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TWI835747B - 用於治療黏多醣病 ii 型之基因治療 - Google Patents

用於治療黏多醣病 ii 型之基因治療 Download PDF

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TWI835747B
TWI835747B TW107133321A TW107133321A TWI835747B TW I835747 B TWI835747 B TW I835747B TW 107133321 A TW107133321 A TW 107133321A TW 107133321 A TW107133321 A TW 107133321A TW I835747 B TWI835747 B TW I835747B
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克里斯欽 亨德勒
詹姆士Ｍ 威爾森
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賓州大學委員會
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Abstract

本文提供包含AAV9介導的鞘內/腦池內和/或全身遞送表現盒之共同治療療法，該表現盒含有hIDS基因和二或多種免疫抑制劑。本文亦提供含有用於治療韓特氏徵候群和與韓特氏徵候群相關症狀的此等載體及組成物的方法和套組。

Description

用於治療黏多醣病II型之基因治療
本發明係於國立衛生研究院(National Institutes of Health)之核准號R01DK54481、P40OD010939及P30ES013508的政府支持下完成，美國政府可擁有本發明的特定權利。
本發明係關於治療黏多醣病II型(MPS II)，亦稱為韓特氏徵候群(Hunter Syndrome)的基因治療方法。
MPS II，亦已知為韓特氏徵候群，是一種罕見的X染色體隱性遺傳疾病，每100,000人中有1人至每170,000人中有1人受影響，主要是男性。這種進行性和破壞性疾病是由艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因的突變引起的，導致溶酶體酶的缺乏，艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(IDS，或稱為I2S)-其為硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)和硫酸皮膚素(dermatan sulfate)的溶酶體代謝所需的酶。這些普遍存在的多醣，稱為GAG(glycosaminoglycans，糖胺聚醣)， 在MPS II患者的組織和器官中積聚，導致特徵性蓄積性損傷和多種疾病後遺症。此病患族群的發病率和死亡率很高-在嚴重表型(以神經認知惡化為特徵)的病患中，已報導在平均年齡為11.7歲時發病；在患有輕度或減弱表型的患者中，已報導於21.7歲時死亡。
MPS II病患在出生時表現正常，但疾病的表徵和症狀通常在18個月至4歲之間成為嚴重型，而在減弱型為4至8歲之間。所有受影響患者常見的表徵和症狀包括身材矮小、面部粗糙、巨頭畸形、巨舌症、聽力喪失、肝臟和脾腫大、多發性心臟病、關節攣縮、椎管狹窄和腕管綜合症。經常性上呼吸道和耳部感染發生於大多數患者，且進行性氣道阻塞通常被發現，導致睡眠呼吸暫停且通常會死亡。心臟病為此一族群死亡的主要原因，其特徵是瓣膜功能障礙導致右心室和左心室肥大和心臟衰竭。死亡通常歸因於阻塞性呼吸道疾病或心臟衰竭。
在嚴重型疾病中，可以達成早期發育的程度，但發育遲緩在18-24個月內非常明顯。一些患者無法通過在首年聽力篩查測試，其他程度被延遲，包括沒有支撐能力、行走能力和言語能力。發育進程在6.5歲左右開始停滯。雖然有一半患有MPS II的兒童接受如廁訓練，但大多數兒童(如果不是全部)將隨著疾病的進展而失去這種能力。
具有顯著神經系統受引響的患者表現出嚴重的行為障礙，包括從生命的第二年開始的過動、頑固和 攻擊性並持續到8-9歲，此時神經變性減弱了這種行為。
超過一半達到10歲的嚴重受影響患者據報導會癲癇發作，且直到死亡時，大多數中樞神經系統(CNS)受累的患者會嚴重殘疾並需要不間斷的照護。雖然患有減弱型疾病的患者表現出正常的智力功能，但MRI成像顯示所有MPS II患者的大腦異常，包括白質病變、腦室擴大和腦萎縮。
以重組艾杜硫酶(Elaprase®，Shire Human Genetic Therapies)的酵素替代治療(「ERT」)是韓特氏徵候群唯一被核准的治療方法，並且須每週輸注給藥。然而，目前施用的ERT並不會通過血腦屏障(「BBB」)，因此無法解決患具有嚴重疾病患者(即具有CNS/神經認知和行為參與的MPS II)的未滿足需求。目前解決該問題的努力旨在修正酵素以使其能夠通過BBB。
本文提供使用複製缺陷腺相關病毒(adeno-associated virus，「AAV」)傳送人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(「hIDS」)基因至被診斷患有MPS II之病患(人類受試者)的CNS，亦已知為韓特氏徵候群(Hunters syndrome)。治療目的係藉由基於rAAV之CNS導向的基因治療作為可行方法，以功能上取代病患有缺陷的艾杜醣醛酸2-硫酸酯酶以治療疾病。量測治療療效可藉由評估(a)預防具有MPS II(韓特氏徵候群)病患的神經認知減弱；(b)降低疾病的生物標誌，例如CSF、血清及/或尿液中的GAG水平及/或酵素活性(IDS或己糖胺酶(hexosaminidase))，及/或肝臟和脾臟的體積。嬰兒的神經認知可藉由貝里嬰幼兒發展量表(Bayley Scales of Infant and Toddler Development,Third Ed.,BSID-III)來測量，可進行神經認知和適應性行為評估(例如，分別使用貝里嬰兒發展量表(Bayley Scales of Infant Development)和文蘭德適應行為量表(Vineland Adaptive Behavior Scales))。
在某些具體實施例中，提供治療人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(hIDS)缺乏症的治療療法，其包括共同治療。該共同治療包含共同投予：(a)複製缺陷型重組腺相關病毒(rAAV)的懸浮液，其中：(i)該rAAV具有AAV9衣殼和含一核酸序列的載體基因體，該核酸序列在指導hIDS(rAAV9.hIDS)表現的調控序列下編碼hIDS；(ii)適於鞘內遞送的調配物緩衝液，其包含生理可相容的水性緩衝液和可選擇的表面活性劑，及賦形劑，(b)至少第一免疫抑制劑，其選自至少一種皮質類固醇、抗代謝劑、T細胞抑制劑、大環內酯或細胞抑制劑；及(c)至少一種第二免疫抑制劑，其選自至少一種皮質類固醇、抗代謝劑、T細胞抑制劑、大環內酯或細胞抑制劑，其中投予至少一種免疫抑制劑係在遞送rAAV9.hIDS載體的同一天或之前開始；且其中在載體給藥後持續投予至少一種免疫抑制劑至少8週。在某些具體實施例中，該rAAV9.hIDS具有選自：SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：11；或SEQ ID NO：14之載體基因體。在某些具體實施例中，在載體遞送之前，該病患最初預先給予靜脈注射類固醇。在某些 具體實施例中，病患在載體遞送後給予口服類固醇，在某些具體實施例中，該療法包含一或多種含他克莫司(tacrolimus)或西羅莫司(sirolimus)或其組合的大環內酯。在某些具體實施例中，投予載體前先遞送第一劑量之大環內酯。在某些具體實施例中，在給予AAV9.hIDS後第48週停止免疫抑制療法。在某些具體實施例中，懸浮液的pH為6至9，或pH為6.8至7.8。在某些具體實施例中，rAAV9.hIDS可以約1.9×1010GC/g腦質量之劑量經鞘內注射給藥。在某些具體實施例中，rAAV9.hIDS可以約6.5×1010GC/g腦質量之劑量經鞘內注射給藥。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為1.9×1010GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為9.4×1010GC/g腦質量。
在某些具體實施例中，提供含複製缺陷型重組腺相關病毒(rAAV)懸浮液的用途，其中rAAV包含AAV9衣殼及含一核酸序列的載體基因體，該核酸序列在指導hIDS表現(rAAV9.hIDS)的調控序列下編碼人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(hIDS)，其中該懸浮液包含劑量約1.3×1010基因體拷貝數(GC)/g腦質量或約6.5×1010基因體拷貝數(GC)/g腦質量的rAAV9.hIDS。在某些具體實施例中，該rAAV9.hIDS具有選自：SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：11；或SEQ ID NO：14之載體基因體。在某些具體實施例中，係在含二或多種免疫抑制劑之共同治療療法中使用。在某些具體實施例中，二或多種免疫抑制劑包含：至少一種第一免疫抑制劑，選自至少一種皮質 類固醇、抗代謝劑、T細胞抑制劑、大環內酯，或細胞抑制劑；及至少一種第二免疫抑制劑，選自至少一種皮質類固醇、抗代謝劑、T細胞抑制劑、大環內酯或細胞抑制劑。在某些具體實施例中，在rAAV9.hIDS遞送之前，該病患最初預先給予靜脈注射類固醇。在某些具體實施例中，該病患在rAAV9.hIDS遞送後給予口服類固醇，在某些具體實施例中，該共同療法包含一或多種含他克莫司或西羅莫司或其組合的大環內酯。在某些具體實施例中，該人類病患已被診斷出黏多醣病II(MPS II)或嚴重韓特氏徵候群。
在某些具體實施例中，提供含複製缺陷型重組腺相關病毒(rAAV)水性懸浮液，其包含AAV9衣殼及含一核酸序列的載體基因體，該核酸序列在指導hIDS表現(rAAV9.hIDS)的調控序列下編碼人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(hIDS)，其中該懸浮液被調配成劑量為1.3×1010GC/g腦質量或約6.5×1010GC/g腦質量用於鞘內注射至所需人類。在某些具體實施例中，該懸浮液用於與下列共同治療：(i)至少一種第一免疫抑制劑，選自至少一種皮質類固醇、抗代謝劑、T細胞抑制劑、大環內酯或細胞抑制劑：及(ii)至少一種第二免疫抑制劑，選自至少一種皮質類固醇、抗代謝劑、T細胞抑制劑、大環內酯或細胞抑制劑，其中投予免疫抑制劑是在AAV載體遞送之前或同日開始；且其中投予至少一種免疫抑制劑是在載體投予後持續至少8週。
在某些具體實施例中，提供一種以複製缺陷型重組腺相關病毒(rAAV)治療所需病患的方法，其包含以約為1.3×1010GC/g腦質量或約6.5×1010GC/g腦質量之劑量鞘內注射一包裹於AAV9衣殼中之編碼人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(hIDS)的異源性核酸。在某些具體實施例中，該病患已被診斷具有黏多醣病II(MPS II)或嚴重韓特氏徵候群。在某些具體實施例中，該rAAV9.hIDS具有選自SEQ ID NO：3；(b)SEQ ID NO：11；或(c)SEQ ID NO：14之載體基因體。在某些具體實施例中，該劑量係以至少1.3×1010GC/g腦質量、至少1.9×1010GC/g腦質量、至少6.5×1010GC/g腦質量或9.4×1010GC/g腦質量或約4×1011GC/g腦質量投予。
本發明這些和其他面向從本發明的詳細描述將是顯而易見的。
10‧‧‧遞送裝置
12‧‧‧注射器
14‧‧‧注射器
16‧‧‧旋轉公魯爾接頭
18‧‧‧閥門
20‧‧‧配管
22‧‧‧夾體
24‧‧‧接頭
26‧‧‧穿刺針
28‧‧‧穿刺針
圖1是AAV9.CB.hIDS載體基因體的示意圖。IDS表現盒側翼為反向末端重複序列(ITR)，由巨細胞病毒(cytomegalovirus；CMV)增強子和雞β肌動蛋白啟動子(CB7)的雜交體驅動表現。轉殖基因包括雞β肌動蛋白內含子和兔β-球蛋白多聚腺苷酸化(polyA)信號。
圖2A-2C提供IT載體治療後MPS II小鼠的CNS和血清中的IDS表現。MPS II小鼠在2-3個月齡時以ICV注射AAV9.CB.hIDS進行治療，劑量為三種劑量之一：3×108GC(低)、3×109GC(中)或3×1010GC(高)。注射後三週後將動物犧牲，在CSF(圖2A)全腦均質物(圖2B)和 血清(圖2C)中測量IDS活性。野生型和未治療的MPS II小鼠作為對照。
圖3提供投予AAV9.CB.hIDS的MPS II小鼠中載體DNA的生物分佈。以ICV注射3×1010GC的AAV9載體治療MPS II小鼠，注射後3週，將動物犧牲並藉由Taqman PCR在組織DNA中定量載體基因體。
圖4A-4D提供IT載體在MPS II小鼠中遞送後周邊GAG的校正。MPS II小鼠在2-3個月齡時以3×108GC(低)、3×109GC(中)或3×1010GC(高)三種劑量之一，用ICV注射AAV9.CB.hIDS治療。注射後三個月將動物犧牲，在肝臟(圖4A)和心臟(圖4B)中測量己糖胺酶活性，在所有劑量之肝臟中以及在中劑量和高劑量之心臟中都觀察到儲存校正。在肝臟(圖4C)和心臟(圖4D)中測量GAG含量，野生型和未治療的MPS II小鼠作為對照。*p<0.05，單因子變異數分析(one-way ANOVA)，然後進行Dunnett檢驗。
圖5A-5L提供MPS II小鼠中腦儲存損傷的劑量依賴性解析。MPS II小鼠在2-3個月齡時以3×108GC(低)、3×109GC(中)或3×1010GC(高)三種劑量之一，用ICV注射AAV9.CB.hIDS。注射後三個月將動物犧牲，並將大腦之溶小體膜蛋白LIMP2和神經節苷脂GM3染色，藉由盲目評價者在來自每隻動物的四個皮質腦切片中定量染色陽性之細胞的GM3(圖5A、5C、5E、5G和5I)和LIMP2(5B、5D、5F、5H和5J)。顯示代表性的皮質腦切片(GM3，圖5K；LIMP2，圖5L)。野生型和未治療的 MPS II小鼠作為對照。*p<0.05，單因子變異數分析，然後進行Dunnett檢驗。
圖6A-6C顯示在經載體治療的MPS II小鼠中改善的物體區辨(object discrimination)。未經治療的MPS II小鼠及WT雄性同窩出生仔鼠在4-5個月齡時進行行為測試。MPS II小鼠在2-3個月齡時以3×108GC(低)、3×109GC(中)或3×1010GC(高)三種劑量之一，用ICV注射AAV9.CB.hIDS。注射後兩個月，動物接受行為測試。圖6A說明Y迷宮行為，而圖6B說明情境恐懼制約(contextual fear conditioning)，其藉由盲目評價者在注射後2個月評估。「Pre」表示在接收到無信號的1.5mA足部衝擊後24小時重新暴露於封閉空間時的凍結時間。*p<0.05，雙因子變異數分析(two-way ANOVA)，然後是Sidak的多重比較測試。圖6C顯示在新的對象再認作業(recognition task)中探索新穎或熟悉的對象所花費的百分比時間，其用於評估長期記憶。野生型和未處理的MPS II小鼠作為對照。*p<0.05，使用Bonferroni校正的t試驗(t-test)用於多重比較。
圖7A-7B提供在以IT AAV9治療的MPS I小鼠中大腦存儲損傷之酵素表現和修正的比較。MPS I小鼠在2-3個月齡時以3×108GC(低)、3×109GC(中)或3×1010GC(高)三種劑量之一，用ICV注射AAV9.CB.hIDUA。在載體注射後3週將一同年齡群之動物犧牲，收取大腦，測量IDUA活性。此顯示於圖7A。圖7B顯示在注射後3個月將第二同年齡群之動物犧牲，並對於大腦之溶小體膜蛋 白LIMP2染色。藉由盲目評價者在4片皮質腦切片中對於LIMP2染色陽性的細胞定量。野生型和未治療的MPS II小鼠作為對照。*p<0.05，單因子變異數分析，然後進行Dunnett試驗。
圖8顯示在以ICV AAV9.CB.hIDS治療的MPS II小鼠中對於人類IDS的抗體反應。MPS II小鼠在2-3個月齡時以3×108GC(低)、3×109GC(中)或3×1010GC(高)三種劑量之一，用ICV注射AAV9.CB.hIDS。在經載體給藥後第21天或第90天所犧牲的小鼠屍檢時收集血清，藉由間接ELISA評估抗人類IDS之抗體。虛線表示來自未治療動物的未與抗原接觸之血清(naïve serum)中高於平均力價之2 SD。大多數動物沒有可檢測的抗體(在未與抗原接觸之血清的背景水平)。
圖9A-9D說明在MPS II小鼠的正常開放空間活動(open field activity)和Y型迷宮表現。未經治療的MPS II小鼠和WT雄性同窩出生仔鼠在4-5個月齡時進行行為測試。藉由對於水平活動量(horizontal activity)的XY軸光束間斷(XY axis beam breaks)(圖9A)、對於垂直活動量的Z軸光束間斷(圖9B)及對於中心活動量的百分比中心光束間斷(圖9C)測量正常活動量。在8分鐘Y型迷宮測試期間記錄總支路進入(total arm entries)(圖9D)。
圖10A-10B提供製造方法流程圖。
圖11為用於腦池內遞送醫藥組成物的裝置(10)的圖像，包括用於同軸插入法的可選擇的穿刺針(28)，其包括一10cc載體注射器(12)、一10cc預充式導管沖洗注 射器(14)、一T型延長套組(包括配管(20)、於配管末端之一夾體(22)及接頭(24))、一22G×5"腰椎穿刺針(26)及一可選擇的18G×3.5"穿刺針(28)。亦說明了具有旋轉公魯爾接頭(luer lock)(16)的四通栓閥。
圖12A-12I說明用ICV AAV9治療的犬隻中，腦炎和轉殖基因特異性T細胞反應。以單次ICV或IC注射表現GFP的AAV9載體治療一歲大的MPS I犬。除了發現注射後12天死亡的I-567外，將所有動物在注射後14天犧牲。將大腦分成冠狀切片，其顯示經ICV治療的動物中注射部位(箭頭)附近的顯著病變(圖12A至12F)。來自顯著病變周圍的大腦區域之組織切片以蘇木精和伊紅染色(圖12G和12H)，原始放大倍數=4×(左格)，20×(右格)。在屍檢時由一隻經ICV治療的犬隻(I-565)收集末梢血液單核球細胞，並藉由干擾素-γ ELISPOT測量抗AAV9衣殼和人類IDUA蛋白的T細胞反應(圖12I)。使用披覆完整GFP序列的重疊15個氨基酸胜肽之單池(single pool)測量T細胞對GFP轉殖基因產物的反應，將包含AAV9衣殼蛋白的胜肽分成三個池(指定為池A-C)。*=陽性反應，定義為>3倍背景(未經刺激之細胞)和每百萬細胞大於55個斑點。植物性血球凝集素(Phytohemagglutinin；PHA)和離子黴素(ionomycin)與佛波醇-12-十四烷醯-13-乙酸酯(PMA)作為T細胞活化的陽性對照。
圖13為一長條圖，說明以ICV或IC AAV9治療之犬隻的載體生物分佈。除了在注射後12天進行屍檢的動 物I-567之外，以表現GFP的AAV9載體單次ICV或IC注射後14天，將犬隻犧牲。藉由定量PCR在組織樣品中檢測載體基因體，數值表示為每個二倍體細胞的載體基因體拷貝數(GC/二倍體基因體)。從海馬或大腦皮層收集的大腦樣品被註明為經ICV治療的犬隻的注射或未注射的大腦半球；對於經IC治療的動物，它們分別是右半球和左半球。並未從動物I-567的經注射之大腦半球收集樣品用於PCR。
圖14A至14H顯示以ICV或IC AAV9治療的犬隻的大腦和脊髓中的GFP表現。從經由ICV或IC注射表現GFP的AAV9載體治療的犬隻收集大腦和脊髓樣品，藉由直接螢光鏡檢查來評估GFP表現。代表性的切片顯示為額葉皮質樣品，以及從頸部、胸部和腰部水平面收集的脊髓前角。原始放大倍數=10x。
圖15A-15Q顯示在經ICV AAV9(表現溶小體酵素β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB))治療之MPS VII犬隻的穩定轉殖基因表現且不存在腦炎。用單次ICV注射表現GUSB的AAV9載體治療具有GUSB遺傳缺陷(MPS VII模型)的6週齡犬隻。在注射時和注射後第7天和第21天收集的CSF樣品中測量GUSB酵素活性(圖15A)。注射後三週，將犬隻犧牲。進行注射部位周圍的腦區域粗略和顯微鏡評估(圖15B至15D)。原始放大倍數=4x(中央格)和10x(右格)。使用在活性GUSB切割時會產生紅色產物的基質，在腦和脊髓切片中檢測到GUSB活性(圖15E-15N)。代表性的切片顯示在頸部、胸部和腰部水平 面收集的大腦皮層、小腦和脊髓前角的樣品。原始放大倍數=4×(皮質和小腦)，10×(脊髓)。從未治療的MPS VII犬隻、正常的犬隻、以及經ICV AAV9治療的MPS VII犬隻所收集的大腦皮層切片染色神經節苷脂GM3，其病理性累積在MPS VII犬隻大腦中(圖15O至15Q)。原始放大倍數=4x。
圖16A至16B顯示在非人類之靈長類動物(NHP)腰部鞘內注射後的對比度分佈。成年食蟹猴(cynomolgus macaques)經接受稀釋於5mL碘六醇180(Iohexol 180)的AAV9載體之腰部穿刺鞘內注射。藉由螢光鏡檢查法評估沿脊髓的對比度分佈，顯示胸部和頸部區域的代表性圖像。在所有動物注射後10分鐘內，沿著脊髓的整個長度可見對比物質(箭頭)。
圖17是顯示以鞘內AAV9治療之NHP中的載體生物分佈長條圖。在稀釋於5mL碘六醇180的AAV9載體之腰部穿刺鞘內注射後14天，將NHP犧牲。注射後，將兩隻動物以頭低腳高姿勢(特德倫堡姿勢；Trendelenburg position)放置10分鐘，經由定量PCR檢測組織樣品中的載體基因體，數值表示為每二倍體細胞的之載體基因體拷貝數(GC/二倍體基因體)。
圖18A至18H顯示以鞘內AAV9治療的NHP之腦和脊髓中的GFP表現。藉由直接螢光顯微鏡檢查從經AAV9載體鞘內注射治療之NHP所收集的大腦和脊髓樣品評估GFP表現。藉由腰椎穿刺投予載體。注射後，將兩隻動物以頭低腳高姿勢放置10分鐘，代表性的切片顯示額葉皮質的樣品，以及從頸部、胸部和腰部水平面收集的脊髓前角。由於在一些NHP組織中存在自發螢光材料，攫取紅色頻道影像以區分自發螢光與GFP信號。自發螢光影像以洋紅色覆蓋。原始放大倍數=4x(皮質)，10x(脊髓)。
圖19A-19B說明MPS I中升高的CSF精胺。對來自MPS I犬隻(n=15)和正常對照組(n=15)的CSF樣品進行高通量LC/MS和GC/MS代謝物篩選。顯示出前100個差異檢測的代謝物(ANOVA)的熱圖(圖19A)。MPS I同齡群中最年輕的動物(28日齡)用星號表示。藉由定量同位素稀釋LC/MS分析，量測來自6名患有MPS I之幼兒和2名正常幼兒的CSF樣品中的精胺濃度(圖19B)。
圖20A-20J說明MPS I神經元中的精胺依賴性異常軸突生長。從E18野生型或MPS I小鼠胚胎收取之皮質神經元在平板培養後24小時以精胺(50ng/mL)或精胺合成酶抑制劑APCHA處理。在平板培養後96小時取得相差影像(圖20A至20D)。藉由盲目評價者對每個處理條件的複製培養物中45-65個隨機選擇的神經元加以定量軸突數、長度和分支(圖20E和20H、20G和20J、以及20F和20I)。***p<0.0001(ANOVA隨後進行Dunnett檢驗)。
圖21A-21K說明基因治療後MPS I犬隻中CSF精胺水平和大腦GAP43表現的標準化。5隻MPS I犬在一個月齡時以表現犬IDUA的AAV9載體鞘內注射治療。兩隻犬隻(I-549、I-552)在出生後第1天藉由肝臟定向基因治療耐受IDUA，以防止在一些MPS I犬隻中引起IDUA的抗體反應。鞘內載體注射後6個月，在大腦組織中測量IDUA活性(圖21A)。藉由對溶小體膜蛋白LIMP2染色來評估大腦儲存損傷(圖21B至21H)。藉由西方墨點法(western blot)測量皮質大腦樣品中的GAP43(圖21I)，並藉由光密度測定法定量相對於β-肌動蛋白之量(圖21J)。在經同位素稀釋LC/MS量測犧牲時之CSF精胺(圖21K)。未治療的MPS I犬隻(n=3)和正常犬隻s(n=2)作為對照。*p<0.05(Kruskal-Wallis試驗，然後進行Dunn試驗)。
圖22A-22B說明使用精胺作為CSF生物標誌來評估MPS I中的CNS定向基因治療。將於出生時對人類IDUA耐受的6隻MPS I犬隻在一月齡時經鞘內注射表現人類IDUA之AAV9治療(1012GC/kg，n=2，1011GC/kg，n=2，1010GC/kg，n=2)。治療後6個月量測CSF精胺水平(圖22A)。以鞘內注射表現貓IDUA之AAV9(1012GC/kg)治療三隻MPS I貓，治療後6個月定量CSF精胺(圖22B)。未治療的MPS I犬隻(n=3)和正常犬隻(n=2)作為對照。
圖23說明藉由隨機森林分析(random forest analysis)所鑑定的代謝物之平均降低準確度。
圖24說明MPS I犬隻大腦樣品中多胺合成路徑中酵素的表現。
圖25說明MPS VII犬隻CSF中的精胺濃度。
圖26A至26C說明APCHA治療對WT神經元生長沒有影響。
圖27說明在以ICV AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG各種劑量(3e8，3×108GC；3e9，3×109GC；3e10，3×1010GC)治療的MPS II小鼠(IDSγ/-)中MPS II相關病理學發現的劑量依賴性減少。評估累積病理學評分並在y軸上繪圖。異基因型組合小鼠(IDSγ/+)作為對照。結果證實，以ICV AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG治療之MPS II小鼠中與MPS II相關病理學發現的劑量依賴性減少。
圖28說明實施例9所描述的恒河猴(Rhesus Macaques)中的CSF細胞增多。在不同天所收集的CSF樣品中計數白血球細胞(白血球，y軸)(x軸，第0天，第7天，第14天，第21天，第30天，第45天，第60天和第90天)。鑽石形代表未經AAV9.CB7.hIDS治療之RA 2198的數據。正方形、三角形和x分別代表來自用5×1013GC之Ax9.CB7.hIDS治療的RA1399、RA2203和RA2231的數據。*、圓圈和+分別代表用1.7×1013GC之AAV9.CB7.hIDS治療的RA1358、RA1356和RA2177的數據。
圖29顯示如實施例9所述量測在第60天之NHP血清中產生的抗hIDS抗體的ELISA結果。稀釋作為x軸，同時光密度(OD)作為y軸。鑽石形代表來自未經AAV9.CB7.hIDS治療之RA2198的數據，正方形表示用1.7×1013GC之AAV9.CB7.hIDS治療的RA2197的數據，而三角形和x表示分別用5×1013GC之AAV9.CB7.hIDS治療的RA 2203和RA 2231的數據。
本文所提供者為一種醫藥組成物，其可經由鞘內注射投予至所需之人類受試者。在某些具體實施例中，含本文所述之rAAV.hIDS的醫藥組成物之用途係用於製備可藉由鞘內注射投予所需之人類受試者的醫藥品。該人類受試者(病患)可能先前曾被診斷患有黏多醣病II(MPS II)或嚴重的韓特氏徵候群。
效力可藉由活體外細胞培養分析量測，例如本文實施例5G中描述的活體外效力分析，其中HEK293或Huh7細胞用已知多重rAAV GC轉導每細胞，並使用4MU-艾杜糖醛酸苷酵素分析(iduronide enzymatic assay)在轉導後數72小時分析上清液的IDS活性。
這種rAAV.hIDS載體製劑可以藉由鞘內/腦池內注射給予兒童或成年人類受試者，以達到CNS中hIDS表現的治療水平。作為治療候選者的病患是患有嚴重或減弱的MPS II疾病的兒童或成年病患。嚴重疾病被定義為早期神經認知缺陷，其發育商(DQ)(BSID-III)比平均值低至少1個標準偏差，或在順序測試中被記錄減弱大於1個標準偏差的歷史證據。
對於具有韓特氏徵候群之病患的治療有效rAAV.hIDS鞘內/腦池內劑量範圍約為1×1011至7.0×1014GC(平坦劑量(flat dose))-相當於109至1011GC/g病患腦質量。或者，以下治療有效的平坦劑量可以投予所指之年齡群組的病患。
在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為1.3×1010GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投 予至MPSII病患的劑量為6.5×1010GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為1.9×1010GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為9.4×1010GC/g腦質量。
在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為1.3×109GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為1.3×1011GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為1.8×1011GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為2.15×1011GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為5.5×1011GC/g腦質量。
在某些具體實施例中，由於在發育中的小孩早期發生相對快速的腦生長，所以投予IC的AAV9.hIDS總劑量取決於不同年齡層的假設腦質量。關於對於研究受試者之按年齡的腦質量，詳見例如(AS Dekaban,Ann Neurol,1978 Oct；4(4)：345-56。
治療目的是藉由基於rAAV之CNS導向基因治療在功能上取代病患有缺陷的艾杜醣醛酸2-硫酸酯酶作為治療疾病的可行方法。治療功效可以藉由下列評估測量：(a)在具有MPS II(韓特氏徵候群)之病患中預防神經認知減弱；(b)在CSF、血清及/或尿液和/或肝臟和脾臟體積中，減少疾病的生物標誌，例如GAG水平及/或酵素活性(IDS或己糖胺酶)。幼兒的神經認知可藉由貝里嬰幼兒發展量表(Bayley Scales of Infant and Toddler Development,Third Ed.,BSID-III)量測。可以進行神經認知和適應性行為評估(例如，分別使用貝里幼兒發展量表和文蘭德適應行為量表)。
在治療之前，可以評估MPS II病患對於遞送hIDS基因的rAAV載體的衣殼之中和抗體(Nab)，此類Nab可干擾轉導效率並降低治療功效。具有基線血清Nab力價
Figure 107133321-A0305-02-0021-7
1：5之MPS II病患是以rAAV.hIDS基因治療方案治療的良好候選人。治療具有血清Nab>1：5力價的MPS II病患可能需要組合治療，例如在以rAAV.hIDS載體遞送治療之前及/或期間用免疫抑制劑暫時共同治療。可選擇地，免疫抑制共同治療可使用作為預防措施，無需事先評估抗AAV載體衣殼及/或調配物其他成分的中和抗體。在某些具體實施例中，先前的免疫抑制治療可能令人滿意地防止對hIDS轉基因產品的潛在不良免疫反應，特別是，在幾乎沒有IDS活性水平的病患者中，其中轉基因產品可能被視為「外來的」。然而類似於在動物中觀察到的反應可能不會在人類受試者中發生，作為預防性免疫抑制治療推薦用於所有rAAV-hIDS受體。
本發明的方法包括將rAAV.hIDS遞送至CNS並伴隨hIDS的全身遞送的基因治療組合。使用艾杜硫酯酶(idursulfase)之ERT輸注(例如，使用Elaprase®)或使用具有肝臟趨向性的rAAV.hIDS(例如帶有AAV8衣殼的rAAV.hIDS)的額外基因治療可以實現全身遞送。
在某些具體實施例中，病患藉由肝指向性注射給予AAV.hIDS，以便病患耐受hIDS，並且病患隨後藉由鞘內注射投予AAV.hIDS，當病患為幼兒、兒童及/ 或成年人時，以快速運送CNS中治療濃度的hIDS。
如本文中所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」意指藥物藉由注射入椎管的投予途徑，更具體而言為進入蜘蛛膜下腔以使其到達腦脊液(CSF)。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、腦室內、枕骨下/腦池內及/或C1-2穿刺。例如，可以藉由腰椎穿刺方法導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。在另一實例中，注射可以進入腦大池(cisterna magna)。
如本文中所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」意指藥物直接進入腦大池小腦延髓之腦脊液的給藥途徑，更具體而言為藉由枕骨下穿刺，或藉由直接注射入腦大池或永久定位的管體。
如本文中所使用，「治療有效量」意指AAV.hIDS組成物的量，其遞送並在靶細胞中表現足以改善或治療一種或多種MPS II的症狀的酵素量。「治療」可以包括預防MPS II徵候群之一的症狀惡化並可能逆轉其一種或多種症狀。例如，rAAV.hIDS的治療有效量是改善具有MPS II的病患之神經認知功能的量。可以藉由使用貝里嬰幼兒發展量表評估受試者的神經認知發育商(DQ)來量測此種神經認知功能的改善。神經認知功能的改善亦可以藉由使用技術中已知的方法評估受試者的智商(IQ)來測量，其包括但不限於例如使用魏氏智力簡化量表(Wechsler Abbreviated Scale of Intelligence，WASI)(IQ)、貝里幼兒發展量表、霍普金斯詞彙學習測驗(Hopkins Verbal Learning Test)(記憶)，及/或注意力多項參數測試(Tests of Variables of Attention)(TOVA)。在另一具體實施例中，治療有效量的rAAV.hIDS是減少在尿液及/或腦脊液及/或血清及/或其他組織中致病性GAG、硫酸乙醯肝素及/或己糖胺酶濃度的量。在其他實施例中，可以觀察到角膜混濁的矯正，觀察到中樞神經系統(CNS)中的損傷的矯正，及/或觀察到血管周圍及/或腦膜GAG儲存的逆轉。
在某些具體實施例中，治療功效可使用一或多種下列所述測定：血漿(總GAG、硫酸皮膚素、硫酸乙醯肝素、I2S活性)、CSF(總GAG、硫酸皮膚素、硫酸乙醯肝素、I2S活性)及尿液(總GAG、硫酸皮膚素、硫酸乙醯肝素)中之生物標誌；認知和適應功能的神經發育參數：貝里嬰幼兒發展量表(3rd Edition(BSID-III))或考夫曼兒童智力測驗(Kaufman Assessment Battery for Children,2nd Edition(KABC-II))；及/或文蘭德適應行為量表(Vineland Adaptive Behavior Scales,3rd Edition,Comprehensive Interview Form(VABS-III))。可選擇地，可藉由對於AAV9.hIDS去氧核糖核酸(DNA)之核酸(DNA)定量聚合酶連鎖反應(PCR)，在CSF、血漿及尿液中載體濃度監測病毒剝落。在某些具體實施例中，治療功效可以一或多種方法監測：免疫原性測量，包括一種或多種抗AAV9的中和抗體力價及對CSF及血清中I2S的結合抗體力價；酵素聯結免疫斑點法(enzyme-linked ImmunoSpot，ELISPOT)分析：對AAV9和I2S的T細胞反應；流式細胞術：AAV-和I2S特異性調節T細胞；藉 由大腦核磁共振成像(MRI)評估CNS結構異常；藉由MRI及腹部超聲波評估肝臟和脾臟體積；藉由腦幹聽覺反應測試(ABR)測量聽覺能力變化；暫時停用IV ERT(ELAPRASE®)之受試者的血漿和尿液總GAG、硫酸乙醯肝素和硫酸皮膚素。
「治療有效量」可以基於動物模型而不是人類病患來確定，本文描述合適的鼠類模型實例。
如本文中所使用，「功能性人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶」係指人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶酵素，其它通常在無MPS II或相關徵候群的人類中起作用。相反地，引起MPS II或相關徵候群的人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶酵素變體被認為是無功能的。在一具體實施例中，功能性人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶具有野生型人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶的胺基酸序列，敘述於Wilson et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(21)：8531-8535(1990)，NCBI Reference Sequence NP_000193.1，複製於SEQ ID NO：2(550個胺基酸)；這種前原蛋白(preproprotein)包括一個信號胜肽(胺基酸1至25)，一個原胜肽(胺基酸26至33)和一個由胺基酸34至455(一個42kDa鏈)組成的成熟胜肽)和胺基酸456至550(14kDa鏈)。另詳見UniProtKB/Swiss-Prot(P22304.1)。
如本文中所使用，術語「NAb力價」係指測量產生多少中和抗體(例如抗AAV Nab)，其中和其靶向表位(例如AAV)的生理作用。抗-AAV NAb力價可如Calcedo,R.,et al.,Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses.Journal of Infectious Diseases,2009.199(3)：p.381-390中所述量測，其以參考文獻併入本文。
如本文中所使用，「表現盒」係指一種核酸分子，其包含IDS基因、啟動子並可包括其它調控序列，其中盒可藉由遺傳載體(例如質體)遞送至包裝宿主細胞並包裝到病毒載體(例如，病毒顆粒)的衣殼中。通常，這種用於產生病毒載體的表現盒含有本文所述的IDS編碼序列，其側翼是病毒基因體的包裝信號和例如本文所述的那些其他表現控制序列。
