuticas.

Durante la fabricacion de antitrombina III (AT) a partir del sobrenadante de etanol al 8% mediante cromatograffa de afinidad de heparina, el Factor H del complemento, en ciertas condiciones, se une a la Heparina inmovilizada y se puede purificar a partir de fracciones (residuales) que no contengan AT. En los casos en los que no se absorbe AT procedente del sobrenadante al 8% o en los que el Factor H del complemento no se une a la resina de afinidad de Heparina en las condiciones dadas, el Factor H del complemento se encuentra enriquecido en los precipitados secundarios de los procesos de fabricacion de inmunoglobulina establecidos y se considera como una impureza.

Un aspecto adicional en la fabricacion de preparados proteicos del plasma terapeuticos es el riesgo potencial de transmitir patogenos de transmision sangumea, p. ej., el virus de la hepatitis B y C (VHB y VHC), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotropico humano de celulas T (VLHT-I), parvovirus B19, virus de la hepatitis A (VHA), citomegalovirus (CMV) [revisados en: “Virus safety of human blood, plasma, and derived products”; Thrombosis Research, Volumen 107, Suplemento 1, 31 de octubre de 2002, paginas S39-S45 Lutz G. Guertler)] y, aunque con un riesgo menor, agentes causantes de encefalopaffas espongiformes transmisibles (EET).

La presente invencion proporciona preparados farmaceuticos del Factor H del complemento producidos mediante los metodos de la invencion. Los preparados producidos de este modo tienen concentraciones del Factor H del complemento de 5 mg/mL o superiores, preferentemente 50 mg/mL o superiores, mas preferentemente 100 mg/mL o superiores.

Antecedentes

El Factor H del complemento fue descrito por primera vez por Nilsson y Mueller-Eberhard (J Exp Med, 122, pag. 277-298) y en la bibliograffa se describen varios metodos para su purificacion (p. ej., Alsenz et al., Biochem J (1984), 224, 389-398 / Fearon, J. Immunol. (1977) 119, 1248-1252 / Crossley et al., Biochem J (1980), 191. 173-182). A pesar de ello, estos metodos son tecnologfas ffpicas de pequena escala para obtener una unica protema de pureza elevada con el proposito de caracterizarla y no son adecuados para la fabricacion rutinaria de farmacos proteicos del plasma. Los procedimientos de purificacion citados en EP0222611 tambien son metodologfas de laboratorio ffpicas desarrolladas exclusivamente para la purificacion unicamente del Factor H del complemento a partir de suero o plasma humano.

La solicitud de patente PCT/EP2006/005631 describe un proceso para la purificacion de Factor H del complemento funcional basado en intermedios obtenidos mediante la precipitacion fraccionada a gran escala de plasma o suero humano con etanol, que no afecta a la aprobacion reguladora de otras protemas terapeuticas que se obtienen comercialmente a partir de plasma, asf como tambien un proceso para la purificacion de Factor H del complemento funcional en el cual la purificacion se basa en el sobrenadante del precipitado en etanol al 8% de acuerdo con el metodo de Cohn o el precipitado III de acuerdo con el metodo de Oncley o el precipitado B de acuerdo con el metodo de Kistler y Nitschmann. El documento PCT/EP2006/005631 tambien describe un proceso para la purificacion de Factor H del complemento funcional, basado en intermedios obtenidos mediante la precipitacion fraccionada a gran escala de suero o plasma humano con etanol en combinacion con procedimientos cromatograficos, donde estos procedimientos cromatograficos se pueden basar en la precipitacion con polietilenglicol (Nagasawa S, Stroud RM; Mol Immunol 1980; 17: 1365-72), cromatograffa de afinidad mediante heparina inmovilizada (citacion segun se ha indicado mas arriba), cromatograffa de intercambio ionico (Crossley LG, Porter RR; Biochem J 1980; 191 : 173-82) y cromatograffa de interaccion hidrofoba (Ripoche J, Al Salihi A, Rousseaux J, Fontaine M ; Biochem J 1984; 221, 89-96). Finalmente, el documento PCT/EP2006/005631 describe un proceso para la purificacion de Factor H del complemento funcional a partir de un eluato separando el Factor H del complemento de la antitrombina III.

Moure et al. (2003) Meat Science Vol. 64, N.° 4, paginas 391 - 398 describe un proceso de acoplamiento para el fraccionamiento proteico del plasma que utiliza precipitacion en etanol y cromatograffa de intercambio ionico.

Bumouf (1995) Journal of Chromatography B 664, paginas 3 - 15 es un arffculo de revision sobre los beneficios y las

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tendencias futuras de la cromatograffa en el fraccionamiento del plasma.

Burnouf y Radosevich (2003) Haemophilia 9, paginas 24 - 37 es un arffculo de revision sobre la nanofiltracion de productos biofarmaceuticos derivados de plasma.

Bakaltcheva et al. (2007) Thrombosis Research 120, paginas 105 - 116 evalua la sacarosa, la trehalosa, el sorbitol, el manitol y la glicina como estabilizantes para plasma entero liofilizado.

Pikal et al. (1991) Pharmaceutical Research Vol. 8, N.° 4, paginas 427 - 436 investiga los efectos de variables de formulacion sobre la estabilidad de una hormona de crecimiento humana liofilizada.

El documento EP 0 317 376 A1 se refiere a un proceso para la preparacion de un concentrado de Factor IX de pureza elevada.

El documento EP 1 739 093 A1 describe procesos para la separacion de protemas del plasma, en particular de fibrinogeno y Factor XIII.

Compendio de la invencion

La presente invencion proporciona procesos de produccion industrial a gran escala para preparados del Factor H del complemento derivados de plasma humano para uso terapeutico, que utilizan fracciones secundarias de procesos de fraccionamiento ya establecidos y autorizados que no afectan a la integridad de dichos procesos autorizados, combinados con metodos para la desactivacion y/o eliminacion de virus/patogenos.

Descripcion detallada de la invencion

Por consiguiente, la invencion se refiere a un metodo para la purificacion de Factor H del complemento en una solucion que comprende los pasos de:

a) proporcionar una fraccion que comprende Factor H del complemento mediante la precipitacion fraccionada a gran escala de suero o plasma humano con etanol, donde mediante dicho proceso de precipitacion fraccionada a gran escala se produce al menos una protema farmaceutica adicional que se puede obtener comercialmente

b) purificar adicionalmente el Factor H del complemento mediante al menos un metodo de purificacion seleccionado del grupo siguiente:

I. Cromatograffa de afinidad de heparina

II. Cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC, por sus siglas en ingles)

III. Cromatograffa de intercambio anionico (AEC, por sus siglas en ingles)

IV. Cromatograffa de intercambio cationico (CEC, por sus siglas en ingles)

V. Cromatograffa de hidroxiapatita (HAC, por sus siglas en ingles)

VI. Cromatograffa de inmunoafinidad

c) tratar la fraccion que contiene el Factor H del complemento al menos una vez antes, durante o despues del paso b) de dicho proceso de purificacion con un metodo de desactivacion y/o eliminacion de virus/patogenos;

donde la purificacion del Factor H del complemento comprende los siguientes pasos del proceso:

I. una cromatograffa de intercambio anionico inicial

II. seguida de una cromatograffa de interaccion hidrofoba

III. seguida de pasteurizacion

IV. seguida de una cromatograffa de afinidad de heparina

V. seguida de nanofiltracion.

La protema farmaceutica adicional podffa ser, a modo de ejemplo no limitante, una o mas de las protemas seleccionadas entre albumina, antitrombina III, Factor VIII, Factor IX, fibrinogeno, Factor XIII, trombina (FIIa), FVII/IIa, preparados de complejos de protrombina (PPSB), inhibidor de la proteinasa alfa-1, inhibidor C1, inmunoglobulinas, transferrina, butirilcolinesterasa.

La tecnologfa de desactivacion o eliminacion de virus/patogenos se puede seleccionar, a modo de ejemplo no limitante, entre pasteurizacion, tratamiento con disolvente/detergente o nanofiltracion.

