TW202102120A

TW202102120A - 具抗氧化與抑制前列腺癌細胞生長的半固態優格及其製備方法

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Publication number: TW202102120A
Application number: TW108125098A
Authority: TW
Inventors: 錢佑; 張灝; 丘錦朋; 杜英齊
Original assignee: 錢佑
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2021-01-16

Abstract

本發明揭露一種具抗氧化與抑制前列腺癌細胞生長的半固態優格及其製備方法，該半固態優格中不同品種的菌株利用動物乳汁製品於37℃至43℃發酵16小時至24小時而成，其具有良好的感官品評結果，並可加入醬汁配料、固態配料或固態水果配料，以提升整體食用的感官效果。半固態優格原液經過極性漸增的溶媒萃取，而在不同萃取物中鑑定出主量成分。半固態優格證實具有清除自由基、抗氧化、高還原力、抑制癌細胞生長之功效。

Description

具抗氧化與抑制前列腺癌細胞生長的半固態優格及其製備方法

本發明關於一種半固態優格及其製備方法。

腸-腦之間的雙向訊息網路稱為腸-腦軸(gut-brain axis)，後來又發現腸道的共生菌群對此腸-腦軸具有貢獻，三者互相影響，因此成為共生菌-腸-腦軸(microbiota-gut-brain axis)。美國國家精神衛生研究院(NIMH)於2013年啟動探索腸道微生物群-大腦交流機制的特別計畫，目的為開發抗精神疾病的新藥以及非侵入性治療方法。從那時起，共生菌-腸-腦軸的相關研究如雨後春筍般展開，成為神經科學研究之焦點，主軸為探討腸道微生物群與大腦之間的相互作用。腸道微生物群透過神經網路、神經內分泌系統及免疫系統對大腦產生重要影響，而人體行為的擾動也會改變腸道微生物群的組成。文獻已報導共生菌-腸-腦軸的相互平衡關係，並證實與多種疾病相關，例如：發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)、胃腸道癌症、膽石症、行為障礙、焦慮、憂鬱、慢性疲勞症候群(chronic fatigue syndrome,CFS)、肝性腦病變(hepatic encephalopathy)、過敏、肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化等。在癌症化療及手術後的照護上，人體臨床研究已報導藉由調控腸道微生物群的組成能改善乳癌患者的心肺健康及降低癌症復發恐懼(fear of cancer recurrence)。

目前，西醫及中醫體系正積極發展、或結合共生菌-腸-腦軸的研究進行藥物開發、疾病治療及其作用機轉的研究；而另一醫療系統-阿育吠陀(Ayurveda)使用大量薑黃於改善消化道不適、神經保護、預防阿茲海默症，其多樣性的功效也與腸-腦軸有相關。但由於飲食習慣不同，薑黃的使用有區域性的限制，主要在印度。

在西醫體系中，利用共生菌-腸-腦軸研究進行藥物開發稱之為微生態藥物，其係指利用正常微生物或調節微生物正常生長的物質所製成的藥物製劑。可應用於感染、糖尿病、腫瘤、發炎疾病、免疫相關疾病等適應症。微生態藥物包括：活體生物藥(live biotherapeutic product,LBP)、小分子微生態調節劑(small molecule microbiome modulator,SMMM)、糞菌移植(fecal microbiota transplant,FMT)。其中，LBP係指透過對人體微生物的鑑定、篩選及組合而明確控制菌體種類及數量，針對不同適應症採用不同菌體種類、數量及其組合來確保用藥的安全性及有效性。然而，美國食品藥物管理局(FDA)至今尚未批准任何LBP上市，只在2016年發佈LBP的早期臨床試驗指南，使得LBP的開發具有明確標準。SMMM係指能夠選擇性促進宿主腸道的一或多種有益細菌生長繁殖的物質，藉由影響菌體的生長繁殖達成治療目的。目前已知的SMMM藥物開發只到臨床二期。FMT則是指將健康人體糞便的功能菌群移植至患者胃腸道，重建患者的腸道菌群，以進行腸道及腸道外疾病的治療。雖然美國已於2013年將FMT列入復發性困難梭狀桿菌感染(Clostridium difficile infection)的治療指南，但不同國家的政策差異大，FMT目前缺乏統一及有效的監管。整體而言，微生態藥物的臨床試驗進展不如預期，目前尚無批准上市的微生態藥物。另一問題是微生態藥物的臨床試驗人數相對較少，藥物療效的人體驗證仍不如預期。

中醫體系並非利用共生菌-腸-腦軸研究開發藥物，而是研究中藥與腸道微生物群的相互作用。中藥對於腸道微生物群的調節作用例如：含有多醣的補益類中藥對於益菌及病原菌具有扶植作用，但對於益菌的扶植效果明顯優於病原菌，而生長良好的益菌所產生的代謝物又間接抑制病原菌生長。例如，黨參多醣在體外可促進雙歧桿菌生長，進而增加乙酸代謝，增強雙歧桿菌的定殖抗性(colonization resistance)。腸道微生物群對於中藥的代謝作用例如：目前已證實許多中藥成分只有經過腸道微生物群的代謝才產生藥效成分而達到治療效果。例如，黃芩所含的黃芩苷(baicalin)在腸道內難以被直接吸收，只有被腸道微生物群水解為黃芩素(baicalein)才能被吸收進入血液而發揮作用。人體臨床試驗證實，葛根芩連湯可藉由改變腸道微生物群治療第二型糖尿病。整體而言，共生菌-腸-腦軸的中藥研究提供了西方醫學可接受的作用機轉解釋，但仍無法改善中藥因劑量太高、治療時間太長而導致服藥順從性(drug compliance)及服藥依順性(medication adherence)皆低的老問題。

上述西醫、中醫及阿育吠陀醫療系統對於共生菌-腸-腦軸的研究與開發著重在疾病、藥物及治療。整體而言，這些發展仍處於萌芽期，尚未具有產業上成功案例或具規模的量產。因此，仍須開發新穎可應用於共生菌-腸-腦軸的產品及技術，以達生物醫學的功效。

本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨的精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案的簡要說明。

本發明之目的為提供一種半固態優格，包括：動物乳汁製品及複數菌粉，動物乳汁製品包括水及動物乳汁，複數菌粉與動物乳汁製品相混合，其中複數菌粉來自於對應的複數種菌株，複數種菌株包括：比菲德氏菌(Bifidobacterium bifidum)、嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis)、雷特氏雙岐桿菌(Bifidobacterium lactis)、長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)以及鼠李糖桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。

