JP2003530362A - 診断剤をターゲッティングするための脂質ベースの系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、脂質ベースの組成物の使用による診断剤のターゲッティングに関する。本発明は、癌などの疾患組織、感染性および炎症性状態における細胞外PLA₂活性の増大されたレベルに関連づけられるかまたはそれが原因で生じる種々の障害の診断に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、脂質ベースの組成物の使用による診断剤(本明細書中では一般的に
「標識」と記す)のターゲッティングに関する。本発明は、癌などの疾患組織、
感染性および炎症性状態における細胞外PLA₂活性の増大されたレベルに関連づけ
られるかまたはそれが原因で生じる種々の障害の診断に有用である。

【０００２】発明の背景 診断イメージングは、現代医学で広く使用されている。それには、使用する方
法に関係なく、特定の構造部分を周辺組織から区別するために、対象の領域から
適切な強度のシグナルを得ることが必要である。Torchilin(1998年)により指摘
されたように、イメージングには、対象の領域の3空間次元と第4次元すなわち時
間との関係が含まれており、これは、薬剤の薬物動態および画像を得るのに必要
な時間の両方に関連している。画像を形成するために使用することのできる物理
的性質としては、放射線の放出または吸収、核磁気モーメントおよび緩和、なら
びに超音波の透過または反射が挙げられる。適用される物理的原理によれば、現
在使用されているイメージング法には、γ-シンチグラフィー(γ線を放出する放
射性物質の適用を含む)；磁気共鳴(MR、高周波シグナルの作用下における原子核
の異なるエネルギー準位間の遷移に基づく現象)；コンピューター断層撮影(CT、
電離放射線を利用する方法であり、身体の横断画像および対象の領域の3次元画
像を得るためにコンピューターを用いる)；ならびに超音波検査(US、超音波照射
を用いる方法であり、超音波が種々の組織を透過する速度の差異に基づく)が包
含される。4種のイメージング法はすべて、それらの物理的原理、感度、分解能(
空間分解能と時間分解能の両方)、コントラスト剤を媒介させた増強を用いない
画像提供能力、およびコストや安全性のようないくつかの他のパラメーターが異
なっている。通常、多数の病状の早期発見および位置特定のためのさまざまな器
官および組織のイメージングは、さまざまなイメージング操作で適切なコントラ
スト剤(以下参照)を用いないかぎりうまく行うことができない。

【０００３】 イメージングを改良するためにコントラスト剤が使用される。これらは、特定
タイプのシグナル(照射)を周辺組織よりもはるかに強力に吸収することのできる
物質である。コントラスト剤は、それぞれのイメージング法(表I参照)に特有な
ものであり、特定の対象部位でのそれらの蓄積の結果として、適切なイメージン
グ法が適用された場合、それらの部位は容易に視覚化されうる。

【０００４】

【表１】

【０００５】 イメージングをうまく行うために達成しなければならない組織中濃度は、方法
や診断用成分によって変化する。表1を参照されたい。多くの場合、コントラス
ト剤を媒介させたイメージングは、いくつかの組織(すなわち、マクロファージ
に富んだ組織)が粒状物質を吸収する能力に基づく。この方法は粒径依存的であ
って、毛細血管または毛細リンパ管に入るのに十分な程度に小さいが組織内に残
留させるのに十分な程度に大きい粒子の微妙なバランスに依存する。イメージン
グ法のいずれにおいても、コントラスト剤の2つの主要な投与経路、すなわち、
体循環と局所循環が使用される。それぞれに特有の利点および欠点がある。コン
トラスト剤またはコントラスト剤担体の物理化学的性質を変化させることにより
、局所投与後における注射部位からのその消失速度を調節することができる。全
身投与の欠点は、潜在的に有毒なコントラスト剤への非標的器官の暴露を増大さ
せることである。

【０００６】リポソーム 必要な領域でのコントラスト剤の蓄積を促進するために、コントラスト剤用の
担体として種々の微粒子が提案された。それらの担体のうち、微細な人工リン脂
質小胞であるリポソームに特別な関心が払われた。なぜなら、容易に制御できる
という性質および良好な薬理学的特性をもつからである。多くの個々の脂質およ
びそれらの混合物は、水相に懸濁させた場合、自発的に2層構造(リポソーム)を
形成する。そのとき、それらの分子の疎水性部分は内側を向き、親水性部分はそ
れらを取り囲む水相に露出される。いくつかの異なるタイプのリポソームが存在
する。それぞれのタイプは固有の特性を有しており、特定の方法によって調製す
ることができる。リポソームの通常の分類は、それらのサイズおよび単一小胞を
形成する同心二重層の数に基づいている(たとえば、多重ラメラ小胞(MLV)、単ラ
メラ小胞LUV、小単ラメラ小胞(SUV))。LUVの生産方法は、容易にスケールアップ
することが可能であり、予測可能なサイズおよび狭いサイズ分布を有するリポソ
ームの大バッチの工業的生産に使用することができる。

【０００７】 ほぼ20年間にわたり、リポソームは、次の理由により、薬物および診断剤のた
めの有望な担体として認識されてきた。(1)リポソームは完全に生体適合性であ
る；(2)それらは、薬物の物理化学的性質に応じて実際上任意の薬物または診断
剤をその内部水区画中にまたはその膜自体の中に閉じ込めることができる；(3)
リポソームに組み込まれた医薬は、外部環境の不活性化作用から保護され、しか
もそれと同時に望ましくない副反応を起こすことがない；(4)リポソームはまた
、細胞中にまたは個々の細胞区画内にさえも医薬を送達する特有の機会を提供す
る。さまざまなin vivo送達の目的を遂行すべく、リポソーム調製前に新しい成
分を脂質混合物に添加することによりおよび／または調製方法を変更することに
より、リポソームのサイズ、電荷および表面特性を容易に変化させることができ
る。

【０００８】 残念ながら、リン脂質リポソームは、循環系に導入された場合、非常に急速に
(通常の半クリアランス時間は30分以内である)細網内皮系(RES)の細胞によって
隔離される。肝細胞が主な原因であり、隔離は、リポソームのサイズ、電荷、お
よび組成に比較的依存する。循環する末梢血単球もまた、リポソームをエンドサ
イトーシスにより取り込み、その後、組織に侵入し、エンドサイトーシスにより
取り込まれたリポソームを体内の特定の病的領域に送達できる。

【０００９】 最近まで、薬物担体としてのリポソームの利用可能性は、血流からのリポソー
ムの急速なクリアランスのために制限されてきた。たとえば、従来のリポソーム
は、静脈内投与後1〜2時間以内に血流から大部分が除去される可能性がある。

【００１０】 リポソームの循環時間を長くするためのさまざまな方法が提案されてきた。こ
れらのうち2つは、血流中のリポソームの半減期をたかだか40〜50時間だけ延長
することに成功した。米国特許第4,837,028号に記載された1方法では、リポソー
ムは、ガングリオシドG_M1および非常に硬質の脂質を用いて製剤化される。米国
特許第5,013,556号に開示された他の一般的方法では、リポソームは、ポリエチ
レングリコール(PEG)鎖の層で被覆される。

【００１１】 RES器官はリポソームの天然の標的でありかつ静脈内投与するとそれらを良好
に蓄積するので、マクロファージに最も富んだRES器官、すなわち、肝臓および
脾臓のイメージングは、コントラスト剤を充填したリポソームを用いて行なわれ
た最初のイメージングであった。肝臓および脾臓の診断イメージングは、通常こ
れらの器官中の腫瘍および転移のほかに、特定の血流不整および炎症過程をも見
いだすことを目的としている。これを目的とする少なくとも3つの異なるイメー
ジング法の使用が報告された。すなわち、γ-、MR-、およびCT-イメージングで
ある。

【００１２】コントラストリポソームを用いる腫瘍イメージング コントラスト剤充填リポソームの重要かつ有望な用途の1分野は、腫瘍イメー
ジングである。腫瘍におけるリポソーム蓄積の主な機構は、漏出性腫瘍毛細管を
介した間質空間への管外遊出に依拠する。多くの他の場合と同様に、そのような
蓄積の効力は、長期循環性PEG被覆リポソームの使用により顕著に増大させるこ
とができる。リポソームベースのイメージング剤は、腫瘍のγ-、MR-、CT-、お
よび音波検査イメージングですでに使用され、成功をおさめている。腫瘍イメー
ジング用のインジウム111標識リポソーム(VesCan（登録商標）、Vestar, Inc.)
は、すでに第II〜III相臨床試験の段階にある。

【００１３】 炎症および感染部位を視覚化するために、リポソーム製剤を使用してもよい。
感染および炎症部位を視覚化するための微粒子イメージング剤の使用は、循環系
から管外遊出して、腫瘍および梗塞組織について我々がすでに記載したものと類
似した部位に蓄積される微粒子の能力に基づいている。

【００１４】 診断イメージングを目的とするリポソームの使用に関連した2つの大きな問題
、すなわち、腫瘍イメージングにおけるコントラストリポソームの効力の低さは
、血液からのリポソームのクリアランスが速いことおよび疾患組織に蓄積できな
いことによって、しばしば説明されてきた。これらの障害はいずれも、本発明で
対処される。

【００１５】発明の概要 本発明は、細胞外PLA₂活性の局在化された活性により特性づけられる疾患の診
断に特に有用な画像強調系に関する。

【００１６】 Kaiser(1999)により報告されたように、PLA₂は、悪性細胞によって生産される
ように思われる。膵臓、乳房および胃の癌を含めて種々の癌組織の免疫組織化学
的染色は、PLA₂に関して陽性であった。PLA₂の増大された発現および分泌は、IL
-6によって刺激された胃癌細胞中に見いだされ、16種のヒト癌腫細胞系のうち6
種は自発的に培養液上清にPLA₂を分泌した(Kaiser、1999年)。したがって、細胞
外PLA₂活性の増大されたレベルが癌組織に関連づけられることは、きわめて十分
に確立されたことと考えられる。

【００１７】 漏出性腫瘍毛細管を介した間質空間への管外遊出によりリポソームが腫瘍に蓄
積されるという観察と組み合わされる腫瘍組織中の増大されたPLA₂活性は、本明
細書に開示されている腫瘍の強調イメージングのためのリポソームの使用の基礎
になっている。

【００１８】 さらに、細胞外PLA₂活性は、炎症および感染組織のような特定の疾患領域で増
大する。癌組織部位に対して述べたことと同様に、微粒子は、循環系から管外遊
出して、感染、炎症および梗塞組織に蓄積されることが観測された(Torchilin、
1998年)。しかしながら、たとえば、腫瘍には蓄積されるが感染部位には蓄積さ
れない正に帯電した⁶⁷Ga-リポソームを用いて、感染と腫瘍とを区別することが
可能であることに注目することは重要である(Ogihara (1986) J Nucl Med 27, 1
300-7)。

【００１９】 本発明は、グリセロール主鎖上の1位にアルキル結合およびsn-2位にアシル結
合を含有しかつこれにグラフト重合されたポリマー鎖または多糖鎖を有するグリ
セロリン脂質のような脂質二重層形成性エーテル脂質から構成されたリポソーム
やミセルなどの脂質ベースの担体の形態をとるような標識送達系を提供する。さ
らに、担体系は、血管循環時間の延長およびその結果として疾患のある標的組織
中への蓄積をもたらすリポポリマー、糖脂質、ステロールなどの脂質二重層安定
化成分を含有していてもよい。担体が標識の標的部位、たとえば癌細胞に達した
とき、PLA₂が触媒するアシル結合の加水分解により、標識、典型的にはリゾ-エ
ーテル脂質およびエステル結合誘導体が放出される。癌細胞にはほとんど存在し
ないアルキル開裂酵素とは対照的に、細胞外PLA₂活性は癌組織中で増大する。さ
らに、細胞外PLA₂活性は炎症組織のような疾患領域中で増大する。

【００２０】 本発明は、脂質誘導体と標識とを含む脂質ベースの系の使用であって、この脂
質誘導体は、(a)少なくとも7炭素原子の長さの脂肪族基および少なくとも7個の
炭素原子を有する有機基ならびに(b)親水性部分を有し、この脂質誘導体はさら
に、有機基は加水分解により開裂除去されうるが脂肪族基は実質的に影響を受け
ずに残存する程度に細胞外PLA₂に対する基質であり、それにより、有機基の開裂
除去された脂質誘導体は、リゾホスホリパーゼに対する基質でないリゾ脂質誘導
体の形態で遊離され、この系は、系の表面上に親水性鎖を提示するようにリポポ
リマーまたは糖脂質を内包する、哺乳動物組織における細胞外PLA₂活性の局所的
増加に関連づけられる疾患または状態を検出および／または定量化するための診
断用組成物の調製のための上記使用を提供する。

【００２１】 したがって、細胞外ホスホリパーゼにより特異的かつ部分的にのみ開裂されう
ると同時にリポポリマーまたは糖脂質を含有する脂質誘導体の含まれたリポソー
ム(またはミセル)が、哺乳動物細網内皮系によって認識されることなくかつ細胞
壁を透過することなく、細胞外PLA₂活性の増大された標的組織に到達するのに十
分な長い時間にわたり血流中を循環する性質を有し、それによりリポソームの脂
質誘導体が細胞外PLA₂により特異的に開裂されて結果として所望の位置で画像強
調成分を遊離するという驚くべき知見を本発明は利用する。

【００２２】図面の説明 （後述の「図面の簡単な説明」を参照されたい）

【００２３】詳細な説明 本発明の重要な特徴の1つは、特定の脂質誘導体が哺乳動物組織の特異的細胞
外位置において明確に規定された方法で細胞外PLA₂により開裂されるという認識
である。該当する疾患組織中に標識をターゲッティングするように細胞外PLA₂が
モノエーテル/モノエステル脂質誘導体を開裂しうることを見いだした。

【００２４】脂質誘導体 したがって、本発明で使用される画像強調系(リポソームまたはミセル)は、(a
)少なくとも7炭素原子の長さの脂肪族基および少なくとも7個の炭素原子を有す
る有機基ならびに(b)親水性部分を有する脂質誘導体に依存する。この脂質コン
ジュゲートコントラスト剤はさらに、有機基は加水分解により開裂除去されうる
が脂肪族基は実質的に影響を受けずに残存する程度に細胞外ホスホリパーゼA₂に
対する基質であり、それにより、脂質コンジュゲートコントラスト剤は、リゾホ
スホリパーゼに対する基質でないリゾ脂質誘導体の形態で遊離される。この系は
、系の表面上に親水性鎖を提示するようにリポポリマーまたは糖脂質を内包する
。

【００２５】 「脂質」および「リゾ脂質」という用語は(リン脂質に関連して)当業者に周知
の用語であろうが、本発明の説明および特許請求の範囲内では、「脂質」という
用語は、次式で表されるグリセロールのトリエステルを意味することを意図して
いる点を強調しておかなければならない。

【００２６】

【化３】 式中、R^AおよびR^Bは、脂肪酸部分(C_9〜30-アルキル/アルキレン/アルキルジエン
/アルキルトリエン/-アルキルテトラエン-C(=O)-)であり、R^Cは、ホスファチジ
ン酸(PO₂-OH)またはホスファチジン酸の誘導体である。したがって、基R^Aおよび
R^Bは、エステル結合を介してグリセロール主鎖に結合している。

【００２７】 「リゾ脂質」という用語は、R^B脂肪酸基が不在の(たとえば、加水分解により
開裂除去された)脂質、すなわち、R^Bが水素でありかつ他の置換基が実質的に影
響を受けない上記の式で表されるグリセロール誘導体を意味するものとする。脂
質からリゾ脂質への変換は、酵素の作用下で、特に、細胞性および細胞外PLA₂の
作用下で行うことができる。

