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TW202020152A - 調節rtel1表現之寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於治療HBV感染，尤其慢性HBV感染之RTEL1抑制劑。本發明尤其關於RTEL1抑制劑用於去穩定化諸如HBV cccDNA之cccDNA之用途。本發明亦關於與RTEL1互補且能夠降低RTEL1 mRNA之反義寡核苷酸。本發明亦包含一種醫藥組合物及其用於治療及/或預防HBV感染之用途。

Description

調節RTEL1表現之寡核苷酸
本發明係關於RTEL1抑制劑，諸如與RTEL1互補之寡核苷酸(寡聚物)，從而導致對RTEL1表現之調節或RTEL1活性之調節。本發明尤其關於RTEL1靶向核酸分子用於治療及/或預防B型肝炎病毒(HBV)感染，尤其慢性HBV感染之用途。本發明尤其關於RTEL1抑制劑用於去穩定化諸如HBV cccDNA之cccDNA之用途。本發明亦包含一種醫藥組合物及其用於治療及/或預防HBV感染之用途。
B型肝炎為由B型肝炎病毒(HBV)引起之傳染病， HBV為一種經由反轉錄複製之小型親肝性病毒。慢性HBV感染為諸如肝硬化及肝細胞癌之重度肝病之關鍵因素。慢性HBV感染之現行治療係基於投與聚乙二醇化1型干擾素或核苷(核苷酸)類似物，諸如拉米夫定(lamivudine)、阿德福韋(adefovir)、恩替卡韋(entecavir)、替諾福韋二吡呋酯(tenofovir disoproxil)及替諾福韋艾拉酚胺(tenofovir alafenamide)，其靶向病毒聚合酶，其為一種多功能反轉錄酶。治療成效通常以B型肝炎表面抗原(HBsAg)之損失衡量。然而，很少達成完全HbsAg清除，此係由於B型肝炎病毒DNA在感染後持續存在於體內。HBV續存係由穩定地維持在胞核中之HBV基因組之游離型形式介導。此游離型形式稱為「共價閉合環狀DNA」 (cccDNA)。cccDNA充當包括前基因組RNA (pgRNA)之所有HBV轉錄物之模板，該前基因組RNA為一種病毒複製中間產物。少數cccDNA複製物之存在足以重新引發全面的HBV感染。HBV之現行治療不靶向cccDNA。然而，慢性HBV感染之治癒將需要消除cccDNA (由Nassal, Gut. 2015 Dec;64(12):1972-84. doi：10.1136/gutjnl-2015-309809綜述)。
端粒伸長解螺旋酶1 (RTEL1)之調控因子編碼DNA解螺旋酶，其在穩定性、保護及端粒伸長中起作用且與已知端粒蛋白(shelterin)複合物中之蛋白質相互作用以在DNA複製期間保護端粒。此基因中之突變已與先天性角化不良(dyskeratosis congenita)及Hoyerall-Hreidarsson症候群相關聯(參見例如Vannier等人 2014 Trends Cell Biol. 第24卷 第416頁之綜述)。
定位於胞核中之RTEL1充當ATP依賴性DNA解螺旋酶，其涉及端粒長度調控、DNA修復及基因組穩定性之維護。RTEL1充當在減數分裂期間抵消毒性重組且限制交越之抗重組酶且藉由以物理方式解離股侵入事件來調節減數分裂重組及交越恆定且藉此藉由減數分裂合成依賴性股退火(SDSA)以及D環重組中間產物之拆卸來促進非交越修復。此外，RTEL1拆卸T環且藉由抵消端粒G4-DNA結構來防止端粒脆弱性，該等端粒G4-DNA結構共同確保端粒之動力學及穩定性。
RTEL1已在siRNA篩選中鑑別為HPV游離基因體之穩定劑：(Edwards等人 2013 PLoS One 第8卷, e75406)。靶向RTEL1之siRNA已同樣用於鑑別Hoyeraal-Hreidarsson症候群中與RTEL1之相互作用物(Schertzer等人 2015 Nucleic Acid Res 第43卷 第1834頁)。此外，RTEL1藉由針對基本宿主蛋白質之siRNA篩選鑑別為HIV宿主依賴性因子以為抑制HIV感染提供目標(WO 2007/094818)。
據吾人所知，RTEL1在cccDNA穩定性及維護之情形中從未被鑑別為cccDNA依賴性因子，抑制RTEL1之分子亦從未被推薦為用於治療HBV感染之cccDNA去穩定劑。
本發明顯示，在HBV感染細胞中，RTEL1之抑制與cccDNA之減少之間存在相關性，此在治療HBV感染個體方面為相關的。本發明之一目的係為了鑑別在HBV感染細胞中減少cccDNA之RTEL1抑制劑。此類RTEL1抑制劑可用於治療HBV感染。
本發明進一步鑑別出新穎核酸分子，其能夠抑制活體外及活體內RTEL1之表現。
本發明係關於能夠調節RTEL1表現之靶向核酸之寡核苷酸及治療或預防與RTEL1之作用相關之疾病。
因此，在第一態樣中，本發明提供一種用於治療及/或預防B型肝炎病毒(HBV)感染之RTEL1抑制劑。特定言之，能夠降低cccDNA及/或前基因組RNA (pgRNA)之RTEL1抑制劑為適用的。此類抑制劑有利地選自具有長度為12至60個核苷酸之核酸分子，其能夠降低RTEL1 mRNA (諸如單股反義寡核苷酸)、siRNA或與哺乳動物RTEL1互補之shRNA。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含具有至少10個核苷酸，尤其16至20個核苷酸之連續核苷酸序列之具有12-60個核苷酸，諸如12-30個核苷酸的寡核苷酸，其與哺乳動物RTEL1互補。此類寡核苷酸能夠抑制RTEL1之表現。該寡核苷酸可為單股反義寡核苷酸或shRNA核酸分子。
該反義寡核苷酸可具有間隔體設計。較佳地，反義寡核苷酸能夠藉由目標核酸之裂解抑制RTEL1之表現。裂解較佳係經由核酸酶募集達成。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之反義寡核苷酸及醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供用於藉由以有效量向該細胞投與本發明之反義寡核苷酸或組合物來調節表現RTEL1之目標細胞中之RTEL1表現的活體內或活體外方法的方法。
在另一態樣中，本發明提供用於治療或預防與RTEL1之活體內活性相關之疾病、病症或功能異常的方法，其包含向罹患疾病、病症或功能異常或易受疾病、病症或功能異常影響之個體投與治療或預防有效量之本發明之反義寡核苷酸。
本發明之其他態樣為本發明之核酸分子的共軛物及包含本發明之分子的醫藥組合物。特定言之，靶向肝臟之共軛物為受關注的，諸如GalNAc簇。
定義 HBV 感染 術語「B型肝炎病毒感染」或「HBV感染」為此項技術中通常已知的，且係指由B型肝炎病毒(HBV)引起且影響肝臟之傳染病。HBV感染可為急性或慢性感染。慢性B型肝炎病毒(CHB)感染為影響全球2億4千8百萬個體之全球範圍的疾病負擔。每年約686,000例死亡係歸因於HBV相關之末期肝臟疾病及肝細胞癌(HCC) (GBD 2013；Schweitzer等人, 2015)。WHO預計，在不擴大干預之情況下，CHB感染者之數目將在接下來40-50年內保持在當前的高水準下，其中在2015年與2030年之間發生累計兩千萬例死亡(WHO 2016)。CHB感染不為具有單一臨床變現之均質疾病。感染個體在其生命中已成功通過CHB相關聯之肝臟疾病的數個階段；疾病之此等階段亦為用護理標準(SOC)治療之基礎。現行準則建議僅治療基於血清ALT含量、HBV DNA含量及肝臟疾病之嚴重性這三項準則而選擇之CHB感染個體(EASL, 2017)。此建議係由於SOC，亦即核苷(核苷酸)類似物(NA)及聚乙二醇化干擾素α (PEG-IFN)不為治癒性的且必須經長時段投與，藉此增加其安全風險。NA有效地抑制HBV DNA複製；然而，其對其他病毒標記具有極有限的作用/不具有作用。HBV感染之兩個標誌，B型肝炎表面抗原(HBsAg)及共價閉合環狀DNA (cccDNA)為以HBV治癒為目標之新穎藥物的主要目標。在CHB個體之血漿中，HBsAg次病毒(空)粒子數量比HBV病毒粒子多103至105倍(Ganem & Prince, 2014)；咸信其過量會促進疾病之免疫病原性，包括個體不能產生中和抗HBs抗體，其為在急性HBV感染消退後觀測到之血清學標記。
cccDNA ( 共價閉合環狀 DNA) cccDNA為駐留於經感染肝細胞之胞核中之病毒基因模板，其中其在慢性HBV感染之自然過程期間產生為噬菌體感染所需之所有HBV RNA轉錄物且對病毒續存負責(Locarnini & Zoulim, 2010 Antivir Ther. 15 增刊 3:3-14. doi：10.3851/IMP1619)。充當病毒儲存庫之cccDNA為治療停止後病毒反彈之來源，從而使長期且頻繁的終身治療成為必要。PEG-IFN由於其各種副作用而僅可向CHB之一小子集投與。
因此，極需要新穎療法，其可為大部分CHB患者遞送由HBV cccDNA降解或消除定義之完全治癒。
