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TW202208853A - 用於檢測折疊錯誤蛋白質之裝置及其使用方法 - Google Patents

用於檢測折疊錯誤蛋白質之裝置及其使用方法 Download PDF

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TW202208853A
TW202208853A TW110135659A TW110135659A TW202208853A TW 202208853 A TW202208853 A TW 202208853A TW 110135659 A TW110135659 A TW 110135659A TW 110135659 A TW110135659 A TW 110135659A TW 202208853 A TW202208853 A TW 202208853A
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溫蒂 戴維斯
丹尼 李文森
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Abstract

本發明係關於一種診斷裝置及使用該裝置檢測目的蛋白之方法，該目的蛋白與哺乳動物的疾病或功能失調相關。具體上，目的蛋白可為與哺乳動物之部分蛋白質折疊錯誤疾病相關之折疊錯誤蛋白質，該哺乳動物包含疑似罹有該疾病或處於該疾病風險之哺乳動物。

Description

用於檢測折疊錯誤蛋白質之裝置及其使用方法
本發明係關於一種用於檢測蛋白質之裝置及方法，更具體而言，係關於一種用於檢測哺乳動物動物的折疊錯誤蛋白質之裝置及其使用方法。
根據美國婦產科醫生學會(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)，包含子癇前症(preeclampsia)併發的妊娠高血壓疾病涵蓋了全球約 10 %的孕婦且為母體與胎兒罹病及死亡之主因[參考資料：懷孕中高血壓，美國婦產科醫生學會專案組於懷孕中高血壓的報告，婦產科 122，122卷，第5號，2013年11月(ACOG 2013 準則)(Hypertension in Pregnancy, Report of the American College of Obstetricians and Gynecologists’ Task Force on Hypertension in Pregnancy, Obstetrics and Gynecology 122 VOL. 122, NO. 5, NOVEMBER 2013  (the ACOG 2013 guildelines))]。此外，以上症狀為早產及相關併發產期死亡之主因[參考文獻： Ananth CV, Vintzileos AM. J Matern Fetal Neonatal Med. 2006:19(12):773-82]。妊娠高血壓可被分類成 1) 子癇前症-子癇症(preeclampsia-eclampsia)、2) 慢性高血壓、3) 慢性高血壓併發子癇前症(chronic hypertension with superimposed preeclampsia)或 4) 妊娠高血壓(gestational hypertension)。
子癇前症-子癇症為一種已知甚少之懷孕相關症狀，其為母體死亡、早產、以及用於生育的健保花費提升之主因。在全球，有 76,000 位準母親死於子癇前症。子癇前症在美國是與懷孕相關死亡的五分之一的原因，且其症狀可導致痙攣、器官衰竭及死亡。該病症大多發生於懷孕約 20 週之後，且婦女直到產後期仍有風險。該病症可導致稱為子癇症的痙攣或抽搐。子癇前症可被分類為輕度、重度、較不嚴重、更重度或無重度特徵的子癇前症、或有重度特徵的子癇前症。子癇前症亞型的溶血性肝臟酵素升高低血小板(hemodialysis-elevated liver enzyme-low platelet count，HELLP)症候群的特徵為病人罹有溶血症狀、肝臟酵素升高及低血小板量的症狀。病人具有不正常併發症狀之子癇前症稱為非典型子癇前症(atypical preeclampsia)
其唯一已知的治療方式為分娩嬰兒，因此子癇前症為醫學上指示的早產之主因，估計為所有早產的 17 %。美國健保系統對於子癇前症的母親及嬰兒之分娩及照護的花費估計超過 130 億美金。現今，子癇前症在診斷上仍為挑戰，因其只能藉由其症狀來確認：通常為高血壓及尿蛋白的存在。對於改善子癇前症診斷的研究通常為尋找被調升或調降之血液中已知生物標記，但幾乎沒有發現已量產的全球性有效的診斷產品。
利用需要因子癇前症診斷的醫學上指示分娩(medically indicated delivery due to a diagnosis of preeclampsia，MIDPE)之重度子癇前症的婦女尿液樣本及無偏差質譜蛋白質圖譜法(unbiased mass spectrometry protein profiling approach)進行研究並找出SERPINA-1及白蛋白(albumin)的唯一非隨機裂解產物。傾向SERPINA-1斷片(fragment)折疊錯誤並形成超分子聚集體(supramolecular aggregates) 的資訊而提出子癇前症可能為折疊錯誤疾病，而與阿茲海默症 (Alzheimer’s disease) 不同 [參照美國專利第8,263,342號及Buhimsch 等人，Am J Obstet Gynecol . 2008 November; 199(5): 551.e1–551.16. doi:10.1016/j.ajog.2008.07.006. ] 。此外，基於蛋白質與剛果紅(Congo Red ，CR)染劑(嗜剛果紅蛋白質，congophilla)結合之折疊錯誤蛋白質從患有子癇前症之婦女尿液內發現。與構形狀態相依抗類澱粉聚集體抗體(conformational state-dependent anti-amyloid aggregate antibodies)結合的一或多個的摺疊錯誤蛋白質或「超分子聚集體」與高度活化類澱粉前驅蛋白[amyloid precursor protein，APP)作用途徑相關且類澱粉樣蛋白沉積在子癇前症婦女的胎盤(參照Buhimschi 等人，Sci. Transl. Med. 6，245ra92 (2014) ]。在清洗之後，親和性點漬法(dot blot affinity assay)測量CR留存之比例(因與折疊錯誤蛋白質結合)(如原CR之%)且結果以剛果紅留存(Congo Red Retention，CRR) %呈現。
在80 位婦女(其中 40 位需要醫學上指示的分娩及 40 位為「控制組」的健康孕婦)之可行性研究中，剛果紅留存%在重度子癇前症之尿液中顯著較高(P ＜ 0.001)，該結果具 100% 靈敏度及特異性。在 582 位婦女 (為橫向及縱向世代) 的效度研究中，其中患有重度子癇前症及子癇前症合併存在高血壓或蛋白尿症(proteinuria)的婦女具有比其他所有臨床分類高的剛果紅留存% (P ＜ 0.001)。此外，75% 診斷患有輕度子癇前症、89% 診斷患有重度子癇前症及 91% 診斷患有合併子癇前症之婦女具有高於其他組別之剛果紅留存結果(P＜0.05)。整體而言，在子癇前症需要MIDPE的預測中，在效度世代中僅剛果紅留存具有 85.9% 靈敏度及85.00% 特異性，95% 的陽性概度比(positive likelihood ratio)與 95% 的陰性概度比(negative likelihood ratio)。剛果紅留存優於目前用於子癇前症的臨床上篩選方法(相較於血壓或尿蛋白量測桿P ＜ 0.001；相較於美國婦產科醫生學會(ACOG)建議臨界值之合併血壓與尿蛋白的結合P = 0.004) (Buhimschi等人，Sci. Transl. Med . 6, 245ra92 (2014) 及 美國專利第9,229,009號)。
剛果紅亦與纖維素結合，其用以建立基於分析的簡單試紙。將應用於試紙上以產生染劑與試紙內的纖維素結合之一般的尿液-染劑混合物顯現成紅色緊實中心點。反之，具有嗜剛果紅尿蛋白之婦女尿液由於染劑已與該蛋白結合而不再與纖維素結合，因此替代地以擴散形式分散而顯示成暈圈(hole)(參照美國專利申請公報第 20150293115 號)。在參照生產及分娩篩檢中心進行排除子癇前症之346位婦女的臨床實驗中，病患尿液利用CR簡易試紙分析(CRD)進行測試。CRD測試根據ACOG 2013 準則定義對子癇前症的診斷證實有 79% 靈敏度、 89% 特異性、91% 的陰性預測值、74% 的陽性預測值[參考文獻：Rood 等人 2016 AJOG，214卷，第1期，附錄，S24-S25頁(Rood et al 2016 AJOG Volume 214, Issue 1, Supplement, Pages S24–S25) ]。CRD測試在將尿液運用於試紙前，需要混合尿液及染劑之步驟，且其結果可能在讀取及解釋上具有挑戰。
如上所述，可使用在照護點以檢測懷孕哺乳動物且特指婦女之子癇前症可能性之簡易診斷裝置仍具有高度意義及未滿足的需求性。該裝置藉由提供關於婦女是否具有罹患子癇前症之風險或已罹患子癇前症之早期資訊，並藉此因接收立即的治療性介入，因而可具有拯救成千上萬位懷孕婦女及其未出生之嬰兒之潛力。
本文所提及的所有專利及出版物其全部內容於此併入作為參考。
本發明包括用於檢測哺乳動物之生物樣本內至少一蛋白質之診斷裝置。該裝置包含 a) 樣本接收材料，其中樣本接收材料可接收生物樣本；b) 檢測試劑，其中該檢測試劑可與存在於生物樣本中之至少一蛋白質反應(即結合)；c)分離器(trap)，其中分離器與樣本接收材料接觸且可與生物樣本中至少一蛋白質結合之檢測試劑與沒有與生物樣本中至少一蛋白質結合之檢測試劑分離，因而與生物樣本中至少一蛋白質結合之檢測試劑可流經分離器，且因而未與生物樣本中至少一蛋白質結合之檢測試劑藉由分離器捕捉；d)毛細管床，其中毛細管床與分離器接觸，且其中該毛細管床配置成含有在生物樣本流經分離器後含有生物樣本。若在生物樣本檢測到至少一蛋白質時，該毛細管床顯示結合的檢測試劑。樣本接收材料、分離器以及該毛細管床配置成依序接觸。該裝置之樣本接收材料可包含例如檢測試劑。並且，檢測試劑可位於樣本接收材料之上或其之內。
再者，該裝置可裝入(encased)於外殼或片匣。外殼或片匣可包含用於施用生物樣本之槽(或其他入口)且亦可包含用於讀取所獲取的結果之窗口。該裝置可使用在各種臨床或非臨床環境或於臨床實驗室之照護點。
