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TW202312985A - 靶向動脈粥樣硬化脂質體奈米載體遞送系統及其製備方法 - Google Patents

靶向動脈粥樣硬化脂質體奈米載體遞送系統及其製備方法 Download PDF

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TW202312985A
TW202312985A TW111133607A TW111133607A TW202312985A TW 202312985 A TW202312985 A TW 202312985A TW 111133607 A TW111133607 A TW 111133607A TW 111133607 A TW111133607 A TW 111133607A TW 202312985 A TW202312985 A TW 202312985A
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TW
Taiwan
Prior art keywords
liposome
atherosclerosis
delivery system
solution
nanocarrier delivery
Prior art date
Application number
TW111133607A
Other languages
English (en)
Inventor
馬茜
陳小明
鄧拓
王惠婧
Original Assignee
大陸商北京茵諾醫藥科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本發明提供了一種靶向動脈粥樣硬化脂質體奈米載體遞送系統，所述脂質體奈米載體遞送系統包括脂質體載體及其主動包封的用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質；其中，所述脂質體奈米載體遞送系統的製備方法包括通過加入造成脂質體內外溶液酸度梯度的鹽溶液水化所述脂質體載體主動包封所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質的步驟，還提供了其在製備藥物中的應用。

Description

靶向動脈粥樣硬化脂質體奈米載體遞送系統及其製備方法
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及一種主動包封脂質體奈米載體遞送系統及其製備方法和應用。
心腦血管疾病是高致殘率、高病死率、高醫療風險及高醫療費用的第一大慢性疾病，是全球第一位的死亡原因。心腦血管病占居民全部死因的40%以上，而動脈粥樣硬化相關疾病是心腦血管疾病的重中之重。根據統計，全球動脈粥樣硬化患者4.66億，其中冠心病患者1.54億，每年新發2.73千萬。全球每年新發急性心肌梗死1900萬，患者死亡率為34％至42％，即使患者僥倖存活，心梗後1-5年全因死亡和心血管事件的相對危險度至少比一般人群高30％。
2018年《中國心血管病報告》顯示：根據2010年中國第六次人口普查資料，目前中國冠心病患者達到1100萬人，每年新增患者人數超過100萬，每年死於心血管疾病的患者多達390萬，占居民疾病死亡構成的40%以上。大量研究證實，動脈粥樣硬化是導致患者發生心肌梗死、缺血性腦中風的主要原因，該類患者也最易發生猝死或心功能不全、腦梗塞後遺症等嚴重不良事件，給家庭和社會帶來沉重的醫療負擔。
然而，面對如此重大的疾病，全球範圍內尚無較好的防治手段。對於動脈粥樣硬化目前的治療仍是全身用藥。口服藥物僅能延緩斑塊進展，而無法明顯逆轉斑塊，更無法將疾病徹底治癒。而國人對他汀等藥物的耐受性差，易誘發肝功能異常、新發糖尿病、橫紋肌溶解、認知障礙等併發症。目前，患者的治療策略仍然是終身藥物治療，無法將疾病治癒，還面臨很多藥物副反應。例如口服他汀類藥物治療動脈粥樣硬化需要採用強化大劑量才能具有穩定斑塊的作用，而全身大劑量使用他汀類藥物治療也存在嚴重副作用(例如肝功能異常、橫紋肌溶解、II型糖尿病等)發生率升高的風險。
對於現有的全身性給藥而言，藥物在進入體內後通常僅有極少一部分有效成分能夠真正作用於病變部位。尤其是動脈粥樣硬化，位於血管壁中，血流速度快，藥物無法進入斑塊，更無法在斑塊中聚集。這是制約藥物療效，並導致藥物毒副作用的根本原因。靶向給藥系統是指具有靶向給藥能力的給藥系統。在經某種途徑給藥以後，靶向給藥系統所包含的藥物會由於細微性或電性等特異性富集於靶部位，或通過帶有靶向探針的載體特異性地富集於靶部位。靶向給藥系統能夠使藥物瞄準特定的病變部位，並在目標病變部位釋放有效成分。因此，靶向給藥系統可以使藥物在目標病變部位形成相對較高的濃度，並減少血液循環中的藥量，從而在提高藥效的同時抑制毒副作用，減少對正常組織和細胞的傷害。
脂質體為常用的靶向給藥系統。脂質體具有提高藥效、降低藥物毒副作用、提升藥物的生物利用度、生物安全性強等明顯優勢。ZL201980001843.4公開了一項通過被動包封法製備靶向CD44的脂質體奈米藥物，可利用易損斑塊內主要存在的巨噬細胞、單核細胞、內皮細胞、淋巴細胞和平滑肌細胞的表面上的CD44的表達狀態及其與透明質酸（HA）的親和能力，構建靶向斑塊或與易損斑塊相關的疾病的能夠實現藥物的脂質體藥物遞送系統用於診斷或治療易損斑塊並持續釋放的靶向給藥系統，但是目前手段僅限於被動載藥方法。ZL201980001833.0公開了通過薄膜水化、探頭超聲兩步法，將一系列具有親水或疏水的治療藥物和造影劑包被在親水內腔或者疏水脂質層中，進一步與靶向配體偶聯。這種策略屬於被動包封，雖然普適性強，但包封率往往不夠高，治療效果也有進一步提升空間。
另外，對脂溶性強的他汀類藥物製備成脂質體的研究表明，可以通過對脂溶性強的他汀藥物採用薄膜水化或逆向蒸發法，將藥物包在脂質體雙層膜內，達到提高代謝時間、提高生物利用度等目的。 但是這些方法對於具有一定水溶性的他汀藥物並不適用。為了解決這些問題，本發明的發明人發現並公開了通過主動載藥方法將具有一定水溶性的他汀藥物進行主動包封，達到靶向給藥的方法。
在靶向奈米製劑領域，製劑粒徑和靶向配體偶聯密度對治療效果的影響密切相關，但是結論並不統一，即針對不同適應症的奈米製劑的尺寸和表面配體偶聯濃度沒有統一標準且針對不同適應症差異較大。對於動脈粥樣硬化這一疾病來說，探索適宜尺寸的粒徑和配體濃度對藥效發揮至關重要的作用。本發明公開了一種新的載藥工藝，以及使用特定奈米結構和特定配體密度進行針對動脈粥樣硬化疾病的治療的配方。
本發明的目的在於克服現有技術中的缺陷，提供一種主動包封脂質體奈米載體遞送系統，及其製備方法和應用。同時本發明披露了在靶向奈米藥物中，特定粒徑和表面配體密度對藥效的影響。
在闡述本發明內容之前，定義本發明中所使用的術語如下：
術語“靶向給藥系統”是指：具有靶向給藥能力的給藥系統。在經某種途徑給藥以後，靶向給藥系統所包含的藥物會通過特殊載體或靶向彈頭(例如，靶向配體)的作用特異性地富集於靶部位。目前已知的用於實現靶向給藥的手段包括利用各種微粒給藥系統的被動靶向性能、在微粒給藥系統的表面進行化學修飾、利用一些特殊的理化性能、利用抗體介導靶向給藥、利用配體介導靶向給藥、利用前體藥物靶向給藥等。
術語“動脈粥樣硬化”是指：一組稱為動脈硬化的血管病中常見而最重要的一種，特點為受累動脈病變從內膜開始，先後有脂質和複合糖類積聚、出血和血栓形成、纖維組織增生和鈣質沉著，並有動脈中層的逐漸退變和鈣化。由於在動脈內膜積聚的脂質外觀呈黃色粥樣，因此稱為動脈粥樣硬化。
術語“主動包封脂質體”是指：使用跨膜pH梯度或離子梯度將某些親水性或兩親性化合物裝載到預製的脂質體中。該技術被稱為主動或遠端包封。
為實現上述目的，本發明的第一方面提供了一種主動包封脂質體奈米載體遞送系統。 所述脂質體奈米載體遞送系統包括脂質體載體及其主動包封的用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質。
根據本發明第一方面的脂質體奈米載體遞送系統，其中，所述脂質體載體的材料包含磷脂和膽固醇； 優選地，所述磷脂選自以下一種或多種：氫化大豆磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯甘油、二硬脂醯磷脂醯絲氨酸、二油醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯乙醇胺、二油醯磷脂醯絲氨酸、二油醯磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇、二肉桂醯磷脂醯膽鹼、二肉桂醯磷脂醯乙醇胺、二肉桂醯磷脂醯絲氨酸、二肉桂醯磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯磷脂醯絲氨酸、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇、二芥醯磷脂醯膽鹼、二芥醯磷脂醯乙醇胺、二芥醯磷脂醯絲氨酸、二芥醯磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇、鞘磷脂、卵磷脂醯膽鹼、卵磷脂醯乙醇胺和卵磷脂醯甘油。
根據本發明第一方面的脂質體奈米載體遞送系統，其中，所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質和所述脂質體載體的質量比為1:0.1~50，優選為1：0.2~30，更優選為1：0.5 ~20。 可選擇的是，所述脂質體奈米載體遞送系統的製備進一步包括使用鹽溶液水化後的所述脂質體載體主動包封所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質的步驟。