化合物 本文中，術語「化合物」意謂能夠抑制RTEL1表現或活性之任何分子。本發明之特定化合物為核酸分子，諸如根據本發明之RNAi分子或反義寡核苷酸或包含此類核酸分子之任何共軛物。舉例而言，本文中，化合物可為靶向RTEL1之核酸分子，尤其反義寡核苷酸或siRNA。
寡核苷酸 如本文中所使用之術語「寡核苷酸」定義為，熟習此項技術者一般將其理解為包含兩個或更多個共價鍵聯核苷的分子。此類共價結合之核苷亦可稱為可互換使用之核酸分子或寡聚物。
在本說明書及申請專利範圍中提及之寡核苷酸為長度少於70個核苷酸之一般治療性寡核苷酸。寡核苷酸可為或包含單股反義寡核苷酸，或可為另一寡聚核酸分子，諸如CRISPR RNA、siRNA、shRNA、適體或核糖核酸酶。治療性寡核苷酸分子通常係在實驗室中藉由固相化學合成，隨後純化及分離來製備。然而，shRNA通常使用自其中其接著經轉錄以產生將形成莖環(髮夾) RNA結構之單股RNA的慢病毒載體遞送至細胞，該莖環(髮夾) RNA結構能夠與RNA干擾機構(包括RNA誘導沉默複合物(RISC))相互作用。在本發明之一實施例中，shRNA為以化學方式產生之shRNA分子(不依賴於來自質體或病毒之基於細胞之表現)。
當提及寡核苷酸之序列時，提及共價鍵聯核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾的序列或順序。一般而言，本發明之寡核苷酸為人造的，且經化學合成，且通常經純化或分離。儘管在一些實施例中，本發明之寡核苷酸為在進入目標細胞時自載體轉錄之shRNA。本發明之寡核苷酸可包含一或多種經修飾之核苷或核苷酸。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含或由以下組成：10至70個核苷酸長度，諸如12至60，諸如13至50，14至40，諸如15至30，諸如12-25，諸如16至22，諸如16至20個連續核苷酸長度。因此，在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可具有12-25個核苷酸之長度。可替代地，在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可具有15-22個核苷酸之長度。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含或由以下組成：24或更少個核苷酸，諸如22個，諸如20或更少個核苷酸，諸如18或更少個核苷酸，諸如14、15、16或17個核苷酸。應理解，本文中所給出之任何範圍包括範圍端點。因此，若稱核酸分子包括12至25個核苷酸，則包括12個與25個核苷酸兩者。
在一些實施例中，連續核苷酸序列包含或由12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個連續核苷酸長度組成。
寡核苷酸係用於調節哺乳動物中目標核酸之表現。在一些實施例中，諸如用於siRNA、shRNA及反義寡核苷酸之核酸分子通常用於抑制目標核酸之表現。
在本發明之一個實施例中，寡核苷酸選自RNAi藥劑，諸如siRNA或shRNA。在另一實施例中，寡核苷酸為單股反義寡核苷酸，諸如與RNaseH相互作用之高親和力經修飾之反義寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可包含一或多種經修飾之核苷或核苷酸，諸如經2'糖修飾之核苷。
在一些實施例中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷間鍵。
在一些實施例中，寡核苷酸可與非核苷部分(共軛部分)共軛。
寡核苷酸庫應理解為變體寡核苷酸之集合。寡核苷酸庫之目的可變化。在一些實施例中，寡核苷酸庫係由具有靶向一或多種哺乳動物RTEL1目標核酸之疊加核鹼基序列的寡核苷酸構成，其目的為鑑別寡核苷酸庫內最有效的序列。在一些實施例中，寡核苷酸庫為親本或上代寡核苷酸之寡核苷酸設計變體(子代核酸分子)庫，其中寡核苷酸設計變體保留親本核酸分子之核心核鹼基序列。
反義寡核苷酸 如本文中所使用之術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由雜交至目標核酸，尤其雜交至目標核酸上之連續序列而調節目標基因之表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸在本文中基本上不為雙股，且因此不為siRNA或shRNA。較佳地，本發明之反義寡核苷酸為單股。應理解，本發明之單股寡核苷酸可形成髮夾結構或分子間雙螺旋體結構(同一寡核苷酸之兩個分子之間的雙螺旋體)，只要寡核苷酸之全長內之序列內或序列間自身互補程度小於50%。
有利地，本發明之單股反義寡核苷酸不含有RNA核苷，此係由於此將減小核酸酶耐性。
有利地，本發明之寡核苷酸包含一或多種經修飾之核苷或核苷酸，諸如經2'糖修飾之核苷。此外，有利的係，未經修飾之核苷為DNA核苷。
RNAi 分子 本文中，術語「RNA干擾(RNAi)分子」係指能夠經由細胞質中之RNA誘導沉默複合物(RISC)來誘導RNA依賴性基因沉默之較短雙股RNA基寡核苷酸，其中該等分子與催化性RISC組分AGO蛋白(argonaute)相互作用。RNAi分子調節(例如抑制)細胞(例如個體，諸如哺乳動物個體內之細胞)中之目標核酸之表現。RNAi分子之一種類型為小干擾RNA(siRNA，其為由兩個互補寡核苷酸構成之雙股RNA分子，其中在轉錄後一股與互補mRNA之結合導致其降解及轉譯損失。小髮夾RNA (shRNA)為形成莖環(髮夾)結構之單股RNA基寡核苷酸，其能夠經由DICER及RNA減少沉默複合物(RISC)來減少mRNA。RNAi分子可基於所關注之基因(目標核酸)之序列而設計。對應的RNAi可接著以化學方式或藉由活體外轉錄來合成，或由載體或PCR產物表現。
siRNA 術語siRNA係指小干擾核糖核酸RNAi分子。其為一類雙股RNA分子，在此項技術中亦稱為短干擾RNA或沉默RNA。siRNA通常包含有義股(亦稱為隨從股)及反義股(亦稱為引導股)，其中各股具有17-30個核苷酸長度，通常19-25個核苷長度，其中反義股與目標核酸(適合地，成熟的mRNA序列)互補，諸如至少95%互補，諸如完全互補，且有義股與反義股互補，使得有義股及反義股形成雙螺旋體或雙螺旋體區。siRNA股可形成鈍端雙螺旋體，或有利地，有義股及反義股3'端可形成例如1、2或3個核苷之3'突出物以類似於由Dicer產生之產物，該產物在活體內形成RISC基質。US 8,349,809及US 8,513,207中已描述Dicer基質之有效擴展形式，該等文獻特此以引用之方式併入。在一些實施例中，有義股與反義股兩者皆具有2nt 3'突出物。因此，雙螺旋體區可例如為17 - 25個核苷酸長度，諸如21-23個核苷酸長度。
當在細胞內部時，反義股併入至RISC複合物中，該RISC複合物介導目標核酸之目標降解或目標抑制。siRNA通常包含除RNA核苷以外的經修飾核苷。在一個實施例中，siRNA分子可使用經修飾核苷酸間鍵及經2'糖修飾之核苷來化學修飾，該等經2'糖修飾之核苷諸如經2'-4'雙環核糖修飾之核苷，包括如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA之經LNA及cET或2'取代之修飾。特定言之，2'-氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基可併入至siRNA中。
在一些實施例中，siRNA有義(隨從)股之所有核苷酸可經諸如LNA之經2'糖修飾之核苷修飾(參見例如WO2004/083430、WO2007/085485)。在一些實施例中，siRNA之股從故可為非連續的(參見例如WO2007/107162)。在siRNA之反義股之種子區處發生的以熱方式去穩定化核苷酸之併入已報導為適用於降低siRNA之偏離目標活性(參見例如WO2018/098328)。適合地，siRNA在反義股之5'端處包含5'磷酸酯基團或5'-磷酸酯模擬物。在一些實施例中，反義股之5'端為RNA核苷。
在一個實施例中，siRNA分子進一步包含至少一個硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷間鍵。硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷間鍵可在一個或兩個股(例如，反義股；或有義股)之3'-端處；或硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷間鍵可在一個或兩個股(例如，反義股；或有義股)之5'-端處；或硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷間鍵可在一個或兩個股(例如，反義股；或有義股)之5'-端與3'-兩者處。在一些實施例中，剩餘核苷間鍵為磷酸二酯鍵。在一些實施例中，siRNA分子包含一或多個硫代磷酸酯核苷間鍵。在siRNA分子中，硫代磷酸酯核苷間鍵可減少RICS中之核酸酶裂解，因此，有利的係，並非所有反義股中之核苷間鍵經修飾。
