TW202130805A - 增生抑制劑 - Google Patents

Abstract

本發明的目的是提供一種將與經分化誘導之胰島素分泌細胞共存之非內分泌性的目標外細胞去除的方法。本發明係關於產生胰島素之細胞集團的製造方法，包含以PLK阻礙劑處理由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團的步驟。

Description

增生抑制劑

本發明係關於將存在於由多能性幹細胞分化誘導所得之產生胰島素之細胞集團或胰β細胞集團中之非內分泌性的目標外細胞去除的方法。

目前正進行著由iPS細胞或ES細胞等多能性幹細胞分化誘導稱為胰島素產生細胞或胰β細胞之胰島素分泌細胞，並應用於糖尿病治療之研究。

截至目前，已開發、報導用以由多能性幹細胞分化誘導成胰島素分泌細胞集團之各種方法(非專利文獻1)。然而，於分化誘導所得之胰島素分泌細胞集團中，除了作為目標之胰島素分泌細胞，亦同時包含非內分泌性的細胞，為了增進對於糖尿病治療的利用，期望更有效率地取得作為目標之胰島素分泌細胞的方法。

[先前技術文獻]

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Stem Cell Research(2015)14, 185-197

本發明者們發現，由多能性幹細胞分化誘導成產生胰島素之細胞或胰β細胞的細胞集團中，除了此等胰島素分泌細胞(產生胰島素之細胞或胰β細胞)，存在有藉由染色顆粒素A(以下，記載為「CHGA」)陰性為特徵之非內分泌性細胞(以下，有記載為「CHGA陰性細胞」的情況)。再者，發現CHGA陰性細胞中，包含以Ki67標記陽性為特徵之增生性高的細胞(CHGA陰性且Ki67陽性細胞)。

欲將經分化誘導的胰島素分泌細胞應用於糖尿病的治療等時，由安全性的觀點而言，嚴密地控制胰島素分泌細胞以外的細胞係極為重要的。再者，具有高增生性之細胞的混入、殘存，有對接受者的壞影響或影響所移植的胰島素分泌細胞的長期存活之虞，而不佳。

此處，本發明係以提供去除與所分化誘導之胰島素分泌細胞共存之CHGA陰性細胞的方法為目的。

本發明者們，為了解決上述課題而致力研究的結果，發現將由多能性幹細胞分化誘導所得之胰前驅細胞集團，較佳係內分泌前驅細胞集團，更佳係產生胰島素之細胞集團，或處於在此之後的分化階段的細胞集團以PLK阻礙劑處理，藉此，可抑制CHGA陰性細胞的增生，可獲得此等細胞的含量已減低的胰前驅細胞集團、內分泌前驅細胞集團、產生胰島素之細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團。

本發明係基於該等新穎發現者，包含下列發明。

[1]一種產生胰島素之細胞集團的製造方法，係包含以PLK阻礙劑處理由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團的步驟。

[1-1]一種產生胰島素之細胞集團的製造方法，係包含以PLK阻礙劑處理由多能性幹細胞所分化誘導之內分泌前驅細胞集團的步驟。

[1-2]一種產生胰島素之細胞集團的製造方法，係包含以PLK阻礙劑處理由多能性幹細胞所分化誘導之胰前驅細胞集團的步驟。

[2]如[1]至[1-2]中任一項製造方法，其中，所製造的細胞集團係以20%以下的比率包含CHGA陰性細胞。

[3]如[1]至[2]中任一項製造方法，其中，所製造的細胞集團係以3%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[4]如[1]至[3]中任一項製造方法，其中，所製造的細胞集團係以15%以上的比率包含胰島素陽性且NKX6.1陽性的細胞。

[5]如[1]至[4]中任一項製造方法，係更包含使以PLK阻礙劑處理後的細胞集團分化的步驟。

[6]如[1]至[5]中任一項製造方法，係以3μM以下的PLK阻礙劑進行處理。

[7]一種抑制CHGA陰性細胞之增生的方法，該CHGA陰性細胞係存在於由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團中，

該方法係包含以PLK阻礙劑處理該細胞集團。

[7-1]一種抑制CHGA陰性細胞之增生的方法，該CHGA陰性細胞係存在於由多能性幹細胞所分化誘導之內分泌前驅細胞集團中，

該方法係包含以PLK阻礙劑處理該細胞集團。

[7-2]一種抑制CHGA陰性細胞之增生的方法，該CHGA陰性細胞係存在於由多能性幹細胞所分化誘導之胰前驅細胞集團中，

該方法係包含以PLK阻礙劑處理該細胞集團。

[8]如[7]之方法，係以3μM以下的PLK阻礙劑處理產生胰島素之細胞集團。

[9]如[7]或[8]的方法，係使存在於產生胰島素之細胞集團中的CHGA陰性細胞減少成20%以下的比率。

[10]如[7]至[9]中任一項方法，係使存在於由多能性幹細胞所分化誘導之細胞集團中的CHGA陰性且Ki67陽性的細胞減少成3%以下的比率。

[11]如[7]至[10]中任一項方法，係使存在於由多能性幹細胞所分化誘導之細胞集團中的胰島素陽性且NKX6.1陽性的細胞增大成15%以上的比率。

[12]一種細胞集團，係經PLK阻礙劑處理，且為由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團，並且，以20%以下的比率包含CHGA陰性細胞。

[13]如[12]之細胞集團，係以3%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[14]如[12]或[13]之細胞集團，係以15%以上的比率包含胰島素陽性且NKX6.1陽性的細胞。

[15]如[12]至[14]中任一項細胞集團，係使用於移植用。

[16]一種治療糖尿病用的醫藥，係包含[12]至[15]中任一項細胞集團。

[17]一種用以治療或預防糖尿病的方法，係包含將以PLK阻礙劑處理後之由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團移植的步驟。

[18]如[1]至[6]中任一項製造方法，其中，PLK阻礙劑係PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑。

[19]如[1]至[6]中任一項製造方法，其中，PLK4阻礙劑係PLK4的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[20]如[1]至[6]中任一項製造方法，其中，PLK4阻礙劑係(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-二甲基-4-嗎啉基]甲基]苯基]乙烯基]-1H-咪唑-6-基]-5’-甲氧基-螺[環丙烷-1,3’-[³H]吲哚]-2’(1’H)-酮(CAS No.1338800-06-8)或其鹽。

[21]如[1]至[6]中任一項製造方法，其中，PLK1阻礙劑係PLK1的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[22]如[1]至[6]中任一項製造方法，其中，PLK1阻礙劑係(R)-5-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-3-(1-(2-(三氟甲基)苯基)乙氧基)噻吩-2-羧醯胺(CAS No.929095-18-1)或此等之鹽。

[23]如[7]至[11]中任一項方法，其中，PLK阻礙劑係PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑。

[24]如[7]至[11]中任一項方法，其中，PLK4阻礙劑係PLK4的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[25]如[7]至[11]中任一項方法，其中，PLK4阻礙劑係(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-二甲基-4-嗎啉基]甲基]苯基]乙烯基]-1H-咪唑-6-基]-5’-甲氧基-螺[環丙烷-1,3’-[³H]吲哚]-2’(1’H)-酮(CAS No.1338800-06-8)或其鹽。

[26]如[7]至[11]中任一項方法，其中，PLK1阻礙劑係PLK1的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[27]如[7]至[11]中任一項方法，其中，PLK1阻礙劑係(R)-5-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-3-(1-(2-(三氟甲基)苯基)乙氧基)噻吩-2-羧醯胺(CAS No.929095-18-1)或此等之鹽。

[28]如[12]至[15]之任一項細胞集團，其中，PLK阻礙劑係PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑。

[29]一種治療糖尿病用的醫藥，係包含[28]之細胞集團。

[30]如[17]的方法，其中，PLK阻礙劑係PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑。

[31]如[5]的方法，其中，使以PLK阻礙劑處理後之產生胰島素之細胞集團分化的步驟，係藉由移植至動物而進行。

[32]如[7]至[11]中任一項方法，係使前述存在於細胞集團中的CHGA陰性細胞的絕對數減少。

[33]如[7]至[11]中任一項方法，係不使非前述存在於細胞集團中的CHGA陰性細胞的細胞數減少。

[34]如[12]至[14]中任一細胞集團，係以2%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[35]如[12]至[14]中任一項細胞集團，係以1%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[36]一種前藥，係包含[12]至[14]、[34]及[35]中任一項細胞集團。

[37]一種製造方法，係製造產生胰島素之細胞集團或胰β細胞集團的方法，包含下列步驟：

(1)以PLK阻礙劑處理產生胰島素之細胞集團或胰β細胞集團的步驟、以及

(2)於包含活體適合性材料的凝膠中包埋產生胰島素之細胞集團的步驟。

[38]一種製造方法，係製造產生胰島素之細胞集團或胰β細胞集團的方法，包含下列步驟：

(0)藉由純化標的細胞集團之方法，使標的細胞集團的純度成為至少70%以上的步驟、

(1)以PLK阻礙劑處理產生胰島素之細胞集團或胰β細胞集團的步驟、以及

(2)使以PLK阻礙劑處理後之產生胰島素之細胞集團進行分化的步驟。

[39]如[30]之製造方法，其中，PLK4阻礙劑係PLK4的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[40]如[30]之製造方法，其中，PLK4阻礙劑係(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-二甲基-4-嗎啉基]甲基]苯基]乙烯基]-1H-咪唑-6-基]-5’-甲氧基-螺[環丙烷-1,3’-[³H]吲哚]-2’(1’H)-酮(CAS No.1338800-06-8)或其鹽。

