TW202321439A - 關節病治療劑和關節病治療劑的製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明的課題為提供一種關節病治療劑及上述關節病治療劑的製造方法，該關節病治療劑包含具有關節治療所必需的分子之滑膜衍生間葉系幹細胞。依據本發明，提供一種關節病治療劑，其包含具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞。

Description

關節病治療劑和關節病治療劑的製造方法

本發明有關一種關節病治療劑及上述關節病治療劑的製造方法，該關節病治療劑包含具有關節治療所必需的分子之滑膜衍生間葉系幹細胞。

近年來，隨著再生醫療技術及細胞治療技術的進步，正在積極地實施利用自體、同種或異種細胞之各種細胞治療和研究用細胞產品的開發。其中，間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell：MSC）可期待作為有用的細胞治療的細胞源。間葉系幹細胞能夠從各種生體組織採集，已報告有能夠從骨髓組織（非專利文獻1）、脂肪組織（非專利文獻2）、肌肉組織（非專利文獻3）、滑膜組織（非專利文獻4）及骨膜組織（非專利文獻5）等分離。尤其，已報告有滑膜衍生間葉系幹細胞與骨髓等各種間葉系組織衍生的間葉系幹細胞相比具有更高的增殖能力及軟骨形成能力（非專利文獻6）。又，在專利文獻1～3中，揭示有一種使用滑膜衍生間葉系幹細胞治療關節軟骨損傷和半月板損傷之方法。在專利文獻4中，記載有一種使用CD140b等分子而成之肢芽間葉系細胞群、軟骨前驅細胞群、成骨前驅細胞（osteoprogenitor cell）群的製備方法及品質管理方法。

[非專利文獻1]Prockop, D.J., 1997, Science. 276:71-4 [非專利文獻2]Zuk, P.A. et al., 2002, Mol Biol Cell. 13:4279-95 [非專利文獻3]Cao et al., 2003, Nat Cell Biol. 5:640-6 [非專利文獻4]De Bari, C. et al., 2001, Arthritis Rheum. 44:1928-42 [非專利文獻5]Fukumoto, T. et al., 2003, OsteoarthritisCartilage. 11:55-64 [非專利文獻6]Sakaguchi, et al. , 2005, Arthritis Rhum. 52:2521-9

[專利文獻1]日本專利第5928961號公報 [專利文獻2]日本專利第5656183號公報 [專利文獻3]日本專利第6864302號公報 [專利文獻4]國際公開WO2021/054449號公報

在細胞產品的品質管理中，確保各批的等效性及同一性是一個課題。然而，由於構成產品之細胞本身並非為完全均勻的結構物，且難以確定其特徵，因此，通常難以確保各批的等效性及同一性。因此，為了管理產品品質，不僅進行了最終產品的品質試驗，而且導入已適用於醫療設備之QMS（Quality Management System，品質管理系統）概念，對製造原料、材料管理、製造製程管理、製程管理試驗進行了記錄及控制，藉此實施了對整個過程的管理。然而，隨著科學技術的進步，鑑定作為最終產品的細胞本身的特徵之重要性日益增加。

作為細胞的品質管理方法，例如，以細胞類型特異性的表面標誌物為指標，正在進行目標最終產品的細胞類型的鑑定（例如，鑑定為間葉系幹細胞）。然而，藉由這種品質管理方法獲得之細胞有治療效果不穩定之慮，仍然不能完全令人滿意。

迄今為止，已報告有使用滑膜幹細胞之關節治療劑的製造方法。然而，未充分進行用於確保治療劑的有效性之品質管理而存在治療效果不穩定的問題。細胞產品主要利用用於確定細胞類型之標誌物來進行品質管理，而未進行與效價（有效性）相關之品質管理。

由於表示效價（有效性）之標誌物基於作用機制來鑑定，因此，在本發明中，旨在闡明與細胞治療產品的有效性相關之作用機制，並鑑定基於作用機制之標誌物，進而提供基於其標誌物之治療劑的製造方法。亦即，本發明的課題為提供一種關節病治療劑及上述關節病治療劑的製造方法，該關節病治療劑包含具有關節治療所必需的分子之滑膜衍生間葉系幹細胞。

本發明人為了解決上述課題進行了深入探討結果，發現整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上為對利用滑膜幹細胞治療關節疾病的療效所必需的品質管理標誌物。本發明係依據上述發現而完成者。

亦即，依據本發明可提供以下發明。 ＜1＞一種關節病治療劑，其包含具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞。 ＜2＞如＜1＞所述之關節病治療劑，其中 滑膜衍生間葉系幹細胞具有整合素β1及血小板衍生生長因子受體β兩者的表面抗原。 ＜3＞如＜1＞或＜2＞所述之關節病治療劑，其具有編碼II型膠原蛋白α1鏈之基因且移植後產生II型膠原蛋白α1鏈。 ＜4＞如＜1＞至＜3＞之任一項所述之關節病治療劑，其具有FGFR3的表面抗原。 ＜5＞如＜1＞至＜4＞之任一項所述之關節病治療劑，其中 相對於關節病治療劑中所含之所有細胞之、具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞的比率為30%以上。 ＜6＞一種＜1＞至＜5＞之任一項所述之關節病治療劑的製造方法，其包括： 步驟A，用酶處理滑膜組織； 步驟B，清洗酶處理後的混合物； 步驟C，在基材上培養清洗後的混合物中所含之滑膜衍生間葉系幹細胞；及 步驟D，將培養後的滑膜衍生間葉系幹細胞從基材分離。 ＜7＞如＜6＞所述之方法，其中 上述步驟B為將酶處理後的混合物清洗至上清液中的殘存酶濃度達到0.5ng/mL以下之步驟。 ＜8＞如＜6＞或＜7＞所述之方法，其中 在上述步驟C中，培養滑膜衍生間葉系幹細胞之期間為28天以內。 ＜9＞如＜6＞至＜8＞之任一項所述之方法，其中 在上述步驟D中，藉由使細胞剝離液作用於間葉系幹細胞120分鐘以內的時間來進行分離。 ＜10＞如＜6＞至＜9＞之任一項所述之方法，其進一步包括對具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞進行分選之步驟。 [發明效果]

本發明的關節病治療劑藉由包含具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞而能夠發揮對關節病之治療效果。依據本發明，能夠抑制所製造之關節病治療劑的治療效果的變動，能夠對產品的治療效果進行品質管理。

以下，對本發明的內容詳細地進行說明。在本說明書中，“～”係指以將記載於其前後之數值作為下限值及上限值而包括之含義來使用。

本發明的關節病治療劑包含具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β（在本說明書中亦稱為PDGFRb）中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞。 滑膜衍生間葉系幹細胞可以僅具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一者，但較佳為具有整合素β1及血小板衍生生長因子受體β兩者。

滑膜衍生間葉系幹細胞較佳為藉由具有編碼II型膠原蛋白α1鏈之基因且移植後產生II型膠原蛋白α1鏈而能夠發揮治療效果。 滑膜衍生間葉系幹細胞較佳為具有FGFR3（fibroblast growth factor receptor3（纖維母細胞生長因子受體3））的表面抗原。

相對於本發明的關節病治療劑中所含之所有細胞之、具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞的比率較佳為30%以上，亦可以為40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上或95%以上。

本發明的關節病治療劑能夠藉由一種方法來製造，該方法包括： 步驟A，用酶處理滑膜組織； 步驟B，清洗酶處理後的混合物； 步驟C，在基材上培養清洗後的混合物中所含之滑膜衍生間葉系幹細胞；及 步驟D，將培養後的滑膜衍生間葉系幹細胞從基材分離。

＜用酶處理滑膜組織之步驟A＞ 滑膜組織能夠在麻醉下從關節的非荷重部分採集。 滑膜組織的生物來源並無特別限定，能夠使用任意生物、較佳為源自哺乳動物之滑膜組織。例如，能夠使用源自靈長類（例如，黑猩猩、日本獼猴、人）之滑膜組織，特佳為能夠使用源自人之滑膜組織。

滑膜組織可以為源自單一供體之滑膜組織，亦可以為源自複數個供體之滑膜組織，但是較佳為源自單一供體之滑膜組織。

以對人給藥為目的，製造滑膜衍生間葉系幹細胞之情況下，較佳為較佳為使用從組織適合性抗原的類型與受體一致或類似之供體採集之滑膜組織。更佳為採集滑膜之對象與移植滑膜衍生間葉系幹細胞之對象為同一對象。亦即，使用從受體本身採集之滑膜組織（自體移植）為較佳。 滑膜組織的採集量能夠考慮供體的種類或所必要之滑膜衍生間葉系幹細胞的量來確定。例如能夠從0.1g～10g、較佳為0.1g～2.0g、更佳為0.1g～1.5g、進一步較佳為0.1g～1.0g的滑膜組織獲得滑膜衍生間葉系幹細胞。所採集之滑膜組織依據需要用剪刀等切碎之後提供於後述之酶處理。

滑膜組織用酶進行處理。 作為酶，只要為含有蛋白酶之酶，則並無特別限定，但是較佳為含有1種以上的膠原蛋白酶及1種以上的中性蛋白酶之混合酶。特佳之酶為Liberase（註冊商標）。作為Liberase（註冊商標），例如能夠使用Liberase MNP-S（Roche Diagnostics K.K.製造），其為一種含有I型膠原蛋白酶、II型膠原蛋白酶及中性蛋白酶（thermolysin）之酶。

