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TW202342012A - 製備用作醫藥活性化合物的（５ｓ）－｛［２－（４－羧基苯基）乙基］［２－（２－｛［３－氯－４＇－（三氟甲基）聯苯－４－基］甲氧基｝苯基）乙基］胺基｝－５，６，７，８－四氫喹啉－２－羧酸及其結晶形式之方法 - Google Patents

製備用作醫藥活性化合物的（５ｓ）－｛［２－（４－羧基苯基）乙基］［２－（２－｛［３－氯－４＇－（三氟甲基）聯苯－４－基］甲氧基｝苯基）乙基］胺基｝－５，６，７，８－四氫喹啉－２－羧酸及其結晶形式之方法 Download PDF

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布吉特 凱爾
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彼得 費
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圭多 貝克
朱利安 艾格
克萊門斯 伯特
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Abstract

本發明係關於用於製備式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸及其新穎的結晶形式之新穎和改良方法

Description

製備用作醫藥活性化合物的(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸及其結晶形式之方法
本發明係關於製備式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸及其新穎結晶形式的新穎和改良方法 (I) 其為尤其是假多晶形式單水合物I(I-M-I)或單水合物II(I-M-II)， (I-M-I)，(I-M-II).
再者本發明係關於用於製備假多晶形式單水合物I (I-M-I)或假多晶形式單水合物II(I-M-II)，較佳地式(I-M-I)之單水合物I的新穎和選擇性結晶方法，以及包括式(I-M-I)之單水合物I或假多晶形式單水合物II(I-M-II)，較佳地式(I-M-I)之單水合物I的醫藥組成物及其用於治療及/或防止疾病的用途，尤其是用於治療及/或防止肺疾病、心肺疾病和心血管疾病，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)的用途。
在本發明內文中，(I-A)是指非晶形式之式(I)化合物；晶形變體I，單水合物I係稱為(I-M-I)，而晶形變體II，單水合物II係稱為(I-M-II)。在無進一步區分下，式(I)之化合物係以一或多種變體或以溶劑化物，尤其是以水合物存在。
未公開的藥理學研究令人驚訝地揭示了WO2014/012934之實例23，即式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸相較於WO2014/012934中所揭示的類似5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸具有改良的藥理學性質，如，例如更長的作用時間。因此，式I的酸適用於治療心肺疾病和用於製造用於這些疾病的吸入藥物。
由於其在目標肺部疾病中的適用性、便利性以及患者的順從性和依從性，因此選擇乾粉吸入劑型作為較佳的藥物形式。
然而，如WO 14/012934-A1的實例23所揭示，式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸僅能以非晶形式取得(參見比較實例11)，不適用於藉由乾粉吸入器給藥之吸入劑型。
用於開發藥用形式，尤其是包括式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸固體形式的乾粉吸入形式，就用於可重複製造和分離一確定結晶形式之式(I)化合物，有很高的需求。
需要許多努力才能將式I化合物最終結晶成確定的固體形式。
通常式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸傾向於以非晶狀態固化。為了克服此一性質，進行了鹽選擇篩選，試圖找出具有有利性質的新晶體物質。所有的試驗都導致非晶或高度無序的物質，且並無觀察到鹽形成。
提出以L-精胺酸實驗所產生的殘留物之XRPD圖作為例子(參見圖 4)。
令人驚訝地，獲得數種假多晶形式之式I化合物，並未發現無水晶體形式。
已鑑定出下列式(I)化合物之晶體形式，其為假多晶形式單水合物I和II((I-M-I)和(I-M-II))、半水合物、倍半水合物、二水合物和1,25水合物(參見實例6，圖5至32)。在本文中變體、多晶形式和多晶型具有相同的意義。此外亦存在非晶形式。整體上-假多晶形式和非晶形式為式(I)化合物之不同的固體形式。
化合物的穩定性和均一性為醫藥的關鍵要求以及取得衛生當局核准的先決條件。其增加了包括式(I)化合物之製備和調配的安全性和品質，且因此降低了對病患的風險。
然而，在數個鑑定的假多晶形式中，必須在數個階段期間鑑定出最適合和穩定的形式。
發現二水合物在乾燥過程中經歷了非晶化(參見圖10a)。半水合物的晶格表現出無序(見圖5)，其可能支持機械加工，如，例如調配過程中的相變及/或非晶化。因為攪拌製程非常長，倍半水合物的結晶對於大規模製造並不可行。
發現二種單水合物克服了這些不同假多晶形式的不欲性質。然而最終證明這些單水合物形式中僅有一種在微粉化過程中是穩定的，因此最適合的形式例如用於製造吸入藥物，尤其是作為乾粉為基底的吸入藥物。令人驚訝地，在微粉化過程中，發現單水合物II依照微粉化條件顯示部分非晶化(參見實例8b，圖42)或除此之外還轉變為單水合物I(參見實例8a，圖43)。再者，觀察到單水合物II亦在儲存期間顯示轉變成單水合物I(參見實例7b，圖40和41)。因此假多晶形式單水合物I適合用於醫藥領域並優於式I化合物的其他固體形式，特別適用於醫藥組成物，尤其是乾粉吸入劑型。
特別是式(I)化合物之單水合物I形式確保防阻不欲的轉化為另外形式的式(I)化合物和如上所述的相關性質變化。
式(I)、(I-M-I)和(I-M-II)之化合物作為可溶性鳥苷酸環化酶之活化劑並可用於預防及/或治療肺、心肺和心血管疾病的藥物，例如，舉例而言用於治療肺動脈高壓(PAH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺病(PH-COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎 (PH-IIP)，更特言之，其係關於治療心肺病症的方法，例如肺動脈高壓(PAH)和與慢性肺疾病(第3類組PH)相關的肺高壓(PH)，例如PH-COPD和PH-IIP。
肺高壓(PH)為一種進行性肺病症，如果不治療，會在診斷後數年內導致死亡。肺高壓係以平均肺動脈壓(mPAP)升高來定義(靜止時正常值＜20 mmHg)。肺高壓的病理生理學特徵為肺血管之血管收縮和重塑。在慢性PH值中，主要是未肌肉化的肺血管出現新肌肉化，以及已肌肉化的血管的血管肌周長增加。這種逐漸增加的肺循環閉塞造成右心上漸進的壓力，從而導致右心輸出量減少及最終導致右心衰竭[M. Humbert et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S]。特發性(或原發性)肺動脈高壓(IPAH)為一種非常罕見的病症，而繼發性肺高壓(非PAH PH)則非常常見，有人認為後者為目前第三大最常見的冠心病和全身性高血壓後的心血管疾病類群。自2008年以來，依照Dana Point分類，肺高壓係根據各自的病因分為多個亞群[M. Humbert and V.V. McLaughlin, J. Am. Coll. Cardiol. 2009, 54 (1), S1-S2; D. Montana and G. Simonneau, in: A.J. Peacock et al. (Eds.), Pulmonary Circulation. Diseases and their treatment, 3rd edition, Hodder Arnold Publ., 2011, pp. 197-206; updated Nizza classification Gérald Simonneau, David Montani, David S. Celermajer, Christopher P. Denton, Michael A. Gatzoulis, Michael Krowka, Paul G. Williams, Rogerio Souza: Haemodynamic definitions and updated clinical classification of pulmonary hypertension, in: European Respiratory Journal, 2018; DOI: 10.1183/13993003.01913-2018]。
儘管PH的治療取已有所進展，但目前尚未有治愈此嚴重病症的前景。市面上可取得的標準療法(例如前列腺環素(prostacyclin)類似物、內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑)能改善病患的生活品質、運動耐受力和預後。這些治療原則主要為全身給藥(除吸入的曲前列尼(Treprostinil)和吸入伊洛前列腺素(Iloprost)或NO之外)及主要藉由調節血管緊張度在血液動力學上發揮作用。這些藥物的應用由於副作用而受限，其中某些副作用很嚴重，及/或給藥形式複雜。藉由特定的單一療法可改善或穩定病患臨床狀況之時間為有限的(例如由於耐受性之發展)。最終治療升級並因此應用其中必須同時給予多種藥物之組合治療。目前，這些標準療劑僅核准用於治療肺動脈高壓(PAH)和慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)。在與肺疾病(第3類組PH)相關的續發性PH形式，例如PH-COPD或PH-IIP的情況下，這些治療原則(例如西地那非(sildenafil)、波生坦(bosentan))在臨床研究中失敗，因為非選擇性血管舒張，其造成了病患中動脈氧含量降低(去飽和)。就此可能的原因為由於非選擇性血管擴張劑的全身給藥對異質性肺病症的肺通氣-灌注調適產生不利影響[I. Blanco et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2010, 181, 270-278; D. Stolz et al., Eur. Respir. J. 2008, 32, 619-628]。
新穎的組合治療為治療肺高壓之最有前景的未來治療選擇之一。在這方面，發現治療PH的新藥理學機制特別有利[Ghofrani et al., Herz 2005, 30, 296-302; E.B. Rosenzweig, Expert Opin. Emerging Drugs 2006, 11, 609-619; T. Ito et al., Curr. Med. Chem. 2007, 14, 719-733]。特別是可與市面上已有的治療概念相結合的新穎治療方法可能形成更有效治療的基礎，因此對病患有很大的好處。此外，此一新穎作用原理的選擇性肺部適用性不僅可提供了將其用於PAH之選項，而且亦可為患有續發性PH(第3類組PH)的病患提供第一治療選項，因為其經由吸入施用靶定施用到肺部的通氣區域，避免非選擇性的全身血管擴張。
在肺高壓的動物模型中，驗證了吸入性投予微粒形式之sGC活化劑BAY58-2667(西那西呱(cinaciguat))導致肺動脈壓之劑量依賴的選擇性下降。在此模型中，靜脈內給予1H-1,2,4-㗁二唑并[4,3a]喹㗁啉-1-酮(ODQ)，其係氧化sGC的修復血紅素基團，降低了吸入NO(iNO)之血管擴張效應，而此項係因BAY58-2267而增加。這些結果導致了吸入sGC活化劑可能代表一種新穎的有效治療患有肺高壓病患之方法的假設，特別是若這些病患係因缺乏NO或sGC氧化而對iNO及/或PDE5抑制劑的反應下降[O.V. Evgenov et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2007, 176, 1138-1145]。然而，在此模型中，西那西呱本身並不具有足夠的作用持續時間，且此外，更高的劑量會導致不欲的全身性副作用。
Merck Sharp Dohme正在開發一種sGC刺激劑吸入應用，作為用於PAH的乾粉(MK5475；NCT04609943)。然而，如同PH和其他肺部疾病，吸入的一氧化氮(iNO)和sGC刺激劑之反應性可能因sGC的氧化而受損。靶定肺部的吸入性sGC活化劑可能克服此限制。
就此，應可將(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸與已核准、既有的肺高壓標準療法，以及與慢性肺疾病(例如COPD)和續發性PH形式的IIP之基本療法結合。
口服通常為活性藥物的較佳給藥路徑。對於心肺適應症，將藥物局部施用於目標器官肺部為較佳，以便藉由增加局部藥物濃度來提高效用，並避免藥物因全身利用性而造成的全身副作用。一般而言，較低頻率的給藥療法為理想的，例如用以提高病患對治療的依從性(病患的順從性)，但必須確定24小時的覆蓋供在給藥間隔期間血液動力學活性藥物的持續效用。許多肺部靶定的吸入藥物需要頻繁施用流程(例如伊洛前列腺素(Iloprost)/非塔敏思(Ventavis))，由於其例如半衰期及/或肺部滯留時間短，需要每天多次施用供24小時覆蓋。特言之，由於對病患有利的方便性和依從性因素，每日施用一次為較佳的。然而，依照藥物的特定行為和性質，尤其是其肺選擇性和肺滯留時間，此目標有時難以達成。
另一種全身給藥方式，注射，甚至與許多缺點相關(例如，需要臨床就診的不便、不適、病患對於以針頭為基礎的遞送方法之厭惡、給藥側的藥物反應)，更需要替代給藥路徑。
藉由吸入之肺部遞送為一種可提供優於口服和注射給藥數個優點的替代給藥途徑。這些優點尤其是藉由增加局部濃度和降低全身藥物副作用的可能性而效用更高，並且亦包括病患自我給藥的便利性、藉由吸入之易於遞送、免除針頭及諸如此類。
就用於吸入的醫藥製劑，其中不需要佐劑，特別是用於懸浮液吸入的固體製劑的情況下，製劑可單獨由活性成份組成。然而，就實際因素，例如為了促進非常低劑量活性成份的藥物遞送，製劑通常為除了活性成份外亦含有一或多種藥理上惰性和生理上可接受之賦形劑或載劑的醫藥品。例如，在R. Stangl, “An Overview of Innovative Inhalation Devices”, European Pharmaceutical Review, pages 50-55, (2002)及文中引述的參考文獻中可找到各種適合的製劑和對應的給藥輔助之綜述。在2019年，Moon等人發表了關於口服吸入產品遞送技術的最新評論(Moon et al., AAPS PharmSciTech 20, 2019 117 pp 1-17)。
非晶形式的式(I)化合物(參見比較實例11)及其製備方法係描述於專利申請案WO 2014/012934(參見實施例23)中，從前驅物5-([2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]{2-[4-(甲氧基羰基)-苯基]乙基-}胺基)-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸乙酯(WO 2014/012934之實例92A)開始，並概述於下列流程1中。
流程1：根據WO 2014/012934製備式(I)化合物
藉由濃縮層析餾份，獲得非晶固體之式(I)化合物(mosliciguat)。用於調整同質異晶現象之最後階段結晶的確定方法迄今未有描述。
此種製造方法的另一項缺點為其導致增加的低溶解度單鈉鹽之形成(參見例如比較實例12)。不可能藉由加入另外的酸將此單鈉鹽轉化為游離酸。此舉導致大量未使用的單鈉鹽，其就藥物物質之品質要求而言為不可接受的且必須濾除，因此降低了式I化合物的產率。
再者，在WO 2014/012934所揭示的方法中使用二㗁烷作為溶劑，不符合ICH指南。與此相反的，在本發明方法中係以THF替代二㗁烷。
式(I)化合物之另一種前驅物，亦即 (5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4‘-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯(化合物XII)之改良的合成 (XII) 已揭示於WO2021/233783中。然而，在此參考文獻中並無揭示式(I)化合物本身的合成方法。
因此，需要可重現地以高總產率、低製造成本和高純度滿足所有法規要求來提供式(I)化合物及尤其是晶體單水合物I(I-M-1)及/或II(I-M-II)，較佳地式(I-M-I)之單水合物I，在大工業規模上可實行的改良合成。
方法
根據本發明方法，如流程2所示，其特徵在於中間物的純化步驟係經由形成鹽/萃取/澄清過濾來進行並藉此避免層析純化步驟。另外，根據本發明方法係提供了高靈活性，因為式(I)之目標化合物可藉由三種路徑來製造： A) 路徑1由式(XII)之酯開始(方法步驟[A]和[B] =路徑1)， B) 路徑2由減縮方法之式(X)的中間物開始(WO2021/233783)(方法步驟[C]、[A]和[B]=路徑2)， C) 路徑3由式(XII-NSA)之固體NSA鹽開始(方法步驟[D]、[A]和[B]=路徑3)。
流程2：製造根據本發明式(I)化合物之方法，包括方法路徑1、2和3
包括步驟[A]和[B]的核心方法(路徑1)係用於全部三個替代路徑。根據本發明方法具有優於WO 2014/012934中揭示的先前技術方法之數個優點。若根據先前技術方法製造，則不可避免地包括在式I產物中的數種副產物可避免或至少較容易分離。本發明者們確定步驟[B]中從式(I-diNa)的二鈉鹽形成式(I)之目標酸為主要問題。以反向的方式控制反應混合物的pH值來進行此步驟至關重要。因此，方法步驟[B]需要將式(I-DiNa)的二鈉鹽中間物逆向加入等莫耳量的酸當量。相較於先前技術方法，藉由此逆向添加，式(I)化合物之微溶單鈉鹽的形成顯著減少(參見比較實例11)。然而，主要形成的低量單鈉鹽以及其他微溶雜質可藉由二鈉鹽溶液的澄清過濾來分離。另外，藉由逆向添加避免了其他副產物如鹽酸鹽。
另一種選擇，式(I)化合物可在不分離中間物的情況下從化合物(X)和(XI)開始藉由偶合，隨後的二酯裂解和酸釋放來製備(例如方法步驟[C]、[A]和[B]中所示，參見流程2(路徑2)。
在替代的路徑3)中，式(I)化合物可經由其NSA鹽來製備，其特徵在於在第一步驟[D]中，必須從式(XII-NSA)之NSA鹽中釋放二丁酯，然後經由二個步驟進一步轉化為游離酸(二丁酯之鹼性皂化(步驟[A])，及之後逆向加入酸用以釋放式(I)之游離酸(步驟[B])。
因此與WO 2014/012934中所揭示的方法相反，根據本發明方法係提供產率增加和高純度的式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸。
為了提供所欲的高純度式(I-M-I)之晶體形式單水合物I，需要一選擇性結晶方法。
一根據本發明之選擇性結晶方法，如流程3所示，其特徵在於：式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸係以晶體、純形式獲得，尤其是單水合物變體I，(I-M-I)或單水合物變體II(I-M-II)，較佳地單水合物變體I，(I-M-I)形式。
流程3：式(I)之酸的選擇性結晶用以產生其單水合物形式
依照所使用的溶劑，形成單水合物(I-M-I)或單水合物(I-M-II)。令人驚訝地，從丙酮、甲醇和水或甲醇和水的混合物中結晶(方法[E])選擇性地產生單水合物I，式(I-M-I)化合物，而從丙酮和水的混合物中結晶(方法[F])選擇性地產生單水合物II，式(I-M-II)化合物。
所述的製造方法，包括根據本發明之全部三個方法路徑1、2和3(參見流程2)，可有利地與所述結晶方法(參見流程3)組合，以便藉由使用從甲醇和水的混合物中結晶(方法[E])，選擇性地和以高產率及純度形成式(I)之酸的晶體形式，較佳地式(I-M-I)之單水合物I。
根據本發明之方法因此適用於在工業規模合成中以高產率和高純度，重複地製造式(I)之酸，尤其是單水合物變體I(I-M-I)或單水合物變體II(I-M-II)之形式，較佳地單水合物變體I(I-M-I)。
下列流程4、5和6係以示例的方式說明根據本發明之方法：(路徑1)、(路徑2)和路徑3。
流程4：經由二鈉鹽(I-DiNa)之逆向酸滴定，製備式(I)化合物的方法(路徑1)
此方法係包括下列步驟：式(XII)化合物之二酯，例如式(XII)的二丁酯的鹼裂解(步驟[A])，及隨後於方法步驟[B]中酸釋放最終式(I)之酸，流程4)。此方法其特徵在於，將二鈉鹽 (I-DiNa)分次添加到無機酸溶於適合溶劑，例如，THF溶劑之溶液中，其中小心監測溶液pH值的端點用以保持在3.8和4.2的pH值之間的窗口內。 方法步驟[A]
就從二酯(XII)製備式(I)之目標酸，係先裂解二酯(XII)。
經由其前驅物(X)與4-(溴乙基)-3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯](XI)之偶合反應於惰性極性溶劑中可得到式(XII)化合物(揭示於WO2021/233783，實例11中)。
就酯裂解(XII) → (I-DiNa)(步驟[A])，係將式(XII)化合物溶於THF或二㗁烷，較佳地THF和一適合的鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰溶液，較佳地氫氧化鈉溶液，特佳地4%氫氧化鈉溶液(1N)，加入過量，較佳地4倍莫耳過量，並在20°C至70°C，較佳地60°C的溫度下攪拌，直至完全轉化為式(I)化合物的二鈉鹽、二鋰鹽或二鉀鹽。就純化反應混合物，係加入適合的酯作為溶劑，較佳地乙酸乙酯，及視需要去離子水，較佳地在10°C至40°C，較佳地23°C的溫度下，並且將含有二-鹼金屬鹽(I-DiM)，例如(I-DiNa)、(I-DiK)或(I-DiLi)，較佳地(I-DiNa)之水相分離。較佳地以適合的酯，較佳地乙酸乙酯再次進行萃取。在不超過40℃，較佳地36℃的溫度於減壓下蒸餾除去水相中殘留的酯溶劑。視需要，可將反應混合物過濾，將過濾殘餘物丟棄。將濾液用於下個步驟。 方法步驟[B]
從二鹼金屬鹽(I-DiM)，例如(I-DiNa)、(I-DiK)或(I-DiLi)，較佳地式(I)化合物的二鈉鹽(I-DiNa)釋放式(I)之二羧酸，令人驚訝地無法藉由將無機酸加到式(I)化合物的二鈉鹽之溶液中定量達到。這舉導致轉化不完全並形成大量式(I)化合物的單鈉鹽，其沉澱且即使藉由進一步添加無機酸亦無法轉化為式(I)化合物。
令人驚訝地，發現藉由將式(I)化合物的二鈉鹽(I-DiNa)的溶液加至一定義量的酸中，直到調整至一狹義的pH值。以下述方法(「逆向法」)，高效的(I-DiNa) → (I)之反應為可能的。
提供THF和無機酸，較佳地鹽酸之混合物。
由於與過量鹽酸的反應導致不欲的式(I)化合物的鹽酸鹽形成，而鹽酸不足造成殘留量的鈉鹽，因此將酸調整至等莫耳量至關重要。因此，由於式I化合物含有二個鹼性羧酸鹽功能基，因此需要與2當量的酸反應，例如較佳地2當量的鹽酸。根據本發明方法，式(XII)的主要前驅物二丁酯可以數種形式存在：a)以一定義含量(例如藉由從NSA鹽中釋放)或b)作為從減縮方法獲得的中間溶液。因此視需要，為了確定二鈉鹽溶液的含量和計算相應所需的酸量，可將小量二鈉鹽溶液與一定義量的酸溶液，較佳的鹽酸一起研製(濕磨)。
然後，相對於提交的鹽酸量設定二鈉鹽溶液的消耗量，並且據此計算用於另一部份量轉化之鹽酸的量。
最初加入的鹽酸/THF混合物之pH小於3.8。將步驟[A]中獲得的式(I-DiNa)化合物之溶液分成數部分的量加到此混合物中，其中小心監測溶液pH值端點用以保持在介於3.8和4.2間之pH值的窗口內。然後分離出反應混合物的有機相。
分離較佳地係在將氯化鈉和THF加入反應混合物及隨後攪拌之後進行。
就分離/純化及/或結晶式(I)之目標化合物，係將有機相濃縮。濃縮有機相較佳地係於降低的大氣壓力，非常佳地係在200 mbar及較佳地於20和50℃之間的溫度，非常佳地於40℃下進行。
視需要，式I之目標化合物可分離為固體，例如藉由在升高的溫度，例如在60°C在氮氣流中，在真空下，於降低的大氣壓下，非常佳地於200 mbar下乾燥。
本發明亦提供了上文所導入的部分反應之組合，供製備式(I)化合物的晶形變體I，式(I-M-I)之單水合物I，或變體II，式(I-M-II)之單水合物II，較佳地式(I-M-I)之單水合物I。
在前述「逆向」方法中，取代二丁酯衍生物，亦可使用其他酯衍生物作為用氫氧化鈉溶液鹼水解步驟中的起始物。
相較於先前技術(WO 2014/012934，實例23)，此新穎方法具有減少微溶單鈉鹽形成的優點(參見，例如比較實例12)。由於不可能藉由加入另外的酸將此單鈉鹽轉化為游離酸，此舉導致必須濾除大量未使用的單鈉鹽且因而降低式I化合物的產率。這令人驚訝的結果係藉由將二鈉鹽溶液逆向加到2當量的無機酸中所獲得。
再者係得到高純度的式I化合物。因此，與先前技術(WO 2014/012934)相反，可免除複雜的層析。此外，在本發明方法中，殘留的鈉鹽可在結晶前藉由過濾分離。
再者，在WO 2014/012934所揭示的方法中係使用二㗁烷作為溶劑，其不符合ICH指南。與此相反的，在本發明方法中係以THF替代二㗁烷。
令人驚訝地，依照所選的溶劑而定，獲得確定晶型的式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸：a)式(I-M-1)之單水合物I，b)式(I-M-II)之單水合物II。而藉由先前技術合成，式I化合物僅可得到非晶形式。
令人驚訝地，當從包括甲醇、丙酮和水，或甲醇和水的溶劑混合物結晶時，係獲得一確定晶型為式(I-M-1)之單水合物I的式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸。
令人驚訝地，當從包括丙酮和水的溶劑混合物結晶時，係獲得一確定晶型為式(I-M-II)之單水合物II的式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸。
已發現，藉由上述結晶方法以高產率和純度選擇性地獲得式(I-M-1)單水合物I形式的(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸。
(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸並非以非晶形式形成，而是以高總產率形成式(I-M-1)之單水合物I的結晶形式，包括皂化、二鈉鹽形成和進一步轉化為式I的游離酸以及最後純化和結晶之步驟，例如理論值的71%，尤其是在大規模的情況下。從式XI的二芳基芐基溴開始，總產率達到理論值的67%。再者，該化合物係以高純度獲得，例如鈉鹽可在結晶前藉由過濾分離，而鹽酸鹽和其他雜質可藉由根據本發明之結晶方法分離出。
因此，對比先前技術(WO 2014/012934)，可以免除複雜的層析，及最終以高純度和產率獲得目標化合物式I之酸，例如式(I-M-I)之晶體單水合物I。 具體實例1(路徑1)
本發明係提供製備式(I)化合物之方法， 其特徵為在第一步驟[A]中係將溶於適合溶劑中的式(XII-1)化合物， (XII-1)， 其中 R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基， 與選自氫氧化鈉、氫氧化鋰或氫氧化鉀之鹼反應，產生二鹼金屬鹽(I-DiM)， 其中M=Na、Li或K (I-DiM) 將其萃取純化，但無進一步分離後，於第二步驟[B]中藉由以下方式進行反應： 將反應溶液分次加入溶於適合溶劑的無機酸混合物中，直到達到3.8至4.2的pH值，其中最初加入的無機酸混合物之pH值具有小於3.8之值，且最多包括與二鈉鹽相關的二個酸當量 最後得到式(I)之化合物 (I)。
本發明進一步係提供製備式(I)化合物之方法， 其特徵為於第一步驟[A]中將根據具體實例1之溶於適合溶劑中的式(XII-1)化合物， (XII-1)， 其中 R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基， 與氫氧化鈉溶液反應，產生二鈉鹽(I-DiNa) (I-DiNa) 將其萃取純化，但無進一步分離後，於第二步驟[B]中藉由以下方式進行反應： 將反應溶液分次加入溶於適合溶劑的無機酸混合物中，直到達到3.8至4.2的pH值，其中最初加入的無機酸混合物之pH值具有小於3.8之值，且最多包括與二鈉鹽相關的二個酸當量 (I) 最後得到式(I)的化合物。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵為在步驟[A]中使用氫氧化鈉溶液作為鹼得到二鈉鹽 為中間物。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在式(XII-1)中殘基R3和R4為相同的，特佳的當R3=R4=丁基時。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在第一步驟[A]中的溶劑為四氫呋喃或二㗁烷，較佳地四氫呋喃。
本發明之另外的目標為製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在第一步驟[A]中係使用以式(XII1)化合物為基礎之過量，較佳地4當量的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，較佳地4%氫氧化鈉溶液(1N)。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中第一步驟[A]係在40°C至70°C，較佳地60°C的溫度下進行。
本發明亦提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中二鈉鹽溶液係藉由以有機溶劑較佳地乙酸乙酯萃取來純化。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中第二步[B]之無機酸為鹽酸。
本發明亦提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在第二步[B]中，有機產物層係在將氯化鈉加到混合物中後分離。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於有機產物層之濃縮係在降低的大氣壓，較佳地在200 mbar及較佳地介於20至50°C的溫度，非常佳地在40°C的溫度下進行。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於將式(I)化合物分離為固體，另一種選擇將有機產物層濃縮至殘餘體積。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中式I之目標化合物可分離為固體，例如藉由在升高的溫度，例如在60°C在氮氣流中於真空下，在降低的大氣壓下，非常佳的在200 mbar下乾燥。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於式(I)化合物係分離為固體。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於式(I)的化合物係藉由過濾分離為固體或為濃縮的殘餘量 其特徵在於 •將有機產物層從混合物分離出， •濃縮有機產物層，其中一固體分離出， •藉由過濾分離該固體及 •將分離的固體乾燥。 •另一種選擇將有機產物層濃縮成一殘餘量。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於加入鹽水後分離有機溶劑。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於有機溶劑的濃縮係在降低的大氣壓下，較佳地在200 mbar及較佳地在20和50℃之間的溫度，非常佳的在40℃進行。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於係藉由過濾分離該固體。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例1及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於係於40℃至50℃之間的溫度和40 mbar至30 mbar的降低大氣壓力下乾燥固體。
另一種選擇，式(I)的化合物可在不分離中間物的情況下從化合物(X)和(XI)開始藉由偶合，隨後裂解二酯和酸釋放來製備(例如在路徑2中所示，包括方法步驟[C]、[A]和[B](參見流程5)。
流程5：在無分離二丁酯(XII)下用於製造式(I)化合物之方法(路徑2)
下文詳細描述用於製備化合物(I)之根據本發明替代方法。 方法步驟[C]
另一種選擇，式(I)化合物可在不分離中間物的情況下由式(X)化合物製備(減縮方法)。就此，進行偶合反應(步驟[C])，類似如WO2021/233783 中所揭示的流程2中之方法步驟11。
式(X)化合物可經由例如其前驅物在作為溶劑之正丁醇中的酸性酯化反應來取得(揭示於WO2021/233783，實例10)。
就得到根據式(XII)之化合物，係將式(X)之(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-羥苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯在10℃和40℃之間，較佳地在25℃的溫度下，溶解於惰性極性溶劑中，例如醚、丙酮或乙腈中，較佳地乙腈中。較佳地將反應混合物於40℃和60℃之間的溫度和減壓下，較佳地80 mbar和120 mbar之間，非常佳地120 mbar蒸餾，並加入另外的乙腈。此程序可重複。
相對於化合物(X)，較佳地係以1 eq至2 eq之間的量，非常佳地1,2 eq，加入式(XI)之4-(溴甲基)-3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]。於溶液中加入鹼，其中鹼係由鹼金屬碳酸鹽類組成之群組中選出，例如碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸銫或鹼金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉或氫氧化鉀，或四烷基銨碳酸鹽，較佳地碳酸銫。鹼係以莫耳過量加入，較佳地相對於化合物(X)以2 eq至4 eq，非常佳地2 eq之量加入。攪拌反應混合物直到反應完全，得到化合物(XII)。較佳地，可在持續攪拌下於反應混合物中加入另量的鹼，較佳地碳酸銫。將所得到的懸浮液過濾。在丟棄過濾殘餘物(濾餅)之前，最好以乙腈清洗。液體反應混合物可在不分離式(XII)化合物下於另一反應步驟中，例如在反應步驟[A]中進一步反應。
另一種選擇，式(XII)之化合物可分離為油狀物，及然後其可在另一反應步驟，例如反應步驟[A]中反應。就分離該油狀物，係將混合物濃縮成油狀物，較佳地在以乙腈清洗後，於15℃和60℃之間，較佳地30℃和50℃之間，特佳地在40℃的溫度下。濃縮較佳地係在降低的大氣壓力下進行。
液體反應溶液係在無分離式(XII)化合物下以油狀物用於下個階段中，藉由首先將溶劑換成THF或二㗁烷，藉由蒸餾，其中較佳地係使用THF。
然後類似如上所述之方法步驟[A]，進行酯裂解步驟[A]及類似上述方法步驟[B]，從式(I-DiNa)步驟[B]之二鈉鹽釋放式(I)之二羧酸。 具體實例2(路徑2)
本發明係提供一用於製備式(I)化合物的方法，其特徵在於第一步[C]中將式(X-1)化合物， (X-1)， 其中 R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基， 在由鹼金屬碳酸鹽、鹼金屬氫氧化物或四烷基銨碳酸鹽組成之群組中選出之鹼的存在下，與式(XI)化合物反應， (XI)， 得到式(XII-1)化合物， (XII-1) 其中 R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基， 其進一步的特徵在於式(XII-1)化合物係在無純化下於第二步驟[A]中 溶於適合的溶劑中與選自氫氧化鈉、氫氧化鋰或氫氧化鉀溶液之鹼反應，產生二鹼金屬鹽(I-DiM)， 其中M=Na、Li或K (I-DiM) 將其萃取純化，但無進一步分離後，於第二步驟[B]中藉由以下方式進行反應： 將反應溶液分次加入溶於適合溶劑的無機酸混合物中，直到達到3.8至4.2的pH值，其中最初加入的無機酸混合物之pH值係小於3.8並最多包括與二鈉鹽相關的二個酸當量 最後得到式(I)的化合物 (I)。
本發明進一步係提供製備實施例2之式(I)化合物的方法，其特徵在於第一步驟[C]中將式(X-1)化合物， (X-1)， 其中 R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基 在由鹼金屬碳酸鹽、鹼金屬氫氧化物或四烷基銨碳酸鹽組成之群組中選出之鹼的存在下，與式(XI)化合物反應， (XI)， 得到式(XII-1)化合物， (XII-1) 其中 R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基 其進一步的特徵在於式(XII-1)化合物係在無純化下於第二步驟[A]中 溶於適合的溶劑中與氫氧化鈉反應，產生二鈉鹽(I-DiNa)， (I-DiNa) 將其萃取純化，但無進一步分離後，於第二步驟[B]中藉由以下方式進行反應： 將反應溶液分次加入溶於適合溶劑的無機酸混合物中，直到達到3.8至4.2的pH值，其中最初加入的無機酸混合物之pH值係小於3.8且最多包括與二鈉鹽相關的二個酸當量 最後得到式(I)化合物 (I)。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其中在式(XII-1)中的殘基R 3和R 4為相同的，特佳的當R 3＝R 4＝丁基時。
本發明之另外的目的為製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於在第一步驟[C]中係使用由醚、丙酮或乙腈組成之群組中選出的適合溶劑，較佳地乙腈。
本發明之另外的目的為製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於在第一步驟[C]中係使用由鹼金屬碳酸鹽組成之群組中選出之適合的鹼，例如碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸銫，較佳地碳酸銫。
本發明之另外的目的為製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於在第一步驟[C]中，該鹼為鹼金屬氫氧化物，係由氫氧化鈉或氫氧化鉀組成之群組中選出。
本發明之另外的目的為製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於在第一步驟[C]中係使用四烷基銨碳酸鹽作為鹼。
本發明之另外的目的為製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於在第一步驟[C]中，係使用由鹼金屬碳酸鹽、鹼金屬氫氧化物或四烷基銨碳酸鹽組成之群組中選出之莫耳過量的鹼，較佳地以相對於式(X)化合物2eq至4eq之量，特佳地相對於化合物(X)為2 eq。
本發明之另外的目的為製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於在第一步驟[C]中，式(XI)化合物較佳地相對於式(X)化合物係以1：1至2：1之莫耳比來使用，特佳地相對於式(X)的化合物1.2：1之莫耳比。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其中在第二步驟[A]中該溶劑為四氫呋喃或二㗁烷，較佳地四氫呋喃。
本發明之另外的目的為製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其中在第二步驟[A]中係使用氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，較佳地以式(XII-1)化合物為基準，過量的4%氫氧化鈉溶液(1N)，較佳地4當量。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其中在第二步驟[A]中該步驟係於40°C至70°C之溫度，較佳地60°C下進行。
本發明亦提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其中該二鈉鹽溶液係藉由以一有機溶劑，較佳地乙酸乙酯萃取加以純化。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其中在第三步驟[B]中該無機酸為鹽酸。
本發明亦提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其中在第三步驟[B]中該有機層係在將氯化鈉加到混合物中後分離。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其中式I之目標化合物可分離為固體，例如藉由在升高的溫度下，例如在60°C在氮氣流中於真空下，在降低的大氣壓下，非常佳的在200 mbar下乾燥。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於式(I)的化合物係分離為固體，另一種選擇該有機層係濃縮為一殘餘量。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於式(I)的化合物係藉由過濾分離為固體或為濃縮的殘餘量 其特徵在於 •從混合物分離出有機產物層， •濃縮有機產物層，其中一固體分離出， •藉由過濾分離該固體及 •將分離的固體乾燥。 •另一種選擇將有機產物層濃縮成一殘餘量。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於該有機層係在加入鹽水後分離。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於有機溶劑的濃縮係在降低的大氣壓下，較佳地在200 mbar及較佳地在20和50℃之間的溫度，非常佳的在40℃進行。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於係藉由過濾分離該固體。
本發明進一步係提供製備如上述根據實施例2和上文一或多個另外實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於係於40℃至50℃之間的溫度和40 mbar至30 mbar的降低大氣壓力下乾燥固體。
經由式(XII-NSA)之NSA鹽製造式(I)之目標化合物的另外替代方法係概述於流程6中。
流程6：經由式(XII-NSA)之NSA鹽製造式(I)化合物的方法(路徑3)
此方法之特徵在於式(XII-NSA)之固體NSA鹽(經由反應步驟[G]可取得，參見流程7)係經由三個步驟(第一：鹼性釋放式(XII)之二丁酯(步驟[D])，第二：二丁酯之鹼裂解(步驟[A])，及之後將式(I-DiNa)之二鈉鹽逆加入酸中(步驟[B])，轉變為游離酸。 方法步驟[D]
就從式(XII-NSA)化合物開始獲得式(I)化合物，係於第一步驟中從鹽中釋放式(XII)化合物[步驟D]。因此，將式(XII-NSA)化合物以適合的醚，較佳地THF處理，並在10℃至25℃的溫度下與水和氨水一起攪拌，由此最終達到7.8至8.2的pH值。藉由加入與水不混溶的有機溶劑，例如及較佳地異丙醚，進行相分離。
令人驚訝地，相分離僅在使用氨水作為鹼時才有可能。其他鹼，例如碳酸鉀、氫氧化鉀或氫氧化鈉由於形成廣泛的無用層而失敗。
丟棄水相。將有機相濃縮成蒸發殘餘物，較佳地在以水和氨水的混合物(pH值為7.8至8.2)清洗並經硫酸鈉乾燥之後。將所得到的蒸發殘餘物於下個步驟中反應。濃縮係於最高40°C的溫度在降低的大氣壓力下進行。
令人驚訝地，經由NSA鹽的形成和釋放之方法具有優勢，即油狀二丁酯可轉化為固體。此項使得整體可加工性甚至更方便。令人驚訝地，吾等發現，儘管其他常見酸，如，例如甲苯磺酸，但僅鹽酸與NSA形成穩定的固體。 方法步驟[A]
就酯裂解(XII)→(I-DiNa)(反應步驟[A])，係將步驟[D]中所獲得的式(XII)之二酯溶解於THF或二㗁烷中，較佳地THF，並添加適合的鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰溶液，較佳地氫氧化鈉溶液，特佳地添加過量4%重量比的氫氧化鈉溶液，較佳地4當量，在40℃至70℃的溫度下，較佳地60℃。攪拌反應混合物直至完全轉化為式(I)化合物之二鈉鹽、二鋰鹽或二鉀鹽。
就所述反應，亦可利用式(XII-1)之二酯替代式(XII)化合物 (XII-1)， 其中R 1和R 2獨立地為C 1-C 4-烷基。
就純化反應混合物，係加入適合的酯作為溶劑，較佳地乙酸乙酯，及視需要去離子水，較佳地在10°C至40°C，較佳地23°C的溫度下，並將含有二鹼金屬鹽(I-DiM)，例如(I-DiNa)、(I-DiK)或(I-DiLi)，較佳地(I-DiNa)之水相分離。較佳地以相同的酯重複萃取。在最高40℃，較佳地36℃之溫度於減壓下蒸餾去除水相中殘留的酯溶劑。視需要可過濾反應混合物，其中係將過濾殘餘物丟棄。將反應混合物用於下個反應步驟(方法步驟[B])。 方法步驟[B]
從二鹼金屬鹽(I-DiM)，例如(I-DiNa)、(I-DiK)或(I-DiLi)，較佳地式(I)化合物之二鈉鹽(I-DiNa)釋放式(I)之二酸羧令人驚訝地無法藉由將無機酸加到式(I)化合物的二鈉鹽溶液中而定量達成。此舉導致不完全轉化並形成大量的式(I)化合物之單鈉鹽，其沉澱且即使藉由另外添加無機酸亦無法轉化為式(I)化合物。
令人驚訝地，已發現可能藉由將式(I)化合物之二鈉鹽(I-DiNa)的溶液加到過量的酸中直到調整出窄義pH值，製備式(I)的化合物。以下述方法(「逆向法」)，高效的(I-DiNa)→(I)反應為可能的。
提供THF和無機酸，較佳地鹽酸之混合物。
由於與過量鹽酸的反應使得不欲的式(I)化合物之鹽酸鹽形成且鹽酸不足造成鈉鹽的殘留量，因此將酸調整至等莫耳量至關重要。因此，由於式I的化合物含有二個鹼性羧酸鹽功能機，因此需要與2當量的酸，例如較佳地2當量的鹽酸反應。因此視需要，為了確定二鈉鹽溶液的含量和計算相應必需的酸量，可將小量二鈉鹽溶液以一定義量的酸溶液，較佳地鹽酸研製。
然後相對於提交的鹽酸量設定二鈉鹽溶液的消耗量，以及據此計算用於轉化另外部分量之鹽酸的量。
最初加入的鹽酸/THF混合物之pH值係小於3.8。將在步驟[A]中得到的式(I-DiNa)化合物的溶液分成數部分的量加到混合物中直至達到3.8至4.2的pH值。然後分離出反應混合物的有機相。
分離較佳地係在將氯化鈉和THF加入反應混合物中及隨後攪拌之後進行。
就分離/純化及/或結晶式(I)之目標化合物，係將有機相濃縮。有機相的濃縮較佳地係在降低的大氣壓力下，非常佳地在200 mbar及較佳地在介於20和50℃間的溫度下，非常佳地40℃下進行。
視需要，式I之目標化合物可分離為固體，例如藉由在升高的溫度，例如在60°C於氮氣流中在真空下，在降低的大氣壓下，非常佳地在200 mbar下乾燥。 具體實例3(NSA鹽)
式(XII-NSA)之NSA鹽為新穎的。
本發明之另一具體實例為下式之NSA鹽
合成式(XII-NSA)之NSA鹽係如下列流程7所概述。
流程7：合成式(XII-NSA)之NSA鹽 方法步驟[G]
就於反應步驟[G]中獲得根據式(XII-NSA)之化合物(流程7)，係在介於15℃和40℃之間的溫度，較佳地在25℃，將式(XII)化合物溶解於THF中，加入萘-1,5-二磺酸，攪拌直到反應完全。將反應混合物在介於15℃至60℃之間，較佳地介於30℃至50℃之間，非常佳地40℃的溫度下濃縮，及最後將殘餘物在相同溫度下乾燥直至達到恆重。乾燥過程較佳地係於惰性氣體，較佳地在氮氣及/或在減壓下進行。 具體實例4(路徑3)
本發明係提供製備式(I)化合物之方法，其特徵在於在第一步驟[D]中將式(XII-NSA-1)之NSA鹽 其中R 1和R 2獨立地為C 1-C 4-烷基， 以適合的醚處理並在10°C至25°C的溫度與水和氨水一起攪拌，最終達到介於7.8至8.2之間的pH值，之後將反應混合物以不混溶於水的有機溶劑處理，分離各相，及最後濃縮有機相，其進一步的特徵在於在第二步驟[A]中，係將溶於適合溶劑中的式(XII-1)化合物， (XII-1)， 其中R 1和R 2獨立地為C 1-C 4-烷基， 與選自氫氧化鈉、氫氧化鋰或氫氧化鉀溶液之鹼反應，產生二鹼金屬鹽(I-DiM)， 其中M=Na、Li或K (I-DiM) 將其萃取純化，但未進一步分離後，在第三步驟[B]中反應 藉由將反應溶液分次加入無機酸溶於適合溶劑的混合物中，直到達到3.8至4.2的pH 值，其中最初加入的無機酸混合物具有小於3.8的pH值，且最多包括與二鈉鹽相關的二個酸當量 最後得到式(I)之化合物 (I)。
本發明進一步係提供製備根據具體實例4之式(I)化合物的方法，其特徵在於在第一步驟[D]中將式(XII-NSA-1)之NSA鹽 其中R 1和R 2獨立地為C 1-C 4-烷基， 以適合的醚處理並在10°C至25°C的溫度與水和氨水一起攪拌，最後達到介於7.8至8.2之間的pH值，之後將反應混合物以不混溶於水的有機溶劑處理，分離各相，最後濃縮有機相，其進一步的特徵在於在第二步驟[A]中將溶於適合溶劑中的式(XII-1)化合物， (XII-1)， 其中R 1和R 2獨立地為C 1-C 4-烷基， 與氫氧化鈉溶液反應，產生二鈉鹽(I-DiNa)， (I-DiNa) 將其萃取純化，但未進一步分離後，在第三步驟[B]中反應 藉由將反應溶液分次加入溶於適合溶劑的無機酸混合物中，直到達到3.8至4.2的pH值，其中最初加入的無機酸混合物具有小於3.8的pH值且最多包括與二鈉鹽相關的二個酸當量 最後得到式(I)之化合物 (I)。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在式(XII-1)中殘基R 3和R 4為相同的，特佳地當R 3＝R 4＝丁基時。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在第一步驟[D]中該醚為四氫呋喃。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在第一步驟[D]中所加入的溶劑為異丙醚。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在第一步驟[D]中於相分離後丟棄水相並將有機相濃縮成固體，較佳地在以水和氨水的混合物，氨水溶液(7.8至8.2之pH值)清洗及經硫酸鈉乾燥後。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在第二步驟[A]中該溶劑為四氫呋喃或二㗁烷，較佳地四氫呋喃。