La pasteurizacion, en el sentido de la invencion, se refiere a metodos que exponen una composicion lfquida del Factor H a una temperatura de 60 ± 1 °C durante un tiempo de al menos 10 h

El tratamiento con disolvente/detergente, en el sentido de la invencion, se refiere a metodos de tratamiento de una

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composicion Ifquida del Factor H con formulaciones de fosfato de tri-n-butilo y un detergente seleccionado del grupo constituido por Triton X-100, Tween o colato sodico.

La nanofiltracion, en el sentido de la invencion, se refiere a metodos para eliminar virus y/o agentes causantes de encefalopatfas espongiformes transmisibles (EET) de una composicion lfquida del Factor H, comprendiendo dicho 5 metodo filtrar dicha solucion del Factor H a traves de un filtro que tenga un tamano de poro < 80 nm.

Las diferentes tecnoIog^as de purificacion se pueden repetir una o varias veces o se pueden combinar unas con otras dependiendo del nivel deseado de pureza para el Factor H del complemento de grado farmaceutico final.

La cromatograffa, en el sentido de la invencion, se refiere a una cualquiera de las siguientes tecnicas:

• aplicar el Factor H del complemento en solucion a una matriz de union respectiva, unir el Factor H del 10 complemento a dicha matriz, opcionalmente lavar dicha matriz una o mas veces, en unas condiciones en las que el

Factor H del complemento permanezca unido a la matriz, aplicar a continuacion una solucion a la matriz con el Factor H del complemento unido que provoque la elucion del Factor H del complemento a partir de la matriz de union, o

• aplicar el Factor H del complemento en solucion a una matriz de union respectiva, unir las impurezas a dicha 15 matriz a la vez que se deja el Factor H en la fraccion no unida.

Opcionalmente, dichos procesos tambien comprenderan un paso de precipitacion/eliminacion de lfpidos, o la adicion de un inhibidor de proteasas o la eliminacion de una proteasa.

La invencion engloba preparados del Factor H del complemento obtenidos mediante cualquiera de los procesos mencionados anteriormente.

20 Un preparado farmaceutico, en el sentido de la invencion, es cualquier composicion que comprenda Factor H del complemento que se pueda utilizar en medicina.

Una realizacion preferida de los metodos expuestos anteriormente para la purificacion del Factor H consiste en empezar la purificacion a partir de una fraccion que comprenda Factor H del complemento obtenida mediante la precipitacion fraccionada a gran escala de suero o plasma humano con etanol la cual es una fraccion residual, p. ej., 25 una fraccion a partir de la cual no se obtiene ningun producto farmaceutico en la actualidad.

Figuras:

Figura 1: representacion esquematica de un fraccionamiento de plasma industrial de Cohn/Oncley modificado Figura 2: representacion esquematica de un fraccionamiento de plasma industrial de Kistler/Nitschmann modificado Ejemplos:

30 Las concentraciones del Factor H del complemento a las que se hace referencia en las siguientes secciones se obtienen mediante un ensayo de inmunodifusion radial (RID, por sus siglas en ingles) disponible en el mercado ("HUMAN FACTOR H 'NL' BlNDARID™"; codigo del producto: RN030.3; The Binding Site Limited, Birmingham, Reino Unido).

1. Obtencion de una fraccion que comprende Factor H del complemento

35 a. Sobrenadante en etanol al 8% (Fraccion I) en el fraccionamiento de Cohn(Oncley)

Cuando se aplican los metodos de fraccionamiento de Cohn/Oncley, el Factor H del complemento se encuentra comprendido en el sobrenadante de la precipitacion en etanol al 8%. En el caso de separar antitrombina III (AT) a partir del sobrenadante en etanol al 8% mediante cromatograffa de afinidad de Heparina, el Factor H del complemento, en ciertas condiciones, se une a la Heparina inmovilizada y se puede purificar a partir de las 40 fracciones (residuales) que no contienen AT (remftase mas abajo).

b. Fraccion III en el fraccionamiento de Cohn(Oncley)

Si el Factor H del complemento no se recupera partir del sobrenadante en etanol al 8%, se encuentra enriquecido en la Fraccion III, una fraccion secundaria de los procedimientos tfpicos de produccion de inmunoglobulina.

c. Precipitado B en el fraccionamiento de Kistler/Nitschmann

45 Cuando se utilizan los metodos de fraccionamiento de Kistler/Nitschmann, el Factor H del complemento se encuentra enriquecido en el Precipitado B, una fraccion secundaria de los procedimientos tfpicos de produccion de

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inmunoglobulina.

2. Metodos de purificacion adicionales

a. Cromatograffa de afinidad de heparina

Ya que el Factor H del complemento tiene una afinidad conocida por los glicosaminoglicanos, la cromatograffa de afinidad de heparina es un metodo de purificacion adecuado. Se puede utilizar heparina o derivados de heparina o productos que mimeticen la heparina, inmovilizados en matrices de base polimerica o basadas en agarosa. Algunos ligandos de afinidad similares a la heparina alternativos de funcion comparable son, p. ej., el sulfato de condroitina, sulfato de heparan, sulfato de dermatan, sulfato de queratan, u oligomeros sinteticos, p. ej., ester del sulfato de celobiosa (sulfato de cellufine Matrex ™), o analogos terapeuticos de la heparina, p. ej., oligosacaridos sulfatados que representan estructuras parciales de la heparina (p. ej., pentasacaridos sulfatados, tetrasacaridos sulfatados).

La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un fraccionamiento de Kistler/Nitschmann o dicha fraccion en la cual se han eliminado los lfpidos, p. ej., mediante el metodo descrito en el apartado 2.g.) se formula para obtener una conductividad correspondiente < 25 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna con una resina de afinidad de heparina (heparina inmovilizada en Toyopearl HW-65). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 - 1 mol/L) en el mismo tampon.

El sobrenadante al 8% de un fraccionamiento de Cohn/Oncley modificado (remftase a la Figura 1) se sometio a una cromatograffa de afinidad de heparina. Se anadieron aprox. 0.08 L de resina de afinidad de heparina (heparina inmovilizada en Toyopearl HW-65) por litro de sobrenadante al 8% y la suspension se agito durante aprox. 1 h en condiciones de refrigeracion. Posteriormente, la resina se recupero por filtracion y se transfirio a una columna de cromatograffa. El Factor H del complemento se eluyo de la resina utilizando una solucion que contema aprox. 0.25 mol/L de citrato trisodico dihidratado a un pH de 6.25, mientras que la ATIII permanecio unida a la columna.

Tabla 1: Factor H del complemento purificado mediante cromatograffa de afinidad de heparina basandose en un sobrenadante en etanol al 8% (Fraccion I) del fraccionamiento de Cohn(Oncley)

Muestra: Volumen [L] Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Sobrenadante al 8%: 2955 n.a. 308 100

Eluato de citrato: 500 8.6 1530 84

Este proceso para purificar el Factor H del complemento no afecta a los procesos de fabricacion autorizados del producto ATIII ni de los productos preparados a partir del fraccionamiento del sobrenadante de afinidad de heparina (p. ej., IgG, albumina, a-1 PI, etc.).

b. Cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC)

El Factor H del complemento, en ciertas condiciones, se une a resinas de HIC adecuadas y se puede desorber con sistemas tampon de fuerza ionica baja. Algunos ligandos de HI adecuados son, p. ej., fenilo, octilo, butilo, metilo, asf como tambien ligandos modem multimodales (p. ej. hexilamina, fenilpropilamina, 4-mercaptoetilpiridina) inmovilizados en matrices de base polimerica o basadas en agarosa. Algunos ejemplos de medios multimodales o medios de HIC disponibles en el mercado son, p. ej., Fenil Sepharose, Octil Sepharose, Butil Sepharose, Capto™ MMC (todos ellos de GE Healthcare), Toyopearl Fenil-650, Toyopearl Butil-650, Toyopearl Hexil-650 (todos ellos de Tosoh Biosciences), soporte para HIC Macro-Prep Metil, soporte para HIC Macro-Prep t-Butil (Bio-Rad), HEA HyperCel; PPA HyperCel, MEP HyperCel (todos ellos de Pall). En una realizacion preferida, se utiliza butilo como ligando, lo cual da como resultado la mejor recuperacion del Factor H del complemento.