本發明之另一目的為提供一種前述半固態優格原液的分離方法，包括：冷凍乾燥該半固態優格原液，獲得粉狀產物；以正己烷萃取粉狀產物，獲得正己烷萃取物及第一殘留物，其中正己烷萃取物的主量成分為具有雙鍵及氫氧基的短鏈脂肪酸；以乙酸乙酯萃取第一殘留物，獲得乙酸乙酯萃取物及第二殘留物，其中乙酸乙酯萃取物的主量成分為糖脂；以乙醇萃取第二殘留物，獲得乙醇萃取物及第三殘留物，其中乙醇萃取物的主量成分包括雙醣及寡醣；以及以水萃取第三殘留物，獲得水萃取物及第四殘留物，其中水萃取物的主量成分包括多醣、醣蛋白以及蛋白質。

本發明的另一目的為提供一種將前述半固態優格用於抑制癌細胞生長的用途，其中癌細胞為前列腺癌細胞。

本文用語「動物乳汁製品」大體上包括水及動物乳汁，動物乳汁可以液態形式存在，或是經巴斯德滅菌法而乾燥為粉末形式，且動物乳汁的來源可為人乳、牛乳或羊奶等。

本文的各種細菌菌株及癌症細胞株均可透過市售方式取得，並無須進行生物材料寄存。本文的半固態優格在冷藏及室溫環境下為半固態，粘度範圍為1500-2500cP。本文半固態優格中的菌株在37℃至43℃的溫度及16小時至24小時的發酵時間呈現不等的發酵結果。

3‧‧‧分離方法

12‧‧‧優格原液

14‧‧‧粉狀產物

16‧‧‧正己烷萃取物

18‧‧‧第一殘留物

20‧‧‧乙酸乙酯萃取物

22‧‧‧第二殘留物

24‧‧‧乙醇萃取物

26‧‧‧第三殘留物

28‧‧‧水萃取物

30‧‧‧第四殘留物

第1圖為菌種代號LR-36的16S rDNA定序結果及NCBI比對結果，為鼠李糖桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。

第2圖為菌種代號LPL-68的16S rDNA定序結果及NCBI比對結果，為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。

第3圖(A)為菌種代號UY-58的顯微照片。為革蘭氏陽性桿菌，不具觸酶、氧化酶及運動性，不會產生內生孢子，於好氧及厭氧環境下皆會生長。

第3圖(B)為菌種代號UY-58的16S rDNA定序結果。最接近發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)，相似性為99.9%。

第4圖(A)為菌種代號UY-76的顯微照片。為革蘭氏陽性桿菌，不具觸酶、氧化酶及運動性，不會產生內生孢子，於好氧及厭氧環境下皆會生長。

第4圖(B)為菌種代號UY-76的16S rDNA定序結果。最接近瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，相似性為100%。

第5圖為分離方法3的流程圖。

第6圖(A)為優格11正己烷萃取物(11-H)的¹H-NMR圖譜。

第6圖(B)為優格11乙酸乙酯萃取物(11-E)的¹H-NMR圖譜。

第6圖(C)為優格11乙醇萃取物(11-A)的¹H-NMR圖譜。

第6圖(D)為優格11水萃取物(11-W)的¹H-NMR圖譜。

第7圖(A)為優格12正己烷萃取物(12-H)的¹H-NMR圖譜。

第7圖(B)為優格12乙酸乙酯萃取物(12-E)的¹H-NMR圖譜。

第7圖(C)為優格12乙醇萃取物(12-A)的¹H-NMR圖譜。

第7圖(D)為優格12水萃取物(12-W)的¹H-NMR圖譜。

第8圖(A)為優格13正己烷萃取物(13-H)的¹H-NMR圖譜。

第8圖(B)為優格13乙酸乙酯萃取物(13-E)的¹H-NMR圖譜。

第8圖(C)為優格13乙醇萃取物(13-A)的¹H-NMR圖譜。

第8圖(D)為優格13水萃取物(13-W)的¹H-NMR圖譜。

第9圖(A)為優格14正己烷萃取物(14-H)的¹H-NMR圖譜。

第9圖(B)為優格14乙酸乙酯萃取物(14-E)的¹H-NMR圖譜。

第9圖(C)為優格14乙醇萃取物(14-A)的¹H-NMR圖譜。

第9圖(D)為優格14水萃取物(14-W)的¹H-NMR圖譜。

第10圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的總多酚含量分析柱狀圖。

第11圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的總flavanone類黃酮含量分析柱狀圖。

第12圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的總多醣含量分析柱狀圖。

第13圖為優格11經分離方法3所獲得各萃取物在203nm波長的HPLC圖譜。

第14圖為優格12經分離方法3所獲得各萃取物在203nm波長的HPLC圖譜。

第15圖為優格13經分離方法3所獲得各萃取物在203nm波長的HPLC圖譜。

第16圖為優格14經分離方法3所獲得各萃取物在203nm波長的HPLC圖譜。

第17圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的DPPH自由基清除率柱狀圖。

第18圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的總抗氧化能力-ABTS自由基清除率柱狀圖。

第19圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的還原力測定柱狀圖。

第20圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的血癌細胞存活抑制率柱狀圖。

第21圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的腦癌細胞存活抑制率柱狀圖。

第22圖為優格飲品11至14經分離方法3所獲得各萃取物的胃癌細胞存活抑制率柱狀圖。

第23圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的大腸癌細胞存活抑制率柱狀圖。

第24圖為優格11至14經分離方法3所獲得各萃取物的前列腺癌細胞存活抑制率柱狀圖。

本發明的上述目的及優點在參閱以下詳細說明及附圖之後對那些所屬技術領域中具有通常知識者將變得更立即地顯而易見。

本發明將優格的活性代謝物進行活性導引分離，確定活性成分並調製成適合口服的半固態食品或藥劑，且仍保持成分的功效。

實驗1、菌種的分離與鑑定：

取1ml的生牛乳作為樣品，以乳酸桿菌MRS培養基(Lactobacilli MRS Broth)作為稀釋液進行10倍連續稀釋(濃度倍數分別為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)，分別取200μl稀釋物滴於無菌MRS洋菜培養基，再進行塗盤。將培養皿置於37℃厭氧培養箱培養24小時。之後無菌挑選型態、顏色、大小不同的單一菌落繼續培養，並反覆挑選菌落及培養以分離菌種，確定培養皿上的菌落皆為相同形態、顏色、大小。最後將分離的單一菌株進行菌種保存及鑑定。優格菌種的鑑定係先以肉眼觀察培養皿上為單一菌落，再挑選二個相同菌落進行格蘭氏染色，確定為格蘭氏陽性或陰性菌。較佳地是以相位差顯微鏡於4及40倍倍數下觀察菌落。挑選單一菌落進行DNA萃取及16S PCR試驗，以NCBI資料庫比對序列，由其結果完成鑑定。