如前述，檢測試劑與生物樣本中至少一蛋白質結合。該至少一蛋白質可例如為：折疊錯誤蛋白質、蛋白質聚集體(aggregated protein)、超分子蛋白質聚集體(supramolecular aggregated protein)及其混合物及各蛋白質之斷片。該至少一蛋白質可包含β-褶板結構(beta sheet structure)。此外，該至少一蛋白質可為嗜剛果紅性(congophilic)。折疊錯誤蛋白質可包含，例如：α1-抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin)(SerpinA1)、血漿銅藍蛋白(ceruloplasmin)、重鏈IgG、輕鏈IgG、可誘導干擾素蛋白質6-16(interferon-inducible protein)(IF-16-6，G1P3)、白蛋白(albumin)，以及其混合物及其斷片、或各蛋白的斷片。然而，折疊錯誤蛋白質不限於此些蛋白質。例如，折疊錯誤蛋白質可為任何蛋白質(或蛋白質組合)，其導致折疊錯誤疾病或與其相關。
本檢測試劑可為例如：偶氮染劑(azo dye)、硫代黃素 T(Thioflavin T)以及偶氮染劑之相似物。可與本發明結合使用之偶氮染劑之一例為剛果紅(即，二鈉4-氨基-3- [4- [4-(1-氨基-4-磺酸根基-萘-2-基)二氮烯基苯基]苯基]二氮烯基-萘-1-磺酸(disodium 4-amino-3-[4-[4(1-amino-4-sulfonato-naphthalen-2-yl)diazenylphenyl]phenyl]diazenyl-naphthalene-1-sulfonate)) (亦可使用剛果紅之類似物，例如：化學式C32 H22 N6 Na2 O6 S2 之二級重氮染劑(secondary diazo dye)使用作為與本發明之裝置結合使用之檢測試劑) 。剛紅果可預載入至前述之樣本接收材料上。
本發明所述之裝置之該樣本接收材料可包含例如：硝化纖維素(nitrocellulose)、纖維素(cellulose)、玻璃纖維、棉花、編織篩網、不織布材料、多孔性塑膠、聚合物及/或聚酯類(polyester)。該聚酯類可為例如：聚乙烯(polyethylene)。
本發明所述之裝置之分離器可包含例如：硝化纖維素、纖維素、玻璃纖維、棉花/玻璃纖維、編織篩網、不織布材料、聚合物及/或聚碸類(polysulfone)。
本發明之裝置之毛細管床可包含例如：硝化纖維、層析紙、聚碸類及/或纖維素等。
尤其值得提及的是，本發明之裝置可在約 10 分鐘或10 分鐘內以下，較佳為約 5分鐘或5分鐘內，更佳為約 3 分鐘或3分鐘內，且最佳為約 1分鐘或1分鐘內提供測試結果。再者，其一可藉由可視化提供定性或半定量。此外，如有需要，其一亦可獲得半定量結果或定量結果，以測量至少一蛋白質之量。
本發明亦包括前述之診斷裝置，其用於檢測生物樣本中之折疊錯誤蛋白質，用於檢測生物樣本內之蛋白質聚集體及/或用於檢測生物樣本內之超分子蛋白質聚集體，其中該樣本自哺乳動物取得，例如：人類、靈長類以及基因工程哺乳動物。在部分範例中，該哺乳動物可為懷孕個體。如前述之裝置可用於檢測子癇前症，當檢測試劑與生物樣本所含之折疊錯誤蛋白質、蛋白質聚集體及/或超分子蛋白質聚集體(即與懷孕哺乳動物之子癇前症相關之蛋白質)反應(即結合)時，則可診斷為子癇前症。裝置之分離器可配置成與裝置之檢測試劑進行競爭性(competitively)結合。該裝置可配置側流裝置(lateral flow device)或包含樣本接收材料、分離器及毛細管床之測試片。
此外，本發明包含檢測哺乳動物之生物樣本中之至少一蛋白質之方法，該方法包含以下步驟：a) 在足以允許至少一蛋白質與檢測試劑結合的情況下，將哺乳動物的生物樣本施加至本發明之診斷裝置的樣本接收材料一段時間；及b) 檢測於毛細管床上之檢測試劑的存在，其中毛細管床上之檢測試劑的存在表示至少一蛋白質存在於生物樣本。
該方法可用於檢測患有蛋白質折疊錯誤疾病(misfolded-protein disorders)或處於患有蛋白質折疊錯誤疾病風險之哺乳動物之生物樣本內至少一蛋白質。該方法包含以下步驟：(a)在足以允許至少一蛋白質與檢測試劑結合的時間及條件下，將哺乳動物的生物樣本施加至上述診斷裝置的樣本接收材料一段時間及 (b) 檢測於毛細管床上結合之檢測試劑的存在，其中毛細管床上之檢測試劑的存在表示至少一蛋白質存在於生物樣本，且代表該哺乳動物患有蛋白質折疊錯誤疾病。再者，該至少一蛋白質可為例如：折疊錯誤蛋白質、蛋白質聚集體、超分子蛋白質聚集體、或其混合物、或具有β-褶板結構之蛋白質，例如嗜剛果紅蛋白質。該至少一蛋白質可為嗜剛果紅性及/或具有β-褶板結構。更具體而言，折疊錯誤蛋白質可包含，例如：α1-抗胰蛋白酶(SerpinA1)、血漿銅藍蛋白、重鏈IgG、輕鏈IgG、可誘導干擾素-蛋白質6-16(IF-16-6，G1P3)、白蛋白、其混合物及其斷片或上述各蛋白質之斷片。蛋白質折疊錯誤疾病可為例如：子癇前症、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、傳染性蛋白顆粒疾病(prion disease)以及帕金森氏症(Parkinson’s disease)。在其他經確認為蛋白質折疊錯誤疾病之疾病或症狀中發現之折疊錯誤蛋白質亦可藉本發明之裝置檢測。關於使用本發明之裝置診斷子癇前症，其可診斷不同型態之子癇前症，其包括例如：輕度子癇前症(mild preeclampsia)、重度子癇前症(severe preeclampsia)、非典型子癇前症(atypical preeclampsia)、溶血性肝臟酵素升高低血小板(hemodialysis-elevated liver enzyme-low platelet count，HELLP)症候群及子癇症(eclampsia)。此外，病患可患有妊娠高血壓疾病，因此，本方法可用於識別性診斷部分妊娠高血壓疾病，例如辨別子癇前症與高血壓症狀，如慢性高血壓、妊娠高血壓、其他原因造成之高血壓，或辨別前述子癇前症之型態。
前述方法使用且施加至樣本接收墊之生物樣本可為例如：尿液(乾淨或自然獲取)、血液、唾液、組織、組織液、血清、血漿、腦脊髓液、羊水以及萃取物質(例如：鼻腔分泌、耳垢、排泄物及組織之萃取物)。該方法可針對與哺乳動物相關之生物樣本使用，例如：人類、靈長類及基因工程哺乳動物。哺乳動物可為懷孕個體。在人類的情況下，該方法使用於約懷孕8至42週之孕婦(即，胎齡)，較佳為懷孕約 18 至 41 週，更佳為懷孕 20 至 41 週或20週以分娩。然而本發明之方法亦可使用於產後哺乳動物。尤其值得提及的是，使用該裝置、利用該方法所檢測之至少一蛋白質可藉由視覺化檢測以取得定性或半定量結果，或藉由測量檢測以取得半定量或定量結果。視覺化後，可測量至少一蛋白質以取得半定量或定量結果。
此外，本發明包括包含前述裝置之套件。該套件亦可包含校準器或控制組試劑以及該裝置之使用說明書。並且，該套件亦可包含樣本施用器。
本發明為裝置以及該裝置之使用方法。更具體而言，該裝置為可用於數種臨床及非臨床環境的快速測流層析測試(lateral flow chromatographic rapid test)，以檢測生物樣本中關注的蛋白質。該裝置可用於檢測哺乳動物的蛋白質折疊錯誤疾病。該哺乳動物可為懷疑患有一或多個此疾病或處於其風險中。
本文將描述具有數種不同之實施例的裝置。基本上，其包含用於檢測生物樣本內之一或多個目的蛋白(protein of interest)之測試片(參照例如第 1 圖)。該檢測藉由一連串反應的手段執行。該測試片包含具有毛細作用的一段側流分析或層析材料，且具有層析溶劑運輸起始的第一端。其亦具有層析溶劑運輸終點的第二端。測試片包含位在第一端與第二端之間的複數個區域或區(參照例如第 2 圖及第 3 圖)。該區域包含由檢測試劑，例如染劑浸染之第一區域。該檢測試劑與該生物樣本內一或多個目的蛋白進行特異性結合。第一區域亦接收生物樣本。相較之下，為第一區域下游之第二區域留存未與生物樣本中一或多個目的蛋白結合之檢測試劑，並且與該生物樣本內之一或多個目的蛋白結合之檢測試劑將被轉移至第三區域。位於該第二區域之下游的測試片的第三區域接收通過第二區域後之樣本。若目的蛋白存在於樣本時，則第三區域將顯示檢測試劑。其亦包含用於檢測結合蛋白質的檢測試劑以作為測量生物樣本內一或多個蛋白質的手段。在一實施例中，該裝置確認了取自病患之生物樣本中的折疊錯誤蛋白質的存在，且可確定病患是否具有蛋白質折疊錯誤疾病。一或多個蛋白質的存在可經由視覺定義的定性或半定量，或可藉由使用可存在於裝置內之測量元件進行半定量或定量。在生物樣本施加於第一區域後，第一區域於樣本中釋出檢測試劑，且該第二區域分離與一或多個蛋白質結合之檢測試劑及未結合之檢測試劑，並僅容許結合之檢測試劑轉移至第三區域，且接著顯示用於觀察及測量的結合之檢測試劑。第一區域可為樣本接收材料。第二區域可為分離器。第三區域可為毛細管床或顯示片。
該裝置之特定元件或構件及該元件的特性或性質將如下文詳細地描述： 用於本裝置元件之材料
樣本接收材料、分離器及毛細管床可由相同或不同材料所製。該材料為側流裝置及層析的技術領域中通常已知[參照參考文獻：EMD Millipore Rapid Lateral Flow Test Strips Considerations for Product Development, available from EMD Millipore, Billerica, MA]。薄膜是基於其物理及化學性質所選擇，其影響毛細管流且因此影響試劑沉澱及分析表現。該材料包括例如但不限於：硝化纖維素、濾紙、層析紙、纖維素、塑膠聚合物、非對稱聚碸類膜(asymmetric polysulfone membrane)、棉、棉絨及/或玻璃纖維、聚酯類、聚乙烯及聚碸類。該薄膜可由聚合物製成，該聚合物包括例如：硝化纖維素、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride)、尼龍(nylon)及聚醚碸(polyethersulfone)。該墊片材料通常使用作為樣本接收材料，以提供控制及均勻地接收樣本且助於其流至裝置中相鄰的條狀材料。墊片材料為多孔性的，通常由以下材料製成：纖維素(即濾紙)、玻璃纖維、編織網及合成的不織布材料或聚酯類。過濾基質特別在需要將包含於樣品中的外部材料與待分析之樣本部分分離時(例如，將細胞物質與流體分離出來時)，其可用於樣本接收。過濾基質可例如為：纖維素、非對稱聚碸類膜(包括但不限於 VividTM 血漿分離膜(VividTM Plasma separation membrane)及非對稱性亞微米(BTS)聚碸類膜(asymmetric sub-micron (BTS) polysulfone membrane))。吸收墊可使用作為例如在裝置條之末端的芯片(wick)，以將樣本拉過側流片，且可增加分析的樣本量並增強分析靈敏度。吸收墊通常為纖維素或棉花絨且可基於床體積(bed volumn)的厚度、可壓縮性及均勻性來最佳地選擇。測試片整體可安裝於背襯卡上，其通常為塑膠背襯且黏合劑的卡片。如本文所述，雖然各種材料通常在側流裝置具有特定目的，但各材料可考慮本發明的接收材料、分離器及顯示片的目的而具有適當地特性。詳見材料的進一步討論之例子。