本發明另外的目的為製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在第二步驟[A]中係使用氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，較佳地以式(XII-1)化合物為基準過量的4%氫氧化鈉溶液(1N)，較佳地4當量。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在第二步驟[A]中該步驟係於40°C至70°C，較佳地60°C的溫度下進行。
本發明亦提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中該二鈉鹽溶液係藉由以有機溶劑，較佳地乙酸乙酯萃取加以純化。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在一第三步驟[B]中該無機酸為鹽酸。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其中在一第三步驟[B]中該有機產物層係在將氯化鈉加入該混合物後分離。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於該有機產物層之濃縮係在降低的大氣壓力下，較佳地在200 mbar及較佳地在介於20和50℃之間的溫度，非常佳地在40℃進行。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於式(I)的化合物係分離為固體另一種選擇係將有機產物層濃縮為一殘餘量。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於式(I)的化合物係藉由過濾分離為固體或為濃縮的殘餘量 其特徵在於 •從混合物分離出有機產物層， •濃縮有機產物層，其中一固體分離出， •藉由過濾分離該固體及 •將分離的固體乾燥 •另一種選擇將有機產物層濃縮成一殘餘量。
本發明進一步係提供製備如上述根據具體實施例4及上文一或多個另外的具體實施例之式(I)化合物的方法，其特徵在於將固體在至高60°C的溫度於氮氣流中及於降低的大氣壓下，例如40 mbar至30 mbar下乾燥。
本發明亦提供了上文所導入的部分反應之組合，供製備式(I)化合物的結晶變體I，式(I-M-I)之單水合物I，或變體II，式(I-M-II)之單水合物II，較佳地式(I-M-I)之單水合物I。
以一例示方式，描述經由上述方法路徑1、2和3可得到的式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的進一步純化 (I) (參見流程2)，最後產生式(I-M-I)之單水合物I。
依照規模和方法路徑，可能較佳的係在最終結晶之前純化式I化合物。因此，結晶可包括組合的方法步驟[H]和[E]。亦可僅根據步驟[E]使式(I)化合物結晶。此項係以示例性方式描述。 方法步驟[H]： 純化目標化合物I(1.結晶)：
含有式I之游離酸的粗有機相，例如將經由上述方法路徑1、2或3之一所獲得的(參見流程2)真空濃縮，溶於四氫呋喃，較佳地相對於四氫呋喃的蒸發殘餘物0.8至1.1倍的量，及然後加入2.2：1之甲醇和水的混合物，較佳地相對於丁酯，於約5倍量的2.2：1甲醇水混合物中在20°C在攪拌下。加入(5S)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I之晶種並攪拌一段時間，較佳地12 h。將固體分離並以1：1的甲醇和水之混合物清洗。然後將固體於20°C下真空乾燥。
乾燥係於較佳地40°C和50°C之溫度及40 mbar至30 mbar進行。 方法步驟[E]：
結晶/形成單水合物形式I，(I-M-I)：甲醇、丙酮、水結晶
將經由上述方法路徑1、2或3之一，例如經由路徑3獲得的式I化合物(固體形式、蒸發殘餘物形式或亦為THF中的濃縮物)加熱至升高的溫度，較佳地加熱至50°C，以1：1的丙酮和甲醇混合物，較佳地4至8倍量，較佳地相對於式I之固體化合物的量各溶劑約4倍的量，並冷卻至20℃。將得到的溶液過濾，例如通過Seitz過濾板，加熱至50℃，及最後於一段時間內，較佳地於30分鐘內逐滴加入水，較佳地相對於式I之固體化合物的量1.8倍的水量。因此，最後將化合物於2.2：2.2：1丙酮、甲醇和水的混合物中攪拌，其中相對於式(I)之固體酸的克(g)重，溶劑的克量為約10：1。將溶液接種小量式(I-M-I)之單水合物I的晶種，依照規模而定至高數克的小量，攪拌30分鐘，於至少30分鐘內冷卻至20℃並抽氣過濾出固體。濕產物較佳地係與水，較佳地相對於式I固體化合物之量10倍的水量，一起攪拌一段時間，較佳地12小時。最後，抽氣過濾出固體並以水清洗二次，較佳地相對於式I固體化合物之量2倍的水量。將濕產物於20°C在氮氣流中減壓下乾燥至恆重，得到的式I化合物晶形變體I，式(I-M-I)之單水合物I。
另一種選擇，將例如經由上述方法路徑1、2或3之一(參見流程2)，例如經由路徑2所獲得的含有式I游離酸之粗有機相，在真空中濃縮，溶於四氫呋喃中，較佳地相對於四氫呋喃蒸發殘餘物的0.8至1.1倍的克(g)量，及然後加入2.3：1的甲醇和水混合物，較佳地相對於丁酯，2.3：1甲醇水混合物約7倍的量，較佳地在20°C攪拌下。加入(5S)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I之晶種。然後計量另再加入約17.3倍量的2.3：1甲醇水混合物。因此最後係於相對於固體化合物24.3倍克(g)量之2.3：1甲醇水混合物中攪拌該化合物。將其攪拌一段時間，較佳地至隔夜。分離固體並以1：1的甲醇和水混合物清洗。然後將固體，較佳地在40至50℃和40至30 mbar下真空乾燥。
另一種選擇，將式I之固體化合物溶於4：1的甲醇和水混合物中，其中溶劑與固體的比例係如下：相對於式(I)化合物的克(g)量以克(g)計4倍量甲醇和相對於式(I)化合物的克(g)量以克(g)計約1倍量的水。之後加入4：1的丙酮和水混合物，其中溶劑與固體的比例係如下：加入4倍量的丙酮和約1倍量的水。因此，最後將化合物於4：4：2的丙酮、甲醇和水混合物中攪拌，其中相對於式(I)的固體酸之克(g)量，溶劑克(g)量為約10：1。將其攪拌至隔夜。抽氣過濾出固體，以1倍量的丙酮/水(8：2)混合物清洗，並於60℃以氮氣真空乾燥至隔夜。 具體實例5(單水合物I之結晶方法[E])
本發明係提供製備 (5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)之晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法， 其特徵在於將式(I)化合物 (I) 從極性溶劑之混合物結晶，其中該極性溶劑係由甲醇、丙酮、水所組成之清單中選出，其中至少一甲醇和水之混合物必須於20°C至100°C的溫度並將式(I-M-I)化合物 (I-M-I) 分離出，視需要冷卻後。
本發明亦提供製備根據上文具體實例5之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法， 其特徵在於將含有式I之游離酸的粗有機相，例如經由上述方法路徑1、2或3之一所獲得的(參見流程2)，真空濃縮，溶於四氫呋喃中，較佳地相對於四氫呋喃的蒸發殘餘物0.8至1.1倍的克(g)量，及然後加入2.2：1的甲醇和水混合物，較佳地相對於丁酯約5倍量的2.2：1甲醇水混合物，較佳地在20°C攪拌下逐滴加入。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於式(I)化合物係於2.2：1或2.3：1之甲醇和水混合物中在介於約20°C至約50°C之間的溫度下攪拌。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於式(I)化合物係於2.2：1或2.3：1之甲醇和水混合物中在介於約20°C至約50°C之間的溫度下攪拌，且相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，甲醇和水混合物的量以克(g)計為約5至24，較佳地約10倍量。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於將式(I)化合物首先於約50°C之溫度溶於1：1的甲醇和丙酮混合物，冷卻至室溫並將溶液過濾澄清。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於將式(I)化合物首先溶於1：1的甲醇和丙酮混合物，其中各溶劑相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，係以克(g)計4至8倍的量來提供。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於將式(I)化合物首先溶於1：1的甲醇和丙酮混合物，較佳地相對於以克(g)計的式I固體化合物的量，以4倍量之各溶劑(相對於1：1混合物為8倍量)，於約50°C之溫度及冷卻至室溫，較佳地20°C藉由過濾來澄清化溶液，加熱至50°C並於一段時間內逐滴加入水。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於係於30分鐘的時間內逐滴加入水。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於水係以相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，於30分鐘的時間內逐滴加入1.8倍的量。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於在加入水後，較佳地相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，加入以克(g)計1.8倍的水量，將式(I-M-I)化合物之晶種加入該經攪拌的混合物中。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於在加入水後，較佳地相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，加入以克(g)計1.8倍的水量，將式(I-M-I)化合物之晶種加入該經攪拌的混合物中，持續攪拌一段時間，較佳地30分鐘並將混合物冷卻至20°C及最後將固體過濾出。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於在加入水後，較佳地相對於以克(g)計之固體式I化合物的量，加入以克(g)計1.8倍的水量，接種式(I-M-I)化合物之晶種，持續攪拌一段時間，較佳地30分鐘並將濕產物之濾液與水攪拌，較佳地相對於式I之固體化合物的量，10倍的水量，進行一段時間，較佳地12小時。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於最後將固體抽氣過濾並以水清洗二次，較佳地相對於式I固體化合物的量，2倍的水量。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於在過濾固體後，將濕產物於20°C氮氣流中於真空下，例如40至30 mbar乾燥至恆重。
本發明亦提供製備根據具體實例5及上文一或多個另外的具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於在過濾固體後，將濕產物於升高的溫度，例如介於40°C和50°C之間於真空下，例如40至30 mbar乾燥至恆重。
以一示例的方式，描述經由上述方法路徑1、2或3(參見流程2)可得到的式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的進一步純化 (I) ，最後產生式(I-M-II)之單水合物II。
此項係以示例的方式描述。 方法步驟[F]
結晶/形成單水合物形式II，(I-M-II)：丙酮水結晶(參見上文流程3)
將經由上述方法路徑1、2或3之一，例如經由路徑3獲得的式I化合物(為固體形式、蒸發殘餘物形式或亦為THF中的濃縮物)加熱至升高的溫度，較佳地以丙酮和水之混合物加熱至50°C，其中丙酮和水的比例係在7.8：1、9：1和22.2：1間變化，其特徵在於相對於式I之固體化合物，溶劑的總量以克(g)計為約2至3倍。將得到的溶液冷卻至20℃並過濾，例如通過Seitz過濾板，加熱至50℃。冷卻至45°C，接種 (5S)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物II形式之晶種，冷卻至20℃歷時一段時間，較佳地約3小時，攪拌並加熱至40°C。攪拌懸浮液，冷卻至20°C及攪拌，並抽氣過濾出固體。將濕產物於25°C氮氣流中減壓下乾燥至恆重，得到的式II化合物晶形變體II，式(I-M-II)之單水合物II。
另一種選擇，將式I之固體化合物溶於8：1的丙酮和水混合物中，其中溶劑與固體的比例係如下：相對於式(I)化合物的克(g)量，以克(g)計8倍的丙酮量和相對於式(I)化合物的克(g)量，以克(g)計約1倍的水量。因此，最後將化合物於8：1的丙酮和水混合物中攪拌，其中相對於式(I)之固體酸的克(g)量溶劑的克(g)量為約9：1。攪拌至隔夜。抽氣過濾固體，以1倍量的丙酮/水(8：2)混合物清洗，並在60℃以氮氣於真空下乾燥至隔夜。 具體實例6(單水合物II之結晶方法[F])
本發明係提供製備(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物II(I-M-II)之方法， 其特徵在於將式(I)化合物 (I) 於20°C至100°C的溫度從丙酮和水的混合物結晶並將式(I-M-II)化合物 (I-M-II) 分離出，視需要在冷卻後。
本發明亦提供製備根據具體實例6之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)體變體單水合物II(I-M-II)的方法 其特徵在於將式(I)化合物於50°C的溫度於丙酮和水的混合物中攪拌，其中丙酮與水的比率係介於23：1和4：1之間，較佳地23：1和7：1。
本發明亦提供製備根據具體實例6和上文一或多個具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物II(I-M-II)的方法，其特徵在於係於丙酮和水的混合物中攪拌式I之酸，其中丙酮與水的比率係介於23：1和7：1之間及另外其中相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，丙酮係以4至8倍量提供而其中水係以0.2至0.8倍量提供。
本發明亦提供製備根據具體實例6和上文一或多個具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物II(I-M-II)的方法，其特徵在於係於丙酮和水的混合物中攪拌式I之酸，其中丙酮與水的比率係介於23：1和7：1之間及另外其中相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，丙酮係以4至8倍量提供而其中水係以0.2至0.8倍量提供，將混合物加熱至50°C並過濾使溶液澄清。
本發明亦提供製備根據具體實例6和上文一或多個具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物II(I-M-II)的方法，其特徵在於係於丙酮和水的混合物中攪拌式I之酸，其中丙酮與水的比率係介於23：1和7：1之間及另外其中相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，丙酮係以4至8倍量提供而其中水係以0.2至0.8倍量提供，將混合物加熱至50°C並過濾使溶液澄清及然後於介於45至50°C間的溫度將式(I-M-II)化合物的晶種加到經攪拌的混合物中。
本發明亦提供製備根據具體實例6和上文一或多個具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物II(I-M-II)的方法，其特徵在於係於丙酮和水的混合物中攪拌式I之酸，其中丙酮與水的比率係介於23：1和7：1之間及另外其中相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，丙酮係以4至8倍量提供而其中水係以0.2至0.8倍量提供，將混合物加熱至50°C並過濾使溶液澄清，及然後於介於45至50°C間的溫度將式(I-M-II)化合物的晶種加到經攪拌的混合物中，持續攪拌一段時間，較佳地30分鐘並將混合物冷卻至20°C及最後將固體濾出。
本發明亦提供製備根據具體實例6和上文一或多個具體實例之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物II(I-M-II)的方法，其特徵在於在過濾固體後將濕產物於25°C在氮氣流中於真空，例如40至30 mbar下乾燥至恆重。 (假-)多晶型
WO 2014/012934 揭示了僅為一非晶固體之式(I)的(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸。根據WO 2014/012934之實例23中描述的合成所製備之式(I)化合物的對應X光繞射圖係如圖33所示(參見對比實例11)，其並不適用於藉由乾粉吸入器給藥之吸入劑型。
就開發醫藥形式，尤其是包括固體形式之式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的乾粉吸入形式，對於可重複製造和分離式(I)化合物之確定晶體形式有高需要。
需要許多努力才能將式I的化合物最後結晶成一確定的固體形式。
首先嘗試將(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸轉變成晶體形式失敗了且僅產生具有不受控制相變之不欲的非晶型。
就克服此性質，進行一鹽選擇篩選，試圖找出具有有利性質的新晶體物質。然而，所有的試驗都導致了非晶或高度無序的物質，且並無觀察到鹽形成(參見圖4：L-精胺酸的鹽篩選實驗)。
令人驚訝地獲得了數種假多晶形式的式I化合物，而未發現無水晶體形式。
已鑑定出下列式(I)化合物之晶體形式其為假多晶形式單水合物I和II((I-M-I)和(I-M-II))、半水合物、倍半水合物、二水合物和1,25水合物(參見實例6和圖5至32)。在本文中變體、多晶型和多晶體具有相同的意義。此外亦存有非晶形式。整體上-假多晶形式和非晶形式-為不同的式(I)化合物固體形式。
化合物的穩定性和均一性為醫藥的關鍵要求以及衛生當局核准的先決條件。其增加了包括式(I)化合物之製劑和調配物的安全性和品質，且從而降低了對病患的風險。
然而，在數個鑑定出的假多晶形式中，必須在幾個階段中鑑定出最適合和穩定的形式。
發現二水合物在乾燥期間中經歷了非晶化(參見圖10a)。半水合物的晶格展現出無序(參見圖5)，其可支持機械加工，如例如，調配方法中的相變及/或非晶化。由於非常長的攪拌過程，倍半水合物的結晶對於擴大規模並非可行的。
發現二種單水合物克服了這些不同假多晶形式之不欲的性質。然而最後證明這些單水合物形式中僅一種在微粉化期間為穩定的且因此最適合的形式例如用於製造吸入藥物，特別是作為乾粉基底的吸入藥物。令人驚訝地，在微粉化期間中，發現單水合物II依照微粉化條件顯現部分非晶化(參見實例8b，圖 42)或除此之外轉變為單水合物I(參見實例8a，圖43)。再者，觀察到單水合物II在儲存期間顯現轉變為單水合物I(參見實例7b、圖40和41)。因此假多晶形式單水合物I適用於藥物領域，特別是適用於醫藥組成物，尤其是乾粉吸入劑型，且優於式I化合物的其他固體形式。
特言之，式(I)化合物之單水合物I形式確保防止了不欲的轉化為另外形式之式(I)化合物以及如上述之相關性質改變。
本發明之目的因此為提供一具有優越的應用性能，例如在微粉化期間的機械穩定性和與固態轉化相關的儲存穩定性之假多晶形式物。
目前令人驚訝地發現，藉由應用特定的結晶條件所獲得的單水合物I具有此等優越的性能。特言之，若與先前技術中已知的非晶形式或本文所描述的所有其他假多晶形式相比，單水合物I展現改良的性能，如微粉化過程中的機械穩定性、增強的儲存穩定性和更佳的可加工性。特言之，單水合物I展現增加的穩定性且從而確保防止不欲地轉化為式(I)化合物之另外的假多晶形式，且從而防止如上述的相關性質變化。增加的穩定性提升了包括式(I)化合物之調配物的安全性和品質。
因此，式(I)化合物之假多晶形式單水合物I(I-M-I)為工業應用上最佳的式I化合物形式。
使用根據本發明的方法(參見上文流程2和3)，有可能以高產率和純度選擇性地分離式(I-M-I)之單水合物I結晶形式的式(I)化合物。
多晶型，尤其是水合物，較佳地形式I和II的單水合物可藉由式(I)之酸的結晶來製造(參見流程3)。
依照所使用的溶劑，形成單水合物(I-M-I)或單水合物(I-M-II)。從甲醇和水的混合物或丙酮、甲醇和水的混合物中結晶選擇性地產生式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸其式(I-M-I)的單水合物I形式，而從丙酮和水的混合物結晶則選擇性地產生形式II的單水合物(I-M-II)。
(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之單水合物I可以各別的繞射圖為基準藉由X光粉末繞射來定性，這些繞射圖係在25°C並以Cu-Kα1照射(1.5406 Å)所記錄。根據本發明之單水合物I展現至少2個，通常至少3個，通常至少5個，特言之至少7個，更特言之至少10個，及尤其是下列引用數值的全部反射：
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：12.8和29.2或至少6.9、7.2和7.3或至少6.9、7.2、7.3、12.8和29.2或至少6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0和15.2，或至少下列反射：6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8和25.1或至少下列反射：6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7和23.7，或至少下列反射：6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7、23.7、9.9、5.7和11.5，各以2Ɵ值±0.2°表示。
在另外的具體實例中，式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：12.8、16.0和25.8或至少6.9、7.2和7.3，或至少6.9、7.2、7.3、12.8、16.0和25.8或至少6.9、7.2、7.3、12.8、16.0、25.8、15.2和25.1或至少6.9、7.2、7.3、12.8、16.0、25.8、15.2、25.1和23.7或至少6.9、7.2、7.3、12.8、16.0、25.8、15.2、25.1、23.7、9.9、5.7和11.5，各以2Ɵ值±0.2°表示。
在另外的具體實例中，式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：12.8、20.5和25.8或至少6.9、7.2和7.3或至少6.9、7.2、7.3、12.8、20.5、25.8、15.2和25.1或至少6.9、7.2、7.3、12.8、20.5、25.8、15.2 、25.1和23.7或至少6.9、7.2、7.3、12.8、20.5、25.8、15.2、25.1、23.7、9.9、5.7和11.5，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：5.7、6.9、7.2、7.3、9.9、10.4、10.6、11.1、11.5、12.0、12.3、12.4、12.8、13.7、14.1、14.3、15.2、15.6、16.0、16.9、17.2、17.5、17.7、18.0、18.4、18.8、19.2、19.9、20.2、20.5、20.7、21.3、21.9、22.2、22.5、23.0、23.4、23.7、24.1、25.1、25.8、26.0、26.4、28.9、29.2、29.4、30.6、31.1、32.2、35.3，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係不展現至少下列反射：3.1和9.3，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係不展現至少下列反射：6.1和8.5，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係不展現至少下列反射：8.5及/或30，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係不展現至少下列反射：7.9及/或31.6，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係不展現至少下列反射：7.6，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係不展現至少下列反射：14.8，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：12.8和29.2或至少6.9、7.2和7.3或至少6.9、7.2、7.3、12.8和29.2或至少6.9、7.2、7.3、12.8、 29.2、23.0和15.2，或至少下列反射：6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8和25.1或至少下列反射：6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7和23.7 、或至少下列反射：6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7、23.7、9.9、5.7和11.5及同時不展現至少下列反射：6.1和8.5，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：12.8、16.0和25.8或至少6.9、7.2和7.3,或至少6.9、7.2、7.3、12.8、16.0和25.8或至少6.9、7.2、7.3、12.8、16.0、25.8、15.2和25.1或至少6.9、7.2、7.3、12.8、16.0、25.8、15.2、 25.1和23.7或至少6.9、7.2、7.3、12.8、16.0、25.8、15.2、 25.1、 23.7、9.9、5.7和11.5及同時不展現至少下列反射：6.1和8.5，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-I)的單水合物I另外地可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：12.8、20.5和25.8或至少6.9、7.2和7.3或至少6.9、7.2、7.3、12.8、20.5、25.8、15.2和25.1或至少6.9、7.2、7.3、12.8、20.5、25.8、15.2、25.1和23.7或至少6.9、7.2、7.3、12.8、20.5、25.8、15.2、25.1、23.7、9.9、5.7和11.5及同時不展現至少下列反射：6.1和8.5，各以2Ɵ值±0.2°表示。
多晶型單水合物I的式(I)化合物亦可藉由如圖6所示之X光粉繞射圖明確地定性式(I)化合物。
式(I)化合物之假多晶形式形式，式(I-M-I)的單水合物I可藉由拉曼光譜定性，其至少在下列展現最大頻帶：3073、2950、2937、1685、1616、1527、1293、1278、1259 cm-1。
式(I)化合物之假多晶形式單水合物I可藉由IR光譜定性，其至少在下列展現最大頻帶：2933、1595、1375、1327、1272、1242、1167、1110cm-1。 具體實例7(式(I-M-I)之單水合物I)
本發明係提供式(I)化合物之式(I-M-I)的晶體形式單水合物I， (I-M-I)， 其特徵在於該化合物的X光繞射圖(在25°C和以Cu-K α1作為放射源)顯示至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：12.8和29.2。
本發明進一步係提供根據具體實例7之式(I-M-I)單水合物I晶體形式的式(I)化合物，其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25℃及以Cu-Kα1為放射源)係展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：6.9、7.2和7.3。
本發明進一步係提供根據具體實例7之式(I-M-I)單水合物I晶體形式的式(I)化合物，其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25℃及以Cu-Kα1為放射源)係展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0和15.2。
本發明進一步係提供根據具體實例7及上文一或多個另外具體實例之式(I-M-I)單水合物I晶體形式的式(I)化合物， 其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25℃及以Cu-Kα1為放射源)展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7和23.7。
本發明進一步係提供根據具體實例7及上文一或多個另外具體實例之式(I)化合物的式(I-M-I)單水合物I晶體形式， 其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25℃及以Cu-Kα1為放射源)展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：6.9、7.2和7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7、23.7、9.9、5.7及11.5。
另一種選擇本發明進一步係提供式(I)化合物之式(I-M-I)單水合物I的晶體形式， (I-M-I)， 其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25℃及以Cu-Kα1為放射源)展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：12.8、16.0和25.8。
本發明進一步係提供根據具體實例7之式(I)化合物的式(I-M-I)單水合物I晶體形式，其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25℃及以Cu-Kα1為放射源)展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：12.8、16.0、25.8、6.9、7.2和7.3。
本發明進一步係提供根據具體實例7之式(I-M-I)單水合物I晶體形式的式(I)化合物，其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25℃及以Cu-Kα1為放射源)展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：6.9、7.2和7.3、12.8、29.2、23.0及15.2。
本發明進一步係提供根據具體實例7及上文一或多個另外的具體實例之式(I)化合物的式(I-M-I)晶體形式單水合物I， 其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25℃及以Cu-Kα1為放射源)展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：6.9、7.2、7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8和25.1。
本發明進一步係提供根據具體實例7及上文一或多個另外的具體實例之式(I)化合物的式(I-M-I)晶體形式單水合物I， 其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25℃及以Cu-Kα1為放射源)展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：6.9、7.2和7.3、12.8、29.2、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7、23.7、9.9、5.7及11.5。
本發明進一步係提供式(I)化合物之式(I-M-I)的晶體形式單水合物I， (I-M-I)， 其特徵在於該化合物的IR光譜係在2933、1595、1375、1327、1272、1242、1167、1110 cm-1cm-1展現最大頻帶。
本發明進一步係提供式(I)化合物之式(I-M-I)的晶體形式單水合物I， (I-M-I)， 其特徵在於該化合物的拉曼光譜係在3073、2950、2937、1685、1616、1527、1293、1278、1259 cm-1展現最大頻帶。
可藉由X-光粉末繞射、差示掃描量熱法(DSC)、IR-和拉曼-光譜法區分其他不同形式的式(I)化合物。
除了單水合物I之外，亦鑑別出其他假多晶形式單水合物II、半水合物、1,25-水合物、倍半水合物以及二水合物(參見實例6，圖2至29)，其進一步特徵係如下。
(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之假多晶形式單水合物II、半水合物、1,25-水合物、倍半水合物以及二水合物可以各別的繞射圖為基準藉由X光粉末繞射加以定性，這些繞射圖係於25°C和以Cu-Kα1放射(1.5406 Å)所記錄。假多晶形式單水合物 II、半水合物、1,25-水合物、倍半水合物以及二水合物展現至少3個，通常至少5個，特別是至少7個，更特別是至少10個，及尤其是下列引用數值的全部反射：
式(I)化合物之假多晶形式單水合物II可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：6.1和8.5，以及至少6.1、8.5、12.7、23.9和13.9，較佳地至少下列反射：6.1、8.5、12.7、23.9、13.9、23.0和12.2，更佳地至少下列反射：6.1、8.5、12.7、23.9、13.9、23.0、12.2、10.8和15.3，及最佳地至少下列反射：6.1、8.5、12.7、23.9、13.9、23.0、12.2、10.8、15.3、17.3、21.7和22，以及最佳地至少下列反射：6.1、8.5、12.7、23.9、13.9、23.0、12.2、10.8、15.3、17.3、21.7和22，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：5.7、6.1、7.1、8.5、9.9、10.2、10.8、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.7、13.0、13.9、14.2、15.2、15.3、15.7、16.4、17.3、17.7、17.9、18.3、18.5、18.8、19.2、19.8、20.2、20.8、21.1、21.7、22.0、22.4、22.8、23.1、23.4、23.9、24.2、24.4、25.1、25.5、25.7、26.2、26.4、26.8、27.2、27.5、28.9、30.0、30.1、30.6、32.2、32.4，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：3.1和9.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：6.9、7.2和7.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：29.2，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
T式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.9及/或31.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：14.8，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其係展現至少下列反射：6.1和8.5，以及至少6.1、8.5、12.8、23.0和15.2，較佳地至少下列反射：6.1、8.5、12.8、23.0、15.2、25.8和25.1，更佳地至少下列反射：6.1、8.5、12.8、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7和23.7，最佳地至少下列反射：6.1、8.5、12.8、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7、23.7、9.9、5.7和11.5，亦最佳地至少下列反射：12.8、23.0、15.2、25.8、25.1、17.7、23.7、9.9、5.7、6.1、8.5和11.5且同時不展現至少下列反射：6.9、7.2和7.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
假多晶形式單水合物II之式(I)化合物亦可藉由如圖7中所示之X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性。
式(I)化合物之假多晶形式單水合物I亦可藉由拉曼光譜加以定性，其係展現至少下列最大譜帶：3073、2950、2936、1685、1615、1526、1294、1279、1259 cm-1。
式(I)化合物之假多晶形式單水合物I亦可藉由IR光譜加以定性，其係展現至少下列最大譜帶：2934、1595、1375、1327、1272、1242、1167、1110 cm-1。 具體實例8(式(I-M-II)之單水合物II)
本發明進一步係提供式(I)化合物之式(I-M-II)的晶體形式單水合物II (I-M-II)， 其特徵在於該化合物的X光繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)係展現至少下列反射，以2Ɵ值± 0.2°表示：6.1和8.1，較佳地6.1、8.1、12.7、23.9和13.9，較佳地至少下列反射：6.1、8.1、12.7、23.9、13.9、23.1和12.2，更佳地至少下列反射：6.1、8.1、12.7、23.9、13.9、23.1、12.2、10.8和15.3，最佳地至少下列反射：6.1、8.1、12.7、23.9、13.9、23.1、12.2、10.8、15.3、17.3、21.7和22.0。
式(I)化合物之假多晶形式單水合物II亦可藉由如圖7中所示之X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：3.1和9.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：6.9、7.2和7.3，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：29.2，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.9及/或31.6，各以2Ɵ值±0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式，式(I-M-II)之單水合物II另外可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：14.8，各以2Ɵ值± 0.2°表示。 具體實例9(式(I)化合物之半水合物)
式(I)化合物之假多晶形式半水合物可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性，其係展現至少下列反射：3.1、5.3、6.7、7.1、9.3、10.6、 12.4、14.3、16.1、19.7、20.8、24.0、31.1，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式半水合物可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性，其係展現至少下列反射：3.1、5.3、6.7、7.1、9.3和31.1，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
假多晶形式半水合物之式(I)化合物亦可藉由如圖5中所示之X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性。
式(I)化合物之假多晶形式半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：6.9、7.2和7.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：29.2，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：8.5及/或30.0，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.9及/或31.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：14.8，各以2Ɵ值± 0.2°表示。 具體實例10(式(I)化合物之1.25水合物)
式(I)化合物之假多晶形式1,25水合物可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性，其係展現下列反射：5.9、6.1、7.9、10.5、 11.9、12.2、12.5、13.2、13.6、13.7、14.4、15.2、15.3、15.4、15.7、15.9、16.5、16.9、17.2、17.4、17.6、17.8、18.3、18.6、18.7、19.0、19.5、19.6、19.8、20.5、20.7、21.0、21.4、22.0、23.2、23.8、24.0、24.4、24.6、25.0、25.2、25.6、26.1、26.8、27.4、27.6、28.4、28.8、30.2、30.7、31.1、31.6、32.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式1,25水合物可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性，其係展現至少下列，反射：7.9、10.5、12.2、12.5、13.6、15.2、16.9、19.0、24.0、24.4、24.6、31.6各以2Ɵ值± 0.2°表示。
假多晶形式1,25水合物之式(I)化合物亦可藉由如圖8中所示之X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性。
式(I)化合物之假多晶形式1,25水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：3.1和9.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式1,25水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：6.9、7.2和7.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式1,25水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：29.2，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式1,25水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：8.5及/或30.0，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式1,25水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.9及/或31.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式1,25水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式1,25水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：14.8，各以2Ɵ值± 0.2°表示。 具體實例11(式(I)化合物之倍半水合物)
式(I)化合物之假多晶形式倍半水合物可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性，其係展現至少下列反射：12.2、25.1和14.5，較佳地至少12.2、25.1、14.5、18.7和26.4較佳地至少下列反射：12.2、25.1、14.5、18.7、26.4、18.3和23.4，更佳地至少下列反射：最佳地至少下列反射：12.2、25.1、14.5、18.7、26.4、18.3、23.4、21.5、8.6和5.1及7.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式倍半水合物可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性，其係展現至少下列反射：5.1、7.6、8.6、12.2、14.5、18.3、18.7、21.5、23.4、24.7、25.1、26.4，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式倍半水合物可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性，其係展現至少下列反射：5.1、6.3、7.6、8.6、11.4、12.2、12.5、12.9、13.3、14.3、14.5、15.2、15.5、15.8、16.2、16.4、16. 7、17.3、17.5、17.7、18.3、18.7、19.4、20.5、20.7、20.8、21.4、21.5、21.8、22.4、22.9、23.4、24.0、24.7、25.1、26.1、26.4、27.0、27.4、28.5、32.2、36.5，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
假多晶形式倍半水合物之式(I)化合物亦可藉由如中圖9所示之X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性。
式(I)化合物之假多晶形式倍半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：下列反射：3.1和9.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式倍半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：6.9、7.2和7.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式倍半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：29.2，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式倍半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：8.5及/或30.0，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式倍半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.9及/或31.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式倍半水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：14.8，各以2Ɵ值± 0.2°表示。 具體實例12(式(I)化合物之二水合物)
式(I)化合物之假多晶形式二水合物可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性，其係展現至少下列反射：10.1、10.5、11.2、12.5、13.6、14.8、15.5、20.2、20.5、21.1、22.2、23.2、25.1、29.6各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式二水合物可藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性，其係展現至少下列反射：6.1、6.8、10.1、10.5、11.2、11.3、12.3、12.5、13.1、13.6、14.6、14.8、15.5、16.2、16.4、16.8、17.1、17.3、17.9、18.5、18.8、19.5、20.2、20.5、21.1、21.4、22.2、23.2、24.3、25.1、25.4、25.6、26.3、26.9、27.4、28.5、28.7、29.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
假多晶形式二水合物之式(I)化合物可藉由如中圖10所示之X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)明確定性。
式(I)化合物之假多晶形式二水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：3.1和9.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式二水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：6.9、7.2和7.3，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式二水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：29.2，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式二水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：8.5及/或30.0，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式二水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.9及/或31.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。