縮寫「sc」係指自我互補。「自身互補AAV」係指其中由重組AAV核酸序列所攜帶的編碼區已被設計形成分子內雙股DNA模板的構築體。在感染時，並非等待細胞媒介的第二股的合成，而是scAAV的兩個互補半部將結合形成一個準備立即複製及轉錄的雙股DNA(dsDNA)單元，參見例如D M McCarty et al,“Self-complementary recombinant Adeno-Associated Virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”,Gene Therapy,(August 2001),Vol 8,Number 16,Pages 1248-1254。自我互補AAVs描述於例如，美國專利6,596,535；7,125,717；及7,456,683，其每一者藉由引用整體併入本文。
如本文中所使用，術語「操縱聯結(operably linked)」係指與感興趣基因鄰接的表現控制序列及在反向或距離上起作用以控制感興趣的基因的表現控制序列 兩者。
當用於指蛋白質或核酸時，術語「異源的」係指蛋白質或核酸包含二或多種序列或子序列，其在自然界中未以彼此相同的關係發現。例如，核酸通常被重組產生，其具有來自不相關基因的兩個或更多個序列，該序列被排列以製備新的功能性核酸。例如，於一具體實施例，核酸具有來自一個基因的啟動子，該啟動子被排列以引導來自不同基因的編碼序列的表現。因此，就編碼序列而言，啟動子係異源的。
「複製缺陷病毒」或「病毒載體」係指一合成或人工病毒顆粒，其中含有感興趣基因的表現盒被包裝於病毒殼體或套膜中，其中亦被包裝於病毒衣殼或套膜內的任何病毒基因體序列是複製缺陷的，亦即它們不能產生子代病毒體但保留感染靶細胞的能力。在一具體實施例中，病毒載體的基因體不包括編碼複製所需要的酵素的基因(基因體可以被設計成「無膽的(gutless)」-僅包含感興趣的轉殖基因的側邊為人工基因體的增幅及包裝所需的信號)，但此等基因可於生產過程中被供應。因此，使用於基因治療被認為是安全的，由於除非在複製所需的病毒酵素存在下，複製及子代病毒體的感染無法發生。
如本文中所使用，「重組AAV9病毒顆粒」係指具有AAV9衣殼的核酸酶抗性顆粒(NRP)，該衣殼中包裝有含用於所欲基因產物之表現盒的異源性核酸分子。這種表現盒通常含有位於基因序列側翼的AAV 5' 及/或3'反向末端重複序列，其中該基因序列與表現控制序列可操作地連接。表現盒的這些和其它合適元件於下文更詳細地描述，並且可替代地在本文中稱為轉殖基因基因組序列。此亦可稱為「完整的」AAV衣殼。這種rAAV病毒顆粒在將轉殖基因遞送至能夠表現由表現盒所攜帶的所欲基因產物的宿主細胞時被稱為「藥理學活性」。
在許多情況下，rAAV顆粒被稱為「DNase抗性」。然而，除了該核酸內切酶(DNase)之外，其他核酸內切酶和核酸外切酶也可用於本文所述的純化步驟，以移除污染的核酸。可以選擇此種核酸酶來降解單鏈DNA和/或雙鏈DNA和RNA。這些步驟可以含有單個核酸酶，或針對不同目標的核酸酶混合物，並可以是核酸內切酶或核酸外切酶。
術語「核酸酶抗性」係指AAV衣殼於表現盒周圍組裝，該表現盒被設計為將轉基因遞送至宿主細胞並保護此等包裝的基因體序列免於在用以移除可能來自生產過程之污染性核酸的核酸酶培養步驟期間的降解(消化)。
如本文中所使用，「載體基因體」係指被包裝於AAV衣殼(例如，AAV9)內的核酸序列。通常，對於AAV，存在AAV ITR以使表現盒能夠包裝，該表現盒包含編碼轉殖基因產物(例如hIDS)的核酸序列及其調控序列。於以下實施例中，表現盒在其極端5'端(extreme 5’ end)和極端3'端由AAV ITR側接。合適地，重組AAV(rAAV)的載體基因體缺乏編碼AAV cap基因的AAV 序列，並且缺乏編碼AAV rep基因產物的AAV序列，以提供無複製能力的rAAV。
如本文中所使用，「AAV9衣殼」係指具有GenBank登錄號：AAS99264胺基酸序列的AAV9，藉由引用併入本文中，且AAV vp1衣殼蛋白複製於SEQ ID NO：13。本發明包括來自該編碼序列的一些變體，其可包括與參考胺基酸序列(於GenBank登錄號：AAS99264，SEQ ID NO：13和US7906111(亦即WO 2005/033321))具有約99%同一性的序列(即，與參考序列的差異小於約1%)。此類AAV可包括例如天然分離物(例如，hu31或hu32)，或具有胺基酸取代、缺失或添加的AAV9的變體，例如，包括但不限於從與AAV9衣殼對齊的任何其他AAV衣殼中對應位置所「徵補(recruited)」的替代殘基中選擇胺基酸取代；例如敘述於US 9,102,949、US 8,927,514、US2015/349911；及WO 2016/049230A1。然而，在其他具體實施例中，可以選擇與上述序列具有至少約95%同一性的AAV9或AAV9衣殼的其他變體。詳見例如美國公開專利申請案2015/0079038。因此，產生衣殼的方法、編碼序列以及製備rAAV病毒載體的方法已被描述，詳見例如Gao,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10),6081-6086(2003)及US 2013/0045186A1。
術語「AAV9中間體」或「AAV9載體中間體」係指組裝的rAAV衣殼，其缺乏包裝在其中的所需基因體序列。這些也可稱為「空的」衣殼。這樣的衣殼可不 包含表現盒的可檢測基因體序列，或者僅包含部分包裝的基因體序列而不足以實現基因產物的表現。這些空的衣殼對於將感興趣的基因轉移至宿主細胞並不起作用。
術語「一」或「一種」係指一個或多個，如此，術語「一」(或「一種」)，「一或多種」及「至少一種」於本文中可互換使用。
詞語「包含」、「含有」和「含」應包含在內而不是排他性地解釋。詞語「由...組成」、「由...構成」及其變體應被排他性的而不是包含在內的解釋。雖然說明書中的各種具體實施例是使用「包含」語言呈現的，但在其他情況下，相關的具體實施例也旨在使用「由...組成」或「基本上由...組成」的語言來解釋和描述。
除非另有說明，否則術語「約」包括±10%內的變化，包括±10%。
除非於本說明書中另有指明，否則本文使用的技術及科學術語具有本項技術領域中具通常知識者通常理解的相同含義，且藉由參考公開的文本提供本項技術領域中具通常知識者對本申請中使用的許多術語的一般指引。
本發明提供複製缺陷型AAV遞送hIDS基因至被診斷患有MPS II之病患(人類受試者)CNS的用途。用於遞送hIDS基因(「rAAV.hIDS」)的重組AAV(「rAAV」)載體具有對於CNS的向性(tropism)(例如，帶有AAV9衣殼的rAAV)，且hIDS轉殖基因受特定表現控制元件控制，例如巨細胞病毒(CMV)增強子和雞β肌動蛋白啟動 子(CB7)的雜交體。在某些具體實施例中，提供適用於鞘內、腦池內和全身性投予的醫藥組成物，其在調配物緩衝液中包含rAAV.hIDS載體的懸浮液，該調配物緩衝液包含生理上相容的水性緩衝液、表面活性劑及可選擇的賦形劑。該rAAV懸浮液另外之特徵在於：(i)rAAV基因體拷貝(GC)力價為至少1.0×1013GC/mL；(ii)經SDS-PAGE分析測定rAAV空/全顆粒比率為0.01至0.05(95%-99%不含空衣殼)(參見實施例5D)；在其他具體實施例中，本文提供的rAAV9.hIDS至少約80%、至少約85%或至少約90%不含空衣殼；及/或(iii)劑量為至少約4×108GC/g腦質量至約4×1011GC/g腦質量的rAAV懸浮液具有效力。
在某些具體實施例中，所投予之劑量為至少1.3×1010GC/g腦質量、至少1.9×1010GC/g腦質量、至少6.5×1010GC/g腦質量或9.4×1010GC/g腦質量，或約4×1011GC/g腦質量。
在某些具體實施例中，所投予之劑量為1.9×1011GC/腦質量至5.6×1011GC/g腦質量，具有或不具免疫抑制。在某些具體實施例中，免疫抑制是從前21天至第20天，且為西羅莫司(sirolimus)。
效力可藉由活體外細胞培養分析法測量，例如實施例5G中所描述的活體外效分析，其中HEK293細胞以rAAV GC已知的多種性轉導每細胞，並在轉導後72小時分析上清液的IDS活性。hIDS的功能(活性)及/ 或效力可以在合適的活體外分析中量測，例如使用4MU-艾杜醣醛酸苷酵素分析，其量測hIDS切割螢光基質4-甲基傘形酮α-L-艾杜醣醛酸-2-硫酸鹽(4-Methylumbelliferyl alpha-L-iduronide-2 sulfate)的能力。在所述條件下測量，比活性(specific activity)>7,500pmol/min/μg，詳見Activity Assay Protocol on www.RnDSystems.com。已經描述量測酵素活性的其他合適方法[詳見例如Kakkis,E.D.,et al(1994).Protein Expression Purif.5：225-232；Rome,L.H.,et al(1979).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：2331-2334]，包括本文所描述者。活性亦可使用下述方法評估，例如E.Oussoren,et al,Mol Genet Metab.2013 Aug；109(4)：377-81.doi：10.1016/j.ymgme.2013.05.016.Epub 2013 Jun 4。作為治療候選人的病患是具有MPS II(韓特氏徵候群)及/或與MPS II相關症狀的兒童及成年病患。
治療目的是藉由基於rAAV之CNS導向基因治療以功能上取代病患之缺陷的艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶作為治療疾病的可行方法。如本文所述的rAAV載體所表現的，在CSF、血清、神經元或其他組織中檢測到的至少約2%的表現水平可提供治療效果。然而，可達到更高的表現水平，這樣的表現水平可以是正常功能性人類IDS水平的2%至約100%。在某些具體實施例中，可以在CSF、血清或其他組織中檢測到高於正常的表現水平。
測量治療功效可藉由評估(a)預防在具有 MPS II之病思(韓特氏徵候群)的神經認知減弱；(b)減少疾病的生物標誌，例如GAG水平及/或在CSF、血清及/或尿液中的酵素活性，及/或肝臟及脾臟之體積。幼兒之神經認知可藉由貝里嬰幼兒發展量表(Third Ed.,BSID-III)量測。可進行神經認知及適應性行為評估(例如，分別使用貝里幼兒發展量表及文蘭德適應行為量表)。
某些具體實施例包括rAAV.hIDS基因治療遞送至CNS並伴隨hIDS的全身傳遞的組合。全身遞送可使用ERT(例如，使用Elaprase®)或使用對於肝臟具有向性的rAAV.hIDS(例如，帶有AAV8衣殼的rAAV.hIDS)的額外基因治療來完成。
某些具體實施例亦提供rAAV.hIDS醫藥組成物的製造和特徵(實施例4，見下文)。
5.1. AAV.hIDS結構和調配物 5.1.1. 表現盒
提供包含含hIDS基因的表現盒的AAV載體，其特徵為具有SEQ ID NO：1核苷酸序列(CCDS 14685.1)。此序列是編碼Genbank NP000193.1的公開基因序列，也以SEQ ID NO：2附於本文中。在另一具體實施例中，表現盒含有特徵為具有與SEQ ID NO：1至少約75%相同之核苷酸序列的hIDS基因，並編碼功能性人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶。在另一具體實施例中，表現盒含有特徵為具有與SEQ ID NO：1至少約80%相同之核苷酸序列的hIDS基因，並編碼功能性人類艾杜醣醛 酸-2-硫酸酯酶。在另一具體實施例中，該序列與SEQ ID NO：1至少約85%之同一性或與SEQ ID NO：1至少約90%之同一性，並編碼功能性人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶。在一具體實施例中，該序列與SEQ ID NO：1至少約95%之同一性，與SEQ ID NO：1至少約97%之同一性，或與SEQ ID NO：1至少約99%之同一性，並編碼功能性人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶。在一具體實施例中，該序列與SEQ ID NO：1至少約77%相同。在另一具體實施例中，該表現盒含有編碼SEQ ID NO：8之nt 1177至nt 2829序列的hIDS，亦顯示為SEQ ID NO：11之1937之nt 3589。在另一具體實施例中，該表現盒含有hIDS，其編碼與SEQ ID NO：8之nt 1177至nt 2829(亦顯示為SEQ ID NO：11之nt 1937至nt 3589)至少約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%或約99%相同之序列。
在另一具體實施例中，功能性人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶可包括合成的胺基酸序列，其中所有的或部分的前原蛋白SEQ ID NO：2之最初25個胺基酸(對應於前導(信號)胜肽)被異源性前導胜肽(leader peptide)置換。此前導胜肽，例如來自介白素-2(IL-2)或抑癌素(oncostatin)之前導胜肽，可改善酵素通過分泌路徑輸送出細胞進入血液循環中。合適的前導胜肽較佳，但不一定是人源的。合適的前導胜肽可由proline.bic.nus.edu.sg/spdb/zhang270.htm選取，其以參考文獻併入本文，或可使用各種用於在所選蛋白質中確 定前導(信號)胜肽之計算機應用程式來確定。隨然並無限制，但此序列可約為15至約50個胺基酸長度，或約19至約28個胺基酸長度，或可依需要更大或更小。此外，至少一個活體外分析已被敘述為有益於評估IDS酵素之酵素活性[詳見例如Dean et al,Clinical Chemistry,2006 Apr；52(4)：643-649]。除了移除所有或部分前原蛋白(SEQ ID NO：2之胺基酸1至25)外，所有或部分原蛋白(proprotein)(SEQ ID NO：2之胺基酸26至33)可被移除，並可選擇地以異源性成熟胜肽置換。
在另一具體實施例中，提供包含表現盒的AAV載體，該表現盒另含有特徵為具有SEQ ID NO：5之nt 3423至nt 4547的核苷酸序列(GenBank之CDS：AB448737.1)的SUMF1基因。此序列為編碼NCBI參考序列：NP_877437.2的公開基因序列，其亦以SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：10附於本文中。一些研究已建議，硫酸酯酶(例如IDS)的表現可受限於硫酸酯酶修飾因子SUMF1的可利用性，這是IDS轉譯後修飾所必需的(Fraldi,et al,Biochemical J,2007：403：305-312)。在另一具體實施例中，該表現盒含有特徵為具有與SEQ ID NO：5之nt 3423至nt 4547至少約80%相同之核苷酸序列的SUMF1基因，且編碼功能性人類SUMF1。在另一具體實施例中，該序列與SEQ ID NO：5之nt 3423至nt 4547至少約85%之同一性，或與SEQ ID NO：5之nt 3423至nt 4547至少約90%相同，且編碼功能性人類SUMF1。在一具體實施例中，該序列與SEQ ID NO：5 之nt 3423至nt 4547至少約95%、約97%或約99%相同，且編碼功能性人類SUMF1。在一具體實施例中，該序列與SEQ ID NO：5之nt 3423至nt 4547至少約76.6%相同。在另一具體實施例中，該表現盒含有編碼SEQ ID NO：8之nt 3423至nt 4553的序列的hSUMF1。在另一具體實施例中，該表現盒含有hSUMF1，其編碼與SEQ ID NO：8之nt 3423 to nt 4553至少約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%或約99%相同之序列。
在一具體實施例中，提供包含表現盒的AAV載體，該表現盒含有hIDS編碼序列及hSUMF1編碼序列。在另一具體實施例中，hIDS編碼序列及hSUMF1編碼序列以內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)連接。在另一具體實施例中，該IRES具有SEQ ID NO：5之2830至nt 3422或SEQ ID NO：8之nt 2830至nt 3422的序列。在另一具體實施例中，該表現盒含有SEQ ID NO：5之nt 1177至nt 4547或SEQ ID NO：8之nt 1177至nt 4553，其包含hIDS編碼序列、IRES及hSUMF1編碼序列。
關於序列的同一性或相似性在本文中定義為在對齊序列和導入間隙(如果需要)後，候選序列中的胺基酸殘基與本文所提供的胜肽和多胜肽區域相同(即，相同的殘基)或相似的(即，來自基於共同側鏈性質的同群組之胺基酸殘基，詳見下文)的百分比，以達到最大百分比序列同一性。百分比(%)同一性是量測兩種多核苷酸或兩種多胜肽的關係，藉由分別比較它們的核苷酸或胺基 酸序列來確定。一般而言，將要比較的兩個序列對齊以給出序列之間的最大相關性，檢查兩個序列的排列，並確定兩個序列之間確切的胺基酸或核苷酸對應的位置數，除以比對的總長度並乘以100得到%同一性數字。此%同一性數字可以在待比較序列的整個長度上確定，這對於具有相同或非常相似長度的序列是特別合適的，並且是高度同源的，或者在更短的定義長度上，對於長度不等或具有較低同源性的序列這更為合適。存在許多算法和基於其的計算機程式，這些算法能夠在文獻和/或公開或商業上可用於執行序列比對和百分比同一性，算法或程式的選擇不是對本發明的限制。
合適的序列比對程式之實例包括，例如在Unix的CLUSTALW軟體，然後導入Bioedit程式(Hall,T.A.1999,BioEdit：a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucl.Acids.Symp.Ser.41：95-98)；可於EMBL-EBI獲得之Clustal Omega(Sievers,Fabian,et al."F ast,scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega." Molecular systems biology 7.1(2011)：539及Goujon,Mickael,et al."A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI." Nucleic acids research 38.suppl 2(2010)：W695-W699)；Wisconsin Sequence Analysis Package，9.1版(Devereux J.et al.,Nucleic Acids Res.,12：387-395,1984,available from Genetics Computer Group,Madison,Wis.,USA)。BESTFIT和GAP程式可用於確定兩個多核苷酸之間的%同一性和兩個多胜肽序列之間的%同一性。
其他用於確定序列之間的同一性或相似性的程式包括例如，BLAST系列程式，獲自National Center for Biotechnology Information(NCB),Bethesda,Md.,USA，且可經NCBI的首頁進入NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)；ALIGN程式(2.0版)，其為GCG序列序列比對軟體套件之一部分。當使用ALIGN軟體比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表、12的間隙長度罰分及4的間隙罰分；及FASTA(Pearson W.R.and Lipman D.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85：2444-2448,1988，以Wisconsin Sequence Analysis Package之一部分獲得)。SeqWeb軟體(a web-based interface to the GCG Wisconsin Package：Gap program的網路界面)。
在一些具體實施例中，該盒被設計成由重組腺相關病毒表現，且載體基因體亦含有AAV反向末端重複序列(ITRs)。在一具體實施例中，rAAV是偽型的，即AAV衣殼與提供ITR的AAV來自不同的來源AAV。在一具體實施例中，使用AAV血清型2的ITR。然而，可以選擇來自其他合適來源的ITR，可選擇的是，該AAV可以是自身互補的AAV。
本文所述之表現盒使用AAV 5’反向末端重複序列(ITR)及AAV 3’ ITR。然而，這些元件的其他配置 可能是合適的。已描述5' ITR的縮短型，稱為△ITR，其中刪除了D-序列和末端分辨率位點(terminal resolution site，trs)。在其他具體實施例中，使用全長AAV 5’及/或3’ ITR。在要產生偽型AAV的情況下，表現中的ITR選自與衣殼的AAV來源相異的來源。例如，可以選擇AAV2 ITR用於具有特定效率的AAV衣殼，用於靶向CNS內的CNS或組織或細胞。在一具體實施例中，為了方便和加速監管批准，使用來自AAV2的ITR序列或其刪除型(△ITR)。然而，可以選擇來自其他AAV源的ITR。當ITR的來源來自AAV2並且AAV衣殼來自另一個AAV來源時，所得到的載體可以被稱為偽型化的。然而，可以使用其他AAV ITR來源。
在一具體實施例中，該表現盒被設計用於表現並分泌於中樞神經系統(CNS)，包括腦脊液和大腦。在特別希望的具體實施例中，該表現盒可用於CNS和肝臟中的表現，從而可以治療MPS II的全身和CNS相關作用。例如，本發明人已經觀察到某些組成型啟動子(例如，CMV)在經鞘內遞送時並不會以所欲之水平來驅動表現，從而提供局部最佳化hIDS表現水平。然而，雞β-肌動蛋白啟動子在鞘內遞送和全身遞送時表現良好，因此，這是特別理想的啟動子。可以選擇其他啟動子，但含有它的表現盒可能不具有雞β-肌動蛋白啟動子的所有優點。已描述各種雞β-肌動蛋白啟動子單獨或與各種增強子元件組合(例如，CB7是具有巨細胞病毒增強子元件(CAG啟動子)的雞β-肌動蛋白啟動子，其包括啟動子、 雞β肌動蛋白的第一外顯子和第一內含子，及兔β球蛋白基因之剪接接受體)，CBh啟動子[SJ Gray et al,Hu Gene Ther,2011 Sep；22(9)：1143-1153。
對於肝臟和其他組織，組織特異性的啟動子實例是眾所周知的(白蛋白，Miyatake et al.,(1997)J.Virol.,71：5124-32；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig et al.,(1996)Gene Ther.,3：1002-9；α胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)，Arbuthnot et al.,(1996)Hum.Gene Ther., 7：1503-14)、骨鈣化素(Stein et al.,(1997)Mol.Biol.Rep.,24：185-96)；骨涎蛋白(bone sialoprotein)(Chen et al.,(1996)J.Bone Miner.Res.,11：654-64)、淋巴球(CD2，Hansal et al.,(1998)J.Immunol.,161：1063-8，免疫球蛋白重鏈；T細胞受體鏈)，神經元，例如神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Andersen et al.,(1993)Cell.Mol.Neurobiol., 13：503-15)、神經纖維絲(neurofilament)輕鏈基因(Piccioli et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88：5611-5)，及神經元特異性vgf基因(Piccioli et al.,(1995)Neuron, 15：373-84)等等。或者，可以選擇可調節的啟動子，參見例如WO2011/126808B2，其藉由引用併入本文。
在一具體實施例中，該表現盒包含一或多種表現增強子。在一具體實施例中，該表現盒包含二或多個表現增強子。這些增強子可相同或相異，例如，增強子可包括α mic/bik增強子或CMV增強子。此增強子可以以兩個彼此相鄰的複製物(copies)存在。或者，增強子 的雙重複製物可用一或多種序列分開。在另一個具體實施例中，表現盒還包括內含子，例如雞β-肌動蛋白內含子、人類β-球蛋白內含子和/或市售的Promega®內含子。其他合適的內含子包括技術中所熟知者，例如WO 2011/126808中所述。
再者，表現盒以具有合適的多聚腺苷酸化信號被提供。在一具體實施例中，polyA序列是兔球蛋白polyA，詳見例如WO 2014/151341。或者，另一polyA，例如人類生長激素(hGH)多聚腺苷酸化序列、SV40 polyA、SV50 polyA或合成的polyA。其他習知調節元件可以是附加的或可選擇地包括在表現盒中。
一示例性rAAV.hIDS載體基因體顯示於SEQ ID NO：3的nt 2至nt 3967、SEQ ID NO：5的nt 11至nt 4964、SEQ ID NO：8的nt 11至nt 4964、SEQ ID NO：11的nt 2至nt 3967或SEQ ID NO：14的nt 2至nt 3965。
5.1.2. 產生rAAV.hIDS病毒顆粒
在一具體實施例中，重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其具有AAV衣殼並且在控製表現的調控序列的控制下，包裝有AAV反向末端重複序列、人類艾杜醣醛酸2-硫酸酯酶(hIDS)基因，其中該hIDS基因具有提供編碼功能性人類艾杜醣醛酸2-硫酸酯酶之SEQ ID NO：1(圖1)所示的序列或與其至少約95%相同的序列。在一具體實施例中，hIDS表現盒的側翼是AAV5'ITR和AAV3'ITR。在另一具體實施例中，AAV是單鏈AAV。
關於鞘內及/或腦池內遞送，AAV9是特別理 想的。可選擇地，如本文所述的rAAV9.hIDS載體可與設計用於特異性靶向肝臟的載體共同施用。可以使用具有肝臟向性的許多rAAV載體中的任何一種，可選擇作為rAAV衣殼來源的AAV實例包括，例如rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8[詳見例如美國公開專利申請案2007-0036760-A1；美國公開專利申請案2009-0197338-A1；EP 1310571]。亦見於WO 2003/042397(AAV7及其他猿猴AAV)、美國專利案7790449及美國專利案7282199(AAV8)、WO 2005/033321及US 7,906,111(AAV9)、及WO 2006/110689]，及rh10[WO 2003/042397]、AAV3B；AAVdj[US 2010/0047174]。一種特別理想的rAAV是AAV2/8.TBG.hIDS.co。
在許多情況下，rAAV顆粒被指為DNase抗性。然而，除了此核酸內切酶(DNase)外，其他核酸內切酶和核酸外切酶也可以用於本文所述的純化步驟，以除去污染的核酸。可以選擇此種核酸酶來降解單股DNA及/或雙股DNA與RNA。這些步驟可含有單個核酸酶，或針對不同目標的核酸酶混合物，並且可以是核酸內切酶或核酸外切酶。
製備AAV系載體的方法是已知的，詳見例如美國公開專利申請案2007/0036760(2007年2月15日)，其藉由引用併入本文。使用AAV9的AAV衣殼特別適合於本文所述的組成物和方法。AAV9的序列和基於AAV9衣殼產生載體的方法敘述於US 7,906,111；US2015/0315612；WO 2012/112832；其藉由引用併入本 文。然而，可選擇或生成其他AAV衣殼，例如，AAV8的序列和基於AAV8衣殼產生載體的方法敘述於美國專利案7,282,199 B2、US 7,790,449及US 8,318,480，其藉由引用併入本文。許多此類AAV的序列被提供於上述所引用的美國專利案7,282,199 B2、US 7,790,449、US 8,318,480及美國專利案7,906,111及/或可獲自GenBank。任何AAV衣殼的序列都可以使用各種分子生物學和基因工程技術容易地合成，合適的生產技術為本領域熟悉技術者所熟知的，詳見例如，Sambrook et al,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY)。或者，編碼胜肽之寡核苷酸(例如，CDRs)或可合成產生的胜肽本身，例如，通過眾所周知的固相合肽合成方法(Merrifield,(1962)J.Am.Chem.Soc.,85：2149；Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman,San Francisco,1969)pp.27-62)。這些和其他合適的生產方法是在本領域熟悉技術者的知識範圍內，而不是對本發明的限制。
本文所述重組腺相關病毒(AAV)可使用以之技術產生，詳見例如WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。這種方法涉及培養包含編碼AAV衣殼的核酸序列之宿主細胞；功能性rep基因；(至少)由AAV反向末端重複序列(ITRs)和轉殖基因組成的表現盒；和足夠的輔助功能，以允許表現盒包裝到AAV衣殼蛋白中。
為了計算空的和完整的顆粒含量，針對所選 擇樣品的VP3帶體積(VP3 band volume)(例如，在本文的實施例中，碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中GC的#=顆粒的#)針對加載的GC顆粒作圖。得到的線性方程式(y=mx+c)用於計算測試物品尖峰之帶體積中的顆粒數。然後將每20μL加載的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。pt/mL除以GC/mL得到顆粒與基因體拷貝數(pt/GC)的比率。Pt/mL-GC/mL得到空的pt/mL，空的pt/mL除以pt/mL和x100得到空顆粒的百分比。
通常，分析空衣殼及具有經包裝基因體之AAV載體顆粒的方法是本技術領域已知的，詳見例如，Grimm et al.,Gene Therapy(1999)6：1322-1330；Sommer et al.,Molec.Ther.(2003)7：122-128。為了測試變性衣殼，該方法包括使經處理的AAV原液經受SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，其由能夠分離三種衣殼蛋白的任何凝膠組成，例如，於緩衝液中含有3-8%Tris-乙酸酯的梯度凝膠，然後跑凝膠直至樣品材料分離，並將凝膠轉印到尼龍紙或硝酸纖維膜上，以尼龍紙較佳。然後將抗AAV衣殼抗體使用作為初級抗體與變性衣殼蛋白結合，較佳為抗AAV衣殼單株抗體，最佳為B1抗AAV-2單株抗體(Wobus et al.,J.Virol.(2000)74：9281-9293)。然後使用二級抗體，其結合初級抗體並包含檢測與初級抗體結合的方法，更佳為含與其共價結合的檢測分子之抗IgG抗體，最佳為與辣根過氧化物酶共價結合之綿羊抗小鼠IgG抗體。檢測結合的方法用於半定量測定初級抗體和二級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素放 射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組，例如，關於SDS-PAGE，可以取出來自管柱濾分的樣品並在含有還原劑(例如DTT)的SDS-PAGE裝載緩衝液中加熱，並且在預製的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如Novex)上分離衣殼蛋白。可以使用SilverXpress(Invitrogen，CA)根據製造商的說明書進行銀染色，或其他合適的染色方法，即SYPRO紅寶石或考馬斯(coomassie)染色。在一具體實施例中，可以藉由定量即時PCR(Q-PCR)測量管柱濾分中AAV載體基因體的濃度(vg)。將樣品稀釋並用DNase I(或另一種合適的核酸酶)消化以除去外源DNA。在核酸酶去活性後，使用引子和對引子之間的DNA序列特異性的TaqManTM螢光探針進一步稀釋和擴增樣品。在Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection System上量測每一樣品達到確定的螢光水平(閾值循環，Ct)所需的循環數。含有與AAV載體中所含序列相同的序列之質體DNA被使用於在Q-PCR反應中產生標準曲線，藉由將其標準化成質體標準曲線的Ct值，使用從樣品獲得的循環閾值(Ct)之值以確定載體基因體力價，也可使用基於數位PCR(digital PCR)的終點分析(End-point assay)。
在一方面，使用優化的q-PCR方法，其利用廣譜絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K(例如可從Qiagen商購獲得)。更具體地，優化的qPCR基因體力價分析與標準分析類似，除了在DNase I消化後用蛋白酶K緩衝液稀釋樣品並用蛋白酶K處理，然後加熱去活化。適當地 用與樣品大小等量之蛋白酶K緩衝液稀釋樣品，該蛋白酶K緩衝液可以濃縮至2倍或更高。通常，蛋白酶K處理為約0.2mg/mL，但可以在0.1mg/mL至約1mg/mL之間變化。處理步驟通常在約55℃下進行約15分鐘，但可以在較低溫度(例如，約37℃至約50℃)下進行較長時間(例如，約20分鐘至約30分鐘)，或更高的溫度(例如，高達約60℃)更短的時段(例如，約5至10分鐘)。類似地，熱去活化通常在約95℃下持續約15分鐘，但溫度可降低(例如，約70至約90℃)並延長時間(例如，約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如，1000倍)並如標準測定中所述進行TaqMan分析。
此外，或者，可以使用微滴數位PCR(ddPCR)。例如，已經描述藉由ddPCR確定單股和自我互補AAV載體基因體力價的方法，詳見例如，M.Lock et al,Hu Gene Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods.2014 Apr；25(2)：115-25.doi：10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014Feb 14。
簡而言之，從基因體缺陷型AAV9中間體中分離具有包裝基因體序列的rAAV9顆粒的方法包括使包含重組AAV9病毒顆粒和AAV 9衣殼中間體的懸浮液進行快速液相層析，其中AAV9病毒顆粒和AAV9中間體與在pH 10.2時平衡的強陰離子交換樹脂結合，並經鹽梯度，同時監測洗提液在約260和約280的紫外線吸收。雖然對於rAAV9不太理想，但pH可以在約10.0至10.4的範圍內。在該方法中，當A260/A280的比率達到折點 時由被洗提之濾份收集AAV9全衣殼。在一個實例中，對於親和性層析步驟，可以將滲濾產物應用於有效捕獲AAV2/9血清型的Capture SelectTM Poros-AAV2/9親和樹脂(Life Technologies)。在這些離子條件下，顯著百分比的殘留細胞DNA和蛋白質流經管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。
rAAV.hIDS載體可以如圖11所示的流程圖製造，其在以下5.4節和實施例4中有更詳細的描述。
5.1.3. rAAV.hIDS之醫藥調配物
rAAV9.hIDS調配物是一種懸浮液，含有有效量的AAV.hIDS載體，懸浮在含有鹽水、表面活性劑和生理上相容的鹽或鹽混合物的水溶液中。將調配物適當地調整至生理可接受的pH，例如pH 6至9，或pH 6.5至7.5，pH 7.0至7.7，或pH 7.2至7.8。由於腦脊液的pH為約7.28至約7.32，對於鞘內遞送，可能需要該範圍內的pH；而對於靜脈內遞送，可能需要6.8至約7.2的pH。然而，可以選擇最寬範圍內的其他pH和這些次範圍用於其他遞送途徑。
合適的表面活性劑或表面活性劑的組合，可選自無毒的非離子表面活性劑。在一具體實施例中，選擇終止於初級羥基的雙官能嵌段共聚物表面活性劑，例如Pluronic® F68[BASF]，亦已知為Poloxamer 188，其具有中性pH，具有8400之平均分子量。可選擇其他表面活性劑及其他Poloxamers，亦即非離子三嵌段共聚物，由聚氧丙烯(聚(環氧丙烷))的中心疏水鏈組成，側面 是兩個聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))親水鏈、SOLUTOL HS 15(聚乙烯二醇-15羥硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一具體實施例中，這些共聚物通常以字母「P」(對於泊洛沙姆)命名，後面是三位數：前兩位x 100給出聚氧丙烯核的近似分子量，最後一位x 10給出聚氧乙烯含量百分比。在一個具體實施例中，選擇泊洛沙姆188。該表面活性劑的含量可高達懸浮液的約0.0005%至約0.001%。
在一具體實施例中，藉由oqPCR或數位微滴PCR(ddPCR)測量，調配物可含有例如至少約1×109GC/mL至3×1013GC/mL的濃度，敘述於例如M.Lock et al,Hu Gene Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods.2014 Apr；25(2)：115-25.doi：10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14，其藉由引用併入本文。
在一具體實施例中，提供一種冷凍組成物，其包含冷凍形式之如本文所述含rAAV之緩衝溶液。可選擇地，一種或多種表面活性劑(例如，Pluronic F68)、安定劑或防腐劑存在於該組成物中。使用時，將組成物適當地解凍並用合適的稀釋劑(例如無菌食鹽水或緩衝液食鹽水)滴定至所需劑量。
