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WO2024014497A1 - 細胞移植用のフィブリンゲルシート - Google Patents

細胞移植用のフィブリンゲルシート Download PDF

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WO2024014497A1
WO2024014497A1 PCT/JP2023/025809 JP2023025809W WO2024014497A1 WO 2024014497 A1 WO2024014497 A1 WO 2024014497A1 JP 2023025809 W JP2023025809 W JP 2023025809W WO 2024014497 A1 WO2024014497 A1 WO 2024014497A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
fibrin gel
gel sheet
sheet
fibrin
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2023/025809
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English (en)
French (fr)
Inventor
洋章 杉山
光 上野
彬文 吉原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Orizuru Therapeutics Inc
Original Assignee
Orizuru Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orizuru Therapeutics Inc filed Critical Orizuru Therapeutics Inc
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Priority to JP2024533746A priority patent/JPWO2024014497A1/ja
Priority to KR1020257003710A priority patent/KR20250036837A/ko
Priority to AU2023307842A priority patent/AU2023307842A1/en
Priority to CN202380053547.5A priority patent/CN119546748A/zh
Priority to IL318270A priority patent/IL318270A/en
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    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/56—Fibrin; Thrombin

Definitions

  • the present invention relates to a fibrin gel sheet for cell transplantation, in which cells are uniformly dispersed and encapsulated in a fibrin gel sheet, and which has an unprecedentedly large size, and a method for manufacturing the same.
  • Functional differentiated cells derived from pluripotent stem cells such as induced pluripotent cells and embryonic stem cells (ES cells) are expected to serve as a cell source for transplantation and regenerative medicine.
  • pluripotent stem cells such as induced pluripotent cells and embryonic stem cells (ES cells)
  • ES cells embryonic stem cells
  • Non-Patent Document 1 discloses a sheet-like structure formed by sandwiching pancreatic islet cells encapsulated in fibrin gel between Vycryl (registered trademark) meshes of 7 mm x 7 mm. It is described that it was transplanted into a site of a recipient diabetic model rat that had undergone angiogenesis treatment in advance.
  • Vycryl registered trademark
  • Non-Patent Document 2 discloses a sheet-like structure formed by sandwiching pancreatic islet cells encapsulated in a hydrogel containing polyvinyl alcohol (PVA) between polyethylene terephthalate (PET) meshes with a size of 20 mm x 15 mm. It is described that the construct was transplanted into a recipient diabetic model rat.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PET polyethylene terephthalate
  • Patent Document 1 discloses a sheet-like structure in which pancreatic islet cells encapsulated in a hydrogel containing PVA are sandwiched between circular PET meshes with a diameter of 15 mm, and the structure is used in a diabetic model as a recipient. It has been reported that it was transplanted into mice.
  • the previously reported sheet-like structure in which functional differentiated cells are encapsulated in a biodegradable gel is intended for transplantation into diabetic model animals (rats and mice), and its size is When targeting large mammals such as humans, the size may not be sufficient, and the number of cells loaded may not be sufficient. Therefore, in this field, there has been a strong desire to develop the above-mentioned structure that has a larger size and contains more cells, which can also be used in humans.
  • the present inventors tried to create the above-mentioned structure having a larger size using fibrin gel, and found that the larger amount of fibrin gel prepared to create the larger size did not reach the desired size. It was discovered that when trying to spread the material to a size of 1 and mold it into a sheet, it gelled (solidified) before it was sufficiently spread, making it difficult to mold it to the desired size. Furthermore, when trying to mold a large amount of fibrin gel into a sheet of the desired size while continuously injecting it, the cells in the solution will precipitate, and the cell content will decrease from the beginning to the end of the continuous injection. It has become clear that only the structure described above can be produced in which the cell density gradually decreases and, as a result, the cell density is not uniform. Heterogeneity in cell density is undesirable because it may reduce therapeutic efficiency and affect long-term engraftment of transplanted cells.
  • the present invention aims to solve these problems discovered by the present inventors, and has a larger size than ever before, and at the same time, a larger number of cells are uniformly dispersed and encapsulated.
  • the object is to provide a sheet-like fibrin gel structure (ie, a fibrin gel sheet).
  • the present inventors have found that, in the formation of fibrin gel, by adjusting the blending amount of fibrinogen and thrombin and/or the temperature during gelation (solidification), it is possible to It has been discovered that the rate of gelling (solidification) of the gel can be adjusted and that it can be spread and shaped into fibrin gel sheets having a desired larger size.
  • a fibrin gel in forming a fibrin gel, by adding and suspending biodegradable particles to a fibrinogen solution in which cells are suspended, or by adding and dissolving a biodegradable gelling agent to the fibrinogen solution.
  • a biodegradable gelling agent By suppressing cell precipitation, cells can be maintained in a uniformly dispersed and suspended state, and by gelling (solidifying) this, even in molding by continuous injection, It has been found that a fibrin gel sheet with uniform cell density can be obtained.
  • a fibrin gel sheet for cell transplantation in which cells are uniformly dispersed and encapsulated in a fibrin gel sheet, has a surface area of 2.25 cm 2 or more, and a thickness of 1 mm or less.
  • the fibrin gel sheet of [1] in which cells are encapsulated in an amount exceeding 1.5 ⁇ 10 6 cells/cm 2 .
  • the fibrin gel sheet of [1] or [2], wherein the cells are in the form of spheroids.
  • the fibrin gel sheet of [5] which contains a biodegradable gelling agent in an amount of 0.2 to 2 w/v%.
  • the fibrin gel sheet of [8] which has a size that allows the biodegradable particles to pass through an opening of 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • a laminate of fibrin gel sheets for cell transplantation comprising a plurality of laminated fibrin gel sheets according to any one of [1] to [12].
  • a fibrin gel sheet used in a cell transplant treatment method in which cells are uniformly dispersed and encapsulated in a fibrin gel sheet, has a surface area of 2.25 cm 2 or more, and a thickness of 1 mm or less .
  • [8a] The fibrin gel sheet according to any one of [1a] to [4a], further encapsulating biodegradable particles.
  • the fibrin gel sheet of [8a] which has a size that allows the biodegradable particles to pass through an opening of 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • the fibrin gel sheet according to any one of [8a] to [10a] wherein the biodegradable particles are gelatin gel particles.
  • the fibrin gel sheet according to any one of [1a] to [10a] further comprising a support.
  • [33a] A laminate of fibrin gel sheets used in a cell transplant treatment method, which is formed by laminating a plurality of fibrin gel sheets according to any one of [1a] to [12a].
  • This specification includes the content described in the specification and/or drawings of Japanese Patent Application No. 2022-113546 filed on July 14, 2022, which is the basis of the priority of this application. All publications, patents, and patent applications cited herein are incorporated by reference in their entirety.
  • the present invention it is possible to provide a fibrin gel sheet that has a larger size than hitherto available and in which more cells are uniformly dispersed and encapsulated, as well as a method for producing the same.
  • FIG. 1 is a photographic diagram showing the appearance of (A) a fibrin gel mass containing iPIC and (B) a fibrin gel sheet containing iPIC. Scale bar: 10mm.
  • Figure 2 is a graph showing the analysis results of blood human c-peptide concentration measured over time by ELISA method in nude rats in which fibrin gel masses containing iPIC or fibrin gel sheets containing iPIC were subcutaneously implanted. be.
  • Figure 3 shows the results of histological analysis of the implantation site 10 days and 6 weeks after implantation in nude rats in which (A) fibrin gel mass containing iPIC or (B) fibrin gel sheet containing iPIC was subcutaneously implanted.
  • FIG. Scale bar 1mm.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of analyzing the relationship between thrombin concentration and fibrin gel gelation time.
  • Figure 5 shows the appearance (A) of a fibrin gel sheet containing large animal/human-sized iPICs manufactured by a method using a cooled metal mold, and the positions 1 to 4 of the sheet observed using a phase contrast microscope. It is a photographic figure showing the result (B) observed by.
  • FIG. 6 is a photographic diagram showing the state of iPIC suspended in (A) fibrinogen solution and (B) fibrinogen+gelatin microsphere solution and left to stand for a predetermined period of time. Arrowheads in (A) indicate precipitation of iPIC.
  • Figure 7 shows the analysis results of blood human c-peptide concentration measured over time by ELISA method in nude rats subcutaneously implanted with fibrin gel sheets containing iPIC or fibrin + gelatin microsphere gel sheets containing iPIC. It is a graph diagram.
  • Figure 8 is a photographic diagram (A) showing the appearance and cross section of a fibrin + gelatin microsphere gel sheet containing large animal/human-sized iPICs produced manually by pipette injection and using a 3D printer, and the brightness distribution of each sheet.
  • FIG. 9 is a graph showing the measurement results of the number of cells (concentration) in the fibrinogen+collagen solution discharged from the syringe.
  • FIG. 10 is a graph showing the analysis results of blood human c-peptide concentration measured by ELISA method in nude rats in which a fibrin + gelatin microsphere gel sheet containing iPIC or a fibrin + collagen gel sheet containing iPIC was subcutaneously implanted. It is a diagram.
  • FIG. 11 is a graph showing the measurement results of the number of cells contained in six arbitrary locations (1 to 6) of a fibrin + collagen gel sheet containing large animal/human-sized iPICs produced using a 3D printer. .
  • “about” means up to plus or minus 25%, 20%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% or 1%, respectively, with respect to the reference value. Indicates a fluctuating value. Preferably, the term “about” indicates a range of plus or minus 15%, 10%, 5%, or 1%, respectively, relative to the reference value.
  • not using feeder cells basically means not containing feeder cells, and not using a medium preconditioned by culturing feeder cells. Therefore, the medium does not contain substances such as growth factors and cytokines secreted from feeder cells.
  • feeder cell refers to a cell that is co-cultured with another type of cell to provide an environment that supports the cell and allows it to grow.
  • Feeder cells may be from the same species as the cells they support or from a different species.
  • human dermal fibroblasts or human embryonic stem cells may be used as feeders for human cells, primary cultures of mouse embryonic fibroblasts, and immortalized mouse embryonic fibroblasts may be used.
  • Feeder cells can be inactivated, such as by radiation or mitomycin C treatment.
  • adheresion refers to the attachment of cells to a container, e.g., attachment of cells to a sterile plastic (or coated plastic) cell culture dish or flask in the presence of an appropriate medium. It refers to the fact that Some cells cannot be maintained or grow in culture unless they are attached to a cell culture vessel. In contrast, non-adherent cells can be maintained and expanded in culture without being attached to a container.
  • culture refers to maintaining, growing, and/or differentiating cells in an in vitro environment.
  • “Culture” means sustaining, proliferating, and/or differentiating cells in a tissue or outside the body, eg, in a cell culture dish or flask.
  • Culture includes two-dimensional culture (plane culture) and three-dimensional culture (suspension culture).
  • purify and purification refer to removing impurities in a composition, such as a composition of cells, to make it pure with respect to specific components.
  • “Purified” when used to describe the composition of a cell is one in which the amount of impurity is relative to the proportion of such components in the composition of the cell before it is purified. Refers to a composition of cells that has a comparatively reduced purity and increased purity of certain components.
  • a composition of cells can be purified with respect to a target cell type, such that the proportion of target cell types is increased compared to the proportion of target cells present in the composition of cells prior to purification.
  • Compositions of cells can also be purified for target cell types by cell selection and sorting methods known in the art.
  • compositions of cells can also be purified by certain sorting or selection processes as described herein.
  • the method of purifying the target cells results in the target cells being at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% pure. , impurities (including contaminating cells) may be undetectable.
  • growth factor is an endogenous protein that promotes differentiation and/or proliferation of specific cells.
  • growth factors include epidermal growth factor (EGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), hepatocyte growth factor (HGF), and insulin-like growth factor 1.
  • IGF-1 insulin-like growth factor 2
  • IGF-2 insulin-like growth factor 2
  • KGF keratinocyte growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • transferrin various interleukins (e.g., IL-1 to IL-18), various colony-stimulating factors (e.g., granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF)), Included are various interferons (such as IFN- ⁇ ) and other cytokines that have effects on stem cells, such as stem cell factor (SCF) and erythropoietin (Epo).
  • SCF stem cell factor
  • Epo erythropoietin
  • ROCK inhibitor refers to a substance that inhibits Rho kinase (ROCK: Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase), and refers to a substance that inhibits either ROCK I or ROCK II. You can.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it has the above function, and for example, N-(4-pyridinyl)-4 ⁇ -[(R)-1-aminoethyl]cyclohexane-1 ⁇ -carboxamide (herein, Y27632 ), Fasudil (HA1077), (2S)-2-methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonyl]hexahydro-1H-1,4-diazepine (H-1152), 4 ⁇ -[(1R)-1-aminoethyl]-N-(4-pyridyl)benzene-1 ⁇ -carboxamide (Wf-536), N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)- 4PER[(R)-1-aminoethyl]cyclohexane-1 ⁇ -carboxamide (Y-30141), N-(3- ⁇ [2-(4-amino-1,2,5
  • ROCK inhibitors are not limited to these, and antisense oligonucleotides and siRNAs against ROCK mRNA, antibodies that bind to ROCK, dominant negative ROCK mutants, etc. can also be used as ROCK inhibitors, and commercially available are available or can be synthesized according to known methods.
  • a “GSK3 ⁇ inhibitor” is a substance that has inhibitory activity against GSK3 ⁇ (glycogen synthase kinase 3 ⁇ ).
  • GSK3 (glycogen synthase kinase 3) is a type of serine/threonine protein kinase and is involved in many signal pathways involved in glycogen production, apoptosis, stem cell maintenance, and the like. GSK3 exists in two isoforms, ⁇ and ⁇ .
  • the "GSK3 ⁇ inhibitor” used in the present invention is not particularly limited as long as it has GSK3 ⁇ inhibitory activity, and may be a substance that has both GSK3 ⁇ inhibitory activity and GSK3 ⁇ inhibitory activity.
  • CHIR98014 (2-[[2-[(5-nitro-6-aminopyridin-2-yl)amino]ethyl]amino]-4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1H -imidazol-1-yl)pyrimidine), CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl] TDZD-8 (4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione), SB216763 (3-(2,4-dichlorophenyl) )-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione), TWS-119(3-[6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2 , 3-d]pyrimidin-4-
  • GSK3 ⁇ inhibitors are not limited to these, and antisense oligonucleotides and siRNAs against GSK3 ⁇ mRNA, antibodies that bind to GSK3 ⁇ , dominant negative GSK3 ⁇ mutants, etc. can also be used as GSK3 ⁇ inhibitors, and commercially available are available or can be synthesized according to known methods.
  • serum replacement refers to, for example, KnockOutTM Serum Replacement (KSR: Thermo Fisher Scientific), StemSure (registered trademark) Serum Replacement (Wako), B-27 supplement. , N2-supplements, albumin (e.g. lipids) rich albumin), insulin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements (e.g. zinc, selenium (e.g. sodium selenite)), 2-mercaptoethanol, 3' thiol glycerol or mixtures thereof (e.g. ITS-G). ).
  • Preferred serum replacements include B-27 supplement, KSR, StemSure® Serum Replacement, and ITS-G.
  • concentration in the medium is 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 2% by weight. In the present invention, it is preferable to use a "serum substitute" in place of serum.
  • factor having CDK8/19 inhibitory activity means any substance that has CDK8/19 inhibitory activity. In contrast to other proteins of the same CDK family, CDK8 is not required for cell proliferation and inhibition of CDK8 has no significant effect under normal conditions. CDK19 and CDK8 are similar, and inhibition of CDK8 is usually accompanied by inhibition of CDK19. Conventionally known "factors having CDK8/19 inhibitory activity" can be used, and such CDK8/19 inhibitors can be found in patent documents or non-patent documents.
  • Factors with CDK8/19 inhibitory activity are not limited to these, and antisense oligonucleotides and siRNAs against CDK8/19 mRNA, antibodies that bind to CDK8/19, dominant negative CDK8/19 mutants, etc. It can be used as a factor having 19-inhibitory activity, and can be commercially available or synthesized according to known methods.
  • the present invention relates to a fibrin gel sheet for cell transplantation (hereinafter sometimes simply referred to as "fibrin gel sheet of the present invention"), in which cells are uniformly dispersed and encapsulated in a fibrin gel sheet. It is.
  • the fibrin gel sheet of the present invention is characterized by having a size that could not be achieved with conventional fibrin gel sheets for cell transplantation.
  • the surface area of the sheet (also referred to as one side of the sheet) is 2.25 cm 2 or more, preferably 4 cm 2 or more, more preferably 9 cm 2 or more, even more preferably 16 cm 2 or more, even more preferably 25 cm 2 or more, particularly preferably 36 cm 2 In particular, it is more preferably 49 cm 2 or more, especially more preferably 64 cm 2 or more, even more preferably 81 cm 2 or more, particularly preferably 100 cm 2 or more, and the upper limit is not particularly limited, and the size and shape of the transplant site Although it is possible to select the size as appropriate depending on the size, for example, the size may be 400 cm 2 or less.
  • the range of the surface area of the fibrin gel sheet of the present invention can be expressed using two numerical values respectively selected from the lower limit and upper limit.
  • the surface area of the fibrin gel sheet of the present invention is 2.25 cm 2 or more. ⁇ 400cm 2 or less, preferably 4cm 2 or more and 400cm 2 or less, more preferably 9cm 2 or more and 400cm 2 or less, even more preferably 16cm 2 or more and 400cm 2 or less, even more preferably 25cm 2 or more and 400cm 2 or less, especially Preferably 36 cm 2 or more and 400 cm 2 or less, especially more preferably 49 cm 2 or more and 400 cm 2 or less, even more preferably 64 cm 2 or more and 400 cm 2 or less, even more preferably 81 cm 2 or more and 400 cm 2 or less, particularly preferably
  • the size can be appropriately selected from the range of 100 cm 2 or more and 400 cm 2 or less.
  • the shape of the above-mentioned one side of the fibrin gel sheet of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the size and shape of the transplant site. , octagon, etc.), rounded polygons, circles, ellipses, etc., but are not limited to these.
  • the fibrin gel sheet of the present invention has a rectangular shape
  • its vertical length is 15 mm or more, preferably 20 mm or more, more preferably 30 mm or more, still more preferably 40 mm or more, even more preferably 50 mm or more, Particularly preferably 60 mm or more, particularly more preferably 70 mm or more, particularly still more preferably 80 mm or more, even more preferably 90 mm or more, particularly preferably 100 mm or more
  • the upper limit is not particularly limited, but for example, 200 mm or less. I can do it.
  • the fibrin gel sheet of the present invention has a horizontal length of 15 mm or more, preferably 20 mm or more, more preferably 30 mm or more, even more preferably 40 mm or more, even more preferably 50 mm or more, particularly preferably 60 mm or more, especially more preferably is 70 mm or more, particularly preferably 80 mm or more, even more preferably 90 mm or more, particularly preferably 100 mm or more, and the upper limit thereof is not particularly limited, but may be, for example, 200 mm or less.
  • the size of the fibrin gel sheet of the present invention is (vertical length) width x width length (horizontal length x length may be acceptable)), 15 mm or more to 200 mm or less x 15 mm or more to 200 mm or less, preferably 20 mm or more to 200 mm or less x 20 mm or more to 200 mm or less, More preferably 30 mm or more and 200 mm or less x 30 mm or more and 200 mm or less, still more preferably 40 mm or more and 200 mm or less x 40 mm or more and 200 mm or less, even more preferably 50 mm or more and 200 mm or less x 50 mm or more and 200 mm or less, particularly preferably 60 mm.