式(I)化合物之假多晶形式二水合物可另外藉由X-光粉末繞射圖(在25°C和以Cu-Kα1作為放射源)加以定性，其不展現至少下列反射：7.6，各以2Ɵ值± 0.2°表示。 治療方法：
根據本發明式(I)化合物之晶體形式，較佳地單水合物I(I-M-I)或單水合物II(I-M-II)，更佳地單水合物I(I-M-I)具有有用的藥理學性質並可用於防止和治療人類和動物的疾病。根據本發明之式(I)化合物形式可開闢另外的治療選項且因此可增豐藥劑調配。
在本發明的內文中，術語「治療」係包括抑制、延緩、阻止、改善、減弱、限制、減少、抑制、逆轉或治癒疾病、症狀、病症、損傷或健康損害、此等狀態的發展、過程或進展及/或此等狀態之症候。本處，請理解術語「治療法」係與術語「治療」為同義的。
在本發明的內文中，術語「防止」、「預防」或「預防措施」係作為同義詞使用且係指避免或降低得到、感染、遭受或患有一疾病、症狀、病症、損傷或健康損害、此等狀態之發展或進展及/或此等狀態之症候的風險。
疾病、症狀、病症、損傷或健康損害之治療或防止可為部分或完全發生。
在本發明內文中，術語「治療功效」係定義為藉由施予包括一治療上有效量之式(I)化合物，尤其是比較實例11之式(I)化合物或鹽、溶劑化物或多晶型或式(I)化合物之鹽的溶劑化物或結晶變體或式(I)化合物的代謝物，尤其是其假多晶形式，例如 (I-M-I)和(I-M-II)的醫藥乾粉調配物，降低病患的平均肺動脈壓，同時臨床上沒有相關的全身血壓改變。
在本發明內文中，術語「肺血管阻力(PVR)」係定義為參數1)將肺動脈高壓的嚴重度以主要肺血管中的壁張力加以定性，藉由侵入性方法測量肺動脈血壓加以分析，及2)藉由實質上降低與肺動脈血壓直接相關的此參數來評估新藥的效用(參見D. Singh, R. Tal-Singer, I. Faiferman, S. Lasenby, A. Henderson, D. Wessels, A. Goosen, N. Dallow, R. Vessey & M. Goldman, Plethysmography and impulse oscillometry assessment of tiotropium and ipratropium bromide; a randomized, double-blind, placebo-controlled, cross-over study .in healthy subjects, Br. Journal Clin Pharmacol, 2006, 61, 398-404)。
在本發明的內文中，6分鐘行走測試結果之改善係定義為病患能在6分鐘的時間窗內行走之距離上的改善，其係對應患有嚴重疾病正在治療中之病患體能的增加。
在本發明內文中「NYHA類別」的轉變係定義為NYHA分類之類別編號從較高類別改善至較低類別編號，其係對應具有更佳的心臟性能之改善的心功能。
肺的生理功能係在標準化條件下以肺功能測試如肺活量或身體體積描記法進行評估，得到標準化和有效的參數測量，例如1秒內用力呼氣容積(FEV1)可直接評估如支氣管擴張劑之藥物效應，一種在治療上使用不同藥物對於改善患有支氣管收縮如COPD或氣喘之肺疾病的肺功能效用。
在本發明的內文中術語「改善的血液動力學效應」係定義為藥物的血管舒張作用以降低肺動脈壓、改善肺通氣區域之血液循環以及改善肺功能而無全身性副作用且從而造成個體病患體能和整體狀況之臨床上相關改善。
在本發明內文中術語「肺內選擇性」係指吸入的活性成份僅在肺的通氣區域而不是在非通氣區域展現其血管舒張之藥效動力學性質的特性。其係為了防止通氣和灌注之間不匹配的惡化(藉由增加不通氣區域之灌注)，若活性成份亦到達不通氣區域，則可能發生該情況。肺內選擇性係藉由尤其是藉由病患主動吸入所進行之施予途徑來確保。
在本發明內文中術語「支氣管擴張效應」係定義為參數的改善，例如卡巴膽鹼(carbachol)預收縮天竺鼠氣管之鬆弛、肺阻力(RL)和動態順應性(Cdyn)、人體特殊氣道阻力(specific airway resistance)(E-2.1)、人體FEV1或其他指出通氣改善的參數。
在本發明內文中術語「長期治療/使用」係定義為病患每天一或二次吸入治療至少連續二天，較佳地至少連續2至7天，較佳地至少連續14天的期間，特別是就整個疾病過程開始治療後，視需要亦與標準照護組合(SoC，例如內皮素拮抗劑，例如波生坦(bosentan)，PDE5抑制劑，例如西地那非(sildenafil)，IP促效劑，例如伊洛美定(Ilomedin)或曲前列尼(treprostinil)、鈣通道阻斷劑、索特西普(sotatercept)和sGC刺激劑，例如利奥西呱(riociguat))。
術語「每天一次」已為熟習本項技術者所熟知且係指每天給藥一次，並包括在短時間內同時或連續投予一劑型以及投予二或多個劑型。
術語「每天一或二次」已為熟習本項技術者所熟知且係指一天給藥一次或一天二次，而在一天中各對應的時間點投予藥物係包括投予一劑型以及在短時間內同時或連續投予二或多個劑型。
術語「連續日」是指一個接一個之後的發生日，而無間隔日，且並不意味著相繼日或循環日。
術語「吸入劑型」係指藥物物質之組合，亦即活性成份，較佳地一晶體形式，例如單水合物I或單水合物II或倍半水合物的形式，較佳地單水合物I或單水合物II的形式，更佳地式(I-M-I)的單水合物I的形式，與醫藥上適合的吸入載劑組合。用於吸入之藥物物質和醫藥上適合的載劑之組合係為乾粉形式。較佳地將乾粉填充在一腔室中，更佳地填充在膠囊中。較佳地，醫藥上適合的載劑為吸入用乳糖。
術語「反射」或「波峰」為同義詞且就有關X光值和繞射圖係具有相同意義。晶體形式最常見係以X光粉末繞射(XRPD)來定性。XRPD反射圖(波峰，典型地以2-θ度表示)通常被認為是特定晶型的指紋。
就本發明之目的，術語「呼吸器官」(或呼吸系統)係指氣道-包括鼻、口腔和咽、喉、氣管、支氣管以及肺-為功能器官系統。
與心肺病症相關聯的術語「局部給藥」或「局部控制」就本發明之目的係指-相對於旨在經由胃腸道吸收之口服給藥劑型，及相對於靜脈內給藥，(二者係經由血流造成全身藥物分佈)-係藉由吸入以可吸入劑型投予活性成份，用以主要覆蓋肺部作為目標器官，其需要較低的劑量並造成較低的一般藥物暴露。根據本發明所使用的粉末形式之製劑或含粉末的懸浮劑為吸入的製劑。
術語「吸入」或「藉由吸入給藥」就此係指導入到呼吸器官，尤其是進入及/或經由氣道，較佳地進入及/或經由鼻腔或口腔，特佳地經由口腔以達到活性成份沉積到作為作用部位的支氣管和肺。
就本發明之目的，術語「氣管內」或「氣管內給藥」係指將化合物導入氣管而非藉由吸入，特別是用於實驗動物如大鼠或小豬和狗作為給藥模型之肺部疾病控制(例如經由PennCentury裝置之氣管內施用，適用於乾粉以及藥物溶液和懸浮液)。
根據本發明之化合物，如式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)為有效的可溶性鳥苷酸環化酶活化劑。其導致血管舒張、抑制血小板聚集和降低血壓，以及增加冠狀動脈血流和微循環。再者，其具有支氣管擴張效用。這些活性係經由直接的可溶性鳥苷酸環化酶之血紅素非依賴性活化和細胞內cGMP量的增加所媒介。
此外，根據本發明之化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)具有進一步有利的藥理學性質，特別是關於在肺內給藥後其肺選擇性作用(與全身作用相反)、其肺滯留時間及/或其作用持續時間(E-1)。
臨床上亦可顯現根據本發明化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)之良好治療功效和目標參與：在吸入施用後，觀察到總特定氣道阻力降低(E-2.1)，血漿cGMP濃度增加作為肺中藥物濃度的替代物(目標參與之指標)(E-2.1，E-2.2)和選擇性降低肺動脈壓和肺血管阻力(E-2.4)。
再者，可顯現用於吸入施用之藥物物質的適合藥物動力學性質。藥物物質之口服、靜脈內和吸入給藥後的血漿濃度分析顯示吸入給藥後的半衰期最長(E-2.3)。人類吸入1000 µg後，發射劑量經測定為720 µg。此項研究的結果證實了就吸入乾粉給藥，沉積的肺劑量和半衰期為足夠的，使每天一次的治療能在肺中供藥物物質足夠的24小時藥物覆蓋(如實例4所示)。
總言之，所有的結果顯示式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)，尤其是式(I-M-I)之單水合物I特別適用於治療肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺動脈高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH-COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)，並且適合吸入乾粉給藥，使每天一次治療能供實例4在肺部足夠的24小時藥物覆蓋。
根據本發明化合物，式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)特別適用於治療及/或防止心血管、心肺和肺病症，較佳地用於心肺病症。
因此，根據本發明化合物，特別是(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)可用於供治療及/或防止心血管和心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺動脈高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH- COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)，以及肺部病症，例如氣喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或肺纖維化之藥物中。
在本發明的內文中，術語「sGC調節劑」係包括能夠調節sGC的二類不同的化合物，sGC刺激劑和sGC活化劑(Sandner P, Becker-Pelster EM, Stasch JP. Discovery and development of sGC stimulators for the treatment of pulmonary hypertension and rare diseases. Nitric Oxide 2018;77：88-95.; Hoenicka M, Becker EM, Apeler H, Sirichoke T, Schröder H, Gerzer R, Stasch JP. Purified soluble guanylyl cyclase expressed in a baculovirus/Sf9 system：stimulation by YC-1, nitric oxide, and carbon monoxide. J Mol Med (Berl) 1999;77：14-23; Evgenov OV, Kohane DS, Bloch KD, Stasch JP, Volpato GP, Bellas E, Evgenov NV, Buys ES, Gnoth MJ, Graveline AR, Liu R, Hess DR, Langer R, Zapol WM. Inhaled agonists of soluble guanylate cyclase induce selective pulmonary vasodilation. Am J Respir Crit Care Med 2007;176：1138-1145)。這二類化合物係直接與sGC結合作為變構調節劑。sGC刺激劑具有雙重作用模式，可獨立於NO之外，直接刺激天然sGC，並藉由穩定NO-sGC結合使sGC對低量的NO敏感。相比之下，sGC活化劑與未被佔用的血紅素結合結構域相結合，從而模擬NO-結合的血紅素，並活化病理上經改變、對NO無反應的apo-sGC。最近的證據已顯示，與許多心肺疾病相關的氧化壓力將細胞內天然sGC量轉變為apo-sGC形式(Evgenov OV, Pacher P, Schmidt PM, Hasko G, Schmidt HH, Stasch JP. NO-independent stimulators and activators of soluble guanylate cyclase：discovery and therapeutic potential. Nat Rev Drug Discov 2006;5：755-768; Münzel T, Genth-Zotz S, Hink U. Targeting heme-oxidized soluble guanylate cyclase：solution for all cardiorenal problems in heart failure? Hypertension 2007;49：974-976)，其在各種心血管病理生理學症狀例如PH，提供sGC活化劑的理論基礎(Wood KC, Durgin BG, Schmidt HM, Hahn SA, Baust JJ, Bachman T, Vitturi DA, Ghosh S, Ofori-Acquah SF, Mora AL, Gladwin MT, Straub AC. Smooth muscle cytochrome b5 reductase 3 deficiency accelerates pulmonary hypertension development in sickle cell mice. Blood Adv 2019;3：4104-4116.; Rahaman MM, Nguyen AT, Miller MP, Hahn SA, Sparacino-Watkins C, Jobbagy S, Carew NT, Cantu-Medellin N, Wood KC, Baty CJ, Schopfer FJ, Kelley EE, Gladwin MT, Martin E, Straub AC. Cytochrome b5 Reductase 3 Modulates Soluble Guanylate Cyclase Redox State and cGMP Signaling. Circ Res 2017;121：137-148.; Durgin BG, Hahn SA, Schmidt HM, Miller MP, Hafeez N, Mathar I, Freitag D, Sandner P, Straub AC. Loss of smooth muscle CYB5R3 amplifies angiotensin II-induced hypertension by increasing sGC heme oxidation. JCI Insight 2019;4：e129183.; Sandner P, Zimmer DP, Milne GT, Follmann M, Hobbs A, Stasch JP. Soluble guanylate cyclase stimulators and activators. Handb Exp Pharmacol 2019;doi：10.1007/164_2018_197)。
在本發明內文中，術語「肺高壓」包括其原發性和繼發性亞型，如下文根據其各別病因學以Dana Point/Nizza分類所定義[參見D. Montana and G. Simonneau, in：A.J. Peacock et al. (Eds.), Pulmonary Circulation. Diseases and their treatment, 3rd edition, Hodder Arnold Publ., 2011, pp. 197-206; M.M. Hoeper et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2009, 54 (1), S85-S96] updated Nizza classification Gérald Simonneau, David Montani, David S. Celermajer, Christopher P. Denton, Michael A. Gatzoulis, Michael Krowka, Paul G. Williams, Rogerio Souza：Haemodynamic definitions and updated clinical classification of pulmonary hypertension, in：European Respiratory Journal, 2018; DOI：10.1183/13993003.01913-2018]。這些包括特別是第1類組肺動脈高壓(PAH)，其中包括特發性和家族性形式(分別為IPAH和FPAH)。再者，PAH亦包括新生兒持續性肺高壓和與膠原病相關的肺高壓(APAH)、先天性全身性肺分流病灶、門脈高壓、HIV感染、特定藥物和醫藥品(例如食慾抑制劑)之攝入，以及具有顯著靜脈/微血管組份的病症，例如肺靜脈閉塞性病症和肺微血管瘤，或伴隨其他病症，如甲狀腺病症、肝糖儲積症、高雪氏症(Gaucher disease)、遺傳性微血管擴張症、血紅蛋白病變、骨髓增生性病症和脾切除。第2類組包括具有誘因性左心病症的PH患者，例如心室、心房或瓣膜病症。第3類組包括與肺部病症相關的肺高壓形式，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、間質性肺疾病(ILD)、肺纖維化(IPF)及/或低氧血症(例如，睡眠呼吸暫停症候群、肺泡通氣不足、慢性高原病、遺傳性畸形)。第4類組包括具有慢性血栓性及/或栓塞性疾病的PH病患，例如近端及/或遠端肺動脈血栓栓塞性阻塞(CTEPH)或非血栓性栓塞(例如，由於腫瘤病症、寄生蟲、外來體所致)。較不常見的肺高壓形式，例如患有結節病、組織細胞增生症X或淋巴管瘤的病患則歸納於第5類組中。
根據本發明化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)亦適用於治療及/或防止肺部病症，例如氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纖維化。
在本發明內文中，術語「氣喘」係包括肺氣道之異質性慢性發炎疾病。其特徵為多變和反復出現的症候，從可逆性氣流阻塞(通常由支氣管的過度反應引起)到支氣管痙攣。症狀包括喘息、咳嗽、胸悶和呼吸急促之情況。這些可能一天發生幾次或每週發生幾次。因人而異，氣喘症狀可能在夜間或運動時加重。氣喘被認為是由遺傳和環境因素所共同引起。環境因素包括暴露於空氣污染和過敏原。其他潛在的觸發因素包括藥物，例如阿斯匹靈和β阻斷劑。診斷通常係以症狀模式、隨時間對治療的反應以及肺活量測定肺功能檢測。氣喘係根據症狀的頻率、一秒內用力呼氣容積(FEV1)和高峰呼氣流速加以分類。其亦可分為特應性或非特應性，其中特應性係指發生第1型過敏反應之傾向。目前尚無已知的氣喘治愈方法，但可完善的進行系統性治療。可藉由避開觸發因素，例如過敏原和呼吸道刺激物來防止症狀，並使用吸入的皮質類固醇來抑制。若氣喘症候仍未得到控制，除了吸入皮質類固醇外，亦可使用長效β促效劑(LABA)和其他物質，例如抗白三烯藥劑。急性惡化症候的治療通常係以吸入的短效β-2促效劑，例如沙丁胺醇(salbutamol)和皮質類固醇來進行。在嚴重的情況下，可能需要全身性皮質類固醇、硫酸鎂和住院。一部分的氣喘患者會發展為嚴重疾病，其病因涉及氣道發炎以及尚不明確的內在驅動因素。就解決此項，吾等研究了人類氣道平滑肌細胞(HASMC)，其鬆弛驅動氣道支氣管擴張，且其功能障礙導致了嚴重氣喘中的氣道阻塞和過敏反應。因為HASMC鬆弛可由NO-可溶性鳥苷酸環化酶(sGC)-cGMP訊號傳遞路徑所驅動，所以來自嚴重氣喘供體之HASMC可能在其sGC或支持sGC功能的氧化還原酶中具有內在缺陷。大多數嚴重氣喘供體HASMC(12/17)和肺樣本主要表現功能失調的sGC，其對NO無反應且異二聚體含量低和高Hsp90關聯性。此sGC表型與支持性氧化還原酶細胞色素b5還原酶、觸酶(catalase)和硫氧還蛋白-1(thioredoxin-1)的較低表現量以及血紅素氧化酶1和2的較高表現相關，其暗示了嚴重氣喘患者由於內在的sGC功能障礙，而在其氣道平滑肌中具有缺陷的NO-sGC-cGMP訊號傳遞傾向之假設，其轉而又與影響sGC成熟和功能的細胞氧化還原酶的內在變化有關。因此，sGC活化劑可為這些病患在這些病理生理條件下最適化支氣管擴張之新目標選項(參見，例如下列參考文獻：Arnab Ghosh, Cynthia J. Koziol-White, William F. Jester Jr., Serpil C. Erzurum, Kewal Asosingh, Reynold A. Panettieri Jr.see, Dennis J. Stuehr：An inherent dysfunction in soluble guanylyl cyclase is present in the airway of severe asthmatics and is associated with aberrant redox enzyme expression and compromised NO-cGMP signaling in Redox Biology 39 (2021) 101832; Maggie Lam,Jane E. Bourke, Ph.D., A New Pathway to Airway Relaxation：Targeting the “Other” Cyclase in Asthma American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology Volume 62 Number 1 | January 2020; Cynthia J. Koziol-White, Arnab Ghosh, Peter Sandner, Serpil E. Erzurum, Dennis J. Stuehr, and Reynold A. Panettieri, Jr.：Soluble Guanylate Cyclase Agonists Induce Bronchodilation in Human Small Airways, Am J Respir Cell Mol Biol Vol 62, Iss 1, pp 43–48, Jan 2020.)。
憑藉其活性樣貌，根據本發明化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)特別適用於治療及/或防止心血管和心肺病症，例如原發性和續發性肺高壓。
本發明再者係提供使用根據本發明化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)供治療及/或防止病症，特別是心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH- COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。
本發明再者係提供使用根據本發明化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)供製備用於治療及/或防止病症，特別是心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH-COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)之醫藥品。
本發明再者係提供包括至少一種根據本發明化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)之醫藥品供用於治療及/或防止病症，特別是心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH-COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。
本發明再者係提供使用根據本發明化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)供用於治療及/或防止病症，特別是心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH- COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)之方法中。
本發明再者係提供用於治療及/或防止病症，特別是心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH-COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎 (PH-IIP)之方法，包括每日一次或二次投予式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸，特別是比較實例11以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)歷時一段等於或多於2天，較佳地至少連續2至7天，較佳地歷時一段至少連續14天，特別是以吸入劑型從整個疾病過程之治療開始後，例如以乾粉調配劑形式之乾粉吸入器給予有此需要的病患，其中當以吸入投予有此需要的病患者時，該sGC活化劑具有持續24小時的功效。
本發明進一步係關於式I之sGC活化劑吸入劑型的用途，特別是比較實例11，式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)供製造用於治療心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH-COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)之醫藥品IIP)，每日一次或二次投予歷時一段等於或多於2天，較佳地至少連續2至7天，較佳地歷時一段至少連續14天，特別是整個疾病過程之治療開始後，其中當吸入投予有此需要的病患者時，該活化劑具有持續24小時的效力。
本發明進一步係關於一種包裝的醫藥組成物，其係包括一含有乾粉吸入器及一包括式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)之醫藥調配物的容器，該容器再者含有使用該乾粉之說明，例如在深吸一口氣後，該等對象必須屏住呼吸約2秒，以便乾粉藥物從氣流中凝結到更深的肺部區域表面，並沉積在靠近其預期藥理作用部位處，用以治療心肺病症，較佳地肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH-COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。
在一較佳的具體實例本發明進一步係關於一種包裝的醫藥組成物，其係包括一含有乾粉吸入器及包括式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)之醫藥調配物的容器，該包裝的醫藥組成物，包括一含有乾粉之容器，而該乾粉係包括(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，該容器進一步含有用於每日一次或二次之頻率投予該乾粉之說明，用以治療心肺病症，較佳地肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH- COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)，再者肺病症。
本發明進一步係關於含有至少一根據本發明化合物，通常與一種或多種惰性、無毒、醫藥上適合的賦形劑一起的藥物，及其用於上述目的之用途。
根據本發明化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)可單獨使用或若需要與其他的活性化合物組合使用。本發明進一步係關於含有至少一種根據本發明化合物，特別是式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫-喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)及一或多種另外的活性化合物之醫藥品，特別適用於治療及/或預防前述疾病。作為適合的組合活性化合物，可提及的例如及較佳地有： •有機硝酸鹽和NO供體，例如硝普鈉(sodium nitroprusside)、硝酸甘油、單硝酸異山梨酯、二硝酸異山梨酯、嗎多明(molsidomine)或SIN-1，以及吸入性NO •Ca-通道阻斷劑，用於具有正常血管反應性之PAH病患 •抑制環鳥苷單磷酸鹽(cGMP)及/或環腺苷單磷酸鹽(cAMP)降解的化合物，例如磷酸二酯酶(PDE)1、2、3、4及/或5之抑制劑，特別是PDE 3抑制劑如恩西芬太尼(ensifentrine)，PDE 4抑制劑，例如羅氟司特(roflumilast)、他尼司特(tanimilast)或瑞伐司特(revamilast)，以及PDE 5抑制劑，例如西地那非(sildenafil)、伐地那非(vardenafil)、他達拉非(tadalafil)、烏地那非 (udenafil )、達桑他非(dasantafil)、阿伐那非(avanafil)、米羅地那非(mirodenafil)或洛地那非(lodenafil)； •NO-非依賴但血紅素-依賴的鳥苷酸環化酶刺激劑，特別是利奧西呱(riociguat)和描述於WO 00/06568、WO 00/06569、WO 02/42301、WO 03/095451、WO 2011/147809、WO 2012/004258、WO 2012/028647、WO 2012/059549和WO2014/068099中的化合物； •前列腺環素類似物和IP受體促效劑，例如及較佳地伊洛前列腺素(iloprost)、貝拉前列素(beraprost)、曲前列素(treprostinil)、依前列醇(epoprostenol)或NS-304； •內皮素受體拮抗劑，例如及較佳地波生坦(bosentan)、達魯生坦(darusentan)、安立生坦(ambrisentan)或西他生坦(sitaxsentan)； •人類嗜中性顆粒球彈性蛋白酶(HNE)抑制劑，例如及較佳地西維來司他(sivelestat)或DX-890 (Reltran)； •抑制訊息轉遞級聯之化合物，特別是來自酪胺酸激酶抑制劑之群組，例如及較佳地達沙替尼(dasatinib)、尼羅替尼(nilotinib)、伯舒替尼(bosutinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、西地尼布(cediranib)、阿西替尼(axitinib)、特拉替尼(telatinib)、伊馬替尼(imatinib)、布立尼布(brivanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瓦他尼布(vatalanib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、卡紐替尼(canertinib)、來他替尼(lestaurtinib)、培利替尼(pelitinib)、舒馬賽尼(semaxanib)、馬西替尼(masitinib)或坦度替尼(tandutinib)； •作為配體陷阱之化合物，對TGF-β超家族中的多種蛋白質具有高選擇性，包括活化素(activin)、GDF和其他據信具有阻斷TGF-β超家族訊號傳遞路徑的能力，及藉此可提升第II型骨形態發生蛋白受體(BMPR-II)訊號傳遞之再平衡，及潛在地，恢復血管穩態如索特西普(sotatercept) •Rho激酶抑制劑，例如及較佳地法舒地爾(fasudil)、Y‑27632、SLx-2119、BF-66851、BF-66852、BF-66853、KI-23095或BA-1049； •抗阻塞劑，例如用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)或支氣管氣喘，例如及較佳地吸入或全身性給藥的β-受體模擬物(例如沙丁胺醇、沙美特羅(salmeterol))或吸入給藥的抗-毒蕈鹼物質(例如異丙托銨(ipratropium)、噻托銨(tiotropium))； •抗發炎劑及/或免疫抑制劑，例如用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管氣喘或肺纖維化，例如及較佳地全身或吸入給藥的皮質類固醇、呼特福(flutiform)、吡非尼酮(pirfenidone)、乙醯半胱胺酸、硫唑嘌呤(azathioprine)或BIBF-1120、尼達尼布(nintedanib)或曲前列尼(treprostinil)； •用於全身及/或吸入治療肺部病症的活性化合物，例如囊狀纖維化(α-1-抗胰蛋白酶、氨曲南(aztreonam)、iva-caftor、魯瑪卡托(lumacaftor)、阿塔魯倫(ataluren)、阿米卡星(amikacin)、左氧氟沙星(levofloxacin))、慢性阻塞性肺病(COPD)(噻托溴銨(Tiotropium)、LABA/LAMA、LAS40464、PT003、SUN-101)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)和急性肺損傷(ALI)(干擾素-β-1a、創傷因子、PEG-腎上腺髓質素、吸入sGC調節劑，例如BAY1211163)，阻塞性睡眠呼吸暫停(VI-0521、TASK通道阻斷劑和ADRA2C拮抗劑)、支氣管擴張(甘露醇、環丙沙星(ciprofloxacin))、閉塞性細支氣管炎(環孢菌素(cyclosporine)、氨曲南)； •抗血栓形成劑，例如及較佳地來自血小板聚集抑制劑、抗凝血劑或促纖維蛋白溶解物質之群。
抗血栓劑較佳地應了解為來自血小板聚集抑制劑、抗凝血劑或促纖維蛋白溶解物質之群組的化合物。
在一本發明之較佳具體實例中，根據本發明之化合物係與血小板聚集抑制劑組合給藥，例如及較佳地阿斯匹靈(aspirin)、氯吡格雷(clopidogrel)、噻氯匹啶(ticlopidine)或雙嘧達莫(dipyridamole)。
在一本發明之較佳具體實例中，根據本發明之化合物係與凝血酶原抑制劑組合給藥，例如及較佳地希美加群(ximelagatran)、美拉加群(melagatran)、達比加群(dabigatran)、比伐盧定(bivalirudin)或克立生(Clexane)。
在一本發明之較佳具體實例中，根據本發明之化合物係與GPIIb/IIIa拮抗劑組合給藥，例如及較佳地替羅非班(tirofiban)或阿昔單抗(abciximab)。
在一本發明之較佳具體實例中，根據本發明之化合物係與Xa因子抑制劑組合給藥，例如及較佳地利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)、非地沙班(fidexaban)、雷沙班(razaxaban)、磺達肝素(fondaparinux)、依達肝素(idraparinux)、DU-176b、PMD-3112、YM-150、KFA-1982，EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX 9065a、DPC 906、JTV 803、SSR-126512或SSR-128428。
在一本發明之較佳具體實例中，根據本發明之化合物係與肝素或低分子量(LMW)肝素衍生物組合給藥。
在一本發明之較佳具體實例中，根據本發明之化合物係與維生素K拮抗劑組合給藥，例如及較佳地香豆素(coumarin)。
用於降低肺部血壓之藥劑較佳地應了解為來自鈣拮抗劑、PDE5抑制劑、sGC刺激劑和活化劑、前列腺環素類似物和IP1受體促進劑以及內皮素受體拮抗劑之群的化合物。
在一本發明之較佳具體實例中，根據本發明之化合物係與鈣拮抗劑組合給藥，例如及較佳地硝苯地平(nifedipine)、氨氯地平(amlodipine)、維拉帕米(verapamil)或地爾硫卓(diltiazem)。
在一本發明之較佳具體實例中，根據本發明之化合物係與內皮素受體拮抗劑組合給藥，例如及較佳地波生坦(bosentan)、達盧生坦(darusentan)、安立生坦(ambrisentan)或西他生坦(sitaxsentan)。
用於吸入之調配物
本發明進一步係關於含有至少一種根據本發明式(I)化合物之晶體形式，較佳地式(I-M-I)之單水合物I或式(I-M-II)之單水合物II，特佳地式(I-M-I)之單水合物I通常與一或多種惰性、無毒、醫藥上適合的賦形劑一起的醫藥品，及其用於前述目的之用途。
一較佳的本發明之具體實例為主要包括式(I)化合物之單水合物I且無顯著分量之式(I)化合物的另外形式及視需要另外醫藥上可接受之賦形劑的醫藥組成物。更佳地，該醫藥組成物，相對於存在組成物中之所有式(I)化合物形式的總量，係含有以重量計大於85%，更佳地以重量計大於90%，最佳地以重量計大於95%之式(I)化合物的單水合物I。 活性成份
根據本發明之用於乾粉吸入的固體製劑係在一適合的吸入等級載劑之基質中含有一特定量的活性成份(亦即式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，較佳地(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)單水合物I形式)或(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)單水合物II形式)，特佳的(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)單水合物I形式)作為活性化合物，其不超過約20%。通常活性成份的量係介於0.5%和20%之間，較佳地介於0.75%和10%之間。其內之活性成份的量係以可供使用的製劑為基準，以重量計通常為至少0.75%，或至少3%，或至少5%或至少10%。非常佳的活性成份的量為3%、10%或20%。
根據本發明之用於乾粉吸入的固體製劑係含有特定粒徑、適用於吸入施予的活性成份(亦即式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，較佳地(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)單水合物I形式)或(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)單水合物II形式)，特佳的(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)單水合物I形式)。
就根據本發明之活性成份((5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，較佳地(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)單水合物I形式)或(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)單水合物II形式)，特佳的(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)單水合物I形式)的粒徑分布，係如下表所定義。 表1：活性成份，例如式(I-M-I)或(I-M-II)之化合物的粒徑分布
上部粒徑X90 最大6 µm
平均粒徑X50 1-3 µm
下部粒徑X10 最大1 µm
就吸入性藥物產品，重要的是保證具有限定粒徑＜5 μm的均質藥物物質，用以確保遞送至深肺部隔室。此技術要求可藉由藥物物質顆粒之微粉化來進行(參見實驗部分B，實例8)。
就達到此要求所設定之活性成份粒徑分佈的適當規範係如表1所述。
因此，為了確保適合遞送活性物質於目標位點，尤其是深層氣道和肺泡，發明者們發現提供活性成份，X90=6 µm及/或X50 1-3 µm及/或X10最大1 µm粒徑的式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，較佳地(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)單水合物I形式或式(I-M-II)之單水合物II形式)，較佳地式(I-M-I)單水合物I形式為必要的。 乳糖載劑
根據本發明之用於乾粉吸入的固體製劑一般係含有一定量，不超過約99.25%之適合該活性化合物的載劑。通常吸入等級載劑的量係介於99.25%和80%之間，較佳地介於99.25%和90%之間。其內載劑的量，以乾粉混合物為基準，以重量計通常為至少99.25%，或至少97%，或至少95%或至少90%。
不同的吸入等級載劑之物質基本上為可取得的。
發明者們發現，根據本發明供吸入之調配物優異的氣霧劑性能係藉由選擇乳糖作為載劑物質而達成。
吸入用乳糖有不同的粒徑範圍和不同的特性可供使用。
由於細藥物粒子與粗載劑粒子活性位點之相當強力的結合，預期，相較於活性成份，粒徑分佈集中在較高粒徑的粗乳糖載劑可能會導致較差的氣霧劑性能(Paolo Colombo, Daniela Traini and Francesca Buttini "Inhalation Drug Delivery – Techniques and Products" (由Wiley-Blackwell 2013所發表)。高氣霧劑性能其特徵為增加的細粒子劑量和分量以及與標稱劑量相關的輸送劑量。一旦粉末被霧化，藥物與載體的黏附和隨後的分離之間的平衡是預期的，通常亦描述為粉末或藥物分散體。亦可預期，氣霧劑性能行為將隨著添加細載劑顆粒或藉由使用含有乳糖細粉固有部分的乳糖物質而改善，儘管程度無法預測(de Boer et al 2012, Grasmejier et al 2015)。作為一改善藥物分散和從載劑釋放之表現，階式衝擊器之測量為用於細粒子劑量(或者細粒子質量)以及細粒子分量(具有一定義粒徑上限，例如，相對於單劑量單位的遞送劑量或標稱劑量5µm或4.5µm之藥物質量的百分比分數)之既定選擇方法。這些方法亦確立為現行藥典(例如，歐洲藥典(Pharm Eur.)或美國藥典(USP))中用於吸入產品之強制性品質控制方法。
然而，添加細乳糖的潛在影響及其幅度無法預測，因為在乾粉黏合劑混合物內可能有疊加乳糖細粒效應的其他主要影響。非常重要的，微粉化藥物本身的性質可能對特定藥物分子粒子之二元或三元混合物的黏合性質和內聚性質(例如內聚性：黏合平衡(CAB)或表面能)具有影響，其甚至使預測更加困難。
發明者們發現，根據本發明用於吸入之優異氣霧劑性能係藉由選擇細乳糖和粗乳糖作為具有特定粒徑之載劑物質來達成。
根據本發明粗乳糖物為經篩分或研磨、晶體、具有低細粒子含量的α-乳糖單水合物(例如，市售的Lactohale® 100或Lactohale® 206)。
具有相似粒徑分佈之根據本發明粗乳糖亦可選自其他品牌，例如Meggle Inhalac® 120或DFE Respitose® SV010。
就選擇主要的粗載劑，乳糖品質之選擇，其應具有粒徑X90比活性成份之X90大至少10倍以及低的固有細粒含量，以顧及載劑主要部分的穩定品質。
選擇細乳糖用以改善氣霧劑性能。發明者們假設類似活性成份之粒徑可能適合控制活性成份粒子與粗載劑粒子的暫時結合，儘管其他細乳糖粒徑規格可能亦為合適的。因此，選擇具有X90＜10µm或X90＜30µm或X50≤5µm或1.0至3.0µm之粒徑的細乳糖產品被認為足以組成乳糖載劑。
根據本發明之細乳糖物質為經研磨或微粉化、晶體、α-乳糖單水合物，具有X90≤10µm的低粒徑(「乳糖細粉」)(例如，市售的Lactohale®300)或X90＜30µm或X50≤5µm或1.0至3.0µm(例如，市售的Lactohale®230)。亦可選擇具有類似性質和粒徑的細研磨或微粉化乳糖，例如Meggle Inhalac®500。物質和粉末混合物的粒徑分佈通常係藉由雷射繞射光譜、顯微技術或習知的篩分分析和分類來測量[B.Y. Shekunov, P. Chattopadhyay, H.H.Y. Tong and A.H.L. Chow, Particle size analysis in pharmaceutics, Pharm. Res.2007, 24 (2), S203-S227](亦參見D.4)。
根據本發明用於吸入品質之市售乳糖(例如Lactohale® 100、Lactohale® 300)的粒徑分佈係彙整於下表2中。 表 2 ：根據本發明用於吸入之乳糖的粒徑分佈
粗乳糖 細乳糖
商業名稱 Lactohale® 100 Lactohale® 300
上部粒徑X90 200-250µm ≤10µm
平均粒徑X50 125-145µm ≤5µm
下部粒徑X10 45-65µm 未定
商業名稱 Lactohale® 200
上部粒徑X90 120-160µm
平均粒徑X50 50-100µm
下部粒徑X10 5-15µm
商業名稱 Lactohale ®206 Lactohale ®230
上部粒徑X90 115-170µm ＜30µm
平均粒徑X50 75-95µm ＜10µm
下部粒徑X10 20-50µm 1.0–3.0µm
根據本發明之用於乾粉吸入的固體製劑含有粗乳糖之混合物。
發明者們發現，粗乳糖粒徑可在一定範圍內變化，而不會危及以根據本發明調配物為基礎之載劑的氣霧劑性能或混合物均一性。
根據本發明，粗乳糖具有X90=200-250 μm或120-160 μm或115-170 μm，或115-250 μm之粒徑。再者，根據本發明，粗乳糖係具有X90≤250 μm或≤170 μm或≤160 μm之粒徑。再者，根據本發明，粗乳糖係具有至少或≥115 μm或至少或≥120 μm或至少或≥200 μm之X90的粒徑。
根據本發明，粗乳糖係具有X50=125-145 µm或50-100 µm或75-95微米或50-145 µm之粒徑。再者，根據本發明，粗乳糖係具有X50≤145 μm或≤100 μm或≤95 μm的粒度之粒徑。再者，根據本發明，粗乳糖係具有至少或≥50 µm，或至少或≥75 µm，或至少或≥125 µm，或X10=45-65 µm或5-15 μm或20-50 µm之X50的粒徑。
根據本發明，細乳糖係具有X90=≤10 μm或＜30 μm，X50≤5 μm或1.0至3.0 μm之粒徑。藉由使用帶有固有細粒子含量之Lactohale 200®，無需於乳糖載劑中添加任何其他細乳糖粒子。因此，以本發明載劑為基礎的調配物可以Lactohale 200®或具有固有乳糖細粉含量之類似乳糖產品加以調配。
根據本發明，Lactohale 100®和Lactohale 300®為較佳的。
再者，發明者們發現，根據本發明用於吸入之調配物的優異氣霧劑性能係藉由調整乾粉混合物內細乳糖的特定含量和粗乳糖的特定含量來達成。
發明者們確定乳糖載劑的細乳糖含量為重要參數。為了得到特徵為優異的氣霧劑性能之吸入用的根據本發明調配物，細乳糖之含量應在特定範圍內選擇。例如，粉末混合物/乳糖載劑中較高的細乳糖含量，例如發現20%或更高的含量對混合物均一性具有負面影響(參見例如，比較實例20)。已顯示，根據本發明之粉末混合物和調配物可具有介於1%和10%間，以及以介於5%和10%間之範圍內變化的細乳糖含量，而細乳糖含量亦可為吸入用乳糖之固有部分，亦即就Lactohale 2000®之情況(參見具體實例34)，經計算為5-15 µm之X10，而不會危及氣霧劑性能。
根據本發明，粉末混合物中細乳糖的含量係介於1%和10%之間，較佳地介於5%和10%之間，較佳地介於2.5%和7.5%之間，較佳地介於5%和7.5%之間，更佳地5%。
發明者們確定粉末混合物的粗乳糖含量亦為一個重要參數。為了得到特徵為優異氣霧劑性能之吸入用的根據本發明調配物，粗乳糖的含量應在特定的範圍內選擇。
根據本發明，粉末混合物中粗乳糖的含量係介於98.25%至75%之間，較佳地介於94.25%至75%之間，較佳地介於92.00%至75%之間，更佳地介於90.00%至75%之間，及特佳地90%至85%。
由於根據本發明的乾粉混合物為三元混合物，因此所有三種組份需要以限定的最大粒徑形式和以特定比例之形式提供。
發明者們發現，吸入用之根據本發明調配物的優異氣霧劑性能係藉由選擇特定比例之細乳糖和粗乳糖以及活性成份來達成。
根據本發明，粉末混合物中粗乳糖與細乳糖的比例係介於445：5和65：5之間，較佳地94.25：5和65：5，較佳地94.25：5和75：5、91.75：7.5和89.25：10，較佳地92：5和75：5之間，特佳地為92：5、85：5以及75：5之比例。
根據本發明，粉末混合物中式(I)或(I-M-I)之活性成份與粗乳糖的比例係介於1：126和1：3.8之間，較佳地介於1：31和1：3.8之間。
根據本發明，粉末混合物中式(I)或(I-M-I)之活性成份與細乳糖的比例係從 1：13和1：0.1，較佳地介於1：13 和1：0.25，較佳地介於1：1.67和1：0.25之間。 其他的賦形劑
根據本發明之製劑一般可含有其他藥理學上可接受的賦形劑，包括，尤其是載劑(例如，吸入等級乳糖、乳糖單水合物、甘露醇)、分散劑、濕潤劑、潤滑劑(例如，硬脂酸鎂)、界面活性化合物(例如，月桂基硫酸鈉、二硬脂醯磷脂醯膽鹼)、離子化合物(例如氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀)、合成和天然聚合物(例如角叉菜膠、羥丙基甲基纖維素、明膠)或pH調節劑(例如氫氧化鈉、氯化鈉、檸檬酸鹽，檸檬酸三鈉)、著色劑(例如無機顏料，如，例如氧化鐵或氧化鈦)。 腔室
根據本發明，包括其單水合物形式I-M-I或I-M-II形式之活性成份和乳糖的乾粉混合物可經由乾粉吸入器給藥，例如單劑量吸入器，其中各劑量係在使用前載入到裝置中，多單位劑量吸入器，其中數個單劑量係個別密封(預先計量)並可在每次啟動之前於給劑腔室中排放，或者儲室多單位劑量吸入器，其中大量供應藥物係預加載到裝置中並在每次啟動之前在給劑腔室中排放(由裝置計量)。較佳地，根據本發明之乾粉混合物係經由配備/裝載有腔室的單劑量吸入器給藥，例如包含乾粉混合物的膠囊或泡罩。較佳地，該等腔室為單獨的膠囊，較佳地明膠或羥丙基甲基纖維素的硬膠囊，最佳地羥丙基甲基纖維素膠囊。
包括微粉化之活性成份的乾粉混合物，例如式(I-M-I)之單水合物I或式(I-M-II)之單水合物II，根據實例2或4，係填充到硬膠囊中(羥丙基甲纖維素=羥丙甲纖維素=HPMC，例如3號)或來自硬明膠或其他適合物質之替代膠囊。醫藥硬膠囊大小為標準化的，並具有定義計量之特性，例如3號膠囊具有157 mm之長度，57 mm之直徑，而2號膠囊具有176 mm之長度，62 mm之直徑，1號膠囊具有194 mm之長度，68 mm之直徑。
依照填充重量和活性成份濃度，可達到不同的標稱劑量。具有不同活性成份，例如式(I-M-I)之單水合物I或式(I-M-II)之單水合物II，根據實例2或4之標稱劑量膠囊的示例性組成物，係如示例具體實例1至3所示並展現於下表3中。 表 3：帶有定義標稱劑量之根據本發明調配物的實例(硬膠囊中填充的粉末).