在一個實例中，調配物可包含例如緩衝食鹽水溶液，其於水中包含一或多種氯化鈉、碳酸氫鈉、右旋糖、硫酸鎂(例如硫酸鎂．7H2O)、氯化鉀、氯化鈣(例如氯化鈣．2H2O)、磷酸氫二鈉及其混合物。適合地，對於 鞘內遞送，滲透壓在與腦脊液相容的範圍內(例如，約275至約290)；詳見例如，emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。可選擇地，對於鞘內遞送，市售稀釋劑可使用作為懸浮劑，或與另一懸浮劑和其他可選擇的賦形劑組合使用。詳見例如，Elliotts B®溶液[Lukare Medical]。在其他具體實施例中，該調配物可含有一或多種滲透增強子，合適的滲透增強子之實例可包括，例如，甘露醇、甘胺膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、水楊酸鈉、辛酸鈉、癸酸鈉、十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。
在某些具體實施例中，提供一種套組，其包括懸浮於調配物(可選擇地為冷凍)之濃縮載體、可選擇的稀釋緩衝液，以及用於鞘內投予所需之裝置和其它組分。在另一具體實施例中，該套組可另外或選擇地包括用於靜脈內遞送的組分。在一具體實施例中，該套組提供足夠的緩衝液以允許注射，這種緩衝液可以允許濃縮載體約1：1至1：5的稀釋，或更多。在其他具體實施例中，包括更高或更低量的緩衝液或無菌水以允許臨床治療醫生進行劑量滴定和其他調整。在其他實施例中，該裝置的一種或多種組分包括在該套組中。
5.2. 基因治療方案 5.2.1 目標病患族群
本文提供治療II型黏多醣病的方法，包括將本文所述之治療有效量的rAAV.hIDS遞送至所需病患。特別是，本文提供了用於在診斷患有MPS II的病患中預 防、治療和/或改善神經認知減弱的方法，包括將本文所述之治療有效量的rAAV.hIDS遞送至所需病患。本文所述的rAAV.hIDS載體的「治療有效量」可以矯正以下任一段落中所確定之一種或多種症狀。
作為治療候選人的病患是具有MPS II(韓特氏徵候群)及/或與MPS II相關的症狀的兒童及成年病患，MPS II的特徵在於溫和/衰減表型或嚴重的表型。在嚴重表型(神經認知惡化)，病患者的平均年齡為11.7歲時發生死亡，在溫和/衰減表型之病患為21.7歲。大多數(三分之二)的病患患有這種疾病的嚴重型。具有MPS II的病患在出生時看起來是正常的，但在嚴重型，疾病的表徵和症狀通常於18個月至4歲之間存在，而在衰減型則為4至8歲之間。表徵和症狀常見於所有受影響的病患，包括身材矮小、面部粗糙、巨頭畸形、巨舌症、聽力喪失、肝臟和脾腫大、多發性心臟病、關節攣縮、椎管狹窄和腕管徵候群。在大多數病患中經常發生上呼吸道和耳部感染，並且常常發現進行性氣道阻塞，導致睡眠呼吸暫停並經常發生死亡。心臟病是此群人中死亡的主要原因，特徵是瓣膜功能障礙導致右心室和左心室肥大和心衰竭，死亡通常歸因於阻塞性氣道疾病或心衰竭。
在嚴重形式的MPS II中，可以滿足早期發育階段，但發育遲緩在18-24個月內很明顯。有些病患在第一年就未通過聽力篩查測試，其他階段會被推遲，包括沒有支持能力、走路能力和言語能力。發育進展在3至5歲之間開始穩定，據報導回歸開始於大約6.5歲。 在接受如廁訓練的具有MPS II之兒童中，若非全部喪失，則約有50%的兒童在疾病進展時會喪失這種能力。
具有顯著神經系統受累的病患表現出嚴重的行為障礙，包括從生命的第二年開始的多動、頑固和攻擊，並持續至8-9歲，此時神經變性減弱了這種行為。
據報導，超過一半的嚴重受影響之病患癲癇發作達到10歲，並到死亡時，大多數患有中樞神經系統疾病的病患都是嚴重的弱智者，需要不斷的護理。儘管具有減毒疾病的病患表現出正常的智力功能，但MRI成像顯示所有患有MPS II的病患者都有大腦異常，包括白質病變、腦室擴大和腦萎縮。
本發明組成物避免了與重組酵素免疫反應相關的長期酵素替代治療(ERT)的併發症，其可以從輕度到全面的過敏反應以及終身周邊通道口(peripheral access)的併發症，例如局部和全身性感染。與ERT相反，本發明組成物不需要終生、每週重複注射。不希望受理論束縛，本文所述之治療方法被認為可用於至少矯正與MPS II病症相關的中樞神經系統表型，其藉由提供以具備高轉導效率之載體來提供有效長期基因轉移，其提供連續的、升高的循環IDS水平，在CNS隔室外提供治療性制衡作用。
在一些具體實施例中，根據本文所述的方法治療被診斷患有嚴重MPS II的病患。在一些具體實施例中，根據本文所述的方法治療被診斷有減毒MPS II的病患。在一些具體實施例中，具有早期神經認知缺陷的具 有MPS II之兒童受試者依本文所述的方法進行治療。在某些具體實施例中，根據本文所述的方法治療2歲或年紀更大的病患，其被診斷患有韓特氏徵候群且具有神經認知缺陷或有發生神經認知缺陷風險。在某些具體實施例中，根據本文所述的方法治療2歲或年紀更大的病患，其存在已知與嚴重的韓特氏病相關的主要重排或缺失突變。
在某些具體實施例中，根據本文所述的方法治療新生嬰兒(3個月或更小)。在某些具體實施例中，根據本文所述的方法治療3個月至9個月大的嬰兒。在某些具體實施例中，根據本文所述的方法治療9個月至36個月大的兒童。在某些具體實施例中，根據本文所述的方法治療3歲至12歲的兒童。在某些具體實施例中，根據本文所述的方法治療12歲至18歲的兒童。在某些具體實施例中，根據本文所述的方法治療18歲或以上的成年人。
適當地，治療所選擇的病患可包括具有一或多種以下特徵者：藉由在血清、血漿、纖維母細胞或白血球中測量到的缺乏或減少的IDS酵素活性證實MPS II的確診診斷；由MPS II引起的早期神經認知缺陷的確診證據，如果不能藉由任何其他神經或精神因素解釋，則定義為以下任一種：DQ(BSID-III)，其低於平均值至少1標準偏差，或序列測試中減弱大於1標準差的確診歷史證據。或者，可以使用尿液、血清、腦脊液或基因檢測中增加的GAG。在治療之前，受試者，例如幼兒，較佳地進行基因分型以鑑定MPS II病患，即在編碼hIDS之基因中具有突變的病患。在治療之前，可評估MPS II病患對用於遞送hIDS基因的AAV血清型之中和抗體(Nab)，此種Nab可以干擾轉導效率並降低治療功效。具有基線血清Nab力價
Figure 107133321-A0305-02-0052-9
1：5的MPS II病患是用rAAV.hIDS基因治療方案治療的良好候選者。用血清Nab>1：5之力價治療MPS II病患者可能需要一種組合治療，例如在以rAAV.hIDS載體遞送治療之前和/或期間與免疫抑制劑暫時共同治療。可選擇地，免疫抑制共同治療可使用作為預防措施，而無需事先評估AAV載體衣殼及/或調配物的其他組分的中和抗體。可能需要預先免疫抑制治療以防止對hIDS轉基因產品的潛在不良免疫反應，尤其是在幾乎沒有IDUA活性水平的病患者中，其中該轉基因產品可能被視為「外來的」。在下文所述的小鼠、犬隻和NHP的非臨床研究結果與對hIDS和神經炎之免疫反應的發展一致。雖然人類受試者可能不會發生類似的反應，但作為預防措施，建議所有rAAV-hIDS接受者使用免疫抑制治療。
此種共同治療的免疫抑制劑包括，但不限於，糖皮質激素、類固醇、抗代謝劑、T細胞抑制劑、大環內酯(例如雷帕黴素(rapamycin)或雷帕黴素類似物(rapalog))和細胞抑制劑，包括烷化劑、抗代謝物、細胞毒性抗生素、抗體或對免疫親和素(immunophilin)具有活性之藥劑。免疫抑制劑可包括氮芥(nitrogen mustard)、亞硝基脲(nitrosourea)、鉑化合物、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)、甲氨蝶呤(methotrexate)、來氟米特(leflunomide，Arava)、環磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil，Leukeran)、氯奎寧(例如羥氯奎寧)、硫酸奎寧、甲氟奎寧(mefloquine)、阿托奎酮(atovaquone)與氯胍(proguanil)的組合、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、巰嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、放線黴素(dactinomycin)、蒽環黴素(anthracycline)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、光黴素(mithramycin)、IL-2受體-(CD25-)或CD3-定向抗體、抗-IL-2抗體、阿巴西普(abatacept，Orencia)、阿達木單抗(adalimumab，Humira)、阿那白滯素(anakinra，Kineret)、賽妥珠單抗(certolizumab，Cimzia)、依那西普(etanercept，Enbrel)、戈利木單抗(golimumab，Simponi)、英夫利昔單抗(infliximab，Remicade)、利妥昔單抗(rituximab，Rituxan)、托珠單抗(tocilizumab，Actemra)及托法替布(tofacitinib，Xeljanz)、環孢菌素(cyclosporine)、他克莫司、西羅莫司、IFN-β、IFN-γ、鴉片樣物質或TNF-α(腫瘤壞死因子-α)結合劑及這些藥物的組合。在某些具體實施例中，免疫抑制治療可在基因治療給藥前0、1、2、7或更多天開始，這種治療可能涉及在同一天共同施用兩種或更多種藥物。在一具體實施例中，兩或更多種藥物可例如為一或多種皮質類固醇(例如，前列腺素或強體松)及可選擇的MMF及/或鈣調磷酸酶(calcinuerin)抑制劑(例如他克莫司或西羅莫司(即雷帕黴素))。在一具體實施例中，兩或更多種藥物為黴酚酸酯(mycofenolate mofetil，MMF)及/或西羅莫司。在另一具體實施例中，兩或更多種藥物可為例如甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)、強體松、他克莫司及/或西羅莫司。在某些具體實施例中，藥物為MMF及他克莫司，用於在載體遞送前0至15天，並在MMF及/或與他克莫司的整個隨後派用中維持約8週。一種或多種這些藥物可在基因治療給藥後以相同劑量或調整劑量繼續使用。在某些具體實施例中，病患最初用IV類固醇(例如，甲基培尼皮質醇)給藥以加載劑量，然後逐漸減少用口服類固醇(例如腎上腺皮質酮)以使第12週病患脫離類固醇。皮質類固醇治療由他克莫司(24週)及/或西羅莫司(12週)補充，並可進一步補充MMF。當使用他克莫司和西羅莫司時，每個劑量應調整低劑量以維持血液波谷濃度(trough level)約4ng/mL至約8ng/ml，或總共約8ng/mL至約16ng/mL。在某些具體實施例中，當僅使用這些藥劑中的一種時，他克莫司及/或西羅莫司的總劑量可在約16ng/mL至約24ng/mL的範圍內。如果僅使用一種藥劑，則應使用標記劑量(較高劑量)；例如，0.15-0.20mg/kg/天之他克莫司，每12小時給予兩次分劑量；及1mg/m2/天之西羅莫司；負荷劑量應為3mg/m2。如果將MMF增至療法中，則可以保持他克莫司及/或西羅莫司的劑量，因為作用機制不同。這些和其他療法可在大約前14天至前第1天(例如，前第2天，第0天等)開始，並至少持續至約至1週(7天)，或至少約60天、或至少約12週、或至少約16週、或至至約約24週、或至少約48週、或視需要更長。在某些具體實施例中，選擇一無他克莫司之療法。
在某些具體實施例中，病患將接受如下之免疫抑制：皮質類固醇：甲基培尼皮質醇10mg/kg IV每日一次1前劑量，及口服強體松在第2天以0.5mg/kg/天開始，逐漸逐漸減量並在第12週停藥，他克莫司：在第2週至第24週，經口服1mg BID，在第24週；和第32週之間逐漸減量超過8週；西羅莫司：在前第2天加載劑量，然後西羅莫司0.5mg/m2/天分成BID給藥直至第48週。在某些具體實施例中，在用AAV9.hIDS給藥後第48週停用IS治療。
不希望受理論束縛，免疫抑制共同治療有以下一或多種：誘導對AAV及/或轉殖基因的無反應性或免疫耐受性；阻斷免疫反應以優化療效；盡量減少針對轉殖基因的新生免疫反應；盡量減少預先存在的免疫反應對轉殖基因的影響；盡量減少預先存在的免疫反應對AAV的影響；預防免疫藥物毒性；盡量減少TG表現細胞的破壞；減少NHP中的軸突病變/DRG神經毒性。
在某些具體實施例中，具有一或多種以下特徵的病患可由其護理醫師自行決定排除在治療之外：
●是否存在任何不屬於MPS II的神經認知缺陷，研究者或醫學監測員認為可能會對研究結果的解釋產生混淆
●是否具有任何症狀(例如，任何疾病的病史、任何當前疾病的證據、體檢時的任何發現或任何實驗室異常)，研究者認為，會使受試者處於不適當的風險或會干擾評估受試者的安全性或研究結果的研究產品或解釋
●神經精神症狀之診斷
●是否具有對鞘內/顱內治療有任何禁忌，包括對螢光鏡成像的禁忌
●是否對MRI有任何禁忌
●在登記時是否具有急性腦積水
●是否最近在篩選前4週內或在該臨床研究中使用的研究性產品的5個半衰期內參加具有研究性產品的任何其他臨床研究，以較長者為準
●是否經歷造血幹細胞移植(HSCT)
●是否在篩選前6個月內經鞘內投予接受艾杜硫酯酶
●是否在任何時候都接受過鞘內艾杜硫酯酶，並且經歷與鞘內投予有關之重大不良反應(AE)，研究者及/或醫學監測員認為這會使受試者處於過度的風險中。
在其他具體實施例中，護理醫師可確定存在一或多種這些身體特徵(病史)不應排除本文提供的治療。
5.2.2. 投予之劑量及模式
適於投予病患之醫藥組成物包含含 rAAV.hIDS vectors之調配物緩衝液懸浮液，該調配物緩衝液包含生理上相容的水性緩衝液、表面活性劑和可選擇的賦形劑。在某些具體實施例中，本文所述醫藥組成物經鞘內投予。在其他具體實施例中，本文所述醫藥組成物經腦池內投予。在其他具體實施例中，本文所述醫藥組成物經靜脈內投予。在某些具體實施例中，該醫藥組成物藉由周邊靜脈輸注20分鐘(±5分鐘)。然而，此時間可以根據需要或期望進行調整。然而，還可以選擇其他給藥途徑。或者或另外，如果需要，可以組合給藥途徑。
雖然預期單次施用rAAV是有效的，但可以重複施用(例如，每季、每兩年、每年或另外需要，特別是在新生兒的治療中)。考慮到受試者耐受輸注/注射的年齡和能力，治療有效量之初始劑量可通過分次輸注/注射療程遞送。然而，不需要每週重複注射一次完整的治療劑量，提供病患舒適和治療結果方面的優點。
在一些具體實施例中，rAAV懸浮液具有rAAV基因體拷貝(GC)力價至少1.0×1013GC/mL。在某些具體實施例中，rAAV懸浮液中該rAAV空/全顆粒比率介於0.01至0.05之間(95%-99%無空衣殼)。在一些具體實施例中，投予所需MPS II病患rAAV懸浮液之至少約4×108GC/g腦質量至約4×1011GC/g腦質量之劑量。
以下治療有效的rAAV.hIDS平坦劑量可投與至MPS II病患之指定年齡群： ●新生兒：約1×1011至約3×1014GC；●3-9月齡：約6×1012至約3×1014GC；●9月齡-6歲：約6×1012至約3×1014GC；●3-6歲：約1.2×1013至約6×1014GC；●6-12歲：約1.2×1013至約6×1014GC；●12+歲：約1.4×1013至約7.0×1014GC；●18+歲(成年)：約1.4×1013至約7.0×1014GC。
在其他具體實施例中，下列治療有效的平坦劑量投與至MPS II病患之年齡群：●新生兒：約3.8×1012至約1.9×1014GC；●3-9月齡：約6×1012至約3×1014GC；●9-36月齡：約1013至約5×1013GC；●6-12歲：約1.2×1013至約6×1014GC；●12+歲：約1.4×1013至約7.0×1014GC；●18+歲(成年)：約1.4×1013至約7.0×1014GC。
在某些具體實施例中，這些範圍中的一或多種用於任何年齡的病患。在某些具體實施例中，2.6×1012基因體拷貝數(GC)(2.0×109GC/g腦質量)之平坦劑量投予6歲或大於6歲之病患。在某些具體實施例中，1.3×1013(GC)(1.0×1010GC/g腦質量)之平坦劑量投予6歲或大於6歲之病患。在一些具體實施例中，投予12+歲(包括18+歲)MPSII病患的劑量為1.4×1013基因體拷貝數(GC)(1.1×1010GC/g腦質量)。在一些具體實施例中，投予12+歲(包括18+歲)MPSII病患的劑量為7×1013GC(5.6×1010GC/g腦質量)。在另一具體實施例中，投予至MPSII病 患的劑量為至少約4×108GC/g腦質量至約4×1011GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予MPSII新生兒的劑量範圍為約1.4x1011至約1.4x1014GC；投予幼兒3-9月齡之劑量範圍為約2.4×1011至約2.4×1014GC；投予MPSII幼童9-36月齡之劑量範圍為：約4×1011至約4×1014GC；投予MPSII兒童3-12歲之劑量：範圍從約4.8×1011至約4.8×1014GC；投予兒童及成年12+歲之劑量範圍從約5.6×1011至約5.6×1014GC。
在某些具體實施例中，至少約4×108GC/g腦質量至約4×1011GC/g腦質量之rAAV懸浮液劑量具有效力。在某些具體實施例中，投與之劑量為至少1.3×1010GC/g腦質量、至少1.9×1010GC/g腦質量、至少6.5×1010GC/g腦質量或9.4×1010GC/g腦質量或約4×1011GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為1.3×1010GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為6.5×1010GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為1.9×1010GC/g腦質量。在某些具體實施例中，投予至MPSII病患的劑量為9.4×1010GC/g腦質量。
在某些具體實施例中，由於在發育中的孩子早期發生相對快速的腦生長，所以給予IC的AAV9.hIDS的總劑量取決於不同年齡層的假設腦質量。關於研究受試者按年齡之腦質量，詳見例如(AS Dekaban,Ann Neurol,1978 Oct；4(4)：345-56。
Figure 107133321-A0202-12-0058-186
用於遞送這些劑量和濃度的合適體積可由本領域技術人員確定。例如，可選擇約1μL至150mL的體積，選擇較高的體積用於成年。通常，對於新生兒，合適的體積為約0.5mL至約10mL，對於較大的幼兒，可選擇約0.5mL至約15mL。對於幼童，可以選擇約0.5mL至約20mL的體積。對於兒童，可以選擇至多約30mL的體積。對於青少年，可以選擇多至約50mL的體積。在另一個具體實施例中，病患可接受體積為約5mL至約15mL的鞘內投予，或約7.5mL至約10mL。可以確定其他合適的體積和劑量。將調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且這樣的劑量可以根據使用重組載體的治療應用而變化。
貝里嬰幼兒發展量表(Bayley Scales of Infant and Toddler Development,Third Ed.,BSID-III)來測量，可進行神經認知和適應性行為評估(例如，分別使用貝里嬰兒發展量表和文蘭德適應行為量表)。
5.2.3. 監測功效
本文所述的治療功效可藉由評估(a)在具有MPS II(韓特氏徵候群)之病患中預防神經認知減弱；(b) 降低疾病的生物標誌，例如CSF、血清及/或尿液中之GAG水平和/或酵素活性，及/或肝臟和脾臟體積。神經認知可以通過測量智商(IQ)來確定，例如經由貝里嬰幼兒發展量表量測賀勒氏症(Hurler)受試者，或經由魏氏智力簡化量表(WASI)量測賀勒-施艾氏症(Hurler-Scheie)受試者。可以使用神經認知發展和功能的其他適當方法，例如使用貝里嬰幼兒發展量表(BSID-III)之評估發育商(DQ)、使用霍普金斯詞彙學習測驗評估記憶，及/或使用注意力多項參數測試(TOVA)。監測其他神經心理學功能，例如文蘭德適應行為量表、視覺處理、精細運動、交流、社會化、日常生活技能及情緒和行為健康。亦管理藉由獲取體積之大腦核磁共振成像(MRI)、擴散成像(diffusion imaging，DTI)和靜息狀態數據、藉由超音波檢查獲得之正中神經橫截面積、改善脊髓壓迫、安全性、肝臟大小和脾臟大小。
可選擇地，其他功效測量可包括評估生物標誌(例如，如本文所述之多胺)及臨床結果。評估尿液的總GAG含量、GAG相對於肌酸酐的濃度，以及MPS II特異性pGAG。評估血清及/或血漿的IDS活性、抗IDS抗體、pGAG和肝素輔因子II-凝血酶複合物的濃度和炎症標誌物。評估CSF的IDUA活性、抗IDS抗體、己糖胺酶(hex)活性和pGAG(例如硫酸乙醯肝素和硫酸皮膚素)。在CSF和血清中可以評估對於載體(例如AAV9)之中和抗體及抗體與抗-IDS抗體結合。對載體衣殼(例如AAV9)或hIDS轉殖基因產物的T細胞反應可藉由 ELISPOT分析評估。亦可是監測在CSF、血清和尿液中IDS表現的藥物動力學及載體濃度(PCR至AAV9 DNA)。
本發明之方法包括將rAAV.hIDS基因治療遞送至CNS與伴隨hIDS的全身遞送的組合。可使用ERT(例如，使用Elaprase®(艾杜硫酯酶))或使用具有肝臟向性之rAAV.hIDS的額外基因治療以及來完成全身遞送(例如，帶有AAV8衣殼的rAAV.hIDS)。
與全身遞送相關的臨床療效的其他測量可包括例如，骨科測量，例如骨礦物質密度、骨礦物質含量、骨骼幾何形狀和強度、經雙能量X射線吸收測定法(DXA)測量的骨密度；高度(年齡之站立高度/平躺長度的Z分數；骨代謝標誌物：測量血清骨鈣素(OCN)和骨特異性鹼性磷酸酶(BSAP)、I型膠原之羧基末端端肽(ICTP)和I型膠原羧基末端端肽α1鏈(CTX)；靈活性和肌肉力量：Biodex和物理治療評估，包括6分鐘步行研究(Biodex III等速力量測試系統用於評估每個參與者的膝蓋和肘部強度)；主動關節運動範圍(ROM)；兒童健康評估問卷調查/健康評估調查問卷(CHAQ/HAQ)殘疾指數得分；肌電圖(EMG)及/或氧氣利用以監測個人的心肺合適性：運動試驗期間的攝氧峰值(VO2峰值)；呼吸暫停/呼吸不足指數(AHI)；強迫肺活量(FVC)；左心室質量(LVM)。
在某些具體實施例中，提供一種診斷及/或治療病患的MPS II或監測治療的方法。該方法涉及從懷疑患有MPS II的人類病患者獲得腦脊液或血漿樣品；檢測樣品中的精胺濃度水平；診斷選自具有精胺濃度超過1 ng/mL的病患中的MPS II的黏多醣病病患；並向經診斷病患遞送如本文提供的有效量的人類IDS。
在另一方面，該方法涉及監測和調節MPS II治療。這種方法包括從接受MPS II治療的人類病患中獲取腦脊液或血漿樣品；藉由進行質譜分析檢測樣品中的精胺濃度水平；調整MPS II治療劑的劑量水平。例如，「正常」人類精胺濃度在腦脊液中約為1ng/mL至2ngmL或更低。然而，未經治療的MPS II病患可具有大於2ng/mL且高至約100ng/mL的精胺濃度水平。如果病患的水平接近正常水平，則可降低任何伴劑的劑量。相反地，如果病患具有高於所欲之MPS II水平，則可以向病患提供更高劑量或另外的治療，例如ERT。
可以使用合適的分析來確定精胺濃度。關於分析的實例敘述於J Sanchez-Lopez,et al,"Underivatives polyamine analysis is plant samples by ion pair liquid chromatography coupled with electrospray tandem mass spectrometry," Plant Physiology and Biochemistry,47(2009)：592-598,avail online 28 Feb 2009；MR Hakkinen et al,"Analysis of underivatized polyamines by reversed phase liquid chromatography with electrospray tandem mass spectrometry",J Pharm Biomec Analysis,44(2007)：625-634，定量同位素稀釋液相層析(LC)/質譜(MS)分析，可以使用其他合適的測定。
在一些具體實施例，本文所述的治療功效藉由在具有早期神經認知缺陷的MPS II兒童受試者中給藥 後第52週評估神經認知來確定。在一些具體實施例中，藉由在MPS II病患中評估CSF糖胺聚醣(GAG)與神經認知的關係來確定本文所述治療劑的功效。在一些具體實施例中，藉由評估治療劑對MPS II病患中CNS的身體變化的影響來確定本文所述治療的功效，如藉由磁共振成像(MRI)測量，例如灰質和白質和CSF室的體積分析。在一些具體實施例中，藉由評估治療劑對於MPS II病患的腦脊液(CSF)、血清和尿液中之生物標誌(例如，GAG、HS)的藥效學作用來確定本文所述治療劑的功效。在一些具體實施例中，藉由評估治療對MPS II病患生活質量(QOL)的影響來確定本文所述治療劑的功效。在一些具體實施例中，藉由評估治療劑對MPS II病患運動功能的影響來確定本文所述治療劑的功效。在一些具體實施例中，藉由評估治療劑對MPS II病患的生長和發育程度的影響來確定本文所述治療劑的功效。
如本文所述的rAAV載體所表現的，在CSF、血清或其他組織中檢測到的至少約2%的hIDS水平可以提供治療效果。然而，可以實現更高的表現水平。這樣的表現水平可以是正常功能的人類IDS水平的2%至約100%。在某些具體實施例中，可以在CSF、血清或其他組織中檢測到高於正常的表現水平。
在某些具體實施例中，本文所述的治療、預防及/或改善MPS II及/或其症狀的方法造成在經治療的病患中神經認知發育商(DQ)的顯著增加，如使用貝里幼兒發展量表的評估。在某些具體實施例中，相對於具有 韓特氏徵候群之病患的未治療/自然病史控制資料，本文所述的治療、預防及/或改善MPS II及/或症狀的方法造成經治療的病患的DQ減少不超過15分。
在某些具體實施例中，本文所述的治療、預防及/或改善MPS II及/或其症狀的方法造成功能性人類IDS水平的顯著增加。在某些具體實施例中，本文所述的治療、預防及/或改善MPS II及/或其症狀的方法造成GAG水平的顯著降低，如在病患者血清、尿液及/或腦脊液(CSF)樣品中所測量的。
5.3. 組合治療
本發明某些具體實施例包括將rAAV.hIDS基因治療遞送至CNS並伴隨全身遞送hIDS的組合。使用ERT(例如，使用Elaprase®)或使用具有肝臟向性的rAAV.hIDS的另外基因治療(例如，帶有AAV8衣殼的rAAV.hIDS)可以達成全身遞送。
在某些具體實施例中，rAAV9.hIDS的鞘內投予與第二次AAV.hIDS注射共同給藥，例如針對肝臟。在這種情況下，載體可相同。例如載體可具有相同衣殼及/或相同載體基因體序列。或者，載體可能不同。例如，每個載體世系(stock)可設計具有不同的調控序列(例如每個具有不同的組織特異性啟動子)，例如肝特異性啟動子和CNS特異性啟動子。另外，或者，每個載體世系可以具有不同的衣殼。例如被引導至肝臟的載體世系可以具有選自AAV8、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8、rh10、AAV3B或AAVdj等的衣殼。在此種方法中，可以調節 每個載體世系的劑量，使得鞘內遞送的總載體在約1×108GC至x 1×1014GC的範圍內；在其他具體實施例中，兩種途徑遞送的組合載體在1×1011GC至1×1016GC的範圍內。或者，每種載體可以約108GC至約1012GC/載體的量遞送，此劑量實質上可同時或在不同時間遞送，例如，間隔約1天至約12週，或約3天至約30天，或其他合適的時間。
在一些具體實施例中，治療方法包含：(a)以足量的hIDS酵素或肝臟定向的rAAV-hIDUA投予具有MPS II及/或韓特氏徵候群之症狀的病患，以誘導轉殖基因特異性耐受性；及(b)將rAAV.hIDS投予至病患之CNS，其中rAAV.hIDS在病患中指導hIDS的治療水平的表現。
在另一具體實施例中，本發明提供一種治療具有MPS II及/或與韓特氏徵候群相關症狀的人類病患的方法，該方法包括以足量的hIDS酵素或肝導向rAAV-hIDS耐受具有MPS II和/或相關的韓特氏徵候群症狀的病患，以誘導轉殖基因特異耐受性，隨後以經rAAV調控遞送之hIDS送至病患。在某些具體實施例中，例如，當病患小於4週齡(新生兒階段)或幼兒時，病患經由肝導向注射投予rAAV.hIDS，以便使病患耐受hIDS，而當病患是幼兒、兒童和/或成年時，病患隨後藉由鞘內注射投予rAAV.hIDS以在CNS中表現hIDS的治療濃度。
在一實例中，MPS II病患在出生後約兩週內 藉由遞送hIDS至病患而被耐受，例如，在約0至約14天內，或約1天至12天，或約第3天至約第10天，或約第5天至第8天，即病患是新生幼兒。在其他具體實施例中，可以選擇年齡較大的幼兒。耐受劑量的hIDS可經rAAV遞送。然而，在另一具體實施例中，藉由直接遞送酵素(酵素替代治療)來遞送劑量。產生重組hIDS的方法已於文獻中描述。
另外，如Elaprase®(艾杜硫酯酶)商業生產的重組hIDS可用於全身遞送。儘管目前不太優異，但可以藉由「裸露的」DNA、RNA或另一種合適的載體遞送該酵素。在一具體實施例中，將酵素靜脈內及/或鞘內遞送至病患。在另一具體實施例中，使用另一種給藥途徑(例如，肌肉內、皮下等)。在一個具體實施例中，選擇用於耐受的MPS II病患在開始耐受劑量之前不能表現任何可檢測量的hIDS。當遞送重組人類IDS酵素時，靜脈內注射rhIDS可以包含約0.5mg/kg體重。或者，選擇更高或更低的劑量。類似地，當由載體表現時，可遞送較低表現的蛋白質水平。在一具體實施例中，用於耐受而遞送的hIDS的量低於治療有效量。然而，可以選擇其他劑量。
通常，在投予耐受劑量後，將治療劑量遞送至受試者，例如，在耐受後劑量後約3天至約6個月，更佳為耐受劑量後約7天至約1個月。然而，可以選擇這些範圍內的其他時間點，也可以選擇更長或更短的等待期間。
作為替代方案，除載體外，在載體給藥之前、 期間及/或之後還可以給予免疫抑制治療。免疫抑制治療可包括如上所述的腎上皮皮質酮、黴酚酸酯(MMF)和他克莫司或西羅莫司。所述之無他克莫司療法可為較佳。
5.4. 製備
一具體實施例提供製備本文所述的rAAV.hIDS醫藥組成物(實施例4，見下文)。在圖10A和10B中提供說明性的製備方法，可如圖10A和10B所示的流程圖所示製備rAAV.hIDS載體。簡而言之，細胞為在適當細胞培養物(例如HEK 293)中製備之細胞。製備本文所述的基因治療載體的方法包括本領域中所熟知的方法，例如用於產生基因治療載體的質體DNA的產生、載體的產生和載體的純化。在一些具體實施例中，基因治療載體是AAV載體，且所生成的質體是編碼AAV基因體和感興趣基因的AAV順式-體質、AAV反式-質體含有AAV rep和cap基因和腺病毒輔助質體(helper plasmid)。載體產生的過程可包括方法步驟，例如開始細胞培養、細胞繼代、細胞接種、以質體DNA轉染細胞、轉染後培養基更換成無血清培養基、以及含有載體的細胞和培養基的收穫。經收穫的含載體的細胞和培養基較佳為本文所述之粗製細胞收穫物。
之後，粗製細胞收穫物可以是受試者方法步驟，例如濃縮載體收穫物、透析過濾載體收穫物、微流化載體收穫物、載體收穫物的核酸酶消化，過濾經微流化之中間體的、經層析法之粗純化、經超速離心之粗純化、藉由切向流過濾(tangential flow filtration)之緩衝液 交換及/或調配和過濾以製備大量載體。
在高鹽濃度下進行兩步驟親和性層析純化，然後使用陰離子交換樹脂層析法以純化載體藥物產品並移除空衣殼。這些方法更詳細地敘述於國際專利申請案PCT/US2016/065970(2016年12月9日申請)及其優先權文件、美國專利案申請案62/322,071(2016年4月13日申請)及62/226,357(2015年12月11日申請)、且命名為「AAV9的可擴展純化方法(Scalable Purification Method for AAV9)」，其藉由引用併入本文。關於AAV8的純化方法，國際專利申請案PCT/US2016/065976(2016年12月9日申請)及其優先權文件美國專利申請案62/322,098(2016年4月13日申請)及62/266,341(2015年12月11日申請)，及關於rh10，國際專利申請案PCT/US16/66013(2016年12月9日申請)及其優先權文件、美國專利申請案62/322,055(2016年4月13日申請)及62/266,347，命名為「AAVrh10的可擴展純化方法(Scalable Purification Method for AAVrh10)」，亦於2015年12月11日申請，及關於AAV1，國際專利申請案PCT/US2016/065974(2015年12月9日申請)及其優先權文件、美國專利申請案62/322,083(2016年4月13日申請)及62/26,351，關於「AAV1的可擴展純化方法(Scalable Purification Method for AAV1)」，2015年12月11日申請，其所有藉由引用併入本文。
5.5. 用於遞送醫藥組成物進入腦脊液的裝置和方法
在一方面，本文提供的載體可藉由本節中提供的方法及/或裝置鞘內投予，並在實施例及圖11中進一步描述。或者，可以選擇其他裝置和方法。該方法包含以下步驟：將腰椎穿刺針推進病患的腦大池中，將一段可撓性配管連接到腰椎穿刺針的近端插座，並將閥門的輸出端口連接到可撓性配管的近端，並且在該推進和連接步驟之後以及在允許配管用病患的腦脊液自動灌注之後，將含有一定量的等張溶液之第一容器連接至閥門的沖洗入口，然後將含有一定量的醫藥組成物之第二容器連接至閥門的載體入口。在將第一和第二容器連接到閥門之後，打開在閥門的載體入口和出口之間流體流動的路徑，並經腰椎穿刺針將醫藥組成物注入病患者，並在注射醫藥組成物之後，經由閥門的沖洗入口和出口打開流體流動的路徑，並將等張溶液注入腰椎穿刺針以將醫藥組成物沖洗到病患者體內。
在另一方面，提供一種用於腦池內遞送醫藥組成物的裝置，該裝置包括含有一定量醫藥組成物的第一容器、含有等張溶液的第二容器，及腰椎穿刺針，通過該腰椎穿刺針，醫藥組成物可以從裝置直接排出進入病患腦大池的腦脊液中。該裝置進一步包括閥門，該閥門具有與第一容器相互連接的第一入口端口、與第二容器相互連接的第二入口端口、與腰椎穿刺針相互連接的出口端口、及用於控制醫藥組成物及等張溶液經腰椎穿刺針流動的魯爾接頭(luer lock)。
如本文中所使用，術語電腦斷層掃描(CT)係指放射線照相術，其中身體結構的三維影像經電腦從一系列平面橫截面影像沿軸線製成建構而成。
如圖11所示的設備或醫療裝置10包括通過閥門16相互連接的一或多個容器12和14。容器12和14分別提供醫藥組成物、藥物、載體或類似物質和新鮮來源和等張溶液的新鮮來源，例如食鹽水。容器12和14可以是能夠將流體注入病患的任何形式醫療裝置。
舉例來說，每個容器12和14可以注射器、套管等的形式提供。例如，在圖示的具體實施例中，容器12以包含一定量的醫藥組成物之分離的注射器被提供，並且在本文中稱為「載體注射器」。僅僅出於例示的目的，容器12可以包含約10cc的醫藥組成物等。
同樣地，容器14可以包含一定量的食鹽水溶液之分離的注射器、套管等的形式被提供，並且可以稱為「沖洗注射器」。僅僅出於例示的目的，容器14可包含約10cc的食鹽水溶液。
作為替代方案，容器12和14可以注射器以外的形式提供，並且可整合至單個裝置中，例如，整合的醫療注射裝置具有一對分離的腔室，一個用於醫藥組成物且一個用於食鹽水。而且，可根據容納所需之流體量來提供腔室或容器的尺寸。
在圖示的具體實施例中，閥門16以具有旋轉公魯爾接頭18的四通栓閥被提供，閥門16將容器12和14互連(即，所示的具體實施中的載體注射器和沖洗注射器)，且旋轉公魯爾接頭使得通過閥門16的路徑能夠關閉或打開至各個容器12和14中。以此方式，通過閥門16的路徑可以對載體注射器和沖洗注射器都閉合，或者可以對所選擇的一個載體注射器和沖洗注射器開放。作為四通栓閥的替代，閥門可以是三通栓閥或流體控制裝置。
在圖示的具體實施例中，閥門16連接到一段延伸配管20或類似的流體導管的一端。可基於所欲之長度或內部容積來選擇配管20，僅作為例示，配管的長度可為約6至7英寸。
在圖示的具體實施例中，配管12的相對端22連接到T型延長套組24，T型延長套組24又連接到腰椎穿刺針26。舉例而言，針26可為五英寸，22或25號腰椎穿刺針。此外，作為一種選擇，腰椎穿刺針26可連接至穿刺針28，例如三英寸半，18號穿刺針。
在使用上，腰椎穿刺針26及/或可選擇的穿刺針28可朝向腦大池進入病患。在針前進之後，可獲得電腦斷層掃描(CT)影像，其允許針26和/或28和相關的軟組織(例如，椎旁肌、骨、腦幹和脊髓)的可視化。藉由觀察針座中的腦脊液(CSF)和腦大池內針尖的可視化來確認正確的針放置位置。之後，可將相對短的延伸配管20附接到插入的腰椎穿刺針26，然後可將四通栓閥16連接到配管20的相對端。
允許上述組件與病患的CSF成為「自我準備」。之後，將預填充的普通食鹽水沖洗注射器14連接到四通栓閥16的沖洗入口，然後將含有醫藥組成物的載體注射器12連接到四通栓閥16的矢量入口。之後，栓閥16的輸出端口向載體注射器12打開，並且載體注射器的內容物可經閥門16和組裝設備緩慢注入並進入病患一段期間。僅僅出於例示的目的，此期間可為大約1-2分鐘及/或任何其他所欲之時間。
在注入載體注射器12的內容物之後，將栓閥16上的旋轉接頭18轉到第二位置，因此使用預充式導管沖洗注射器14可以所欲之量的普通食鹽水沖洗所裝配的栓閥16和針。僅舉例來說，可以使用1至2cc的普通食鹽水；儘管可根據需要使用更多或更少的量。正常的食鹽水確保所有或大部分醫藥組成物被迫通過裝配的裝置注入並進入病患，因此很少或沒有醫藥組成物保留在裝配的裝置中。
在用食鹽水沖洗所裝配之裝置後，將裝配的裝置(包括針頭、延伸配管、栓閥和注射器)從受試者中緩慢取出並放在手術托盤上，以便丟棄至生物危害廢物容器或硬質容器(用於針頭)。
篩選過程可由最終可領導腦池內(IC)程序的主要研究人員進行，主要研究人員可描述方法、操作程序、管理程序本身以及所有潛在的安全風險，以便讓受試者(或指定的看護人)充分了解情況。獲取或執行病史、伴隨藥物治療、體檢、生命像徵、心電圖(ECG)和實驗室檢測結果，並提供給神經放射學家、神經外科醫生和麻醉師，用於IC程序篩選評估受試者的資格。
為了留出足夠的時間來審查資格，可在第一次篩選訪視和研究訪視之前一週之間的任何時間進行以 下程序。例如，在「第0天」，可以獲得具有及不具有釓的頭/頸磁共振成像(MRI)(即，eGFR>30mL/min/1.73m2)。除頭頸MRI外，研究者還可藉由屈曲/伸展研究確定是否需要進一步評估頸部。MRI方案可以包括T1、T2、DTI、FLAIR和CINE方案影像。
此外，頭/頸MRA/MRV可根據機構方案獲得(即，可排除具有內部/轉導操作歷史的受試者或可能需要進一步測試(例如，放射性核苷酸腦池造影))充分評估CSF流量，確定CSF空間之間的流通之可能的阻塞或缺乏。