  • the size can be appropriately selected from the range of ⁇ 200 mm or less x 90 mm or more and 200 mm or less, particularly preferably 100 mm or more - 200 mm or less x 100 mm or more and 200 mm or less.
  • the size of the fibrin gel sheet of the present invention is 15 mm or more x 15 mm or more, preferably 20 mm x 20 mm. , 20 mm x 30 mm, or 30 mm x 30 mm, more preferably 40 mm x 40 mm, 40 mm x 50 mm, 50 mm x 50 mm, 40 mm x 60 mm, or 60 mm x 60 mm, even more preferably 70 mm x 70 mm, 80 mm x 80 mm, 90 mm x 90 mm, 100 mm. x 100 mm, or 200 mm x 200 mm, etc., but are not limited to these.
  • the thickness of the fibrin gel sheet of the present invention can be appropriately set depending on factors such as the size and amount of encapsulated cells and the size of the transplant site, but is preferably 1 mm or less. Since the thickness of the fibrin gel sheet of the present invention is 1 mm or less, nutrients and oxygen can be efficiently supplied to the cells contained in the fibrin gel sheet, and the fibrin gel can be quickly decomposed after transplantation. achievable and desirable.
  • the thickness of the fibrin gel sheet of the present invention can be, for example, 1 mm or less, 900 ⁇ m or less, 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, or 400 ⁇ m or less, and the lower limit is not particularly limited, but for example, 100 ⁇ m or more, 200 ⁇ m or more, or 300 ⁇ m or more.
  • the range of the thickness of the fibrin gel sheet of the present invention can be expressed using two numerical values respectively selected from the upper and lower limits.
  • the thickness of the fibrin gel sheet of the present invention is 100 ⁇ m or more and 1 mm or less.
  • the thickness of the fibrin gel sheet of the present invention is about 400 ⁇ m.
  • the thickness of the fibrin gel sheet of the present invention does not need to be uniform throughout the sheet, and even the thickest part may be within the above range.
  • the expression that cells are "uniformly dispersed and encapsulated" means that the seeded cells are not confined to any part of the fibrin gel sheet of the present invention, but are widely distributed within the fibrin gel sheet. means to be All cells do not need to be completely embedded in the fibrin gel sheet, but in a cell culture seeded on the surface of the fibrin gel and cultured adherently, the cells are localized only on the surface of the fibrin gel sheet.
  • cells are "dispersed and encapsulated.” More specifically, in this specification, cells are "uniformly dispersed and encapsulated” at any plurality of locations (for example, 2, 4, or 6 locations, etc.) on the fibrin gel sheet of the present invention. ) means that the deviation of each cell number (cell density) included in a predetermined range is small, and preferably the value of each cell number is within ⁇ 20% of their average value, preferably ⁇ 15%. It means within a range of ⁇ 10%, more preferably within ⁇ 10%.
  • the expression that cells are "uniformly dispersed and encapsulated” refers to the positional relationship between the seeded cells, for example, cells seeded on the surface or inside of the fibrin gel. is cultured and proliferated, and if the seeded cells come into contact with/combine with each other, it cannot be said that the cells are at least dispersed among the seeded cells, so the cells are It does not fall under the condition of being "uniformly dispersed and contained.”
  • Examples of such a state in which the seeded cells are in contact/bond are a cell culture (e.g., cell sheet, etc.) formed by seeding and culturing on the surface/inside of a fibrin gel, Such aspects are not intended to be included in the present invention.
  • the morphology of the seeded cells may be, for example, a state of a cell mass or cell aggregate in which cells aggregate and aggregate, i.e., a spheroid. This is not intended to exclude the possibility that the cells may be in the form of , or that the seeded cells will proliferate.
  • cells are cells to be transplanted to a patient who requires them for cell therapy, and can be appropriately selected depending on the patient's symptoms, such as epidermis, nerves, brain, spinal cord, etc.
  • Cells that constitute organs and tissues such as (but not limited to) the esophagus, stomach, small intestine, large intestine, bladder, urethra, lung, thyroid, pancreas, liver, muscle, skeleton, heart, blood vessels, spleen, kidney, and blood. Examples include cells having functions equivalent to or similar to those of the progenitor cells.
  • Cells may be used alone or in combination with different cells.
  • the form of cells in the fibrin gel sheet of the present invention is not particularly limited, and may be cells separated from each other (single cell state), or cell clusters or cell aggregates in which cells aggregate and aggregate.
  • the cells may exist in the form of spheroids, or may be cells cultured in suspension. Examples of cells in the form of spheroids include, but are not limited to, pancreatic islet cells, hepatocytes, cardiomyocytes, and the like.
  • cells may be cells collected from a living body, cultured cells, or cells obtained by freezing and thawing these cells.
  • “cells” are cells derived from pluripotent stem cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells.
  • pluripotency refers to the ability to differentiate into tissues and cells with various different forms and functions, and to differentiate into cells of any of the three germ layers. “Pluripotency” means that it cannot differentiate into a scutellum and therefore has no ability to form an individual, whereas “totipotency” means that it can differentiate into any tissue in the body, including the scutellum. ” is distinguished from.
  • multipotency refers to the ability to differentiate into a limited number of cell lines.
  • mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, and neural stem cells are multipotent but not pluripotent.
  • pluripotent stem cells refer to embryonic stem cells (ES cells) and similar pluripotent cells, that is, to various tissues of the body (endoderm, mesoderm, ectoderm). refers to cells that potentially have the ability to differentiate into all germ layers). Examples of cells having pluripotency similar to ES cells include "induced pluripotent stem cells” (sometimes referred to herein as “iPS cells”). Preferably, in the present invention, the pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells.
  • ES cells various mouse ES cell lines established by inGenius, RIKEN, etc. can be used for mouse ES cells, and for human ES cells, available from the National Institutes of Health.
  • Various human ES cell lines established by NIH, RIKEN, Kyoto University, and Cellartis are available.
  • ES cell lines include NIH's CHB-1 to CHB-12 lines, RUES1 line, RUES2 line, HUES1 to HUES28 line, etc., WiCell Research Institute's H1 line and H9 line, RIKEN's KhES-1 line, KhES-2 line, etc. strains, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain, etc. can be used.
  • “Induced pluripotent stem cells” refer to cells obtained by reprogramming mammalian somatic cells or undifferentiated stem cells by introducing specific factors (nuclear reprogramming factors).
  • specific factors nuclear reprogramming factors
  • Yamanaka et al. established iPS cells by introducing four factors, Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc, into mouse fibroblasts.
  • Nanog-iPS cells were established using Nanog expression as an indicator (Okita, K., Ichisaka, T. , and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), iPS cells produced by a c-Myc-free method (Nakagawa M, Yamanaka S., et al.
  • induced pluripotent stem cells Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.
  • induced pluripotent stem cells created by Daley et al. Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451:141-146
  • induced pluripotent stem cells created by Sakurada et al. Japanese Unexamined Patent Publication No. 2008-307007, etc.
  • human iPS cell lines include RIKEN's HiPS-RIKEN-1A strain, HiPS-RIKEN-2A strain, HiPS-RIKEN-12A strain, Nips-B2 strain, Kyoto University's Ff-WJ-18 strain, and Ff- I01s01 strain, Ff-I01s02 strain, Ff-I01s04 strain, Ff-I01s06 strain, Ff-I14s03 strain, Ff-I14s04 strain, QHJI01s01 strain, QHJI01s04 strain, QHJI14s03 strain, QHJI14s04 strain, 253G1 strain, 201B7 strain, 40 9B2 strain, 454E2 606A1 stock, 610B1 stock, 648A1 stock, CDI's MyCell iPS Cells (21525.102.10A) stock, MyCell
  • Pluripotent stem cell-derived cells that can be used in the present invention include, but are not limited to, iPS cell-derived pancreatic islet cells (hereinafter sometimes referred to as "iPIC").
  • iPICs include insulin producing cells and/or pancreatic ⁇ cells.
  • Insulin-producing cells are cells characterized by the expression of at least one marker of insulin and NK6 homeobox 1 (NKX6.1).
  • Pancreatic ⁇ cells are more mature cells than insulin-producing cells and are characterized by the expression of at least one marker of MAFA, UCN3, and IAPP.
  • the term “marker” refers to a cell antigen or its gene that is specifically expressed by a predetermined cell type, such as a "marker protein” or “marker gene.”
  • the marker is a cell surface marker, in which case enrichment, isolation, and/or detection of viable cells can be performed.
  • the marker can be a positive selection marker or a negative selection marker.
  • Detection of a marker protein can be performed using an immunological assay (ELISA, immunostaining, flow cytometry, etc.) using an antibody specific to the marker protein.
  • Detection of marker genes can be performed using nucleic acid amplification methods and/or nucleic acid detection methods (RT-PCR, microarrays, biochips, etc.) known in the art.
  • RT-PCR nucleic acid detection methods
  • “positive” for a marker protein means that it is detected as positive by flow cytometry
  • negative means that it is below the detection limit by flow cytometry.
  • positive” for a marker gene means that it is detected by RT-PCR, and “negative” means that it is below the detection limit by RT-PCR.
  • “Expression” is defined as the transcription and/or translation of a specific nucleotide sequence driven by a promoter within a cell.
  • iPIC can be obtained from pluripotent stem cells by inducing differentiation according to known methods (WO2009/012428, WO2016/021734, Stem Cell Research (2015) 14, 185-197). That is, iPIC can be obtained using the following differentiation induction step: Step 1) Inducing differentiation from pluripotent stem cells to definitive endoderm cells; Step 2) Inducing differentiation from definitive endoderm cells to gastrula cells; Step 3) Inducing differentiation from gastrula cells to posterior foregut cells; Step 4) Inducing differentiation from posterior foregut cells to pancreatic progenitor cells; Step 5) Inducing differentiation from pancreatic progenitor cells to endocrine progenitor cells; Step 6) Differentiation of endocrine progenitor cells into iPICs is induced. Each step will be explained below, but the induction of differentiation into each cell is not limited to these methods.
  • Step 1) Differentiation into definitive endoderm cells Pluripotent stem cells are first differentiated into definitive endoderm cells. Methods for inducing definitive endoderm from pluripotent stem cells are already known, and any of these methods may be used.
  • the pluripotent stem cells are differentiated into definitive endoderm cells by being cultured in a medium containing activin A, more preferably in a medium containing activin A, a ROCK inhibitor, or a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • the number of cells at the start of culture is not particularly limited, and is 22,000 to 150,000 cells/cm 2 , preferably 22,000 to 100,000 cells/cm 2 , and more preferably 22,000 to 80,000 cells/cm 2 .
  • the culture period is 1 to 4 days, preferably 1 to 3 days, particularly preferably 3 days.
  • the culture temperature is not particularly limited, but the culture is carried out at 30 to 40°C (for example, 37°C). Further, the carbon dioxide concentration in the culture container is, for example, about 5%. Culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the media used in this step include RPMI 1640 medium, MEM medium, iMEM medium, DMEM/F12 medium, Improved MEM Zinc Option medium, Improved MEM/1% B-27/Penisilin Streptomycin medium, MCDB131/20mM Glucose/ NaHCO3 / Basal media used for culturing mammalian cells can be used, such as FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAXTM/Ascorbic Acid/Penisilin Streptomycin media.
  • the concentration of activin A in the medium is usually 30 to 200 ng/mL, preferably 50 to 150 ng/mL, more preferably 70 to 120 ng/mL, particularly preferably about 100 ng/mL.
  • activin A can be included in the medium at low doses, for example in an amount of 5-100 ng/mL, preferably 5-50 ng/mL, more preferably 5-10 ng/mL.
  • the concentration of activin A in the medium is about 0.1-100 ng/mL, preferably about 1-50 ng/mL, more preferably about 3-10 ng/mL.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of GSK3 ⁇ inhibitor used.
  • the concentration is usually 2 to 5 ⁇ M, preferably 2 to 4 ⁇ M, particularly preferably about It is 3 ⁇ M.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of ROCK inhibitor used.
  • the concentration is usually 5 to 20 ⁇ M, preferably 5 to 15 ⁇ M, particularly preferably about It is 10 ⁇ M.
  • Insulin can further be added to the medium.
  • Insulin can be included in the medium in an amount of 0.01-20 ⁇ M, preferably 0.1-10 ⁇ M, more preferably 0.5-5 ⁇ M.
  • the concentration of insulin in the medium may be, but is not limited to, the concentration of insulin contained in the added B-27 supplement.
  • the cells are cultured for one day in a medium containing activin A, a ROCK inhibitor, and a GSK3 ⁇ inhibitor, and then cultured for two more days in a medium containing only activin A, while changing the medium every day.
  • pluripotent stem cells are cultured in the presence of low doses of activin A in a medium containing 0.01-20 ⁇ M insulin, followed by a second culture in medium without insulin. It can be manufactured by performing the following steps.
  • Step 2) Differentiation into gastrula cells
  • the definitive endoderm cells obtained in step 1) are further cultured in a medium containing growth factors to induce differentiation into gastrula cells.
  • the culture period is 2 to 8 days, preferably about 4 days.
  • the culture temperature is not particularly limited, but the culture is carried out at 30 to 40°C (for example, 37°C). Further, the carbon dioxide concentration in the culture container is, for example, about 5%. Culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • a basic medium used for culturing mammalian cells can be used.
  • growth factors serum substitutes, vitamins, antibiotics, etc. may be added to the medium as appropriate.
  • EGF EGF, KGF, and FGF10 are preferred, EGF and/or KGF are more preferred, and KGF is even more preferred.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M.
  • the concentration is about 5-2000 ng/mL (i.e., about 0.8-320 nM), preferably about 5-1000 ng/mL (i.e., about 0.8-160 nM), more preferably about 10-1000 ng/mL (i.e., about 0.8-160 nM). 1000 ng/mL (ie, approximately 1.6-160 nM).
  • the concentration is about 5-2000 ng/mL (ie, about 0.3-116 nM), preferably about 10-1000 ng/mL (ie, about 0.6-58 nM).
  • the concentration is usually 5 to 150 ng/mL, preferably 30 to 100 ng/mL, particularly preferably about 50 ng/mL.
  • Step 3) Differentiation into posterior foregut cells
  • the gastrula cells obtained in step 2) are further cultured in a medium containing growth factors, cyclopamine, noggin, etc., and induced to differentiate into posterior foregut cells.
  • the culture period is 1 to 5 days, preferably about 2 days. Culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the culture temperature is not particularly limited, but the culture is carried out at 30 to 40°C (for example, 37°C). Further, the carbon dioxide concentration in the culture container is, for example, about 5%.
  • a basic medium used for culturing mammalian cells can be used.
  • growth factors serum substitutes, vitamins, antibiotics, etc. may be added to the medium as appropriate.
  • EGF EGF, KGF, and FGF10 are preferred, EGF and/or KGF are more preferred, and KGF is even more preferred.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M.
  • the concentration is about 5-2000 ng/mL (i.e., about 0.8-320 nM), preferably about 5-1000 ng/mL (i.e., about 0.8-160 nM), more preferably about 10-1000 ng/mL (i.e., about 0.8-160 nM). 1000 ng/mL (ie, approximately 1.6-160 nM).
  • the concentration is about 5-2000 ng/mL (ie, about 0.3-116 nM), preferably about 10-1000 ng/mL (ie, about 0.6-58 nM).
  • the concentration is usually 5 to 150 ng/mL, preferably 30 to 100 ng/mL, particularly preferably about 50 ng/mL.
  • the concentration of cyclopamine in the medium is not particularly limited, but is usually 0.5 to 1.5 ⁇ M, preferably 0.3 to 1.0 ⁇ M, particularly preferably about 0.5 ⁇ M.
  • the concentration of Noggin in the medium is not particularly limited, but is usually 10 to 200 ng/mL, preferably 50 to 150 ng/mL, particularly preferably about 100 ng/mL.
  • Step 4) Differentiation into pancreatic progenitor cells
  • the posterior foregut cells obtained in step 3) are further treated in a medium containing a factor having CDK8/19 inhibitory activity, preferably a factor having CDK8/19 inhibitory activity and a growth factor.
  • the culture period is 2 to 10 days, preferably about 5 days. Culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the posterior foregut cells obtained in step 3 were incubated with 0.25% trypsin-EDTA solution.
  • the cells are treated and dispersed in the liquid by pipetting to obtain a cell dispersion, the resulting dispersion is centrifuged, the collected cells are resuspended in a small amount of new medium, and the cell suspension is Re-seeded in the new medium in step 4).
  • a basic medium used for culturing mammalian cells can be used.
  • growth factors serum substitutes, vitamins, antibiotics, etc. may be added to the medium as appropriate.
  • the various compounds or salts thereof mentioned above can be used, and the amount added to the medium is determined as appropriate depending on the compound or salt thereof used, but it is usually about 0.00001 ⁇ M. ⁇ 5 ⁇ M, preferably 0.00001 ⁇ M to 1 ⁇ M.
  • the concentration of the factor having CDK8/19 inhibitory activity in the medium is preferably a concentration that achieves 50% or more inhibitory activity against CDK8/19.
  • EGF EGF, KGF, and FGF10 are preferred, KGF and/or EGF are more preferred, and KGF and EGF are even more preferred.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M.
  • the concentration is about 5-2000 ng/mL (i.e., about 0.8-320 nM), preferably about 5-1000 ng/mL (i.e., about 0.8-160 nM), more preferably about 10-1000 ng/mL (i.e., about 0.8-160 nM). 1000 ng/mL (ie, approximately 1.6-160 nM).
  • the concentration is about 5-2000 ng/mL (ie, about 0.3-116 nM), preferably about 10-1000 ng/mL (ie, about 0.6-58 nM).
  • the concentrations are usually 5 to 150 ng/mL for EGF, preferably 30 to 100 ng/mL, particularly preferably about 50 ng/mL, and 10 to 200 ng/mL for KGF.
  • it is 50 to 150 ng/mL, particularly preferably about 100 ng/mL.
  • the first day of culturing in step 4) may be carried out in the presence of a ROCK inhibitor, and thereafter culturing may be carried out in a medium containing no ROCK inhibitor.
  • the medium may contain a protein kinase C (PKC) activator.
  • PKC protein kinase C
  • PDBu PKC activator II
  • TPB PKC activator V
  • the PKC activator is added at a concentration of about 0.1 to 100 ng/mL, preferably about 1 to 50 ng/mL, more preferably about 3 to 10 ng/mL.
  • dimethyl sulfoxide and/or activin (1 to 50 ng/mL) may be added to the medium.
  • a serum substitute eg, B-27 supplement, ITS-G
  • amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (product name) may be added to the medium.
  • antibiotics e.g. Antibiotic-Antimycotic, penicillin, streptomycin, or mixtures thereof
  • antibacterial agents For example, amphotericin B
  • antioxidants pyruvate, buffers, inorganic salts, etc.
  • concentration in the medium is usually 0.01 to 20% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight.
  • Culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • cell culture is performed by adhesive culture without using feeder cells.
  • culture containers such as dishes, flasks, microplates, and cell culture sheets such as OptiCell (product name) (Nunc) are used.
  • Culture vessels may be surface treated to improve adhesion (hydrophilicity) with cells, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin, Matrigel (e.g. BD Matrigel (Japan)). It is preferably coated with a cell adhesion substrate such as Becton Dickinson, Inc.) or vitronectin.
  • a culture vessel coated with type I collagen, Matrigel, fibronectin, vitronectin, poly-D-lysine, etc. is preferable, and a culture vessel coated with Matrigel or poly-D-lysine is more preferable.
  • the culture temperature is not particularly limited, but the culture is carried out at 30 to 40°C (for example, 37°C). Further, the carbon dioxide concentration in the culture container is, for example, about 5%.