siRNA分子可進一步包含配位體。在一些實施例中，配位體與有義股之3'端共軛。
就生物分佈而言，siRNA可與靶向配位子共軛，且/或調配成例如脂質奈米粒子。
本發明之其他態樣係關於包含此等dsRNA (諸如適用於醫療用途之siRNA分子)之醫藥組合物，及藉由投與本發明之dsRNA分子(諸如siRNA)來抑制目標基因之表現的方法，例如，以用於治療如本文中所揭示之各種疾病病況。
shRNA 短髮夾RNA或shRNA分子一般在40與70個核苷酸長度之間，諸如在45與65個核苷酸長度之間，諸如50及60個核苷酸長度，且形成與已知為Dicer之核酸內切酶相互作用之莖環(髮夾)RNA結構，咸信該核酸內切酶將dsRNA加工成具有特徵性兩個鹼基3'突出物之19-23個鹼基對短干擾RNAs，該等3'突出物接著併入至RNA誘導沉默複合物(RISC)中。在與適當的目標mRNA結合之後，RISC內之一或多種核酸內切酶使目標裂解以誘發沉默。RNAi寡核苷酸可使用經修飾核苷酸間鍵及經2'糖修飾之核苷來化學修飾，該等經2'糖修飾之核苷諸如經2'-4'雙環核糖修飾之核苷，包括如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA之經LNA及cET或2'取代之修飾。
在一些實施例中，shRNA核酸分子包含一或多個硫代磷酸酯核苷間鍵。在RNAi分子中，硫代磷酸酯核苷間鍵可減少RICS中之核酸酶裂解，因此，有利的係，並非所有shRNA分子之莖環中的核苷間鍵經修飾。硫代磷酸酯核苷間鍵可有利地置放在shRNA分子之莖環的3'及/或5'端中，尤其置放在分子之與目標核酸(例如siRNA分子中之有義股或隨從股)不互補之部分中。然而，與目標核酸互補之shRNA分子的區可亦在經預測以在由Dicer裂解後變為3'及/或5'末端之部分中之最先2至3個核苷間鍵中經修飾。
連續核苷酸序列 術語「連續核苷酸序列」係指寡核苷酸之與目標核酸互補之區。該術語在本文中可與術語「連續核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基元序列」互換使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸構成連續核苷酸序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列包括於siRNA分子之引導股中。在一些實施例中，連續核苷酸序列為shRNA分子之與目標核酸100%互補之部分。在一些實施例中，寡核苷酸包含連續核苷酸序列，諸如F-G-F'間隔體區，且可視情況包含其他核苷酸，例如可用於將官能基(例如用於靶向之共軛物基團)附接至連續核苷酸序列之核苷酸連接區。核苷酸連接區可與目標核酸互補或可能不與其互補。在一些實施例中，反義寡核苷酸之核鹼基序列為連續核苷酸序列。在一些實施例中，連續核苷酸序列與目標核酸100%互補。
核苷酸及核苷 核苷酸及核苷為寡核苷酸及聚核苷酸之建構嵌段，且出於本發明之目的包括天然存在與非天然存在之核苷酸及核苷兩者。在本質上，核苷酸(諸如DNA及RNA核苷酸)包含核糖部分、核鹼基部分及一或多個磷酸酯基團(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱作「單元」或「單體」。
經修飾核苷 如本文中所用之術語「經修飾核苷」或「核苷修飾」係指與當量DNA或RNA核苷相比，藉由引入一或多個糖部分或(核)鹼基部分之修飾而經修飾的核苷。在一較佳實施例中，經修飾核苷包含經修飾糖部分。術語經修飾核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾「單元」或經修飾「單體」互換使用。具有未經修飾DNA或RNA糖部分之核苷在本文中稱為DNA或RNA核苷。若在DNA或RNA核苷之鹼基區中具有修飾的核苷允許Watson Crick鹼基配對，則其一般仍稱為DNA或RNA。
經修飾核苷間鍵 術語「經修飾核苷間鍵」定義為，熟習此項技術者一般理解為除磷酸二酯(PO)鍵以外的鍵，其將兩個核苷共價偶合在一起。本發明之寡核苷酸可因此包含一或多個經修飾核苷間鍵，諸如一或多個硫代磷酸酯核苷間鍵，或一或多個二硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，與磷酸二酯鍵相比，經修飾核苷間鍵提高寡核苷酸之核酸酶耐性。就天然存在之寡核苷酸而言，核苷間鍵包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵之磷酸酯基團。經修飾核苷間鍵尤其適用於活體內使用之穩定化寡核苷酸，且可用以防止本發明之寡核苷酸中DNA或RNA核苷區處，例如間隔體寡核苷酸之間隙區G內，以及經修飾核苷區(諸如區F及F')中之核酸酶裂解。
在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個經天然磷酸二酯修飾之核苷間鍵，諸如例如對核酸酶攻擊具有較多抗性之一或多個經修飾核苷間鍵。核酸酶耐性可藉由在血清中培育寡核苷酸或藉由使用核酸酶耐性檢定(例如蛇毒液磷酸二酯酶(SVPD))來測定，兩者皆為此項技術中所熟知。能夠增強寡核苷酸之核酸酶耐性的核苷間鍵稱為耐核酸酶核苷間鍵。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少50%之核苷間鍵經修飾，諸如寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少60%，諸如至少70%，諸如至少75%，諸如至少80%或諸如至少90%之核苷間鍵經修飾。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵經修飾。將認識到，在一些實施例中，將本發明之寡核苷酸鍵聯至非核苷酸官能基(諸如共軛物)之核苷可為磷酸二酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵為耐核酸酶核苷間鍵。
在本發明之寡核苷酸之情況下，有利地使用硫代磷酸酯核苷間鍵。
硫代磷酸酯核苷間鍵由於核酸酶耐性、有益的藥物動力學及製造簡易性而尤其適用。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少50%之核苷間鍵為硫代磷酸酯，諸如寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少60%，諸如至少70%，諸如至少75%，諸如至少80%或諸如至少90%之核苷間鍵為硫代磷酸酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵均為硫代磷酸酯。
諸如硫代磷酸酯鍵之耐核酸酶鍵尤其適用於能夠在用目標核酸形成雙螺旋體時募集核酸酶之寡核苷酸區，諸如用於間隔體之區G。然而，硫代磷酸酯鍵亦可適用於非核酸酶募集區及/或親和力增強區，諸如用於間隔體之區F及F'。在一些實施例中，間隔體寡核苷酸可在區F或區F'，或區F與區F'兩者中包含一或多個磷酸二酯鍵，其中區G中之所有核苷間鍵可為硫代磷酸酯。
有利地，寡核苷酸之連續核苷酸序列的所有核苷間鍵為硫代磷酸酯，或寡核苷酸之所有核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵。
應認識到，如EP 2 742 135中所揭示，反義寡核苷酸可包含其他核苷間鍵(除磷酸二酯及硫代磷酸酯以外的核苷間鍵)，例如膦酸烷酯/膦酸甲酯核苷間，其根據EP 2 742 135可例如在另外DNA硫代磷酸酯中耐受間隙區。
核鹼基 術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中之嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明之上下文中，術語核鹼基亦涵蓋經修飾核鹼基，其可不同於天然存在之核鹼基，但在核酸雜交期間具有功能性。在此上下文中，「核鹼基」係指天然存在之核鹼基，諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤，以及非天然存在之變體兩者。此類變體例如描述於Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 增刊37 1.4.1中。
在一些實施例中，核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變成經修飾嘌呤或嘧啶來經修飾，經修飾嘌呤或嘧啶為諸如經取代嘌呤或經取代嘧啶，諸如選自以下之核鹼基：異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫基-尿嘧啶、2'硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