示例的具體實例1 示例的具體實例2 示例的具體實例3
標稱計量 120µg 480µg 1000µg
粉末混合物中活性成份之濃度(實例4) 0.75% 3% 10%
填充重量 16 mg 16mg 10 mg
在肺內給藥，活性成份，(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，較佳地(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I(參見實例4)之量(標稱劑量)為每次吸入約10 µg至50000 µg，較佳地每次吸入約100 µg至10000 µg，進一步較佳地每次吸入約100至6000 µg，進一步較佳地每次吸入約120至4000 µg，進一步較佳地每次吸入約200至4000 µg，非常特佳地約240 µg至4000 µg，非常特佳地約240 µg至2000 µg，非常特佳地約240 µg至1000 µg，非常特佳地約240 µg至480 µg，非常特佳地約480 µg至4000 µg，非常特佳地約480 µg至2000 µg，非常特佳地約480 µg至1000 µg，非常特佳地約1000 µg至4000 µg，非常特佳地約1000 mg至2000 µg，非常特佳地約1000 µg，非常特佳地約2000 µg，非常特佳地約4000 µg。
腔室，較佳地硬膠囊，非常佳地以HMPC為基底的硬膠囊，根據本發明3號膠囊含有8-40 mg之吸入調配物的填充量，較佳地10-30 mg之吸入調配物的填充量，更佳地10-20 mg之吸入調配物的填充量，更佳地16-20 mg之吸入調配物的填充量。
根據本發明，最佳地為下列組成物： 表 4 ：以百分比為基準根據本發明之包含乾粉混合物的最終膠囊製劑
標稱劑量 膠囊 例如HMPC 粉末填充量 乾粉混合物中之API含量(%) 粗乳糖含量(%) 細乳糖含量(%) API：粗乳糖比率 API：細乳糖比率
480 µg 3號 16 mg 3% 92% 5% 1：31 1：1.67
1000 µg 3號 10 mg 10% 89% 1% 1：8.9 1：0.1
1000 µg 3號 10 mg 10% 87.5% 2.5% 1.8.75 1：0.25
1000 µg 3號 10 mg 10% 85% 5% 1：8.5 1：0.5
2000 µg 3號 20 mg 10% 85% 5% 1：8.5 1：0.5
3000 µg 3號 30 mg 10% 85% 5% 1：8.5 1：0.5
4000 µg 3號 40 mg 10% 85% 5% 1：8.5 1：0.5
2000 µg 3號 10 mg 20% 75% 5% 1：3.8 1：0.25
3000 µg 3號 15 mg 20% 75% 5% 1：3.8 1：0.25
4000 µg 3號 20 mg 20% 75% 5% 1：3.8 1：0.25
根據本發明，粉末混合物中具有3%的式(I)或(I-M-I)活性成份含量之粉末混合物係包括480 µg之式(I)或(I-M-I)活性成份，92%粗乳糖和5%細乳糖，並可於硬膠囊，較佳地3號HMPC膠囊中填充質量16 mg之粉末混合物，及其然後可經由「單位劑量」吸入器給藥，例如較佳地Plastiape (Berry) RS01低電阻裝置。
根據本發明，粉末混合物中式(I)或(I-M-I)之活性成份含量為10%的粉末混合物係包括1000 µg、2000 µg、3000 µg或4000 µg之式(I)或(I-M-I)活性成份，85%粗乳糖和5%細乳糖，並可填充(為10 mg、20 mg、30 mg或40 mg粉末混合物之相應質量)於硬膠囊中，較佳地3號HMPC膠囊及然後可經由「單一單位劑量」吸入器給藥，例如較佳地Plastiape (Berry) RS01低電阻裝置。
根據本發明，粉末混合物中式(I)或(I-M-I)活性成份含量為20%的粉末混合物係包括2000 µg、3000 µg或4000 µg式(I)或(I-M-I)之活性成份，75%粗乳糖和5%細乳糖，並可填充(為10 mg、15 mg或20 mg粉末混合物之對應質量)於硬膠囊中，較佳地3號HMPC膠囊，及其然後可經由「單一單位劑量」吸入器給藥，例如較佳地Plastiape (Berry) RS01低電阻裝置。 表 5 ：包含乾粉混合物之根據本發明的最終膠囊製劑，以質量為基準的特徵：
標稱劑量 膠囊 例如HMPC 粉末填充量 乾粉混合物中之API含量(mg/g) 粗乳糖含量(mg) 細乳糖含量(mg) API：粗乳糖比率 API：細乳糖比率
480 µg 3號 16 mg 30 mg/g 14.72 mg 0.8 mg 1：31 1：1.67
1000 µg 3號 10 mg 100 mg/g 8.9 mg 0.1 mg 1：8.9 1：0.1
1000 µg 3號 10 mg 100 mg/g 8.75 mg 0.25 mg 1.8.75 1：0.25
1000 µg 3號 10 mg 100 mg/g 8.5 mg 0.5 mg 1：8.5 1：0.5
2000 µg 3號 20 mg 100 mg/g 17.0 mg 1.0 mg 1：8.5 1：0.5
3000 µg 3號 30 mg 100 mg/g 25.5 mg 1.5 mg 1：8.5 1：0.5
4000 µg 3號 40 mg 100 mg/g 34.0 mg 2.0 mg 1：8.5 1：0.5
2000 µg 3號 10 mg 200 mg/g 7.5 mg 0.5 mg 1：3.8 1：0.25
3000 µg 3號 15 mg 200 mg/g 11.25 mg 0.75 mg 1：3.8 1：0.25
4000 µg 3號 20 mg 200 mg/g 15.0 mg 1.0 mg 1：3.8 1：0.25
根據本發明，粉末混合物中式(I)或(I-M-I)活性成份含量為30 mg/g的粉末混合物係包括480 µg式(I)或(I-M-I)的活性成份，14.72 mg粗乳糖和0.8 mg細乳糖，並且可於硬膠囊，較佳地3號HMPC膠囊中填充質量16 mg之粉末混合物，及然後可經由「單一單位劑量」吸入器給藥，例如較佳的Plastiape (Berry) RS01低電阻裝置。
根據本發明，粉末混合物中式(I)或(I-M-I)活性成份含量為100 mg/g的粉末混合物，係包括1000 µg、2000 µg、3000 µg或4000 µg式(I)或(I-M-I)(I)或(I-M-I)之活性成份，8.9 mg、8.75 mg、8.5 mg、17.0 mg、25.5 mg或34.0 mg粗乳糖和0.1 mg、0.25 mg、0.5 mg、1.0 mg、1.5 mg 或 2.0 mg細乳糖，並可填充(以10 mg、20 mg、30 mg或40 mg粉末混合物之相應質量)於硬膠囊中，較佳地3號HMPC膠囊，及然後可經由「單一單位劑量」吸入器給藥，例如較佳的Plastiape (Berry) RS01低電阻裝置。
根據本發明，粉末混合物中式(I)或(I-M-I)活性成份含量為200 mg/g的粉末混合物係包括2000 µg、3000 µg或4000 µg式(I)或(I-M-I)(I)或(I-M-I)之活性成份，7.5 mg、11.25 mg或15.0 mg粗乳糖和0.5 mg、0.75 mg或1.0 mg細乳糖，並可填充(以10 mg、15 mg、20 mg粉末混合物之相應質量)於硬膠囊中，較佳地3號HMPC膠囊，及然後可經由「單一單位劑量」吸入器給藥，例如較佳的Plastiape (Berry) RS01低電阻裝置。 製造方法
根據本發明之製劑一般-如通常在粉末形式之可吸入自由流動的醫藥品的製造，可藉由將活性成份微粉化及視需要將微粉化的活性成份與非活性載劑化合物混合來製備。
根據本發明的化合物可轉化為所述的給藥形式。此項可以本身已知的方式藉由與惰性、無毒、醫藥上適合的賦形劑混合來進行。乾粉調配物和成品(填充乾粉混合物的硬膠囊)係根據以下流程圖和說明來製造。
表 6 ：
成份 製造步驟
粗乳糖單水合物 稱重/分層
細乳糖單水合物 稱重/分層
混合/篩分，形成乳糖預混物
乳糖單水合物預混物 稱重/分層
活性成份：微粉化的單水合物I或II，實例2或4 稱重/分層
混合/篩分(循環)
活性成份:微粉化的單水合物I或II，實例2或4/乳糖混合物
膠囊 膠囊填充
最終填充好的膠囊(DP)
步驟1：
在開始混合之前，將細乳糖部分稱重並舖於在兩層粗乳糖之間。 步驟2：
乳糖預混物之混合係於滾筒混合器中以72 rpm、67 rpm 或34 rpm或32 rpm或30 rpm，較佳地32 rpm進行2次(2個循環)歷時20分鐘。將乳糖預混物在循環之間經由500 µg篩網篩分。 步驟3：
活性成份：經微粉化的單水合物I或II，實例2或4，經由500 µm篩網篩分並加入預混的乳糖中。在開始混合循環之前，將乳糖預混物和活性成份分層，其間交替著6層乳糖預混物和5層活性成份(單水合物I或II，實施例2或4)。 步驟4：
這些組份循環性混合，例如3至5個循環，較佳地於滾筒混合器，例如玻璃或不銹鋼，較佳地不銹鋼，進行3個循環。各循環係以72 rpm、67 rpm、34 rpm或32 rpm較佳地32 rpm進行20至30分鐘，較佳地30分鐘(90分鐘總混合時間)，較佳地32 rpm歷時30分鐘，混合循環之間有10分鐘的停機時間。若需要(例如，目視結塊)，可在混合循環之間個別篩分混合物。 步驟5：
將混合物留在不銹鋼容器中於室溫(15-25°C)和35至65%相對濕度下靜置一段特定時間，較佳地24至72小時，更佳地48小時。 步驟6：
使用膠囊填充機(例如 MG2 Flexalab)將混合物以所欲的填充重量填充至膠囊中。 吸入器裝置
在本發明內文中，sGC活化劑，例如實例2或4係以乾粉或乾粉調配物藉由乾粉吸入器裝置來施用。
本發明內文中較佳的乾粉吸入器裝置係定義為以膠囊為基礎的預先計量吸入裝置之單一劑量吸入器(參見圖1a和1b)。在本發明內文中，係使用Plastiape(Berry)RS01低電阻裝置施予劑量。此裝置(較高電阻類型)係揭示和和描述於治療其他病患群族，例如囊性纖維化(CF)或非CF支氣管擴張症有關的出版物中(ELKINS et al. Inspiratory Flows and Volumes in Subjects with Cystic Fibrosis Using a New Dry Powder Inhaler Device, The Open Respiratory Medicine Journal, 2014, 8, 1-7和ELKINS et al. Inspiratory Flows and Volumes in Subjects with Non-CF Bronchiectasis Using a New Dry Powder Inhaler Device, The Open Respiratory Medicine Journal, 2014, 8, 8-13)。
吸入器係藉由將裝有乾粉調配物的單一膠囊插入裝置中來操作。按下二個鈕(按壓鈕)刺破膠囊，使用者將其嘴巴置放在咬嘴周圍並深深地用力吸氣。來自吸入的能量將藥物製劑從膠囊中引出，將粉末分散成氣霧，活性成份粒子從乳糖載劑粒子釋放出並將其帶入呼吸道。將用過的膠囊移出並丟棄。依照病患的治療需求和相應的臨床裝置標示，該裝置可能重複使用。投予的膠囊數目決定藥物的劑量。
其他預先計量的乾粉吸入裝置例如以泡罩條為基礎的多單位劑量裝置亦可用作較佳的施用方法且若氣霧路徑具有類似的設計或性質(例如裝置阻力和定義流速的壓力下降)則可能導致相當的結果。
在本發明的內文中，亦揭示了含有包含實例1之製劑或可能具有將這些製劑併入膠囊或泡罩中並適合藉由吸入其固體形式給藥之儲存器的裝置，亦即能藉由吸入以固體形式投予含有活性成份：例如單水合物I或II，實例2或4之製劑的霧化器(粉末吸入器)。 人類劑量預估
根據本發明調配物之特徵，有關遞送的劑量(DD)係藉由過濾收集管法測定而細粒子劑量(FPD)係藉由階式衝撞所測定。測定遞送劑量和細粒子劑量的分析方法一般係描述於藥典中，因為這些就可吸入劑型，例如乾粉吸入調配物為統一的並為用於例如釋放臨床用的DPI產品之品質控制的構成習用法。
已經發現，具有不同標稱劑量的不同調配物導致不同的遞送劑量，更重要地，導致作為有效劑量特徵之特定細粒子劑量，因而被遞送至肺深處到達作用部位。理論上，輸送劑量和細粒子劑量和分量與填充粉末劑量係具有線性關係，但由於數個相互作用的因素，無法可靠地預測，實際上可能不同並需要相關研究。希望遞送劑量盡可能接近標稱劑量。在實行中，輸送劑量與標稱劑量永遠不會100%相符，因為在吸入膠囊的表面和使用過的乾粉吸入器的氣霧路徑上在某程度上總會留下殘留物。當然，這性質係高度依活性成份的物理化學性質及其從粉末混合物的釋放行為而定。類似地，相對於填充的標稱活性成份含量，希望細粒子劑量和細粒子分量盡可能高，以便於盡可能好好利用可用的藥物量並減少活性成份的損失或降低遞送至深肺以外之其他隔室的份量(例如藉由經口吞嚥較大藥物粒子的影響)。
由於可吸入調配物的性質以及與例如口服固體調配物相反，並非所有標稱含量都將遞送至肺部。可定義數個分量，其係以特定的體外分析方法定性，並支持估算吸入期間傳遞給病患的劑量分量(遞送劑量或發射劑量)和以下例如5 µm或4.5 µm細粒子的分量(以µm計的大小截取值係依FPD的定義而定)，因為預計會到達深部氣道和肺泡(細粒子劑量)。就概述，請參閱下表。 表7：有關吸入藥物產品劑量的術語定義
術語 縮寫 定義 同義字或等同術語
標稱劑量 ND 填入膠囊(臨床研究)或霧化器(藥理學動物實驗)中的API總劑量 膠囊劑量，膠囊效用，膠囊上標示的藥物物質之量
發射劑量 ED 在定義的實驗室檢測條件下，實際上離開裝置的劑量 相當於遞送劑量
遞送劑量 DD 經估算或計算由動物所吸入的劑量(從鼻尖/嘴至肺泡)或人類可取用的藥物物質之量，裝置外，以依劑量為基準 相當於發射劑量
肺沉積劑量 LDD/LD 被認為到達個別動物和人類肺部(支氣管和肺沉積)之劑量 認為該FPD(活體外所測)係相當於人類的肺沉積劑量
細粒子劑量 FPD 藉由活體外階式撞擊分析所測定的空氣動力學粒徑分佈(ASPD)函數所計算的參數。吸入器每次啟動或劑量遞送的活性醫藥成份(API)之質量，包含在空氣動力學直徑小於4.5 - 5 µm之粒子中(例如，根據歐洲藥典)。 就DPI，係假設FPD基本上係等於人類肺沉積劑量
細粒子分量 FPF 根據有關ED/DD或標稱劑量之FPD，細粒子質量之分量(以%計)
藥物動力學/藥效動力學(PK/PD)關係之評估
以血栓素(thromboxane)A2挑戰的麻醉PAH小型豬模型(見實驗部分E-1)被認為是預測人類最小有效劑量和有效劑量(MED，ED)的最相關和最靈敏的模型。就測定有效的LD，係重複實驗，不同之處在於吸收過濾器連接在管末端用以測定沉積的肺劑量。實例1之霧化產生的平均霧化效率為標稱施用劑量的5%，產生約0.15 µg/kg(3 µg/kg ND)、0.5 µg/kg(10 µg/kg ND)、1.5 µg/kg(30 µg/kg ND)和5 µg/kg(100 µg/kg ND)之LD。假設最小有效ND為3 µg/kg(PAP減少5%)，則最小有效沉積LD被認為是0.15 µg/kg。
將小型豬模型3、10、30和100 µg/kg的標稱劑量乘以5%的過濾器沉積因子，得到小型豬中0.15、0.5、1.5和5 µg/kg的肺沉積劑量。將這些值乘以60 kg即為人類的肺劑量。因此，就60 kg人類反映PAP減少的FPD經計算為9、30、90和300 µg。
因此，經由小型豬的直接放大，不考慮呼吸道內的蛋白質結合，以60 kg體重之人類為基礎的預測MED(5%PAP下降)經計算為9 µg LDD。作為未結合濃度之替代物，其為肺中可能的活性濃度，吾等考慮了小型豬和人類血漿中未結合分量的個別差異。就假設PAP減少5%，此考量產生了60 kg參與者41 µg LDD之最小有效肺劑量(LD)。因此，以60 kg體重為基準，預測的最小人類有效劑量係在9 µg LDD至41 µg LDD的範圍內(參見圖3)。 表 8 ：在有或無考量蛋白質結合之種間差異下的有效肺劑量
小型豬中相對的肺沉積劑量[µg/kg] 60 kg人類中總肺沉積劑量[µg]
未考量蛋白結合之種間差異a 考量蛋白結合之種間差異b
0.15 µg/kg (3 µg/kg標稱劑量) 9 41
0.50 µg/kg (10 µg/kg標稱劑量) 30 137
1.5 µg/kg (30 µg/kg標稱劑量) 90 410
5.0 µg/kg (100 µg/kg標稱劑量) 300 1370
a計算(小型豬中相對的肺沉積劑量x 60 kg)
b計算(小型豬中相對的肺沉積劑量x 60 kg x 4.55 (未結合的小型豬(血漿fu 0.348%)/人類(血漿fu 0.0764%)分量之比率)
亦以如表8中所列的小型豬之相對肺沉積劑量為基準，就有效劑量(有效PAP下降＞5至高35%，持續時間長達4小時的完整觀察期)進行了此轉譯。
因此，以小型豬數據為基準之人類中有效肺沉積劑量預期係在9 μg至1370 μg的範圍內。
將100 µg/kg視為無全身副作用下(BP下降)，小型豬模型中的最高有效劑量，其中假定9至1370 µg肺沉積劑量為有效劑量，對應的最大有效人類LDD為1370 µg，依照不同的種間蛋白結合的影響(參見表7)。就DPI產品，係假設細粒子物劑量(FPD)基本等同人體肺部沉積劑量。
就解決對大範圍的肺沉積劑量之需求並將其轉譯為待製造之乾粉吸入膠囊的細粒子劑量(FPD目標)的技術規範，進行了一些計算和粗略估計。一般而言，若細粒子分量達到標稱劑量的20%以上，則認為以粉末混合載劑調配物為基礎的可吸入產品係具有優越的性能。再者，高性能吸入產品需要與遞送劑量相關的高FPF(%)且係以≥30%為目標。考慮到技術和實際因素(粉末混合物中的活性物質濃度和混合物的膠囊填充質量)，後續使用FPD目標供成品乾粉吸入膠囊建立定義的標稱劑量。FPD和DD目標以及對應的標稱劑量係列於以下表9和10二表格中。 表 9 ：標稱劑量目標和細粒子劑量及%分量之目標(ds)
膠囊標稱劑量 [µg] 平均FPF (標稱之FPD%) 平均FPF (DD之FPD%) 平均FPD ＜4.5µm (目標 a)[µg] 最小FPD ＜ 4.5µm(目標之65% b) [µg]
60 ≥ 20% ≥ 30% 12 8
75 ≥ 20% ≥ 30% 15 10
120 ≥ 20% ≥ 30% 24 16
480 ≥ 20% ≥ 30% 96 62
500 ≥ 20% ≥ 30% 100 65
1000 ≥ 20% ≥ 30% 200 130
2000 ≥ 20% ≥ 30% 400 260
3000 ≥ 20% ≥ 30% 600 390
6000 ≥ 20% ≥ 30% 1200 780
9000 ≥ 20% ≥ 30% 1800 1170
a) 從標稱目標之FPF%所計算的目標值 b) 由於製造和分析測定中預期的變化性，因此建立最小目標。
對於遞送和標稱劑量之間的關係，沒有一般約束力(例如藥典)要求，由於不同活性成份的性質非常不同，具有不同性質及其製造的醫藥調配物，因此無法定義此項。相反，遞送劑量之統一性係由藥典定義，用以確保劑量間的一致性。目標遞送劑量為一經驗參數，係在標準化條件下以一定義的乾粉吸入裝置從一定義劑型的多次測定所產生。預期的平均遞送劑量應落在目標DD的85至115%範圍內。最小遞送劑量要求係佔平均遞送劑量範圍下限的85%。目標給藥劑量百分比(從≥50%到≥65%的標稱值)係就所有非線性的標稱劑量所定義，並需要考慮相對較高的含量活性成份黏附在例如膠囊和裝置表面，特別是具有較低的標稱填充劑量。 表 10 ：標稱劑量，DD目標和相關的最小遞送劑量
膠囊標稱劑量 [µg] 平均DD (標稱劑量之%) 平均DD (目標A)[µg] 最小DD (目標之85%)[µg]
60 ≥ 50% 30 26
75 ≥ 50% 38 32
120 ≥ 60% 72 61
480 ≥ 60% 288 245
500 ≥ 60% 300 255
1000 ≥ 65% 650 553
2000 ≥ 65% 1300 1105
3000 ≥ 65% 1950 1658
6000 ≥ 65% 3900 3315
9000 ≥ 65% 5850 4973
令人驚訝地，臨床前實驗顯示sGC活化劑，式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)(參見E-1)在PAH動物模型中改善了肺選擇性並延長了作用持續時間(吸入施用後，在無全身血壓(=BP)下降效應下延長了選擇性肺動脈壓(=PAP)下降)(參見實驗部分E-1)。再者，已研究了作用持續時間之預測和人體劑量之預測。依照不同種間蛋白結合之考量，將100 µg/kg視作為小型豬模型中的有效劑量，假定300至1370 µg肺沉積劑量為有效劑量。
最後研究了活性成份之不同假多晶形式的藥理學效應。所有包括晶體形式之化合物的乾粉調配物，實例11，例如倍半水合物實例6e在此急性PAH模型中於吸入施用後選擇性和劑量依賴地降低了PAP，具有至少4小時之長作用持續時間。就增加的施用劑量，觀察到清晰的劑量反應曲線(參見E-1)。
再者，吾等發現sGC活化劑(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，特別是其單水合物II之形式(實例2)在首次臨床研究中(參見實驗部分E-2.1)增加cGMP量作為sGC活化的第二信使分子作為肺中藥物濃度的替代物(標靶結合之指標)以及健康志願者在超過12小時的時間內有利的支氣管擴張性質，至高達乾粉施用後24小時，例如總特殊氣道阻力(sRaw)的下降，一指出肺中支氣管擴張活性的參數，其支持了臨床上長的肺滯留時間以及(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，特別是其單水合物II之形式(實例2)成功地用於心肺疾病治療之適性。在健康志願者中觀察到至高4000 µg的劑量對全身血壓無臨床上有意義的效用。
再者，吾等發現，在劑量至高4000 µg(含)時對全身血壓無臨床上相關影響下，在患有肺高壓病患中肺動脈壓和肺血管阻力選擇性降低。直到3小時的測量期結束(＞3小時的測量期在技術上為不可行的)，該效用一直持續且無下降反應。在此研究中從測量的實例4之長血漿半衰期可結論出超過3小時測量值的肺滯留時間(大概超過12小時的時間，至高達乾粉施用後24小時)(參見實驗部分E-2.4)。
此外，藥物物質(實例4)之口服、靜脈內和吸入給藥後的血漿濃度分析顯示，吸入施用後活性成份的半衰期最長(E-2.3)。在人類中吸入1000 µg後，發射(肺)劑量經測定為720 µg。此研究的結果證實了肺劑量和半衰期對於吸入乾粉給藥而言為足夠的，能使每天一次的治療足夠實例4在肺中24小時的藥物覆蓋。
總結，所有的結果顯示式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式，如，例如(I-M-I)和(I-M-II)，特別是式(I-M-I)之單水合物I特別適用於治療肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病(第3類)相關的肺高壓(PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)，並且適合吸入乾粉給藥，使每天一次治療足夠實例4在肺中之24小時的藥物覆蓋。
另外，吾等發現(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸特別是其單水合物I之形式(實例4)具有有利的物化性質，例如蛋白結合和CACO通量(參見實驗部分E-3.1(Caco滲透性)和E-3.2(蛋白結合)，其使得(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸特別是其單水合物I之形式(實例4)為一適合藉由將乾粉吸入肺部來局部治療心肺疾病的化合物。再者，數據指出(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸特別是其單水合物I之形式(實例4)(I-M-I)不僅顯示經由肺部選擇性血管舒張有效降低PAP，且相較於西尼西呱(cinaciguat)顯示更持久的支氣管擴張性質，其對患有慢性肺部疾病(第3類組PH)之PH病患的每天一次或二次的吸入治療可能為有利的或甚至具有治療肺功能受限，例如氣喘病患的潛力。
因此藥物物質，例如根據本發明式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式 (I-M-I)和(I-M-II)係具有下列優越的主要藥理學性質： •(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)­乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸為一種有效和選擇性sGC活化劑，且在吸入後提供了一治療PH的新方法。 •(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸在不同疾病相關動物模型中(施以血栓素和缺氧挑戰的大鼠、豬和狗)於吸入施用後選擇性降低了升高的PAP，具有長的作用持續時間，建議每天施用二次。 •在作為VQ-不相稱代表的單側通氣小型豬模型中，(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸在吸入施用後，與全身性施予的血管擴張劑相比，在對氧合作用無負面效應之下降低了PAP。 •除了PAH標準治療(SoC)(例如波生坦、西地那非、伊洛美定和利奧西呱)之外，(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸在PAH小型豬模型中吸入施用後選擇性降低了升高的PAP。 •(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之效用在氧化壓力的實驗條件下增強了(1H-[1,2,4]㗁二唑并[4,3-a]喹㗁啉-1-酮，一種高選擇性、不可逆之可溶性鳥苷酸環化酶[ODQ]的血紅素位點抑制劑，L-Nω-硝基精胺酸甲基酯[L-NAME]治療)。 •就通氣而言，(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸顯現支氣管擴張效應(乙醯膽鹼[ACh]大鼠模型)和對氣道過度反應性及發炎(慢性卵清蛋白氣喘小鼠模型)的抑制作用。 •在三種不同類型的給藥後(口服、靜脈內、吸入)測量(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸特別是其單水合物I形式(實例4)之血漿濃度，吸入施用後顯示最長的消除半衰期。 •在人體中吸入1000 µg後，發射(肺)劑量經測定為720 µg。 •在人類中以sGC活化劑(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸其式(I-M-I)之晶體形式單水合物I形式(實例4)的首次研究顯示sGC活化和肺滯留時間長結合支氣管擴張性質和選擇性降低肺動脈壓及肺血管阻力以良好的局部和全身耐受性至高達4000 µg(包括)的最高檢測劑量。
因此藥物物質，例如根據本發明式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸以及其假多晶形式(I-M-I)和(I-M-II)在病患中具有優越的主要藥理學和藥效學性質，包括降低肺動脈壓(mPAP)和肺血管阻力(PVR)，藉由例如FEV1所測量的支氣管擴張、具有低至無全身不良反應之肺選擇性(特別是對全身血流動力學，例如臨床相關的血壓或心率變化)和低至無增加的VQ-不相稱，用以避免相關的去飽和，再者在肺內給藥後足夠的肺滯留時間及/或足夠的作用持續時間。
因此，根據本發明之醫藥乾粉調配物適合用於治療心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。
除有另有說明，否則下列試驗和實例中的重量數據為重量百分比；份量為重量份。液體/液體溶液之溶劑比例、稀釋比例和濃度數據係以各案例的體積為基準。 本發明之具體實例(假多晶形式) 單水合物 I1. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8和29.2，或在6.9、7.2、7.3、12.8和29.2處之波峰。 2. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8、16.0和25.8，或至少在6.9、7.2、7.3、12.8、16.0和25.8處之波峰。 3.     一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8、20.5和25.8，或至少在6.9、7.2、7.3、12.8、20.5和25.8處之波峰。 4. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8、5.7、6.9、7.2、7.3和9.9處之波峰。 5. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8、5.7和16.0,或至少在6.9、7.2、7.3、12.8、5.7和16.0處之波峰。 6. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8、5.7和20.5，或至少在6.9、7.2、7.3、 12.8、5.7和20.5處之波峰。 7. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8、5.7和29.2，或至少在6.9、7.2、7.3、12.8、5.7和29.2處之波峰。 8.     如請求項8至14中任一項之化合物，其中該X-光粉末繞射圖進一步係包括在23.0、15.2、25.8和25.1處之波峰。 9.     一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 係具有如圖6中所示之X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)。 10.   如請求項8至16中任一項之化合物，其中該晶體形式於微粉化期間為穩定的。 11.   一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8處之波峰，且該化合物係具有如圖27中所示之DSC溫譜圖。 12.   一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8處之波峰並缺乏在27.2和27.5處之波峰。 13.   一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-I)的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.8和5.7處之波峰並缺乏在8.5和6.1處之波峰。 14.   一種醫藥組成物，其係包括如請求項1至13中任一項之化合物和一醫藥上可接受的賦形劑。 15.   如請求項1至13中任一項之化合物係用於治療及/或預防心肺疾病。 16.   如請求項15之醫藥組成物，係用於治療及/或預防心肺疾病，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。 17.   如請求項1至13中任一項所定義之化合物的用途，係用於製造醫藥組成物供治療或防止心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。 18.   如請求項1至13中任一項之化合物的用途，係用於製造穩定的吸入性劑型供用於乾粉吸入器。 19.   一種治療或防止心肺病症之方法，其中該心肺病症係由在哺乳動物的下列項目所組成之群組中選出：肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)，該方法係包括投予一有此需要的哺乳動一治療上有效量之如請求項1至13中任一項的化合物。 20.   如請求項19之方法，其中該心肺病症為慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。 單水合物 II1.     一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7、13.9、21.7和16.4處之波峰。 2. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7、13.9、21.7和24.4處之波峰。 3. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7、21.7和25.5處之波峰。 4. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7、5.7、6.1和7.1處之波峰。 5. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7、5.7和8.5處之波峰。 6. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7、6.1和9.9處之波峰。 7. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7、7.1和8.5處之波峰。 8. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7、7.1和6.1處之波峰。 9. 一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 係具有如圖7中所示之X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)。 10.   一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7處之波峰且該化合物係具有如圖28中所示之DSC溫譜圖。 11.   一種化合物，其為(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之式(I-M-II)的晶形變體單水合物II (I-M-II) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.7處之波峰並缺乏在(1)11.1和20.5，(2)11.1和29.2，(3)20.5和29.2，(4)11.1和16.0，(5)11.1和16.9，及/或(6)16.0和16.9處之波峰。 12.   如請求項11之化合物，其係缺乏在繞射角2Ɵ值±0.2在11.1和29.2處之波峰。 13.   如請求項11之化合物，其係缺乏在繞射角2Ɵ值±0.2在11.1和20.5處之波峰。 14.   如請求項1至13中任一項之化合物，其中該X-光粉末繞射圖係包括在繞射角2Ɵ值±0.2在12.7、23.9、13.9、23.0和12.2處之波峰。 15.   一種醫藥組成物，其係包括如請求項1至14中任一項之化合物及一醫藥上可接受的賦形劑。 16.   如請求項1至14中任一項之化合物，係用於治療及/或預防心肺疾病。 17.   如請求項15之醫藥組成物，係用於治療及/或預防心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。 18.   如請求項1至14中任一項所定義之化合物的用途，係用於製造醫藥組成物供治療或防止心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。 19.   如請求項1至14中任一項之化合物的用途，係用於製造穩定的吸入性劑型供用於乾粉吸入器中。 20.   一種治療或防止心肺病症之方法，其中該心肺病症係由在哺乳動物的下列項目所組成之群組中選出：肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)，該方法係包括投予一有此需要的哺乳動物一治療上有效量之如請求項1至14中任一項的化合物。 21.   如請求項20之方法，其中該心肺病症為慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。 倍半水合物1.     一種化合物，其為式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的晶形變體倍半水合物 (I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.2和7.6處之波峰。 2.     一種化合物，其為式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的晶形變體倍半水合物 (I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.2、5.1和26.4處之波峰。 3.     一種化合物，其為式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的晶形變體倍半水合物 (I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.2、8.6和14.5處之波峰。 4.     一種化合物，其為式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的晶形變體倍半水合物 (I) 其係具有如圖9中所示之X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)。 5.     一種化合物，其為式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的晶形變體倍半水合物 (I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.2處之波峰且該化合物係具有如圖30中所示之DSC溫譜圖。 6.     一種化合物，其為式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的晶形變體倍半水合物 (I) 其中該化合物的X-光粉末繞射圖(在25℃和以Cu-Kα1為放射源所測)係包括在繞射角2Ɵ值±0.2至少在12.2處之波峰並缺乏在(1)10.6，(2)25.8和6.7 (3)25.8和7.1，(4)25.8和10.6，(5)10.4，(6)5.7和6.7及/或(6)25.5、5.7和6.7處之波峰。 7.     如請求項6之化合物，其係缺乏在繞射角2Ɵ值±0.2在10.6處之波峰。 8.     如請求項6之化合物，其係缺乏在繞射角2Ɵ值±0.2在5.7和6.7處之波峰。 9.     如請求項1至8中任一項之化合物，其中該x-光粉末繞射圖係包括在繞射角2Ɵ值±0.2在12.2、14.5、18.7、25.1和27.0處之波峰。 10.   一種醫藥組成物，其係包括如請求項1至9中任一項之化合物及一醫藥上可接受的賦形劑。 11.  如請求項1至9中任一項之化合物，係用於治療及/或預防心肺疾病。 12.   如請求項9之醫藥組成物，係用於治療及/或預防心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。 13.   如請求項1至13中任一項所定義之化合物的用途，係用於製造醫藥組成物供治療或防止心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。 14.   如請求項1至9中任一項之化合物的用途，係用於製造穩定的吸入性劑型供用於乾粉吸入器中。 15.   一種治療或防止心肺病症之方法，其中該心肺病症係由在哺乳動物的下列項目所組成之群組中選出：肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)，該方法係包括投予一有此需要的哺乳動物一治療上有效量之如請求項1至9中任一項的化合物。 16.   如請求項15之方法，其中該心肺病症為慢性阻塞性肺疾病中的肺高壓(PH-COPD)和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。 實驗部分 縮寫和首字母縮寫詞
abs. 絕對
acac 乙醯丙酮
BINAP (2,2'–雙(二苯基膦基)–1,1'–二萘基)
cat. 催化
CI 化學游離(MS中)
coe 環辛烯
d 天
TLC 薄層層析
DCM 二氯甲烷
DMA 二甲基乙醯胺
DMF 二甲基甲醯胺
DMSO 二甲基亞碸
ee 鏡像異構物過量值
EI 電子撞擊游離(MS中)
ent 鏡像異構物/鏡像異構上純的
eq 當量
ESI 電子噴灑游離(MS中)
EtOAc 乙酸乙酯
GC-MS 氣相層析-結合質譜
% by weight 重量百分比
h 小時
HPLC 高壓高效項液相層析
ID 內徑
iPrOAc iPrOH conc. 乙酸異丙酯 異丙醇 濃(度)
LC-MS 液相層析-結合質譜
LDA 二異丙基醯胺鋰
LiHMDS 雙(三甲基矽基)醯胺鋰
min 分鐘
MS 質譜
MTBE 2-甲氧基-2-甲基丙烷
NMR 核磁共振光譜
NMP N-甲基-2-吡咯酮
Ph 苯基
pTsOH Rf 對-甲苯磺酸 保留指數(TLC中)
RP-HPLC 逆相高效液相層析
RRT 相對滯留時間
Rt 滯留時間
RT 室溫
TESCl 氯三乙基矽烷
THF 四氫呋喃
v/v 體積對體積比率(溶液)
aq. 水性，水溶液
Tinternal 內部溫度
Tsheath 護套溫度
分析方法 DSC/TG
使用來自Perkin-Elmer的差示掃描量熱儀(型號DSC7，Pyris-1或Diamond)記錄DSC溫譜圖。使用非氣密鋁盤以20 Kmin-1的加熱速率進行測量。流動氣體為氮氣。無樣本製備。
使用來自Perkin-Elmer的熱天平(型號TGA7和Pyris 1)記錄TGA溫譜圖。使用開放式鉑金盤以10 Kmin-1的加熱速率進行測量。流動氣體為氮氣。無樣本製備。 XRPD
於室溫使用XRD-繞射儀X`Pert PRO (PANalytical)和STOE STADI-P(輻射Cu Kα1，波長1.5406 Å)記錄X光繞射圖。無樣本製備。所有X光反射均以°2Ɵ(theta)值(峰值最大值)表示，解析度±0.2°。 拉曼(Raman)
使用來自 Bruker的FT-Raman-拉曼分光光譜儀(型號RFS 100和MultiRam)於室溫記錄拉曼光譜。解析度為2 cm-1。測量係於玻璃瓶或鋁盤中進行。無樣本製備。 IR
IR-ATR光譜係於室溫使用來自Bruker 的FT-IR分光光譜儀Tensor 37和通用金剛石ATR裝置所記錄。解析度為4 cm-1。無樣本製備。 LC-MS法 方法A
儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC System；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 50 x 1 mm；溶析液A：1 l Wasser + 0.25 ml 99%ige甲酸，溶析液B：1 l乙腈+ 0.25 ml 99 %ige 甲酸；梯度：0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A 烘箱：50°C；流速：0.40 ml/min；UV-偵測：210 nm。. HPLC法 方法B
高效液相層析配置有恆溫管柱烘箱、UV偵測器和數據評估系統，測量波長206 nm，帶寬：6 nm，烘箱溫度30℃，管柱：chiralpak AD-H，長度：250 mm，內徑： 4.6 mm，粒度：5 μm，移動相：A：正庚烷，B：乙醇+0.1%二乙胺，梯度程序：開始1 ml/min 70%溶析液A，30%溶析液B；12 min 1 ml/min 40%溶析液A，60%溶析液B。樣本溶劑：乙醇+0.1%二乙胺，試驗溶液：約1.0 mg/ml的物質，溶於樣本溶劑，注射量：5 μl RT：鏡像異構物1：5.8 min (RRT 1.00)，鏡像異構物2：7.2 min RRT1.25 方法C
高效液相層析配置有恆溫管柱烘箱、UV偵測器和數據評估系統，測量波長204 nm，帶寬：6 nm，烘箱溫度45℃，管柱：chiralpak AD-H，長度：250 mm，內徑： 4.6 mm，粒度：5 μm，移動相：A：正庚烷，B：乙醇+0.2%三氟乙酸+0.1%二乙胺，梯度程序：1.5 ml/min 60%溶析液A，40%溶析液B；樣本溶劑：乙醇，試驗溶液：約1.0 mg/ml的物質，溶於樣本溶劑，注射量：10 μl RT：鏡像異構物1：2.9 min RRT 1,00，鏡像異構物2：3.7 min RRT1.28 方法L
裝置類型MS：Waters Synapt G2S；裝置類型UPLC：Waters Acquity I-CLASS；管柱：Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 µm；溶析液A：1l水+0.01%甲酸；洗脫液B ：1 l乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0 min 2% B → 2.0 min 2% B → 13.0 min 90% B → 15.0 min 90% B；烘箱：50°C；流速：1.20 ml/min；UV偵測：210 nm 方法M
高效液相層析配置有恆溫管柱烘箱、UV偵測器和數據評估系統，測量波長226 nm，帶寬：40 nm，烘箱溫度30℃，管柱：Zorbax Bonus-RP，長度：150 mm，內徑：3.0 mm，粒度：3.5 μm，移動相：A：水+0.1% TFA，B：ACN + 0.1% TFA/甲醇=2+1，梯度程序：0.0 min 50% B → 12.0 min 70% B → 17.0 min 90% B → 25.0 min 90% B；流速：0.60 ml / min；樣本溶劑：異丙醇+0.1%二乙胺，試驗溶液：約35 mg的物質溶於25 ml CAN並以水+0.1% TFA加滿至50 ml(0.7 mg/mL)，注射體積：3 μl 新方法M
高效液相層析配置有恆溫管柱烘箱、UV偵測器和數據評估系統，測量波長226 nm，帶寬：40 nm，管柱：XBridge Phenyl 長度：50 mm，內徑：4.6 mm，粒度：2.5μm；管柱溫度：22°C；移動相：A：緩衝液pH7 (0.66 g/L (NH 4) 2HPO 4和0,58 g/L NH 4H 2PO 4)；B：CAN；梯度程序：0.00 min = 95% A，5% B；t 8.3-11 = 20% A，80% B；流速：1.2 mL/min.；UV-燈：210 nm 方法N
高效液相層析配置有恆溫管柱烘箱、UV偵測器和數據評估系統，測量波長210 nm，管柱：XBridge Phenyl 長度：50 mm，內徑：4.6 mm，粒度：2.5 μm；管柱溫度：22°C；移動相：A：0.66 g (NH 4) 2HPO 4和0.58 g (NH 4)H 2PO 4溶於1 l純水；B：CAN，梯度程序：0.00 min 95% B → 8.3 min 80% B → 11.0 min 80%；流速：1.2 ml/min；樣本溶劑：ACN+水，注射體積：3 µL。 A–化學品實例 起始物和中間物 實例1A (5S)-5-([2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]{2-[4-(甲氧基羰基)苯基]乙基}胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧基酯(鏡像異構物2)
根據WO 2014/012934實例92A中所揭示的製程，合成該化合物。 實例2A (5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-羥苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯
根據WO2021/233783實例10中所揭示的製程，合成該化合物。 實例 3A(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4‘-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯
根據WO2021/233783實例11中所揭示的製程，合成該化合物。
另一起始物4-(溴甲基)-3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯](式XI之化合物)係從市面上購得。 實例4A 萘-1,5二磺酸-丁基-(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸酯(1：1)加合物
於一3L燒瓶中，將889.1 g(1.06 mol)的(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯(油)溶於1850 ml的四氫呋喃。於室溫加入304.6 g (1.06 mol)的萘-1,5-二磺酸，攪拌混合物直到其完全溶解。隨後，將溶液於旋轉蒸發器上於40°C濃縮。將殘餘物(固體)在真空乾燥箱內於40°C氮氣流中乾燥成1126.3 g。 產率(粗產物)：1126.3g；94.4%之理論產率 鏡像異構物純度(HPLC方法B)：95.3% ee 純度(面積)：81.8%(方法N)，Rt 16.11 (BP-Diester)) 實例4B至4E 以不同的酸形成(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4‘-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯之穩定鹽類的試驗 4B ：加入 (+)- 二 - 對 - 甲苯甲醯基 -D- 酒石酸
將4 g(0.005 mol)的(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯(油)於50°C的溫度逐漸溶於總量75 ml的甲醇中。加入溶於2.5 ml甲醇之1.8 g (0.005 mol)(+)-二-對-甲苯甲醯基-D-酒石酸。最後將混合物攪拌過整個周末。
於較小部分的反應混合物中加入不同的溶劑引發結晶。試過以下溶劑均無效果：MTBE、MIBK、甲基氯化物、甲苯。加入環己烷、正己烷和甲基環己烷混合物後形成二層。
將幾滴反應混合物於錶玻璃上乾燥並將所生成的乾燥團塊刮下及最終在環己烷、正己烷和甲基環己烷的混合物中攪拌。生成的固體熔化了。
用甲基環己烷，有一固體分離出。固體的HPLC分析顯示為酒石酸。
在將水加入另一部分的反應混合物後，有一固體分離出。該固體難以分離。
將反應混合物脫去溶劑。得到3.1g淡黃色泡沫晶體。
於泡沫晶體中加入31 ml的甲基環己烷並攪拌4小時。得到2.8 g淺黃色固體。
無定義的鹽可偵測出。 4C ：加入三氟乙酸 (=TFA)
將0.21 g (0.2 mmol)的(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯(油)溶於2 ml的乙腈。加入0.1 ml的TFA。形成一橙色溶液。真空蒸發溶劑，得到一橙色油狀物。
無觀察到鹽形成。 4D ：加入甲磺酸
將0.26 g(0.3 mmol)的(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯(油)溶於1.5 ml的二氯甲烷。加入20.1 µl的甲磺酸。形成一橙色溶液。於室溫攪拌1小時後無結晶。
於40°C真空蒸發溶劑，得到黃色泡沫晶體。
篩選數種溶劑用以引發結晶化或純化。
二氯甲烷、MIBK、MTBE、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二㗁烷、正丁醇、甲醇、乙醇、四氫呋喃、甲苯在室溫下形成溶液。
異丙醚、水、乙醚、環己烷產生黏稠團塊。
進一步於室溫於正己烷中攪拌，再次產生黏稠團塊。
無鹽可分離出。 4E ：加入樟腦磺酸
將0.29 g(0.34 mmol)的(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯(油)溶於1.5 ml的二氯甲烷。加入80.05 µg的樟腦磺酸。形成一橙色溶液。
於40°C真空蒸發溶劑，得到黃色泡沫晶體。
篩選數種溶劑用以引發結晶化或純化。
二氯甲烷、MIBK、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二㗁烷、正丁醇、甲醇、乙醇、四氫呋喃、甲苯在室溫下產生溶液。
MTBE添加造生油滴形成。
水、異丙醚、乙醚、環己烷和正庚烷全不僅得到黏稠團塊
無鹽可分離出。 實例 5A 和實例 6A5-{(第三丁氧基羰基)[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯(鏡像異構物1和2)
將15 g(21.42 mmol)的外消旋5-{(第三丁氧基羰基)[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)­聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯(實例22A)藉由超臨界流體層析(SFC)於對掌相上分離成鏡像異構物[管柱：Chiralpak OD-H, 20 µm, 400 mm x 50 mm；移動相：二氧化碳/異丙醇70：30 (v/v)；流速：400 ml/min；壓力：80 bar；UV偵測：220 nm；溫度：37°C]： 實例5A(鏡像異構物1)： 產率：5830 mg Rt = 2.83 min；化學純度＞99.9%；＞99% ee [管柱：Chiralpak OD-H, 5 µm, 250 mm x 4.6 mm；移動相：二氧化碳/異丙醇 70：30 (v/v)；流速：3 ml/min；UV偵測：210 nm]. 實例6A (鏡像異構物2)： 產率：6330 mg Rt = 5.30 min；化學純度＞99%；＞98% ee [管柱：Chiralpak OD-H, 5 µm, 250 mm x 4.6 mm；移動相：二氧化碳/異丙醇 70：30 (v/v)；流速：3 ml/min；UV偵測：210 nm]。 實例 7A5-{[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯二鹽酸鹽(鏡像異構物1)
將以另外2240 ml的二㗁烷稀釋之3208 ml溶於二㗁烷的4 N氯化氫溶液加入455 g (641.56 mmol)的5-{(第三丁氧基羰基)[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯(鏡像異構物1，實例1A)，並將混合物於室溫攪拌至隔夜。然後將反應混合物濃縮至乾並於高真空下將殘餘物乾燥至隔夜。由此得到448.7 g (641.59 mmol，約100%之理論值)的目標產物。 LC-MS(方法A)：Rt = 1.06 min；m/z = 609/611 (M+H)+. 實例 8A5-{[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯(鏡像異構物1)
將448.7 g (641.59 mmol)的5-{[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯二鹽酸鹽(鏡像異構物1，實例3A)以6869 ml的THF處理，加入268 ml的三乙胺，並將混合物於室溫攪拌1小時。然後濾出沉澱的氯化三乙銨晶體並以THF清洗。將得到的濾液蒸發至乾。將殘餘物溶於乙酸乙酯，以10%濃度的氯化鈉水溶液清洗二次，用硫酸鎂乾燥，過濾並再次蒸發至乾。由此得到391 g (620.59 mmol，理論值之97%)的目標化合物。 LC-MS (方法A)：Rt = 1.08 min；m/z = 609/611 (M+H)+. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm)：1.27 (t, 3H), 1.57-1.72 (m, 2H), 1.76-1.87 (m, 1H), 1.87-1.95 (m, 1H), 1.95-2.07 (m, 1H), 2.65-2.88 (m, 6H), 3.75 (br. s, 1H), 4.28 (q, 2H), 5.19 (s, 2H), 6.92 (t, 1H), 7.08 (d, 1H), 7.16-7.26 (m, 2H), 7.65-7.77 (m, 3H), 7.84 (d, 3H), 7.89 (s, 1H), 7.95 (d, 2H). 實例 9A5-([2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]{2-[4-(甲氧基­羰基)苯基]乙基}胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯(鏡像異構物1)
將378 g (620.59 mmol)的5-{[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]­甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯(鏡像異構物1，實例4A)、360 g (1241.19 mmol)的4-(2-碘乙基)苯甲酸甲酯和98.66 g (930.89 mmol)的無水碳酸鈉溶於8191 ml無水乙腈之懸浮液於110°C的浴溫攪拌至隔夜。然後另再加入360 g (1241.19 mmol)的4-(2-碘乙基)苯甲酸甲酯和128.65 g (930.89 mmol)的碳酸鉀粉末，並將混合物另再加熱回流72 h。冷卻反應混合物後，濾出無機鹽並將得到的濾液蒸發至乾。將所生成的殘餘物以乙酸乙酯處理，以10%濃度的氯化鈉水溶液洗清二次，用硫酸鎂乾燥，過濾，然後再次蒸發至乾。將所得到的殘餘物分成二份於矽膠(9 kg)上層析純化(移動相：石油醚/乙酸乙酯8：2→7：3)。由此得到397 g(551.32 mmol，理論值之89%)的目標化合物。 LC-MS (方法A)：Rt = 1.67 min；m/z = 771/773 (M+H)+. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm)：1.27 (t, 3H), 1.37-1.52 (m, 1H), 1.52-1.67 (m, 1H), 1.85-1.96 (m, 1H), 1.96-2.05 (m, 1H), 2.56-2.80 (m, 10H), 3.81 (s, 3H), 3.97-4.09 (m, 1H), 4.26 (q, 2H), 5.07 (m, 2H), 6.87 (t, 1H), 7.01-7.16 (m, 4H), 7.23 (t, 1H), 7.35-7.48 (m, 2H), 7.53 (d, 1H), 7.61 (d, 1H), 7.74 (d, 2H), 7.77-7.89 (m, 5H). 比較實例 比較實例11 (5S)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸
將2450 mg(3.18 mmol)的(5S)-5-([2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]{2-[4-(甲氧基羰基)苯基]乙基}胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯(實例1A，鏡像異構物2)溶於25 ml的二㗁烷，加入9.5 ml的1N氫氧化鈉水溶液，及然後將混合物於室溫攪拌至隔夜。反應完成後，於旋轉蒸發器上移除二㗁烷，並將剩餘的混合物以約50 ml的水稀釋。然後使用乙酸將混合物酸化至pH 4-5。抽氣過濾出沉澱的固體並以水重複清洗(總共約50 ml的水)。 然後將固體以50 ml水處理並於室溫攪至隔夜。再次抽氣過濾後，再次以水清洗固體，及然後於40°C高真空下乾燥至隔夜。由此得到標題化合物2300 mg (2.9 mmol，93%純度，含有未知量的單鈉鹽，具有相同的滯留時間)。 LC-MS (方法A)：Rt = 1.37 min；m/z = 729/731 (M+H)+. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ [ppm] = 1.38-1.71 (m, 2H), 1.84-2.08 (m, 2H), 2.59-2.84 (m, 10H), 3.97-4.11 (m, 1H), 4.99-5.16 (m, 2H), 6.87 (t, 1H), 7.05 (br. d, 2H), 7.12 (br. d, 2H), 7.23 (br. t, 1H), 7.38-7.48 (m, 2H), 7.54 (d, 1H), 7.62 (d, 1H), 7.71-7.91 (m, 7H), 11.90-13.60 (br. s, 約2H). XRPD：非晶相，參見圖33
經由VCD光譜法測定比較實例11之絕對組態：
振動圓二色性(VCD)為一測定對掌分子之絕對組態的既定方法(參見美國藥典公約(USP)和國家處方集(USP-NF)，第二增刊USP-NF 34，第782章和1782，2016年6月1和VCD之絕對組態，白皮書BioTools，2017)。
涉及測定的步驟係如下： 1.   使用DMSO測量實驗的VCD光譜。實例1的樣本係於5.5 mg/0.15 ml之濃度所測。 2.  其中一種鏡像異構物的VCD係使用Gaussian09TM(市售套裝軟體)全始記算法算(ab initio calculations)所計算。然後藉由反轉所有頻帶的訊號或計算鏡像結構的VCD，得到其他鏡像異構物的VCD光譜。 3.   最後的步驟為實驗光譜與二個計算光譜之比較，用以確定在信號和訊號強度之間得到最佳相關性的鏡像異構物。可使用CompareVOA™軟體計算二個此類光譜之間重疊的信賴程度。 VCD光譜儀：ChirallR-2X w/DualPEM 濃度：5.5 mg/0.15 ml之實例1溶於DMSO 解析度：4 cm-1 PEM設定：1400 cm-1 掃描次數/測量時間：20小時 樣本槽：BaF2 徑長：100 　m 計算詳情： Gaussian版本：Gaussian 09 用於波茲曼總和(Boltzman sum)的總低能量構象異構物：92 DFT計算之方法和基組：B3LYP/6-31G(d) 計算的絕對組態：S 比較實例11之絕對組態，以VCD光譜的一致性為基礎，被分派為(S)-鏡像異構物。分派的信賴程度為94%。 測定比較實例11之熱穩定性：
將 0.3 mg的比較實例11溶於0.1 ml二甲基亞碸和0.4 ml乙腈中。然後加入1.0 ml水。震盪HPLC小瓶並以超音波處理以便完全溶解。將此溶液立即以HPLC分析(t0時之參照)。於另一HPLC小瓶中秤取0.3 mg的試驗化合物。將小瓶加蓋並於90°C的加熱板塊中儲存7天。
此段時間過後，打開小瓶的蓋子，並將0.1 ml二甲基亞碸和0.4 ml乙腈加入壓力化合物中。然後加入1.0 ml水。震盪HPLC小瓶並以超音波處理以便完全溶解。以HPLC分析樣本(1週後的樣品)。使用以百分比表示的波峰面積進行定量。 表 11 ：
HPLC-法
溶析液： A= 5 ml HClO 4/L水 B= ACN 梯度： 時間(min.) %B 流速 (mL/min.)