  • the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) can be further purified using a known surface marker such as glycoprotein 2 (GP2).
  • GP2 glycoprotein 2
  • the above purification can be performed by a method known per se, for example, using beads on which anti-GP2 antibodies are immobilized.
  • Step 5) Differentiation into endocrine progenitor cells
  • the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) are further cultured in a medium containing growth factors to induce differentiation into endocrine progenitor cells.
  • Culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) are treated with a 0.25% trypsin-EDTA solution and dispersed in the solution by pipetting to obtain a cell dispersion, The resulting dispersion is centrifuged, the collected cells are resuspended in a small amount of new medium, and the cell suspension is re-inoculated into the new medium in step 5).
  • the culture period is 2 to 3 days, preferably about 2 days.
  • a basic medium used for culturing mammalian cells can be used. According to a previous report (Nature Biotechnology 2014; 32:1121-1133), SANT1, retinoic acid, ALK5 inhibitor II, T3, and LDN were added to the medium, and further Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, and FGF (preferably FGF2) were added. , serum substitutes, vitamins, antibiotics, etc. may be added as appropriate.
  • the culture is performed in a non-adhesive manner without using feeder cells. During culture, dishes, flasks, microplates, porous plates (Nunc), etc., or bioreactors are used.
  • the culture container is preferably surface-treated to reduce adhesion to cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, but the culture is carried out at 30 to 40°C (for example, 37°C). Further, the carbon dioxide concentration in the culture container is, for example, about 5%.
  • the endocrine progenitor cells obtained in step 5) can be further purified using a known surface marker such as glycoprotein 2 (GP2).
  • GP2 glycoprotein 2
  • the above purification can be performed by a method known per se, for example, using beads on which anti-GP2 antibodies are immobilized.
  • Step 6) Differentiation into iPIC
  • the endocrine progenitor cells obtained in step 5) are further cultured in a medium containing growth factors to induce differentiation into iPIC.
  • the culture period is 10 to 30 days, preferably about 10 to 20 days.
  • a basic medium used for culturing mammalian cells can be used.
  • the medium contained ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor XX, ⁇ -secretase inhibitor RO, N-cysteine, AXL inhibitor, and ascorbic acid according to a previous report (Nature Biotechnology 2014; 32:1121-1133).
  • Wnt inhibitors, ROCK inhibitors, FGF (preferably FGF2), serum substitutes, vitamins, antibiotics, etc. may be added as appropriate.
  • the medium may be supplemented with ALK5 inhibitor II, T3, LDN, the ⁇ -secretase inhibitor RO, and ascorbic acid, or T3, ALK5 inhibitor II, ZnSO 4 , heparin, N-acetylcysteine, Trolox, and R428 may also be added.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture. Culture does not use feeder cells. In the case of three-dimensional culture, non-adhesive culture is used. During culture, dishes, flasks, microplates, porous plates (Nunc), etc., or bioreactors are used.
  • the culture container is preferably surface-treated to reduce adhesion to cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, but the culture is carried out at 30 to 40°C (for example, 37°C). Further, the carbon dioxide concentration in the culture container is, for example, about 5%.
  • the fibrin gel sheet of the present invention is characterized by having a higher number of cells (higher density of cells) that could not be achieved with conventional fibrin gel sheets for cell transplantation . More than .5 ⁇ 10 6 , preferably 2 ⁇ 10 6 or more, more preferably 2.5 ⁇ 10 6 or more, even more preferably 3 ⁇ 10 6 or more, even more preferably 4.5 ⁇ 10 6 As mentioned above, it is particularly preferably contained in an amount of 5 x 10 6 or more, and the upper limit is not particularly limited, but it can be, for example, 10 x 10 6 or less, preferably 7 x 10 6 or less.
  • the fibrin gel sheet of the present invention includes cells 1. More than 5 ⁇ 10 6 to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 , preferably 2 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 , more preferably 2.5 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 , more preferably 3 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 , even more preferably 4.5 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 , particularly preferably in an amount appropriately selected from the range of 5 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 .
  • the above-mentioned iPIC usually exists in the form of cell clusters having a size of about 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, but the fibrin gel sheet of the present invention has more than 3,000 iPIC cells per cm 2 , preferably 4,000 iPICs per cm 2 . 20,000 or more, more preferably 5,000 or more, even more preferably 6,000, even more preferably 9,000, particularly preferably 10,000 or more, and the upper limit is not particularly limited, but for example, 20,000 or more, Preferably, the number can be 14,000 or less.
  • the range of the number of iPICs (cell clusters) contained in the fibrin gel sheet of the present invention can be expressed using two numerical values respectively selected from the lower limit and upper limit values.
  • the fibrin gel sheet of the present invention iPIC (cell clusters), more than 3,000 to 20,000 cells/cm 2 , preferably 4,000 to 20,000 cells/cm 2 , more preferably 5,000 to 20,000 cells/cm 2 , even more preferably 6,000 cells/cm 2 . It may be included in an amount appropriately selected from the range of from 9,000 to 20,000 pieces/cm 2 , more preferably from 9,000 to 20,000 pieces/cm 2 , particularly preferably from 10,000 to 20,000 pieces/cm 2 . can.
  • the fibrin gel is formed by allowing fibrinogen and thrombin to interact in a suitable solvent (eg, water, physiological saline, etc.).
  • a suitable solvent eg, water, physiological saline, etc.
  • the amounts of fibrinogen and thrombin used to form the fibrin gel and the method for mixing the two can be appropriately determined based on the method for producing a fibrin gel sheet of the present invention, which will be described in detail below.
  • the fibrin gel sheet of the present invention further includes a biodegradable material having a particulate form (hereinafter sometimes referred to as "biodegradable particles").
  • biodegradable particles a biodegradable material having a particulate form
  • biodegradable particles are added and suspended in a fibrinogen solution together with cells in the method for producing a fibrin gel sheet of the present invention, which is detailed below, and are dispersed in the solution to suppress cell precipitation. This allows cells to be dispersed and encapsulated in the fibrin gel sheet that is finally obtained.
  • the biodegradable material constituting the "biodegradable particles” may be any material that can be decomposed in vivo by hydrolysis, etc., and is not particularly limited, but examples include polylactic acid (PLA), Caprolactone (PCL), polyurethane (PU), polyethylene glycol (PEG), polyhydroxyethyl methacrylate, polyester, polyglycolic acid (PGA), polylactic acid-co-glycolic acid (PLGA), poly(3-hydroxybutyrate-co) -hydroxyvalerate) (PHBV), poly(ethylene-co-vinyl acetate) (PEVA) polyacrylamide, polyethylene oxide, polyethylene amine, polyhydroxybutyric acid, poly(N-vinylpyrrolidone), polyvinyl alcohol, polypropylene fumarate, poly Acrylic acid, poly-e-caprolactone, polymethacrylic acid, polyvinylidene difluoride (PVDF), pectic acid, hyaluronic acid, heparin sul
  • the biodegradable particles are made from a gel-like biodegradable material selected from the group consisting of gelatin, collagen, hyaluronic acid, carboxymethylcellulose, PLA, PGA, PLGA, etc., modified versions thereof, and combinations thereof. configured.
  • the form of the "biodegradable particles” may be any form that can suppress cell precipitation and maintain dispersion in the solution, such as block, bead, pellet, sheet, gel, etc. It can have any morphology and can be solid or porous.
  • the form of the "biodegradable particles” is preferably a three-dimensional shape, such as a sphere, a polyhedron such as a tetrahedron, a hexahedron, a cylinder, a prism, a cone, a truncated cone, a pyramid, a truncated pyramid, a torus, a disc, Examples include ellipsoids, modified solids thereof, etc., but are not limited thereto.
  • the size of the "biodegradable particles” may be any size that can suppress cell precipitation and maintain dispersion in the solution, and that does not hinder the formation of the fibrin gel sheet of the present invention, with an opening of 100 ⁇ m or more.
  • the size may be such that it can pass through 1000 ⁇ m, preferably 100 ⁇ m to 800 ⁇ m, more preferably 150 ⁇ m to 400 ⁇ m, and still more preferably 200 ⁇ m.
  • the biodegradable particles are gelatin gel and have a spherical shape that can pass through an opening of 200 ⁇ m.
  • the amount of biodegradable particles contained in the fibrin gel sheet of the present invention may be any amount that can suppress cell precipitation and maintain dispersion in the fibrinogen solution and does not hinder the formation of the fibrin gel sheet of the present invention.
  • the amount of biodegradable particles in the fibrinogen solution is 10 to 30 w/v%, preferably 15 to 25 w/v%, more preferably 18 to 22 w/v%, and even more preferably 20 w/v%. can be included.
  • the biodegradable particles may maintain their form and shape, or may be partially or entirely integrated with the fibrin gel.
  • the fibrin gel sheet of the present invention further includes a biodegradable gelling agent.
  • the "biodegradable gelling agent” is added to and dissolved in a fibrinogen solution together with cells, imparts viscosity to the solution, and This suppresses precipitation of cells in solution and enables maintenance of dispersion, thereby allowing cells to be dispersed and encapsulated in the fibrin gel sheet finally obtained.
  • the "biodegradable gelling agent” is a substance that can be decomposed in vivo by hydrolysis, etc., and is also capable of imparting a viscosity to the solution that can suppress cell precipitation and maintain dispersion.
  • the material is not particularly limited as long as it does not interfere with the formation of the fibrin gel sheet of the present invention, and for example, the above-mentioned biodegradable materials can be used (excluding fibrin).
  • the biodegradable gelling agent includes collagen, hyaluronic acid, heparin sulfate, chondroitin sulfate, heparan sulfate proteoglycan, carboxymethyl cellulose, alginic acid, cellulose, silk fibroin, keratin, gelatin, dextran, PEG, etc., and modified products thereof, Biodegradable materials selected from the group consisting of: and combinations thereof can be used.
  • the amount of the biodegradable gelling agent contained in the fibrin gel sheet of the present invention is an amount that can suppress cell precipitation and maintain dispersion in the fibrinogen solution, and that does not interfere with the formation of the fibrin gel sheet of the present invention.
  • the amount of the biodegradable gelling agent in the fibrinogen solution is 0.2 to 2 w/v%, preferably 0.4 to 1.5 w/v%, more preferably 0.5 to 1 w/v%. v %, more preferably 0.75 w/v %.
  • the fibrin gel sheet of the present invention can further include a support.
  • the support supports the fibrin gel sheet of the present invention during production and/or use, and can contribute to improving the operability of the fibrin gel sheet.
  • the support may be made of the aforementioned biodegradable materials or non-biodegradable materials, such as polyester (PEs), polypropylene (PP), polyethylene (PE), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene terephthalate (PET), nylon, It is made of silk (not limited thereto) and has any shape (eg, sheet, mesh, plate, woven fabric, nonwoven fabric, etc.) capable of supporting the fibrin gel sheet of the present invention.
  • the support may be adhered to the surface of the fibrin gel sheet of the present invention, or a part or the entire support may be fixed in the fibrin gel sheet of the present invention.
  • the fibrin gel sheet of the present invention includes a mesh-like support made of polyester or polylactic acid-co-glycolic acid.
  • the fibrin gel sheet of the present invention may be provided in the form of a laminate in which a plurality of fibrin gel sheets are stacked.
  • the laminate may be one in which each fibrin gel sheet contains the same cells, or may be a combination of fibrin gel sheets in which some or all of the sheets contain different cells.
  • the present invention also relates to a method for producing a fibrin gel sheet of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the "method of the present invention"), and the method is a method in which cells are suspended.
  • the fibrinogen solution is reacted with thrombin to form and gel (solidify) it into a sheet having a surface area of 2.25 cm 2 or more and a thickness of 1 mm or less.
  • Fibrin gel can be obtained by combining fibrinogen and thrombin in an appropriate solvent (eg, water, physiological saline, etc.) and gelling (solidifying) the mixture.
  • Cells are uniformly dispersed and suspended in the fibrinogen solution, and the amount of cells can be determined based on the fibrin gel sheet after being molded, that is, 1.5 x 10 6 per cm 2 of fibrin gel sheet. More than 2 x 10 6 pieces, preferably 2 x 10 6 or more, more preferably 2.5 x 10 6 or more, even more preferably 3 x 10 6 or more, even more preferably 4.5 x 10 6 or more, particularly preferably Although the upper limit is not particularly limited, it can be suspended in an amount of 5 x 10 6 or more, for example, 10 x 10 6 or less, preferably 7 x 10 6 or less.
  • the range of the number of cells suspended in the fibrinogen solution can be expressed using two numbers selected from the lower limit and upper limit, respectively.
  • More than ⁇ 10 6 to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 preferably 2 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less /cm 2 , more preferably 2.5 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 , more preferably 3 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 , even more preferably 4.5 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 , Particularly preferably, they can be suspended in an amount appropriately selected from the range of 5 ⁇ 10 6 or more to 10 ⁇ 10 6 or less/cm 2 .
  • the fibrinogen solution when the cells are iPICs, contains iPICs in a cell mass of more than 3,000, preferably 4,000 or more, more preferably more than 4,000 per cm 2 of fibrin gel sheet.
  • the amount is 5,000 or more, more preferably 6,000 or more, even more preferably 9,000 or more, particularly preferably 10,000 or more, and the upper limit is not particularly limited, but for example, 20,000 or less, preferably 14,000 or less. It can be suspended in an amount that becomes .
  • the range of the number of iPIC (cell clusters) suspended in the fibrinogen solution can be expressed using two numbers selected from the lower limit and upper limit, respectively.
  • more than 3000 to less than 20000 pieces/cm 2 preferably more than 4000 to less than 20000 pieces/cm 2 , more preferably more than 5000 to less than 20000 pieces/cm 2 , even more preferably more than 6000 pieces/cm 2 Suspended in an amount appropriately selected from the range of ⁇ 20,000 cells/cm 2 , more preferably 9,000 to 20,000 cells/cm 2 , particularly preferably 10,000 to 20,000 cells/cm 2 . be able to.
  • the surface area of one side of the sheet is 2.25 cm 2 or more, preferably 4 cm 2 or more, more preferably 9 cm 2 or more, more preferably 16 cm 2 or more, even more preferably 25 cm 2 or more, especially preferably 36 cm 2 or more, especially more preferably 49 cm 2 or more, even more preferably 64 cm 2 or more, even more preferably 81 cm 2 or more,
  • the size is 100 cm 2 or more, and the upper limit is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the size and shape of the transplant site, but the size can be, for example, 400 cm 2 or less.
  • the range of the surface area of the fibrin gel sheet obtained by molding can be expressed using two values selected from the lower limit and upper limit, for example, the surface area of the fibrin gel sheet obtained by molding is 2.25 cm. 2 or more and 400 cm 2 or less, preferably 4 cm 2 or more and 400 cm 2 or less, more preferably 9 cm 2 or more and 400 cm 2 or less, even more preferably 16 cm 2 or more and 400 cm 2 or less , even more preferably 25 cm 2 or more and 400 cm 2 or less.
  • the size can be appropriately selected from the range of 100 cm 2 or more to 400 cm 2 or less.
  • the shape of the above-mentioned one side of the fibrin gel sheet obtained by molding is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the size and shape of the implantation site. Examples include, but are not limited to, polygons with rounded corners, circles, ellipses, etc. (squares, octagons, etc.).
  • the vertical length is 15 mm or more, preferably 20 mm or more, more preferably 30 mm or more, even more preferably 40 mm or more, even more preferably 50 mm or more, particularly preferably 60 mm or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but can be, for example, 200 mm or less
  • the horizontal length is 15 mm or more, preferably 20 mm or more, more preferably 30 mm or more, even more preferably 40 mm or more, even more preferably 50 mm or more, especially preferably 60 mm or more, especially more preferably 70 mm or more, even more preferably
  • the length is 80 mm or more, particularly preferably 90 mm or more, particularly preferably 100 mm or more, and the upper limit thereof is not particularly limited, but may be, for example, 200 mm or less.
  • the range of the vertical length and horizontal length can be expressed using two numerical values respectively selected from the lower limit and upper limit.
  • the size of the fibrin gel sheet obtained by molding is (vertical length).
  • Length x horizontal length horizontal length x vertical length may be used
  • 15 mm or more and 200 mm or less x 15 mm or more and 200 mm or less preferably 20 mm or more and 200 mm or less x 20 mm or more and 200 mm or less , more preferably 30 mm or more and 200 mm or less x 30 mm or more and 200 mm or less, still more preferably 40 mm or more and 200 mm or less x 40 mm or more and 200 mm or less, even more preferably 50 mm or more and 200 mm or less x 50 mm or more and 200 mm or less, particularly preferably 60 mm or more and 200 mm or less x 60 mm or more and 200 mm or less, especially more preferably 70 mm or more and 200 mm or less x 70 mm or more and
  • the size of the fibrin gel sheet obtained by molding is 15 mm or more x 15 mm or more, preferably 20 mm x 20 mm, 20 mm x 30 mm, or 30 mm x 30 mm, more preferably 40 mm x 40 mm, 40 mm x 50 mm, 50 mm x 50 mm, 40 mm x 60 mm, or 60 mm x 60 mm, even more preferably 70 mm x 70 mm, 80 mm x 80 mm, 90 mm x 90 mm, Examples include 100 mm x 100 mm, 200 mm x 200 mm, etc., but the size is not limited to these.
  • the thickness of the fibrin gel sheet obtained by molding can be appropriately set depending on factors such as the size and amount of the encapsulated cells and the size of the transplant site, but is preferably 1 mm or less. Since the thickness of the fibrin gel sheet obtained by molding is 1 mm or less, nutrients and oxygen can be efficiently supplied to the cells contained in the fibrin gel sheet, and the fibrin gel can be rapidly decomposed after transplantation. can be achieved and is preferable.
  • the thickness of the fibrin gel sheet obtained by molding can be, for example, 1 mm or less, 900 ⁇ m or less, 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, or 400 ⁇ m or less, and the lower limit is not particularly limited, but for example, 100 ⁇ m or more, It can be 200 ⁇ m or more, or 300 ⁇ m or more. Further, the range of the thickness of the fibrin gel sheet obtained by molding can be expressed using two values selected from the upper and lower limits, for example, the thickness of the fibrin gel sheet obtained by molding is 100 ⁇ m or more.
  • the thickness can be 1 mm or less, 100 ⁇ m to 800 ⁇ m or less, 200 ⁇ m to 600 ⁇ m or less, or 300 ⁇ m or more to 400 ⁇ m or less, and the thickness can be appropriately selected from these ranges.
  • the thickness of the fibrin gel sheet obtained by molding can be about 400 ⁇ m. Note that the thickness of the fibrin gel sheet obtained by molding does not need to be uniform throughout the sheet, and even the thickest part may be within the above range.
  • the gelation (solidification) rate of the fibrin gel to be formed is adjusted by adjusting the blending amount of fibrinogen and thrombin and/or the temperature during molding, and the fibrin gel having a desired size is adjusted. This allows it to be spread and molded into a gel sheet.
  • the fibrinogen solution contains fibrinogen in an amount of 5 to 150 mg/mL, preferably 10 to 80 mg/mL, more preferably 20 mg/mL, and thrombin is 0.4 U or less, preferably 0.0 U per 1 mg of fibrinogen. It is 3U or less or 0.25U or less, more preferably 0.2U or less or 0.15U or less, even more preferably 0.1U or less or 0.08U or less, and the lower limit is not particularly limited, but the blending ratio is 0.04U or more. Act in an amount that becomes .
  • thrombin can act on fibrinogen in any form, and may be added directly to the fibrinogen solution, or after being dissolved in an appropriate solvent (e.g., water, physiological saline, etc.) to form a thrombin solution, May be mixed with fibrinogen solution.