核鹼基部分可藉由用於各對應核鹼基之字母碼(例如A、T、G、C或U)指示，其中各字母可視情況包括等效功能之經修飾核鹼基 舉例而言，在所例示之寡核苷酸中，核鹼基部分選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，就LNA間隔體而言，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
經修飾寡核苷酸 術語經修飾寡核苷酸描述包含一或多個經糖修飾之核苷及/或經修飾核苷間鍵之寡核苷酸。術語嵌合寡核苷酸為已用於文獻中以描述具有經修飾核苷及DNA核苷之寡核苷酸的術語。本發明之反義寡核苷酸有利地為嵌合寡核苷酸。
互補性 術語「互補性」描述核苷/核苷酸之Watson-Crick鹼基配對之能力。Watson-Crick鹼基對為鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。應理解，寡核苷酸可包含具有經修飾核鹼基之核苷，例如通常使用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶，且因而術語互補性涵蓋未經修飾與經修飾核鹼基之間的Watson Crick鹼基配對(參見例如Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 增刊37 1.4.1)。
如本文中所使用之術語「%互補」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中連續核苷酸序列之跨越連續核苷酸序列的核苷酸比例(以%為單位)與參考序列(例如目標序列或序列基元)互補。因此，互補性百分比係藉由以下來計算：對在兩個序列(當與目標序列5'-3'及來自3'-5'之寡核苷酸序列對準時)之間互補之所對準核鹼基(來自Watson Crick鹼基對)進行計數，用彼數目除以寡核苷酸中核苷酸之總數目且乘以100。在此類比較中，未對準(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸稱為錯配。在計算連續核苷酸序列之互補性%時不允許插入及缺失。應理解，在測定互補性時，忽略核鹼基之化學修飾，只要保持核鹼基形成Watson Crick鹼基配對之官能性能力即可(例如出於計算一致性%之目的，5'甲基胞嘧啶視為與胞嘧啶相同)。
術語「完全互補」係指100%互補性。
以下為與目標核酸(SEQ ID NO:11)完全互補之寡核苷酸基元(SEQ ID NO:33)之實例 5'- CTTTGACCAGAGTATGTAAAATTCTC-3' (SEQ ID NO：11) 3'-AAACTGGTCTCATACATTTT -5'     (SEQ ID NO：33)。
一致性 如本文中所使用之術語「一致性」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中連續核苷酸序列之跨越連續核苷酸序列的核苷酸比例(以%為單位表示)與參考序列(例如序列基元)相同。因此，一致性百分比係藉由以下計算：對在(本發明之化合物之連續核苷酸序列及參考序列中之)兩個序列之間相同(匹配)之所對準核鹼基進行計數，用彼數目除以寡核苷酸中核苷酸之總數目且乘以100。因此，一致性百分比 = (匹配 x 100)/對準區(例如連續核苷酸序列)之長度。在計算連續核苷酸序列之一致性百分比時不允許插入及缺失。應理解，在測定一致性時，忽略核鹼基之化學修飾，只要保持核鹼基形成Watson Crick鹼基配對之官能性能力即可(例如出於計算一致性%之目的，5-甲基胞嘧啶視為與胞嘧啶相同)。
雜交 如本文中所用之術語「雜交(hybridizing/hybridize)」應理解為兩個核酸股(例如寡核苷酸及目標核酸)在相對股上之鹼基對之間形成氫鍵，藉此形成雙螺旋體。兩個核酸股之間的結合親和力為雜交之強度。通常描述，就熔融溫度(Tm )而言定義為一半寡核苷酸與目標核酸成雙螺旋體時之溫度。在生理條件下，Tm 不與親和力嚴格成比例(Mergny及Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準狀態吉布斯(Gibbs)自由能ΔG°為結合親和力之更精確表示，且藉由ΔG° = -RTln(Kd )與反應之解離常數(Kd )相關，其中R為氣體常數且T為絕對溫度。因此，寡核苷酸與目標核酸之間的反應之極低ΔG°反映寡核苷酸與目標核酸之間的強雜交。ΔG°為與其中水性濃度為1 M，pH為7且溫度為37℃之反應相關聯之能量。寡核苷酸與目標核酸之雜交為自發性反應且就自發性反應而言，ΔG°小於零。ΔG°可以實驗方式量測，例如藉由使用如Hansen 等人, 1965,Chem. Comm. 36-38及Holdgate等人, 2005,Drug Discov Today 中所描述之等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry；ITC)。熟習此項技術者將知曉商業設備可供用於ΔG°量測。ΔG°亦可藉由使用如SantaLucia, 1998,Proc Natl Acad Sci USA. 95：1460-1465所描述之最近鄰模型，使用由Sugimoto等人, 1995,Biochemistry 34:11211-11216及McTigue等人, 2004,Biochemistry 43:5388-5405描述之適當導出的熱力學參數來在數值上估算。為具有藉由雜交調節本發明之寡核苷酸之既定核酸目標的可能性，本發明之寡核苷酸針對10-30個核苷酸長度之寡核苷酸雜交至ΔG°估算值低於-10千卡(kcal)之目標核酸。在一些實施例中，雜交度或雜交強度係藉由標準狀態吉布斯自由能ΔG°量測。針對8-30個核苷酸長度之寡核苷酸，寡核苷酸可雜交至ΔG°估算值低於-10千卡範圍，諸如低於-15千卡，諸如低於-20千卡及諸如低於-25千卡之目標核酸。在一些實施例中，寡核苷酸雜交至ΔG°估算值為-10至-60千卡，諸如-12至-40，諸如-15至-30千卡或-16至-27千卡，諸如-18至-25千卡的目標核酸。
目標核酸 根據本發明，目標核酸為編碼哺乳動物RTEL1之核酸且可例如為基因、RNA、mRNA及前體mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。目標可因此稱為RTEL1目標核酸。
本發明之寡核苷酸可例如靶向哺乳動物RTEL1中之外顯子區(尤其siRNA及shRNA目標外顯子區，但亦反義寡核苷酸)，或可例如靶向RTEL1前體mRNA中之內含子區(尤其反義寡核苷酸目標內含子區)。人類RTEL1基因編碼此等中之15個轉錄物，7個為蛋白質編碼且因此為潛在的核酸目標。表1列出定位於SEQ ID NO:1之人類RTEL1前體mRNA上之7個轉錄物的經預測外顯子區及內含子區。應理解，本發明之寡核苷酸可靶向表1中所列出之轉錄物中之一或多者的成熟mRNA序列。 表1.用於編碼RTEL1 mRNA轉錄物之不同蛋白質的人類RTEL1前體mRNA (SEQ ID NO:1)中的轉錄物區外顯子區及內含子區
Figure 108124604-A0304-0001
適當地，目標核酸編碼RTEL1蛋白質，尤其哺乳動物RTEL1，諸如人類RTEL1 (參見例如表2及3)，其提供人類及猴RTEL1之前體mRNA序列。
在一些實施例中，目標核酸選自SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2或其天然存在之變體(例如表1中編碼哺乳動物RTEL1蛋白質之序列)。
若在研究或診斷學中採用本發明之寡核苷酸，則目標核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。
就活體內或活體外應用而言，本發明之寡核苷酸通常能夠抑制細胞中RTEL1目標核酸之表現，該細胞表現RTEL1目標核酸。本發明之寡核苷酸之核鹼基的連續序列通常與RTEL1目標核酸互補，如跨越寡核苷酸之長度所量測，視情況除一或兩個錯配之外，且視情況不包括將寡核苷酸連接至視情況選用之官能基(諸如共軛物)之基於核苷酸的連接子區或其他非互補末端核苷酸(例如區D'或D'')。在一些實施例中，目標核酸可為RNA或DNA，諸如信使RNA，諸如成熟mRNA (例如表1中所列出之轉錄物的外顯子的區)或前體mRNA。
在一些實施例中，目標核酸為編碼諸如人類RTEL1之哺乳動物RTEL1蛋白質之RNA或DNA，例如人類RTEL1 mRNA序列，諸如以SEQ ID NO 1所揭示者。關於例示性目標核酸之其他資訊提供於表2及表3中。 表2. 跨越物種之RTEL1之基因組及裝配資訊.