用於測試片配置之其他材料，尤其是顯示片為側流技術及層析技術的技術領域中已知之材料。 本裝置之元件或構件 樣本接收材料(樣本墊)
裝置之第一元件(以下略稱為樣本接收材料或樣本墊)作為海綿並保持用以測試的超量的樣本流體。接收材料吸收樣本，但亦容許其流動或吸附至下一個相鄰的材料。其通常對於存在於樣本中之目的蛋白以及檢測試劑(例如，染劑)為惰性，且因此不與其反應，以使蛋白質及檢測試劑經由材料而流動或吸附至側流裝置中的相鄰材料。
樣本接收材料可浸入自哺乳動物或病患樣本中，或替代地，該樣本可間接或直接施用於樣本接收材料。樣本可藉由，例如：具刻度之滴管、吸量管、移液管、或可重複配給病患樣本之吸量管而施用於樣本接收材料。若樣本接收材料配置以浸入生物樣本(例如，參照第 5 圖)，則樣本接收材料可為相對較長(例如但不限於：約 10 mm)。若該樣本接收材料配置以接收藉由例如滴管或吸量管所施用的樣本時，則樣本接收材料可為相對較短(在約 5 mm 至約 10 mm之間，但不限於此 )。一般而言，該寬度可為約 2 mm 至 10 mm ，且更常見為 2.5 mm 至 5 mm(±0.5 mm)。樣本接收材料的長度及寬度的變化是可能的，且依據如片匣或外殼之大小以及生物樣本與檢測試劑充分混合之能力的因素。
特別是，樣本接收墊作為毛細基質，其中生物樣本及檢測試劑(例如，染劑)可自由地混合。樣本墊亦可具有以乾燥型式之檢測試劑，其可適用於在分析物(例如，生物樣本內檢測之目的蛋白)與檢測試劑之間的最佳化化學反應。檢測試劑可預先載入於樣本接收材料上。在一實施例中，當加至樣本接收墊的生物樣本(例如，尿液)溶解檢測試劑時，接著樣本及檢測試劑染劑之混合物藉由流經測試墊至例如分離器的相鄰材料之方式通過該裝置。
另外，樣本墊包含一系列之兩個或更多的樣本墊(參照例如第 4 圖)。例如，第一墊可接收樣本且第二墊可含有檢測試劑，因而生物樣本由第一元件(第一墊)遷移至含有乾燥型態之檢測試劑的第二元件(第二墊)，其可適用於目的的分析物與檢測試劑之間的最佳化化學反應。若使用兩個或更多的樣本接收材料，任其一可含有該檢測試劑。較佳地，第一樣本接收材料包含檢測試劑且第二樣本接收材料不含有檢測試劑。
在另一實施例中，第一樣本墊接收生物樣本且被設計成分離出或留存可存在於該樣本中之不溶性材料。過濾的樣本其後流經第一樣本墊或至第二樣本墊且檢測材料已併入於第一樣本墊或第二樣本墊，且允許檢測試劑及樣本適當地混合。第二墊可具有與第一墊相同或不同的組成。
再者，在另一實施例中，該第一樣本墊接收樣本且亦含有檢測試劑，而第二樣本墊用於在進入測試片的下一相鄰材料(例如，分離器)之前提供檢測試劑與關注分析物混合的額外時間。
在一額外實施例中，樣本接收材料包含用於檢測試劑之基材且乾燥留存於基材上。檢測試劑可在樣本接收材料上或其之內。一但病患樣本被加入，則釋放檢測材料。該基材不吸收病患樣本或不與其反應，當施用時，其移動經由基質移動並至相鄰材料之上，例如，分離器。
應值得注意的是，該樣本可例如經由樣本槽或用於接收樣本之裝置其他物件施用或放置進片匣或外殼。當測試片安裝或封裝於片匣或外殼內側時，樣本槽或物件可位於例如測試片的樣本接收材料之上(參照第1圖)。
使用作為樣本接收材料或樣本墊之材料為側流裝置及層析的技術領域中已知之材料 [見參考文獻： EMD Millipore Rapid Lateral Flow Test Strips Considerations for Product Development, available from EMD Millipore, Billerica, MA]且基於影響樣本接收、控制及均勻毛細管流及樣本過濾之物理性質及化學性質進行選擇。此外，若樣本接收材料亦含有檢測試劑，理論上，該材料為用於保持檢測試劑且當測試樣本加入時最佳化釋放的適當基質。該墊材料為多孔性的，通常由纖維素(例如：濾紙)、玻璃纖維、編織篩網及合成不織布材料或多孔性塑膠(例如：聚酯類)所製成。可使用作為樣本接收材料之其他材料例如為：非對稱聚碸類膜(polysulfone asymmetric membranes)、棉花/玻璃纖維材料如 Ahlstrom® 8950、塑膠聚合物膜，例如聚乙烯(例如，高密度聚乙烯)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene)以及多孔性玻璃纖維膜(參照例如Porex，Fairburn，GA)。材料的進一步描述參照範例(即，範例2及範例6)。
應值得注意的是，當檢測試劑為具有對纖維素的親和性的染劑時，用於本發明之裝置的樣本接收材料可為存在足以與生物樣本中一或多個修飾目的蛋白質結合的檢測試劑之纖維素。更具體而言，該纖維素不可被容許與針對結合至例如生物樣本中的一或多個折疊錯誤蛋白質之關注蛋白質的檢測試劑進行「外部競爭(out compete)」。替代地，若纖維素存在於與檢測試劑之反應性低於一或多個修飾的目的蛋白質之基質時，則纖維素使可用於樣本接收材料 (本文中提到之纖維素定義為具有(C6 H10 O5 )n 化學式之有機化合物，且特別為由數百至數千的 β(1-＞4)鏈結 D-葡萄糖單元 (β linked D-glucose units)之直鏈所組成之多醣類) 。 分離器
接著，該流體(例如，樣本或與檢測試劑混合的樣本)自樣本分析材料或樣本墊流經過濾器(以下略稱為「分離器」)，其設計成可留存任何未結合之檢測試劑。特別是，分離器適用於分離側流裝置中的游離(free)檢測試劑(例如，染劑)與蛋白質結合之檢測試劑 。具體而言，分離器材料容許樣本流流至下一個相鄰材料，但若生物樣本中不存在一或多個目的蛋白，則留存、阻礙未結合的檢測試劑的流動或與未結合的檢測試劑結合。
分離器鄰接樣本墊，但較佳為與樣本墊重疊，其中樣本墊含有檢測試劑(例如，染料)或一系列之樣本墊元件(參照例如第 3 圖)。分離器之功能為分離以下兩者：與一或多個測試樣本蛋白或目的蛋白(例如，一或多個折疊錯誤蛋白質)結合之檢測試劑以及未與一或多個測試樣本蛋白質結合之檢測試劑，從而容許結合之檢測試劑流過分離器並留存未結合之檢測試劑於分離器。另外，分離器可為相同或不同材料的一系列的一或多個過濾器。
不受理論束縛，分離器材料可含有用與檢測試劑的基材，以使未結合檢測試劑與分離器材料結合且無法流至下一材料。已與蛋白質結合之檢測試劑不與分離器中之基材結合且流至測試片之下一材料。基材可為分離器材料(例如，纖維素)或可被化學修飾或外加至分離器材料。此外，分離器材料組成之結構特性提供未結合之檢測試劑的留存。
此外，分離器亦可由重疊或連續的複數片材料所組成，以最佳化未結合檢測試劑之留存(見第 4 圖)。複數片可由相同或不同材料製成。可用於分離器的過濾器基質例如為纖維素、熱塑性聚合物，如非對稱聚碸淚膜(包括但不限於 VividTM 血漿分離膜及非對稱性亞微米(BTS)聚碸類膜(asymmetric sub-micron (BTS) polysulfone membrane))。分離器材料之進一步描述請參照範例(例如，範例2、範例4、範例5、範例8、範例13、範例14及範例16)。
實際上，出乎意料且非預料中的結果為，許多硝化纖維素材料作為分離器材料確實運作情況良好且容許尿液及與染劑結合蛋白質流經該裝置。例如：Whatman® AE99 硝化纖維素膜運作情形十分良好(見表1)。亦有運作狀況大致良好之纖維素材料(例如：Ahlstrom® 601、319、247、Whatman® CF1、CF3、CF4；EMI11513、5475、5493)，但亦有部分纖維素材料表現不佳(例如：Ahlstrom® 270)。意外地，在允許蛋白結合CR染劑流動並留存未結合染劑方面表現良好的材料為 VividTM 血漿分離材料(Pall Corporation)及非對稱性亞微米(BTS)聚碸類膜(Pall Corporation)(參照表1及表2)。
當檢測試劑為如剛果紅的染劑時，分離器材料可為例如：濾紙、纖維素類型及/或如 EMI 11513、EMI 5475、EMI 5493、1281、642、標準17(Standard 17)、C048、LF1、LF1、VF2、CF1、CF3、Ahlstrom 319的材料。分離器可為例如約 5 至 10 mm的長度，或其可為一系列的片，其中每個長度為 5 至 10 mm。
在一實施例中，分離器留存游離的檢測試劑(例如，染劑)，但容許結合蛋白質染劑流過。在一特定實施例中，分離器包含纖維素且檢測試劑為剛果紅。 檢測試劑
檢測試劑為與樣本中一或多個目的蛋白反應的物質。例如，檢測試劑可為與存在於哺乳動物之生物樣本(例如，病患之樣本)之一或多個折疊錯誤蛋白質 (例如，嗜剛果紅性蛋白質)、聚集蛋白質及/或超分子聚集蛋白質反應或具有與其之結合親和性的物質。檢測試劑可被預載入於檢測墊上(例如，施用於試劑墊上，或試劑墊浸於檢測試劑或染劑)。試劑墊可為樣本接收材料或樣本接收墊。
在一態樣中，檢測試劑為染色生物樣本中若存在的目的蛋白之子集合之染劑。在一實施例中，檢測試劑可與折疊錯誤的蛋白質反應。例如，染劑可為偶氮染劑(azo dye)，例如剛果紅(CR)，或緩衝或非緩衝的其類似物。再者，只要其他染劑具有對生物樣本或病患樣本內目的的折疊錯誤蛋白質、聚集蛋白質及/或一或多個超分子蛋白質的親和性(及可與其結合或反應)時，亦可使用作為檢測試劑。該染劑的例子包括但不限於剛果紅類似物，例如於下列出版物所述：Sellarajah S 等人，剛果紅類似物的合成及其抗病原性蛋白顆粒活性的評價，J Med Chem. 2004 Oct 21;47(22):5515-34 (Sellarajah S et al,Synthesis of analogues of Congo red and evaluation of their anti-prion activity , J Med Chem. 2004 Oct 21;47(22):5515-34)；以及Hélène Rudyk 等人，篩選剛果紅及其類似物的預防瘙癢病感染細胞中PrP-res形成的能力，Journal of General Virology (2000), 81, 1155–1164(Hélène Rudyk et al.,Screening Congo Red and its analogues for their ability to prevent the formation of PrP-res in scrapie-infected cells , Journal of General Virology (2000), 81, 1155–1164)。該用於檢測一或多個折疊錯誤蛋白質之檢測試劑亦可例如為硫代黃素T(Thioflavin T)。