  • an appropriate solvent e.g., water, physiological saline, etc.
  • any means can be used to mold the fibrinogen solution reacted with thrombin into a sheet having a desired size and thickness.
  • any molding means conventionally known in the field of manufacturing polymer sheets (e.g. , molding, extrusion molding, calendar molding, inflation molding, etc.), and is preferably carried out by molding.
  • the fibrinogen solution can be easily injected into a sheet mold and spread and molded using a spatula, trowel, etc. as necessary.
  • the fibrinogen solution reacted with thrombin is shaped under cooling.
  • the cooling temperature may be any temperature that allows the fibrin gel solution to be molded into a sheet having a desired size and thickness, and is not particularly limited, for example, 2 to 8°C, preferably 2 to 6°C. °C, more preferably 4°C. Cooling may be performed as long as the fibrin gel solution can be cooled, and the fibrin gel solution may be cooled, or the molding means (for example, a mold, etc.) in contact with the fibrin gel solution may be cooled.
  • the above-mentioned support may be integrated with the fibrin gel sheet before the molded fibrin gel solution gels (solidifies).
  • the support may be adhered to the surface of the fibrin gel solution, or part or all of it may be immersed in the fibrin gel solution. By gelling (solidifying) this, it is possible to obtain a fibrin gel sheet that is integrally provided with the support.
  • biodegradable particles are further added and suspended in the fibrinogen solution in which cells are suspended, or a “biodegradable gelling agent” is added and dissolved.
  • a biodegradable gelling agent is added and dissolved.
  • biodegradable particles can be used, and can suppress cell precipitation and maintain dispersion in a fibrinogen solution in which cells are suspended, and can be used in the fibrin gel sheet of the present invention.
  • Biodegradable particles can be added and suspended in an amount that does not interfere with cell formation; for example, biodegradable particles can be added to a fibrinogen solution in which cells are suspended in an amount of 10 to 30 w/v%, preferably 15 to 25 w/v%, more preferably It is added and suspended in an amount of 18 to 22 w/v%, more preferably 20 w/v%.
  • the biodegradable particles are gelatin gel particles, have a spherical shape that can pass through an opening of 200 ⁇ m, and are added in an amount of 20 w/v % to a fibrinogen solution in which cells are suspended; suspend
  • the "biodegradable gelling agent” can be one defined above, which can suppress cell precipitation and maintain dispersion in the fibrinogen solution in which the cells are suspended, and which can be used for the fibrin of the present invention.
  • the biodegradable gelling agent can be added and dissolved in an amount that does not interfere with the formation of a gel sheet, for example, 0.2 to 2 w/v%, preferably 0.4 to 1%, of a biodegradable gelling agent is added to a fibrinogen solution in which cells are suspended. It is added and dissolved in an amount of .5 w/v%, more preferably 0.5 to 1 w/v%, even more preferably 0.75 w/v%.
  • the biodegradable gelling agent is collagen, which is added and dissolved in an amount of 0.75 w/v % to the fibrinogen solution in which the cells are suspended.
  • the fibrinogen solution contains fibrinogen in an amount of 5 to 150 mg/mL, preferably 20 to 100 mg/mL, more preferably 80 mg/mL.
  • Thrombin may be used in an amount sufficient to gel (solidify) the fibrinogen solution, for example, 0.5 to 5 U, preferably 1 to 4 U, more preferably 1.5 to 3 U per mg of fibrinogen. It is applied in an amount of .5U.
  • Thrombin can be made to act on fibrinogen in any form, and can be added directly to a fibrinogen solution by dissolving it in an appropriate solvent (e.g., water, physiological saline, etc.) to make a thrombin solution, and then adding it to the fibrinogen solution.
  • an appropriate solvent e.g., water, physiological saline, etc.
  • the effect can be exerted by adding thrombin, by including thrombin in the "substrate” described in detail below, or by a combination of a plurality of them. If the substrate contains thrombin, the fibrinogen and thrombin can be combined by applying a fibrinogen solution to the substrate.
  • any means can be used to form the fibrinogen solution in which cells are suspended into a sheet having a desired size and thickness, such as coating the fibrin gel solution on an appropriate base material, It can be carried out by one or a combination of any forming means conventionally known in the sheet manufacturing field (for example, mold forming, extrusion molding, calendar molding, inflation molding, etc.), and preferably by molding onto a suitable base material. It is done by coating.
  • any forming means conventionally known in the sheet manufacturing field (for example, mold forming, extrusion molding, calendar molding, inflation molding, etc.), and preferably by molding onto a suitable base material. It is done by coating.
  • it is possible to maintain uniform dispersion of suspended cells, and the fibrinogen solution in which cells are suspended can be injected not only at once but also continuously ( Even when the injection process takes a long time from the start to the end of the injection, it is possible to easily form the cell into a sheet in which the cells are uniformly dispersed.
  • the "base material” may be anything that has a flat surface that allows a sheet to be formed on its surface, and is not particularly limited, but it is preferable to use the above-mentioned support as the base material. can.
  • the fibrinogen solution in which cells are suspended can be applied to the substrate by any means, for example, by injection, by using one or more of a spatula, a trowel, a spray, a bioprinter (2D or 3D printer), etc. can be performed manually and/or mechanically, preferably mechanically using a bioprinter.
  • the fibrin gel sheet of the present invention produced by the method of the present invention can be used in a cell culture medium such as, but not limited to, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), RPMI1640 medium, MEM medium, CMRL medium, etc. or a buffer, such as Stored in an isotonic solution such as, but not limited to, phosphate buffered saline (PBS), Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), etc., such as, but not limited to, physiological saline until use. I can do it.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • RPMI1640 medium MEM medium
  • CMRL medium CMRL medium
  • a buffer such as Stored in an isotonic solution such as, but not limited to, phosphate buffered saline (PBS), Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), etc., such as, but not limited to, physiological saline until use. I can do it.
  • the fibrin gel sheet of the present invention can be used depending on the above-mentioned cells to be dispersed and encapsulated, such as epidermis, nerves, brain, spinal cord, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, bladder, urethra, lung, etc.
  • Cells that have the same or similar functions as cells constituting organs and tissues such as (but not limited to) the thyroid, pancreas, liver, muscle, skeleton, heart, blood vessels, spleen, kidney, blood, etc., and their progenitor cells. It can be used in cell therapy methods to enhance or maintain the functions of organs and tissues, or to supplement or supplement the functions of those organs and tissues that have been reduced or lost due to diseases, disorders, etc. used for transplantation into patients in need.
  • the fibrin gel sheet of the present invention when the fibrin gel sheet of the present invention contains iPIC derived from pluripotent stem cells, the fibrin gel sheet of the present invention can reduce the blood sugar level (glucose) in the transplanted patient by the action of insulin and glucagon secreted by the iPIC. ) levels can be improved and/or maintained, and blood sugar levels can be controlled to normal values. Accordingly, the fibrin gel sheets of the present invention containing iPICs can be used to treat or prevent diseases, disorders, or conditions in which it is necessary to improve and/or maintain blood sugar levels.
  • the fibrin gel sheets of the present invention containing iPICs can be used to treat or prevent diseases, disorders, or conditions in which it is necessary to improve and/or maintain blood sugar levels.
  • Such diseases, disorders, or conditions include diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes), altered fasting and postprandial glucose levels, and hypoglycemia (e.g., hypoglycemia due to insulin administration in diabetic patients). These include, but are not limited to.
  • treatment means treatment, cure, prevention, or improvement of remission of a disease, disorder, or symptom, or reduction of the rate of progression of a disease, disorder, or symptom.
  • prevention means reducing the possibility or risk of developing a disease, disorder, or symptom, or delaying the onset of a disease, disorder, or symptom.
  • the fibrin gel sheet of the present invention is transplanted to patients who require it for cell therapy, such as mammals such as mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys, and humans. (but not limited to), preferably large mammals, and particularly preferably humans.
  • the fibrin gel sheet of the present invention When the fibrin gel sheet of the present invention is implanted, the fibrin gel is rapidly decomposed, and the encapsulated cells can quickly come into contact with the host tissue and receive oxygen, nutrients, etc. Therefore, the fibrin gel sheet of the present invention can be transplanted into tissues with poor blood vessels (for example, subcutaneously), and prior angiogenesis treatment may not be necessary or necessary upon transplantation.
  • the fibrin gel sheet of the present invention allows one or more sheets to be transplanted depending on the patient's symptoms and the size of the transplant site, and since the fibrin gel sheet of the present invention is thin, Depending on the situation, a plurality of sheets may be stacked and transplanted.
  • iPIC iPIC is produced using human iPS cells (Ff-I14-s04) according to the above steps 1)-6) and previously reported (Stem Cell Research (2015) 14, 185-197; Nature Biotechnology 2014; 32:1121-1133). It was prepared by inducing differentiation from a strain.
  • pancreatic progenitor cells prepared by inducing differentiation from human iPS cells were mixed with differentiation factors (SANT1, retinoic acid, T3, LDN, Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, FGF2) in a differentiation induction medium containing ALK5iII (10 ⁇ M) ( The cells were cultured for 2 days in Improved MEM/1% B-27/Penisilin Streptomycin medium) to induce differentiation into endocrine progenitor cells.
  • differentiation factors SANT1, retinoic acid, T3, LDN, Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, FGF2
  • a differentiation induction medium Improved MEM/1% B-27/Penisilin Streptomycin medium
  • ALK5iII (10 ⁇ M) was used together with differentiation factors (T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, FGF receptor 1 inhibitor PD-166866).
  • differentiation induction containing ALK5iII (10 ⁇ M) along with T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, N-acetylcysteine, AXL inhibitor R428, ascorbic acid, ROCK inhibitor, ZnSO 4 , heparin, and Trolox was performed.
  • the cells were cultured for 4 days in a medium (MCDB131/20mM Glucose/NaHCO 3 /FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/Penisilin Streptomycin medium) to induce differentiation into iPIC.
  • a medium MCDB131/20mM Glucose/NaHCO 3 /FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/Penisilin Streptomycin medium
  • the obtained iPIC had the form of an aggregate (spheroid) (about 150 ⁇ m in diameter) in which about 500 cells aggregated.
  • a fibrin gel mass containing iPIC and a fibrin gel sheet containing iPIC were subcutaneously implanted into nude rats under anesthesia. After transplantation, blood was collected from the tail vein, plasma was collected, and human c-peptide concentration was measured by ELISA.
  • Figure 1 shows the appearance of the fibrin gel mass and fibrin gel sheet. In all cases, iPIC was retained within the gel, and no cell leakage was observed.
  • Figure 2 shows the results of measuring the blood human c-peptide concentration over time in nude rats in which a fibrin gel mass containing iPIC or a fibrin gel sheet containing iPIC was subcutaneously implanted
  • Figure 3 shows the results 10 days after implantation. The results of histological analysis of each transplanted site after 6 weeks are shown.
  • Example 2 Production of large animal/human size fibrin gel sheet (manufacturing method 1_method using a cooled metal mold) ⁇ Method> ⁇ Evaluation of gelation time
  • fibrinogen solution 40 mg/mL
  • thrombin solution 31 U/mL, 15.6 U/mL, 10.4 U/mL, 5.2 U/mL, 3.1 U/mL
  • Example 3 Production of large animal/human size fibrin gel sheet (manufacturing method 2-1_fibrin + gelatin microsphere gel sheet) ⁇ Method> ⁇ Confirmation of maintenance of cell dispersion Dissolve gelatin to 2w/v% using physiological saline, cool in a refrigerator at 4°C to gel, and then pass the gelatin gel through a mesh with an opening of 200 ⁇ m. As a result, gelatin gel microspheres (hereinafter referred to as "gelatin microspheres”) of about 200 ⁇ m were produced. Gelatin microspheres were suspended in a fibrinogen solution (40 mg/mL) to a concentration of 20 w/v% to prepare a fibrinogen+gelatin microsphere solution.
  • a fibrinogen solution 40 mg/mL
  • the fibrin gel sheet containing the iPIC described in Example 1 and the fibrin+gelatin microsphere gel sheet containing the above iPIC were implanted subcutaneously into nude rats under anesthesia. After transplantation, blood was collected from the tail vein, plasma was collected, and human c-peptide concentration was measured by ELISA.
  • Polyester mesh (69% open area, size 40x60 mm) impregnated with 300 ⁇ L of thrombin solution (62.5 U/mL) and glycolic acid/lactic acid polyester (90/10, poly(glycolide-co-L-lactide), size
  • 300 ⁇ L of thrombin solution (62.5 U/mL) and glycolic acid/lactic acid polyester (90/10, poly(glycolide-co-L-lactide), size
  • 600 ⁇ L of thrombin solution was applied to the entire surface and left to stand for 5 minutes to gel.
  • a thin layer of encapsulated fibrin + gelatin microsphere gel sheet was prepared.
  • FIG. 6 shows the state of iPIC suspended in a fibrinogen solution and a fibrinogen+gelatin microsphere solution and left standing.
  • fibrinogen solution FIG. 6(A)
  • precipitation of iPIC was observed after 10 minutes of standing (arrowhead).
  • fibrinogen + gelatin microsphere solution FIG. 6(B)
  • iPIC remained dispersed even after 30 minutes of standing.
  • the iPIC was retained within the gel sheet, and no cell leakage was observed.
  • FIG. 7 shows the results of measuring the blood human c-peptide concentration over time in nude rats in which a fibrin gel sheet containing iPIC or a fibrin + gelatin microsphere gel sheet containing iPIC was subcutaneously implanted. There was no significant difference in the amount of human c-peptide in the blood between the fibrin gel sheet and the fibrin + gelatin microsphere gel sheet, and even the use of gelatin microspheres in the sheet had a negative effect on the secretion of human c-peptide by iPIC. It was shown that there is no.
  • Figure 8 shows a fibrin + gelatin microsphere gel sheet containing large animal/human-sized iPICs, which was produced by manual pipette injection and using a 3D printer. With either method, it was possible to produce the fibrin + gelatin microsphere gel sheet of large animal/human size, iPIC was retained within the gel, and no cell leakage was observed (FIG. 8(A)).
  • Example 4 Preparation of large animal/human size fibrin gel sheet (manufacturing method 2-2_fibrin + collagen gel sheet) ⁇ Method> - Confirmation of maintenance of cell dispersibility Fibrinogen solution (80 mg/mL) and collagen solution (3 w/v %) were mixed at a ratio of 3:1 to prepare a fibrinogen + collagen solution.
  • iPIC was suspended in a fibrinogen+collagen solution and then filled into a syringe. The syringe is held vertically with the tip facing down, and after 0, 10, 20, and 30 minutes of standing, a certain amount of the ejected liquid is collected and the number of cells (concentration) is measured. The dispersibility retention function was evaluated.
  • Fibrinogen solution 80 mg/mL
  • collagen solution 3 w/v%
  • iPIC cells were collected into a 1.5 mL tube and centrifuged, the medium supernatant was removed, and 25 ⁇ L of fibrinogen+collagen solution was added and suspended.
  • 25 ⁇ L of thrombin solution was applied to the entire surface and allowed to stand for 5 minutes to gel, thereby producing a thin layer of fibrin+collagen gel sheet containing iPIC.
  • a fibrin + gelatin microsphere gel sheet containing iPIC as described in Example 3 "in vivo test" and a fibrin + collagen gel sheet containing iPIC described above were implanted subcutaneously into a nude rat under anesthesia. After transplantation, blood was collected from the tail vein, plasma was collected, and human c-peptide concentration was measured by ELISA.
  • iPIC 75x10 6 cells were fractionated into a 15 mL tube and centrifuged, the medium supernatant was removed, and 600 ⁇ L of fibrinogen + collagen solution was added and suspended.
  • a fibrinogen + collagen solution in which iPIC was suspended was thinly applied onto a poly(glycolide-co-L-lactide) (size 40 x 60 mm) mesh impregnated with 300 ⁇ L of thrombin solution (125 U/mL) using a 3D printer.
  • 600 ⁇ L of thrombin solution was applied to the entire surface and allowed to stand for 5 minutes to gel, thereby producing a thin layer of fibrin+collagen gel sheet containing iPIC.
  • FIG. 9 shows the measurement results of the number of cells (concentration) in the fibrinogen+collagen solution discharged from the syringe.
  • the cell concentration in the ejected liquid was almost constant regardless of the standing time, indicating that iPIC did not precipitate even though the syringe was held vertically, and a constant number of cells were ejected. . Therefore, it was shown that the dispersed state of cells could be maintained by using the fibrinogen + collagen solution.
  • the iPIC was retained within the gel sheet, and no cell leakage was observed.
  • Figure 10 shows the results of measuring the blood human c-peptide concentration over time in nude rats in which a fibrin + gelatin microsphere gel sheet containing iPIC or a fibrin + collagen gel sheet containing iPIC was subcutaneously implanted. No significant difference was observed in the amount of human c-peptide in blood between the fibrin+gelatin microsphere gel sheet and the fibrin+collagen gel sheet, indicating that both had equivalent performance.