[41]如[30]之製造方法，其中，PLK1阻礙劑係PLK1的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[42]如[30]之製造方法，其中，PLK1阻礙劑係(R)-5-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-3-(1-(2-(三氟甲基)苯基)乙氧基)噻吩-2-羧醯胺(CAS No.929095-18-1)或此等之鹽。

[43]如[17]、[30]及[39]至[42]中任一項方法，其中，前述細胞集團係以20%以下的比率包含CHGA陰性細胞。

[44]如[17]、[30]及[39]至[42]中任一項方法，其中，前述細胞集團係以3%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[45]如[17]、[30]及[39]至[42]中任一項方法，其中，前述細胞集團係以15%以上的比率包含胰島素陽性且NKX6.1陽性的細胞。

[46]一種細胞集團，係使用於用以治療或預防糖尿病的方法中，並且，經PLK阻礙劑處理之由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團。

[47]如[46]的細胞集團，其中，PLK阻礙劑係PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑。

[48]如[47]的細胞集團，其中，PLK4阻礙劑係PLK4的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[49]如[47]的細胞集團，其中，PLK4阻礙劑係(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-二甲基-4-嗎啉基]甲基]苯基]乙烯基]-1H-咪唑-6-基]-5’-甲氧基-螺[環丙烷-1,3’-[³H]吲哚]-2’(1’H)-酮(CAS No.1338800-06-8)或其鹽。

[50]如[47]的細胞集團，其中，PLK1阻礙劑係PLK1的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[51]如[47]的細胞集團，其中，PLK1阻礙劑係(R)-5-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-3-(1-(2-(三氟甲基)苯基)乙氧基)噻吩-2-羧醯胺(CAS No.929095-18-1)或此等之鹽。

[52]如[46]至[51]中任一項細胞集團，係以20%以下的比率包含CHGA陰性細胞。

[53]如[46]至[51]中任一項細胞集團，係以3%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[54]如[46]至[51]中任一項細胞集團，係以2%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[55]如[46]至[51]中任一項細胞集團，係以1%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[56]如[46]至[51]中任一項細胞集團，係以15%以上的比率包含胰島素陽性且NKX6.1陽性的細胞。

[57]一種細胞集團之用途，係在用以治療或預防糖尿病之醫藥的製造中，使用經PLK阻礙劑處理之由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團。

[58]如[57]之用途，其中，PLK阻礙劑係PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑。

[59]如[58]之用途，其中，PLK4阻礙劑係PLK4的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[60]如[58]之用途，其中，PLK4阻礙劑係(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-二甲基-4-嗎啉基]甲基]苯基]乙烯基]-1H-咪唑-6-基]-5’-甲氧基-螺[環丙烷-1,3’-[³H]吲哚]-2’(1’H)-酮(CAS No.1338800-06-8)或其鹽。

[61]如[58]之用途，其中，PLK1阻礙劑係PLK1的50%阻礙濃度(IC₅₀)未達5nM的物質。

[62]如[58]之用途，其中，PLK1阻礙劑係(R)-5-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-3-(1-(2-(三氟甲基)苯基)乙氧基)噻吩-2-羧醯胺(CAS No.929095-18-1)或此等之鹽。

[63]如[57]至[62]中任一項用途，其中，前述細胞集團係以20%以下的比率包含CHGA陰性細胞。

[64]如[57]至[62]中任一項用途，其中，前述細胞集團係以3%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[65]如[57]至[62]中任一項用途，其中，前述細胞集團係以2%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[66]如[57]至[62]中任一項用途，其中，前述細胞集團係以1%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。

[67]如[57]至[62]中任一項用途，係以15%以上的比率包含胰島素陽性且NKX6.1陽性的細胞。

本說明書係包含屬於本申請優先權基礎案之日本國特許出願第2019-191876號的說明書及/或圖式記載的內容。

本說明書中所引用的全部出版物、專利及專利申請係以參考方式併入本文者。

根據本發明，可提供一種去除與經分化誘導之產生胰島素之細胞共存之CHGA陰性細胞的手法。

1.用語

以下，說明本說明書中所記載的用語。

本說明書中，「約」係顯示相對於基準值之正值或負值分別變動25%、20%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之值。較佳地，「約」或「大約」之用語，係顯示相對於基準值之正值或負值分別在15%、10%、5%、或1%的範圍。

本說明書中，「包含(comprise(s)或comprising)~」意指，表示包含該語句之後的要件，但不限於此等。因此，雖然暗示包含該語句之後的要件，但非暗示排除其他任意要件。

本說明書中，「由~所組成(consist(s)of或consisting of)」意指包含該語句之後每一要件，且限定為此等。因此，「由~所組成」之語句，表示所列舉的要件為要求或必須，實質上不存在其他要件。

本說明書中，不進行「使用餵養細胞」意指，基本上不包含餵養細胞，不使用藉由培養餵養細胞所得之預調整培養基等。因此，培養基中不包含由餵養細胞所分泌的生長因子及細胞激素等物質。

又，「餵養細胞」或「餵養者」意指與其他種類細胞共同培養，而賦予可支持、生長該細胞之環境的細胞。餵養細胞可為源自與此等所支持的細胞同種，亦可源自不同種。例如，人類細胞之餵養者係可使用人類皮膚纖維母細胞或人類胚胎幹細胞，亦可使用小鼠胚纖維母細胞的初代培養物、及不死化小鼠胚纖維母細胞。餵養細胞可藉由放射線照射或絲裂黴素C處理等而不活性化。

本說明書中，「接著」意指細胞附著於容器，例如，細胞於適當的培養基的存在下附著於滅菌塑膠(或經被覆的塑膠)之細胞培養皿或燒瓶。細胞之中，亦有不接著於細胞培養容器則無法維持、或生長者。相對於此，非接著性細胞係不接著於容器仍可於培養物中維持、增生。

本說明書中，「培養」意指使細胞於活體外(in-vitro)環境中維持、生長且/或分化。「進行培養」意指於組織或體外，例如，於細胞培養皿或燒瓶中持續、增生且/或分化。培養包含2維培養(平面培養)及3維培養(浮遊培養)。

說明書中，「進行富集(enrich)」及「富集(enrichment)」意指使細胞組成物等組成物中之特定構成成分的量增加，「已富集(enriched)」意指細胞組成物，例如，為了說明細胞集團使用時，與富集前的細胞集團中之該等構成成分的比率相比，特定構成成分的量增加的細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物，針對標的細胞型進行富集，因此，與存在於富集前的細胞集團內之標的細胞的比率相相較，標的細胞型的比率增加。細胞集團可藉由所屬技術領域中習知的細胞選擇及篩選方法富集標的細胞型。細胞集團亦可藉由本說明書所記載之特定的篩選或選擇過程進行富集。本發明之特定實施態樣中，藉由富集標的細胞集團的方法，細胞集團係針對標的細胞集團富集至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。

本說明書中，「進行貧化(deplete)」及「貧化(depletion)」意指使細胞組成物等組成物中之特定構成成分的量減少，「已貧化(depleted)」意指細胞組成物，例如，為了說明細胞集團使用時，與貧化前的細胞集團中之該等構成成分的比率相比，特定構成成分的量為減少的細胞集團。例如，可將細胞集團等之組成物，針對標的細胞型進行貧化，因此，與存在於貧化前的細胞集團內之標的細胞的比率相比，標的細胞型的比率減少。細胞集團可藉由所屬技術領域中習知的細胞選擇及篩選方法貧化標的細胞型。細胞集團亦可藉由本說明書所記載之特定的篩選或選擇過程而進行貧化。本發明之特定實施態樣中，藉由貧化標的細胞集團的方法，細胞集團係針對標的細胞集團減少(貧化)至少50%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。

本說明書中，「進行純化(purify)」及「純化(purification)」意指移除細胞組成物等組成物中的不純物、針對特定構成成分作成純粹者，「已純化(purified)」意指細胞組成物，例如，為了說明細胞集團使用時，與純化前的細胞集團中之該等構成成分的比較相比，不純物的量減少，且特定構成成分的純度提升之細胞集團。例如，可將細胞集團等之組成物，針對標的細胞型純化，因此，與存在於純化前的細胞集團內之標的細胞的比率相比，標的細胞型的比率增加。細胞集團可藉由所屬技術領域中習知的細胞選擇及篩選方法純化標的細胞型。細胞集團亦可藉由本說明書所記載之特定的篩選或選擇過程進行純化。本發明之特定實施態樣中，藉由純化標的細胞集團的方法，標的細胞集團的純度成為至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%，或者是，成為無法檢出不純物(包含夾雜細胞)的程度。

本說明書中，「不使細胞數減少」意指沒有起因於本發明方法的 實施而顯著地減少細胞數，意指該方法實施前的細胞數與該方法實施後的細胞數之間無顯著差異。惟，可能發生不是以本發明方法的實施為原因之細胞數減少(例如，先前已知的細胞培養及分化的步驟中通常可能發生的細胞自然死亡等)。因此，「不使細胞數減少」包含與本發明方法的實施前相比之實施後細胞的減少率為30%以下、20%以下、10%以下、或5%以下的情況。

本說明書中，「抑制增生」意指沒有起因於本發明方法的實施而顯著地增加細胞數，意指該方法實施前的細胞數與該方法實施後的細胞數之間沒有顯著增加。因此，「抑制增生」包含與本發明方法實施前相比之實施後的細胞的增加率為30%以下、20%以下、10%以下、或5%以下的情況。

本說明書中，「標記」意指「標記蛋白質」、「標記基因」等，意指由預定細胞型所特異性地表現的細胞抗原或其基因。較佳地，標記係細胞表面標記，此時，可實施生存細胞的濃縮、單離、及/或檢出。標記可為陽性選擇標記或者陰性選擇標記。