神經放射學家、神經外科醫生和麻醉師最終根據所有可用信息(掃描、病史、體檢、實驗室等)討論並確定每個受試者是否符合IC程序的資格。麻醉前的評估也可以從「28天前」到「第1天」獲得，該評估提供氣管、頸部(縮短/加厚)和頭部活動範圍(頸部屈曲度)的詳細評估，記住MPS受試者的特殊生理需求。
在IC程序之前，CT套件將確認以下設備和藥物的存在：成年人腰椎穿刺(LP)套組(由各機構提供)；BD(Becton Dickinson)22或25號x 3-7”腰椎穿刺針(Quincke bevel)；Coaxial穿刺針，由執行程序的醫師自行決定使用(用於導入腰椎穿刺針)；配有旋轉(Spin)公魯爾接頭四通小孔栓閥；配有母魯爾接頭配接器之T型延長套組(配管)，長度約為6.7英寸；Omnipaque 180(碘六醇)，用於鞘內投予；用於靜脈內(IV)投予的碘化造影劑；注射用1%利多卡因(lidocaine)溶液(若未在成年人LP試劑盒中提供)；預填充10cc普通食鹽水(無菌)沖洗注射器；射線透不過的標記；手術準備設備/剃刀；枕頭/支撐器，以允許插管受試者的正確定位；氣管插管設備、全身麻醉機和機械人工呼吸器；術中神經生理監測(IONM)設備(和所需人員)；及含有載體的10cc注射器；依據單獨的配藥學手冊準備並運送到CT/手術室(OR)套件。
該程序的知情同意書在醫療記錄和/或研究文件中得到確認和記錄。根據機構要求，獲得放射學和麻醉學工作人員對該程序的單獨同意。受試者根據機構指南(例如，兩個IV進入位置)在相應的醫院護理單位內進行靜脈通路安置。靜脈輸液由麻醉師自行決定。在麻醉師的判斷並根據機構指南，受試者可在適當的病人護理單位、手術區域或手術/CT程序套件中使用全身麻醉進行誘導並接受氣管插管。
進行腰椎穿刺，首先移除5cc腦脊液(CSF)，然後鞘內注射造影劑(Omnipaque 180)以幫助腦大池的可視化。可執行適當的受試者定位操縱以促進造影劑擴散到腦大池中。
術中神經生理監測(IONM)設備連接至受試者，受試者被置於俯臥位或側臥位的CT掃描儀台上，必須有足夠的工作人員以確保受試者在運輸和定位期間的安全。如果認為合適，受試者可以術前評估期間提供確定為安全的頸部屈曲的方式定位，並在定位後記錄正常的神經生理監測信號。
可確認下列工作人員在場並現場確定：執行程序的醫師/神經外科醫生；麻醉師和呼吸技師；護士和醫師助理；CT(或OR)技術人員；神經生理學技師；和現場協調員。「暫停時間」可根據聯合委員會/醫院協定完成，以確認正確受試者、程序、地點、位置和房間內存在的所有必要設備。然後，主要的現場調查員可確認他/她可為可進行準備受試者的工作人員。
將受試者在顱底下的皮膚適當剃光，如果認為需要經由執行程序的醫師定位目標位置和影像脈管系統，則執行CT偵察影像，然後以IV造影劑進行程序前規劃CT。在確定目標部位(腦大池)及設計針頭軌跡後，根據機構指南，使用無菌技術將皮膚準備進行手術並覆蓋。根據執行程序的醫師所示，將射線透不過標記放置在目標皮膚位置，藉由1%利多卡因浸潤將標記下的皮膚麻醉，然後將22G或25G腰椎穿刺針朝向腦大池推進，可選擇使用同軸穿刺針。
在針推進後，使用機構設備可行的最薄CT切片厚度(理想為
Figure 107133321-A0305-02-0076-10
2.5mm)獲得CT影像。使用可能的最低輻射劑量之連續CT影像，其允許針和相關軟組織(例 如，椎旁肌、骨、腦幹和脊髓)的充分可視化，藉由觀察針座中的CSF和腦大池內針尖的可視化來確認正確的針放置位置。
執行程序的醫師確認載體注射器位於接近無菌區但位於無菌區外。在處理或管理載體注射器中的醫藥組成物之前，無菌區域內協助程序的工作人員須戴上手套、面罩和護目鏡。
將延伸配管連接到插入的腰椎穿刺針上，然後將其連接到四通栓閥上。一旦該設備與受試者的CSF「自動灌注」，10cc預充填普通食鹽水的沖洗注射器就連接到四通栓閥的沖洗入口，然後將載體注射器提供給執行程序的醫師並連接到四通栓閥上的載體入口端。
藉由將栓閥的旋轉接頭置於第一位置，將栓閥的出口打開至載體注射器後，緩慢注入載體注射器的內容物(約1-2分鐘)，注意不要在注射期間施加過大力量到注射器的活塞上。注入載體注射器的內容物後，將栓閥的旋轉接頭轉到第二位置，以便使用附屬的預充式導管沖洗注射器，以1-2cc普通食鹽水沖洗栓閥和針頭組件。
當準備好後，執行程序的醫師會提醒員工，他/她將從受試者移除設備。在單次動作中，將針、延伸配管、栓閥和注射器從受試者緩慢移除並放置在手術托盤上，以丟棄到生物危害廢物容器或硬容器(針頭用)中。
檢查針插入部位的出血或腦脊液滲漏的跡像，並按調查員的指示進行治療。根據指示，使用紗布、 手術膠帶和/或Tegaderm敷料進行包紮，然後將受試者從CT掃描儀中移開並放置在擔架上，有足夠的工作人員在運輸和定位期間確保受試者的安全。
停止麻醉且依據麻醉後護理之機構指南照護受試者，從受試者中移除神經生理監測器。受試者所在之擔架的頭部在恢復過程中應稍微抬起(~30度)。根據機構指南，受試者被運送到合適的麻醉後護理單位，在受試者已經充分恢復意識並處於穩定狀態後，他/她將被允許進入適當的樓層/單位進行步驟準則授權之評估。按照步驟準則進行神經學評估，初級調查員將與醫院和研究人員合作監督受試者的護理。
在一具體實施例中，本文提供的組成物遞送方法包括以下步驟：將腰椎穿刺針推進到病患的腦大池；將一段可撓性配管連接到腰椎穿刺針的近端插座和閥門的輸出端口連接到柔性配管的近端；並且在該推進和連接步驟之後以及在允許配管用病患的腦脊液自動灌注之後，將含有一定量的等張溶液之第一容器連接至閥門的沖洗入口，然後將含有一定量的醫藥組成物之第二容器連接至閥門的載體入口；在將第一和第二容器連接到閥門之後，打開在閥門的載體入口和出口之間流體流動的路徑，並經腰椎穿刺針將醫藥組成物注入病患者；並在注射醫藥組成物之後，經由閥門的沖洗入口和出口打開流體流動的路徑，並將等張溶液注入腰椎穿刺針以將醫藥組成物沖洗到病患者體內。在某些具體實施例中，該方法進一步包含在將配管和閥門連接到腰椎穿刺 針的插座之前，確認腰椎穿刺針的遠端尖端在腦大池內的正確放置位置。在某些具體實施例中，確認步驟包括利用電腦斷層掃描(CT)成像使腦大池內的腰椎穿刺針的遠端尖端可視化。在某些具體實施例中，確認步驟包括在腰椎穿刺針的插座中觀察病患的腦脊液的存在。
在上述方法中，閥門可以是具有旋轉魯爾接頭的栓閥，其適於旋轉到第一位置，允許從載體入口端口流到出口端口，同時阻止流過沖洗入口端口，及旋轉到第二位置，允許從沖洗入口端口流到出口端口，同時阻止流過載體入口端口，其中當該醫藥組成物被注入病患時，旋轉魯爾接頭定位在該第一位置，當該醫藥組成物被等張溶液沖洗入該病患時，定位於該第二位置。在某些具體實施例中，在注射等張溶液進入腰椎穿刺針以沖洗醫藥組成物至病患後，將具有配管、閥門和第一和第二容器作為組件連接到其上的腰椎穿刺針從病患中取出。在某些具體實施例中，閥門為具有旋轉公魯爾接頭的四通栓閥。在某些具體實施例中，第一和第二容器為單獨的注射器。在某些具體實施例中，T形接頭位於腰椎穿刺針的插座，並將配管與腰椎穿刺針相互連接。可選擇地，腰椎穿刺針包括在腰椎穿刺針遠端的穿刺針。腰椎穿刺針可以是5英寸，22或24號的腰椎穿刺針。在某些具體實施例中，穿刺針為3.5英寸，18號穿刺針。
在某些方面，該方法利用至少由以下所構成之裝置：一第一容器，用於容納一定量的醫藥組成物；一第二容器，用於容納等張溶液；一腰椎穿刺針，通過 該腰椎穿刺針，醫藥組成物可以從裝置直接排出進入病患腦大池的腦脊液中；及一閥門，具有與第一容器相互連接的第一入口端口、與第二容器相互連接的第二入口端口、與腰椎穿刺針相互連接的出口端口、及用於控制醫藥組成物及等張溶液經腰椎穿刺針流動的魯爾接頭。在某些具體實施例中，該閥門可以是具有旋轉魯爾接頭的栓閥，其適於旋轉到第一位置，允許從第一入口端口流到出口端口，同時阻止流過第二入口端口，及旋轉到第二位置，允許從第二入口端口流到出口端口，同時阻止流過第一入口端口。可選擇地，閥門為具有旋轉公魯爾接頭的四通栓閥。在某些具體實施例中，第一和第二容器為單獨的注射器。在某些具體實施例中，腰椎穿刺針經由一段可撓性配管與閥門相連，T-接頭可以將配管互連到腰椎穿刺針。在某些具體實施例中，該腰椎穿刺針為5英寸，22或24號的腰椎穿刺針。在某些具體實施例中，該裝置進一步包含在腰椎穿刺針遠端的穿刺針。可選擇地，該穿刺針為3.5英寸，18號穿刺針。
此方法和此裝置可各自可選擇地用於本文所提供的組成物之鞘內遞送。或者，其他方法和裝置可用於此種鞘內遞送。
以下實施例僅是說明性的，並非是對本文所述之本發明的限制。
6.實施例 實施例1：治療人類受試者的方案
此實施例係關於對具有MPS II(即韓特氏徵候群)的病患之基因治療。在此實施例中，基因治療載體AAV9.CB.hIDS是一種複製缺陷的腺相關病毒載體9(AAV9)，其表現編碼野生型hIDS酵素的經修飾hIDS基因，被投予MPS II病患之中樞神經系統(CNS)。如本文所述，在全身麻醉下將AAV載體的劑量直接注射到CNS中，使用神經認知發展及/或替代標誌(包括生物標誌)的臨床測量來評估治療效果，例如，在受試者的CSF或血清中致病性GAG及/或硫酸肝素(HS)濃度的降低。
A. 基因治療載體
基因治療載體是一種表現人類艾杜醣醛酸2-硫酸酯酶(IDS)的血清型9的非複製重組腺相關病毒(AAV)載體，在本實施例中稱為AAV9.CB.IDS(參見圖1)。AAV9血清型允許在IC投予後在CNS中有效表現hIDS產物。
IDS表現盒的側面是反向末端重複序列(ITRs)，且表現由巨細胞病毒(CMV)增強子和雞β肌動蛋白啟動子(CB7)的雜交體驅動。轉殖基因包括雞β肌動蛋白內含子和兔β球蛋白多聚腺苷酸化(polyA)信號。
將載體懸浮於調配物緩衝液(Elliots B Solution，0.001% Pluronic F68)中，將構築體包裝在AAV9衣殼中，如先前在M.Lock et al,Human Gene Ther,21：1259-1271(2010)中所述，進行純化和滴定。在下述實施例4中更詳細地描述製造方法。
載體製造：
產生一系列載體。一個質體包含密碼子優化 的IDS序列(SEQ ID NO：11的nt 1177至nt 2829)。另外兩者使用CB7啟動子(CB6)的短版本，並表現稱為SUMF1的第二蛋白質[SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：10]。所產生的載體基因體AAV.CB7.CI.hIDSco.RBG具有SEQ ID NO：11之nt 2至nt 3967序列，同時AAV.CB6.hIDSco.IRES.hSUMF1co具有SEQ ID NO：8之nt 11至nt 4964序列。藉由密碼子優化和合成hIDS序列構建質體，然後將所產生的構築體選殖到質體pENN.AAV.CB7.CI.RBG或pENN.AAV.CB6.CI.RBG中，其為經AAV2 ITR側接之表現盒，含有CB7或CB6、CI和RBG表現元件，以獲得該載體基因體。
亦產生含有天然人類IDS cDNA的質體；這些質體在本文中稱為pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG及pAAV.CB6.CI.hIDS.IRES.SUMF1.RBG。源自這些質體的載體基因體[SEQ ID NO：3之nt 2至nt 3967及SEQ ID NO：5之nt 11至nt 4964]為單股DNA基因體，其具有AAV2衍生的ITR側接hIDS表現盒。來自轉殖基因盒的表現由CB7或CB6啟動子驅動，是一種CMV立即早期增強子(C4)與雞β肌動蛋白啟動子之間的雜交體，而來自此啟動子的轉錄由雞β肌動蛋白內含子(CI)的存在而加強。表現盒的polyA信號是RBG polyA，藉由合成hIDS序列建構質體，然後將所產生之構築體選殖到質體pENN.AAV.CB7.CI.RBG或pENN.AAV.CB6.CI.RBG中，為一種經AAV2 ITR側接之表現盒，含有CB7、CI和RBG表現元件，以獲得該載體基因體。
序列元件的描述：
反向末端重複序列(ITR)：AAV ITRs(GenBank # NC001401)是兩端相同但序列相反的序列。當AAV和腺病毒輔助功能以反式提供時，AAV2 ITR序列既作為載體DNA複製的起點也作為載體基因體的包裝信號。因此，該ITR序列代表載體基因體複製和包裝所需的唯一順序列。
C MV立即早期增強子(382bp，C4；GenBank # K03104.1)，此元件存在於該載體基因體質體。
雞β-肌動蛋白啟動子(282bp；CB；GenBank # X00182.1)用於驅動高水平hIDS表現。
雞β-肌動蛋白內含子：來自雞β肌動蛋白基因(GenBank # X00182.1)的973bp內含子存在於載體表現盒中，該內含子被轉錄，但藉由剪接從成熟信使RNA(mRNA)中除去，將其兩側的序列合在一起。已顯示在表現盒中存在內含子將促進mRNA從細胞核向細胞質的轉運，從而增強用於轉譯之mRNA穩定水平的積累。這是基因載體中的一個共同特徵，旨在提高基因表現的水平，此元件存在於載體基因體和質體中。
艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶編碼序列：該hIDS序列被合成[SEQ ID NO：1]。所編碼的蛋白質為550個胺基酸[SEQ ID NO：2；Genbank NP_000193，UnitProtKB/Swiss-Prot(P22304.1)]，先前於本說明書有述及。詳見，SEQ ID NO：1及2。密碼子優化的hIDS編碼序列顯示於SEQ ID NO：8的nt 3423至nt 4553以及SEQ ID NO：11的nt 1937至nt 3589。
多聚腺苷酸化信號：127bp兔β-球蛋白多聚腺苷酸信號(GenBank # V00882.1)提供抗體mRNA的有效多聚腺苷酸之順式序列。此元件用作轉錄終止的信號，在新生轉錄物的3'端的特異性切割事件和添加長的多聚腺苷酸尾，此元件存在於載體基因體和質體中。
B.給藥和投予途徑
病患年齡為
Figure 107133321-A0305-02-0084-11
4個月至<5歲，接受rAAV9.CB7.hIDS單一鞘內/腦池內之劑量範圍為2.6×1012GC(2.0×109GG/g腦質量)(低劑量)至1.3×1014GC(1.0×1011GC/g腦質量(高劑量))。病患可以1.3×1010GC/g腦質量之劑量或6.5×1010GC/g腦質量之劑量治療。
在某些具體實施例中，AAV9.hIDS經由枕骨下路徑投予輸注進入腦大池(IC)，經由CT引導將針插入IC中，手術過程中需要全身麻醉和氣管插管，篩選期間的頭/頸MRI用於顯示合適的解剖結構。
在某些具體實施例中，進行腰椎穿刺，首先去除5cc的CSF，然後注射造影劑IT以幫助腦大池的可視化。CT(具有造影劑)用於引導針插入和施用rAAV9.CB7.hIDUA進入枕骨下空間。
投予下列治療有效的平坦劑量至所指定年齡族群之病患；●新生兒：約1×1011至約3×1014GC；●3-9月齡：約6×1012至約3×1014GC；●9月齡-6歲：約6×1012至約3×1014GC；●3-6歲：約1.2×1013至約6×1014GC；●6-12歲：約1.2×1013至約6×1014GC；●12+歲：約1.4×1013至約7.0×1014GC；●18+歲(成年)：約1.4×1013至約7.0×1014GC。
在其他具體實施例中，投予下列治療有效的平坦劑量至所指定年齡族群之MPS病患：●新生兒：約3.8×1012至約1.9×1014GC；●3-9月齡：約6×1012至約3×1014GC；●9-36月齡：約1013至約5×1013GC；●6-12歲：約1.2×1013至約6×1014GC；●12+歲：約1.4×1013至約7.0×1014GC；●18+歲(成年)：約1.4×1013至約7.0×1014GC。
為了確保從給予病患的rAAV9.CB7.hIDS的劑量中除去空衣殼，如本文中所討論，藉由氯化銫梯度超速離心或在載體純化方法中藉由離子交換層析將空衣殼與載體顆粒分離。
除載體外，還可給予免疫抑制治療。免疫抑制治療包括皮質類固醇(甲基培尼皮質醇10mg/kg靜脈內[IV]一次，於前第2天，及口服強體松，以0.5mg/kg/日開始於前第1天逐漸減少並於第16週停藥)、他克莫司(0.2mg/kg/日經口服[PO]，於前第2天至24週)及西羅莫司(每日一次[QD]，由前第2天直至第48週訪視)。說明性的西羅莫司劑量可包括(6mg PO前第2天，然後2mg QD，從前第1天直至第48週訪視)。西羅莫司劑量調整可使全血波谷濃度(whole blood trough concentrations)維持在16-24ng/mL之間。也可以對療法中的其他藥物進行調整，包括將藥物遞送更短或更長的時間期間。在大多數受試者中，劑量調整可以基於以下方程式：新劑量=當前劑量x(目標濃度/當前濃度)。以濃度監測的進一步劑量調整之前，受試者可以繼續使用新的維持劑量至少7-14天。可選擇地，可允許病患保持靜脈內酵素替代治療(ERT，例如ALDURAZYMETM[拉隆酶(laronidase)])的穩定療法，以及任何支持性措施(例如，物理治療)。監測病患對任何之不良事件。嚴重不良事件可包括可能的藥物引起的肝臟損傷、高膽紅素血症，定義為ALT~3×ULN和膽紅素~2×ULN(>35%直接)，稱為「Hy's Law」事件。
在一些具體實施例中，免疫抑制治療療法如下：
皮質類固醇：
在早晨投予載體(第1天給藥前)，病患在至少30分鐘期間內接受10mg/kg IV(最大500mg)之甲基培尼皮質醇，甲基培尼皮質醇在腰椎穿刺和鞘內(IC)注射rAAV9.CB7.hIDUA之前投予。用對乙醯胺酚(acetaminophen)和抗組織胺預先給藥是可選擇的。
在第2天，開始口服強體松，目標是在第12週停止強體松。強體松的劑量如下：第2天至第2週結束：0.5mg/kg/日。第3週和第4週：0.35mg/kg/日。第5-8週：0.2mg/kg/日。第9-12週：0.1mg/kg。
強體松在第12週後停止，強體松的確切劑量 可以調整到下一個更高的臨床實用劑量。
西羅莫司：載體給藥前2天(前第2天)：給予西羅莫司1mg/m2每4小時×3劑量的負荷量。從前第1天開始：西羅莫司0.5mg/m2/天，每天兩次給藥，目標血液水平為4-8ng/ml，西羅莫司在第48週訪視後停藥。
他克莫司：他克莫司在第2天(在rAAV9.CB7.hIDUA投予後一天)開始，劑量為1毫克，每日兩次，並調整至血液水平4-8ng/mL，持續24週。從第24週訪視開始，他克莫司在8週內逐漸減少。在第24週，劑量減少約50%，在第28週，劑量進一步減少約50%，他克莫司在第32週停藥。
C. 病患亞群
合適的病患包括，男性或女性受試者年齡為：●新生兒；●3-9月齡；●9-36月齡；●3-12歲；●12+歲；●18+歲(成年)。
D. 測量臨床目標
主要臨床目標包括預防及/或可選擇地逆轉與MPS II缺陷相關之神經認知減弱。臨床目標可以藉由測量神經認知來確定，例如藉由貝里嬰幼兒發展量表，第三版，BSID-III測量。其他適當的測量為適應性行為 評估，例如藉由文蘭德適應行為量表，第二版(VABS-II)測量，及生活質量測量，例如藉由嬰幼兒生活品質問卷調查(Infant Toddler Quality of Life QuestionnaireTM，ITQOL)測量。
次要終點包括生物標誌和臨床結果的評估，可選擇地，聽力可被評估作為次要終點。評估尿液的總GAG含量以及硫酸乙醯肝素。評估血清的IDS活性、抗IDS抗體、GAG和肝素輔助因子II-凝血酶複合物的濃度。評估CSF的GAG、IDS活性、抗IDS抗體和硫酸肝素。評估抗IDS抗體的存在，作為在CSF和血清中IDS表現的藥代動力學。亦藉由MRI進行灰質和白質和CSF心室的體積分析。
實施例2：黏多醣病II型之鼠類研究-將腺相關病毒載體遞送至CSF中可減輕黏多醣病II型小鼠的中樞神經系統疾病。
A. AAV9遞送至腦脊液修正CNS疾病
黏多醣病II型(MPS II)是一種X染色體溶體小體存儲障礙，通常表現在兒童早期骨骼和關節畸形、心臟和呼吸系統疾病以及發育遲緩。全身性遞送缺乏的酵素，艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)，改善了MPS II的許多症狀，但由於酵素不穿過血腦屏障，目前沒有有效的方法來預防中樞神經系統(CNS)疾病的進展。使用MPS II的小鼠模型，評估IDS基因之經AAV血清型9載體介導的遞送作為在CNS中實現連續IDS表現的方法，IDS剔除小鼠接受單次注射至側腦室的三種載體量中的一種 (低-3×108，中-3×109或高-3×1010基因體拷貝數)，且在載體投予後3週犧牲小鼠以評估載體生物分佈和IDS表現(n=每組7-8隻小鼠)，或在載體投予後3個月評估基因轉移對疾病進展的影響(n=每組7-8隻小鼠)。在腦脊液中可檢測到IDS活性，在低劑量同齡群中達到野生型水平的15%，且在最高劑量下達到正常水平的268%。大腦酵素活性範圍從低劑量同齡群的2.7%到高劑量同齡群的32%。通過對神經節苷脂GM3染色來定量腦儲存損傷，指出劑量依賴性校正，分別在低劑量、中劑量和高劑量同齡群中減少35%、46%和86%。在新的物體識別測試中，經過治療的小鼠也表現出改善的認知功能，這些發現指出，鞘內AAV介導的基因轉移作為持續的酵素遞送至CNS的平台，解決了對具有MPS II之病患此種關鍵未滿足的需求。
B. AAV9.CB.hIDS的藥理學和神經行為學影響
藉由以新黴素抗性基因替換IDS基因的外顯子4和5來創建MPS II的剔除小鼠模型(IDS剔除；IDSy/-)(詳見Garcia et al.,2007,J Inherit Metab Dis,30：924-34)。該模型沒有檢測到可檢測的酵素活性，並且發展出類似於MPS II病患中發現的組織學儲存損傷。IDS剔除小鼠展現出MPS II的許多臨床特徵，包括骨骼異常。小鼠的神經行為表型尚未得到廣泛評估，儘管一些研究表明存在異常(Muenzer et al.,2001,Acta Paediatr Suppl,91(439)：99-9)，因此是用於研究AAV9.CB.hIDS作為MPS II治療效果的相關模型。事實 上，這是相同的剔除小鼠模型，已用於評估MPS II中酵素替代治療的效果，以支持該群體的臨床試驗。在此MPS II小鼠模型中進行的以下研究建立了治療活性AAV9.CB.hIDS。
C. 材料與方法
載體，將人類IDUA和IDS cDNAs選殖到含有雞β肌動蛋白啟動子、CMV增強子、內含子和兔β球蛋白多聚腺苷酸化序列的表現構築體中，該表現構築體的側翼為AAV2反向末端重複序列。如前所述，藉由三重轉染HEK 293細胞和碘克沙醇純化，從這些構築體產生AAV9載體(Lock et al.(2010).Hum Gene Ther 21：1259-71)。
動物程序，所有動物方案均由賓夕法尼亞大學的機構動物護理和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。IDS剔除小鼠獲自Jackson Laboratory(世系編號：024744)並在內部繁殖。來自族群的野生型C57BL/6雄性作為對照。在2-3個月大時，用異氟烷(isoflurane)麻醉動物，並用無菌磷酸鹽緩衝化食鹽水稀釋的5μL載體注射ICV。在屍檢時，藉由枕骨穿刺用32號針連接到聚乙烯配管收集腦脊液。藉由心臟穿刺收集末端血清樣品。在氯胺酮(ketamine)/甲苯噻(xylazine)麻醉下藉由放血將動物安樂死，經頸椎脫位確認死亡。在乾冰上收集腦、心臟、肺、肝臟和脾臟。關於組織學實驗，將腦分為前半部分，其固定用於LIMP2免疫組織化學，後半部分固定用於GM3免疫組織化學。 小鼠的兩個同齡群被用於行為實驗，在一系列程序中測試野生型和IDS KO小鼠的初始同齡群，以確定基因缺失是否影響學習和記憶。使用AAV9.CB.hIDS(分別為3×108、3×109或3×1010基因體拷貝數(GC))的低、中或高載體劑量治療小鼠的第二同齡群，用於研究IT遞送的可行性作為拯救行為缺陷的策略。
行為程序：所有行為程序均由不知道基因型和治療組的操作者進行。
開放空間活動量(open field activity)：用Photobeam Activity System(PAS)-開放空間(San Diego Instruments)測量期間進行之自發活動量。將小鼠單獨放置在場所中進行單次10分鐘的試驗，收集水平和垂直梁架制動以評估一般運動和飼養活動。
Y型迷宮：短期記憶是用標準Y型迷宮(San Diego Instruments)評估，在8分鐘試驗期間記錄支路進入(arm entries)的順序和數目。自發交替(SA)被定義為順序進入迷宮的所有三個支路而不立即返回到先前進入的支路。收集總支路進入(AE)作為運動活動的量度。自發交替百分比計算為%SA=(SA/(AE-2)* 100)。
情境恐懼制約(Contextual fear conditioning)：制約實驗根據以下所述進行Abel et al.Cell.1997 Mar 7；88(5)：615-26。在訓練當天，小鼠被允許探索獨特的制約室(Med Associates)300秒，在248-250秒之間輸送無信號的1.5mA連續足部電擊。在室中再過30秒後，小鼠被送回家籠。二十四小時後，回憶空間背 景係在訓練發生的同一房間內進行評估連續5分鐘。以評分僵直反應的軟體(Freezescan，CleverSystems)評估記憶。將訓練期的2.5分鐘預刺激時期的僵直百分比與再次暴露於腔室時的僵直百分比進行比較，僵直的增加表明學習已經發生。
新目標識別：實驗設備由下列組成，在白色地板上的灰色矩形場所(60cm×50cm×26cm)和兩個獨特的物體：3.8×3.8×15cm金屬條和3.2cm直徑×15cm PVC管。在接觸設備之前，小鼠每天處理1-2分鐘，持續5天。在為期五天的適應期間，小鼠被允許探索空場所五分鐘/天。在訓練階段，小鼠在15分鐘內探索兩個相同的物體，以建立熟悉程度。在24小時後的回憶階段，小鼠返回具有一個現在熟悉的物體和一個新物體的場所，小鼠將優先探索該新的物體。對新穎事物的偏好減少表明未能回憶起熟悉的對象，從而導致學習不足。記錄所有場次，並以開放來源影像分析程式(open source image analysis program)對探索物體所花費的時間進行評分(Patel el al.,Front Behav Neurosci.2014 Oct 8；8：349)。
酵素和GAG分析。如前所述進行GAG、Hex和IDUA分析(Hinderer et al.(2015).Mol Ther 23：1298-307)。藉由將10μL樣品與溶於0.1M乙酸鈉和0.01M乙酸鉛(pH5.0)的20μL 1.25mM之4-甲基傘形酮α-L-艾杜醣醛酸-2-硫酸鹽(Santa Cruz Biotechnology)培養以測量IDS活性。在37℃培養2小時後，加入45μL McIlvain 緩衝液(0.4M磷酸鈉、0.2M檸檬酸鈉，pH 4.5)和5μL重組人類艾杜醣醛酸酶(iduronidase)(Aldurazyme，0.58mg/mL，G酵素)，並將反應混合物在37℃下培養隔夜。將混合物在甘胺酸緩衝液(pH 10.9)中稀釋，藉由螢光(激發態365nm，發射450nm)與無4-MU的標準稀釋液相比定量所釋放的4-MU。
組織學，將腦分為前後半部分，固定前半部分用於LIMP2免疫組織化學，固定後半部分用於GM3免疫組織化學。如前述進行LIMP2和GM3免疫組織化學(Hinderer et al.(2015).Mol Ther 23：1298-307)。藉由盲目評價者在來自每隻動物的4個腦切片中定量LIMP2和GM3染色陽性的細胞數。
載體生物分佈，快速解剖用於載體生物分佈分析的組織，並在乾冰上冷凍。將樣品儲存在-80℃直至分析時，使用QIAmp DNA Mini套組從組織中分離DNA，並藉由TaqMan PCR定量載體基因體，如(Wang,et al.(2011).Hum.Gene Ther.22：1389-1401)所述。
用於抗-hIDS抗體之ELISA，將聚苯乙烯ELISA平板以含重組人類IDS(R & D Systems)5μg/mL之經滴定至pH 5.8的PBS中塗覆隔夜。洗滌平板並在含2%牛血清白蛋白之中性PBS中阻斷1小時。然後將平板與在PBS中1：1000稀釋的血清樣品一起培養，結合的抗體用1：10,000稀釋的HRP共軛山羊抗小鼠抗體(Abcam)(於含有2%BSA的PBS中)檢測。使用四甲基聯苯胺基質顯色分析，並用2N硫酸終止，然後測量450nm 處的吸光度。藉由連續稀釋任意指定力價為1：10,000的陽性血清樣品所產生的標準曲線來確定力價。
統計，使用單因子變異數分析，然後進行Dunnett多重比較試驗，比較治療和未治療小鼠的組織GAG含量、Hex活性和腦存儲損傷。使用學生t試驗(Students t-test)分析開放空間和Y型迷宮日期。雙因子變異數分析及Dunnett事後分析應用於恐懼制約數據以評估試驗和基因型效應。關於新物體識別測試，使用每一組別之t試驗比較探索新物體與熟悉物體的時間，然後進行Bonferroni校正以進行多重比較。
四個年齡匹配的雄性IDS剔除小鼠群組和一組野生型同窩出生仔鼠(每組8隻小鼠(n=8))在2-3個月齡時接受以下治療：
●群組1：未治療
●群組2：腦室內AAV9.CB.hIDS低劑量3×108GC(1.875×109GC/g腦質量)
●群組3：腦室內AAV9.CB.hIDS中劑量3×109GC(1.875×1010GC/g腦質量)
●群組4：腦室內AAV9.CB.hIDS高劑量3×1010GC(1.875×1011GC/g腦質量)
●群組5：未治療野生型同窩出生仔鼠
D. 結果：
以腦室內(ICV)注射AAV9載體治療介於2至3月齡之雄性IDSy/-小鼠，該AAV9載體表現來自具有巨細胞病毒增強子(AAV9.CB.hIDS)的雞β肌動蛋白啟動子 的人類IDS。在最初的同齡群中，小鼠用三種載體劑量中的一種進行治療[3×108、3×109或3×1010基因體拷貝數(GC)]，並且在載體投予後3週犧牲小鼠以評估載體生物分佈和IDS表現，未治療之IDSy/-小鼠及野生型雄性同窩出生仔鼠作為對照，收取組織用於生物分佈分析。對高劑量組中的載體生物分佈的分析證明了有效的腦靶向，每個宿主二倍體基因體平均有一個載體基因體(圖3)。與先前AAV遞送至CSF的研究一致，亦存在載體逃逸至外周和有效的肝靶向，每個宿主二倍體基因體具有多於一個載體基因體(圖3)。在IDS活性上，腦組織、CSF和血清均表現出劑量依賴性增加，其接近或超過高劑量組中的野生型水平(圖2A-2C)。在中等劑量和高劑量同齡群的幾隻動物之血清中檢測到人類IDS，然而這似乎沒有顯著影響循環酵素活性(圖8)。
為了評估IDS基因之IT AAV9介導的傳遞的治療潛力，用等效載體劑量治療IDSy/-小鼠的另一同齡群，然後在稍後的時間點評估以評估基因轉移對於疾病進展的影響。在載體投予後兩個月，小鼠受到行為和神經認知測試，治療3個月後，犧牲動物並收集組織用於疾病活動的組織學和生物化學評估。
與高水平的血清酵素活性一致，肝臟中GAG儲存減少，且存在朝向正常化GAG儲存於心臟存的非顯著趨勢(圖4A-4B)。此外，溶小體酵素己糖胺酶(Hex)的活性在GAG儲存環境中上調，在二種組織中被正常化(圖4C-4D)。這些數據指出在鞘內給予AAV9.CB.hIDS後可 能具有全身治療活性。
未經治療的MPS II小鼠大腦顯示神經元溶體小體積的明確組織學證據，包括溶小體膜蛋白LIMP2的堆積，以及包括GM3在內的神經節苷脂的二次儲存(圖5L)。藉由LIMP2和GM3染色，經治療的小鼠證實神經元儲存損傷的劑量依賴性降低(圖5A-5L)。基於該數據，估計1.875×109GC/g的低劑量是小鼠中的最小有效劑量(MED)，因為此為小鼠在GM3和LIMP2儲存病變上呈現出顯著(約50%)降低的最低劑量。MPSII小鼠中的其他研究評估臨床候選物的廣泛劑量，並確認1.3×109GC/g腦質量的最低有效劑量(MED)。MED的選擇代表所評估的最低劑量，是基於I2S活性水平的劑量依賴性變化以及MPS II的CNS和外周特徵，包括生物標誌、組織病理學和神經行為功能。
當小鼠在載體投予後2個月達到4-5月齡時進行行為測試，進行全面測試以評估一般行為及短期和長期記憶。IDSy/-小鼠在開放空間場所顯示出正常的探索活動(圖9A-9C)。Y型迷宮中的自發交替(spontaneous alternation)(圖9D)用於評估短期工作記憶。IDSy/-小鼠與野生型同窩出生仔鼠有相似數量的支路進入和等同的自發交替，證實完整的短期記憶。長期記憶係使用典型情境恐懼制約(FC)和新物體識別(NOR)評估，在FC中，厭惡刺激與特定背景的關聯在重新暴露於該背景時引起僵直反應。在測試的回憶階段期間，所有小鼠顯示僵直的時間百分比的增加證明學習發生，然而IDSy/-小鼠顯示 相對於野生型同窩出生仔鼠的僵直減少(圖6A)。在治療的動物中，情境恐懼制約並沒有明顯的改善，儘管由於正常和未經治療的IDSy/-小鼠之間的微小差異而難以評估治療效果(圖6B)。在NOR中，允許小鼠探索一對相似的物體，訓練後24小時，一個現在熟悉的物體被一個新物體所取代。小鼠天生就有探索新物體的傾向；沒有這樣做證實缺乏識別熟悉物體並且顯示記憶缺陷。野生型小鼠表現出對新物體的偏愛，但IDSy/-小鼠沒有表現出偏好。值得注意的是，鞘內AAV9基因治療挽救了在IDSy/-小鼠中觀察到的長期NOR缺陷(圖6C)。在所有經治療的IDSy/-小鼠中，物體辨別似乎得到改善，與熟悉的物體相比，所有組都表現出探索新物體的更大百分比時間的趨勢。儘管該研究沒有足夠的權限來比較給藥組之間行為缺陷的相對程度(圖6A-6C)，但是對於新物體的偏好僅在中劑量同齡群中具有統計學顯著性。
在鼠類疾病模型中，評估IT AAV遞送的一個缺點是極小的小鼠CNS，具有腦質量僅為0.4g及CSF體積為40μL，可能無法準確模擬載體和分泌的酵素在大3,500倍的人腦中之擴散。在先前對相關溶小體貯存疾病黏多醣病I型(MPSI)的研究中，我們利用天然存在的大型動物疾病模型來解決這個問題[Hinderer et al,Mol Therapy：the Journal of the Am Soc Gen Therapy,2014：22：2018-2027；Hinderer et al,Mol Therapy：the Journal of the Am Soc Gen Therapy,2015：23：1298-1307]。平均腦質量分別為30g和72g，MPS I貓 和犬隻提供更加真實的模型，以解決在人腦中實現廣泛的載體和酵素遞送的挑戰。在這些模型中進行的研究提供了IT AAV9遞送對MPS I的功效的關鍵證據[Hinderer et al,Mol Therapy：the Journal of the Am Soc Gen Therapy,2014：22：2018-2027；Hinderer et al,Mol Therapy：the Journal of the Am Soc Gen Therapy,2015：23：1298-1307]。為了確定在MPS II中使用相同的方法是否可能獲得相似的功效，我們在MPS I小鼠中進行平行的劑量-範圍研究，以檢測MPS II中酵素表現的相對效率和交叉校正。MPS I小鼠以載體治療相同於用於IDSy/-小鼠的治療，除了用α-L-艾杜醣醛酸酶(IDUA)轉殖基因代替IDS。關於MPS II的研究，MPS I小鼠於2-3月齡以3×108、3×109或3×1010GC(n=每族群8隻)劑量治療，並在治療後第21天犧牲以測量大腦酵素活性或在治療後3個月犧牲以進行組織學分析。在腦酵素表現具有與在IDSy/-小鼠中觀察到的相似劑量反應，儘管IDUA的表現與IDS相比，在絕對酵素活性和相對於野生型表現水平方面似乎更有效(圖7A)。腦存儲損傷的校正在兩種疾病模型之間是相似的，儘管在最低載體劑量的MPS I小鼠中治療似乎適度地更有效(圖7A-7B)。這些結果一同建議，用於MPS II的IT AAV9介導的基因轉移幾乎與在MPS I中所觀察到者那樣有效地校正腦存儲損傷，且當從小鼠按比例增加時該方法仍然有效。然而，與MPS I相比，在MPS II中可能需要稍高的載體量，以克服腦中較低效的酵素表現。
在本研究中，在MPS II小鼠中攜帶人類IDS基因的AAV9載體之IT遞送造成在CNS表現出治療水平並解決腦儲存病變。與經治療的對照相比，經治療的小鼠中較強的新物體辨別指出了功能上的改善。神經認知缺陷之前並未於IDSy/-小鼠中良好地表徵，這些研究結果證實，IDSy/-小鼠在開放空間具有正常的探索活動，且具有相對於野生型同窩出生仔鼠的Y型迷宮中的類似的支路進入。這些運動評估在考慮需要正常探索的其他行為類型上至關重要。已經發現IDSy/-小鼠具有完整的短期工作記憶，其經由與對照相比之Y型迷宮中的類似自發交替所證實。相反地，Higuchi et al.[Mol Genet and Metabolism,2012：107：122-128]報導在32週齡IDSy/-小鼠的降低的自發交替及增加的支路進入。不同的Y型迷宮結果可能是由於測試時的不同年齡，並強調了MPS II的漸進性質。我們評估IDS缺乏對兩種形式的長期記憶的影響，在IDSy/-小鼠的情境恐懼制約中發現輕度缺陷。雖然IDSy/-小鼠能夠回憶起牠們接受厭惡刺激的背景，但與野生型同窩出生仔鼠相比，他們顯示出明顯降低的僵直反應。接受AAV9的IT遞送的IDSy/-小鼠顯示出類似於未注射的小鼠的僵直反應，因此，未檢測到恢復。在新物體識別中也發現長期記憶缺陷，在NOR中，IDSy/-小鼠沒有表現出相對於熟悉物體的新物體的偏好，經載體治療的小鼠證實在未治療的IDSy/-小鼠中所見到的NOR缺陷的恢復。物體辨別僅在中劑量同齡群中具有統計學意義，儘管每組8隻動物，該研究不能很好 地評估行為終點的劑量反應。AAV9 IT遞送的能力以差異地影響兩種類型的長期記憶的恢復可能是由於每項任務所需的不同神經基質。情境恐懼制約是一種海馬迴依賴性任務，與需要外周皮質的NOR相反[Oliveira,et al,Post-training reversible inactivation of the hippocampus enhances novel object recognition memory.Learning & memory(Cold Spring Harbor,NY)2010；17：155-160；Abel,et al,Cell 1997；88：615-626]。