酶反應能夠在含有酶之水溶液中進行，亦可以使用含有人血清之水溶液。人血清可以為自體血清，亦可以為同種異體血清，但是較佳為自體血清。 酶處理中的酶濃度較佳為0.01mg/ml～10mg/ml，更佳為0.1mg/ml～10mg/ml，進一步較佳為0.5mg/ml～10mg/ml，進一步更佳為0.5mg/ml～5.0mg/ml，特佳為0.5mg/ml～2.0mg/ml，最佳為0.7mg/ml～2.0mg/ml。 滑膜組織與酶的質量比例較佳為1000:1～10:1，更佳為500:1～20:1，進一步較佳為200:1～40:1。

酶反應能夠在較佳為15℃至40℃、更佳為20℃至35℃、進一步較佳為25℃至35℃的溫度下進行。 反應時間為2小時以上即可，更佳為2.5小時以上，進一步較佳為3小時以上。反應時間的上限並無特別限定，可以為10小時以內、9小時以內、8小時以內、7小時以內、6小時以內、5小時以內或4小時以內。 經酶處理之混合物中含有滑膜衍生間葉系幹細胞。 經酶處理之混合物能夠藉由通過細胞過濾器移到離心管並進行離心處理來回收滑膜衍生間葉系幹細胞。

＜清洗酶處理後的混合物之步驟B＞ 在步驟B中，清洗酶處理後的混合物。 在步驟B中，較佳為能夠清洗至上清液中殘存酶濃度達到0.5ng/mL以下。上清液中的殘存酶濃度更佳為0.3ng/mL以下，進一步較佳為0.2ng/mL以下，特佳為0.1ng/mL以下。

清洗能夠藉由如下方法來進行：將藉由離心處理而回收之上述之滑膜衍生間葉系幹細胞，在培養基中再懸浮，並再次進行離心（用400g進行5分鐘等）。作為培養基，能夠使用α修飾Eagle最低必需培養基（αMEM），但是並無特別限定。如上所述，清洗可以使用培養基進行複數次（2次以上）。

＜在基材上培養清洗後的混合物中所含之滑膜衍生間葉系幹細胞之步驟C＞ 在步驟C中，在基材上培養清洗後的混合物中所含之滑膜衍生間葉系幹細胞。 作為基材，能夠舉出培養板等平面塑膠基材及培養袋、微載體（microcarrier）或凝膠等立體基材，但並無特別限定。 培養中所使用之培養基，能夠將通常用於動物細胞的培養之培養基作為基礎培養基來製備。作為通常用於動物細胞的培養之培養基，能夠舉出αMEM、DMEM（Dulbecco Modified Eagle Medium）、DMEM與F12的混合培養基（DMEM:F12=1:1）、RPMI培養基（GIBCO（註冊商標）RPMI1640培養基等）、DMEM/F12與RPMI的混合培養基（DMEM/F12:RPMI=1:1）等，但是並無特別限定。

作為培養基，可以為含有血清之培養基，亦可以為不含血清之培養基。以對生體給藥為目的，從自體組織製造滑膜衍生間葉系幹細胞之情況下，培養基可以為含有同種血清者。亦即，以對人給藥為目的，從人的組織製造滑膜衍生間葉系幹細胞之情況下，可以使用含有人血清之培養基。當使用血清之情況下，可以為自體血清，亦可以為同種異體血清，但是較佳為自體血清。當使用血清之情況下，培養基中的血清的添加量例如為20體積%以下、10體積%以下或5體積%以下。

細胞的培養條件並無特別限定，能夠採用通常的細胞培養條件。例如能夠舉出在溫度30～40℃、3～7%CO ₂下的培養，但是並無特別限定。作為一例，能夠舉出溫度37℃、5%CO ₂下的培養。

在本發明中，不更換培養基而進行培養為較佳。又，在上述之培養中，不與滑膜衍生間葉系幹細胞以外的其他細胞共同培養而製造滑膜衍生間葉系幹細胞為較佳。

已知，培養期間愈長愈會進行滑膜衍生間葉系幹細胞向軟骨細胞的分化，因此若培養期間超過特定的長度，則滑膜衍生間葉系幹細胞的原位（in situ）下的軟骨形成能力會下降。因此，在本發明中，為了在未分化狀態下且在具有良好的原位（in situ）軟骨形成能力之狀態下使滑膜衍生間葉系幹細胞增殖，調節培養期間為較佳。在步驟C中，培養滑膜衍生間葉系幹細胞之期間為28天以內為較佳。

又，在本發明中，需要考慮為了覆蓋軟骨損傷部且使患部再生而準備充分數量的未分化滑膜幹細胞之必要性。因此，培養期間為5天以上、7天以上或10天以上為較佳，10～14天、10～21天或10～28天為更佳，10～21天為進一步較佳。

已知，能夠藉由在添加有轉化生長因子（transforming growth factor）β3（TGF-β3）、地塞米松（Dexamethasone）、骨成形性蛋白質（bone morphogenetic protein）2（BMP-2）之軟骨形成培養基中培養間葉系幹細胞，以分化為軟骨細胞，並在體外（in vitro）製作軟骨組織。因此，在本發明中，為了防止滑膜衍生間葉系幹細胞向軟骨細胞的分化，在不存在TGF-β3、地塞米松或BMP-2之狀態下培養已分離之滑膜衍生間葉系幹細胞為較佳。

還已知，滑膜衍生間葉系幹細胞與體外（in vitro）的間葉系幹細胞的繼代數成反比而原位（in situ）軟骨形成能力下降。因此，為了製備未分化的間葉系幹細胞，製造原代或第1繼代中的滑膜衍生間葉系幹細胞為較佳。

在本發明中，自體治療中所使用之血清源自自體，自體治療中能夠從供體採集之血清的量有限，又，就滑膜衍生間葉系幹細胞的增殖的觀點而言，需要一定以上的細胞密度，因此將酶處理後的滑膜衍生間葉系幹細胞以100細胞/cm ²以上且5000細胞/cm ²以下、200細胞/cm ²以上且5000細胞/cm ²以下、500細胞/cm ²以上且5000細胞/cm ²以下、500細胞/cm ²以上且2500細胞/cm ²以下或500細胞/cm ²以上且2000細胞/cm ²以下的細胞密度來接種並培養為較佳。又，為了在酶處理之後使滑膜衍生間葉系幹細胞增殖，培養10天以上為更佳。

培養結束時所獲得之細胞數量為1.0×10 ⁷細胞以上、2.0×10 ⁷細胞以上、2.5×10 ⁷細胞以上或3.0×10 ⁷細胞以上為較佳，4.0×10 ⁷細胞以上為更佳，5.0×10 ⁷細胞以上為進一步較佳，6.0×10 ⁷細胞以上為特佳。

＜將培養後的滑膜衍生間葉系幹細胞從基材分離之步驟D＞ 在步驟D中，將培養後的滑膜衍生間葉系幹細胞從基材分離。在步驟D中，較佳為能夠藉由使細胞剝離液作用於間葉系幹細胞120分鐘以內的時間來進行分離。作為細胞剝離液，其為含有胰蛋白酶（trypsin）樣酶和EDTA之溶液。特佳之酶為TrypLE。作為TrypLE，例如，能夠使用TrypL Express（Gibco公司製造）、TrypLE Select（gibco公司製造）等。

就充分地剝離細胞之觀點而言，使細胞剝離液作用於間葉系幹細胞之時間為進行10分鐘以上為較佳。使細胞剝離液作用於間葉系幹細胞之時間為10分鐘～120分鐘為較佳，10分鐘～60分鐘以內的時間為更佳。可以為10分鐘～50分鐘、10分鐘～40分鐘、20分鐘～60分鐘、20分鐘～50分鐘或20分鐘～40分鐘。

間葉系幹細胞為源自中胚葉性組織（間葉）之體幹細胞。已知間葉系幹細胞存在於骨髓、滑膜、骨膜、脂肪組織、肌肉組織，而且已知其具有分化成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及筋細胞之能力。關於間葉系幹細胞向軟骨細胞的分化，已知藉由將BMP或TGF-β添加到培養液中，能夠促進未分化間葉系幹細胞向軟骨細胞的分化，而且軟骨組織能夠在體外（in vitro）條件下再生。

間葉系幹細胞能夠藉由檢測間葉系幹細胞中的特徵分子（例如，酶、受體、低分子化合物等）來確認。作為間葉系幹細胞中的特徵分子，可舉出細胞表面標誌物（陽性標誌物）CD73、CD90、CD105、CD166等，但是並不限定於該等。又，作為間葉系幹細胞中未表達之陰性標誌物，可舉出CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD11b、CD14等，但是並不限定於該等。另外，CD為Clusters of differentiation（分化簇）的縮寫，HLA-DR為human leukocyte antigen-D-related（人類白血球抗原-D相關）的縮寫。利用該等陽性標誌物及陰性標誌物，能夠確認其為間葉系幹細胞。該等標誌物的檢測中能夠利用免疫學方法，但是亦可以藉由各分子的mRNA量的定量來實施檢測。

本說明書中滑膜衍生間葉系幹細胞為滑膜中所含之幹細胞。滑膜衍生間葉系幹細胞為間葉系幹細胞的一種。滑膜衍生間葉系幹細胞例如能夠藉由檢測CD90陽性、CD45陰性、軟骨分化能力來進行檢測，但是檢測方法並無特別限定。

當將藉由上述方法製造之滑膜衍生間葉系幹細胞製成關節病治療劑之情況下，藉由常規方法將上述細胞與藥學上允許之載體混合等來製成適合於對個體給藥之形態的製劑即可。作為載體，例如能夠舉出加入生理鹽水、葡萄糖或其他佐劑（例如D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化鈉等）進行等滲之注射用蒸餾水。進而，亦可以摻合緩衝劑（例如磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液）、止痛劑（例如氯化苄烷銨、鹽酸普魯卡因等）、穩定劑（例如人血清白蛋白、聚乙二醇等）、保存劑、抗氧化劑等。

本發明的關節病治療劑的製造方法較佳為可以進一步包括分選步驟：對具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞進行分選。