如第1及2圖所示，菌種代號LR-36以及LPL-68經16S rDNA定序及NCBI比對後，其分別為鼠李糖桿菌(Lactobacillus rhamnosus)以及植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。此外，如第3圖(A)、第3圖(B) 及表1所示，菌種代號UY-58經顯微鏡觀察鑑定、DNA萃取、16S rDNA定序(SEQ ID NO：1)、API 50 CHL鑑定，確認為革蘭氏陽性菌，且最接近發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum，相似性為99.9%)。第4圖(A)及第4圖(B)為菌種代號UY-76經顯微鏡觀察鑑定、DNA萃取、16S rDNA定序(SEQ ID NO：2)、API 50 CHL鑑定，確認為革蘭氏陽性桿菌，且最接近瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus，相似性為100%)。

經過分離、鑑定，共取得20株菌種，依拉丁文名稱順序排列如表3所示。

實驗2、優格的發酵製備：

本發明發酵製備實驗的設計模型是以菌種種類及比例、發酵溫度、及發酵時間為操縱變因，發酵後以黏度、酸鹼值(pH)為品管標準。優格黏度在100釐泊(cP)以下、pH值5.0以上判定為未發酵或發酵不完全，發酵時間過長(超過12小時)的實驗組因考量生產效率不佳也被淘汰。實驗2的製備方法為：將250ml之75℃熱水加入36g奶粉進行高溫殺菌，成為動物乳汁製品。待其冷卻至35~43℃，加入0.3g菌粉。再分別置於不同溫度(37℃、40℃、43℃)培養箱反應不同時間(8小時、10小時、12小時)，之後測量黏度(Brookfield DVE RV黏度計)與pH值(Milwaukee pH600酸鹼度計)。表4為14組成功發酵的菌種組合所含之菌株。

結果發現，不同奶粉對於是否能成功發酵的影響不大；菌種種類之間的重量比例對於發酵結果影響亦不大。因此，各實驗組別菌種種類之間的(菌粉)重量比例皆為1：1，而菌種種類越多表明具有越容易成功發酵的趨勢，亦即菌種種類越多，成功發酵的實驗再現性越高。接著，以成功發酵再現性最高的4組(表4的菌種組合11至14)進行3重複實驗，確認不同菌種組合的最佳發酵條件(即，能在最短發酵時間內達到最高黏度與最低pH值)，優格黏度高於100cp、pH值低於5.0時，判定為發酵完全。實驗結果如表5所示。

菌種組合11至14發酵製備的3重複實驗結果顯示：

菌種組合11：發酵溫度固定為37℃，發酵時間需12小時才能發酵完全；發酵溫度固定為40℃，發酵時間10小時能發酵完全，發酵時間8、12小時無法發酵完全；發酵溫度固定為43℃，發酵時間10、12小時能發酵完全，發酵時間越長黏度越高、pH值越低。發酵時間固定為8小時，發酵溫度37、40、43℃皆無法發酵完全；發酵時間固定為10小時，發酵溫度40、43℃能發酵完全，發酵溫度越高黏度越低、pH值越高；發酵時間固定為12小時，發酵溫度37、43℃能發酵完全。

菌種組合12：發酵溫度固定為37℃，發酵時間10、12小時皆能發酵完全，發酵時間越長黏度越高、pH值越低；發酵溫度固定為40℃，發酵時間8、10、12小時皆能發酵完全，發酵時間越長黏度越高、pH值越低；發酵溫度固定為43℃，發酵時間8、10、12小時皆能發酵完全，發酵時間越長黏度先低後高、pH值越低。發酵時間固定為8小時，發酵溫度40、43℃能發酵完全，發酵溫度越高黏度越低、pH值越高；發酵時間固定為10小時，發酵溫度37、40、43℃皆能發酵完全，發酵溫度越高黏度先高後低、pH值先低後高；發酵時間固定為12小時，發酵溫度37、40、43℃皆能發酵完全，發酵溫度越高黏度先高後低、pH值先低後高。

菌種組合13：發酵溫度固定為37℃，發酵時間8、10、12小時皆能發酵完全，發酵時間越長黏度越高、pH值越低；發酵溫度固定為 40℃，發酵時間8、10、12小時皆能發酵完全，發酵時間越長黏度越高、pH值越低；發酵溫度固定為43℃，發酵時間8、10、12小時皆能發酵完全，發酵時間越長黏度先低後高、pH值越低。發酵時間固定為8小時，發酵溫度37、40、43℃皆能發酵完全，發酵溫度越高黏度越高、pH值越低；發酵時間固定為10小時，發酵溫度37、40、43℃皆能發酵完全，發酵溫度越高黏度先高後低、pH值先低後高；發酵時間固定為12小時，發酵溫度37、40、43℃皆能發酵完全，發酵溫度越高黏度先低後高、pH值先低後不變。

菌種組合14：發酵溫度固定為37℃，發酵時間8、10、12小時皆能發酵完全，發酵時間越長黏度越高、pH值越低；發酵溫度固定為40℃，發酵時間8、10、12小時皆能發酵完全，發酵時間越長黏度越高、pH值越低；發酵溫度固定為43℃，發酵時間8、10、12小時皆能發酵完全，發酵時間越長黏度越高、pH值不變。發酵時間固定為8小時，發酵溫度37、40、43℃皆能發酵完全，發酵溫度越高黏度先低後高、pH值越低；發酵時間固定為10小時，發酵溫度37、40、43℃皆能發酵完全，發酵溫度越高黏度先高後低、pH值先低後不變；發酵時間固定為12小時，發酵溫度37、40、43℃皆能發酵完全，發酵溫度越高黏度先高後低、pH值先低後高。