Figure 108124604-A0304-0002
 Fwd = 正股。基因組座標提供前體mRNA序列(基因組序列)。NCBI參考提供mRNA序列(cDNA序列)。 表3.跨越物種之RTEL1之序列細節.
Figure 108124604-A0304-0003
附註：SEQ ID NO 2包含多個NNNN區，其中定序已無法精確地優化序列，且因此包括退化序列。為避免疑問，本發明之化合物與實際目標序列互補且因此不為退化化合物。
在一些實施例中，目標核酸為SEQ ID NO 1。
在一些實施例中，目標核酸為SEQ ID NO 2。
目標序列 如本文中所使用之術語「目標序列」係指存在於目標核酸中之核苷酸的序列，其包含與本發明之寡核苷酸互補之核鹼基序列。在一些實施例中，目標序列由具有核鹼基序列之目標核酸上的區組成，該核鹼基序列與本發明之寡核苷酸之連續核苷酸序列互補。目標核酸之此區可互換地稱為目標核苷酸序列、目標序列或目標區。在一些實施例中，目標序列長於單個寡核苷酸之互補序列，且可例如表示目標核酸之較佳區，該區可藉由本發明之若干寡核苷酸靶向。
在一些實施例中，目標序列為選自由人類RTEL1 mRNA外顯子，諸如選自上文表1中之清單的RTEL1人類mRNA外顯子組成之群之序列。
在一些實施例中，目標序列為選自由人類RTEL1 mRNA內含子，諸如選自上文表1中之清單的RTEL1人類mRNA內含子組成之群之序列。
本發明之寡核苷酸包含與目標核酸互補或雜交之連續核苷酸序列，諸如本文中所描述之目標序列。
與寡核苷酸互補或雜交之目標序列一般包含具有至少10個核苷酸之連續核鹼基序列。連續核苷酸序列在10與35個核苷酸之間，諸如12至30個，諸如14至20個，諸如16至20個連續核苷酸。在本發明之一個實施例中，目標序列選自由以下組成之群： 如表4中所示之SEQ ID NO:3-21。 表4：人類RTEL1前體mRNA (SEQ ID NO:1)上之目標序列
Figure 108124604-A0304-0004
在一些實施例中，目標序列選自表5A或5B中所示之區。
目標細胞 如本文中所使用之術語「目標細胞」係指表現目標核酸之細胞。若目標細胞感染有HBV，則其對於本發明之醫療用途為有利的。在一些實施例中，目標細胞可在活體內或活體外。在一些實施例中，目標細胞為哺乳動物細胞，諸如嚙齒動物細胞，諸如小鼠細胞或大鼠細胞，或土拔鼠細胞或靈長類細胞，諸如猴細胞(例如食蟹獼猴細胞)或人類細胞。
在較佳實施例中，目標細胞表現RTEL1 mRNA，諸如RTEL1前體mRNA或RTEL1成熟mRNA。就反義寡核苷酸靶向而言，通常忽略HTRA1 mRNA之聚A尾。
此外，目標細胞可為肝細胞。在一個實施例中，目標細胞為感染HBV之感染之原發性人類肝細胞，抑或衍生自感染HBV之感染之個體或具有人類化肝臟之感染HBV之感染的小鼠(PhoenixBio, PXB-小鼠)。
根據本發明，目標細胞可感染有HBV。此外，目標細胞可包含HBV cccDNA。因此，目標細胞較佳包含RTEL1 mRNA，諸如RTEL1 前體mRNA或RTEL1成熟mRNA及HBV cccDNA。
天然存在之變體 術語「天然存在之變體」係指HTRA1基因或轉錄物之變體，其源自與目標核酸相同之基因座，但可例如藉助於引起大量密碼子編碼同一胺基酸之基因密碼之簡併，或歸因於前體mRNA之替代性拼接，或存在多形現象(諸如單核苷酸多形現象(SNP))及對偶基因變體而不同。基於存在寡核苷酸之充足互補序列，本發明之寡核苷酸可因此靶向目標核酸及其天然存在之變體。
在一些實施例中，天然存在之變體與哺乳動物RTEL1目標核酸，諸如SEQ ID NO 1及/或2之目標核酸具有至少95%，諸如至少98%或至少99%同源性。在一些實施例中，天然存在之變體與SEQ ID NO:1之人類RTEL1目標核酸具有至少99%同源性。在一些實施例中，天然存在之變體為已知多形現象。
表現之調節 如本文中所使用之術語「表現之調節」應理解為當相比於在投與寡核苷酸之前RTEL1的量時，寡核苷酸更改RTEL1之量之能力的總術語。可替代地，表現之調節可藉由參考對照實驗來判定。一般應理解，對照物為用生理食鹽水組合物處理之個體或目標細胞，或用非靶向寡核苷酸(模擬物)處理之個體或目標細胞。
調節之一種類型為寡核苷酸例如藉由使mRNA降解或阻斷轉錄而抑制、下調、減少、遏制、移除、停止、阻斷、預防、減輕、降低、避免或終止HTRA1之表現的能力。調節之另一類型為寡核苷酸例如藉由修復拼接位點或防止抑制性機制(諸如微RNA壓制)之剪接或移除或阻斷而恢復、增加或增強RTEL1之表現的能力。
糖修飾 當相比於發現在DNA及RNA中之核糖部分時，本發明之寡核苷酸可包含一或多個具有經修飾糖部分，亦即糖部分之修飾的核苷。
已製備大量具有核糖部分之修飾之核苷，其首要目的在於改良寡核苷酸之某些特性，諸如親和力及/或核酸酶耐性。
此類修飾包括其中核糖環結構經修飾之彼等修飾，例如藉由用以下替代：己醣環(HNA)；或雙環，其通常在核糖環(LNA)上之C2與C4碳原子之間具有雙基團(biradicle)橋鍵；或未鍵聯核糖環(例如UNA)，其通常在C2與C3碳原子之間缺乏鍵。其他經糖修飾之核苷包括例如雙環己醣核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。經修飾核苷亦包括糖部分經非糖部分替代之核苷，例如在肽核酸(PNA)或N-嗎啉基核酸之情況下。
糖修飾亦包括經由將核糖環上之取代基更改成除氫以外的基團，或在DNA及RNA核苷中天然發現之2'-OH基團而得到的修飾。取代基可例如在2'、3'、4'或5'位置處引入。
高親和力經修飾核苷 高親和力經修飾核苷為經修飾之核苷酸，其在併入至寡核苷酸中時增強寡核苷酸對其互補目標之親和力，例如如藉由熔融溫度(Tm )所量測。本發明之高親和力經修飾核苷較佳導致熔融溫度升高如下：每個經修飾核苷在+0.5至+12℃之間、更佳在+1.5至+10℃之間且最佳在+3至+8℃之間。大量高親和力經修飾核苷為此項技術中已知的，且包括例如多種經2'取代之核苷以及鎖核酸(locked nucleic acid；LNA) (參見例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。
經 2' 糖修飾之核苷 經2'糖修飾之核苷為在2'位置處具有除H或-OH以外的取代基之核苷(經2'取代之核苷)，或包含能夠在2'碳與核糖環中之第二碳之間形成橋鍵的2'鍵聯雙基團的核苷，諸如LNA (2'-4'雙基團橋接)核苷。
實際上，大量焦點已聚集在形成經2'取代之核苷上，且已發現許多經2'取代之核苷在併入至寡核苷酸中時具有有益特性。舉例而言，經2'修飾之糖可向寡核苷酸提供增強之結合親和力及/或增加之核酸酶耐性。經2'取代之經修飾核苷之實例為2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。對於其他實例，請參見例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213，以及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。以下為一些經2'取代之經修飾核苷之圖示。
Figure 02_image001
Figure 02_image003
相對於本發明，經2'取代糖之經修飾核苷不包括2'橋接核苷，如LNA。
鎖核酸核苷 (LNA 核苷 ) 「LNA核苷」為經2'-糖修飾之核苷，其包含鍵聯該核苷之核糖環之C2'與C4'的雙基團(亦稱為「2'-4'橋鍵」)，其限制或鎖定核糖環之構形。此等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。當LNA併入至互補RNA或DNA分子之寡核苷酸中時，核糖之構形鎖定與增強之雜交親和力(雙螺旋體穩定化)相關聯。此可常規地藉由量測寡核苷酸/補體雙螺旋體之熔融溫度而測定。
非限制性、例示性LNA核苷揭示於WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth等人 J. Org. Chem. 2010, 第75(5)卷 第1569-81頁、Mitsuoka等人, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238，以及Wan及Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645−9667中。
