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TW202136515A - 用於治療韓特氏病之腺相關病毒載體 - Google Patents

用於治療韓特氏病之腺相關病毒載體 Download PDF

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TW202136515A TW109143730A TW109143730A TW202136515A TW 202136515 A TW202136515 A TW 202136515A TW 109143730 A TW109143730 A TW 109143730A TW 109143730 A TW109143730 A TW 109143730A TW 202136515 A TW202136515 A TW 202136515A
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Abstract

本揭露尤其提供一種重組腺相關病毒(rAAV)載體，其包含AAV8或AAV9殼體及經密碼子最佳化之編碼人類艾杜糖-2硫酸酯酶(I2S)之序列。本揭露亦提供一種治療患有韓特氏症候群(MPS II)之個體之方法，其包含向該有需要之個體投與重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體包含AAV8或AAV9殼體及可操作地連接至編碼艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之核酸序列之啟動子，且其中投與導致該個體之I2S酶活性之增加。

Description

用於治療韓特氏病之腺相關病毒載體
韓特氏症候群(Hunter syndrome)，亦稱為第II型黏多醣病，為由缺乏或不存在艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase；I2S)造成之胞溶體貯積病。艾杜糖-2-硫酸酯酶參與特定黏多醣(亦稱為醣胺聚醣或GAG)之分解及再循環。因此，在韓特氏症候群中，GAG在整個身體的細胞中堆積，其繼而干擾體內各種細胞和器官之正常功能，導致許多嚴重的症狀。在韓特氏症候群之許多病例中，受影響之個體之神經元及腦膜中有大量GAG堆積，導致各種形式的中樞神經系統(CNS)症狀、認知表現受損及發展遲緩。
在韓特氏症候群之管理中已使用了各種治療選擇，包括酶替代療法(ERT)。經批准之治療性ERT治療包括靜脈內投與重組I2S酶。然而，靜脈內投與之I2S酶具有各種局限，包括向CNS之細胞及組織中之分佈不良以及向深部體組織諸如心臟、肺及骨中之分佈不良。韓特氏症候群之治療仍為一項挑戰。
使用在體內產生治療性蛋白的載體對於疾病治療而言為合乎需要的，但受限於各種因素，包括在體內所要治療性蛋白之產生不佳。
本發明提供了有效且穩健的編碼I2S (在本申請案通篇，指代為I2S或IDS)的重組腺相關病毒(rAAV)載體。本發明部分基於以下令人驚訝的發現，亦即包含I2S序列之經最佳化之rAAV載體導致體內穩健的I2S表現。
在一些態樣中，本發明提供了一種重組腺相關病毒(rAAV)載體，其包含AAV8殼體及編碼人類艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種重組腺相關病毒(rAAV)載體，其包含AAV9殼體及編碼人類艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之序列。
在一些實施例中，rAAV編碼經密碼子最佳化之人類I2S酶。在一些實施例中，經密碼子最佳化之人類I2S具有選自SEQ ID NO: 11或12之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼人類I2S酶之序列包含與SEQ ID NO:6具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的序列。在一些實施例中，人類I2S酶由與SEQ ID NO: 6具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的核苷酸序列編碼。在一些實施例中，人類I2S酶由核苷酸序列SEQ ID NO: 6編碼。
在一些實施例中，人類I2S酶之胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 1相同的序列。在一些實施例中，人類I2S酶之胺基酸序列為與SEQ ID NO: 1相同的序列。
在一些實施例中，人類I2S酶之胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 2具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的序列。
在一些實施例中，編碼人類I2S酶之序列包含與SEQ ID NO: 2相同的序列。在一些實施例中，人類I2S酶之胺基酸序列為與SEQ ID NO: 2相同的序列。
在一些實施例中，經密碼子最佳化之編碼人類I2S酶之序列包含與SEQ ID NO: 11或12具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的序列。在一些實施例中，經密碼子最佳化之編碼人類I2S酶之序列包含與SEQ ID NO: 11或12相同的序列。
在一些實施例中，載體進一步包含肝特異性啟動子。
在一些實施例中，肝特異性啟動子為運甲狀腺素蛋白(transthyretin)啟動子(TTR)。
在一些實施例中，載體進一步包含5’及3’反向末端重複序列(ITR)、I2S序列上游的內含子及順式作用調控模組(CRM)。
在一些實施例中，載體進一步包含遍在啟動子。
在一些實施例中，載體進一步包含5’及3’反向末端重複序列、I2S序列上游的內含子及順式作用調控模組(CRM)。
在一些實施例中，rAAV載體包含硫酸酯酶修飾因子1 (SUMF1)。
在一些實施例中，SUMF1在內部核糖體進入位點(IRES)之後。
在一些實施例中，載體進一步包含WPRE序列。在一些實施例中，WPRE序列為變異體WPRE序列或經最佳化之WPRE序列。在一些實施例中，WPRE序列由與SEQ ID NO: 7具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的核苷酸序列編碼。在一些實施例中，WPRE序列由具有SEQ ID NO: 7之核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，內含子為小鼠微小病毒(minute virus of mice；MVM)或SV40內含子。在一些實施例中，內含子為β-球蛋白/IgG嵌合內含子。
在一些實施例中，CRM為肝特異性CRM。
在一些實施例中，CRM為神經元特異性CRM。在一些實施例中，CRM為肌肉特異性CRM。
在一些實施例中，CRM為CRM8。
在一些實施例中，載體包含至少三個CRM。
在一些態樣中，本發明提供了一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV8殼體及rAAV載體，該載體包含：a) 5’反向末端重複序列(ITR)；b)順式作用調控模組(CRM)；c)肝特異性啟動子；d)小鼠微小病毒(MVM)；e)編碼人類艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的序列；f)土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)；及g) 3’ ITR。
在一些實施例中，編碼人類I2S酶之序列為野生型序列或經密碼子最佳化之序列。
在一些實施例中，編碼人類I2S酶的核苷酸序列為與SEQ ID NO: 6具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的序列。在一些實施例中，編碼人類I2S的核苷酸序列與SEQ ID NO 6相同。在一些實施例中，編碼人類I2S酶的核苷酸序列為與SEQ ID NO: 11或12具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的序列。在一些實施例中，編碼人類I2S酶的核苷酸序列為與SEQ ID NO: 11或12相同的序列。
在一些實施例中，包含編碼硫酸酯酶修飾因子1 (SUMF1)及內部核糖體進入位點(IRES)的序列。
在一些態樣中，本發明提供了一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV9殼體及rAAV載體，該載體包含：a) 5’反向末端重複序列(ITR)；b)順式作用調控模組(CRM)；c)遍在啟動子；d)小鼠微小病毒(MVM)；e)編碼人類艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的序列；f)土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)；及g) 3’ ITR。
在一些實施例中，編碼人類I2S酶之序列為野生型序列或經密碼子最佳化之序列。
在一些實施例中，包含編碼硫酸酯酶修飾因子1 (SUMF1)及內部核糖體進入位點(IRES)的序列。
在一些實施例中，rAAV載體不包含ApoB。
一種治療患有韓特氏症候群(MPS II)之個體之方法，其包含向該有需要之個體投與前述請求項中任一項之rAAV。
一種治療患有韓特氏症候群(MPS II)之個體之方法，其包含向該有需要之個體投與重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體包含AAV8或AAV9殼體及可操作地連接至編碼艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之核酸序列之啟動子，且其中投與導致該個體之I2S酶活性之增加。
在一些實施例中，在個體血清中偵測到I2S活性之增加。
在一些實施例中，在個體肝中偵測到I2S活性之增加。
在一些實施例中，在中樞神經系統(CNS)中偵測到I2S活性。
在一些實施例中，在個體腦中偵測到I2S活性之增加。
在一些實施例中，在腦之海馬迴、丘腦、胼胝體、皮質、小腦或紋狀體中偵測到I2S活性之增加。
在一些實施例中，在個體腎等中偵測到I2S活性之增加。在一些實施例中，在個體心臟中偵測到I2S活性之增加。在一些實施例中，在個體肺中偵測到I2S活性之增加。在一些實施例中，在個體骨髓中偵測到I2S活性之增加。在一些實施例中，在個體腎中偵測到I2S活性之增加。
在一些實施例中，在單次投與之後，I2S活性之增加維持至少30、60、90、120、150、180天或更長時間。
在一些實施例中，藉由硫酸肝素檢定量測I2S活性水準。
在一些實施例中，藉由硫酸皮膚素檢定量測I2S活性水準。
在一些實施例中，投與AAV降低了個體之醣胺聚醣(GAG)水準。
在一些實施例中，投與AAV降低個體血清中之GAG水準。
在一些實施例中，投與AAV降低了個體肝中之GAG水準。
在一些實施例中，投與AAV降低了個體腎等中之GAG水準。在一些實施例中，投與AAV降低了個體心臟中之GAG水準。在一些實施例中，投與AAV降低了個體肺中之GAG水準。在一些實施例中，投與AAV降低了個體骨髓中之GAG水準。在一些實施例中，投與AAV降低了個體腎中之GAG水準。
在一些實施例中，投與AAV降低了個體CNS中之GAG水準。
在一些實施例中，投與AAV降低了個體腦中之GAG水準。
在一些實施例中，投與AAV降低腦之海馬迴、丘腦、胼胝體、皮質、小腦或紋狀體中之GAG水準。
在一些實施例中，靜脈內投與AAV。
在一些實施例中，鞘內投與AAV。
在一些實施例中，以約5×109 vg之劑量投與AAV。
在一些實施例中，rAAV之投與不引起免疫反應。
以下各節中詳細描述了本發明之各種態樣。各節之使用不意謂限制本發明。各節均可應用於本發明之任一態樣。在本申請案中，除非另外說明，否則使用「或」意謂「及/或」。除非上下文另外明確說明，否則如本文所用，單數形式「一個」、「一種」及「該」包括單數及複數個指示物。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2019年12月10日申請之美國序列第62/945,920號之權益及優先權，該案之內容以引用之方式併入本文。定義
腺相關病毒 (AAV) ：如本文所用，術語「腺相關病毒」或「AAV」或重組AAV (「rAAV」)包括但不限於1型AAV、2型AAV、3型AAV (包括3A及3B型)、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、鳥類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV及綿羊AAV (參見 例如Fields等人, Virology, 第2卷, 第69章 (第4版, Lippincott-Raven Publishers)；Gao等人, J. Virology 78:6381-6388 (2004)；Mori等人, Virology 330:375-383 (2004))。通常，AAV可感染分裂細胞及非分裂細胞，且可以染色體外狀態存在，而無需整合至宿主細胞基因體中。AAV載體通常用於基因療法。
投與 ：如本文所用，術語「投與」或「引入」在藉由導致rAAV載體之有效遞送的方法或途徑將編碼I2S之rAAV載體遞送至個體中的語境中可互換使用。用於投與rAAV載體之各種方法為此項技術中已知的，包括例如靜脈內、皮下或經皮。可藉由使用「基因槍」或生物彈粒子(biolistic particle)遞送系統進行rAAV載體之經皮投與。在一些實施例中，rAAV載體、及/或轉基因表現盒、及/或經最佳化之IDS 轉基因序列、及/或基因表現盒之任何組成物係經由非病毒化學粒子諸如脂質奈米粒子、非病毒生物分子諸如胞外體及/或細胞外囊泡投與的。
動物： 如本文所用，術語「動物」係指動物界的任何成員。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發展階段的人類。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發展階段的非人類動物。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物(例如 ，嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物及/或豬)。在一些實施例中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥、爬蟲類、兩棲類、魚、昆蟲及/或蠕蟲。在一些實施例中，動物可為基因轉殖動物、基因工程改造之動物及/或殖株。
公認的免疫球蛋白多肽包括κ及λ輕鏈以及α、γ (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε及μ重鏈或其他物種之等同物。全長免疫球蛋白「輕鏈」(約25 kDa或約214個胺基酸)在NH2末端包含約110個胺基酸的可變區且在COOH末端包含κ或λ恆定區。全長免疫球蛋白「重鏈」(約50 kDa或約446個胺基酸)類似地包含可變區(約116個胺基酸)及前述重鏈恆定區之一，例如，γ (約330個胺基酸)。
大約或約： 如本文所用，如應用於一或多個感興趣的值的術語「大約」或「約」係指與所述參考值類似的值。在某些實施例中，除非另外說明或另外從上下文顯而易見，否則術語「大約」或「約」係指落入在所說明之參考值之任一方向(大於或小於)上25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的範圍內的值的範圍(除了這個數超過可能值的100%的情況下)。
生物活性 ：如本文所用，片語「生物活性」係指在生物系統中、特別是在生物體中具有活性的任何劑之特徵。例如，當向生物體投與時，劑對該生物體具有生物學作用，被認為具有生物活性。在特定實施例中，在肽具有生物活性的情況下，該肽之共享該肽的至少一種生物活性的部分通常被稱為「生物活性」部分。
功能等同物或衍生物 ：如本文所用，術語「功能等同物」或「功能衍生物」在胺基酸序列之功能衍生物之語境中表示保留與原始序列實質上類似的生物活性(功能或結構)的分子。功能衍生物或等同物可為天然衍生物或以合成方式經製備。示範性功能衍生物包括具有一或多個胺基酸之取代、缺失或添加的胺基酸序列，條件為蛋白之生物學活性為保守的。合乎需要的是，取代胺基酸具有與經取代之胺基酸類似的化學-物理性質。合乎需要的類似化學-物理性質包括電荷之類似性、蓬鬆度，疏水性、親水性及其類似者。
體外 ：如本文所用，術語「體外 」係指在人工環境中發生的事件，例如 在試管或反應容器中、在細胞培養物中等 ，而不是在多細胞生物體內。
體內 ：如本文所用，術語「體內 」係指在多細胞生物體諸如人類及非人類動物內發生的事件。在基於細胞之系統的語境中，該術語可用於指代在活細胞內發生的事件(與例如體外 系統相反)。
IRES ：如本文所用，術語「IRES」係指任何合適的內部核糖體進入位點序列。
經分離之 ：如本文所用，術語「經分離之」係指物質及/或實體(1)當初始產生(無論是在自然界中及/或在實驗環境中)時已與至少一些與其相關聯的組分分離，及/或(2)由人為產生、製備及/或製造。經分離之物質及/或實體可於至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、約99%、實質上100%或100%與其初始相關聯之其他組分分離。在一些實施例中，經分離之劑大於約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、實質上100%或100%純度。如本文所用，若物質實質上不含其他組分，則其為「純」的。如本文所用，術語「經分離之細胞」係指多細胞生物體中不包含的細胞。