實驗3、優格的感官品評：

優格對於維持身體健康具有多樣性的功效。例如，實驗證實，長期食用優格能有效降低總膽固醇以及總膽固醇與高密度脂蛋白膽固醇之比例；高膽固醇血症患者食用含嗜酸乳桿菌的優格能降低血清膽固醇；高膽固醇血症患者食用含嗜酸乳桿菌及長雙歧桿菌的優格可增加高密度膽固醇；長期食用優格可有效降低罹患糖尿病的風險；食用優格還能預防心血管疾病。因此，長期食用足夠量的優格方能達到維持身體健康功效。

為了達成上述目標，本發明將菌種組合1至14發酵製備為優格1至14，並進行感官品評(sensory evaluation)的分析、篩選。感官品評為美國食品科技學會定義及發展出的評判基準，其應用視、嗅、嚐三種感覺來測量優格的特性。感官品評的實驗設計包括：感官分析方法總論(ISO 6658：2005)、感官品評字彙(ISO 5492：2008)、顏色感官檢驗(目視比色：ISO 11037：1999)、質地感官檢驗(質地剖面：ISO 11036：1994)、風味感官檢驗(風味剖面：ISO 6564：1985)、描述分析(感官特性的定性描述：ISO 11035：1994、感官特性強度的評估：ISO 4121：2003)。實驗方法則採用描述分析法(descriptive analysis)、順位評分法(ranking method)及喜好評分法(hedonic scale)進行評鑑。

1.以描述分析法進行優格1至14的評鑑：

此是召集具有發酵產品開發、發酵乳製品開發、優格產品開發實務經驗之高感官敏銳性品評員11人進行實驗，其中男性5名、女性6名，以會議討論方式進行品評，判斷優格間外觀、質地、風味上的差異性，最後以視(色澤、乾淨度)、嗅(奶香、香氣、氣味獨特性)、嚐(酸度、甜度、滑順度、醇厚度)、以及整體喜好(風味表現、後韻)描述差異性狀，採喜好度五分評分法(1分：非常不喜歡，2分：不喜歡，3分：不喜歡也不討厭，4分：喜歡，5分：非常喜歡)進行評價。實驗結果如表6所述。

2.以順位評分法進行優格1至14的評鑑：

品評員的人數、性別如上所述，品評員依其喜好程度將優格1至14區分為3個等級(喜好等級高、中、低)，每個等級再依喜好程度最高至低由左至右排列。結果如表7所述。

3.以喜好評分法進行優格11至14的評鑑：

將順位評分法喜好等級高的優格11至14再以喜好評分法確認是否有顯著性差異、了解喜好程度與產品特性關係，以消費者問卷調查方式進行，採喜好度五分評分法(1分：非常不喜歡，2分：不喜歡，3分：不喜歡也不討厭，4分：喜歡，5分：非常喜歡)進行評分。也針對香氣、甜味、酸味，以五分制(1分：太淡，2分：淡，3分：適中，4分：濃，5分：太濃)進行紀錄，分數越接近3分越佳。

第1次消費者問卷調查於百貨公司商店街舉行，此在不受外界環境干擾、彼此不互相影響下進行。品評對象為未經訓練之消費者共67人，其中男性24人(35.8%)、女性43人(64.2%)。年齡分布為：未滿20歲25人(37.3%)、20-29歲21人(31.3%)、30-39歲13人(19.4%)、40-49歲3人(4.5%)、50-59歲4人(6%)、60歲以上1人(1.5%)。前三大職業分佈為：學生30人(44.8%)、服務業17人(25.4%)、軍公教5人(7.4%)，其餘15人(22.4%)。

第2次消費者問卷調查於大學學區舉行，此亦在不受外界環境干擾、彼此不互相影響下進行。品評對象為未經訓練之消費者共69人，其中男性31人(44.9%)、女性38人(55.1%)。年齡分佈為：18-22歲50人(72.5%)、23-30歲15人(21.8%)、未滿18歲4人(5.8%)。職業分佈皆為學生(69人，100%)。

綜合第1次及第2次消費者問卷調查結果，參與總人數為136人。請參閱表8，整體喜好程度以優格14最佳，分數為大於4分的喜歡；其次為優格12；優格11、13的分數相近，分數皆大於3分的不喜歡也不討厭。此外，優格11、12、13及14被全部136位消費者評定為最喜好(第一順位)之優格的人數分別為32、38、31及35人。

在純天然、未加入任何調味料的製程下，優格11至14的香氣差異不大，都稍微偏淡；優格11至14的甜味皆適中；優格11至14的酸味差異不大，都稍微偏淡(如表9結果所示)。

實驗4、優格萃取物的製備：

優格活性代謝物的種類及含量受菌種、配方、發酵環境而有所差異。為了確定本發明的優格的活性成分，選擇感官品評喜好等級高的優格11至14進行萃取及分配萃取，將獲得的劃分層再進行成分分析及活性測試。

1.分離方法1：

將優格原液以加熱減壓濃縮進行乾燥，獲得膏狀物。再以乙醇連續萃取膏狀物3次，獲得乙醇萃取物。將該乙醇萃取物真空過濾，並加熱、減壓濃縮，獲得粗萃取物。再以乙酸乙酯：水(1：1(v/v))對粗萃取物進行分配萃取。但粗萃取物乳化層太多，導致分離效果不佳，無法進行後續分離實驗。若改以二氯甲烷：水(1：1(v/v))對粗萃取物進行分配萃取，仍有乳化層太多的問題。

2.分離方法2：

將優格原液不經乾燥，而是加水(1：1(v/v))稀釋，再加入乙酸乙酯(1：1(v/v))進行分配萃取，仍產生大量乳化層，導致分離效果不佳。若改為加入二氯甲烷(1：1(v/v))或者正丁醇(1：1(v/v))進行分配萃取，仍有乳化層太多的問題。

3.分離方法3：

將優格原液進行冷凍乾燥，獲得粉狀產物，再將粉狀產物以極性漸增的溶媒依序進行萃取。發現二氯甲烷的萃取率太低、和正己烷的萃取效果無顯著差異，以正丁醇萃取後有溶媒殘留的問題、難接續後續的溶媒萃取，故二氯甲烷、正丁醇皆不適合作為此分離方法的萃取溶媒。