【００２８】 「脂質誘導体」および「リゾ脂質誘導体」という用語はそれぞれ、「脂質」お
よび「リゾ脂質」のグループの範囲内にある上記の可能な化合物の可能性ある誘
導体を包含するものとみなされる。生物学的に活性な脂質誘導体およびリゾ脂質
誘導体の例は、Houlihan, et al., Med. Res. Rev., 15, 3,157-223に与えられ
ている。したがって、自明なことであろうが、「誘導体」という拡張語は最も広
義に解釈されなければならない。

【００２９】 しかしながら、本発明の範囲内では、脂質誘導体およびリゾ脂質は、特定の官
能基条件(上記参照)および/または構造要件を満足しなければならない。好適な
脂質誘導体は(a)少なくとも7、好ましくは少なくとも9炭素原子の長さの脂肪族
基および少なくとも7個の炭素原子を有する有機基ならびに(b)親水性部分を有す
るものである点が特に注目に値する。脂肪族基および有機基が通常の脂質中の2
個の脂肪酸部分に相当し、親水性部分が(リン)脂質またはその生物学的等価体の
ホスフェート部分に相当することは明白であろう。

【００３０】 したがって、本発明の背後にある一般的概念は、哺乳動物の体の局在化領域、
特に疾患組織における細胞外PLA₂活性の増大されたレベルを利用することである
。本発明の範囲内で利用することのできる脂質誘導体は、細胞外PLA₂に対する基
質でなければならない。すなわち、脂質誘導体は、脂質中の2位の脂肪酸に対応
する有機基が酵素によって加水分解されうるものでなければならない。細胞外PL
A₂は酵素クラス(EC)3.1.1.4に属することが知られている。したがって、(細胞外
)PLA₂について言及された場合、脂質中の2位の脂肪酸に対応する有機基の加水分
解開裂を誘発することのできるこのクラスのすべての細胞外酵素、たとえばリパ
ーゼが対象になると解釈しなければならない。脂質ベースの画像強調系(リポソ
ームおよびミセルとして)に特有な利点の1つは、モノマー基質と比較して、組織
化された基質のほうが、細胞外PLA₂活性が有意に増大されるということである。

【００３１】 細胞外PLA₂によって加水分解可能な要件を考慮すれば、有機基(たとえば、脂
肪族基)は、細胞外PLA₂によって、好ましくは、開裂除去させられる基がカルボ
ン酸であるように、開裂させることのできるエステル官能基を介して結合される
ことが好ましいことは明らかである。

【００３２】 さらに、脂質誘導体、すなわち、細胞外PLA₂による開裂の後のリゾ脂質誘導体
、の脂肪族基(脂質中の1位の脂肪酸に相当する基)は、細胞外PLA₂の作用によっ
て実質的に影響を受けないことが本発明の重要な特徴である。「実質的に影響を
受けない」とは、脂肪族基の完全性が保存され、脂肪族基(1位の脂肪族基)の1モ
ル%未満、好ましくは0.1モル%未満が細胞外PLA₂の作用下で開裂されることを意
味する。

【００３３】 また、有機基の加水分解開裂から得られるリゾ脂質誘導体それ自体は、リゾホ
スホリパーゼに対する基質ではない。リゾホスホリパーゼは、酵素クラス(EC)3.
1.1.5に属することが知られている。したがって、リゾホスホリパーゼについて
言及された場合、リゾ(リン)脂質+水からホスホグリセロール+脂肪酸を生じる反
応を触媒するこのクラスのすべての酵素が対象になると解釈しなければならない
。「リゾホスホリパーゼに対する基質ではない」という用語は、リゾホスホリパ
ーゼが、対応するエステル脂質と比較して、この基質に対して1%未満の活性を有
すること、すなわち実質的に酵素活性をもたないことを意味するものとする。

【００３４】 そのようなリゾ脂質誘導体の好適な例は、リゾホスホリパーゼの作用下で加水
分解開裂を起こさないものである。したがって、リゾ脂質誘導体は、特に、リゾ
脂質の1位にまたはリゾ脂質誘導体におけるリゾ脂質の1位に対応する位置にエス
テル結合を有するリゾ脂質およびリゾ脂質誘導体ではない。

【００３５】 本発明の画像強調系に組み込まれる脂質誘導体の好ましい1クラスは、次式で
表すことができる。

【００３６】

【化４】 〔式中、 XおよびZは、独立して、O、CH₂、NH、NMe、S、S(O)、およびS(O)₂から、好ま
しくはO、NH、NMeおよびCH₂、特にO、から選択され； Yは、-OC(O)-であり、この場合、Yは、酸素またはカルボニル炭素原子のいず
れかを介して、好ましくはカルボニル炭素原子を介してR²に連結され； R¹は、式Y¹Y²で表される脂肪族基であり； R²は、少なくとも7個の炭素原子を有する有機基、たとえば、少なくとも7、好
ましくは少なくとも9炭素原子の長さを有する脂肪族基、好ましくは式Y¹Y²で表
される基であり； ここで、Y¹は、-(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(
CH₂)_n7-(CH=CH)_n8r-(CH₂)_n9であり、n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9の合計は
、9〜29の整数であり；n1は、0または1〜29の整数であり、n3は、0または1〜20
の整数であり、n5は、0または1〜17の整数であり、n7は、0または1〜14の整数で
あり、n9は、0または1〜11の整数であり；n2、n4、n6およびn8のそれぞれは、独
立して、0または1であり；Y²は、CH₃またはCO₂Hであり；それぞれのY¹-Y²は、独
立して、ハロゲンまたはC_1〜4-アルキルで置換されていてもよいが、好ましくは
、Y¹-Y²は無置換であり、 R³は、ホスファチジン酸(PO₂-OH)、ホスファチジン酸の誘導体ならびにホスフ
ァチジン酸およびそれらの誘導体に対する生物学的等価体から選択される(特に
、親水性ポリマーまたは多糖が共有結合されているホスファチジン酸誘導体)。
〕 上述したように、好ましい実施形態は、Yが-OC(O)-(ここで、Yはカルボキニル
炭素原子を介してR²に連結されている)であることを含む。最も好ましい実施形
態は、XおよびZがOでありかつYが-OC(O)-(ここで、Yはカルボニル炭素原子を介
してR²に連結されている)であることを含む。これは、脂質誘導体が1-モノエー
テル-2-モノエステル-リン脂質タイプの化合物であることを意味する。 脂質誘導体の他の好ましいグループは、基XがSであるものである。

【００３７】 1実施形態では、R¹およびR²は、式Y¹Y²で表される脂肪族基である。式中、Y²
は、CH₃またはCO₂Hであるが、好ましくはCH₃であり、Y¹は、-(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2 -(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)_n7-(CH=CH)_n8-(CH₂)_n9であり、n1
+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9の合計は、9〜29の整数である。すなわち、脂肪
族基Y¹Y²は、10〜24炭素原子の長さである。n1は、0に等しいかまたは1〜23の整
数であり、n3は、0に等しいかまたは1〜20の整数であり、n5は、0に等しいかま
たは1〜17の整数であり、n7は、0に等しいかまたは1〜14の整数であり、n9は、0
に等しいかまたは1〜11の整数であり；n2、n4、n6およびn8は、それぞれ独立し
て、0に等しいかまたは1である。

【００３８】 1実施形態では、脂肪族基R¹/R²またはR³基の1つ以上は、コンピューター断層
撮影(CT)イメージングに特に好適なハロゲン(ブロモ、ヨード)もしくはバリウム
原子などの標識を含んでいるか、またはPETスキャンの目的に特に有用な¹¹Cなど
の不安定同位体が富化されている。

【００３９】 R¹およびR²としての脂肪族基は、1実施形態では、好ましくは飽和で非分枝状
である。すなわち、それらは、好ましくは隣接炭素原子間に二重結合をもたず、
このとき、n2、n4、n6およびn8のそれぞれは、0に等しい。したがって、Y¹は、
好ましくは(CH₂)_n1である。より好ましくは(この実施形態では)、R¹およびR²は
、それぞれ独立して、(CH₂)_n1CH₃であり、最も好ましくは、(CH₂)₁₇CH₃または(C
H₂)₁₅CH₃である。このほかの実施形態では、これらの基は、1つ以上の二重結合
を有することができる。すなわち、それらは不飽和であってもよく、n2、n4、n6
およびn8の1つ以上が1に等しくてもよい。たとえば、不飽和炭化水素が1つの二
重結合を有する場合、n2は1に等しく、n4、n6およびn8はそれぞれ0に等しく、Y¹ は(CH₂)_n1CH=CH(CH₂)_n3に等しい。n1は0に等しいかまたは1〜21の整数であり、
同様にn3は0であるかまたは1〜20の整数であり、n1またはn3の少なくとも一方は
0に等しくない。

【００４０】 特定の1実施形態では、脂質誘導体は、モノエーテル脂質である誘導体である
。ただし、XおよびZはOであり、R¹およびR²は、独立して、アルキル基(CH₂)_nCH₃ (ここで、nは、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25
、26、27、28、または29、好ましくは14、15または16、特に14である)から選択
され、Yは-OC(O)-(ここで、Yはカルボニル炭素原子を介してR²に連結されている
)である。

【００４１】 R³に相当する親水性部分(しばしば「ヘッド基」としても知られる)に関して、
ホスファチジン酸(PO₂-OH)、ホスファチジン酸の誘導体ならびにホスファチジン
酸およびそれらの誘導体に対する生物学的等価体に対応する多種多様な基を使用
できると考えられる。自明なことであろうが、R³に対する不可欠の要件は、この
基が細胞外PLA₂によるR²基(実際にはR²-C(=O)またはR²-OH)の酵素的開裂を可能
にするものでなければならないということである。「ホスファチジン酸およびそ
れらの誘導体に対する生物学的等価体」とは、実際上、そのような基(ホスファ
チジン酸として)が細胞外PLA₂による酵素的開裂を可能にするものでなければな
らないことを意味する。

【００４２】 R³は、典型的には、ホスファチジン酸(PO₂-OH)、ホスファチジルコリン(PO₂-O
-CH₂CH₂N(CH₃)₃)、ホスファチジルエタノールアミン(PO₂-O-CH₂CH₂NH₂)、N-メチ
ル-ホスファチジルエタノールアミン(PO₂-O-CH₂CH₂NCH₂)、ホスファチジルセリ
ン、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジルグリセロール(PO₂-O-C
H₂CHOHCH₂OH)から選択される。ホスファチジン酸の他の可能な誘導体は、グルタ
ル酸、セバシン酸、コハク酸、および酒石酸のようなジカルボン酸が、ホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール
などの末端窒素に連結されているものである。

【００４３】 脂質誘導体の一部分がさらにリポポリマーまたは糖脂質である特定の実施形態
では、親水性ポリマーまたは多糖は、典型的には、脂質誘導体のホスファチジル
部分に共有結合で連結される。

【００４４】 リポポリマーを形成するように本発明の脂質誘導体に好適に組み込むことので
きる親水性ポリマーは、水易溶性で、小胞形成性脂質に共有結合で連結すること
ができ、かつ毒性作用をもつことなくin vivoで許容される(すなわち、生体適合
性である)であるポリマーである。好適なポリマーとしては、ポリエチレングリ
コール(PEG)、ポリ乳酸(ポリラクチドとも呼ばれる)、ポリグリコール酸(ポリグ
リコリドとも呼ばれる)、ポリ乳酸-ポリグリコール酸コポリマー、ポリビニルア
ルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン(polymethoxazoline)、
ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタ
クリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、および誘導体化セルロース、たと
えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが挙げら
れる。

【００４５】 好ましいポリマーは、約100ダルトンから約10,000ダルトンまで、より好まし
くは約300ダルトンから約5,000ダルトンまでの分子量を有するものである。特に
好ましい実施形態では、ポリマーは、約100から約5,000ダルトンまでの分子量、
より好ましくは約300から約5,000ダルトンまでの分子量を有するポリエチレング
リコールである。特に好ましい実施形態では、ポリマーは、750ダルトンのポリ
エチレングリコール(PEG(750))である。ポリマーはまた、含まれるモノマーの数
によって規定することも可能である。本発明の好ましい実施形態では、少なくと
も約3個のモノマーのポリマー、たとえば、3個のモノマーからなるPEGポリマー(
約150ダルトン)を利用する。

【００４６】 糖脂質またはリポポリマーを脂質誘導体の割合で表現する場合、そのような脂
質誘導体(ポリマー鎖または多糖鎖を有する脂質誘導体)は、典型的には、脱水し
た脂質ベースの系全体の1〜80モル%、たとえば、2〜50モル%または3〜25モル%を
占める。しかしながら、ミセル組成物の場合、その割合はさらに高くなる可能性
があり、たとえば、脱水した脂質ベースの系全体の1〜100モル%。たとえば、10
〜100モル%になることもある。

【００４７】 ホスファチジル部分に(たとえば、ホスファチジルエタノールアミンの末端窒
素を介して)共有結合で連結される好ましいポリマーは、ポリエチレングリコー
ル(PEG)、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリラクチド-ポリグリコール酸コ
ポリマーおよびポリビニルアルコールである。

【００４８】 R²が少なくとも7個の炭素原子を有する有機基(たとえば、特定の長さ(少なく
とも7、好ましくは9炭素原子)を有する脂肪族基)でなければならないこと、かな
りの程度の変化が可能であり、たとえば、R²は必ずしも長鎖残基である必要はな
いがより複雑な構造を持つものであってもよいことを理解すべきである。

【００４９】 一般的には、R²は、細胞外PLA₂により遊離されうる環境中でかなり不活性であ
ってもよいし、またはR²は、診断用途に好適な標識に相当するものであってもよ
いと考えられる。このほか、R²は、典型的には補助薬物としてあるいはリゾ脂質
誘導体および/または環境中に存在する任意の他の(第2の)薬物に対する効率向上
剤として有効な医薬的役割を担うものであってもよい。後者の場合、脂質ベース
の系は、診断方法に関連した有用な性質だけでなく治療効果をも有しうる。この
実施形態では、基R²は、長鎖残基、たとえば、脂肪酸残基(この脂肪酸には、基Y
からのカルボニルが含まれるであろう)であってもよい。これについては、先に
詳細に記載した。これらのサブグループ内のR²としての補助薬物の対象となる例
は、ポリ不飽和酸、たとえば、オレエート、リノール酸、リノレン酸、およびア
ラキドノイルの誘導体である(Yからのカルボニルが含まれる)。たとえば、アラ
キドン酸誘導体としてのプロスタグランジンE1のようなプロスタグランジンは、
プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリン(leukotrine)の作用
を含めてホルモン作用の公知のレギュレーターである。R²としての効率向上剤の
例は、標的細胞膜の透過性を増大させたり細胞外PLA₂の活性を増大させたりする
もの、または脂質にコンジュゲートされたコントラスト剤、あるいは任意の第2
の薬物である。これらの例は、短鎖(C_8〜12)脂肪酸である。

【００５０】 したがって、本発明はまた、診断および治療の両方を目的とした脂質ベースの
系の使用に関する。

【００５１】 可能なR²基の種々の例は、基の名称ではなく個別の種の名称により参照される
ことを理解しなければならない。さらに、可能な例には、有機基を脂質骨格に連
結させる結合(上記式中の「Y」に対応する)のカルボニル基またはオキシ基が含
まれる可能性があることを理解しなければならない。このことはもちろん、当業
者であればわかるであろう。

【００５２】 本発明において使用される脂質誘導体の好適な例に対する一般式は具体的に示
されていないが、例えば、細胞外PLA₂による開裂速度を変化させるために、また
は単に脂質誘導体を含むリポソームの特性を変化させるために、脂質誘導体のグ
リコール部分が置換されていてもよいことを理解しなければならない。