La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un fraccionamiento de Kistler/Nitschmann o dicha fraccion en la cual se han eliminado los lfpidos, p. ej., mediante el metodo descrito en el apartado 2.g.) se formula para obtener una conductividad correspondiente > 100 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con Butil Sepharose FF (GE Healthcare). La columna se lava con una solucion tampon de alto contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico, 2 mol/L de NaCl) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente

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descendente de NaCI (2-0 mol/L) en el mismo tampon.

El lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% se sometio a un proceso de eliminacion de I^pidos (remffase mas abajo) y se ajusto hasta obtener una conductividad de aprox. 130 mS/cm mediante la adicion de NaCl y un valor de pH de 5.5. La solucion se aplico a una columna empaquetada con Butil Sepharose FF (GE Healthcare) y el Factor H del complemento se unio a la resina en dichas condiciones. Despues de lavar la columna con una solucion tampon de alto contenido en sales (2 mol/L de NaCl, 200 mmol/L de citrato trisodico dihidratado, pH de 5.5), el Factor H del complemento se eluyo mediante un gradiente por pasos hasta llegar a un 30% de la concentracion de NaCl inicial en el mismo tampon.

Tabla 2: Factor H del complemento purificado mediante cromatograffa de interaccion hidrofoba basandose en un sobrenadante en etanol al 8% (Fraccion I) del fraccionamiento de Cohn(Oncley)

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Filtrado de PEG: 4.1 915 100

Eluato de Butil Sepharose: 1.5 1503 75

c. Cromatograffa de intercambio anionico (AEC)

El Factor H del complemento, en ciertas condiciones, se une a resinas de AEC adecuadas y se puede desorber con sistemas tampon de fuerza ionica elevada. Algunos ligandos de AEC adecuados son, p. ej., dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) o amonio cuaternario (Q) inmovilizado en matrices de base polimerica o basadas en agarosa. Algunos medios de intercambio anionico disponibles en el mercado son, p. ej., DEAE-Sepharose, Q- Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl Super Q-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TmAe (Merck KGaA), soporte Macro-Prep DEAE, suporte Macro-Prep High Q (BioRad), DEAE HyperD, Q HyperD, DEAE Trisacryl, DEAE Sperodex (todos ellos de Pall). En una realizacion preferida, se utiliza amonio cuaternario inmovilizado en una matriz base constituida al menos parcialmente por dextrano (Q- Sepharose XL, Capto™ Q) debido a una capacidad de union del Factor H del complemento significativamente superior en comparacion con otros medios de AEC.

Los medios de AEC que presentan una capacidad de union baja o mas baja para el Factor H se pueden utilizar en modo negativo, lo cual significa que, en ciertas condiciones, unicamente las impurezas se unen a la matriz, mientras que el Factor H permanece en la fraccion no unida. Algunos ejemplos de medios de AEC con una capacidad de union baja o mas baja para el Factor H son, p. ej., DEAE Sepharose FF, Toyopearl DEAE-650, soporte MacroPrep DEAE.

La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un fraccionamiento de Kistler/Nitschmann o dicha fraccion en la cual se han eliminado los lfpidos, p. ej., mediante el metodo descrito en el apartado 2.g.) se formula para obtener una conductividad correspondiente < 6 mS/cm (25 °C) y un pH de 7 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con Q-Sepharose XL (GE Healthcare). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico, 2 mol/L de NaCl) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 -1 mol/L) en el mismo tampon.

La fraccion secundaria rica en Factor H del complemento procedente del paso de afinidad de heparina de acuerdo con el ejemplo 1 o, como alternativa, el material sometido al proceso de eliminacion de lfpidos de acuerdo con 2 g se ajusto hasta obtener un valor de pH de 9 y se diluyo hasta obtener una conductividad < 6 mS/cm. La solucion diluida se aplico a una columna empaquetada con Capto™ Q (GE Healthcare) y el Factor H del complemento se unio a la resina en dichas condiciones. Despues de lavar la columna con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de TRIS, pH de 7.5), el Factor H del complemento se eluyo mediante un gradiente ascendente de NaCl (0 - 0.5 mol/L) en el mismo tampon.

Tabla 3: Factor H del complemento purificado mediante cromatograffa de intercambio anionico basandose en un sobrenadante en etanol al 8% (Fraccion I) del fraccionamiento de Cohn(Oncley)

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Filtrado de PEG: 3.6 735 100

Eluato de Capto Q: 2.9 2355 76

La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatografia de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un 5 fraccionamiento de Kistler/Nitschmann o dicha fraccion en la cual se han eliminado los Kpidos, p. ej., mediante el metodo descrito en el apartado 2.g.) se formula para obtener una conductividad correspondiente < 20 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con DEAE-Sepharose FF (GE Healthcare). En estas condiciones, el Factor H se encuentra comprendido en la fraccion no unida. 10 Opcionalmente, la columna se puede lavar posteriormente con una solucion tampon de bajo contenido en sales para recuperar cantidades traza del Factor H que hayan quedado en la fase fiquida del empaquetamiento de la columna.

d. Cromatografia de intercambio cationico (CEC)

El Factor H del complemento, en ciertas condiciones, se une a resinas de CEC adecuadas y se puede desorber con sistemas tampon de fuerza ionica elevada. Algunos ligandos de CEC adecuados son, p. ej., carboximetilo (CM), 15 sulfopropilo (SP) o metilsulfonato (S) o similares, inmovilizados en matrices de base polimerica o basadas en agarosa. Algunos medios de intercambio cationico disponibles en el mercado son, p. ej., CM-Sepharose, SP- Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl CM-650, Toyopearl SP-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD SO3', Fractogel eMd COO- (Merck KGaA), soporte Macro-Prep CM, soporte Macro-Prep High S (BioRad), CM HyperD, S HyperD, CM Trisacryl, SP Trisacryl, SP Sperodex (todos ellos de Pall).

20 La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatografia de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un fraccionamiento de Kistler/Nitschmann o dicha fraccion en la cual se han eliminado los lfpidos, p. ej., mediante el metodo descrito en el apartado 2.g.) se formula para obtener una conductividad correspondiente < 20 mS/cm (25 °C) 25 y un pH de 5 - 7 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con Fractogel EMD SO3" (Merck). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 - 1 mol/L) en el mismo tampon.

30 La fraccion secundaria rica en Factor H del complemento procedente del paso de afinidad de heparina de acuerdo con el ejemplo 1 o, como alternativa, el material sometido al proceso de eliminacion de lfpidos de acuerdo con la seccion 2 g se ajusto hasta obtener un valor de pH de 6 y se diluyo hasta obtener una conductividad < 6 mS/cm. La solucion diluida se aplico a una columna empaquetada con SP Sepharose FF (GE Healthcare) y el Factor H del complemento se unio a la resina en dichas condiciones. Despues de lavar la columna con una solucion tampon de 35 bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado, pH de 6.5), el Factor H del complemento se eluyo mediante un gradiente ascendente de NaCl (0 - 0.5 mol/L) en el mismo tampon.

Tabla 4: Factor H del complemento purificado mediante cromatografia de intercambio cationico basandose en un sobrenadante en etanol al 8% (Fraccion I) del fraccionamiento de Cohn(Oncley)

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Filtrado de PEG: 3.9 840 100

Eluato de SP Sepharose: 5.6 3500 95

40 e. Cromatografia de hidroxiapatita (HAC)

El Factor H del complemento se puede purificar utilizando compuestos constituidos por preparados de fosfato calcico, fluoroapatita, hidroxiapatita o similares a hidroxiapatita como fase solida para cromatografia. Tales medios pueden ser, p. ej., Bio-Gel de hidroxiapatita HT y HTP (Bio-Rad), Fluoroapatita ceramica, Hidroxiapatita ceramica (Bio-Rad), hA Ultrogel (Pall) y similares.