標記蛋白質的檢出可使用對於該標記蛋白質為特異性的抗體之免疫學的檢測，例如，利用ELISA、免疫染色、流式細胞術進行。標記基因的檢出可利用所屬技術領域習知的核酸增幅方法及/或核酸檢出方法，例如，利用RT-PCR、微陣列、生物晶片等進行。本說明書中，標記蛋白質係「陽性」時，意指以流式細胞術檢出陽性，「陰性」意指以流式細胞術係檢出極限以下。再者，本說明書中，標記基因係「陽性」時，意指藉由RT-PCR檢出，「陰性」意指以RT-PCR係檢出極限以下。

本說明書中，「表現(expression)」定義為藉由細胞內的啟動子(promoter)所驅動之特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。

本說明書中，「具有CDK8/19阻礙活性的因子」意指具有CDK8/19阻礙活性的各種物質。相對於相同CDK家族之其他蛋白質，CDK8對於細胞增生為非必要，CDK8的阻礙於通常的條件下無大效果。CDK19與CDK8類似，CDK8阻礙通常伴隨CDK19的阻礙。

「增生因子」係促進特定細胞的分化及/或增生的內因性蛋白質。「增生因子」可列舉例如：上皮生長因子(EGF)、酸性纖維母細胞增生因子(aFGF)、鹼性纖維母細胞增生因子(bFGF)、肝細胞增生因子(HGF)、類胰島素增生因子1(IGF-1)、類胰島素增生因子2(IGF-2)、角質細胞增生因子(KGF)、神經增生因子(NGF)、源自血小板之增生因子(PDGF)、轉形增生因子β(TGF-β)、血管內皮細胞增生因子(VEGF)、轉鐵蛋白、各種介白素(例如，IL-1至IL-18)、各種菌落(colony)刺激因子(例如，顆粒球/巨噬細胞-菌落刺激因子(GM-CSF))、各種干擾素(例如，IFN-γ等)及對於幹細胞具有效果之其他細胞激素，例如，幹細胞因子(SCF)及紅血球生成素(Epo)。

本說明書中，「ROCK阻礙劑」意指阻礙Rho激酶(ROCK：Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase)的物質，亦可為阻礙ROCK I與ROCK II之任一者的物質。ROCK阻礙劑只要具有上述功能則無特別限定，可列舉例如：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-甲醯胺(本說明書中，有時亦稱為Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基]磺醯基]六氫-1H-1,4-二氮雜環庚烯(H-1152)、4β-[(1R)-1-胺基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-甲醯胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-甲醯胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-胺基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-嗎啉基)乙基]-氧基}苯甲醯胺(GSK269962A)、N-(6-氟 -1H-咪唑-5-基)-6-甲基-2-側氧基-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氫-1H-吡啶-5-羧醯胺(GSK429286A)。ROCK阻礙劑不限定為該等者，針對ROCK的mRNA之反義核苷酸或siRNA、與ROCK鍵結之抗體、顯性負(Dominant negative)ROCK變異體等亦可使用作為ROCK阻礙劑，可由商業取得或可根據習知的方法合成。

本說明書中，「GSK3β阻礙劑」係對GSK3β(肝醣合成酶激酶3β)具有阻礙活性的物質。GSK3(肝醣合成酶激酶3)係絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之一種，參與和肝醣的產生或細胞凋亡、幹細胞的維持等有關的多種傳訊路徑。GSK3存在α與β之2種同功型。本發明所使用之「GSK3β阻礙劑」只要具有GSK3β阻礙活性則無特別限定，亦可為與GSK3β阻礙活性組合兼具GSK3α阻礙活性的物質。

GSK3β阻礙劑可例示：CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-胺基吡啶-2-基)胺基]乙基]胺基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]菸鹼甲腈)、TDZD-8(4-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、TWS-119(3-[6-(3-胺基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]酚)、肯帕羅酮(Kenpaullone)、1-氮雜肯帕羅酮(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羥基苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-環戊二烯基釕複合體、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、鋰等。GSK3β不限定為該等者，針對GSK3β之mRNA的反義核苷酸或siRNA、與GSK3β鍵結的抗體、顯性負GSK3β變異體等亦可作為GSK3β阻礙劑使用，可由商業取得或可根據習知的方法合成。

本說明書中之「血清代替物」可列舉例如：KnockOut^TM Serum Replacement(KSR：Thermo Fisher Scientific)、StemSure(註冊商標)Serum Replacement(Wako)、B-27補充料、N2-補充料、白蛋白(例如，富含脂質白蛋白)、胰島素、轉鐵蛋白、脂肪酸、膠原蛋白前驅物、微量元素(例如鋅、硒(例如，亞硒酸鈉))、2-巰基乙醇、3’-硫醇基甘油或此等之混合物(例如，ITS-G)。血清代替物較佳為B-27補充料、KSR、StemSure(註冊商標)Serum Replacement、ITS-G。培養基中添加血清代替物時之培養基中的濃度為0.01至10重量%，較佳係0.1至2重量%。本發明中，較佳為使用「血清代替物」替代血清。

2. CHGA陰性細胞增生經抑制之產生胰島素之細胞集團

本發明係關於CHGA陰性細胞增生經抑制之產生胰島素之細胞集團，該等細胞集團可藉由以PLK阻礙劑處理而獲得。

再者，本發明係關於藉由以PLK阻礙劑處理而抑制CHGA陰性細胞增生的方法。

「CHGA陰性細胞」意指由多能性幹細胞分化為胰β細胞的過程中，存在於由多能性幹細胞所分化誘導之胰前驅細胞集團，較佳係內分泌前驅細胞集團，更佳係產生胰島素之細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團中，並表現CHGA標記陰性之非內分泌性細胞。

「CHGA陰性細胞」包含作為標記之Ki67的表現被確認之細胞(亦即，CHGA陽性且Ki67陽性的細胞)。

「Ki67」已知為細胞周期關連核蛋白質，確認表現於增生中的細胞的G1期、S期、G2期、M期，且確認不表現於增生休止的G0期，因此，亦作為細胞增生與 細胞周期的標記而已知。據此，CHGA陽性且Ki67陽性細胞，係顯示高增生性的細胞。

本發明之「產生胰島素之細胞集團」意指包含由多能性幹細胞分化誘導所得之產生胰島素之細胞的細胞集團。「產生胰島素之細胞」意指胰島素標記的表現被確認之細胞(亦即，胰島素陽性細胞)。「產生胰島素之細胞」亦可為表現NK6同源匣(homeobox)1(NKX6.1)的標記，較佳地，「產生胰島素之細胞」為表現胰島素及NKX6.1二者標記的細胞(亦即，胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞)。

本發明之「產生胰島素之細胞集團」，與根據以往習知手法之由多能性幹細胞分化誘導所得之產生胰島素之細胞集團相比，CHGA陰性細胞的含量低，其含有率(本說明書中，有記載為「比率」的情況)為40%以下或30%以下，較佳係20%以下，更佳係15%以下，進一步較佳係10%以下，例如，9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、或1%以下。該含有率的下限雖無特別限定，通常為0%以上、0.1%以上、或0.5%以上。該含有率可使用分別選自前述上限及下限的數值的2個數值表示，例如，該含有率係0.5%至40%、或0.5%至30%，較佳係0.5%至20%，更佳係0.5%至15%，進一步較佳係0.5%至10%。另一方面，與根據以往習知手法之由多能性幹細胞分化誘導所得之產生胰島素之細胞集團相比，本發明之「產生胰島素之細胞集團」為胰島素陽性細胞，特別是胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞已富集的細胞集團，胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞的含有率係14%以上，較佳係15%以上，更佳係20%以上，進一步較佳係25%以上，例如，為30%以上、35%以上、40%以上、或45%以上。該含有率的上限雖無特別限定，通常為70%以下、60%以下、或50%以下。該含 有率可使用分別選自由前述上限及下限的數值的2個數值表示，例如，該含有率係14%至50%，較佳係15%至50%，更佳係20%至50%，進一步較佳係25%至50%。

本發明之「產生胰島素之細胞集團」係可將由多能性幹細胞所分化誘導所得之胰前驅細胞集團，較佳係內分泌前驅細胞集團，更佳係產生胰島素之細胞集團、或處於在此之後的分化階段的細胞集團以PLK阻礙劑處理而獲得。藉由將處於預定分化階段的細胞集團以PLK阻礙劑處理，可抑制CHGA陰性細胞增生，使其細胞含量降低，並富集胰島素陽性細胞，較佳係胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞。

由多能性幹細胞分化為胰β細胞的過程中，已知因應分化階段出現具有不同特徵的細胞(WO2009/012428、WO2016/021734)。例如，此分化階段以相對未分化的順序，可大致分類為多能性幹細胞、胚體內胚層細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、胰前驅細胞、內分泌前驅細胞、產生胰島素之細胞、胰β細胞。

本說明書中，「多能性(pluripotency)」意指可分化為各種具有不同形態及功能的組織或細胞的能力，亦可分化為3胚層之任何系統的細胞。「多能性(pluripotency)」無法分化為胚盤，因此，就無形成個體的能力之點而言，與可分化為包含胚盤之生體的各組織之「全能性(totipotency)」區別。

本說明書中之「多潛能性(multipotency)」意指可分化為複數的限定數系統的細胞的能力。例如，間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞為多潛能性(multipotent)，而非多能性(pluripotent)。

本說明書中，「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」係指胚胎幹細胞(ES細胞)、及潛在地具有與其同樣的分化多能性，亦即分化為生體的各種組 織(內胚層、中胚層、外胚層之全部)的能力的細胞。ES細胞及具有同樣的分化多能性的細胞，可列舉「人工多能性幹細胞」(本說明書中，亦稱為「iPS細胞」)。較佳地，本發明中，多能性幹細胞為人類多能性幹細胞。