多肽 ：如本文所用，術語「多肽」係指經由肽鍵連接在一起的胺基酸之順序鏈。該術語用於指任何長度的胺基酸鏈，但一般熟習此項技術者應理解，該術語不限於長鏈，且可指代包含經由肽鍵連接在一起的兩個胺基酸的最小鏈。如熟習此項技術者所已知，多肽可經加工及/或修飾。
蛋白 ：本文所用之術語「蛋白」係指一或多種起離散單元作用的多肽。若單一多肽為離散功能單元且不需要與其他多肽永久或暫時物理締合以形成離散功能單元，則術語「多肽」及「蛋白」可互換使用。若離散功能單元包含多於一種彼此物理結合的多肽，則術語「蛋白」係指多個物理上偶聯且一起起離散單元作用的多肽。
調控元件 ：如本文所用，術語「調控元件」係指能夠調控及/或控制基因轉錄的轉錄控制元件，特別是非編碼順式作用轉錄控制元件。調控元件包含至少一個轉錄因子結合位點，例如組織特異性轉錄因子之至少一個結合位點。在本文所述之實施例中，調控元件具有肝特異性轉錄因子之至少一個結合位點。通常，當與在沒有調控元件之情況下基因從單獨啟動子之轉錄相比，調控元件增加或增強啟動子驅動之基因表現。因此，調控元件特別地包括強化子序列，但是應理解，增強轉錄之調控元件不限於典型的遠側上游強化子序列，而是可在其調控之基因之任何距離處發生。如此項技術中所理解，調控轉錄之序列可位於體內調控之基因之上游(例如，在啟動子區中)或下游(例如，在3’UTR中)，且可緊鄰基因或在更遠處定位。調控元件可包含天然存在之序列、此類調控元件(之部分)之組合或調控元件之若干拷貝例如非天然存在之序列。因此，調控元件包括天然存在及經最佳化或工程改造之調控元件，以達成所要表現水準。
個體 ：如本文所用，術語「個體」係指人類或任何非人類動物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物)。人類包括產前和產後狀態。在許多實施例中，個體為人類。個體可為患者，其係指向醫療提供者呈現疾病之診斷或治療的人類。術語「個體」在本文中可與「個體(individual)」或「患者」互換使用。個體可受疾病或病症折磨或易患疾病或病症，但可顯示或可不顯示該疾病或病症之症狀。
實質上 ：如本文所用，術語「實質上」係指展現出感興趣之特徵或性質的全部或幾乎全部的程度或度之定性條件。一般熟習生物學技術者應理解，生物學及化學現象很少(如果有的話)進行完全及/或繼續進行至完全或達成或避免絕對結果。因此，術語「實質上」在本文用於捕捉許多生物學及化學現象中固有的完整性之潛在缺乏。
實質同源性 ：片語「實質同源性」在本文用於指代胺基酸或核酸序列之間的比較。如一般熟習此項技術者應理解，若兩個序列在對應位置含有同源殘基，則其一般被視為「實質上同源的」。同源殘基可為相同殘基。替代地，同源殘基可為具有適當類似的結構及/或功能特徵的不同殘基。例如，如一般熟習此項技術者所熟知，某些胺基酸通常被分類為「疏水性」或「親水性」胺基酸，及/或被分類為「極性」或「非極性」側鏈。一個胺基酸被同一類型的另一胺基酸取代可常常被視為「同源」取代。
如此項技術中所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種算法中之任一種來比較，包括可在商業電腦程式中使用的那些，諸如BLASTN (用於核苷酸序列)以及BLASTP、間隔BLAST及PSI-BLAST (用於胺基酸序列)。示範性此類程式描述於Altschul等人, basic local alignment search tool,J. Mol. Biol. , 215(3): 403-410, 1990；Altschul等人,Methods in Enzymology ；Altschul等人, 「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res . 25:3389-3402, 1997；Baxevanis等人,Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins , Wiley, 1998；以及Misener等人(編),Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, 第132卷), Humana Press, 1999。除鑑別同源序列之外，上文所提及之程式通常提供同源性程度之指示。在一些實施例中，若兩個序列之對應殘基之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多在相關的一段殘基內同源，則其被視為實質上同源。在一些實施例中，相關段為完整序列。在一些實施例中，相關段為至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多個殘基。
實質一致性 ：片語「實質一致性」在本文用於指代胺基酸或核酸序列之間的比較。如一般熟習此項技術者應理解，若兩個序列在對應位置含有相同殘基，則其一般被視為「實質上相同的」。如此項技術中所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種算法中之任一種來比較，包括可在商業電腦程式中使用的那些，諸如BLASTN (用於核苷酸序列)以及BLASTP、間隔BLAST及PSI-BLAST (用於胺基酸序列)。示範性此類程式描述於Altschul等人, Basic local alignment search tool,J. Mol. Biol. , 215(3): 403-410, 1990；Altschul等人,Methods in Enzymology ；Altschul等人,Nucleic Acids Res . 25:3389-3402, 1997；Baxevanis等人, Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998；以及Misener等人(編), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, 第132卷), Humana Press, 1999。除鑑別相同序列之外，上文所提及之程式通常提供性程一致度之指示。在一些實施例中，若兩個序列之對應殘基之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多在相關的一段殘基內相同，則其被視為實質上相同。在一些實施例中，相關段為完整序列。在一些實施例中，相關段為至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多個殘基。
罹患 ：「罹患」疾病、病症及/或疾患之個體已經診斷為或顯示該疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀。
治療有效量 ：如本文所用，術語治療劑之「治療有效量」意謂當向罹患或易患疾病、病症及/或疾患之個體投與時足以治療、診斷、預防該疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀及/或延遲其發作的量。一般熟習此項技術者應理解，治療有效量通常經由包含至少一個單位劑量之給藥來投與。
治療 ：如本文所用，「治療」係指用於部分或完全減輕、改善、緩和、抑制、預防具體疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀或特徵、延遲其發作、降低其嚴重性及/或減少其發生率的任何方法。治療可出於降低發展與疾病相關聯之病理之風險的目的向未展現出疾病徵象及/或僅展現出疾病早期徵象之個體投與。
本文藉由端點對數值範圍的敘述包括該範圍內的所有數及分數(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.9、4及5)。亦應理解，假定其所有數及分數均由術語「約」修飾。
以下各節中詳細描述了本發明之各種態樣。各節之使用不意謂限制本發明。各節均可應用於本發明之任一態樣。在本申請案中，除非另外說明，否則使用「或」意謂「及/或」。除非上下文另外明確說明，否則如本文所用，單數形式「一個」、「一種」及「該」包括單數及複數個指示物。
以下各節中詳細描述了本發明之各種態樣。各節之使用不意謂限制本發明。各節均可應用於本發明之任一態樣。在本申請案中，除非另外說明，否則使用「或」意謂「及/或」。
本揭露描述有效且穩健的重組腺相關病毒(rAAV)載體，其用於體內產生I2S，以用於治療與I2S缺乏相關聯之疾病，諸如韓特氏症候群。
第II型黏多醣病(MPS II，韓特氏症候群)為由艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之缺乏導致的X染色體性聯隱性胞溶體貯積症。I2S裂解醣胺聚醣(GAG)硫酸皮膚素及硫酸乙醯肝素之末端2-O-硫酸根部分。由於患有韓特氏症候群之患者中缺少或缺乏I2S酶，GAG逐漸地積累與多種細胞型之胞溶體中，引起細胞充盈(engorgement)、器官巨大、組織破壞及器官系統功能障礙。
一般而言，患有韓特氏症候群者之身體表現包括體症狀及神經症狀。例如，在一些韓特氏症候群病例中，中樞神經系統(CNS)涉入引起發展遲緩及神經系統問題。諸如神經系統退化症及智能障礙之症狀出現與兒童時期，且罹患神經元效應(neuronal effect)之韓特氏症候群患者常常由於腦之器官受損而早逝。類似地，GAG之累積可不利地影響身體之器官系統。最初表現為心臟、肺及氣道之壁增厚以及肝、脾及腎之異常腫大，這些深遠的變化可最終引起普遍的災難性器官衰竭。因此，韓特氏症候群總是為嚴重的、進行性的且限制生命的。
酶替代療法(ERT)為經批准用於治療韓特氏症候群(MPS II)的療法，其涉及向患有韓特氏症候群之患者投與外源替代I2S酶。然而，各種弊端與ERT相關聯，其中包括例如I2S向各種靶器官之分佈有限。
本文所述之載體提供I2S在各種器官(包括例如肝、腎、脾、心臟、肺及中樞神經系統)中之穩健表現。因此，在一些實施例中，本文所述之載體導致肝中I2S之表現。在一些實施例中，本文所述之載體導致腎中I2S之表現。在一些實施例中，本文所述之載體導致脾中I2S之表現。在一些實施例中，本文所述之載體導致心臟中I2S之表現。在一些實施例中，本文所述之載體導致肺中I2S之表現。在一些實施例中，本文所述之載體導致中樞神經系統中I2S之表現。在一些實施例中，本文所述之載體導致血漿中I2S之表現。 rAAV I2S 載體設計
在一些態樣中，本文提供了一種編碼艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白之重組腺相關病毒(rAAV)載體。繪示本揭露之示範性rAAV載體之示意圖繪示於圖1B中。如圖1B中所示，在一些實施例中，本揭露之rAAV載體包含肝特異性啟動子、5’及3’反向末端重複序列(ITR)、順式作用調控模組(CRM)、內含子及WPRE序列。
在一些實施例中，載體亦包括硫酸酯酶修飾因子1 (SUMF)基因。在一些實施例中，載體包含內部核糖體進入位點(IRES)。
載體之艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)可為野生型或經密碼子最佳化之變異體。因此，在一些實施例中，rAAV載體包含野生型I2S核苷酸序列。在一些實施例中，包含經密碼子最佳化之I2S序列。
本發明之合適I2S為可取代天然存在之艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白之至少部分活性或拯救一或多種與I2S缺乏相關聯之表現型或症狀的任何蛋白或蛋白之一部分。如本文所用，術語「I2S酶」及「I2S蛋白」以及語法等同物可互換使用。
通常，人類I2S蛋白以前驅物形式產生。人類I2S之前驅物形式含有訊息肽(全長前驅物之胺基酸殘基1-25)、原肽(pro-peptide)(全長前驅物之胺基酸殘基26-33)及鏈(全長前驅物之殘基34-550)，該鏈可進一步加工成42 kDa鏈(全長前驅物之殘基34-455)及14 kDa鏈(全長前驅物之殘基446-550)。通常，前驅物形式亦稱為全長前驅物或全長I2S蛋白，其含有550個胺基酸。訊息肽移除之成熟形式(SEQ ID NO: 1)及典型野生型或天然存在之人類I2S蛋白之全長前驅物(SEQ ID NO:2)之胺基酸序列顯示於表1中。訊息肽以下劃線表示。表 1. 人類艾杜糖 -2- 硫酸酯酶
成熟形式 SETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP(SEQ ID NO:1)
全長前驅物 MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALG SETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP(SEQ ID NO:2)
各種類型的啟動子均可用於本文所述之rAAV載體。這些包括例如遍在啟動子、組織特異性啟動子及可調控(例如可誘導型或可抑制型)啟動子。在一些實施例中，啟動子為肝特異性啟動子。肝特異性啟動子之實例為此項技術中已知的且包括例如人類運甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)、α-抗胰蛋白酶啟動子、人類因子IX原/肝轉錄因子反應性寡聚物、LSP及基本白蛋白啟動子。肝特異性啟動子描述於例如Zhijian Wu等人,Molecular Therapy 第16卷, 第2期, 2008年2月，其內容以引用之形式併入本文。
在一些實施例中，啟動子為遍在啟動子。在一些實施例中，啟動子為雞β肌動蛋白啟動子。
在一些實施例中，rAAV載體含有額外強化子或調控元件以促進mRNA之轉錄及/或轉譯(例如，強化子序列、Kozak序列、多腺苷酸化序列、轉錄終止序列、IRES及其類似者)。在一些實施例中，載體包含5’及3’反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，載體包含一或多種強化子元件。在一些實施例中，載體包含poly(A)尾。
在一些實施例中，rAAV載體包含一或多種小元件，諸如內含子。各種內含子為此項技術中已知的。本文所述之rAAV載體之合適內含子包括例如MVM內含子、截短F.IX內含子、嵌合β球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈SA內含子、SV40及/或α球蛋白第1內含子。在一些實施例中，rAAV載體包含MVM內含子。在一些實施例中，rAAV載體包含SV40內含子。
在一些實施例中，rAAV載體包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後控制元件(WPRE)。WPRE之各種經最佳化之形式或變異體形式為此項技術中已知的，且包括WPRE3、WPREmut6delATG等。其他變異體WPRE形式包括例如WPRE2、WPRE_wt (GenBank登錄號J04514)、WPRE_wt (GenBank登錄號J02442)及WPREmut6。
在一些實施例中，rAAV載體包含順式肌動蛋白調控模組(CRM)。各種類型CRM均適用於本文所述之載體且包括例如肝特異性CRM、神經元特異性CRM。在一些實施例中，本文所述之載體包括肝細胞特異性CRM，例如CRM8。在一些實施例中，載體包括多於一個CRM。例如，在一些實施例中，載體包含兩個、三個、四個、五個或六個CRM。在一些實施例中，載體包含三個CRM，例如三個CRM8。
在一些實施例中，rAAV載體經序列最佳化以增加轉錄物穩定性(以實現更有效的轉譯)並降低免疫原性。在一些實施例中，I2S經序列最佳化。
在一些實施例中，rAAV載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11載體。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 1。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 2。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 3。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 4。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 5。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 6。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 7。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 8。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 9。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 10。在一些實施例中，rAAV載體為AAV 11。
示範性元件序列顯示於以下表2中。在一些實施例中，rAAV載體包含有包含與表2中所示之載體元件具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的核苷酸序列的rAAV載體元件。在一些實施例中，rAAV載體包含與表2中所示之載體元件核苷酸序列相同的載體元件核苷酸序列。在表中，Xn (60-100)意謂包含60-100個核苷酸的DNA效價標籤。表 2. 示範性 I2S rAAV 元件序列
3xCRM8
gggggaggctgctggtgaatattaaccaaggtcaccccagttatcggaggagcaaacaggggctaagtccaccgggggaggctgctggtgaatattaaccaaggtcaccccagttatcggaggagcaaacaggggctaagtccaccgggggaggctgctggtgaatattaaccaaggtcaccccagttatcggaggagcaaacaggggctaagtccac (SEQ ID NO: 3)