在MPS II和MPS I的小鼠模型中IT AAV9遞送效率的比較指出，兩種疾病之間的酵素表現和組織校正是相似的，提供用於MPS II的IT AAV遞送證據在更大的腦尺寸和CSF體積的背景下足以有效產生廣泛的疾病校正，如先前在MPS I的大型動物模型中所示[Hinderer et al,Mol Therapy：the Journal of the Am Soc Gen Therapy,2014：22：2018-2027；Hinderer et al,Mol Therapy：the Journal of the Am Soc Gen Therapy,2015：23：1298-1307]。有趣的是，與MPS I相比，缺乏酵素的表現在MPS II中的效率稍低，這可能僅僅是這些特定載體的表現效率的產物，儘管表現構築體中的控制元件是相同的。一些研究已建議，硫酸酯酶(例如IDS)的表現可受到硫酸酯酶修飾因子SUMF1之可利用性的限制，這是IDS的轉譯後修飾所必需的[Fraldi,et al,Biochemical J,2007：403：305-312]。然而，評估IDS和SUMF1的共表現的試驗性實驗並未證明更活躍的IDS表現(數據未顯示)。無論如何，在MPS II小鼠和MPS I小鼠中，存 儲損傷的矯正幾乎同樣有效，這指出基因轉移對於MPS I和MPS II病患應該同樣有效，儘管在後一種情況下，適度較高的載體量可能對於最佳結果是必須的。
除CNS基因轉移外，在經治療的MPS II小鼠中存在顯著的肝臟轉導和外周酵素表現，這指出在MPS II中IT AAV9遞送之可能的全身性優點，這與在各種其他物種中進行IT AAV遞送的研究一致[Passini et al,Hu Gene Therapy,2014；25：619-630；Hinderer et al,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 2014；1；；Hinderer et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy 2014；22：2018-2027；Hinderer,et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy 2015；23：1298-1307；Gurda,et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy 2015；Higuchi et al,cited above；Haurigot,et al,J Clin Invest,2013：123：3254-3271；Gray et al,Gene Therapy,2013：20：450-459]。值得注意的是，IT AAV載體遞送後的肝臟轉導在物種間差異很大，因此尚不清楚人類是否會表現出顯著的外周表現。
該研究表明IT AAV9遞送實現了對大腦的有效IDS基因轉移並解決了MPS II的CNS表現，支持該方法進入臨床。
這些數據提供了AAV9.CB.hIDS可改善MPS II小鼠神經認知缺陷的初步證據。
實施例3：非人類之靈長類動物研究
進行非人類之靈長類動物(NHPs)的研究以評估AAV9.CB.hIDS在成年雄性恒河猴中的安全性和作用，該研究的目的是評估鞘內(IT)AAV9.CB.hIDS的局部、急性和慢性毒性，並確定載體的生物分佈。共21隻雄性獼猴以AAV9.CB.hIDS兩種劑量中的一種(5.6×1011或1.875×1011GC/g腦質量)經IT注射AAV9.CB.hIDS進行治療，或以媒劑控制稀釋。低劑量約大於MPS II小鼠(MED為1.875×109GC/g)中的MED 100倍，且對應於在MPS II小鼠中產生統計學上顯著組織學改善及被認為反映出認知功能的神經行為改變的最低劑量。較高的劑量(約300倍的MED)為載體可被調配的最大濃度，且受到保持可安全投予至CSF的注射體積(<10%CSF體積)要求的限制。在注射過程中，將動物保持在全身麻醉下，腰椎穿刺針放入枕骨下空間；經由螢光鏡檢查法確認放置位置，且劑量以1mL的總體積投予。在注射後第0、3、7、14、21和30天，之後每月一次收集血清和CSF用於臨床病理學評估。在注射後第14、90和180天，犧牲來自每個劑量組的3隻雄性獼猴(每個時間點總共6隻)用於病理學和生物分佈。經媒劑治療的動物作為對照。對來自所有動物的組織進行完整的組織病理學，並對高劑量同齡群組進行載體生物分佈的分析，如前所述藉由定量PCR進行DNA萃取和檢測載體基因體(詳見Chen et al,2013,Hum Gene Ther Clin Dev,24(4)：154-160)。該分析法對每μg DNA具有大於20載體基因體拷貝數的靈敏 度，且包括加標對照以驗證個別樣品中的反應效率。在14天、3個月和6個月收集生物分佈、生物化學和免疫原性數據。
在投以1.8×1011或5.5×1011 rAAV9.CB8.hIDS載體與免疫抑制(MMF和西羅莫司/雷帕黴素)組合的恒河猴研究中，觀察到以下情況。沒有與給藥程序相關的AE，並且在臨床上一般觀察、體重變化、器官重量、CBC、血清化學或凝血參數方面沒有與載體相關的異常。IS程序引起腸道徵兆，其中一些炎症參數和貧血症與載體給藥無關。IS阻止了對hIDS的體液免疫反應，且在其他動物中不存在反應或反應減少到最小(接近背景)。IS動物中對hIDS沒有T細胞反應，僅LD組對AAV9有輕度至中度反應。在第60天MMF停藥後未見反彈的免疫反應。高劑量組和低劑量組均具有脊髓背側白質束和坐骨神經的微小至輕度軸突病變。在背根神經節具有單核球細胞浸潤之微小至輕度神經元細胞體變性，其於背部白質束和三叉神經節呈現出。儘管存在高載體拷貝數，但在大腦或脊髓內未見到炎症。在整個腦、脊髓和背根神經節中檢測到高水平的AAV載體基因體。在外周，尤其是肝臟中也發現了顯著的載體生物分佈。
實施例4：製造rAAV9.CB7.hIDS載體
藉由三重質體轉染人類HEK293 MCB細胞產生AAV9.CB7.hIDS：(i)hIDS載體基因體質體，(ii)稱為pAAV29之AAV輔助質體，含有AAV rep2和cap 9野生型基因，和(iii)稱為pAd△F6(Kan)之輔助腺病毒質體。
質體pAAV.CB7.CI.hIDS.RGB的選殖如上述實施例1中所述。源自此質體的載體基因體是單股DNA基因體，具有AAV2衍生的ITR，其位於hIDS表現盒之側翼。來自轉基基因盒的表現由CB7啟動子驅動，這是一種巨細胞病毒(CMV)立即早期增強子(C4)和雞β肌動蛋白啟動子之間的雜交體，而由此啟動子的轉錄是藉由雞β肌動蛋白內含子(CI)的存在而增強。表現盒的polyA信號是兔β-球蛋白(RBG)polyA。通過密碼子優化和合成hIDS序列[SEQ ID NO：8之nt 1177至nt 2829，及SEQ ID NO：11之nt 1937至nt 3589]構建質體，然後將得到的構築體轉殖至質體pENN.AAV.CB7.CI.RBG(p1044)，其為一種含有CB7、CI和RBG表現元件之AAV2 ITR側翼的表現盒，得到pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG。
順式質體pAAV.CB7CIhIDS.RGB.KanR的選殖：使用PacI限制酶由此質體切下載體基因體，並選殖到含有卡那黴素(kanamycin)抗性基因的pKSS系質體骨架(p2017)中，最終的載體基因體質體是pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR。
AAV2/9輔助質體pAAV29KanRGXRep2：AAV2/9輔助質體pAAV29KanRGXRep2編碼4種野生型AAV2 rep蛋白和來自AAV9的3種野生型AAV VP衣殼蛋白。為了產生嵌合包裝構築體，首先除去含有野生型AAV2 rep和cap基因的來自質體p5E18之AAV2 cap基因，並以從肝臟DNA擴增的AAV9 cap基因之PCR片段置換，所得到的質體給予標識符pAAV2-9(p0008)。請注 意，通常驅動rep表現的AAV p5啟動子在此構築體中從rep的5'端移動到cap的3'端，這種排列用於在啟動子和rep基因(即質體骨架)之間引入間隔，下調rep的表現並增加支持載體產生的能力。p5E18中的質體骨架來自pBluescript KS，該AAV2/9輔助質體pAAV29KanRGXRep2編碼4種野生型AAV2 rep蛋白、來自AAV9的3種野生型AAV VP衣殼蛋白和卡那黴素抗性。
pAdDeltaF6(Kan)腺病毒輔助質體的大小為15,770bp。質體包含對AAV複製很重要的腺病毒基因體區域，即E2A、E4和VA RNA(腺病毒E1功能由293細胞提供)，但不含其他腺病毒複製或結構基因。質體不包含對複製至關重要的順式元件，例如腺病毒反向末端重複序列，因此預計不會產生傳染性腺病毒。其衍生自E1、E3缺失的Ad5分子選殖株(pBHG10，pBR322系質體)。在Ad5 DNA中引入缺失以去除不必要的腺病毒基因的表現並將腺病毒DNA的量從32Kb減少至12kb。最後用卡那黴素抗性基因代替安比西林(ampicillin)抗性基因，得到pAd△F6(Kan)。AAV載體生產所必需的E2、E4和VAI腺病毒基因的功能元件保留在該質體中。腺病毒E1必需基因功能由HEK293細胞提供。藉由Qiagen Genomic Services進行DNA質體定序，並顯示出與參考序列pAdDeltaF6(Kan)p1707FH-Q的以下重要功能元件100%同源性：E4 ORF6 3692-2808bp；E2A DNA結合蛋白11784-10194bp；VA RNA區域12426-13378bp。
在圖10A-10B中提供概述製造過程的流程圖。
細胞接種：合格的人類胚胎腎293細胞株將用於生產方法。使用康寧(Corning)T-燒瓶和CS-10將細胞擴增至5×109-5×1010個細胞，其允許產生足夠的細胞質量用於接種高達50個HS-36用於每BDS批次的載體生產。將細胞培養於由Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)組成補充有10%γ輻射的、US來源的胎牛血清(FBS)的培養基中。細胞為固定物依賴性，且細胞分離將使用TrypLE Select(無動物產物的細胞分離試劑)完成。細胞接種是使用無菌的一次性可拋棄式生物製成袋和配管組完成。將細胞維持在37℃(±2℃)、5%(±0.5%)CO2氣壓中，以新鮮、無血清DMEM培養基替換細胞培養基，並使用優化的PEI系轉染法以三種生產質體轉染。生產方法中使用的所有質體均在CMO質量系統和基礎設施的背景下生產，利用cGMP製造的最顯著特性；可追溯性，文件控制和材料隔離。
在BSC中製備足夠的DNA質體轉染複合物以轉染多達50個HS-36(每BDS批次)。最初製備含有7.5mg pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR載體基因體質體、150mg pAdDeltaF6(Kan)、75mg pAAV29KanRGXRep2 AAV輔助質體和GMP級PEI(PEIPro，PolyPlus Transfection SA)的DNA/PEI混合物。在小規模優化研究中，此質體比例被確定為AAV生產的最佳值。充分混合後，將溶液在室溫下靜置25分鐘，然後被加至無血清培養基中以淬 滅反應，然後再加入到HS-36中。將轉染混合物在HS-36的所有36層之間均衡，並將細胞在37℃(±2℃)下於5%(±0.5%)CO2氣壓中培養5天。
細胞培養基收取：使用拋棄式生物製程袋從每個HS-36收取轉染的細胞和培養基，藉由無菌方式將培養基排出元件，收取培養基後，以MgCl2補充至~80公升體積至終濃度為2mM(用於Benzonase的輔因子)，並添加Benzonase核酸酶(Cat #：1.016797.0001，Merck Group)至最終濃度為25單位/毫升。將產品(在拋棄式生物製程袋中)於37℃下在培養箱中培養2小時，以提供足夠的時間用於酵素消化由於轉染程序而存在於收穫物中的殘留細胞和質體DNA。進行此步驟以使最終載體中殘留DNA的量最小化。培養期過後，加入NaCl至終濃度為500mM，以幫助在過濾及下游切向流過濾期間的產物回收。
淨化：使用深度過濾器膠囊(1.2μm/0.22μm)從產品中除去細胞和細胞碎片，該深度過濾器膠囊串聯連接，作為由蠕動泵驅動的無菌、封閉的配管和袋組。淨化確保下游過濾器和層析管柱免受污染，且降低負荷菌過濾確保在過濾器列末端，在下游純化之前去除在上游生產過程中可能引入的任何負荷菌。將收取物質通過Sartorius Sartoguard PES膠囊過濾器(1.2/0.22μm)(Sartorius Stedim Biotech Inc.)。
大規模切向流過濾：使用定制無菌、封閉的生物製程配管、袋和膜組，藉由切向流過濾(Tangential Flow Filtration，TFF)達成經淨化產物的體積降低(10倍)。TFF的原理是在平行於適當孔隙率(100kDa)之膜的壓力下使溶液流動，壓力差驅動較小尺寸的分子通過膜並有效進入廢物流，同時保持大於膜孔的分子。藉由再循環溶液，平行的流掃過膜表面，防止膜孔結垢。藉由選擇適當的膜孔徑和表面積，液體樣品可快速減少體積，同時保留並濃縮所需的分子。TFF應用中的滲濾包括在與液體通過膜並至廢物流的相同速率下，添加新鮮的緩衝液至再循環樣品中。隨著滲濾體積的增加，從再循環樣品中除去增量的小分子。這導致淨化產物的適度純化，但也實現了與隨後的親和性管柱層析步驟相容的緩衝液交換。因此，我們利用100kDa的PES膜進行濃縮，然後用4體積的緩衝液滲濾，該緩衝液由20mM Tris pH 7.5和400mM NaCl組成。將滲濾的產物在4℃下儲存隔夜，然後用1.2μm/0.22μm深度過濾器膠囊進一步淨化，以除去任何沉澱物質。
親和性層析：將滲濾的產物施用於Capture SelectTM Poros-AAV2/9親和性樹脂(Life Technologies)，其有效捕獲AAV2/9血清型。在這些離子條件下，顯著百分比的殘留細胞DNA和蛋白質流過管柱，同時有效捕獲AAV顆粒。施用後，洗滌管柱以除去額外的進料雜質，然後進行低pH步驟洗提(400mM NaCl，20mM檸檬酸鈉；pH 2.5)，藉由收集至1/10體積的中和緩衝液(Bis Tris丙烷，200mM，pH 10.2)中將其立即中和。
陰離子交換層析：為了進一步減少包括空AAV顆粒在內的製程雜質，將Poros-AAV2/9洗提池稀釋50倍(20mM Bis Tris丙烷，0.001% Pluronic F68；pH 10.2)以降低離子強度使其能夠結合CIMultus Q多孔性整體式聚合物基材(monolith matrix)(BIA Separations)。在低鹽洗滌後，使用60CV NaCl線性鹽梯度(10-180mM NaCl)洗提載體產物。這種淺鹽梯度有效地將不含載體基因體的衣殼顆粒(空顆粒)從含有載體基因體顆粒(全顆粒)中分離出來，從而得到富含全衣殼的製劑。將濾分收集到含有1/100體積的0.1% pluronic F68和1/27體積的Bis Tris pH 6.3的試管中，以分別最小化非特異性結合至試管及於高pH的暴露長度。收集適當的峰值濾分，並評估峰面積及與先前數據進行比較以確定近似的載體產量。
最終調配物和無菌過濾產生BDS：TFF用於在具有100kDa膜的合併的AEX級分上獲得最終的調配物。以100kDa膜使用TFF於合併的AEX濾分上以獲得最終的調配物。此藉由用4體積的調配物緩衝液(Elliots B溶液，0.001% Pluronic F68)滲濾並濃縮得到BDS來實現的，由此將陰離子交換層析的峰值面積與先前的數據進行比較以估計濃度因子，達到
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5×1013GC/ml滴定量。取出樣品進行BDS測試(於以下章節敘述)。將過濾純化的體積儲放於無菌聚丙烯管中並在隔離位置於
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-60℃冷凍直至最終填充物釋放。初步穩定性研究指出，在我們提出的調配物緩衝液中，DP在冷凍和解凍後不會失去活 性，在進行另外的研究以評估在-80℃下長期儲存後的穩定性。
最終填充：將冷凍的BDS解凍、合併、使用最終的調配物緩衝液稀釋至目標滴定量，最後通過0.22μm過濾器(Millipore，Billerica，MA)過濾並填充到West Pharmaceutical的「即用(Ready-to-Use)」(預先滅菌)之2ml玻璃瓶和13mm塞子，並在每個小瓶填充量
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0.6毫升至
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2.0毫升密封。單獨標記的小瓶根據以下說明標記，經標記的小瓶儲存在
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-60℃。
載體(藥物產品)以單一固定濃度裝入小瓶，唯一的變量是每小瓶的體積。為了達到較低劑量濃度，以Elliots B溶液，0.001% Pluronic F68稀釋藥物產物。高劑量載體不稀釋直接使用，而低劑量載體需要1：5稀釋於調配物緩衝液中，其經由藥房在給藥時進行。
實施例5：載體測試
進行特徵分析，包括血清型同一性、空顆粒含量和轉殖基因產物鑑定，該分析之說明如下所示。
A. 載體基因體同一性：DNA定序
分離病毒載體基因體DNA，並使用引子移步(primer walking)藉由2倍定序覆蓋以確定序列，執行序列比對並與預期序列比較。
B. 載體衣殼同一性：AAV衣殼VP3的質譜分析
藉由基於質譜(MS)分析的VP3衣殼蛋白的胜肽測定來達成載體之AAV2/9血清型的確認。該方法涉及從SDS-PAGE凝膠上切下的VP3蛋白條帶的多酵素消 化(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和內切蛋白酶Glu-C)，然後在Q-Exactive Orbitrap質譜儀上用UPLC-MS/MS對衣殼蛋白定序找出特徵。發展出串聯質譜(MS)方法，其允許減去宿主蛋白質產物並從質譜中得到衣殼胜肽序列。
C. 基因體拷貝數(GC)力價
基於基因體拷貝數力價的oqPCR在一系列連續稀釋液中測定，並與同源質體標準(pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR)進行比較，oqPCR分析使用以DNase I和蛋白酶K的連續消化，然後進行qPCR分析以測量殼體化載體基因體拷貝數。使用靶向RBG polyA區域的序列特異性引子合併螢光標記探針雜交至相同區域來完成DNA檢測。與質體DNA標準曲線的比較允許滴定測定而無需任何PCR後樣品操作。已將許多標準、驗證樣品和對照(用於背景和DNA污染)引入分析中，藉由建立和定義分析參數來確定苷分析，該分析參數包括靈敏度、偵測限制、鑑定範圍和分析內和分析間的精確度。建立內部AAV9參考批次並用於執行資格研究。需注意，我們先前的經驗建議，藉由本文描述的優化qPCR分析所獲得的力價通常比用於產生臨床前數據的標準qPCR技術所獲得的力價高2.5倍。
D. 空顆粒與全顆粒比率
經SDS-PAGE分析確定藥物產物的總顆粒含量，藉由各種方法(分析超速離心、電子顯微鏡和260/280nm吸光度)分析在碘克沙醇梯度上純化的參考載體製劑，以確定該製劑包含>95%基因體(全)顆粒。將該參考 材料連續稀釋至已知的基因體拷貝數(並因此經擴展、粒子數)，且各稀釋液與藥物產品的類似稀釋系列在SDS PAGE凝膠上一起進行。經光密度測定法測定參考材料和藥物產物VP3蛋白質條帶的峰面積體積，並將參考材料體積相對於顆粒數作圖。藉由從該曲線外推確定藥物產物的總顆粒濃度，然後減去基因體拷貝數(GC)力價以獲得空顆粒力價，空粒子比與全粒子比率是空粒子力價與GC力價的比率。
E. 感染性力價
感染單位(IU)分析用於確定RC32細胞(表現rep2的HeLa細胞)中載體的生產攝取和複製。已採用類似於先前公佈的96孔終點型式。簡而言之，在各稀釋rAAV下將RC32細胞以連續稀釋的rAAV9.CB.hIDS和均勻稀釋的Ad5共同感染重複12次。感染後72小時，將細胞裂解，並進行qPCR以檢測rAAV載體擴增超過進量。進行終點稀釋TCID50計算(Spearman-Karber)以確定複製力價，以IU/ml表示。由於「感染性」值取決於與細胞接觸的顆粒、受體結合、內化、轉運至細胞核和基因體複製，彼等受到分析幾何形狀及所使用細胞株中適當受體和結合後路徑的影響。受體和結合後路徑通常不在永生化細胞株中維持，因此感染性分析力價並不是存在「感染性」顆粒數量的絕對量度。然而，殼體化GC與「感染單位」的比例(描述為GC/IU比率)可用作衡量批次之間產物一致性的指標。
GC/IU比率是產物一致性的衡量標準，將 oqPCR力價(GC/ml)除以感染單位(IU/ml)，得到經計算的GC/IU比率。
F. 具複製能力的AAV(rcAAV)分析
分析樣品中存在可能在生產過程中可能出現的具複製能力AAV2/9(rcAAV)。已發展出3繼代分析(3 passage assay)，其包含細胞系擴增和繼代，然後藉由即時qPCR(cap 9目標)檢測rcAAV DNA。細胞系成分由以測試樣品稀釋液及野生型人類腺病毒5型(Ad5)接種單層HEK293細胞(P1)所組成。載體產物的1010GC是測試產物的最大量，由於腺病毒的存在，具複製能力的AAV在細胞培養物中擴增。2天後，產生細胞裂解物並將Ad5加熱滅活。然後將淨化的裂解物通過第二輪細胞(P2)以增強靈敏度(再次於Ad5存在下)。2天後，產生細胞裂解物並且Ad5加熱滅活。然後將淨化的裂解物通過到第三輸細胞(P3)上以使靈敏度最大化(再次於Ad5存在下)。2天後，裂解細胞以釋放DNA，然後將其加入qPCR以檢測AAV9 cap序列。AAV9 cap序列在Ad5依賴性方法中擴增表示存在rcAAV。使用含有AAV2 rep和AAV9 cap基因的AAV2/9替代陽性對照，可以確定分析的檢測極限(LOD)(0.1、1、10和100IU)，並使用rAAV9.CB.hIDS載體(1×1010、1×109、1×108、1×107GC)的連續稀釋液，可以定量存在於測試樣品中的rcAAV的約略水平。
G. 活體外效力
為了將qPCR GC力價與基因表現相關聯，藉由用已知的每細胞之多重GC轉導HEK293(人類胚胎腎) 細胞，並在轉導後72小時測定上清液之IDS活性來進行活體外生物分析。IDS活性量測係藉由將經含0.1ml 100mmol/l 4MU-艾杜醣醛酸苷-2-硫酸鹽之0.1ml水所稀釋的樣品在37℃培養1-3小時。藉由加入2ml之290mmol/l甘氨酸、180mmol/l檸檬酸鈉於pH 10.9終止反應，經比較螢光與4MU的標準稀釋液定量釋放的4MU。與高活性的臨床前和tox載體製劑的比較能夠解釋產物活性。
H. 總蛋白、衣殼蛋白、蛋白質純度測定和衣殼蛋白比率
首先使用二金雞鈉酸(bicinchoninic acid，BCA)分析定量相對於牛血清白蛋白(BSA)蛋白質標準曲線之載體樣品總蛋白，藉由將等份的樣品與套組中提供的Micro-BCA試劑混合以進行測定，相同的程序適用於BSA標準品的稀釋液。將混合物在60℃培養並在562nm處測量吸光度，使用4-參數擬合從已知濃度的標準吸光度產生標準曲線，根據4-參數回歸量化未知樣品。
為了提供AAV純度的半定量測定，然後將樣品標準化為基因體力價，並在還原條件下在SDS-聚丙烯醯胺(SDS-PAGE)凝膠上分離5×109GC。然後用SYPRO Ruby染料染色凝膠，藉由與各泳道25、50和100ng蛋白質的共同電泳BSA標準比較，經光密度測定法定量任何雜質條帶，這些含量佔總AAV蛋白樣品的1%、2%和4%。除了三種AAV特異性蛋白質VP1、VP2和VP3之外，出現的染色條帶被認為是蛋白質雜質。將所有雜質條帶與參考蛋白質進行比較，並報告雜質質量百分比以及近似分子量。SDS-PAGE凝膠亦用於定量VP1、VP2 和VP3蛋白並確定它們的比例。
實施例6：MPS II生物標誌
在本研究中，進行來自MPS I犬隻的CSF樣品的代謝物輪廓，其顯露出CSF代謝體中與實質疾病有關的改變，最顯著的差異是與正常對照相比，精胺水平升高超過30倍。該發現在MPS I病患樣品中以及在MPS I的貓模型中得到證實，並且預期也在MPS II中發現。精胺與HS結合，精胺的細胞攝取取決於這種相互作用[M.Belting,S.Persson,L.-Å.Fransson,Proteoglycan involvement in polyamine uptake.Biochemical Journal 338,317-323(1999)；J.E.Welch,et al.,Single chain fragment anti-heparan sulfate antibody targets the polyamine transport system and attenuates polyamine-dependent cell proliferation.International journal of oncology 32,749-756(2008)；published online EpubApr]。細胞表面蛋白多醣，例如磷脂肌醇蛋白聚糖-1(glypican-1)可經它們的HS部分結合精胺，在磷脂肌醇蛋白聚糖蛋白的胞飲作用後，HS鏈的細胞內切割將結合的精胺釋放到細胞中(Belting et al；K.Ding,S et al,The Journal of biological chemistry 276,46779-46791(2001)；published online EpubDec 14)。因此，完整的HS再循環對於精胺攝取是不可或缺的。在MPS I中，細胞外精胺的積累可藉由抑制這種攝取機制而發生，這是由於HS循環效率低，或者通過精胺與積累於MPS之細胞外GAG的簡單結合，使精胺結合平衡轉變為有利於細胞外分佈。將來的研究應該提出對於這些積累於MPS I CSF之精胺的機制之相關貢獻。
我們發現精胺合成的抑制劑阻斷了MPS神經元中過量的軸突生長，並可藉由類似於病患CSF中所發現的精胺濃度在WT神經元中誘導軸突生長。在MPS的犬隻模型中，基因治療逆轉了精胺的積累和GAP43的正常化表現，暗示在活體內相同路徑受到影響。我們並不能直接評估精胺合成抑制在活體內的影響，因為可用的抑制劑並不會穿過血腦屏障，且在我們的動物模型中從出生開始慢性直接CNS給藥是不可行的。雖然我們的活體外研究結果支持精胺在MPS I異常軸突生長中的作用，但重要的是要注意，抑制精胺合成並無完全逆轉表型，且精胺添加至正常神經元並沒有增加軸突生長至MPS I神經元的水平。精胺調節的作用可能受到相對較短治療時間的限制。也有可能是精胺積累並非導致MPS I中軸突生長的唯一介質。尤其，許多神經營養因子通過HS修飾受體結合，細胞外基質中與HS的相互作用可影響軸突生長[D.Van Vactor,D.P.Wall,K.G.Johnson,Heparan sulfate proteoglycans and the emergence of neuronal connectivity.Current opinion in neurobiology 16,40-51(2006)；published online EpubFeb(10.1016/j.conb.2006.01.011)]。因此，精胺積累可能是促進MPS I異常軸突生長的幾個因素之一。
在經篩選的15隻MPS I犬隻CSF樣本中，只有一隻落入精胺濃度的正常範圍內。在28日齡時，此為該研究中所包含的最年輕的動物。這一發現指出，精胺積累可能與年齡有關。將來的研究應該在MPS病患中縱向評估CSF精胺水平，如果精胺在MPS病患中隨著年齡的增長而增加，這可以解釋認知減弱的動力學，因為大多數的病患在發育遲緩開始前經歷了1-2年的正常發育。
HS代謝受損可能引發改變神經元生長的代謝物積累，這可能點出MPS I中酵素缺乏與異常軸突生長表型之間存在新的聯繫，這可能解釋了與這些疾病相關的認知功能障礙。這些發現亦指出CSF精胺可用作非侵入性生物標誌，用於評估新型CNS導向治療MPSI的藥效學。
材料與方法：
實驗設計：此研究最初設計用於檢測代謝物，與來自健康對照的樣品相比，在MPS I病患CSF樣品中該代謝物存在顯著不同水平。由於來自患有MPS IH的兒童和健康對照的CSF樣品的有限可利用性，使用來自MPS I犬隻的CSF樣品進行初始篩選，其中可獲得更多數量，以便隨後在人類樣本中評估候選生物標誌。來自個體未治療的MPS I犬隻的共15個CSF樣品可用於分析，並且從健康對照獲得另外15個樣品。在預期的代謝物篩選中鑑定MPS I犬隻CSF中升高的精胺後，由以基因治療處理之MPS I犬隻和貓的先前研究的CSF樣品以及病患樣品中追溯性地測量精胺。這些分析中每組所包括的受試者數量受樣本可利用性的限制而非基於統計 學考量；因此，在某些情況下，數字不足以進行統計比較。對於活體外軸突生長的研究，每種條件下定量的細胞數量基於先導實驗，該實驗指出每個條件需要>30個細胞來檢測每細胞之軸長、軸突數或軸突分支的20%差異。將細胞接種並用指定的藥物處理後，對小孔進行編碼，並藉由盲目評價者進行細胞影像的取得和軸突長度和分支的手動定量。使用不同的基質[經聚-L-離胺酸(Sigma)塗佈的組織培養板而不是細胞培養玻片(chamber slide，Sigma S6815)]重複野生型和MPS小鼠神經元的比較，得到類似的結果。使用具有相似結果的兩種基質進行四次添加及不添加精胺的野生型神經元的比較。
CSF代謝物概況分析：藉由Metabolon進行CSF代謝物概況分析。
將樣品儲存在-80℃直至處理。使用MicroLab STAR®系統(Hamilton Company)製備樣品。在QC目的的萃取過程第一步之前，增加回收標準。在劇烈搖動下以甲醇沉澱蛋白質2分鐘，然後離心。將所得之提取物分成五個部分：一份用於正離子模式電噴霧之電離逆相(RP)UPLC-MS/MS分析，一份用於負離子模式電噴霧電離之RP/UPLC-MS/MS分析，一份用於以負離子模式電噴霧電離之親水作用色譜(HILIC)/UPLC-MS/MS分析，一份用於GC-MS分析，及一份樣品保留用於備份。將樣品短暫放置在TurboVap®(Zymark)上以除去有機溶劑。對於LC，將樣品在準備用於分析前於氮氣下儲存隔夜。對於GC，將每個樣品在準備用於分析前於真空下乾燥隔 夜。
該平台的LC/MS部分係基於Waters ACQUITY超高效液相層析(UPLC)和Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率/精確質譜儀，與加熱電噴霧電離(HESI-II)源和Orbitrap質量分析儀(以35,000質量分辨率運行)相連接。將樣品提取物乾燥，然後在與每種LC/MS方法相容的溶劑中重構。每種重構溶劑都含有一系列固定濃度的標準品，以確保注射和層析的一致性。對於RP層析法，使用酸性正離子優化條件分析一個等分試樣，使用鹼性負離子優化條件分析另一個等分試樣，每種方法都使用單獨的專用管柱(Waters UPLC BEH C18-2.1×100mm,1.7μm)。在酸性條件下重構的萃取物用水和含有0.1%甲酸的甲醇梯度洗提，使用甲醇和水類似地洗提鹼性萃取物，但是使用6.5mM碳酸氫銨。使用由水和乙腈與10mM甲酸銨組成的梯度，從HILIC管柱(Waters UPLC BEH Amide 2.1×150mm，1.7μm)洗提後，通過負電離分析第三等分試樣。MS分析使用動態排除在MS和數據依賴性MSn掃描之間交替進行，掃描範圍在方法之間略有不同，但覆蓋範圍為80-1000m/z。
將預定用於GC-MS分析的樣品在真空下乾燥至少18小時，然後使用雙三甲基矽烷基三氟乙醯胺在乾燥的氮氣下衍生化。衍生的樣品在5%二苯基/95%二甲基聚矽氧烷稠合二氧化矽管柱(20m×0.18mm ID；0.18μm膜厚)上以氦氣作為載體氣體分離，溫度從60°升至340℃，期間為17.5分鐘。使用電子碰撞電離(EI)在 Thermo-Finnigan Trace DSQ快速掃描單四極桿質譜儀上分析樣品，並以單位質量解析力操作，掃描範圍為50-750m/z。
與實驗樣品一起分析幾種類型的對照：藉由採集少量各實驗樣品產生的混合基質樣品作為整個數據集的技術複製品；萃取的水樣品作為方法空白試樣；小心選擇不干擾內源性化合物測量的QC標準混合物加入到每個分析的樣品中，允許儀器性能監測和輔助層析序列比對。通過計算在注入質譜儀之前添加到每個樣品的標準品的中位數相對標準差(RSD)來確定儀器可變性。藉由計算100%匯集的基質樣品中存在的所有內源代謝物(即，非儀器標準品)的中位數RSD來確定總體過程變異性。實驗樣品在平台運行中隨機化，QC樣品在注射之間均勻間隔。
代謝物鑑定係藉由自動比較實驗樣品中的離子特徵與化學標準條目之參考資料庫，其包括保留時間、分子量(m/z)、較佳之加成物和來源別片段以及MS譜並藉由使用Metabolon開發的軟體進行質量控制的目視檢查來策劃。已知化學實體的鑑定係基於與純化標準的代謝資料庫條目的比較，使用曲線下面積測量定量峰值。將每個樣品中各代謝物的原始面積計數標準化，以校正由於儀器日間調整差異所導致的每運行日的中位數值變化，因此，將每次運行的中位數設置為1.0。這保留了樣品之間的變化，但允許在相似的圖形尺度上比較廣泛不同的原始峰值面積的代謝物，在標準化後觀察到的 最小值歸因於缺失值。
定量MS分析：將CSF樣品(50μL)與精胺-d8內部標準(IsoSciences)混合，藉由與4倍之過量甲醇混合將樣品去蛋白質化，並在4℃下以12,000x g離心，將上清液在氮氣流下乾燥，然後再懸浮於50μL水中。將5μL等分試樣進行LC-MS分析，使用Waters ACQUITY UPLC系統(Waters Corp.，Milford，MA，USA)進行LC分離，其配備有Xbridge® C18管柱(3.5μm，150×2.1毫米)。流速為0.15mL/min，溶劑A為0.1%甲酸且溶劑B為含有0.1%甲酸的98/2乙腈/H2O(v/v)，洗提條件如下：0分鐘時2%B，2分鐘時2%B，5分鐘時60%B，10分鐘時80%B，11分鐘時98%B，16分鐘時98%B，17分鐘時2%B，在22分鐘時2%B，管柱溫度為35℃。使用Finnigan TSQ Quantum Ultra光譜儀(Thermo Fisher，San Jose，CA)以正離子模式進行MS/MS分析，具有以下參數：噴射電壓為4000V，毛細管溫度為270℃，屏蔽氣體壓力為35任意單位，離子掃氣壓力為2任意單位，輔助氣壓為10任意單位，汽化器溫度為200℃，管鏡頭偏移為50，毛細管偏移為35，除沫器偏移為0。監測以下轉移：203.1/112.1(精胺)；211.1/120.1(精胺-d8)，掃描寬度為0.002m/z，掃描時間為0.15秒。
動物程序：所有動物方案均由賓夕法尼亞大學的機構動物護理和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Pennsylvania)批准。對於CSF代謝物篩選，在3-26月齡 的正常犬隻中及1-18月齡的MPS I犬隻中經枕骨下穿刺收集樣品。MPS I犬隻和貓之基因轉移研究如前所述進行(20,22)，在載體施用後6-8個月收集CSF樣品。對於小鼠皮質神經元實驗，從E18 IDUA-/-或IDUA+/+胚胎製備初始皮質神經元培養物。
病患樣品：從各受試者的父母或法定監護人處獲得知情同意，該協議得到了明尼蘇達大學機構審查委員會(Institutional Review Board of the University of Minnesota)的批准。經腰椎穿刺收集CSF。所有MPS I病患都診斷為賀勒氏徵候群，且在採集樣本之前未接受過酵素替代治療或造血幹細胞移植。MPS I病患年齡為6-26月齡，健康對照者分別為36和48月齡。
統計分析：使用MetaboAnalyst 3.0進行隨機森林分析(random forest analysis)和熱圖生成[R.G.Kalb,Development 120,3063-3071(1994)；J.Zhong,et al,Journal of neurochemistry 64,531-539(1995)D.Van Vactor,D.P.W et al,Current opinion in neurobiology 16,40-51(2006)；published online EpubFeb(10.1016/j.conb.2006.01.011)]。對原始峰值數據進行對數轉換並正規化為正常樣品值的平均值，所有其他統計分析均使用GraphPad Prism 6進行。藉由ANOVA之後以Dunnett試驗，比較經培養的神經元軸長度、軸突數和分枝，藉由Kruskal-Wallis試驗之後以Dunn試驗，比較CSF精胺和皮質GAP43。
GAP43西方墨點法：使用Qiagen Tissuelyser 在30Hz下將額葉皮質樣品於0.2%氚核X-100中均質化5分鐘，藉由在4℃下離心澄清樣品，以BCA分析於上清液中測定蛋白質濃度。將樣品在具有DTT(Thermo Fisher Scientific)之NuPAGE LDS緩衝液中於70℃培養1小時，並在MOPS緩衝液中的Bis-Tris 4-12%聚丙烯醯胺凝膠上分離。將蛋白質轉移至PVDF膜，並在5%脫脂奶粉中阻斷1小時。用在5%脫脂奶粉中以稀釋至1μg/mL的兔多株抗GAP43抗體(Abcam)探測該膜，然後在5%脫脂奶粉中以1：10,000稀釋的經HRP綴合的多株抗兔抗體(Thermo Fisher Scientific)進行探測。使用SuperSignal West Pico基質(Thermo Fisher Scientific)檢測條帶，使用Image Lab 5.1(Bio-Rad)進行光密度測定。
軸突生長分析：如上所述收取第18天胚胎皮質神經元，並在細胞培養玻片(Sigma S6815)或聚-L-離胺酸(Sigma)塗佈的組織培養盤上，於補充B27(Gibco)之無血清Neurobasal培養基(Gibco)中以100,000細胞/mL的濃度平板培養。在平板培養(第1天)後24小時，將處理應用於重複小孔。用於定量的相-造影劑影像在Nikon Eclipse Ti上以20X進行，使用600ms手動曝光和高造影劑1.70倍增益。對治療條件盲目之個體以每孔捕獲10-20個影像並對其進行編碼，影像在ImageJ(NIH)中被轉換為8位元格式，並經盲目評價者在NeuronJ中進行追踪[E.Meijering,et al,Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.Cytometry.Part A：the journal of the International Society for Analytical Cytology 58,167-176(2004)；published online EpubApr[10.1002/cyto.a.20022)]。手動追蹤體細胞直徑、軸突數、分支點和軸長度。在NeuronJ中追蹤的影像使用基於影像尺寸的轉換因子轉換為微米；使用0.17微米/像素的轉換因子將2560×1920像素的影像轉換為微米。
組織學：如前所述進行腦組織處理和LIMP2免疫螢光[C.Hinderer,et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy 22,2018-2027(2014)；published online EpubDec(10.1038/mt.2014.135)]。