本發明之LNA核苷之特定實例呈現於方案1 (其中B如上文所定義)中。方案 1
Figure 108124604-A0304-0005
特定LNA核苷為β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA，諸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA (ScET)及ENA。
醫藥學上可接受之鹽 術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留游離鹼或游離酸(其合乎生物學上或其他方面需要)之生物有效性及特性之鹽。該等鹽係由以下形成：無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，尤其鹽酸；及有機酸，諸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、N-乙醯基半胱胺酸。此外，此等鹽可藉由將無機鹼或有機鹼添加至游離酸中來製備。衍生自無機鹼之鹽包括但不限於鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽。衍生自有機鹼之鹽包括但不限於以下之鹽：一級胺、二級胺及三級胺；經取代胺，包括天然存在之經取代胺；環胺及鹼離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、離胺酸、精胺酸、N-乙基哌啶、哌啶、多元胺樹脂。式(I)化合物亦可以兩性離子形式存在。式(I)化合物之尤其較佳醫藥學上可接受之鹽為以下之鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸及甲磺酸。
RNase H 活性及募集 反義寡核苷酸之RNase H活性係指當與互補RNA分子成雙螺旋體時，反義寡核苷酸募集RNase H之能力。WO01/23613提供用於測定RNaseH活性之活體外方法，其可用於判定募集RNaseH之能力。通常，若寡核苷酸在具備互補目標核酸序列時具有至少5%之如以pmol/l/min為單位所量測之初始速率，諸如至少10%或多於20%之初始速率，則認為其能夠募集RNase H，該初始速率係在使用與被測試之經修飾寡核苷酸具有相同基底序列，但在寡核苷酸中所有單體之間僅含有DNA單體與硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸，且使用由WO 01/23613 (特此以引用之方式併入)提供之實例91-95之方法時測定。就用於測定RHase H活性而言，重組性人類RNA酶H1可購自Creative Biomart® (與表現於大腸桿菌中之His標籤融合之重組性人類RNASEH1)。
間隔體 本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可為間隔體，亦稱為間隔體寡核苷酸或間隔體設計。通常使用反義間隔體以經由RNase H介導之降解來抑制目標核酸。間隔體寡核苷酸包含至少三個相異結構區，5'-側翼、間隙及3'-側翼，F-G-F'，呈『5 -＞ 3』定向。「間隙」區(G)包含使得寡核苷酸能夠募集RNase H之一段連續DNA核苷酸。間隙區係藉由包含一或多個經糖修飾之核苷(有利地高親和力經糖修飾之核苷)之5'側翼區(F)且藉由包含一或多個經糖修飾之核苷(有利地高親和力經糖修飾之核苷)之3'側翼區(F')側翼。區F及F'中之一或多個經修糖飾之核苷增強目標核酸之寡核苷酸的親和力(亦即為增強親和力之經糖修飾之核苷)。在一些實施例中，區F及F'中之一或多個經糖修飾之核苷為經2'糖修飾之核苷，諸如高親和力2'糖修飾，諸如獨立地選自LNA及2'-MOE。
在間隔體設計中，間隙區之5'及3'最末核苷為DNA核苷，且分別與5' (F)或3' (F')區之經糖修飾之核苷相鄰定位。側翼序列可進一步經限定在距間隙區最遠的末端處，亦即在5'側翼序列之5'端及3'側翼序列之3'端處具有至少一個經糖修飾之核苷。
區F-G-F'形成連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可包含具有式F-G-F'之間隔體區。
間隔體設計F-G-F'之總體長度可為例如12至32個核苷，諸如13至24，諸如14至22個核苷，諸如14至17個，諸如16至18個核苷。
藉助於實例，本發明之間隔體寡核苷酸可由下式表示： F1-8 -G5-18 -F'1-8 ，諸如 F1-8 -G5-16 -F'1-8 ，諸如 F1-8 -G7-16 -F'2-8 其限制條件為間隔體區F-G-F'之總體長度為至少12個，諸如至少14個核苷酸長度。
在本發明之一態樣中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列由以下組成或包含以下：式5'-F-G-F'-3'之間隔體，其中區F及F'獨立地包含或由1-8個核苷組成，該等核苷中1-4個經2'糖修飾且限定F及F'區之5'及3'端，且G為在6至18個(諸如6至16個)能夠募集RNaseH之核苷的區。在一些實施例中，G區由DNA核苷組成。
區F、G及F'在下文進一步加以定義，且可併入至F-G-F'式中。
間隔體 - 區 G 間隔體之區G (間隙區)為使得寡核苷酸能夠募集RNaseH (諸如人類RNase H1)之核苷(通常DNA核苷)區。RNaseH為識別DNA與RNA之間的雙螺旋體且酶促裂解RNA分子之細胞酶。適合地，間隔體可具有至少5或6個連續DNA核苷，諸如5-18個連續DNA核苷、5-17個連續DNA核苷，諸如5-16個連續DNA核苷，諸如6-15個連續DNA核苷，諸如7-14個連續DNA核苷，諸如8-12個連續DNA核苷酸，諸如8-12個連續DNA核苷酸長度之間隙區(G)。在一些實施例中，間隙區G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個連續DNA核苷組成。在一些情況下，間隙區中之胞嘧啶(C) DNA經甲基化，此類殘基標註為5-甲基-胞嘧啶(me C，或用e代替c)。當間隙中存在cg二核苷酸以降低潛在毒性時，間隙中之胞嘧啶DNA之甲基化為有利的，修飾不會對寡核苷酸之功效產生顯著影響。已報導經5'取代之DNA核苷，諸如5'甲基DNA核苷用於DNA間隙區中(EP 2 742 136)。
在一些實施例中，間隙區G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個連續硫代磷酸酯鍵聯DNA核苷組成。在一些實施例中，間隙中之所有核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵。
儘管傳統間隔體具有DNA間隙區，但存在用於間隙區內時允許RNaseH募集之經修飾核苷之諸多實例。已報導在包括於間隙區內時能夠募集RNaseH的經修飾核苷包括例如α-L-LNA、C4'烷基化DNA (如PCT/EP2009/050349及Vester等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300中所描述，該等文獻皆以引用之方式併入本文中)、如ANA及2'F-ANA之阿拉伯糖衍生之核苷(Mangos等人 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (未鎖定核酸) (如Fluiter等人, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039中所描述，該文獻以引用之方式併入本文中)。UNA為未鎖定核酸，通常其中核糖之C2與C3之間的鍵已移除，從而形成未鎖定的「糖」殘基。此類間隔體中所使用之經修飾核苷在引入至間隙區中時可為採用2'內型(DNA樣)結構(亦即允許RNaseH募集之修飾)的核苷。在一些實施例中，本文中所描述之DNA間隙區(G)可視情況含有1至3個在引入至間隙區中時採用2'內型(DNA類)結構之經糖修飾之核苷。