此外，在本發明之一態樣中，檢測試劑以乾燥型態存在於裝置中，但亦可以其他型態存在。該檢測試劑之型態適於當施用且允許與目的蛋白結合時，與樣本進行混合之最佳化。檢測試劑之型態為適於長期穩定度或裝置儲存壽命之型態。在一實施例中，乾燥檢測試劑為染劑。再者，染劑可為剛果紅且可為例如：0.1 µg 至 800 µg，較佳為 0.2 µg 至 480 µg，更佳為 1 µg至 400 µg，再更佳為 2.5 µg 至 120 µg的量存在於裝置中。
剛果紅(CR)(例如，緩衝及未緩衝)可預載入至樣本接收材料。例如，於套件生產時，剛果紅溶液可施用於材料並在其組裝及包裝前進行乾燥(參照第 2 圖及範例 6 )。
檢測試劑為可檢測的，即由裸眼可視或可藉由例如視覺檢驗及/或機械或電子讀取器檢查的其他方式檢測。
本發明提供例如，於裝置生產或組裝期間，併入測試裝置的檢測試劑。其為對於檢測折疊錯誤蛋白質之習知裝置，需在加入測試前先混合染劑及生物樣本的改良。在一較佳實施例中，測試片包含含有檢測試劑的樣本接收材料。當生物樣本加至測試裝置的樣本接收材料時，其與樣本接收材料中的檢測試劑混合且生物樣本-接收試劑混合物流經裝置。 毛細管床(「顯示片」)
具有或沒有蛋白質結合檢測試劑(protein-bound-detection reagent)之樣本(例如，尿液)流經分離器並至毛細管床上(以下略稱為「顯示片」)並進行累積。因此，顯示片容許樣本向上流至測試片並顯示檢測試劑之存在與否。具體而言，顯示片容許樣本向上流至測試片並顯示檢測試劑結合分析物的存在與否。檢測試劑或結合試劑其後可藉由人類或機械手段視覺化(以獲得定性結果)及/或進行測量(即，半定量或定量)。當目的蛋白存在時，顯示片最佳地提供整體樣本之均勻流動及檢測試劑的相對均相顯示(homogeneous display)。在部分實施例中，與顯示片上的檢測試劑的強度或濃度可對應至該樣本中目的蛋白的量。在另一實施例中，檢測試劑向上流至顯示片之距離可指示生物樣本內目的蛋白量。此外，檢測試劑的強度及流上顯示片上的距離兩者可指示樣本內目的蛋白的濃度。再者，在檢測折疊錯誤蛋白質聚集體或超分子聚集體的情況下，檢測試劑的強度及流上顯示片的距離兩者可指示樣本內存在之蛋白質聚集體的大小。適當的毛細管床的材料包括例如硝化纖維或層析紙。再者，非對稱聚碸類膜亦可提供適當的顯示片。其他適當的材料包括CytoSep® 膜，如 CytoSep® 1660及MN-260。如下所述，側流片的毛細管床對準側流片之片匣或外殼之結果觀測窗。材料的進一步細節參照範例 (例如，範例2、範例3及範例9)。若蛋白質結合檢測試劑存在，則檢測試劑於結果觀測窗內可視化(見第 1 圖)。 芯片
可選擇地，該裝置含有芯片。該芯片可位於本發明之測試片或裝置中的第三區域或顯示片之後。當其使用時，施用至該裝置之生物樣本(例如，流體)持續自顯示片遷移至最終多孔性吸收材料，「芯片」，其作為樣本累積器且亦有將樣本沿測試片拉動之功能。吸收墊可使用作為例如在該裝置條末端之芯片，以拉動樣本拉經過側流片，且可增加分析的樣本量以及增強分析靈敏度。吸收墊通常為纖維素或棉花絨且可基於床體積的厚度、可壓縮性及均勻性來最佳地選擇。 背襯卡
該裝置可具有背襯卡。測試片整體可安裝於背襯卡(例如：可自 Lohmann，Orange，VA 購得)上，其通常為塑膠背襯卡及黏合劑。 外殼/片匣
在本發明中之一實施例，該診斷裝置被容納、裝入(encase)或封裝於外殼或片匣。該裝置可進一步包含外殼或片匣，其包括但不限於配置成包裝該裝置為目的之匣狀物、塑膠裝置或擠製塑膠片。數種通常的片匣外殼為商業上可購得(例如：從 Kanani Biologicals、Gujarat、India或 EASE-Medtrend Biotech LTD，Shanghai，中國)或可依目的以現有材料客製(參照例如，美國設計專利申請序號No. 29/533,647.)。該裝置可配置成具有樣本槽之外殼或片匣，以用於接收樣本，其中當樣本槽安裝/容納於片匣內時，樣本槽位於測試片之樣本接收材料之上。此外，該裝置可被配置以安裝於外殼或片匣中時，測試片的顯示片或毛細管床位於外殼之結果觀測窗之下。
在一實施例中，本發明之裝置亦包含可定量結果，例如毛細管床上(即，在結果視窗中)之檢測試劑的強度(例如，染劑)之電子讀取器，及亦可進一步包含顯示結果的顯示螢幕(例如，LED螢幕)。該讀取器可為外殼的一部份，或與外殼一體成形之元件，例如，在該結果顯示窗中。此讀取器例如在Venkatraman, Biosensors and Bioelectronics Volume 74, 15 December 2015, Pages 150–155、PCT申請號WO2013083686 A1、PCT申請號 WO2004010143 A2 以及PCT申請號 WO2006010072 A2 中所描述。 覆蓋帶
具有或沒有外殼之裝置可更進一步包含蓋體，如保護性膠帶(例如，可自 Lohmann，Orange，VA 購得)或可保護該裝置不受損壞且可提供正常讀取測試結果之其他材料。例如，該裝置可配置成作為測桿(dipstick) 使用(例如，尿液測桿)。在本實施例中，側流片可以保護性膠帶覆蓋(參照第 5 圖及範例 11 )。 執行控制組試劑
在一較佳實施例，在該裝置使用前，控制組試劑可存在於毛細管床上且可視於觀測窗(參照第 1 圖及第 2 圖、範例 12 )。當該生物樣本(例如，流體)流經毛細管床，控制組試劑溶解，控制組試劑線散布及/或帶走控制試劑至顯示片，以使結果觀測窗內不會看到控制組試劑，或其為模糊、或為可看到或測量的其他部份變化。在觀測窗內之控制組試劑之變化指示測試樣本(例如，流體)已被加入且已正常的通過該裝置，例如作為執行控制組(參照範例12 )。控制組試劑為例如藉由裸眼或其他檢測或測量方式(例如，藉由機械檢驗及/或電子讀取器)而可視覺上檢測。在一實施例中，控制組試劑為酒石黃(tartazine)。作為執行控制組試劑使用之其他染劑包括食用藍色 1 號-亮藍色FCF，E133(藍色色澤)(FD&C Blue No. 1 – Brilliant Blue FCF, E133 (blue shade))、食用藍色 2 號-靛藍，E(靛藍色色澤) (FD&C Blue No. 2 – Indigotine, E (indigo shade))、食用綠色 3 號-固綠FCF，E143-(綠松石色澤)(FD&C Green No. 3 – Fast Green FCF, E143 (turquoise shade))、食用紅色 7 號-赤蘚紅，E127(粉紅色澤)(FD&C Red No. 3 – Erythrosine, E127 (pink shade))、食用紅色 40 號-誘惑紅AC，E129(紅色色澤) (FD&C Red No. 40 – Allura Red AC, E129 (red shade))、食用黃色 4 號-檸檬黃，E102(黃色色澤) (FD&C Yellow No. 5 – Tartrazine, E102 (yellow shade))及食用黃色 5 號-日落黃FCF，E110(橙色色澤) (FD&C Yellow No. 6 – Sunset Yellow FCF, E110 (orange shade))。 檢測目的蛋白
如前述，本發明為關於一種裝置及利用該裝置檢測關注蛋白質，更具體而言為折疊錯誤蛋白質、聚集的蛋白質及/或超分子蛋白質聚集體之方法。α螺旋(alpha helix)已知為天然構形之功能蛋白質的突出結構性模體(prominent structural motif)。反之，蛋白質的構形改變可能導致β褶板結構模體(即，β褶板結構)或折疊錯誤蛋白質其後傾向於導致蛋白質聚集與毒性。折疊錯誤蛋白質可因此成為蛋白質聚集體或超分子聚集體的形式且可與折疊錯誤蛋白質疾病相關，如子癇前症、阿茲海默症、傳染性蛋白顆粒疾病(prion disease)及帕金森氏症。
具體上，與子癇前症相關且藉由本發明的裝置及方法所檢測之折疊錯誤蛋白質、蛋白質聚集體及/或超分子聚集體可包括但不限於例如：α1-抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin)(SerpinA1)、血漿銅藍蛋白(ceruloplasmin)、重鏈IgG、輕鏈IgG、可誘導干擾素蛋白質6-16(interferon-inducible protein)(IF-16-6, G1P3)、白蛋白(albumin)，以及各蛋白質之斷片、其混合物，以及該混合物之斷片。該蛋白質具有與本發明裝置使用之檢測試劑的結合親和性(如下文所述)。例如，折疊錯誤蛋白質為嗜剛果紅性，具有對稱為剛果紅等的染劑的親和性。
本發明之裝置亦可用於檢測子癇前症以外的蛋白折疊錯誤疾病。例如，該裝置可用於檢測折疊錯誤蛋白質疾病及症狀之折疊錯誤蛋白質，該折疊錯誤蛋白質疾病及症狀例如為阿茲海默症、大腦β類澱粉血管病變(Cerebral beta-amyloid angiopathy)、青光眼之視網膜神經節細胞退化(Retinal ganglion cell degeneration in glaucoma)、傳染性蛋白顆粒疾病、帕金森氏症及其他突觸核蛋白病(synucleinopathies)、tau蛋白病變(Tauopathies)、額顳葉退化症(Frontotemporal lobar degeneration，FTLD)、FTLD-FUS、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、亨丁頓舞蹈症(Huntington’s disease)及其他三重、重複疾病、失智症(Dementia)(家族性英國及丹麥失智症(familial British and Danish))、遺傳性腦出血合併類澱粉病變(Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis)、體顯性腦動脈血管病變合併皮質下腦梗塞及腦白質病變(CADASIL)、亞歷山大氏症(Alexander disease)、各種類澱粉病變(amyloidosis)、Serinopathies、第二型糖尿病(Type II diabetes)、包涵體肌炎/肌肉病變(Inclusion body myositis/myopathy)、白內障(cararacts)、色素性視網膜炎合併視紫紅質突變(Retinitis pigmentosa with rhodopsin mutations)、甲狀腺髓質癌(Medullary thyroid carcinoma)、垂體催乳素腺瘤(Pituitary prolactinoma)、遺傳性格子狀角膜營養不良(Hereditary lattice corneal dystrophy)、麥洛利氏小體(Mallory bodies)、肺泡蛋白質沉著症(Pulmonary alveolar proteinosis)、牙源性類澱粉瘤(Odontogenic tumor amyloid)、囊性纖維變性(Cystic fibrosis)、鐮刀型貧血症(Sickle cell disease)以及重症肌肉病變(Critical illness myopathy)。 生物樣本