【００５３】 脂質ベースの系に有用な化合物の特定のグループは、次式で表される脂質誘導
体である。

【００５４】

【化５】 〔式中、 XおよびZは、独立して、O、CH₂、NH、NMe、S、S(O)、およびS(O)₂、好ましく
はO、NH、NMeおよびCH₂、特にO、から選択され； Yは、-OC(O)-であり、この場合、Yは、酸素またはカルボニル炭素原子のいず
れかを介して、好ましくはカルボニル炭素原子を介して、R²に連結され； R¹は、式Y¹Y²で表される脂肪族基であり； R²は、少なくとも7個の炭素原子を有する有機基であり； ここで、Y¹は、-(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(
CH₂)_n7-(CH=CH)_n8r-(CH₂)_n9であり、n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9の合計は
、9〜29の整数であり；n1は、0または1〜29の整数であり、n3は、0または1〜20
の整数であり、n5は、0または1〜17の整数であり、n7は、0または1〜14の整数で
あり、n9は、0または1〜11の整数であり；n2、n4、n6およびn8のそれぞれは、独
立して、0または1であり；Y²は、CH₃またはCO₂Hであり；それぞれのY¹-Y²は、独
立して、ハロゲンまたはC_1〜4-アルキルで置換されていてもよいが、好ましくは
、Y¹-Y²は、無置換であり、 R³は、親水性ポリマーまたは多糖が結合されるホスファチジン酸の誘導体から
選択される。親水性ポリマーまたは多糖は、典型的にはかつ好ましくは、ポリエ
チレングリコール、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)-ポリ(グリコ
ール酸)コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメト
キサゾリン(polymethoxazoilne)、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプ
ロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド
、および誘導体化セルロースから、特に、ポリエチレングリコール、ポリ(乳酸)
、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)-ポリ(グリコール酸)コポリマー、およびポ
リビニルアルコールから選択される。〕 特定のサブグループは、XおよびZがOであり、R¹およびR²が、独立して、アル
キル基(CH₂)_nCH₃(ここで、nは、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
、22、23、24、25、26、27、28、または29、好ましくは14または16である)から
選択され、Yが-OC(O)-(ここで、Yはカルボニル炭素原子を介してR²に連結されて
いる)であるものである。

【００５５】 特定のグループの化合物は、100から10000ダルトンまで、特に300〜5000ダル
トンのPEG分子量を有する、ポリエチレンオキシド-1-O-パルミチル-sn-2-パルミ
トイル-ホスファチジルエタノールアミンDPPE-PEGおよびポリエチレンオキシド-
1-O-ステアリル-sn-2-ステアロイル-ホスファチジルエタノールアミンDSPE-PEG
である。

【００５６】リポソームおよびミセルとして製剤化される脂質誘導体 「脂質ベースの画像強調系」という用語は、主成分として脂質または脂質誘導
体を含む巨大分子構造を包含する。この好適な例は、リポソームおよびミセルで
ある。現在のところリポソームが最も広い適用範囲を提供すると考えられる。こ
れについては以下に最も詳しく記載する。リポソームは、現在、好ましい脂質ベ
ースの系であると考えられるが、ミセル系もまた、本発明の範囲内の興味深い実
施形態を提供すると考えられる。

【００５７】 本明細書に記載の実施形態と有利に組み合わせることのできる1つの重要な変
更形態では、脂質誘導体は、唯一の成分として、または他の成分(他の脂質、ス
テロールなど)と組み合わせて(このほうがより一般的である)、リポソームに組
み入れられる。したがって、本明細書に記載の脂質ベースの系は、好ましくは、
脂質誘導体と標識とを含む層から構成されたリポソームの形態である。

【００５８】 本明細書で使用する場合、「標識」という用語は、哺乳動物体に投与して、生
きている組織を画像化するための体外手段により検出しうる種を意味するものと
する。標識は、放射性同位体および放射性同位体標識化合物のような放射性標識
；放射線不透過性化合物;蛍光性化合物などから選択されうる。より特定の標識
は、¹¹¹In、^99mTc、⁶⁷Ga、¹¹C；Gd、Mn、酸化鉄、アルゴン、窒素、ヨウ素、臭
素およびバリウムである。

【００５９】 ガンマシンチグラフィー用の好適な標識は、¹¹¹In、^99mTc、⁶⁷Gaのような診断
用放射性核種である。実用目的では、放射性ヌクレオチドが、たとえば、ジエチ
レントリアミン五酢酸(DTPA)、ヘキサメチルプロピレンアミンオキシム(HMPAO)
、ジイソプロピルイミノ二酢酸(DISIDA)のようなキレート化剤、またはさらには
ヒト血清アルブミン(HSA)のようなタンパク質と複合化される。このほか、リポ
ソームの調製中または調製後にリポソーム表面上にキレート部分を固定すること
のできる疎水基を導入することによりDTPAまたは類似のキレート化合物を誘導体
化してもよい。

【００６０】 X線用の好適な標識は、リポソームに導入して肝臓および脾臓の平面X線イメー
ジングおよびCTイメージングの両方に使用しうる、ベログラフィン、イオキサグ
レート、イオヘキソール、イオプロミド、イオメプロール、イオパミドール、イ
オペントール、イオジキサノール、イオベルソールの各種非イオン性コントラス
ト剤などである。

【００６１】 磁気共鳴 (MR) イメージング用の好適な標識は、種々の担体分子に結合される
GdおよびMnのような常磁性イオンならびに酸化鉄である。たとえば、ガドリニウ
ムジエチレントリアミン五酢酸(Gd-DTPA)錯体は、肝臓、脾臓、および肝転移のM
Rイメージングに有効なコントラスト剤であることが実証されている。

【００６２】 コンピューター断層撮影（CT）イメージング用の好適な標識は、ヨウ素、臭素
、バリウムなどである。

【００６３】 好適な標識の他の例は、しばしば、イメージングまたは検出の選択された方法
ごとに与えられる。それらの例は、Handbook of medical imaging, vol. 1, 2,
3, SPIE Press, Washington USA, 2000, edd. Beutel, Konden and van Metter
に詳細に記載されている。

【００６４】 「リポソーム」は、1つ以上の脂質二重層を含む自己集合性構造として知られ
ている。脂質二重層のそれぞれは、水性区画を取り囲み、両親媒性脂質分子の2
つの対向する単層を構成する。両親媒性脂質(ここでは、特に、脂質誘導体)は、
1つまたは2つの無極性(疎水性)脂肪族基(脂質誘導体中のR¹およびR²に対応する)
に共有結合で連結された極性(親水性)ヘッド基領域(脂質誘導体中の置換基R³に
対応する)を含む。疎水基と水性媒質との間でエネルギー的に不利な接触が起こ
ると、極性ヘッド基は水性媒質の方向に向いて配向し、一方、疎水基は二重層の
内部方向に向いて再配向するように脂質分子の再配列が誘発されると一般に考え
られる。疎水基が水性媒質との接触から効果的に保護されている場合、エネルギ
ー的に安定な構造が形成される。

【００６５】 以上からわかるように、脂質ベースの系(たとえば、リポソーム)は、標識の取
り込みに特に有用である。

【００６６】 リポソームは、単一の脂質二重層(単ラメラリポソーム、「ULV」)、または複
数の脂質二重層(多重ラメラリポソーム、「MLV」)を有することができ、さまざ
まな方法により作製することができる(レビューに関しては、たとえば、Deamer
and Uster, Liposomes, Marcel Dekker, N.Y., 1983, 27-52を参照されたい)。
これらの方法には、多重ラメラリポソーム(MLV)を作製するためのBanghamの方法
；実質的に等しいラメラ間溶質分布を有するMLVを作製するためのLenk、Fountai
nおよびCullisの方法(たとえば、米国特許第4,522,803号、米国特許第4,588,578
号、米国特許第5,030,453号、米国特許第5,169,637号および米国特許第4,975,28
2号を参照されたい)；ならびにオリゴラメラリポソームを調製するためのPapaha
djopoulosらの逆相蒸発法(米国特許第4,235,871号)が包含される。音波処理(Pap
ahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta, 135, 624 (1968)を参照された
い)または押出し(米国特許第5,008,050号および米国特許第5,059,421号)のよう
な方法により、MLVからULVを作製することができる。本発明のリポソームは、こ
れらの開示のいずれの方法によっても、作製することができる。それらの内容は
参照により本明細書に組み入れられるものとする。

【００６７】 より大きなリポソームからより小さなサイズのリポソームを調製するために、
音波処理、均質化、フレンチプレス適用および摩砕のような種々の方法を使用す
ることができる。押出し(米国特許第5,008,050号を参照されたい)を使用してリ
ポソームのサイズを低減させることができる。すなわち、規定の選択されたサイ
ズのフィルター細孔にリポソームを加圧下で通過させることにより、あらかじめ
決められた平均サイズを有するリポソームを作製することができる。クロスフロ
ー濾過(国際特許公開第89/08846号を参照されたい)を使用してリポソームのサイ
ズを調節することもできる。すなわち、よりサイズの不均一性が少なく、より均
一な規定のサイズ分布を有するリポソーム集団を有するリポソームを作製するこ
とができる。これらの文献の内容は参照により本明細書に組み入れられるものと
する。電気的光拡散に準ずるようないくつかの方法および当業者が十分に入手し
うる範囲内の装置(たとえば、Nicomp（登録商標）粒径測定装置)により、リポソ
ームのサイズを決定することもできる。

【００６８】 たとえ脂質ベースの系がリポソーム系であったとしても、本発明の脂質誘導体
がその系の主要部分を構成できることに注目することはきわめて興味深い。この
事実は、本発明の脂質誘導体と脂質との構造的類似性(機能的類似性ではない)に
依るものである。したがって、本発明用の脂質誘導体は、リポソームの唯一の成
分でありうる。すなわち、脱水した全リポソームの100モル%まで、脂質誘導体に
より構成することができると考えられる。これは、リポソームのわずかな部分を
構成することができるにすぎない公知のモノ-エーテルリゾ脂質と対照的である
。

【００６９】 典型的には、以下で詳述されているように、リポソームは、有利には、医薬作
用を有していても有していなくてもよいがリポソーム構造をより安定化(または
より不安定化)させるかまたはクリアランスからリポソームを保護することによ
り循環時間を増大させてリポソームを含む医薬の全体的効率を改良する他の成分
を含む。

【００７０】 これについて述べると、特定の脂質誘導体は、典型的には、脱水した全リポソ
ームを基準にして15〜100モル%、たとえば、50〜100モル%、好ましくは75〜100
モル%、特に90〜100モル%を構成するであろうと考えられる。

【００７１】 リポソームは単ラメラまたは多重ラメラでありうる。いくつかの好ましいリポ
ソームは単ラメラであり、約200nm未満、より好ましくは約50nm超〜約200nm未満
の直径を有している。

【００７２】 リポソームは、典型的には、当技術分野で知られているように、(a)有機溶媒
中に脂質誘導体を溶解する工程と；(b)工程(a)の脂質誘導体溶液から有機溶媒を
除去する工程と；(c)リポソームが形成されるように工程(b)の生成物を水性溶媒
で水和する工程とを含む方法によって調製されている。

【００７３】 この方法は、工程(a)の有機溶媒または工程(c)の水相に標識を添加する工程を
さらに含む。このほか、最初にリポソームを形成し、電気化学ポテンシャルを確
定し（たとえば、最も外側のリポソーム二重層を横切るpH勾配により確定する）
、次に、リポソームの外部の水性媒質にイオン化可能な標識を添加することによ
り、イオン化可能な標識をリポソームに充填することができる(たとえば、米国
特許第5,077,056号および国際特許公開第86/01102号を参照されたい)。

【００７４】 それに続いて、この方法は、100nmなどの特定のサイズのリポソームを作製す
るために、工程(c)で作製したリポソームをフィルターに通して押出す工程を含
んでいてもよい。

【００７５】 広範囲にわたるサイズを有する脂質ベースの粒子系、すなわち、リポソームお
よびミセルを、前述の技術により調製することが可能である。投与経路にもよる
が、医薬用途に好適なサイズは、通常20〜10,000nmの範囲、特に30〜1000nmの範
囲であろう。50〜200nmの範囲のサイズが通常好まれる。なぜなら、このサイズ
範囲内のリポソームは、哺乳動物の細網内皮系(「RES」)によってより速く認識
されるためにより速く循環系から除去されるより大きなリポソームの場合よりも
、哺乳動物の血管系内でより長時間循環すると一般に考えられるからである。血
管循環時間が長くなると、脂質ベースの系が腫瘍や炎症などの対象の部位に到着
する可能性が増大する。

【００７６】 静脈内および筋肉内注射による投与に適合した、本明細書に記載の実施形態に
規定されている画像強調系の場合、リポソームは好ましくは約100nmの平均粒径
を有していなければならないと考えられる。したがって、粒径は、一般的には50
〜200nmの範囲になければならない。

【００７７】 さらに、皮下注射を介した投与に適合した画像強調系の場合、リポソームは、
好ましくは100〜5000nmの平均粒径を有していなければならない。そのとき、リ
ポソームは、単一層であっても多層であってもよい。

【００７８】 リポソーム中に脂質誘導体を含有させることにより得られる利点の1つは、リ
ポソーム構造が、特に、下記のように安定化された場合、個別化合物としての脂
質誘導体および標識よりもはるかに長い血管循環時間を有することである。さら
に、脂質誘導体および標識は、リポポリマーまたは糖脂質の含まれているリポソ
ーム中に「充填」された場合、多かれ少なかれ不活性になるかまたはさらには「
隠蔽」されるであろう。このことはまた、いかなる起こりうる不利な作用をも、
たとえば、溶血作用をも抑制できることを意味する。

【００７９】 癌、感染または炎症のある疾患領域または組織などの対象の領域で反応するま
で、リポソームは、好ましくは不活性成分として機能しなければならない。以下
に記載されているように、リポソームは、いくつかの他の成分を含んでいてもよ
い。特に、本発明に係る画像強調系は、標識の放出を制御する成分、細胞外PLA₂ 活性制御剤または透過エンハンサー、たとえば、短鎖脂質およびリポポリマー/
糖脂質をさらに含有していてもよい。

【００８０】 改変剤としてリポソーム中に組み込まれる化合物の2つの重要なグループは、1
00〜10000ダルトンのPEG分子量を有するリポポリマー(たとえば、ポリエチレン
オキシド-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンDPPE-PEG、ポリエチ
レンオキシド-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンDSPE-PEG)のよう
な安定化化合物リポポリマーおよび糖脂質である。リポポリマーは、リポソーム
用の安定化剤として(すなわち、リポポリマーは循環時間を長くする)、および本
発明に関連してかなり興味深いことに、細胞外PLA₂に対するアクチベーターとし
て機能する。この安定化作用については、以下で説明する。

【００８１】 リポソームの外面は哺乳動物の循環系内で、オプソニンのような血清蛋白質に
より被覆されるようになると考えられる。特定の理論により制限することをなん
ら意図するものではないが、血清蛋白質の結合がおおむね阻害されるようにリポ
ソームの外面を改変することによってリポソームのクリアランスを抑制すること
ができると考えられる。有効な表面改変、すなわち、オプソニン作用およびRES
取り込みの阻害を引き起こすリポソームの外面の改変は、哺乳動物の循環系内の
リポソームの薬物動態学的挙動が改変されて、リポポリマーに対して先に記載し
たように細胞外PLA₂の活性が増強されるように、リポソームへの血清蛋白質の結
合を阻害することのできる化学部分の結合により極性ヘッド基が誘導体化された
脂質をリポソーム二重層中に組み込むことによって達成されると考えられる。