hTTR 啟動子
aaatgacctattaagaatatttcatagaacgaatgttccgatgctctaatctctctagacaaggttcatatttgtatgggttacttattctctctttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgcagtcagattggcagggataagcagcctagctcaggagaagtgagtataaaagccccaggctgggagcagccatcacagaagtccactcattcttggcagg (SEQ ID NO: 4)
MVM 內含子
ctaaggtaagttggcgccgtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattaccttttttacaggcctg (SEQ ID NO: 5)
hIDS wt
atgccgccaccccggaccggccgaggccttctctggctgggtctggttctgagctccgtctgcgtcgccctcggatccgaaacgcaggccaactcgaccacagatgctctgaacgttcttctcatcatcgtggatgacctgcgcccctccctgggctgttatggggataagctggtgaggtccccaaatattgaccaactggcatcccacagcctcctcttccagaatgcctttgcgcagcaagcagtgtgcgccccgagccgcgtttctttcctcactggcaggagacctgacaccacccgcctgtacgacttcaactcctactggagggtgcacgctggaaacttctccaccatcccccagtacttcaaggagaatggctatgtgaccatgtcggtgggaaaagtctttcaccctgggatatcttctaaccataccgatgattctccgtatagctggtcttttccaccttatcatccttcctctgagaagtatgaaaacactaagacatgtcgagggccagatggagaactccatgccaacctgctttgccctgtggatgtgctggatgttcccgagggcaccttgcctgacaaacagagcactgagcaagccatacagttgttggaaaagatgaaaacgtcagccagtcctttcttcctggccgttgggtatcataagccacacatccccttcagataccccaaggaatttcagaagttgtatcccttggagaacatcaccctggcccccgatcccgaggtccctgatggcctaccccctgtggcctacaacccctggatggacatcaggcaacgggaagacgtccaagccttaaacatcagtgtgccgtatggtccaattcctgtggactttcagcggaaaatccgccagagctactttgcctctgtgtcatatttggatacacaggtcggccgcctcttgagtgctttggacgatcttcagctggccaacagcaccatcattgcatttacctcggatcatgggtgggctctaggtgaacatggagaatgggccaaatacagcaattttgatgttgctacccatgttcccctgatattctatgttcctggaaggacggcttcacttccggaggcaggcgagaagcttttcccttacctcgacccttttgattccgcctcacagttgatggagccaggcaggcaatccatggaccttgtggaacttgtgtctctttttcccacgctggctggacttgcaggactgcaggttccacctcgctgccccgttccttcatttcacgttgagctgtgcagagaaggcaagaaccttctgaagcattttcgattccgtgacttggaagaggatccgtacctccctggtaatccccgtgaactgattgcctatagccagtatccccggccttcagacatccctcagtggaattctgacaagccgagtttaaaagatataaagatcatgggctattccatacgcaccatagactataggtatactgtgtgggttggcttcaatcctgatgaatttctagctaacttttctgacatccatgcaggggaactgtattttgtggattctgacccattgcaggatcacaatatgtataatgattcccaaggtggagatcttttccagttgttgatgccttga (SEQ ID NO: 6)
WPREmut6delATG
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactttgttgctccttttacgctttgtggatacgctgctttattgcctttgtatcttgctattgcttcccgtttggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttttgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatc (SEQ ID NO: 7)
BGH pA
cctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggaa (SEQ ID NO: 8)
3’ ITR
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagaga (SEQ ID NO: 9)
5’ ITR
ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct (SEQ ID NO: 10)
經密碼子最佳化之人類IDS (COOL opt)
atgccaccacctaggacaggcaggggcctgctttggcttggactggtgctgagctctgtctgtgttgccctgggctccgagacccaagccaactctacaaccgatgctctcaatgttctgctcatcatagtggatgacctgcggccctctctaggctgctatggagacaagttggtgcggagccccaacatagaccagctagcctctcactccctgctgttccagaatgccttcgcccagcaagctgtgtgcgccccctctagagtgtctttcctgaccgggagaaggcctgatacaacaaggctgtatgactttaacagctactggagggtgcacgcaggcaacttctccactatcccccaatacttcaaggagaatggctatgtgaccatgagcgtgggcaaggtcttccaccctggaatctcctccaaccacactgatgatagtccctactcttggtcttttcctccctatcaccctagcagtgagaagtatgagaacaccaaaacctgcagaggccctgatggggagctgcatgctaacctcctgtgtcctgtagatgtgctggacgtcccagagggcaccttgccagataagcagtctactgagcaggctatccagctgcttgagaaaatgaagacttctgcatctcccttctttctggctgttggctaccacaagcctcacatccccttcaggtaccctaaggagttccaaaagctctatcctctggaaaacatcacacttgcccccgatcctgaggtccctgacggcctcccaccagtagcctacaatccttggatggacattaggcagagagaggatgtccaggctctgaatatttctgtgccctatgggcccatcccggtggacttccagcgcaaaatcagacagtcctactttgcctctgtgagctatctggacacccaggttgggaggctcctctccgcccttgacgacctccagttggccaacagcaccattatagccttcacctctgaccacggctgggcactgggggaacacggggagtgggctaagtactctaactttgatgtggccacccacgtgcccctcatcttttatgtgcctggcaggactgccagcctgcccgaagctggggaaaaactgtttccatacctggacccttttgacagtgcttctcagctcatggaacctggccgtcagagcatggatctggtggagctagtgtccctcttcccaaccttggctggccttgctggtctccaggtgcctcctagatgcccagtcccctccttccatgttgaactctgccgtgaggggaagaatctgctgaagcacttcagattcagagacttggaggaggacccctaccttcctgggaaccccagggagttgattgcatactcccagtatcccaggccaagtgacattccccagtggaactccgacaaaccaagtctgaaggacatcaagatcatggggtacagcatcaggaccattgactacagatacacagtgtgggttggatttaacccagatgagttcttggcaaacttttctgacatccatgcaagtcagttgtattttgtggacagcgaccctctgcaggatcacaacatgtacaatgacagccagggtggggacctctttcaactcctcatgccatag (SEQ ID NO: 11)
經密碼子最佳化之人類IDS (AUS 最佳化)
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IRES
gcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctcacctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataat (SEQ ID NO: 13)
SUMF1 野生型
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經密碼子最佳化之SUMF-1 (COOL 最佳化)
atggctgctcctgccctggggctggtgtgtggaagatgtcctgaactgggcctggttctgttactgcttctgctcagcctgctctgtggtgctgccggcagccaagaggcaggcactggcgctggagctggaagcctggctgggtcttgtggatgtggcacaccacagaggccaggggctcatggctcctctgctgcagctcataggtacagcagagaagccaatgctccaggcccagtgcctggagagagacagctggctcacagcaagatggtgcccatccctgctggggtgttcacaatgggaacagatgatccccagatcaagcaggatggggaggcgcctgccaggagggtgaccattgatgcattctatatggatgcctatgaggtgagcaatacagaatttgagaagtttgtgaactctactggctacctgactgaggctgaaaaatttggagactcttttgtgtttgaaggaatgcttagtgaacaggttaagaccaacatccagcaggctgttgcagcagccccctggtggttgcctgtcaagggagctaactggaggcaccctgagggaccagattctacaatcctgcatagacctgatcatcctgttctgcatgtgtcttggaatgatgctgtggcttactgtacctgggcaggaaaaaggctgccaacagaagctgagtgggaatactcttgcagaggaggcctgcacaatagactgttcccatggggcaacaagctgcaacccaagggccagcactatgctaacatctggcagggagaattccctgtgacaaacacaggagaggacggcttccagggaactgcccctgtagatgctttccctcctaatggctatggcctgtataacattgttggcaacgcctgggagtggacttctgattggtggacagtgcaccactctgttgaggagacactgaatcctaaggggccaccttctggaaaggatagagtgaagaaggggggaagctacatgtgccacaggtcttattgttacagatacaggtgcgctgctaggtctcagaacacccctgatagcagtgctagcaatctgggcttcaggtgtgccgctgacagactgcctaccatggattaa (SEQ ID NO: 15)
經密碼子最佳化之SUMF-1 (AUS 最佳化)
atggctgcccctgctctgggattggtttgtggcagatgtcctgagcttggtctggtgctgttgctccttctgttgtctctgctgtgtggagcagctgggtctcaggaagctggcacaggcgctggggctggctctctggccgggtcatgtggctgtggaactccccagcggcctggagcccatggcagctctgccgcagcacacaggtattctagggaagccaatgccccaggccctgtgcctggggagagacagctagctcattctaagatggtgcctatcccagccggggtttttacaatgggcactgatgatcctcagattaagcaggatggagaggcccccgccagaagagtgaccattgatgctttctacatggatgcatatgaagtgtccaacacagagtttgagaaatttgtgaactctactggatacttgaccgaggctgagaagtttggagattcctttgtctttgaaggcatgctgtctgagcaggtcaagaccaacattcagcaagcagtggccgctgcaccttggtggcttcctgtgaagggcgccaactggagacatccagaggggccagatagtaccatcctccacagacctgatcacccagtccttcatgtttcctggaatgatgcagttgcttactgcacttgggccggcaagaggctccctactgaggcagagtgggaatactcctgcagaggaggcctgcacaacagactgttcccttgggggaacaagcttcagcccaaaggccagcactatgctaacatctggcagggtgagtttccagtcaccaatacaggggaggacggattccagggaaccgcaccagtagatgccttccctcctaatggctatggcctgtataatattgtgggcaatgcatgggagtggacctctgactggtggactgtgcaccactcagtggaggaaaccctgaaccctaagggacccccttcaggcaaagatagagtcaaaaagggagggagctatatgtgtcacagatcctattgctacagatatagatgtgcagccaggtcccagaacacccctgactcttctgctagcaacctgggctttcggtgtgctgctgatagactgcccaccatggactaa (SEQ ID NO: 16)
在一些實施例中，rAAV I2S載體包含與以下表3中所示之核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，rAAV I2S載體包含與以下表3中所示之核苷酸序列相同的序列。表 3 ：示範性 rAAV I2S 載體核苷酸序列
pXL024