如第5圖所示的分離方法3，經溶媒排列組合萃取試驗後，最後以正己烷、乙酸乙酯、乙醇及水依序進行萃取。亦即，優格原液12進行冷凍乾燥，獲得粉狀產物14，再以正己烷萃取粉狀產物14，獲得正己烷萃取物16(樣品代號：11-H、12-H、13-H、14-H)及第一殘留物18。接著，以乙酸乙酯萃取第一殘留物18，獲得乙酸乙酯萃取物20(樣品代號：11-E、12-E、13-E、14-E)及第二殘留物22。之後，以乙醇萃取第二殘留物22，獲得乙醇萃取物24(樣品代號：11-A、12-A、13-A、14-A)及第三殘留物26。最後，再以水萃取第三殘留物26，獲得水萃取物28(樣品代號：11-W、 12-W、13-W、14-W)及第四殘留物30。萃取物及殘留物並得各自進行加熱減壓濃縮。優格11至14的各種萃取物的實驗結果如表10所示。表10顯示：此分離方法能克服液態-液態分配萃取產生乳化層的問題，將優格的各類活性成分分離、濃縮集中收集，並得以視覺、嗅覺明顯確認各種萃取物在外觀性狀、風味上的差異。

實驗5、優格萃取物的成分分析：

1.核磁共振光譜(NMR)分析：

優格11至14經分離方法3獲得16個萃取物，將這些萃取物進行NMR分析，以氫的同位素(氘)溶劑：CDCl₃、acetone-d6、MeOH-d4、C₅D₅N、DMSO-d6及D₂O測試萃取物的溶解度，結果發現C₅D₅N、DMSO-d6對於16個萃取物皆有較佳的溶解度。在¹H-NMR預實驗中發現C₅D₅N的溶媒訊號會遮蔽萃取物的訊號，最後選擇DMSO-d6作為NMR分析的溶劑，萃取物的濃度為25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml及100mg/ml。發現正己烷萃取物(11-H、12-H、13-H、14-H)、乙酸乙酯萃取物(11-E、12-E、13-E、14-E)、乙醇萃取物(樣品代號：11-A、12-A、13-A、14-A)在50mg/ml時的¹H-NMR圖譜顯示出最佳磁場及特徵訊號，水萃取物(11-W、12-W、13-W、14-W)的最佳樣品濃度為25mg/ml。正己烷萃取物(11-H、12-H、13-H、14-H)及乙酸乙酯萃取物(11-E、12-E、13-E、14-E)在加入DMSO-d6後、測試前，加熱至37~40℃能再提高樣品溶解度、進而優化¹H-NMR圖譜的特徵訊號。以核磁共振光譜儀JEOL ECS 400MHz FT-NMR進行實驗，解析度為400MHz，化學位移以ppm(δ)表示，偶合常數(coupling constants)以Hertz(J)表示。如第6圖(A)至第9圖(D)的16個萃取物的¹H-NMR圖譜及表11的16個萃取物的NMR訊號分析及主量成分判定所示，正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、乙醇萃取物、水萃取物的NMR特徵訊號及主量成分皆不相同，優格飲品11至14之間的NMR訊號亦有所差異。

2.總多酚(total polyphenol)含量分析：

優格11至14經分離方法3獲得16個萃取物，將這些萃取物以Folin-Ciocalteu比色法進行分析，其原理為Folin-Ciocalteu試劑中的磷鎢酸(phosphotungstic acid)及磷鉬酸(phosphomolybdic acid)被多酚類分子氧化呈色，並以没食子酸(gallic acid)作為標準品。實驗方法為：以甲醇溶解没食子酸(5mg/mL)後，製成50、100、250及500μg/mL的標準品，各取20μL標準品以二次水將體積補充至1.6mL，接著加入100μL的2N Folin-Ciocalteu試劑、再加入300μL的20% Na₂CO₃後並混合，在40℃反應40分鐘，於725nm下測定吸光值。此外另以二次水代替標準品，進行歸零。以濃度及吸光值之關係繪製標準曲線。20μL的待測樣品(1mg/mL)以相同方式處理，依標準曲線計算每克萃取物中總多酚類含量。如表12及第10圖所示的總多酚含量，優格11的萃取物中，11-E含量最高，11-W最低；優格12的萃取物中，12-A含量最高，12-W最低；優格13的萃取物中，13-H含量最高，13-W最低；優格14的萃取物中，14-E含量最高，14-W最低。綜合16個萃取物，14-E的總多酚含量最高，11-W最低。4個正己烷萃取物(11-H至14-H)中，總多酚含量範圍為18.2~24.0mg_{Gallic acid}/g。4個乙酸乙酯萃取物(11-E至14-E)中，總多酚含量範圍為9.4~40.6mg_{Gallic acid}/g。4個乙醇萃取物(11-A至14-A)中，總多酚含量範圍為11.3~28.3mg_{Gallic acid}/g。4個水萃取物(11-W至14-W)中，總多酚含量範圍為2.6~7.1mg_{Gallic acid}/g。

3.總flavanone類黃酮含量分析：

原理為2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNP)會針對黃烷酮(flavanone)結構上的醛基或酮基進行衍生化，使其在特定波長下具有吸光特性，並以橙皮素(hesperetin)為標準品。實驗方法為：將1mL待測樣品加入2mL的DNP溶液及2mL甲醇，置於50℃水浴加熱50分鐘。冷卻後加入5mL的KOH甲醇溶液混合，室溫下靜置2分鐘，再將1mL混合溶液裝至含5mL甲醇的離心瓶，振盪後以1108×g離心10分鐘。過濾後的上清液以甲醇定量至25mL，並在波長494nm測定吸光值。測定之吸光值與標準品的標準曲線對照定量，換算成每克萃取物之flavanone類黃酮含量。如表12及第11圖所示的總flavanone類黃酮測定結果，優格11的萃取物中，11-A含量最高，11-E最低；優格12的萃取物中，12-A含量最高，12-H最低；優格13的萃取物中，13-A含量最高，13-H最低；優格14的萃取物中，14-A含量最高，14-H最低。綜合16個萃取物，12-A的總flavanone類黃酮含量最高，12-H最低。4個正己烷萃取物(11-H至14-H)中，總flavanone類黃酮含量範圍為15.0~23.1mg_Hesperetin/g。4個乙酸乙酯萃取物(11-E至14-E)中，總flavanone類黃酮含量範圍為16.0~26.0mg_Hesperetin/g。4個乙醇萃取物(11-A至14-A)中，總flavanone類黃酮含量範圍為62.5~91.3mg_Hesperetin/g。4個水萃取物(11-W至14-W)中，總flavanone類黃酮含量範圍為28.2~49.5mg_Hesperetin/g。