待檢測之一或多個目的蛋白可自哺乳動物之生物樣本發現。生物樣本可例如為自乾淨或自然蒐集所取得之尿液、腦脊髓液、羊水或可能包含一或多個目的蛋白之任何體液樣本(例如，血液、唾液、羊水、腦脊髓液、血漿或血清)。該樣本亦可為自病人之分泌物之萃取物，例如：從鼻腔分泌物、排泄物、或耳垢、或以適當的溶液中萃取之組織試樣並施用至該裝置。目的蛋白可從例如懷孕或產後哺乳動物之生物樣本中發現。 病患
該病患可為哺乳動物。此外，哺乳動物可為懷孕個體，例如：懷孕婦女、懷孕靈長類動物或例如利用實驗研究而設置成具有子癇前症的身體症狀及病徵的基因工程改造動物模式(例如，高血壓及尿蛋白)。較佳地，為了診斷子癇前症，該病人可為任何懷孕婦女。該懷孕婦女可為被懷疑患有子癇前症或處於罹患子癇前症之風險。例如，該懷疑可基於以下理由：(1) 出現如美國婦產科醫生學會(ACOG)所訂立之子癇前症之病徵與症狀(懷孕中高血壓，美國婦產科醫生學會專案組於懷孕中高血壓的報告，婦產科 122，122卷，第5號，2013年11月)，具體而言，例如表 E-1(ACOG 2013 準則)及/或(2)具有一或多個子癇前症之風險因子(例如，過去懷孕時患有子癇前症之婦女、多胞胎身孕之婦女、患有心血管或腎臟異常之婦女或患有自體免疫疾病(如紅斑性狼瘡)的婦女)。 套件
本發明亦包含用於檢測樣本的目的蛋白之套件。在一實施例中，該套件包含檢測與子癇前症相關的折疊錯誤蛋白質之裝置，該蛋白質存在於懷孕哺乳動物之樣本。該套件包含上述任何替代實施例中的本發明之裝置。該套件亦可包含將病患樣本施用至樣本接收材料之手段，例如：吸量管(例如，自Genesee Scientific，San Diego，CA可購得之細尖移液管)或滴管、控制組及該裝置的使用說明書。因此，該裝置不僅可以單獨實體(stand-alone entity)使用，其亦可以套件形式使用，其在部分臨床或非臨床環境上可具有更多優點。該套件可被包裝在箔袋或聚酯膠膜袋。此外，套件袋可為單獨包裝，或各包裝為多個，例如 2、5、10、15、25、50 或 100 組套件。 裝置使用環境及裝置使用方法
本發明之裝置可用於例如臨床實驗室(於醫院內的環境或醫院外的環境)、立即性照護環境、醫師室實驗室(physician office laboratories)、急診部門(例如，醫院內)或近病人端檢驗(near-patient testing)或由醫務人員、非醫務人員甚至是病患為人類時由病人本身的之定點照護(point-of-care)裝置。此外，該裝置可與其他診斷分析組合使用(例如，檢測與子癇前症相關之蛋白質(即生物標記)如 sFlt-1、PlGF、PP-A、PP13、正五聚蛋白(pentraxin)、抑制素-A(inhibin-A)及可溶之內皮因子(endoglin)之免疫分析)及/或通常使用於診斷子癇前症之方法或觀測(例如：血壓讀數、用於診斷子癇前症之臨床測試包括血小板計數、血清肌酸酐濃度、血清丙胺酸轉胺酶(alaninine aminotransferase，ALT)及天冬胺酸轉胺酶 (aspartate aminotransferase，AST))，及其他病徵或症狀，如體重增加、暈眩、頭痛、視線模糊等。
舉例而言，本發明包括診斷子癇前症之方法或在患有妊娠高血壓疾病或被懷疑可能罹有子癇前症的病人進行鑑別診斷之方法，該方法包含下列步驟：a) 測定懷孕病患的血壓，其中血壓高於 140/90 mm/Hg 之懷孕病患可指示該懷孕病患之子癇前症及 b) 施用來自病患的生物樣本至本發明之裝置，因而病患的生物樣本中至少一目的蛋白的檢測提供或支持病患的子癇前症診斷或作為鑑別診斷。
再者，本發明亦包含治療懷疑患有子癇前症之懷孕哺乳動物的方法，其包含下列步驟：a) 施用由哺乳動物之生物樣本至本發明之裝置，以測定至少一蛋白質的存在，該至少一蛋白質指示懷孕哺乳動物患有子癇前症；以及 b) 使懷孕哺乳動物進行分娩以治療子癇前症。此外，該裝置亦可用於分娩後，以測定該病患之生物樣本內是否表現一或多個折疊錯誤蛋白質。若一或多個折疊錯誤蛋白質存在，則病患可需更進一步的管理或治療性介入(例如，硫酸鎂(magnesium sulfate)及其他抗高血壓劑的施予)以治療子癇前症，或病患可利用本發明之裝置監控，以指示何時生物樣本內不再檢測到該蛋白質。另外，本發明之裝置可於治療上介入後使用，以測定治療是否成功或測量存在於生物樣本內的目的蛋白的量或存在的變化(例如，減少、移除或增加)。因此，本發明之裝置可用於病患的治療前及治療後，以測定是否需要進一步治療性介入、測定治療性介入是否有效及/或是否需施予治療性介入的替代形式或增加治療劑之劑量，以解決子癇前症或其他蛋白質折疊錯誤疾病。 裝置優點及裝置使用的方法
本發明之裝置至少因以下理由優於習知裝置：1) 該裝置提供較少步驟的簡易測試流程；2) 該裝置提供用於最佳化生產的標準測試材料的使用；3) 該裝置提供測試套件內之檢測試劑的改善穩定性，以提供更長的保存期限；4) 結果更簡單且更容易判讀；5) 保持相對低的成本；以及6) 提供適用於定點照護使用或用於臨床實驗室環境的快速結果。
具體上，提供的裝置及方法遠優於習知用於檢測可能的子癇前症的試紙套件(參照例如，美國專利申請公開號 No. 20150291115)，亦即提供的裝置對於使用者需要更少的步驟，結果更易於判讀且其比試紙套件更為穩定並擁有至少 6 個月的長期保存期限，較佳為 1 年，更佳為 2 年，再更佳為 3 年，再更佳為 4 年，及再更佳為 5 年。本發明之裝置亦提供快速結果(即，由施用生物樣本(如尿液)至該裝置的 3 分鐘以內，較佳為 2 分鐘以內，更佳為 1 分鐘以內或更短時間內)，以適合訓練最少的定點照護用戶使用。
本發明可藉由下列的非限定範例進行說明： 範例 範例1 樣本裝置
第1圖呈現位於片匣或外殼中的本發明之裝置測試片之照片。第1圖的左側描繪在與生物樣本接觸之前外殼中的裝置。第1圖的右側呈現該裝置測已知與子癇前症相關之折疊錯誤蛋白質為陰性、弱陽性及陽性之尿液樣本的結果。
第2圖呈現本發明之裝置之測試片實施例之範例。測試片包含控制組染劑、顯示片、分離器(例如，三片材料)、第二樣本墊、第一樣本墊及於樣本墊上乾燥之染劑。
第3圖呈現本發明之診斷裝置之實施例。第3圖A部分呈現俯視圖。第3圖B部分呈現從側面觀看第3圖A部分之相同實施例。該樣本墊、分離器及顯示片可為彼此對接。第3圖C部分呈現彼此重疊的樣本墊、分離器及顯示片之實施例(側面圖)。
第 4圖顯示於測試片內之不同材料配置。第4圖 A 部分呈現依序具有兩個樣本墊、分離器及顯示片(毛細管床) 的本發明之替代實施例。各片具有與相鄰片的重疊。第4圖B部分呈現具有依序重疊的兩個樣本墊、三重分離器及顯示片之本發明的另一替代實施例，其各片具有與相鄰片的重疊。
第5圖呈現本發明的測試片的量桿配置之範例。此實施例於測試片之頂部上配置有覆蓋帶。在測試片之頂部，覆蓋帶為不透明顏色且可用於支持測試片。於該測試片之中間部，覆蓋帶為透明以提供用於結果的觀測窗。覆蓋帶可被配置使透明觀測窗之位置於例如分離器之上的約10 mm。該觀測窗之覆蓋帶可由顏色(例如，白色)所環繞，以易於觀測結果。於分離器之下，覆蓋帶為不透明顏色以覆蓋分離器。於該測試片之底部，覆蓋帶可顯示以指示利用何端浸入測試樣本中的箭頭，且可顯示以指示測試片浸入樣本時之最大程度的線。於測試片的尾端可沒有覆蓋帶，以便於浸入時測試樣本的吸附。 範例2 材料測試
各種類似紙材料用於測試自懷孕婦女的尿液樣本辨別罹患或未罹患子癇前症的能力。剛果紅(CR)染劑(Sigma. St. Louis, MO)加入至尿液樣本且將一滴加入至材料，以評估適合用於樣本接收、分離器及顯示片的特性。結果點漬在約3分鐘後可視化，並於子癇前症患者及正常控制組孕婦之尿液之間的視覺差異(表1 )。結果「優良(excellent)」代表材料適合提供子癇前症患者的CR尿液與正常孕婦病患之CR尿液之間的可視覺觀察差異，因而材料可使用於診斷測試裝置。結果「不佳(poor)」代表材料不適合提供 CR-子癇前症陽性與CR-控制組尿液之間的可視覺觀察差異。在結果評分表上，結果「不佳(poor)」為最不適合之材料，「微妙(subtle)」為稍佳但不理想，「可(okey)」為較佳，「良好(good)」為更佳，「佳(better)」為更提升且「優良」為最適當之材料。非對稱聚碸類膜被認為提供最佳結果。部分棉花材料如 CF3 及 CF4 效果良好，但其他棉花材料，如 Ahlstrom 270 則效果不佳。硝化纖維及玻璃纖維材料普遍在此用途下效果不佳。 [表1]
製造商 材料 組成 結果
Pall Corp, Port Washington, New York Vivid 非對稱性聚碸類 優良
Pall Corp BTS 非對稱性聚碸類 優良
Whatman, GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA AE98 硝化纖維 可
Whatman AE99 硝化纖維 佳
Whatman FF120 塑膠上之硝化纖維 良好
Whatman FF170HP 塑膠上之硝化纖維 不佳
Whatman FF85 塑膠上之硝化纖維 微妙
Whatman FF80HP 塑膠上之硝化纖維 微妙
Whatman Prima 40 硝化纖維 可
Whatman Prima 125 硝化纖維 較不佳
Whatman Immunopore RP 微妙
Whatman Standard 14 玻璃纖維 不佳
Whatman Standard 17 玻璃纖維 不佳
Whatman CF3 棉花 可
Whatman CF4 棉花 可
Whatman VF2 不佳
Whatman LF1 微妙
Millipore, EMD Millipore,  Billerica, MA HF75 硝化纖維 中等
Millipore HF90 硝化纖維 中等
Millipore HF120 硝化纖維 不佳
Millipore HF135 硝化纖維 不佳
Millipore HF170 硝化纖維 不佳
Millipore HF180 硝化纖維 不佳
Sartorius Stedim,  Bohemia, New York CN150 硝化纖維 微妙