45 El Factor H del complemento, en ciertas condiciones, se une a la matriz de HA y se puede desorber utilizando sistemas tampon que contienen concentraciones de sal, preferentemente fosfato, cada vez mayores.

La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatografia de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un

fraccionamiento de Kistler/Nitschmann o dicha fraccion en la cual se han eliminado los Ifpidos, p. ej., mediante el metodo descrito en el apartado 2.g.) se formula para obtener una conductividad correspondiente < 15 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con HA Ultrogel (Pall). 5 La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (p. ej., 10 mmol/L de fosfato de potasio) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de fosfato (0 -1 mol/L).

f. Cromatografia de inmunoafinidad

El Factor H del complemento se puede capturar y purificar mediante cromatograffa de inmunoafinidad. Se inmovilizan anticuerpos espedficos para el Factor H del complemento en matrices de cromatograffa adecuadas. Las 10 matrices adecuadas para aplicaciones a gran escala son resinas preactivadas, p. ej., Sepharose 6B activada con epoxi, EAH Sepharose 4B, Amino Sepharose 6 FF, 6-AKS Sepharose 4FF, Toyopearl AF Epoxi, Toyopearl AF Amino, Toyopearl AF Tresilo o similares. Los procedimientos de acoplamiento son conocidos por los expertos en la tecnica. Las soluciones que contienen el Factor H del complemento se aplican en tales inmunoadsorbentes en condiciones en las que el Factor H del complemento se una a los anticuerpos inmovilizados. Las impurezas no 15 unidas se eliminan lavandolas con sistemas tampon adecuados (p. ej., tampon de citrato, tampon de fosfato, tampon de HEPES) y posteriormente se eluye el Factor H del complemento a partir del inmunoadsorbente utilizando, p. ej., concentraciones lo suficientemente elevadas de sales caotropicas (p. ej., tiocianato, bromuro de litio, etc.) o sistemas tampon de pH bajo (p. ej., glicina, pH de 2 - 3) o sistemas tampon de pH elevado (p. ej., tampon de TRIS, pH de 9).

La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de 20 afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un fraccionamiento de Kistler/Nitschmann o dicha fraccion en la cual se han eliminado los lfpidos, p. ej., mediante el metodo descrito en el apartado 2.g.) se formula en HEPES a un pH de 7.6. La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con un inmunoadsorbente portador de anticuerpos anti-Factor 25 H. La columna se lava con el tampon de HEPES mencionado y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de KCNS (0 -1 mol/L).

3. Pasos de purificacion adicionales opcionales

a. Eliminacion de lipidos

Debido a que las fracciones ricas en el Factor H del complemento a las que se hace referencia en la seccion “1. 30 Obtencion de una fraccion que comprende Factor H del complemento” pueden contener impurezas de lipoprotemas o lfpidos, podna ser necesario eliminarlas antes de las tecnicas de purificacion posteriores basadas en cromatograffa para proteger las resinas de cromatograffa de la acumulacion cada vez mayor de dichos lfpidos (“contaminacion de la columna”). Las impurezas de lfpidos se pueden eliminar de las soluciones de protemas utilizando medios de, p. ej., precipitacion o adsorcion. Algunos agentes precipitantes adecuados son, p. ej., polietilenglicoles (PEG) o sulfato 35 de amonio, algunos adsorbentes adecuados son, p. ej., sflice en polvo (“sflice pirogenica”; Aerosil 200, Aerosil 380), sulfatos de dextrano o fluorocarburos (Freon-113).

La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un 40 fraccionamiento de Kistler/Nitschmann) se formula para obtener una conductividad correspondiente < 40 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato) a una temperatura de 0 - 40 °C. A la solucion que contiene Factor H del complemento acondicionada de este modo se le anade PEG 4000 para obtener como resultado una concentracion final de un 2 - 10% p/v. Como alternativa, se pueden utilizan polietilenglicoles de otros pesos moleculares, donde pesos moleculares mas elevados requieren 45 concentraciones finales mas bajas y viceversa. Tras un periodo de incubacion suficiente para conseguir la precipitacion de las impurezas objetivo, se elimina el precipitado por filtracion o centrifugacion.

El lavado rico en Factor H del complemento (32 mS/cm, pH de 6.2) procedente de la cromatograffa de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% se calento hasta 30 °C. Se anadio un concentrado de PEG 4000 (25% p/v) para obtener una concentracion final de PEG de un 7.5% p/v. La mezcla se agito durante 30 min (30 °C) y se filtro a 50 traves de una combinacion de filtros de profundidad tras la adicion de 10 g/L del adyuvante de filtracion perlita.

Tabla 5: Eliminacion de lfpidos en el lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley utilizando

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precipitacion con PEG

Muestra: Abs. a 280 nm Factor H Triglicerido Colesterol


: [mg/L] [%] [mg/dL] [%] [mg/dL] [%]

Eluato de citrato: 8.4 1596 100 75 100 162 100

Filtrado de PEG 4000: 3.6 915 78.3 3 5.5 17 14.3

La Fraccion III se resuspendio en solucion tampon de citrato hasta obtener una conductividad de 30.5 mS/cm y un valor de pH de 6.3 (25 °C). Se anadio polietilenglicol 4000 hasta obtener una concentracion final de un 7.5%. Posteriormente, la suspension se filtro a traves de una combinacion de filtros de profundidad.

Tabla 6: Eliminacion de lfpidos en la resuspension en tampon de citrato rica en Factor H del complemento de la Fraccion III procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley utilizando precipitacion con PEG

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Suspension de la Fraccion III: 9.6 318 100

Filtrado: 4.3 178 59

El Precipitado B se resuspendio en solucion tampon de citrato hasta obtener una conductividad de 29.5 mS/cm y un valor de pH de 6.3 (25 °C). Se anadio polietilenglicol 4000 hasta obtener una concentracion final de un 7.5%. Posteriormente, la suspension se filtro a traves de una combinacion de filtros de profundidad.

Tabla 7: Eliminacion de lfpidos en la resuspension en tampon de citrato rica en Factor H del complemento del Precipitado B procedente de un fraccionamiento de Kistler/Nitschmann utilizando precipitacion con PEG

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L]

Filtrado: 4.8 268

b. Eliminacion o inhibicion de impurezas proteoliticas

Debido a que las fracciones secundarias ricas en el Factor H del complemento a las que se hace referencia en la seccion “1. Obtencion de una fraccion que comprende Factor H del complemento” pueden contener impurezas proteoliticas, capaces de escindir la molecula del Factor H del complemento lo cual proporcionana formas truncadas de funcion deficiente, podna ser necesario implementar metodos adecuados para eliminar o inhibir estas impurezas procedentes de/contenidas en las soluciones que contienen Factor H del complemento lo antes posible en el proceso de fabricacion.

Algunas medidas adecuadas para eliminar tales impurezas proteoliticas son los metodos cromatograficos que utilizan inhibidores de proteasas inmovilizados en matrices de base polimerica o basadas en agarosa. Tales inhibidores de proteasas pueden ser, p. ej., benzamidina, 4-aminobenzamidina, clorhidrato de benzamidina y sus derivados, lisina y sus derivados, acido 6-aminohexanoico (acido £-aminocaproico) y sus derivados, acido trans-4- (aminometil)ciclohexanocarboxflico (acido tranexamico) y sus derivados, fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF) y sus derivados, fluoruro de (4-amidinofenil)metanosulfonilo (APMSF) y sus derivados, 3,4- dicloroisocumarina (DCI) y sus derivados, acetil-leucil-leucil-arginal (Leupeptina) y sus derivados, aprotinina y sus derivados, inhibidor de la tripsina de la soja y sus derivados, a2-antiplasmina y sus derivados, antitrombina (antitrombina III) y sus derivados. Algunos medios de cromatograffa disponibles en el mercado son, p. ej., ECH Lisina Sepharose 4 B, Benzamidina Sepharose 6B (GE Healthcare), p-Aminobenzamidina Agarosa 6XL (Prometic) o similares.