4.總多醣含量分析：

此分析是以苯酚-硫酸法(phenol-sulfuric acid assay)進行，原理為五碳糖及六碳糖在酸性、高溫的條件下會因脫水作用分解成喃甲醛(furfural)，喃甲醛進一步與酚反應生成橘黃色產物，以吸光值變化換算出總多醣含量，並以0、10、20、30、40、50μg/ml葡萄糖為標準品。實驗方法為：將0.5mL的5%酚溶液加入0.5mL的10mg/mL待測品，再加入2.5mL濃硫酸混合均勻，於100℃水浴反應20分鐘，溫度冷卻後以490nm波長測定吸光值。如表12及第12圖所示的總多醣測定結果，優格11的萃取物中，11-W含量最高，11-H最低；優格12的萃取物中，12-W含量最高，12-E最低；優格13的萃取物中，13-W含量最高，13-H最低；優格14的萃取物中，14-W含量最高，14-H最低。綜合16個萃取物，14-W的總多醣含量最高，14-H最低。4個正己烷萃取物(11-H至14-H)的總多醣含量範圍為7.6~11.2mg_Glucose/g。4個乙酸乙酯萃取物(11-E至14-E)的總多醣含量範圍為9.7~18.4mg_Glucose/g。4個乙醇萃取物(11-A至14-A)的總多醣含量範圍為223.2~249.4mg_Glucose/g。4個水萃取物(11-W至14-W)的總多醣含量範圍為414.4~494.1mg_Glucose/g。

5.薄層層析(TLC)分析：

參照台灣中藥典(第二版)中常用的正相薄層層析法進行分析，溶媒系統以離子性溶媒系統(正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇)或非離子性溶媒系統(正己烷、甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲醇)、以及加酸(冰醋酸(GAA)、甲酸(FA))或加鹼(10%氨、25%氨、二乙胺)搭配進行測試。如表13所示，正己烷萃取物及乙酸乙酯萃取物(11-H、11-E、12-H、12-E、13-H、13-E、14-H、14-E)的極性較為相近，TLC主要斑點能在同一溶媒系統具有良好的分析效果。乙醇萃取物(11-A至14-A)及水萃取物(11-W至14-W)在正相薄層層析中皆無理想的分析效果，TLC主要斑點未能存在於R_f 0.3-0.8。

6.高效液相層析(HPLC)分析：

參照台灣中藥典(第二版)中常用的逆相高效液相層析法進行分析，條件如下：高效液相層析儀為Agilent 1100系列，偵測器為G1315B光二極體陣列偵測器，自動取樣器為G1329A自動取樣器，層析管柱為 Intersil ODS-3V 250 x 4.6mm(5μm)，移動相的溶劑A為乙腈、溶劑B為0.1% H₃PO₄，流速為1ml/min，管柱溫度為30℃，偵測波長為203、210、254、280及365nm。溶媒系統條件如下：移動相包括溶劑A及B、線性梯度為0~20分鐘0% A~10% A，20~40分鐘10% A~40% A，40~60分鐘40% A~100% A，60~70分鐘100% A，流速及管柱溫度如上所述。如表14及第13圖至第16圖所示，5種偵測波長中，正己烷萃取物(11-H至14-H)及乙酸乙酯萃取物(11-E至14-E)皆未觀察到顯著的層析波峰，乙醇萃取物(11-A至14-A)及水萃取物(11-W至14-W)只有203nm呈現較佳的層析波峰。

實驗6、優格萃取物的抗氧化活性測試：

1.清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-pricrylhydrazyl,DPPH)自由基能力測定：

脂質在自行氧化過程中產生自由基而造成脂質酸敗，抗氧化物藉由提供氫來清除脂質過氧化物自由基，進而抑制氧化連鎖反應。DPPH在抗氧化研究中常被使用來評估抗氧化物的供氫能力。DPPH甲醇溶液在517nm有強吸光，被抗氧化劑還原時吸光值降低。因此，在517nm的吸光值越低表示抗氧化劑的供氫能力越強。實驗方法為：將4mL的萃取物樣品(50mg的萃取物溶於15mL的50%乙醇溶液)加入1mL新鮮配製的10 mM DPPH甲醇溶液，振盪混合後置於室溫30分鐘，檢測517nm波長的吸光值。結果以清除百分比表示，清除百分比越高表示測試樣品的供氫能力越佳。如表15及第17圖所示，萃取物11-A、14-A在16個萃取物中具有較佳的清除DPPH自由基能力。

2.總抗氧化能力(trolox equivalent antioxidant capacity,TEAC)測定：

2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)(ABTS)在過氧化氫、過氧化酶催化下產生氧化反應，形成穩定的藍綠色水溶性ABTS˙⁺陽離子自由基。使用紫外光-可見光光度計、在620nm下有較強吸光值，對照標準品水溶性維他命E類似物(trolox)製作標準曲線。當ABTS˙⁺陽離子自由基與抗氧化劑還原時，溶液顏色會變淺、吸光值降低，從而換算清除ABTS˙⁺陽離子自由基之能力。清除能力越好表示抗氧化物供氫能力越強。實驗方法為：將配製完成後的ABTS置於冰箱1小時，使其產生穩定的藍綠色ABTS˙⁺自由基水溶液。將80μL萃取物樣品(50mg的萃取物溶於15mL的50%乙醇溶液)加入96孔盤，再加入120μL的ABTS˙⁺自由基水溶液，總體積為200μL。於室溫下避光震盪10分鐘，測定620nm的吸光值。吸光值越低表示清除ABTS˙⁺自由基效果越佳，以百分比計算清除率。如表15及第18圖所示的總抗氧化能力結果，優格11的萃取物中，11-A能力最佳，11-E最弱；優格12的萃取物中，12-A能力最佳，12-H最弱；優格13的萃取物中，13-A能力最佳，13-H最弱；優格14的萃取物中，14-A能力最佳，14-H最弱。在16個萃取物中，12-A的總抗氧化能力最佳，12-H最弱。