作為對具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞進行分選之步驟，可舉出對整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準進行管理之步驟。

整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準係指整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的基因或蛋白質的表達量。整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準能夠計算為絕對值或相對值（比較對照或與基準表達量之比或差等）。

整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準能夠藉由本領域技術人員已知的任意方法測定，並且能夠按照常規方法實施。作為表達水準的測定，可以測定作為基因轉錄產物之mRNA量。mRNA量的測定只要為能夠測定所期望的mRNA量之方法，則並無特別限定，能夠從公知的方法中適當選擇使用。例如，能夠利用如下方法：將與編碼整合素β1或血小板衍生生長因子受體β之基因雜交之寡核苷酸作為引子之基因擴增法、或將與編碼特定蛋白質分子之基因雜交之寡（聚）核苷酸作為探子之雜交法。具體而言，可舉出RT-PCR（反轉錄聚合酶連鎖反應）法、即時RT-PCR法、DNA微陣列法、細胞陣列法、北方氏轉印（Northern blot）法、點狀墨點法、RNase保護檢測法等。

關於在上述測定方法中所使用之引子或探子，能夠藉由標記並檢測上述標記的訊息強度來測定mRNA量。即時RT-PCR法能夠直接使用RNA作為樣品，藉由光學測定基因擴增過程，能夠依據擴增所需溫度循環的次數進行基因定量，因此較佳。又，作為對照，能夠使用作為持家基因之甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、β肌動蛋白等mRNA的表達量來使編碼整合素β1或血小板衍生生長因子受體β之基因的表達量標準化。再者，關於在上述測定方法中所使用之引子及探子，本領域技術人員能夠基於編碼整合素β1或血小板衍生生長因子受體β之基因的鹼基序列的資訊來適當設計和製備。

關於整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準的測定，例如，能夠利用如下方法：使用針對整合素β1或血小板衍生生長因子受體β之抗體或抗體片段進行免疫學測定。具體而言，能夠舉出流氏細胞儀、西方印漬法、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）、螢光抗體法及細胞陣列法等。關於該等測定方法，亦能夠藉由常規協定或經適當修改、變更之常規協定來實施。

例如，在藉由流氏細胞儀測定細胞中的整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準之情況下，若整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的陽性率較佳為30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上或90%以上，則能夠分選為具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞。

在分選具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞時，例如，能夠藉由對利用上述方法測定之細胞中的整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準與預定之基準表達量進行比較來進行分選。作為基準表達量，例如，可以為已確認到具有一定的品質之細胞（陽性對照）中的整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準，亦可以為已確認到不具有一定的品質之細胞（陰性對照）的表達水準。

藉由整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準與基準表達水準的比較，能夠分選出細胞中的整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準為陽性對照的表達量的同等以上的情況下的細胞，並將其用作關節病治療劑。

又，亦可以預先設定整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準的截止值，並對經測定之細胞的整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準與截止值進行比較。例如，基於表示整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達量與治療效果之間的相關性之回歸直線，能夠將截止值作為賦予所期望的治療效果之整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準。例如，能夠分選出細胞中的整合素β1或血小板衍生生長因子受體β的表達水準為截止值以上的情況下的細胞，並將其用作關節病治療劑。

本發明的關節病治療劑能夠用於關節治療。作為關節治療，能夠舉出伴隨關節的損傷、損害或炎症之疾病的治療，能夠舉出軟骨等結締組織的變性和/或由炎症引起之關節疾病、或非炎症性的關節疾病的治療。作為關節治療，例如能夠舉出選自包括半月板損傷、外傷性軟骨損傷、離斷性骨軟骨炎、無腐性骨壞死、變形性關節病（例如變形性膝關節病）、關節類風濕（例如慢性關節類風濕）、痛風、反應性關節炎、乾癖性關節炎、若年性關節炎、炎症性關節炎、關節軟骨缺陷之群組中之疾病的治療，但是並不限定於該等疾病。

使用本發明的關節病治療劑之關節的治療方法包括如下步驟： 以藉由滑膜衍生間葉系幹細胞覆蓋軟骨損傷部或半月板損傷部之方式，移植本發明的關節病治療劑之步驟；及 藉由使關節病治療劑中所含之滑膜衍生間葉系幹細胞分化為軟骨細胞，在軟骨損傷部或半月板損傷部以原位（in situ）再生軟骨組織之步驟。

將本發明的關節病治療劑移植到患者時，為了有效地治療軟骨損傷部或半月板損傷部，對每個軟骨損傷部或半月板損傷部適用2.0×10 ⁷～1.0×10 ¹¹個或2.5×10 ⁷～1.0×10 ¹¹個或3.0×10 ⁷～1.0×10 ¹¹個、4.0×10 ⁷～1.0×10 ¹¹個或2.5×10 ⁷～1.0×10 ¹⁰個或2.5×10 ⁷～1.0×10 ⁹個或2.5×10 ⁷～1.0×10 ⁸個滑膜衍生間葉系幹細胞、或者適用2.0×10 ⁷～1.0×10 ⁸個滑膜衍生間葉系幹細胞為較佳。

藉由將滑膜衍生間葉系幹細胞移植到軟骨損傷部或半月板損傷部，軟骨損傷部或半月板損傷部被滑膜衍生間葉系幹細胞覆蓋。滑膜衍生間葉系幹細胞的移植能夠藉由開放手術或藉由關節內窺鏡手術來進行。為了盡量減少侵襲，在關節內窺鏡下移植滑膜衍生間葉系幹細胞為較佳。

軟骨損傷部或半月板損傷部可以被滑膜衍生間葉系幹細胞的懸浮液覆蓋，亦可以被滑膜衍生間葉系幹細胞的細胞片覆蓋。例如，能夠將明膠或膠原蛋白等生體吸收性凝膠用作凝膠狀物質。滑膜衍生間葉系幹細胞與軟骨損傷部或半月板損傷部接著之能力高。

在治療軟骨損傷時，本發明的低侵襲性手術的特徵為藉由滑膜衍生間葉系幹細胞覆蓋軟骨損傷部，且包括以下步驟： 保持體位，以使軟骨損傷部朝向上方； 將滑膜衍生間葉系幹細胞的細胞片、滑膜衍生間葉系幹細胞的懸浮液或包含滑膜衍生間葉系幹細胞之凝膠狀物質靜置於軟骨損傷部的表面；及 保持體位特定時間，藉此使滑膜衍生間葉系幹細胞接著於軟骨損傷部的表面。

在治療半月板損傷時，本發明的低侵襲性手術的特徵為藉由滑膜衍生間葉系幹細胞覆蓋半月板損傷部，且包括以下步驟： 保持體位，以使半月板損傷部朝向下方； 將滑膜衍生間葉系幹細胞的懸浮液注射於膝關節內；及 保持體位特定時間，使滑膜衍生間葉系幹細胞接著於半月板損傷部。

為了確實地使滑膜衍生間葉系幹細胞接著於軟骨損傷部或半月板損傷部的表面，將移植之滑膜衍生間葉系幹細胞保持於軟骨損傷部或半月板損傷部的表面至少10分鐘，保持15分鐘為較佳為較佳。為了實現這一目標，以使軟骨損傷部或半月板損傷部朝向上方而且將滑膜衍生間葉系幹細胞保持在朝向上方之軟骨損傷部或半月板損傷部為目的，將體位保持至少10分鐘，保持15分鐘為較佳。

為了使滑膜衍生間葉系幹細胞與軟骨損傷部或半月板損傷部的接著更牢固，能夠進一步用骨膜覆蓋伴隨滑膜衍生間葉系幹細胞之軟骨損傷部或半月板損傷部。將滑膜衍生間葉系幹細胞保持在軟骨損傷部的表面或半月板損傷部的表面上至少10分鐘之後，手術完成。

在本發明中，移植之滑膜衍生間葉系幹細胞在軟骨損傷部或半月板損傷部分化為軟骨細胞，然後在軟骨損傷部或半月板損傷部以原位（in situ）再生軟骨組織。

在滑膜衍生間葉系幹細胞在原位（in situ）的軟骨形成過程中，按照局部微小環境（營養供給及細胞因子環境等）再生軟骨組織，因此不需要從外部進行操作。關於滑膜衍生間葉系幹細胞的原位軟骨形成的結果，軟骨組織在軟骨損傷部或半月板損傷部再生，修復損傷，而且在軟骨損傷的情況下，骨區域、軟骨與骨的邊界、軟骨中心部、表面區域、而且與原來的軟骨相鄰之區域以原來的軟骨組織形式形成，或者在半月板損傷的情況下形成半月板軟骨。

藉由以下實施例對本發明進一步具體地進行說明，但是本發明並不限定於實施例。 [實施例]

＜實施例1＞大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製作 建立大鼠滑膜衍生間葉幹細胞時，使用了LEW/CrlCrlj大鼠。對αMEM no nucleosides（無核苷）（Gibco Cat.No.12561056）培養基，添加CollagenaseV（膠原蛋白酶V）（Sigma Cat.No.C9263），以使異氟烷麻醉下採集之滑膜組織的濃度達到2或3mg/mL，並在37℃下使其反應2小時。添加經冷卻之培養基以停止反應，並通過40μm的細胞過濾器去除了殘餘組織。將經回收之細胞接種到細胞培養燒瓶中，並用αMEM no nucleosides在CO ₂濃度5%、37℃下進行了培養，該αMEM no nucleosides中加入了Fetal Bovine Serum（胎牛血清）（Gibco Cat.No.10270106）使其最終濃度達到20%、加入了L-glutamine（左旋麩醯胺酸）200mmol/L（Gibco Cat.#25030081）使其最終濃度達到1%、以及加入了Antibiotic-Antimycotic（抗生素-抗黴菌）（100X）（Gibco Cat.No.15240062）使其最終濃度達到1%之。培養8天之後，丟棄燒瓶內的培養基，並用PBS（磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline））清洗2次之後，添加TrypLE Express（Gibco Cat.No.12604-013），並在37℃的培養箱（incubator）靜置5分鐘，並且作為滑膜衍生間葉幹細胞回收了細胞。藉由離心丟棄上清液，並置換為COS-banker（COSMO BIO Cat.No.COS-CFM01）而製作了大鼠滑膜衍生間葉幹細胞的凍存液。