根據本發明第一方面的脂質體奈米載體遞送系統，其中，所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質為弱酸性物質； 優選地，所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質選自以下一種或多種：他汀類藥物、貝特類藥物、抗血小板藥物、PCSK9抑制劑、抗凝藥物、血管緊張素轉換酶抑制劑、鈣離子拮抗劑、MMPs抑制劑、β受體阻滯劑和糖皮質激素，及其藥學上可接受的鹽，以及所述藥物或物質的活性製劑； 更優選地，所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質選自以下一種或多種：洛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、苯紮貝特、環丙貝特、吉非貝琪、阿司匹林、阿西美辛、奧紮格雷鈉、替羅非班以及它們的藥效片段或藥學上可接受的鹽。
根據本發明第一方面的脂質體奈米載體遞送系統，其中，所述脂質體奈米載體遞送系統可以通過靶向配體修飾，如GAG、膠原、層黏連蛋白、纖黏連蛋白、選擇蛋白、骨橋蛋白(OPN)以及單克隆抗體HI44a、HI313、A3D8、H90、IM7和透明質酸或透明質酸的衍生物； 優選地，所述靶向配體選自透明質酸、絲甘蛋白聚糖(serglycin)、膠原、纖黏連蛋白、選擇蛋白、骨橋蛋白(OPN)、單克隆抗體HI44a和IM7。
根據本發明第一方面的脂質體奈米載體遞送系統，其中，所述脂質體載體選自小單室脂質體、大單室脂質體和多室脂質體。
本發明的第二方面提供了第一方面所述的脂質體奈米載體遞送系統的製備方法，包括通過加入鹽溶液水化所述脂質體載體並分離造成脂質體內外溶液酸度梯度的步驟。
根據本發明第二方面的脂質體奈米載體遞送系統，其中，所述鹽為弱酸強鹼鹽； 優選地，所述鹽的陰離子部分選自以下一種或多種：醋酸根、依地酸根、碳酸氫根、檸檬酸根、苯甲酸根和葡萄糖酸根；和/或 所述鹽的陽離子部分選自以下一種或多種：鈣離子、銅離子、鎳離子、鋇離子、鎂離子和鋅離子； 更優選地，所述鹽選自以下一種或多種：醋酸鈣、碳酸氫鈣、檸檬酸鎂和葡萄糖酸銅。
根據本發明第二方面的製備方法，其中該製備方法可以包括以下步驟： （1）將脂質體載體材料溶於良溶劑； （2）向步驟（1）所得產物中加入造成脂質體內外溶液酸度梯度的鹽溶液對其進行水化，分散成粗脂液； （3）降低步驟（2）所得粗脂液的粒徑，得到精製脂質體溶液； （4）對步驟（3）所得到的精製脂質體溶液通過純化去除外部離子，脂質體內外形成酸度梯度； （5）在步驟（4）所得到純化後的精製脂質體溶液加入一待包被物質溶液，孵育使所述待包被物質溶液中的藥物進入脂質體內部，得到所述脂質體奈米載體遞送系統。
根據本發明第二方面的製備方法，其中，所述步驟（1）中還包括蒸發去除所述良溶劑的水分使所述脂質體形成脂膜的步驟； 優選地，所述蒸發的溫度為40~80℃，優選為50~70℃，更優選為50~60℃； 更優選地，所述蒸發的方式為旋轉蒸發； 進一步優選地，所述旋轉蒸發的速度為50~200 r/min，優選為70~120  r/min，更優選為80~100 r/min。
根據本發明第二方面的製備方法，其中，步驟（1）中，所述良溶劑選自以下一種或多種：氯仿、乙醇、甲醇、二氯甲烷、丙酮、甲苯、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈以及二氯乙烷。
根據本發明第二方面的製備方法，其中，步驟（1）中，所述脂質體載體材料包含磷脂和膽固醇； 優選地，所述磷脂的濃度為0.1~500 mg/mL，優選為0.1~200 mg/mL，更優選為0.2-100 mg/mL；和/或 所述膽固醇的濃度為0.05~200 mg/mL，優選為0.1~100 mg/mL，更優選為0.1-50 mg/mL。
根據本發明第二方面的製備方法，其中，步驟（2）中， 所述鹽溶液的濃度為100~500 mM，優選為200~300 mM，更優選為200~250 mM；和/或 所述水化的溫度為30~90℃，優選為40~80℃，更優選為45~65℃。
根據本發明第二方面的製備方法，其中，步驟（3）中，所述降低粒徑的方法為通過將所述粗脂液通過濾膜擠出； 優選地，所述濾膜為聚碳酸酯膜； 更優選地，所述濾膜的孔徑為30~800 nm，例如50~400 nm，例如100 ~200 nm，例如30 nm、50 nm、100 nm、200 nm、400 nm、600nm或800 nm，優選100-150 nm。
根據本發明第二方面的製備方法，其中，步驟（4）中，所述去除外部離子的方法選自以下一種或多種：超濾膜包分離、透析分離和離子交換。
根據本發明第二方面的製備方法，其中，步驟（5）中，所述待包被物質溶液的濃度為0.01~100 mg/mL，優選為0.05~50 mg/mL，更優選為0.1~20 mg/mL，進一步優選為0.1-10 mg/mL。
根據本發明第二方面的製備方法，其中，步驟（5）中，所述孵育的溫度為20~80℃，優選為25~70℃
根據本發明第二方面的製備方法，其中，當所述脂質體奈米載體遞送系統通過靶向配體修飾時，所述方法還包括以下步驟： （6）將所述靶向配體與步驟（5）所得的脂質體奈米載體遞送系統共同孵育，得到一修飾後的脂質體奈米載體遞送系統。
本發明的第三方面提供了一種藥物，所述藥物包含第一方面所述的脂質體奈米載體遞送系統或按照第二方面所述的製備方法而製得的脂質體奈米載體遞送系統，以及至少一種藥學上可接受的載體。
本發明的第四方面提供了第一方面所述的脂質體奈米載體遞送系統、按照第二方面所述的製備方法而製得的脂質體奈米載體遞送系統、第三方面所述的藥物在製備用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的藥物中的應用。
優選地，所述動脈粥樣硬化相關的疾病選自以下一種或多種：動脈粥樣硬化症、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（包括急性冠脈綜合症、無症狀心肌缺血-隱匿性冠心病、心絞痛、心肌梗死、缺血性心臟病、猝死、支架內再狹窄）、腦動脈粥樣硬化症（包括缺血性腦中風、出血性腦中風）、外周血管動脈粥樣硬化症（包括頸動脈粥樣硬化症、椎動脈粥樣硬化症、鎖骨下動脈粥樣硬化症、閉塞性周圍動脈粥樣硬化、視網膜動脈粥樣硬化症、腎動脈粥樣硬化症、下肢動脈粥樣硬化症、上肢動脈粥樣硬化症、腸系膜動脈粥樣硬化症、動脈粥樣硬化性陽痿）、主動脈夾層、血管瘤、血栓栓塞、心力衰竭和心源性休克。
本發明的第五方面提供了第一方面所述的脂質體奈米載體遞送系統、按照第二方面所述的製備方法而製得的脂質體奈米載體遞送系統、第三方面所述的藥物在製備用於治療血管斑塊的藥物中的應用； 優選地，所述血管斑塊為動脈斑塊； 更優選地，所述藥物用於遏制動脈斑塊進展、逆轉動脈斑塊和/或減小動脈斑塊體積。
本發明屬於靶向製劑領域，涉及一種主動靶向脂質體奈米載體遞送系統及其製備方法和應用，尤其是靶向動脈粥樣硬化的主動包封脂質體奈米藥物的創新性製備方法和用途，例如在動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的診斷、預防和治療中的用途。
為了進一步提升奈米藥物遞送系統的治療效果，提高奈米載體的載藥量和包封率，增強靶向奈米藥物臨床轉化能力，本發明公開了通過主動載藥製備靶向脂質體奈米藥物的工藝路線，而且本案發明人意外地發現適宜尺寸的粒徑和配體濃度對藥效發揮至關重要的作用。本發明公開了載藥工藝、特定載體奈米結構和特定配體密度，以及針對動脈粥樣硬化疾病治療的新方法，實現了多種動脈粥樣硬化、抗炎、抗血小板等藥物在動脈粥樣硬化處的高效富集。
本發明公開了一系列靶向脂質體藥物主動載藥新系統、方法和工藝，使其對藥物包封率可以達到90%以上，體現了其作為藥物載體的明顯優勢，並進一步在模型動物體內驗證了其卓越的治療效果，拓展了靶向動脈粥樣硬化脂質體藥物載體的應用。
優選地，所述脂質體的配方包括：磷脂0.2-100 mg/mL、膽固醇0.1-50 mg/mL、藥物0.1-10 mg/mL，其中藥物與脂質材料的質量比在1：0.5到1：20之間。
根據本發明的一種實施方式，本發明提供了一種通過主動包封裝載藥物用於動脈粥樣硬化治療的脂質體製劑，粒徑為50~300 nm，磷脂0.2-100 mg/mL、膽固醇0.1-50 mg/mL、藥物0.1-10 mg/mL，其中藥物與脂質材料的質量比在1：0.5到1：20之間。優選地，所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質選自他汀類藥物、貝特類藥物、抗血小板藥物、PCSK9抑制劑、抗凝藥物、血管緊張素轉換酶抑制劑、鈣離子拮抗劑、MMPs抑制劑、β受體阻滯劑和糖皮質激素，以及它們的藥學上可接受的鹽中的一種或多種，包括這些種類藥物或物質的活性製劑。
更優選地，所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質選自洛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、苯紮貝特、環丙貝特、吉非貝琪、阿司匹林、阿西美辛、奧紮格雷鈉和替羅非班以及它們的藥效片段或藥學上可接受的鹽中的一種或多種，以及它們的藥學上可接受的鹽中的一種或多種。
本發明的一種實施方式提供了脂質體奈米載體遞送系統的製備方法，所述方法包括以下步驟： （1）將磷脂類膜材溶於一良溶劑，可以蒸發除去溶劑或不除去； （2）向步驟（1）所得溶液或蒸乾物中加入造成脂質體內外溶液酸度梯度的鹽溶液水化，初步分散成粗脂液； （3）通過對粗脂液降低粒徑，得到一精製脂質體溶液； （4）對步驟（3）所得到的該精製脂質體溶液通過純化去除外部離子，脂質體內外形成酸度梯度； （5）在步驟（4）所得到純化後的該精製脂質體溶液加入一待包被物質溶液，使該物質進入脂質體內部； （6）基於插入法將靶向配體組裝在脂質體表面。
本發明提供了一種主動包封的脂質體在製備用於動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的診斷、預防和治療的產品中的應用。