Sartorius Stedim,  CN140 硝化纖維 微妙
Sartorius Stedim,  CN95 硝化纖維 微妙
Ahlstrom, Helsinki Finland 270 棉花 不佳
Ahlstrom 222 不佳
Ahlstrom 320 不佳
Ahlstrom 111 玻璃 不佳
Ahlstrom 142 玻璃 不佳
Ahlstrom 21 不佳
Ahlstrom 141 玻璃 不佳
Ahlstrom 6613 玻璃或聚酯類 不佳
Ahlstrom 6615 不佳
Ahlstrom 181 不佳
Ahlstrom 169 不佳
Ahlstrom 161 不佳
Ahlstrom 151 不佳
Ahlstrom 131 不佳
Ahlstrom 601 棉花 良好
Ahlstrom 237 可
Ahlstrom 238 棉花 微妙
Ahlstrom 8950 棉花或玻璃 不佳
Ahlstrom 8951 玻璃纖維或聚酯類 不佳
Ahlstrom 8964 玻璃纖維  不佳
Ahlstrom CytoSep 1662 專屬(Proprietary) 良好
Ahlstrom CytoSep 1663 專屬 良好
Ahlstrom CytoSep 1660 專屬 良好
Ahlstrom ReliaFlow 319 微妙
Ahlstrom ReliaFlow 800 不佳
Ahlstrom ReliaFlow 1281 微妙
Macherey Nagel Bethlehem, PA MN-260 良好
Macherey Nagel MN-321 微妙
Macherey Nagel MN-615 良好
Macherey Nagel MN-616g 可
Macherey Nagel MN-640 可
Macherey Nagel MN-6176 可
Lypore Rochester, NH 9334 不佳
Lypore 9390 不佳
Lypore 9389 不佳
範例3 測試片
由於 BTS 及 Vivid 在提供子癇前症患者之 CR尿液與控制組孕婦病患之 CR尿液之間的可視覺觀察差異呈現優良結果，因而測試片由 Ahlstrom® 8950 (棉花/玻璃纖維組成物， 8950)樣本墊及BTS 或VividTM 執行片或毛吸管床所組成。剛果紅加入至尿液樣本，並將樣本渦流震盪，其後將樣本施用於測試片之 8950 端。於 BTS 或 VividTM 膜執行片上觀察結果。罹患子癇前症之婦女尿液施用至含有測試片的 VividTM 膜而產生非常清晰訊號(剛果紅染色的粉紅/紅)之結果，且陰性尿液則無訊號。該訊號為依據體積，隨著體積減少則訊號亦減少。在陽性及陰性尿液在較大樣本體積下皆產生陽性染色，而使BTS片顯示其之間無差異。隨著減少施用的樣本體積，而同樣地減少對於陽性或陰性尿液的訊號。 [表2]
執行材料 陽性尿液 染色結果 陰性尿液 結果
Vivid 90 µL 陽性 90 µL 陰性
Vivid 50 µL 弱陽性 50 µL 陰性
Vivid 30 µL 陰性 30 µL 陰性
BTS 90 µL 陽性 90 µL 陽性
BTS 50 µL 弱陽性 50 µL 弱陽性
BTS 30 µL 陰性 30 µL 陰性
以上結果表示 VividTM 材料適用於本發明之診斷測試裝置之材料，而 BTS 則執行不佳。 範例4 分離器材料評估
VividTM 及 BTS 膜被評估作為位於樣本墊與執行片(即毛細管床或顯示片)之間的分離器材料，以測定當施用陰性尿液(即，由未罹患子癇前症婦女之不含目的蛋白之尿液)時是否有助於CR 染劑之留存，且允許具有子癇前症陽性尿液之 CR流經至顯示片。測試片組裝以包含作為樣本墊的8950，其具有VividTM 膜或BTS 膜，隨後為 CytoSep® 1660 執行片。加入 CR 的尿液施用於 8950 且於 CytoSep® 1660 執行片上觀察結果。
當施用陽性尿液(即，由罹患子癇前症婦女之含有目的蛋白的尿液)-剛果紅染劑時，於所有條片上觀察到染色。當施用陰性尿液-剛果紅時，由 VividTM 膜分離器所製之條片為陰性，且由 BST 膜分離器所製之條片呈現部分染劑染色。VividTM 材料為有效的分離器，以在陰性尿液進行測試時，其可留存 CR 染劑，而在陽性尿液進行測試則可通過CR 染劑。BTS 為效果不佳的分離器。 範例5 用於測試片內預載入檢測試劑的材料評估
剛果紅染劑施用於樣本墊材料並使其乾燥。施用陽性尿液並觀察染劑自樣本墊釋放之結果。 [表3]
材料 結果
POREX® 4894  (Porex, Fairburn, GA) 良好的染劑釋放及流動
Porex® X-4897 良好的染劑釋放及流動
Porex® D3883B 中等的染劑釋放，仍留存點漬。
Porex® PVA 不佳的染劑釋放，不流動
Fusion 5-1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh PA) 中等的染劑釋放，仍留存點漬。
Fusion 5-2 (GE Healthcare Life Sciences,) 中等的染劑釋放，仍留存點漬
GF DVA 1 (GE Healthcare Life Sciences,) 不佳的染劑釋放
GF DVA 2 (GE Healthcare Life Sciences,) 不佳的染劑釋放
Whatman® 33 (GE Healthcare Life Sciences,) 中等的染劑釋放，仍留存點漬
該檢測試劑(即，此例子的染劑)理想上為當生物樣本(即，尿液)施用時，自樣本墊材料中釋放。部分材料包括 POREX® 4894 及 Porex® X-4897 提供良好的染劑釋放且因此其高度適用於診斷測試裝置。此外，部分材料亦提供染劑釋放且可適用，例如 Fusion 材料(玻璃微纖維)及 Whatman® 33。 範例6 具有併入測試片之染劑之樣本墊評估
包括浸漬有剛果紅染劑之 Porex® X4897 及 POREX® 4894之樣本墊材料併入至測試片，該測試片具有  VividTM X 分離器及MN-260 執行或顯示片。尿液加入至各條片之樣本墊且 MN-260 顯示片上觀察結果。
結果：當加入尿液時，樣本墊材料釋放染劑。加入子癇前症陽性尿液產生MN260 材料的陽性染色。在大多數的情形，加入子癇前症陰性尿液產生MN260材料的無染色結果；然而在部分情形，於MN-260片的起始仍有部分染色。以上結果顯示 Porex® 、VividTM X及 MN260 材料之配置可提供用於辨別子癇前症陽性尿液及子癇前症陰性尿液，以提供有用的診斷測試裝置。 範例7 側流分析片匣內之測試片評估
條片係由置於 Fusion 5 之上的浸有染劑 POR-4899 樣本墊，隨後為作為分離器的 VividTM X 膜，接著為 MN-260 顯示片所組成。該條片置於通用片匣內，並且樣本墊直接位於片匣之樣本注入口下且MN260 芯片可見於片匣的結果觀測窗。75 µL的尿液被加入至樣本注入口且結果可於結果觀測窗觀察。當加入陽性尿液時，可於結果觀測窗觀察到紅色染色，而當加入陰性尿液時，則不會觀察到染色。該配置提供用於辨別子癇前症陽性及子癇前症陰性之尿液之有效的診斷裝置。 範例8 改良分離器
有時，在條片上測試之陰性尿液在結果片上造成部分條紋，特別是時間過長時。因此評估額外的分離器配置，以觀察是否可實現陽性樣本與陰性樣本的較佳分離，及是否可排除陰性尿液的條紋。條片係由置於 Fusion 5 之上的浸有染劑POR-4899 樣本墊、兩個錯置但重疊層之VividTM X 分離器以及MN260 顯示片所組成。當其施用陰性尿液進行測試時，雙層分離器避免染劑洩漏及條紋，因而提供用以辨別子癇前症陽性及子癇前症陰性之尿液之改善的診斷測試裝置。 範例9 裝置片配置
POR-4899使用運動分配機(Kinematic dispensing machine)分配6µl/cm 之剛果紅染料進行條紋化。 POR-4588 則以 4µl/cm 進行條紋化。墊片於 37 ℃乾燥 1 小時並保存於防潮箱。測試片由條紋化POR 材料、一層 VividTM X 分離器及 MN-260 所組成。POR-4899片於進行尿液測試時效果良好；然而，當含有POR-4588之條片進行陰性尿液測試時，於顯示片上產生染劑洩漏。當POR-4588以4µl/cm條紋化時進一步的評估，則產生乾淨的陰性尿液運行。 其後，POR-4588以6 µl/cm 或 8 µl/cm條紋化並與雙層 VividTM X 分離器組成來進行評估。與 6µl/cm染劑片組成之條片於陰性尿液測試時得到最佳結果，且於陰性尿液測試時具有最低量的染劑洩漏及條紋。進一步地，具有3層VividTM X 分離器且以8µl/cm條紋化之 POR-4588 的評估得到良好結果及較強的陽性訊號。 [表4]
染劑墊 剛果紅分配比例 分離器 陽性/陰性辨別
POR-4899 6 µl/cm 單層 VividTM X分離器 √
POR-4588 4 µl/cm 單層 VividTM X分離器 偽陽性
POR-4588 6 µl/cm 雙層 VividTM X分離器 √
POR-4588 8 µl/cm 雙層 VividTM X分離器 √
以具有施用 8µl/cm 之剛果紅的 POR-4588 及雙層 Vivid 分離器所配置之裝置於測試子癇前症陰性尿液時呈現乾淨的陰性結果，且於測試子癇前症陽性尿液時呈現強陽性結果，因此其為較佳的診斷測試裝置配置。 範例10 測桿型測試設計之評估
測試片是利用在6µl/cm、8µl/cm 及 10µl/cm 條紋化之 POR-4588與三層 VividTM X 分離器及 MN-260所組成。條片浸入至60 µL 之尿液。該尿液成功地被吸附上該條片，且以8µl/cm條片的方式提供最佳的陽性測試結果及乾淨的陰性測試結果。因此，診斷測試裝置之適當測桿形式可以此方式配置且其可將子癇前症陽性及子癇前症陰性之尿液的辨別使用於診斷目的。 範例11 診斷測試裝置配置之進一步評估
由兩個 Porex® 樣本墊，其一有染劑條紋；三層 VividTM X 分離器以及 MN260所製成的測試片於片匣/外殼中進行測試且作為用於測試尿液的測桿。該片匣外殼可能因控制樣本於樣本墊的中心點上的流動、良好的染劑吸收、向上流至條片的中心、及執行片染色結果更均質而改善了結果。5 個陰性尿液皆測試為陰性；5 個陽性尿液樣本得到 2 個弱陽性、3 個陽性結果。作為測桿型，測試片置入於測試管內 100 µl尿液中。在 3 分鐘時，所有陽性及陰性尿液的結果陰性。然而，在給予更多時間後，至 5 分鐘時的陽性尿液結果為 2 個弱陽性、3 個陽性，而陰性尿液仍為陰性。因此，此測試配置皆適用於子癇前症診斷測試裝置。 範例12 執行控制組之評估