＜實施例2＞藉由抑制整合素β1來抑制大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的細胞外基質接著能力 作為整合素β1被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製備，對實施例1中所製作之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的凍存液進行活化復甦，並使用αMEM no nucleosides在CO ₂濃度5%、37℃下培養1週後，將回收之細胞懸浮於含有反應溶劑2%FBS之PBS中，該αMEM no nucleosides中加入了Fetal Bovine Serum使其最終濃度達到20%、加入了L-glutamine200mmol/L使最終濃度達到1%、以及加入了Antibiotic-Antimycotic（100X）使其最終濃度達到1%。對每細胞數5×10 ⁶cells（細胞），添加12μg的Purified anti-mouse（純化抗小鼠）/rat（大鼠）CD29 Antibody（抗體）（BioLegend Cat.No.102202），在冰冷下使其反應1小時之後回收了細胞（整合素β1-rSMSC）。作為未進行整合素β1抑制之對照處理，使Purified Armenian Hamster（純化亞美尼亞倉鼠）IgG Isotype Ctrl（同型對照）（BioLegend Cat.No.400902）在冰冷下反應1小時之後回收了細胞（IgG-rSMSC）。又，設置僅用反應溶劑進行了相同的反應之未處理細胞（Non-treated-rSMSC），並將其供於以下的接著處理。

為了確認整合素β1被抑制，對作為整合素β1的功能之一的細胞外基質的接著功能進行了確認。作為細胞外基質接著反應，用10mmol/L的含有MgCl ₂・6H ₂O之PBS（以下PBS（+））進行清洗，且再次用PBS（+）懸浮細胞，並進行調整使其達到1×10 ⁵cells/10μL/well（孔），並且將其接種到Collagen Type I Cellware 8-Well Culture Slide（I型膠原蛋白細胞器皿8孔培養載玻片）（Corning Cat.No.354630）中。在室溫下靜置10分鐘後，用PBS（+）進行了清洗。其後，用顯微鏡（OLIMPUS Cat.No.IX71）以物鏡10倍進行了觀察。又，取得可觀察到最多接著細胞之1處視野的影像，並進行了接著細胞數的計算。

將結果示於圖1中。關於接著細胞數，Non-treated-rSMSC為1637cells、IgG-rSMSC為1214cells、整合素β1-rSMSC為194cells，觀察到藉由抑制整合素β1，細胞的接著數量大幅減少。由此能夠確認到，藉由用Purified anti-mouse/rat CD29 Antibody進行處理，能夠抑制大鼠滑膜幹細胞中的整合素β1。

＜實施例3＞藉由抑制PDGFRb來抑制大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的細胞增殖能力 作為PDGFRb被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製備，對實施例1中所製作之凍存液進行活化復甦，並使用αMEM no nucleosides在CO ₂濃度5%、37℃下培養1週後，將回收之細胞懸浮於含有反應溶劑2%FBS之PBS中，該αMEM no nucleosides中加入了Fetal Bovine Serum使其最終濃度達到20%、加入了L-glutamine 200mmol/L使其最終濃度達到1%、以及加入了Antibiotic-Antimycotic（100X）使其最終濃度達到1%。

對每個細胞數1×10 ⁶cells，分別使40、120μg的Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly（R＆D Systems Cat.No.AF385），在冰冷下反應1小時之後，在96孔盤（Corning Cat No.353072）上以1000cells/well接種細胞，並在CO ₂濃度5%、37℃下開始了培養（PDGFRb-rSMSC）。作為未進行PDGFRb抑制之對照處理，使Normal Goat IgG Control（正常山羊IgG對照）（R＆D Systems Cat.No.AB-108-C）在冰冷下反應1小時，並在96孔盤上以1000cells/well進行了接種（IgG-rSMSC）。又，亦設置了不進行反應而在96孔盤上僅接種1000cells/well的細胞之Non-treated-rSMSC。

為了確認PDGFRb被抑制，對作為PDGFRb的功能之細胞增殖能力進行了確認。在CO ₂濃度5%、37℃下培養並在培養第6天，藉由使用CellTiter-Glo（Promega Cat.No.G7571）之ATP assay，定量評價了細胞的增殖性。

將結果示於圖2a中。40μg/mL PDGFRb-rSMSC的ATP濃度為3.78±0.84μmol/L、120μg/mL PDGFRb-rSMSC的ATP濃度為4.12±1.29μmol/L、IgG-rSMSC為6.08±0.63μmol/L、Non-treated-rSMSC為6.81±0.82μmol/L，觀察到藉由PDGFRb的抑制，細胞增殖大幅得到抑制。由此能夠確認到，藉由用Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly進行處理，能夠抑制大鼠滑膜幹細胞的增殖。

為了確認PDGFRb的配位體特異性，作為PDGFRb被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製備，對在實施例1中所製作之凍存液進行活化復甦，使用加入Fetal Bovine Serum使其最終濃度達到20%、加入L-glutamine 200mmol/L使其最終濃度達到1%、及加入Antibiotic-Antimycotic（100X）使其最終濃度達到1%之αMEM no nucleosides，在CO ₂濃度5%、37℃下培養1週後，將回收之細胞懸浮於含有2%FBS之反應溶劑PBS中。

對每個細胞數1×10 ⁶cells，分別使10、20、40μg的Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly（R＆D Systems Cat.No.AF385）在冰冷下反應1小時之後，在96孔盤（Corning Cat No.353072）上以1000cells/well接種細胞，並在CO ₂濃度5%、37℃下開始了培養（PDGFRb-rSMSC）。作為未進行PDGFRb抑制之對照處理，使Normal Goat IgG Control（正常山羊IgG對照）（R＆D Systems Cat.No.AB-108-C）在冰冷下反應1小時，並在96孔盤上以1000cells/well進行了接種（IgG-rSMSC）。又，亦設置了不進行反應而在96孔盤上僅接種1000cells/well的細胞之Non-treated-rSMSC。

在細胞接種第二天，丟棄培養上清液，並將培養基與αMEM no nucleosides（Gibco Cat.No.10270106）進行了更換，該αMEM no nucleosides中加入了Fetal Bovine Serum使其最終濃度達到0.5%、加入了L-glutamine200mmol/L使其最終濃度達到1%、加入了Antibiotic-Antimycotic（100X）使其最終濃度達到1%、以及加入了PDGF-BB，Rat，Recombinant（R＆D systems Cat.No.520-BB-050）使其達到4ng/mL。關於實驗水準，加入Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly（R＆D Systems Cat.No.AF385）使其最終濃度分別達到10、20、40μg/mL，使培養基的總量為100μL。進行陽性對照時，加入Nomal Goat IgG Control（R＆D Systems Cat.No.AB-108-C）使培養基的總量為100μL。進行陰性對照時，不加入抗體，僅加入了培養基100μL。在培養第6天，藉由使用CellTiter-Glo（Promega Cat.No.G7571）之ATP assay，定量評價了細胞的增殖性。

將結果示於圖2b中。10μg/mL PDGFRb-rSMSC的ATP濃度為0.62±0.12μmol/L，20μg/mL PDGFRb-rSMSC的ATP濃度為0.65±0.05μmol/L，40μg/mL PDGFRb-rSMSC的ATP濃度為0.24±0.05μmol/L，IgG-rSMSC為0.49±0.17μmol/L，Non-treated-rSMSC為0.24±0.11μmol/L，觀察到40μg/mL PDGFRb-rSMSC對IgG-rSMSC細胞增殖顯著減少。由此能夠確認到，藉由用Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly進行處理，能夠以配位體特異性的方式抑制大鼠滑膜幹細胞中的PDGFRb。

＜實施例4＞Col2A1缺失大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製作 對實施例1中所製作之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞實施Col2A1基因的缺失操作，藉由Sanger測序分析（Sanger sequencing analysis）確認到Col2A1基因的缺失。將Col2A1基因野生型（Col2A1WT-rSMSC）和缺失型（Col2A1KO-rSMSC）的大鼠滑膜幹細胞的Col2A1鹼基序列示於圖3、圖4、圖5及圖6中，將基於其序列而轉譯之胺基酸序列示於圖7、圖8及圖9中。將Col2A1基因野生型（Col2A1WT-rSMSC）的大鼠滑膜幹細胞的Col2A1鹼基序列示於序列號1中，將Col2A1基因缺失型（Col2A1KO-rSMSC）的大鼠滑膜幹細胞的一條染色體的Col2A1鹼基序列示於序列號2中，將Col2A1基因缺失型（Col2A1KO-rSMSC）的大鼠滑膜幹細胞的另一條染色體的Col2A1鹼基序列示於序列號3中。將Col2A1基因野生型（Col2A1WT-rSMSC）的胺基酸序列示於序列號4中，將Col2A1基因缺失型（Col2A1KO-rSMSC）的胺基酸序列示於序列號5及序列號6中。其結果發現，在Col2A1KO-rSMSC中，以胺基酸轉譯起始密碼子ATG為起點，其為已缺失第55個至第62個鹼基之DNA和具有插入於第59個鹼基之異質框移突變體。其中一個等位基因由於鹼基的缺失而從第19個胺基酸開始序列發生突變，且在第29個插入終止密碼子，因此發現本來應為1419胺基酸，但現在被轉譯為28胺基酸殘基的突變體之鹼基序列。另一個等位基因由於鹼基的插入而從第20個胺基酸開始序列發生突變，且在第50個插入終止密碼子，因此發現本來應為1419胺基酸，但現在被轉譯為49胺基酸殘基的突變體之鹼基序列。呈現該突變體之鹼基序列由於作為Col2A1的重要功能領域之三重螺旋結構領域亦即第133個胺基酸至第1146個胺基酸的序列未被轉譯，因此判斷為能夠取得具有已缺失Col2A1功能的基因序列之滑膜幹細胞（Col2A1KO-rSMSC）。