本發明的脂質體奈米載體遞送系統可以具有但不限於以下有益效果： 本發明提供了一種製備主動包封脂質體奈米載體遞送系統的工藝路線及其優化過程，同時驗證了所得靶向遞送系統的逆轉斑塊能力。該系統具有高包封率和載藥量，對包封藥物保護性強，長期放置藥物不會釋放，藥物在體內的緩慢釋放，能夠提高藥物在病灶局部的富集濃度，具有低毒高效的優勢。本發明方法簡便，綠色、可控，載藥量高，對各種藥物的相容性好，生物相容性好、安全性高，易於進行靶向配體修飾，所得靶向藥物對動脈粥樣硬化的治療具有很好的效果。
下面通過具體的實施例進一步說明本發明，但是，應當理解為，這些實施例僅僅是用於更詳細具體地說明之用，而不應理解為用於以任何形式限制本發明。
本部分對本發明試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行描述。本領域技術人員清楚，在上下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和操作方法是本領域公知的。
以下實施例中使用的試劑和儀器如下： 試劑： DSPC，DSPE，膽固醇，DSPE-PEG，購自AVT公司； 氯仿，無水乙醇，碳酸氫鈉，EDC，NHS，醋酸鈣，瑞舒伐他汀鈣，購自百靈威科技； HA，購自華熙生物； DSPE-PEG-NH 2，購自Sigma； 超濾膜包，購自Merck；聚碳酸酯膜，購自Whatman； 阿托伐他汀，購自萊瑞森； 阿司匹林，匹伐他汀，洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、苯紮貝特，環丙貝特，阿西美辛，奧紮格雷，替羅非班購於百靈威。2-羥基丙基-β-環糊精購於Sigma-Aldrich。 儀器： 擠出儀，ATS、AE001； 鐳射細微性儀，購自瑪律文公司，型號Nano-ZS。 HPLC，購自Waters公司，型號e2695。
實施例 1 構建靶向斑塊透明質酸靶材（ HPD ）合成
在本實施例中，以平均分子量為1.2-1.6萬的透明質酸鈉（HA）和DSPE-PEG2000-NH 2（DPN）為原料，在EDC和 NHSS作用下，兩者通過醯胺鍵縮合，經析晶、乙醇洗滌得到靶向CD44的HPD靶向材料成品。
具體方法為稱取HA 75 g用純化水或注射用水攪拌溶解。加入DPN或DPN的DMF溶液，控制DPN和HA的投料質量比在1:1或大於1:1，加入EDC或EDC和NHSS，混合均勻，25-40℃攪拌反應≥10小時。反應結束後向反應液中加入等體積或大於一倍體積的無水乙醇攪拌均勻後靜置20分鐘以上。靜置後的溶液離心收集沉澱或經膜包濃縮後離心收集沉澱，用乙醇重懸洗滌沉澱並離心，重複洗滌2次以上，洗滌後得到的離心沉澱採用真空乾燥或凍乾，控制終產品中含水量小於10%。
從圖1中，可以看到HA和HPD的紅外光譜。
實施例 2 乙醇注入法主動包封瑞舒伐他汀 的奈米脂質體製備
在本實施例中，採用乙醇注入&主動包封法製備載瑞舒伐他汀的奈米脂質體。
稱取DSPC、膽固醇、DSPE-PEG2000 (質量比為3：1：1或3：1：0.5)，上述脂材用乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（大於等於150 mM）在 40-60℃的保溫攪拌條件下將乙醇相注入水相醋酸鈣溶液中使脂材溶液充分水化，形成粗脂質體懸浮液（醋酸鈣水相和乙醇相溶液的體積比大於2）。使用擠出儀分別經600 nm、400 nm、200 nm和100 nm的聚碳酸酯膜或其多層組合膜擠出3次以上。擠出後的奈米脂質體溶液採用純化水稀釋20倍及以上，通過控制膜孔徑獲得粒徑約為90 nm、120 nm和150 nm的三種不同大小的奈米粒（LP/R A90, LP/R A120, LP/R A150），PDI均小於0.2。使用透析袋或超濾膜包透析分離未包封的醋酸鈣，收集內液，與瑞舒伐他汀鈣溶液或瑞舒伐他汀鈣和蔗糖的混合溶液混勻後（瑞舒伐他汀鈣和總脂材的質量比小於0.25），於4-66℃條件下孵育15分鐘或以上，得到主動包封瑞舒伐他汀鈣的奈米脂質體。所製備的奈米脂質體對API的包封率大於80%，最終製劑中API的濃度小於等於20 mg/mL。
從圖2中，可以看到本實施例中乙醇注入法主動包封瑞舒伐他汀的奈米脂質體LP/R A90、 LP/R A120和LP/R A150的冷凍電子顯微鏡（A，B，C）和水合粒徑結果（D，E，F）。
實施例 3 混合水化主動包封瑞舒伐他汀的 奈米脂質體製備
在本實施例中，採用混合水化&主動包封法製備瑞舒伐他汀的奈米脂質體。稱取DSPC、膽固醇、DSPE-PEG2000 (質量比為3：1：1- 0.5)，上述脂材用乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（150 mM或大於150 mM）在 40-60℃保溫條件下採用三通管、微流控等其他混合器按恒比例混合乙醇相和水相，使脂材充分水化，形成粗脂質體懸浮液（醋酸鈣水相和乙醇相溶液的體積比大於2）。採用擠出儀分別經600 nm、400 nm、200 nm和100 nm的聚碳酸酯膜或其多層組合膜擠出3次以上。擠出後的脂質體溶液採用純化水稀釋20倍及以上，通過控制膜孔徑和擠出次數，最終獲得粒徑約為90 nm、120 nm和150 nm的三種不同大小的奈米粒（LP/R B90, LP/R B120, LP/R B150），PDI均小於0.2。使用透析袋或超濾膜包透析分離未包封的醋酸鈣，收集內液，與瑞舒伐他汀鈣溶液或瑞舒伐他汀鈣和蔗糖的混合溶液混勻後（瑞舒伐他汀鈣和總脂材的質量比小於0.25），於4-66℃條件下孵育15分鐘或以上，得到主動包封瑞舒伐他汀鈣的奈米脂質體。所製備的奈米脂質體對API的包封率大於80%，最終製劑中API的濃度小於等於20 mg/mL。
從圖3中可以看出，本實施例中混合水化主動包封瑞舒伐他汀的奈米脂質體LP/R B90、LP/R B120和LP/R B150的冷凍電子顯微鏡（A，B，C）和水合粒徑結果（D，E，F）。
實施例 4 主動包封瑞舒伐他汀 奈米脂質體靶向製劑的製備
如上述實施例1所製備的靶向材料HPD插入實施例2所製備的130 nm載藥奈米脂質體LP/R A150中得到靶向載藥奈米脂質體。具體插入方式為：由實施例3所製備的載瑞舒伐他汀鈣的奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為200±31 μg/mL的高濃度靶向配體脂質體（HA H-LP/R A150）、中濃度靶向配體脂質體100±24 μg/mL（HA M-LP/R A150）、10±5 μg/mL低濃度靶向載藥脂質體（HA L-LP/R A150）。
從圖4中，可以看到本實施例中主動包封瑞舒伐他汀奈米脂質體HA H-LP/R A150、HA M-LP/R A150和HA L-LP/R A150的冷凍電子顯微鏡（A，B，C）和水合粒徑結果（D，E，F）。
試劑盒採用競爭法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被透明質酸衍生物（HA）的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HA結合蛋白（HABP）和抗HABP抗體，經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，再加入HRP標記的抗小鼠免疫球蛋白G（酶標二抗），經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗原-HA結合蛋白-HABP抗體-酶標抗體的免疫複合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產生藍色產物，在終止液（2 M硫酸）作用下，最終轉化為黃色，顏色的深淺和樣品中的透明質酸（HA）呈負相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），擬合標準品曲線，可以計算出樣本中透明質酸（HA）的濃度。
實施例 5 靶向的瑞舒伐他汀主動包封脂質體奈米載體遞送系統（ HA@LP/R C ）的製備
在本實施例中，採用薄膜分散法、主動載藥、化學偶聯工藝製備負載治療劑的脂質體HA@LP/R C。
稱取二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、DPN、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺 (DSPE-PEG) (質量比為3：0.5：1：1)，上述脂材用氯仿溶解。通過緩慢旋轉蒸發(55℃水浴，90 r/min，30 min) 除去有機溶劑，從而在容器壁上形成脂膜。加醋酸鈣水溶液（200 mM）在 45℃的恒溫水浴鍋中使脂膜充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，隨後與25 mL瑞舒伐他汀鈣（133 mg）混勻後，於65℃條件下孵育半小時，得到粒徑為160 nm的主動包封藥物脂質體LP/R C。圖5示出了本發明實施例1中LP/R C的細微性分佈圖。
製備的瑞舒伐他汀鈣奈米脂質體溶液和預先溶解好的HA水溶液混合加入偶聯劑EDC和NHSS，在25℃或大於25℃保溫條件下反應2小時以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未偶聯和HA，得到最終產品中HA濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體HA@LP/R C。
實施例 6 靶向的阿托伐他汀主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入-主動包封法、插入法製備負載治療劑的脂質體HA-LP/A C製備。