RT-PCR：來自3隻正常犬隻和5隻MPS犬隻的額葉皮質樣品於屍檢時立即在乾冰上冷凍，用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific)萃取RNA，在室溫下用DNAse I(Roche)處理20分鐘，並使用RNeasy套組(Qiagen)依製造商的說明純化。使用具有隨機六聚體引子的High Capacity cDNA Synthesis套組(Applied Biosystems)逆轉錄經純化之RNA(500ng)。藉由使用Applied Biosystems 7500之Sybr green PCR定量精胺酸酶、鳥胺酸脫羧酶、精胺合成酶、亞精胺合成酶、精胺-亞精胺乙醯基轉移酶及甘油醛磷酸去氫酶的轉錄物。
即時PCR系統。使用由所有個別樣品組成的合併標準品的四倍稀釋液，對於各目標基因產生標準曲線。最高標準被賦予任意轉錄體數，且基於標準曲線將個別樣品的Ct值轉換為轉錄體數，數值以相對於GAPDH 對照表示。
統計分析：使用MetaboAnalyst 3.0進行隨機森林分析(random forest analysis)和熱圖生成[J.Xia,et al,MetaboAnalyst 2.0-a comprehensive server for metabolomic data analysis.Nucleic Acids Research,(2012)；published online Epub May 2,2012(10.1093/nar/gks374)；J.Xia,et al.,MetaboAnalyst：a web server for metabolomic data analysis and interpretation.Nucleic Acids Research 37,W652-W660(2009)；published online Epub July 1,2009(10.1093/nar/gkp356).J.Xia,et al,MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.Nucleic Acids Research,(2015)；published online EpubApril 20,2015(10.1093/nar/gkv380)]。代謝物屏幕中的不可檢測值被估算為數據集中所觀察到的最小值，將原始峰值數據正規化為正常樣品值的平均值並進行對數轉換。所有其他統計分析均使用GraphPad Prism 6進行。藉由ANOVA之後以Dunnett試驗，比較經培養的神經元軸長度、軸突數和分枝，藉由Kruskal-Wallis試驗之後以Dunn試驗，比較CSF精胺和皮質GAP43。
結果 1. 經由代謝物的概況分析鑑定升高的CSF精胺
使用MPS I的犬模型進行CSF代謝物的初始篩選，這些動物在IDUA基因中攜帶剪接位點突變，導致酵素表現完全喪失，並且發展出類似於MPS I病患的 臨床和組織學特徵[K.P.Menon,et al,Genomics 14,763-768(1992)；R.Shull,et al.,The American journal of pathology 114,487(1984)]。從15隻正常犬隻和15隻MPS I犬隻收集CSF樣本，經LC和GC-MS評估CSF樣品的代謝物相對量，藉由質譜法可在CSF樣品中陽性鑑定出總共281個代謝物。其中，47例(17%)MPS I犬隻相對於對照為顯著升高，88例(31%)相對於對照為降低。在圖19A中顯示組別之間最不同的50代謝的熱圖。代謝物概況分析鑑定出MPS I和正常犬隻之間多胺、鞘脂、乙醯化胺基酸和核苷酸代謝上的顯著差異。隨機森林族群分析鑑定出多胺精胺是MPS I和正常犬隻之間代謝物差異的最大貢獻者(圖23)，除了在樣本採集時一隻1月齡以下的MPS I犬隻外，平均而言，在MPS I犬隻中，精胺超過30倍。穩定同位素稀釋(SID)-LC-MS/MS分析發展成定量測量CSF中的精胺。從賀勒氏徵候群(6-26月齡)的6名兒童以及2名健康對照(36和48月齡)中篩選樣品，兩個健康對照均具有低於分析的定量極限(1ng/mL)的CSF精胺水平，而來自MPS I病患的CSF樣品平均高於定量極限的10倍(圖19B)。MPS IH病患中的精胺升高似乎與HS在精胺結合和攝取中的已知角色一致[M.Belting,et al,Journal of Biological Chemistry 278,47181-47189(2003)；M.Belting,et al,Proteoglycan involvement in polyamine uptake.Biochemical Journal 338,317-323(1999)；J.E.Welch,et al,International journal of oncology 32,749-756(2008))]；增加的合成似乎不太可能是CSF精胺升高的原因，因為正常和MPS I犬隻大腦樣品在多胺合成的路徑中具有相似的轉錄調節酵素之mRNA表現水平(圖24)。為了確定精胺升高是否是硫酸乙醯肝素儲存疾病的一般性質或特異於MPS I，在來自MPS VII的犬模型的CSF樣品中測量精胺，其顯示出相似的升高(圖25)。
2.精胺在與MPS相關的異常軸突生長中的角色
軸突損傷神經元上調多胺合成後，促進軸突向外生長[D.Cai,et al,Neuron 35,711-719(2002)；published online EpubAug 15；K.Deng,et al,The Journal of neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience 29,9545-9552(2009)；published online Epub Jul 29；Y.Gao,et al,Neuron 44,609-621(2004)；published online Epub Nov 18；R.C.Schreiber,et al.,Neuroscience 128,741-749(2004)]。因此，我們評估精胺在MPS神經元中描述的異常軸突過度生長表型中的角色[Hocquemiller,S.,et al,Journal of neuroscience research 88,202-213(2010)]。來自MPS I小鼠的E18皮質神經元培養物在培養4天後表現出比來自該群落的野生型小鼠的神經元更大的軸突數、分枝和總軸長度(圖20A-20F)。以精胺合成的抑制劑APCHA治療MPS神經元，顯著降低軸突的生長和分支，經置換精胺，該效果是可逆的(圖20A-20F)。相同的APCHA濃度不影響正常神經元的生長(圖26)。以相似於活體內鑑定的濃度添加精胺至野生型神經元培養物中，導致軸突生長和分支的顯著增加(圖20A-20F)。
3. 基因治療在CSF精胺和GAP43表現上的影響
GAP43是軸突生長的中樞調節因子，其藉由MPS III小鼠神經元在活體外和活體內均有過度表現，表示在神經元培養物中異常激活的相同軸突生長路徑在活體內也是活躍的。為了評估IDUA缺乏對GAP43表現和精胺積累的活體內影響，我們測量了未經治療的MPS I犬隻及以CNS定向基因治療處理的CSF精胺和腦GAP43水平。我們之前描述過五隻MPS I犬隻用鞘內注射腺相關病毒血清型9載體進行治療，該載體攜帶犬IDUA轉殖基因[C.Hinderer,et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy 23,1298-1307(2015)；published online Epub Aug]。MPS I犬隻可對正常的IDUA酵素產生抗體，因此兩隻犬隻以預處理為具有肝臟IDUA基因轉移的新生兒，以誘導對蛋白質的免疫耐受。兩隻耐受的犬隻在AAV9治療後表現出遠高於正常的大腦IDUA活性。三隻非耐受的犬隻表現出不同水平的表現，一隻動物達到高於正常的水平，另外兩隻表現出接近正常的表現(圖21A)。CSF精胺減少與大腦IDUA活性成反比，相對於未經治療的動物，IDUA表現最低的兩隻犬隻減少3倍，表現最高的動物減少超過20倍(圖21A、21B至21H和21K)。GAP43在MPS I犬隻的額葉皮質中上調，且在所有經載體治療的動物中表現被標準化(圖21I-21J)。
我們進一步評估CSF精胺水平與經一系列載 體劑量治療的MPS I犬隻的IDUA重建之間的關係，將經由新生兒肝臟基因轉移而對人類IDUA先前耐受的MPS I犬隻，經鞘內注射表現人類IDUA的AAV9載體進行治療，劑量為3種劑量之一(1010、1011、1012GC/kg，n=每劑量2隻)[(C.Hinderer,et al,Neonatal tolerance induction enables accurate evaluation of gene therapy for MPS I in a canine model.Molecular Genetics and Metabolism,dx.doi.org/10.1016/j.ymgme.2016.06.006]。注射後6個月評估CSF精胺(圖22A)。CSF精胺的減少是劑量依賴性的，中等和高載體劑量的動物達到正常範圍，而CSF精胺僅在低劑量動物中部分減少。為了獨立驗證IDUA缺乏與CSF精胺積累之間的聯繫，我們在MPS I的貓模型中評估CSF精胺水平。使用我們之前報導的基因治療研究的CSF樣本，我們發現未經治療的MPS I貓表現出升高的CSF精胺(圖22B)[C.Hinderer,P.Bell,B.L.Gurda,Q.Wang,J.P.Louboutin,Y.Zhu,J.Bagel,P.O'Donnell,T.Sikora,T.Ruane,P.Wang,M.E.Haskins,J.M.Wilson,Intrathecal gene therapy corrects CNS pathology in a feline model of mucopolysaccharidosis I.Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy 22,2018-2027(2014)；published online EpubDec(10.1038/mt.2014.135)]。鞘內投予高劑量的表現貓IDUA的AAV9載體將CSF精胺水平正規化(圖22B)。
C. 討論
在本研究中，我們對來自MPS I犬隻的CSF樣本進行代謝物概況分析，其揭示在CSF代謝體中與實質疾病相關的改變，最顯著的差異是與正常對照相比，精胺水平升高了30多倍。此發現在MPS I病患樣品中以及在MPS I的貓模型和MPS VII的犬模型中得到證實，精胺以高親和力直接與HS結合，精胺的細胞攝取取決於這種相互作用[M.Belting,S.PERSSON,L.-A.Fransson,Proteoglycan involvement in polyamine uptake.Biochemical Journal 338,317-323(1999)；J.E.Welch,et al,International journal of oncology 32,749-756(2008)]。細胞表面蛋白多醣(例如磷脂肌醇蛋白聚糖-1)可經由其之HS部分結合精胺，並且在磷脂肌醇蛋白聚糖蛋白的胞飲作用後，HS鏈的細胞內裂解將結合的精胺釋放到細胞中[Belting et al,cited above；K.Ding,et al,The Journal of biological chemistry 276,46779-46791(2001)；published online EpubDec 14]。因此，完整的HS再循環對於精胺攝取是不可或缺的。由於IDUA缺乏所導致的低效HS再循環可能抑制這種精胺攝取機制，導致細胞外精胺積累。或者，細胞外GAG可以隔離精胺，改變平衡以促進細胞外分佈。在此研究中用於LC-MS樣品製備的甲醇脫蛋白步驟亦沉澱可了溶性HS，表明在CSF中檢測到的精胺是未結合的，因此細胞外精氨酸積累的原因是吸收抑制而不是GAG結合[N.Volpi,Journal of chromatography.B,Biomedical applications 685,27-34(1996)；published online Epub Oct 11]。功能性神經網絡的形成和維持需要精確控制軸突生長和突觸形成，在發育過程中，CNS環境對神經突形成的抑制作用越來越大，髓鞘相關蛋白很大程度上阻礙了成年腦中的軸突生長。這種向軸突增長減少的發展趨勢與GAP43表現的減少相平行[S.M.De la Monte,et al,Developmental Brain Research 46,161-168(1989)；published online Epub4/1/]。MPS神經元所呈現出的持續GAP43表現和誇大的軸突向外生長可能干擾這種抑制和生長促進信號的正常平衡，導致異常連接和認知受損，HS存儲如何導致軸突增長的增加尚未確定。許多研究表明多胺在軸突向外生長；在軸突損傷後，用於合成精胺及其前體腐胺和亞精胺的限速酵素升高，即使在髓鞘的抑制信號存在下也能增強軸突生長[Cia(2002),Deng(2009),Gao(2004)，皆引用於上文]。此外，當直接注入CSF時，用腐胺處理神經元會引起軸突生長，這種作用被精胺合成的抑制劑阻斷(Deng(2009)引用於上文)]。多胺對軸突生長發揮作用的機制尚不清楚，一個潛在的目標是NMDA受體，其之活化經由精胺結合而增強(J.Lerma,Neuron 8,343-352(1992)；published online Epub2//(dx.doi.org/10.1016/0896-6273(92)90300-3))。NMDA信號傳導誘導軸突向外生長，且受體的精胺敏感次單元在發育過程中被高度表現[D.Georgiev,et al,Experimental cell research 314,2603-2617(2008)；published online EpubAug 15(10.1016/j.yexcr.2008.06.009)；R.G.Kalb,Regulation of motor neuron dendrite growth by NMDA receptor activation.Development 120,3063-3071(1994)；J.Zhong,et al,Journal of neurochemistry 64,531-539(1995)]。值得注意的是，許多神經營養因子經由HS修飾的受體結合，且細胞外基質中與HS的相互作用可以影響軸突生長[(D.Van Vactor,et al,Current opinion in neurobiology 16,40-51(2006)，Epub Feb在網路公開]。因此，精胺積累可能是促進MPS I中異常軸突生長的幾個因素之一。在篩選的15隻MPS I犬隻CSF樣品中，只有一隻落在精胺濃度的正常範圍內，在28日齡，這是該研究中所包含的最年輕的動物。此發現指出，精胺積累可能與年齡有關，儘管這項研究證實在患有賀勒氏徵候群的幼兒中，它已經升高了6個月。將來的研究將在MPS病患中縱向評估CSF精胺水平。如果精胺在MPS病患者中隨著年齡的增長而增加，這就解釋了認知減弱的動力學，因為大多數病患在發育遲緩開始前經歷了1~2年的正常發育。HS代謝受損可能引發改變神經元生長的代謝物質的積累，這表明MPS中酵素缺乏與異常軸突生長表型之間存在新的聯繫，這可能解釋了與這些疾病相關的認知功能障礙。將來的研究證實其他MPS(例如MPS II)中升高的精胺，這些發現還指出，CSF精胺可用作非侵入性生物標誌，用於評估新型CNS導向治療MPS的藥效學。用於CNS定向治療的未來試驗評估了認知終點與CSF精胺變化之間的相關性。
實施例7：經CT引導之ICV遞送裝置 A. 程序前篩選評估 1. 醫療方案訪視1：篩選
主調查員敘述導引腦池內(IC)程序、管理程序本身以及所有潛在安全風險的篩選過程，以便受試者(或指定的護理人員)在充分告知下簽署知情同意。
進行以下操作並提供給神經放射學家/神經外科醫生/麻醉師進行IC程序的受試者資格的篩選評估：病史；伴隨藥物；體檢；生命體徵；心電圖(ECG)；和實驗室測試結果。
2. 間隔：篩選研究訪視2
為了有足夠的時間審查資格，在第一次篩選訪視至研究訪視2(第0天)前一週之間的任何時間進行以下程序：
●具有及無釓之頭部/頸部磁共振成像(MRI)[注意：受試者必須是合適的候選人才能接受釓(即eGFR>30mL/min/1.73m2)]
●除了頭部/頸部MRI之外，調查員尚須通過屈曲/伸展研究以確定是否需要進一步評估頸部
●MRI步驟準則包括T1、T2、DTI、FLAIR及CINE步驟準則影像
●頭/頸MRA/MRV依機構步驟準則(注意：可以排除具有內部/轉導操作歷史的受試者，或者可能需要進一步測試(例如，核醫腦室造影(radionuclide cisternography))，其允許充分評估CSF流量並識別可能的阻塞或CSF空間之間欠缺交流。
●神經放射學家/神經外科醫生受試者程序評估會議：來 自3個站點的代表召開電話會議(或網絡會議)，根據所有可用信息討論每個受試者對IC程序的資格(掃描、病史、體檢、實驗室等)，應盡一切努力就進行IC程序或篩選衰弱的受試者達成共識(即，每個成員都應準備接受作出的決定)。
●麻醉前評估28天前至第1天，對呼呼吸道、頸部(縮短/加厚)和頭部活動範圍(頸部屈曲度)進行詳細評估，同時牢記MPS受試者的特殊生理需求。
3. 第1天：電腦處理斷層掃描機組和用於投予之載體製備。在IC程序之前，CT機組確認存在以下設備和藥物：
●成年腰椎穿刺(LP)套組(按機構提供)
●BD(Becton Dickinson)22或25號×3-7”腰椎穿刺針(Quincke斜面)
●同軸穿刺針(例如，18G×3.5”)，由執行程序的醫師決定使用(用於引入腰椎穿刺針)
●具有旋轉(Spin)公魯爾接頭之四通小孔栓閥
●具有母魯爾接頭配接器之T型延長套組(配管)，約6.7”長
●Omnipaque 180(碘六醇)，用於鞘內投予
●用於靜脈內(IV)投予之碘化造影劑
●用於注射之1%利多卡因溶液(若成年LP套組並未提供)
●用充填10cc普通食鹽水(無菌)之沖洗注射器
●射線透不過的標記
●手術準備設備/剃刀
‧枕頭/允許插管受試者正確定位的支撐件
‧氣管插管設備、全身麻醉機及機械人工呼吸器
‧術中神經生理監測(IONM)設備(和所需人員)
‧含有AAV9.hIDUA載體的10cc注射器；根據單獨的配藥學手冊準備並運送到CT/手術室(OR)套件
4.第1天：受試者準備和給藥
‧該研究和程序的知情同意書在醫療記錄和/或研究文件中得到確認和記錄，根據機構要求，獲得放射學和麻醉學工作人員對該程序的單獨同意。
‧根據機構指南研究受試者可以在適當的醫院護理單位內進行靜脈通路(例如，兩個IV進入位置)，靜脈輸液由麻醉師自行決定。
‧在麻醉師的判斷並根據機構指南，受試者可在適當的病人護理單位、手術區域或手術/CT程序套件中使用全身麻醉進行誘導並接受氣管插管。
‧進行腰椎穿刺，首先移除5cc腦脊液(CSF)，然後鞘內注射造影劑(Omnipaque 180)以幫助腦大池的可視化。 可執行適當的受試者定位操縱以促進造影劑擴散到腦大池中。
‧若尚未如此操作，將術中神經生理監測(IONM)設備連接至受試者。
‧受試者被置於俯臥位或側臥位的CT掃描儀台上。
‧如果認為合適，受試者可以術前評估期間提供確定為安全的頸部屈曲的方式定位，並在定位後記錄正常的神經生理監測信號。
‧確認下列研究人員及調查員在場並現場確定：
○執行程序的醫師/神經外科醫生
○麻醉師和呼吸技師
○護士和醫師助理
○CT(或OR)技術人員
○神經生理學技師
○現場協調員
‧將受試者在顱底下的皮膚適當剃光。
‧如果認為需要經由執行程序的醫師定位目標位置和影像脈管系統，則執行CT偵察影像，然後以IV造影劑進行程序前規劃CT。
‧一旦確定目標部位(腦大池)及設計針頭軌跡，就可根據機構指南，使用無菌技術將皮膚準備進行手術並覆蓋。
‧根據執行程序的醫師所示，將射線透不過標記放置在目標皮膚位置。
‧藉由1%利多卡因浸潤將標記下的皮膚麻醉。
‧將22G或25G腰椎穿刺針朝向腦大池推進，可選擇使用同軸穿刺針。
‧在針推進後，使用機構設備可行的最薄CT切片厚度(理想為
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2.5mm)獲得CT影像。使用可能的最低輻射劑量之連續CT影像，其允許針和相關軟組織(例如，椎旁肌、骨、腦幹和脊髓)的充分可視化。
‧藉由觀察針座中的CSF和腦大池內針尖的可視化來確認正確的針放置位置。
●執行程序的醫師確認含載體之注射器位於接近無菌區但位於無菌區外。在處理或投予載體前，無菌區域內協助程序的工作人員須戴上手套、面罩和護目鏡(無菌區域外的其他工作人員不需要採取這些程序)。
●將短的(~6”)延伸配管連接到插入的腰椎穿刺針上，然後將其連接到四通栓閥上。一旦該設備與受試者的CSF「自動灌注」，10cc預充填普通食鹽水的沖洗注射器就連接到四通栓閥。
●將含載體之注射器提供給執行程序的醫師並連接到四通栓閥上的入口端。
●一旦將通至含載體之注射器的栓閥出口打開，注射器的內容物將被緩慢注入(約1-2分鐘)，小心不要在注射期間施加過大力量於活塞上。
●一旦注入含AAV9.hIDUA之注射器的內容物，將栓閥旋轉，以便使用附屬的預充式注射器以1-2cc普通食鹽水沖洗栓閥和針頭組件。
●當準備好後，執行程序的醫師會提醒員工，他/她將從受試者移除設備。
●在單次動作中，將針、延伸配管、栓閥和注射器從受試者緩慢移除並放置在手術托盤上，以丟棄到生物危害廢物容器或硬容器(針頭用)中。
●檢查針插入部位的出血或腦脊液滲漏的跡像，並按調查員的指示進行治療。根據指示，使用紗布、手術膠帶和/或Tegaderm敷料進行包紮。
●將受試者從CT掃描儀中移開並放置在擔架上。
‧停止麻醉且依據麻醉後護理之機構指南照護受試者，從研究受試者中移除神經生理監測器。
‧受試者所在之擔架的頭部在恢復過程中應稍微抬起(~30度)。
‧根據機構指南，受試者被運送到合適的麻醉後護理單位。
‧在受試者已經充分恢復意識並處於穩定狀態後，他/她將被允許進入適當的樓層/單位進行步驟準則授權之評估。按照步驟準則進行神經學評估，初級調查員將與醫院和研究人員合作監督受試者的護理。
實施例8：大動物鞘內投予路徑的評估
本研究之目的為評估CSF給藥更常規的方法，包括腦室內(ICV)注射和經由腰椎穿刺注射。簡而言之，在這項研究中，在犬隻中進行ICV和IC AAV給藥的比較。經由腰椎穿刺在非人類之靈長類動物中評估載體給藥，其中一些動物在注射後以頭低腳高姿勢放置，這已被建議改善載體的顱部分佈。在犬隻研究中，ICV和IC載體給藥在整個大腦和脊髓中產生類似有效的轉導。然而，ICV同齡群中的動物發展出腦炎，顯然是由於對轉基因產物的嚴重T細胞反應。僅在ICV同齡群中發生這種轉基因特異性免疫反應被懷疑與注射過程中在轉基因表現部位上局部炎症的存在有關。在非人類靈長類動物(NHP)研究中，與我們先前研究相比，藉由使用極大的注射體積(約佔總CSF體積的40%)，載體投予到腰椎槽(lumbar cistern)後的轉導功效得到改善。然而，此 路徑的效率仍低於IC投予。注射後以頭低腳高姿勢定位的動物並沒有提供額外的好處。然而，發現大注射體積可以改善載體的顱部分佈。
為了最大化鞘內AAV遞送的有效性，將確定載體投予至CSF的最佳途徑是至關重要的。我們先前曾報導，經由枕骨下穿刺向腦大池(小腦髓質池)注射載體在非人類靈長類動物中實現了有效的載體分佈，而經由腰椎穿刺的注射導致脊髓的轉導顯著降低且幾乎沒有分佈至腦中，此強調管理途徑的重要性[Hinderer,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online 2014；1]。其他人已經提出將載體遞送到側腦室(一種常見的臨床程序)會導致有效的載體分佈[Haurigot et al,J Clin Invest.,Aug 2013；123(8)：3254-3271]。亦已報導，經由注射後將動物置於頭低腳高姿勢以促進顱骨載體分佈可改善經由腰椎穿刺的遞送[Meyer et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy.Oct 31 2014]。在這項研究中，我們比較了在犬隻中表現綠色螢光蛋白(GFP)報告基因的AAV9載體的腦室內和腦池內投予，我們發現兩種途徑均在整個CNS中實現有效分佈，儘管腦室內遞送可能帶來轉殖基因特異性免疫反應的額外風險。我們還評估NHP中腰椎穿刺的載體遞送，以及注射後將動物置於頭低腳高姿勢的影響。雖然我們確實發現大注射體積可以改善載體的顱部分佈，但是注射後定位沒有明顯的效果。
A. 材料與方法：
1. 載體製造：GFP載體由攜帶表現盒的AAV血清型9衣殼組成，該表現盒包含具有巨細胞病毒立即早期增強子的雞β肌動蛋白啟動子、人工內含子、增強型綠色螢光蛋白cDNA、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件和兔β球蛋白多聚腺苷酸化序列。GUSB載體由攜帶表現盒的AAV血清型9衣殼組成，該表現盒包含具有巨細胞病毒立即早期增強子的雞β肌動蛋白啟動子、人工內含子、犬GUSB cDNA和兔β球蛋白多聚腺苷酸化序列。藉由三重轉染HEK 293細胞產生載體，並如前所述在碘克沙醇梯度上純化[Lock et al,Human gene therapy.Oct 2010；21(10)：1259-1271]。
2. 動物實驗：所有犬隻皆在賓夕法尼亞大學獸醫學院人類遺傳病動物模型國家轉診中心(NIH OD P40-010939)在國家衛生研究院及USDA之研究中動物護理和使用指南下飼養。
3. NHP研究：此研究包括6隻9至12歲的食蟹猴，注射時動物的體重在4到8千克之間。於注射之前，將載體(2×1013GC)稀釋於5mL Omnipaque(碘六醇)180造影劑材料中，經由腰椎穿刺注射載體，如前所述[Hinderer,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online 2014；1]。螢光鏡檢查法證實了正確注射進入鞘內空間，對於特倫德倫堡(頭低腳高姿勢)組別的動物，注射後立即將床頭降低30度，持續10分鐘。進行安樂死和組織收集，如前所述[Hinderer,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online 2014；1]。
4. 犬隻研究：此項研究包括6隻1歲的MPS I犬隻，以及2月齡之MPS VII犬隻。對所有經ICV治療的犬隻進行基線MRI以計劃注射坐標，進行腦池內注射，如前所述[Hinderer et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015；23(8)：1298-1307]。對於ICV注射，使用靜脈注射異丙酚麻醉犬隻，氣管內插管，在異氟烷麻醉下維持並置於立體定位框架中，將皮膚無菌備置，並切開注射部位。在注射部位鑽出一個鑽孔，通過該鑽孔將26號針推進至預定深度，經CSF回流確認放置位置。在1至2分鐘內緩慢注入載體(1mL中1.8×1013GC)。進行安樂死和組織收集，如前所述[Hinderer et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015；23(8)：1298-1307]。
5. 組織學：以所描述處理大腦以評估GFP表現[Hinderer,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online 2014；1]。如前所述進行GUSB酵素染色和GM3染色[Gurda et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy.Oct 8 2015]。
6. ELISPOT：在屍檢時，從經載體治療的犬隻收集血液於肝素化試管中，藉由Ficoll梯度離心分離末梢血液單核球細胞。藉由乾擾素γELISPOT評估對AAV9衣殼胜肽和GFP胜肽的T細胞反應。將AAV9和GFP胜肽庫合成為具有10個胺基酸重疊的15聚體(Mimotopes)。將AAV9胜肽庫分為3池：來自胜肽1至50的A池，來自胜肽51至100的B池及來自胜肽101至146的C池。亦將GFP胜肽庫分為3池。使用佛波醇-12-十四烷醯-13-乙酸酯加離子黴素鹽(PMA+ION)作為陽性對照，使用DMSO作為陰性對照。以胜肽刺激細胞，並如所述檢測干擾素γ的分泌。如果每百萬個淋巴球中有大於55個斑點形成單位(SFU)且為DMSO陰性對照值的3倍，則該反應被認為是陽性。
7.生物分佈：在屍檢時，用於生物分佈的組織立即在乾冰上冷凍，如所述藉由TaqMan PCR進行載體基因體之DNA分離和定量[Wang et al,Human gene therapy.Nov 2011；22(11)：1389-1401]。
8.GUSB酵素分析：如所述，在CSF中測量GUSB活性[Gurda et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy.Oct 8 2015]。
B.結果 1.犬隻腦室內和腦池內載體遞送之比較
我們先前研究使用溶小體存儲疾病黏多醣病I型(MPS I)的犬模型證明，AAV9注入腦大池可以有效地靶向整個大腦和脊髓[Hinderer et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015；23(8)：1298-1307]。在此研究中，我們比較了表現GFP報導基因的AAV9載體投予至成年MPS I犬隻的腦大池或側腦室中的分佈。將三隻犬以注射單次1mL載體(1.8×1013基因體拷貝數)至腦大池治療。另三隻犬隻接受相同載體之單次載體注射到側腦室。對於藉由ICV注射治療的犬隻，進行基線MRI以選擇較大的側腦室進行注射並定義目標坐標。使用立體定位框架進行注射以精確地靶向指定的腦室。
在整個研究中，以IC載體注射治療的三隻犬隻是健康的，在載體注射後兩週對其實施安樂死以評估載體生物分佈和轉殖基因表現。在任何IC治療的犬隻中沒有觀察到顯著或微小的腦損傷(圖12A-12F)。藉由定量PCR測量載體基因體，揭示了大腦和脊髓的所有採樣區域中的載體沉積(圖13)，與載體基因體的分佈一致，強大的轉殖基因表現在大腦皮層的大部分區域以及整個脊髓中都是可檢測的(圖14A-14H)。脊髓組織學對於α運動神經元的強轉導是顯著的，具有有利於胸段和腰段的轉導梯度。
以載體注射ICV治療的三隻犬隻在手術後最初看起來是健康的。然而，在注射後12天發現一隻動物(I-567)死亡。另外兩隻動物存活至指定的14天屍檢時間點，儘管一隻動物(I-565)在安樂死之前變得麻痺，另一隻(I-568)開始出現面部肌肉無力，這些臨床發現與顯著重大腦損傷有關(圖12A-12F)。來自所有三隻動物的腦在針道周圍呈現變色，且發現死亡的動物中有相關的出血，組織學評估顯示注射部位周圍區域存在嚴重的淋巴細胞炎症，在每隻動物的腦中也觀察到血管周圍淋巴細 胞浸潤(圖12G和12H)。鑑於這種免疫毒性的證據，在屍檢時，從經ICV治療的一隻犬隻(I-565)收集的末梢血液樣本中評估對AAV9衣殼蛋白和GFP轉殖基因的T細胞反應。干擾素γELISPOT顯示抗GFP的強T細胞反應，沒有證據顯示對衣殼蛋白有反應(圖12I)。此暗示所觀察到的腦炎是由抗轉殖基因產物的細胞介導免疫反應所引起的。
經ICV治療的動物之載體分佈與經IC治療之群組中所觀察到的相似，儘管IC同齡群中的脊髓轉導稍微更大(圖13)。在經ICV治療的動物中整個檢測的CNS區域觀察到GFP表現(圖14A至14H)。
2.在NHP中經腰椎穿刺給予AAV9後頭低腳高姿勢對CNS轉導的影響
我們先前將AAV9注射至NHP的腦大池或腰椎槽進行比較，發現腰椎路徑的靶向脊髓的效率低10倍，而靶向大腦的效率低100倍[C.Hinderer,et al,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online 2014；1]。其他調查員之前已證實藉由腰椎穿刺使用AAV9投予的更好轉導，注射後將動物置於頭低腳高姿勢可達到改善載體的顱骨分佈[Myer et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy.Oct 31 2014]。在此方法中，將載體稀釋至過量造影劑材料以增加溶液的密度並促進在特德倫堡組別中的重力驅動分佈，在L3-4間隙中用單次注射表現GFP(2×1013基因體拷貝數)的AAV9治療6隻成年食蟹猴。將載體在碘六醇180造影劑材料中稀釋至最終體積為5mL，在注射後立即將四隻動物以手術台的頭部-30°角度放置10分鐘。10分鐘後，捕獲螢光影像以驗證CSF中的造影劑分佈，特別是這種大注射量(約佔動物總CSF體積的40%)[Reiselbach et al,New England Journal of Medicine.1962；267(25)：1273-1278]，造影劑材料迅速分佈在整個脊髓蜘蛛網膜下腔並進入基底腦池，即使是未放置頭低腳高姿勢的動物也是如此(圖16A及16B)。藉由PCR(圖17)和GFP表現(圖18A至18H)分析載體基因體分佈證實整個腦和脊髓的轉導，注射後定位對於轉導細胞的數量或分佈並沒有明顯的影響。如先前所報導的，在鞘內AAV投予後存在載體逃逸到外周和肝轉導[Hinderer et al,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online 2014；1；Haurigot et al,Journal of Clinical Investigation.Aug 2013；123(8)：3254-3271]。肝臟轉導的程度取決於預先存在的抗AAV9之中和抗體(nAb)，六隻動物中有四隻沒有可檢測的基線AAV9 nAb(力價<1：5)，兩隻動物(4051和07-11)具有可檢測的預先存在的AAV9抗體，力價為1：40。與先前的結果一致，預先存在的抗體阻斷肝臟轉導，並導致向脾臟的載體分佈增加[Wang et al,Human gene therapy.Nov 2011；22(11)：1389-1401,but had no impact on CNS transduction；Haurigot et al,Journal of Clinical Investigation.Aug 2013；123(8)：3254-3271]。
C. 討論
由於枕骨下穿刺不是臨床實施中常用的手術，我們評估了更多常規的CSF通路部位，包括側腦室和腰椎槽。在這裡，我們評估了一種方法，採用更高密度的載體溶液及注射後頭低腳高姿勢以改善腰椎區域的載體分佈。
在犬隻研究中，IC和ICV載體注射均產生類似的有效載體分佈，但腦炎只發生在ICV組別。在經ICV治療的一隻犬隻中可檢測到抗GFP轉殖基因的T細胞反應，暗示在這些動物中所觀察到的淋巴細胞腦炎是由於轉基因特異性免疫反應。誘導對於新抗原的T細胞反應需要兩個元件-藉由年幼T細胞識別蛋白質之表位，以及促進T細胞活化的炎性「危險信號」。AAV被認為能夠表現外源轉基因而不會引起對轉基因產物的免疫，因為它不會激活先天免疫系統，從而在年幼淋巴球遇到新表現抗原時避免了炎症信號並促進耐受而不是免疫。在外來轉基因產物表現的相同位置處發生的穿透腦實質之創傷所引起的局部炎症可提供誘導對轉基因產物的免疫反應所需之危險信號。先前的MPS I犬隻研究證實了此點，其發展出對於酵素的細胞介導免疫反應，該酵素由直接腦注射而不是IC注射所遞送之AAV載體表現[Ciron et al,Annals of Neurology.Aug 2006；60(2)：204-213；Hinderer,et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015；23(8)：1298-1307]。這種免疫應答的可能性取決於轉殖基因產物是否被識別為外來的-用於遞送表現亦 是內源性產生之蛋白質的載體，甚至由注射引起的炎症反應也不會破壞對自身蛋白質的耐受性。在MPS VII犬隻進行ICV載體遞送研究的結果支持這一概念，因為轉殖基因產物與內源蛋白的相似性可能是由於不存在對於GFP所觀察到的T細胞反應類型的原因。具有隱性疾病的病患亦是如此，該病患攜帶允許產生類似於轉殖基因產物的蛋白質的錯義突變。因此，免疫風險可能因病患群和轉殖基因產物而異，且在某些情況下，可能需要免疫抑制以防止對轉殖基因的破壞性T細胞反應。目前的研究結果建議，使用IC而非ICV給藥路徑可以減輕有害免疫反應的風險。
在NHP中經腰椎穿刺投予AAV9的研究顯示，在整個CNS中的轉導比我們先前在該施用途徑中所觀察到的更大。這種差異似乎是由於本研究中的大注射量，這對於將載體稀釋至過量的造影劑材料中是必要的。先前的研究以顯示，如此大量的注射(約佔CSF體積的40%)可以將注射的物質直接驅入基底腦池，甚至是恒河猴的腦室CSF[Reiselbach，引用如上]。將這種方法轉化為人類的潛力尚不清楚，因為複製此種方法需要非常大的注射體積(>60mL)，這種注射不是常規投予病患。此外，即使採用這種高容量方法，經由腰椎穿刺進行注射的效率也低於先前的IC遞送結果。在此先前研究中，動物按體重給藥，因此只有一隻動物接受的IC載體劑量與此處所使用的相當[Hinderer,et al,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online 2014；1]。該動物在腦和脊髓中具有平均3倍較高的載體分佈，這表明甚至非常大的體積載體遞送至腰椎槽也不如IC遞送有效。在文獻報導的造影劑中，我們發現在腰椎間盤注射後將動物放置頭低腳高姿勢沒有額外的好處[Meyer et al,Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy.Oct 31 2014]。
這些發現一起支持腦大池水平的載體給藥，因為這種方法比經由腰椎穿刺給藥實現更有效的載體分佈，並且似乎比ICV給藥攜帶更低的轉殖基因產物免疫風險。可使用在臨床前研究中所使用的枕骨下穿刺法臨床上進行腦大池的載體遞送。另外，在注射部位接近腦大池的情況下，使用側向路徑(C1-2穿刺)注射到第一和第二頸椎之間的蜘蛛網膜下腔可能產生類似的載體分佈。C1-2路徑具有額外的優點，與枕骨下穿刺不同，它在臨床上廣泛用於CSF通路，特別是用於鞘內造影劑投予。
實施例9：經鞘內注射恒河猴AAV2/9.CB7.CI.serhIDS.RBG之非臨床藥理學/毒理學研究
進行一項研究，其設計為評估鞘內投射兩種劑量的AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBG(一種編碼人類IDS的載體)至恒河猴的安全性，以獲得高於人類給藥的最低有效劑量(MED)的充足安全邊際。