「ES細胞」只要為小鼠ES細胞則可利用inGenious公司、理化學研究所(理研)等所建立之各種小鼠ES細胞株；只要為人類ES細胞則可利用美國國立衛生研究所(NIH)、理研、京都大學、Cellartis公司所建立之各種人類ES細胞株。例如，ES細胞株可利用NIH的CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等；WiCell Research Institute的H1株、H9株，理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。

「人工多能性幹細胞」係指於哺乳動物體細胞或未分化幹細胞，藉由導入特定的因子(核初期化因子)經由重編程所得之細胞。目前，「人工多能性幹細胞」有各種各樣者，除了由山中等人於小鼠纖維母細胞藉由導入Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的4因子所建立之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell，(2006)126：663-676)之外，亦可使用於人類纖維母細胞導入同樣的4因子所建立之源自人類細胞的iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131：861-872.)、上述4因子導入後Nanog表現之作為指標進行篩選而建立之Nanog-iPS細胞(Okita，K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)、以不包含c-Myc之方法所製作之iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106))、以無病毒方式導入6因子所建立之iPS細胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K et al.Stem Cells.31(3)：458-66.)。再者，亦可使用由Thomson等人所製作之導入OCT3/4、SOX2、NANOG 及LIN28之4因子所建立之人工多能性幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318：1917-1920.)、由Daley等人所製作之人工多能性幹細胞(Park IH,Daley GQ.etal.,Nature(2007)451：141-146)、由櫻田等人所製作之人工多能性幹細胞(日本特開2008-307007號)等。

除此之外，亦可使用已公開之所有論文(例如，Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol 3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)、或專利(例如，日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)所記載之所屬技術領域習知的人工多能性幹細胞之任一者。

人工多能性細胞株可利用NIH、理化學研究所(理研)、京都大學等所建立之各種iPS細胞株。例如，只要是人類iPS細胞株之可列舉：理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株；京都大學的Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株；CDI公司的MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。

本說明書中之「胰前驅細胞集團」意指包含胰前驅細胞之細胞集團。本說明書中，胰前驅細胞意指表現PDX-1、NKX6.1、PTF-1α、GATA4及SOX9之至少一個標記之細胞。

胰前驅細胞集團係以30%以上，較佳係40%以上，更佳係50%以 上，進一步較佳係60%以上，更進一步較佳係70%以上的比率包含胰前驅細胞之細胞集團。胰前驅細胞集團中，除了胰前驅細胞，亦可包含其他細胞(例如，內分泌前驅細胞、產生胰島素之細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。

本說明書中之「內分泌前驅細胞集團」意指包含內分泌前驅細胞之細胞集團。

本說明書中，內分泌前驅細胞意指表現CHGA、NeuroD及NGN3之至少一個標記，以及不表現胰關聯的荷爾蒙系(例如，胰島素等)的標記之細胞。內分泌前驅細胞亦可表現PAX-4、NKX2.2、Islet-1、PDX-1、PTF-1α等標記。

內分泌前驅細胞集團係以30%以上，較佳係40%以上，更佳係50%以上，進一步較佳係60%以上，更進一步較佳係70%以上的比率包含內分泌前驅細胞之細胞集團。內分泌前驅細胞集團中，除了內分泌前驅細胞，亦可包含其他細胞(例如，胰前驅細胞、產生胰島素之細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。

細胞集團中之特定的細胞比率，可基於如流式細胞術之可算出細胞數的習知手法求出。

「產生胰島素之細胞」係如上所述，「產生胰島素之細胞集團」通常以5%以上，較佳係10%以上，更佳係15%以上，進一步較佳係20%以上，更進一步較佳係25%以上，特別較佳係30%以上的比率包含產生胰島素之細胞。該細胞集團中，除了產生胰島素之細胞，亦可包含其他細胞(例如，內分泌前驅細胞；表現升糖素、體抑素、及胰臟多肽之至少一個標記之其他產生胰荷爾蒙之細胞；Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。

本說明書中之「胰β細胞」意指比「產生胰島素之細胞」成熟的 細胞，具體而言，意指表現屬於胰β細胞成熟標記的MAFA、UCN3、及IAPP之至少一個標記，或者是因升糖素刺激而造成的胰島素分泌上升反應為特徵之細胞。

「胰β細胞集團」可藉由使產生胰島素之細胞集團分化、成熟，較佳係於生體內分化、成熟而獲得包含胰β細胞之細胞集團。該細胞集團中，除了胰β細胞，亦可包含其他細胞(例如，產生胰島素之細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。

處於各分化階段之細胞集團，係可使用將多能性幹細胞分化誘導成胰β細胞之習知的手法獲得。亦即，可利用下列分化誘導步驟獲得各目標細胞集團：

步驟1)由多能性幹細胞分化誘導成胚體內胚層細胞；

步驟2)由胚體內胚層細胞分化誘導成原腸管細胞；

步驟3)由原腸管細胞分化誘導成後方前腸細胞；

步驟4)由後方前腸細胞分化誘導成胰前驅細胞；

步驟5)由胰前驅細胞分化誘導成內分泌前驅細胞；

步驟6)由內分泌前驅細胞分化誘導成產生胰島素之細胞。

以下，說明各步驟，但成為各細胞的分化誘導不限定為此等方法。

步驟1)成為胚體內胚層細胞的分化

首先，使多能性幹細胞分化為胚體內胚層細胞。由多能性幹細胞誘導胚體內胚層之方法為習知，亦可使用其中任一種方法。較佳地，多能性幹細胞係以包含活化素A的培養基，更佳係以包含活化素A、ROCK阻礙劑、GSK3β阻礙劑的培養基進行培養，使其分化為胚體內胚層細胞。培養開始時的細胞數無特別限定，為 22000至150000細胞/cm²，較佳係22000至100000細胞/cm²，更佳係22000至80000細胞/cm²。培養期間為1日至4日，較佳係1日至3日，特別較佳係3日。

培養溫度無特別限定，於30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中之二氧化碳濃度例如5%左右。培養亦能以2維培養及3維培養之任一者進行。

本步驟使用之培養基可使用：RPMI 1640培養基、MEM培養基、iMEM培養基、DMEM/F12培養基、改良的MEM Zinc Option培養基、改良的MEM/1%B-27/青黴素鏈黴素培養基、MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO₃/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAX^TM/抗壞血酸/青黴素鏈黴素培養基等，哺乳類細胞的培養中所使用之基本培養基。

活化素A於培養基中的濃度通常為30至200ng/mL，較佳係50至150ng/mL，更佳係70至120ng/mL，特別較佳係約100ng/mL。

就其他態樣而言，活化素A於培養基中可為低用量，例如，以5至100ng/mL，較佳係5至50ng/mL，更佳係5至10ng/mL的量含有活化素A。

就進一步其他態樣而言，活化素A之培養基中的濃度約0.1至100ng/mL，較佳係約1至50ng/mL，更佳係約3至10ng/mL。

GSK3β阻礙劑之培養基中的濃度，根據所使用之GSK3β阻礙劑的種類而適當地設定，例如使用CHIR99021作為GSK3β阻礙劑時的濃度通常為2至5μM，較佳係2至4μM，特別較佳係約3μM。

ROCK阻礙劑之培養基中的濃度，根據所使用之ROCK阻礙劑的種類而適當地設定，例如使用Y27632作為ROCK阻礙劑時的濃度通常5為至20μM，較佳係5至15μM，特別較佳係約10μM。

培養基中，可進一步添加胰島素。於培養基中，能以0.01至20μM，較佳係0.1至10μM，更佳係0.5至5μM的量含有胰島素。培養基中之胰島素的濃度，亦可為所添加之B-27補充料所包含的胰島素濃度，但不限定為此等。

特定的態樣中，以包含活化素A、ROCK阻礙劑、GSK3β阻礙劑的培養基培養1日後，一邊以僅包含活化素A的培養基每日交換培養基，一邊進一步培養2日。或者是，可藉由在低用量的活化素A的存在下，將多能性幹細胞於包含胰島素0.01至20μM的培養基中進行第1培養，接著，於不包含胰島素的培養基中進行第2培養而製造。

步驟2)成為原腸管細胞的分化

將步驟1)所得之胚體內胚層細胞，進一步以包含增生因子的培養基培養而分化誘導為原腸管細胞。培養期間為2日至8日，較佳係約4日。

培養溫度無特別限定，於30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中之二氧化碳濃度例如為5%左右。培養能以2維培養及3維培養之任一者進行。

培養基係與步驟1)同樣地，可使用哺乳類細胞的培養所使用之基本培養基。培養基中除了增生因子，亦可適當地添加血清代替物、維生素、抗生物質等。

增生因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為EGF及/或KGF，進一步較佳為KGF。

增生因子之培養基中的濃度，根據使用之增生因子的種類而適當地設定，通常約0.1nM至1000μM，較佳係約0.1nM至100μM。EGF時，其濃度係約5至2000ng/mL(亦即，約0.8至320nM)，較佳係約5至1000ng/mL(亦即，約0.8至 160nM)，更佳係約10至1000ng/mL(亦即，約1.6至160nM)。FGF10時，其濃度係約5至2000ng/mL(亦即，約0.3至116nM)，較佳係約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)。例如，使用KGF作為增生因子時的濃度，通常為5至150ng/mL，較佳係30至100ng/mL，特別較佳係約50ng/mL。