稱取DSPC、膽固醇、DSPE-PEG (質量比為3：1：1)，乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出控制粒徑最終為130 nm。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取1 mL與2 mL阿托伐他汀鈣（2.5 mg）混勻後，於60℃條件下孵育10 min，得到主動包封藥物脂質體LP/A C。
製備的阿托伐他汀鈣的奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體。
從圖6中，可以看到本實施例中靶向阿托伐他汀主動包封脂質體HA-LP/A C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 7 靶向的阿司匹林主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入-主動包封法、後插入法製備HA-LP/Asp C。阿司匹林水溶液（2 mg/mL）用NaOH調節pH使其溶解。稱取DSPC、膽固醇、DSPE-PEG (質量比為3：1：1)，乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2 mL與1 mL阿司匹林水溶液混勻後，於40℃條件下孵育10 min，得到主動包封藥物脂質體LP/Asp C。
製備的阿司匹林奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體。
圖7顯示了本實施例中靶向阿司匹林主動包封藥物脂質體HA-LP/A C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 8 靶向的匹伐他汀主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入-主動包封法、後插入法製備HA-LP/P C。
匹伐他汀水溶液（1 mg/mL）。稱取DSPC、膽固醇、DSPE-PEG(質量比為3：1：1)，乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2 mL與1 mL匹伐他汀水溶液混勻後，於室溫條件下孵育10min，得到主動包封藥物脂質體LP/P C。
製備的匹伐他汀奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體（HA-LP/P C）。
圖8顯示了本實施例中靶向匹伐他汀主動包封脂質體HA-LP/P C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 9 靶向的洛伐他汀主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入-主動包封、後插入法製備HA-LP/L C。洛伐他汀水溶液（Lova，1 mg/mL）用NaOH調節pH使其溶解。稱取DSPC、膽固醇、DSPE-PEG (質量比為3：1：1)，乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出10次。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2 mL與1 mL洛伐他汀水溶液混勻後，於65℃條件下孵育10 min，得到主動包封藥物脂質體LP/L C。
製備的洛伐他汀奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體（HA-LP/L C）。
圖9顯示了本實施例中靶向洛伐他汀主動包封脂質體HA-LP/L C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 10 靶向的辛伐他汀主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入、主動包封法、後插入法製備HA-LP/S C。辛伐他汀水溶液（Simv, 1 mg/mL）用NaOH調節pH並加入10%的2-羥基丙基-β-環糊精使其溶解稱取DSPC、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG)(質量比為3：1：1)，乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出10次。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2 mL與1 mL辛伐他汀水溶液混勻後，於室溫條件下孵育30 min，得到主動包封藥物脂質體LP/S C。
製備的辛伐他汀奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體（HA-LP/S C）。
圖10顯示了本實施例中靶向辛伐他汀主動包封脂質體HA-LP/S C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 11 靶向的普伐他汀主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入-主動包封法製備HA-LP/P C。普伐他汀水溶液（Pravas, 1 mg/mL）。稱取DSPC、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺 (DSPE-PEG) (質量比為3：1：1)，乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出10次。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2 mL與1 mL普伐他汀水溶液混勻後，於40℃條件下孵育30 min，得到主動包封藥物脂質體LP/P C。
製備的普伐他汀奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體（HA-LP/P C）。
圖11顯示了本實施例中靶向普伐他汀主動包封脂質體HA-LP/P C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 12 靶向的苯紮貝特主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入-主動包封、後插入法製備HA-LP/B C。苯紮貝特水溶液（Beza, 1 mg/mL）用NaOH調節pH並加入10%的2-羥基丙基-β-環糊精使其溶解。稱取DSPC、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺 (DSPE-PEG) (質量比為3：1：1)，脂材用乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出10次。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2 mL與1 mL苯紮貝特水溶液混勻後，於40℃條件下孵育30 min，得到主動包封藥物脂質體LP/B C130。
製備的苯紮貝特奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體（HA-LP/B C）。
圖12顯示了本實施例中靶向苯紮貝特主動包封脂質體HA-LP/B C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 13 靶向的環丙貝特主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入、主動包封、後插入法製備HA-LP/C C。環丙貝特水溶液（Cipro, 1.5 mg/mL）用NaOH調節pH為6.0使其溶解。稱取二硬脂醯磷脂醯膽鹼 (DSPC)、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺 (DSPE-PEG) (質量比為3：1：1)脂材用乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出10次。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2 mL與1 mL環丙貝特水溶液混勻後，於室溫條件下孵育30 min，得到主動包封藥物脂質體LP/C C。
製備的環丙貝特奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體（HA-LP/C C）。
圖13顯示了本實施例中靶向環丙貝特主動包封脂質體HA-LP/C C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 14 靶向的阿西美辛主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入、主動包封、後插入法製備HA-LP/Am C。阿西美辛水溶液（Acemet, 1 mg/mL）加入10%的2-羥基丙基-β-環糊精使其溶解。稱取二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG)(質量比為3：1：1)，脂材用乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出10次。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2 mL與1 mL阿西美辛水溶液混勻後，於室溫條件下孵育30 min，得到主動包封藥物脂質體LP/Am C。
製備的阿西美辛奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體（HA-LP/Am C）。