【００８２】 急速なRES取り込みを回避して血流中で増大された半減期を有するリポソーム
調製物を考案した。STEALTH（登録商標）リポソーム(Liposome Technology Inc.
, Menlo Park, Calif.)は、脱水した全リポソームの約5モル%のポリエチレング
リコール(PEG)-グラフト脂質を含む。リポソーム外面上にポリマーが存在すると
、RESの器官によるリポソームの取り込みが低減される。そこに含まれる界面活
性剤の破壊作用に対して抵抗性を示すようにリポソーム膜を構築することができ
る。たとえば、親水性(すなわち、水溶性)ポリマーで誘導体化された脂質を成分
として含有するリポソーム膜は、通常、増大された安定性を有する。脂質二重層
のポリマー成分は、RESによる取り込みからリポソームを保護するので、血流中
のリポソームの循環時間は長くなる。

【００８３】 リポポリマーで使用するのに好適な親水性ポリマーは、水易溶性で、小胞形成
性脂質に共有結合で連結することができ、かつ毒性作用をもたずin vivoで許容
される(すなわち、生体適合性である)ポリマーである。好適なポリマーとしては
、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ乳酸(ポリラクチドとも呼ばれる)、ポリ
グリコール酸(ポリグリコリドとも呼ばれる)、ポリ乳酸-ポリグリコール酸コポ
リマー、およびポリビニルアルコールが挙げられる。好ましいポリマーは、約10
0または120ダルトンから約5,000または10,000ダルトンまで、より好ましくは約3
00ダルトンから約5,000ダルトンまでの分子量を有するものである。特に好まし
い実施形態では、ポリマーは、約100から約5,000ダルトンまでの分子量、より好
ましくは約300から約5,000ダルトンまでの分子量を有するポリエチレングリコー
ルである。特に好ましい実施形態では、ポリマーは、750ダルトンのポリエチレ
ングリコール(PEG(750))である。ポリマーはまた、含まれるモノマーの数によっ
て規定することも可能である。本発明の好ましい実施形態では、少なくとも約3
個のモノマーのポリマー、たとえば、3個のモノマーからなるPEGポリマー(約150
ダルトン)を利用する。本発明で使用するのに好適でありうる他の親水性ポリマ
ーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン(polymethoxazoline)
、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメ
タクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、および誘導体化セルロース、た
とえば、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが挙げ
られる。

【００８４】 糖脂質とは、親水性多糖鎖が共有結合で連結される脂質である。リポポリマー
が現在最も有望な効果を示すが、リポポリマーと同様に糖脂質を利用できること
はわかるであろう。

【００８５】 リポポリマーの含量は有利には脱水した全リポソームを基準にして1〜50モル%
、たとえば、2〜25%、特に2〜15モル%の範囲であると一般に考えられる。

【００８６】 リポソームの二重層または多重層はまた、安定化剤やターゲッティング化合物
などとして、他の成分、たとえば、他の脂質、ステロール系化合物、ポリマー-
セラミドを含有していてもよい。

【００８７】 脂質誘導体を含むリポソームは、(原理的には)排他的に脂質誘導体から構成し
うる。しかしながら、リポソームを改変するために、「他の脂質」を併用しても
よい。他の脂質は、すべての脂質成分が強固に充填されて二重層からの脂質誘導
体の放出が抑制されるように二重層の脂質誘導体成分と共に適合性充填立体配座
をとる能力に応じて選択される。適合性充填立体配座に寄与する脂質ベースの因
子は当業者に周知であり、たとえば、アシル鎖長および不飽和度ならびにヘッド
基サイズおよび電荷が挙げられるが、これらに限定されるものではない。したが
って、当業者であれば、過度の実験を行うことなく、卵ホスファチジルエタノー
ルアミン(「EPE」)またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(「DOPE
」)のような種々のホスファチジルエタノールアミン(「PE」)を含めて、好適な
他の脂質を選択することができる。種々の方法で脂質を改変することが可能であ
る。たとえば、グルタル酸、セバシン酸、コハク酸および酒石酸のようなジカル
ボン酸でヘッド基を誘導体化することにより改変することが可能である。この場
合、ジカルボン酸は、好ましくはグルタル酸(「GA」)である。したがって、好適
なヘッド基誘導体化脂質としては、ジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン-グルタル酸(「IDPPE-GA」)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタ
ノールアミン-グルタル酸(「POPE-GA」)およびジオレオイルホスファチジルエタ
ノールアミン-グルタル酸(「DOPE-GA」)のようなホスファチジルエタノールアミ
ン-ジカルボン酸が挙げられる。最も好ましくは、誘導体化脂質はDOPE-GAである
。

【００８８】 「他の脂質」の全含量は、典型的には、脱水した全リポソームを基準にして0
〜30モル%、特に、1〜10モル%の範囲であろう。

【００８９】 リポソームに組み込まれたステロール系化合物は、一般的には、脂質二重層の
流動性に影響を及ぼす可能性がある。したがって、ステロールと周囲の炭化水素
基との相互作用により、一般的には、二重層からのこれらの基の遊出が抑制され
る。リポソームに組み込まれるステロール系化合物(ステロール)の例は、コレス
テロールであるが、さまざまな他のステロール系化合物が利用可能である。ステ
ロール系化合物が存在する場合、その含量は、脱水した全リポソームを基準にし
て0〜25モル%、特に0〜10モル%、たとえば0〜5モル%の範囲であると一般に考え
られる。

【００９０】 ポリマー-セラミドは血管循環時間を改良する安定化剤である。その例は、セ
ラミドのポリエチレングリコール誘導体(PEG-セラミド)、特に、ポリエチレング
リコールの分子量が100〜5000のものである。ポリマー-セラミドの含量は、脱水
した全リポソームを基準にして0〜30モル%、特に0〜10モル%の範囲であると一般
に考えられる。

【００９１】 さらに他の成分が、脱水した全リポソームを基準にして0〜2モル%、特に0〜1
モル%を占めてもよい。

【００９２】 本発明に係る実施形態によれば、リポソームの脂質二重層は、PEG鎖が、脂質
二重層の内面から、リポソームにより取り込まれた内部空間内に伸び、かつ脂質
二重層の外面から周囲環境中に伸びるように、ポリエチレングリコール(PEG)で
誘導体化された脂質を含有する(たとえば、米国特許第5,882,679号ならびに図10
および11を参照されたい)。

【００９３】 ポリエチレングリコールのような生体適合性親水性ポリマーで誘導体化された
小胞形成性脂質を調製するためのさまざまな連結方法が当技術分野で知られてい
る(たとえば、米国特許第5,213,804号; 米国特許第5,013,556号を参照されたい)
。

【００９４】 本発明に係るリポソームの誘導体化脂質成分はさらに、選択的生理学的条件下
、たとえば、ペプチダーゼもしくはエステラーゼ酵素または還元剤の存在下で、
開裂させることのできるペプチド、エステル、もしくはジスルフィド結合のよう
な不安定な脂質-ポリマー結合を含んでいてもよい。ポリマーをリン脂質に連結
するような結合を用いることにより、投与後数時間にわたりそのようなリポソー
ムの高い血中レベルを達成し、続いて、可逆的に結合を開裂させて外側リポソー
ム二重層からポリマーを除去するようにできる。そのとき、ポリマーの含まれな
いリポソームは、RES系により急速に取り込まれやすくなる(たとえば米国特許第
5,356,633号を参照)。

【００９５】 さらに、本発明に係るリポソームは、リポソームの外面に結合された非ポリマ
ー性分子、たとえば、ハプテン、酵素、抗体もしくは抗体フラグメント、サイト
カインおよびホルモン(たとえば、米国特許第5,527,528号を参照されたい)、な
らびに他の小さなタンパク質、ポリペプチド、単糖多糖部分、または特定の酵素
認識特性もしくは表面認識特性をリポソームに付与する非タンパク質性分子を含
有していてもよい。公開PCT出願WO94/21235号を参照されたい。特定の器官また
は細胞型にリポソームを優先的にターゲッティングする表面分子を、本明細書中
では「ターゲッティング分子」と呼ぶ。ターゲッティング分子としては、特異的
抗原(糖部分に対する受容体)を有する特異的細胞にリポソームをターゲッティン
グする抗体および糖部分、具体的には、ガングリオシドまたはマンノースやガラ
クトースをベースにしたものが挙げられる。リポソームに表面分子を連結するた
めの方法は当技術分野で公知である(たとえば、米国特許第4,762,915号を参照さ
れたい)。

【００９６】 リポソームは、その内容物の実質的部分が保持されるようにして、脱水、保存
、次に再形成に付すことができる。リポソームを脱水するには、一般に、リポソ
ーム二重層の内面および外部の両方で二糖のような親水性乾燥保護剤を使用する
ことが必要である(米国特許第4,880,635号を参照されたい)。この親水性化合物
はリポソーム中での脂質の再配列を防止すると一般に考えられる。その結果、サ
イズおよび内容物は、乾燥操作中およびそれに続く再水和が終わるまで保持され
る。そのような乾燥保護剤に求められる適切な品質は、それらが強力な水素結合
受容体であり、リポソーム二重層成分の分子内間隔を保持する立体化学的特性を
有することである。このほか、脱水前にリポソーム調製物を凍結させず、しかも
脱水後の調製物中に十分な水が残存する場合、乾燥保護剤を省略することができ
る。

【００９７】標識担体系としての脂質誘導体リポソーム 脂質ベースの系は、さまざまな疾患、たとえば、典型的には、癌、具体的には
、脳、乳房、肺、大腸、もしくは卵巣の癌、または白血病、リンパ腫、肉腫、癌
腫から選択される疾患および炎症状態の診断に使用することができる。

【００９８】 上述したように、本発明の脂質誘導体を含むリポソームはまた、標識をも含む
。標識は、脂質誘導体分子に共有結合で連結させてもよいし、あるいはより多く
の場合に行われるように、脂質ベースの系内に、たとえば、ミセルもしくはリポ
ソームの内部に、またはミセルもしくはリポソームの膜部分中に組み込んでもよ
い。特定の実施形態では、上述した脂質ベースの画像強調系は、標識を含むリポ
ソームの形態をとる。脂質ベースの系は、さらなる実施形態において、単独の医
薬作用を有していてもよいし脂質誘導体およびリゾ脂質誘導体と組み合わせて相
乗的な医薬作用を有していてもよい第2の薬物(製薬上有効な成分)を内包するこ
とができる。それにより、脂質ベースの系は、二重の作用、すなわち、標識と薬
物もしくは薬物混合物とをターゲッティング化送達する作用を有する。

【００９９】 これについて述べると、本発明はまた、リポソームの形態をとりかつ第2の薬
物が組み込まれた画像強調系を提供する。

【０１００】 可能な「第2の薬物」は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与することのできる
任意の化合物または物質組成物である。そのような薬剤は、哺乳動物において生
物学的活性を有することができる。リポソームに関連しうる第2の薬物としては
、抗ウイルス剤、たとえば、アシクロビル、ジドブジンおよびインターフェロン
；抗細菌剤、たとえば、アミノグリコシド、セファロスポリンおよびテトラサイ
クリン；抗真菌剤、たとえば、ポリエン抗生物質、イミダゾールおよびトリアゾ
ール；抗代謝剤、たとえば、葉酸ならびにプリンおよびピリミジン類似体；抗新
生物剤、たとえば、アントラサイクリン抗生物質および植物アルカロイド；ステ
ロール、たとえば、コレステロール；炭水化物、たとえば、糖およびデンプン；
アミノ酸、ペプチド、タンパク質、たとえば、細胞受容体タンパク質、免疫グロ
ブリン、酵素、ホルモン、神経伝達物質および糖タンパク質；染料；散瞳化合物
；気管支拡張剤；局所麻酔剤などが挙げられるが、これらに限定されるものでは
ない。特に興味深い第2の薬物は、(i)抗腫瘍剤、たとえば、アントラサイリン誘
導体、シスプラチン、パクリタキセル、5-フルオロウラシル、エキシスリンド(e
xisulind)、シスレチノイン酸、スルジナック(suldinac)スルフィドおよびビン
クリスチン、(ii)抗生物質および抗真菌剤、ならびに(iii)抗炎症剤、たとえば
、ステロイドおよび非ステロイドから選択される。特に、ステロイドはまた、リ
ポソームに対して安定化作用を有することができる。

【０１０１】 本発明はまた、診断用組成物と医薬との組み合わせとしての、本明細書に記載
されている任意の脂質ベースの画像強調系の使用、ならびに哺乳動物組織におい
て細胞外ホスホリパーゼA2活性の局所的増加に関連づけられる疾患または状態の
治療用の医薬を調製するための、本明細書に記載されている任意の脂質ベースの
画像強調系の使用に関する。そのような疾患または状態は、典型的には、癌、た
とえば、脳、乳房、肺、大腸、卵巣の癌、または白血病、リンパ腫、肉腫、癌腫
および炎症状態から選択される。

【０１０２】医薬調製物および診断的使用 また、製薬上許容される担体、脂質誘導体および標識を含む医薬組成物がこれ
とともに提供される。

【０１０３】 「製薬上許容される担体」とは、本明細書中で使用する場合、ヒトを含めて哺
乳動物に、リポソーム薬物製剤を含めて脂質およびリポソームを投与することに
関連した使用で、一般に許容しうる媒質である。

【０１０４】 製薬上許容される担体は、一般的には、当業者が決定および説明を十分に行え
る範囲内にあるいくつかの因子に応じて製剤化される。こうした因子としては、
特定の脂質コンジュゲート化コントラスト剤および/または使用する第2の薬物、
リポソーム調製物、その濃度、安定性および目標の生物学的利用能；リポソーム
組成物で処置される疾患、障害または状態;被験者、その年齢、大きさおよび全
身状態；ならびに対象への組成物の投与経路、たとえば、経鼻、経口、経眼、皮
下、乳腺内、腹腔内、静脈内、または筋肉内が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。非経口薬物投与で使用される典型的な製薬上許容される担体と
しては、たとえば、5重量体積%のデキストロースを含有する水溶液D5Wおよび生
理食塩水が挙げられる。製薬上許容される担体は、追加の成分、たとえば、保存
剤や酸化防止剤のような含まれる有効成分の安定性を増大させる成分を含有する
ことができる。

【０１０５】 リポソームまたは脂質誘導体は、典型的には、製薬上許容される水性媒質など
の分散媒中に製剤化される。

【０１０６】 通常の診断用途では、標識を含む所定量の組成物、典型的には哺乳動物の体重
1kgあたり約0.1〜約1000mgの脂質誘導体が、好ましくは静脈内に、投与される。

【０１０７】 医薬組成物は、好ましくは、従来の無毒の製薬上許容される担体および佐剤を
含有する製剤またはたとえば好適な送達デバイスもしくはインプラントの形態で
、注射、注入もしくは埋植(静脈内、筋肉内、関節内、皮下など)により非経口的
に投与される。

【０１０８】 そのような組成物の処方および調製については、製薬技術分野の当業者には周
知である。特定の処方に関しては、「Remington's Pharmaceutical Sciences」
という題名の教本中に見いだすことができる。

【０１０９】 したがって、本発明に係る医薬組成物は、無菌注射剤の形態で脂質ベースの系
を含有しうる。そのような組成を調製するために、好適な脂質コンジュゲート化
コントラスト剤を非経口的に許容しうる液体ビヒクル中に分散させる。この液体
ビヒクルには、便宜上、懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、pH調節剤および/また
は分散剤が含まれていてもよい。利用することのできる許容しうるビヒクルには
、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウムもしくは好適な緩衝剤の添加により好
適なpHに調節された水、1,3-ブタンジオール、リンゲル溶液および等張食塩水が
ある。水性製剤にはまた、1種以上の保存剤、たとえば、メチル、エチルもしく
はn-プロピルp-ヒドロキシ安息香酸エステル)が含まれていてもよい。