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Abstract

本発明は、従来なかったより大きなサイズを有すると同時に、細胞が均一に分散され内包されてなる細胞移植用のフィブリンゲルシートならびにその製造方法を提供することを目的とするものであり、細胞がフィブリンゲルシートに均一に分散され内包されてなり、一面の表面積が２．２５ｃｍ2以上のサイズを有し、１ｍｍ以下の厚さを有する、細胞移植用のフィブリンゲルシートならびにその製造方法を提供する。

Description

細胞移植用のフィブリンゲルシート
　本発明は、細胞がフィブリンゲルシートに均一に分散され内包されてなり、かつこれまでになかった大きなサイズを有する細胞移植用のフィブリンゲルシート、ならびにその製造方法に関する。
　［発明の背景］
　人工多能性細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞から誘導される機能性分化細胞は、移植再生医療の細胞供給源として期待されている。今日では、そのような機能性分化細胞が生分解性ゲル中に内包されてなる各種構造体が開発され、それを利用した細胞移植治療の研究が進められている。
　例えば、非特許文献１には、フィブリンゲルに内包された膵島細胞を、７ｍｍ×７ｍｍの大きさのバイクリル（登録商標）メッシュで挟んで形成されたシート状構造体が開示され、当該構造体をレシピエントとなる糖尿病モデルラットの予め血管新生処置が施された部位へ移植したことが記載されている。
　非特許文献２には、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含むハイドロゲルに内包された膵島細胞を、２０ｍｍ×１５ｍｍの大きさのポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）メッシュで挟んで形成されたシート状構造体が開示され、当該構造体をレシピエントとなる糖尿病モデルラットへ移植したことが記載されている。
　特許文献１には、ＰＶＡを含むハイドロゲルに内包された膵島細胞を、直径１５ｍｍの円形型ＰＥＴメッシュで挟んで形成されたシート状構造体が開示され、当該構造体をレシピエントとなる糖尿病モデルマウスへ移植したことが記載されている。
ＷＯ２０１８／１５５６２２
Ｈｉｒｏｔａｋｅ　Ｋｏｍａｔｓｕら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　２０２０；３３：８０６－８１８． Ｍｅｉｒｉｇｅｎｇ　Ｑｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００４　Ｄｅｃ；２５（２７）：５８８５－９２．
　一方、従来報告されている機能性分化細胞が生分解性ゲル中に内包されてなるシート状構造体は、糖尿病モデル動物（ラットやマウス）への移植を目的としたものであり、そのサイズはヒト等の大型の哺乳動物を対象とした場合には十分なサイズとはいえない場合があり、また搭載される細胞数も十分な量とはいえない場合があった。そのため、当該分野においてはヒト等においても利用可能なより大きなサイズを有し、かつより多くの細胞を含む前記構造体の開発が切望されていた。
　当該課題を解決すべく、本発明者らはフィブリンゲルを用いてより大きなサイズを有する前記構造体の作製を試みたところ、より大きなサイズを作製するために調製されたより大量のフィブリンゲルは、所望のサイズまで広げてシート状に成型しようとした場合、十分に広げる前にゲル化（固化）し、目的とするサイズに成型することは困難であることを見出した。また、当該大量のフィブリンゲルを連続的に注入しながら所望のサイズを有するシート状に成型しようとした場合、溶液中の細胞が沈殿を生じ、連続的注入のはじまりから終わりにかけて細胞の含有量が徐々に減少し、結果的に細胞密度が均一でない前記構造体しか作製できないことが明らかとなった。細胞密度の不均一性は、治療効率の低下や、移植された細胞の長期の生着に影響を及ぼす虞があり、好ましくない。
　そこで本発明は、本発明者らが見出したこれらの課題を解決することを目的とするものであり、従来なかったより大きなサイズを有すると同時に、より多くの細胞が均一に分散され内包されてなるシート状のフィブリンゲル構造体（すなわち、フィブリンゲルシート）を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、フィブリンゲルの形成において、フィブリノーゲンとトロンビンの配合量及び／又はゲル化（固化）時の温度を調整することによって、形成されるフィブリンゲルのゲル化（固化）速度を調整することができ、所望のより大きなサイズを有するフィブリンゲルシートへと広げて成形できることを見出した。
　また、フィブリンゲルの形成において、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液に生分解性粒子を添加、懸濁することによって、または、生分解性ゲル化剤を添加、溶解することによって、当該フィブリノーゲン溶液中にて細胞が沈殿するのを抑制して、細胞が均一に分散して懸濁された状態を維持することができ、これをゲル化（固化）させることにより、連続的注入による成形においても、細胞密度が均一なフィブリンゲルシートが得られることを見出した。
　本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］　細胞がフィブリンゲルシートに均一に分散され内包されてなり、一面の表面積が２．２５ｃｍ2以上のサイズを有し、１ｍｍ以下の厚さを有する、細胞移植用のフィブリンゲルシート。
［２］　細胞が１．５×１０6個超／ｃｍ2の量で内包される、［１］のフィブリンゲルシート。
［３］　細胞がスフェロイドの形態である、［１］又は［２］のフィブリンゲルシート。
［４］　細胞がｉＰＳ細胞由来膵島細胞である、［１］～［３］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［５］　さらに、生分解性ゲル化剤を含む、［１］～［４］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［６］　生分解性ゲル化剤を０．２～２ｗ／ｖ％の量で含む、［５］のフィブリンゲルシート。
［７］　生分解性ゲル化剤がコラーゲンである、［５］又は［６］のフィブリンゲルシート。
［８］　さらに、生分解性粒子を内包する、［１］～［４］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［９］　生分解性粒子が目開き１００μｍ～１０００μｍを通過できるサイズである、［８］のフィブリンゲルシート。
［１０］　生分解性粒子を１０～３０ｗ／ｖ％の量で含む、［８］又は［９］のフィブリンゲルシート。
［１１］　生分解性粒子がゼラチンゲル粒子である、［８］～［１０］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［１２］　支持体をさらに備える、［１］～［１１］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［１３］　細胞がフィブリンゲルシートに均一に分散され内包されてなり、一面の表面積が２．２５ｃｍ2以上のサイズを有し、１ｍｍ以下の厚さを有する、細胞移植用のフィブリンゲルシートの製造方法であって、
　細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液をトロンビンと作用させて、一面の表面積が２．２５ｃｍ2以上のサイズを有し、１ｍｍ以下の厚さを有するシート状に成型してゲル化させる工程、
を含む、製造方法。
［１４］　細胞が、フィブリンゲルシートにおいて１．５×１０6個超／ｃｍ2となる量にて、フィブリノーゲン溶液に懸濁される、［１３］の製造方法。
［１５］　細胞がスフェロイドの形態である、［１３］又は［１４］の製造方法。
［１６］　細胞がｉＰＳ細胞由来膵島細胞である、［１３］～［１５］のいずれかの製造方法。
［１７］　細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液がさらに、生分解性ゲル化剤を含む、［１３］～［１６］のいずれかの製造方法。
［１８］　細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液が、生分解性ゲル化剤を０．２～２ｗ／ｖ％の量で含む、［１７］の製造方法。
［１９］　生分解性ゲル化剤がコラーゲンである、［１７］又は［１８］の製造方法。
［２０］　支持体上に塗布することによりシート状に成型する、［１７］～［１９］のいずれかの製造方法。
［２１］　バイオプリントにより支持体上に塗布する、［２０］の製造方法。
［２２］　支持体がトロンビンを含む、［２０］又は［２１］の製造方法。
［２３］　細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液がさらに、生分解性粒子を含む、［１３］～［１６］のいずれかの製造方法。
［２４］　生分解性粒子が目開き１００μｍ～１０００μｍを通過できるサイズである、［２３］の製造方法。
［２５］　細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液が、生分解性粒子を１０～３０ｗ／ｖ％の量で含む、［２３］又は［２４］の製造方法。
［２６］　生分解性粒子がゼラチンゲル粒子である、［２３］～［２５］のいずれかの製造方法。
［２７］　支持体上に塗布することによりシート状に成型する、［２３］～［２６］のいずれかの製造方法。
［２８］　バイオプリントにより支持体上に塗布する、［２７］の製造方法。
［２９］　支持体がトロンビンを含む、［２７］又は［２８］の製造方法。
［３０］　トロンビンを、フィブリノーゲン１ｍｇに対して０．４Ｕ以下の配合比となる量にて作用させる、［１３］～［１６］のいずれかの製造方法。
［３１］　２～８℃の冷却下にてシート状に成型する、［３０］の製造方法。
［３２］　さらに、支持体をフィブリンゲルシートと一体化させる工程を含む、［３０］又は［３１］の製造方法。
［３３］　［１］～［１２］のいずれかのフィブリンゲルシートが複数積層されてなる、細胞移植用のフィブリンゲルシートの積層体。
［１ａ］　細胞がフィブリンゲルシートに均一に分散され内包されてなり、一面の表面積が２．２５ｃｍ2以上のサイズを有し、１ｍｍ以下の厚さを有する、細胞移植治療方法において使用されるフィブリンゲルシート。
［２ａ］　細胞が１．５×１０6個超／ｃｍ2の量で内包される、［１ａ］のフィブリンゲルシート。
［３ａ］　細胞がスフェロイドの形態である、［１ａ］又は［２ａ］のフィブリンゲルシート。
［４ａ］　細胞がｉＰＳ細胞由来膵島細胞である、［１ａ］～［３ａ］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［５ａ］　さらに、生分解性ゲル化剤を含む、［１ａ］～［４ａ］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［６ａ］　生分解性ゲル化剤を０．２～２ｗ／ｖ％の量で含む、［５ａ］のフィブリンゲルシート。
［７ａ］　生分解性ゲル化剤がコラーゲンである、［５ａ］又は［６ａ］のフィブリンゲルシート。
［８ａ］　さらに、生分解性粒子を内包する、［１ａ］～［４ａ］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［９ａ］　生分解性粒子が目開き１００μｍ～１０００μｍを通過できるサイズである、［８ａ］のフィブリンゲルシート。
［１０ａ］　生分解性粒子を１０～３０ｗ／ｖ％の量で含む、［８ａ］又は［９ａ］のフィブリンゲルシート。
［１１ａ］　生分解性粒子がゼラチンゲル粒子である、［８ａ］～［１０ａ］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［１２ａ］　支持体をさらに備える、［１ａ］～［１０ａ］のいずれかのフィブリンゲルシート。
［３３ａ］　［１ａ］～［１２ａ］のいずれかのフィブリンゲルシートが複数積層されてなる、細胞移植治療方法において使用されるフィブリンゲルシートの積層体。
　本明細書は本願の優先権の基礎である２０２２年７月１４日に出願された日本国特許出願２０２２－１１３５４６号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。
　本発明によれば、従来なかったより大きなサイズを有すると同時に、より多くの細胞が均一に分散され内包されてなるフィブリンゲルシートならびにその製造方法を提供することができる。
図１は、（Ａ）ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲル塊、及び（Ｂ）ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルシートの外観を示す写真図である。スケールバー：１０ｍｍ。 図２は、ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲル塊、又はｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルシートが皮下移植されたヌードラットにおける血中ヒトｃ－ペプチド濃度をＥＬＩＳＡ法により経時的に測定した解析結果を示すグラフ図である。 図３は、（Ａ）ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲル塊、又は（Ｂ）ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルシートが皮下移植されたヌードラットにおける、移植１０日後と６週後における移植部位の組織学的解析結果を示す写真図である。スケールバー：１ｍｍ。 図４は、トロンビン濃度とフィブリンゲルのゲル化時間の関係を解析した結果を示すグラフ図である。 図５は、冷却した金属製の型を使用した方法により製造された、大動物・ヒトサイズのｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルシートの外観（Ａ）及び、当該シートの１～４の位置を位相差顕微鏡により観察した結果（Ｂ）を示す写真図である。 図６は、（Ａ）フィブリノーゲン溶液および（Ｂ）フィブリノーゲン＋ゼラチンマイクロスフェア溶液に懸濁し、所定時間静置した後のｉＰＩＣの状態を示す写真図である。（Ａ）における矢頭は、ｉＰＩＣの沈殿を示す。 図７は、ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルシート、又はｉＰＩＣを内包したフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートが皮下移植されたヌードラットにおける血中ヒトｃ－ペプチド濃度をＥＬＩＳＡ法により経時的に測定した解析結果を示すグラフ図である。 図８は、ピペット注入による手作業と３Ｄプリンターを用いて作製した大動物・ヒトサイズのｉＰＩＣを内包したフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートの外観と断面を示す写真図（Ａ）及び各シートの輝度分布を画像解析し標準偏差を算出した結果（Ｂ）、ならびに、３Ｄプリンターを用いて作製した当該フィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートの任意の４か所（１～４）に含まれる細胞数の測定結果を示すグラフ図（Ｃ）である。 図９は、シリンジから排出されたフィブリノーゲン＋コラーゲン溶液中の細胞数（濃度）の計測結果を示すグラフ図である。 図１０は、ｉＰＩＣを内包したフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシート、又はｉＰＩＣを内包したフィブリン＋コラーゲンゲルシートが皮下移植されたヌードラットにおける血中ヒトｃ－ペプチド濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した解析結果を示すグラフ図である。 図１１は、３Ｄプリンターを用いて作製した大動物・ヒトサイズのｉＰＩＣを内包したフィブリン＋コラーゲンゲルシートの任意の６か所（１～６）に含まれる細胞数の測定結果を示すグラフ図である。
１．用語
　以下、本明細書において記載される用語について説明する。
　本明細書において、「約」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ２５％、２０％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％まで変動する値を示す。好ましくは、「約」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。
　本明細書において、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
　本明細書において、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）　ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。
　本明細書において、「フィーダー細胞を使用」しないとは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。
　なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別の種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンＣ処理などによって不活性化することができる。
　本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。
　本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ、かつ／又は分化させることを意味する。培養には２次元培養（平面培養）や、３次元培養（浮遊培養）が含まれる。
　本明細書において、「純化する（ｐｕｒｉｆｙ）」及び「純化すること（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の不純物を取り除き、特定の構成成分について純粋なものにすることを指し、「純化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、細胞の組成物を説明するために使用される場合、不純物の量が、純化される前の細胞の組成物におけるそのような構成成分の割合と比較して減少し、特定の構成成分の純度が向上している細胞の組成物を指す。例えば、細胞の組成物を、標的細胞型に関して純化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、純化する前の細胞の組成物内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞の組成物は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について純化させることもできる。細胞の組成物は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって純化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞を純化する方法により、標的細胞の純度は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％になるか、不純物（夾雑細胞を含む）は検出できない程度になりうる。
　本明細書において、「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１８）、種々のコロニー刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、種々のインターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γなど）及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）が挙げられる。
　本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫ　ＩとＲＯＣＫ　ＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ－（４－ピリジニル）－４β－［（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド（本明細書中、Ｙ２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン（Ｈ－１１５２）、４β－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－（４－ピリジル）ベンゼン－１α－カルボアミド（Ｗｆ－５３６）、Ｎ－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）－４ＰＥＲ［（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド（Ｙ－３０１４１）、Ｎ－（３－｛［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ｝フェニル）－４－｛［２－（４－モルホリニル）エチル］－オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－６－メチル－２－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－ピリジン－５－カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）を挙げることができる。ＲＯＣＫ阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＲＯＣＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＲＯＣＫに結合する抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体等もＲＯＣＫ阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
　本明細書において、「ＧＳＫ３β阻害剤」とは、ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）に対する阻害活性を有する物質である。ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ＧＳＫ３β阻害活性を有すれば特に限定されず、ＧＳＫ３β阻害活性と合わせてＧＳＫ３α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９８０１４（２－［［２－［（５－ニトロ－６－アミノピリジン－２－イル）アミノ］エチル］アミノ］－４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ＴＤＺＤ－８（４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＴＷＳ－１１９（３－［６－（３－アミノフェニル）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－イルオキシ］フェノール）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１－アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）及びＡＲ－ＡＯ１４４－１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム複合体、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。ＧＳＫ３β阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＧＳＫ３βに結合する抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ３β変異体等もＧＳＫ３β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
　本明細書において「血清代替物」とは、例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、Ｂ－２７サプリメント、Ｎ２－サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、２－メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ＩＴＳ－Ｇ）が挙げられる。血清代替物としては、Ｂ－２７サプリメント、ＫＳＲ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ－Ｇが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は０．０１～１０重量％、好ましくは０．１～２重量％である。本発明においては、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。
　本明細書において、「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」とは、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じＣＤＫファミリーの他のタンパク質とは対照的に、ＣＤＫ８は、細胞増殖には必要とされず、ＣＤＫ８の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。ＣＤＫ１９とＣＤＫ８は類似しており、ＣＤＫ８阻害は通常ＣＤＫ１９の阻害も伴う。「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」は従来公知のものを使用することができ、このようなＣＤＫ８／１９阻害剤は、特許文献又は非特許文献から見つけることができる。例えば、ＵＳ２０１２／００７１４７７、ＷＯ２０１５／１５９９３７、ＷＯ２０１５／１５９９３８、ＷＯ２０１３／１１６７８６、ＷＯ２０１４／００３８９５８、ＷＯ２０１４／１３４１６９、ＪＰ２０１５／５０６３７６、ＵＳ２０１５／０２７４７２６、ＵＳ２０１６／００００７８７、ＷＯ２０１６／００９０７６、ＷＯ２０１６／００１６９５１、ＷＯ２０１６／０１８５１１、ＷＯ２０１６／１００７８２及びＷＯ２０１６／１８２９０４に記載される化合物のうち、ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する化合物又はその塩を、本発明における「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」として利用することができる。例えば、本発明においては、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、及び（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミド又はその塩を「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」として利用することができる。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子はこれらに限定されるものではなく、ＣＤＫ８／１９のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＣＤＫ８／１９に結合する抗体、ドミナントネガティブＣＤＫ８／１９変異体等もＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
２．細胞移植用のフィブリンゲルシート
　本発明は、細胞がフィブリンゲルシートに均一に分散され内包されてなる、細胞移植用のフィブリンゲルシート（以下、単に「本発明のフィブリンゲルシート」と記載する場合がある）に関するものである。
　本発明のフィブリンゲルシートは、従来の細胞移植用のフィブリンゲルシートでは達成し得なかったサイズを有することを特徴とするものであり、シートの一面（すなわち、シートの主表面のいずれかの面、もしくはシートの片面とも称される）の表面積が２．２５ｃｍ2以上、好ましくは４ｃｍ2以上、より好ましくは９ｃｍ2以上、さらに好ましくは１６ｃｍ2以上、よりさらに好ましくは２５ｃｍ2以上、とりわけ好ましくは３６ｃｍ2以上、とりわけより好ましくは４９ｃｍ2以上、とりわけさらに好ましくは６４ｃｍ2以上、とりわけよりさらに好ましくは８１ｃｍ2以上、特に好ましくは１００ｃｍ2以上であり、その上限は特に限定されず、移植部位の大きさや形状に応じて適宜選択することが可能であるが、例えば４００ｃｍ2以下となるサイズを有することができる。