圖14顯示了本實施例中靶向阿西美辛主動包封脂質體HA-LP/Am C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 15 靶向的奧紮格雷主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入、主動包封、後插入法製備LP/O C。奧紮格雷水溶液（Ozagrel, 2 mg/mL）加入10%的2-羥基丙基-β-環糊精使其溶解。稱取二硬脂醯磷脂醯膽鹼 (DSPC)、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺 (DSPE-PEG) (質量比為3：1：1)，脂材用乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出10次。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2與1 mL Ozagrel水溶液混勻後，於室溫條件下孵育30 min，得到主動包封藥物脂質體LP/O C。
製備的奧紮格雷奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL 的靶向載藥脂質體（HA-LP/O C）。
圖15顯示了本實施例中靶向奧紮格雷主動包封脂質體HA-LP/O C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 16 靶向的替羅非班主動包封脂質體奈米載體的製備
在本實施例中，採用乙醇注入、主動包封、後插入法制LP/T C。替羅非班水溶液（Tirofiban, 2 mg/mL）加入10%的2-羥基丙基-β-環糊精使其溶解。稱取二硬脂醯磷脂醯膽鹼 (DSPC)、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺 (DSPE-PEG) (質量比為3：1：1)，脂材用乙醇溶解。加醋酸鈣水溶液（250 mM）在 65℃的恒溫水浴鍋中使脂材溶液充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出10次。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，取2 mL與1 mL Tirofiban水溶液混勻後，於65℃條件下孵育30 min，得到主動包封藥物脂質體LP/T C130。
製備的替羅非班奈米脂質體溶液和預先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體（HA-LP/T C）。
圖16顯示了本實施例中靶向替羅非班主動包封脂質體HA-LP/T C冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 17 靶向的瑞舒伐他汀主動包封脂質體奈米載體遞送系統（ HA@LP/R d ）的製備
稱取氫化大豆磷脂醯膽鹼、DPN、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺 (DSPE-PEG) (質量比為3：0.5：1：1)，上述脂材用氯仿溶解。通過緩慢旋轉蒸發 (55℃水浴，90 r/min，30 min) 除去有機溶劑，從而在容器壁上形成脂膜。加葡萄糖酸銅水溶液（200 mM）在45℃的恒溫水浴鍋中使脂膜充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，隨後與25 mL瑞舒伐他汀鈣（133 mg）混勻後，於65℃條件下孵育半小時，得到主動包封藥物脂質體LP/R d。
HA水溶液混合加入偶聯劑EDC和NHSS，將其和LP/R d脂液混合實現偶聯，在25℃或大於25℃保溫條件下反應2小時以上，結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未偶聯的HA，得到最終產品中HA濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體HA@LP/R d。
圖17顯示了本實施例中靶向瑞舒伐他汀主動包封脂質體HA@LP/R d冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 18 靶向的阿托伐他汀主動包封脂質體奈米載體遞送系統（ HA@LP/A d ）的製備
稱取二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、DPN、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺 (DSPE-PEG) (質量比為3：0.5：1：1)，上述脂材用氯仿溶解。通過緩慢旋轉蒸發 (55℃水浴，90 r/min，30 min) 除去有機溶劑，從而在容器壁上形成脂膜。加醋酸鈣水溶液（300 mM）在45℃的恒溫水浴鍋中使脂膜充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出。使用超濾膜包分離未包封的醋酸鈣，收集內液，隨後與25 mL阿托伐他汀鈣混勻後，於65℃條件下孵育半小時，得到粒徑為130 nm的主動包封藥物脂質體LP/A d。
HA水溶液混合加入偶聯劑EDC和NHSS，將其和LP/A d脂液混合實現偶聯，在25℃或大於25℃保溫條件下反應2小時以上，結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未偶聯的HA，得到最終產品中HA濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體HA@LP/A d。
圖18顯示了本實施例中靶向阿托伐他汀主動包封脂質體HA@LP/A d冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 19 靶向環丙貝特主動包封脂質體奈米載體遞送系統（ HA@LP/C d ）的製備
稱取鞘磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺 (DSPE-PEG) (質量比為3：1：1)，上述脂材用氯仿溶解。通過緩慢旋轉蒸發 (55℃水浴，90 r/min，30 min) 除去有機溶劑，從而在容器壁上形成脂膜。加碳酸氫鈣水溶液（250 mM）在 45℃的恒溫水浴鍋中使脂膜充分水化，形成粗製脂質體懸浮液。使用擠出儀分別經過200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜擠出。使用超濾膜包分離未包封的碳酸氫鈣，收集內液，隨後與25 mL環丙貝特混勻後，於65℃條件下孵育半小時，得到粒徑為130 nm的主動包封藥物脂質體LP/C d。
由實施例1所製備HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育30分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為200 μg/mL的高濃度靶向配體脂質體得到最終產品中HA濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體HA@LP/C d。
圖19顯示了本實施例中靶向環丙貝特主動包封脂質體HA@LP/C d冷凍電子顯微鏡和DLS。
實施例 20 靶向苯紮貝特主動包封脂質體奈米載體遞送系統（ HA-LP/B d ）的製備
在本實施例中，採用乙醇注入&主動包封法製備載苯紮貝特的奈米脂質體。
稱取二硬脂醯磷脂醯絲氨酸（DOPS）、膽固醇、DSPE-PEG2000 (質量比為3：1：1)，上述脂材用乙醇溶解。加檸檬酸鎂水溶液（200 mM）在 40-60℃的保溫攪拌條件下將乙醇相注入檸檬酸鎂水溶液中使脂材溶液充分水化，形成粗脂質體懸浮液（醋酸鈣水相和乙醇相溶液的體積比大於2）。使用透析袋或超濾膜包透析分離未包封的醋酸鈣，收集內液，與瑞舒伐他汀鈣溶液或瑞舒伐他汀鈣和蔗糖的混合溶液混勻後（瑞舒伐他汀鈣和總脂材的質量比小於0.25），於4-66℃條件下孵育15分鐘或以上，得到主動包封瑞舒伐他汀鈣的奈米脂質體。所製備的奈米脂質體對API的包封率大於20%，最終製劑中API的濃度小於等於20 mg/mL。
由實施例1所製備HPD水溶液混合，在25℃或大於25℃保溫條件下孵育30分鐘以上，孵育結束後使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的HPD，得到最終產品中HPD濃度為200 μg/mL的高濃度靶向配體脂質體得到最終產品中HA濃度為10-200 μg/mL的靶向載藥脂質體HA-LP/B d。
圖20顯示了本實施例中靶向苯紮貝特主動包封脂質體HA-LP/B d冷凍電子顯微鏡和DLS。
試驗例 1 本發明奈米載體遞送系統載體的穩定可控性
以本發明公開的製備的負載治療劑的奈米遞送系統為例，本發明的遞送系統具有穩定可控的性質，從而適合於動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的治療。
1. 藥物濃度測定法：
載體藥物瑞舒伐他汀、替羅非班、奧紮格雷、阿西美辛、環丙貝特、苯紮貝特、普伐他汀、阿司匹林、匹伐他汀鈣、洛伐他汀和辛伐他汀，具有很強的紫外吸收特性，因此可以通過採用HPLC-UV法，藥物溶液的濃度(X)對HPLC色譜峰的峰面積(Y)建立標準定量方程。
HPLC分析方法為：流動相：A：1.0%三氟乙酸：乙腈：水（1:29:70）；B：1.0%三氟乙酸：水：乙腈（1:24:75）。柱溫：40℃，型號：Inertsil ODS-3（150*3.0）mm。平衡系統，等基線穩定後進樣。
2. 水合粒徑的測定：
本發明的遞送系統的細微性測定由瑪律文智慧鐳射細微性儀測定。結果如表2所示。
3. 製劑中 HPD 測定：