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTTAATTAAACGCGTGGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACCGGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACCGGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACACTAGTAAATGACCTATTAAGAATATTTCATAGAACGAATGTTCCGATGCTCTAATCTCTCTAGACAAGGTTCATATTTGTATGGGTTACTTATTCTCTCTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGCAGTCAGATTGGCAGGGATAAGCAGCCTAGCTCAGGAGAAGTGAGTATAAAAGCCCCAGGCTGGGAGCAGCCATCACAGAAGTCCACTCATTCTTGGCAGGCCGCGGCTAAGGTAAGTTGGCGCCGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTTTTTTACAGGCCTGGGCGCGCCGCCACCATGCCGCCACCCCGGACCGGCCGAGGCCTTCTCTGGCTGGGTCTGGTTCTGAGCTCCGTCTGCGTCGCCCTCGGATCCGAAACGCAGGCCAACTCGACCACAGATGCTCTGAACGTTCTTCTCATCATCGTGGATGACCTGCGCCCCTCCCTGGGCTGTTATGGGGATAAGCTGGTGAGGTCCCCAAATATTGACCAACTGGCATCCCACAGCCTCCTCTTCCAGAATGCCTTTGCGCAGCAAGCAGTGTGCGCCCCGAGCCGCGTTTCTTTCCTCACTGGCAGGAGACCTGACACCACCCGCCTGTACGACTTCAACTCCTACTGGAGGGTGCACGCTGGAAACTTCTCCACCATCCCCCAGTACTTCAAGGAGAATGGCTATGTGACCATGTCGGTGGGAAAAGTCTTTCACCCTGGGATATCTTCTAACCATACCGATGATTCTCCGTATAGCTGGTCTTTTCCACCTTATCATCCTTCCTCTGAGAAGTATGAAAACACTAAGACATGTCGAGGGCCAGATGGAGAACTCCATGCCAACCTGCTTTGCCCTGTGGATGTGCTGGATGTTCCCGAGGGCACCTTGCCTGACAAACAGAGCACTGAGCAAGCCATACAGTTGTTGGAAAAGATGAAAACGTCAGCCAGTCCTTTCTTCCTGGCCGTTGGGTATCATAAGCCACACATCCCCTTCAGATACCCCAAGGAATTTCAGAAGTTGTATCCCTTGGAGAACATCACCCTGGCCCCCGATCCCGAGGTCCCTGATGGCCTACCCCCTGTGGCCTACAACCCCTGGATGGACATCAGGCAACGGGAAGACGTCCAAGCCTTAAACATCAGTGTGCCGTATGGTCCAATTCCTGTGGACTTTCAGCGGAAAATCCGCCAGAGCTACTTTGCCTCTGTGTCATATTTGGATACACAGGTCGGCCGCCTCTTGAGTGCTTTGGACGATCTTCAGCTGGCCAACAGCACCATCATTGCATTTACCTCGGATCATGGGTGGGCTCTAGGTGAACATGGAGAATGGGCCAAATACAGCAATTTTGATGTTGCTACCCATGTTCCCCTGATATTCTATGTTCCTGGAAGGACGGCTTCACTTCCGGAGGCAGGCGAGAAGCTTTTCCCTTACCTCGACCCTTTTGATTCCGCCTCACAGTTGATGGAGCCAGGCAGGCAATCCATGGACCTTGTGGAACTTGTGTCTCTTTTTCCCACGCTGGCTGGACTTGCAGGACTGCAGGTTCCACCTCGCTGCCCCGTTCCTTCATTTCACGTTGAGCTGTGCAGAGAAGGCAAGAACCTTCTGAAGCATTTTCGATTCCGTGACTTGGAAGAGGATCCGTACCTCCCTGGTAATCCCCGTGAACTGATTGCCTATAGCCAGTATCCCCGGCCTTCAGACATCCCTCAGTGGAATTCTGACAAGCCGAGTTTAAAAGATATAAAGATCATGGGCTATTCCATACGCACCATAGACTATAGGTATACTGTGTGGGTTGGCTTCAATCCTGATGAATTTCTAGCTAACTTTTCTGACATCCATGCAGGGGAACTGTATTTTGTGGATTCTGACCCATTGCAGGATCACAATATGTATAATGATTCCCAAGGTGGAGATCTTTTCCAGTTGTTGATGCCTTGAGGTACCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTTTGTTGCTCCTTTTACGCTTTGTGGATACGCTGCTTTATTGCCTTTGTATCTTGCTATTGCTTCCCGTTTGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTTTGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGGTACCGTCGACCCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAATCTAGA Xn(60-100) GTTTAAACATTTAAATAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGTATACATCGATGTGAGTTCGCGGGTGGCTGGGGGGCCCTGGGCTGCGACCGCCCCCGAACCGCGTCTACGAGCCTTGCGGGCTCCGGGTCTTTGCAGTCGTATGGGGGCAGGGTAGCTGTTCCCCGCAAGGAGAGCTCAAGGTCAGCGCTCGGACCTGGCGGAGCCCCGCACCCAGGCTGTGGCGCCCTGTGCAGCTCCGCCCTTGCGGCGCCATCTGCCCGGAGCCTCCTTCCCCTAGTCCCCAGAAACAGGAGGTCCCTACTCCCGCCCGAGATCCCGACCCGGACCCCTAGGTGGGGGACGCTTTCTTTCCTTTCGCGCTCTGCGGGGTCACGTGTCGCAGAGGAGCCCCTCCCCCACGGCCTCCGGCACCGCAGGCCCCGGGATGCTAGTGCGCAGCGGGTGCATCCCTGTCCGGATGCTGCGCCTGCGGTAGAGCGGCCGCCATGTTGCAACCGGGAAGGAAATGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAACCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAGGTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCAAAGAAGTGGGTTTATGGAGGTCCTCTTGTGTCCCCTCCCCGCAGAGGTGTGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAGCCGGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCGCAAAATGGCCCCTCTGGTGGTGGCCCCTTCCTGCAGCGCCGGCTCACCTCACGGCCCCGCCCTTCCCCTGCCAGCCTAGCGTTGACCCGACCCCAAAGGCCAGGCTGTAAATGTCACCGGGAGGATTGGGTGTCTGGGCGCCTCGGGGAACCTGCCCTTCTCCCCATTCCGTCTTCCGGAAACCAGATCTCCCACCGCACCCTGGTCTGAGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGGCTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCACTTACCTGTGCTCCCACTCCTGATTTCTGGAAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGCAAATCAAAGCCCTGGGACTAGGGGGTTAAAATACAGCTTCCCCTCTTCCCACCCGCCCCAGTCTCTGTCCCTTTTGTAGGAGGGACTTAGAGAAGGGGTGGGCTTGCCCTGTCCAGTTAATTTCTGACCTTTACTCCTGCCCTTTGAGTTTGATGATGCTGAGTGTACAAGCGTTTTCTCCCTAAAGGGTGCAGCTGAGCTAGGCAGCAGCAAGCATTCCTGGGGTGGCATAGTGGGGTGGTGAATACCATGTACAAAGCTTGTGCCCAGACTGTGGGTGGCAGTGCCCCACATGGCCGCTTCTCCTGGAAGGGCTTCGTATGACTGGGGGTGTTGGGCAGCCCTGGAGCCTTCAGTTGCAGCCATGCCTTAAGCCAGGCCAGCCTGGCAGGGAAGCTCAAGGGAGATAAAATTCAACCTCTTGGGCCCTCCTGGGGGTAAGGAGATGCTGCATTCGCCCTCTTAATGGGGAGGTGGCCTAGGGCTGCTCACATATTCTGGAGGAGCCTCCCCTCCTCATGCCTTCTTGCCTCTTGTCTCTTAGGCATGCAAAAGAGTCGAATAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATGCATAATAAATACTGATAACATCTTATAGTTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTGATATCAAAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTGTATATACAAAAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGTTCATCAATCGAAAAAGCAACGTATCTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATATATCAAGCAAAGTGACAGGCGCCCTTAAATATTCTGACAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATAAAAAAACCCGCCGAAGCGGGTTTTTACGTTATTTGCGGATTAACGATTACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCTTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATCAAAGTGCATCACTTCTTCCCGTATGCCCAACTTTGTATAGAGAGCCACTGCGGGATCGTCACCGTAATCTGCTTGCACGTAGATCACATAAGCACCAAGCGCGTTGGCCTCATGCTTGAGGAGATTGATGAGCGCGGTGGCAATGCCCTGCCTCCGGTGCTCGCCGGAGACTGCGAGATCATAGATATAGATCTCACTACGCGGCTGCTCAAACTTGGGCAGAACGTAAGCCGCGAGAGCGCCAACAACCGCTTCTTGGTCGAAGGCAGCAAGCGCGATGAATGTCTTACTACGGAGCAAGTTCCCGAGGTAATCGGAGTCCGGCTGATGTTGGGAGTAGGTGGCTACGTCACCGAACTCACGACCGAAAAGATCAAGAGCAGCCCGCATGGATTTGACTTGGTCAGGGCCGAGCCTACATGTGCGAATGATGCCCATACTTGAGCCACCTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACAAAAAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATTTTTTTTTCCTCCTCGGCGTTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATAGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCGCTGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGTGCACTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGGAACTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTTTTTTCCTCCTTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGCGATCGC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Xn(60-100) 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(SEQ ID NO: 18)
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Xn(60-100) 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pXL028
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Xn(60- 100)GTTTAAACATTTAAATAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGTATACATCGATGTGAGTTCGCGGGTGGCTGGGGGGCCCTGGGCTGCGACCGCCCCCGAACCGCGTCTACGAGCCTTGCGGGCTCCGGGTCTTTGCAGTCGTATGGGGGCAGGGTAGCTGTTCCCCGCAAGGAGAGCTCAAGGTCAGCGCTCGGACCTGGCGGAGCCCCGCACCCAGGCTGTGGCGCCCTGTGCAGCTCCGCCCTTGCGGCGCCATCTGCCCGGAGCCTCCTTCCCCTAGTCCCCAGAAACAGGAGGTCCCTACTCCCGCCCGAGATCCCGACCCGGACCCCTAGGTGGGGGACGCTTTCTTTCCTTTCGCGCTCTGCGGGGTCACGTGTCGCAGAGGAGCCCCTCCCCCACGGCCTCCGGCACCGCAGGCCCCGGGATGCTAGTGCGCAGCGGGTGCATCCCTGTCCGGATGCTGCGCCTGCGGTAGAGCGGCCGCCATGTTGCAACCGGGAAGGAAATGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAACCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAGGTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCAAAGAAGTGGGTTTATGGAGGTCCTCTTGTGTCCCCTCCCCGCAGAGGTGTGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAGCCGGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCGCAAAATGGCCCCTCTGGTGGTGGCCCCTTCCTGCAGCGCCGGCTCACCTCACGGCCCCGCCCTTCCCCTGCCAGCCTAGCGTTGACCCGACCCCAAAGGCCAGGCTGTAAATGTCACCGGGAGGATTGGGTGTCTGGGCGCCTCGGGGAACCTGCCCTTCTCCCCATTCCGTCTTCCGGAAACCAGATCTCCCACCGCACCCTGGTCTGAGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGGCTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCACTTACCTGTGCTCCCACTCCTGATTTCTGGAAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGCAAATCAAAGCCCTGGGACTAGGGGGTTAAAATACAGCTTCCCCTCTTCCCACCCGCCCCAGTCTCTGTCCCTTTTGTAGGAGGGACTTAGAGAAGGGGTGGGCTTGCCCTGTCCAGTTAATTTCTGACCTTTACTCCTGCCCTTTGAGTTTGATGATGCTGAGTGTACAAGCGTTTTCTCCCTAAAGGGTGCAGCTGAGCTAGGCAGCAGCAAGCATTCCTGGGGTGGCATAGTGGGGTGGTGAATACCATGTACAAAGCTTGTGCCCAGACTGTGGGTGGCAGTGCCCCACATGGCCGCTTCTCCTGGAAGGGCTTCGTATGACTGGGGGTGTTGGGCAGCCCTGGAGCCTTCAGTTGCAGCCATGCCTTAAGCCAGGCCAGCCTGGCAGGGAAGCTCAAGGGAGATAAAATTCAACCTCTTGGGCCCTCCTGGGGGTAAGGAGATGCTGCATTCGCCCTCTTAATGGGGAGGTGGCCTAGGGCTGCTCACATATTCTGGAGGAGCCTCCCCTCCTCATGCCTTCTTGCCTCTTGTCTCTTAGGCATGCAAAAGAGTCGAATAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATGCATAATAAATACTGATAACATCTTATAGTTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTGATATCAAAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTGTATATACAAAAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGTTCATCAATCGAAAAAGCAACGTATCTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATATATCAAGCAAAGTGACAGGCGCCCTTAAATATTCTGACAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATAAAAAAACCCGCCGAAGCGGGTTTTTACGTTATTTGCGGATTAACGATTACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCTTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATCAAAGTGCATCACTTCTTCCCGTATGCCCAACTTTGTATAGAGAGCCACTGCGGGATCGTCACCGTAATCTGCTTGCACGTAGATCACATAAGCACCAAGCGCGTTGGCCTCATGCTTGAGGAGATTGATGAGCGCGGTGGCAATGCCCTGCCTCCGGTGCTCGCCGGAGACTGCGAGATCATAGATATAGATCTCACTACGCGGCTGCTCAAACTTGGGCAGAACGTAAGCCGCGAGAGCGCCAACAACCGCTTCTTGGTCGAAGGCAGCAAGCGCGATGAATGTCTTACTACGGAGCAAGTTCCCGAGGTAATCGGAGTCCGGCTGATGTTGGGAGTAGGTGGCTACGTCACCGAACTCACGACCGAAAAGATCAAGAGCAGCCCGCATGGATTTGACTTGGTCAGGGCCGAGCCTACATGTGCGAATGATGCCCATACTTGAGCCACCTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACAAAAAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATTTTTTTTTCCTCCTCGGCGTTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATAGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCGCTGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGTGCACTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGGAACTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTTTTTTCCTCCTTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGCGA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pXL029