對照物經由枕骨下穿刺給予隨機分組至第1組的單一獼猴，測試物經由枕骨下穿刺給予隨機分組至2-3組的6隻恒河猴。第2組中的獼猴以高劑量5×1013基因體拷貝數(GC)(N=3)接受測試物；第3組中的獼猴接受1.7×1013GC(N=3)的低劑量投予之測試物。收集血液和腦脊液作為一般安全監督盤的一部分。
在載體投予後90±3天完成這些研究的生命期階段後，對獼猴進行屍檢及收取組織用於全面的組織病理學檢查。在屍檢時從肝臟、脾臟和骨髓中收取淋巴球以檢查這些器官中細胞毒性T淋巴球(CTL)的存在。
I. 實驗設計 A. 材料
測試物-AAV9.CB7.hIDS亦已知為AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBG，且已知為AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR，這些名稱是同義詞，可以互換使用。
測試物以單批次產生，具有濃度5.72×1013GC/ml，藉由微滴數位PCR(Droplet digital PCR，dd PCR)測量。載體在生產後於
Figure 107133321-A0202-12-0147-175
-60℃下儲存直至注射當天，在注射當天，載體以對照物稀釋。一旦稀釋後，將載體在2-4℃下儲存於冰箱中或冰上直至注射時間。載體製劑在注射當天完成。
以對照物Elliot調配物緩衝液(EFB)且無測試物(EFB+0.001% Pluronic F68)投予對照組動物，對照物在生產後於室溫下儲存直至注射當天。
B. 測試系統
測試系統選擇的理由：此研究涉及用於CNS疾病的基因治療載體之鞘內(IT)遞送。非人類之靈長類動物(NHP)的CNS尺寸是我們臨床目標群的最佳代表性模型，此研究提供了IT注射後與載體的劑量相關之毒性數據。
使用由Covance Research Products,Inc.(Alice，TX)提供的重量在3至10kg之間的七(7)隻3-7歲的雄性恒河猴(Macaca mulatta)(恒河猴(Rhesus macaques))。
II.一般設計程序
在該研究中使用7隻恒河猴(雄性)，將動物分成表1中所列之三個研究組別，所有7隻動物皆經由枕骨下穿刺接受IT注射。
Figure 107133321-A0305-02-0150-1
將動物麻醉並經由枕骨下穿刺給予測試物進入腦大池。
將麻醉的獼猴準備於手術室中並轉移到螢光鏡檢查法套件且以側臥位放置於成像台上，頭部向前彎曲用於CSF收集及投藥至腦大池。準備無菌之注射位置，使用無菌技術，將21-27號之1-1.5英寸Quincke腰椎穿刺針(Becton Dickinson)推入枕骨下空間，直到觀察到CSF的流動，在給藥之前收集高達1.0mL的CSF用於基線分析並。通過的解剖結構包括皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬腦膜和寰枕筋膜。針頭指向腦大池較寬的 上部間隙，以避免血液污染和潛在的腦幹損傷。使用螢光鏡(OEC9800 C-Arm，GE)經由脊髓造影驗證針刺的正確放置位置，螢光鏡根據製造商的建議操作。在CSF收集後，將魯爾(leur access)通路延伸導管連接到腰椎穿刺針以促進Iohexal(商品名：Omnipaque 180mg/mL，General Electric Healthcare)造影劑介質和測試或對照物的給藥。經由導管和腰椎穿刺針給予一(1)mL的碘六醇。在驗證針頭放置後，將含有測試物的注射器(體積相當於1mL加上注射器和接頭無效空間的體積)連接到可撓性接頭並在20-60秒內緩慢注射。取下針頭並將直接壓力施加到穿刺部位，收集留在注射設備中的剩餘測試物並於
Figure 107133321-A0305-02-0151-12
-60℃下儲存。
在動物不能成功地投藥至腦大池的情況，則可使用投藥至C1-C2鞘內空間(寰樞關節)作為投藥的替代位置。給藥程序如下，將動物置於側臥位，頭部向前彎曲用於收集CSF及投藥至C1-C2鞘內空間，無菌準備注射位置。使用無菌技術，將21-27號之1-1.5英寸Quincke腰椎穿刺針(Becton Dickinson)推入鞘內空間，直到觀察到CSF的流動，在給藥之前收集高達1.0mL的CSF用於基線分析並。通過的解剖結構包括皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬腦膜和筋膜。針頭插入C2椎骨上方並進入椎骨空間，以避免血液污染和潛在的頸髓傷害。其餘程序類似於先前對腦大池給藥所述之程序。
動物接受AAV9.CB7.hIDS或對照物的鞘內注射，給藥頻率列於表3中。高劑量之AAV9.CB7.hIDS為5×1013GC而低劑量為1.7×1013GC。每隻獼猴注射的經稀釋AAV9.CB7.hIDS或對照物的總體積為1mL。
III. 結果
如在CSF中計數白血球顯示，在高劑量治療組別(第2組)中，3隻動物中有2隻觀察到腦脊液細胞增多，在低劑量治療組別(第3組)中，3隻物中有1隻(圖28)。在第90天，在除了一隻高劑量治療的動物(RA 2203)之外，所有動物中解決了這種細胞增多症。
此外，此外，存在背柱軸突病變(數據未顯示)。
在某些具體實施例中，低劑量對應於1.9×1011GC/g腦重，高劑量為9.4×1010GC/g腦重。在某些具體實施例中，高劑量對應於5.6×1011GC/g腦重。在其他具體實施例中，低劑量和高劑量分別對應於1.3×1010GC/g腦質量和6.5×1010GC/g腦質量。在某些具體實施例中，所施用的產品的總體積不超過5mL。
對於從上述動物收集的血清樣品進行抗hIDS抗體的ELISA分析，在第60天獲得的結果繪製在圖29，並且如下表2所示。將CSF樣品稀釋20倍用於經抗hIDS抗體的ELISA分析進行評估，結果顯示於表3中。與高劑量組別(第3組)之血清和CSF相比，在低劑量治療組別(第2組)中觀察到降低的免疫原性。在未治療的對照中未觀察到抗hIDS的免疫原性。
Figure 107133321-A0305-02-0153-2
Figure 107133321-A0305-02-0153-3
實施例10：在免疫抑制的恒河猴中經鞘內注射AAV9.CB7.hIDS的非臨床藥理學/毒理學研究
進行一項研究，其設計為評估化學誘導的免疫抑制(IS)對於鞘內投射兩種劑量的AAV9.CB7.hIDS(一種編碼人類IDS之載體)至恒河猴的安全性的影響，該研究如實施例9中所述，並如下所述修正。
重複實施例9之對照物投藥動物，測試物經由枕骨下穿刺給予隨機分組至1-2組的6隻恒河猴。第1組中的獼猴以高劑量5×1013基因體拷貝數(GC)(N=3)接受測試物；第2組中的獼猴接受1.7×1013GC(N=3)的低劑量投予之測試物。收集血液和腦脊液作為一般安全監督盤的一部分。來自第1組和第2組的猴子在AAV9.CB7.hIDS給藥前至少2週接受黴酚酸酯(MMF)直到且包括給藥後第60天，以及在給藥前至少2週接受雷帕黴素直到且包括給藥後第90天(+/- 3天)。監測兩種免疫抑制藥物的血漿波谷濃度，且劑量調整以維持範圍為2-3.5mg/L之黴酚酸(mycofenolate acid，MPA，為MMF的活性代謝物)及10-15μg/L之雷帕黴素。
在載體投予後90±3天完成這些研究的生命期階段後，對獼猴進行屍檢及收取組織用於全面的組織病理學檢查。在屍檢時從肝臟、脾臟和骨髓中收取淋巴球以檢查這些器官中細胞毒性T淋巴球(CTL)的存在。
A. 材料
測試物、對照物、其製備描述於實施例9中。
B. 測試系統
如實施例9中所述使用並保定恒河猴(Macaca mulatta)。將6隻動物(6隻雄性)的同齡群用於該研究。從最低至最高的ID分配給動物1-6的數字。藉由亂數產生器(random.org)生成數字1-6的隨機列表，一旦隨機分配，動物按如下順序分配：第1組分配3隻動物；第2組分配3隻動物。
C. 一般設計程序
樣本大小和組別命名：
6隻恒河猴用於研究，將動物分成表4中所列之二個研究組別，所有6隻動物皆經由枕骨下穿刺接受IT注射。
Figure 107133321-A0202-12-0152-6
對第1組和第2組中的所有動物施用免疫抑制療法，表5總結每組動物的藥物組合、劑量和給藥日程。可用全身性抗生素及/或抗真菌劑治療動物以便治療與免疫抑制相關的機會性感染(如果發生)。
以黴酚酸酯(MMF)和雷帕黴素的組合給予動物，兩種免疫抑制藥物都經由口胃飼管或鼻飼管給予經麻醉或有意識但經控制於椅子的獼猴。麻醉的動物不會被禁食以允許從管中抽吸胃內容物(正確的放置驗證)，免疫抑制療法至少在測試物鞘內給藥前兩週開始。IS藥物的起始劑量係基於先前在恒河猴中所描述的功效，先前用於其他研究之GTP的劑量，並且在血液水平監測時進行調整。
動物在免疫抑制第一天的體重用於計算初始劑量，然後每天早晨稱重動物，而且如果重量變化超過+/- 10%則重新計算劑量。
最初每週監測2次波谷水平，並在第60天後每週監測一次(當僅使用雷帕黴素時)。
Figure 107133321-A0305-02-0155-4
c.IS藥物
雷帕黴素在鞘內給藥前最少14天以0.5-4mg/kg PO，SID的劑量投予，直至並包括研究的第90天(+/- 3天)。起始劑量為1mg/kg。計算雷帕黴素劑量以使研究期間的目標波谷水平盡可能接近10-15μg/L，如果在一週內未達到目標波谷藥物水平，則劑量以0.25-2mg/kg劑量間隔滴定。在穩定期之後，若連續2次採血的波谷水平太低，則進行調整。若其太高，則立即進行調整。
MMF以50mg/kg PO，BID的起始劑量，在鞘內給藥之前至少14天投予且直到並包括研究的第60天。然後使用波谷水平結果來調整劑量滴定於5-25mg/kg劑量間隔。MPA的波谷水平盡可能維持接近2-3.5mg/L，穩定期後，若連續2次採血的波谷水平太低，則進行調整，若其太高，則立即進行調整。
d. IS藥物調配物
使用市售口服溶液以200mg/mL的濃度將MMF經口投予至測試系統。
使用一種或多種以下市售調配物將雷帕黴素經口投予至測試系統：0.5mg包衣錠劑；1mg包衣錠劑；2mg包衣錠劑。
當投予丸劑調配物時，錠劑按如下方法製備：將每個雷帕黴素丸劑置於室溫或溫水的稀釋劑中(如果需要，使用溫水加速溶解)以溶解錠劑之外包衣，使用大約10ml的水，黃色塗層下的藥丸是白色的。
一旦外包衣溶解，每個丸劑用研缽和研杵粉碎直到成為細粉末，形成均勻的溶液。將用於溶解錠劑的稀釋劑總體積記錄在研究記錄中。
將總混合物吸入劑量注射器中，並如本實施例中所述通過OG或NG管給藥。
在給予MMF及/或雷帕黴素後，用飲用水沖洗口胃或鼻胃管飼管，沖洗量記錄在研究記錄中。
進行以下研究以評估在MPS II小鼠中腦室內(ICV)遞送AAV9.CB7.CI.hIDS的功效並確定最小有效劑量。功效係基於對載體的藥效學反應(酵素活性hIDS蛋白的產生)的證據和對MPS II疾病(IDS缺乏)的行為與組織學表現的影響。
此研究評估了在化學免疫抑制的恒河猴中經由影像引導枕骨下穿刺給藥後長達90天，2種劑量水平的AAV9.CB.hIDS(一種編碼人類艾杜醣醛酸2-硫酸酯酶(hIDS)的載體)之安全性、生物分佈和藥理學。將對照物經由枕骨下穿刺投予單一非免疫抑制的獼猴。經由枕骨下穿刺投予AAV9.CB.hIDS至隨機分組至第1-2組的5隻恒河猴。第1組的獼猴以高劑量(HD)5×1013GC(n=3)接受測試物；第2組的獼猴接受以低劑量(LD)1.7×1013GC(n=3)投予的測試物。在基線、第7、14、21、30、45、60及90天收集血液和腦脊液(CSF)作為一般安全監督盤的一部分。在相同的時間點分析血清和CSF中對轉殖基因產物hIDS及對於AAV9衣殼的體液反應以及hI2S酶活性。評估在基線、第30、60和90天之血液中以及第90天之脾臟和骨髓中，T細胞對轉殖基因產物hI2S和對AAV9衣殼的反應。在基線、第7、14、21、30、45、60和90天之血液中以及在基線、第5、30和90天 之尿液和糞便(排放(shedding))中定量總血液和腦脊液中的載體基因體。在載體投予後90±3天完成研究的生命期階段後，對獼猴進行屍體剖檢並收取組織用於進一步評估。來自中樞神經系統(CNS)、外周神經系統(PNS)和外周器官的載體基因體之組織病理學評估和生物分佈完成於組織的綜合列表。
並無與給藥程序相關的AE，且在臨床一般觀察中，體重變化、器官重量、CBC、血清化學或凝血參數方面並沒有與AAV9.CB.HIDS相關的異常。IS程序引起與AAV9.CB.HIDS給藥無關的一些炎症參數之腸道症狀和貧血症。在屍檢日，只有一隻來自LD組別(RA2233)的動物出現淋巴細胞性CSF細胞增多症(每μL 23個細胞)。
藉由IS可有效預防對hI2S的體液免疫反應，且在其他動物中不存在或降低至最小反應，IS動物中對hI2S並沒有T細胞反應，僅LD組別對AAV9有輕度至中度的反應。在第60天停止服用MMF後未見反彈的免疫反應。
載體投予後存在輕微的AAV9 Nab反應，其在LD動物中比在HD動物中更明顯，IS對LD動物的AAV9 Nab反應沒有明顯影響(IS和非IS動物均低)，但似乎有效調節HD動物的AAV9 Nab反應。
在以AAV9.CB.HIDS治療的HD和LD動物中，IS完全阻止了CSF AAV9 Nab反應。
在高劑量和低劑量組別中類似地觀察到治療 相關的發現，並由脊髓背側白質束和坐骨神經的最小至輕度軸突病變組成。在背根神經節中單核球細胞浸潤的微小至輕度神經元細胞體變性，在背部白質束和三叉神經節中的投射通常類似於Stusy # 2，因此化學誘導的免疫抑制不影響這些發現。
儘管存在高載體拷貝數，但在腦或脊髓內未見到炎症，可能反映出背根神經節的解剖學特異性，其為高度血管化且缺乏與中樞神經系統不同的保護性血腦障礙[Sapunar D,et al.,Dorsal root ganglion-a potential new therapeutic target for neuropathic pain.Journal of Pain Research.2012；5：31-38.doi：10.2147/JPR.S26603]。
所有經AAV9.CB.HIDS治療之動物的大腦、脊髓和背根神經節中檢測到高水平的AAV載體基因體，低劑量組在所有CNS和背根神經節樣品中產生2×105GC/μg DNA的平均值，高劑量組為3.4×105GC/μg DNA。在外周也發現顯著的載體生物分佈，特別是在肝臟中，其水平比HD動物的CNS高約10倍，相當於LD動物的CNS。轉染最少的器官是眼、腎、睾丸和甲狀腺，平均水平在甲狀腺中的54GC/μg DNA和腎中的8,540GC/μg DNA之間。
一隻動物(RA2233)已預先存在AAV9 NAb(基線力價1：40)，其完全抑制肝臟、眼睛、心臟、肺、睾丸和甲狀腺的轉導(未檢測到的基因體拷貝數)，而CNS和PNS載體生物分佈不受影響。對應於CNS、PNS和外周 器官中載體基因體拷貝數的存在，除了一隻動物以外的所有動物的血清中以及在所有動物之CSF中，I2S活性在基線上迅速增加，顯示AAV9.CB.hIDS表現功能性I2S酵素，其存在於鞘內治療動物的CSF和血清中。
載體DNA存在於由經AAV9.CB.HIDS投予之動物所收集的所有血液樣品中，在第7天達到峰值。載體DNA水平隨著時間的推移而下降，但到第90天時(研究之測試物投予後最後一個時間點)並未完全為陰性。
載體DNA在血液中比在CSF中更豐富，包括在最早的時間點，顯示從CSF到血液隔間的快速轉移。
載體DNA排放大部分經由膽汁清除發生，在糞便中檢測到的基因體拷貝值高於在尿液中，糞便中的排放(直到第30-90天)比尿液中更持久(直到第5天)。
實施例11：腦室內AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG在MPS II小鼠模型中的功效 I. 摘要
韓特氏徵候群，黏多醣病II型(MPS II)，為一種X染色體遺傳性疾病，由缺乏酵素艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)引起，其涉及在溶小體中糖胺聚醣(GAG)皮膚素和硫酸乙醯肝素的代謝。這種缺陷導致未降解的GAG於細胞內積累，且最終導致進行性的嚴重臨床表型。在過去的二三十年中已經進行了許多嘗試來確定該疾病的可能治療策略，包括基因治療和體細胞治療。進行研究以評估在MPS II鼠類模型中單一腦室內(ICV)投予AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG(一種表現人類I2S的AAV9 載體)的短期(21天)生物分佈、表現和活性。設計並進行進一步的研究以確定在MPS II的鼠類模型中，藉由ICV路徑投予作為單一劑量之AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG的最小有效劑量(MED)，且注射後(pi)有3個月觀察期。該研究亦包括一些安全性終點(評估對轉殖基因的體液免疫反應和腦組織病理學)。
以3×108GC或3×109GC或3×1010GC之劑量(由載體qPCR滴定決定)，於第0天腦室內投予AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG至2-3月齡之C57BL/6 I2S γ/-(MPS II)小鼠(16雄性/組)。在第21天，對第3-5組(表6)的小鼠進行安樂死並屍檢以評估CNS I2S活性、生物分佈和抗hI2S免疫原性。在第60天和第89天之間，在一系列神經行為分析(開放空間、Y型迷宮、情境恐懼制約和新物體識別)中評估野生型小鼠和未經治療MPS II小鼠，以在這些端點上疾病狀態影響具有之特徵。基於這些初始分析的結果，在評估長期記憶的兩種分析(情境恐懼制約和新物體識別)中評估剩餘的經治療之小鼠。在ICV給予AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG後大約3個月，對所有剩餘的小鼠進行安樂死並屍檢，評估血清和CSF的I2S活性以及血清之抗I2S抗體。評估肝臟和心臟的GAG組織含量。藉由LIMP2和GM3的免疫組織化學染色評估腦整體溶小體存儲(初級GAG儲存和次級神經節儲存二者)，已經顯示組織己糖胺酶水平在MPS II小鼠和MPS II病患中更高，且是溶小體恆定性瓦解的生物標誌。因此測量組織己糖胺酶酵素活性作為溶小體功能之生物標誌 次於AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG給藥，評估腦的組織病理學以研究功效和安全性二者。
Figure 107133321-A0202-12-0160-9
ICV投予高達3×1010GC(ddPCR法為5.2×1010GC)之AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG至C57BL/6 I2S γ/-(MPS II)小鼠，其耐受性良好，無臨床症狀或死亡，且導致分佈到CNS及外周組織，特別是肝臟，因此證明注射的病毒顆粒從CSF部分重新分佈到末梢血液。
有證據表明腦中存在I2S基因表現，其經由檢測第21天之大腦和注射後3個月之CSF中的I2S活性為載體和劑量依賴性增加證明，其中酵素活性接近最高 劑量時野生型的水平(腦組織)且與中高劑量時的野生型(CSF)相當和更高。溶小體隔室具有劑量依賴性標準化，如藉由在注射後3個月的所有劑量下CNS中LIMP2和GM3染色的減少所示。在H & E染色的腦切片中，亦觀察到在神經膠質空泡化之量和頻率上以及在兩性物質的神經元積累上(MPS II CNS表型的指標)的劑量依賴性減少。對應於H & E染色切片中CNS溶小體含量的變化和疾病相關形態的改善，在一長期記憶(新物體識別，NOR)的測量方法中獲得改善，但在另一方面(情境恐懼制約(CFC))卻沒有改善，在NOR的改善中沒有明顯的劑量反應。
在注射後3個月時亦觀察到血清I2S活性的劑量依賴性增加，具有酵素活性與在中等和高劑量之野生型相當或更高。反映血清中I2S活性的標準化，經治療的MPS II小鼠在肝臟和心臟中的己糖胺酶活性和GAG含量具有劑量依賴性降低。肝臟己糖胺酶和GAG水平在肝臟中的所有劑量水平和在心臟中的中高劑量下被標準化，高轉導的肝臟(每二倍體基因體1至10個GC)可能充當血清中I2S分泌的貯庫器官和較高劑量的心臟交叉校正。
雖然在一些小鼠中觀察到與ICV投予程序本身相關的變化，但沒有證據表明腦中有與測試物相關的毒性。對轉殖基因的體液免疫反應很小，僅在一些中等和高劑量動物中觀察到，而不影響這些動物的健康或腦組織病理學。
總之，AAV9.CB7.CI.IDS.rBG在所有劑量水平的MPS II小鼠中均具有良好的耐受性，並在與MPS II之CNS和外周參數改善相關的I2S水平(表現及酵素活性)上導致劑量依賴性增加。所投予的最低劑量，3×108GC(5.2×108GC ddPCR方法)是本研究中的最小有效劑量。
II. 材料與方法 A. 鑑定為AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG的測試物是透明無色液體，經qPCR測量的力價為1.18×10 13GC/mL，經ddPCR測量為2.057×10 13GV/mL。內毒素<1.0EU/mL，純度為100%。將測試物品儲存在
Figure 107133321-A0202-12-0162-177
-60℃。 B. 劑量調配物及分析 1. 測試物之製備：
將測試物以無菌磷酸鹽緩衝液食鹽水(PBS)稀釋至每個劑量組別的適當濃度，將稀釋的載體保持在冰上，並在稀釋後4小時內注射動物。
C. 測試系統
小家鼠(Mus musculus)C57BL/6JI2Sγ/-(MPS II表型，N=56雄性)及C57BL/6J I2Sγ/-(野生型表型，N=8雄性)在曼谷轉化研究實驗室(Translational Research Laboratories，TRL)飼養，最初從Jackson Laboratories(世系編號024744)獲得的世系。動物在第0天(給藥當天)時為2-3月齡。
D. 實驗設計 1. 研究W2356
在第0天，來自第3-5組的所有動物(16隻雄性/組，W2356和W2301研究組合)ICV給予AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG。在第21天，將第3-5組(8隻雄性/組，W2356研究)的小鼠/組安樂死並屍檢且收集大腦、心臟、肺、肝和脾臟並在乾冰上快速冷凍，用於評估腦I2S活性和組織載體生物分佈。
Figure 107133321-A0202-12-0163-10
2. 研究W2301
在第0天，來自第3-5組的所有動物(16隻雄性/組，W2356和W2301研究組合)ICV給予AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG。從注射後2至3個月：來自第1組和第2組(8隻小鼠/組)的動物在一系列神經行為分析中評估，包括開放空間活動、Y型迷宮活動、情境恐懼制約和新物體識別，以確定在這些端點上是否存在疾病狀態(MPS II基因型)的影響。如果觀察到疾病的明顯影響，則還要在該分析中評估來自第3-5組的8隻小鼠/組，以確定用載體處理是否對反應有影響。
將第1-5組(在神經行為分析中評估的相同動物，8隻小鼠/組)的動物深度麻醉(氯胺酮-甲苯噻．)，以收集CSF(腦大池穿刺)和血液(心臟穿刺)用於評估血清和CSF I2S活性和血清抗hI2S抗體。然後將小鼠安樂死並屍檢，且收集樣本用於腦組織病理學；腦溶小體貯存(藉由免疫組織化學和影像分析評估)；肝臟和心臟己糖胺酶活性；及肝臟和心臟GAG含量(按組織含量評估)。
Figure 107133321-A0305-02-0166-5
3.測試物投予
選擇ICV路徑是因為它是微創的且在小鼠中不需要外科手術(與需要頸部皮膚和肌肉切口的腦大池路徑相比)。由於該研究包括一些涉及小鼠活動記錄的神經行為端點，較佳為不涉及存活手術的非侵略性注 射。我們和其他人先前已經證實，在小鼠和大型動物中，單一注射AAV9至腦脊液(ICV或腦大池)中會靶向整個CNS內的神經元[Dirren at al.,Hum.Gene.Therapy 25,109-120(2014)；Snyder et al.Hum.Gene Ther 22,1129-1135(2011),Federici et al.Gene Therapy 19,852-859(2012),Haurigot et al.J Clin Invest 123,3254-3271(2013),Bucher et al.Gene Therapy 21,522-528(2014),Hinderer et al.Mol Ther：22,2018-2027(2014)and Mol Ther-Methods & Clin Dev 1,14051(2014)]。Haurigot等人(2013)所公布的數據特別發表另一種溶小體貯存疾病背景中ICV和腦大池注射二者的比較，證明兩種投予路徑就轉殖基因表現和生物分佈方面而言是等同的。
由於體積的約束(對成年小鼠ICV注射為5μL)的最大可行劑量為每隻小鼠約6×1010GC(qPCR滴定法)。由於在GTP用於治療其他MPS所獲得的先前結果及由於對較大動物之可擴展性的擔憂，將載體稀釋以便每隻小鼠注射3×1010、3×109或3×108GC(qPCR滴定方法)。基於ddPCR方法，實際劑量為每隻小鼠5.2×1010、5.2×109和5.2×108GC。考慮到年輕成年C57Bl6小鼠的平均腦質量為0.4克(Biology of the laboratory mouse by the staff of the laboratory,second revised edition,Earl L.Green Editor)，這相當於最高劑量為每克腦質量1.31×1011GC和最低劑量為每克腦質量1.31×109GC。
將載體ICV投予至右側腦室中，小鼠用異氟烷麻醉。每隻麻醉的小鼠經由頭部背後鬆弛的皮膚牢固地抓住，並用裝有26號針頭的Hamilton注射器自由地向前囟門前側和外側注射，同時調整為插入3mm深。注射方法先前在經由將染料或物質P注入右側腦室中的小鼠中得到驗證，成功被定義為小鼠在注入腦脊液後，藍色染料的可視化或藉由瘙癢行為(施用P物質後)。
F. 程序、觀察和測量
每天監測動物的發病率/死亡率。藉由每日籠側視覺觀察一般外觀、毒性跡象、痛苦和行為變化以監測動物，這些數據未記錄於此非GLP研究。
在第60天和第90天之間(載體投予後2-3個月)，將來自研究W2356的第1組和第2組的8隻動物進行行為和神經認知測試，以確定在這些端點上基因型的影響。如果鑑定出基因型的影響，則使用來自研究W2356第3-5組的8隻動物進行另外的測試以確定是否存在治療效果，所有行為程序均由不知道基因型和組別的操作員執行。
一般運動能力(開放空間活動)：
以Photobeam Activity System(PAS)-Open Field(San Diego Instruments)測量開放空間中的自發活性。在此評估中，小鼠被單獨放置在場所進行一次10分鐘的試驗，收集水平和垂直光束間斷以評估一般運動能力和直立上半身活動。
b)短期記憶(Y型迷宮活動)：
Y型迷宮自發交替是一種行為測試，用於測 量囓齒動物探索新環境的意願。測試發生在Y形迷宮中，三個白色不透明塑料支路彼此成120°角。在介紹迷宮中心後，允許動物自由探索三支路，囓齒動物通常較喜愛調查迷宮的新支路，而不是回到之前訪視過的支路。在多支路進入的過程中，受試者應該表現出進入最近訪視量較小的支路的趨勢。記錄支路進入的數量和三元組的數量，以便計算交替的百分比。進入定義為所有四肢皆存在於支路內，該測試用於量化小鼠轉基因品系的認知缺陷，並評估新化學實體對認知的影響。大腦許多部分-包括海馬迴、隔膜、基底前腦和前額葉皮質-都參與了這項任務。在此研究中，使用標準的Y型迷宮(San Diego Instruments)，並在8分鐘的試驗期間記錄支路進入的順序和數量。自發交替(SA)被定義為順序進入迷宮的所有3個支路而不立即返回到先前進入的支路。收集的總支路進入(AE)作為運動活動的度量，自發交替百分比以%SA=(SA/(AE-2)*100)計算。
c)長期記憶(情境恐懼制約)：
在這些任務中，動物學會害怕新的環境或情緒中性的條件刺激(CS)，例如一種音調，因為與其之厭惡的無條件刺激(US)有時間關聯，通常是足部休克。當暴露於相同的背景或相同的CS時，條件動物顯示僵直反應(Abel et al,Cell 88：615-626.1997)。在訓練當天，小鼠被允許探索特製的調節室(Med Associates Inc)300秒，在300秒的248-250秒之間，發出了無信號、1.5毫安連續足部電擊。在室中再過30秒後，小鼠被送回家 籠。二十四小時後，回憶空間背景是在訓練發生的同一房間連續5分鐘進行評估，以用於評分僵直反應的軟體(Freezescan，CleverSys Inc)評估記憶。將訓練期間(施用足部電擊之前)的2.5分鐘預刺激時期中的僵直百分比與再次暴露於腔室時的僵直百分比進行比較，僵直的增加表明足部電擊的回憶(即已經發生學習，且動物將腔室與足部電擊相關聯)。
d)長期記憶(新物體識別)：
新物體識別(NOR)任務用於在囓齒動物模型中評估中樞神經系統疾病的認知，特別是識別記憶，該測試基於囓齒動物會花費更多時間探索新物體而不是熟悉物體的自發傾向，探索新物體的選擇反映學習和識別記憶的使用。新物體識別任務在開放空間場所進行，其具有兩種不同的物體，這些物體的高度和體積通常一致，但形狀和外觀不同。在適應期間，允許動物探索空場所，在習慣後二十四小時，將動物暴露於具有以相等距離放置的兩個相同物體之熟悉場所。第二天，小鼠被允許在熟悉的物體和一個新物體的存在下探索開放空間，以測試長期識別記憶。記錄探索每個對象所花費的時間和辨別指數百分比。在這項研究中，實驗設備由白色地板上的灰色矩形場所(60cm×50cm×26cm)組成，兩個獨特的物體是3.8×3.8×15cm的金屬棒和3.2cm直徑×15cm長的PVC管。在為期5天的習慣階段，小鼠每天管理1-2分鐘，並允許探索空場所5分鐘/天。在訓練階段，將兩個相同的物體放置在場所中，允許小鼠探測物 體15分鐘。在回憶階段，小鼠被帶回具有一個熟悉的物體和一個新物體的場所，普通小鼠優先探索新物。記錄所有場次，並使用開放來源影像分析程序對探索對象所花費的時間進行評分[Patel et al Front Behav Neurosci 8：349(2014)]。
I. 實驗室評估 1. 血清及CSF中I2S活性
注射後約3個月在屍檢時收集用於血清和CSF I2S活性的血液，由血液分離血清並將血清和CSF在乾冰上冷凍並儲存在-80℃直至分析。I2S活性係藉由將10μL樣品與溶於0.1M乙酸鈉和0.01M乙酸鉛(pH 5.0)的20μL 1.25mM 4-甲基傘形酮(MU)α-L-吡喃艾杜糖醛酸2-磺酸酯(4-Methylumbelliferyl a-L-idopyranosiduronic acid 2-sulfate)(Santa Cruz Biotechnology)一起培養來測量。在37℃培養2小時後，加入45μL McIlvain緩衝液(0.4M磷酸鈉，0.2M檸檬酸鈉，pH4.5)和5μL重組人類艾杜醣醛酸酶(Aldurazyme，0.58mg/mL，Genzyme)至反應混合物中並在37℃下培養隔夜。將混合物在pH 10.9的甘胺酸緩衝液中稀釋，且與無4-MU之標準稀釋液比較下定量釋放的4-MU以螢光(激發365nm，發射450nm)。
2. 血清抗-I2S抗體
在研究W2356(第21天)和研究W2301(約3個月)的終末屍檢端點經由心臟穿刺收集血液用於測量血清抗hI2S抗體，分離血清並在乾冰上冷凍並儲存在-80℃直至分析。將聚苯乙烯平板用重組人類I2S(R & D Systems)5μg/mL(在PBS中，滴定至pH 5.8)塗布隔夜，將平板洗滌並在含2%牛血清白蛋白(BSA)之中性PBS中封阻1小時，然後將平板與以PBS 1：1000稀釋之血清樣品一起培養。以PBS(含2% BSA)1：10,000稀釋的辣根過氧化酶(HRP)-共軛之山羊抗小鼠抗體(Abcam)來檢測結合抗體，使用四甲基聯苯胺基質顯色測定，並用2N硫酸終止，然後測量450nm處的吸光度。藉由連續稀釋任意指定1：10,000力價的陽性血清樣品所產生的標準曲線確定力價。
使用QIAmp DNA Mini套組從高劑量組的組織分離DNA，並藉由TaqMan PCR定量載體基因體，其如前所述(Bell et al,2006)。使用QIAamp DNA Mini套組(Qiagen,Valencia,CA,USA)從組織中萃取總細胞DNA，使用靶向rBG polyA序列的引子和探針組，經由即時PCR(TaqMan Universal Master Mix，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)進行萃取之DNA中載體基因體的檢測和定量。
正向引子：5V-TTCCCTCTGCCAAAAATTATGG-3V，SEQ ID NO：16；反向引子：5V-CCTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGCT-3V，SEQ ID NO：17；探針：6FAM-ACATCATGAAGCCCC-MGBNFQ，SEQ ID NO：18。
PCR條件設定為100ng總細胞DNA作為模板，各300nM引子和200nM探針。循環在95℃下進行 10分鐘，在95℃下進行40個15秒的循環，在60℃下進行1分鐘。計算每100ng DNA的1×104基因體拷貝數值以表示每個細胞一個基因體拷貝。
根據標準步驟準則，在注射後3個月的屍檢時經福馬林固定石蠟包埋的延腦切片進行H & E染色。藉由經委員會認證的獸醫病理學家評估腦的H & E切片的毒性證據，並與MPS II表型相關的發現範圍界定特徵。隨後，病理學家在不知道治療的情況下重新檢查玻片並將MPS II表型的組織學表現評分，包括膠質細胞質空泡化、神經元細胞質腫脹和兩性物質的積累。經由熟練的GTP形態學核心人員，在來自W2356研究的每隻動物的2-4片腦切片中定量LIMP2和GM3之染色陽性的細胞數。
GM3(冷凍切片)：如所述使用單株抗體DH2(Glycotech，Gaithersburg，MD)作為初級抗體，然後使用生物素化二級抗小鼠抗體(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)並以Vectastain Elite ABC套組(Vector Labs,Burlingame,CA)檢測，在30μm厚的浮動冷凍切片上進行GM3免疫染色。將經染色之切片轉移到玻片上並用Fluoromount G(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)固定。
LIMP2(經福馬林固定之切片)：在來自福馬林固定石蠟包埋的腦組織之6μm切片上進行LIMP2免疫染色。連續經由乙醇和二甲苯將切片脫石蠟，在微波爐中於10mmol/L檸檬酸鹽緩衝液(pH6.0)中煮沸6分鐘用 以抗原修復，並用含1%驢血清之PBS+0.2% Triton中封阻15分鐘，然後藉由連續與稀釋於封阻緩衝液中的初級抗體(1小時)和經標記之二級抗體(45分鐘)培養，初級抗體是兔抗LIMP2(Novus Biologicals，Littleton，CO，1：200)，二級抗體是FITC-或TRITC-標記的驢抗兔(Jackson Immunoresearch)。
使用TissueLyser(Qiagen)將上述獲得的組織樣品(b部分)在裂解緩衝液(0.2%Triton-X100,0.9%NaCl，pH4.0)中均質化，將樣品冷凍解凍並經離心澄清。以BCA分析定量蛋白質。使用螢光基質4-甲基傘形酮α-L-吡喃艾杜糖醛酸2-磺酸酯(Santa Cruz Biotechnology)測量I2S活性，使用如所述的標準程序(Hinderer等人，2015)測量己糖胺酶活性和GAG濃度。
IV. 電腦化系統
關於開放空間，將數據輸入Excel並使用Graphpad Prism進行分析。關於Y型迷宮，將數據輸入Excel並使用Graphpad Prism進行分析。關於CFC，使用Freezescan(CleverSys Inc)。關於NOR，使用MATLAB Implementation和用戶指南：www.seas.upenn.edu/~molneuro/autotyping.html。
V. 統計分析
使用單因子變異數分析，然後經由Dunnett多重比較試驗，比較治療和未治療小鼠的組織GAG含量、Hex活性和腦存儲損傷。用學生t試驗分析開放空間和Y型迷宮數據。將雙向ANOVA和Dunnett事後分 析應用於恐懼制約數據以評估試驗和基因型效應。對於新物體識別測試，使用t試驗於每組以比較探索新物體與熟悉物體的時間，然後Bonferroni校正用於多重比較。
VI. 結果
沒有觀察到死亡率。並沒有被認為與載體治療相關的臨床觀察結果。
為了評估一般的運動活動，進行開放空間試驗。與野生型同窩出生仔鼠相比，I2S γ/-小鼠在開放空間場所顯示出正常的探索活性(圖9A-9C)。
進行比較野生型和I2S γ/-(MPS II)小鼠在開放空間場所(水平運動)中的表現(圖9A)。基於攫取水平移動的XY軸光束間斷，自動記錄10分鐘試驗期間的自發活動，而WT和MPS II小鼠之間並沒有差異。
進行比較野生型和I2S γ/-(MPS II)小鼠在開放空間場所(垂直運動或飼養)中的表現(圖9B)。在10分鐘試驗期間的自發活動係基於Z軸光束間斷的自動記錄，該光束間斷攫取小鼠以其後腿直立上半身，而WT和MPS II小鼠之間並沒有差異。
進行比較野生型和I2S γ/-(MPS II)小鼠在開放空間場所(中心活動)中的表現(圖9C)。在10分鐘試驗期間的自發活動係基於中心光束間斷的自動記錄，該光束間斷攫取在開放區域中所花費的時間，作為焦慮的標記，而WT和MPS II小鼠之間未見到顯著差異。
為了評估短期記憶，分析Y型迷宮活動。野生型和I2S γ/-(MPS II)小鼠在8分鐘Y型迷宮測試期間 的比較，在WT和MPS II小鼠之間的支路進入總數沒有差異。與野生型同窩出生仔鼠相比，I2S γ/-小鼠在Y型迷宮中也具有相似數量的支路進入和同樣的自發交替，表明疾病過程不影響短期記憶(圖9D)。
為了評估長期記憶，進行情境恐懼制約(FC)。在野生型、未治療和經治療的MPS II小鼠中測試使用情境恐懼制約對認知的治療效果的評估。在y軸上繪製僵直百分比(圖6B)，將學習前的僵直反應(Pre)與每組的適應後(Probe)的僵直反應進行比較(圖6B)。在FC測定中，所有小鼠(I2S γ/-和野生型)顯示在測試的回憶階段期間僵直的時間百分比增加，表明已經發生學習，但是I2S γ/-小鼠相對於野生型同窩出生仔鼠顯示出降低的僵直(數據未顯示)。雖然由於正常和未治療的I2S γ/-小鼠之間的微小差異很難評估治療相關效應，但在用AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG治療的小鼠中，對於情境恐懼制約的反應沒有明顯的改善(圖6B)。