3.還原力測定：

抗氧化劑會將赤血鹽(K₃Fe(CN)₆)還原成黃血鹽(K₄Fe(CN)₆)，黃血鹽再與Fe³⁺作用生成普魯士藍，在620nm波長測定吸光值，以檢測普魯士藍之生成量，吸光值愈高表示抗氧化劑還原力愈強。實驗方法為：將200μL萃取物樣品(50mg的萃取物溶於15mL的50%乙醇溶液)加入微量離心管，再加入200μL的1%赤血鹽，總體積為400μL。混合後置於50℃水浴槽反應20分鐘，反應完成後置於冰上冷卻10分鐘，再加入200μL的10%三氯乙酸(TCA)混合，以3,000rpm離心10分鐘。將75μL上清液加入96孔盤，再加入75μL超純水及30μL的0.1% FeCl₃．6H₂O，混合後測定620nm吸光值。吸光值越高代表還原力越強。如表15及第19圖所示，優格11的萃取物中，11-A還原力最佳，11-H及11-E的還原力相等且最弱；優格12的萃取物中，12-A還原力最佳，12-W最弱；優格13的萃取物中，13-A還原力最佳，13-H最弱；優格14的萃取物中，14-A還原力最佳，14-H還原力最弱。在16個萃取物中，12-A還原力最佳，13-H還原力最弱。

實驗7、優格萃取物的抑制癌細胞生長活性測試：

針對共生菌-腸-腦軸的相關器官，活性代謝物自口腔攝入開始，會經由消化道、血液、循環系統、至泌尿系統(排泄系統)，選擇以口腔癌(Ca9-22、Cal-27細胞株)、血癌(K562、Molt 4細胞株)、腦癌(GBM8401、U87MG細胞株)、胃癌(KATO III、SNU-1細胞株)、大腸癌(DLD-1細胞株)、前列腺癌(LN-cap、PC-3細胞株)進行優格11至14經分離方法3所獲得16個萃取物的抑制癌細胞生長活性測試。實驗方法為細胞存活率分析(MTT assay)，將各種癌細胞植入96孔盤，每孔細胞密度為7×10³cells/100μL，再加入不同濃度(在100μg/mL之內)的樣品(以DMSO作為控制組)，置於37℃、5% CO₂細胞培養箱靜置72小時。再加入50μL MTT，培養1小時。以2000rpm離心3分鐘，去除上清液再加入200μL DMSO，置於震盪器上搖晃至紫色結晶完全溶解，讀取570mm及620mm的吸光值。結果呈現為不同樣品以100μg/mL濃度內處理後，最佳抑制癌細胞生長百分比。口腔癌的人體臨床治療以手術、放射治療(電療)為主，本實驗中的16個萃取物未顯示抑制口腔癌細胞生長的效果。其他癌症細胞的實驗結果如表16及第20圖至第24圖所示。

1.抑制血癌細胞(K562、Molt 4細胞株)的生長活性：

如第20圖所示，在抑制血癌細胞K562生長方面，優格11的萃取物中，11-A的抑制活性最佳，11-W最弱；優格12的萃取物中，12-A的抑制活性最佳，12-W最弱；優格13的萃取物中，13-W的抑制活性最佳，13-H最弱；優格14的萃取物中，14-A的抑制活性最佳，14-W最弱。綜合16個萃取物中，12-A的抑制癌細胞生長活性最佳。如第20圖所示，在抑制血癌細胞Molt 4生長方面，優格11的萃取物中，11-H的抑制活性最佳，11-E、11-W皆無抑制活性；優格12的萃取物中，12-A的抑制活性最佳，12-H、12-W皆無抑制活性；優格13的萃取物中，13-A的抑制活性最佳，13-E最弱；優格14的萃取物中，14-E的抑制活性最佳，14-A、14-W皆無抑制活性。綜合16個萃取物中，14-E的抑制活性最佳。

2.抑制腦癌細胞(GBM8401、U87MG細胞株)生長活性：

如第21圖所示，在抑制腦癌細胞GBM8401生長方面，優格11的萃取物中，11-A的抑制活性最佳，11-E最弱；優格12的萃取物中，12-A的抑制活性最佳，12-W最弱；優格13的萃取物中，13-H的抑制活性最佳，13-W最弱；優格14的萃取物中，14-A的抑制活性最佳，14-H最弱。綜合16個萃取物中，11-A的抑制活性最佳。如第21圖所示，在抑制細胞U87MG生長方面，優格11的萃取物中，11-A的抑制活性最佳，11-W最弱；優格12的萃取物中，12-H的抑制活性最佳，12-W最弱；優格13的萃取物中，13-H的抑制活性最佳，13-E、13-W皆無抑制活性；優格14的萃取物中，14-W的抑制活性最佳，14-E最弱。綜合16個萃取物中，14-W的抑制活性最佳。

3.抑制胃癌細胞(KATO III、SNU-1細胞株)生長活性：

如第22圖所示，在抑制胃癌細胞KATO III生長方面，優格11的萃取物中，11-H的抑制活性最佳，11-W最弱；優格12的萃取物中，12-E的抑制活性最佳，12-H、12-W皆無抑制活性；優格13的萃取物中，只有13-E具有抑制活性；優格14的萃取物中，14-W的抑制活性最佳，14-A最弱。綜合16個萃取物中，14-W的抑制活性最佳。如第22圖所示，在抑制胃癌細胞SNU-1生長方面，優格11的萃取物中，11-H的抑制活性最佳，11-A最弱；優格12的萃取物中，12-E的抑制活性最佳，12-W最弱；優格13的萃取物中，13-H的抑制活性最佳，13-A最弱；優格14的萃取物中，14-A的抑制活性最佳，14-E最弱。綜合16個萃取物中，12-E的抑制活性最佳。

4.抑制大腸癌細胞(DLD-1細胞株)生長活性：

如第23圖所示，在抑制大腸癌細胞DLD-1生長方面，優格11的萃取物中，11-H的抑制活性最佳，11-W最弱；優格12的萃取物中，12-H的抑制活性最佳，12-E最弱；優格13的萃取物中，13-H的抑制活性最佳，13-W最弱；優格14的萃取物中，14-A的抑制活性最佳，14-E最弱。綜合16個萃取物中，11-A的抑制活性最佳。

5.抑制前列腺癌細胞(LN-cap、PC-3細胞株)生長活性：

如第24圖所示，在抑制前列腺癌細胞LN-cap生長方面，優格11的萃取物中，11-A的抑制活性最佳，11-E最弱；優格12的萃取物中，12-H的抑制活性最佳，12-E最弱；優格13的萃取物中，13-A的抑制活性最佳，13-H、13-E皆無抑制活性；優格14的萃取物中，14-W的抑制活性最佳，14-H最弱。綜合16個萃取物中，11-A的抑制活性最佳。如第24圖所示，在抑制前列腺癌細胞PC-3生長方面，優格11的萃取物中，11-E的抑制活性最佳，11-H最弱；優格12的萃取物中，12-H的抑制活性最佳，12-W最弱；優格13的萃取物中，13-E的抑制活性最佳，13-H、13-W皆無抑制活性；優格14的萃取物中，14-E的抑制活性最佳，14-A最弱。綜合 16個萃取物中，13-E的抑制活性最佳。