Como alternativa a su eliminacion, las impurezas proteoliticas se pueden inhibir en las soluciones que contienen Factor H del complemento anadiendo uno o mas inhibidores de proteasas de entre los del grupo mencionado anteriormente a la solucion y, posteriormente, eliminando el complejo de enzima/inhibidor mediante los siguientes pasos de purificacion. Otra estrategia para eliminar las impurezas proteoliticas consiste en el uso de tintes inmovilizados como, p. ej., Cibacron Blue F3GA o sus derivados, otros tintes de tipo triazina como Procion Red HE- 3B y sus derivados, o Procion Green H-4G y sus derivados, Reactive Red 120 y sus derivados, Reactive Green 19 y sus derivados, Reactive Yellow 86 y sus derivados, Reactive Orange 14 y sus derivados y similares, inmovilizados en matrices de base polimerica o basadas en agarosa.

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La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un fraccionamiento de Kistler/Nitschmann) se formula para obtener una conductividad correspondiente < 40 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato) a una temperatura de 0 - 40 °C. La solucion se hace pasar a traves de una columna empaquetada con, p. ej., ECH Lisina Sepharose 4B (GE Healthcare) y la columna se lava posteriormente con 3 volumenes de columna de solucion tampon. Como alternativa, la Lisina Sepharose se puede incubar por lotes (anadirla a la solucion e incubar a la vez que se agita) y eliminar por filtracion.

Se anade benzamidina o benzamidina*HCl o 4-aminobenzamidina o 4-aminobenzamidina*2HCl a una solucion que contiene Factor H del complemento hasta obtener una concentracion de S 200 mmol/L. Posteriormente, la solucion se somete a uno de los metodos o combinaciones de los metodos que se han descrito en las secciones 2 a-g. 3 a-f. 4 a-c. 5 a-f.

4. Combinacion de metodos de purificacion

Con el fin de obtener un producto de Factor H del complemento con una pureza mas elevada que la que se consigue mediante los metodos mencionados anteriormente, cualquiera de los metodos 2 a-f y 3 a-b se puede o bien aplicar por segunda vez o bien combinar con pasos adicionales de purificacion cromatografica.

a. Cromatograffa de afinidad de heparina

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos de las secciones 2 a-f se puede purificar adicionalmente mediante cromatograffa de afinidad de heparina. En la seccion 2 a se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

Las soluciones que contienen Factor H del complemento se formulan para obtener una conductividad correspondiente < 25 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna de afinidad de heparina (heparina inmovilizada en Toyopearl HW-65). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 -1 mol/L) en el mismo tampon.

El eluato rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de intercambio cationico en SP Sepharose FF (de acuerdo con la seccion 2d) se diluyo hasta obtener una conductividad de aprox. 6 mS/cm mediante la adicion de agua y se ajusto hasta un valor de pH de 5.5. La solucion se aplico a una columna con una resina de afinidad de heparina (heparina inmovilizada en Toyopearl HW-65). La columna se lavo con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluyo utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 -1 mol/L) en el mismo tampon.

Tabla 8: Factor H del complemento purificado mediante cromatograffa de intercambio cationico y posteriormente mediante cromatograffa de afinidad de heparina basandose en un sobrenadante en etanol al 8% (Fraccion I) del fraccionamiento de Cohn(Oncley)

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Eluato de SP: 5.6 3500 100

Eluato de afinidad de heparina: 5.2 5400 83

b. Cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC)

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos de las secciones 2 a-f se puede purificar adicionalmente mediante cromatograffa de interaccion hidrofoba. En la seccion 2 b se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

Las soluciones que contienen Factor H del complemento se formulan para obtener una conductividad correspondiente > 100 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con Butil Sepharose FF (GE Healthcare). La columna se lava con una solucion tampon de alto contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico, 2 mol/L de NaCl) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente descendente de NaCl (2 - 0 mol/L) en el mismo tampon.

El eluato rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de intercambio cationico en Fractogel EMD SO3' (de acuerdo con la seccion 2d) se ajusto hasta obtener una conductividad de aprox. 130 mS/cm mediante

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la adicion de NaCI y un valor de pH de 5.5. La solucion se aplico a una columna empaquetada con Butil Sepharose FF (GE Healthcare) y el Factor H del complemento se unio a la resina en dichas condiciones. Despues de lavar la columna con una solucion tampon de alto contenido en sales (2 mol/L de NaCl, 200 mmol/L de citrato trisodico dihidratado, pH de 5.5), el Factor H del complemento se eluyo utilizando un gradiente por pasos hasta llegar a un 30% de la concentracion inicial de NaCl en el mismo tampon.

Tabla 9: Factor H del complemento purificado mediante cromatograffa de intercambio cationico y posteriormente mediante cromatograffa de interaccion hidrofoba basandose en un sobrenadante en etanol al 8% (Fraccion I) del fraccionamiento de Cohn(Oncley)

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Eluato de EMDSO3': 4.8 3800 100

Eluato de Butil Sepharose: 1.2 1700 76

c. Cromatograffa de intercambio anionico (AEC)

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos de las secciones 2 a-f se puede purificar adicionalmente mediante cromatograffa de intercambio anionico. En la seccion 2 c se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

Las soluciones que contienen Factor H del complemento se formulan para obtener una conductividad correspondiente < 10 mS/cm (25 °C) y un pH de 6 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con Q-Sepharose XL (GE Healthcare). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 -1 mol/L) en el mismo tampon.

d. Cromatografia de intercambio cationico (CEC)

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos de las secciones 2 a-f se puede purificar adicionalmente mediante cromatograffa de intercambio cationico. En la seccion 2 d se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

Las soluciones que contienen Factor H del complemento se formulan para obtener una conductividad correspondiente < 10 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 8 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con SP-Sepharose FF (GE Healthcare). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 -1 mol/L) en el mismo tampon.

e. Cromatografia de hidroxiapatita (HAC)

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos de las secciones 2 a-f se puede purificar adicionalmente mediante cromatograffa de hidroxiapatita. En la seccion 2 e se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatograffa de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un fraccionamiento de Kistler/Nitschmann) se formula para obtener una conductividad correspondiente < 15 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 8 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con HA Ultrogel (Pall). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (p. ej., 10 mmol/L de fosfato de potasio) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de fosfato (0 -1 mol/L).

f. Cromatografia de inmunoafinidad

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos de las secciones 2 a-f se puede purificar adicionalmente mediante cromatograffa de inmunoafinidad. En la seccion 2 f se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

5. Tecnologfas de desactivacion/eliminacion de virus

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Las realizaciones preferidas de la invencion para conseguir la desactivacion/eliminacion de virus son combinaciones de los siguientes metodos aceptados de forma generalizada:

a. Pasteurizacion (desactivacion termica de virus durante 10 h a 60 °C en estado l^quido)

b. Tratamiento con disolvente/detergente

c. Nanofiltracion

a. Pasteurizacion

La pasteurizacion a 60 °C durante 10 h es un metodo aceptado de forma generalizada para la desactivacion de virus en derivados del plasma y se ha demostrado que es eficaz contra un amplio espectro de virus (Sofer G, “Virus Inactivation in the 1990s- and into the 21st Century”, Biopharm International, suplemento de junio de 2003). La pasteurizacion se puede aplicar a cualquier preparado del Factor H del complemento purificado parcialmente o muy purificado obtenido a partir de cualquiera de los metodos descritos en la seccion 1, 2, 3 o 5.

Las soluciones que contienen Factor H del complemento se formulan en soluciones tampon adecuadas (p. ej., tampon de citrato, tampon de fosfato, tris(hidroximetil)aminometano, HEPES, MOPS, etc.) que contienen NaCl con concentraciones de hasta 1 mol/L o sin NaCl con valores de pH de 5-9. Una de las realizaciones preferidas consiste en 50 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5.5 + NaCl al 0.9% con una concentracion de protemas correspondiente a una Abs. a 280 nm = 15. Se anaden hasta 1.5 kg de sacarosa por L de solucion y se disuelven. Se pueden anadir otros estabilizantes, p. ej., aminoacidos como la glicina y la lisina con concentraciones de hasta 1 mol/L o incluso superiores. La solucion estabilizada de este modo se calienta a continuacion hasta 60 °C y se mantiene a esa temperatura durante 10 h.