管柱： Nucleodur 100 C18ec 3µm 50*2mm 0,00 2,0 0,750
溫度： 30 °C 1,00 2,0 0,750
UV WL.： 210 nm 9,00 98,0 0,750
HPLC流： 0,750 mL/min. 13,00 98,0 0,750
13,50 2,0 0,750
15,00 2,0 0,750
發現比較實例11在試驗期間為穩定的。
此外，WO 14/012934-A1中揭示的數個實例僅顯示有限的熱穩定性(於90°C，7天)：例如實例2(實驗部分比較例實例5)，實例24(實驗部分比較例6)，實例25(實驗部分比較例7)，實例28(實驗部分比較例8)，實例29(實驗部分比較例9)和實例31(實驗部分比較實例10)。 比較實例12 (5R)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(鏡像異構物1)
將291 g (377.29 mmol)的5-([2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]{2-[4-(甲氧基羰基)苯基]乙基}胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸乙酯(鏡像異構物1，實例5A)溶於3000 ml的二㗁烷，加入1132 ml的1N氫氧化鈉水溶液及然後將混合物於室溫攪拌至隔夜。反應完成後，於旋轉蒸發器上移除二㗁烷，並將剩餘的混合物以約6000 ml的水稀釋。然後使用乙酸將混合物酸化至pH 4-5。抽氣濾出沉澱的固體並以水重複清洗(總共約3000 ml水)。然後使用乾燥劑五氧化二磷於室溫在高真空下將固體乾燥3天。然後移除乾燥劑並將固體於40℃另再乾燥48 h。由此，得到249 g (342.15 mmol，理論值之91%)的標題化合物。 LC-MS (方法A)：Rt = 1.33 min；m/z = 729/731 (M+H)+. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ [ppm] = 1.37-1.66 (m, 2H), 1.84-2.05 (m, 2H), 2.56-2.81 (m, 10H), 3.98-4.08 (m, 1H), 5.01-5.14 (m, 2H), 6.87 (t, 1H), 7.05 (d, 2H), 7.12 (d, 2H), 7.23 (t, 1H), 7.39-7.47 (m, 2H), 7.54 (d, 1H), 7.62 (d, 1H), 7.71-7.90 (m, 7H), 11.60-13.85 (br. s, 約2H).
比較實例11的絕對組態經確定為(5S)，為比較實例12之對應絕對組態，應是相反物，亦即(5R)。 比較實例13 (5R)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單鈉鹽(鏡像異構物1)
於一容器中裝入60 g非晶(5R)-5-([2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]{2-[4-(甲氧基羰基)苯基]乙基}胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸酯(比較實例12)和800 g丙酮。將容器加熱至回流溫度。在冷卻至室溫後，將回流溫度下所形成的固體過濾出。 產率：8 g的乾燥產物，理論值之13% 鏡像異構物純度(HPLC方法C)：100% ee (ICP)：鈉含量：3.1%鈉 比較實例14 (5R)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物II(鏡像異構物1)
將174.2 g比較實例12與2003.3 g丙酮於回流下攪拌。將混合物冷卻至20℃並濾出不溶性固體(乾燥後19.5 g)。於濾液中加入273 g丙酮，將其加熱至57°C，並加入1101.4 g水和0.4 g單水合物II，R鏡像異構物的晶種(從類似本製程之小規模前實驗所製備)。另再加入1101.4 g水，並將其於室溫攪拌至隔夜。濾出產物並於55℃真空(30 mbar)下乾燥至143.8 g。
從根據相同製程所製備的21.0 g比較實例12另外得到20.3 g。
將固體合併為164.1 g，並將161.0 g的此等固體與1993.0 g丙酮於回流下攪拌。在此溫度下，加入930.0 g水和0.8 g單水合物II，R鏡像異物之晶種(從類似本製程之小規模前實驗所製備)並將其冷卻至50°C。另再加入200.0 g水和400.0 g丙酮用以改善可攪拌性。將其於50℃攪拌1h，加入1263.0 g水，將其攪拌30 min，於2h內冷卻至20℃並於室溫攪拌至隔夜。濾出產物並於55℃真空(30 mbar)下乾燥至154.4 g。
將一部分固體(95.0 g)在40℃溶於916.7 g丙酮中，冷卻至室溫並將溶液過濾澄清。加入170.1 g水，30 min後加入單水合物II，R鏡像異構物的晶種(從類似本製程之小規模前實驗所製備)並攪拌至隔夜。將稀懸浮液加熱至50°C，將所生成的溶液冷卻至室溫，接種單水合物II，R鏡像異物的晶種(從類似本製程之小規模前實驗所製備)並攪拌過夜。濾出固體，以76.0 g丙酮和19.0 g水(8：2)之混合物清洗並抽氣乾燥至68.4 g。
將濾液於40℃/250至15 mbar濃縮並濾出沉澱的固體。於55℃將28.2 g固體溶於157.2 g丙酮水混合物(9：1 w/w)，冷卻至15℃。加入10 g水後，將其接種單水合物II，R鏡像異構物的晶種(從類似本製程之小規模前實驗所製備)，並於15°C攪拌至隔夜。將懸浮液加熱至50°C，攪拌30 min並在4 h內冷卻至20°C。在1 h內再次加熱至50°C，於4.5 h內冷卻至15°C，並於15°C攪拌至隔夜。濾出固體，以28 g的丙酮水(8：2 w/w)混合物清洗並抽氣乾燥至20.6 g。
將固體合併為87.0 g的目標化合物。 鏡像異構物純度(HPLC 方法C)：99.8%ee 純度(方法M，面積)：99.7%，Rf 9.33 min XRPD：單水合物II 實例 實例 1(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}­苯基)­乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物II(晶種) (I-M-II)
將2.0 g的式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(類似比較實例11所製造)溶於16.2 g丙酮和1.8 g水(8：1混合物)，再加入1.8 g水。將澄清溶液攪拌至隔夜並在1.5 h後開始結晶。抽氣過濾出固體，以2 g丙酮/水(8：2)清洗並於60℃以氮氣真空乾燥至隔夜： 產率：1.5 g的白色固體，理論值之75% XRPD：單水合物II，X-光粉末繞射圖係如圖34中所示。
反射(最大波峰[°2θ]
5.7
6.1
7.1
8.5
9.4
9.9
10.2
10.8
11.4
11.6
11.7
12.2
12.7
13.0
13.9
14.2
14.5
15.1
15.3
15.7
15.9
16.1
16.4
17.1
17.3
17.7
17.9
18.3
18.5
18.7
19.1
19.7
19.8
20.2
20.4
20.8
21.1
21.2
21.6
22.0
22.3
22.8
23.0
23.4
23.8
24.2
24.4
24.4
25.1
25.5
26.2
26.4
27.1
27.4
27.7
28.0
28.5
28.9
29.2
29.5
29.7
30.0
30.4
30.6
31.2
31.6
32.2
32.4
32.8
實例2 (5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸為單水合物II (路徑3，從丙酮、甲醇和水結晶)
將1067 g的四氫呋喃置入6 L玻璃攪拌裝置並於攪拌下分次加入333 g(0.396 mol)的萘-1,5-二磺酸-丁基(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸酯(1：1)加合物(實例4A)。於20°C至25°C加入1335 ml水，然後加入氨水(27%)，直至達到7.8至8.2的pH值(約46克)。加入1440 g異丙醚，分離出水相，以1335 ml水/1 ml 27%氨水再次清洗有機相及然後以1335 ml水清洗。將有機相經由覆蓋200 g硫酸鈉(無水)的Seitz濾板過濾，以200 g異丙醚沖洗，並將濾液於40°C真空濃縮，得到267 g的蒸發殘餘物。
將蒸發後的殘餘物溶於848 g二㗁烷中，加入1583 g的1N氫氧化鈉溶液並將混合物於60℃攪拌5.5 h。然後於20°C加入1480 g乙酸乙酯，分離出水性產物層(二鈉鹽溶液)，以1480 g乙酸乙酯清洗，並於最高40°C真空中蒸餾出殘餘的乙酸乙酯。將殘餘物以2500 g水稀釋，將一部分的二鈉鹽溶液(1178 g)逐滴加到1095 g的四氫呋喃和137g 10%的鹽酸之混合物中，直至達到4.0之pH。
二鈉鹽溶液的消耗量與提交的鹽酸量有關，並計算用於另外部分量轉化之鹽酸量。將第二份二鈉鹽溶液(1789 g)逐滴加到計算量的四氫呋喃(1789 g)和10%濃度的鹽酸(208 g)中，直至達到4.0的pH。
將第三份二鈉鹽溶液(1510 g)逐滴加到計算量的四氫呋喃(1505 g)和10%濃度的鹽酸(175 g)中，直至達到4.0的pH。
將合併的有機相於最高40°C於真空中濃縮，直到無溶劑的水凝結於回流冷凝器上。抽氣過濾出沉澱的固體並以750 g的水清洗。
使用相同的製程，根據上述製程轉化第二和第三部分各333 g的萘-1,5-二磺酸-丁基(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-chloro-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸酯(1：1)加合物(實例4A)。
將合併的濕產物於60°C在氮氣流中在真空下乾燥，得到587 g(約理論值之91%)的式I之目標化合物。 結晶：
將固體(587 g)與3674 g丙酮和470 g水之混合物加熱至50°C。將所得到的溶液經由Seitz濾板過濾並加熱至40℃。將濾液與1.5 g的(5S)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物II(實例1)之晶種混合，在2 h內冷卻至20°C，攪拌0.5 h並於2 h內再次加熱至50°C。將混合物攪拌0.5 h，於3 h內冷卻至20°C，攪拌0.5 h並在2 h內再次加熱至50°C。在3 h內將其冷卻至20°C，攪拌0.5 h並抽氣過濾出固體。以800 g丙酮和90 g水之混合物清洗濕產物，並於25°C在氮氣流中於真空下乾燥至361 g的恆重。
品質的製程中控制和所接收產物的變體不符合要求。因此，再次重結晶。
將固體(361 g)與1949 g丙酮和217 g水之混合物加熱至50°C。將得到的溶液經由Seitz濾板過濾並加熱至50℃。將其與1.5 g的(5S)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物II(實例1)之晶種混合，在3 h內冷卻至20°C，攪拌0.5 h並於3 h內再次加熱至50°C。將混合物攪拌0.5 h，於3 h內冷卻至20°C，攪拌0.5 h並在3 h內再次加熱至50°C。在3 h內將其冷卻至20°C，攪拌0.5 h並抽氣過濾出固體。將濕產物於25°C在氮氣流中於真空下乾燥至271 g的恆重。
製程中控制確認了足夠的品質，但並非所得到產物之所欲的變體。因此，再次重結晶。
將固體(271 g)與1668 g丙酮和75 g水之混合物加熱至50°C。將得到的溶液經由Seitz濾板過濾並加熱至50℃。將其冷卻至45°C，與1.5 g的(5S)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物II(實例1)之晶種混合，在3 h內冷卻至20°C，攪拌0.5 h並於1小時內加熱至40°C。將懸浮液攪拌0.5 h，於3 h內冷卻至20°C並攪拌，以抽氣過濾出固體。將濕產物於25°C在氮氣流中於真空下乾燥至恆重。
製程中控制確認了足夠的品質，且產物之變體符合要求。 產率：117 g單水合物II；理論產率之18% 鏡像異構物純度(HPLC 方法C)：99.6% ee 純度(面積)：99.8% (方法M，Rt 9.33 min) XRPD：單水合物II，X-光粉末繞射圖係如圖35中所示。 微粉化後： 鏡像異構物純度(HPLC 方法C)：100.0% ee 純度(面積)：99.7% (方法M，Rt 9.35 min) XRPD：單水合物II帶有部分非晶化，X-光粉末繞射圖係如圖36中所示。 微粉化前之單水合物II：參見圖35
反射(最大波峰[°2θ]
5.7
6.1
6.3
7.1
8.5
9.9
10.1
10.2
10.8
11.4
11.6
11.8
12.2
12.7
13.0
13.9
14.3
14.5
15.1
15.3
15.7
15.9
16.2
16.4
17.1
17.3
17.7
17.9
18.3
18.5
18.8
19.2
19.8
20.3
20.5
20.8
21.1
21.3
21.6
22.0
22.4
22.8
23.1
23.3
23.5
23.8
24.2
24.5
25.1
25.4
25.6
26.2
26.4
26.7
27.1
27.4
27.7
28.1
28.3
28.5
28.9
29.2
29.5
29.8
30.0
30.6
30.7
31.2
31.7
32.2
32.4
32.8
34.8
35.3
36.3
微粉化後之單水合物 II( 部分非晶化 ) ，圖 36
反射(最大波峰[°2θ]
5.7
6.1
7.1
8.5
9.9
10.1
10.8
11.5
11.6
12.2
12.7
13.0
13.9
14.2
15.2
15.3
15.7
16.4
17.2
17.3
17.7
18.0
18.3
18.5
18.8
19.1
19.8
20.2
20.8
21.1
21.3
21.6
22.1
22.4
23.1
23.4
23.5
23.9
24.3
24.5
25.2
25.4
25.6
26.3
27.1
27.5
28.9
29.5
30.6
32.4
實例 3(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}­苯基)­乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I(晶種)
將2.0 g式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(類似比較實例11所製造)溶於8.1 g甲醇和1.8 g水中，加入8.1g丙酮和另外1.8 g水。攪拌至隔夜。抽氣過濾出固體，以2 g丙酮/水(8：2)清洗並於60℃以氮氣真空乾燥至隔夜。 產率：1.8 g的白色固體，理論值之90% 鏡像異構物純度(HPLC方法C)：92.0% ee 純度(面積)：97.3% (方法M，Rt 8.94 min) XRPD：單水合物I，參見圖37
反射(最大波峰[°2θ]
5.7
7.1
9.9
10.2
10.7
11.4
12.2
12.8
14.0
15.1
15.6
15.9
17.2
17.7
19.2
19.5
19.8
20.2
20.3
20.7
21.0
22.2
22.9
23.4
23.8
24.2
24.5
25.0
25.7
26.0
26.4
28.8
29.1
30.5
32.1
實例4 (5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸為單水合物I 從NSA鹽釋放二丁酯：
將800 g的四氫呋喃置入6 L玻璃攪拌中的裝置並於攪拌下分次加入250 g (0.30 mol)的萘-1,5-二磺酸-丁基-(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基)-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸酯(1：1)(實例4A)。於20°C至25°C加入1L水及然後加入27%的氨水，直至達到7.8至8.2之pH(約27g)。加入1080 g異丙醚，分離出水相，將有機相再次以1L水/0.8 ml 27%氨水萃取，及然後以1L水清洗。將有機相經由覆蓋150 g硫酸鈉(無水)的Seitz濾板過濾，以150 g異丙醚沖洗，並將濾液於40°C真空濃縮至192 g蒸發殘餘物。 二丁酯之皂化：
將蒸發殘餘物溶於610 g的四氫呋喃，加入1139g的1N氫氧化鈉溶液，並將混合物於60℃攪拌24h。然後於20℃加入875 g的乙酸乙酯，分離出水性產物相(二鈉鹽溶液)並於最高40℃真空蒸餾出殘餘的乙酸乙酯。 形成式I之游離酸：
將殘餘物以1875 g水稀釋，經由Seitz濾板過濾，並將一部分二鈉鹽溶液(835g)逐滴加到821 g四氫呋喃和103 g 10%鹽酸之混合物中直至達到4.0之pH值。加入174 g氯化鈉和420 g四氫呋喃並分離出有機產物相。
二鈉鹽溶液的消耗量與提交的鹽酸量有關，計算用於另外部分量轉化的鹽酸量。將第二份二鈉鹽溶液(2000 g)逐滴加到計算的四氫呋喃(2116 g)和10%濃度的鹽酸(246 g)之量中，直至達到4.0之pH。加入174 g的氯化鈉和420 g的四氫呋喃並分離出有機產物相。於組合的水相中加入261 g的氯化鈉和1043 g的四氫呋喃並分離出有機產物相。將組合的有機相於最高40°C真空濃縮至800 ml的殘餘量。 結晶：
加入184 g的四氫呋喃並於20°C攪拌下逐滴加入646 g的甲醇和291 g的水之混合物。將其與0.8 g的(5S)-5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯]-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I(實例3)混合並攪拌12 h。將固體分離出並以112 g甲醇和112 g水的混合物清洗。然後將固體於20℃真空乾燥至127 g。使用相同的製程製備第二部分128 g。
將組合的固體與1020 g的丙酮和1020 g的甲醇之混合物加熱至50°C，並冷卻至20°C。將得到的溶液經由Seitz過濾板過濾，加熱至50℃並在30 min內逐滴加入460 g的水。接種1.5克的單水合物I之晶種(實例3)，攪拌30 min，在至少30 min內冷卻至20℃，並抽氣過濾出固體。將濕產物與2550 g水一起攪拌12 h，然後抽氣過濾並以510 g的水清洗二次。將濕產物於20°C在氮氣流中真空下乾燥至恆重。 產率：230 g單水合物I，(I-M-I)；理論值之71% 純度(面積)：96.0% (方法M，Rt 8.94 min) 鏡像異構物純度(HPLC 方法C)：99.3% ee XRPD：單水合物I型；參見圖38
反射(最大波峰[°2θ]
5.7
6.9
7.2
7.4
9.9
10.7
11.1
11.5
12.0
12.2
12.4
12.8
13.7
14.1
14.3
15.2
15.6
16.0
16.9
17.2
17.5
17.7
18.0
18.4
18.8
19.1
19.9
20.3
20.5
20.7
20.9
21.3
21.9
22.2
22.5
23.0
23.2
23.4
23.7
24.1
24.4
25.1
25.8
26.1
26.5
26.8
28.8
29.4
30.0
30.6
31.0
32.2
35.4
實例5 (5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基) 聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸為單水合物I
在一惰化的2L反應器中，將(5S)-5-({2-[4-(丁氧基羰基)苯基]乙基}[2-(2-羥苯基)乙基]胺基)-5.67,8-四氫喹啉-2-羧酸丁酯(WO2021/233783的實例2A)於T護套=22°C(50.8g,1.0eq.)溶於乙腈(380mL)。在T護套=50°C和120 mbar蒸餾溶液。然後再次加入乙腈(380 ml)並在相同條件下再次蒸餾混合物。於溶液中加入乙腈(660 mL)並攪拌5 min。然後加入4-(溴甲基)-3-氯-4'-(三氟甲基)[聯苯](二芳基苯甲基溴)(53.5 g, 1.2 eq.)並將混合物再次攪拌5 min直至其溶解。然後加入碳酸銫(83.1 g，2.0 eq.)並將混合物攪拌4 h。再次將碳酸銫(20.8 g，0.5 eq.)加入到懸浮液中並將混合物攪拌1 h。將產物懸浮液藉由過濾來澄清化並將濾餅於壺上以乙腈(110 mL)清洗一次。將濾餅丟棄。
在90 mbar和T護套=45°C，將有機反應溶液於惰化2L反應器中濃縮，直到蒸餾物乾涸。當T護套=23°C時，加入THF(425 mL)。於150 mbar和T護套=45°C將溶液濃縮，直到蒸餾物乾涸。於溶液中加入THF(425 mL)和4% NaOH(680 mL)。將乳液加熱至T內部=60°C並另再攪拌20小時。
將溶液冷卻至T內部=23°C，加入去離子水(800 ml)和乙酸乙酯(435 ml)，並將混合物攪拌15 min。分離各相。將有機相丟棄並以乙酸乙酯(435 mL)萃取水相。丟棄有機相並在140-160 mbar和T護套=45至40°C至T內部=36°C蒸餾水相。藉由過濾將產物溶液澄清化並以去離子水(80 mL)清洗濾餅一次。將殘餘物丟棄。
滴定產物溶液。就此目的，係將25% HCl、去離子水和THF放入惰化4公升反應器中。在T內部=20°C ± 5°C加入有機產物溶液直至pH 3.8至4.2。然後加入THF(360 mL)和氯化鈉(471 g)並將混合物攪拌30 min。分離各相並以THF(450mL)萃取水相。丟棄水相並將有機相結晶。就此目的，係將其在200 mbar和ΔT=30°C濃縮至匯集量。然後加入THF並在相同條件下將混合物再次蒸餾至理論產量的4倍。在T內部=22°C，計量加入去離子水(49 mL，49g)和甲醇(144 ml，114g)的混合物，接種並攪拌15 min。另再計量加入去離子水(113 ml，113g)和甲醇(335 mL，265g)的混合物並將混合物攪拌至隔夜。將懸浮液過濾並將產物在壺上以去離子水和甲醇(1：1)的混合物清洗一次。然後將其於40至50°C和40至30 mbar下乾燥。 產率：23.4 g，理論值之67% 純度(面積)：99.3%(新方法M，Rt 6.28) XRPD：單水合物I，參見圖39 實例 6調查式I之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之晶體/多晶型的研究 實例 6a(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸半水合物
將2.9 g(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I(類似實例3/4所製備的物質)懸浮於20 ml的丙酮。在環境條件下將懸浮液攪拌三天。過濾殘餘物並將所生成的固體於環境條件下乾燥。 水含量：1.5 %水 拉曼：參見表13，參見圖12 IR：參見表14，參見圖19 XRPD：參見表12，參見圖5 實例 6b(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I
類似實例3製備目標化合物(單水合物I)。 水含量：乾燥前3.9%，乾燥後2.4% 拉曼：參見表13，參見圖13 IR：參見表14，參見圖20 XRPD：參見表12，參見圖6 實例 6c(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}­苯基)­乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物II
類似實例1製備目標化合物(單水合物II)。 水含量：乾燥前3.9%，乾燥後2.4 % 拉曼：參見表13，參見圖14 IR：參見表14，參見圖21 XRPD：參見表12，參見圖7 實例 6d(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸1.25水合物
將3 g(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I(類似實例3/4所製備的物質)懸浮於20 mL的異丙醇/水混合物(1：1)。將懸浮液於60°C攪拌8天。將殘餘物過濾並將生成的固體於環境條件下乾燥。 水含量：2.9%水 拉曼：參見表13，參見圖15 IR：參見表14，參見圖22 XRPD：參見表12，參見圖8 實例 6e(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸倍半水合物
將3 g(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I(類似實例3/4所製備的物質)懸浮於15 mL的異丙醇/水混合物(1：1)。將懸浮液於80°C攪拌4周。加入另外10 mL的溶劑混合物，用以改善懸浮液的攪拌性質。將殘餘物過濾並將生成的固體於環境條件下乾燥。 水含量：3.7%水 拉曼：參見表13，參見圖16 IR：參見表14，參見圖23 XRPD：參見表12，參見圖9 實例 6f(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸二水合物
將3 g(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I(類似實例3/4所製備的物質)懸浮於20 mL的甲醇。將懸浮液於環境條件攪拌8天。將殘餘物過濾並將生成的固體於環境條件下乾燥。 水含量：4.8%水 拉曼：參見表13，參見圖17 IR：參見表14，參見圖24 XRPD：參見表12，參見圖10 乾燥後二水合物形式變為非晶形 XRPD：非晶型，參見圖10a 實例 6g(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸
類似比較實例11製備非晶型。 拉曼：參見表13，參見圖18 IR：參見表14，參見圖25 XRPD：參見表12，參見圖11 式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之多晶型的物理特徵
表12：式(I)化合物之假多晶形式的XRPD(X-光粉末繞射)數據
XRPD係根據標題方法下所述的通用製程所記錄。 表 12 ：
反射(最大波峰)[2θ]
半水合物 單水合物I 單水合物II 1,25-水合物 倍半水合物 二水合物
3.1 5.7 5.7 5.9 5.1 6.1
5.3 6.9 6.1 6.1 6.3 6.8
6.7 7.2 7.1 7.9 7.6 10.1
7.1 7.3 8.5 10.5 8.6 10.5
9.3 9.9 9.9 11.9 11.4 11.2
10.6 10.4 10.2 12.2 12.2 11.3
12.4 10.6 10.8 12.5 12.5 12.3
14.3 11.1 11.4 13.2 12.9 12.5
16.1 11.5 11.6 13.6 13.3 13.1
19.7 12.0 11.8 13.7 14.3 13.6
20.8 12.3 12.0 14.4 14.5 14.6
24.0 12.4 12.2 15.2 15.2 14.8
31.1 12.8 12.7 15.3 15.5 15.5
13.7 13.0 15.4 15.8 16.2
14.1 13.9 15.7 16.2 16.4
14.3 14.2 15.9 16.4 16.8
15.2 15.2 16.5 16.7 17.1
15.6 15.3 16.9 17.3 17.3
16.0 15.7 17.2 17.5 17.9
16.9 16.4 17.4 17.7 18.5
17.2 17.3 17.6 18.3 18.8
17.5 17.7 17.8 18.7 19.5
17.7 17.9 18.3 19.4 20.2
18.0 18.3 18.6 20.5 20.5
18.4 18.5 18.7 20.7 21.1
18.8 18.8 19.0 20.8 21.4
19.2 19.2 19.5 21.4 22.2
19.9 19.8 19.6 21.5[1] 23.2
20.2 20.2 19.8 21.8 24.3
20.5 20.8 20.5 22.4 25.1
20.7 21.1 20.7 22.9 25.4
21.3 21.7 21.0 23.4 25.6
21.9 22.0 21.4 24.0 26.3
22.2 22.4 22.0 24.7 26.9
22.5 22.8 23.2 25.1 27.4
23.0 23.1 23.8 26.1 28.5
23.4 23.4 24.0 26.4 28.7
23.7 23.9 24.4 27.0 29.6
24.1 24.2 24.6 27.4
25.1 24.4 25.0 28.5
25.8 25.1 25.2 32.2
26.0 25.5 25.6 36.5
26.4 25.7 26.1
28.9 26.2 26.8
29.2 26.4 27.4
29.4 26.8 27.6
30.6 27.2 28.4
31.1 27.5 28.8
32.2 28.9 30.2
35.3 30.0 30.7
30.1 31.1
30.6 31.6
32.2 32.3
32.4
表 13 ：式(I)化合物之假多晶形式的拉曼數據 拉曼光譜係根據標題方法下所述的通用製程所記錄。
頻帶[最大波峰以cm-1表示]
半水合物 單水合物I 單水合物II 1,25-水合物 倍半水合物 二水合物 非晶形
3069 3073 3073 3064 3081 3073 3069
2941 2950 3042 2954 3064 2971 3008
2917 2937 3003 2933 3019 2940 2938
2862 2906 2950 2907 2993 2897 2869
2825 2892 2936 2858 2979 2877 2732
1700 2852 2892 2828 2965 2864 1769
1689 1685 2854 1765 2924 1689 1708
1617 1616 1685 1694 2897 1617 1617
1528 1527 1615 1610 2873 1611 1610
1496 1451 1526 1528 2858 1573 1587
1487 1440 1458 1492 2805 1527 1527
1452 1420 1451 1459 2736 1497 1489
1423 1384 1441 1449 1690 1460 1450
1372 1374 1420 1439 1616 1454 1372
1349 1328 1384 1430 1530 1443 1326
1329 1293 1372 1381 1463 1433 1279
1294 1278 1328 1369 1453 1422 1263
1283 1259 1294 1327 1440 1384 1231
1269 1228 1279 1283 1421 1372 1205
1260 1191 1259 1258 1370 1332 1194
1229 1162 1228 1233 1330 1296 1162
1207 1153 1196 1197 1291 1282 1126
1196 1128 1162 1166 1274 1259 1072
1163 1116 1153 1128 1263 1228 1054
1131 1056 1128 1116 1231 1196 1037
1074 1042 1057 1053 1199 1169 1015
1054 1033 1043 1041 1183 1149 960
1042 1015 1016 1015 1169 1128 926
1014 997 998 999 1148 1115 883
1002 937 894 938 1131 1059 859
936 922 861 922 1115 1042 843
885 893 843 887 1096 1015 804
860 861 837 858 1071 1003 777
844 844 808 840 1060 937 766
819 808 777 817 1040 924 755
804 793 757 806 964 891 738
776 776 750 775 944 873 692
745 756 701 755 928 861 638
702 750 693 746 911 835 457
693 703 655 739 863 806 440
657 692 638 701 850 777 408
638 655 569 658 835 757 183
572 638 473 637 826 750 107
476 568 463 605 814 741
464 473 439 587 805 703
439 464 419 571 767 692
423 439 410 477 757 658
407 419 394 462 743 652
395 410 357 441 701 637
349 393 323 421 693 601
300 359 302 403 678 571
242 323 281 333 656 465
176 301 233 316 634 438
145 281 208 297 491 422
110 230 195 282 464 410
197 148 226 440 399
149 117 177 422 360
117 142 409 314
102 394 287
372 226
349 190
341 152
326 103
301
271
251
243
224
187
156
113
表 14 ：式(I)化合物之假多晶形式的IR數據 IR光譜係根據標題方法下所述的通用製程所記錄。
頻帶[最大波峰以cm-1表示]
半水合物 單水合物I 單水合物II 1,25-水合物 倍半水合物 二水合物 非晶形
3032 3660 3659 3426 3516 3395 3405
2937 3416 3416 3044 3404 3197 3036
2864 3038 3039 2921 3073 3037 2941
2648 2933 2934 2854 2939 2938 2864
1761 2863 2892 2832 2922 2865 2644
1695 2809 2862 2650 2895 2646 1701
1640 2644 2809 1767 2876 1684 1685
1590 1761 2733 1692 2854 1597 1599
1558 1678 2647 1602 2815 1558 1559
1528 1595 1762 1511 2733 1539 1494
1495 1539 1679 1497 2650 1497 1453
1452 1498 1595 1448 1683 1453 1419
1418 1454 1539 1429 1668 1431 1371
1373 1419 1498 1376 1607 1419 1325
1325 1375 1454 1325 1594 1376 1272
1293 1327 1431 1275 1559 1327 1238
1241 1292 1419 1237 1533 1270 1166
1166 1272 1375 1178 1503 1241 1112
1112 1242 1327 1158 1450 1167 1072
1072 1167 1292 1128 1377 1106 1057
1059 1110 1272 1109 1330 1072 1036
1038 1072 1242 1066 1302 1037 1014
1014 1062 1167 1040 1242 1013 925
924 1039 1110 1014 1171 954 882
883 1014 1072 939 1152 924 845
844 956 1062 924 1136 886 821
818 938 1039 887 1105 844 805
750 923 1014 858 1073 819 751
703 887 938 840 1060 804 704
692 858 923 815 1036 750 692
656 845 888 805 1013 703 669
635 818 858 783 992 691 654
591 806 845 748 954 656 637
582 742 818 701 928 634 609
569 703 806 692 910 608 589
692 756 657 881 575 577
654 742 646 862 564 558
637 703 641 849 558
608 692 635 819
575 654 604 802
559 637 577 778
609 560 755
576 740
558 700
692
655
640
632
606
566
559
B– 假多晶形式之性質 實例 7式(I)之[(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸之假多晶形式，例如式(I-M-II)之單水合物II的性質 儲存穩定性
化合物的穩定性和均一性是藥物的關鍵要求，也是衛生當局批准的先決條件。其增加了包括式(I)化合物之製劑和調配物的安全性和品質且因而降低了對病患的風險。
使用式(I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的單水合物II形式於各種條件下進行穩定性研究歷時1個月、3個月和6個月： 表 15 ：儲存安定性研究結果，單水合物II
樣本 容器 溫度 相對溼度 結果
7a 按扣蓋棕色玻璃 25°C 60 % 單水合物II
7b 聚乙烯 25°C 60 % 單水合物I
7c 聚乙烯 40°C 75 % 單水合物I
7d 以濾紙片封蓋的棕色玻璃 40°C 75 % 單水合物I
在大多數此等儲存條件下，單水合物II(起始物，參見圖40)經歷了轉化為水合物I(參見，例如圖41：實例7b，XRPD)。
相比之下，式(I-M-I)之單水合物I於這些條件下為穩定的。
特言之，式(I)化合物之單水合物I確保防止不欲的轉化為另外形式的式(I)化合物和如上所述之性質上的相關變化。 實例 8式(I)之[(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，例如式(I-M-II)之單水合物II的假多晶形式性質 微粉化
對於吸入藥物產品，重要的是保證具有確定粒徑＜5 µm的均質藥物物質以確保遞送至深肺隔室。此技術要求可藉由藥物物質粒子之微粉化來提供。
就達到該要求而設定的活性成份粒徑分佈之適當規格係如表16a中所述。 表 16a：活性化合物，例如式(I-M-I)或(I-M-II)之化合物的粒徑分布
上部粒徑X90 最大6 µm
平均粒徑X50 1至3 µm
下部粒徑X10 最大1 µm
為了研究式(I-M-II)之單水合物II用於藥物產品製造的可行性，係檢測了數種微粉化條件。在必要的微粉化步驟期間，一般不應發生非晶化即使是部分非晶化或形式轉化。甚至微粉化過程中的部分非晶化可能導致活性成份及/或後來在儲存期間最終藥物產品中活性成份再結晶的風險。
使用50 mm螺旋噴射粉碎機和具有以下參數的加壓氮氣(參見表16b)將對應的批件(實例8a-8d)微粉化。 表 16b ：不同微粉化條件，單水合物II作為起始物
實例 粉碎機類型 溫度 噴射器壓力 研磨壓力 生產量 PSD 觀察
8a VA噴射粉碎機 25°C 4 .5 bar 4.0 bar 4.5 g/min X10：0.4 µm，X50：1.7 µm，X90：4.2 µm (乾式測量4 bar) 轉變為單水合物I
8b 塗覆PTFE噴射粉碎機 25°C 4.5 bar 4.0 bar 4.5 g/min X10：0.7 µm，X50：1.9 µm，X90：5.0 µm (乾式測量4 bar) 部分非晶化的單水合物II
8c VA噴射粉碎機 65°C 4.5 bar 4.0 bar 5.5 g/min X10：0.4 µm，X50：1.8 µm，X90：4.8 µm (乾式測量4 bar) 部分非晶化的單水合物II
8d VA噴射粉碎機(低壓條件) 65°C 4.5 bar 3.0 bar 10.6 g/min X10：0.5 µm，X50：2.3 µm，X90：9.6 µm (乾式測量4 bar) 部分非晶化的單水合物II
首先在標準條件下(VA噴射粉碎機(50mm)，溫度25℃)於一定向實驗中發現，單水合物II基本上可微粉化而得到所欲的粒徑分佈(參見表16a和16b，實例8a)。
在式(I-M-II)之單水合物II微粉化期間，部分非晶化係在數種情況下發生，甚至在「低壓力」下(參見上表16b和圖42，XRPD)。
XRPD：帶有部分非晶化的單水合物II，實例8b
另外發現，除了部分非晶化之外，在使用VA噴射粉碎機(直徑50 mm)25°C微粉化下，亦發生從單水合物II轉變為單水合物I(參見表16b，實例8a和圖43，XRPD)。
因為所有的研究條件顯示，轉變為形式I或部分非晶化的形式II之形式轉變，所以進一步研究單水合物I以便檢驗單水合物I用於可靠藥物製造之可行性。
使用100 mm螺旋噴射粉碎機和具有下列參數之加壓氮氣將對應批件微粉化(參見表16c)。 表 16c ：大批件微粉化條件，單水合物I作為起始物
實例 粉碎機類型 溫度 噴射器壓力 研磨壓力 生產量 PSD 觀察
8e 塗覆PTFE噴射粉碎機 25°C 5 bar 4.5 bar 22.8 g/min X10：0.7 µm, X50：2.1 µm，X90：6.1 µm (乾式測量4 bar) 單水合物I
8f PTFE噴射粉碎機l 65°C 5 bar 4.0 bar 23 to 28 g/min X10：0.6 µm, X50：2.4 µm，X90：6.3 µm (乾式測量3 bar，N=3) 單水合物I
8g VA (不鏽鋼)噴射粉碎機 25°C 6 bar 4,5 bar 8,5 g/min X10：0,5 µm, X50：1.8 µm，X90：3.9 µm (乾式測量3 bar) 單水合物I
上表中引用的所有測量值係藉由使用壓縮空氣以乾式分散之雷射繞射所得到的。在含有界面活性劑之水懸浮液中測量可能導致較小的粒徑(x90最多小1 µm)。
相較之下，式(I-M-I)之單水合物I在微粉化條件下為穩定的。 XRPD：單水合物形式I；參見圖44 C– 醫藥組成物 C-1 吸入用之乾粉製劑
將根據本發明之化合物，例如式(I-M-I)之單水合物I(實例4)或式(I-M-II)之單水合物II(實例2)以下列方式調配成醫藥乾粉製劑： 製造方法
乾粉調配物和成品(填充乾粉混合物之硬膠囊)係根據以下說明所製造。
步驟1：在開始混合之前，將細乳糖部分稱重並在分置於兩層或粗乳糖之間。
步驟2：以32 rpm的速度混合乳糖預混物歷時2 x 20分鐘。在循環之間將乳糖預混物經由500 µg篩網篩分。
步驟3：將微粉化的活性成份，例如式(I-M-I)之單水合物I實例4，或式(I-M-II)之單水合物II實例2，經由500 µm篩網篩分，並加至預混的乳糖中。在開始混合循環之前，將乳糖預混物和活性成份以6層乳糖預混物和5層活性成份，例如式(I-M-I)之單水合物I實例4或式(I-M-II)之單水合物II實例2於之間交替分層。
步驟4：在轉鼓式混合器中循環混合各組份。各循環係在32 rpm進行30分鐘，混合循環之間有10分鐘的停機時間。若需要(例如，目視結塊)，可在混合循環之間分別篩分混合物。
步驟5：將混合物於室溫(15-25°C)和相對濕度35-65%的不銹鋼容器中靜置至少48小時。
步驟6：使用膠囊填充機(例如MG2 Flexalab)將混合物以所欲的填充重量填入膠囊中。 吸入用的乾粉混合物： 表 17 ：示例的具體實例1至3之組成物(乳糖含量/比率)
示例的具體實例1 示例的具體實例2 示例的具體實例3
低濃度混合物(0.75%活性物，300g) 中濃度混合物(3%活性物，300g) 高濃度混合物 (10%活性物，300g)
量 (g) 量 (%) 量 (g) 量 (%) 量 (g) 量 (%)
活性成份：單水合物I，實例4* 2.25 0.75% 9.00 3% 30.00 10%
粗乳糖(Lactohale 100) 282.75 94.25% 276.00 92% 255.00 85%
細乳糖(Lactohale 300) 15.00 5% 15.00 5% 15.00 5%
總計 300.00 300.00 300.00
混合物的均勻性分析(RSD%) 99% (2.1%) 102% (2.2%) 102% (4.4%)
乳糖混合物中LH 300細粉含量** 5.0% 5.2% 5.6%
活性成份：LH 100之比率 1 ：126 1 ：31 1 ：8.5
活性成份：LH 300之比率* 1 ：6.7 1 ：1.67 1 ：0.5
**使用單水合物I. **就實際因素，細乳糖(LH 300)與粗乳糖(LH 100)的比例略有變化，粉末混合物中細乳糖的實際量保持不變，而變化的API(化合物1)量係藉由降低LH 100粗乳糖含量來調整。細乳糖(LH 300)的百分比含量在所有配方中為固定的，活性成份與細乳糖部分和粗乳糖部分的比例則在所指的範圍內變化。
就吸入性藥物產品，重要的是保證具有限定粒徑＜5 µm的均質藥物物質，用以確保遞送至深肺部隔室。此技術要求可藉由藥物物質粒子之微粉化來進行。
就達到此要求所設定的活性成份粒徑分佈的適當規格係如表18中所述。
根據本發明活性成份式(I-M-I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I，實例4之粒徑分布係如下表18所定義。 表 18 ：實例4之粒徑分布
上部粒徑X90 最大6 µm
平均粒徑X50 1至3 µm
下部粒徑X10 最大1 µm
根據本發明係使用不同粒徑範圍和不同特性的吸入用乳糖。
根據本發明的粗乳糖物質為具有低細粒子含量之篩分、晶體α-乳糖單水合物(例如，市售的Lactohale® 100)。
一不同的中粗乳糖為粉碎的Lactohale® 200，其已含有大量的乳糖細粉，基本上可為客戶量身訂製所希望的粒徑和細粉含量。
另一種不同的粗乳糖為Lactohale® 206，其為一種粉碎的α-乳糖，具有嚴格控制的粒徑，無任何細粒子。
根據本發明細乳糖物質為微粉化、晶體α-乳糖單水合物，具有X90≤ 10 µm之低粒徑(「乳糖細粉」)(例如市售的Lactohale® 300)。亦可選擇具有相似性質和粒徑之根據本發明細微粉化乳糖，例如 Meggle Inhalac® 500。
一不同的細乳糖物質為Lactohale 230®，一種具有低粒徑，X90 ＜30 µm經粉碎的α-乳糖單水合物，具有不規則形狀的粒子；
根據本發明吸入用的乳糖(例如Lactohale® 100、Lactohale® 300和其他)之粒徑分佈係如下表19中所定義。 表 19 ：乳糖載劑組份之粒徑分布
粗乳糖 細乳糖
Lactohale® 100 Lactohale® 300
上部粒徑X90 200 - 250 µm ≤ 10 µm
平均粒徑X50 125 - 145 µm ≤ 5 µm
下部粒徑X10 45 - 65 µm 未定
Lactohale® 200*
上部粒徑X90 120 - 160 µm
平均粒徑X50 50 - 100 µm
下部粒徑X10 5 - 15 µm
Lactohale ®206** Lactohale ®230***
上部粒徑X90 115 - 170 µm ＜ 30 µm
平均粒徑X50 75 - 95 µm ＜ 10 µm
下部粒徑X10 20 - 50 µm 1.0 – 3.0 µm
*用於比較實例20和示例的具體實例34至35 **用於示例的具體實例39至44 ***用於示例的具體實例36至38和42至44
混合物的品質係藉由測量混合物分析和均勻性來評估，如D.3中所述。
作為品質要求，根據本發明混合物應滿足下列標準： 90至110%之混合物分析，較佳地95至105%(以%表示之活性成份含量) 及NMT(＝不大於)之RSD(＝相對標準偏差)(n＝10)的混合物均一性10%，較佳地7.5%，更佳地5%。 膠囊中的乾粉混合物 ( 吸入用的成品調配物 ) ：
將包括微粉化的活性成份(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸，較佳地(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I(實例4)以及乳糖載劑組份：細乳糖和粗乳糖之乾粉混合物填入硬膠囊(羥丙基甲基纖維素=羥丙甲纖維素=HPMC，例如3號)或由硬明膠或其他合適物質所製成的替代膠囊中。
依照填充重量和活性成份濃度，可達到不同的標稱劑量。帶有實例4(單水合物I)之不同標稱劑量膠囊的示例性組成物係顯示於下表中。將最終產品就其對應氣霧性能進行評估(硬凝膠膠囊中的乾粉組合物)(參見表20)。 表 20 ：示例的具體實例1-3之氣霧性能
示例的具體實例1 示例的具體實例2 示例的具體實例3
標稱劑量 120 µg 480 µg 1000 µg
粉末混合物中活性成份實例4的濃度 0.75% 3% 10%
填充重量 16 mg 16mg 10 mg
遞送劑量(DD) 71µg 316µg 705µg
DD(標稱劑量之%) 59% 66% 71%
細粒子劑量＜4.5µm (FPD) 32µg 128µg 258µg
FPF(標稱劑量之%) 27% 27% 26%
FPF(DD之%) 45% 41% 37%
氣霧性能包括，如遞送劑量(DD)、細粒子劑量(=FPD)和細粒子分量(=FPF)之參數。DD係根據方法D.1所測，細粒子劑量(=FPD)和細粒子分量(=FPF)係根據方法D.2所測(空氣動力學粒徑分佈)。
作為品質要求，根據本發明膠囊中的乾粉混合物應滿足下列標準： ≥20%的FPF(＜ 4,5 µm活性物之標稱劑量的%)及 ≥30%活性成份的FPF(＜4,5 µm活性物之DD的%)。
如上表所示，示例的實施例1-3展現優越的氣霧性能和適當的混合物均勻性以及良好的化學穩定性(參見穩定性數據)。
另外的乾粉混合物係使用式(I-M-I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物I(實例2)作為活性成份並使用部分不同製造方法所製造。
根據本發明活性成份式(I-M-II)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物II(實例2)的粒徑分布係如下表21中所定義。 表 21：實例2之粒徑分布
上部粒徑X90 最大6 µm
平均粒徑X50 1至3 µm
下部粒徑X10 最大1 µm
示例的具體實例4至6係彙整於下表22中。 表 22 ：包括實例2之示例的具體實例4至6組成物(乳糖含量)
示例的具體實例4 示例的具體實例5 示例的具體實例6
API濃度和批件大小 (0.75%活性物，300g) (3%活性物，300g) (10%活性物，300g)
量 (g) 量 (%) 量 (g) 量 (%) 量 (g) 量 (%)
活性成份：(實例2)* 3.75 0.75% 9.00 3% 20.00 10%
粗乳糖(Lactohale 100) 471.25 94.25% 276.00 92% 170.00 85%
細乳糖 (Lactohale 300) 25.00 5% 15.00 5% 10.00 5%
總計 500.00 300.00 200.00
混合物均一度分析(RSD%) 96% (1.5%) 98% (0.8%) 103% (4.4%)
LH 300細粉含量 乳糖混合物** 5.0% 5.2% 5.6%
比率 活性成份：LH 100** 1 ：126 1 ：31 1 ：8.5
比率 活性成份：LH 300** 1 ：6.7 1 ：1.67 1 ：0.5
*使用單水合物II **細乳糖(LH 300)與粗乳糖(LH 100)之比率係說明於根據本發明示例的具體實例1至3之章節中。
示例的具體實例4至6之製造方法在步驟2、3和4為不同的。
步驟2：乳糖預混物的混合係以67 rpm進行2 x 20 分鐘(示例的具體實例4之低濃度混合物為72 rpm)。乳糖預混物係在循環之間經由500 µg篩網篩分。
步驟3：活性成份：將微粉化的單水合物II實例2加入預混乳糖中，無需過篩。在混合循環開始之前，將乳糖預混物和活性成份分層，其間交替著4層乳糖預混物和3層活性成份(實例2，單水合物II化合物1)。
步驟4：在第一個混合週期開始之前，將分層混合物經由500 µm篩網篩分。於轉鼓式混合器中以3個循環將組份混合。各循環係以67 rpm進行30分鐘(示例的具體實例4之低濃度混合物為72 rpm)，並在混合循環之間經由 500 µm篩網篩分。
得到來自下列示例的具體實例4至6之填充膠囊的結果。 表 23 ：示例的具體實例4至6之氣霧性能
示例的具體實例 4.1 + 4.2 ( 低 / 高粉末填充 ) 示例的具體實例 5 示例的具體實例 6
標稱劑量 60 µg 120 µg 480 µg 1000 µg
粉末混合物中活性成份實例2之濃度 0.75% 0.75% 3% 10%
填充重量 8 mg 16 mg 16mg 10 mg
遞送劑量(DD) 30µg 82µg 316µg 671 µg
DD (標稱劑量之%) 50% 68% 66% 67 %
細粒子劑量＜4.5µm (FPD) 12µg 31µg 126µg 242 µg
FPF(標稱劑量之%) 20% 26% 26% 24 %
FPF(DD之%) 40% 38% 40% 36%
示例的具體實例4至6之結果顯示，使用式(I-M-II)形式之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]-胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸單水合物II(實例2)可達到類似的有利氣霧性能，用以調配根據本發明之乾粉混合物。 穩定性試驗
穩定性研究係各以一低濃度(120 µg，根據本發明，示例的具體實例1)和高濃度(1000 µg，根據本發明，示例的具體實例3)的臨床批件進行。就外觀、遞送劑量、空氣動力學粒徑分佈、分析和降解產物以及物理形式(僅限高濃度批件)進行了穩定性試驗。根據概述於表24和25中的方法進行本研究。 表 24 ：穩定性方法–包括實例4之吸入用長期膠囊(臨床批件)
儲存條件 儲存[月數]
0 1 3 6 9 12 18 24 36
25°C/60% RH x x x x (x) x x x (x)
RH 相對溼度 x     檢測站
(x)  選擇性檢測站
在整個試驗期間，並無觀察到任何試驗參數有顯著變化之跡象。因此，根據本發明之粉末混和調配物對於希望的用途和儲存期為充分穩定的。 穩定性數據係如下表25中所示。 表 25 ：穩定性數據–包括實例4之吸入用長期膠囊
試驗 可接受標準 儲存時間 [月] 具體實例1 (120 µg) 具體實例2 (1000 µg)
調配物 初始 符合 符合
(硬膠囊，透明&無色 1 符合 符合
無標記) 3 符合 符合
6 符合 符合
12 符合 符合
18 符合 符合
24 符合 符合
膠囊含量之外觀 初始 白色粉末 灰白色粉末
(白色至灰白色粉末) 1 白色粉末 白色粉末
3 白色粉末 白色粉末
6 白色粉末 白色粉末
12 白色粉末 白色粉末
18 白色粉末 白色粉末
24 白色粉末 白色粉末
遞送劑量均一性 初始 71 625
平均遞送劑量 1 67 659
120 µg：64 – 92 µg 3 75 691
1000 µg：550 – 750 µg 6 70 625
12 66 644
18 63 646
24 68 660
等級1(n=10) 初始 符合 符合
(有9/10必須在75%至 1 符合 符合
125%之間 3 符合 符合
而全部皆須在 6 符合 符合
平均值的65%至135%之間) 12 符合 符合
18 符合 符合
24 符合 符合
等級2 (n=30) 初始 n.a. n.a.
(30個數值中有不超過3個 1 n.a. n.a.
落在75%至125%的限制之外且 3 n.a n.a
且所有的值皆不落在 6 n.a n.a
平均值之65%至135%的限制之外) 12 n.a n.a
18 n.a n.a
24 n.a n.a
空氣動力學粒徑分布 初始 3.2 3.1
MMAD 1 3.3 3.1
(1.8 – 5.0µm) 3 3.4 3.2
6 3.3 3.1
12 3.5 3.1
18 3.5 3.3
24 3.5 3.1
FPD 初始 34 230
120 µg：15 – 37 µg 1 24 235
1000 µg 123 – 312µg 3 20 255
6 24 276
12 23 260
18 26 252
24 22 265
實例4產品之降解
BP胺基酸 初始 ＜ 0.05 ＜ 0.05
(最大1.5%) 1 n.d. n.d.
3 n.d. n.d.
6 ＜ 0.05 ＜ 0.05
12 ＜ 0.05 ＜ 0.05
18 ＜ 0.05 ＜ 0.05
24 ＜ 0.05 ＜ 0.05
BP-THQ-羧酸 初始 0.1 ＜ 0.05
(最大1.5 %) 1 0.1 n.d.
3 0.1 n.d.
6 0.1 0.05
12 0.1 0.05
18 0.1 0.05
24 0.1 0.06
任何不明的降解產物 初始 0.3 0.3
(最大1.5 %) 1 0.3 0.3
3 0.3 0.3
6 0.3 0.3
12 0.3 0.3
18 0.3 0.3
24 0.3 0.3
所有降解產物之總和 初始 1.0 0.9
(最大5.0%) 1 0.8 0.8
3 0.8 0.7
6 0.8 0.8
12 1.0 0.9
18 1.2 1.0
24 1.1 1.1
實例4之分析 初始 115 962
120 µg：108 – 132 µg/膠囊 1 116 995
1000 µg：900 – 1100 µg/膠囊 3 113 961
6 113 965
12 113 955
18 114 967
24 112 977
物理形式 初始 -- 單水合物
(單水合物) 1 -- --
3 -- --
6 -- --
12 -- 單水合物
18 -- --
24 -- 單水合物
n.d. = 未偵測，未檢測 C-2 用於臨床研究，例如口服和靜脈內給藥之共用溶液 (Service solution)包括實例4之共用溶液：
製備濃度0.005%之活性成份實例4(式(I-M-I)之單水合物I)的臨床研究共用溶液(參見實例E-2.3)，總體積20 ml，最後裝入棕色玻璃小瓶。 表 26 ：包括實例4之共用溶液的定量組成物
組成物 量 [mg] 填充量 a [mg]
藥物物質
活性成份，實例4 (式(I-M-I)之單水合物I) 1.0000 1.0450
賦形劑
羥丙基β環狀糊精(Hydroxypropylbetadex) 200.00 209.00
胺基丁三醇(Trometamol) 24.200 25.289
氯化鈉 152.00 158.84
氫氧化鈉1N q.s. q.s.
鹽酸10% q.s. q.s.
注射用水 19773 20664
a 量包括0.9 ml過滿量，確保20.0 ml之精確量
b 根據最新版歐洲藥典，由NaOH和純水所組成，
q.s.足量
製造
步驟1：將一容器裝入大約85%之所需量的注射用水。
步驟2：將稱取的羥丙基β環狀糊精之量轉移到容器中，攪拌溶液直至完全溶解。
步驟3：將稱取的胺基丁三醇之量轉移至容器中，攪拌溶液直到完全溶解。
步驟4：以適量的1N氫氧化鈉將pH調至12.0 (11.8至12.2)。
步驟5：將稱取的活性成份實例4(式(I-M-I)單水合物I)之量轉置於容器中，攪拌溶液直至完全溶解。
步驟6：將稱取的氯化鈉之量轉置於容器中，攪拌溶液直至完全溶解。
步驟7：以適量的10%鹽酸將pH調整至7.8 (7.7至7.9)。
步驟8：計算最終重量的水量，邊攪拌邊加入所需量的注射用水。
步驟9：在經由膜過濾器(孔徑0.2 µm)無菌填充到玻璃小瓶之前，將溶液預過濾(過濾器1，生物負載減少過濾器)和無菌過濾(過濾器2)。
步驟10：將溶液填充至無菌、去熱原的20 mL棕色玻璃注射小瓶中。
步驟11：將小瓶加蓋並捲封進行完全封閉。 D– 分析方法 ( 遞送劑量，細粒子劑量，混合物分析和均一性 )
下文詳細描述了測定遞送劑量和細粒子劑量的分析方法。
D.1 ： 遞送劑量 (DD) 此方法係根據Ph. Eur. Monograph Preparations for Inhalation – Powders for inhalation，以乾粉吸入器(參見說明，第94頁，圖1a和1b)和吸入膠囊(膠囊之製備請參見C.)，使用特定的樣本收集管(劑量單位採樣適配器=DUSA)、數位流量計和真空泵來進行。採樣係以90 L/min 的流量進行2.4秒，相當於3.6 L的吸入量。DD樣本製備係於20°C和40至55% RH 下進行。
使用帶有UV-偵測之高效液相層析測量樣本(彙整如下)
D.2 空氣動力學粒度分佈 (APSD)( 用於測定 FPD) 此方法係根據Ph. Eur. 2.9.18 aerodynamic assessment of fine particles以乾粉吸入器(參見說明，第86頁，圖A和B)和吸入膠囊(膠囊的製備參見 C.)，使用設備E(新一代撞擊器，NGI)、數位流量計和真空泵來進行。將NGI採樣杯各塗覆2 mL 1%矽油之己烷溶液。採樣係以90 L/min的流量進行2.4秒，相當於3.6 L的吸入量。DD樣本製備係於20°C和40至55% RH下進行。就120 µg 膠囊，將5個個別的膠囊連續發射到如上所述的NGI中，就較高的劑量濃度(例如480 µg、1000 µg)，就各NGI分析一個膠囊為足夠的。 使用帶有UV-偵測的逆相高效液相層析測量樣本(彙整如下)
RP-HPLC-UV法 (用於來自APSD和DD檢測和膠囊分析之樣本) 此測定方法係用於分析在遞送劑量均一性(藉由DUSA取樣管)和空氣動力學粒徑測定(藉由新一代撞擊器)期間所製備樣本中實例2或4或比較實例14之含量。
設備 帶有恆溫管柱烘箱、UV-偵測器或二極管陣列偵測器及層析數據系統的高效液相層析
管柱 HPLC管柱 Poroshell 120 EC-C8，2.7 µm，150 × 4.6 mm.
樣本稀釋液[Sol] 乙腈/水/磷酸50/50/0.35 (用於APSD & DD)
酸化水 磷酸/水(7：1000 (v：v))
樣本製備 將所需的膠囊數目置入含有酸化水的定量燒瓶中。以乙醇沖洗膠囊並將包括膠囊殼的溶液轉置於定量燒瓶。所生成的溶液具有6 µg/mL之濃度。 用於APSD之樣本係藉由以乙腈萃取NGI杯所製備。 用於DD樣本係藉由以樣本稀釋液清洗樣本管所製備。
HPLC條件
溶析液 A) 52：48 H2O：MeCN含0.3%磷酸
B) 5：95 H2O：MeCN含0.3%磷酸
溶析 梯度
時間(min) %A %B
0.0 100 0
6.0 100 0
6.5 0 100
8.0 0 100
8.5 100 0
11.0 100 0
層析運行時間 11分鐘
流速 1.5 mL/分鐘
管柱烘箱之溫度 35 ºC (± 2 ºC)
偵測 分光光度計於260 nm
注射量 100 µL
D.3 混合物分析/均一性(HPLC) 帶有UV-偵測之高效液相層析(HPLC)
設備 1. 帶有恆溫管柱烘箱、UV-偵測器或二極管陣列偵測器及層析數據系統的高效液相層析
2. HPLC管柱Poroshell 120 EC-C8，2.7 µm，150 × 4.6 mm.
3. 超音波浴
試劑 1. 磷酸(例如，Merck公司).
2. 乙腈(MeCN)(HPLC-等級).
3. 去離子水(例如Millipore).
樣本稀釋劑[Sol] 乙腈/水/磷酸50/50/0.35
酸化水 磷酸/水(7：1000 (v：v))
試驗溶液[TS] 準備試驗溶液10次。所有試驗溶液在環境/光條件下可穩定達7天。
7.5 µg/mg混合物濃度 (1.2 µg/mL樣本溶液) 目標膠囊濃度：60 µg 精確稱取約8.0 mg的7.5 µg/mg散裝混合物置入50 mL定量燒瓶中。溶解並以稀釋劑定容，產生1.2 µg/mL實例2或4或比實例14溶液。
7.5 µg/mg混合物濃度 (1.2 µg/mL樣本溶液) 目標膠囊濃度：120 µg 精確稱取約16.0 mg的7.5 µg/mg散裝混合物置入100 mL定量燒瓶中。溶解並以稀釋劑定容，產生1.2 µg/mL實例2或4或比較實例14溶液。
30 µg/mg混合物濃度 (4.8 µg/mg溶液，(1.44 µg/mL樣本溶液) 目標膠囊濃度：480 µg 精確稱取約16.0 mg的30 µg/mg散裝混合物置入100 mL定量燒瓶中。溶解並以稀釋劑定容，及以稀釋劑將3.0 mL稀釋至10 mL，產生1.4 µg/mL實例2或4或比較實例14溶液。
100 µg/mg混合物濃度 (5 µg/mg 儲存液， 1.5 µg/mL樣本溶液) 目標膠囊濃度：1000 µg 精確稱取約10.0 mg的散裝混合物置入200 mL定量燒瓶中。溶解並以稀釋劑定容，及以稀釋劑將6.0 mL稀釋至20 mL，產生1.5 µg/mL實例2或4或比較實例14溶液。
標準儲存液[SSS] (15 µg/mL) 以雙重複稱取製備大約15 µg/mL溶液所需之實例2或4或實例14參照標準的量並轉置於100 mL定量燒瓶中。以超音波處理並以稀釋劑稀釋體積。將儲存液標記為SSS1和SSS2。
若造成相同的最終濃度，則可使用不同重量的標準物質和不同的稀釋步驟。
標準溶液[SS] (1.5 µg/mL) 使用稀釋劑將5.0 mL的各儲存標準稀釋至50 mL並充分混合，產生工作標準溶液。
HPLC條件 如遞送劑量和細粒子劑量所述。
D.4 粒徑分布 (雷射繞射) 適用於，例如API和乳糖
原理 將一以適當濃度分散在適當液體或氣體中的代表性樣本通過一單色光燈，通常為雷射。藉由多元偵測器測量由粒子以不同角度散射的光。然後使用適當的光學模型和數學程序將散射模式值轉換為總體積與形成體積粒徑分佈之離散數量的大小等級比例。
設備 帶有RODOS乾式分散單元之Sympatec HELOS
參數 壓力： 4 bar 進給速率：18% 焦距(RODOS)：100 mm
精確度 變異系數最大5%
雷射繞射測量之替代配置
設備 帶有乾式分散單元之Malvern Mastersizer 3000
參數 壓力：3.5 bar 進給速率：20 % 焦距：300 mm 取樣時間：3s
精確度 變異系數：最大5%
粒徑分析數據通常係以體積計的篩下物累積分佈。符號x係用來表示粒徑，其定義為體積等效球形直徑。最常見的特徵值係藉由內插法從粒徑分佈來計算。經常使用的為體積分佈之10%、50%和90%篩下值之粒徑，以x10、x50和x90表示。x50亦稱為中位數粒徑。符號d廣泛用來指派粒徑，因此符號x可以符號d代替。 D.5 另外的穩定性試驗方法
外觀 目視檢測
RP-HPLC-UV方法 (用於降解產物) 以260 nm UV-偵測和外部校正的逆相高效液相層析(HPLC)。
設備 帶有恆溫管柱烘箱、UV-偵測器或二極管陣列偵測器和層析數據系統的高效液相層析
管柱 HPLC管柱 Poroshell 120 EC-C8，2.7 µm，150 × 4.6 mm.