實驗8、半固態優格的製備：

根據感官品評喜好等級高的優格11至14，取對應的菌種組合11至14依實驗2進行半固態優格的發酵製備，獲得半固態優格11至14。發酵溫度37℃至43℃發酵時間16小時至24小時，半固態優格11至14的粘度大於1500cP(較佳為1500-2500cP)、pH值小於4.6(較佳為4.4±0.2)，判定為發酵完全。使用者利用匙面積長4~6公分、寬3~4公分的湯匙舀取半固態優格3立方公分，匙面朝下5秒，半固態優格具足夠粘度不因重力而往下滴於桌面。

實驗9、半固態優格配料的感官品評：

為了增加半固態優格食用上的多樣性、提高使用者每日的優格攝取量(例如能在30分鐘內吃完200g)且長期飲用不膩口，實驗9以半固態優格12為基底加入配料的配方設計，並以描述分析法進行評鑑。實驗9召集具有發酵產品開發、發酵乳製品開發、優格產品開發實務經驗之高感官敏銳性品評員5人進行實驗，其中男性3人、女性2人，並以會議討論方式進行品評。

1.鹹甜口味的半固態優格配方設計：

加入芝麻醬為醬汁：芝麻醬香味濃郁，含有油脂，兩者相容後風味含有油脂味，使整體風味產生鹹食口感，但風味過於特異，接受度不高。加入小黃瓜為配料：小黃瓜切丁0.5立方公分及以下鋪於表面，小黃瓜風味掩蓋優格風味，整體蔬菜味明顯，缺少優格的獨特風味。加入玉米為配料：將無調味玉米罐頭之玉米粒鋪於表面，玉米略帶甜味，可提升整體甜味，但玉米風味與優格風味融合為一種特殊味道，接受度甚低。感官品評結果：半固態優格的配方設計不適合鹹甜口味。

2.半固態優格配料的配方設計：

配料感官品評的評估重點為：口感的滑順度、整體的均衡度；進一步包括視覺的刺激感，提升使用者觀看而想食用半固態優格的欲望(促進食慾、增強主動攝取)。所添加的醬汁配料包括但不限於黑糖、抹茶、蜂蜜、楓糖漿、煉乳、巧克力、咖啡、薑汁，其感官品評的結果如表17所述。所添加的固態配料包括但不限於珍珠、椰果、咖啡凍、粉條、芋圓、布丁、仙草凍、豆花、綠豆、紅豆、薏仁、紫米、燕麥，其感官品評的結果如表18所述。此外，亦可使用水果作為固態配料，包括但不限於西瓜、芒果、草莓、荔枝、火龍果、百香果、酪梨、香蕉、木瓜、奇異果、柳橙、葡萄柚、鳳梨，其感官品評的結果如表19所示。

本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

<110> 錢佑

<120> 具抗氧化與抑制前列腺癌細胞生長的半固態優格及其製備方法

<160> 2

<210> 1

<211> 1478

<212> rDNA

<213> 發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)

<220>

<223> 菌種代號UY-58的16S rDNA

<400> 1

<210> 2

<211> 1515

<212> rDNA

<213> 瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)

<220>

<223> 菌種代號UY-76的16S rDNA

<400> 2

Claims

一種半固態優格，包括：一動物乳汁製品，包括水及動物乳汁；複數菌粉，與該動物乳汁製品相混合，其中該複數菌粉來自以下的複數種菌株所組成：比菲德氏菌(Bifidobacterium bifidum)、嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis)、雷特氏雙岐桿菌(Bifidobacterium lactis)、長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)以及鼠李糖桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。
如申請專利範圍第1項所述的半固態優格，其中各該複數種菌株的菌粉重量均相同。
如申請專利範圍第1項所述的半固態優格，其中該複數種菌株在該動物乳汁製品中，以37℃至43℃發酵16小時至24小時。
如申請專利範圍第1項所述的半固態優格，其中該半固態優格的粘度範圍為1500-2500cP、pH值範圍為4.4±0.2。
如申請專利範圍第1項所述的半固態優格，其中該半固態優格還包括一醬汁配料，該醬汁配料選自由黑糖、蜂蜜、巧克力、咖啡及其組合所組成的群組其中之一。
如申請專利範圍第1項所述的半固態優格，其中該半固態優格還包括一固態配料，該固態配料選自由珍珠、椰果、咖啡凍、粉條、芋圓、布丁、紅豆、紫米、燕麥及其組合所組成的群組其中之一。
如申請專利範圍第1項所述的半固態優格，其中該半固態優格還包括一固態水果配料，該固態水果配料選自由芒果、草莓、火龍果、百香果、酪梨、香蕉、奇異果、柳橙、葡萄柚及其組合所組成的群組其中之一。
如申請專利範圍第1項所述的半固態優格，其中該半固態優格的原液係以下列分離方法加以分離，該分離方法包括：冷凍乾燥該半固態優格的該原液，獲得一粉狀產物；以正己烷萃取該粉狀產物，獲得一正己烷萃取物及一第一殘留物，其中該正己烷萃取物的主量成分為具有雙鍵及氫氧基的短鏈脂肪酸；以乙酸乙酯萃取該第一殘留物，獲得一乙酸乙酯萃取物及該第二殘留物，其中該乙酸乙酯萃取物的主量成分為糖脂；以乙醇萃取該第二殘留物，獲得一乙醇萃取物及一第三殘留物，其中該乙醇萃取物的主量成分包括雙醣及寡醣；以及以水萃取該第三殘留物，獲得一水萃取物及一第四殘留物，其中該水萃取物的主量成分包括多醣、醣蛋白以及蛋白質。
如申請專利範圍第8項所述的半固態優格，其中該正己烷萃取物及該乙酸乙酯萃取物以正相薄層層析法進行成分分析，該正相薄層層析法的溶媒系統為甲苯：乙酸乙酯：甲酸=5：4：1(v/v/v)。
如申請專利範圍第8項所述的半固態優格，其中該乙醇萃取物及該水萃取物以逆相高效液相層析法進行成分分析。
一種將申請專利範圍第1項所述之半固態優格用於抑制癌細胞生長的用途，其中該癌細胞為前列腺癌細胞。