本實驗之目的為探討指示何時樣本成功地跑上(run up)測試片之控制組，即「執行控制組(run control)」。當陰性生物樣本進行測試且於顯示片或結果片上沒有觀察到染色時，是難以告知其為陰性結果或測試沒有正確地執行(即，發生沒有確實加入樣本、加入的樣本不足或吸附上條片的樣本不足)。當水溶性著色的條紋噴佈於執行片材料上，並定位以在組裝於外殼時，其將可見於外匣結果觀測窗之頂部。利用樣本經由樣本注入口施加至樣本墊並可經由結果觀測窗進行觀察。當樣本到達控制組染劑條紋時，溶解該條紋並與樣本一起進行。執行控制組條紋的消失提供簡易的視覺指標，以指示該樣本已成功流過條片。控制組不干擾尿液測試的判讀結果。控制組條紋染劑之一例為酒石黃。可作為執行控制組之其他染劑包括：食用藍色1號-亮藍色FCF，E133(藍色色澤) (FD&C Blue No. 1 – Brilliant Blue FCF, E133 (blue shade))、食用藍色2號-靛藍，E132(靛藍色色澤) (FD&C Blue No. 2 – Indigotine, E132 (indigo shade))、食用綠色3號-固綠FCF，E143-(綠松石色澤) (FD&C Green No. 3 – Fast Green FCF, E143 (turquoise shade))、食用紅色7號-赤蘚紅，E127(粉紅色澤) (FD&C Red No. 3 – Erythrosine, E127 (pink shade))、食用紅色40號-誘惑紅AC，E129(紅色色澤) (FD&C Red No. 40 – Allura Red AC, E129 (red shade))、食用黃色4號-檸檬黃，E102(黃色色澤) (FD&C Yellow No. 5 – Tartrazine, E102 (yellow shade))及食用黃色5號-日落黃FCF，E110(橙色色澤) (FD&C Yellow No. 6 – Sunset Yellow FCF, E110 (orange shade))。 範例13 分離器的替代材料的探討
測試片由兩個 Porex® 樣本墊，其第一樣本墊以剛果紅(CR)染劑條紋化；如表5所示的各種替代分離器材料；以及 MN-260執行片所組成。陰性尿液樣本於組合測試片上進行測試且評估各分離器之以下能力：1) 留存樣本內不存在目的蛋白時的 CR 染劑的能力以及 2)不留存結合CR的蛋白質之 能力。 [表5]
分離器材料 陰性樣本的測試結果 陽性樣本的測試結果
EMI 11513 (EMI Specialty Papers, Redding, CT)   陰性，少量染劑流失 陽性
EMI 5475 (EMI Specialty Papers) 陰性，極少量染劑流失 陽性
EMI 5493 (EMI Specialty Papers) 陰性，少量染劑流失 陽性
ReliaFlow 1281 陰性，少量染劑流失 陽性(條狀)
Ahlstrom 642 陰性，極少量染劑流失 陽性
Whatman® Standard 17 陰性，中量染劑流失 陽性(條狀)
Millipore C048 陰性，極少量染劑流失 弱陽性
Whatman® LF1 陰性，少量染劑流失 弱陽性
Whatman® VF2 陰性，極少量染劑流失 弱陽性
Whatman® CF1 陰性，少量染劑流失 陽性
Whatman® CF3 陰性，極少量染劑流失 陽性
結果：大部分上述之分離器材料顯示允許嗜剛果紅蛋白質-陽性生物樣本(嗜剛果紅蛋白質陽性尿液)與嗜剛果紅蛋白質-陰性生物樣本(嗜剛果紅蛋白質陰性尿液)的識別。
為更進一步改善陰性樣本測試時的檢測試劑(CR)之留存，測試片接著利用表 6 中描述之選擇之分離器材料以三層製成。 [表6]
分離器材料 陰性樣本的測試結果 陽性樣本的測試結果
EMI 11513 陰性 弱陽性
642 陰性 陽性
C048 陰性 弱陽性
CF1 陰性，少量流失 陽性
結果：三層分離器有效地留存未結合之 CR 檢測試劑而不使其進入顯示片。然而，由 EMI 11513 及 C048 製成之三層分離器配置亦降低測試陽性樣本之結果訊號強度。由 642 製成之三層分離器在測試的分離器之中，提供陽性樣本及陰性樣本兩者的最佳結果。 範例14 分離器材料的進一步探討
為更進一步探討使用作為本發明之診斷測試裝置內之分離器的適當材料，測試片由兩個 Porex® 樣本墊，其中第一樣本墊以CR 染劑(8 µl/cm)條紋化；如表 7 所述之分離器；以及 MN260執行片所組成。各配置之測試片皆以嗜剛果紅陰性尿液樣本、兩個弱陽性嗜剛果紅蛋白樣本及兩個強陽性嗜剛果紅蛋白樣本進行測試。 [表7]作為單層的分離器材料之探討
材料 陰性 弱陽性 強陽性 弱陽性 強陽性
EMI 11513 - +-   +- ++
237 - + ++ + ++
319 - + ++ + ++
CF1 - +- ++ +- +
VividTM - ++ ++ +- ++
5475 - + ++ +- ++
5493 - +- ++ +- ++
C048 - +-- + +-- +
CF3 - +-- + +-- +
238 - + + +- +
601 - + + + +
1281 - +- + +- ++
642 - +- + +-- +
MN640m - +- + +-- +
MN615 - +- ++ +- +
意外的，5493 結果較 5475 之結果弱，其中 5493 相較於 5475 具有約 4 倍的吸收性及 2 倍快的毛細上升特性。此結果顯示吸收性低且毛細上升較慢之材料對於穩定化訊號為較佳的。同樣地，CF3 較具有兩倍吸收力的 CF1 弱。材料 238 具有較 237 弱之訊號，且具有兩倍的吸附速度，且 319 在此列表中呈現最強的顏色結果，其具有最慢的吸附速度。運行較快的材料之MN640具有比 MN-615弱的訊號。
結果顯示具有較弱的吸收性、較慢的毛細上升或吸附速度之材料對於更穩定化訊號可為較佳材料。 範例15 診斷檢測裝置之評估
組成完整的測試片，其包含：置於 Fusion 5 (由 GE 生產的專屬單層基質膜)之頂部上的浸有染劑之Porex® 樣本墊、VividTM 膜片分離器以及 MN260毛細管床膜。該測試片容納於通用 LFA 片匣殼。尿液樣本加入至圓形樣本槽，且於三分鐘時於矩形觀測窗觀察結果。
結果：陰性尿液樣本於觀測窗無觀測到染劑，弱陽性尿液樣本觀測到淡粉紅色，強陽性尿液樣本觀測到深粉紅色。上述結果表示此為用於檢測樣本內嗜剛果紅蛋白的診斷測試裝置用以診斷子癇前症的適當配置。 範例16 最佳化分離器材料的進一步評估
組成完整的測試片，其包含：浸有染劑之 Porex® 樣本墊，第二Porex® 樣本墊(不含染劑)、 11513、5475、319、247 或 CF1 的單層或雙層分離器、具有Whatman 470芯片之 MN260 膜毛細管床。MN260 含有酒石黃染劑之執行控制組條紋。該測試片被容納於類似LFA片匣，以使測試樣本添加至浸有染劑之 Porex® 墊上、以及使 觀測窗居中於MN260膜上最佳化，以在執行測試之前可觀察到酒石黃染劑，而執行測試之後觀測不到。尿液樣本加入至圓形樣本槽且結果在三分鐘後可於該矩形觀測窗觀測結果。 結果
在三分鐘後，陰性尿液樣本於觀測窗沒有觀測到染劑，弱陽性尿液樣本觀測到淡粉紅色，且強陽性尿液樣本觀測到深粉紅色/紅色。此外，在加入樣本之前明顯之黃色酒石黃染劑條紋可觀察到隨著樣本吸附而移動，且三分鐘後幾乎不可視或完全消失。上述結果表示此為用於檢測樣本內嗜剛果紅蛋白的診斷測試裝置用以診斷子癇前症的適當配置。 範例17 本裝置之結果與CRD測試結果
本發明之測試裝置藉由測試自疑似罹患子癇前症婦女的剛果紅點狀(CRD)測試之研究的105 個臨床尿液樣本進行評估(Rood 等人，2016 AJOG, 214(1)s24-s25)。該樣本進行選擇而提供 27 個強陽性樣本、28 個陰性樣本及 50 個弱陽性樣本。該樣本之陰性/陽性狀態由 %CRR定義(Irina A. Buhimschi 等人,Sci. Transl. Med. 6, 245ra92 (2014))。該樣本皆被加至檢測裝置且結果皆於三分鐘後進行視覺評分：陰性(- 或 0)、弱陽性(+ 或 1)或強陽性(++ 或 2)。
結果顯示測試裝置結果與 CRD 結果為103/105個(98 %)樣本一致。當與子癇前症的判定診斷(基於 ACOG準則：Hypertension in Pregnancy Report of the American College of Obstetricians and Gynecologists’ Task Force on Hypertension in Pregnancy, 2013 Obstetrics & Gynecology 122(5): 1122-1131))進行比較時，本發明之裝置之測試結果顯示具有 91% 之靈敏度；64% 之特異性，82% 的準確率，其中陽性預測值為 83% 及陰性預測值為 79%。
當測試樣本加入該測試之樣本槽上，於 30 秒後可觀察到液體前端移上測試片。於約1分鐘時該前端觸及黃色染劑控制條紋並於約 1.5 分鐘時移至該觀測窗至末端。隨著液體前端移至結果觀測窗的 30 秒及之後可清楚見到強陽性結果。測視窗的完整結果著色約1.5分鐘。由於液體前端通常在加入樣本後的約1至3分鐘以於結果觀測窗顯色而顯示陰性，因此弱陽性結果較強陽性結果需更長的時間進行解析。第 1 圖呈現結果的範例。 範例18 裝置使用尿液樣本控制組之評估
組成的裝置測試片包含：浸有120ug/裝置染劑的Porex® 4588樣本墊、第二 Porex® 樣本墊(不含染劑)、Ahlstrom 319之雙層分離器、具有Whatman 470芯片之MN260膜毛細管床。MN260 含有酒石黃染劑之執行控制組條紋。該測試片被容納於類似LFA片匣，以使測試樣本添加至浸有染劑之 Porex® 墊上、以及使 觀測窗居中於MN260膜上最佳化，以在執行測試之前可觀察到酒石黃染劑，而執行測試之後觀測不到。
自確認罹患子癇前症的5位病患之尿液樣本匯集並建立陽性分析控制組。嗜剛果紅蛋白之存在藉由剛果紅點漬測試 (Buhimschi 2014)進行確認。磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline)(10 mM 磷酸鹽(phosphate)， pH 7.4， 150 mM NaCl)使用作為陰性控制組且用於系列稀釋陽性分析控制組。製備以下比例之稀釋溶液(樣本對緩衝液總體積之比例)：未稀釋、1:4、1:8、1:15 及 1:40。各系列稀釋之尿液樣本於裝置中以二重複測試。
結果：對於特定稀釋的各尿液樣本之各重複在該裝置上呈現相同染色密度。該測試結果呈現於下表。
[表8]匯集尿液樣本之系列稀釋的測試結果
稀釋 測試結果
未稀釋 +++
1:4 ++
1:8 +
1:10 +
1:15 +
1:40 -