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Xn(60- 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pXL030
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pXL032
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(SEQ ID NO: 23)
編碼 I2S 之 rAAV 載體在疾病治療中的用途
本文描述了治療與I2S酶缺乏相關聯之疾病之方法。因此，在一些實施例中，本文所述之rAAV載體合適於治療具有I2S缺乏(諸如患有韓特氏症候群(MPSII))的個體。治療方法包括向有需要之個體投與如本文所述之重組腺相關病毒(rAAV)載體。
本文所述之rAAV載體可用於治療與I2S缺乏或病症相關聯之任何疾病。
在一些實施例中，rAAV在向有需要之個體投與之後保持附加型。在一些實施例中，rAAV載體在向有需要之個體投與之後步保持附加型。例如，在一些實施例中，rAAV載體整合至個體之基因體中。此類整合可例如藉由使用各種基因編輯技術來達成，諸如鋅指核酸酶(ZFN)、類轉錄活化因子效應核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease；TALENS)、ARCUS基因體編輯及/或CRISPR-Cas系統。
在一些實施例中，包含本文所述之rAAV載體之醫藥組成物用於治療有需要之個體。含有本發明之rAAV載體或粒子之醫藥組成物含有醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。合適的醫藥載劑之實例為此項技術中熟知的且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液諸如油/水乳液、各種類型的潤濕劑、無菌溶液及其類似者。此類載劑可藉由習知方法調配且以治療有效量向個體投與。
rAAV載體經由合適的途徑向有需要之個體投與。在實施例中，rAAV載體藉由靜脈內、腹膜內、皮下或皮內投與來投與。在實施例中，rAAV載體經靜脈內投與。在實施例中，皮內投與包含藉由使用「基因槍」或生物彈粒子遞送系統進行之投與。在一些實施例中，rAAV載體經由非病毒脂質奈米粒子來投與。例如，包含rAAV載體之組成物可包含一或多種稀釋劑、緩衝液、脂質體、脂質、脂質複合物。在一些實施例中，rAAV載體包含在微球或奈米粒子諸如脂質奈米粒子內。在一些實施例中，rAAV載體、及/或轉基因表現盒、及/或經最佳化之IDS 轉基因序列、及/或基因表現盒之任何組成物係經由非病毒化學粒子諸如脂質奈米粒子、非病毒生物分子諸如胞外體及/或細胞外囊泡投與的。
在一些實施例中，在投與rAAV載體之後約2至6週，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在約2週時，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在約3週時，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在約4週時，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在約5週時，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在約6週時，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後約2至6週，在個體之肝細胞中可偵測到功能性I2S。
在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少3個月、6個月、12個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年時，在個體之血漿中可偵測到功能性I2S。因此，在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少3個月，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少6個月，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少12個月，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少2年，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少3年，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少4年，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少5年，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少6年，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少7年，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少8年，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少9年，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少10年，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後個體之剩餘生命中，在個體之血漿或血清中可偵測到功能性I2S。
在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV導致活性I2S之產生，其程度與投與靜脈內遞送之經純化之I2S蛋白之後發現的程度相同。在一些實施例中，與投與靜脈內遞送之經純化之I2S蛋白相比，所投與之包含I2S之rAAV導致較大量活性I2S之產生。
在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV導致個體之醣胺聚醣(GAG)之減少。在一些實施例中，與投與包含I2S之rAAV之前個體基線GAG水準相比，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或約10%。因此，在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約95%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約90%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約85%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約80%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約75%。在一些實施例中，所投與的包含I2S的rAAV使個體之GAG減少約70%。在一些實施例中，所投與的包含I2S的rAAV使個體之GAG減少約65%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約60%。在一些實施例中，所投與的包含I2S的rAAV使個體之GAG減少約55%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約50%。在一些實施例中，所投與的包含I2S的rAAV使個體之GAG減少約45%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約40%。在一些實施例中，所投與的包含I2S的rAAV使個體之GAG減少約35%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約30%。在一些實施例中，所投與的包含I2S的rAAV使個體之GAG減少約25%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約20%。在一些實施例中，所投與的包含I2S的rAAV使個體之GAG減少約15%。在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少約10%。
在一些實施例中，所投與之包含I2S之rAAV使個體之GAG減少至少約2週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、12個月、1年、2年、3年、4年、5年或多於5年。
在一些實施例中，與投與包含I2S之rAAV之前可在個體中偵測到之功能性I2S之量相比，在向個體投與AAV載體之後可在循環中偵測到之功能性I2S之水準高約2倍與10倍之間。
在一些實施例中，在向個體投與AAV載體之後，可偵測之活性I2S之水準達到或超過人類治療性水準。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約2倍與35倍之間。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約2倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約3倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約4倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約5倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約6倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約6倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約7倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約8倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約9倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約10倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約15倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約20倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約25倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約30倍。在一些實施例中，投與之後活性I2S之水準為人類治療性水準的約35倍。
因此，與向有需要之個體單次投與經純化之I2S相比，投與包含I2S之rAAV載體導致持續穩健的表現。
在一些實施例中，rAAV I2S載體呈每個個體之單一劑量進行遞送。在一些實施例中，個體經遞送最小有效劑量(MED)。如本文所用，MED係指達成導致個體之GAG水準降低的I2S活性所需的rAAV I2S載體劑量。
載體效價係基於載體製劑之DNA含量來確定。在一些實施例中，使用定量PCR或經最佳化之定量PCR來確定rAAV I2S載體製劑之DNA含量。在一個實施例中，劑量為約1×1011 載體基因體 (vg)/kg體重至約1×1013 vg/kg，包括端點。
在一個實施例中，劑量在1×109 vg/kg至3×1015 vg/kg之範圍內選擇(例如，1×109 vg/kg、3×109 vg/kg、1×1010 vg/kg、3×1010 vg/kg、1×1011 vg/kg、3×1011 vg/kg、1×1012 vg/kg、3×1012 vg/kg、1×1013 vg/kg、3×1013 vg/kg、1×1014 vg/kg、3×1014 vg/kg、1×1015 vg/kg、3×1015 vg/kg)。在一些實施例中，劑量為5×1013 vg / kg。在另一實施例中，劑量為5×l012 vg/kg。在特定實施例中，向個體投與之rAAV之劑量為至少5×1011 vg/kg、1×1012 vg/kg、1.5×1012 vg/kg、 2.0×1012 vg/kg、2.5×1012 vg/kg、3.0×1012 vg/kg、3.5×1012 vg/kg、4.0×1012 vg/kg、4.5×1012 vg/kg、5.0×1012 vg/kg、5.5×1012 vg/kg 、6.0×1012 vg/kg、6.5×1012 vg/kg、7.0×1012 vg/kg或7.5×1012 vg/kg。
在一些實施例中，rAAV I2S載體組成物可以含有在約1.0×109 vg至約1.0×1015 vg之範圍內的量的複製缺陷病毒的劑量單位調配。如本文所用，術語「劑量」可指代在治療過程中向個體遞送之總劑量或者單次(多次)投與中遞送之量。
在一些實施例中，劑量足以降低患者之血漿GAG水準25%或更多。在一些實施例中，rAAV I2S與一或多種治療劑組合投與以治療韓特氏症候群。 rAAV 病毒載體之產生
用於生成及分離合適於向個體遞送之AAV病毒載體之方法為此項技術中已知的。參見例如US專利7790449、US專利7282199、WO 2003/042397、WO 2005/033321、WO 2006/1 10689及US 7588772 B2。在一個系統中，生產者細胞株經編碼側接ITR之轉基因的構築體以及編碼rep及cap的構築體暫態轉染。在第二系統中，穩定供應rep及cap的包裝細胞株經編碼側接ITR之轉基因的構築體暫態轉染。在這些系統中之各者中，AAV病毒體回應於以輔助腺病毒或疱疹病毒之感染而產生，需要將rAAV與污染病毒分離。最近，已開發了不需要以輔助病毒之感染來回收AAV (亦即，腺病毒El、E2a、VA及E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52及UL29以及疱疹病毒聚合酶)且在運輸中亦由系統供應的系統。在這些較新系統中，輔助功能可藉由以編碼所需輔助功能的構築體暫態轉染細胞來供應，或細胞可經工程改造以穩定含有編碼輔助功能之基因，其表現可控制在轉錄或轉錄後水準。
在一些實施例中，藉由以基於桿狀病毒之載體之感染來將側接ITR及rep/cap基因之表現盒引入至所要細胞或細胞株中。