步驟3)成為後方前腸細胞的分化

將步驟2)所得之原腸管細胞進一步以包含增生因子、環帕明(cyclopamine)、頭蛋白(noggin)等之培養基培養，分化誘導為後方前腸細胞。培養期間係1日至5日，較佳係約2日左右。培養能以2維培養及3維培養之任一者進行。

培養溫度無特別限定，於30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中之二氧化碳濃度例如為5%左右。

培養基係與步驟1)同樣地，可使用哺乳類細胞的培養所使用之基本培養基。培養基中除了增生因子，亦可適當地添加血清代替物、維生素、抗生物質等。

增生因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為EGF及/或KGF，進一步較佳為KGF。

增生因子之培養基中的濃度，根據使用之增生因子的種類而適當地設定，通常約0.1nM至1000μM，較佳係約0.1nM至100μM。EGF時，其濃度係約5至2000ng/mL(亦即，約0.8至320nM)，較佳係約5至1000ng/mL(亦即，約0.8至160nM)，更佳係約10至1000ng/mL(亦即，約1.6至160nM)。FGF10時，其濃度係約5至2000ng/mL(亦即，約0.3至116nM)，較佳係約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)。例如，使用KGF作為增生因子時的濃度，通常為5至150ng/mL，較佳係30至100ng/mL，特別較佳係約50ng/mL。

環帕明之培養基中的濃度無特別限定，通常為0.5至1.5μM，較佳係0.3至1.0μM，特別較佳係約0.5μM。

頭蛋白之培養基中的濃度無特別限定，通常為10至200ng/mL，較佳係50至150ng/mL，特別較佳係約100ng/mL。

步驟4)成為胰前驅細胞的分化

將步驟3)所得之後方前腸細胞進一步以包含具有CDK8/19阻礙活性的因子的培養基，較佳係以包含具有CDK8/19阻礙活性的因子與增生因子的培養基培養，分化誘導為胰前驅細胞。培養期間係2日至10日，較佳係約5日左右。培養能以2維培養及3維培養之任一者進行。

2維培養時，根據既有報導(Toyoda et al.,Stem cell Research(2015)14，185-197)，將步驟3)所得之後方前腸細胞，以0.25%胰蛋白酶-EDTA處理及經由移液(pipetting)使其分散，所得之分散液付諸於離心分離，將回收的細胞再懸濁於少量的新培養基，將此細胞懸濁液再播種於步驟4)之新的培養基。

培養基係與步驟1)同樣地，可使用哺乳類細胞的培養所使用之基本培養基。培養基中除了增生因子，亦可適當地添加血清代替物、維生素、抗生物質等。

具有CDK8/19阻礙活性的因子可使用前述各種化合物或其鹽，根據使用之化合物或其鹽，適當地決定對培養基的添加量，通常約0.00001μM至5μM，較佳係0.00001μM至1μM。具有CDK8/19阻礙活性的因子之培養基中的濃度較佳為達到對CDK8/19為50%以上的阻礙活性的濃度。

增生因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為KGF及/或EGF，進一步較佳為KGF及EGF。

增生因子之培養基中的濃度，根據使用之增生因子的種類而適當地決定，通常約0.1nM至1000μM，較佳係約0.1nM至100μM。EGF時，其濃度係約5至2000ng/mL(亦即，約0.8至320nM)，較佳係約5至1000ng/mL(亦即，約0.8至160nM)，更佳係約10至1000ng/mL(亦即，約1.6至160nM)。FGF10時，其濃度係約5至2000ng/mL(亦即，約0.3至116nM)，較佳係約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)。例如，使用KGF及EGF作為增生因子時的濃度，EGF通常為5至150ng/mL，較佳係30至100ng/mL，特別較佳係約50ng/mL、KGF通常為10至200ng/mL，較佳係50至150ng/mL，特別較佳係約100ng/mL。

步驟4)中培養之最初1日係於ROCK阻礙劑的存在下進行，之後亦能以不含ROCK阻礙劑的培養基培養。

再者，培養基中亦可含有蛋白質激酶C(PKC)活化劑。PKC活化劑可使用PDBu(PKC activator II)、TPB(PKC actovator V)等，但不以此為限。PKC活化劑的濃度係以約0.1至100ng/mL，較佳係約1至50ng/mL，更佳係約3至10ng/mL進行添加。

再者，培養基中亦可添加二甲基亞碸、及/或活化素(1至50ng/mL)。

任一步驟中，培養基中除了上述成分，亦可添加血清代替物(例如，B-27補充料、ITS-G)。再者，因應所需，亦可添加胺基酸、L-麩胺醯胺、GlutaMAX(製品名)、非必須胺基酸、維生素、菸鹼醯胺、抗生物質(例如，抗生素-抗黴劑(Antibiotic-Antimycotic)(本說明書中，有時稱為AA)、青黴素、鏈黴素、或此等之混合物)、抗菌劑(例如，兩性黴素B)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。於培養基添加抗生物質時，其培養基中的濃度通常為0.01至20重量%， 較佳係0.1至10重量%。培養能以2維培養及3維培養之任一者進行。

再者，細胞培養係2維培養時不使用餵養細胞，進行接著培養。培養時，使用皿、燒瓶、微孔盤、OptiCell(製品名)(Nunc公司)等細胞培養片等培養容器。培養容器較佳是經用以提升與細胞的接著性(親水性)之表面處理，經膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連蛋白、纖連蛋白、基質膠(例：BD基質膠(日本Becton Dickinson公司))、玻連蛋白等細胞接著用基質被覆。培養容器較佳是經I型膠原蛋白、基質膠、纖連蛋白、玻連蛋白或聚-D-離胺酸等被覆之培養容器，更佳為經基質膠或聚-D-離胺酸被覆之培養容器。

培養溫度無特別限定，於30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中之二氧化碳濃度例如為5%左右。

步驟4)所得之胰前驅細胞可利用屬於習知表面標記之糖蛋白質2(GP2)等進一步地純化。上述純化係本身已知的方法，例如，可使用固定有抗GP2抗體的珠粒進行。

步驟5)成為內分泌前驅細胞的分化

將步驟4)所得之胰前驅細胞進一步地以包含增生因子的培養基培養而分化誘導為內分泌前驅細胞。培養能以2維培養及3維培養之任一者進行。2維培養時，將步驟4)所得之胰前驅細胞以0.25%胰蛋白酶-EDTA處理後藉由移液使其分散，所得之分散液付諸於離心分離，回收的細胞再懸濁於少量的新培養基，將此細胞懸濁液再播種於步驟5)之新的培養基。培養期間係2日至3日，較佳係約2日。

培養基係與步驟1)同樣地，可使用哺乳類細胞的培養所使用之基本培養基。培養基中，根據既有報導(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，可添加SANT1、維生素A酸、ALK5抑制劑II、T3、LDN，進一步亦可適當地添加 Wnt阻礙藥、ROCK阻礙劑、FGF(較佳為FGF2)、血清代替物、維生素、抗生物質等。

培養係不使用餵養細胞，以非接著培養進行。培養時，使用皿、燒瓶、微孔盤、多孔盤(Nunc公司)等或生物反應器。培養容器較佳係進行用以降低與細胞的接著性之表面處理。

培養溫度無特別限定，於30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中之二氧化碳濃度例如為5%左右。

步驟6)成為產生胰島素之細胞的分化

將步驟5)所得之內分泌前驅細胞進一步以包含增生因子的培養基培養而分化誘導為產生胰島素之細胞。培養期間係10日至30日，較佳係約10至20日。

培養基係與步驟1)同樣地，可使用哺乳類細胞的培養所使用之基本培養基。培養基根據既有報導(Nature Biotechnology 2014：32：1121-1133)，可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶(secretase)阻礙劑XX、γ-分泌酶阻礙劑RO、N-半胱胺酸、AXL抑制劑、抗壞血酸，進一步亦可適當地添加Wnt阻礙藥、ROCK阻礙劑、FGF(較佳為FGF2)、血清代替物、維生素、抗生物質等。例如，培養基中亦可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑RO、及抗壞血酸，或者是亦可添加T3、ALK5抑制劑II、ZnSO₄、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、Trolox、及R428。

培養能以2維培養及3維培養之任一者進行。培養係不使用餵養細胞。3維培養時，以非接著培養進行。培養時，使用皿、燒瓶、微孔盤、多孔盤(Nunc公司)或生物反應器。培養容器，較佳係進行用以降低與細胞的接著性之表面處理。

培養溫度無特別限定，於30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中之二氧化碳濃度例如為5%左右。

成為胰β細胞的分化

上述步驟所得之細胞係可分化誘導為胰β細胞。分化成為胰β細胞集團的步驟，可藉由將內分泌前驅細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團，較佳係產生胰島素之細胞集團，移植至動物生體內進行。

「動物」較佳係哺乳動物，可列舉例如：人類、非人類靈長類、豬，牛、馬、綿羊、山羊、駱馬、犬、貓、兔、小鼠、豚鼠等，較佳係人類。

移植較佳係在可將細胞集團固定之規定位置的生體內區域進行，例如，可於動物的皮下、腹腔內、腹膜上皮、網膜、脂肪組織、筋肉組織、胰臟、腎臟等各臟器的被膜下等進行。所移植的細胞數可根據移植細胞的分化階段，或移植對象之年齡、體重、移植部位的大小，疾病的嚴重度等重要因素而變化，雖無特別限定，例如可為10×10⁴細胞至10×10¹¹個左右。所移植之細胞集團，可於生體內環境中分化誘導，分化成為目標細胞集團，較佳係胰β細胞集團，之後，可回收，亦可直接留置於生體內。