試劑盒採用競爭法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被透明質酸衍生物（HA）的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HA結合蛋白（HABP）和抗HABP抗體，經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，再加入HRP標記的抗小鼠免疫球蛋白G（酶標二抗），經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗原-HA結合蛋白-HABP抗體-酶標抗體的免疫複合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產生藍色產物，在終止液（2M硫酸）作用下，最終轉化為黃色，顏色的深淺和樣品中的透明質酸（HA）呈負相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），擬合標準品曲線，可以計算出樣本中透明質酸（HA）的濃度。
採用透明質酸（HA）定量檢測ELISA試劑盒進行檢測，準確稱取HPD適量，加水配製成約2.5 mg/mL的對照儲備液，採用等比例水稀釋的方式，配製線性工作溶液（0~1.25 mg/mL），取無HPD的製劑溶液適量，分別與各線性工作溶液混合作為標準線性溶液；取製劑溶液適量，根據需要加無HPD的製劑溶液進行稀釋，並加入適量水使製劑測定溶液與標準線性溶液中的脂質體比例相同，作為供試品溶液；在ELISA試劑盒測定前，標準線性溶液和供試品溶液分別加入10%Triton溶液進行溶解，混合均勻，依照ELISA試劑盒操作程式進行，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），四參數擬合標準曲線，計算出供試品中HPD的濃度。
參考標準曲線圖如圖29所示， 擬合方程: y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D 其中：A= 2.763；B= 1.777；C= 3.681；D=0.146；r2 =0.999。
4. 包封率的測定：
取一定量奈米載體，HPLC法測游離藥物和總藥物量，並通過以下公式1計算包封率。結果如表2所示。 包封率（%）=（1-M 游離藥物量/ M 總藥物量）*100%…    …………公式1 表 1本發明的奈米載體遞送系統工藝簡述、平均粒徑和包封率結果
名稱 工藝描述 水合粒徑 (Z-average) 藥物包封率 (%)
LP/R A90 乙醇注入法 主動包封 88 91.7±1.8
LP/R A120 120 93.2±1.7
LP/R A150 152 95.6±1.7
LP/R B90 混合水化 主動包封法 89 93.5±1.2
LP/R B120 128 94.4±1.4
LP/R B150 142 95.4±0.85
HA H-LP/R A150 乙醇注入法 主動包封、HPD 後插入 165 95.5±1.24
HA M-LP/R A150 142
HA L-LP/R A150 141
HA@LP/R C 薄膜分散法、主動載藥、化學偶聯 164 93.5±1.5
HA-LP/A C 乙醇注入-主動包封法、插入法 170 91.5±1.9
HA-LP/Asp C 乙醇注入-主動包封法、後插入法 145 92.5±1.7
HA-LP/P C 乙醇注入-主動包封法、後插入法 126 90.5±1.6
HA-LP/L C 乙醇注入-主動包封法、後插入法 155 91.5±2.2
HA-LP/S C 乙醇注入-主動包封法、後插入法 144 94.4±1.5
HA-LP/P C 乙醇注入-主動包封法、後插入法 150 95.1±0.9
HA-LP/B C 乙醇注入-主動包封法、後插入法 155 95.7±0.8
HA-LP/C C 乙醇注入-主動包封法、後插入法 148 93.4±1.4
HA-LP/Am C 乙醇注入-主動包封法、後插入法 146 94.7±1.1
HA-LP/O C 乙醇注入-主動包封法、後插入法 147 91.9±1.5
HA-LP/T C 採用乙醇注入、主動包封、後插入法 132 92.7±1.3
HA@LP/R d 薄膜水化、主動包封、化學偶聯 葡萄糖酸銅 169 91.3±0.9
HA@LP/A d 薄膜水化、主動包封、化學偶聯 醋酸鈣 165 94.3±1.6
HA-LP/C d 薄膜水化、主動包封、後插入法 碳酸氫鈣 139 91.3±2.2
HA-LP/B d 乙醇注入、主動包封法、後插入法 檸檬酸鎂 142 91.7±1.7
注：以上資料均以平行測定3次的結果的“平均值+標準差”的形式表示。
5. 長期穩定性考察
將本發明的奈米遞送系統在4℃儲存，於不同的時間點取樣，並通過鐳射細微性儀檢測其水合粒徑的變化。HPLC方法考察其含量和包封率的變化。結果如圖21所示。
試驗例 2 本發明的靶向脂質體奈米載體遞送系統靶向能力驗證
本試驗例的目的是驗證本發明所述的靶向脂質體奈米藥物載體遞送系統，例如HA@LP/R C載體遞送系統，對於動脈粥樣硬化斑塊的靶向能力。具體的，由於動脈粥樣硬化斑塊富含巨噬細胞，高表達CD44受體，因此研究選用了THP1巨噬細胞，並使用脂多糖對其進行活化，通過與經螢光標記的靶向HA@LP/R C或非靶向LP/R C一起孵育，然後進行活細胞顯微觀察和螢光值檢測。通過對比具有HA靶頭和非靶向脂質體組結果，評估對HA靶向脂質體對於高表達CD44受體的啟動的巨噬細胞的靶向性。
1. 實驗試劑和儀器： 表 2實驗使用試劑列表
名稱 廠家 型號
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585
THP1人巨噬細胞 武漢普諾賽生命科技有限公司 CL-0233
Lipopolysaccharide (LPS) Fisher Scientific 00-4976-93
Hoechst33342 BD Biosciences 561908
RPMI1640 Fisher Scientific 11998075
Gibco Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 11573397
RIPA細胞裂解液 Solarbio Life Sciences R0010-20ml
Cy5.5 螢光染料 西安瑞禧 210892-23-2
超濾管 (MWCD 50KD) Merck millipore UFC910096
表 3實驗使用儀器清單
名稱 廠家 型號
螢光讀板儀 Perkin Elmer EnVision2105
智慧活細胞檢測系統 BioTek Lionheart FX
醫藥低速水平轉子離心機 北京白洋 52A
2. 實驗步驟
2.1 供試品的螢光標記
精確稱量1.0 mg Cy5.5 染料溶解於1ml無水乙醇，配製成1 mg/ml Cy5.5溶液。分別取5 ml 靶向HA@LP/R C或者非靶向LP/R C脂質體，加入0.1 mL 1mg/ml的Cy5.5溶液，150 rpm攪拌12h，進行螢光標記。然後用超濾管過濾，去除未反應的螢光分子。使用螢光酶標儀對於過濾後得到的螢光標記的脂質體進行螢光檢測。檢測後的螢光標記的脂質體用於後續的細胞內吞實驗。
2.2 細胞內吞實驗
操作步驟參照本平臺細胞復蘇操作流程，培養基用本平台常規THP1細胞培養基（RPMI1640+10% FBS）。細胞復甦後重懸密度為5×105/ml，接種於T75培養瓶。將懸浮生長的10 ml THP1細胞移至15ml離心管中，1000 rpm離心 5 分鐘，並重懸於1 ml培養基中並細胞計數，配製成1×105/200 μl的濃度的細胞懸液。往1×105/200 μl的細胞懸液中加入PMA至終濃度為100 ng/ml。混合均勻後，把細胞懸液接種於96孔板中，200 μl/孔，持續刺激72 h。刺激72小時後，棄去原先的培養基，加入含有脂多糖（LPS）的新鮮培養基（LPS溶液1000倍稀釋於新鮮培養基中，配製的終濃度為2.5 μg/mL）。LPS處理2小時。
實驗設兩組，分別加入。取1 ml螢光標記的脂質體，按體積10倍稀釋於新鮮的培養基中，此時瑞舒伐他汀濃度為0.2 mg/ml。96孔板棄去含有LPS的培養液，加入稀釋好的螢光標記的供試品，每組三個重複，於37°C繼續孵育30 min。
PBS洗板1次，把2 μl Hoechst33342母液稀釋於10 ml新鮮的培養基中配製成稀釋好的Hoechst33342溶液，並把稀釋好的Hoechst33342溶液和細胞孵育10 min進行細胞核的染色。於Lionheart FX智慧活細胞成像分析系統進行拍照。將拍照後的孔板，棄去染色液，加入100 μl RIPA細胞裂解液，採用螢光讀板儀檢測孔板中螢光強度。獲得的試驗資料使用Graph Pad Prism 8軟體計算均值和標準差並進行t檢驗的統計學分析，p＜0.05 為統計學上顯著。
3. 試驗結果
細胞內吞實驗比較了LPS刺激後的THP1細胞對於HA@LP/R C和LP/R C內吞效率。實驗結果見圖25，和非靶向LP/R C脂質體組比較，HA@LP/R C組的螢光值顯著增加，是非靶向脂質體組的3倍。螢光顯微鏡觀察也顯示（見圖26），HA@LP/R C組的細胞內紅色螢光比非靶向LP/R C組的細胞內紅色螢光顯著增加。表明，LPS刺激後的THP1細胞對HA@LP/R C內吞效率要顯著高於其對非靶向脂質體的內吞效率。
結果顯示，靶向組中顯紅色螢光的細胞顯著多於非靶向脂質體組。且與非靶向脂質體組相比，靶向組螢光值也顯著增加。可得出結論，含有HA靶頭的脂質體可以被高表達CD44受體的啟動的巨噬細胞特異性攝取。
試驗例 3 本發明的靶向脂質體奈米載體遞送系統在體內的分佈和代謝研究
本試驗例的目的是初步揭示本發明所述的靶向脂質體奈米藥物載體遞送系統在動物體內的分佈和代謝情況。本試驗將試驗例2中細胞內吞實驗的HA@LP/R C和LP/R C脂質體繼續用於動物體內分佈和代謝初步研究。