El Factor H del complemento purificado mediante HIC (de acuerdo con la seccion 2 b) se formulo en NaCl al 0.9%, 50 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5.5 con una concentracion de protemas correspondiente a una Abs. a 280 nm = 15. Se anadio 1 kg de sacarosa por L de solucion y se disolvio. Se ajusto el valor del pH hasta 5.5. Posteriormente, la solucion estabilizada se calento hasta 60 °C y se mantuvo a esa temperatura durante 10 h. De forma correspondiente, la solucion se enfrio hasta temperatura ambiente y se diluyo con un factor de 1:3 con tampon de citrato de pH 5.5.

Tabla 10: Pasteurizacion de un Factor H del complemento purificado mediante HIC

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Prepasteurizacion: 9.5 10 550 100

Pospasteurizacion: 9.6 10 000 95

b. Tratamiento con disolvente/detergente (S/D)

Ademas de la pasteurizacion, otro metodo aprobado para la desactivacion de virus es el tratamiento con combinaciones de un disolvente, p. ej., fosfato de tri-n-butilo (TNB), y un detergente, p. ej., Triton X-100, Polisorbato 80 (Tween 80) o colato sodico en estado lfquido.

El tratamiento con S/D se puede aplicar a cualquiera de los preparados del Factor H del complemento purificados parcialmente o muy purificados obtenidos a partir de cualquiera de los metodos descritos en la seccion 1, 2, 3 o 5, pero posteriormente se debe llevar a cabo un metodo adecuado para eliminar los reactivos S/D.

Se anade Triton X-100 y fosfato de tri-n-butilo a una solucion que contiene Factor H del complemento hasta obtener una concentracion final de un 1% p/v de cada uno. La solucion se agita durante 4-6 h a 25 - 30 °C. Posteriormente, se elimina el disolvente y el detergente mediante cromatograffa, ya sea de un modo tal que el Factor H del complemento se una a la fase estacionaria y el disolvente y el detergente se eliminen por lavado en la fraccion no unida o bien de un modo tal que el disolvente y el detergente se unan a un ligando adecuado (p. ej., C-18) dejando el Factor H del complemento en la fraccion no unida.

c. Nanofiltracion

La filtracion de virus es la realizacion preferida para cumplir con las directrices reguladoras respecto a la implementacion de principios/mecanismos de reduccion de virus complementarios (diferentes modos de accion). La combinacion de uno de los metodos de desactivacion de virus mencionados anteriormente (4a o 4 b) con filtracion como un metodo de reduccion/eliminacion de virus cumple perfectamente con dichos requisitos reguladores. Algunos filtros para la retencion de virus adecuados son, p. ej., Planova™ de 35 nm, Planova ™ de 20 nm (Asahi corporation), Ultipor DV 50 o DV 20 (Pall corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFR o NFP (Millipore).

La nanofiltracion se puede aplicar a cualquiera de los preparados del Factor H del complemento purificados

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parcialmente o muy purificados obtenidos a partir de cualquiera de los metodos descritos en la seccion 1, 2, 3 o 5, donde la capacidad del filtro utilizado puede variar segun sea el grado de pureza de la solucion que se ha de filtrar.

Se filtro una solucion del Factor H del complemento a traves de un filtro de retencion de virus aceptado, Planova™ de 20 nm (Asahi corporation). Aprox. 45 mL de una solucion del Factor H del complemento purificada se filtraron a traves de un modulo Planova 20 de 0.001 m2 tras la prefiltracion a traves de un filtro de 0.1 pm Durapore de 12.5 cm2 (Millipore).

Tabla 11: Filtracion del Factor H del complemento purificado a traves de un modulo Planova™ de 20 nm

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Antes de la filtracion a traves de 0.1 pm: 4.7 5860 100

Filtrado a traves de Planova de 20 nm: 4.3 4220 72

6. Combinaciones adicionales de metodos de purificacion

Con el fin de obtener un producto de Factor H del complemento de pureza muy elevada, cada uno de los metodos mencionados anteriormente y sus combinaciones se pueden o bien reaplicar o bien combinar con otros pasos de purificacion cromatografica.

a. Cromatograffa de afinidad de heparina

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos o repeticiones de los metodos o combinaciones de los metodos descritos en las secciones 1-4 se puede purificar adicionalmente mediante cromatograffa de afinidad de heparina. En la seccion 2 a se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

Las soluciones que contienen Factor H del complemento se formulan para obtener una conductividad correspondiente < 25 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 9 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna con una resina de afinidad de heparina (heparina inmovilizada en Toyopearl HW-65). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 -1 mol/L) en el mismo tampon.

El eluato rico en Factor H del complemento procedente de una combinacion de cromatograffa de intercambio anionico en Q-Sepharose XL, cromatograffa de interaccion hidrofoba en Butil Sepharose FF y pasteurizacion se formulo hasta obtener una conductividad de aprox. 6 mS/cm y un valor de pH de 5.5. La solucion se aplico a una columna con una resina de afinidad de heparina (heparina inmovilizada en Toyopearl HW-65). La columna se lavo con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluyo utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 -1 mol/L) en el mismo tampon.

Tabla 12: Purificacion del Factor H del complemento mediante una combinacion de cromatograffa de intercambio anionico, cromatograffa de interaccion hidrofoba, pasteurizacion y una cromatograffa de afinidad de heparina final

Muestra: Absorcion a 280 nm Factor H [mg/L] Factor H [%]

Factor H procedente de AEC + HIC + pasteurizacion: 3.0 3700 100

Eluato de la afinidad de heparina: 6.2 8800 86

b. Cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC)

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos o repeticiones de los metodos o combinaciones de los metodos descritos en las secciones 1-4 se puede purificar adicionalmente mediante cromatograffa de interaccion hidrofoba. En la seccion 2 b se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

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c. Cromatoarafia de intercambio anionico (AEC)

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos o repeticiones de los metodos o combinaciones de los metodos descritos en las secciones 1-4 se puede purificar adicionalmente mediante cromatoarafia de intercambio anionico. En la seccion 2 c se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

d. Cromatoarafia de intercambio cationico (CEC)

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos o repeticiones de los metodos o combinaciones de los metodos descritos en las secciones 1-4 se puede purificar adicionalmente mediante cromatoarafia de intercambio cationico. En la seccion 2 d se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

e. Cromatoarafia de hidroxiapatita (HAC)

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos o repeticiones de los metodos o combinaciones de los metodos descritos en las secciones 1-4 se puede purificar adicionalmente mediante cromatoarafia de hidroxiapatita. En la seccion 2 e se hace referencia a los ligandos y/o medios adecuados.

La fraccion que actua como fuente (lavado rico en Factor H del complemento procedente de la cromatoarafia de afinidad de heparina del sobrenadante al 8% procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o la Fraccion III redisuelta procedente de un fraccionamiento de Cohn/Oncley, o el Precipitado B redisuelto procedente de un fraccionamiento de Kistler/Nitschmann) se formula para obtener una conductividad correspondiente < 15 mS/cm (25 °C) y un pH de 5 - 8 en sistemas tampon adecuados (p. ej., solucion salina o tampon de fosfato o tampon de citrato). La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con HA Ultrogel (Pall). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (p. ej., 10 mmol/L de fosfato de potasio) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de fosfato (0 -1 mol/L).

f. Cromatoarafia de inmunoafinidad

Una solucion que contiene Factor H del complemento resultante de uno de los metodos en las secciones 1-4 se puede purificar adicionalmente mediante cromatoarafia de inmunoafinidad. En la seccion 2 f se hace referencia a los liaandos y/o medios adecuados.

7. Formulaciones del Factor H del complemento

Con el fin de obtener preparados del Factor H del complemento terapeuticos fisica y qmmicamente estables, de modo que estos preparados se puedan almacenar a, p. ej., 2-8 °C o temperaturas superiores y se puedan manipular, reconstituir y utilizar a temperatura ambiente (p. ej., 18-28 °C), el Factor H del complemento purificado (de acuerdo con las secciones 1.-5.) se puede formular junto con excipientes y estabilizantes adecuados, y posteriormente se puede liofilizar.