【０１１０】 腫瘍または新生物の診断が望まれる場合、リポソームに取り込まれた標識を血
流を介して効果的に送達するには、リポソームが連続的(しかし「漏出性」)内皮
層およびに腫瘍に血液を供給する血管を取り囲む下側基底膜を透過できることが
必要である。より小さなサイズのリポソームは、内皮細胞バリヤーおよび腫瘍細
胞と毛細管とを分離する下側基底膜を通って腫瘍中に管外遊出させるのにより有
効であることがわかった。

【０１１１】 本明細書中で使用する場合、「充実性腫瘍」とは、血流以外の解剖学的部位で
増殖する腫瘍を指す(白血病のような血液由来の腫瘍とは対照的である)。充実性
腫瘍では、増殖腫瘍組織に栄養補給するために小血管および毛細管の形成が必要
となる。

【０１１２】 本発明によれば、選択された標識は、本発明に従ってリポソーム内に閉じ込め
られ；リポソームは、内皮および基底膜のバリヤーを透過する公知のサイズに製
剤化される。得られたリポソーム製剤は、そのような処置の必要な被験者に非経
口的に、好ましくは静脈内投与により投与することができる。腫瘍増殖領域の血
管の透過性の急激な増加によって特性づけられる腫瘍は、本発明の方法による処
置に特に適している。リポソームは、最終的には、腫瘍部位でのリパーゼの作用
によって分解されるか、またはたとえば熱もしくは超音波の照射によって透過性
になりうる。次に、標識は、生物学的に利用可能かつ輸送可能な可溶化された形
で放出される。たとえ標識が放出されないとしても、リポソームが対象の組織に
濃縮されるという事実だけで、診断を行うことが可能である。さらに、疾患組織
でしばしば見られるような温度の小さな上昇は、細胞外PLA₂の刺激をさらに増大
させる可能性がある。

【０１１３】 診断される疾患または状態は、哺乳動物中で増大されたPLA₂レベルを有するこ
とにより特性づけられる。この増大は、多くの場合、たとえば、脳癌、乳癌、肺
癌、大腸癌、卵巣癌、リンパ腫、肉腫および癌腫からなる群より選択される悪性
組織によって惹起される。悪性組織は、典型的には原発性腫瘍である。このほか
、悪性組織は、原発性腫瘍を起源とする転移細胞である。

【０１１４】 炎症の部位特異的ターゲッティングが望まれる場合、標識の効果的なリポソー
ム送達を行うために、リポソームは長い血中半減期を有し、連続的な内皮細胞層
および炎症部位に隣接する血管を取り囲む下側基底膜を透過できることが必要で
ある。より小さなサイズのリポソームは、内皮細胞バリヤーを通って関連する炎
症領域に管外遊出させるのに有効であることがわかった。しかしながら、従来の
小さなリポソーム調製物では標識保有容量に限りがあるので、そのような目的に
対する有効性にも限界があった。

【０１１５】 本発明によれば、選択された標識は、本発明に従ってリポソーム内に閉じ込め
られ；リポソームは、内皮および基底膜のバリヤーを透過する公知のサイズに製
剤化される。得られたリポソーム製剤は、診断対象の被験者に非経口的に、好ま
しくは静脈内投与により投与することができる。炎症領域の血管の透過性の急激
な増加によって特性づけられる炎症領域は、本発明の方法によるターゲッティン
グに特に適している。

【０１１６】 細胞外PLA₂の活性は癌、炎症などを患った哺乳動物体の領域で異常に高いこと
が知られている。本発明は、この事実を利用する方法を提供するものであり、細
胞外PLA₂活性は、対照の正常領域と比較して体の疾患領域において少なくとも25
%高くなければならないと考えられる(細胞外環境中で測定される)。しかしなが
ら、細胞外PLA₂活性のレベルは多くの場合かなり高く、たとえば、少なくとも10
0%、たとえば、少なくとも200%、たとえば、少なくとも400%高いと見積もられる
。このことは、「正常」レベルの細胞外PLA₂活性を有する組織に及ぼす影響を最
小限に抑えつつ、哺乳動物の診断を行うことができることを意味する。

【０１１７】 標識は、陽電子放射断層撮影(PET)、X線、ガンマシンチグラフィー、磁気共鳴
（MR）イメージング、コンピューター断層撮影（CT）イメージングおよび超音波
検査からなる群より選択される検出方法によって検出可能および場合により定量
可能であるように適用することができる。 本発明を、以下の非限定的実施例によって説明する。

【０１１８】

【実施例】

これらの実施例では、リポソーム調製物の調製および試験について具体的に説
明する。診断用途の組成の調製物は、この記載内容に従って作製することができ
る。

【０１１９】実施例1 リポソームの調製 狭いサイズ分布を有する十分に水和させた単ラメラリポソームを、1-O-ヘキサ
デシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1-O-DPPC)およびジ-
ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)から作製した。DPPCはAva
nti Polar lipidsから入手したものであり、1-O-DPPCは我々の実験室で合成した
ものである。簡潔に述べると、秤量済みDPPCまたは1-O-DPPCをクロロホルムに溶
解させた。N₂の穏やかな気流により溶媒を除去し、脂質皮膜を低圧下で一晩乾燥
させて微量の溶媒を除去した。150mM KCL、10mM HEPES(pH=7.5)、1mM NaN₃、30
μM CaCl₂および10μM EDTAを含有する緩衝液中に乾燥させた脂質を分散するこ
とにより、多重ラメラ小胞を作製した。Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta
, 858, 161-168に記載されているように、2重の100nm 細孔径ポリカーボネート
フィルターを通して多重ラメラ小胞を10回押出した。

【０１２０】 0.34mLのセル体積を有するパワー補償タイプ（the power compensating type
）のN-DSC II示差走査熱量計(Calorimetry Sciences Corp., Provo)を用いて熱
容量曲線を得た。走査前、開始温度の熱量計中でリポソーム懸濁液を50分間平衡
化させた。+10℃/時間の走査速度を使用した。脂質濃度は1mMであった。1-O-DPP
CおよびDPPCに対する図1aおよび1b(上側の曲線)に示される熱容量曲線中の狭い
ピークに反映されているように、多重ラメラリポソーム(MLV)のゲルから流体へ
の転移は、鋭い一次転移として特性づけられる。鋭いピークは、多重ラメラリポ
ソームの転移挙動を反映しており、押出された単ラメラの1-O-DPPCおよびDPPCリ
ポソームについて図1aおよび1b(下側の曲線)に示すように、単ラメラリポソーム
(LUV)(Pedersen et al., 1996, Biophys. J. 71, 554-560)で観測されたゲルか
ら流体へのより幅の広い転移とは対照的である。

【０１２１】実施例2 ホスホリパーゼA ₂ の反応プロフィールおよび遅延時間測定 精製済みヘビ毒ホスホリパーゼA₂(Agikistrodon piscivorus piscivorus由来
のPLA₂)を、Maraganore et al., J. Biol. Chem. 259, 13839-13843の手順に従
って単離した。このPLA₂酵素は、脂質-膜境界面におけるホスホリパーゼ触媒加
水分解の共通した分子機構を示す、ヒト細胞外ホスホリパーゼA₂に対して構造的
類似性を示す低分子量14kD分泌酵素のクラスに属する (Wery et al., Nature 35
2, 79-82; Hoenger et al. Biochemistry 35, 9003-9006; Vermehren et al, Bi
ochimica et Biophysica Acta 1373, 27-36)。上述したように、狭いサイズ分布
を有する十分に水和させた単ラメラリポソームを、1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサ
デカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1-O-DPPC)から調製すると共に、5およ
び10モル% 1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-snグリセロ-3-ホスホエタノ
ールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-350](1-O-DPPE-PEG35O)また
は5および10モル% 1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホス
ホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](1-O-DPPE-PE
G2000)を有する1-O-DPPGから調製した。図2に示したPLA₂反応時間プロフィール
および表2に報告した遅延時間および加水分解パーセントについてのアッセイ条
件は、次のとおりであった：0.15mM 単ラメラリポソーム、150nM PLA₂、150mM K
CL、10mM HEPES(pH 7.5)、1mM NaN₃、30μM CaCl₂、および10μM EDTA。

【０１２２】

【表２】 触媒反応を、PLA₂の添加前に800秒間平衡化させた2.5mlのサーモスタット制御
リポソーム懸濁液(0.150mM)に8.9μLの42μM PLA₂(150nM)原液を添加することに
より開始した。リポソームに対するPLA₂の特徴的な遅延-バースト挙動は、285nm
で励起した後の340nmにおけるPLA₂からの固有蛍光の突然の増加およびそれに続
く、それに付随する脂質懸濁液からの90°光散乱の減少により示される (Hoenge
r et al., Biochemistry 35, 9003-9006)。PLA₂の添加前および観測された遅延
時間の1200秒後に、加水分解されずに残存した1-O-DPPCの量および生成した1-O-
ヘキサデシル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(リゾ-1-O-PPC)の量を
HPLC分析するためのサンプルを採取した。脂質懸濁液から100μl アリコートを
抜き取り、酵素反応を停止するために、1ml クロロホルム/メタノール/酢酸(2:4
:1)溶液とすばやく混合した。溶液を1mlの水で洗浄し、20μlの重質有機相をHPL
Cに使用した。図3のHPLCクロマトグラムは、リポソーム懸濁液にPLA₂(t=800秒)
を添加する前および添加した後(t=2050秒)の1-O-DPPCの量を示している。5μmジ
オールカラム、クロロホルム/メタノール/水(730:230:30,v/v)から構成された移
動相および蒸発光散乱検出器を用いてHPLC分析を行った。1-O-DPPCからリゾ-1-O
-PPCへのPLA₂触媒脂質加水分解の代謝回転をHPLCにより測定した(表1参照)。図2
に示すように酵素の固有蛍光および90°光散乱を時間の関数として測定した。

【０１２３】実施例3 取り込まれた水溶性モデル薬物および/またはコントラスト剤のホスホリパーゼA ₂誘導放出 多重ラメラ1-O-DPPCリポソームを、相転移温度よりも10℃高い温度においてpH
=7.5のHEPES緩衝液中で1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-
ホスホコリンの皮膜を1時間水和させることにより、20mMの自己消光濃度の蛍光
性カルセインの存在下で作製した。単ラメラリポソームを、2重の100nmポリカー
ボネートフィルターを通して多重ラメラリポソームを10回押出すことにより作製
した。単ラメラリポソームを転移温度未満の温度まですばやく冷却し、Sephadex
G-50を充填したクロマトグラフィー用カラムを用いて、カルセイン含有1-O-DPP
Cリポソームを遊離カルセインから分離した。

【０１２４】 PLA₂誘発カルセイン放出のためのアッセイ条件は、25μM 単ラメラ1-O-DPPC-
リポソーム、25nM PLA₂、150mM KCL、10mM HEPES(pH 7.5または8.0)、1mM NaN₃
、30μM CaCl₂、および10μM EDTAであった。PLA₂は、PLA₂の添加前に37℃で少
なくとも20分間平衡化させた2.5mlのサーモスタット制御1-O-DPPC-リポソーム懸
濁液に900秒の時点で添加した。放出されたカルセインのパーセントは、放出%=1
00×(I_F(t)-I_B)/(I_T-I_B)として決定する。式中、I_F(t)は、酵素添加後の時間tで
測定された蛍光であり、I_Bは、バックグラウンド蛍光であり、I_Tは、1-O-DPPC-
リポソームを破壊することによりカルセインの完全放出を引き起こすTriton X-1
00の添加後に測定された全蛍光である。図4に示すように、PLA₂は、1-O-DPPC-リ
ポソーム中の閉じ込められたカルセインの90パーセントの全放出を誘導した。

【０１２５】実施例4 ホスホリパーゼA ₂ により制御される、標的モデル膜の透過性の増大 多重ラメラモデル膜標的リポソームを、相転移温度(Tm=55℃)よりも10℃高い
温度においてpH=7.5のHEPES緩衝液中で1,2-O-ジオクタデシル-sn-グリセロ-3-ホ
スファチジルコリン(D-O-SPC)の皮膜を1時間水和させることにより、20mMの自己
消光濃度の蛍光性カルセインの存在下で作製した。単ラメラリポソームを、2重
の100nmポリカーボネートフィルターを通して多重ラメラ標的リポソームを10回
押出すことにより作製した。単ラメラリポソームを転移温度未満の温度まですば
やく冷却し、Sephadex G-50を充填したクロマトグラフィー用カラムを用いて、
カルセイン含有リポソームを遊離カルセインから分離した。上述したように1-O-
ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンから構成された
単ラメラ担体リポソームを調製した。492nmで励起した後の520nmの蛍光強度を測
定することにより、標的リポソームからのカルセイン放出を測定する。

【０１２６】 D-O-SPCリポソームおよび1-O-DPPCリポソームの濃度は、25μMであった。ヘビ
毒PLA₂(Agkistrodon piscivorus piscivorus)を添加(25nM)して加水分解の反応
を開始し、1-O-ヘキサデシル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(リゾ-
1-O-PPC)および脂肪酸加水分解生成物を生成させた。標的脂質膜中への非二重層
形成性リゾ-1-O-PPCおよび脂肪酸加水分解生成物の取り込みにより、カルセイン
がD-O-SPCリポソームから放出されるので、図5に示すように、カルセインが周辺
の緩衝液媒質中に希釈され、492nmで励起した後の520nmの蛍光の直線的増加が観
測される。放出されたモデル薬物および/またはコントラスト剤であるカルセイ
ンのパーセントを上述したように決定する(実施例3を参照)。

【０１２７】実施例5 溶血アッセイ 狭いサイズ分布を有する十分に水和させた単ラメラリポソームを、1-O-ヘキサ
デシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1-O-DPPC)から調製す
ると共に、5モル% 1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホス
ホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-350](1-O-DPPE-PEG
35O)または5モル% 1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホス
ホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000(1-O-DPPE-PEG
2000)を有する1-O-DPPCから調製した。リン酸緩衝食塩水(PBS)中で脂質を水和さ
せた。対照として、PBS中の1-O-オクタデシル-2-O-メチル-sn-グリセロ-3-ホス
ホコリン(ET-18-OCH₃)をアッセイに組み入れた。

【０１２８】 溶血アッセイを、Perkins et al., Biochim. et Biophys. Acta 1327, 61-68
に記載されるように行った。簡潔に述べると、それぞれのサンプルをPBSで連続
希釈し、1-O-DPPCリポソームの各希釈懸濁液0.5mlを0.5mlの洗浄済みヒト赤血球
(RBC)[PBS中4%(v/v)]と混合した。対照用として、0.5mlの赤血球懸濁液を0.5ml
の緩衝液(負の溶血対照)または0.5mlの水(正の溶血対照)のいずれかと混合した
。サンプルおよび標準を37℃インキュベーターに入れて、20時間攪拌した。管を
低速度(2000×G)で10分間遠心し、RBCペレットを形成させた。200μlの上清を、
Perkin-Elmer 320の走査分光光度計を用いて550nmにおける吸光度によって定量
した。100パーセントの溶血は、界面活性剤トリトンX-100から得られた最大の量
の溶血として定義した。図6の溶血プロフィールは、2mM 1-O-DPPCリポソームに
ついて溶血値が低い(5%未満) ことを示している。図6はまた、低濃度のET-18-OC
H₃が著しい溶血を引き起こすことを示している。