進行移植之際，細胞集團亦可包埋於包含生體適合性材料的凝膠中進行移植，例如，亦可將包埋於包含生體適合性材料的凝膠中之細胞集團封入膠囊、包裝袋、腔室等裝置再移植至生體內。

本發明中之「包埋」意指將內分泌前驅細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團於包含生體適合性材料之凝膠中分散及收納。

本說明書中之「生體適合性材料」意指於移植至生體內，短期或長期留置時，不會誘導顯著的免疫反應或有害的生體反應(例如，毒性反應、凝 血等)之任意材料。再者，「生體適合性材料」較佳為生物分解性材料。如之材料可列舉：聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚胺酯(PU)、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羥基乙基酯、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-co-乙醇酸(PLGA)、聚(3-羥基丁酸酯-co-羥基戊酸酯)(PHBV)、聚(乙烯-co-乙酸乙烯酯)(PEVA)、聚丙烯醯胺、聚環氧乙烷、聚乙烯胺、聚羥基酪酸、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙烯醇、聚富馬酸丙烯、聚丙烯酸、聚e-己內酯、聚甲基丙烯酸、聚偏二氟乙烯(PVDF)、果膠酸、透明質酸、肝素硫酸、硫軟骨素酸、硫酸肝素蛋白多醣、肝素、幾丁質、殼多醣、三仙膠、羧基甲基纖維素、羧基甲基殼多醣、海藻酸鹽、海藻酸酯、膠原蛋白、纖維素、絲蛋白素、角蛋白、明膠、纖維蛋白、聚葡萄糖、層連蛋白、結蘭膠、聚矽氧、胺甲酸乙酯、彈性蛋白等及此等之修飾物、以及此等之組合。「生體適合性材料」的表面因應所需亦可實施以可進行細胞接著的表面修飾(例如，以細胞接著用基質(膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連蛋白、纖連蛋白、基質膠、玻連蛋白等)進行之披覆)進行的改變，或已知控制細胞增生、分化及機能之官能基(例如，胺基、羧基、羥基、甲基丙烯酸基、丙烯酸基等)進行的改變。特定的態樣中，「生體適合性材料」可合適地使用海藻酸鹽或海藻酸酯。

海藻酸鹽只要為水溶性鹽即可，可利用金屬鹽、銨鹽等。例如，可合適地使用海藻酸鈉、海藻酸鈣、海藻酸銨等。

海藻酸酯(亦稱為海藻酸丙二醇酯)係於海藻酸的羧基經酯鍵結有丙二醇的衍生物。

海藻酸鹽所包含之甘露糖醛酸與葡萄糖醛酸的比率(M/G比)係任意者，一般而言，M>G時可形成富柔軟性的凝膠，M<G時可形成堅固的凝膠。本發明中，可利用以10至90%、20至80%、30至70%、或40至60%的比率包含葡 萄糖醛酸者。

使用有海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠的製作，係能以習知的手法(WO2010/032242、WO2011/154941)為基準而製作，可藉由於海藻酸鹽或海藻酸酯的溶液添加交聯劑使其凝膠化而可獲得。

於溶劑中，能以0.05至10重量%(較佳為0.1至5重量%，更佳為0.5至3重量%)的量包含海藻酸鹽或海藻酸酯。溶劑只要可溶解海藻酸鹽或海藻酸酯者即可，可利用水、生理食鹽水等。

交聯劑只要是可凝膠化海藻酸鹽或海藻酸酯的溶液者即可，無特別限定，可利用多價的金屬陽離子。多價的金屬陽離子較佳係2價的金屬陽離子，更佳係鈣離子、鍶離子、鋇離子。交聯劑能以鹽的形態利用，本發明中，可利用選自氯化鈣、氯化鍶、氯化鋇中之至少一種作為交聯劑。

包含海藻酸鹽或海藻酸酯的凝膠中可包含奈米纖維。奈米纖維係具有奈米領域直徑之天然或合成纖維。天然奈米纖維可列舉：包含膠原蛋白、纖維素、絲蛋白素、角蛋白、明膠、殼多醣等多醣類之一種或複數種者。合成奈米纖維可列舉：聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚胺甲酸乙酯(PU)、聚(交酯-co-乙交酯)(PLGA)、聚(3-羥基丁酸酯-co-羥基戊酸酯)(PHBV)、聚(乙烯-co-乙酸乙烯酯)(PEVA)等。於包含海藻酸的凝膠中，能以未達1重量%，例如，能以0.9重量%、0.8重量%、0.7重量%、0.6重量%、0.5重量%、或未達其之量包含奈米纖維。包含海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠中所含之奈米纖維量的下限無特限定，可為0.05重量%以上，較佳係0.1重量%以上。

包含海藻酸鹽或海藻酸酯的凝膠的細胞集團的包埋係能以任意的手段進行無特別限定，例如，可藉由於海藻酸鹽或海藻酸酯的溶液中混合細胞 集團，藉由使其凝膠化進行。

於海藻酸鹽或海藻酸酯的溶液中能以選自1×10⁴細胞至1×10⁹細胞/mL，較佳係1×10⁷細胞至1×10⁸細胞/mL的量包含細胞集團。

包含細胞集團的海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液的凝膠化，係可於該溶液添加交聯劑進行。相對於該溶液，添加的交聯劑的量為0.1至5重量%，例如，可選自0.1至1重量%的量。凝膠化係於細胞培養或細胞移植使用之具有預定構成及/或形狀的容器內進行，或者是，於以可獲得適合該容器之凝膠的方式所設計的鑄模內進行。

或者是，亦能以習知的手法(WO2010/010902)為基準藉由形成包含海藻酸之凝膠膠囊而進行。亦即，可對交聯劑的溶液進行滴加包含細胞集團之海藻酸鹽或海藻酸酯的溶液。根據滴加時的噴嘴的形狀及滴加方法，可調整液滴的尺寸，據此可規定包含海藻酸的凝膠膠囊的尺寸。滴加方法無特別限定，可藉由空氣噴灑法、無氣噴灑方式、靜電噴灑法等方法進行。包含海藻酸之凝膠膠囊的尺寸無特限定，可作成直徑為5mm以下、1mm以下、500μm以下。交聯劑溶液中，可選自0.1至10重量%，例如，0.1至5重量%的量含有交聯劑。

本發明中之「PLK阻礙劑」，係對於Polo-like kinase(PLK)具有阻礙活性的物質。PLK係以真核生物保存之絲胺酸/蘇胺酸/激酶家族，為擔任細胞週期的M期進展的激酶，已知有PLK1、PLK2、PLK3、及PLK4之4種。本發明所使用之PLK阻礙劑，只要可壓抑CHGA陰性細胞增生即可，可為對於PLK1、PLK2、PLK3、及PLK4之任一者的阻礙劑，對於各PLK之阻礙劑亦可為其他對於PLK之阻礙劑。本發明所使用之PLK阻礙劑，只要可壓抑CHGA陰性細胞增生即可，亦可為組合PLK阻礙活性並兼具其他活性(阻礙活性等)的物質。較佳地，本 發明中之「PLK阻礙劑」係對於PLK1、或PLK4具有阻礙活性之阻礙劑，較佳係對於PLK1、或PLK4具有選擇性之阻礙劑。例如，可合適地利用對於PLK1、或PLK4之50%阻礙濃度(IC50)係1μM以下，較佳係100nM以下，更佳係50nM以下，進一步較佳係10nM以下，特佳係5nM以下，特別較佳係3nM以下的物質。PLK阻礙活性的判定方法可選自習知的方法選擇，例如可列舉使用Serine/Threonine Kinase Assay Kits(MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO.,LTD.)的判定方法等。本發明中之「PLK阻礙劑」可利用先前習知者，可由專利文獻或非專利文獻查詢。