樣本稀釋劑[Sol] 乙腈/水/磷酸50/50/0.35
酸化水 磷酸/水(7：1000 (v：v))
樣本製備 將所需的膠囊數目置入含有酸化水的定量燒瓶中。以乙腈沖洗膠囊並將無膠囊殼的溶液轉置於定量燒瓶。將用以產生60 µg/mL之實例4溶液量的乙腈加入定量燒瓶中。
HPLC條件
溶析劑 A) 55：45 H2O：MeCN含0.3% 磷酸
B) 5：95 H2O：MeCN含0.3%磷酸
溶析 梯度
時間(min) %A %B
0.0 100 0
12.0 100 0
32.0 0 100
35.0 0 100
35.1 100 0
42.0 100 0
層析運作時間 42分鐘
流速 1.5 mL/分鐘
管柱烘箱之溫度 35ºC (±2ºC)
偵測 分光光度計於260 nm
注射量 100 µL
D.6 定性成品乾粉混合物中之粒子分布和 API 及乳糖粒子大小的另外方法
方法之原理 自動光學和拉曼顯微鏡整合系統，用於分析組成物粉末樣本之形態/粒徑和數量，同時鑑定粉末混合物組份的化學性質。
裝置： Malvern Morphologi 4-ID
乾式分散(示例的設定)： 體積：5 mm 3壓力：3 bar 分散時間：3 ms 安定時間：60 s
形態學(示例的設定)： 光源：穿透(Diascopic) 物鏡(放大倍率) x50 掃描面積784 mm 2
拉曼(示例的設定)： 擷取時間：15 s 頻譜遮蔽：於0.520 cm -1和790–1740 cm -1之區域
E– 生物實例 E-1 以麻醉血栓素挑戰之小型豬的血液動力學肺選擇性和作用持續時間
使用雌雄兩性及具有2至6公斤體重的健康哥廷根小型豬(Göttingen Minipigs® Ellegaard)(Ellegaard, Denmark)。將動物以肌肉內投予約25 mg/kg氯胺酮(ketamine)和約10 mg/kg阿扎哌隆(azaperone)鎮靜。以靜脈內投予約2 mg/kg氯胺酮和約0.3 mg/kg咪達唑侖(midazolam)開始麻醉。藉由靜脈內投予約7.5 30 mg/kg/h氯胺酮和約1-4 mg/kg/h咪達唑侖(輸注速率1-4 ml/kg/h)和約150 μg/kg/h泮庫溴銨(pancuronium bromide)(例如Pancuronium-Actavis)維持麻醉。插管後，將動物藉由呼吸機以恆定呼吸量(10-12 ml/kg，35次呼吸/分鐘；Avea®，Viasys Healthcare，USA，或Engström Carestation，GE Healthcare，Freiburg，Germany)進行通氣，以便達到約5%的末端吐氣CO2濃度。使用富含約40%氧氣(正常氧濃度)的室內空氣進行通氣。就測量肺動脈壓(PAP)、血壓(BP)和心率(HR)之血流動力學參數，係將導管插入頸動脈用以測量血壓，並以流動導向的方式導入一Swan-Ganz®導管經由頸靜脈進入肺動脈。藉由壓力傳感器(Combitransducer，B. Braun，Melsungen，Germany)/放大器和Ponemah®作為數據採集軟體，記錄和評估血液動力學信號。
在將儀器放入動物後，開始連續輸注血栓素A2類似物，增加肺動脈壓。輸注溶於生理鹽水中約0.3至0.75 µg/kg/min的9,11-二去氧-9α,11α-環氧甲基前列腺素F2α(U-44069；Sigma，型號D0400，或Cayman化學公司，型號16440)，以達到平均肺動脈壓力增加到超過25 mmHg的值。輸注開始後30分鐘，達到平台期並開始實驗。
以靜脈內輸注或藉由吸入投予試驗物質。就吸入用溶液之製備，係採下列程序：就具有4 kg體重的動物，製備儲存液(300 μg/kg)，稱取1.2 mg試驗化合物並溶於總體積3 ml(1%DMSO、99%之0.2%濃度檸檬酸溶液、以1N氫氧化鈉水溶液調整pH值至8)。然後使用預先已以氫氧化鈉水溶液調整至pH 8的0.2%濃度檸檬酸將溶液稀釋至所用的濃度。在各試驗中，係使用Aeroneb® Pro霧化器系統將每4 kg動物3 ml試驗化合物溶液霧化於呼吸迴路的吸入臂中。從霧化開始，平均霧化時間約為7分鐘。 預測人類中之效用持續時間
有關預測人類研究之作用持續時間，係將比較實例11在吸入施用Ventavis®後(=伊洛前列腺素(Ilopro)，10 µg/kg標稱劑量)於PAH小型豬模型中進行了比較，將其用作為臨床參照。Ventavis®具有約40 min之最大作用持續時間。比較實例11的所有劑量在整個240 min的觀察間隔期間顯示了劑量依賴的效用(參見圖45)。因此，在此臨床前動物模型中，作用持續時間比Ventavis長6倍以上。在臨床研究中，Ventavis對血液動力學(PVR)顯示約60分鐘的作用持續時間(參照：來自隨機對照前導試驗研究之吸入曲前列腺環素(Treprostinil)在嚴重肺高壓中的有利影響結果，Robert Voswinckel, MD,* Beate Enke, MD,* Frank Reichenberger, MD,* Markus Kohstall, MD,*Andree Kreckel, MD,* Stefanie Krick, MD,* Henning Gall, MD,* Tobias Gessler, MD, PHD,*Thomas Schmehl, PHD,* Hossein A. Ghofrani, MD,* Ralph Theo Schermuly, PHD,*Friedrich Grimminger, MD, PHD,* Lewis J. Rubin, MD,† Werner Seeger, MD,* Horst Olschewski, MD*‡Journal of the American College of Cardiology Vol. 48, No. 8, 2006)，其與吾等觀察到的約40分鐘之作用持續時間具良好相關性。
在比較實例11的作用持續時間在PAH小型豬模型和人類之間為可相較之假設下，如類似Ventavis所示和描述，比較實例11在人類中的作用持續時間應至少為6小時或甚至更長。 表 27 ：媒劑溶液、比較實例11(10、30和100 µg/kg)和Ventavis(10 µg/kg)在PAH小型豬模型中吸入施用後的效用。PAP相對於基線的%變化(霧化開始前10分鐘間隔)。數據是平均值±SD。
PAP%變化與預置值
時間 媒劑 n=4 Ventavis® n=3 比較實例11 10µg/kg n=3 比較實例11 30µg/kg n=3 比較實例11 100 µg/kg n=3
平均 SD 平均 SD 平均 SD 平均 SD 平均 SD
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 -0.2 2.7 -30.3 9.0 0.6 0.5 0.3 0.6 -2.1 2.7
20 -0.4 6.3 -20.7 21.6 0.2 0.3 -2.0 1.0 -7.2 3.8
30 0.5 6.5 -6.9 13.5 -0.7 0.4 -4.6 0.8 -14.6 6.0
40 2.4 4.1 1.7 2.9 -1.5 2.2 -7.8 0.9 -18.1 6.9
50 4.3 4.0 4.9 0.9 -2.3 2.7 -9.8 0.6 -22.2 8.6
60 5.6 4.6 -3.5 3.3 -11.8 1.0 -25.1 7.9
70 6.2 5.2 -4.2 3.2 -14.1 0.7 -27.0 7.4
80 6.2 5.2 -3.7 4.2 -14.2 0.7 -27.9 7.3
90 7.0 5.3 -4.3 4.6 -14.4 0.2 -28.9 9.1
100 7.0 5.3 -5.3 4.9 -14.8 0.3 -31.1 8.8
110 7.0 5.7 -6.2 4.9 -15.3 0.3 -30.8 8.4
120 7.6 5.5 -6.7 5.4 -15.3 1.0 -31.3 8.4
130 7.9 5.9 -6.2 4.9 -15.5 1.9 -31.2 9.1
140 7.7 5.5 -7 5.0 -15.3 2.2 -31.6 8.7
150 7.9 5.1 -7.6 5.3 -16.3 1.7 -31.1 8.2
160 8.9 4.8 -7.6 6.1 -16.3 2.3 -30.1 8.5
170 9 5.8 -8.2 5.9 -14.9 2.1 -31.1 8.9
180 8.6 6.0 -8.0 4.4 -14.7 2.1 -31.1 9.2
190 9.2 6.0 -7.8 4.7 -15.1 2.1 -30.5 8.5
200 8.9 5.7 -7.3 3.6 -15.3 2.6 -30.9 8.6
210 9.4 6.0 -7.5 4.5 -13.8 2.3 -30.6 8.9
220 9.9 5.3 -7.2 3.7 -13.6 2.2 -31.6 9.2
230 9.1 4.7 -7.2 3.4 -12.8 2.4 -31.2 7.4
240 8.4 4.1 -7.6 2.7 -13.4 1.9 -31.0 8.0
預測人類劑量
為了產生人類劑量估計值，在PAH小型豬模型中對比較實例11重複實驗，其不同之處在於管的末端連接了吸收過濾器用以測定沉積的肺劑量。比較實例11的霧化造成標稱施用劑量之3至6%的霧化效率。以過濾器實驗的所有結果為基準，沉積在過濾器上的氣霧分量的算術平均值為5%，產生約0.15 μg/kg(3 μg/kg標稱劑量)，0.5 μg/kg( 10 μg/kg標稱劑量)、1.5 μg/kg(30 μg/kg標稱劑量)和5 μg/kg(100 μg/kg標稱劑量)之相對肺沉積劑量。假設PAP降低5%之最小有效標稱劑量為3 μg/kg及5%的平均霧化效率，則以PAH小型豬模型為基礎，最小有效沉積肺劑量被認為是0.15 μg/kg。因此，對於60 kg體重的人類病患，依照無論是否有不同蛋白質結合之影響，假定最小有效肺沉積劑量為9至41 µg(參見表28)。考慮到在小型豬模型中有效劑量為100 µg/kg，再次依照對不同種間蛋白質結合之考量，假定300至1370 µg肺沉積劑量為有效劑量。 表 28 ：有和無考量蛋白結合之種間差異的有效肺劑量
小型豬中相對肺沉積劑量 [µg/kg] 60 kg人類中總肺沉積劑量 [µg]
不考量蛋白結合的種間差異a 考量蛋白結合的種間差異b
0.15 µg/kg (3 µg/kg標稱劑量) 9 41
0.50 µg/kg (10 µg/kg標稱劑量) 30 137
1.5 µg/kg (30 µg/kg標稱劑量) 90 410
5.0 µg/kg (100 µg/kg標稱劑量) 300 1370
a計算(小型豬中相對肺沉積劑量×60 kg)
b計算(小型豬中相對肺沉積劑量×60 kg×4.55(未結合小型豬(血漿fu 0.348%)/人類(血漿fu 0.0764%)之分量比率)
乾粉調配物之效用
在定性化合物溶液霧化後比較實例11之效用後，以另一步驟研究化合物實例11之晶體形式，例如倍半水合物，例如實例6e，在麻醉的PAH小型豬中於吸入施用不同乾粉乳糖調配物(表29)後對PAP和BP的效用。 表 29 ：應用於小型豬實驗中比較實例11之晶體形式，例如倍半水合物，例如實例6e的乾粉調配物
調配物 藥物承載 % (w/w) 乾粉/每隻動物施用的藥物劑量 施用的比較實例11之晶體形式劑量
化合物實例11晶體形式於乳糖中的乳糖調配物I 2 1.5 mg/ 30 µg 7.5 µg/kg
化合物實例11晶體形式於乳糖中的乳糖調配物II 6 1.5 mg/ 90 µg 22.5 µg/kg
微粉化的倍半水合物實例6e 100 1.5 mg/ 1500 µg 375 µg/kg
w/w：重量/重量
1.5 mg/4 kg動物體重乳糖媒劑(LH300/LH200 20/78或LH300/LH200 20/80)，乳糖調配物I(LH300/LH200 20/78包括2w-%化合物實例11之晶體形式的)，乳糖調配物II (LH300/LH200 20/80包括6w-%化合物實例11之晶體形式或化合物實例11之微粉化晶體形式，例如倍半水合物，例如實例6e經由連接空氣泵之PennCentury®乾粉吹氣機於氣管內施用(i.t.)。在所有動物中，乳糖施用導致PAP增加對BP沒有任何影響(圖46至49)。在氣管內施用施用乳糖調配物I (2%w/w)、乳糖調配物II (6%w/w)或化合物11的微粉化晶體形式，例如倍半水合物實例6e後，並未觀察到PAP降低對BP有任何影響(圖46至48)。如圖49所示，效用開始緩慢，乳糖調配物I (2%w/w)，在氣管內施用後，大約190 min後達到最大效用，乳糖調配物II (6%w/w)大約在170 min後而微粉化倍半水合物實例6e大約在80 min後。對於所有劑量，對PAP的選擇性效應持續了完整的4h觀察間隔。在此動物模型中，在這些實驗條件下，在此模型中以乳糖調配物II以及微粉化倍半水合物實例6e可達到的最大效用。由於乳糖調配物I已為有效的，比較實例11的MED以及其假多晶形式，例如倍半水合物和單水合物I或單水合物II(式I化合物的不同假多晶形式物的類似功效已顯示於下列試驗中)為＜7.5 µg/kg，這與用液體溶液推導人體劑量預測之實驗非常吻合(MED3µg/kg)。由於技術限制，較低劑量並不適用。 表 30 ：氣管內施用不同乳糖載體、乳糖調配物I (7.5 µg/kg)、乳糖調配物II (22.5 µg/kg)和微粉化倍半水合物，例如實例6e (375 µg/kg)後的效應。數據顯示為PAP和BP[mmHg]的絕對值(n=3)
乳糖1.5mg/4kg(@0min)+乳糖調配物I 2%  1.5mg/4kg (@90min) 乳糖1.5mg/4kg(@0min)+乳糖調配物II 6% 1.5mg/4kg (@90min)
時間 PAP BP PAP BP
0 38.8 37.1 37.2 101 106 119 38.6 36.8 40.0 110 115 93
10 37.3 37.7 37.6 95 110 118 39.4 37.1 39.2 111 112 92
20 35.3 36.8 38.4 96 106 119 39.9 37.9 39.1 113 117 88
30 40.4 37.2 38.7 101 105 119 40.3 37.4 39.8 114 115 89
40 41.8 37.8 39.4 103 105 119 40.9 38.5 40.9 113 116 92
50 41.9 39.4 39.2 105 102 118 41.7 38.1 41.0 113 115 93
60 41.9 40.9 39.7 107 100 118 42.4 38.0 39.8 112 114 91
70 40.9 41.2 39.6 108 101 116 42.8 39.2 41.6 112 113 95
80 37.6 42.4 37.4 108 94 111 43.3 39.5 40.6 111 113 93
90 35.5 42.3 38.4 111 97 111 43.0 39.2 40.2 111 110 93
100 38.1 43.8 37.5 113 100 110 43.2 40.0 42.5 110 112 94
110 38.8 43.8 36.5 114 93 107 44.2 38.5 40.4 110 111 94
120 40.9 43.8 35.3 115 96 107 42.7 36.5 40.1 110 111 96
130 40.9 43.6 34.2 115 89 106 40.8 36.4 38.6 110 109 96
140 41.3 42.3 33.5 116 86 105 40.6 35.6 35.6 109 110 96
150 41.3 39.5 33.2 117 89 104 39.9 35.0 35.9 110 108 98
160 40.4 39.0 32.9 116 87 103 38.8 34.1 34.1 110 107 98
170 40.9 38.1 32.9 116 86 102 37.1 34.8 32.5 110 106 97
180 40.9 38.1 32.6 114 88 101 35.5 31.6 32.6 109 105 98
190 41.5 39.7 33.6 116 90 102 34.4 31.7 30.8 108 106 96
200 39.3 39.7 32.5 112 89 103 34.5 31.7 30.5 108 106 95
210 40.2 39.7 32.3 112 90 102 34.5 31.5 30.3 107 106 96
220 38.6 38.7 31.5 110 89 104 34.2 29.9 28.6 106 104 95
230 39.3 38.7 31.5 111 88 105 32.7 29.5 28.6 106 104 96
240 38.2 38.5 30.5 109 89 104 32.2 28.6 28.0 106 104 96
250 40.3 38.1 31.2 110 90 103 31.6 29.1 27.4 105 102 96
260 39.6 36.4 30.0 107 90 100 29.6 28.7 27.7 105 102 97
270 38.7 36.9 29.3 108 94 98 28.8 27.9 26.6 104 103 94
280 39.6 36.2 28.9 106 91 98 32.5 27.2 26.2 105 102 93
290 40.1 37.0 28.3 107 91 95 31.5 26.6 26.6 105 100 91
300 38.2 37.9 28.0 104 90 92 30.6 26.6 25.7 104 101 94
310 40.0 37.1 27.4 105 91 92 30.6 26.3 26.0 105 97 93
30.3 26.2 26.1 104 95 93
30.2 26.0 25.7 103 95 93
29.7 25.3 26.5 102 90 94
乳糖1.5 mg/4kg (@30min)+微粉化倍半水合物之晶體形式實例6e 1.5 mg/4kg (@90min)
時間 PAP BP
0
10
20 42.0 36.4 37.5 99 107 119
30 41.9 37.1 37.5 99 104 117
40 42.0 37.3 38.6 99 108 119
50 41.4 37.4 39.8 99 109 118
60 41.4 36.8 41.2 100 107 118
70 41.0 37.4 41.3 100 109 118
80 40.9 38.1 40.8 101 114 119
90 40.4 39.5 40.7 102 116 118
100 40.7 38.7 39.6 99 111 117
110 36.5 37.6 35.4 101 112 116
120 34.3 36.4 30.8 101 114 115
130 32.3 35.7 28.6 101 114 115
140 30.8 35.0 27.5 99 120 114
150 30.3 29.0 26.6 99 121 114
160 29.0 30.3 26.9 100 122 114
170 28.0 28.3 25.1 101 121 115
180 25.8 30.8 25.3 99 119 115
190 25.1 30.8 23.9 99 123 114
200 25.5 30.6 24.6 98 116 113
210 25.0 30.8 24.2 99 117 116
220 24.3 32.9 23.6 97 123 114
230 24.0 31.5 23.6 97 119 114
240 24.3 31.0 23.5 97 119 112
250 24.2 31.3 22.9 97 118 111
260 24.0 31.5 23.5 96 116 112
270 24.5 29.8 22.6 99 115 109
280 23.9 29.8 22.8 97 111 110
290 23.5 30.3 22.0 97 110 107
300 24.6 30.0 22.2 98 109 108
310 23.9 29.6 21.9 97 109 105
25.3 29.1 22.5 94 108 105
25.1 28.5 21.6 97 108 105
表 31 ：氣管內施用不同乳糖載體、乳糖調配物I (7.5 µg/kg)、乳糖調配物II (22.5 µg/kg)和微粉化倍半水合物，例如實例6e (375 µg/kg)後的效用。數據顯示為相對於PAP基線的百分比變化，為各動物之絕對值。
時間 乳糖調配物I 2% 乳糖LH300/LH200  20：78 m/m 乳糖調配物II 6% 乳糖 LH300/LH200  20：80 m/m
80 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
90 97.6 100.8 99.8 96.0 101.5 101.0 100.7 101.9 105.7 102.0 100.7 97.9
100 89.7 103.8 94.3 90.9 99.3 103.2 102.8 98.0 100.6 103.3 102.9 97.6
110 84.7 103.6 96.8 103.9 100.2 104.0 99.3 93.0 99.7 104.3 101.5 99.4
120 90.9 107.1 94.6 107.7 101.9 105.7 95.1 92.7 96.0 105.8 104.6 102.0
130 92.6 107.1 92.0 107.9 106.3 105.4 94.6 90.6 88.5 108.0 103.6 102.3
140 97.5 107.1 88.8 108.0 110.1 106.7 92.8 89.1 89.4 109.8 103.3 99.5
150 97.5 106.7 86.0 90.2 86.9 84.7 110.8 106.4 103.8
160 98.6 103.5 84.3 86.3 88.6 80.7 112.1 107.4 101.3
170 98.4 96.6 83.7 82.6 80.5 81.1 111.2 106.6 100.4
180 96.4 95.5 82.9 80.1 80.8 76.7 111.9 108.6 106.1
190 97.6 93.3 82.9 80.4 80.9 76.0
200 97.6 93.3 82.1 80.2 80.1 75.4
210 98.8 97.1 84.6 79.6 76.1 71.0
220 93.7 97.3 81.9 76.1 75.2 71.2
230 95.8 97.3 81.3 74.9 72.9 69.6
240 92.1 94.6 79.4 73.5 74.1 68.2
250 93.7 94.6 79.3 68.9 73.1 68.9
260 91.0 94.1 76.8 66.9 71.1 66.1
270 96.1 93.1 78.5 75.6 69.4 65.1
280 94.5 89.2 75.5 73.4 67.8 66.1
290 92.3 90.2 73.7 71.2 67.9 64.0
300 94.3 88.6 72.8 71.2 67.1 64.7
310 95.7 90.5 71.3 70.6 66.7 65.0
320 91.0 92.8 71.3 70.2 66.3 63.9
330 95.4 90.8 69.1 69.2 64.5 66.0
時間 微粉化倍半水合物實例6e 乳糖LH300/LH200  20：80 m/m
80 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
90 98.9 103.6 99.8 99.7 101.8 100.1
100 99.5 101.4 97.3 100.0 102.3 103.2
110 89.3 98.7 86.8 98.6 102.5 106.3
120 84.0 95.6 75.7 98.6 101.0 110.1
130 78.9 93.7 70.2 97.7 102.6 110.1
140 75.2 91.8 67.5 97.4 104.6 108.8
150 74.0 76.0 65.4
160 71.0 79.5 65.9
170 68.5 74.3 61.5
180 63.2 80.8 62.0
190 61.5 80.8 58.6
200 62.3 80.3 60.2
210 61.0 80.7 59.4
220 59.5 86.3 57.8
230 58.6 82.6 57.8
240 59.3 81.5 57.6
250 59.3 82.2 56.1
260 58.8 82.7 57.6
270 59.9 78.3 55.4
280 58.4 78.3 55.9
290 57.4 79.6 53.9
300 60.1 78.7 54.5
310 58.4 77.6 53.7
320 61.8 76.3 55.1
330 61.3 74.8 53.0
總言之，包括化合物實例11之晶體形式，例如倍半水合物實例6e的所有乾粉調配物在此急性PAH模型中吸入施用乾粉後選擇性地和劑量依賴地降低了PAP，具有至少4小時之長作用持續時間。對於化合物11之晶體形式的漸增劑量，觀察到清晰的劑量反應曲線。相較於霧化液體調配物(最大效用在開始吸入後約90 min)，乾粉調配物最大效用延遲到較晚的時間點(乳糖調配物I(2% w/w)~190 min，乳糖調配物II(6% w/w)~170 min)(參見圖49)。 評估不同水合物之乾粉的功效
此外，就評估比較實例11之不同水合物的功效，係將比較實例11以1.5 mg/4kg (=375 µg/kg)的劑量作為微粉化單水合物II(實例2)、微粉化半水合物(類似於實例6a)，以及微粉化倍半水合物(類似於實例6e)經由PennCentury®乾粉吹入器氣管內施用於PAH小型豬中。在各實驗開始時應用純乳糖媒劑作為參照。所有3種水合物在有關PAP下降以及全身BP下降上顯示相當的功效(見圖50和51)。在觀察間隔的最後一小時內，所有3種水合物對全身血壓有輕微影響。在相當高的標稱劑量375 µg/kg氣管內(i.t.)施用時，此輕微的全身BP下降可能是經由藥物的全身性外溢所致。其亦可能反映麻醉動物在麻醉期間的BP有所降低。 表 32 ：在氣管內施用不同水合物微粉化單水合物II(實例2)、微粉化半水合物(實例6a)和微粉化倍半水合物(實例6e)後比較實例11對BP和PAP之效用。數據顯示為絕對值[mmHg]為平均值±SEM (n=3)。
單水合物II (實例2) 半水合物(實例6a)
時間 BP(平均) PAP(平均) BP(平均) PAP(平均)
-10 116 126 139 37.9 37.8 39.4 99 85 86 38.7 40.6 38.7
0 109 127 136 35.8 38.7 39.7 101 85 85 39.6 40.8 38.5
10 110 126 135 35.8 38.7 37.1 103 83 79 40.2 41.1 41.1
20 117 128 139 38.9 38.2 40.2 101 83 84 40.4 41.3 41.3
30 121 128 139 39.8 38.6 40.0 100 81 88 40.2 41.3 41.3
40 123 127 137 40.4 39.0 40.7 98 81 90 40.4 41.8 41.0
50 120 127 135 39.7 39.2 40.2 99 78 89 40.7 41.7 40.9
60 121 127 136 39.9 39.2 40.8 100 79 86 41.2 42.0 40.9
70 124 126 137 39.1 36.0 37.2 102 78 87 38.8 40.6 40.1
80 123 124 135 39.1 36.1 35.9 102 79 90 34.1 39.9 37.7
90 122 125 134 37.9 35.2 34.5 101 81 92 30.1 37.7 36.6
100 122 124 132 36.8 33.2 32.7 100 80 95 28.3 35.9 35.0
110 122 125 133 35.5 31.9 31.2 99 79 99 27.2 34.8 34.0
120 121 125 132 34.8 30.2 29.8 99 79 96 26.4 34.1 32.9
130 120 124 131 34.2 29.7 29.3 98 81 97 25.7 33.7 31.7
140 119 125 131 34.3 29.3 28.6 99 82 98 25.3 33.2 31.3
150 117 124 130 33.7 28.4 28.4 97 82 97 25.0 32.9 30.7
160 117 121 130 33.7 27.8 27.8 96 81 97 24.5 32.5 30.2
170 116 120 129 33.5 27.5 28.0 95 79 95 24.0 32.4 29.9
180 114 117 132 33.5 27.1 28.1 94 79 94 23.7 31.9 29.7
190 112 116 133 33.6 26.7 28.3 94 85 93 24.4 32.4 29.2
200 109 115 131 33.5 26.8 28.0 92 85 92 24.8 32.4 29.4
210 110 117 130 33.4 26.3 27.6 90 81 91 24.8 31.9 29.2
220 110 116 128 33.7 26.3 27.1 89 79 89 24.7 31.7 29.1
230 111 115 129 33.8 26.0 27.6 87 78 89 24.0 31.3 28.6
240 111 113 121 33.3 26.6 26.8 87 77 87 24.1 31.3 28.1
250 109 110 123 33.2 26.0 26.3 85 76 85 24.2 30.7 28.1
260 109 108 119 33.4 26.3 26.7 85 76 84 24.1 30.6 28.1
270 108 106 119 33.6 25.9 26.3 85 76 87 24.4 30.6 27.8
280 108 104 116 33.4 26.3 26.2 85 75 84 24.3 30.7 28.0
290 106 102 114 33.2 25.9 25.8 84 75 83 24.1 30.7 27.6
300 105 101 114 33.1 25.9 25.7 83 77 82 23.7 30.5 27.7
倍半水合物(實例6e)
時間 BP(平均) PAP(平均)
-10 99 107 119 42.0 36.4 37.5
0 99 104 117 41.9 37.1 37.5
10 99 108 119 42.0 37.3 38.6
20 99 109 118 41.4 37.4 39.8
30 100 107 118 41.4 36.8 41.2
40 100 109 118 41.0 37.4 41.3
50 101 114 119 40.9 38.1 40.8
60 102 116 118 40.4 39.5 40.7
70 99 111 117 40.7 38.7 39.6
80 101 112 116 36.5 37.6 35.4
90 101 114 115 34.3 36.4 30.8
100 101 114 115 32.3 35.7 28.6
110 99 120 114 30.8 35.0 27.5
120 99 121 114 30.3 29.0 26.6
130 100 122 114 29.0 30.3 26.9
140 101 121 115 28.0 28.3 25.1
150 99 119 115 25.8 30.8 25.3
160 99 123 114 25.1 30.8 23.9
170 98 116 113 25.5 30.6 24.6
180 99 117 116 25.0 30.8 24.2
190 97 123 114 24.3 32.9 23.6
200 97 119 114 24.0 31.5 23.6
210 97 119 112 24.3 31.0 23.5
220 97 118 111 24.2 31.3 22.9
230 96 116 112 24.0 31.5 23.5
240 99 115 109 24.5 29.8 22.6
250 97 111 110 23.9 29.8 22.8
260 97 110 107 23.5 30.3 22.0
270 98 109 108 24.6 30.0 22.2
280 97 109 105 23.9 29.6 21.9
290 94 108 105 25.3 29.1 22.5
300 97 108 105 25.1 28.5 21.6
表 33 ：在氣管內施用不同水合物微粉化單水合物II(實例2)、微粉化半水合物(類比實例6a)和微粉化倍半水合物(類比實例6e)後比較實例11對BP和PAP之效用。數據顯示為對比預置值之%變化為各動物的絕對值。
單水合物II (實例2) 半水合物(實例6a)
時間 PAP BP PAP BP
50 99.1 99.2 98.5 99.1 100.1 100.0 99.3 98.7 98.9 99.6 98.4 100.6
60 99.7 99.3 99.8 99.9 100.1 100.7 100.7 99.4 99.2 100.6 99.7 97.2
70 97.7 91.1 91.0 102.4 99.3 101.4 94.7 96.1 97.0 102.6 98.4 98.4
80 97.7 91.3 88.0 101.6 97.7 100.0 83.4 94.5 91.2 102.6 99.7 101.8
90 94.7 89.1 84.5 100.7 98.5 99.2 73.4 89.2 88.7 101.6 102.2 104.0
100 91.8 84.0 80.0 100.7 97.7 97.7 69.0 85.0 84.7 100.6 101.0 107.4
110 88.8 80.9 76.3 100.7 98.5 98.5 66.5 82.4 82.1 99.6 99.7 111.9
120 87.0 76.6 73.0 99.9 98.5 97.7 64.4 80.8 79.7 99.6 99.7 108.6
130 85.5 75.2 71.7 99.1 97.7 97.0 62.8 79.9 76.7 98.6 102.2 109.7
140 85.6 74.3 70.0 98.3 98.5 97.0 61.8 78.7 75.7 99.6 103.5 110.8
150 84.1 71.9 69.4 96.6 97.7 96.3 60.9 78.0 74.3 97.6 103.5 109.7
160 84.1 70.4 68.1 96.6 95.3 96.3 59.9 77.1 73.1 96.6 102.2 109.7