【０１２９】実施例6 ポリマーグラフト化1-O-DPPC脂質によるホスホリパーゼA2活性の増強 実施例2に記載されているように、狭いサイズ分布を有する十分に水和させた
単ラメラリポソームを、1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-
ホスホコリン(1-O-DPPC)から調製すると共に、5または10モル% 1-O-ヘキサデシ
ル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(
ポリエチレングリコール)-350](1-O-DPPE-PEG35O)を有する1-O-DPPCから調製し
た。PLA₂遅延時間測定のためのアッセイ条件は、0.15mM 単ラメラリポソーム、1
50nM PLA₂、150mM KCL、10mM HEPES(pH 7.5)、1mM NaN₃、30μM CaCl₂および10
μMのEDTAであった。触媒反応は、PLA₂の添加前に41℃で800秒間平衡化させた2.
5mlのサーモスタット制御リポソーム懸濁液に8.9μLの42μM PLA₂原液を添加す
ることにより開始した。急激な酵素活性の出現までの経過時間を、285nmで励起
した後の340nmにおけるPLA₂からの固有蛍光の突然の増加により測定する。図7に
示す結果は、5および10モル%の1-O-DPPE-PEG₃₅₀を1-O-DPPCリポソームに組み込
んだ場合、遅延時間が著しく減少することを示している。

【０１３０】実施例7 1-O-DPPE-PEG350、DSPE-PEG750および1-O-DPPE-PEG2000から構成されたミセルの 調製 ミセルを、1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタ
ノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-350](1-O-DPPE-PEG350)、
ジ-オクタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポ
リエチレングリコール)-750(DSPE-PEG75O)または1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデ
カノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレング
リコール)-2000(1-O-DPPE-PEG2000)から作製した。簡潔に述べると、秤量したポ
リマー脂質をクロロホルムに溶解させた。N₂の穏やかな気流により溶媒を除去し
た。次に、低圧下で脂質皮膜を一晩乾燥させ、微量の溶媒を除去した。ミセルは
、150mM KCL、10mM HEPES(pH=7.5)、1mM NaN₃、30μM CaCl₂および10μM EDTAを
含有する緩衝液中に乾燥ポリマー脂質を分散することにより作製した。

【０１３１】実施例8 ミセルのホスホリパーゼA ₂ 加水分解により制御された標的モデル膜の透過性増大 多重ラメラモデル膜標的リポソームを、相転移温度(Tm=55℃)よりも10℃高い
温度においてpH=7.5のHEPES緩衝液中で1,2-O-ジオクタデシル-sn-グリセロ-3-ホ
スファチジルコリン(D-O-SPC)の皮膜を1時間水和させることにより、20mMの自己
消光濃度の蛍光性モデル薬物および/またはコントラスト剤であるカルセインの
存在下で作製した。単ラメラリポソームを、2重の100nmポリカーボネートフィル
ターを通して多重ラメラリポソームを10回押出すことにより作製した。単ラメラ
リポソームを転移温度未満の温度まですばやく冷却し、Sephadex G-50を充填し
たクロマトグラフィー用カラムを用いて、カルセイン含有リポソームを遊離カル
セインから分離した。1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホ
スホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-350](1-O-DPPE-P
EG350)、ジ-オクタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メト
キシ(ポリエチレングリコール)-750](DSPE-PEG750)または1-O-ヘキサデシル-2-
ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエ
チレングリコール)-2000](1-O-DPPE-PEG2000)から構成されたミセルを、実施例7
に記載したように調製した。標的リポソームからのカルセイン放出は、492nmで
励起した後の520nmの蛍光強度を測定することにより測定する。

【０１３２】 D-O-SPCおよびポリマー脂質ミセルの濃度は、25μMであった。ヘビ毒PLA₂(Agk
istrodon piscivorus piscivorus)を添加(25nM)して加水分解の反応を開始し、
加水分解生成物であるリゾ-1-O-PPEおよび遊離脂肪酸を即座に生成させた。標的
脂質膜中への非二重層形成性リゾ-1-O-脂質および脂肪酸の取り込みにより、カ
ルセインがD-O-SPCリポソームから放出されるので、図8に示すように、カルセイ
ンが周辺の緩衝液媒質中に希釈され、492nmで励起した後の520nmの蛍光の直線的
増加が観測される。放出されたカルセインのパーセントは実施例3に記載したよ
うに決定する。1-O-DPPE-PEG350のPLA₂触媒加水分解では放出速度が最も速かっ
たのに対して、ヘッド基に結合された最長のポリマー鎖(PEG2000)を有するDPPE
では放出速度が最も遅かった。

【０１３３】実施例9 DSPE-PEG750から構成されたミセルの加水分解 DSPE-PEG750から構成されたミセルの加水分解に続いて、生成したステアリン
酸の量を分析した。触媒反応を、PLA₂の添加前に45℃で600秒間平衡化させたDSP
E-PEG750のサーモスタット制御ミセル懸濁液(0.150mM) 2.5mlに8.9μLの42μM P
LA₂(150nM)原液を添加することにより開始した。ミセルに対するPLA₂の特徴的な
バースト挙動は、285nmで励起した後の340nmにおけるPLA₂からの固有蛍光の突然
の増加およびそれに続く、それに付随する脂質懸濁液からの90°光散乱の減少に
より示される(Hoenger et al., Biochemistry 35, 9003-9006)。生成したステア
リン酸の量をHPLC解析するためのサンプルを、PLA₂の添加前および観測された遅
延時間の100秒後に採取した。図9のHPLCクロマトグラムは、45℃で観測された遅
延時間(10秒)の100秒後のステアリン酸の生成量を示している。加水分解により
生成したステアリン酸の量 (0.156mM)は、DSPE-PEG750ポリマー-脂質を100％加
水分解した場合と同じであった。HPLC分析は、5μmジオールカラム、クロロホル
ム/メタノール/水(730:230:30,v/v)からなる移動相および蒸発光散乱検出器を用
いて行った(実施例2参照)。

【０１３４】実施例10 モデル例 ポリマー被覆リポソームは、長い血管循環時間および疾患組織中の漏出性血管
による受動的ターゲッティングに基づいて汎用性のある標識送達系として機能す
ることができる。この実施例では、実験モデル系について記載することにより、
疾患のある標的組織における細胞外ホスホリパーゼA₂の増大した活性を利用する
改良されたプログラム可能な薬物および/またはコントラスト剤送達の新しい原
理を説明する。ホスホリパーゼA₂は、担体リポソーム中の脂質ベースのプロエン
ハンサーを加水分解してリゾ-リン脂質および遊離脂肪酸を生成する。これらは
相乗的に作用して、標的膜の透過性を増大させると同時に、リポソームの不安定
化および薬物の放出を増大させることが示されている。提案された系は感温性に
することができ、そして炎症組織、感染組織、または癌組織のような疾患のある
標的部位でのみホスホリパーゼA₂により自発的に活性化される特異的な脂質ベー
スのプロエンハンサー、プロ不安定化剤またはプロドラッグを担体中に組み込む
ことによって優れたリポソームベースの薬物および/またはコントラスト剤送達
系を開発する合理的な方法を提供する。

【０１３５】 薬物および/またはコントラスト剤は、リポソーム担体の改変された薬物動態
を利用して、原理的には、リポソーム担体および標的膜での各部位における物理
化学的および病態生理学的な因子の組み合わせを利用することにより、疾患組織
にターゲッティングすることができる。糖脂質またはリポポリマーの組み込まれ
たリポソーム、たとえば、リポソームとして知られるポリエチレングリコール(P
EG)-脂質は、おそらくポリマー被覆により生じる立体的保護によって、血管系に
おいて改良された安定性を呈する。これらのリポソームの循環時間の長期化と疾
患組織の血管多孔性の増大とが組み合わされていることが、イメージング目的の
特異的なコントラスト剤の送達系(たとえば、MnベースのMRイメージング剤)のみ
ならず、ドキソルビシンのような抗癌剤並びに抗菌剤及び抗炎症剤を含む特異的
な系についての臨床結果が肯定的であることの基盤となっている。Niesman et a
l., J. Liposome Res. 4, 939-957; Koenig and Brown, Invest. Radiol. 20, 2
97; Basic et al., Magn. Reson. Med. 13, 44-61; Niesmam et al., Invest. R
adiol. 25, 545-551。

【０１３６】 リポソームは自己集合した脂質系であり、したがって、その安定性は、かなり
の程度まで、非特異的物理的相互作用によって支配される。したがって、リポソ
ームの物理的性質の分子制御について洞察することは、特異的薬物送達目的に関
連させてリポソームの性質を操作および調節するうえで重要である。たとえば、
高温により薬物放出を高めるための系をデザインするために、熱誘起ゲル-流体
脂質相転移の利用および最適化が行われている。最近、管外遊出により腫瘍部位
に蓄積されるリポソームの二重層安定化性脂質の時間遅延放出を用いて、抗癌剤
ミトキサントロンを含有するプログラム可能な膜融合PEG-リポソームが構築され
た。望ましくは、(i) 薬物放出の標的組織での選択的な増大と、(ii)薬物および
/またはコントラスト剤の疾患細胞への輸送の増大とを同時に引き起こすデュア
ルバーチャルトリガー機構(dual virtual trigger mechanism)を内蔵した高機能
で汎用性のある薬物および/またはコントラスト剤送達系をデザインできればよ
い。この原理を図11.aに模式的に示す。

【０１３７】 この実施例では、病的標的部位で開始されるそのようなデュアル機構を保持す
る単純で機能的な実験のための生物物理学的モデル系の開発について説明する。
このモデルは、細胞外PLA₂のレベルが何倍にも増大する可能性のある炎症組織お
よび癌組織の場合のような、疾患部位における細胞外ホスホリパーゼA₂の活性の
増大を前提とする。PEGリポソームのリン脂質は、細胞外PLA₂に曝露されると、
従来の裸のリポソームと比較してより盛んに加水分解を受けることが判明した。
これは、リポソームの不安定化および取り込まれている薬物の放出の増大を引き
起こす。続いて、加水分解生成物であるリゾ-リン脂質および遊離脂肪酸が、薬
物および/またはコントラスト剤の標的膜を横切る透過に対して吸収エンハンサ
ーとして作用する。このようにして、担体リポソームのリン脂質は、担体の部位
ではプロ不安定化剤として、標的膜の部位ではプロエンハンサーとして作用する
。この原理の分子レベルでの説明を図11.bで模式的に示す。

【０１３８】 この実験的モデル系は、裸のリポソーム、ポリマー被覆リポソーム担体および
モデル標的膜からなる。担体は、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミ
ン(DPPE)-PEG2000タイプである、2.5モル%リポポリマーを有するジパルミトイル
ホスファチジルコリン脂質(DPPC)から作製した100nm単ラメラリポソームである
。標的膜は、ステアロイル鎖のアシル結合がエーテル結合であるリン脂質1,2-O-
ジオクタデシル-sn-グリセロ-ホスファチジルコリン(D-O-SPC)から作製した別の
リポソームである。DPPCとは対照的に、D-O-SPCは、PLA2触媒加水分解に対して
不活性であるため、自己の酵素による分解により損傷を受けないという標的細胞
膜の安定性を模擬する。担体リポソームにおける不安定化剤の作用と標的膜にお
けるエンハンサーの作用とを同時におよび別々に調べることのできるこの実験的
アッセイには、自己消光濃度の水溶性蛍光性カルセインモデル薬物および/また
はコントラスト剤を担体リポソーム中ではなく非加水分解性標的リポソームの内
部に閉じ込めることが含まれる。次に、細胞外PLA₂を添加することで標的膜にお
ける細胞外PLA₂のレベルの増大をシミュレートして、担体リポソームおよび標的
リポソームの懸濁液中で加水分解反応を開始させることができる。続いて、カル
セインのD-O-SPC標的膜を横切る透過を蛍光の増加によりモニターする。担体リ
ポソーム中のPEG-脂質の存在の影響を調べるために、肝臓や脾臓のようなマクロ
ファージに富んだRESの器官のターゲッティングに有利に使用することのできる
従来の裸のDPPCリポソームを用いて類似の実験を行った。さらに、リゾ-リン脂
質の透過性増大作用と遊離脂肪酸の透過性増大作用とを比較および識別するため
に、リゾ-リン脂質および遊離脂肪酸を同時にまたは別々に標的リポソームに添
加して、酵素を用いずに実験を行った。

【０１３９】 図12.aには、系にPLA₂を添加した後のカルセイン放出の結果を時間の関数とし
て示す。使用した特定のPLA₂の反応時間過程は、酵素活性の尺度として便利に使
用することのできるいわゆる遅延時間を伴う特徴的な遅延-バースト挙動を有す
る。ポリマー被覆リポソームの細胞外PLA₂による分解の増大についての先の知見
と同じく、担体リポソームがリポポリマーDPPE-PEG2000を含む場合、遅延時間の
劇的な減少およびそれに付随する放出速度の増大が観測される。

【０１４０】 これらの結果から、DPPCリポソーム担体のDPPC脂質のPLA₂触媒加水分解の生成
物として1:1混合物の形で生成されるリゾリン脂質および遊離脂肪酸は、標的膜
中に組み込まれて、膜透過性を大きく増大させることが示唆される。きわめて低
い水溶性を有するこれらの生成物は、非円筒状の分子形状をもつことから、膜中
に湾曲応力場を生じさせるかまたは小規模の横方向相分離を誘起して、膜の欠陥
および増大された透過性をもたらすことが知られている。このことは図13のデー
タによって実証される。このデータからわかるように、この標的系にリゾリン脂
質または脂肪酸をPLA₂の不在下で別々に添加すると、カルセインの標的膜を横切
っての放出の速度が増大する。しかしながら、きわめて重要な発見として、リゾ
リン脂質および遊離脂肪酸を1:1混合物として同時に添加すると、図13に示すよ
うに、放出速度の劇的な増大が観測される。このことは、2種のエンハンサーは
相乗的に作用することを強く示唆しており、担体リポソームの不安定化と標的膜
を横切る薬物輸送の増大とを組み合わせるべくPLA₂触媒加水分解を利用すること
に特有の可能性があることが強調される。この相乗効果は、細胞外PLA₂が自己の
加水分解生成物により活性化されるという事実によってさらに裏づけられる。こ
のことから担体リポソームの分解性リン脂質が一種のプロアクチベーターとして
機能することはあきらかである。

【０１４１】 この薬物および/またはコントラスト剤送達モデル系において細胞外PLA₂活性
を介してプロエンハンサーおよびプロ不安定化剤として脂質を使用する効果は、
一定したものではなく固有の時間的尺度に左右されることを指摘しておかなけれ
ばならない。この時間的尺度とは、標的膜近傍での担体リポソームの有効滞留時
間である。より迅速に酵素が活性化されるほど、薬物および/またはコントラス
ト剤の放出は速くなり、担体が標的近傍に存在する間の薬物および/またはコン
トラスト剤の吸収は増大する。さらに、より迅速に酵素が作用するほど、疾患の
ある標的部位に接近した他の薬物含有リポソームの加水分解に利用されやすくな
る。細胞外PLA₂活性を薬物放出の制御に利用できることがあきらかになれば、該
酵素が感受性を示すことが知られている脂質二重層の物理的性質を操作すること
により、細胞外PLA₂活性を変化させる周知の機構を使用して、提案された薬物お
よび/またはコントラスト剤送達系を巧妙に改良するためのいくつかの合理的な
道が開かれる。したがって、その戦略は、血管循環時間を顕著に変化させること
なく、担体リポソームの特定の物理的性質を改変することである。我々は、物理
化学的因子である担体の脂質組成と環境(熱力学的)因子である標的部位の局所的
温度との両方の影響を実証することにより、この一般的原理について説明する。

【０１４２】 ジデカノイルホスファチジルコリン(DCPC)のような短鎖リン脂質は、細胞外PL
A₂を活性化する。少量のDCPCを担体PEG-リポソームに導入することにより生じる
標的膜を横切るカルセイン透過に対する影響もまた、図12.aに示す。酵素がほと
んど瞬間的に活性化されるので、放出は非常に速い。我々はさらに、大量のコレ
ステロール(約20モル%)をリポソームに導入したときに細胞外PLA₂が失活するこ
とを見いだした(データは示していない)。これとは対照的に、我々は、少量のコ
レステロール(約3モル%)が細胞外PLA₂を活性化させることを見いだしている。PE
G-リポソームの血液循環時間はコレステロールがなくても大量のコレステロール
を用いたときとほとんど同じであると報告されているので、これらの顕著な発見
には特に関心がもたれる。