在一些實施例中，藉由以基於桿狀病毒之載體之感染來將側接ITR及rep/cap基因之表現盒引入至昆蟲細胞中。對於這些產生系統之綜述，一般而言參見例如Zhang等人, 2009, 「Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production,」Human Gene Therapy 20:922-929，其內容以引用之方式整體併入本文。製造並使用這些及其他AAV產生系統之方法亦描述於以下美國專利，其各自之內容皆以引用之方式整體併入本文：5, 139,941、5,741,683、6,057, 152、6,204,059、6,268,213、6,491,907、6,660,514、6,951,753、7,094,604、7, 172,893、7,201,898、7,229,823及7,439,065。一般而言，參見例如Grieger及Samulski, 2005, 「Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications,」Adv. Biochem. Engin/Biotechnol . 99: 119-145；Buning等人, 2008, 「Recent developments in adeno-associated virus vector technology,」J. Gene Med 10:717-733；以及下文引用之參考文獻，其各自皆以引用之方式整體併入本文。
用於構築本發明之任一實施例之方法為熟習核酸操縱技術者已知的且包括遺傳工程、重組工程及合成技術。參見例如Green及Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)。類似地，生成rAAV病毒體之方法為熟知的，且選擇合適的方法不為對本發明的限制。參見例如K. Fisher等人, (1993) J. Virol, 70:520-532以及美國專利第5,478,745號。
可根據本發明使用之許多質體及其他選殖及表現載體為熟習此項技術者熟知且容易獲得的。此外，熟練技術人員可容易地構築任何數目適用於本發明的其他質體。本發明中此類質體之性質、構築及用途以及其他載體對於熟習本揭露者而言將為顯而易見的。
在一個實施例中，產生質體為本文所述者或如WO2012/158757中所述，其以引用之方式併入本文。用於產生rAAV載體之各種質體為此項技術中已知的且可用於本文。將產生質體培養於表現AAV cap及/或rep蛋白的宿主細胞中。在宿主細胞中，各rAAV基因體經拯救並包裝至殼體蛋白或套膜蛋白中以形成感染性病毒粒子。
在某些實施例中，rAAV表現盒、載體(諸如rAAV載體)、病毒(諸如rAAV)、產生質體包含AAV反向末端重複序列、經密碼子最佳化之編碼IDS 及/或SUMF-1 之核酸序列以及引導宿主細胞中經編碼之蛋白之表現的表現控制序列。在其他實施例中，rAAV表現盒、病毒、載體(諸如rAAV載體)、產生質體進一步包含以下中之一或多者：內含子、Kozak序列、polyA、轉錄後調控元件等。在一個實施例中，轉錄後調控元件為土撥鼠肝炎病毒(WHP)轉錄後調控元件(WPRE)。
關於AAV載體之產生及純化的各種方法為此項技術中已知的。參見例如Mizukami, Hiroaki等人, A Protocol for AAV vector production and purification；美國專利公開案第US20070015238號及第US20120322861號。例如，包含感興趣之基因之質體可與一或多種輔助質體組合(例如，含有rep基因(例如，編碼Rep78、Rep68、Rep52及Rep40)及cap基因(編碼VP1、VP2及VP3，包括如本文所述之經修飾之VP2區)者)且轉染至重組細胞中以使得rAAV可被包裝且隨後純化。
在一些實施例中，在輔助細胞或生產者細胞諸如哺乳動物細胞或昆蟲細胞中進行包裝。示範性哺乳動物細胞包括但不限於HEK293細胞、COS細胞、HeLa細胞、BHK細胞或CHO細胞(參見例如ATCC® CRL-1573™、ATCC® CRL-1651™、ATCC® CRL-1650™、ATCC® CCL-2、ATCC® CCL-10™或ATCC® CCL-61™)。示範性昆蟲細胞包括但不限於Sf9細胞(參見例如ATCC® CRL-1711™)。輔助細胞可包含在本文所述之方法中使用之編碼Rep蛋白及/或Cap蛋白的rep及/或cap基因。在一些實施例中，體外進行包裝。
在一些實施例中，含有感興趣之基因的質體與一或多種輔助質體(例如，含有第一血清型之rep基因及同一血清型或不同血清型之cap基因者)且轉染至輔助細胞中以使得rAAV被包裝。
在一些實施例中，該一或多種輔助質體包括：第一輔助質體，其包含rep基因及cap基因；及第二輔助質體，其包含以下輔助基因中之一或多者：Ela基因、Elb基因、E4基因、E2a基因及VA基因。為清楚起見，輔助基因為編碼輔助蛋白Ela、Elb、E4、E2a及VA之基因。在一些實施例中，cap基因經修飾，以使得蛋白VP1、VP2及VP3中之一或多者不被表現。在一些實施例中，cap基因經修飾，以使得VP2不被表現。用於進行此類修飾之方法為此項技術中已知的(Lux等人(2005),J Virology , 79: 11776-87)。
輔助質體以及製備此類質體之方法一般為此項技術中已知的且一般為可商購獲得的(參見例如pDF6、pRep、pDM、pDG、pDPlrs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E)及pDP8.ape質體來自PlasmidFactory, Bielefeld, Germany；其他產物己服務可獲自Vector Biolabs, Philadelphia, PA、Cellbiolabs, San Diego, CA、Agilent Technologies, Santa Clara, Ca以及Addgene, Cambridge, MA；pxx6；Grimm等人 (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adeno associated Virus Vectors,Human Gene Therapy , 第9卷, 2745-2760；Kem, A.等人 (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno- Associated Virus Type 2 Capsids,Journal of Virology , 第77卷, 11072-11081.；Grimm等人(2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6,Molecular Therapy , 第7卷, 839-850；Kronenberg等人(2005))。實例
本發明之其他特徵、目標及優勢在以下實例中為顯而易見的。然而應理解，該等實例儘管指示了本發明之實施例，但僅以說明而非限制方式給出。自該等實例，本發明範疇內的各種變化及修改對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。 實例 1. 載體設計
生成包含人類艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS或I2S)之編碼序列及其變型之rAAV表現構築體(rAAV載體)之示範性方法及設計提供於此實例中。在此研究中，使用了重組AAV載體(rAAV8)。rAAV載體之基本設計包含側接反向末端重複序列(ITR)之表現盒：5’-ITR及3’-ITR。這些ITR藉由AAV複製蛋白Rep及載體產生細胞中之相關因子介導載體基因體之複製及包裝。通常，表現盒含有啟動子、編碼序列、polyA尾及/或標籤，如圖1A中所示。使用標準分子生物學技術設計並製備了編碼人類IDS (hIDS)之表現構築體。將hIDS之編碼序列插入於啟動子hTTR (人類運甲狀腺素蛋白啟動子)下游。此外，將肝特異性順式作用調控模組(CRM)插入於啟動子上游，且將小鼠微小病毒(MVM)內含子序列插入於啟動子下游。針對高轉導水準對此調控及啟動子組合進行測試，如以下實例中所示。此外，將WPRE序列插入於編碼區下游。不希望受理論束縛，此元件產生增加mRNA穩定性的三級結構。已描述了WPRE之其他功能機制，包括例如改良轉錄終止及促進mRNA核輸出。圖1B展示上文所述之表現構築體之示意圖。然後將表現構築體選殖至AAV質體主鏈中並藉由定序來確認。將載體包裝於病毒粒子中並儲存。
可進行上文方案之任何數目的變型。如圖2中所示，可藉由用在內部核糖體進入位點(IRES)之後的SUMF1 (硫酸酯酶修飾因子1)編碼序列替換WPRE序列來獲得替代構築體。基於公開之資料(Fraldi A等人2007. Biochem J. 403:305-312)，當在體外基於細胞之檢定中測試時，SUMF1之存在增加I2S活性。同一研究中公開之額外體內資料說明，在存在SUMF1之情況下磺醯胺酶(SGSH)活性之改良更顯著。條件為，需要SUMF1來活化內質網中其底物(包括IDS)之甲醯基甘胺酸催化殘基，自同一載體之IDS及SUMF1之共表現可確保在細胞水準下有增加量的SUMF1來加工增加量的IDS，因此增加經活化之IDS在運輸至胞溶體或離開細胞進入其他細胞以實現更新之前被加工的機率。密碼子最佳化
此外，基於多重參數(諸如密碼子適應指數(codon adaptation index；CAI)、CpG位點計數、GC含量及重複鹼基序列)對IDS或SUMF1之編碼序列進行密碼子最佳化。高CAI為較佳的以利用更頻繁使用之密碼子並潛在地增加自載體之轉基因產物表現水準。可引起免疫反應的CpG位點減少。重複鹼基亦被移除。出於此目的，使用針對合成基因設計之基於網路之多目標最佳化平台(稱為COOL (Codon Optimization Online))及內部密碼子使用頻率表。此外，手動移除潛在剪接位點。經最佳化之hIDS及SUMF1編碼序列之特徵概述於表4中，且hIDS-WPRE及hIDS-IRES-SUMF1之代表性構築體之圖示分別展示於圖1B及圖2中。可進行上文方案之任何數目的變型。例如，可使用多於一個啟動子，及/或可將IRES序列引入於編碼區上游。此外，可考慮到調控區、啟動子及內含子之不同組合。表 4 ：經最佳化之 hIDS 及 SUMF1 編碼序列之示範性特徵
編碼順序 CpG CAI CG% 重複序列
hIDS WT 56 0.7645 51.97 896
hIDS COOLopt 24 0.8403 54.14 0
hIDS AUSopt 30 0.8519 54.51 0
SUMF1 WT 49 0.75 55.91 455
SUMF1 COOLopt 7 0.9038 54.04 0
SUMF1 AUSopt 13 0.8572 54.58 0
實例 2. 體內 rAAV 驅動之 hIDS-WPRE 表現之表現
此實例說明體內rAAV驅動之IDS表現之經最佳化之構築體之效力。向小鼠注射對照載體(rAAV-XL032)(A組)；或測試樣品rAAV-XL024 (hIDS wt-WPRE)構築體(B組)或rAAV-XL026 (hIDS-AUSopt-WPRE)構築體(C組)，如圖1A及圖1B中所繪示。六週齡小鼠經由尾部靜脈接受在200 µl體積中的5×109 vg載體，且在注射之後2天、7天、21天、8週及12週收集血清樣品。在第12週處死小鼠，並收穫組織樣品。將一組年齡匹配之野生型小鼠及一組年齡匹配之未治療IDS -KO小鼠分別用作陽性對照及陰性對照。實驗設計概述於以下表5中。表 5. 使用編碼 hIDS 之 rAAV 載體之示範性體內研究
組別 條件 治療 體積 劑量 N/ 組
A 對照載體 rAAV-XL032 (hIDS wt-WPRE) 200 µl 5×109 vg 8
B 測試 rAAV-XL024 (hIDS wt-WPRE) 200 µl 5×109 vg 8
C 測試 rAAV-XL026 (hIDS AUSopt-WPRE) 200 µl 5×109 vg 8
D 陽性對照 WT；未注射 - - 6
E 陰性對照 IDS-KO；未注射 - - 6
F 陽性對照 IDS酶 (鞘內向KO小鼠) 10 µl 250微克/劑量 5
藉由ELISA使用B85抗體確定載體介導之表現量。結果繪示於圖3中。與注射對照載體rAAV-XL032 (A組)之小鼠相比，注射經最佳化之構築體之rAAV載體rAAV-XL024 (B組)及rAAV-XL026 (C組)之小鼠展示較高的血清hIDS濃度，該對照載體為編碼藉由不減少CpG位點及野生型WPRE序列之縮短型式的不同算法經密碼子最佳化之hIDS的載體。對於所有注射載體的組(A組至C組)，在單次注射之後，hIDS濃度增加直至第21天，且hIDS水準維持多達12週(84天)。所有WT及IDS-KO組皆未偵測到hIDS，因為其未表現人類IDS。
當測試hIDS活性水準時獲得類似結果，如圖4A中所示。對於注射載體之所有組(A組至C組)，活性水準增加直至第21天。與表現結果類似，與具有對照載體rAAV-XL032 (A組)之小鼠組相比，注射經最佳化之構築體之rAAV載體之小鼠組(B組及C組)中之hIDS活性較高。在整個研究期，WT小鼠組之hIDS活性水準相對穩定。此實例中所用之rAAV載體為rAAV8。
在組織中，使用ELISA量測hI2S，如圖4B中所示。對於rAAV-XL024 (B組)，在肝及腎中可偵測到hI2S，而在腦中偵測不到。此組未分析心臟及脾。對於rAAV-XL026 (C組)，在肝、腎、心臟、脾及腦中可偵測到hI2S。對於rAAV-XL032 (A組)，在肝、腎及腦中可偵測到hI2S。此組未分析心臟及脾。
在組織中，使用活性量測hI2S，如圖4C中所示。對於rAAV-XL024 (B組)，在肝、腎及腦中可偵測到hI2S活性。此組未分析心臟及脾。對於rAAV-XL026 (C組)，在肝、腎、心臟、脾及腦中可偵測到hI2S。對於rAAV-XL032 (A組)，在肝、腎及腦中可偵測到hI2S。此組未分析心臟及脾。將酶活性水準與WT組比較，如圖4D中所示。在血清及體組織中，所有載體給藥組含有大於WT組的活性水準。在腦中，rAAV-XL026及rAAV-XL032之水準低於WT。 實例 3. 藉由以 hIDS-WPRE 構築體之基因療法的 GAG 清除
艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)自醣胺聚醣(GAG)、硫酸皮膚素及硫酸乙醯肝素移除硫酸根，且其不存在或失活導致第II型黏多醣病(MPSII)或韓特氏症候群，其為胞溶體貯積症。因此，量測GAG清除率以評估經最佳化之rAAV構築體所表現之hIDS之效力。在第12週，自表5中所示之小鼠組提取出腦、肝及腎組織，且量測各組織之GAG水準。
如圖5A中所示，與未經治療之IDS-KO小鼠相比，rAAV-XL026 (C組)及rAAV-XL032 (A組)之腦中GAG水準略微降低。如圖5B及圖5C中所示，當將小鼠注射編碼hIDS之rAAV載體時，肝及腎中GAG水準顯著降低。GAG水準與在未經治療之WT小鼠中發現之GAG水準類似。 實例 4. 藉由以 hIDS-WPRE 構築體之基因療法的硫酸肝素 (HS) 及硫酸皮膚素 (DS) 之減少
此實例說明在小鼠中藉由hIDS之表現，硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素水準之降低。艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)自醣胺聚醣(GAG)、硫酸皮膚素及硫酸乙醯肝素移除硫酸根，且其不存在或失活導致GAG之積累，從而導致第II型黏多醣病(MPSII)或韓特氏症候群，其為胞溶體貯積症。
為了評估經最佳化之rAAV構築體所表現之hI2S之效力，量測GAG清除率。
使用液相層析法-質譜法(LC/MS)檢定量測醣胺聚醣(GAG)，該檢定可偵測在第12週自表5中所示之小鼠組提取之肝、腎、心臟、脾及腦組織中之硫酸乙醯肝素(HS)及硫酸皮膚素(DS)。結果展示於圖6A至圖6B中。
對於rAAV-XL024 (B組)，與未經治療之KO (E組)相比，肝及腎中之HS及DS GAG降低，且在腦中降低程度較小。此組未分析心臟及脾。對於rAAV-XL026 (C組)，與未經治療之KO (E組)相比，肝、腎、心臟、脾相比，HS及DS GAG降低，且在腦中降低程度較小。對於rAAV-XL032 (A組)，與未經治療之KO (E組)相比，肝及腎中之HS及DS GAG降低，且在腦中降低程度較小。
如圖6B中所示，將HS及DS GAG水準正規化為未經治療之IKO=0%降低及WT=100%降低。
總體而言，所有載體給藥組均顯示體組織中HS及DS GAG之降低%以及腦HS及DS GAG之GAG降低%。結果顯示，I2S之表現導緻小鼠組織中之GAG水準降低。 實例 5. 在小鼠中藉由以 hIDS-WPRE 構築體之基因療法的胞溶體貯積隔室之減少
此實例說明在小鼠中，例如在治療黏多醣病(MPSII)中，以hIDS -WPRE構建物進行酶替代療法後，如藉由LAMP1染色所偵測之胞溶體貯積隔室之減少。
簡言之，使用LAMP1染色來量測小鼠之胞溶體貯積隔室。對各種組織諸如肝以及腦海馬迴、丘腦、胼胝體、皮質、小腦及紋狀體進行染色。在此實例中，在實驗期間的第0天、第7天、第14天、第21天及第28天，向對照組小鼠鞘內(IT)投與I2S酶五次(表5中之F組)。LAMP1染色減少指示底物減少，亦即KO小鼠之病理之改善。
結果展示於圖7A及圖7B中。如圖7A中所見，在注射載體之小鼠之肝組織中觀察到LAMP1之顯著減少。肝中之效應與WT小鼠及以ERT治療之小鼠組相當。
腦展示於圖7B中。與未經治療之KO (E組)相比，在以rAAV-XL026之海馬迴中，在以rAAV-XL024及rAAV-XL026之胼胝體中以及在以rAAV-XL024及rAAV-XL026之丘腦中，LAMP1染色陽性之降低達到統計學顯著性。
總體而言，結果顯示，如藉由LAMP1染色所量測，在小鼠肝及腦組織中，IDS之投與導致胞溶體貯積隔室減少。 實例 6. 體內 rAAV 驅動之 hIDS-IRES-SUMF1 表現之表現
此實例比較了在小鼠中投與hIDS-IRES-SUMF1載體相對於hIDS-WPRE載體的hIDS之體內表現及活性。
SUMF1為活化IDS之FGly催化殘基所需的，所以使用表現hIDS及SUMF1之載體相對於表現hIDS-WPRE之載體進行比較。