具體地，將6周齡ApoE-/-小鼠高脂飲食飼養28周，主動脈斑塊生成造成AS動物模型。靶向奈米他汀製劑（HA@LP/R C，劑量5 mg/kg）和非靶向奈米製劑對模型動物靜脈給藥後組織分佈和代謝情況。如圖27所示，可見奈米製劑在體內主要富集在肝部，不可跨越血腦屏障，靶向和非靶體藥物在體內分佈代謝未見明顯區別。
更進一步地，將實驗動物隨機分為以下各組，每組6只： 瑞舒伐他汀口服組：以0.5mg 瑞舒伐他汀/kg體重的劑量進行口服給藥處理； 瑞舒伐他汀靜脈注射組：以0.5 mg 瑞舒伐他汀/kg體重的劑量進行靜脈注射給藥處理； 治療組的治療每隔一天進行1次，共計給藥11次。
動物體重隨著治療時間變化的曲線如圖28所示。由圖28可見治療期間動物體重增加，且未見死亡，說明藥物安全性良好。
試驗例 4 本發明的靶向脂質體奈米載體遞送系統對動脈粥樣硬化的影響的體內實驗
本試驗例的目的是驗證本發明所述的靶向脂質體奈米藥物載體遞送系統，例如HA M-LP/R A150載體遞送系統，對動脈斑塊的體內治療作用。
1. 動物模型的建立和實驗動物分組
（1）配製游離瑞舒伐他汀的生理鹽水溶液，並採用上述實施例2中所述的方法製備負載治療劑的奈米遞送系統。
（2）ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型的建立：
取SPF級ApoE-/-小鼠(42只，5-6周齡，體重20±1 g)作為實驗動物。給予小鼠適應性高脂飲食(脂肪10% (w/w)，膽固醇2% (w/w)，膽酸鈉0.5% (w/w)，其餘部分為小鼠普通飼料)餵養4周後，用1%的戊巴比妥鈉(配製方法為將1 mg戊巴比妥鈉加入至100 mL的生理鹽水中)以40 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉。然後，將小鼠以仰臥位固定於手術板上，用75 %(v/v)酒精以頸部為中心進行消毒，縱向剪開頸部皮膚，鈍性分離頸前腺體，在氣管的左側可見搏動的左頸總動脈。小心分離頸總動脈至分叉處，將長度為2.5 mm、內徑為0.3 mm的矽膠管套置於左頸總動脈的外周，套管的近心段和遠心段均以細絲線縮窄固定。局部緊縮造成近端血流湍流，剪切力增加，造成的血管內膜損傷。將頸動脈復位，間斷縫合頸前皮膚。所有操作均在10倍體視顯微鏡下進行。術後待小鼠蘇醒後將其放回籠中，維持環境溫度在20～25 ℃，燈光保持開閉各12 h。術後第4周開始腹腔注射脂多糖(LPS)(1 mg/kg，在0.2 mL磷酸鹽緩衝鹽水中，Sigma, USA) ，每週2次，持續10周，誘導慢性炎症。術後8周將小鼠置入50 mL注射器(預留充足通氣孔)內造成限制性精神應激，6小時/天，每週5天，共持續6周。小鼠動脈粥樣硬化模型於術後14周造模完畢。
(3) 實驗動物分組及治療：
將實驗動物隨機分為以下各組，每組6只： 動脈粥樣硬化模型對照組：該組動物不進行任何治療性處理； 瑞舒伐他汀口服組：以0.66 mg 瑞舒伐他汀/kg體重的劑量進行口服給藥處理； 瑞舒伐他汀靜脈注射組：以0.66 mg 瑞舒伐他汀/kg體重的劑量進行靜脈注射給藥處理； 奈米製劑給藥（HA M-LP/R A150）組：以0.66 mg 瑞舒伐他汀/kg體重的劑量進行靜脈注射給藥處理； 除動脈粥樣硬化模型對照組外，治療組的治療每隔一天進行1次，共計給藥4周。對於各組動物，於治療前後每週進行頸動脈MRI掃描以檢測斑塊和管腔面積，並結合掃描厚度計算斑塊體積進展百分比。
斑塊體積進展百分比=(治療後斑塊體積-治療前斑塊體積)/ 治療前的斑塊體積。
圖22和23示出了本發明所述的HA M-LP/R A150載體遞送系統對動脈粥樣硬化的體內治療效果。如圖22所示，口服和靜脈注射游離他汀僅能延緩斑塊進展，而不能使已有斑塊消退，靶向奈米載藥治療則不僅明顯遏制了斑塊的進展，更出現了斑塊體積大幅逆轉和消退達30.3%。如圖23所示，相比較於口服和注射他汀藥物，奈米遞送系統顯示出了其極其顯著的主動脈富集功能，相比較於非靶向遞送系統（LP/R A150），這種富集效應在靶向奈米製劑（HA M-LP/R A150）作用下更為明顯。綜上所述，對於小鼠體內動脈粥樣硬化而言，口服及靜脈給予游離的瑞舒伐他汀都未能呈現出逆轉斑塊的效果。然而，當將他汀負載在本發明所述的奈米遞送系統中時，其對於動脈粥樣硬化的治療效果發生了顯著的提升，並起到了縮小斑塊的治療效果，帶有功能修飾的奈米系統效果更佳。
2. 不同HA/脂質材料質量比藥效對比
6周齡ApoE-/-小鼠高脂飲食飼養28周，主動脈斑塊生成造成AS動物模型。將造模成功的動物按血脂和體重隨機分為斑塊模型對照組，非靶向奈米他汀製劑組（LP/R A150，5 mg/kg），靶向奈米他汀製劑-1（HA L-LP/R A150，劑量5 mg/kg），靶向奈米他汀製劑-2（HA M-LP/R A150，劑量5 mg/kg，iv），靶向奈米他汀製劑-3（HA H-LP/R A150，劑量5mg/kg，iv），每組10只。治療每天一次，共治療28天，療程4周。療程結束後行主動脈斑塊大體病理學（en-face），靶向製劑短時間可實現AS模型小鼠主動脈斑塊逆轉，且在HA M-LP/R A150和HA H-LP/R A150製劑組呈現約顯著的斑塊逆轉。
以上研究表明，開發配體偶聯的主動靶向奈米遞送系統需要關注配體在奈米載體表面的偶聯密度，作為具有特殊生理功能的配體分子，低密度或過量偶聯均不能起到良好的靶向效果，提示我們在開發此類產品是尤其需要實現可控的偶聯工藝。
圖24a和圖24b顯示了不同HA/脂質材料質量比藥效的對比。
無
當與附圖一起閱讀時，將更好地理解前面的發明內容以及下面的發明詳述。為了說明本發明，該附圖說明了一些但不是全部的替代性實施方案。但是，應該理解，本發明不限於所示的精確的設置和手段。這些圖，其已併入本說明書並且是本說明書的構成部分，有助於解釋本發明的原則。
圖1例示透明質酸鈉（HA）和靶向斑塊透明質酸靶材（HPD）的紅外光譜圖。
圖2例示乙醇注入法主動包封瑞舒伐他汀的奈米脂質體LP/R A90、 LP/R A120和LP/R A150的冷凍電子顯微鏡（A，B，C）和水合粒徑結果（D，E，F）。
圖3例示混合水化主動包封瑞舒伐他汀的奈米脂質體LP/R B90、LP/R B120和LP/R B150的冷凍電子顯微鏡（A，B，C）和水合粒徑結果（D，E，F）。
圖4例示主動包封瑞舒伐他汀奈米脂質體HA H-LP/R A150、HA M-LP/R A150和HA L-LP/R A150的冷凍電子顯微鏡（A，B，C）和水合粒徑結果（D，E，F）。
圖5例示靶向瑞舒伐他汀主動包封脂質體奈米載體遞送系統HA-LP/R C的冷凍電子顯微鏡（A）和水合粒徑結果（B）。
圖6例示靶向阿托伐他汀主動包封脂質體HA-LP/A C冷凍電子顯微鏡和水合粒徑(Dynamic Light Scattering, DLS)。
圖7例示靶向阿司匹林主動包封藥物脂質體HA-LP/A C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖8例示靶向匹伐他汀主動包封脂質體HA-LP/P C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖9例示靶向洛伐他汀主動包封脂質體HA-LP/L C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖10例示靶向辛伐他汀主動包封脂質體HA-LP/S C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖11例示靶向普伐他汀主動包封脂質體HA-LP/P C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖12例示靶向苯紮貝特主動包封脂質體HA-LP/B C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖13例示靶向環丙貝特主動包封脂質體HA-LP/C C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖14例示靶向阿西美辛主動包封脂質體HA-LP/Am C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖15例示靶向奧紮格雷主動包封脂質體HA-LP/O C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖16例示靶向替羅非班主動包封脂質體HA-LP/T C冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖17例示靶向瑞舒伐他汀主動包封脂質體HA@LP/R d冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖18例示靶向阿托伐他汀主動包封脂質體HA@LP/A d冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖19例示靶向環丙貝特主動包封脂質體HA@LP/C d冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖20例示靶向苯紮貝特主動包封脂質體HA-LP/B d冷凍電子顯微鏡和DLS。
圖21例示本發明的奈米遞送系統的長期穩定性考察結果。
圖22例示本發明的HA-LP/R奈米藥物遞送系統與各對照組的斑塊體積進展百分比。
圖23例示主動脈對不同治療藥物的富集程度比較
圖24a和圖24b例示不同HA/脂質材料質量比藥效對比。
圖25例示細胞內吞實驗細胞裂解液螢光值對比。
圖26a例示LP/R C脂質體細胞內吞實驗活細胞檢測螢光顯微鏡照片; 圖26b例示HA@LP/R C奈米載體遞送系統細胞內吞實驗活細胞檢測螢光顯微鏡照片；藍色為Hoechst33342染的細胞核，紅色為細胞內的Cy5.5標記的脂質體。
圖27例示不同時間條件下螢光標記的HA@LP/R C和LP/R C體內分佈和代謝結果。