【０１４３】 温度は、飽和リン脂質二重層のゲル-流体相転移の領域において細胞外PLA₂の
活性化に対して劇的かつきわめて非線形的効果をもつことが知られている。この
効果は、酵素の変化によって生じるのではなく、脂質二重層の劇的な横方向の構
造変化によって生じる。図12.bのデータから示唆されるように、本発明の薬物お
よび/またはコントラスト剤送達系においてこの効果を利用することが可能であ
る。温度が41℃の転移温度に接近するにつれて、カルセイン放出の速度は徐々に
増大する。このことは、図12.bの挿入図に示す50%カルセイン放出時間t_50%によ
り定量化される。薬物放出を増大するために温熱療法を利用しうること、および
相転移点でリポソームの漏出性が増大されることを利用して薬物含有リポソーム
を局所的に不安定化させるために所定の腫瘍領域の局所的加熱を使用しうること
がすでに示唆されている。本明細書で提案した新しいモデル薬物および/または
コントラスト剤送達系では、こうした感温性の可能性を、細胞外PLA₂の熱的感受
性を介して担体リポソームの物理的性質と組み合わせて十分に利用する。ある最
小サイズの所定の腫瘍部位における外部加熱源を用いた局所的温度上昇によって
熱効果が得られるにすぎない場合とは対照的に、PLA₂制御放出が、疾患領域のサ
イズとは無関係に、しかもあらかじめ疾患組織の位置を特定する必要もなく、温
度と細胞外PLA₂濃度とが高くなるすべての領域で、たとえば、炎症組織で、増大
するであろう。

【０１４４】 DPPC、DCPC、D-O-SPC、およびDPPE-PEG₂₀₀₀は、Avanti Polar Lipidsから入手
した。DPPE-PEG₂₀₀₀リポポリマーは、PEGポリマー鎖中に45個のモノマーを含有
している。精製ヘビ毒PLA₂(Agkistrodon piscivorus piscivorus)は、R. L. Bil
tonen博士からの寛大なる贈り物であった。このPLA₂酵素は、ヒト細胞外ホスホ
リパーゼA₂との構造的類似性を示す低分子量の14kD分泌酵素クラスに属する。多
重ラメラ標的リポソームを、相転移温度T_m=55℃よりも10℃高い温度においてpH=
7.5のHEPES緩衝液中でD-O-SPCの皮膜を1時間水和させることにより、20mMの自己
消光濃度の蛍光性カルセインの存在下で作製した。単ラメラリポソームを、2重
の100nmポリカーボネートフィルターを通して多重ラメラリポソームを10回押出
すことにより作製した。単ラメラリポソームを転移温度未満の温度まですばやく
冷却し、Sephadex G-50を充填したクロマトグラフィー用カラムを用いて、カル
セイン含有リポソームを遊離カルセインから分離した。同じようにして、DPPC、
DCPCおよびDPPE-PEG₂₀₀₀の単ラメラ担体リポソームを調製した（T_m=41℃)。492n
mで励起した後に520nmの蛍光強度を測定することにより、標的リポソームからの
カルセイン放出を測定する。測定はすべて、担体と標的の両方のリポソームの脂
質がゲル状態にある温度で行う。

【０１４５】実施例11 ホスホリパーゼA ₂ 濃度依存性放出のアッセイ 10モル% 1-O-DPPE-PEG350を有する多重ラメラ1-O-DPPCリポソームを、相転移
温度よりも10℃高い温度においてpH=7.5のHEPES緩衝液中で90%の1-O-ヘキサデシ
ル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンおよび10%の1-O-ヘキサデ
シル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ
(ポリエチレングリコール)-350]からなる皮膜を1時間水和させることにより、20
mMの自己消光濃度の蛍光性カルセインの存在下で作製した。単ラメラリポソーム
を、2重の100nmポリカーボネートフィルターを通して多重ラメラリポソームを10
回押出すことにより作製した。単ラメラリポソームを転移温度未満の温度まです
ばやく冷却し、Sephadex G-50を充填したクロマトグラフィー用カラムを用いて
、カルセイン含有リポソームを遊離カルセインから分離した。

【０１４６】 PLA₂誘導カルセイン放出のためのアッセイ条件は、25μM単ラメラリポソーム
、50、1および0.02nM PLA₂、150mM KCL、10mM HEPES(pH 7.5)、1mM NaN₃、30μM
CaCl₂ならびに10μM EDTAであった。PLA₂は、PLA₂の添加前に35.5℃で少なくと
も300秒間平衡化させた2.5mlのサーモスタット制御脂質懸濁液に添加した。放出
されたカルセインのパーセントは、放出%=100×(I_F(t)-I_B)/(I_T-I_B)として決定
する。式中、I_F(t)は、酵素添加後の時間tで測定された蛍光であり、I_Bは、バッ
クグラウンド蛍光であり、I_Tは、1-O-DPPCリポソームを破壊することによりカル
セインの完全放出を引き起こすTriton X-100の添加後に測定された全蛍光である
。図14は、誘導されたカルセイン誘導放出が、リポソーム懸濁液にわずか0.02nM
のPLA₂を添加したときに最も遅かったことを示している。

【０１４７】実施例12 in vivo溶血 アッセイ マウスの群(n=5匹/群; 体重18〜22 g)を、緩衝液(PBS)、ET-18-OCH₃(50mg/kg)
、および5モル% 1-O-DPPE-PEG2000を有する1-O-DPPCから構成されたリポソーム(
68.7および137.5mg/kg)により静脈内注射処理した。注射の30分後、CO₂麻酔をか
けて断頭されたマウスから、ヘパリンの入った管に100μlの血液を直接採取した
。血液を500×Gで10分間遠心し、血漿を取り出し、分析にかけるまで-20℃で保
存した。

【０１４８】 溶血度を、Perkin-Elmer 320走査分光光度計を用いて550nmにおける吸光度に
より測定した。25μlの血漿を2.5mlのPBSまたは2.5mlの10%トリトンX-100と混合
した。100パーセント溶血を、PBSで処理したマウスの血漿を10%トリトンX-100と
混合して得られた最大溶血量と定義し、0パーセント溶血を、PBSで処理したマウ
スの血漿をPBSと混合して得られる溶血量と定義した。

【０１４９】 表3の溶血プロフィールは、5モル% 1-O-DPPE-PEG2000を有する1-O-DPPCから構
成された2mMリポソームで処理したマウスについては溶血値が低いことを示して
いる。ET-18-OCH₃で処理したマウスは、30分以内に死亡した。

【０１５０】

【表３】 本明細書中で使用する場合、「充実性腫瘍」とは、血流以外の解剖学的部位で
増殖する腫瘍を指す(白血病のような血液由来の腫瘍とは対照的である)。充実性
腫瘍では、増殖する腫瘍組織に栄養補給するために小血管および毛細管の形成が
必要となる。

【０１５１】実施例13 無細胞ラット腹膜液中のホスホリパーゼA ₂ による負に帯電したリポソームの加水 分解 カゼイン誘発急性炎症を有するラット由来の無細胞腹膜液を、体重250〜260g
のSRPD雄ラットの腹膜腔に5mlの1%カゼイン酸ナトリウムを注射することにより
調製した。24時間後、血液を抜き取ってラットを死亡させ、炎症流体 (inflamma
tory fluid) を腹膜から採取し、そして無細胞腹膜液を得るために1500Gで20分
間遠心した。

【０１５２】 狭いサイズ分布を有する負に帯電した十分に水和された単ラメラリポソームを
、89モル% ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DPPG)、10
モル% 1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノール
アミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-350](1-O-DPPE-PEG350)および1
モル% 1,2-ビス-(1-ピレンデカノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(ビス-py-D
PC)から調製した。ビス-py-DPCは、342nm励起で470nm発光を呈する励起状態二量
体(エキシマー)を形成する2個の隣接したピレン発蛍光団を有するPLA₂基質であ
る。ホスホリパーゼ触媒加水分解を受けると2個の発蛍光団は分離され、380nm発
光を呈するようになる(モノマー)。

【０１５３】 図15は、100nM PLA₂(Agkistrodon piscivorus piscivorus)の添加前および添
加後における負に帯電したリポソーム(0.100mM)に組み込まれたビス-py-DPCの34
2nmで励起した後に得られた発光スペクトルを示している。ホスホリパーゼ媒介
加水分解の後で観測される発光スペクトルの変化を、342nmで励起して、380nmの
モノマー発光と同時に470nmのエキシマー発光を測定する連続アッセイで使用す
る。図16は、負に帯電したリポソームのラットホスホリパーゼA₂触媒加水分解の
反応時間プロフィールを示す。触媒反応を、PLA₂の添加前に60秒間平衡化させた
2.5mlのサーモスタット制御リポソーム懸濁液に無細胞腹膜液を添加することに
より開始させた。ホスホリパーゼの特徴的な遅延-バースト挙動が、図16の挿入
図で示される380nmのモノマー蛍光の突然の増加およびそれに続くエキシマー蛍
光の減少により示唆される。

【０１５４】 図16に示すPLA₂反応時間プロフィールについてのアッセイ条件は、0.100mMの
負に帯電した単ラメラリポソーム、100μl 無希釈無細胞腹膜液、10mM HEPES(pH
7.5)、5mM CaCl₂、および150mM NaClであった。

【０１５５】 （参考文献） Torchilin, V. P. (1998) Liposomes as carriers of contrast agents for i
n vivo diagnostics. (in vivo診断用のコントラスト剤の担体としてのリポソー
ム) In: Lasic and Papahadjopoulos (eds.) Medical Applications of Liposom
es. Elsevier Science p.515-543. Kaiser, E. (1999) Phospholipase A2: its usefulness in laboratory diagn
ostics. (ホスホリパーゼA₂: 実験室診断におけるその有用性) Crit Rev Olin L
ab Sci 36(2):65-163

【図面の簡単な説明】

【図１】 示差走査熱量測定を用いて得られた熱容量曲線。(a) 1mM 1-O-ヘキサデシル-2
-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1-O-DPPC)から作製した多重ラ
メラMLV(上側の曲線)および単ラメラLUV(下側の曲線)のリポソーム。(b) ジパル
ミトイルホスファチジルコリン(DPPC)から作製したMLV(上側の曲線)およびLUV(
下側の曲線)のリポソーム。

【図２】 90% 1-O-DPPCおよび10% 1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-
3-フォスフォエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-350] (1
-O-DPPE-PEG350)から構成された単ラメラ1-O-DPPC-リポソームのホスホリパーゼ
A₂、PLA₂(A. piscivorus piscivorus)加水分解に対する41℃における特徴的な反
応時間プロフィール。酵素からの固有蛍光(実線)および脂質懸濁液からの90°静
的光散乱(破線)によってPLA₂加水分解反応をモニターする。平衡化されたリポソ
ーム懸濁液に800秒でPLA₂を添加した後、特徴的な遅延時間が続いてから触媒活
性の突然の増加が起こる。酵素添加前および観測された遅延時間の20分後にHPLC
用のサンプルを採取した。

【図３】 90% 1-O-DPPCおよび10% 1-O-DPPE-PEG35Oから構成されたリポソームのホスホ
リパーゼA₂加水分解の影響を示すHPLCクロマトグラム。クロマトグラムは、ホス
ホリパーゼA₂(A. piscivorus piscivorus)をリポソーム懸濁液に添加する前の1-
O-DPPCの量(100%、実線)および遅延バースト後の1-O-DPPCの量(75%、破線)を示
している。

【図４】 10mM HEPES緩衝液(pH 7.5)中に懸濁した25μM 1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサデ
カノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1-O-DPPC)から構成されたリポソームか
らの蛍光性モデル薬物および/またはコントラスト剤カルセインのPLA₂制御放出
を時間の関数として示したものである。25nM ホスホリパーゼA₂(A. piscivorus
piscivorus)を時間900秒で添加した。温度は37℃であった。放出されたカルセイ
ンのパーセントは、放出%=100(I_F(t)-I_B)/(I_T-I_B)として決定される。式中、I_{F( t)} は、酵素添加後の時間tで測定された蛍光であり、I_Bは、バックグラウンド蛍
光であり、I_Tは、リポソームを分解することによりカルセインの完全放出を引き
起こすTriton X-100の添加後に測定された全蛍光である。

【図５】 10mM HEPES緩衝液(pH 7.5)中に懸濁された25μM 1-O-ヘキサデシル-2-ヘキサ
デカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1-O-DPPC)から構成されたリポソーム
に関して、非加水分解性膜(図11b参照)である標的膜を横切る蛍光性カルセイン
のPLA₂制御放出を時間の関数として示したものである。25nM ホスホリパーゼA₂
を時間0秒で添加した。温度は37℃であった。放出されたカルセインのパーセン
トは、図4で記載したように決定する。

【図６】 100% 1-O-DPPC(正方形)；90% 1-O-DPPCおよび10% 1-O-DPPE-PEG35O(三角形)；
90% 1-O-DPPCおよび10% 1-O-DPPE-PEG2000(円形)ならびにET-18-OCH₃(菱形)から
構成されたリポソームの存在下における正常赤血球の溶血プロフィール。5%の溶
血(H₅)を生じる濃度は、100% 1-O-DPPCから構成されたリポソームの場合および9
0% 1-O-DPPCと10% DPPE-PEG350とから構成されたリポソームの場合、2mMをはる
かに超えていた。Perkins et al., 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1327
, 61-68の記載に従って溶血アッセイを行った。簡潔に述べると、それぞれのサ
ンプルをリン酸緩衝食塩水(PBS)で逐次的に希釈し、0.5mlの各希釈懸濁液を0.5m
lの洗浄済みヒト赤血球(RBC)[PBS中4%(v/v)]と混合した。サンプルおよび標準を
37℃インキュベーターに入れて、20時間攪拌した。低速度(2000×Ｇ)で管を10分
間遠心し、200μlの上清を550nmにおける吸光度により定量した。100パーセント
溶血として、界面活性剤Triton X-100から得られた最大の溶血量を定義した。図
6の溶血プロフィールは、2mM 1-O-DPPCリポソームの場合および10% 1-O-DPPE-PE
G350を有する1-O-DPPCリポソームの場合の低い溶血値(5%未満)を示している。

【図７】 0.5および10% 1-O-DPPE-PEG35Oリポポリマーを組み込んだ単ラメラリポソーム
のPLA₂(A. piscivorus piscivorus)加水分解に対する41℃における特徴的な反応
時間プロフィール。酵素からの固有蛍光(実線)および懸濁液からの90°静的光散
乱(破線)によってPLA₂加水分解反応をモニターする。平衡化されたリポソーム懸
濁液にPLA₂を添加した後、特徴的な遅延時間が続いてから触媒活性の突然の増加
が起こる。

【図８】 10mM HEPES緩衝液(pH=7.5)中に懸濁された25μM 1-O-DPPE-PEG350(点線)、DSP
E-PEG750(破線)、1-O-DPPE-PEG2000(実線)から構成されたミセルに関して、非加
水分解性D-O-SPC膜である標的膜を横切る蛍光性モデル薬物および/またはコント
ラスト剤カルセインのPLA₂制御放出を時間の関数として示したものである。ホス
ホリパーゼA₂(25nM)を時間1200秒で添加した。温度は41℃であった。放出された
カルセインのパーセントは、図4で記載したように決定する。1-O-IDPPE-PEG350
のPLA₂触媒加水分解が最大速度かつ最大量の放出を引き起こした。