　本発明のフィブリンゲルシートにおける上記表面積の範囲は前記下限及び上限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、本発明のフィブリンゲルシートの上記表面積は、２．２５ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、好ましくは４ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、より好ましくは９ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、さらに好ましくは１６ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、よりさらに好ましくは２５ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、とりわけ好ましくは３６ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、とりわけより好ましくは４９ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、とりわけさらに好ましくは６４ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、とりわけよりさらに好ましくは８１ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、特に好ましくは１００ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下の範囲より適宜選択される大きさとすることができる。
　本発明のフィブリンゲルシートの上記一面の形状は、特に限定されず、移植部位の大きさや形状に応じて適宜選択することが可能であり、例えば、多角形（例えば、三角形、四角形、五角形、六角形、八角形等）角丸多角形、円形、楕円形等が挙げられるがこれらに限定はされない。
　例えば、本発明のフィブリンゲルシートが四角形を有する場合、その大きさはタテの長さが、１５ｍｍ以上、好ましくは２０ｍｍ以上、より好ましくは３０ｍｍ以上、さらに好ましくは４０ｍｍ以上、よりさらに好ましくは５０ｍｍ以上、とりわけ好ましくは６０ｍｍ以上、とりわけより好ましくは７０ｍｍ以上、とりわけさらに好ましくは８０ｍｍ以上、とりわけよりさらに好ましくは９０ｍｍ以上、特に好ましくは１００ｍｍ以上であり、その上限は特に限定されないが、例えば２００ｍｍ以下とすることができる。また、本発明のフィブリンゲルシートはヨコの長さが、１５ｍｍ以上、好ましくは２０ｍｍ以上、より好ましくは３０ｍｍ以上、さらに好ましくは４０ｍｍ以上、よりさらに好ましくは５０ｍｍ以上、とりわけ好ましくは６０ｍｍ以上、とりわけより好ましくは７０ｍｍ以上、とりわけさらに好ましくは８０ｍｍ以上、とりわけよりさらに好ましくは９０ｍｍ以上、特に好ましくは１００ｍｍ以上であり、その上限は特に限定されないが、例えば２００ｍｍ以下とすることができる。
　当該タテの長さ及びヨコの長さの範囲は前記下限及び上限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、本発明のフィブリンゲルシートの大きさは（タテの長さ×ヨコの長さ（ヨコの長さ×タテの長さであってもよい））、１５ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×１５ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、好ましくは２０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×２０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、より好ましくは３０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×３０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、さらに好ましくは４０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×４０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、よりさらに好ましくは５０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×５０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、とりわけ好ましくは６０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×６０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、とりわけより好ましくは７０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×７０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、とりわけさらに好ましくは８０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×８０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、とりわけよりさらに好ましくは９０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×９０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、特に好ましくは１００ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×１００ｍｍ以上～２００ｍｍ以下の範囲より適宜選択される大きさとすることができる。例えば、本発明のフィブリンゲルシートの大きさは（タテの長さ×ヨコの長さ（ヨコの長さ×タテの長さであってもよい））、１５ｍｍ以上×１５ｍｍ以上、好ましくは２０ｍｍ×２０ｍｍ、２０ｍｍ×３０ｍｍ、もしくは３０ｍｍ×３０ｍｍ、より好ましくは４０ｍｍ×４０ｍｍ、４０ｍｍ×５０ｍｍ、５０ｍｍ×５０ｍｍ、４０ｍｍ×６０ｍｍ、もしくは６０ｍｍ×６０ｍｍ、さらに好ましくは７０ｍｍ×７０ｍｍ、８０ｍｍ×８０ｍｍ、９０ｍｍ×９０ｍｍ、１００ｍｍ×１００ｍｍ、もしくは２００ｍｍ×２００ｍｍ等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　本発明のフィブリンゲルシートの厚みは、内包される細胞の大きさや量、移植部位の大きさ等の要因に応じて適宜設定することができるが、好ましくは１ｍｍ以下である。本発明のフィブリンゲルシートの厚みが１ｍｍ以下であることによって、フィブリンゲルシートに内包される細胞への栄養分や酸素の供給等を効率的に行うことができ、また移植後、速やかなフィブリンゲルの分解を達成することができ、好ましい。本発明のフィブリンゲルシートの厚みは、例えば１ｍｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、又は４００μｍ以下とすることができ、その下限は特に限定されないが、例えば１００μｍ以上、２００μｍ以上、又は３００μｍ以上とすることができる。また、本発明のフィブリンゲルシートの厚みの範囲は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、本発明のフィブリンゲルシートの厚みは、１００μｍ以上～１ｍｍ以下、１００μｍ～８００μｍ以下、２００μｍ～６００μｍ以下、又は３００μｍ以上～４００μｍ以下とすることができ、これらの範囲より適宜選択される厚みとすることができる。例えば、本発明のフィブリンゲルシートの厚みは約４００μｍである。なお、本発明のフィブリンゲルシートの厚みは、シート全体で均一である必要はなく、最も厚みのあるところでも上記の範囲にあればよい。
　本明細書において、細胞が「均一に分散され内包」されてなるとは、播種された細胞が本発明のフィブリンゲルシートのいずれかの部位に限局することなく、当該フィブリンゲルシート中に広く分布して含まれることを意味する。細胞は全て、その全体がフィブリンゲルシート中に、包埋されている必要はないが、フィブリンゲルの表面に播種して接着培養された細胞培養物は、フィブリンゲルシートの表面のみに、細胞が限局して存在するものであることから、細胞が「分散され内包」されてなる態様とは異なるものである。より詳細には、本明細書において、細胞が「均一に分散され内包」されてなるとは、本発明のフィブリンゲルシートの任意の複数個所（例えば、２か所、４か所、又は６か所等）における所定の範囲中に含まれる各細胞数（細胞密度）の偏りが小さいことを意味し、好ましくは当該各細胞数の値が、それらの平均値の±２０％以内、好ましくは±１５％以内、より好ましくは±１０％以内の範囲にあることを意味する。また、本明細書において、細胞が「均一に分散され内包」されてなるとは、播種された細胞間についての位置関係を意味するものであり、例えば、フィブリンゲルの表面又は内部に播種された細胞が培養され増殖して、播種された細胞の由来が異なる細胞群が互いに接触／結合している場合は、播種された細胞間で少なくとも細胞が分散されているとはいえないため、細胞が「均一に分散され内包」されている状態に該当しない。このような播種された細胞間で接触／結合している状態としては、例えば、フィブリンゲルの表面／内部に播種・培養して形成された細胞培養物（例えば、細胞シート等）が挙げられ、このような態様は、本発明に含まれることを意図するものではない。一方、このような播種された細胞間で接触／結合している状態でない限り、播種された細胞の形態が、例えば、細胞同士が集合・凝集化した細胞塊または細胞集合体の状態、すなわちスフェロイドの形態であることや、播種された細胞が増殖すること等を、除外することを意図するものではない。
　本発明において「細胞」は、細胞治療のためにそれを必要とする患者に移植される細胞であり、患者の症状に応じて適宜選択することができ、例えば、表皮、神経、脳、脊髄、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲状腺、膵臓、肝臓、筋肉、骨格、心臓、血管、脾臓、腎臓、血液等（これらに限定はされない）の器官や組織を構成する細胞やその前駆細胞と同等又は類似する機能を有する細胞等が挙げられる。「細胞」は、いずれか単独で用いてもよいし、異なる細胞を組み合わせて用いてもよい。本発明のフィブリンゲルシート中における細胞の形態は特に限定されず、相互に分離された細胞（シングルセルの状態）であってもよいし、細胞同士が集合・凝集化した細胞塊または細胞集合体の状態、すなわちスフェロイドの形態で存在していてもよいし、浮遊培養した細胞であってもよい。スフェロイドの形態の細胞としては、例えば、膵島細胞、肝細胞、心筋細胞等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　本発明において「細胞」は、生体より採取された細胞であってもよいし、培養細胞であってもよく、さらにこれら細胞を凍結融解した細胞であってもよい。好ましくは、本発明において「細胞」は、多能性幹細胞より分化誘導して得られた多能性幹細胞由来の細胞である。
　本明細書において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは区別される。
　本明細書において「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔだが、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔではない。
　本明細書において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。
　「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、理化学研究所（理研）等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）、理研、京都大学、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえばＥＳ細胞株としては、ＮＩＨのＣＨＢ－１～ＣＨＢ－１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１～ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＨ１株、Ｈ９株、理研のＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。
　「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３－６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１－８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ　４４８，３１３－３１７．）、ｃ－Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１－１０６））、ウイルスフリーで６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ；８（５）：４０９－１２，Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８－６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ　Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７－１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ　ＩＨ，Ｄａｌｅｙ　ＧＱ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１－１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８－３０７００７号）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ　Ｙ．，Ｄｉｎｇ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ　５，５６８－５７４；Ｋｉｍ　ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ　ＨＲ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６－６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ　７，７９５－７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８－３０７００７号、特開２００８－２８３９７２号、ＵＳ２００８／２３３６６１０、ＵＳ２００９／０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性細胞株としては、ＮＩＨ、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、京都大学のＦｆ－ＷＪ－１８株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０２株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０６株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株、２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＣＤＩ社のＭｙＣｅｌｌ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌｓ（２１５２５．１０２．１０Ａ）株、ＭｙＣｅｌｌ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌｓ（２１５２６．１０１．１０Ａ）株、等が挙げられる。
　本発明において利用可能な多能性幹細胞由来の細胞としては、ｉＰＳ細胞由来膵島細胞（以下、「ｉＰＩＣ」と記載する場合がある）が挙げられるが、これに限定されるものではない。ｉＰＩＣには、インスリン産生細胞、及び／又は膵β細胞が含まれる。インスリン産生細胞はインスリン及びＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６．１）の少なくとも一つのマーカーの発現により特徴付けられる細胞である。膵β細胞はインスリン産生細胞より成熟した細胞であり、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーの発現により特徴付けられる。「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。
　マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリー等）を利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法（ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ等）を利用して行うことができる。例えば、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、ＲＴ－ＰＣＲにより検出されることを意味し、「陰性」とはＲＴ－ＰＣＲで検出限界以下であることを意味する。
　「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
　ｉＰＩＣは、多能性幹細胞から公知の手法（ＷＯ２００９／０１２４２８，ＷＯ２０１６／０２１７３４，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７））に準じて分化誘導を行うことにより得ることができる。すなわち、以下の分化誘導工程を利用してｉＰＩＣを得ることができる：
　　工程１）多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する；
　　工程２）胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する；
　　工程３）原腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する；
　　工程４）後方前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する；
　　工程５）膵前駆細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する；
　　工程６）内分泌前駆細胞からｉＰＩＣへと分化誘導する。
　以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。
工程１）胚体内胚葉細胞への分化
　多能性幹細胞は、まず胚体内胚葉細胞に分化させる。多能性幹細胞から胚体内胚葉を誘導する方法は既に公知であり、そのいずれの方法を用いてもよい。好ましくは、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地、より好ましくはアクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。培養開始時の細胞数としては、特に限定されず、２２０００～１５００００細胞／ｃｍ2、好ましくは２２０００～１０００００細胞／ｃｍ2、より好ましくは２２０００～８００００細胞／ｃｍ2である。培養期間は１日～４日、好ましくは１日～３日、特に好ましくは３日である。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　本工程で用いる培地としては、ＲＰＭＩ　１６４０培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ／アスコルビン酸／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地を使用することができる。
　アクチビンＡの培地中の濃度は、通常３０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０～１２０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
　別の態様として、アクチビンＡは培地中に低用量にて、例えば、５～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５～１０ｎｇ／ｍＬの量にて含めることができる。
　さらに別の態様として、アクチビンＡの培地中の濃度は、約０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３～１０ｎｇ／ｍＬである。
　ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常２～５μＭ、好ましくは２～４μＭ、特に好ましくは約３μＭである。
　ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５～２０μＭ、好ましくは５～１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭである。
　培地にはさらに、インスリンを添加することができる。インスリンは培地中に０．０１～２０μＭ、好ましくは０．１～１０μＭ、より好ましくは０．５～５μＭの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したＢ－２７サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。
　特定の態様では、アクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で１日培養した後、アクチビンＡのみを含む培地で１日毎に培地を交換しながらさらに２日培養する。あるいは、低用量のアクチビンＡの存在下、多能性幹細胞を、インスリンを０．０１～２０μＭ含む培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンを含まない培地中で第２の培養を行うことにより製造することができる。
工程２）原腸管細胞への分化
　工程１）で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は２日～８日、好ましくは約４日である。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
工程３）後方前腸細胞への分化
　工程２）で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後方前腸細胞に分化誘導する。培養期間は１日～５日、好ましくは約２日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
　シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常０．５～１．５μＭ、好ましくは０．３～１．０μＭ、特に好ましくは約０．５μＭである。
　ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
工程４）膵前駆細胞への分化
　工程３）で得られた後方前腸細胞を、さらにＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導する。培養期間は２日～１０日、好ましくは約５日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　２次元培養の場合には、既報（Ｔｏｙｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４，１８５－１９７）に従い、工程３）で得られた後方前腸細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で処理し、ピペッティングにより当該液中に分散させて細胞分散液を得、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を少量の新たな培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を工程４）の新しい培地に再播種する。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約０．００００１μＭ～５μＭ、好ましくは０．００００１μＭ～１μＭである。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、ＣＤＫ８／１９に対して５０％以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。
　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＫＧＦ及び／又はＥＧＦがより好ましく、ＫＧＦ及びＥＧＦがさらに好ましい。
　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦ及びＥＧＦを使用する場合の濃度は、ＥＧＦは通常通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ、ＫＧＦは通常１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
　工程４）における培養の最初の１日はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行い、以後はＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養してもよい。
　また、培地にはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤を含めても良い。ＰＫＣ活性化剤としては、ＰＤＢｕ（ＰＫＣ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＩＩ）、ＴＰＢ（ＰＫＣ　ａｃｔｏｖａｔｏｒ　Ｖ）などを使用するが、その限りでない。ＰＫＣ活性化剤の濃度は約０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３～１０ｎｇ／ｍＬで添加する。
　また、培地にはジメチルスルホキシド、及び／又はアクチビン（１～５０ｎｇ／ｍＬ）を添加してもよい。
　いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物（例えば、Ｂ－２７サプリメント、ＩＴＳ－Ｇ）を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、ニコチンアミド、抗生物質（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常０．０１～２０重量％、好ましくは０．１～１０重量％である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　また細胞培養は、２次元培養の場合は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（製品名）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例：ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、Ｉ型コラーゲン、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ－Ｄ－リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ－Ｄ－リジンでコートされた培養容器がより好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　工程４）で得られた膵前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