Los excipientes y estabilizantes adecuados pueden ser cualquier sustancia o combinaciones de sustancias de los siguientes grupos:

Agentes espesantes

Crioprotectores

Lioprotectores

Modificadores de la tonicidad

Surfactantes/detergentes

Tampon

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Antioxidantes

a. Agentes espesantes

Se pretende que la expresion “agentes espesantes”, tal como se utiliza en la presente, designe a agentes que proporcionan o contribuyen en la obtencion de la estructura del producto liofilizado, dicho de otro modo, una masa liofilizada atractiva desde el punto de vista visual o un producto farmaceuticamente elegante y, opcionalmente, contribuyen en la estabilizacion de la sustancia activa.

Algunos ejemplos tfpicos de las sustancias utilizadas como agentes espesantes son, p. ej., manitol, glicina, sacarosa, lactosa. Los concentrados tfpicos se encuentran en el intervalo de 0-10% p/v.

b. Crioprotectores

Se pretende que el termino “crioprotectores”, tal como se utiliza en la presente, designe a agentes que protegen a la sustancia activa frente a estres o danos inducidos por la congelacion.

Algunos ejemplos tfpicos de sustancias utilizadas como crioprotectores son, p. ej., polioles (manitol), sacaridos (sacarosa, trehalosa), surfactantes (polisorbato, polioxamero, polietilenglicol). Las concentraciones tfpicas se encuentran en el intervalo de 0-10% p/v.

c. Lioprotectores

Se pretende que el termino “lioprotectores”, tal como se utiliza en la presente, designe a agentes que protegen a la sustancia activa frente a estres o danos inducidos por la deshidratacion (p. ej., debido a la eliminacion parcial de la corteza de hidratacion de una protema) durante la liofilizacion.

Algunos ejemplos tfpicos de sustancias utilizadas como lioprotectores son, p. ej., sacarosa, trehalosa, glutamato de sodio, glicina, isoleucina, clorhidrato de lisina, fenilalanina y arginina. Las concentraciones tfpicas se encuentran en el intervalo de 0-10% p/v.

d. Modificadores de la tonicidad

Se pretende que la expresion “modificadores de la tonicidad”, tal como se utiliza en la presente, designe a agentes cuyo efecto consiste en que la tonicidad, es decir, la osmolalidad del preparado, se encuentre en el intervalo de los fluidos fisiologicos normales (p. ej., sangre o fluido peritoneal) con el fin de prevenir reacciones tras la administracion debidas a concentraciones de iones diferentes entre el preparado y los fluidos fisiologicos.

Algunos ejemplos tfpicos de sustancias utilizadas como modificadores de la tonicidad son, p. ej., NaCl, dextrosa, glicerina, cloruro de calcio, cloruro de potasio.

e. Surfactantes/detergentes

Se pretende que la expresion “surfactantes/detergentes”, tal como se utiliza en la presente, designe a agentes que protegen a la sustancia activa frente a estres o danos inducidos por la interfaz aire-solucion o la interfaz solucion- superficie.

Algunos ejemplos tfpicos de surfactantes/detergentes son, p. ej., los poloxameros (p. ej., poloxamero 188), polisorbatos (p. ej., Tween 20, Tween 80), eteres launlicos polioxietilenados (p. ej., Brij 35).

Las concentraciones tfpicas estan comprendidas en el intervalo de aproximadamente un 0.001% a aproximadamente un 0.5%.

f. Tampon

Se pretende que el termino “tampon”, tal como se utiliza en la presente, designe a agentes que mantienen el pH del preparado en un intervalo en el que la administracion del preparado (p. ej., intravenosa o subcutanea) se tolera bien normalmente (p. ej., pH de 5 - 9) y, ademas, evitan cambios de pH y protegen a la sustancia activa frente a estres o danos inducidos por el pH durante la liofilizacion.

Algunos ejemplos tfpicos de sustancias utilizadas como sustancias tampon son, p. ej., carbonato, fosfato, citrato, borato, trimetamina [(2-amino-2-hidroximetil-1,-3-propanodiol),TRIS], glicina.

g. Antioxidantes

Se pretende que el termino “antioxidantes”, tal como se utiliza en la presente, designe a agentes que proporcionan al menos cierta reduccion del estres oxidativo o la degradacion de la sustancia activa.

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Algunos ejemplos tipicos de sustancias utilizadas como antioxidantes son, p. ej., monotioglicerol, glutationa, acido cftrico, acido ascorbico, metabisulfito de sodio y sulfito de sodio.

Las concentraciones tipicas estan comprendidas en el intervalo de aproximadamente un 0.1% a aproximadamente un 1% (p/v).

Tabla 13: Composicion de las formulaciones:

1. 0.85% de NaCl, 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de glutamato sodico, 1% de arginina, 1% de isoleucina

2. 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de glutamato sodico, 1% de arginina, 1% de isoleucina

3. 0.85% de NaCl, 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de sacarosa, 1% de arginina, 1% de isoleucina

4. 0.85% de NaCl, 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de trehalosa, 1% de arginina, 1% de isoleucina

5. 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de sacarosa, 1% de arginina, 1% de isoleucina

6. 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de trehalosa, 1% de arginina, 1% de isoleucina

7. 0.85% de NaCl, 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de glutamato sodico, 0.1% de Tween 80

8. 0.85% de NaCl, 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de sacarosa, 0.1% de Tween 80

9. 0.85% de NaCl, 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de trehalosa, 0.1% de Tween 80

10. 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de glutamato sodico, 0.1% de Tween 80

11. 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de sacarosa, 0.1% de Tween 80

12. 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9, 1% p/v de glicina, 2% de trehalosa, 0.1% de Tween 80

La solucion que comprende el Factor H del complemento purificado de acuerdo con los metodos descritos en las secciones 1-5 se concentra hasta obtener la concentracion final deseada utilizando medios de ultrafiltracion (p. ej., TFF empleando membranas con un corte de 100 kDa) y se somete a diafiltracion frente a 5-10 intercambios de una solucion tampon adecuada (p. ej., 0.85% de NaCl, 25 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5-9). Posteriormente, se anaden excipientes adicionales de acuerdo con los ejemplos en la seccion 6 a - g (p. ej., 1% p/v de glicina, 2% de sacarosa, 1% de arginina, 1% de isoleucina) y se disuelven completamente. La solucion de Factor H del complemento formulada se filtra a continuacion a traves de un filtro de grado de esterilizacion como prerrequisito para los procedimientos posteriores de rellenado y acabado.

8. Preparados de Factor H del complemento (liofilizacion)

Con el fin de obtener preparados de Factor H del complemento terapeuticos ffsica y qmmicamente estables segun se ha descrito en la seccion 6, el contenido de humedad residual del producto liofilizado debe ser lo suficientemente bajo para proteger a la sustancia activa frente a la degradacion. Se puede obtener un contenido de humedad residual < 3% mediante procedimientos de liofilizacion adecuados y este no se debena sobrepasar en este contexto.

El preparado de Factor H del complemento formulado se introduce en viales adecuados para liofilizacion. Los viales se colocan en un liofilizador adecuado y el preparado se congela con una temperatura de la bandeja de - 47 °C durante 4-5 h (aprox. 0.5-1 °C/min) en condiciones de presion ambiental. Posteriormente, la presion de la camara se reduce hasta 0.15 mbar durante 30-60 min y la temperatura de la bandeja se incrementa hasta -10 °C durante 30-60 min. De forma correspondiente, despues de 10-15 h, la temperatura de la bandeja se incrementa adicionalmente hasta 5 °C y se mantiene constante durante 10-15 h mas. Posteriormente, la temperatura de la bandeja se incrementa adicionalmente hasta 20 °C y se mantiene durante 24-30 h. Normalmente, durante este paso, la temperatura del producto alcanza la temperatura de la bandeja despues de aprox. de 1/2 a 1/3 del tiempo. A continuacion, se consigue el secado secundario incrementando la temperatura de la bandeja hasta 35 °C y manteniendola constante durante 24-30 h.