【図９】 DSPE-PEG750(0.150mM)から構成されたミセルのホスホリパーゼA₂加水分解の影
響を示すHPLCクロマトグラム。クロマトグラムは、ホスホリパーゼA₂(A. pisciv
orus piscivorus)がミセル懸濁液に添加される前に生成されたステアリン酸の量
(実線)および遅延バースト後のDSPE-PEG750の量(破線)を示している。点線は、
純粋なステアリン酸(0.4mM)を示している。加水分解パーセントは、ステアリン
酸標準の積分面積(115850ユニット)およびサンプルの積分面積(45630ユニット)
に基づいて計算した。サンプル中のステアリン酸の濃度は、0.157mM (45630/115
850×0.4mM)と計算された。これは、DSPE-PEG750の100%がリゾ-SPE-PEG750およ
びステアリン酸に加水分解されたことを意味する。

【図１０】 リポソーム薬物および/またはコントラスト剤のターゲッティング、細胞外酵
素による放出および吸収の原理を記述している。 (I) 漏出性毛細管を有する病的組織 (II) リポソーム薬物および/またはコントラスト剤担体 (III) 標的細胞および細胞膜 (IV) 細胞外ホスホリパーゼA₂による局所的な薬物および/またはコントラスト
剤の放出および吸収。

【図１１】 （ａ） 多孔性疾患組織中へのリポソーム薬物および/またはコントラスト剤薬物担体
の蓄積ならびにそれに続く細胞外PLA₂活性による薬物および/またはコントラス
ト剤の放出および標的膜を横切る輸送を含むリポソーム薬物および/またはコン
トラスト剤のターゲッティングの原理を示す概略図。 (I) 漏出性毛細管を有する病的組織 (II) ポリマーにより安定化されている脂質にコンジュゲートされたコントラ
スト剤コントラスト剤担体リポソーム (III) 標的細胞および細胞膜 (IV) 脂質にコンジュゲートされたコントラスト剤(モノエーテル脂質)、プロ
エンハンサー(脂質)、プロアクチベーター(脂質) (V) 薬物(エーテル-リゾ脂質および脂肪酸誘導体)、エンハンサー(リゾ脂質+
脂肪酸)、PLA₂アクチベーター(リゾ脂質+脂肪酸) （ｂ） 薬物および/またはコントラスト剤担体リポソームのリン脂質が、PLA₂触媒加
水分解を介して、薬物および/またはコントラスト剤担体の部位でプロ不安定化
剤としておよび標的の部位でプロエンハンサーとして機能する、分子ベースの生
物物理学的モデル系を示す概略図。脂質をベースとし脂質にコンジュゲートされ
たコントラスト剤を含めるように原理を拡張できる可能性も包含される。 (I) ポリマーにより安定化された薬物および/またはコントラスト剤担体リポ
ソーム (II) 非分解性標的リポソーム膜 (III) 非加水分解性エーテル脂質 (IV) プロエンハンサー(脂質)、脂質にコンジュゲートされたコントラスト剤(
モノエーテル脂質)、プロアクチベーター(脂質) (V) エンハンサー(リゾ脂質+脂肪酸)、薬物(エーテル-リゾ脂質および脂肪酸
誘導体)、PLA₂アクチベーター(リゾ脂質+脂肪酸)

【図１２】 (a) 異なる組成の担体リポソームに関して標的膜を横切る蛍光性モデル薬物お
よび/またはカルセインのPLA₂制御放出を時間の関数として示したものである。
温度は37℃である。裸のDPPC担体と比較して、モデル薬物および/またはコント
ラスト剤の放出速度は、ポリマー被覆担体DPPC+2.5モル% DPPE-PEG2000の場合、
劇的に増大される。酵素に対する局所的アクチベーターとして機能する短鎖リン
脂質(DCPC)を担体も含有している場合、放出速度のさらなる増大が得られる。放
出されたカルセインのパーセントは、放出%=100(I_F(t)-I_B)/(I_T-I_B)として決定
される。式中、I_F(t)は、酵素添加後の時間tで測定された蛍光であり、I_Bは、バ
ックグラウンド蛍光であり、I_Tは、標的リポソームを分解することによりカルセ
インの完全放出を引き起こすTriton X-100の添加後に測定された全蛍光である。
(b) さまざまな温度に関して標的膜を横切る蛍光性モデル薬物および/またはコ
ントラスト剤カルセインのPLA₂制御放出を時間の関数として示したものである。
温度を上昇させると、担体リポソームの脂質二重層基質の構造変化により引き起
こされる酵素の活性増加に起因して放出速度は増大される。本アッセイでは、す
べての場合において約70%の最大放出が達成される。挿入図は、50%カルセイン放
出時間t_50%を温度の関数として示している。標的リポソームおよび担体リポソー
ムの濃度は、25μMであり、PLA₂は、pH=7.5のHEPES緩衝液中25nM濃度で添加する
。

【図１３】 標的膜を横切る蛍光性モデル薬物および/またはコントラスト剤カルセインの2
0分後の全放出を、単独および1:1混合物のリゾパルミトイルリン脂質およびパル
ミチン酸の添加量を増大させた関数として示したものである。標的膜の濃度は、
39℃の温度でpH=7.5のHEPES緩衝液中25μMである。

【図１４】 10mM HEPES緩衝液(pH=7.5)中に懸濁された25μMの90モル% 1-O-ヘキサデシル-
2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(1-O-DPPC)および10モル% 1-O
-ヘキサデシル-2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-
[メトキシ(ポリエチレングリコール)-350](1-O-DPPE-PEG350)から構成されたリ
ポソームからの蛍光性モデル薬物および/またはコントラスト剤カルセインのPLA₂ 制御放出を時間の関数として示したものである。50nM(直線)、1nM(実線)および
0.02nM(点線)のホスホリパーゼA₂(A. piscivorus piscivorus)を時間300秒で添
加した。温度は35.5℃であった。放出されたカルセインのパーセントは、図4で
記載したように決定する。

【図１５】 41℃で平衡化させたリポソーム懸濁液に100nM PLA₂(Agkistrodon piscivorus
piscivorus)を添加する前(実線)および添加した後(破線)における負に帯電した
リポソーム(0.100mM)に組み込まれた1モル%ビス-py-DPCの発光スペクトル。

【図１６】 負に帯電したリポソームのラットホスホリパーゼ触媒加水分解に対する41℃に
おける特徴的な反応時間プロフィール。腹膜液の添加前に60秒間平衡化させた2.
5mlのサーモスタット制御リポソーム懸濁液に無細胞腹膜液を添加することによ
り触媒反応を開始させた。ビス-py-DPCからのモノマー蛍光(実線)およびエキシ
マー蛍光(破線)により加水分解反応をモニターする。平衡化されたリポソーム懸
濁液に60秒で無希釈腹膜液を添加した後、ビス-py-DPC基質が加水分解されると
、モノマー蛍光の突然の増加およびそれと同時にエキシマー蛍光の減少が観測さ
れる。挿入図は、最初の120秒間の反応時間プロフィールを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｋ 49/00 Ｚ Ａ６１Ｂ 8/00 51/00 5/05 ３８３ Ｇ０１Ｒ 33/28 Ｇ０１Ｎ 24/02 Ｂ // Ａ６１Ｂ 8/00 Ａ６１Ｋ 49/02 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フェアメーレン，シャーロット デンマーク国 ディーケイ−4100 ソート フト ソートフトヴェイ 30 (72)発明者 フロクヤール，スヴェン デンマーク国 ディーケイ−2840 ホルト ソルヴェイ ６ (72)発明者 モーリッツエン，オル，ジー． デンマーク国 ディーケイ−5230 オーデ ンス ランゲリニー 44 Ｆターム(参考） 4C085 HH03 HH05 HH07 HH09 HH20 JJ05 KB15 KB17 KB18 KB19 KB21 KB30 LL18 4C096 AA11 AB04 FC14 4C301 EE20 LL20

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 脂質誘導体と標識とを含む脂質ベースの系の使用であって、
   該脂質誘導体が、(a)少なくとも7炭素原子の長さの脂肪族基および少なくとも7
   個の炭素原子を有する有機基ならびに(b)親水性部分を有し、該脂質誘導体がさ
   らに、該有機基は加水分解により開裂除去されうるが該脂肪族基は実質的に影響
   を受けずに残存する程度に細胞外PLA₂に対する基質であり、それにより、該有機
   基の開裂除去された脂質誘導体が、リゾホスホリパーゼに対する基質でないリゾ
   脂質誘導体の形態で遊離され、該系が、該系の表面上に親水性鎖を提示するよう
   にリポポリマーまたは糖脂質を内包する、哺乳動物組織における細胞外PLA₂活性
   の局所的増加に関連づけられる疾患または状態を検出および／または定量化する
   ための診断用組成物の調製のための上記使用。
2. 【請求項２】 前記標識が、¹¹¹In、^99mTc、⁶⁷Ga、¹¹C、Gd、Mn、酸化鉄、
   アルゴン、窒素、ヨウ素、臭素およびバリウムからなる群より選択される、請求
   項１に記載の使用。
3. 【請求項３】 前記脂質誘導体が、次式： 【化１】 〔式中、 XおよびZは、独立して、O、CH₂、NH、NMe、S、S(O)、およびS(O)₂から選択さ
   れ； Yは、-OC(O)-であり、この場合、Yは、酸素またはカルボニル炭素原子のいず
   れかを介してR²に連結され； R¹は、式Y¹Y²で表される脂肪族基であり； R²は、少なくとも7個の炭素原子を有する有機基であり； ここで、Y¹は、-(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(
   CH₂)_n7-(CH=CH)_n8r-(CH₂)_n9であり、n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9の合計は
   、9〜29の整数であり；n1は、0または1〜29の整数であり、n3は、0または1〜20
   の整数であり、n5は、0または1〜17の整数であり、n7は、0または1〜14の整数で
   あり、n9は、0または1〜11の整数であり；n2、n4、n6およびn8のそれぞれは、独
   立して、0または1であり；Y²は、CH₃またはCO₂Hであり；それぞれのY¹-Y²は、独
   立して、ハロゲンまたはC_1〜4-アルキルで置換されていてもよく、 R³は、ホスファチジン酸(PO₂-OH)、ホスファチジン酸の誘導体ならびにホスフ
   ァチジン酸およびそれらの誘導体に対する生物学的等価体から選択される。〕 を有する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の使用。
4. 【請求項４】 R²が、少なくとも7炭素原子の長さの脂肪族基である、請求
   項３に記載の使用。
5. 【請求項５】 R²が、式Y¹Y²で表される基である、請求項４に記載の使用。
6. 【請求項６】 プロドラッグが、脱水した脂質ベースの系全体の15〜100モ
   ル%を構成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 【請求項７】 前記脂質ベースの系が、第2の薬物の組み込まれたリポソー
   ムの形態である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
8. 【請求項８】 前記標識が、前記脂質誘導体に共有結合で連結されている、
   請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
9. 【請求項９】 哺乳動物において増大されたPLA₂レベルを有することにより
   特性づけられる前記疾患または状態が、悪性組織、たとえば、脳癌、乳癌、肺癌
   、大腸癌、卵巣癌、リンパ腫、肉腫および癌腫からなる群より選択される悪性組
   織により惹起される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
10. 【請求項１０】 前記悪性組織が原発性腫瘍である、請求項９に記載の使用
    。
11. 【請求項１１】 前記悪性組織が、原発性腫瘍を起源とする転移細胞である
    、請求項９または１０に記載の使用。
12. 【請求項１２】 前記標識が、陽電子放射断層撮影(PET)、X線、ガンマシン
    チグラフィー、磁気共鳴(MR)イメージング、コンピューター断層撮影(CT)イメー
    ジングおよび超音波検査からなる群より選択された方法により検出可能であるお
    よび／または定量化される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
13. 【請求項１３】 哺乳動物において悪性組織を同定および場合により定量化
    する方法であって、 a) 脂質誘導体と標識とを含む脂質ベースの系であって、該脂質誘導体が、(a)
    少なくとも7炭素原子の長さの脂肪族基および少なくとも7個の炭素原子を有する
    有機基ならびに(b)親水性部分を有し、該脂質誘導体はさらに、該有機基は加水
    分解により開裂除去されうるが該脂肪族基は実質的に影響を受けずに残存する程
    度に細胞外PLA₂に対する基質であり、それにより、該有機基の開裂除去された脂
    質誘導体は、リゾホスホリパーゼに対する基質でないリゾ脂質誘導体の形態で遊
    離され、該系は、該系の表面上に親水性鎖を提示するようにリポポリマーまたは
    糖脂質を内包する上記系を、増大されたPLA₂レベルを有することにより特性づけ
    られる悪性疾患を有する疑いのある個体に投与することによって、該標識を該脂
    質誘導体から該悪性組織に放出させることと、 b) 該標識を検出および場合により定量化することと、 を含む、上記方法。
14. 【請求項１４】 前記標識が、¹¹¹In、^99mTc、⁶⁷Ga、¹¹C、Gd、Mn、酸化鉄
    、アルゴン、窒素、ヨウ素、臭素およびバリウムからなる群より選択される、請
    求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記脂質誘導体が、次式： 【化２】 〔式中、 XおよびZは、独立して、O、CH₂、NH、NMe、S、S(O)、およびS(O)₂から選択さ
    れ； Yは、-OC(O)-であり、この場合、Yは、酸素またはカルボニル炭素原子のいず
    れかを介してR²に連結され； R¹は、式Y¹Y²で表される脂肪族基であり； R²は、少なくとも7個の炭素原子を有する有機基であり； ここで、Y¹は、-(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(
    CH₂)_n7-(CH=CH)_n8r-(CH₂)_n9であり、n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9の合計は
    、9〜29の整数であり；n1は、0または1〜29の整数であり、n3は、0または1〜20
    の整数であり、n5は、0または1〜17の整数であり、n7は、0または1〜14の整数で
    あり、n9は、0または1〜11の整数であり；n2、n4、n6およびn8のそれぞれは、独
    立して、0または1であり；Y²は、CH₃またはCO₂Hであり；それぞれのY¹-Y²は、独
    立して、ハロゲンまたはC_1〜4-アルキルで置換されていてもよく、 R³は、ホスファチジン酸(PO₂-OH)、ホスファチジン酸の誘導体ならびにホスフ
    ァチジン酸およびそれらの誘導体に対する生物学的等価体から選択される。〕 を有する、請求項１３に記載の方法。
16. 【請求項１６】 R²が、少なくとも7炭素原子の長さの脂肪族基である、請
    求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 R²が、式Y¹Y²で表される基である、請求項１６に記載の方
    法。
18. 【請求項１８】 プロドラッグが、脱水した脂質ベースの系全体の15〜100
    モル%を構成する、請求項１３に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記脂質ベースの系が、第2の薬物の組み込まれたリポソ
    ームの形態である、請求項１３に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記標識が、前記脂質誘導体に共有結合で連結されている
    、請求項１３に記載の方法。
21. 【請求項２１】 哺乳動物において増大されたPLA₂レベルを有することによ
    り特性づけられる前記疾患または状態が、悪性組織、たとえば、脳癌、乳癌、肺
    癌、大腸癌、卵巣癌、リンパ腫、肉腫および癌腫からなる群より選択される悪性
    組織により惹起される、請求項１３に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記悪性組織が原発性腫瘍である、請求項２１に記載の方
    法。
23. 【請求項２３】 前記悪性組織が、原発性腫瘍を起源とする転移細胞である
    、請求項２１に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記標識が、陽電子放射断層撮影(PET)、X線、ガンマシン
    チグラフィー、磁気共鳴(MR)イメージング、コンピューター断層撮影(CT)イメー
    ジングおよび超音波検査からなる群より選択された方法により検出および／また
    は定量化される、請求項１３に記載の方法。