170 83.8 69.8 68.5 95.8 94.5 95.5 58.6 76.7 72.3 95.6 99.7 107.4
180 83.8 68.7 68.9 94.1 92.2 97.7 58.0 75.4 71.8 94.6 99.7 106.3
190 83.9 67.7 69.3 92.5 91.4 98.5 59.5 78.4 70.7 94.6 108.5 105.2
200 83.7 67.9 68.5 90.0 90.6 97.0 60.5 76.8 71.1 92.6 107.3 104.0
210 83.4 66.5 67.7 90.8 92.2 96.3 60.6 75.5 70.8 90.6 102.2 102.9
220 84.0 66.7 66.2 90.8 91.4 94.8 60.3 75.1 70.3 89.6 99.7 100.6
230 84.5 65.8 67.6 91.6 90.6 95.5 58.7 74.1 69.1 87.6 98.4 100.6
240 83.2 67.3 65.6 91.6 89.0 89.6 58.9 74.2 68.0 87.6 97.2 98.4
250 83.0 65.7 64.3 90.0 86.7 91.1 59.0 72.7 67.9 85.5 95.9 96.1
260 83.3 66.7 65.4 90.0 85.1 88.1 58.8 72.5 68.0 85.5 95.9 95.0
270 83.8 65.6 64.3 89.2 83.5 88.1 59.6 72.4 67.3 85.5 95.9 98.4
280 83.3 66.5 64.1 89.2 81.9 85.9 59.3 72.6 67.8 85.5 94.6 95.0
290 82.8 65.5 63.1 87.5 80.4 84.4 58.8 72.6 66.7 84.5 94.6 93.9
300 82.7 65.7 62.9 86.7 79.6 84.4 57.9 72.2 67.1 83.5 97.2 92.7
倍半水合物(實例6e)
時間 PAP BP
50 98.3 96.2 101.2 101.4 98.5 100.3
60 97.2 99.6 101.1 102.5 100.3 99.4
70 97.8 97.5 98.5 99.4 96.0 98.6
80 87.8 94.9 87.9 101.4 96.8 97.7
90 82.5 92.0 76.6 101.4 98.5 96.9
100 77.6 90.1 71.1 101.4 98.5 96.9
110 74.0 88.3 68.4 99.4 103.7 96.1
120 72.8 73.1 66.2 99.4 104.6 96.1
130 69.8 76.4 66.8 100.4 105.5 96.1
140 67.3 71.4 62.2 101.4 104.6 96.9
150 62.1 77.7 62.8 99.4 102.9 96.9
160 60.4 77.7 59.3 99.4 106.3 96.1
170 61.3 77.3 61.0 98.4 100.3 95.2
180 60.0 77.6 60.1 99.4 101.1 97.7
190 58.5 83.0 58.5 97.4 106.3 96.1
200 57.6 79.4 58.5 97.4 102.9 96.1
210 58.3 78.3 58.3 97.4 102.9 94.4
220 58.3 79.0 56.8 97.4 102.0 93.5
230 57.8 79.6 58.3 96.4 100.3 94.4
240 58.9 75.3 56.1 99.4 99.4 91.8
250 57.4 75.3 56.6 97.4 96.0 92.7
260 56.4 76.5 54.6 97.4 95.1 90.2
270 59.1 75.7 55.2 98.4 94.2 91.0
280 57.4 74.6 54.4 97.4 94.2 88.5
290 60.8 73.3 55.8 94.4 93.4 85.9
300 60.3 72.0 53.7 101.4 90.8 84.3
E-2.1在健康男性受試者中吸入投予sGC活化劑7天-cGMP和支氣管擴張
健康的白種人男性受試者年齡為18至45歲，身體質量指數(BMI)高於/等於18.5和低於/等於29.9 kg/m2，在為期7天的臨床藥理學I期研究中以每天一次吸入480 µg或1000 µg或2000 µg劑量(2顆1000 µg膠囊)(標稱劑量)之包括實例2或安慰劑的乾粉調配物治療。受試者藉由一次深吸氣從插入手持式吸入裝置的膠囊(見C-1，例如表22和23)吸入藥粉。該藥物的乾粉調配物係分散至氣流中並將細顆粒輸送到肺部深處，希望在該處使PH病患的血管舒張，從而實質降低PAH病患或其他PH亞型之中央肺血管中增加的血壓。此種效應無法顯現在肺部健康的受試者中。此外，吸入的藥物造成支氣管擴張且因而改善具有病理性支氣管收縮的PH病患中的肺部疾病狀態。此種效用係經由身體體積描記法測量健康受試者中下降的特殊氣道阻力。深度吸氣後，受試者屏住呼吸2秒，使得乾粉藥物從氣流凝結於更深的肺部區域的表面，並沉積在靠近其意欲的藥理作用位置。藥物在一天內溶解並經由內襯液平衡肺部。分析了隨時間變化的血漿濃度，作為肺中藥物濃度之替代物，並在吸入後2.0至2.5小時顯現最大血液濃度，之後經由血流支撐肺部的藥物平衡。在首次吸入後，產生一可測量的血漿濃度，如所有投予的劑量所示，其持續48小時，在每天一次吸入14天後24小時內產生穩態藥物濃度，且因而支持藥物在od吸入後的24/7活性。
藉由分析血液樣本的cGMP來控制健康男性中的藥物活性，對所有劑量，7天治療的第一次藥物吸入之前之後及最後一次藥物吸入之後將sGC藥理學活化之直接產物與治療前當日的測量值相比。
此參數與基線相比的變化分析顯示cGMP劑量依賴的增加，於第一次吸入後約2小時開始，在投予實例2後6小時(480和1000 µg劑量)和8小時(2000 µg劑量)達到高峰(參見圖52至56)。相較於全身藥物濃度，此延長的活性係由以吸入乾粉之給藥模式所造成，其將藥物沉積在肺的更深部分，導致每天一次吸入後24小時期間的活性藥物濃度。在投予480、1000和2000 µg實例2後，在第一個記述日觀察到的高峰平均值±SD cGMP值為8.84 ± 1.35、11.69 ± 1.86和16.52 ± 4.24 nmol/L。
重複給劑7天後，觀察到cGMP的平均峰值進一步增加，為投予個別劑量後11.96 ± 2.80、16.70 ± 2.96和32.67 ± 9.48 nmol/L。在第一次治療後10天，平均cGMP濃度已回到接近給劑前所觀察到的濃度。cGMP數據顯示每天一次吸入藥物實例2於sGC目標上產生意欲的劑量依賴效用(參見圖56)。 表 34 ：與基線相比之環單磷酸鳥苷變化(nmol/L)(SAF)
安慰劑 480 µg， 實例2 1000 µg， 實例2 2000 µg， 實例2
-0D 22H 00M 0.47 ± 0.90 1.17 ± 1.00 0.08 ± 1.41 0.66 ± 0.79
-0D 20H 00M -0.11 ± 1.13 0.52 ± 0.95 -0.24 ± 1.75 0.48 ± 0.71
-0D 18H 00M 0.71 ± 1.41 0.21 ± 1.74 -0.87 ± 1.44 0.17 ± 0.78
-0D 16H 00M -0.26 ± 1.89 0.41 ± 0.96 -0.43 ± 1.49 0.29 ± 1.17
-0D 12H 00M -0.11 ± 1.34 0.22 ± 1.17 -0.77 ± 1.72 0.28 ± 0.97
-0D 09H 00M -0.67 ± 1.25 0.20 ± 1.59 -0.84 ± 2.04 -0.18 ± 0.90
0D 00H 00M -0.77 ± 1.27 0.11 ± 1.10 -0.11 ± 1.62 0.68 ± 1.14
0D 02H 00M 0.42 ± 0.52 1.73 ± 0.82 3.26 ± 2.04 4.78 ± 1.35
0D 04H 00M -0.68 ± 2.23 3.04 ± 1.39 5.64 ± 2.54 9.18 ± 2.50
0D 06H 00M -0.40 ± 2.23 3.33 ± 1.39 6.78 ± 2.79 11.04 ± 3.21
0D 08H 00M 0.33 ± 2.56 2.94 ± 1.38 5.94 ± 2.65 11.69 ± 2.78
0D 12H 00M -0.24 ± 2.07 2.10 ± 1.18 4.86 ± 2.91 8.56 ± 2.19
0D 15H 00M -0.58 ± 2.14 1.53 ± 1.50 3.70 ± 2.59 7.54 ± 2.32
1D 00H 00M -0.18 ± 2.06 0.84 ± 0.89 1.26 ± 1.98 3.48 ± 0.90
2D 00H 00M -0.30 ± 2.26 0.74 ± 1.59 0.33 ± 1.99 1.57 ± 0.86
3D 00H 00M -0.14 ± 2.10 1.00 ± 1.92 2.31 ± 2.68 5.17 ± 1.51
4D 00H 00M 0.31 ± 1.99 1.46 ± 1.24 2.86 ± 2.63 9.33 ± 2.55
5D 00H 00M 0.27 ± 2.34 1.50 ± 0.98 3.59 ± 2.51 11.10 ± 3.49
6D 00H 00M 0.71 ± 2.21 1.92 ± 1.21 4.32 ± 2.82 11.71 ± 2.66
7D 00H 00M 0.21 ± 0.83 1.68 ± 0.85 4.74 ± 2.98 11.36 ± 3.37
7D 02H 00M 0.07 ± 0.81 4.22 ± 2.29 6.93 ± 2.99 17.33 ± 4.18
7D 04H 00M 0.20 ± 0.71 5.39 ± 2.34 10.84 ± 2.91 22.23 ± 4.75
7D 06H 00M 0.72 ± 1.06 6.44 ± 2.26 11.79 ± 3.70 27.39 ± 6.93
7D 08H 00M 1.26 ± 1.68 5.19 ± 1.64 11.00 ± 4.58 27.83 ± 7.77
7D 12H 00M 0.59 ± 1.00 3.71 ± 1.79 9.19 ± 5.26 23.33 ± 5.53
7D 15H 00M 0.02 ± 0.73 3.04 ± 2.09 8.00 ± 4.41 19.08 ± 4.95
8D 00H 00M 0.81 ± 0.54 1.69 ± 2.65 4.47 ± 3.81 11.17 ± 3.69
8D 12H 00M 0.66 ± 1.11 0.69 ± 1.53 2.30 ± 3.05 8.02 ± 2.45
9D 00H 00M 0.08 ± 0.73 0.13 ± 1.97 1.38 ± 2.59 5.64 ± 1.36
9D 12H 00M 0.70 ± 1.64 1.10 ± 1.01 1.02 ± 2.24 4.57 ± 2.15
10D 00H 00M 0.89 ± 1.47 -0.00 ± 0.64 1.42 ± 2.87 3.26 ± 1.07
表 35 ：cGMP隨時間變化的cGMP平均值(安慰劑、480、1000和2000 µg，實例2各N=9)：藥物吸入前(基線)(-1d02h–0d00h)首次吸入日後(0d00h–2d00h)，吸入後在第3d00h-7d00h天波谷測量值和最後7天吸入後(7d00h-10d00h)。
安慰劑 480 µg， 實例2 1000 µg， 實例2 2000 µg， 實例2
-1D 02H 00M 5.83 ± 2.01 5.40 ± 1.41 5.02 ± 1.59 4.16 ± 1.70
-0D 22H 00M 6.30 ± 2.42 6.57 ± 1.22 5.10 ± 1.46 4.81 ± 2.22
-0D 20H 00M 5.72 ± 2.00 5.92 ± 0.83 4.78 ± 1.37 4.63 ± 1.86
-0D 18H 00M 6.54 ± 2.68 5.61 ± 0.71 4.16 ± 0.92 4.32 ± 1.33
-0D 16H 00M 5.58 ± 2.13 5.81 ± 1.09 4.59 ± 1.06 4.44 ± 2.15
-0D 12H 00M 5.72 ± 2.17 5.62 ± 1.26 4.26 ± 0.99 4.43 ± 2.24
-0D 09H 00M 5.17 ± 1.90 5.60 ± 1.08 4.18 ± 0.82 3.98 ± 1.91
0D 00H 00M 5.07 ± 1.90 5.51 ± 1.00 4.91 ± 1.27 4.83 ± 2.52
0D 02H 00M 5.49 ± 2.03 7.24 ± 1.25 8.17 ± 1.07 9.61 ± 3.65
0D 04H 00M 4.39 ± 1.20 8.56 ± 1.45 10.56 ± 1.47 14.01 ± 4.51
0D 06H 00M 4.67 ± 1.25 8.84 ± 1.35 11.69 ± 1.86 15.88 ± 5.09
0D 08H 00M 5.40 ± 1.70 8.46 ± 1.59 10.86 ± 1.66 16.52 ± 4.24
0D 12H 00M 4.82 ± 1.35 7.61 ± 1.01 9.77 ± 2.11 13.39 ± 4.01
0D 15H 00M 4.49 ± 0.90 7.04 ± 1.50 8.61 ± 1.63 12.38 ± 4.17
1D 00H 00M 4.89 ± 1.16 6.36 ± 1.10 6.17 ± 1.05 8.31 ± 2.88
2D 00H 00M 4.77 ± 0.74 6.26 ± 2.17 5.24 ± 1.28 6.40 ± 2.09
3D 00H 00M 4.92 ± 0.87 6.51 ± 2.62 7.22 ± 2.04 10.00 ± 3.51
4D 00H 00M 5.38 ± 1.06 6.97 ± 1.96 7.77 ± 1.87 14.17 ± 4.36
5D 00H 00M 5.33 ± 1.07 7.01 ± 1.72 8.50 ± 2.13 15.93 ± 5.52
6D 00H 00M 5.78 ± 1.42 7.43 ± 1.69 9.23 ± 2.12 16.54 ± 4.60
7D 00H 00M 5.28 ± 1.86 7.19 ± 1.47 9.66 ± 2.30 16.19 ± 5.02
7D 02H 00M 5.13 ± 1.97 9.73 ± 3.00 11.84 ± 2.18 22.17 ± 6.07
7D 04H 00M 5.27 ± 2.05 10.90 ± 3.12 15.76 ± 2.29 27.07 ± 7.01
7D 06H 00M 5.79 ± 2.16 11.96 ± 2.80 16.70 ± 2.96 32.22 ± 8.83
7D 08H 00M 6.32 ± 3.30 10.70 ± 2.27 15.91 ± 3.86 32.67 ± 9.48
7D 12H 00M 5.66 ± 2.17 9.22 ± 2.37 14.10 ± 4.55 28.17 ± 7.50
7D 15H 00M 5.09 ± 1.97 8.56 ± 2.80 12.91 ± 3.72 23.91 ± 6.59
8D 00H 00M 5.88 ± 2.07 7.20 ± 3.23 9.38 ± 3.11 16.00 ± 5.77
8D 12H 00M 5.72 ± 2.10 6.20 ± 2.00 7.21 ± 2.24 12.86 ± 3.96
9D 00H 00M 5.14 ± 1.60 5.64 ± 2.53 6.29 ± 1.86 10.48 ± 3.49
9D 12H 00M 5.77 ± 3.38 6.61 ± 1.80 5.93 ± 1.39 9.40 ± 3.10
10D 00H 00M 5.96 ± 2.26 5.51 ± 1.39 6.33 ± 2.30 8.09 ± 2.81
經由身體體積描記法測量的肺功能參數顯示，在第一次給劑實例2後6小時測量的總特殊氣道阻力sRaw，一種健康肺中支氣管擴張活性的參數，與基線相比下降了-0.142至-0.296 kPa/sec，並在所有劑量組中皆觀察到(參見圖57和表36)。 表 36 ：平均(就安慰劑，480、1000和2000 µg實例2各為N=9)隨時間變化的總特殊氣道阻力(kPa/秒)：篩選1/2，治療前一日(-1d00h – 0d00h)第一吸入日(0d00h)-0d06h)，吸入後2d02h-6d04h)和最後7天吸入後(7d00h-7d06h)之測量值。
安慰劑 480 µg， 實例2 1000 µg， 實例2 2000 µg， 實例2
篩選 0.829 ± 0.494 0.844 ± 0.327 0.867 ± 0.376 0.899 ± 0.150
篩選2 0.934 ± 0.522 0.832 ± 0.280 1.009 ± 0.340 0.957 ± 0.140
-1D 00H 00M 0.896 ± 0.301 0.939 ± 0.344 0.996 ± 0.194 0.962 ± 0.266
-0D 22H 00M 0.916 ± 0.332 0.928 ± 0.392 0.903 ± 0.255 0.933 ± 0.165
-0D 18H 00M 0.942 ± 0.302 0.921 ± 0.305 0.901 ± 0.187 0.943 ± 0.245
0D 00H 00M 0.991 ± 0.341 1.078 ± 0.375 0.967 ± 0.233 0.947 ± 0.143
0D 02H 00M 0.948 ± 0.307 0.839 ± 0.182 0.859 ± 0.143 0.677 ± 0.139
0D 06H 00M 0.876 ± 0.268 0.800 ± 0.187 0.824 ± 0.180 0.651 ± 0.149
2D 02H 00M 0.913 ± 0.211 0.883 ± 0.310 0.797 ± 0.141 0.748 ± 0.155
4D 02H 00M 0.902 ± 0.197 0.807 ± 0.200 0.853 ± 0.172 0.709 ± 0.178
6D 04H 00M 0.872 ± 0.192 0.798 ± 0.193 0.787 ± 0.168 0.722 ± 0.168
7D 00H 00M 0.978 ± 0.261 0.823 ± 0.274 0.917 ± 0.227 0.844 ± 0.097
7D 02H 00M 0.872 ± 0.223 0.777 ± 0.282 0.764 ± 0.140 0.716 ± 0.089
7D 06H 00M 0.918 ± 0.212 0.803 ± 0.280 0.787 ± 0.188 0.730 ± 0.151
E-2.2在健康男性受試者中吸入投予sGC活化劑14天用以評估穩態藥物代謝動力學
健康的白種人男性受試者，年齡18至45歲，身體質量指數(BMI)高於/等於18.5和低於/等於29.9kg/m2，在臨床藥理學I期研究中接受為期14日之每天一次1000 µg劑量(標稱劑量)之安慰劑或含有實例4之乾粉調配物的吸入治療。受試者藉由一次深吸氣從插入手持式吸入裝置的膠囊吸入藥粉(參見C項下，例如表17和20)，進入肺部深處。在無肺功能病理生理損傷的受試者中無法評估中央肺血管中增加的血壓力之意欲實質的降低。已分析隨時間變化的血漿濃度，作為肺中藥物濃度的替代物。在每天一次吸入給劑14天用以產生在24小時期間穩態藥物濃度後的分析顯示，在吸入7至11天後達到穩態。在健康的受試者中藉由分析血液樣本之cGMP，控制健康男性中藥物活性/目標參與。結果係以平均值顯示於表37中，以及圖58和表38中與基線相較的變化，在1周治療後具有最大值，並顯示最遲在治療11天後達到cGMP濃度之穩態(如恆定的目標參與之生物標誌物)。 表 37 ：安慰劑(N=4)和1000 µg(N=17)實例4)在治療前當日(-1d00h–-0d09h)第一吸入日(-0d02h-1d00h；)，在第2d00h-2d12h、6d00h-6d12h、10d00h-10d12h吸入之前和之後(概況)，在第3d-5d、7d-9d、11d-12d吸入之前的波谷，及最後14日吸入之前和之後(12d22h-20d00h)，隨時間變化的cGMP濃度(nmol/L)之平均值+/-標準差。
平均 安慰劑(n=4) 1000µg，(n=17) 實例4
-1D 02H 00M 4775.0 +/- 1530.5 5264.7 +/- 2006.8
-0D 22H 00M 4800.0 +/- 469.0 5164.7 +/- 1680.0
-0D 20H 00M 4175.0 +/- 1345.1 4311.8 +/- 1956.4
-0D 18H 00M 4925.0 +/- 797.4 5011.8 +/- 1875.5
-0D 16H 00M 5250.0 +/- 914.7 5941.2 +/- 2641.7
-0D 12H 00M 7900.0 +/- 3763.9 5570.6 +/- 2087.4
-0D 09H 00M 6400.0 +/- 1180.4 5488.2 +/- 1654.9
-0D 02H 00M 3900.0 +/- 668.3 4329.4 +/- 1509.5
0D 02H 00M 6200.0 +/- 1930.5 9170.6 +/- 2348.3
0D 04H 00M 4625.0 +/- 1173.0 11623.5 +/- 2636.9
0D 06H 00M 4000.0 +/- 559.8 14276.5 +/- 3557.1
0D 08H 00M 4500.0 +/- 469.0 14888.2 +/- 3618.2
0D 12H 00M 4500.0 +/- 1409.5 11812.5 +/- 2708.5
0D 15H 00M 4750.0 +/- 1443.4 11064.7 +/- 2963.1
1D 00H 00M 4425.0 +/- 590.9 7305.9 +/- 1593.5
2D 00H 00M 4200.0 +/- 697.6 8876.5 +/- 2507.6
2D 03H 00M 5366.7 +/- 1150.4 17282.4 +/- 4749.9
2D 08H 00M 4700.0 +/- 1493.3 20770.6 +/- 6604.0
2D 12H 00M 4233.3 +/- 1436.4 16941.2 +/- 5408.8
3D 00H 00M 4033.3 +/- 1050.4 9488.2 +/- 2238.5
4D 00H 00M 3466.7 +/- 1429.5 10694.1 +/- 2193.0
5D 00H 00M 3166.7 +/- 1059.9 10252.9 +/- 2390.4
6D 00H 00M 4566.7 +/- 2285.5 9423.5 +/- 2613.1
6D 03H 00M 3800.0 +/- 608.3 17735.3 +/- 4290.1
6D 08H 00M 4266.7 +/- 1222.0 24452.9 +/- 7374.6
6D 12H 00M 4266.7 +/- 750.6 18194.1 +/- 4785.2
7D 00H 00M 3700.0 +/- 1058.3 10511.8 +/- 2026.4
8D 00H 00M 3733.3 +/- 1331.7 10529.4 +/- 1910.7
9D 00H 00M 3800.0 +/- 173.2 10911.8 +/- 2620.6
10D 00H 00M 3766.7 +/- 1011.6 10776.5 +/- 2286.0
10D 03H 00M 4200.0 +/- 1212.4 17058.8 +/- 4319.2
10D 08H 00M 4666.7 +/- 1703.9 21858.8 +/- 6188.5
10D 12H 00M 3800.0 +/- 655.7 17329.4 +/- 4529.3
11D 00H 00M 3966.7 +/- 1357.7 11270.6 +/- 2814.9
12D 00H 00M 4400.0 +/- 1389.2 12388.2 +/- 3016.4
12D 22H 00M 4466.7 +/- 1021.4 11276.5 +/- 3261.8
13D 02H 00M 3800.0 +/- 700.0 13447.1 +/- 2802.9
13D 04H 00M 3200.0 +/- 624.5 17276.5 +/- 4328.9
13D 06H 00M 3633.3 +/- 461.9 21370.6  +/- 5581.2
13D 08H 00M 3933.3 +/- 901.8 22047.1+/- 5535.0
13D 12H 00M 3700.0 +/- 964.4 17217.6 +/- 4806.0
13D 15H 00M 3433.3 +/- 896.3 16382.4 +/- 4045.9
14D 00H 00M 3300.0 +/- 1053.6 9735.3+/- 2740.0
15D 00H 00M 3433.3 +/- 960.9 6852.9 +/- 1222.3
15D 12H 00M 4533.3 +/- 1680.3 7370.6 +/- 1654.8
16D 00H 00M 3666.7 +/- 665.8 6329.4 +/- 1357.3
16D 12H 00M 4800.0 +/- 1500.0 6735.3 +/- 1394.6
17D 00H 00M 2866.7 +/- 577.4 4729.4 +/- 995.5
20D 00H 00M 4033.3 +/- 1893.0 5518.8 +/- 1505.2
追蹤 4566.7 +/- 1078.6 5847.1  +/- 2013.4
表 38 ：在治療前當日(-1d00h--0d09h)第一次吸入日(-0d02h - 1d00h；)、第2d00h-2d12h、6d00h-6d12h、10d00h-10d12h(記述日)吸入後，在第3d–5d、7d-9d、11d-12d天吸入前的波谷和最後14日吸入後(12d22h-20d00h)，與基線相比的cGMP變化(nmol/L)
Δ基線 安慰劑(n=4) 1000 µg，(n=17)實例4
-1D 02H 00M 基線 基線
-0D 22H 00M 25.0  +/- 1408.0 -100.0 +/-1403.1
-0D 20H 00M -600.0 +/- 2219.6 -952.9 +/-1984.7
-0D 18H 00M 150.0  +/-2120.5 -252.9 +/-1345.9
-0D 16H 00M 475.0 +/-2091.8 676.5 +/-1844.1
-0D 12H 00M 3125.0 +/-2742.7 305.9 +/-1880.3
-0D 09H 00M 1625.0 +/-2118.8 223.5 +/-1396.2
-0D 02H 00M 基線 基線
0D 02H 00M 2300.0 +/-1529.7 4841.2 +/-2006.9
0D 04H 00M 725.0 +/-981.1 7294.1 +/-2972.3
0D 06H 00M 100.0 +/-516.4 9947.1 +/-3796.2
0D 08H 00M 600.0 +/-778.9 10558.8 +/-3607.1
0D 12H 00M 600.0 +/-1067.7 7531.3 +/-3057.2
0D 15H 00M 850.0 +/-1097.0 6735.3 +/-2917.4
1D 00H 00M 525.0 +/-1158.7 2976.5 +/-1785.2
2D 00H 00M 300.0 +/-1067.7 4547.1 +/-2374.4
2D 03H 00M 1600.0 +/-1058.3 12952.9 +/-4814.8
2D 08H 00M 933.3 +/-1059.9 16441.2 +/-6525.1
2D 12H 00M 466.7 +/-1527.5 12611.8 +/-5555.1
3D 00H 00M 266.7 +/-1594.8 5158.8 +/-2554.4
4D 00H 00M -300.0 +/-1833.0 6364.7 +/-2482.9
5D 00H 00M -600.0 +/-1646.2 5923.5 +/-2801.2
6D 00H 00M 800.0 +/-2330.2 5094.1 +/-2382.9
6D 03H 00M 33.3 +/-945.2 13405.9 +/-4568.6
6D 08H 00M 500.0 +/-1819.3 20123.5 +/-7302.6
6D 12H 00M 500.0 +/-1081.7 13864.7 +/-4528.5
7D 00H 00M -66.7 +/-1429.5 6182.4 +/-2095.9
8D 00H 00M -33.3 +/-1934.8 6200.0 +/-2018.7
9D 00H 00M 33.3 +/-776.7 6582.4 +/-2425.7
10D 00H 00M 0.0 +/-1311.5 6447.1 +/-2255.0
10D 03H 00M 433.3 +/-1450.3 12729.4 +/-4182.7
10D 08H 00M 900.0 +/-1907.9 17529.4 +/-6277.2
10D 12H 00M 33.3 +/-1184.6 13000.0 +/-4616.5
11D 00H 00M 200.0 +/-1915.7 6941.2 +/-2865.1
12D 00H 00M 633.3 +/-2064.8 8058.8 +/-2949.8
12D 22H 00M 700.0 +/-1200.0 6947.1 +/-3016.4
13D 02H 00M 33.3 +/-503.3 9117.6 +/-2994.0
13D 04H 00M -566.7 +/-251.7 12947.1 +/-4570.3
13D 06H 00M -133.3 +/-896.3 17041.2 +/-5998.9
13D 08H 00M 166.7 +/-1422.4 17717.6 +/-5772.9
13D 12H 00M -66.7 +/-1331.7 12888.2 +/-4847.5
13D 15H 00M -333.3 +/-1159.0 12052.9 +/-3938.8
14D 00H 00M -466.7 +/-1550.3 5405.9 +/-3158.2
15D 00H 00M -333.3 +/-1436.4 2523.5 +/-1666.0
15D 12H 00M 766.7 +/-1628.9 3041.2 +/-1792.7
16D 00H 00M -100.0 +/-1058.3 2000.0 +/-1581.1
16D 12H 00M 1033.3 +/-2003.3 2405.9 +/-1555.4
17D 00H 00M -900.0 +/-964.4 400.0 +/-1434.8
20D 00H 00M 266.7 +/-2542.3 1218.8 +/-1715.1
追蹤 800.0 +/-1743.6 1517.6 +/-2343.9
E-2.3 於健康男性受試者中吸入、口服和靜脈內投予單一劑量的sGC(一種活化劑)—肺沉積
健康的白種人男性受試者，年齡18至45歲，具有身體質量指數(BMI)高於/等於18.5和低於/等於29.9kg/m2，在臨床I期研究中以單一吸入劑量1000 µg(標稱劑量)的治療，單一吸入劑量1000 µg(標稱劑量)+木炭塊，單一口服劑量1000 µg，2小時內單一輸注100 µg的實例4治療。由於靜脈內施用的生物利用度依定義一般為100%，因此高於口服或靜脈內給藥，因此仔細選擇靜脈內劑量低於口服和吸入劑量，用以避免高IV劑量所導致的較高血漿濃度和潛在的副作用，例如血壓降低或暈厥。因此，在本次研究中係選擇100 µg作為IV劑量。在治療之間應用了7天的廓清期。就口服給藥受試者係吞服一溶液(20 ml，含1000 µg，參見C-2下，表26)。受試者在2小時內接受單一輸注溶液(2 ml含100 µg，參見C-2下表26)。受試者(見下表C-1，表17和20)藉由一次深吸氣從插入手持式吸入裝置之膠囊中吸入藥粉。在吸入藥物的乾粉調配物後，某些部分標稱劑量留在膠囊和裝置中，在吸嘴處到達身體的劑量稱為發射劑量。發射劑量可如下計算/測定：標稱劑量-(留在膠囊中+留在設備中)。吸入乾粉後，一部分的發射劑量進入胃腸道(GIT)並稱為口服部份的發射劑量，經由呼吸道到達肺部之另一部分的發射劑量稱為肺劑量並代表肺沉積劑量。由於肺為作用的目標器官，因此必須量化肺沉積劑量。可藉由測定到達GIT以及殘留在膠囊和裝置中的部分標稱劑量，間接估算肺沉積。就研究和測定肺沉積，係進行下列研究(亦請參見圖59)： 1-吸入施用一單劑量1000 µg的乾粉。 2-吸入施用一單劑量1000 µg乾粉與口服木炭塊之組合。木炭塊限制了GIT部分之劑量的口服吸收，因為實例4完全吸附到木炭塊上。這意味著所測得的實例4之濃度係經由肺部到達體循環。 3-投予一口服單劑量1000 µg實例4用以測定口服吸收。 4-投予2小時輸注之實施例4用以研究消除作用。
在全部不同類型的給藥後測量實例4的血漿濃度，此外在吸入施用後測量裝置和膠囊中的殘餘物。血漿濃度分析顯示實例4在靜脈內給藥後迅速消除，消除半衰期為0.26小時。口服給藥後的消除半衰期為4.43小時。有/無木炭之吸入施用後的消除半衰期分別為16.1小時和15.1小時，參見圖60。吸入後較長的終末半衰期可解釋為實例4在肺部形成了肺貯庫，物質從該貯庫持續地轉移到循環系統。
與木炭給藥之乾粉調配物的絕對生物利用性為16.3%，而無木炭給藥的實例4為18.8%。其表示到達肺部之16.3%的實例4乾粉標稱劑量被視為肺部劑量，而到達身體的總乾粉部分為標稱劑量的18.8%。具有木炭塊之吸入施後與無木炭塊之吸入給藥後實例4的相對生物利用性為86.9%。此項顯示口服部分的劑量約為標稱劑量的13%。參見表39和40。發射劑量經計算為720 µg，因膠囊中的殘留物為160µg，裝置中的殘留物為120µg，參見圖61。
此研究結果證實了肺劑量和半衰期對於吸入乾粉給藥為足夠的，使得每天一次的治療能在肺中達到實例4之足夠24 h藥物覆蓋。 表39：G在投予1000 µg吸入、1000 µg吸入+木炭和1000 µg口服後，實例4之隨時間變化的血漿濃度(以µg/L表示)幾何平均和(以%表示的幾何標準偏差SD)
1000 µg實例4，吸入+木炭塊 1000 µg實例4，吸入 1000 µg實例4，吸入
N=16 N=16 N=16
給劑後時間 (h) 幾何平均 幾何SD 幾何平均 幾何SD 幾何平均 幾何SD
0 ＞0.0500 n.a. ＞0.0500 n.a. ＞0.0500 n.a.