間隔體 - 側翼區 F 及 F' 區F緊鄰區G之5' DNA核苷定位。區F之3'最末核苷為經糖修飾之核苷，諸如高親和力經糖修飾之核苷，例如經2'取代之核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。
區F緊鄰區G之3' DNA核苷定位。區F'之5'最末核苷為經糖修飾之核苷，諸如高親和力經糖修飾之核苷，例如經2'取代之核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。
區F為1至8個連續核苷酸長度，諸如2至6，諸如3至4個連續核苷酸長度。有利地，區F之5'最末核苷為經糖修飾之核苷。在一些實施例中，區F之兩個5'最末核苷為經糖修飾之核苷。在一些實施例中，區F之5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區F之兩個5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區F之兩個5'最末核苷為經2'取代之核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，區F之5'最末核苷為經2'取代之核苷，諸如MOE核苷。
區F'為2-8個連續核苷酸長度，諸如3-6，諸如4-5個連續核苷酸長度。有利地，在一些實施例中，區F'之3'最末核苷為經糖修飾之核苷。在一些實施例中，區F'之兩個3'最末核苷為經糖修飾之核苷。在一些實施例中，區F'之兩個3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區F'之3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區F'之兩個3'最末核苷為經2'取代之核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，區F'之3'最末核苷為經2'取代之核苷，諸如MOE核苷。
應注意，當區F或F'之長度為一時，其有利地為LNA核苷。
在一些實施例中，區F及F'獨立地由以下組成或包含以下：經糖修飾之核苷之連續序列。在一些實施例中，區F之經糖修飾之核苷可獨立地選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟-ANA單元。
在一些實施例中，區F及F'獨立地包含LNA與經2'取代之經修飾核苷兩者(混合翼設計)。
在一些實施例中，區F及F'僅由一種類型之經糖修飾之核苷組成，諸如僅由MOE或僅由β-D-氧基LNA或僅由ScET組成。此類設計亦稱為均一側翼序列或均一間隔體設計。
在一些實施例中，區F或F'或者F及F'中之所有核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些實施例中，區F由1-5個，諸如2-4個，諸如3-4個，諸如1、2、3、4或5個連續LNA核苷組成。在一些實施例中，區F及F'中之所有核苷為β-D-氧基LNA核苷。
在一些實施例中，區F或F'或者F及F'中之所有核苷為經2'取代之核苷，諸如OMe或MOE核苷。在一些實施例中，區F由1、2、3、4、5、6、7或8個連續OMe或MOE核苷組成。在一些實施例中，側翼區中僅一者可由經2'取代之核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成。在一些實施例中，5' (F)側翼區由經2'取代之核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而3' (F')側翼區包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些實施例中，3' (F)側翼區經2'取代之核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而5' (F')側翼區包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些實施例中，區F及F'中之所有經修飾核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中區F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替型側翼序列，更多細節參見此等者之定義)。在一些實施例中，區F及F'中之所有經修飾核苷為β-D-氧基LNA核苷，其中區F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替型側翼序列，更多細節參見此等者之定義)。
在一些實施例中，區F及F'之5'最末及3'最末核苷為LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些實施例中，區F與區G之間的核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，區F'與區G之間的核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，區F或F'或者F及F'之核苷之間的核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。
LNA 間隔體 LNA間隔體為其中區F及F'中之一者或兩者包含或由組成LNA核苷之間隔體。β-D-氧基間隔體為其中區F及F'中之一者或兩者包含或由β-D-氧基LNA核苷組成之間隔體。
在一些實施例中，LNA間隔體具有式：[LNA]1-5 -[區G]-[LNA]1-5 ，其中區G如間隔體區G定義中所定義。
MOE 間隔體 MOE間隔體為其中區F及F'由MOE核苷組成之間隔體。在一些實施例中，MOE間隔體具有設計[MOE]1-8 -[區G]-[MOE]1-8 ，諸如[MOE]2-7 -[區G]5-16 -[MOE]2-7 ，諸如[MOE]3-6 -[區G]-[MOE]3-6 ，其中區G如間隔體定義中所定義。具有5-10-5設計之MOE間隔體(MOE-DNA-MOE)已廣泛用於此項技術中。
寡核苷酸中之區 D' 或 D'' 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含或由以下組成：與目標核酸互補之寡核苷酸之連續核苷酸序列，諸如間隔體F-G-F'，及其他5'及/或3'核苷。其他5'及/或3'核苷可或可不與目標核酸完全互補。此類其他5'及/或3'核苷在本文中可稱為區D'及D''。
可出於將連續核苷酸序列(諸如間隔體)連接至共軛部分或另一官能基之目的而添加區D'或D''。當用於連接連續核苷酸序列與共軛部分時，其可充當生物可裂解連接子。替代地，其可用於提供外切核酸酶保護或提供合成或製造簡易性。
區D'及D''可連接至區F之5'端或區F'之3'端，分別產生下式之設計：D'-F-G-F'、F-G-F'-D''或D'-F-G-F'-D''。在此情況下，F-G-F'為寡核苷酸之間隔體部分，且區D'或D''構成寡核苷酸之獨立部分。
區D'或D''可獨立地包含或由以下組成：1、2、3、4或5個其他核苷酸，其可與目標核酸互補或不互補。鄰近於F或F'區之核苷酸不為經糖修飾之核苷酸，諸如DNA或RNA或此等者之經鹼基修飾之型式。D'或D'區可充當易受核酸酶敏感影響的生物可裂解連接子(參見連接子之定義)。在一些實施例中，額外5'及/或3'端核苷酸與磷酸二酯鍵鍵聯，且為DNA或RNA。適用作區D'或D''之基於核苷酸之生物可裂解連接子揭示於WO2014/076195中，該等連接子藉助於實例包括磷酸二酯鍵聯之DNA二核苷酸。生物可裂解連接子於聚寡核苷酸構築體中之用途揭示於WO2015/113922中，其中該等連接子用於鍵聯單一寡核苷酸內之多個反義構築體(例如，間隔體區)。
在一個實施例中，除構成間隔體之連續核苷酸序列以外，本發明之寡核苷酸亦包含區D'及/或D''。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可由下式表示： F-G-F'，尤其F1-8 -G5-16 -F'2-8 D'-F-G-F'，尤其D'1-3 -F1-8 -G5-16 -F'2-8 F-G-F'-D''，尤其F1-8 -G5-16 -F'2-8 -D''1-3 D'-F-G-F'-D''，尤其D'1-3 - F1-8 -G5-16 -F'2-8 -D''1-3 。