工程５）内分泌前駆細胞への分化
　工程４）で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程４）で得られた膵前駆細胞を、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で処理し、ピペッティングすることにより当該液中に分散させて細胞分散液を得、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を少量の新たな培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を工程５）の新しい培地に再播種する。培養期間は２日～３日、好ましくは約２日である。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮを添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　工程５）で得られた内分泌前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
工程６）ｉＰＩＣへの分化
　工程５）で得られた内分泌前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養してｉＰＩＣに分化誘導する。培養期間は１０日～３０日、好ましくは約１０～２０日である。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはＴ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ4、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、及びＲ４２８を添加してもよい。
　培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養は、フィーダー細胞を使用しない。３次元培養の場合、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　本発明のフィブリンゲルシートは、従来の細胞移植用のフィブリンゲルシートでは達成し得なかったより多くの細胞数（高い密度の細胞数）を有することを特徴とするものであり、細胞を１ｃｍ2あたり、１．５×１０6個超、好ましくは２×１０6個以上、より好ましくは２．５×１０6個以上、さらに好ましくは３×１０6個以上、よりさらに好ましくは４．５×１０6個以上、とりわけ好ましくは５×１０6個以上の量で含み、その上限は特に限定されないが、例えば、１０×１０6個以下、好ましくは７×１０6個以下とすることができる。本発明のフィブリンゲルシートに内包される細胞数の範囲は前記下限及び上限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、本発明のフィブリンゲルシートには細胞を、１．５×１０6個超～１０×１０6個以下／ｃｍ2、好ましくは２×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2、より好ましくは２．５×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2、さらに好ましくは３×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2、よりさらに好ましくは４．５×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2、とりわけ好ましくは５×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2の範囲より適宜選択される量にて含めることができる。
　上述のｉＰＩＣは通常、１００μｍ～２００μｍ程度の大きさを有する細胞塊の状態で存在するが、本発明のフィブリンゲルシートにはｉＰＩＣを細胞塊の個数にして１ｃｍ2あたり、３０００個超、好ましくは４０００個以上、より好ましくは５０００個以上、さらに好ましくは６０００個以上、よりさらに好ましくは９０００個以上、とりわけ好ましくは１００００個以上の量で含み、その上限は特に限定されないが、例えば、２００００個以下、好ましくは１４０００個以下とすることができる。本発明のフィブリンゲルシートに内包されるｉＰＩＣ（細胞塊）の個数の範囲は前記下限及び上限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、本発明のフィブリンゲルシートにはｉＰＩＣ（細胞塊）を、３０００個超～２００００個以下／ｃｍ2、好ましくは４０００個以上～２００００個以下／ｃｍ2、より好ましくは５０００個以上～２００００個以下／ｃｍ2、さらに好ましくは６０００個以上～２００００個以下／ｃｍ2、よりさらに好ましくは９０００個以上～２００００個以下／ｃｍ2、とりわけ好ましくは１００００個以上～２００００個以下／ｃｍ2の範囲より適宜選択される量にて含めることができる。
　本発明のフィブリンゲルシートにおいて、フィブリンゲルは適当な溶媒（例えば、水、生理食塩水等）中にてフィブリノーゲンとトロンビンとを作用させることによって形成されたものである。フィブリンゲルの形成に用いられるフィブリノーゲン及びトロンビンの量及び両者の混合方法は、下記に詳述する本発明のフィブリンゲルシートの製造方法に基づいて、適宜決定することができる。
　一態様において、本発明のフィブリンゲルシートはさらに、粒子状の形態を有する生分解性材料（以下、「生分解性粒子」と記載する場合がある）を内包する。
　本発明において「生分解性粒子」は、下記に詳述する本発明のフィブリンゲルシートの製造方法において、細胞と共にフィブリノーゲン溶液中に添加、懸濁され、当該溶液中にて細胞の沈殿を抑制し分散を維持するものであり、これにより最終的に得られるフィブリンゲルシートにおいて、細胞が分散され内包されることを可能とする。
　「生分解性粒子」を構成する生分解性材料としては、生体内で加水分解等により分解可能な物質であればよく、特に限定されるものではないが、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンアミン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリフマル酸プロピレン、ポリアクリル酸、ポリｅ－カプロラクトン、ポリメタクリル酸、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ペクチン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、キチン、キトサン、キサンタン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサン、アルギン酸、アルギン酸エステル、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、フィブリン、プルラン、ラミニン、ゲラン、シリコン、ウレタン、エラスチン等及びそれらの修飾体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、生分解性粒子は、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ等及びそれらの修飾体、ならびにそれらの組み合わせからな群より選択されるゲル状の生分解性材料より構成される。
　「生分解性粒子」の形態は、前記溶液中にて細胞の沈殿を抑制し分散を維持することが可能な形態であればよく、ブロック状、ビーズ状、ペレット状、シート状、ゲル状等の任意の形態を有することができ、中実又は多孔性とすることができる。「生分解性粒子」の形態としては、好ましくは立体形状であり、例えば、球体、四面体、六面体等の多面体、円柱、角柱、円錐、円錐台、角錐、角錐台、トーラス体、円盤体、楕円体それらの変形立体等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　「生分解性粒子」のサイズは、前記溶液中にて細胞の沈殿を抑制し分散を維持することができ、かつ本発明のフィブリンゲルシートの形成を妨げないサイズであればよく、目開き１００μｍ～１０００μｍ、好ましくは１００μｍ～８００μｍ、より好ましくは１５０μｍ～４００μｍ、さらに好ましくは２００μｍを通過できる程度のサイズとすることができる。
　本発明の一態様において、生分解性粒子はゼラチンゲルであり、目開き２００μｍを通過できる球体の形状を有する。
　本発明のフィブリンゲルシートに含まれる生分解性粒子の量は、前記フィブリノーゲン溶液中にて細胞の沈殿を抑制し分散を維持することができ、かつ本発明のフィブリンゲルシートの形成を妨げない量であればよく、例えば、前記フィブリノーゲン溶液中に生分解性粒子を１０～３０ｗ／ｖ％、好ましくは１５～２５ｗ／ｖ％、より好ましくは１８～２２ｗ／ｖ％、さらに好ましくは２０ｗ／ｖ％の量で含むことができる。
　なお、本発明のフィブリンゲルシート中、生分解性粒子はその形態及び形状が維持されていてもよいし、あるいは、その一部又は全体がフィブリンゲルと一体化していてもよい。
　また別の態様において、本発明のフィブリンゲルシートはさらに、生分解性ゲル化剤を含む。
　本発明において「生分解性ゲル化剤」は、下記に詳述する本発明のフィブリンゲルシートの製造方法において、細胞と共にフィブリノーゲン溶液中に添加して溶解し、当該溶液に粘性を付与して、当該溶液中細胞の沈殿を抑制し分散の維持を可能とするものであり、これにより最終的に得られるフィブリンゲルシートにおいて、細胞が分散され内包されることを可能とする。
　「生分解性ゲル化剤」としては、生体内で加水分解等により分解可能な物質であるとともに、前記溶液に細胞の沈殿を抑制し分散を維持することが可能な粘度を付与することができ、かつ本発明のフィブリンゲルシートの形成を妨げないものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、前出の生分解性材料を用いることができる（ただし、フィブリンは除く）。好ましくは、生分解性ゲル化剤は、コラーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、デキストラン、ＰＥＧ等及びそれらの修飾体、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される生分解性材料を用いることができる。
　本発明のフィブリンゲルシートに含まれる生分解性ゲル化剤の量は、前記フィブリノーゲン溶液中にて細胞の沈殿を抑制し分散を維持することができ、かつ本発明のフィブリンゲルシートの形成を妨げない量であればよく、例えば、前記フィブリノーゲン溶液中に生分解性ゲル化剤を０．２～２ｗ／ｖ％、好ましくは０．４～１．５ｗ／ｖ％、より好ましくは０．５～１ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．７５ｗ／ｖ％の量で含むことができる。
　また、本発明のフィブリンゲルシートはさらに、支持体を備えることができる。支持体は、本発明のフィブリンゲルシートの製造時及び／又は使用時において当該フィブリンゲルシートを支持するとともに、当該フィブリンゲルシートの操作性の向上に寄与し得る。支持体は、前出の生分解性材料や非生分解性材料、例えばポリエステル（ＰＥｓ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ナイロン、シルク（これらに限定はされない）からなり、本発明のフィブリンゲルシートを支持することが可能な任意の形状（例えば、シート状、メッシュ状、プレート状、織布状、不織布状等）を有する。支持体は、本発明のフィブリンゲルシートの表面に接着されていてもよいし、あるいはその一部又は全体が、本発明のフィブリンゲルシート中に固定されていてもよい。
　本発明の一態様において、本発明のフィブリンゲルシートは、ポリエステル、又はポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸からなるメッシュ状の形状を有する支持体を備える。
　本発明のフィブリンゲルシートは、複数の当該フィブリンゲルシートが積層された積層体の形態で提供されてもよい。積層体は、各フィブリンゲルシートが全て同じ細胞を内包するものであってもよいし、一部又は全てが異なる細胞をそれぞれ内包するフィブリンゲルシートの組み合わせからなるものであってもよい。
３．本発明のフィブリンゲルシートの製造方法
　本発明はまた、前記本発明のフィブリンゲルシートの製造方法（以下、「本発明方法」と記載する場合がある）に関するものであり、当該方法は、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液をトロンビンと作用させて、一面の表面積が２．２５ｃｍ2以上のサイズを有し、１ｍｍ以下の厚さを有するシート状に成型・ゲル化（固化）させる工程を含む。フィブリンゲルは、適当な溶媒（例えば、水、生理食塩水等）中にてフィブリノーゲンとトロンビンと合わせ、ゲル化（固化）させることにより得ることができる。
　フィブリノーゲン溶液中には細胞が均一分散して懸濁されており、その細胞量は成型された後のフィブリンゲルシートに基づいて決定することができ、すなわちフィブリンゲルシート１ｃｍ2あたり、１．５×１０6個超、好ましくは２×１０6個以上、より好ましくは２．５×１０6個以上、さらに好ましくは３×１０6個以上、よりさらに好ましくは４．５×１０6個以上、とりわけ好ましくは５×１０6個以上となる量にて、その上限は特に限定されないが、例えば、１０×１０6個以下、好ましくは７×１０6個以下となる量にて懸濁することができる。フィブリノーゲン溶液中に懸濁される細胞数の範囲は前記下限及び上限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、フィブリノーゲン溶液中には細胞を、フィブリンゲルシートにおいて１．５×１０6個超～１０×１０6個以下／ｃｍ2、好ましくは２×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2、より好ましくは２．５×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2、さらに好ましくは３×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2、よりさらに好ましくは４．５×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2、とりわけ好ましくは５×１０6個以上～１０×１０6個以下／ｃｍ2となる範囲より適宜選択される量にて懸濁することができる。
　本発明方法の一実施形態において、細胞がｉＰＩＣである場合には、フィブリノーゲン溶液には、ｉＰＩＣを細胞塊の個数にしてフィブリンゲルシート１ｃｍ2あたり、３０００個超、好ましくは４０００個以上、より好ましくは５０００個以上、さらに好ましくは６０００個以上、よりさらに好ましくは９０００個以上、とりわけ好ましくは１００００個以上となる量にて、その上限は特に限定されないが、例えば、２００００個以下、好ましくは１４０００個以下となる量にて懸濁することができる。フィブリノーゲン溶液中に懸濁されるｉＰＩＣ（細胞塊）の個数の範囲は前記下限及び上限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、フィブリノーゲン溶液中にはｉＰＩＣ（細胞塊）を、フィブリンゲルシートにおいて３０００個超～２００００個以下／ｃｍ2、好ましくは４０００個以上～２００００個以下／ｃｍ2、より好ましくは５０００個以上～２００００個以下／ｃｍ2、さらに好ましくは６０００個以上～２００００個以下／ｃｍ2、よりさらに好ましくは９０００個以上～２００００個以下／ｃｍ2、とりわけ好ましくは１００００個以上～２００００個以下／ｃｍ2となる範囲より適宜選択される量にて懸濁することができる。
　フィブリンゲルシートへの成型は、シートの一面（すなわち、シートの主表面いずれかの面、もしくはシートの片面とも称される）の表面積が２．２５ｃｍ2以上、好ましくは４ｃｍ2以上、より好ましくは９ｃｍ2以上、さらに好ましくは１６ｃｍ2以上、よりさらに好ましくは２５ｃｍ2以上、とりわけ好ましくは３６ｃｍ2以上、とりわけより好ましくは４９ｃｍ2以上、とりわけさらに好ましくは６４ｃｍ2以上、とりわけよりさらに好ましくは８１ｃｍ2以上、特に好ましくは１００ｃｍ2以上であり、その上限は特に限定されず、移植部位の大きさや形状に応じて適宜選択することが可能であるが、例えば４００ｃｍ2以下となるサイズとすることができる。
　成型により得られるフィブリンゲルシートにおける上記表面積の範囲は前記下限及び上限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、成型により得られるフィブリンゲルシートの上記表面積は、２．２５ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、好ましくは４ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、より好ましくは９ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、さらに好ましくは１６ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、よりさらに好ましくは２５ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、とりわけ好ましくは３６ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、とりわけより好ましくは４９ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、とりわけさらに好ましくは６４ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、とりわけよりさらに好ましくは８１ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下、特に好ましくは１００ｃｍ2以上～４００ｃｍ2以下の範囲より適宜選択される大きさとすることができる。
　成型により得られるフィブリンゲルシートの上記一面の形状は、特に限定されず、移植部位の大きさや形状に応じて適宜選択することが可能であり、例えば、多角形（例えば、三角形、四角形、五角形、六角形、八角形等）角丸多角形、円形、楕円形等が挙げられるがこれらに限定はされない。
　成型により得られるフィブリンゲルシートが四角形を有する場合、タテの長さが、１５ｍｍ以上、好ましくは２０ｍｍ以上、より好ましくは３０ｍｍ以上、さらに好ましくは４０ｍｍ以上、よりさらに好ましくは５０ｍｍ以上、とりわけ好ましくは６０ｍｍ以上、とりわけより好ましくは７０ｍｍ以上、とりわけさらに好ましくは８０ｍｍ以上、とりわけよりさらに好ましくは９０ｍｍ以上、特に好ましくは１００ｍｍ以上であり、その上限は特に限定されないが、例えば２００ｍｍ以下とすることができ、また、ヨコの長さが、１５ｍｍ以上、好ましくは２０ｍｍ以上、より好ましくは３０ｍｍ以上、さらに好ましくは４０ｍｍ以上、よりさらに好ましくは５０ｍｍ以上、とりわけ好ましくは６０ｍｍ以上、とりわけより好ましくは７０ｍｍ以上、とりわけさらに好ましくは８０ｍｍ以上、とりわけよりさらに好ましくは９０ｍｍ以上、特に好ましくは１００ｍｍ以上であり、その上限は特に限定されないが、例えば２００ｍｍ以下とすることができる。
　当該タテの長さ及びヨコの長さの範囲は前記下限及び上限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、成型により得られるフィブリンゲルシートの大きさは（タテの長さ×ヨコの長さ（ヨコの長さ×タテの長さであってもよい））、１５ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×１５ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、好ましくは２０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×２０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、より好ましくは３０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×３０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、さらに好ましくは４０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×４０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、よりさらに好ましくは５０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×５０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、とりわけ好ましくは６０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×６０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、とりわけより好ましくは７０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×７０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、とりわけさらに好ましくは８０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×８０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、とりわけよりさらに好ましくは９０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×９０ｍｍ以上～２００ｍｍ以下、特に好ましくは１００ｍｍ以上～２００ｍｍ以下×１００ｍｍ以上～２００ｍｍ以下の範囲より適宜選択される大きさとすることができる。例えば、成型により得られるフィブリンゲルシートの大きさは（タテの長さ×ヨコの長さ（ヨコの長さ×タテの長さであってもよい））、１５ｍｍ以上×１５ｍｍ以上、好ましくは２０ｍｍ×２０ｍｍ、２０ｍｍ×３０ｍｍ、もしくは３０ｍｍ×３０ｍｍ、より好ましくは４０ｍｍ×４０ｍｍ、４０ｍｍ×５０ｍｍ、５０ｍｍ×５０ｍｍ、４０ｍｍ×６０ｍｍ、もしくは６０ｍｍ×６０ｍｍ、さらに好ましくは７０ｍｍ×７０ｍｍ、８０ｍｍ×８０ｍｍ、９０ｍｍ×９０ｍｍ、１００ｍｍ×１００ｍｍ、もしくは２００ｍｍ×２００ｍｍ等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　成型により得られるフィブリンゲルシートの厚みは、内包される細胞の大きさや量、移植部位の大きさ等の要因に応じて適宜設定することができるが、好ましくは１ｍｍ以下である。成型により得られるフィブリンゲルシートの厚みが１ｍｍ以下であることによって、フィブリンゲルシートに内包される細胞への栄養分や酸素の供給等を効率的に行うことができ、また移植後、速やかなフィブリンゲルの分解を達成することができ、好ましい。成型により得られるフィブリンゲルシートの厚みは、例えば１ｍｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、又は４００μｍ以下とすることができ、その下限は特に限定されないが、例えば１００μｍ以上、２００μｍ以上、又は３００μｍ以上とすることができる。また、成型により得られるフィブリンゲルシートの厚みの範囲は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、成型により得られるフィブリンゲルシートの厚みは、１００μｍ以上～１ｍｍ以下、１００μｍ～８００μｍ以下、２００μｍ～６００μｍ以下、又は３００μｍ以上～４００μｍ以下とすることができ、これらの範囲より適宜選択される厚みとすることができる。例えば、成型により得られるフィブリンゲルシートの厚みは約４００μｍとすることができる。なお、成型により得られるフィブリンゲルシートの厚みは、シート全体で均一である必要はなく、最も厚みのあるところでも上記の範囲にあればよい。
　本発明方法の一態様においては、フィブリノーゲンとトロンビンの配合量及び／又は成型時の温度を調整することによって、形成されるフィブリンゲルのゲル化（固化）速度を調整し、所望のサイズを有するフィブリンゲルシートへと広げて成形することを可能とするものである。
　本態様においてフィブリノーゲン溶液は、フィブリノーゲンを５～１５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０～８０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬの量で含み、トロンビンはフィブリノーゲン１ｍｇに対して０．４Ｕ以下、好ましくは０．３Ｕ以下もしくは０．２５Ｕ以下、より好ましくは０．２Ｕ以下もしくは０．１５Ｕ以下、さらに好ましくは０．１Ｕ以下もしくは０．０８Ｕ以下であり、その下限は特に限定されないが０．０４Ｕ以上の配合比となる量にて作用させる。フィブリノーゲン及び／又はトロンビンの配合量が、上記範囲よりも多い場合には、ゲル化（固化）が速くすすみ、所望のサイズを有するシート状に広げて成型することが困難又はできない場合がある。一方、フィブリノーゲン及び／又はトロンビンの配合量が、上記範囲よりも少ない場合には、十分にゲル化（固化）せず、所望のサイズを有するシート状に成型することが困難又はできない場合がある。トロンビンは任意の形態でフィブリノーゲンに作用させることができ、フィブリノーゲン溶液に直接添加してもよいし、あるいはあらかじめ適当な溶媒（例えば、水、生理食塩水等）に溶解してトロンビン溶液とした後に、フィブリノーゲン溶液と混合してもよい。
　トロンビンと作用させたフィブリノーゲン溶液を、所望のサイズと厚みを有するシート状に成型する手段は、任意の手段を用いることができ、例えば、ポリマーシートの製造分野において従来公知の任意の成形手段（例えば、型枠成形、押出成形、カレンダ成形インフレ－ション成形等）の一又は複数の組み合わせにより行うことができ、好ましくは型枠成形により行う。本態様においては、トロンビンと作用させたフィブリノーゲン溶液を、所望のサイズと厚みを有するシート状に押し広げて成形することを可能とするものであり、型枠成形、すなわち、所望のサイズと厚みを有するシート型枠に当該フィブリノーゲン溶液を注入し、必要に応じてヘラ、コテ等を利用して押し広げて成形することを容易に実施することができる。
　トロンビンと作用させたフィブリノーゲン溶液の成型は冷却下にて行う。当該フィブリンゲル溶液を冷却下に置くことにより、ゲル化（固化）の速度を抑えて、所望のサイズと厚みを有するシート状への成型、より詳細には、シート状に広げて成型することを可能とする。冷却の温度は、当該フィブリンゲル溶液を所望のサイズと厚みを有するシート状に成型することを可能とする温度であればよく、特に限定されないが、例えば、２～８℃、好ましくは２～６℃、より好ましくは４℃である。冷却は、当該フィブリンゲル溶液を冷却できればよく、当該フィブリンゲル溶液を冷却してもよいし、あるいは当該フィブリンゲル溶液が接する成型手段（例えば、型枠等）を冷却してもよい。
　必要に応じて、成型されたフィブリンゲル溶液がゲル化（固化）する前に、上述の支持体をフィブリンゲルシートと一体化させてもよい。当該支持体は、当該フィブリンゲル溶液の表面に接着させてもよいし、あるいはその一部又は全体を当該フィブリンゲル溶液中に浸漬させてもよい。これをゲル化（固化）させることにより、当該支持体を一体化させて備えるフィブリンゲルシートを得ることができる。
　本発明方法の別の態様においては、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液にさらに、「生分解性粒子」を添加、懸濁することによって、または、「生分解性ゲル化剤」を添加、溶解することによって、当該フィブリノーゲン溶液中にて細胞が沈殿するのを抑制し、当該フィブリノーゲン溶液中にて細胞が均一に分散して懸濁された状態を維持し、細胞が分散され内包されてなるフィブリンゲルシートの製造を可能とする。