將小鼠注射表現以下之rAAV載體：hIDS AUSopt-WPRE構築體(rAAV-XL026；C組)；hIDS-IRES-SUMF1構築體(rAAV-XL027；G組及XL029；H組)；或SUMF1構築體(rAAV-XL030；I組)，作為陰性對照。這些構築體之示意圖描繪於圖1B及圖2中。
六週齡小鼠經由尾部靜脈接受在200 µl體積中的5×109 vg載體，且在注射之後2天、7天及21天收集血清樣品。將一組年齡匹配之野生型小鼠分別用作陽性對照及陰性對照。示範性體內研究概述於表6中。表 6. 使用編碼 hIDS 及 SUMF1 相對於 hIDS 及 WPRE 之 rAAV 載體之示範性體內研究
組別 條件 治療 體積 劑量
C 對照 rAAV-XL026 (hIDS AUSopt-WPRE) 200 µl 5×109 vg
D 陽性對照 WT；未注射 - -
G 測試 rAAV-XL027 (hIDS wt-IRES-SUMF1 wt) 200 µl 200 µl
H 測試 rAAV-XL029 (hIDS AUSopt-IRES-SUMF1AUSopt) 200 µl 200 µl
I 陰性對照 rAAV-XL030 (SUMF1 wt) 200 µl 200 µl
藉由ELISA定量血清中IDS之表現水準。結果描繪於圖8中。出乎意料的是，與注射僅表現hIDS之rAAV-XL026載體之小鼠(C組)相比，注射表現hIDS及SUMF1之rAAV-XL027及rAAV-XL029之小鼠顯示第21天血清中之hI2S濃度較低。
當測試hI2S活性水準時獲得類似結果，如圖9中所示。對於注射表現hIDS及SUMF1之載體的所有組(G至H組)，活性水準皆低於注射表現hIDS-WPRE之載體的組(C組)。不希望受特定理論的束縛，據信rAAV-XL026載體中之WPRE元件產生增加mRNA穩定性的三級結構並隨後產生較高的蛋白表現，並因此活性增加。已描述了WPRE之其他功能機制，包括例如改良轉錄終止及促進mRNA核輸出。另一方面，SUMF1產生hIDS之更具活性的形式，但以WPRE元素表現之hIDS之量顯著更高。此實例中所用之rAAV載體為rAAV8。
結果顯示，相對於hIDS -IRES-SUMF1載體，表現hIDS -WPRE載體時IDS酶水準及活性更高。 實例 7. rAAV 驅動之 hIDS-WPRE 在小鼠體內之血清及組織中之長期表現
此實例比較了在投與hIDS -WPRE之三種劑量之一的小鼠中hIDS之體內表現及活性。在約12至13個月內評估血清及組織中之表現水準及活性。
將小鼠注射：表現hIDS AUSopt-WPRE構築體之rAAV載體(rAAV-XL026)，劑量為5×109 vg (D組)、2.5×1010 vg (E組)、1.25×1011 vg (F組)；空載體構築體rAAV-MY011，劑量為1.25×1011 vg (G組)，作為陰性對照。這些構築體之示意圖描繪於圖1B及圖2中。
五至七週齡小鼠經由尾部靜脈接受在200 µl體積內的載體，且在注射之後第7天、第14天、第28天、第56天、第84天、第112天、第140天、第168天、第196天、第224天、第252天、第280天、第308天、第336天及第364天收集血清樣品。將一組年齡匹配之野生型小鼠及一組年齡匹配之未治療IDS -KO小鼠分別用作陽性對照及陰性對照。示範性體內研究概述於表7中。表 7. 使用 rAAV 載體並監測 12 個月的示範性體內研究
組別 條件 治療 體積 劑量 N/ 組
D 測試 rAAV-XL026 (hIDS AUSopt-WPRE) 200 µl 5×109 vg 12
E 測試 rAAV-XL026 (hIDS AUSopt-WPRE) 200 µl 2.5×1010 vg 12
F 測試 rAAV-XL026 (hIDS AUSopt-WPRE) 200 µl 1.25×1011 vg 12
G 陰性對照 rAAV-MY011 (空載體) 200 µl 1.25×1011 vg 11
H 陰性對照 IDS-KO；未注射 - - 9
I 陽性對照 WT；未注射 - - 6
血清 hI2S 水準及活性： 藉由ELISA確定血清hI2S之表現水準。結果描繪於圖10中。hI2S濃度隨遞增的rAAV-XL026載體劑量而增加(D、E、F組)，且hI2S直至注射之後364天之最終時間點仍可偵測。此實例中所用之rAAV載體為rAAV8。
當測試hI2S活性水準時獲得類似結果，如圖11中所示。hI2S活性濃度隨遞增的rAAV-XL026載體劑量而增加(D、E、F組)，且hI2S活性直至注射之後364天之最終時間點仍可偵測。
組織 hI2S 水準及活性： 在組織中，使用ELISA量測hI2S，如圖12A中所示。對於rAAV-XL026 (D、E、F組)，在肝、脾、腎、心臟、肺及腦中可偵測到hI2S且其隨遞增劑量而增加。
在組織中，如圖12B中所示量測hI2S活性。在肝、脾、腎、心臟、肺及腦中可偵測到rAAV-XL026 (D、E、F組) hI2S活性且其隨遞增劑量而增加。
使用液相層析法-質譜法(LC/MS)檢定量測醣胺聚醣(GAG)，該檢定可偵測在第364天自表7中所示之小鼠組提取之肝、腎、心臟、脾、肺及腦組織中之硫酸乙醯肝素(HS)及硫酸皮膚素(DS)。結果展示於圖12C中。
在體組織中，在所有劑量下的rAAV-XL026 (D、E、F組)皆大大降低了HS及DS GAG水準。如圖12D中所示，將HS及DS GAG水準正規化為未經治療之IKO=0%降低及WT=100%降低。rAAV-XL026之所有三個劑量(D，E，F組)皆顯示體組織中HS及DS GAG之100%降低。在腦HS中，rAAV-XL026 D組之GAG降低了17%，rAAV-XL026 E組之GAG降低了38%，且rAAV-XL026 F組之GAG降低了50%。
對各種組織諸如肝以及腦海馬迴、丘腦、白質、皮質、小腦及紋狀體之LAMP1進行染色。腦展示於圖12E中。與未經治療之KO (H組)相比，在以rAAV-XL026 D組、E組及F組之海馬迴中，在以rAAV-XL026 E組及F組之紋狀體中，在以rAAV-XL026 E組及F組之白質中，在以rAAV-XL026 E組及F組之丘腦中，在以rAAV-XL026 E組及F組之皮質中以及在以rAAV-XL026 E組及F組之小腦中，LAMP1染色陽性之降低達到統計學顯著性。
骨體積： 使用微電腦斷層掃瞄(micro-CT)研究了身體結構。如圖13A及圖13B中所示，使用micro-CT在小鼠7、9、11和13月齡時量測隨時間推移的骨體積。
在圖13A及圖13B中，線A對應於rAAV-XL026 D組，線B對應於rAAV-XL026 E組，線C對應於rAAV-XL026 F組，線D對應於rAAV-MY011 G組陰性對照，線E對應於未經治療之IDS -KO組H陰性對照，且線F對應於未經治療之野生型I組陽性對照。
在肱骨中(圖13A)，rAAV-XL026 D組、E組及F組之骨體積之量測值與陽性對照野生型I組重疊，且這些組之體積低於陰性對照rAAV-MY011 G組及未經治療之IDS -KO H組。
在顱骨之顴弧中(圖13B)，在13個月時，rAAV-XL026 D組、E組及F組之骨體積之量測值與陽性對照野生型I組重疊，且這些組之體積低於陰性對照rAAV-MY011 G組及未經治療之IDS -KO H組。
這些結果顯示在I2S表現後肱骨及顴弧骨中較低的骨體積，其在13個月內仍維持。
總體而言，結果顯示，血清及組織I2S表現及活性水準以及所得的對骨體積的效應在約12至13個月內維持。 實例 8. 在小鼠中低劑量投與之後體內 rAAV 驅動之 hIDS-WPRE 表現之 3 個月監測
此實例說明在5×106 至5 x 109 vg之間的劑量下，投與hI2S之小鼠在3個月內的hI2S之體內表現及活性。
將小鼠注射：表現hIDS AUSopt-WPRE構築體之rAAV載體(rAAV-XL026)，劑量為5×106 vg (C組)、5×107 vg (D組)、5×108 vg (E組)、5×109 vg (F組)；空載體構築體rAAV-MY011，劑量為5×109 vg (B組)，作為陰性對照。
將五至七週齡小鼠經由尾部靜脈投與200 µl載體，且在注射之後第14天、第28天、第56天及第84天收集血清樣品。將一組年齡匹配之野生型小鼠及一組年齡匹配之未治療IDS -KO小鼠分別用作陽性對照及陰性對照。示範性體內研究概述於表8中。 表8. 使用rAAV載體並監測3個月的示範性體內研究
組別 條件 治療 體積 劑量 N/ 組
A 陰性對照 IDS-KO；未注射 - - 8
B 陰性對照 rAAV-MY011 (空載體) 200 µl 2.5×109 vg 8
C 測試 rAAV-XL026 (hIDS AUSopt-WPRE) 200 µl 5×106 vg 8
D 測試 rAAV-XL026 (hIDS AUSopt-WPRE) 200 µl 5×107 vg 8
E 測試 rAAV-XL026 (hIDS AUSopt-WPRE) 200 µl 5×108 vg 8
F 測試 rAAV-XL026 (hIDS AUSopt-WPRE) 200 µl 5×109 vg 8
G 陽性對照 WT；未注射 - - 5
血清 IDS 水準及活性： 藉由ELISA確定投與低劑量hIDS -WPRE載體之小鼠之血清中的hIDS表現水準且展示於圖14A中。D、E、F組之hI2S濃度隨遞減的rAAV-XL026載體劑量而降低，且C組之hI2S不可偵測。此實例中所用之rAAV載體為rAAV8。
如圖14B中所示量測血清I2S活性水準。D、E、F組之hI2S濃度隨遞減的rAAV-XL026載體劑量而降低，且C組之hI2S不可偵測。
總體而言，分別投與5×108 vg及5×109 vg劑量之D及E組顯示優於未經治療之小鼠的I2S表現及活性之增加，且I2S之水準及活性在84天或3個月內仍維持。
組織 I2S 水準及活性： 在肝、脾、腎、心臟、肺、骨髓、四頭肌及腦中，如藉由ELISA所量測，未經治療之KO (A組)及未經治療之WT (J組)以及陰性對照rAAV-MY011 (B組)不含有可偵測之人類I2S (hI2S)蛋白(圖14C)。自5×107 vg至5×109 vg，rAAV-XL026 D、E及F組含有隨遞增劑量而遞增的組織中hI2S濃度。
如圖14D中所示量測了肝、脾、腎、心臟、肺、骨髓、四頭肌及腦中之I2S活性。rAAV-MY011 (B組)在所有組織中皆含有與未經治療之KO (A組)類似的I2S活性。自5×107 vg至5×109 vg，rAAV-XL026 D、E及F組含有隨遞增劑量而遞增的組織中I2S活性濃度。可如圖14E中所示將給藥之KO小鼠各組織中之I2S活性水準與未經治療之WT水準相比較。
在投與低劑量包含hI2S-WPRE之rAAV載體之小鼠中，I2S之組織水準及活性以劑量依賴性方式增加。
組織 GAG 水準： 使用液相層析法-質譜法(LC/MS)檢定量測醣胺聚醣(GAG)，該檢定可偵測在第84天自表8中所示之小鼠組提取之肝、脾、腎、心臟、肺、骨髓、四頭肌、皮膚及腦組織中之硫酸乙醯肝素(HS)及硫酸皮膚素(DS)。如表9及表10中所示，將HS及DS GAG水準正規化為未經治療之IKO=0%降低及WT=100%降低。
在所量測之所有體組織中，5×108 vg rAAV-XL026 E組使HS及GAG水準降低＞90%。在腦中，5×108 vg rAAV-XL026 E組使腦中HS及GAG水準分別降低8.8%及41%。在所量測之所有體組織中，5×109 vg rAAV-XL026 F組使HS及GAG水準降低＞95%。在腦中，5×109 vg rAAV-XL026 F組使腦中HS及GAG水準分別降低39%及78%。
在投與5×107 、5×108 或5×109 vg包含IDS -WPRE之rAAV之後，體組織及腦中之HS及GAG水準降低。 表9. 經正規化之HS GAG減少
組織 rAAV-XL026 5×107 vg rAAV-XL026 5×108 vg rAAV-XL026 5×109 vg
肝 99% 100% 100%
脾 79% 98% 100%
腎 37% 91% 101%
心臟 20% 97% 99%
肺 50% 97% 100%
骨髓 92% 99% 100%
四頭肌 59% 99% 102%
皮膚 62% 94% 100%
腦 11% 8.8% 39%
表10. 經正規化之DS GAG減少
組織 rAAV-XL026 5×107 vg rAAV-XL026 5×108 vg rAAV-XL026 5×109 vg
肝 92% 99% 99%
脾 66% 95% 100%
腎 22% 97% 100%
心臟 43% 99% 99%
肺 32% 100% 100%
骨髓 88% 101% 101%
四頭肌 86% 100% 100%
皮膚 92% 94% 106%
腦 17% 41% 78%
胞溶體貯積： 對各種組織諸如肝、脾、腎、心臟以及腦海馬迴、丘腦、白質、皮質、小腦及紋狀體之LAMP1進行染色。體組織展示於圖14F中。在包括肝、脾及心臟之體組織中，與原始態(naïve ) KO對照相比，rAAV-XL026 5×107 vg劑量D組、5×108 vg劑量E組及5×109 vg劑量F組之LAMP1 IHC染色陽性顯著相抵。在腎中，與原始態KO對照相比，rAAV-XL026 5×108 vg劑量E組及5×109 vg劑量F組之LAMP1染色陽性顯著降低。
腦區中之LAMP1 IHC染色展示於圖14G中。在腦中，量測了海馬迴、紋狀體、丘腦、白質、皮質及小腦中之LAMP1陽性染色。在所有這些區中，rAAV-XL026劑量C、D、E及F組之LAMP1染色陽性與未經治療之KO對照A組無顯著不同。
結果顯示，在投與低劑量IDS -WPRE後體組織中之胞溶體貯積降低，但在腦中不顯著。
總體而言，結果顯示，在小鼠中投與低劑量包含hIDS -WPRE之rAAV之後，血清及組織I2S表現及活性在約三個約內仍維持，且體組織中胞溶體貯積降低，如藉由LAMP所確定。 實例 9. hI2S 轉基因產物在非人類靈長類動物 (NHP) 中的血清表現水準
此實例說明瞭在投與hI2S轉基因產物之非人類靈長類動物中的示範性PK/分佈研究。
約1.8至2歲非人類雄性靈長類動物經由靜脈內輸註投與hI2S產物。第劑量組動物接受1.25×1012 vg/kg低劑量hI2S (n=3)，且高劑量組動物接受6.25×1012 vg/kg較高劑量hI2S (n=6)。對照動物僅接受調配物緩衝液。
在從給藥前開始的各種時間點收集血清樣品，之後投與hI2S轉基因，接著每20天取樣至240天。在3個月時分別殺死低劑量組及高劑量組各自三隻動物。
圖15A顯示給藥後第1天至3個月屍體剖檢之NHP血清中低劑量組之hI2S轉基因產物血清濃度。在1.25×12 vg/kg (低劑量)下觀察到持續的hI2S轉基因產物濃度。
對應地，在圖15B中，血清中hI2S轉基因產物酶活性顯示出持續的水準至3個月。在3個月時，相對於僅接受調配物緩衝液的對照動物中所量測之NHP內源性I2S活性水準，觀察到高約5倍的I2S酶活性水準。
圖15C顯示給藥後第1天至約90天或3個月屍體剖檢之三個NHP及給藥後第1天至約240天或8個月的其餘三隻高劑量動物中高劑量組之hI2S轉基因產物血清濃度。
個別動物顯示變化的hI2S轉基因產物概況，且在達成之初始最大血清濃度水準中觀察到變異性。在跟蹤直至3個月屍體剖檢的動物中觀察到hI2S轉基因產物血清濃度之快速下降。血清中對應的hI2S酶活性顯示增加，隨後21天之後下降至約5200-7500 nmol/h/mL之平穩水準(圖15D)，說明儘管在3個月時終止的三隻動物中I2S轉基因產物濃度減小，但血清中hI2S酶活性為持續的。
跟蹤血清hI2S轉基因產物濃度及血清I2S活性至約240天(8個月)的動物顯示其hI2S轉基因產物濃度概況之變異性。兩隻動物顯示到約8個月為止I2S轉基因產物濃度下降至約100 ng/mL或更低。這亦與到約8個月為止所觀察之hI2S酶活性下降至約內源性水準(調配物緩衝液)相關聯。此研究中之一隻動物顯示hI2S轉基因產物濃度及酶活性持續至約8個月。
總體而言，資料顯示，即使在不存在免疫抑制劑之情況下，非人類靈長類動物中仍達成hI2S轉基因產物之持續表現。 實例 10. 低及高劑量非人類靈長類動物中 hI2S 轉基因產物及 I2S 酶活性之血清濃度相對於抗轉基因產物抗體 ( 亦稱為抗 hI2S ADA ( 抗藥物抗體 )) 及抗 AAV8 ADA 力價之比較
此實例說明瞭用hI2S轉基因產物濃度及酶活性作圖之個別非人類靈長類動物之抗hI2S ADA與抗AAV8 ADA資料之間的比較。
針對hI2S轉基因產物濃度及酶活性對個別動物之抗hI2S ADA及抗AAV8 ADA資料作圖(圖16)。這些圖中說明瞭僅長達3個月的ADA資料。在一些動物(2001、3002、4003、4001及4002)中，在不存在抗hI2S ADA之情況下，在第一個月內觀察到hI2S水準之初始下降。hI2S水準之下降不為劑量依賴性。NHP血清中hI2S轉基因產物濃度之初始下降(在第一個月內)因動物而異(10%至80%)。
平衡之後血清中hI2S轉基因產物之下降與接受高劑量hI2S之組中抗hI2S ADA之存在有關。「平衡狀態」或「重建狀態」係指I2S酶或I2S酶活性之「穩定狀態」或平穩水準。在一些動物(3002和4001)中抗AAV8 ADA之存在可能阻止重新給藥。低劑量組中沒有動物顯示血清中抗hI2S ADA之存在。
結果顯示，在接受高劑量包含hIDS -WPRE之rAAV-XL026的非人類靈長類動物中，血清I2S水準之下降與抗hI2S ADA之存在有關。 實例 11. 個別非人類靈長類動物肝 hI2S 轉基因產物之濃度概況
此實例說明瞭非人類靈長類動物肝中之hI2S轉基因產物濃度概況。
在1個月及2個月時從低劑量(圖17A)及高劑量(圖17B)動物中進行肝生檢，且在3個月時收集最後的肝樣品。在3個月及6個月時對意欲進行12個月屍體剖檢的三隻高劑量組動物進行生檢。
各生檢均取自左葉及右葉。在1個月與3個月之間，低劑量組之肝之左葉與右葉之間的平均hI2S轉基因產物濃度之範圍為平均38.2ng/mL至42.5ng/mL。
在1個月時，高劑量組之肝中hI2S轉基因產物濃度之範圍為175.1 ng/mL至367.6 ng/mL。一隻動物(動物3001)顯示左葉(101.8ng/mL)與右葉(528.3 ng/mL)之間的較大差異。