＜比較例1＞CD120a缺失大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製作 對在實施例1中所製作之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞實施CD120a基因的缺失操作，藉由Sanger測序分析確認到CD120a基因的缺失。將CD120a基因野生型（CD120aWT-rSMSC）和缺失型（CD120aKO-rSMSC）的大鼠滑膜幹細胞的CD120a鹼基序列及基於其序列而轉譯之胺基酸序列示於圖10和圖11中。將CD120a基因野生型（CD120aWT-rSMSC）和缺失型（CD120aKO-rSMSC）的大鼠滑膜幹細胞的CD120a鹼基序列示於序列號7中，將CD120a基因野生型（CD120aWT-rSMSC）的胺基酸序列示於序列號8中，將CD120a基因缺失型（CD120aKO-rSMSC）的胺基酸序列示於序列號9中。其結果發現，在CD120aKO-rSMSC中，以胺基酸轉譯起始密碼子ATG為起點，其為具有已缺失第16個鹼基之DNA之框移突變體。由於鹼基的缺失而從第6個胺基酸開始序列發生突變，且在第19個插入終始密碼子，因此發現本來應為461胺基酸，但現在被轉譯為19胺基酸殘基的突變體之鹼基序列。呈現該突變體之鹼基序列由於構成CD120a之蛋白質區域的序列未被轉譯，因此判斷為能夠取得具有已缺失CD120a功能之基因序列之滑膜幹細胞（CD120aKO-rSMSC）。

＜比較例2＞CD106缺失大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製作 對在實施例1中所製作之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞實施CD106基因的缺失操作，藉由Sanger測序分析確認到CD106基因的缺失。將CD106基因野生型（CD106WT-rSMSC）和缺失型（CD106KO-rSMSC）的大鼠滑膜幹細胞的CD106鹼基序列及基於其序列而轉譯之胺基酸序列示於圖12和圖13中。將CD106基因野生型（CD106WT-rSMSC）和缺失型（CD106KO-rSMSC）的大鼠滑膜幹細胞的CD106鹼基序列示於序列號10中，將CD106基因野生型（CD106WT-rSMSC）的胺基酸序列示於序列號11中，將CD106基因缺失型（CD106KO-rSMSC）的胺基酸序列示於序列號12中。其結果發現，在CD106KO-rSMSC中，以胺基酸轉譯起始密碼子ATG為起點，其為具有已缺失第1059個至第1076個鹼基之DNA之框移突變體。由於鹼基的缺失而從第354個胺基酸開始序列發生突變，且在第356個插入終始密碼子，因此發現本來應為739胺基酸，但現在被轉譯為355胺基酸殘基的突變體之鹼基序列。呈現該突變體之鹼基序列由於作為CD106的跨膜區域之699胺基酸至720胺基酸的序列未被轉譯，因此判斷為能夠取得具有已缺失CD106功能之基因序列之滑膜幹細胞（CD106KO-rSMSC）。

＜實施例5＞已缺失Col2A1之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞中的軟骨分化能力的抑制 Col2A1為軟骨構成成分之一。為了以細胞功能等級來確認Col2A1缺失，檢測了Col2A1KO-rSMSO的軟骨分化能力。將在實施例4中所製作之Col2A1KO-rSMSC 2.5×10 ⁵cells懸浮於DMEM high glucose（高糖）（Thermo Cat.No.11965092），並用450g離心10分鐘之後，在CO ₂濃度5%、37℃下開始培養並誘導了軟骨分化，該DMEM high glucose中加入了TGF-β3（R＆DSystems Cat.No.243-B3-002）使其最終濃度達到10ng/mL、加入了Dexamethasone（地塞米松）（Wako Cat.No.041-18861）使其最終濃度達到3.92μg/mL、加入了L-Ascorbic Acid 2-phosphate（L-抗壞血酸2-磷酸鹽）（Cayman Chemical Cat.No.16457）使其最終濃度達到50μg/mL、加入了L-脯胺酸（MP Biomedicals Cat.No.194728）使其最終濃度達到40μg/mL、加入了Sodium Pyruvate（丙酮酸鈉）（Invitrogen Cat.No.11360070）使其最終濃度達到1μg/mL、加入了ITS-X補充劑（x100）（Wako Cat.No.094-06761）使其最終濃度達到1%、加入了BMP-2（R＆D Systems Cat.No.355-BM-010）使其最終濃度達到0.5μg/mL之。又，作為對照細胞，與Col2A1WT-rSMSC同樣地誘導了軟骨分化。培養3週後，測定細胞塊的直徑及重量，依據細胞塊的組織染色評價軟骨分化能力，並將結果示於圖14中。在Col2A1WT-rSMSC中，短徑為1.55±0.14mm、長徑為2.04±0.25mm、重量為1.9±0.26mg，而在Col2A1KO-rSMSC中，短徑為0.54±0.04mm、長徑為0.76±0.18mm、重量為0.85±0.4mg，觀察到軟骨尺寸及重量的顯著減少。Col2A1為軟骨構成成分，因此可看出由於Col2A1缺失，軟骨尺寸及重量有所減少。此外發現，在Col2A1KO-rSMSC中，番紅O-堅牢綠染色及II型膠原蛋白免疫染色的染色性正在消失。亦即，顯示了由於Col2A1缺失，不僅使II型膠原蛋白的產生能力消失，而且影響了黏多醣的軟骨基質的產生。這表明II型膠原蛋白不僅有助於軟骨組織骨格的形成，而且有助於軟骨分化/基質產生誘導作用。

＜比較例3＞已缺失CD120a之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞中的軟骨分化能力的抑制 檢測了在比較例1中所製作之CD120aKO-rSMSO的軟骨分化能力。在與實施例5相同的分化培養基及培養條件下，實施了軟骨分化誘導。又，作為對照細胞，與CD120aWT-rSMSC同樣地誘導了軟骨分化。培養3週後，測定細胞塊的直徑及重量，依據細胞塊的組織染色評價軟骨分化能力，並將結果示於圖15中。在CD120aWT-rSMSC中，短徑為1.55±0.14mm、長徑為2.04±0.25mm、重量為1.9±0.26mg，而在CD120aKO-rSMSC中，短徑為1.19±0.17mm、長徑為1.53±0.04mm、重量為1.55±1.20mg，未觀察到軟骨尺寸及重量的顯著減少。此外，未觀察到由CD120a缺失引起之番紅O-堅牢綠、II型膠原蛋白免疫染色的染色性的差異，因此認為CD120a並非為有助於細胞的軟骨分化能力之分子。

＜比較例4＞已缺失CD106之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞中的軟骨分化能力的抑制 檢測了在比較例2中所製作之CD106KO-rSMSO的軟骨分化能力。在與實施例5相同的分化培養基及培養條件下，實施了CD106KO-rSMSC 2.5×10 ⁵cells的軟骨分化誘導。又，作為對照細胞，與CD106WT-rSMSC同樣地誘導了軟骨分化。培養3週後，測定細胞塊的直徑及重量，依據細胞塊的組織染色評價軟骨分化能力，並將結果示於圖16中。在CD106WT-rSMSC中，短徑為1.55±0.14mm、長徑為2.04±0.25mm、重量為1.9±0.26mg，而在CD106KO-rSMSO中，短徑為1.58±0.56mm、長徑為1.75±0.52mm、重量為2.38±1.54mg，未觀察到軟骨尺寸、重量的顯著減少。此外，未觀察到由CD106缺失引起之番紅O-堅牢綠、II型膠原蛋白免疫染色的染色性的差異，因此認為CD106並非為有助於細胞的軟骨分化能力之分子。

＜實施例6＞整合素β1被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的半月板再生效果的確認 作為整合素β1被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製備，如實施例2中所記載實施了製備。活化復甦凍存液，培養1週後，將回收之細胞懸浮於含有反應溶劑2%FBS之PBS中。對每細胞數5x10 ⁶cells，添加12μg的Purified anti-mouse/rat 整合素β1 Antibody，在冰冷下使其反應1小時之後回收用於移植（整合素β1-rSMSC）。又，作為不進行抑制之對照處理，使Purified Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl在冰冷下反應1小時之後回收用於移植（IgG-rSMSC）。

在用於評價半月板再生效果的半月板損傷模型的製作中使用了LEW/CrlCrlj大鼠。在半月板損傷及移植間葉幹細胞之方法中，在異氟烷麻醉下切開膝關節部皮膚使膝關節露出。使膝蓋下的內側關節囊露出，用手術刀縱向切開而使股骨遠端部的軟骨露出。將內側半月板從滑膜剝離，使內側半月板露出，並切除了整體的約2/3。縫合膝蓋腱和滑膜，其後縫合肌肉而製作了半月板損傷模型。之後，將經處理之動物分成3組，分別向關節囊內注入了整合素β1被抑制之滑膜幹細胞（整合素β1-rSMSC）5x10 ⁶cells、進行了未抑制之對照處理之滑膜幹細胞（IgG-rSMSC）5x10 ⁶cells、及僅溶劑。注入細胞第二天，向關節囊內注入每膝12μg的Purified anti-mouse/rat整合素β1 Antibody、Armenian Hamster（亞美尼亞倉鼠）IgG Isotype Ctrl或溶劑。處理後，將所有大鼠放回籠子，任其自由運動及進食。