圖28例示給藥HA@LP/R C後動物的體重變化。
圖29例示HPD測定參考標準曲線。

Claims (21)

  1. 一種主動包封脂質體奈米載體遞送系統，其中所述脂質體奈米載體遞送系統包括脂質體載體及其主動包封的用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質。
  2. 如請求項1所述的脂質體奈米載體遞送系統，其中所述脂質體載體的材料包含磷脂和膽固醇； 優選地，所述磷脂選自以下一種或多種：氫化大豆磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯甘油、二硬脂醯磷脂醯絲氨酸、二油醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯乙醇胺、二油醯磷脂醯絲氨酸、二油醯磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇、二肉桂醯磷脂醯膽鹼、二肉桂醯磷脂醯乙醇胺、二肉桂醯磷脂醯絲氨酸、二肉桂醯磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯磷脂醯絲氨酸、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇、二芥醯磷脂醯膽鹼、二芥醯磷脂醯乙醇胺、二芥醯磷脂醯絲氨酸、二芥醯磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇、鞘磷脂、卵磷脂醯膽鹼、卵磷脂醯乙醇胺和卵磷脂醯甘油。
  3. 如請求項1或2所述的脂質體奈米載體遞送系統，其中所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質和所述脂質體載體的質量比為1:0.1~50，優選為1：0.2~30，更優選為1：0.5 ~20。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的脂質體奈米載體遞送系統，其中所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質為弱酸性物質； 更優選地，所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質選自以下一種或多種：他汀類藥物、貝特類藥物、抗血小板藥物、PCSK9抑制劑、抗凝藥物、血管緊張素轉換酶抑制劑、鈣離子拮抗劑、MMPs抑制劑、β受體阻滯劑和糖皮質激素，及其藥學上可接受的鹽，以及所述藥物或物質的活性製劑； 再優選地，所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質選自以下一種或多種：洛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、苯紮貝特、環丙貝特、吉非貝琪、阿司匹林、阿西美辛、奧紮格雷鈉、貝列前素鈉和替羅非班以及它們的藥效片段或藥學上可接受的鹽； 進一步優選地，所述用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的物質為水溶性他汀類藥物；優選為瑞舒伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的脂質體奈米載體遞送系統，其中所述脂質體奈米載體遞送系統可以通過靶向配體修飾； 優選地，所述靶向配體選自以下一種或多種：GAG、膠原、層黏連蛋白、纖黏連蛋白、選擇蛋白、骨橋蛋白(OPN)以及單克隆抗體HI44a、HI313、A3D8、H90、IM7和透明質酸或透明質酸的衍生物。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的脂質體奈米載體遞送系統，其中所述脂質體載體選自小單室脂質體、大單室脂質體及多室脂質體。
  7. 一種製備如請求項1至6中任一項所述的脂質體奈米載體遞送系統的方法，包括通過加入鹽的溶液水化所述脂質體載體並分離造成一脂質體內外溶液酸度梯度的步驟。
  8. 如請求項7所述的製備脂質體奈米載體遞送系統的方法，其中所述鹽為弱酸強鹼鹽； 優選地，所述鹽的陰離子部分選自以下一種或多種： 醋酸根、依地酸根、碳酸氫根、次氯酸根、檸檬酸根、苯甲酸根和葡萄糖酸根；和/或 所述鹽的陽離子部分選自以下一種或多種：鈣離子、銅離子、鎳離子、鋇離子、鎂離子和鋅離子； 更優選地，所述鹽選自以下一種或多種：醋酸鈣、碳酸氫鈣、檸檬酸鎂和葡萄糖酸銅。
  9. 如請求項7或8所述的脂質體奈米載體遞送系統的製備方法，其中所述方法包括以下步驟： （1）將所述脂質體載體的材料溶於一良溶劑； （2）向步驟（1）所得產物中加入造成所述脂質體內外溶液酸度梯度的所述鹽的溶液對其進行水化，分散成一粗脂液； （3）降低步驟（2）所得該粗脂液的粒徑，得到精製脂質體； （4）對步驟（3）所得到的該精製脂質體的溶液通過純化去除所述脂質體的外部離子，使所述脂質體的內外形成酸度梯度； （5）在步驟（4）所得到的該精製脂質體的溶液加入一待包被物質溶液，孵育使所述待包被物質溶液中的藥物進入所述脂質體內部，得到所述脂質體奈米載體遞送系統。
  10. 如請求項9的方法，其中所述步驟（1）中包括蒸發去除所述良溶劑的水分使所述脂質體形成脂膜的步驟； 優選地，所述蒸發的溫度為40~80℃，優選為50~70℃，更優選為50~60℃； 更優選地，所述蒸發的方式為旋轉蒸發； 進一步優選地，所述旋轉蒸發的速度為50~200 r/min，優選為70~120  r/min，更優選為80~100 r/min。
  11. 如請求項9或10所述的方法，其中所述步驟（1）中，所述良溶劑選自以下一種或多種：氯仿、乙醇、甲醇、二氯甲烷、丙酮、甲苯、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈和二氯乙烷。
  12. 如請求項9至11中任一項所述的方法，其中所述步驟（1）中，所述脂質體載體的材料包含磷脂和膽固醇； 優選地，所述磷脂的濃度為0.1~500 mg/mL，優選為0.1~200 mg/mL，更優選為0.2-100 mg/mL；和/或 所述膽固醇的濃度為0.05~200 mg/mL，優選為0.1~100 mg/mL，更優選為0.1-50 mg/mL。
  13. 如請求項9至12中任一項所述的方法，其中所述步驟（2）中， 所述鹽的溶液的濃度為100~500 mM，優選為200~300 mM，更優選為200~250 mM；和/或 所述水化的溫度為30~90℃，優選為40~80℃，更優選為45~65℃。
  14. 如請求項9至13中任一項所述的方法，其中所述步驟（3）中，所述降低粒徑的方法為通過將所述粗脂液通過濾膜擠出； 優選地，所述濾膜為聚碳酸酯膜； 更優選地，所述濾膜的孔徑為30~800 nm，例如50~400 nm，例如100 ~200 nm，例如30 nm、50 nm、100 nm、200 nm、400 nm、600nm或800 nm，優選100-150 nm。
  15. 如請求項9至14中任一項所述的方法，其中所述步驟（4）中，所述去除外部離子的方法選自以下一種或多種：超濾膜包分離、透析分離和離子交換。
  16. 如請求項9至15中任一項所述的方法，其中所述步驟（5）中，所述待包被物質溶液的濃度為0.01~100 mg/mL，優選為0.05~50 mg/mL，更優選為0.1~20 mg/mL，進一步優選為0.1-10 mg/mL。
  17. 如請求項9至16中任一項所述的方法，其中所述步驟（5）中，所述孵育的溫度為20~80℃，優選為40~70℃，更優選為55~65℃。
  18. 如請求項9至17中任一項所述的方法，其中當所述脂質體奈米載體遞送系統通過所述靶向配體修飾時，所述方法更包括以下步驟： （6）將所述靶向配體與所述步驟（5）所得的該脂質體奈米載體遞送系統共同孵育，得到一修飾後的脂質體奈米載體遞送系統。
  19. 一種藥物，其包含請求項1至7中任一項所述的脂質體奈米載體遞送系統或按照請求項8至18中任一項所述的製備方法而製得的脂質體奈米載體遞送系統，以及藥學上可接受的載體。
  20. 請求項1至7中任一項所述的脂質體奈米載體遞送系統、按照請求項8至18中任一項所述的製備方法而製得的脂質體奈米載體遞送系統、請求項19所述的藥物，該三者在製備用於預防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關的疾病的藥物中的應用； 優選地，所述動脈粥樣硬化相關的疾病選自以下一種或多種：動脈粥樣硬化症、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦動脈粥樣硬化症、外周血管動脈粥樣硬化症、主動脈夾層、血管瘤、血栓栓塞、心力衰竭和心源性休克； 其中所述冠狀動脈粥樣硬化性心臟病包括急性冠脈綜合症、無症狀心肌缺血-隱匿性冠心病、心絞痛、心肌梗死、缺血性心臟病、猝死或支架內再狹窄； 所述腦動脈粥樣硬化症包括缺血性腦中風或出血性腦中風； 所述外周血管動脈粥樣硬化症包括頸動脈粥樣硬化症、椎動脈粥樣硬化症、鎖骨下動脈粥樣硬化症、閉塞性周圍動脈粥樣硬化、視網膜動脈粥樣硬化症、腎動脈粥樣硬化症、下肢動脈粥樣硬化症、上肢動脈粥樣硬化症、腸系膜動脈粥樣硬化症或動脈粥樣硬化性陽痿。
  21. 請求項1至7中任一項所述的奈米載體遞送系統、按照請求項8至18中任一項所述的製備方法而製得的奈米載體遞送系統、請求項19所述的藥物，該三者在製備用於治療血管斑塊的藥物中的應用； 優選地，所述血管斑塊為動脈斑塊； 更優選地，所述藥物用於遏制動脈斑塊進展、逆轉動脈斑塊和/或減小動脈斑塊體積。
TW111133607A 2021-09-06 2022-09-05 靶向動脈粥樣硬化脂質體奈米載體遞送系統及其製備方法 TW202312985A (zh)

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