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9. Ejemplo de una realizacion preferida

En una realizacion preferida, el sobrenadante al 8% (2400-2700 L) de un fraccionamiento de Cohn/Oncley modificado se somete a una cromatograffa de afinidad de heparina. Se anaden aprox. 0.08 L de resina de afinidad de heparina (heparina inmovilizada sobre Toyopearl HW-65) por litro de sobrenadante al 8% y la suspension se agita durante aprox. 1 h con refrigeracion. Posteriormente, la resina se recupera por filtracion y se transfiere a una columna de cromatograffa. El Factor H del complemento se eluye de la columna utilizando una solucion que contiene aprox. 0.25 mol/L de citrato trisodico dihidratado a un pH de 6.5, mientras que la ATIII permanece unida a la columna.

El lavado de citrato rico en Factor H del complemento (400-700 L; 32 mS/cm, pH de 6.2) se calienta hasta 30 °C. Se anade un concentrado de PEG 4000 (25% p/v) hasta obtener una concentracion final de PEG de un 7.5% p/v. La mezcla se agita durante 30 min. (30 °C) y se filtra a traves de una combinacion de filtros de profundidad tras la adicion de 10 g/L del adyuvante de filtracion perlita.

El filtrado de PEG que contiene el Factor H del complemento se formula hasta obtener una conductividad de 5-6 mS/cm (25 °C) y un pH de 9 en 25 mmol/L de tampon de TRIS. La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con 80 L de Q-Sepharose XL (GE Healthcare). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente por pasos de NaCl (0.3 mol/L) en el mismo tampon.

El eluato de AEC rico en Factor H del complemento (100-300 L) se formula hasta obtener una conductividad de 135 mS/cm (25 °C) y un pH de 5.5 en tampon de citrato. La solucion acondicionada de este modo se aplica a continuacion a una columna empaquetada con 80 L de Butil Sepharose FF (GE Healthcare). La columna se lava con una solucion tampon de alto contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico, 2 mol/L de NaCl) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente descendente de NaCl (2 - 0 mol/L) en el mismo tampon.

El Factor H del complemento purificado mediante HIC (80-200 L) se formula para obtener un 0.9% de NaCl, 50 mmol/L de citrato trisodico dihidratado de pH 5.5 con una concentracion de protemas correspondiente a una Abs. a 280 nm = 15 mediante ultrafiltracion de flujo tangencial (TF-UF) utilizando membranas con un corte de 100 kDa. Se anade 1 kg de sacarosa por L de solucion y se disuelve. Se ajusta el valor de pH hasta 5.5. Posteriormente, la solucion estabilizada se calienta hasta 60 °C y se mantiene a esa temperatura durante 10 h. De forma correspondiente, la solucion se enfna hasta temperatura ambiente y se diluye con un factor de 1:3 con tampon de citrato de pH 5.5.

A continuacion, la solucion que contiene Factor H del complemento pasteurizado diluido (aprox. 6 mS/cm; pH de 5.5) se aplica a una columna con una resina de afinidad de heparina (40 L de heparina inmovilizada en Toyopearl HW- 65). La columna se lava con una solucion tampon de bajo contenido en sales (25 mmol/L de citrato trisodico) y posteriormente el Factor H del complemento se eluye utilizando un gradiente ascendente de NaCl (0 -1 mol/L) en el mismo tampon.

Tras la cromatograffa de afinidad de heparina, la solucion de Factor H del complemento se filtra a traves de un filtro de retencion de virus aceptado, Planova™ 20 nm (Asahi corporation). Se filtran como maximo 100 L de solucion de Factor H del complemento purificado a traves de un modulo Planova 20 de 1 m2 tras la prefiltracion a traves de uno o mas cartuchos de filtracion de PVDF de 0.1 pm y 10" (0.7 m2) (p. ej., Durapore, Millipore).

Posteriormente, la solucion de Factor H del complemento purificado se somete a diafiltracion y se concentra mediante TF-UF hasta obtener una concentracion de al menos 50 mg/mL* en 25 mmol/L de citrato trisodico de pH 7 + 0.85% de NaCl. Se anaden los excipientes (1% p/v de glicina, 2% de glutamato sodico, 1% de arginina, 1% de isoleucina) y se ajusta el pH hasta 8. La solucion (2000-4000 mL) se filtra a traves de un filtro de grado de esterilizacion (< 0.22 pm) y se introduce en los envases finales (p. ej., viales de inyeccion de vidrio de 30 mL de tipo II, con tapones para liofilizacion de goma de clorobutilo).

Los viales rellenados se liofilizan de forma correspondiente, segun se ha descrito en la seccion 7.

* se determina utilizando un preparado de referencia del Factor H del complemento puro como calibrador

Tabla 14: Pureza (determinada mediante HPLC de exclusion por tamano*) de los intermedios y del preparado formulado final de Factor H del complemento obtenidos de la fabricacion a gran escala

Muestra: Impurezas de PM elevado 1) [% de area] Factor H [% de area] Impurezas de PM bajo 2) [% de area]

Filtrado de PEG 4000: 0.5 17.9 81.6

Eluato de AEC: — 53.1 46.9

Eluato de HIC: 0.2 83.1 16.6

Pospasteurizacion: 6.0 84.6 9.4

Eluato de AFC de heparina: 2.9 93.1 3.9

Masa formulada (aprox. 50 mg/mL): 2.9 95.7 1.4

* TSK G3000 SWxl 1) Tiempo de retencion < Factor H 2) Tiempo de retencion > Factor H

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para la purificacion de Factor H del complemento en una solucion que comprende los pasos de:

a) proporcionar una fraccion que comprende Factor H del complemento mediante la precipitacion fraccionada a gran escala de suero o plasma humano con etanol, donde mediante dicho proceso de precipitacion fraccionada a gran escala se produce al menos una protema farmaceutica adicional que se puede obtener comercialmente;

b) purificar adicionalmente el Factor H del complemento mediante al menos un metodo de purificacion seleccionado del grupo siguiente:

I. Cromatograffa de afinidad de heparina

II. Cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC)

III. Cromatograffa de intercambio anionico (AEC)

IV. Cromatograffa de intercambio cationico (CEC)

V. Cromatograffa de hidroxiapatita (HAC)

VI. Cromatograffa de inmunoafinidad

c) tratar la fraccion que contiene el Factor H del complemento al menos una vez antes, durante o despues del paso b) de dicho proceso de purificacion con un metodo de desactivacion y/o eliminacion de virus/patogenos;

donde la purificacion del Factor H del complemento comprende los siguientes pasos del proceso:

I. una cromatograffa de intercambio anionico inicial

II. seguida de una cromatograffa de interaccion hidrofoba

III. seguida de pasteurizacion

IV. seguida de una cromatograffa de afinidad de heparina

V. seguida de nanofiltracion.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el metodo de purificacion del paso b) se repite una o varias veces o se combina con otro metodo de purificacion.
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde dicha protema farmaceutica adicional que se puede obtener comercialmente se selecciona del grupo constituido por albumina, antitrombina III, Factor VIII, Factor IX, Fibrinogeno, Factor XIII, trombina (FIIa), FVII/IIa, preparados de complejos de protrombina (PPSB), inhibidor de la proteinasa alfa-1, inhibidor C1, inmunoglobulinas, transferrina y butirilcolinesterasa.
4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1-3, donde el metodo de desactivacion o eliminacion de virus/patogenos es pasteurizacion, tratamiento con disolvente/detergente y/o nanofiltracion.
5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1-4, donde la fraccion que comprende el Factor H del complemento es el sobrenadante en etanol al 8% (Fraccion I en el fraccionamiento de Cohn/Oncley) o la Fraccion III (fraccionamiento de Cohn/Oncley) o el Precipitado B en el fraccionamiento de Kistler/Nitschmann.
6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1-5, donde el proceso de purificacion comprende adicionalmente un paso de eliminacion de ffpidos y/o la inhibicion y/o eliminacion de una proteasa.
7. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1-6, donde la fraccion que comprende el Factor H del complemento es una fraccion residual.