在處理過後的3週後，在異氟烷麻醉下，對動物藉由切斷下主動脈而進行放血而使其安樂死。之後，使半月板從膝關節露出，摘出內側半月板並進行了拍照。將所摘出之兩個膝關節的內側半月板的影像示於圖17中。依據與正常半月板的色調及形狀的差異確定再生部分，並用虛線圈起。在作為陰性對照之溶劑組中，半月板具有至中節部之形狀者佔多數。在作為陽性對照之IgG-rSMSC組中，半月板再生至前節部之例子較多，可觀察到的半月板再生部分較大。另一方面，在作為分子被抑制或者已缺失之細胞之整合素β1-rSMSC組中，與陽性對照相比，可觀察到的半月板再生部分較小。

為了定量評價圖17的半月板再生部分的肉眼所見，使用ImageJ（version1.52）藉由下式算出了半月板再生部分（虛線內）的面積的面積。

半月板再生部分面積（mm ²）=半月板再生部分區域的像素數/每1mm ²的像素數

各組的再生部分面積的平均值、標準偏差及統計學分析均用Microsoft Excel 2007（Microsoft Corp.）進行。關於統計學分析，對陽性對照組和分子抑制組及分子抑制組和溶劑組實施2次Student’s T-Test（學生t檢定），分別算出了P值。由於重複進行檢定，因此採用了適應Bonferroni校正並將算出之P值乘以檢定次數（2）而獲得之值。關於顯著水準，將5%（α=0.05）設為存在差異，並將其結果示於表1中。

關於表1中所記載之半月板再生部分的平均面積值，整合素β1-rSMSC組的2.1mm ²相對於IgG-rSMSC的3.4mm ²顯著減少。另一方面，整合素β1-rSMSC組相對於溶劑組的1.7mm ²具有相同程度的再生面積。由此能夠確認到，滑膜幹細胞中的整合素β1分子為有助於半月板再生之重要的分子。

[表1] 表1：半月板再生部分的面積（平均值±標準偏差）

組	面積（mm 2）
整合素β1-rSMSC	2.1±0.5*
IgG-rSMSC	3.4±1.0
溶劑	1.7±0.9

*P＜0.05 vs IgG-rSMSC組

＜實施例7＞PDGFRb被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的半月板再生效果的確認 作為PDGFRb被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製備，如實施例3中所記載實施了製備。活化復甦凍存液，培養1週後，將回收之細胞懸浮於含有反應溶劑2%FBS之PBS中。對每細胞數5x10 ⁶cells，使12μg的Anti-PDGF ReceptorβHuman Goat-Poly（R＆D Systems Cat.No.AF385）在冰冷下反應1小時之後回收用於移植（PDGFRb-rSMSC）。又，作為未進行抑制之對照處理，使Nomal Goat IgG Control（R＆D Systems Cat.No.AB-108-C）在冰冷下反應1小時並回收用於移植（IgG-rSMSC）。

如實施例6中所記載製作了用於評價半月板再生效果之半月板損傷模型。之後，將經處理之動物分成3組，分別向關節囊內注入了PDGFRb被抑制之滑膜幹細胞（PDGFRb-rSMSC）5x10 ⁶cells、進行了未抑制之對照處理之滑膜幹細胞（IgG-rSMSC）5x10 ⁶cells、及僅溶劑。注入細胞第二天，向關節囊內注入每膝12μg的Anti-PDGF ReceptorβHuman Goat-Poly、Nomal Goat IgG Control或溶劑。處理後，將所有大鼠放回籠子，任其自由運動及進食。

在處理過後的3週後，在異氟烷麻醉下，對動物藉由切斷下主動脈而進行放血而使其安樂死。之後，使半月板從膝關節露出，摘出內側半月板並進行了拍照。將所摘出之兩個膝關節的內側半月板的影像示於圖18中。依據與正常半月板的色調及形狀的差異確定再生部分，並用虛線圈起。在作為陰性對照之溶劑組中，半月板具有至中節部之形狀者佔多數。在作為陽性對照之IgG-rSMSC組中，半月板再生至前節部之例子較多，可觀察到的半月板再生部分較大。另一方面，在作為分子被抑制或者已缺失之細胞之PDGFRb-rSMSC組中，與陽性對照相比，可觀察到的半月板再生部分較小。

為了定量評價圖18的半月板再生部分的肉眼所見，如實施例6中所記載測定了半月板再生部分（虛線內）的面積。將其結果記載於表2中。關於半月板再生部分的平均面積值，PDGFRb-rSMSC組的2.2mm ²相對於IgG-rSMSC的3.2mm ²顯著減少。另一方面，PDGFRb-rSMSC組相對於溶劑組的1.3mm ²顯著增加。由此能夠確認到，滑膜幹細胞中的PDGFRb分子為有助於半月板再生之分子。

[表2] 表2：半月板再生部分的面積（平均值±標準偏差）

組	面積（mm 2）
PDGFRb-rSMSC	2.2±0.9*†
IgG-rSMSC	3.2±0.7
溶劑	1.3±1.2

*P＜0.05 vs IgG-rSMSC組 †P＜0.05 vs 溶劑組

＜比較例5＞CD44被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的半月板再生效果的確認 作為CD44被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的製備，活化復甦凍存液，培養1週後，將回收之細胞懸浮於含有反應溶劑2%FBS之PBS中。對每細胞數5x10 ⁶cells，使12μg的Anti-CD44 Rabbit IgGclone Hermes-1（Absolute Antibody Cat.No.Ab00628-23.0）在冰冷下反應30分鐘之後回收用於移植（CD44-rSMSC）。又，作為未進行抑制之對照處理，使Rabbit IgG Isotype Control（兔IgG同種型對照）（invitrogen Cat.No.10500C）在冰冷下反應1小時並回收用於移植（IgG-rSMSC）。

如實施例6中所記載製作了用於評價半月板再生效果之半月板損傷模型。之後，將經處理之動物分成3組，分別向關節囊內注入了CD44被抑制之滑膜幹細胞（CD44-rSMSC）5x10 ⁶cells、進行了未抑制之對照處理之滑膜幹細胞（IgG-rSMSC）5x10 ⁶cells、及僅溶劑。注入細胞第二天，向關節囊內注入每膝12μg的Anti-CD44 Rabbit IgG clone（兔IgG克隆）Hermes-1、Rabbit IgG Isotype Control或溶劑。處理後，將所有大鼠放回籠子，任其自由運動及進食。

在處理過後的4週後，在異氟烷麻醉下，對動物藉由切斷下主動脈而進行放血而使其安樂死。之後，使半月板從膝關節露出，摘出內側半月板並進行了拍照。將所摘出之兩個膝關節的內側半月板的影像示於圖19中。依據與正常半月板的色調及形狀的差異確定再生部分，並用虛線圈起。在作為陰性對照之溶劑組中，半月板具有至中節部之形狀者佔多數。在作為陽性對照之IgG-rSMSC組及CD44-rSMSC組中，半月板再生至前節部之例子較多，可觀察到的半月板再生部分較大。

為了定量評價圖19的半月板再生部分的肉眼所見，如實施例6中所記載測定了半月板再生部分（虛線內）的面積。將其結果記載於表3中。關於半月板再生部分的平均面積值，與IgG-rSMSC的4.0mm ²相比，CD44-rSMSC組的3.4mm ²並無顯著的差異，為相同程度。另一方面，CD44-rSMSC組相對於溶劑組的2.7mm ²顯著增加。由此認為，滑膜幹細胞中的CD44並非為有助於半月板再生之分子。

[表3] 表3：半月板再生部分的面積（平均值±標準偏差）

組	面積（mm 2）
CD44-rSMSC	3.4±0.9†
IgG-rSMSC	4.0±1.0
溶劑	2.7±0.7

†P＜0.05 vs 溶劑組

＜實施例8＞已缺失Col2A1之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞（Col2A1KO-rSMSC）的半月板再生效果的確認 如實施例4中所記載，已缺失Col2A1之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞在確認Col2A1缺失之後，藉由擴大培養進行調整而用於移植（Col2A1KO-rSMSC）。作為陽性對照確認Col2A1野生型序列之後，藉由擴大培養進行調整而用於移植（Col2A1WT-rSMSC）。

如實施例6中所記載製作了用於評價半月板再生效果之半月板損傷模型。之後，將經處理之動物分成3組，分別向關節囊內注入了Col2A1KO-rSMSC、Col2A1WT-rSMSC 5x10 ⁶cells、及僅溶劑。

在處理過後的3週後，在異氟烷麻醉下，對動物藉由切斷下主動脈而進行放血而使其安樂死。之後，使半月板從膝關節露出，摘出內側半月板並進行了拍照。將所摘出之兩個膝關節的內側半月板的影像示於圖20中。依據與正常半月板的色調及形狀的差異確定再生部分，並用虛線圈起。在作為陰性對照之溶劑組中，半月板具有至中節部之形狀者佔多數。在作為陽性對照之Col2A1WT-rSMSC組中，半月板再生至前節部之例子較多，可觀察到的半月板再生部分較大。另一方面，在Col2A1KO-rSMSC組中，與陽性對照相比，可觀察到的半月板再生部分較小。

為了定量評價圖20的半月板再生部分的肉眼所見，如實施例6中所記載測定了半月板再生部分（虛線內）的面積。將其結果記載於表4中。關於半月板再生部分的平均面積值，與Col2A1KO-rSMSC組的2.9mm ²相比，Col2A1WTrSMSC顯著增加為3.8mm ²。另一方面，與溶劑組的2.1mm ²相比，Col2A1KO-rSMSC組顯著增加。由此能夠確認到，滑膜幹細胞中的Col2A1分子為有助於半月板再生之分子。