上列數據證實該診斷裝置可檢測嗜剛果紅性蛋白質，且該效應為可滴定的(titratable)。該數據亦表示，該裝置對應於嗜剛果紅性蛋白質的濃度增加而呈現紅色的漸進式視覺量表(progressive visual scale)。
無
第1圖呈現位於片匣或外殼中的本發明之測試片(test strip)裝置之照片。第 1 圖的左側描繪在與生物樣本接觸之前外殼中的裝置，其具有樣本槽、結果窗口及控制線。第 1 圖的右側呈現該裝置測試已知與子癇前症相關之折疊錯誤蛋白質為陰性、弱陽性及陽性之尿液樣本的結果。
第 2 圖呈現本發明裝置之測試片實施例之範例。該測試片包含控制組染劑、顯示片(或毛細管床)、分離器(例如，三片材料)、第二樣本墊(或樣本接收材料)、第一樣本墊(或樣本接收材料)及於樣本墊上乾燥之染劑。
第 3 圖呈現本發明之診斷裝置之實施例。第 3 圖 A 部分呈現具有樣本墊、分離器、及顯示片之俯視圖。第 3 圖 B 部分呈現從側面觀看第 3 圖 A 部分之相同實施例。該樣本墊、分離器及顯示片可彼此對接(butted)。第 3 圖 C 部分呈現彼此重疊的樣本墊、分離器及顯示片之實施例(側面圖)。
第 4 圖顯示於測試片內之不同材料配置。第 4 圖 A 部分呈現具有兩個樣本墊、分離器及顯示片(毛細管床)的本發明之替代實施例，其各片依序具有與相鄰片的重疊。第 4 圖 B 部分呈現具有依序重疊的兩個樣本墊、三重分離器及顯示片之本發明的另一替代實施例，其各片具有與相鄰片的重疊。
第5圖呈現本發明的測試片的量桿配置之範例。此實施例於測試片之頂部上配置有覆蓋帶。在測試片之頂部，覆蓋帶為不透明顏色且可用於支持測試片。於中間部，覆蓋帶為透明以提供用於結果的觀測窗。覆蓋帶可被配置成使透明觀測窗於例如分離器之上的約10 mm。於觀測窗的覆蓋帶可由顏色(例如，白色)所環繞，以易於觀測結果。於分離器之下，覆蓋帶為不透明顏色以覆蓋分離器。於測試片之底部，覆蓋帶可顯示以指示利用何端浸入測試樣本中的箭頭，且可顯示以指示測試片浸入樣本之最大程度的線。於測試片的尾端可沒有覆蓋帶，以便於浸入時測試樣本的吸附(wicking)。

Claims (28)

  1. 一種檢測一產後哺乳動物是否患有子癇前症並評估是否需要進行一治療介入的方法，該方法包括以下步驟： a) 在足以允許至少一蛋白質與一檢測試劑結合的時間及條件下，將該產後哺乳動物的一生物樣本施加至一診斷裝置中的樣本接收材料一段時間；以及 b) 檢測該診斷裝置之一毛細管床上之該檢測試劑的存在， 其中，於該毛細管床上存在該檢測試劑，表示該至少一蛋白質存在於該生物樣本中，且該產後哺乳動物患有子癇前症以及需要進行該治療介入， 其中，於該毛細管床上不存在該檢測試劑，表示該產後哺乳動物沒有患有子癇前症。
  2. 如請求項1所述的方法，其中當檢測該產後哺乳動物患有子癇前症時，該方法更包括以下步驟： c) 向該產後哺乳動物施用硫酸鎂以進行該治療介入。
  3. 如請求項2所述的方法，其中該方法更包括以下步驟： d) 在足以允許該至少一蛋白質與該檢測試劑結合的時間及條件下，將該產後哺乳動物的該生物樣本施加至該診斷裝置中的樣本接收材料一段時間，以確認該治療介入有效地解決該產後哺乳動物所患有的子癇前症；以及 e) 檢測該診斷裝置之該毛細管床上之該檢測試劑的存在， 其中，於該毛細管床上存在該檢測試劑，表示該至少一蛋白質存在於該生物樣本中，且該產後哺乳動物仍患有子癇前症和需要進一步進行該治療介入， 其中，於該毛細管床上不存在該檢測試劑，表示該產後哺乳動物患有的子癇前症已被有效的解決。
  4. 如請求項1所述的方法，其中當檢測該產後哺乳動物沒有患有子癇前症時，該方法更包括以下步驟： c) 在隔一段時間後，在足以允許該至少一蛋白質與該檢測試劑結合的時間及條件下，將該產後哺乳動物的該生物樣本施加至該診斷裝置中的樣本接收材料一段時間；以及 b) 檢測該診斷裝置之該毛細管床上之該檢測試劑的存在， 其中，於該毛細管床上存在該檢測試劑，表示該至少一蛋白質存在於該生物樣本中，且該產後哺乳動物患有子癇前症以及需要進行該治療介入。
  5. 如請求項4所述的方法，其中該方法更包括以下步驟： e) 向該產後哺乳動物施用硫酸鎂以進行該治療介入。
  6. 如請求項5所述的方法，其中該方法更包括以下步驟： f) 在足以允許該至少一蛋白質與該檢測試劑結合的時間及條件下，將該產後哺乳動物的該生物樣本施加至該診斷裝置中的樣本接收材料一段時間，以確認該治療介入有效地解決該產後哺乳動物所患有的子癇前症；以及 g) 檢測該診斷裝置之該毛細管床上之該檢測試劑的存在， 其中，於該毛細管床上存在該檢測試劑，表示該至少一蛋白質存在於該生物樣本中，且該產後哺乳動物仍患有子癇前症以及需要進一步進行該治療介入， 其中，於該毛細管床上不存在該檢測試劑，表示該產後哺乳動物患有的子癇前症已被有效的解決。
  7. 如請求項1所述的方法，其中該檢測試劑係選自由偶氮染劑、硫代黃素T以及偶氮染劑類似物所組成的群組。
  8. 如請求項7所述的方法，其中該偶氮染劑為剛果紅。
  9. 如請求項1所述的方法，其中該方法與選自由以下至少一種方法結合使用：獲得該產後哺乳動物至少一血壓讀數、獲得該產後哺乳動物至少一血小板計數、測量該產後哺乳動物至少一血清肌酸酐濃度水平、測量該產後哺乳動物至少一血清丙胺酸轉胺酶 (ALT) 濃度水平以及測量該產後哺乳動物至少一天冬胺酸轉胺酶 (AST) 濃度水平。
  10. 如請求項9所述的方法，其中該方法與選自由以下至少一種子癲前症病癥的觀察結合使用：體重增加、暈眩、頭痛以及視線模糊。
  11. 一種檢測一哺乳動物已患有或有風險患有一蛋白質錯誤折疊障礙的方法，該方法包括以下步驟： a) 在足以允許至少一蛋白質與一檢測試劑結合的時間及條件下，將該哺乳動物的一生物樣本施加至一診斷裝置中的樣本接收材料一段時間； b) 檢測該診斷裝置之一毛細管床上之該檢測試劑的存在， 其中，於該毛細管床上存在該檢測試劑，表示該至少一蛋白質存在於該生物樣本中， 其中，該至少一蛋白質選自由α1-抗胰蛋白酶 (SerpinA1)、血漿銅藍蛋白、重鏈IgG、輕鏈IgG、可誘導干擾素蛋白質6-16 (IF-16-6，G1P3)、白蛋白以及其斷片所組成的群組；以及 c) 確定該哺乳動物的該生物樣品內之具有至少一生物標記的存在， 其中，該至少一生物標記與該蛋白質錯誤折疊障礙相關，且該至少一生物標記不同於步驟a)所述的該至少一種蛋白質， 其中，該至少一蛋白質的存在以及該至少一種生物標記的存在，將證實該哺乳動物患有該蛋白質錯誤折疊障礙。
  12. 如請求項11所述的方法，其中該檢測試劑係選自由偶氮染劑、硫代黃素T以及偶氮染劑類似物所組成的群組。
  13. 如請求項12所述的方法，其中該偶氮染劑為剛果紅。
  14. 如請求項11所述的方法，其中該至少一生物標記選自由sFlt-1、PlGF、PP-A、PP13、正五聚蛋白(pentraxin)、抑制素-A(inhibin-A)以及可溶之內皮因子(endoglin)所組成的群組。
  15. 如請求項11所述的方法，其中該蛋白質錯誤折疊障礙係為子癲前症。
  16. 如請求項11所述的方法，其中該哺乳動物係為產前或產後的狀態。
  17. 一種對一哺乳動物已患有或有風險患有一蛋白質錯誤折疊障礙，進行必要的一治療介入，並對於持續該治療介入的該哺乳動物進行持續監測的方法，該方法包括以下步驟： a) 在足以允許至少一蛋白質與一檢測試劑結合的時間及條件下，將該哺乳動物的一生物樣本施加至一診斷裝置中的樣本接收材料一段時間； b) 檢測該診斷裝置之一毛細管床上之該檢測試劑的存在， 其中，於該毛細管床上存在該檢測試劑，表示該至少一蛋白質存在於該生物樣本中； c) 透過該診斷裝置測量該哺乳動物的該生物樣本中該至少一蛋白質的一第一含量； d) 在一個時間間隔之後，重複步驟a)到c)以測量該至少一種蛋白質的一第二含量；以及 e) 比較從步驟 c) 以及 d) 獲得的該至少一種蛋白質的該第一含量以及該第二含量， 其中(i)，該至少一種蛋白質的含量增加，表示該哺乳動物需要進行該治療介入、持續該治療介入或持續監測， 其中(ii)，該至少一種蛋白質的含量減少，表示該哺乳動物不需要進行該治療介入、需要持續該治療介入或需要持續監測， 其中(iii)，該至少一種蛋白質的含量不變，表示該哺乳動物需要進行該治療介入、持續該治療介入或持續監測。
  18. 如請求項17所述的方法，其中當步驟d) 檢測結果該至少一種蛋白質不存在時，表示該哺乳動物不再患有該蛋白質錯誤折疊障礙。
  19. 如請求項17所述的方法，其中該檢測試劑係選自由偶氮染劑、硫代黃素T以及偶氮染劑類似物所組成的群組。
  20. 如請求項19所述的方法，其中該偶氮染劑為剛果紅。
  21. 如請求項17所述的方法，其中該蛋白質錯誤折疊障礙係為子癲前症。
  22. 如請求項17所述的方法，其中該哺乳動物係為產前或產後的狀態。
  23. 一種對一哺乳動物已患有或有風險患有一蛋白質錯誤折疊障礙，根據至少一種蛋白質的變化量，以確定對該哺乳動物進行一治療介入方法的必要性，該方法包括以下步驟： a) 在足以允許該至少一蛋白質與一檢測試劑結合的時間及條件下，將該哺乳動物的一生物樣本施加至一診斷裝置中的樣本接收材料一段時間； b) 檢測該診斷裝置之一毛細管床上之該檢測試劑的存在， 其中，於該毛細管床上存在該檢測試劑，表示該至少一蛋白質存在於該生物樣本中； c)以視覺化檢驗在該毛細管床上之該檢測試劑之一顏色強度； d) 在一個時間間隔之後，重複步驟a)到c)以視覺化檢驗該檢測試劑之該顏色強度；以及 e) 比較從步驟 c) 以及 d) 該檢測試劑之該顏色強度， 其中(i)，與步驟c)相比，在步驟d)中該檢測試劑之該顏色強度增加，表示該至少一種蛋白質的含量增加，且該哺乳動物需要進行該治療介入、持續該治療介入或持續監測， 其中(ii)，與步驟c)相比，在步驟d)中該檢測試劑之該顏色強度降低，表示該至少一種蛋白質的含量減少，且該哺乳動物不需要進行該治療介入、需要持續該治療介入或需要持續監測， 其中(iii)，與步驟c)相比，在步驟d)中該檢測試劑之該顏色強度相同，表示該至少一種蛋白質的含量不變，且該哺乳動物需要進行該治療介入、持續該治療介入或持續監測，
  24. 如請求項23所述的方法，其中當步驟d) 中該檢測試劑沒有產生顏色，表示該哺乳動物不再患有該蛋白質錯誤折疊障礙。
  25. 如請求項23所述的方法，其中該檢測試劑係選自由偶氮染劑、硫代黃素T以及偶氮染劑類似物所組成的群組。
  26. 如請求項25所述的方法，其中該偶氮染劑為剛果紅。
  27. 如請求項23所述的方法，其中該蛋白質錯誤折疊障礙係為子癲前症。
  28. 如請求項23所述的方法，其中該哺乳動物係為產前或產後的狀態。
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