在2個月時，兩隻動物(動物3001及動物3002)顯示自1個月至2個月肝hI2S轉基因產物濃度之快速下降。其他動物(包括3003)亦顯示自2個月至6個月的下降，但程度較小。
總體而言，這些結果顯示，投與rAAV-XL026之後1個月至3個月，非人類靈長類動物組織中I2S轉基因產物之個別濃度概況。 實例 12. hI2S 轉基因產物在非人類靈長類動物組織中的比較性濃度概況
此實例說明瞭hI2S轉基因產物在非人類靈長類動物組織中的比較性濃度概況。
在3個月時，對低劑量組之動物及3隻高劑量組之動物進行組織屍體剖檢。
藉由ELISA量測了包括腎、脾、肺、心臟及骨髓之各種器官之組織均質物中之hI2S轉基因產物濃度。儘管與低劑量組(＞640 ng/mL)相比，3個月時高劑量組之血清中之hI2S轉基因產物濃度顯示在存在抗hI2S ADA之情況下顯著較低的水準(＜250 ng/mL)，但是腎(圖18A)及脾(圖18B)中之平均hI2S濃度顯示高劑量組中之水準高於較低劑量組。
在存在抗hI2S ADA之情況下，高劑量組之3隻動物顯示肺(圖18C)及心臟(圖18D)中之較低hI2S轉基因產物濃度，而在骨髓(圖18E)中，高劑量及低劑量組之動物之間的hI2S組織濃度相當。因為組織來自健康的NHP，所以偵測了例如肺中調配物緩衝液組中之內源性I2S。
結果顯示rAAV-XL026治療後不同非人類靈長類動物中I2S之比較性濃度概況。 實例 13. 相對於 IDS 剔除小鼠，非人類靈長類動物中之比較性 hI2S 組織暴露
此實例說明非人類靈長類動物與IDS KO小鼠之間各種靶組織中的比較性I2S濃度及酶活性。
IDS KO小鼠中自2.5×1011 vg/kg及2.5×1010 vg/kg的hI2S組織酶活性及對應的HS GAG減少百分比展示於表11中。
在小鼠中，對於除腎之外的大部分組織，在約2.5×1010 vg/kg之劑量下觀察到大於95% HS GAG減少，在腎中觀察到約91%的減少。在心臟及骨髓中，與在2.5×1010 vg/kg下的IDS KO小鼠相比，非人類靈長類動物之低劑量組之資料顯示較高的hI2S組織濃度及酶活性。
在肺組織中，在IDS KO小鼠中，僅有30% WT I2S酶活性，而此水準顯示97%的HS GAG減少。在投與低劑量hI2S之非人類靈長類動物中，肺中之酶活性顯示在40%下的較大% WT hI2S酶活性。藉由經由IV輸注在1.25×1012 vg/kg下向NHP投與rAAV-XL026，達成了肺中足夠的hI2S轉基因產生暴露，其可導致疾病模型中HS GAG減少至≥95%。 表11. 剔除小鼠及非人類靈長類動物中hI2S濃度及酶活性之比較以及GAG減少
   3個月屍體剖檢之NHP組織高於媒介物對照的hI2S濃度 3個月屍體剖檢之KO小鼠之hI2S濃度(在2.5×1010 vg/kg下) 表示為WT之%的NHP組織hI2S酶活性 表示為WT之%的KO小鼠組織hI2S酶活性(在2.5×1010 vg/kg下) 表示為KO媒介物之%的KO小鼠組織HS GAG減少(在2.5×1010 vg/kg下) 表示為WT之%的KO小鼠hI2S酶活性(在2.5×1011 vg/kg下) 表示為KO媒介物之%的KO小鼠組織HS GAG減少(在2.5×1011 vg/kg下)
肺(低) 7.1 ng/mg 2 ng/mg 40% 30% 約97% 270% 100%
肺(高) 0.9 ng/mg    20%
心臟(低) 12.5 ng/mg 1.4 ng/mg 232% 210% 約97% 2480% 100%
心臟(高) 4.8 ng/mg    174%
骨髓(低) 29.6 ng/mg 15.1 ng/mg 210% 310% (在2.5×109 vg/kg下為10%) 100% (在2.5×109 vg/kg下為92%) 46,000% 100%
骨髓(高) 30.4 ng/mg    170%
腎(低) 4.5 ng/mg 3 ng/mg 10% 90% 約91% 1380% 100%
腎(高) 31.6 ng/mg    180%
脾(低) 36.2 ng/mg 17 ng/mg 100% 140% 約95% 1170% 100%
脾(高) 58.4 ng/mg    190%
等效物及範疇
熟習此項技術者將認識到或能夠僅僅使用常規實驗確定本文所述之本發明特定實施例之許多等效物。本發明之範疇不意欲限於上文描述，而是如以下申請專利範圍中所示：
圖1A為hIDS表現載體之表現構築體之示意圖。圖1B為展示hIDS-WPRE之經最佳化之表現構築體的一系列示意圖。ITR：反向末端重複序列；pTBG：甲狀腺激素結合球蛋白啟動子；hTTR：人類運甲狀腺素蛋白啟動子；CRM：順式作用調控模組；MVM內含子：小鼠微小病毒內含子；WPRE：土撥鼠肝炎病毒(WHV)轉錄後調控元件；BGH pA：牛生長激素終止劑+ polyA；COOLopt：藉由COOL (Codon Optimization Online)平台進行密碼子最佳化；AUSopt：藉由內部密碼子使用頻率表進行密碼子最佳化。 圖2為展示hIDS-IRES-SUMF1之經最佳化之表現構築體的一系列示意圖。ITR：反向末端重複序列；pTBG：甲狀腺激素結合球蛋白啟動子；hTTR：人類運甲狀腺素蛋白啟動子；CRM：順式作用調控模組；MVM內含子：小鼠微小病毒內含子；WPRE：土撥鼠肝炎病毒(HWP)轉錄後調控元件；BGH pA：牛生長激素終止劑+ polyA；COOLopt：藉由COOL (Codon Optimization Online)平台進行密碼子最佳化；AUSopt：藉由內部密碼子使用頻率表對密碼子進行最佳化。 圖3為展示在注射經鑑定之rAAV載體之後第0天、第2天、第7天、第21天、第8週及第12週時小鼠血清中之總I2S濃度的圖。藉由ELISA確定hI2S濃度。 圖4A為展示在注射經鑑定之rAAV載體之後第0天、第2天、第7天、第21天、第8週及第12週時小鼠血清中之I2S活性的圖。圖4B為展示小鼠組織中之I2S濃度的圖。圖4C為展示小鼠組織中之I2S活性的圖。圖4D為展示投與hIDS表現載體之動物相對於野生型的相對I2S活性的圖。 圖5A為展示小鼠腦中GAG水準的圖。圖5B為展示小鼠肝中GAG水準的圖。圖5C為在注射經鑑定之rAAV載體之後第12週時小鼠腎中GAG水準的圖。 圖6A為展示在注射經鑑定之rAAV載體之後第12週時小鼠肝及腎等中硫酸乙醯肝素(heparan sulfate；HS)及硫酸皮膚素(DS) GAG水準的圖。使用鄧奈特方法(Dunnett method)利用多重比較進行相對於未治療剔除動物的單向ANOVA。**P＜0.01，***P＜0.001。 圖6B為展示在注射經鑑定之rAAV載體之後第12週時肝及腎等中硫酸乙醯肝素(HS)及硫酸皮膚素(DS)水準相對於對照動物的減少百分比的圖。 圖7A為展示藉由LAMP1免疫組織化學染色法確定的肝中LAMP1水準的圖，LAMP1用作偵測減少之胞溶體貯積隔室(compartment)的生物標記物。使用鄧奈特方法利用多重比較進行相對於未治療剔除動物的單向ANOVA。***指示P＜0.001。圖7B為展示藉由LAMP1免疫組織化學染色法確定的腦中LAMP1水準的圖，LAMP1用作偵測減少之胞溶體貯積隔室的生物標記物。使用鄧奈特方法利用多重比較進行相對於未治療剔除動物的單向ANOVA。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。 圖8為注射表現hI2S及SUMF1之載體之後第2天、第7天及第21天時小鼠血清中總hI2S濃度的圖。 圖9為展示在注射經鑑定之rAAV載體之後第0天、第2天、第7天及第21天時小鼠血清中之hI2S活性的圖。 圖10為展示注射之後多達364天的I2S濃度的圖。圖11為展示注射之後多達364天的I2S濃度的圖。 圖12A為在12個月內如藉由ELISA所量測的投與hI2S之小鼠之血清及組織中I2S濃度的圖。圖12B為血清及小鼠組織中I2S活性的圖。圖12C為小鼠組織中GAG水準的圖。圖12D為小鼠組織中GAG水準之減少百分比的圖。圖12E為LAMP1染色的圖，LAMP1為胞溶體貯積隔室之生物標記物。統計係使用單向ANOVA進行的，該單向ANOVA係使用鄧奈特方法利用多重比較而相對於未治療剔除動物進行的。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns=不顯著。 圖13A展示肱骨中骨體積的圖，圖13B展示如藉由microCT所量測的，投與I2S之小鼠之顴弧中相對於對照動物的骨體積的圖。 圖14A為在90天內如藉由ELISA所量測的投與低劑量hI2S之小鼠之血清中I2S濃度的圖。圖14B為血清中I2S活性的圖。圖14C為小鼠組織中I2S濃度的圖。圖14D為小鼠組織中I2S活性的圖。圖14E為投與低劑量hI2S動物相對於野生型動物之相對I2S活性的圖。 圖14F為展示投與hI2S之小鼠之體組織包括肝、脾、心臟及腎中LAMP1染色水準的圖。圖14G為展示腦中LAMP1染色水準的圖。 圖15A為接受低劑量I2S之非人類靈長類動物之I2S血清濃度的圖。圖15B為接受低劑量I2S之非人類靈長類動物之I2S血清活性的圖。 圖15C為接受高劑量I2S之非人類靈長類動物之I2S血清濃度的圖。圖15D為接受高劑量I2S之非人類靈長類動物之I2S血清活性的圖。 圖16展示個別非人類靈長類動物之I2S濃度及酶活性概況以及相同動物之抗I2S ADA活性概況。 圖17A展示投與低劑量hI2S之個別非人類靈長類動物肝中之hI2S濃度。圖17B展示投與高劑量hI2S之個別非人類靈長類動物肝中之hI2S濃度。 圖18A展示投與高劑量及低劑量I2S之非人類靈長類動物腎中之hI2S濃度。圖18B展示投與高劑量及低劑量I2S之非人類靈長類動物脾中之hI2S濃度。圖18C展示投與高劑量及低劑量I2S之非人類靈長類動物肺中之hI2S濃度。圖18D展示投與高劑量及低劑量I2S之非人類靈長類動物心臟中之hI2S濃度。圖18E展示投與高劑量及低劑量I2S之非人類靈長類動物骨髓中之hI2S濃度。

Claims (48)

  1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)載體，其包含AAV8殼體及經密碼子最佳化之編碼人類艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之序列。
  2. 一種重組腺相關病毒(rAAV)載體，其包含AAV9殼體及經密碼子最佳化之編碼人類艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之序列。
  3. 如請求項1或2之rAAV載體，其中該經密碼子最佳化之編碼人類I2S酶之序列包含與SEQ ID NO: 6具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的序列。
  4. 如請求項3之rAAV載體，其中該經密碼子最佳化之編碼人類I2S酶之序列包含與SEQ ID NO: 11或12相同的序列。
  5. 如請求項1之rAAV載體，其中該載體進一步包含肝特異性啟動子。
  6. 如請求項5之rAAV載體，其中該肝特異性啟動子為運甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)。
  7. 如請求項5或6之rAAV載體，其中該載體進一步包含5’及3’反向末端重複序列(ITR)、I2S序列上游的內含子及順式作用調控模組(CRM)。
  8. 如請求項2之rAAV載體，其中該載體進一步包含遍在啟動子。
  9. 如請求項8之rAAV載體，其中該載體進一步包含5’及3’反向末端重複序列、I2S序列上游的內含子及順式作用調控模組(CRM)。
  10. 如前述請求項中任一項之rAAV載體，其中該rAAV載體包含硫酸酯酶修飾因子1 (SUMF1)。
  11. 如請求項10之rAAV載體，其中該SUMF1在內部核糖體進入位點(IRES)之後。
  12. 如前述請求項中任一項之rAAV載體，其中該載體進一步包含WPRE序列。
  13. 如請求項7或9之rAAV載體，其中該內含子為小鼠微小病毒(MVM)或SV40內含子。
  14. 如請求項7或9之rAAV載體，其中該CRM為肝特異性CRM。
  15. 如請求項7或9之rAAV載體，其中該CRM為神經元特異性CRM。
  16. 如請求項7或9之rAAV載體，其中該CRM為CRM8。
  17. 如請求項7或9之rAAV載體，其中該載體包含至少三種CRM。
  18. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV8殼體及rAAV載體，該載體包含： a.   5’反向末端重複序列(ITR)； b.   順式作用調控模組(CRM)； c.   肝特異性啟動子； d.   小鼠微小病毒(MVM)； e.   編碼人類艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之序列； f.    土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)；及 g.   3’ ITR。
  19. 如請求項18之rAAV，其中該編碼人類I2S酶之序列為野生型序列或經密碼子最佳化之序列。
  20. 如請求項19之rAAV，其中該編碼人類I2S酶之序列為與SEQ ID NO: 6具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的經密碼子最佳化之序列。
  21. 如請求項18之rAAV，其進一步包含編碼硫酸酯酶修飾因子1 (SUMF1)及內部核糖體進入位點(IRES)之序列。
  22. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV9殼體及rAAV載體，該載體包含： a.   5’反向末端重複序列(ITR)； b.   順式作用調控模組(CRM)； c.   遍在啟動子； d.   小鼠微小病毒(MVM)； e.   編碼人類艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之序列； f.    土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)；及 g.   3’ ITR。
  23. 如請求項22之rAAV，其中該編碼人類I2S酶之序列為野生型序列或經密碼子最佳化之序列。
  24. 如請求項23之rAAV，其中該編碼人類I2S酶之序列為與SEQ ID NO: 6具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的經密碼子最佳化之序列。
  25. 如請求項22之rAAV，其進一步包含編碼硫酸酯酶修飾因子1 (SUMF1)及內部核糖體進入位點(IRES)之序列。
  26. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該rAAV載體不包含ApoB。
  27. 一種治療患有韓特氏症候群(MPS II)之個體之方法，其包含向該有需要之個體投與前述請求項中任一項之rAAV。
  28. 一種治療患有韓特氏症候群(MPS II)之個體之方法，其包含向該有需要之個體投與重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體包含AAV8或AAV9殼體及可操作地連接至編碼艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)之核酸序列之啟動子，且其中投與導致該個體之I2S酶活性之增加。
  29. 如請求項28之方法，其中在該個體之血清中偵測到該I2S活性之增加。
  30. 如請求項28至29中任一項之方法，其中在該個體之肝中偵測到該I2S活性之增加。
  31. 如請求項28至30中任一項之方法，其中在中樞神經系統(CNS)中偵測到該I2S活性。
  32. 如請求項28至31中任一項之方法，其中在該個體之腦中偵測到該I2S活性之增加。
  33. 如請求項28至32中任一項之方法，其中在腦之海馬迴、丘腦、胼胝體、皮質、小腦或層中偵測到該I2S活性之增加。
  34. 如請求項28至33中任一項之方法，其中在該個體之腎中偵測到該I2S活性之增加。
  35. 如請求項28至34中任一項之方法，其中在單次投與之後，該I2S活性之該增加維持至少30、60、90、120、150、180天或更長時間。
  36. 如請求項28至35中任一項之方法，其中藉由硫酸肝素檢定來量測I2S活性之水準。
  37. 如請求項28至35中任一項之方法，其中藉由硫酸皮膚素檢定來量測I2S活性之水準。
  38. 如請求項28至37中任一項之方法，其中投與該AAV降低該個體之醣胺聚醣(GAG)水準。
  39. 如請求項38之方法，其中投與該AAV降低該個體之血清中之GAG水準。
  40. 如請求項38至39中任一項之方法，其中投與該AAV降低該個體之肝中之GAG水準。
  41. 如請求項38至40中任一項之方法，其中投與該AAV降低該個體之腎中之GAG水準。
  42. 如請求項38至41中任一項之方法，其中投與該AAV降低該個體之CNS中之GAG水準。
  43. 如請求項38至41中任一項之方法，其中投與該AAV降低該個體之腦中之GAG水準。
  44. 如請求項43之方法，其中投與該AAV降低腦之海馬迴、丘腦、胼胝體、皮質、小腦或紋狀體中之GAG水準。
  45. 如請求項28至44中任一項之方法，其中靜脈內投與該AAV。
  46. 如請求項30至44中任一項之方法，其中鞘內投與該AAV。
  47. 如請求項45或46之方法，其中在約5×109 vg之劑量下投與該AAV。
  48. 如請求項30至47中任一項之方法，其中投與該rAAV不引起免疫反應。
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