[表4] 表4：半月板再生部分的面積（平均值±標準偏差）

組	面積（mm 2）
Col2A1KO-rSMSC	2.9±0.8*†
Col2A1WT-rSMSC	3.8±0.6
溶劑	2.1±1.0

*P＜0.05 vs IgG-rSMSC組 †P＜0.05 vs 溶劑組

＜比較例6＞已缺失CD120a之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞（CD120aKO-rSMSC）的半月板再生效果的確認 如比較例1中所記載，已缺失CD120a之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞在確認CD120a缺失之後，藉由擴大培養進行調整而用於移植（CD120aKO-rSMSC）。作為陽性對照確認CD120a野生型序列之後，藉由擴大培養進行調整而用於移植（CD120aWT-rSMSC）。

如實施例6中所記載製作了用於評價半月板再生效果之半月板損傷模型。之後，將經處理之動物分成3組，分別向關節囊內注入了CD120aKO-rSMSC、CD120aWT-rSMSC 5x10 ⁶cells、及僅溶劑。

在處理過後的3週後，在異氟烷麻醉下，對動物藉由切斷下主動脈而進行放血而使其安樂死。之後，使半月板從膝關節露出，摘出內側半月板並進行了拍照。將所摘出之兩個膝關節的內側半月板的影像示於圖21中。依據與正常半月板的色調及形狀的差異確定再生部分，並用虛線圈起。在作為陰性對照之溶劑組中，半月板具有至中節部之形狀者佔多數。另一方面，作為陽性對照之CD120aWT-rSMSC組及CD120aKO-rSMSC組中，半月板再生至前節部之例子較多，與溶劑組相比，可觀察到的半月板再生部分較大。

為了定量評價圖21的半月板再生部分的肉眼所見，如實施例6中所記載測定了半月板再生部分（虛線內）的面積。將其結果記載於表5中。關於半月板再生部分的平均面積值，與CD120aKO-rSMSC組的3.1mm ²相比，CD120aWT-rSMSC為3.3mm ²，未觀察到顯著的差異。另一方面，與溶劑組的1.8mm ²相比，CD120aKO-rSMSC組顯著增加。由此認為，滑膜幹細胞中的CD120a並非為有助於半月板再生之分子。

[表5] 表5：半月板再生部分的面積（平均值±標準偏差）

組	面積（mm 2）
CD120aKO-rSMSC	3.1±0.7†
CD120aWT-rSMSC	3.3±1.6
溶劑	1.8±0.5

†P＜0.05 vs 溶劑組

＜比較例7＞已缺失CD106之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞（CD106aKO-rSMSC）的半月板再生效果的確認 如比較例1中所記載，已缺失CD106之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞在確認CD106缺失之後，藉由擴大培養進行調整而用於移植（CD106KO-rSMSC）。作為陽性對照確認CD106野生型序列之後，藉由擴大培養進行調整而用於移植（CD106WT-rSMSC）。

如實施例6中所記載製作了用於評價半月板再生效果之半月板損傷模型。之後，將經處理之動物分成3組，分別向關節囊內注入了CD106KO-rSMSC、CD106WT-rSMSC5x10 ⁶cells、及僅溶劑。

在處理過後的3週後，在異氟烷麻醉下，對動物藉由切斷下主動脈而進行放血而使其安樂死。之後，使半月板從膝關節露出，摘出內側半月板並進行了拍照。將所摘出之兩個膝關節的內側半月板的影像示於圖22中。依據與正常半月板的色調及形狀的差異確定再生部分，並用虛線圈起。在作為陰性對照之溶劑組中，半月板具有至中節部之形狀者佔多數。另一方面，作為陽性對照之CD106WT-rSMSC組及CD106KO-rSMSC組中，半月板再生至前節部之例子較多，與溶劑組相比，可觀察到的半月板再生部分較大。

為了定量評價圖22的半月板再生部分的肉眼所見，如實施例6中所記載測定了半月板再生部分（虛線內）的面積。將其結果記載於表6中。關於半月板再生部分的平均面積值，與CD106KO-rSMSC組的3.7mm ²相比，CD106WT-rSMSC為3.3mm ²，未觀察到顯著的差異。另一方面，與溶劑組的1.7mm ²相比，CD106KO-rSMSC組顯著增加。由此認為，滑膜幹細胞中的CD106並非為有助於半月板再生之分子。

[表6] 表6：半月板再生部分的面積（平均值±標準偏差）

組	面積（mm 2）
CD106KO-rSMSC	3.7±0.7†
CD106WT-rSMSC	3.3±0.7
溶劑	1.7±0.7

†P＜0.05 vs 溶劑組

＜實施例9＞大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的建立步驟、細胞回收時的處理時間差異及整合素β1、PDGFRb表達率 與實施例1同樣地，從大鼠滑膜分離細胞並培養8天而獲得了大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞。丟棄燒瓶內的培養基，並用PBS清洗2次之後，添加TrypLE Express（Gibco Cat.No.12604-013），並在37℃的培養箱分別靜置5、30、60及120分鐘，剝離並回收了細胞。

將在各個條件下回收之10 ⁶cells懸浮於500μL的PBS中。為了進行死細胞染色，將LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit（Invitrogen Cat.No.L34957）添加到0.5μL細胞懸浮液中，並在室溫下培養了30分鐘。離心之後丟棄上清液，並添加FACS緩衝液（buffer）（最終濃度2mmol/L EDTA・2Na、含有1%bovine serum albumin（牛血清白蛋白）之PBS）1mL，使細胞懸浮於其中。為了測定整合素β1的表達率，添加PEanti-mouse（PE純化抗小鼠）/rat（大鼠）整合素β1 Antibody（Biolegend Cat.No.102207）或PE Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl Antibody（Biolegend Cat.No.400907）5μL，並在4℃下使其反應了30分鐘。之後，進行離心丟棄上清液，使其懸浮於FACS緩衝液1mL中之後，再次進行離心棄去上清液，使其懸浮於FACS緩衝液500μL中，將其供於測定。為了測定PDGFRb的表達率，添加Anti-PDGF Receptorβ，Human，Goat-Poly（R＆D Systems Cat.No.AF385）或Nomal Goat IgG Control（R＆D Systems Cat.No.AB-108-C）5μL，在4℃下使其反應了30分鐘。之後，進行離心丟棄上清液，使其懸浮於FACS緩衝液1mL中。進而，添加Donkey anti-Goat IgG（驢抗山羊LgG）（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody（交叉吸附二級抗體），FITC（invitrogen Cat.No.A16006）1μL，在4℃下使其反應了30分鐘。之後，進行離心丟棄上清液，使其懸浮於FACS緩衝液1mL中之後，再次進行離心棄去上清液，使其懸浮於FACS緩衝液500μL中，將其供於流式細胞儀（Attune NxT, AutoForcusing Cytometer model:AFC2，invitrogen），測定了整合素β1及PDGFRb表達率。

將基於滑膜衍生間葉系幹細胞的剝離處理時間的差異之整合素β1及PDGFRb的表達率記載於表7中。即使將剝離處理時間從通常的5分鐘延長至120分鐘，整合素β1的表達率亦維持在90%以上。另一方面，PDGFRb的表達率以時間相依性的方式減少，在5分鐘時為91.7%，在30分鐘時為76.9%，60分鐘時為63.3%，在120分鐘時為32.8%。如實施例7所示，PDGFRb為滑膜幹細胞中的半月板再生所需的分子，在細胞剝離處理時間中，由於當PDGFRb表達率超過半數時，能夠進一步期待半月板再生效果，因此處理時間為60分鐘以內為較佳，其所需的分子表達率可設定為60%以上。

[表7] 表7：細胞回收時的剝離處理時間和整合素β1、PDGFRb的表達率

表達率	處理時間
5分鐘	30分鐘	60分鐘	120分鐘
整合素β1	98.7%	99.7%	96.1%	97.8%
PDGFRb	91.6%	76.9%	63.3%	32.8%

＜實施例10＞建立大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞時之細胞回收時的培養天數和整合素β1表達率 與實施例1同樣地，從大鼠滑膜分離細胞，在面積為75cm ²的燒瓶中接種7.5x10 ⁴cells，分別培養8、21、28天而獲得了大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞。丟棄燒瓶內的培養基，並用PBS清洗2次之後，添加TrypLE Express （Gibco Cat.No.12604-013），並在37℃的培養箱靜置120分鐘，剝離並回收了細胞。之後，與實施例9同樣地進行死細胞及整合素β1染色操作，將其供於測定。

將基於滑膜衍生間葉系幹細胞的培養天數差異之整合素β1的表達率記載於表8中。滑膜衍生間葉系幹細胞的整合素β1表達率以培養天數相依性的方式減少，在8天時為97.8%，在21天時為62.1%，在28天時為56.1%。如實施例6所示，整合素β1為滑膜幹細胞中的半月板再生所需的分子，因此過半數的整合素β1陽性率細胞為較佳。又，如實施例7所示，半月板再生所需的分子表達率可設定為60%以上，因此培養天數為21天以內為較佳。

[表8] 表8：細胞分離後的培養時間和整合素β1表達率

表達率	培養天數
8天	21天	28天
整合素β1	97.8%	62.1%	56.1%

＜實施例11＞ 對於購自Articular Engineering公司之人體滑膜衍生幹細胞（Cryopreserved Synoviocytes，Normal、P1 型號：CDD-H-2910-N、批次：ST1414，ST1420，ST1434、ST1462），亦藉由流氏細胞儀測定了作為藥效所必需的蛋白質分子之整合素β1、PDGFRb的陽性率。測定設備使用了Attune NxT, AutoForcusing Cytometer（型號：AFC2，invitrogen）。作為抗體，分別使用了整合素β1（APC Mouse Anti-Human CD29 Cat：559883）、PDGFRb（Anti-PDGF Receptorβ，Human，Goat-Poly Cat：AF385）。