　「生分解性粒子」は、上記定義のものを用いることができ、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液中にて細胞の沈殿を抑制し分散を維持することができ、かつ本発明のフィブリンゲルシートの形成を妨げない量で添加、懸濁することができ、例えば、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液に生分解性粒子を１０～３０ｗ／ｖ％、好ましくは１５～２５ｗ／ｖ％、より好ましくは１８～２２ｗ／ｖ％、さらに好ましくは２０ｗ／ｖ％の量で添加、懸濁する。本態様の一実施形態において、生分解性粒子はゼラチンゲル粒子であり、目開き２００μｍを通過できる球体の形状を有し、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液に２０ｗ／ｖ％の量で添加、懸濁する。
　「生分解性ゲル化剤」は、上記定義のものを用いることができ、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液中にて細胞の沈殿を抑制し分散を維持することができ、かつ本発明のフィブリンゲルシートの形成を妨げない量で添加、溶解することができ、例えば、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液に生分解性ゲル化剤を０．２～２ｗ／ｖ％、好ましくは０．４～１．５ｗ／ｖ％、より好ましくは０．５～１ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．７５ｗ／ｖ％の量で添加、溶解する。本態様の一実施形態において、生分解性ゲル化剤はコラーゲンであり、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液に０．７５ｗ／ｖ％の量で添加、溶解する。
　本態様においてフィブリノーゲン溶液は、フィブリノーゲンを５～１５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２０～１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｍｇ／ｍＬの量で含む。トロンビンはフィブリノーゲン溶液がゲル化（固化）するのに十分な量で作用させればよく、例えば、フィブリノーゲン１ｍｇに対して０．５～５Ｕ、好ましくは１～４Ｕ、より好ましくは１．５～３．５Ｕとなる量にて作用させる。トロンビンは任意の形態でフィブリノーゲンに作用させることができ、フィブリノーゲン溶液に直接添加することによって、あらかじめ適当な溶媒（例えば、水、生理食塩水等）に溶解してトロンビン溶液とした後に、フィブリノーゲン溶液に添加することによって、下記に詳述する「基材」にトロンビンを含ませておくことによって、あるいはそれらの複数の組み合わせによって作用させることができる。基材がトロンビンを含む場合には、基材にフィブリノーゲン溶液を塗布することによって、フィブリノーゲンとトロンビンと合わせることができる。
　細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液を、所望のサイズと厚みを有するシート状に成型する手段は、任意の手段を用いることができ、例えば、当該フィブリンゲル溶液の適当な基材への塗布、ポリマーシートの製造分野において従来公知の任意の成形手段（例えば、型枠成形、押出成形、カレンダ成形インフレ－ション成形等）の一又は複数の組み合わせにより行うことができ、好ましくは適当な基材への塗布により行う。本態様においては、懸濁された細胞の均一な分散を維持することを可能とするものであり、細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液を一度に注入する場合だけでなく、連続的に注入する（注入開始から終了までを時間をかけて行う）場合においても、細胞が均一に分散したシート状に成形することを容易に実施することができる。
　「基材」はその表面にてシートを形成することを可能とする平面を有するものであればよく、特に限定されるものではないが、好ましくは上述の支持体を基材として利用することができる。基材への細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液の塗布は任意の手段により行うことができ、例えば、注入、ヘラ、コテ、スプレー、バイオプリンタ（２Ｄもしくは３Ｄプリンタ）等の一又は複数を用いて、手動により及び／又は機械を用いて行うことができ、好ましくはバイオプリンタを用いて機械的に行う。
　本発明に方法により製造された本発明のフィブリンゲルシートは、細胞培養用培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＣＭＲＬ培地等（これらに限定はされない）や緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）等（これらに限定はされない）や等張液、例えば生理食塩水等（これらに限定はされない）中にて使用まで保存することができる。
４．本発明のフィブリンゲルシートの用途
　本発明のフィブリンゲルシートは、分散され内包される上述の細胞に応じて、例えば、表皮、神経、脳、脊髄、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲状腺、膵臓、肝臓、筋肉、骨格、心臓、血管、脾臓、腎臓、血液等（これらに限定はされない）の器官や組織を構成する細胞やその前駆細胞と同等又は類似する機能を有し、それら器官や組織の機能を増強又は維持するために、あるいは、疾患や障害等の原因により低減又は消失したそれら器官や組織の機能を補助又は補充するための細胞治療方法において利用することができ、それを必要とする患者に移植するために用いられる。
　本発明の一実施形態として、本発明のフィブリンゲルシートが多能性幹細胞由来のｉＰＩＣを含む場合、本発明のフィブリンゲルシートはｉＰＩＣの分泌するインスリンやグルカゴンの働きにより移植された患者における血糖値（グルコース）のレベルを改善及び／又は維持することができ、血糖値を正常値にコントロールすることができる。したがって、ｉＰＩＣを含む本発明のフィブリンゲルシートは、血糖値のレベルを改善及び／又は維持することが必要とされる疾患、障害、又は症状を治療又は予防するために用いることができる。このような疾患、障害、又は症状としては、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、空腹時及び食後グルコースレベルの変調、低血糖症（例えば、糖尿病患者におけるインスリン投与による低血糖症）等が挙げられるが、これらに限定はされない。なお、「治療」とは、疾患、障害、又は症状の治療、治癒、防止もしくは、寛解の改善、又は、疾患、障害、又は症状の進行速度の低減を意味する。また、「予防」とは、疾患、障害、又は症状の発症の可能性、危険性を低下させる、又は疾患、障害、又は症状の発症を遅らせることを意味する。
　本発明のフィブリンゲルシートの移植対象は、細胞治療のためにそれを必要とする患者であり、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト等の哺乳動物（これらに限定はされない）が挙げられ、好ましくは大型の哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。
　本発明のフィブリンゲルシートは、移植されるとフィブリンゲルが速やかに分解され、内包される細胞はホストの組織と速やかに接することができ、酸素、栄養等を受けることができる。このため、本発明のフィブリンゲルシートは、血管が乏しい組織（例えば皮下等）へ移植することも可能であり、また、移植に際して事前の血管新生処置は行わなくてもよく、必須ではない。
　本発明のフィブリンゲルシートは、患者の症状や移植部位の大きさに応じて、一又は複数のシートを移植することが可能であり、また、本発明のフィブリンゲルシートはその厚みの薄さから、必要に応じて、複数のシートを積層して移植してもよい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
・ｉＰＩＣの製造
　ｉＰＩＣは、上記工程１）－６）、既報（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７；Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、ヒトｉＰＳ細胞（Ｆｆ－Ｉ１４－ｓ０４株）から分化誘導して調製した。
　すなわち、ヒトｉＰＳ細胞より分化誘導して調製した膵前駆細胞を分化因子（ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、Ｔ３、ＬＤＮ、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ２）と共に、ＡＬＫ５ｉＩＩ（１０μＭ）を含む分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地）で２日間培養して内分泌前駆細胞に分化誘導した。
　次いで、分化因子（Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、ＦＧＦ受容体１阻害剤ＰＤ－１６６８６６）と共に、ＡＬＫ５ｉＩＩ（１０μＭ）含む分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地）で７日間培養後、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－アセチルシステイン、ＡＸＬ阻害剤Ｒ４２８、アスコルビン酸、ＲＯＣＫ阻害剤、ＺｎＳＯ4、ヘパリン、Ｔｒｏｌｏｘと共に、ＡＬＫ５ｉＩＩ（１０μＭ）を含む分化誘導培地（ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地）で４日間培養してｉＰＩＣに分化誘導した。
　得られたｉＰＩＣは、５００個程度の細胞が凝集した凝集塊（スフェロイド）（直径約１５０μｍ）の形態を有した。
実施例１　移植形状の評価
＜方法＞
・フィブリンゲル塊の作製
　ｉＰＩＣ　３ｘ１０6ｃｅｌｌｓ（凝集塊にして約６０００個）を１．５ｍＬチューブに分取し遠心分離した後、培地上清を除去し、フィブリノーゲン溶液（８０ｍｇ／ｍＬ）２５μＬを添加し懸濁した。さらにトロンビン溶液（１２５Ｕ／ｍＬ）２５μＬを添加し５分間静置しゲル化させ、ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲル塊（直径約５ｍｍ）を作製した。
・フィブリンゲルシートの作製
　ｉＰＩＣ　３ｘ１０6ｃｅｌｌｓを１．５ｍＬチューブに分取し遠心分離した後、培地上清を除去し、フィブリノーゲン溶液（８０ｍｇ／ｍＬ）２５μＬを添加し懸濁した。トロンビン溶液（１２５Ｕ／ｍＬ）１２．５μＬを含侵させたポリエステル製メッシュ（開口率６９％、１０ｘ１０ｍｍ）の上にｉＰＩＣを懸濁したフィブリノーゲン溶液を薄く塗布した後、トロンビン溶液２５μＬを全体に塗布し５分間静置しゲル化させ、ｉＰＩＣを内包した薄層のフィブリンゲルシートを作製した。
・Ｉｎ　ｖｉｖｏ評価
　麻酔下にてヌードラットの皮下に、ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲル塊、ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルシートを移植した。移植後、尾静脈より採血し血漿を分取し、ＥＬＩＳＡ法にてヒトｃ－ペプチド濃度を測定した。
＜結果＞
　図１にフィブリンゲル塊とフィブリンゲルシートの外観を示す。いずれもｉＰＩＣがゲル内に保持されており、細胞の漏出は認められなかった。
　図２に、ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲル塊、又はｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルシートが皮下に移植されたヌードラットの血中ヒトｃ－ペプチド濃度の経時的測定結果を、また、図３に移植１０日後と６週後における各移植部位の組織学的解析結果を示す。
　図２の結果は、血中ヒトｃ－ペプチド濃度は、ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルを塊状で移植するよりもシート状で移植した方が高い値を示した。
　また、図３に示す移植１０日後の組織学的解析結果から、塊状では周辺部分のフィブリンゲルのみが分解され、その部分のｉＰＩＣはホスト組織と接しているが、大部分のフィブリンゲルは残存しており、ホスト組織と接していないｉＰＩＣがその中に認められた。一方、シート状ではほぼすべてのフィブリンゲルが速やかに分解されており移植されたｉＰＩＣがホスト組織と接していた。
　移植６週後では、塊状で移植してもすべてのゲルが分解されていたが、血中ヒトｃ－ペプチド濃度はシート状で移植した方が高い値を示した。従って、生分解性素材のゲルを用いた場合であっても、移植初期に速やかにゲルが分解され、移植細胞がホストと接し酸素、栄養等が供給されることが移植細胞の生存には重要であり、その後の長期的な薬効にも影響することが示唆され、薄層のシート状で移植することの有用性が示された。
実施例２　大動物・ヒトサイズフィブリンゲルシートの作製（製造方法１＿冷却した金属製の型を使用した方法）
＜方法＞
・ゲル化時間の評価
　フィブリノーゲン溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）とトロンビン溶液（３１Ｕ／ｍＬ，１５．６Ｕ／ｍＬ，１０．４Ｕ／ｍＬ，５．２Ｕ／ｍＬ，３．１Ｕ／ｍＬ）を調製し、１．５ｍＬチューブ内でそれぞれ４４０μＬずつ合わせ、１～２回ピペッティングして混合した後、ゲル化の状態を以下の基準で評価して、トロンビン濃度とゲル化時間の関係を解析した。
　　ゲル化状態の評価基準：
　　　〇：チューブ内でピペッティング操作が可能
　　　△：ピペッティング操作が可能であるが、部分的にゲル化している
　　　×：全体的にゲル化して、ピペッティング操作を行うことができない
・大動物・ヒトサイズフィブリンゲルシートの作製
　ｉＰＩＣ　４５ｘ１０6ｃｅｌｌｓを１５ｍＬチューブに分取し遠心分離した後、培地上清を除去し、フィブリノーゲン溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）３６０μＬを添加し懸濁した。その後、トロンビン溶液（１５．６Ｕ／ｍＬ）３６０μＬを添加し懸濁した後、予め４℃に冷却した金属製の型（４０ｘ６０ｘ０．４ｍｍ）に素早く広げ、さらにポリエステル製メッシュ（開口率６９％、サイズ４０ｘ１０ｍｍ）をのせ、室温で６分間静置しゲル化させた。
＜結果＞
　トロンビン濃度とゲル化時間の関係を解析した結果、トロンビン濃度が低下するに従って、ゲル化時間が遅延し、１５．６Ｕ／ｍＬ以下の濃度であれば、４０ｘ６０ｘ０．４ｍｍの大きさのフィブリンゲルシートを成型するのに必要な時間が確保できることが示された（図４）。
　フィブリノーゲン溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）とトロンビン溶液（１５．６Ｕ／ｍＬ）を冷却した金属製の型に素早く広げることによって、大動物・ヒトに利用可能な４０ｘ６０ｘ０．４ｍｍのサイズのフィブリンゲルシートを作製することができた（図５）。さらに、得られたフィブリンゲルシートを位相差顕微鏡にて確認した結果、内包したｉＰＩＣがいずれの位置においても均一に分散していることが確認できた（図５（Ｂ）においてｉＰＩＣは黒色の粒状に観察される）。
実施例３　大動物・ヒトサイズフィブリンゲルシートの作製（製造方法２－１＿フィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシート）
＜方法＞
・細胞分散性保持の確認
　ゼラチンを２ｗ／ｖ％となるように生理食塩水を用いて溶解し、４℃冷蔵庫内にて冷却しゲル化させた後、ゼラチンゲルを目開き２００μｍのメッシュに通すことにより、約２００μｍのゼラチンゲルのマイクロスフェア（以下、「ゼラチンマイクロスフェア」と記載する）を作製した。ゼラチンマイクロスフェアを２０ｗ／ｖ％となるようにフィブリノーゲン溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）に懸濁し、フィブリノーゲン＋ゼラチンマイクロスフェア溶液を調製した。ｉＰＩＣをフィブリノーゲン溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）およびフィブリノーゲン＋ゼラチンマイクロスフェア溶液に懸濁したのち静置し、沈殿の形成の有無により、細胞の分散状態の保持を評価した。
・ｉｎ　ｖｉｖｏ試験
　ｉＰＩＣ　３ｘ１０6ｃｅｌｌｓを１．５ｍＬチューブに分取し遠心分離した後、培地上清を除去し、上記のとおり調製したフィブリノーゲン＋ゼラチンマイクロスフェア溶液２５μＬを添加し懸濁した。トロンビン溶液（６２．５Ｕ／ｍＬ）１２．５μＬを含侵させたポリエステル製メッシュ（開口率６９％、サイズ１０ｘ１０ｍｍ）の上にｉＰＩＣを懸濁したフィブリノーゲン＋ゼラチンマイクロスフェア溶液を薄く塗布した後、トロンビン溶液２５μＬを全体に塗布し５分間静置してゲル化させ、ｉＰＩＣを内包した薄層のフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートを作製した。
　麻酔下にてヌードラットの皮下に、実施例１に記載のｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルシート、および上記ｉＰＩＣを内包したフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートを移植した。移植後、尾静脈より採血し血漿を分取し、ＥＬＩＳＡ法にてヒトｃ－ペプチド濃度を測定した。
・大動物・ヒトサイズの作製
　ｉＰＩＣ　７５ｘ１０6ｃｅｌｌｓを１５ｍＬチューブに分取し遠心分離した後、培地上清を除去し、フィブリノーゲン＋ゼラチンマイクロスフェア溶液６００μＬを添加し懸濁した。トロンビン溶液（６２．５Ｕ／ｍＬ）３００μＬを含侵させたポリエステル製メッシュ（開口率６９％、サイズ４０ｘ６０ｍｍ）及びグリコール酸／乳酸ポリエステル（９０／１０、ポリ（グリコリド－ｃｏ－Ｌ－ラクチド）、サイズ４０ｘ６０ｍｍ）メッシュの上にｉＰＩＣを懸濁したフィブリノーゲン＋ゼラチンマイクロスフェア溶液をピペット又は３Ｄプリンターを用いてそれぞれ薄く塗布した後、トロンビン溶液６００μＬを全体に塗布し５分間静置しゲル化させ、ｉＰＩＣを内包した薄層のフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートを作製した。
＜結果＞
　図６にフィブリノーゲン溶液およびフィブリノーゲン＋ゼラチンマイクロスフェア溶液に懸濁し静置したｉＰＩＣの状態を示す。フィブリノーゲン溶液（図６（Ａ））では静置１０分後にはｉＰＩＣの沈殿が認められた（矢頭）。一方、フィブリノーゲン＋ゼラチンマイクロスフェア溶液（図６（Ｂ））では静置３０分後でもｉＰＩＣの分散状態が維持されていた。
　また、製造されたｉＰＩＣを内包した薄層のフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートにおいて、ｉＰＩＣはゲルシート内に保持されており、細胞の漏出は認められなかった。
　図７に、ｉＰＩＣを内包したフィブリンゲルシート、又はｉＰＩＣを内包したフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートが皮下に移植されたヌードラットの血中ヒトｃ－ペプチド濃度の経時的測定結果を示す。当該フィブリンゲルシートとフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートで血中ヒトｃ－ペプチド量に有意差は認められず、シート中にゼラチンマイクロスフェアを用いても、ｉＰＩＣのヒトｃ－ペプチド分泌に負の影響を与えないことが示された。
　図８にピペット注入による手作業と３Ｄプリンターを用いて作製した大動物・ヒトサイズのｉＰＩＣを内包したフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートを示す。いずれの方法でも大動物・ヒトサイズの当該フィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートを作製することが可能であり、ｉＰＩＣがゲル内に保持され細胞の漏出は認められなかった（図８（Ａ））。
　ピペット注入による手作業と３Ｄプリンターを用いて作製した大動物・ヒトサイズのｉＰＩＣを内包したフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートの輝度分布を画像解析し標準偏差を算出した結果、それぞれ１９．４３７と１５．６３０であった（図８（Ｂ））。この結果は、３Ｄプリンターを用いて作製した方が、より均一にフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルを塗布できることが示された。さらに、３Ｄプリンターを用いて作製した当該フィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートにおける任意の４か所を直径１２ｍｍの円形にくり抜き、そこに内包される細胞数を測定したところ、ほぼ同程度の細胞数であることが確認された（図８（Ｃ））。この結果は、３Ｄプリンターを用いることにより、均一に細胞が分布して内包されるフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートを作製可能であることが示された。
実施例４　大動物・ヒトサイズフィブリンゲルシートの作製（製造方法２－２＿フィブリン＋コラーゲンゲルシート）
＜方法＞
・細胞分散性保持の確認
　フィブリノーゲン溶液（８０ｍｇ／ｍＬ）とコラーゲン溶液（３ｗ／ｖ％）を３：１の比率で混合し、フィブリノーゲン＋コラーゲン溶液を調製した。ｉＰＩＣをフィブリノーゲン＋コラーゲン溶液中に懸濁した後、シリンジ内に充填した。シリンジを、筒先を下にして垂直に保持し、静置０、１０、２０、３０分後に排出液の一定量を分取し細胞数（濃度）を計測することによって、フィブリノーゲン＋コラーゲン溶液の細胞分散性保持機能を評価した。
・Ｉｎ　ｖｉｖｏ試験
　フィブリノーゲン溶液（８０ｍｇ／ｍＬ）とコラーゲン溶液（３ｗ／ｖ％）を３：１の比率で混合し、フィブリノーゲン＋コラーゲン溶液を調製した。ｉＰＩＣ　３ｘ１０6ｃｅｌｌｓを１．５ｍＬチューブに分取し遠心分離した後、培地上清を除去し、フィブリノーゲン＋コラーゲン溶液２５μＬを添加し懸濁した。トロンビン溶液（１２５Ｕ／ｍＬ）１２．５μＬを含侵させたグリコール酸／乳酸ポリエステル（９０／１０、ポリ（グリコリド－ｃｏ－Ｌ－ラクチド））メッシュの上にｉＰＩＣを懸濁したフィブリノーゲン＋コラーゲン溶液を薄く塗布した後、トロンビン溶液２５μＬを全体に塗布し５分間静置しゲル化させ、ｉＰＩＣを内包した薄層のフィブリン＋コラーゲンゲルシートを作製した。
　麻酔下にてヌードラットの皮下に、実施例３の「ｉｎ　ｖｉｖｏ試験」に記載のｉＰＩＣを内包したフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシート、および上記ｉＰＩＣを内包したフィブリン＋コラーゲンゲルシートを移植した。移植後、尾静脈より採血し血漿を分取し、ＥＬＩＳＡ法にてヒトｃ－ペプチド濃度を測定した。
・大動物・ヒトサイズの作製
　ｉＰＩＣ　７５ｘ１０6ｃｅｌｌｓを１５ｍＬチューブに分取し遠心分離した後、培地上清を除去し、フィブリノーゲン＋コラーゲン溶液６００μＬを添加し懸濁した。トロンビン溶液（１２５Ｕ／ｍＬ）３００μＬを含侵させたポリ（グリコリド－ｃｏ－Ｌ－ラクチド）、サイズ４０ｘ６０ｍｍ）メッシュの上にｉＰＩＣを懸濁したフィブリノーゲン＋コラーゲン溶液を３Ｄプリンターを用いて薄く塗布した後、トロンビン溶液６００μＬを全体に塗布し５分間静置しゲル化させ、ｉＰＩＣを内包した薄層のフィブリン＋コラーゲンゲルシートを作製した。
＜結果＞
　図９にシリンジから排出されたフィブリノーゲン＋コラーゲン溶液中の細胞数（濃度）の計測結果を示した。排出液中の細胞濃度は静置時間にかかわらずほぼ一定であり、シリンジを垂直に保持したにもかかわらずｉＰＩＣが沈殿することなく、ほぼ一定数の細胞数が排出されたことが示された。従って、フィブリノーゲン＋コラーゲン溶液を用いることにより、細胞の分散状態を維持できることが示された。
　また、製造されたｉＰＩＣを内包した薄層のフィブリノーゲン＋コラーゲンシートにおいて、ｉＰＩＣはゲルシート内に保持されており、細胞の漏出は認められなかった。
　図１０に、ｉＰＩＣを内包したフィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシート、又はｉＰＩＣを内包したフィブリン＋コラーゲンゲルシートが皮下に移植されたヌードラットの血中ヒトｃ－ペプチド濃度の経時的測定結果を示す。当該フィブリン＋ゼラチンマイクロスフェアゲルシートとフィブリン＋コラーゲンゲルシートで血中ヒトｃ－ペプチド量に有意差は認められず、両者は同等の性能を有することが示された。
　３Ｄプリンターを用いて大動物・ヒトサイズの当該フィブリン＋コラーゲンシートを作製することが可能であり、ｉＰＩＣがゲル内に保持され細胞の漏出は認められなかった。作製した大動物・ヒトサイズの当該フィブリン＋コラーゲンゲルシートにおける任意の６か所を直径１２ｍｍの円形にくり抜き、そこに内包される細胞数を測定したところ、ほぼ同程度の細胞数であることが確認された（図１１）。この結果は、フィブリノーゲン＋コラーゲン溶液を用いてｉＰＩＣを懸濁し、３Ｄプリンターを用いて塗布することにより、均一に細胞が分布して内包されるフィブリン＋コラーゲンゲルシートが作製可能であることが示された。


 

Claims (15)

  1. 　細胞がフィブリンゲルシートに均一に分散され内包されてなり、
    　該フィブリンゲルシートがさらに、０．２～２ｗ／ｖ％の量のコラーゲン、及び／又は１０～３０ｗ／ｖ％の量の１００μｍ～１０００μｍを通過できるゼラチンゲル粒子を含む、
    細胞移植用のフィブリンゲルシート。
  2. 　一面の表面積が２．２５ｃｍ２以上のサイズを有し、１ｍｍ以下の厚さを有する、請求項１に記載のフィブリンゲルシート。
  3. 　前記細胞が１．５×１０６個超／ｃｍ２の量で内包される、請求項１に記載のフィブリンゲルシート。
  4. 　前記細胞がスフェロイドの形態である、請求項１に記載のフィブリンゲルシート。
  5. 　前記細胞がｉＰＳ細胞由来膵島細胞である、請求項１に記載のフィブリンゲルシート。
  6. 　支持体をさらに備える、請求項１に記載のフィブリンゲルシート。
  7. 　細胞がフィブリンゲルシートに均一に分散され内包されてなる細胞移植用のフィブリンゲルシートの製造方法であって、
    　該細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液をトロンビンと作用させて、シート状に成型してゲル化させる工程、を含み、
    　該細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液がさらに、０．２～２ｗ／ｖ％の量のコラーゲン、及び／又は１０～３０ｗ／ｖ％の量の１００μｍ～１０００μｍを通過できるゼラチンゲル粒子を含む、製造方法。
  8. 　前記ゲル化させる工程が、前記細胞が懸濁されたフィブリノーゲン溶液をトロンビンと作用させて、一面の表面積が２．２５ｃｍ２以上のサイズを有し、１ｍｍ以下の厚さを有するシート状に成型してゲル化させる、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記細胞が、フィブリンゲルシートにおいて１．５×１０６個超／ｃｍ２となる量にて、フィブリノーゲン溶液に懸濁される、請求項７に記載の製造方法。
  10. 　前記細胞がスフェロイドの形態である、請求項７に記載の製造方法。
  11. 　前記細胞がｉＰＳ細胞由来膵島細胞である、請求項７に記載の製造方法。
  12. 　支持体上に塗布することによりシート状に成型する、請求項７に記載の製造方法。
  13. 　バイオプリントにより支持体上に塗布する、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　支持体がトロンビンを含む、請求項１２に記載の製造方法。
  15. 　請求項１に記載のフィブリンゲルシートが複数積層されてなる、細胞移植用のフィブリンゲルシートの積層体。

     
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