本發明中可利用之PLK阻礙劑可例示(但不限定為此等)：(R)-5-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-3-(1-(2-(三氟甲基)苯基)乙氧基)噻吩-2-羧醯胺(CAS No.929095-18-1)(本說明書中，該化合物亦有記載為「CAS929095-18-1」的情況)、(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-二甲基-4-嗎啉基]甲基]苯基]乙烯基]-1H-咪唑-6-基]-5’-甲氧基-螺[環丙烷-1,3’-[³H]吲哚]-2’(1’H)-酮(CAS No.1338800-06-8)(本說明書中，該化合物亦有記載為「CAS1338800-06-8」的情況)、2-[[2-氟-4-[[(2-氟-3-硝基苯基)甲基]磺醯基]苯基]硫基]-5-甲氧基-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-6-(4-嗎啉基)-4-嘧啶胺(CAS No.1798871-30-3)、2-[[2-氟-4-[[(2-氟-3-硝基苯基)甲基]磺醯基]苯基]硫基]-5-甲氧基-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-6-(1-哌啶基)-4-嘧啶胺(CAS No.1798871-31-4)、7-硝基-5-(三氟甲基)-2-苯并噻唑羧醯胺-3-氧基(CAS No.40533-25-3)、5-(5,6-二甲氧基-1H-苯并咪唑-1-基)-3-[[2-(三氟甲基)苯基]甲氧基]-2-噻吩羧醯胺(CASNo.660868-91-7)、4-[(9-環戊基-7,7-二氟-6,7,8,9-四氫-5-甲基-6-側氧基-5H-嘧啶并[4,5-b][1,4]二氮雜環庚烯-2-基)胺基]-2-氟-5-甲氧基-N-(1-甲基-4-哌啶基)苯甲 醯胺氯化氫(CAS No.2108449-45-o)、3-(1,3-苯并二環戊烯(benzodioxol)-5-基)-N-[(1S)-1-苯基乙基]-異噁唑并[5,4-c]吡啶-5-胺(CAS No.1082739-92-1)、(1S,6bR,9aS,11R,11bR)11-(乙醯基氧基)-1,6b,7,8,9a,10,11,11b-八氫-1-(甲氧基甲基)-9a,11b-二甲基-3H-呋喃并[4,3,2-de]茚并[4,5,-h]-2-h]-2-苯并哌喃-3,6,9-三酮(CAS No.19545-26-7)、5-氰基-7-硝基-2-苯并噻唑羧醯胺-3-氧化物(CAS No.40647-02-7)、2,3,4,5-四氫-7-羥基-1H-苯并呋喃并[2,3-c]氮雜環庚烯-1-酮(CAS No.521937-07-5)、1-[6-[(3-乙醯基-2,4,6-三羥基-5-甲基苯基)甲基]-5,7-二羥基-2,2-二甲基-2H-1-苯并吡喃-8-基]-3-苯基-2-丙烷-1-酮(CAS No.82-08-6)、N-[[4-[(6-氯-3-吡啶基)甲氧基]-3-甲氧基苯基]甲基]-3,4-二甲氧基-苯乙烷胺鹽酸鹽(CAS No.1052532-15-6)、A66(CAS No.1166227-08-2)、(R)-2-(1-(7-甲基-2-N-嗎啉基-4-側氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基胺基)安息香酸(CAS No.1173900-33-8)、N-[(4-甲氧基苯基)磺醯基]-N-[2-[(1E)-2-(1-氧化-4-吡啶基)乙烯基]苯基]-乙醯胺(CAS No.173529-46-9)、鈉(E)-2-((2-甲氧基-5-(((2,4,6-三甲氧基苯乙烯基)磺醯基)甲基)苯基)胺基)乙酸鹽(CAS No.1225497-78-8)、4-((9環戊基-7,7-二氟-5-甲基-6-側氧基-6,7,8,9-四氫-5H-嘧啶并[4,5-b][1,4]二氮雜環庚烯-2-基)胺基)-2-氟-5-甲氧基-N-(1-甲基哌啶基-4-基)苯甲醯胺(CAS No.1137868-52-0)、4-((6-氯-2-甲氧基吖啶基-9-基)甲基)-2-((4-(2-(二甲基胺基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)酚(CAS No.2247919-28-2)、2-甲基-5-(1-甲基乙基)-1-[O-(2-甲基苯甲醯基)肟]-2,5-環己二烯-1,4-二酮(CAS No.321688-88-4)、9-環戊炔-2-[[2-乙氧基-4-(4-羥基-1-哌啶基)苯基]胺基]-5,7,8,9-四氫-5-甲基-6H-嘧啶并[4,5-b][1,4]二氮雜環庚烯-6-酮(CAS No.1228817-38-6)、2,5-環己二烯-1,4-二酮,2-甲基-5-(1-甲基乙基)-,1-肟(CAS No.17302-61-3)等或其鹽。再者，此等之化合物以具有PLK阻礙活性為限，較佳係對於PLK1、 或PLK4之50%阻礙濃度(IC50)係1μM以下，較佳係100nM以下，更佳係50nM以下，進一步較佳係10nM以下，特佳係5nM以下，特別較佳係3nM以下為限，亦可具有一個或複數個取代基，亦可變換一部分的部分結構(取代基、環等)。

較佳地，本發明中之PLK阻礙劑，可利用下列者作為PLK1阻礙劑：(R)-5-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-3-(1-(2-(三氟甲基)苯基)乙氧基)噻吩-2-羧醯胺(CAS No.：929095-18-1)，可利用下列者作為PLK4阻礙劑：(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-二甲基-4-嗎啉基]甲基]苯基]乙烯基]-1H-咪唑-6-基]-5’-甲氧基-螺[環丙烷-1,3’-[³H]吲哚]-2’(1’H)-酮(CAS No.1338800-06-8)。

PLK阻礙劑不限定為上述所示之化合物，亦可使用針對PLK的mRNA之反義核苷酸或siRNA、與PLK結合之抗體、顯性負PLK變異體等作為PLK阻礙劑，可由商業取得或可根據習知的方法合成。

PLK阻礙劑可使用前述各種化合物或其鹽，因應使用的化合物或其鹽，適當地決定對培養基的添加量，通常約0.00001μM至100μM，較佳係0.01μM至10μM，更佳係0.1μM至5μM，特別較佳係0.1μM至3μM。

由多能性幹細胞所分化誘導所得之胰前驅細胞集團，較佳係內分泌前驅細胞集團，更佳係產生胰島素之細胞集團、或處於在此之後的分化階段的細胞集團經由PLK阻礙劑進行的處理，係可藉由使PLK阻礙劑與該細胞集團接觸而進行。例如，可藉由以添加了PLK阻礙劑的培養基培養該細胞集團而進行。於培養基中，能以可阻礙PLK活性的任意量包含PLK阻礙劑，例如，能以10μM以下，或5μM以下的量，較佳係4μM以下，更佳係3μM以下(例如，2μM以下或1μM以下)的量包含PLK阻礙劑。PLK阻礙劑之添加量的下限無特別限定，可為0.1μM 以上，較佳係0.5μM以上。PLK阻礙劑之添加量為10μM以下0.1μM以上，較佳係5μM以下0.5μM以上，特別較佳係3μM以下0.5μM以上。PLK阻礙劑存在下之培養係至少12小時，較佳係24小時以上，可進行2日以上、4日以上、8日以上、10日以上、或15日以上。PLK阻礙劑存在下之培養，較佳進行4日以上。經由PLK阻礙劑進行之處理期間亦可進行培養基的交換，因此培養排程中，可與添加了PLK阻礙劑之交換前具有相同組成的培養基、或具有不同組成的培養基交換。

由多能性幹細胞所分化誘導所得之胰前驅細胞集團，較佳係內分泌前驅細胞集團，更佳係產生胰島素之細胞集團、或處於在此之後的分化階段的細胞集團，係可與以PLK阻礙劑處理一起付諸於成為目標細胞集團之進一步分化的步驟。此處之「與以PLK阻礙劑處理一起」，亦包含同時地進行以PLK阻礙劑處理步驟與分化步驟的情況、以PLK阻礙劑處理之後付諸於分化步驟的情況、以及付諸於分化步驟後再付諸於以PLK阻礙劑處理之步驟的情況。因此，以PLK阻礙劑處理時使用的培養基與分化細胞集團時使用的培養基可為不同者，亦可為於分化步驟使用之培養基進一步地添加PLK阻礙劑。

本方法不抑制畸胎瘤增生，但可減少或抑制胰系譜所包含之增生性細胞的殘存數。

本方法不抑制iPS細胞增生(例如，亦可不減少鹼性磷酸酶陽性細胞數)，但可減少或抑制胰系譜所包含之增生性細胞的殘存數。

根據本方法，藉由使用PLK阻礙劑的處理，可減低內分泌前驅細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團中之CHGA陰性細胞，特別是CHGA陰性且Ki67陽性細胞的絕對數。藉此，可貧化所得之細胞集團中之CHGA陰性細胞，特別是CHGA陰性且Ki67陽性細胞。

亦即，與不以PLK阻礙劑處理而培養及/或分化的情況相比，可減低所得之細胞集團中之CHGA陰性細胞，特別是CHGA陰性且Ki67陽性細胞的比率。所得之細胞集團中之CHGA陰性細胞的比率，為40%以下、30%以下、20%以下、15%以下、或10%以下，較佳為20%以下、15%以下、或10%以下，例如，9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、或1%以下。該比率的下限無特限定，例如為0%以上、0.1%以上、或0.5%以上。該比率可使用分別選自前述上限及下限的數值的2個數值表示，例如，該比率為0.1%至40%、0.1%至30%、0.1%至20%、0.1%至15%、或0.1%至10%，較佳為0.1%至20%、0.1%至15%、或0.1%至10%。或者是，該比率為0.5%至40%、0.5%至30%、0.5%至20%、0.5%至15%、或0.5%至10%，較佳為0.5%至20%、0.5%至15%、或0.5%至10%。特別是CHGA陰性且Ki67陽性細胞的比率於所得之細胞集團中為8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、或0.5%以下，較佳為3%以下、2%以下、1%以下或0.5%以下。該比率的下限無特別限定，例如為0%以上、或0.1%以上。該比率可使用分別選自前述上限及下限的數值的2個數值表示，例如，該比率為0.1%至8%、0.1%至7%、0.1%至6%、0.1%至5%、0.1%至4%、0.1%至3%、0.1%至2%、0.1%至1%、或0.1%至0.5%，較佳為0.1%至3%、0.1%至2%、0.1%至1%、或0.1%至0.5%。

再者，根據本方法，以PLK阻礙劑處理後，將由多能性幹細胞所分化誘導所得之胰前驅細胞集團，較佳係內分泌前驅細胞集團，更佳係產生胰島素之細胞集團、或處於在此之後的分化階段的細胞集團分化成為產生胰島素之細胞或胰β細胞，藉此，抑制CHGA陰性細胞，特別是CHGA陰性且Ki67陽性細胞增生，可獲得產生胰島素之細胞或胰β細胞經富集的細胞集團。亦即，與不以PLK 阻礙劑處理所得之情況相比，可增大分化誘導後所得之細胞集團中之產生胰島素之細胞或胰β細胞的比率。所得之細胞集團中之產生胰島素之細胞或胰β細胞的比率係40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、或90%以上。該比率的上限無特別限定，可為100%以下、99%以下、98%以下、97%以下、96%以下、或95%以下。該比率可使用分別選自前述上限及下限的數值的2個數值表示、例如，該比率為40%至95%、50%至95%、60%至95%、70%至95%、80%至95%、或90%至95%。特別是胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞的比率為14%以上，較佳係15%以上，更佳係20%以上，進一步較佳係25%以上，例如為30%以上、35%以上、40%以上、或45%以上。該比率的上限無特別限定，可為50%以下。該比率可使用分別選自前述上限及下限的數值的2個數值表示，例如，該比率為14%至50%，較佳係15%至50%，更佳係20%至50%，進一步較佳係25%至50%。