其結果，整合素β1的表面抗原陽性率每批分別為99.4%、99.6%、99.6%、99.5%。又，發現PDGFRb的表面抗原陽性率每批分別為92.2%、90.7%、95.2%、85.9%。由此發現，當該人滑膜衍生幹細胞具有作為關節病治療劑之治療效果時，作為標準值，將整合素β1管理為90%以上、將PDGFRb管理為80%以上為妥當。

如此，整合素β1、PDGFRb的表達不僅能夠在實施例9、10中的大鼠滑膜衍生幹細胞得到確認，而且在人滑膜衍生幹細胞中亦能夠確認，這表明可將其作為細胞的有效性品質管理項目來設定。

＜實施例12＞FGFR3被抑制之大鼠滑膜衍生幹細胞的半月板再生效果的確認 作為FGFR3被抑制之大鼠滑膜衍生幹細胞的製備，對在實施例1中所製作之大鼠滑膜衍生幹細胞的凍存液進行活化復甦，使用加入Fetal Bovine Serum使其最終濃度達到20%、加入L-glutamine200mmol/L使其最終濃度達到1%、及加入Antibiotic-Antimycotic（100×）使其最終濃度達到1%之αMEM no nucleosides，在CO ₂濃度5%、37℃下培養1週後，將回收之細胞懸浮於含有反應溶劑2%FBS之PBS中。對每細胞數5×10 ⁶cells，添加100μg的FGFR3 Polyclonal Antibody（Invitrogen Cat.No.PA5-34574），使其在冰冷下反應1小時之後回收了細胞（FGFR3-rSMSC）。作為未進行FGFR3抑制之對照處理，使Rabbit IgG Isotype Control（Thermo Fisher Scientific Cat.No.10500C）在冰冷下反應1小時之後回收了細胞（IgG-rSMSC）。

在用於評價半月板再生效果的半月板損傷模型的製作中使用了LEW/CrlCrlj大鼠。在半月板損傷及移植間葉幹細胞之方法中，在異氟烷麻醉下切開膝關節部皮膚使膝關節露出。使膝蓋下的內側關節囊露出，用手術刀縱向切開而使股骨遠端部的軟骨露出。將內側半月板從滑膜剝離，使內側半月板露出，並從前方切除了約2/3。縫合膝蓋腱和滑膜，其後縫合肌肉而製作了半月板損傷模型。之後，將經處理之動物分成3組，分別向關節囊內注入了FGFR3被抑制之滑膜幹細胞（FGFR3-rSMSC）5×10 ⁶cells、進行了未抑制之對照處理之滑膜幹細胞（IgG-rSMSC）5×10 ⁶cells、及僅溶劑。處理後，將所有大鼠放回籠子，任其自由運動及進食。

在處理過後的3週後，在異氟烷麻醉下，對動物藉由切斷下主動脈而進行放血而使其安樂死。之後，使半月板從膝關節露出，摘出內側半月板並進行了拍照。將所摘出之兩個膝關節的內側半月板的影像示於圖23中。依據與正常半月板的色調及形狀的差異確定再生部分，並用虛線圈起。在作為陰性對照之溶劑組中，半月板具有至中節部之形狀者佔多數。在作為陽性對照之IgG-rSMSC組中，半月板再生至前節部之例子較多，可觀察到的半月板再生部分較大。另一方面，在作為分子被抑制或者已缺失之細胞之FGFR3-rSMSC組中，與陽性對照相比，可觀察到的半月板再生部分較小。

為了定量評價圖23的半月板再生部分的肉眼所見，使用Image J（version 1.52）藉由下式算出了半月板再生部分（虛線內）的面積的面積。

半月板再生部分面積（mm ²）=半月板再生部分區域的像素數/每1mm ²的像素數

各組的再生部分面積的平均值、標準偏差及統計學分析均用Microsoft Excel 2007（Microsoft Corp.）進行。關於統計學分析，對陽性對照組和分子抑制組及分子抑制組和溶劑組實施2次Student’s T-Test（學生t檢定），分別算出了P值。又，顯著水準為5%（α=0.05）時，將藉由Bonferroni校正而除以檢定次數（2次）之顯著水準2.5%（α=0.025）設為存在差異，並將其結果記載於表9中。

關於表9中所記載之半月板再生部分的平均面積值，FGFR3-rSMSC組的1.2mm ²相對於IgG-rSMSC的1.9mm ²顯著減少。另一方面，FGFR3-rSMSC組相對於溶劑組的1.0mm ²具有相同程度的再生面積。由此能夠確認到，滑膜幹細胞中的FGFR3分子為有助於半月板再生之重要的分子。

[表9] 表9：半月板再生部分的面積（平均值±標準偏差）

組	面積（mm 2）
FGFR3-rSMSC	1.2±0.5*†
IgG-rSMSC	1.9±0.6
溶劑	1.0±0.5

*P＜0.025 vs IgG-rSMSC組 †P＜0.025 vs 溶劑組

圖1表示對藉由抑制整合素β1來抑制大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的細胞外基質接著能力之情形進行檢測之結果。 圖2a、圖2b表示對藉由抑制PDGFRb來抑制大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的細胞增殖能力之情形進行檢測之結果。 圖3表示Col2A1基因野生型（Col2A1WT-rSMSC）和缺失型（Col2A1KO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的Col2A1鹼基序列（前半部分）。 圖4表示Col2A1基因野生型（Col2A1WT-rSMSC）和缺失型（Col2A1KO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的Col2A1鹼基序列（後半部分）。 圖5表示Col2A1基因野生型（Col2A1WT-rSMSC）和缺失型（Col2A1KO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的Col2A1鹼基序列（前半部分）。 圖6表示Col2A1基因野生型（Col2A1WT-rSMSC）和缺失型（Col2A1KO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的Col2A1鹼基序列（後半部分）。 圖7表示基於Col2A1基因野生型（Col2A1WT-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的Col2A1鹼基序列而轉譯之胺基酸序列。 圖8表示基於Col2A1基因缺失型（Col2A1KO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的Col2A1鹼基序列而轉譯之胺基酸序列。 圖9表示基於Col2A1基因缺失型（Col2A1KO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的Col2A1鹼基序列而轉譯之胺基酸序列。 圖10表示CD120a基因野生型（CD120aWT-rSMSC）和缺失型（CD120aKO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的CD120a鹼基序列。 圖11表示基於CD120a基因野生型（CD120aWT-rSMSC）和缺失型（CD120aKO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的CD120a鹼基序列而轉譯之胺基酸序列。 圖12表示CD106基因野生型（CD106WT-rSMSC）和缺失型（CD106KO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的CD106鹼基序列。 圖13表示基於CD106基因野生型（CD106WT-rSMSC）和缺失型（CD106KO-rSMSC）大鼠滑膜幹細胞的CD106鹼基序列而轉譯之胺基酸序列。 圖14表示對已缺失Col2A1之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞中的抑制軟骨分化能力之情形進行檢測之結果。 圖15表示對已缺失CD120a之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞中的抑制軟骨分化能力之情形進行檢測之結果。 圖16表示對已缺失CD106之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞中的抑制軟骨分化能力之情形進行檢測之結果。 圖17表示確認到整合素β1被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的半月板再生效果之結果。 圖18表示確認到PDGFRb被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的半月板再生效果之結果。 圖19表示確認到CD44被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的半月板再生效果之結果。 圖20表示確認到已缺失Col2A1之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞（Col2A1KO-rSMSC）的半月板再生效果之結果。 圖21表示確認到已缺失CD120a之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞（CD120aKO-rSMSC）的半月板再生效果之結果。 圖22表示確認到已缺失CD106之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞（CD106aKO-rSMSC）的半月板再生效果之結果。 圖23表示確認到FGFR3被抑制之大鼠滑膜衍生間葉系幹細胞的半月板再生效果之結果。

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Claims (10)

1. 一種關節病治療劑，其包含具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞。
2. 如請求項1所述之關節病治療劑，其中 滑膜衍生間葉系幹細胞具有整合素β1及血小板衍生生長因子受體β兩者的表面抗原。
3. 如請求項1或2所述之關節病治療劑，其具有編碼II型膠原蛋白α1鏈之基因且移植後產生II型膠原蛋白α1鏈。
4. 如請求項1或2所述之關節病治療劑，其具有FGFR3的表面抗原。
5. 如請求項1或2所述之關節病治療劑，其中 相對於關節病治療劑中所含之所有細胞之、具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞的比率為30%以上。
6. 一種請求項1所述之關節病治療劑的製造方法，其包括： 步驟A，用酶處理滑膜組織； 步驟B，清洗酶處理後的混合物； 步驟C，在基材上培養清洗後的混合物中所含之滑膜衍生間葉系幹細胞；及 步驟D，將培養後的滑膜衍生間葉系幹細胞從基材分離。
7. 如請求項6所述之方法，其中 前述步驟B為將酶處理後的混合物清洗至上清液中的殘存酶濃度達到0.5ng/mL以下之步驟。
8. 如請求項6或7所述之方法，其中 在前述步驟C中，培養滑膜衍生間葉系幹細胞之期間為28天以內。
9. 如請求項6或7所述之方法，其中 在前述步驟D中，藉由使細胞剝離液作用於間葉系幹細胞120分鐘以內的時間來進行分離。
10. 如請求項6或7所述之方法，其進一步包括對具有整合素β1或血小板衍生生長因子受體β中的任一種以上的表面抗原之滑膜衍生間葉系幹細胞進行分選之步驟。

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