為了進一步評估長期記憶，進行了新物體識別。在野生型、未治療和治療的MPS II小鼠中測試使用新物體識別對認知治療效果的評估。進行比較野生型、未處理和處理的I2S γ/-(MPS II)小鼠在探索新物體與熟悉物體所花費的時間。在所有經治療小鼠組別中觀察到花費在探索新物體上的時間增加(顯示熟悉物體的記憶)，但僅在中劑量組中具有統計學顯著性(圖6C)。正如預期，野生型小鼠表現出對新物體的偏好，但I2S γ/-並沒有表現出對熟悉物體缺乏記憶(長期記憶障礙)的偏 好。在I2S γ/-(MPS II)小鼠所觀察之NOR缺陷中，鞘內AAV9基因治療產生了改善，但沒有明顯的劑量反應。儘管該研究沒有足夠的權限來比較給藥組之間行為缺陷的相對程度，但對於新物體的偏好僅在中劑量同齡群中具有統計學顯著性(圖6C)。
觀察到野生型、未治療和經治療的MPS II小鼠中腦I2S活性(第21天)的劑量依賴性增加(圖2B)。在此早期時間點，只有高劑量組具有與野生型相似的水平，這是因為表現尚未達到其最大值。
在注射後3個月屍檢時所收集的CSF中觀察到野生型、未治療和經治療的MPS II小鼠的I2S活性(第90天)的劑量依賴性增加(圖2A)。在未治療的I2Sγ/-(MPS II)小鼠中基本上沒有檢測到I2S活性。
此外，在注射後3個月屍檢時檢測到野生型、未治療和經治療的MPS II小鼠中血清I2S活性(第90天)的劑量依賴性增加(圖2C)。在未治療的I2S γ/-(MPS II)小鼠的血清中基本上沒有檢測到活性。
在注射後3個月，在野生型、未治療和經治療的MPS II小鼠的肝臟(圖4C)和心臟(圖4D)中均以劑量依賴性方式將己糖胺酶活性(第90天)標準化，這種標準化的二次性增加之酵素活性顯示出溶小體內平衡的修復。
研究野生型、未治療和經治療的MPS II小鼠的肝臟和心臟GAG儲存，在注射後3個月，GAG的組織含量在心臟(圖4B)和肝臟(圖4A)中均劑量依賴性地減 少，且在中等和高劑量水平下與野生型的組織含量相當。肝臟在所有劑量皆改善，而心臟主要在中高劑量顯示部分改善。
此外，以ICV AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG治療的MPS II小鼠中評估以抗人類I2S的抗體反應所代表的體液免疫原性。僅在第21天和第90天，在中劑量和高劑量之同齡群中的幾隻動物的血清中檢測到人類I2S(圖8)。在兩個時間點，大多數動物都沒有可檢測到的體液免疫反應(類似於對照)，大約三分之一的中劑量動物和約20%的動物組別具有高於背景的抗體水平，高劑量組的反應並不太明顯。圖8顯示二個屍檢端點數據的集合。
在腦中沒有與治療相關的組織病理學發現。在此研究中存在的所有顯微鏡檢查結果被認為是該物種動物的正常背景、年齡和性別、與疾病模型相關，或與載體投予程序有關。
建立基於細胞質空泡化的評分系統，並用於隨後在不知治療或表型下所有測試動物的重新評估。膠質細胞質中的細胞質空泡化，其特徵是具有大的清晰空泡，具有核的偏心或外周位移，是I2S γ/-基因型的顯著特徵。在評估的腦區域中空泡化的量是具有區域可變性。神經元兩性物質的積累並不太突出，僅在未經治療的I2Sγ/-小鼠中觀察到。以AAV9.CB7.CI.hIDS.RBG治療減少了所有檢測之腦區中的兩性物質的膠質空泡化和神經元積累的數量和頻率。累積病理學評分證實神經膠質和神經元病變中與治療相關的改善(圖27)。
在野生型、未治療和經治療的MPS II小鼠的GM3和LIMP2進行免疫組織化學染色。未經治療的I2S γ/-小鼠之腦顯示神經元中溶小體存儲的明顯組織學證據，包括溶小體膜蛋白LIMP2的積累，以及包括GM3在內的神經節苷脂的二次儲存(圖5A至5J)。影像證實在所有劑量下都存在溶小體儲存減少，高劑量組動物與WT對照基本上相似(圖5A至5J)。在野生型，在未治療和經治療的MPS II小鼠中進行GM3-和LIMP2-陽性細胞的劑量依賴性減少的定量。在所有劑量下溶小體儲存顯著減少，高劑量組動物與WT對照基本上相似。經由減少的LIMP2和GM3染色證實，經治療的小鼠被證實在神經元儲存損傷之劑量依賴性降低(圖5K和5L)。
分析來自高劑量組(第21天)的MPS II小鼠中AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG的生物分佈。生物分佈數據證實腦組織被轉導(每二倍體基因體為1至10個GC)，及在所評估的所有外周組織，尤其是肝臟(圖3)。肝臟和CNS中的濃度在1至10GC/二倍體基因體之間；肺之濃度在0.1至1GC/二倍體基因體之間，而心臟和脾臟中的濃度小於0.1GC/二倍體基因體。
VIII. 結論
以高達3×1010GC(5.2×1010GC ddPCR)ICV投予AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG至C57BL/6I2Sγ/-(MPS II)小鼠中耐受性良好，無臨床症狀或死亡率，且造成分配至CNS以及外周組織，特別是肝臟，其顯示注射的病毒顆粒從CSF部分重新分佈至末梢血液中。
經由檢測載體和劑量依賴性增加的第21天之腦中和注射後3個月之CSF中的I2S活性來證明具有腦內有I2S基因表現的證據，酵素活性接近高劑量的野生型水平(腦組織)及相當至高於中高劑量的野生型(CSF)。具有溶小體隔室之劑量依賴性標準化，例如經由在注射後3個月時所有劑量的CNS中的LIMP2和GM3染色之減少所示。在經H & E染色的腦切片中，亦觀察到神經膠質空泡化的量和頻率以及兩性物質的神經元累積(MPS II CNS表型的指標)的劑量依賴性減少。對應於H & E染色切片中CNS溶小體含量的變化和疾病相關形態的改善，在長期記憶的一種測量(新物體識別)中有所改善，但在長期記憶的另一種測量，情境恐懼制約，則沒有改善。在NOR的改善中沒有明顯的劑量反應。MPS II小鼠在其他CNS功能測試、開放空間測試和Y型迷宮中的表現與野生型小鼠相當，因此在這些分析中未評估以載體治療之小鼠。
在注射後3個月時觀察到血清I2S活性的劑量依賴性增加，其水平可與(低劑量)或高於野生型(中/高劑量)相比。反映血清中I2S活性的標準化，MPS II小鼠在肝臟和心臟之己糖胺酶活性和GAG含量上具有劑量依賴性降低；分別將肝臟己糖胺酶及GAG水平在所有劑量水平均標準化以及心臟己糖胺酶和GAG活性在中和高劑量下標準化。高轉導的肝臟(每二倍體基因體為1至10個GC)可能充當血清中I2S分泌的貯庫器官和較高劑量的心臟交叉校正。
雖然在一些小鼠中觀察到與ICV投予程序本身相關的變化，但沒有證據表明腦中有與試驗物相關的毒性。對轉殖基因的體液免疫反應很小，僅在一些中等和高劑量動物中觀察到，但並不影響這些動物的健康或腦組織病理學。
總之，AAV9.CB7.CI.IDS.rBG在所有劑量水平的MPS II小鼠中都具有良好的耐受性，並造成I2S水平的劑量依賴性增加，這與MPS II的CNS和外周參數的改善相關。
投予的最低劑量，3×108GC(5.2×108GC ddPCR)，是本研究中的最小有效劑量。
實施例12-遞送基因治療載體至人類
AAV9.CB7.hIDS(含有人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶表現盒之重組腺相關病毒血清型9衣殼)。以單劑量腦池內(IC)投予遞送產物，將評估兩種劑量水平，1.3×1010基因體拷貝數(GC)/g腦質量(劑量1)及6.5×1010GC/g腦質量(劑量2)，投予的總劑量將基於年齡考量研究受試者之估計的腦尺寸，投予的產物總量將小於5mL。
主要目的：
●對於患有或預計患有嚴重MPS II的兒童受試者單一腦池內(IC)劑量投予後24週，評估AAV9.hIDS測試產物的安全性和耐受性。
次要目的：
●評估AAV9.hIDS測試產物的長期安全性和耐受性
●評估AAV9.hIDS測試產物對腦脊液(CSF)、血漿和 尿液中生物標誌的影響
●評估AAV9.hIDS測試產物對認知、行為和適應功能之神經發育參數的影響
●評估CSF、血漿和尿液中的載體排放
探究目的：
●評估AAV9.hIDS測試產物的免疫原性
●探討AAV9.hIDS測試產物對CNS生理變化的影響
●探討AAV9.hIDS測試產物對疾病全身表現的影響
●探討AAV9.hIDS測試產物對聽覺能力的影響
●探討在臨時停用IV ERT(ELAPRASE®)的受試者中AAV9.hIDS試驗產物對血漿和尿液中生物標誌的影響；
●探討AAV9.hIDS測試產物對生活質量和睡眠測量的影響
此為AAV9.hIDS測試產物的臨床I/II期，首次在人，多中心，開放標籤，單臂劑量遞增研究，不包括對照組。約6名預計患有嚴重MPS II的兒童受試者可錄取2種劑量同齡群，1.3×1010GC/g腦質量(劑量1)或6.5×1010GC/g腦質量(劑量2)，並將以IC注射接受單劑量AAV9.hIDS測試產品投予。安全性將是治療後最初24週(主要研究期)的主要焦點，在主要研究期結束後，受試者在以AAV9.hIDS測試產物治療後將繼續評估(安全性和有效性)長達104週。在研究結束時，受試者將被邀請參加長期的後續研究。
前3名符合條件的受試者將被納入劑量1同 齡群(1.3×1010GC/g腦質量)。AAV9.hIDS測試產品投予第一位受試者後，將有一個8週的安全觀察期。
潛在的受試者將在給藥前最多35天進行篩選，以確定研究的合格性。這些符合資格標準的受試者將在2天前至第1天早晨(根據機構慣例)入院，並在給藥前進行基線評估。受試者將在第1天接受單IC劑量的AAV9.hIDS，並將在給藥後於醫院停留約30-36小時觀察。主要研究期(即第24週)的後續評估將在第4週和第8週、第12週、第16週、第20週和第24週進行。在主要研究期後，訪視將在第28週、第32週、第40週、第48週、第52週、第56週、第64週、第78週和第104週。第12週、第40週和第64週的訪視可以由家庭健康護士執行。第20週和第28週的評估僅限於經由電話聯以繫評估AE和伴隨治療。
根據在動物中進行的臨床前安全性/毒理學研究中潛在免疫原性的發現，所有受試者最初將在研究中接受免疫抑制(IS)，並將包括皮質類固醇(甲基培尼皮質醇10mg/kg靜脈內[IV]第1天一次，及口服強體松，於第2天開始0.5mg/kg/日並逐漸減少且於第12週終止)、他克莫司(1mg每日二次[BID]，經口投予[PO]，第2天至第24週，目標血液水平4-8ng/mL且在第24週和第32週八週之間逐漸縮減)及西羅莫司(在2天前每4小時1mg/m2之加載劑量x3劑量，然後從1天前開始：西羅莫司0.5mg/m2/天分為BID給藥，目標血液水平為4-8ng/毫升直至第48週)。將進行神經系統評估及他克 莫司/西羅莫司的血液水平監測。
由於在發育中的兒童早期發生相對快速的腦生長，所以IC投予AAV9.hIDS的總劑量取決於不同年齡層的假設腦質量。研究受試者的年齡假設腦質量將基於所公佈的數據(Dekaban Ann Neurol.1978 Oct；4(4)：345-56(1978))。
端點： 主要端點：
●直到第24週的安全性：AE和嚴重不良事件(SAEs)次要端點：
●直到第104週的安全性：AE報告、實驗室評估、生命體徵、ECG、體格檢查和神經系統評估
●在CSF(GAGs，12S活性)，血漿(GAS，I2S活性)和尿液(GAGs)的生物標誌
●認知、行為和適應功能的神經發育參數：
○貝里嬰幼兒發展量表(3rdEdition(BSID-III)(Bayley 2005))或考夫曼兒童智力測驗(2nd Edition(KABC-II)(Kaufman 2004))
○文蘭德適應行為量表(2d Edition,Comprehensive Interview Form(VABS-II)(Sparrow et al 2005))
●藉由對AAV9.hIDS去氧核糖核酸(DNA)之定量聚合酶連鎖反應(PCR)，於CSF、血漿和尿液中之載體濃度
探究端點：
●免疫原性測量
○對於AAV9之中和抗體力價及對於CSF和血清中之I2S的結合抗體力價
○酵素連接免疫斑點(ELISPOT)分析：對AAV9和I2S的T細胞反應
○流式細胞法：AAV和I2S特異調節性T細胞
●經由大腦核磁共振成像(MRI)評估CNS結構異常
●藉由MRI和腹部超音波檢查評估肝臟和脾臟大小
●藉由聽覺腦幹反應(ABR)測試量測聽覺能力變化
●在臨時停用IV ERT(ELAPRASE®)的受試者之血漿和尿液總GAG、硫酸乙醯肝素和硫酸皮膚素
●PedsQL(第4版)
●睡眠量表的全球版約6名受試者將被錄取。
●3受試者在劑量1同齡群
●3受試者在劑量2同齡群
●IDMC可建議增加額外的受試者。
研究的總持續時間為給藥後104週，主要安全性評估時間點為24週，篩選可能需要長達35天。
在某些具體實施例中，關鍵入選標準包括：
●具有經量測血漿、纖維母細胞或白血球中的酵素活性確認MPS II的記錄診斷。
●為男性
Figure 107133321-A0202-12-0183-178
18月齡，符合以下標準之一：
○<6歲，且在篩選時神經認知評分測試
Figure 107133321-A0202-12-0183-179
77但高於評分下限(BSID-III或KABC-II)，或
○<6歲，且具有連續減弱>1標準差
○神經認知測試(BSID-III或KABC-II)，或
○篩選時<4歲，且符合以下兩個標準：
●完全刪除IDS或大量(即跨越
Figure 107133321-A0202-12-0184-180
1個外顯子)刪除/重排IDS基因，及
●兄弟姐妹被診斷患有攜帶相同的IDS突變的嚴重MPS II。
在某些具體實施例中，關鍵排除標準包括：
●具有IC注射的禁忌症
●具有IS的禁忌症
●具有腦室腹腔(VP)分流器
●具有造血幹細胞移植(HSCT)
●已接受經由鞘內(IT)投予艾杜硫酯酶[Elaprase®]
●篩選前3個月內
●在任何時候已接受IT艾杜硫酯酶[Elaprase®]，且經歷了與IT投予相關明顯AE，如果PI認為會使受試者處於不適當的風險之中
●已接受IV艾杜硫酯酶[ELAPRASE®]並出現嚴重的超敏反應，包括過敏反應，被認為與IV有關
●艾杜硫酯酶[ELAPRASE®]投予(如果目前接受IV艾杜硫酯酶且所需的劑量中斷或劑量療法不同於每週，則需要與醫療監控人員進行討論)
在某些具體實施例中，為了有資格參加本研究，受試者必須滿足以下所有入選標準：
1.受試者的法定監護人是否願意並且能夠在解釋研 究性質之後，以及在任何研究相關程序之前提供書面簽署的知情同意書。
2.為
Figure 107133321-A0202-12-0185-181
18月齡之男性
3.符合以下標準之一：a.具有MPS II的記錄診斷，且為
Figure 107133321-A0202-12-0185-182
4月齡至<5歲，且具有神經認知測試分數>55且
Figure 107133321-A0202-12-0185-183
77(BSID-III或KABC-II)，或b.具有MPS II的記錄診斷，且為
Figure 107133321-A0202-12-0185-184
4月齡且<5歲，且在順序神經認知測試(BSID-III或KABC-II)上具有
Figure 107133321-A0202-12-0185-185
1標準差的減弱且測試分數>55，或c.具有相關診斷為嚴重MPS II的人，其具有與受試者相同的IDS突變，且遺傳學家認為其遺傳了嚴重形式的MPS II
4.具有足夠的聽覺和視覺能力(有或沒有輔助工具)以完成所需的步驟準則測試，且在測試日符合佩戴該輔助(如果適用)
符合以下任何排除標準的受試者將無資格參加本研究：
5.具有IC注射的禁忌症，包括以下任何一種：
a.藉由參與研究的神經放射學家/神經外科醫生團隊(每個站點1人)審查之基線MRI測試顯示IC注射的禁忌症
b.基於參與研究的神經放射學家/神經外科醫生團隊對可得訊息的回顧，先前頭頸手術的病史導致IC注射的禁忌症
c.對電腦斷層掃描(CT)、造影劑或全身麻醉有任何禁忌症
d.對MRI或釓有任何禁忌症
6.e.已估計腎小球濾過率(eGFR)<30mL/min/1.73m2具有任何症狀禁用強體松、他克莫司或西羅莫司治療
7.具有不能歸因於MPS II的任何神經認知缺陷或神經精神症狀的診斷，PI可能會對研究結果的解釋產生混淆
8.具有任何腰椎穿刺的禁忌症
9.具有心室分流
10.已經歷造血幹細胞移植(HSCT)
11.先前已用基於AAV的基因治療產物治療
12.已接受經由鞘內(IT)投予艾杜硫酯酶[ELAPRASE®]
13.已接受艾杜硫酯酶[ELAPRASE®]IV並經歷嚴重過敏反應，包括被認為與IV艾杜硫酯酶投予相關的過敏性反應，如果要中斷目前接受IV艾杜硫酯酶和所需劑量，或劑量療法不同於每週，則需要與醫療監控人員進行討論。
14.在簽署知情同意書(ICF)之前第1天或5個半衰期之30天內接受任何研究產物，以較長者為準
15.具有任何淋巴瘤病史或皮膚鱗狀細胞癌或基底細胞癌以外的其他癌症病史，在篩選前至少3個月未完全緩解
16.具有血小板計數每微升(μL)<100,000
17.篩選時具有胺基轉移酶(ALT)或天冬胺酸胺基轉移酶(AST)>3×ULN或總膽紅素>1.5×ULN，除非受試者俱有以前已知的吉伯特氏徵候群的病史和分離膽紅素顯示結合膽紅素<35%總膽紅素
18.儘管經過最大程度的治療，但高血壓未受控制(收縮壓[BP]>180mmHg，舒張壓>100mmHg)
19.具有人類免疫缺陷病毒(HIV)或B型肝炎或C型肝炎病毒感染的病史，或B型肝炎表面抗原或B型肝炎核心抗體或C型肝炎或HIV抗體的篩檢試驗呈陽性
20.為臨床現場工作人員的一等親成員或參與研究的任何其他個人，或者是參與研究的臨床現場工作人員或其他個人
21.具有臨床意義的ECG異常，就PI的觀點，會影響受試者的安全性
22.具有嚴重或不穩定的醫學或心理症狀，就PI的觀點，會危及受試者的安全性或成功參與研究或研究結果的解釋
23.具有未受控制的癲癇，就PI的觀點，會使受試者處於不適當的風險之中與免疫抑制治療相關的排除標準：
24.對他克莫司、西羅莫司或強體松有過敏反應的病史
25.具有原發性免疫缺陷病史(例如，常見變異性免 疫缺陷徵候群)、脾切除或任何潛在症狀，使受試者易受感染
26.具有帶狀皰疹(VZV)、巨細胞病毒(CMV)或艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染，在篩選前至少12週尚未完全消退
27.具有任何需要住院治療或使用非腸胃道抗感染藥治療的感染，在訪視2前至少8週尚未解決
28.在訪視2前10天內具有任何主動感染需要口服抗感染藥(包括抗病毒藥)
29.篩選期間具有活動性結核病(TB)病史或Quantiferon-TB Gold測試呈陽性
30.在簽署ICF前8週內具有任何活菌疫苗接種
31.在研究期間簽署ICF或大型外科手術前8週內進行大手術
32.預計在錄取後6個月內需要進行腺樣體切除或扁桃腺切除
33.具有絕對嗜中性球計數<1.3×103/μL
34.具有任何PI認為不適合免疫抑制治療的情況或實驗室異常
(序列表之非關鍵詞文字)
以下訊息僅針對包含根據數字標識符<223>之非關鍵詞文字的序列。
Figure 107133321-A0202-12-0189-187
Figure 107133321-A0202-12-0190-13
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Figure 107133321-A0202-12-0192-15
Figure 107133321-A0202-12-0193-16
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Figure 107133321-A0202-12-0195-18
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本案中引用的所有出版物、專利和專利申請案，及美國臨時專利申請案62/573,841(2017年10月18日申請)、美國臨時專利申請案62/562,179(2017年9月22日申請)及美國臨時專利申請案62/561,769(2017年9月22日申請)及隨文提交之序列表，係藉由引用整體併入本文，如同每個單獨出版物或專利申請案被具體和單獨地指出藉由引用併入。儘管為了清楚理解的目的，已經由說明和實施例詳細描述前述發明，但是本領域具有通常知識者根據本發明的教示將容易明白，可在不脫離後附之申請專利範圍的精神或範圍的情況下對其進行某些變化和修正。
<110> 賓州大學委員會(THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA)
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<141> 2018-09-21
<150> US 62/573,841
<151> 2017-10-18
<150> US 62/562,179
<151> 2017-09-22
<150> US 62/561,769
<151> 2017-09-22
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1653)
<223> 人類IDS酵素
<400> 1
Figure 107133321-A0305-02-0200-6
Figure 107133321-A0202-12-0199-21
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Figure 107133321-A0202-12-0201-23
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
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Figure 107133321-A0202-12-0202-25
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<210> 3
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<223> CB7.CI.hIDS.RBG
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(131)
<223> 5' ITR
<220>
<221> 啟動子
<222> (199)..(580)
<223> CMV IE啟動子
<220>
<221> 啟動子
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<223> CB啟動子
<220>
<221> TATA_信號
<222> (837)..(840)
<220>
<221> 內含子
<222> (959)..(1930)
<223> 雞β-肌動蛋白內含子
<220>
<221> CDS
<222> (1937)..(3589)
<223> hIDS
<220>
<221> polyA_信號
<222> (3623)..(3749)
<223> 兔球蛋白polyA
<220>
<221> misc_feature
<222> (3838)..(3967)
<223> 3' ITR
<400> 3
Figure 107133321-A0202-12-0204-28
Figure 107133321-A0202-12-0205-29
Figure 107133321-A0202-12-0206-30
Figure 107133321-A0202-12-0207-31
Figure 107133321-A0202-12-0208-32
<210> 4
<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 4
Figure 107133321-A0202-12-0208-33
Figure 107133321-A0202-12-0209-34
Figure 107133321-A0202-12-0210-35
Figure 107133321-A0202-12-0211-36
<210> 5
<211> 4964
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CB6.hIDS.IRES.SUMF1
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(140)
<223> 5'ITR
<220>
<221> 增強子
<222> (208)..(589)
<223> CMV IE增強子
<220>
<221> 啟動子
<222> (600)..(859)
<223> CB啟動子
<220>
<221> TATA_信號
<222> (835)..(842)
<220>
<221> 內含子
<222> (976)..(1108)
<220>
<221> CDS
<222> (1177)..(2829)
<223> hIDS
<220>
<221> misc_feature
<222> (2830)..(3422)
<223> IRES
<220>
<221> CDS
<222> (3423)..(4547)
<223> hSUMF
<220>
<221> polyA_信號
<222> (4620)..(4746)
<223> 兔球蛋白polyA
<220>
<221> misc_feature
<222> (4835)..(4964)
<223> 3'ITR
<400> 5
Figure 107133321-A0202-12-0212-37
Figure 107133321-A0202-12-0213-38
Figure 107133321-A0202-12-0214-39
Figure 107133321-A0202-12-0215-40
Figure 107133321-A0202-12-0216-41
Figure 107133321-A0202-12-0217-42
Figure 107133321-A0202-12-0218-43
<210> 6
<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 6
Figure 107133321-A0202-12-0218-44
Figure 107133321-A0202-12-0219-45
Figure 107133321-A0202-12-0220-46
<210> 7
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 7
Figure 107133321-A0202-12-0220-47
Figure 107133321-A0202-12-0221-48
Figure 107133321-A0202-12-0222-49
<210> 8
<211> 4964
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CB6.hIDSco.IRES.hSUMF1co
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(140)
<223> 5'ITR
<220>
<221> 增強子
<222> (208)..(589)
<223> CMV IE增強子
<220>
<221> 啟動子
<222> (600)..(859)
<223> CB啟動子
<220>
<221> TATA_信號
<222> (835)..(842)
<220>
<221> 內含子
<222> (976)..(1108)
<220>
<221> CDS
<222> (1177)..(2829)
<223> hIDSco
<220>
<221> misc_feature
<222> (2830)..(3422)
<223> IRES
<220>
<221> CDS
<222> (3423)..(4553)
<223> hSUMF1co
<220>
<221> polyA_信號
<222> (4620)..(4746)
<223> 兔球蛋白polyA
<220>
<221> misc_feature
<222> (4835)..(4964)
<223> 3'ITR
<400> 8
Figure 107133321-A0202-12-0223-51
Figure 107133321-A0202-12-0224-52
Figure 107133321-A0202-12-0225-53
Figure 107133321-A0202-12-0226-54
Figure 107133321-A0202-12-0227-55
Figure 107133321-A0202-12-0228-56
Figure 107133321-A0202-12-0229-57
<210> 9
<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 9
Figure 107133321-A0202-12-0229-58
Figure 107133321-A0202-12-0230-59
Figure 107133321-A0202-12-0231-60
Figure 107133321-A0202-12-0232-61
<210> 10
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 10
Figure 107133321-A0202-12-0232-62
Figure 107133321-A0202-12-0233-63
Figure 107133321-A0202-12-0234-64
<210> 11
<211> 3967
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CB7.hIDSco.RBG
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(131)
<223> 5'ITR
<220>
<221> 啟動子
<222> (199)..(580)
<223> CMV IE啟動子
<220>
<221> 啟動子
<222> (583)..(864)
<223> CB啟動子
<220>
<221> TATA_信號
<222> (837)..(840)
<220>
<221> 內含子
<222> (959)..(1930)
<223> 雞β-肌動蛋白內含子
<220>
<221> CDS
<222> (1937)..(3589)
<223> hIDSco
<220>
<221> polyA_信號
<222> (3623)..(3749)
<223> 兔球蛋白polyA
<220>
<221> misc_feature
<222> (3838)..(3967)
<223> 3' ITR
<400> 11
Figure 107133321-A0202-12-0234-66
Figure 107133321-A0202-12-0235-67
Figure 107133321-A0202-12-0236-68
Figure 107133321-A0202-12-0237-69
Figure 107133321-A0202-12-0238-70
<210> 12
<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 12
Figure 107133321-A0202-12-0239-71
Figure 107133321-A0202-12-0240-72
Figure 107133321-A0202-12-0241-73
<210> 13
<211> 736
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> AAV9衣殼胺基酸序列
<400> 13
Figure 107133321-A0202-12-0241-74
Figure 107133321-A0202-12-0242-75
Figure 107133321-A0202-12-0243-76
Figure 107133321-A0202-12-0244-77
Figure 107133321-A0202-12-0245-78
<210> 14
<211> 3965
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CB7.CI.hIDS.RBG
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(131)
<223> 5'ITR
<220>
<221> 啟動子
<222> (199)..(580)
<223> CMV IE啟動子
<220>
<221> 啟動子
<222> (583)..(864)
<223> CB啟動子
<220>
<221> TATA_信號
<222> (837)..(840)
<220>
<221> 內含子
<222> (957)..(1928)
<223> 雞β-肌動蛋白內含子
<220>
<221> CDS
<222> (1935)..(3587)
<223> hIDS
<220>
<221> polyA_信號
<222> (3621)..(3747)
<223> 兔球蛋白polyA
<220>
<221> misc_feature
<222> (3836)..(3965)
<223> 3'ITR
<400> 14
Figure 107133321-A0202-12-0246-79
Figure 107133321-A0202-12-0247-80
Figure 107133321-A0202-12-0248-81
Figure 107133321-A0202-12-0249-82
<210> 15
<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構築體
<400> 15
Figure 107133321-A0202-12-0250-83
Figure 107133321-A0202-12-0251-84
Figure 107133321-A0202-12-0252-86
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
Figure 107133321-A0202-12-0252-87
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
Figure 107133321-A0202-12-0253-90
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
Figure 107133321-A0202-12-0253-93

Claims (18)

  1. 一種於治療人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(human iduronate-2-sulfatase，hIDS)缺乏症之治療方案中使用的組合，其中該組合包含複製缺陷型重組腺相關病毒(rAAV)之懸浮液及一免疫抑制方案，該免疫抑制方案包含至少一種第一免疫抑制劑及至少一種第二免疫抑制劑，其中：(a)該複製缺陷型重組腺相關病毒(rAAV)之懸浮液包含：(i)在AAV9衣殼中包含表現盒的rAAV，其中該表現盒包含具有SEQ ID NO：1之序列或與SEQ ID NO：1至少約95%相同之序列的核酸序列，該核酸序列在指導hIDS表現之調控序列控制下編碼人類艾杜醣醛酸-2-硫酸酯酶(hIDS)；其中該調控序列包含巨細胞病毒立即早期(CMV IE)增強子、雞β肌動蛋白啟動子、雞β肌動蛋白內含子、及兔β-球蛋白多聚腺苷酸化(polyA)訊息序列，及(ii)適於鞘內遞送、腦池內遞送、或腦室內遞送之調配物緩衝液，其包含生理上相容的水性緩衝液，及可選擇的表面活性劑和賦形劑；及(b)該至少一種第一免疫抑制劑為靜脈注射的皮質類固醇；及(c)該至少一種第二免疫抑制劑為口服的皮質類固 醇，(d)至少一種免疫抑制劑之投予係於rAAV遞送之前或同日開始；且(e)在rAAV投予後，持續投予至少一種免疫抑制劑至少8週。
  2. 如請求項1之使用的組合，其中該rAAV包含載體基因體，該載體基因體包含一核酸分子，該核酸分子包含AAV 5' ITR、表現盒、及AAV 3' ITR。
  3. 如請求項1之使用的組合，其中在給予rAAV後第48週停止該免疫抑制方案。
  4. 如請求項1之使用的組合，其中該懸浮液具有pH 6至9。
  5. 如請求項1之使用的組合，其中該懸浮液具有pH 6.8至7.8。
  6. 如請求項1之使用的組合，其中該rAAV經由鞘內注射而投予。
  7. 如請求項1之使用的組合，其中該rAAV以下列之劑量鞘內注射投予：(i)約1.3×1010GC/g腦質量，(ii)約1.9×1010GC/g腦質量，(iii)約6.5×1010GC/g腦質量，(iv)約9.4×1010GC/g腦質量，或(v)約4×1011GC/g腦質量。
  8. 如請求項1之使用的組合，其中該rAAV以約4×108GC/g腦質量至約4×1011GC/g腦質量之劑量鞘內注射 投予。
  9. 如請求項1之使用的組合，其中該rAAV以約1.9×1011GC/g腦質量至約5.6×1011GC/g腦質量之劑量鞘內注射投予。
  10. 如請求項1之使用的組合，其中於rAAV遞送之前，病患一開始靜脈預投予皮質類固醇，及/或其中於rAAV遞送後對病患口服投予皮質類固醇。
  11. 如請求項1之使用的組合，其中該方案進一步包含一種以上的免疫抑制劑，該免疫抑制劑為大環內酯，該大環內酯包含他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、或他克莫司與西羅莫司之組合。
  12. 如請求項11之使用的組合，其中第一劑大環內酯係在rAAV投予前遞送。
  13. 如請求項11之使用的組合，其中在rAAV遞送後遞送一種以上之包含他克莫司或西羅莫司、或他克莫司與西羅莫司之組合的大環內酯。
  14. 如請求項1之使用的組合，其中該病患已被診斷患有黏多醣病II(MPS II)或嚴重韓特氏徵候群。
  15. 如請求項1之使用的組合，其中該表現盒包含SEQ ID NO：14之核苷酸199至3747的核酸序列。
  16. 如請求項2之使用的組合，其中該rAAV具有選自下列之載體基因體：(a)SEQ ID NO：3；(b)SEQ ID NO：11；或(c)SEQ ID NO：14。
  17. 如請求項1之使用的組合，其中該水性懸浮液或該rAAV經由腦池內或腦室內注射投予。
  18. 如請求項17之使用的組合，其中該水性懸浮液或該rAAV經由注射被投予至腦大池(cisterna magna)內。
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