0.25 0.0583 (1.78) 0.0628 (1.79) 0.777 (1.44)
0.5 0.261 (1.56) 0.316 (1.32) 3.64 (1.30)
0.75 0.491 (1.46) 0.622 (1.32) 5.28 (1.32)
1 0.662 (1.43) 0.869 (1.29) 5.68 (1.35)
1.5 0.900 (1.39) 1.16 (1.30) 4.69 (1.31)
2 0.969 (1.38) 1.20 (1.31) 3.32 (1.33)
2.5 1.02 (1.31) 1.18 (1.32) 2.26 (1.31)
3 0.933 (1.33) 1.07 (1.32) 1.60 (1.36)
4 0.812 (1.29) 0.927 (1.31) 1.01 (1.46)
6 0.508 (1.31) 0.583 (1.30) 0.424 (1.33)
8 0.373 (1.37) 0.415 (1.36) 0.233 (1.31)
12 0.220 (1.43) 0.250 (1.37) 0.126 (1.38)
15 0.157 (1.46) 0.181 (1.43) 0.0714 (1.60)
24 0.0931 (1.81) 0.106 (1.69) n.a. n.a.
28 0.0761 (1.69) 0.0793 (1.77) n.a. n.a.
32 0.0696 (1.63) 0.0698 (1.79) n.a. n.a.
36 0.054 (1.79) 0.058 (1.86) n.a. n.a.
表40：靜脈內投予100 µg後，實例4之隨時間變化的血漿濃度幾何平均(以µg/L表示)和(以%表示的幾何標準偏差SD)
100 µg實例4，IV mg
N=15
給劑後時間 (h) 幾何平均 幾何SD
0 ＞0.0500 n.a.
0.25 1.76 (1.20)
0.5 2.52 (1.11)
0.75 2.68 (1.14)
1 2.99 (1.12)
1.5 3.15 (1.17)
2 3.07 (1.19)
2.083 2.57 (1.16)
2.25 1.42 (1.20)
2.5 0.559 (1.19)
2.75 0.264 (1.23)
3 0.132 (1.24)
E-2.4吸入投予患有PAH或CTEPH病患單一劑量用以研究肺血管阻力(PVR)之下降
於一臨床1b期研究中以口服吸入單劑量*240µg(2顆120 µg膠囊)、480 µg(1顆480 µg膠囊)、1000 µg的(1顆1000 µg膠囊)、2000 µg(2顆1000 µg膠囊)或4000 µg(4顆1000 µg膠囊)包含實例4(參見C-1，例如表17和20)之插入手持式吸入裝置的乾粉調配物，藉由深吸氣吸入肺部深處，治療年齡18至80歲患有PAH或CTEPH的病患(*單劑量係指投予一劑型/膠囊以及同時或在短時間內連續投予二或更多劑型/膠囊)。納入的病患並不具有用於PAH或CTEPH之標準護理(SoC)藥物的背景治療(例如內皮素拮抗劑、類前列腺素藥劑、第5型磷酸二酯酶抑制劑或可溶性鳥苷酸環化酶刺激劑)。在本研究中病患係如醫師指示例行診斷，經歷侵入性右心導管插入術。此研究的主要目的為調查PVR相對於基線的峰值百分比下降。病患必須具有基線肺動脈壓(mPAP)≥25mmHg及PVR≥400dyn·sec·cm-5(5 Wood Units)，並且未顯現對初始iNO吸入測試的血管反應性才能被納入在各計畫分析中。在給藥後的數個時間點，測量投予藥物的血漿濃度(藥物代謝動力學)，並評估安全性和耐受性。
本研究分係分為A部分和B部分二個部分。在A部分中係對無PAH或CTEPH標準護理(SoC)藥物之背景治療(例如內皮素拮抗劑、前列腺素類、5型磷酸二酯酶抑制劑或可溶性鳥苷酸環化酶刺激劑)的病患投予漸增的前述單劑量。在B部分中，係於A部分完成後，將一從A部分選出的劑量於無背景SoC治療的另外病患(第1組)以及另外在經SoC單一治療(第2組)和以SoC雙重組合治療(第3組)的病患中進行試驗。
PVR為一從右心導管插入術過程期間直接測量的參數所衍生出的參數。包括在計算中的直接參數為：平均肺動脈壓[mmHg](mPAP)、肺毛細血管楔壓[mmHg](PCWP)和心輸出量[l/min](CO)。PVR根據以下式所計算：PVR[dyn*sec*cm -5]=80*(mPAP-PCWP)/CO。
研究設計係顯示於圖62中而最終A部分之概述係顯示於圖63中。
總共38位病患者接受一劑量的實例4乾粉。各劑量組中總計4位病患依計劃納入各計畫組(總計20位病患)。在2000 µg和4000 µg組中，可清楚地觀察到PVR相較於基線的劑量依賴平均變化，以約30%之持續平均變化達到峰值(就PVR之詳情，請參見圖64和表41)。PVR的下降主要係由肺動脈壓力下降所驅動(就平均PAP之詳情，請參見圖65和表42)。-20%的平均峰值變化量-為預定義的相關閾值-明顯超過2000 µg和4000 µg組中的峰值(平均峰值變化為：就240、480、1000、2000和4000 µg分別為-21.0%、-16.1%、-25.9%、-38.1%、-36.3%)。在歷史比較中，在單次給藥後PVR相較於基線-30%的平均變化幅度與吸入競爭藥曲前列尼(Tyvaso®)處於同一等級[Voswinckel et al, Journal of American College of CardiologyVol. 48, No. 8, 2006 October 17, 2006：1672-81]。然而，實例4後的效用有利地持續到3小時的測量期結束時反應並無下降(＞3小時的測量期在技術上對於研究中使用右心導管的患者為不可行的)。從本研究中測量的實例4之長的血漿半衰期可結論出超過3小時測量值的肺保留時間(乾粉施用後大概在超過12小時，至高24小時的時間內)。全身cGMP(環磷酸鳥苷)之增加證實了sGC活化的強力目標參與。看到了總體良好的耐受性，包括4000 µg的最高劑量。觀察到的全身血壓、心率和氧飽和度之變化在任何劑量下都不代表安全性問題。整體而言，觀察到的肺血流動力學參數(PVR和mPAP)之變化在無沒有全身血流動力學的相關變化下，與選擇性肺血管擴張之所欲效應非常一致。 表 41：於患有PAH或CTEPH病患中在基線(0D00H00M)和吸入實例4後(0D00H30M至0D03H00M)隨時間變化的肺血管阻力(PVR)平均值和SD(240、480、1000、2000和4000 µg組，各N=4，符合計畫族群(per protocol set))。與基線相比的相對變化係如圖64所示。
240 µg, N=4 480 µg, N=4 1000 µg, N=4 2000 µg, N=4 4000 µg, N=4
0D00H00M 788.338±416.914 1055.863±317.077 608.898±135.153 468.608±20.537 713.998±117.204
0D00H30M 749.012±398.928  1003.264±300.639 645.387±211.946 464.586±58.200  616.894±97.774 
0D01H00M 734.427±396.799 1007.504±290.883 558.324±169.860 421.730±81.602  542.417±97.103
0D01H30M 726.362±364.099 1031.647±252.210  542.130±187.227 340.782±82.566  573.812±123.865
0D02H00M 710.844±410.668 908.704±252.569 487.951±144.546 339.924±105.884 501.071±97.979 
0D02H30M 716.209±419.311 1038.344±263.837 537.812±204.640 338.404 ± 87.381 526.648±144.679 
0D03H00M 657.829±291.191 909.265±259.510 535.636±235.786 327.284 ± 25.882 493.103±130.480
表 42 ：於患有PAH或CTEPH病患中在基線(0D00H00M)和吸入實例4後(0D00H30M至0D03H00M)隨時間變化的肺動脈壓(mPAP)平均值和SD(240、480、1000、2000和4000 µg組，各N=4，符合計劃書群族(per protocol set))。與基線相比的相對變化係如圖65所示。
240 µg, N=4 480 µg, N=4 1000 µg, N=4 2000 µg, N=4 4000 µg, N=4
0D 00H 00M 42.8±11.1 55.0±8.6 34.3±4.9 33.5±3.4 46.0±8.1
0D 00H 30M 42.5±11.0 52.3±8.4 33.8±7.5 33.3±6.3 43.0±4.6
0D 01H 00M 44.3±10.4 53.8±9.1 31.8±7.4 30.8±5.6 41.3±4.6
0D 01H 30M 43.0±8.0 55.0±8.0 32.0±8.9 28.5±7.3 40.3±5.1
0D 02H 00M 39.5±7.9 52.5±7.9 32.3±9.0 27.0±6.1 40.0±5.3
0D 02H 30M 42.0±6.5 54.0±9.7 33.5±10.7 27.3±6.0 39.8±3.0
0D 03H 00M 39.0± 4.2 56.0±11.1 34.0±11.6 27.5±5.2 39.8±4.1
E-3.       進一步定性 E-3.1     Caco-2 滲透性試驗
試驗化合物穿過Caco-2細胞單層之活體外滲透為一預測來自胃腸道腸道滲透性之建立完整的分析系統(1)。如下所述，於此Caco-2細胞中測定本發明化合物的滲透性：
將人類Caco-2細胞植入24孔插入板上，並使其生長14至16天。就滲透性研究，係將試驗化合物溶於DMSO中，並以傳輸緩衝液[漢克氏緩衝鹽溶液(Hanks' Buffered Salt Solution)，Gibco/Invitrogen，進一步添加葡萄糖和HEPES]稀釋至2 μM的最終試驗濃度。就測定頂端到基底外側的滲透性(PAPPA-B)，係將測試化合物溶液加到細胞單層的頂端及傳輸緩衝液加到單層的基底外側，供測定基底外側到頂部的滲透性(PappB-A)，將測試化合物溶液加到細胞單層的基底外側側，並將運輸緩衝液加到單層的頂端。在實驗開始時從供體室中採取樣本，用以確認質量平衡。在37°C培養2h後，從二個隔室中採集樣本。藉由LC-MS/MS分析樣本，並計算表觀滲透係數。對各細胞單層分析路西法黃色滲透性(Lucifer Yellow permeability)，以確保細胞單層完整性，並測定阿替洛爾(atenolol)(低滲透性之標記)和柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)(主動排泄之標記)的滲透性，供作為質性對照。 表 43 ：滲透性試驗
Caco-2 (2 µM) Papp A-B (nm/s) (平均+/-SD) Papp B-A (nm/s) (平均+/-SD) 外排率
比較實例11 (2.0 µM) 15.1 ±1.7 9.7 ± 0.6 0.64 ± 0.1
比較實例2 (利奥西呱) (2.4 µM) 35 ± 8.4 367 ± 75 11 ± 3.3
比較實例1 (西那西呱) (2.0 µM) 31 ± 3.9 631 ± 71 20 ± 3.5
所有三個實例在Caco-2細胞中均顯示中度滲透性。
相較於比較實例2(利奥西呱)和比較實例1(西那西呱(cinaciguat))，比較實例11顯示了最低的滲透性，為15.1+/-1.7 nm/s。此外，比較實例11並未顯現外排比。外排比係指出涉及例如腸道及/或肝臟之轉運蛋白。轉運蛋白，例如滲透性糖蛋白(=PGP)或乳癌抗藥性蛋白(=BCRP)可能會影響藥物的全身暴露。
比較實例11在本處顯現明確的利益，因為其顯現最低的滲透性，且似乎無轉運蛋白涉入，因此顯示出其對於局部吸入性治療的適用性，具有潛在上非常低的全身性暴露。 E-3.2 蛋白結合 經由 Transil 分析，如下述，分析比較實例 11 和比較實例 1 之蛋白結合
試驗物質於Transil® (固定於矽膠微珠上之磷脂醯膽鹼脂質雙層)和血漿之間的分佈為任何醫藥化合物的特徵性特質，且係依其與血漿蛋白結合的程度而定。藉由比較Transil®和緩衝液之間的分佈與Transil®和任何感興趣物種血漿之間的分佈，可在活體外計算出各別動物物種之血漿中未結合的分量。經由放射性分析測定個別血漿和緩衝液濃度。此方法之詳細描述及其驗證係由Schuhmacher等人發表(2)。 經由超過濾分析，如下述，分析比較實例 2 之蛋白結合
就此分析，係使用30 kDa孔徑的濾膜來分離血漿和無蛋白質的超濾液。藉由離心施予過濾的驅動力。在蛋白質結合研究之前，藉由過濾溶於緩衝液中之四種濃度的試驗化合物，檢測試驗化合物對超過濾裝置的吸附(回收)和試驗化合物通過濾膜的能力。試驗化合物之足夠穩定性和幾乎完全回收(≥90%用於實驗之化合物的實際量)為使用超過濾法的先決條件。於血漿中添加的有機溶劑量不能超過總培養量的2%。將血液樣本匯集(除人類和猴子以外的所有物種)或個別(人類和猴子)收集於肝素化的試管中，並於24小時內用於血液中的培養實驗。血漿是藉由將肝素化血液樣本離心所製備。將血漿儲存於-15°C，直到使用。控制血漿穩定性，化合物回收，與膜和試驗裝置的不特定結合以及血液細胞和血漿之間的配比。藉由液體閃爍計數測定與物質相關的放射性。藉由此分析法，不可能區分出無變化物質和放射性代謝物。就放射分析法之詳情和樣本處理，請參見Goeller et al.(3)。超過濾法之說明一般係由Zhang等人於2012年所發表(4)。 表 44 ：化合物之蛋白結合
未結合分量 (%) Wistar大鼠 米格魯犬 人類 (男性) 獼猴 小型豬 (雌性)
比較實例11 0.224 0.108 0.0764 0.0485 0.348
比較實例2 (利奥西呱) 15.7 17.1 4.97 n.d. n.d.
比較實例1 (西那西呱) 0.351 1.12 0.392 0.0799 n.d.
n.d. 未測
比較實例11和比較實例1(西那西呱)顯現非常高的蛋白質結合，在所有研究的物種中，游離分量低於1%。但在得到的比較結果之所有試驗物種中，實例1顯現最低的游離分量。在大鼠血漿中，比較實例11與比較實例1相比未結合分量係低1.6倍，在人類和獼猴血漿中的游離分量低2倍，而在狗的血漿未結合分量係低10倍。比較實例2(利奧西呱)顯現較高的游離分量，係介於15.7%至4.97%之間。
高蛋白結合被視為如Begg等人所述之高肺選擇性的指標(5)。因此，比較實例11顯示了優於比較實例1和2之有利性質。 參考文獻 1. Artursson P and Karlsson J. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells, High-throughput determination of the free fraction of drugs strongly bound to plasma proteins. Biochem. Biophys, 1991. 175 (3), 880-885. 2. Schuhmacher J, Kohlsdorfer C, Buhner K, Brandenburger T, Kruk R. High-throughput determination of the free fraction of drugs strongly bound to plasma proteins. J Pharm Sci. 2004；93(4)：816-30. 3. Goeller G, Daehler HP, Winkelmann H：Determination of Radioactivity in Liquid and Solid Biological Samples from Pharmacokinetic Experiments. 1996, Bayer Pharma Report No. 25507. 4. Zhang F, Xue J, Shao J, Jia. Compilation of 222 drugs’ plasma protein binding data and guidance for study designs. Drug Discovery Today 2012；9-10(17)：475-485. 5. Begg M, Edwards CD, Hamblin N, Pefani E, Wilson R, Gilbert J, Vitulli G, Mallett D, Morrell J, Hingle MI, Uddin S, Ehtesham F, Marotti M, Harrell A, Newman CF, Fernando D, Clark J, Cahn A, Hessel EM. Translation of Inhaled Drug Optimization Strategies intoClinical Pharmacokinetics and Pharmacodynamics Using GSK2292767A, a Novel Inhaled Phosphoinositide 3-Kinase d Inhibitor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2019；369：443-453.
無
圖1a及1b：以膠囊為基底的單一單位劑量吸入器
圖2：在投予0.15、0.5、1.5和5 µg/kg比較實例11後觀察到的(符號)和擬合的(實線)肺動脈壓(=PAP)變化
圖3：在對應的肺沉積劑量下，體重60公斤的人之最大預期PAP下降
圖4：建立在L-精胺酸鹽篩選實驗上之非晶殘留物的X-光粉末繞射圖
圖5：實例6a，半水合物的X-光粉末繞射圖
圖6：實例6b，單水合物I的X-光粉末繞射圖
圖7：實例6c，單水合物II的X-光粉末繞射圖
圖8：實例6d，1,25-水合物的X-光粉末繞射圖
圖9：實例6e，倍半水合物的X-光粉末繞射圖
圖10：實例6f，二水合物的X-光粉末繞射圖
圖10a：實例6f，乾燥後二水合物的X-光粉末繞射圖
圖11：實例6g，非晶形式的X-光粉末繞射圖
圖12：實例6a，半水合物的拉曼光譜(Raman spectrum)
圖13：實例6b，單水合物I的拉曼光譜
圖14：實例6c，單水合物II的拉曼光譜
圖15：實例6d，1,25-水合物的拉曼光譜
圖16：實例6e，倍半水合物的拉曼光譜
圖17：實例6f，二水合物的拉曼光譜
圖18：實例6g，非晶形式的拉曼光譜
圖19：實例6a，半水合物的IR光譜
圖20：實例6b，單水合物I的IR光譜
圖21：實例6c，單水合物II的IR光譜
圖22：實例6d，1,25-水合物的IR光譜
圖23：實例6e，倍半水合物的IR光譜
圖24：實例6f，二水合物的IR光譜
圖25：實例6g，非晶形式水合物的IR光譜
圖26：實例6a，半水合物的DSC-和TGA-溫譜圖
圖27：實例6b，單水合物I的DSC-和TGA-溫譜圖
圖28：實例6c，單水合物II的DSC-和TGA-溫譜圖
圖29：實例6d，1,25-水合物的DSC-和TGA-溫譜圖
圖30：實例6e，倍半水合物的DSC-和TGA-溫譜圖
圖31：實例6f，二水合物的DSC-和TGA-溫譜圖
圖32：實例6g，非晶形式水合物的DSC-和TGA-溫譜圖
圖33：非晶形式，比較實例11的X-光粉末繞射圖
圖34：單水合物II，比較實例1的X-光粉末繞射圖
圖35：單水合物II，微粉化前比較實例2的X-光粉末繞射圖
圖36：單水合物II，部分非晶化，微粉化後比較實例2的X-光粉末繞射圖
圖37：單水合物I，實例3的X-光粉末繞射圖
圖38：單水合物I，實例4的X-光粉末繞射圖
圖39：單水合物I，實例5的X-光粉末繞射圖
圖40：實例7的X-光粉末繞射圖(儲存穩定性)：起始物質對儲存的穩定性，單水合物II
圖41：實例7的X-光粉末繞射圖(儲存穩定性)：物質在25℃和60%相對濕度於聚乙烯中一個月的儲存穩定性測試後，單水合物 I
圖42：實例8b(微粉化)之X-光粉末繞射圖的重合：起始物(單水合物II)(下方線)和微粉化後的物質(帶有非晶量的單水合物II，塗覆PTFE之噴射粉碎機，25°C)(上方線)
圖43：實例8a(微粉化)的X-光粉末繞射圖：微粉化後的物質(帶有非晶量的單水合物I，VA噴射粉碎機，25°C)
圖44：X-光粉末繞射圖(實例8e)(微粉化)：微粉化後的物質(單水合物I)
圖45：媒劑溶液、比較實例11(10、30和100 µg/kg標稱劑量)和菲塔敏思(Ventavis)(10 µg/kg標稱劑量)在PAH小型豬模型中吸入施用後之效用。數據係以PAP和BP相對於基線(霧化開始前的10分鐘間隔)的%變化表示。數據為平均值±SEM。所有化合物的霧化間隔花費5至7分鐘(灰色長條)。
圖46：乳糖以及乳糖調配物I(7.5 µg/kg)在氣管內施用後的效應。數據為平均值±SEM (n=3)；以PennCentury乾粉吹入器和空氣泵(Air Pump)進行氣管內施用；BP：動脈血壓；PAP：肺動脈壓；SEM：平均值的標準差
圖47：乳糖以及乳糖調配物II(22.5 µg/kg)在氣管內施用後的效應。數據為平均值±SEM (n=3)；以PennCentury乾粉吹入器和空氣泵(Air Pump)進行氣管內施用；BP：動脈血壓；PAP：肺動脈壓；SEM：平均值的標準差
圖48：乳糖和微粉化倍半水合物，例如實例6e (375 µg/kg)在氣管內施用後的效用。數據為平均值±SEM (n=3)；以PennCentury乾粉吹入器和空氣泵(Air Pump)進行氣管內施用；BP：動脈血壓；PAP：肺動脈壓；SEM：平均值的標準差
圖49：氣管內施用不同乳糖媒劑、乳糖調配物I(7.5 µg/kg)、乳糖調配物II(22.5 µg/kg)和微粉化倍半水合物實例6e(375 µg/kg)的效應。數據係以相對於預置值的%變化顯示，為平均值±SEM (n=3)
圖50：在氣管內施用比較實例11之不同水合物微粉化單水合物II(實例2)、微粉化半水合物(實例6a)和微粉化倍半水合物(實例6e)後對BP和PAP的效用。數據係以絕對值[mmHg]顯示為平均值±SEM(n=3)
圖51：在氣管內施用比較實例11之不同水合物微粉化單水合物II(實例2)、微粉化半水合物(實例6a)和微粉化倍半水合物(實例6e)後對BP和PAP的效用。數據係以絕對值[mmHg]顯示，為平均值±SEM(n=3)
圖52：cGMP(nmol/L)之平均值±SD–480 µg(實例2)劑量組(SAF，N=9)之治療前(第-1天)、第一(第1天)和最後(第8天)治療日的比較
圖53：cGMP(nmol/L)之平均值±SD–1000 µg(實例2)劑量組(SAF，N=9)之治療前(第-1天)、第一(第1天)和最後(第8天)治療日的比較
圖54：cGMP(nmol/L)之平均值±SD–2000 µg(實例2)劑量組(SAF，N=9)之治療前(第-1天)、第一(第1天)和最後(第8天)治療日的比較
圖55：cGMP(nmol/L)之平均值±SD–安慰劑組(SAF，N=9)的治療日比較
圖56：在基線日(-1d02h–0d00h)首次吸入日(0d00h-2d00h)、2d00h-7d00h的波谷測量值和吸入7日後(7d00h-10d00h)隨時間變化之體液中cGMP的平均值(N = 9)± SD(nmol/L)
圖57：平均值(N=36，480、1000和2000 µg各12，實例2)和隨時間變化之總特殊氣管阻力(kPa/秒)的SD：篩選1/2，基線日(-1d00h–0d00h)首次吸入日(0d00h-0d06h)，吸入後2d02h-6d04h)和7天吸入後(7d00h-7d06h)的測量值。
圖58：安慰劑(N=4)和1000 µg(N=17)實例4)在治療前(-1d00h–-0d09h)首次吸入日(-0d02h-1d00h)，吸入前和吸入後2d00h-2d12h、6d00h-6d12h、10d00h-10d12h)(概況天數)測量值、第3d-5d、7d-9d、11d-12d吸入前的低谷)和最後14天吸入(12d22h-20d00h)隨時間(nmol/L)與基線相比之cGMP差異的平均值。
圖59：研究肺沉積所進行的治療流程
圖60：血漿中實例4(µg/L)濃度之半對數標度的幾何平均值和標準偏差。
圖61：部分劑量到達吹嘴(發射劑量)，和部分劑量殘留在膠囊中，在裝置中，沉積的肺劑量和部分劑量到達GIT道
圖62：AH或CTEPH病患臨床研究之研究設計
圖63：於PAH或CTEPH病患中進行之臨床研究A部分彙整
圖64：在吸入實例4後(0D00H30M直到0D03H00M)在患有PAH或CTEPH的病患者中(依計畫分析集，240、480、1000、2000和4000 µg組，各N=4)，隨時間與肺血管阻力(PVR)基線(0D00H00M)相比之相對變化(%)的平均值和SD(%)
圖65：在吸入實例4後(0D00H30M直到0D03H00M)在患有PAH或CTEPH的病患者中(依計畫分析集，240、480、1000、2000和4000 µg組各N=4)，隨時間與平均肺動脈壓(mPAP)基線(0D00H00M)相比之相對變化(%)的平均值和SD(%)
無

Claims (15)

  1. 一種製備式(I)化合物之方法，其特徵在於在第一步驟[A]中係將溶於適合溶劑中的式(XII-1)化合物 (XII-1) 其中R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基， 與氫氧化鈉溶液反應，產生二鈉鹽(I-DiNa) (I-DiNa) 將其萃取純化但無進一步分離後，於第二步驟[B]中藉由以下方式進行反應： 將反應溶液分次加入溶於適合溶劑的無機酸混合物中，直到達到3.8至4.2的pH值，其中最初加入的無機酸混合物之pH值具有小於3.8之值，且最多包括與二鈉鹽相關的二個酸當量，最後得到式(I)化合物 (I)。
  2. 根據請求項1所述之製備式I化合物的方法，其特徵在於在第一步驟[C]中係將式(X-1)化合物， (X-1)， 其中 R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基， 在由鹼金屬碳酸鹽、鹼金屬氫氧化物或四烷基銨碳酸鹽組成之群組中選出的鹼之存在下，與式(XI)化合物反應， (XI)， 得到式(XII-1)之化合物， (XII-1) 其中R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基， 其進一步的特徵在於式(XII-1)化合物係在無進一步的純化下於根據請求項1之後續的步驟[A]和[B]中反應。
  3. 根據請求項1所述之製備式I化合物的方法，其特徵在於在第一步驟[D]中係將式(XII-NSA-1)之NSA鹽 其中R 3和R 4獨立地為C 1-C 4-烷基， 以適合的醚處理並與水和氨水在10°C至25°C之溫度下攪拌，藉此最終達到7.8至8.2之pH-值，之後以與水不混溶的有機溶劑處理反應混合物，分離各相及最後濃縮有機相，產生式(XII-1)之丁酯，將其在無純化下於根據請求項1之後續步驟[A]和[B]中進一步反應。
  4. 一種製備(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基) 聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶體形式之方法，其特徵在於將式(I)化合物 (I) 從極性溶劑之混合物中結晶，其中該極性溶劑係選自甲醇、丙酮、水所組成之清單，其中至少甲醇和水的混合物在20°C至100°C的溫度下為必需的，並將化合物(I-M-I) (I-M-I) 分離，視需要在冷卻後， 其特徵在於式(I-M-I)化合物之X光繞射圖(於25°C和以Cu-Kα1作為放射源)係展現至少下列反射：12.8和29.2，以2Ɵ值±0.2°表示。
  5. 根據請求項4所述之製備(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶體形式的方法，其特徵在於將式I之酸首先在50°C的溫度下溶於1：1的甲醇和丙酮混合物中，較佳地相對於以克(g)計之式I固體化合物的量，以各溶劑4倍的量(相對於1：1混合物8倍量)並冷卻至室溫，較佳地20°C，藉由過濾來澄清化溶液，再次加熱至50°C並於一段時間內逐滴加入相對於以克(g)計的固體式I化合物之量1.8倍量的水。
  6. 根據請求項4或5所述之製備(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸(I)晶形變體單水合物I(I-M-I)的方法，其特徵在於該式I之酸係藉由根據請求項1至3中任一項所述之方法所製備。
  7. 一種式(XIII)化合物 (XIII)。
  8. 一種式(I-M-I)之(5S)-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)聯苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]胺基}-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸的晶形變體單水合物I (I-M-I) 其特徵在於該化合物的X光繞射圖(於25°C和以Cu-Kα1作為放射源)係展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：12.8和29.2。
  9. 根據請求項8所述之式(I-M-I)單水合物I，其特徵為於25°C和以Cu-Kα1作為放射源所測量的X光繞射圖係展現至少下列反射，以2Ɵ值±0.2°表示：6.9、7.2、7.3、12.8和29.2。
  10. 一種醫藥組成物，係包括根據請求項8或9所述之式(I)化合物的式(I-M-I)單水合物I及視需要另外的醫藥上可接受賦形劑。
  11. 根據請求項8或9所述之式(I)化合物的式(I-M-I)晶體形式單水合物I，係用於治療及/或預防心肺疾病。
  12. 如請求項10所述之醫藥組成物，係供用於治療及/或預防心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH- COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。
  13. 如請求項8至9中任一項所定義之化合物的用途，係用於製造醫藥組成物供治療或防止心肺病症，例如肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH- COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)。
  14. 如請求項8至9中任一項所定義之式(I-M-I)化合物的用途，係用於製造穩定的吸入劑型供用於乾粉吸入器中。
  15. 一種於哺乳動物中治療或防止心肺病症之方法，其特徵在於該心肺病症係由在哺乳動物的下列項目所組成之群組中選出：肺動脈高壓(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高壓(CTEPH)和與慢性肺疾病相關的肺高壓(PH)(第3類組PH)，例如慢性阻塞性肺疾病(PH- COPD)中的肺高壓和肺高血壓併發特發性間質性肺炎(PH-IIP)，該方法係包括投予一有此需要的哺乳動物一治療上有效量之根據請求項8至9中任一項所述的式(I-M-I)化合物。
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