由本方法所得之產生胰島素之細胞或胰β細胞，係可於移植至動物生體內，於動物生體內分化時直接留置作為胰島素分泌細胞利用。根據由本方法所得之產生胰島素之細胞或胰β細胞，係迴避CHGA陰性細胞，特別是CHGA陰性且Ki67陽性細胞增生，可達成安全且移植細胞的長期存活。

藉由本發明，經去除CHGA陰性細胞，特別是具有高增生性之CHGA陰性且Ki67陽性細胞的產生胰島素之細胞集團或胰β細胞集團(本發明的細胞集團)，係藉由直接或膠囊化而移植至患部，可用為治療糖尿病，特別是I型糖尿病用的細胞醫藥。

再者，本發明的細胞集團亦可為前藥。本說明書中，前藥係指移植至生體內後分化，變化為具有治療疾患功能之細胞的細胞集團。

本發明的細胞集團，係毒性(例如，急性毒性、慢性毒性、遺傳毒 性、生殖毒性、心臟毒性、癌原性)低，藉由直接或藉由與藥學上容許之載體混合作成醫藥混合物，可對於哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、犬、牛、羊、猴、人類)安全地投藥。

以下，藉由實施例說明本發明，但本發明不限定為此等實施例者。

[實施例]

由多能性幹細胞成為內分泌前驅細胞集團的分化誘導，係根據上述步驟1)-5)、既有報導(Stem Cell Research(2015)14,185-197)等實施。成為產生胰島素之細胞的分化誘導，係根據上述步驟6)等實施。

實施例1：產生胰島素之細胞集團以PLK阻礙劑處理所得之細胞集團中之目標外細胞(CHGA陰性細胞)的減少與目標細胞(胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞)的增加(1)

1.方法

1)將由iPS細胞分化誘導所得之內分泌前驅細胞集團，以包含分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑RO、抗壞血酸)的分化誘導培養基(Improved MEM/1%B-27/青黴素鏈黴素培養基)培養7日，分化誘導為產生胰島素之細胞集團。其次，於包含分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑RO、抗壞血酸)之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B-27/青黴鏈黴素培養基)添加PLK1阻礙劑(CAS929095-18-1、3μM)或PLK4阻礙劑(CAS1338800-06-8、3μM)培養4日。

2)將由iPS細胞分化誘導所得之內分泌前驅細胞集團，以包含分化因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑RO、抗壞血酸)，且不含PLK1阻礙劑(CAS929095-18-1)或PLK4阻礙劑(CAS1338800-06-8)的分化誘導培養基 (Improved MEM/1%B-27/青黴素鏈黴素培養基)培養11日，分化誘導為產生胰島素之細胞集團。

以上述1)及2)之各方法所得之細胞集團中之CHGA陰性(且Ki67陽性或Ki67陰性)的細胞數藉由流式細胞術計數，求出各細胞集團中之目標外細胞，亦即，CHGA陰性(且Ki67陽性或Ki67陰性)率。

再者，以上述1)及2)之各方法所得之細胞集團中之胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞數藉由流式細胞術計數，求出各方法中之目標細胞，亦即，胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞率。

2.結果

使用各方法各自進行2次實驗。產生胰島素之細胞的製造步驟中，以PLK1阻礙劑(CAS929095-18-1)或PLK4阻礙劑(CAS1338800-06-8)處理時所得之CHGA陰性(且Ki67陽性或Ki67陰性)細胞率及胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞率的結果示於表1。

成為產生胰島素之細胞的分化誘導步驟的最後4日，使用PLK1阻礙劑(CAS929095-18-1)或PLK4阻礙劑(CAS1338800-06-8)處理時，與Ki67陽性及Ki67陰性細胞之任一者對照相比，確認CHGA陰性細胞率為再現性優異的顯著減少。此結果表示，產生胰島素之細胞的製造過程中，藉由進行PLK1阻礙劑(CAS929095-18-1)或PLK4阻礙劑(CAS1338800-06-8)的處理，減少細胞集團中之目標外細胞(CHGA陰性細胞)，或可抑制此等目標外細胞增生。

另一方面，產生胰島素之細胞之製造過程中，藉由進行PLK1阻礙劑(CAS929095-18-1)或PLK4阻礙劑(CAS1338800-06-8)的處理，細胞集團中之目的 細胞(胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞)率，確認伴隨目標外細胞的減少，與對照相比為再現性優異的顯著增加。

[表1]

由上述結果可知，將產生胰島素之細胞製造步驟的處於最終分化階段之細胞集團以PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑處理，藉此，可減少該細胞集團中存在的目標外細胞(CHGA陰性細胞)或可抑制此等目標外細胞增生，其結果可得到目標細胞(胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞)經富集的細胞集團。

實施例2：將產生胰島素之細胞集團以PLK阻礙劑處理所得之細胞集團中之目標外細胞(CHGA陰性細胞)的減少與目的細胞(胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞)的增加(2)

1.方法

將由iPS細胞分化誘導所得之內分泌前驅細胞集團，使用30mL培養用反應器，再者，除了藉由PLK阻礙劑之產生胰島素之細胞集團的處理進行7日以外，與上述實施例1的方法進行同樣的培養。亦即，將由iPS細胞分化誘導所得之內分 泌前驅細胞集團於30mL培養用反應器，以分化誘導培養基培養4日而分化誘導為產生胰島素之細胞集團。其次，於添加了PLK1阻礙劑(CAS929095-18-1、3μM)或PLK4阻礙劑(CAS1338800-06-8、3μM)之分化誘導培養基培養7日。

對照係將由iPS細胞分化誘導所得之內分泌前驅細胞集團於30mL培養用反應器，以分化誘導培養基培養11日，分化誘導為產生胰島素之細胞集團。

2.結果

即使於使用30mL培養用反應器的系統中，藉由於成為產生胰島素之細胞的分化誘導步驟中使用PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑處理，與Ki67陽性及Ki67陰性細胞之任一者對照相比，CHGA陰性細胞率係確認為再現性優異的著減少，再者，胰島素陽性(且NKX6.1陽性)細胞率，伴隨目標外細胞的減少，與對照相比為再現性優異的顯著增加。再者，與上述實施例1相比，使用PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑的處理時間加長，但無法確認其影響，但確認以PLK1阻礙劑或PLK4阻礙劑的處理係至少對於產生胰島素之細胞製造步驟的處於最終分化階段之細胞集團進行為佳。

實施例3：產生胰島素之細胞集團之單一細胞的RNA-seq表現解析

根據既有報導(Stem Cell Research(2015)14,185-197)、上述步驟1)-6)等，關於由多能性幹細胞分化誘導所得之產生胰島素之細胞集團，實施單一細胞RNA-seq表現解析的結果，於屬於目標外細胞之CHGA陰性細胞中，高度表現PLK基因。由此可知，為了減少/抑制增生目標外細胞，使用PLK作為標靶之阻礙劑時，可觀察到上述之顯著效果。

Claims (17)

1. 一種產生胰島素之細胞集團的製造方法，係包含以PLK阻礙劑處理由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團的步驟。
2. 如請求項1所述之製造方法，其中，所製造的細胞集團是以20%以下的比率包含CHGA陰性細胞。
3. 如請求項1或2所述之製造方法，其中，所製造的細胞集團是以3%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。
4. 如請求項1至3中任一項所述之製造方法，其中，所製造的細胞集團是以15%以上的比率包含胰島素陽性且NKX6.1陽性的細胞。
5. 如請求項1至4中任一項所述之製造方法，係更包含使以PLK阻礙劑處理後之產生胰島素之細胞集團分化的步驟。
6. 如請求項1至5中任一項所述之製造方法，係以3μM以下的PLK阻礙劑處理產生胰島素之細胞集團。
7. 一種抑制CHGA陰性細胞之增生的方法，該CHGA陰性細胞係存在於由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團中，

   該方法係包含以PLK阻礙劑處理該細胞集團。
8. 如請求項7所述之方法，係以3μM以下的PLK阻礙劑處理產生胰島素之細胞集團。
9. 如請求項7或8所述之方法，係使存在於產生胰島素之細胞集團中的CHGA陰性細胞減少為20%以下的比率。
10. 如請求項7至9中任一項所述之方法，係使存在於產生胰島素之細胞集團中的CHGA陰性且Ki67陽性的細胞減少為3%以下的比率。
11. 如請求項7至10中任一項所述之方法，係使存在於產生胰島素之細胞集團中的胰島素陽性且NKX6.1陽性的細胞增大為15%以上的比率。
12. 一種細胞集團，係以20%以下的比率包含CHGA陰性細胞，且為經PLK阻礙劑處理之由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團或處於在此之後的分化階段的細胞集團。
13. 如請求項12所述之細胞集團，係以3%以下的比率包含CHGA陰性且Ki67陽性的細胞。
14. 如請求項12或13所述之細胞集團，係以15%以上的比率包含胰島素陽性且NKX6.1陽性的細胞。
15. 如請求項12至14中任一項所述之細胞集團，係使用於移植用。
16. 一種治療糖尿病用之醫藥，係包含請求項12至15中任一項所述之細胞集團。
17. 一種糖尿病的治療方法，係包含將以PLK阻礙劑處理後且由多能性幹細胞所分化誘導之產生胰島素之細胞集團移植的步驟。