在一些實施例中，定位於區D'與區F之間的核苷間鍵為磷酸二酯鍵。在一些實施例中，區F'與區D''之間的核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵。
共軛物 如本文中所使用之術語共軛物係指共價鍵聯至非核苷酸部分(共軛部分或區C或第三區)之寡核苷酸。
本發明之寡核苷酸與一或多個非核苷酸部分之共軛可例如藉由影響寡核苷酸之活性、細胞分佈、細胞吸收或穩定性來改良寡核苷酸之藥理學。在一些實施例中，共軛部分藉由改良寡核苷酸之細胞分佈、生物可用性、代謝、分泌、滲透性及/或細胞吸收來修飾或增強寡核苷酸之藥物動力學特性。特定言之，共軛物可使寡核苷酸靶向特定器官、組織或細胞類型，且藉此增強寡核苷酸在彼器官、組織或細胞類型中之有效性。同時，共軛物可用以降低寡核苷酸在非目標細胞類型、組織或器官中之活性，例如在非目標細胞類型、組織或器官中之偏離目標活性或活性。
WO 93/07883及WO2013/033230提供適合的共軛物分，該等文獻特此以引用之方式併入。其他適合的共軛部分為能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之彼等共軛部分。特定言之，三價的N-乙醯基半乳胺糖共軛部分適合於結合至ASGPR，參見例如WO 2014/076196、WO 2014/207232及WO 2014/179620 (特此以引用之方式併入) 此類共軛物用以增強肝對寡核苷酸之吸收，同時降低其在腎臟中之存在度，藉此相比於同一寡核苷酸之未共軛型式，增加經共軛寡核苷酸之肝臟/腎臟比率。
寡核苷酸共軛物及其合成亦已報導於Manoharan在Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001中及Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103之全面綜述中，該等文獻中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
在一實施例中，非核苷酸部分(共軛部分)選自由以下組成之群：碳水化合物、細胞表面受體配位體、藥物物質、激素、親油性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素(例如細菌毒素)、維生素、病毒蛋白(例如蛋白殼)或其組合。
連接子 鍵或連接子為兩個原子之間的連接，其經由一或多個共價鍵將所關注之一個化學基團或片段鍵聯至所關注之另一化學基團或片段。共軛部分可直接或經由鍵聯部分(例如連接子或繫栓)附接至寡核苷酸。連接子用以將第三區(例如共軛部分(區C))共價連接至第一區(例如與目標核酸互補之寡核苷酸或連續核苷酸序列(區A))。
在本發明之一些實施例中，本發明之共軛物或寡核苷酸共軛物可視情況包含連接子區(第二區或區B及/或區Y)，其定位於與目標核酸互補之寡核苷酸或連續核苷酸序列(區A或第一區)與共軛部分(區C或第三區)之間。
區B係指包含或由生理學上不穩定鍵組成之生物可裂解連接子，該生理學上不穩定鍵在通常在哺乳動物身體內遭遇之條件或類似於在哺乳動物身體內遭遇之彼等條件下為可裂解的。生理學上不穩定連接子經歷化學轉化(例如，裂解)之條件包括化學條件，諸如pH、溫度、氧化或還原條件或藥劑，及在哺乳動物細胞中發現之鹽濃度或類似於在哺乳動物細胞中遇到之鹽濃度。哺乳動物細內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中(諸如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)之酶活性之存在。在一個實施例中，生物可裂解連接子易受S1核酸酶裂解影響。在一較佳實施例中，易受連接子影響之核酸酶包含1與10個之間的核苷，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷、更佳2與6個之間核苷且最佳2與4個之間的鍵聯核苷，該等核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵，諸如至少3或4或5個連續磷酸二酯鍵。較佳地，核苷為DNA或RNA。含有生物可裂解連接子之磷酸二酯更詳細地描述於WO 2014/076195 (特此以引用之方式併入)中。
區Y係指未必為生物可裂解的但主要用以將共軛部分(區C或第三區)共價至寡核苷酸(區A或第一區)之連接子。區Y連接子可包含鏈結構或重複單元之寡聚物，諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基。本發明之寡核苷酸共軛物可由以下區域性要素構成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。在一些實施例中，連接子(區Y)為胺基烷基，諸如C2 - C36胺基烷基，包括例如C6至C12胺基烷基。在一較佳實施例中，連接子(區Y)為C6胺基烷基。
治療 如本文中所使用之術語「治療」係指對現有疾病(例如如在本文中稱為疾病或病症)之治療或疾病之預防(亦即防治)兩者。因此將認識到，如本文中所提及之治療在一些實施例中可為防治性的。防治性可理解為預防HBV感染變為慢性HBV感染或預防由慢性HBV感染引起之重度肝臟疾病，諸如肝硬化及肝細胞癌。
預防 本文中，術語「預防(preventing/prevention/prevents)」係關於防治性治療，亦即係關於目的係為了預防而非治癒疾病之量測或程序。預防意謂獲得所需藥理學及/或生理作用，其就完全或部分預防疾病或其症狀而言為防治性的。因此，本文中「預防HBV感染」包括預防個體出現HBV感染及預防HBV感染之症狀出現。在本發明中，尤其涵蓋預防來自感染HBV之母親之孩子的HBV感染。亦涵蓋預防急性HBV感染變為慢性HBV感染。
患者 出於本發明之目的，「個體」(或「患者」)可為脊椎動物。在本發明之上下文中，術語「個體」包括人類及其他動物(尤其哺乳動物)及其他生物體。因此，本文中所提供之手段及方法適用於人類治療及獸醫應用。因此，在本文中個體可為動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、天竺鼠、雪貂、貓、犬、雞、綿羊、牛物種、馬、駱駝或靈長類。較佳地，個體為哺乳動物。更佳地，個體為人類。
經感染肝細胞中之HBV cccDNA對持續性慢性感染及再活化負責，為所有病毒次基因組轉錄物及前基因組RNA (pgRNA)之模板以經由胞內核衣殼再循環確保新合成之病毒後代與cccDNA池補給兩者。在本發明之上下文中，第一次顯示RTEL1與cccDNA穩定性相關聯。此知識允許去穩定化感染HBV之個體中之cccDNA的機會，其繼而打開完全治癒長期感染HBV之患者的機會。
本發明之一個態樣為用於治療及/或預防B型肝炎病毒(HBV)感染，尤其慢性HBV感染之RTEL1抑制劑。
RTEL1抑制劑可例如為特異性結合至RTEL1蛋白質之小分子，其中該抑制劑防止或減少RTEL1蛋白質與cccDNA之結合。
本發明之一實施例為能夠降低經感染細胞(諸如感染HBV之細胞)中之cccDNA及/或pgRNA的RTEL1抑制劑。
在又一實施例中，RTEL1抑制劑能夠降低感染HBV之個體中之活體內HBsAg及/或HBeAg。
本發明之寡核苷酸 治療性寡核苷酸為潛在極佳的RTEL1抑制劑，此係由於其可靶向RTEL1轉錄物且經由RNA干擾路徑或經由RNaseH裂解促進其降解。可替代地，諸如適體之寡核苷酸亦可充當RTEL1蛋白質相互作用之抑制劑。
本發明之一個態樣為一種用於治療及/或預防B型肝炎病毒(HBV)感染之RTEL1靶向抑制劑。此類寡核苷酸可選自由單股反義寡核苷酸；siRNA分子；或shRNA分子組成之群。
本章節描述適用於治療及/或預防B型肝炎病毒(HBV)感染之新穎寡核苷酸。
本發明之寡核苷酸能夠抑制活體外及活體內RTEL1表現。抑制係藉由將寡核苷酸雜交至編碼RTEL1之目標核酸或參與RTEL1之調控的目標核酸來達成。目標核酸可為哺乳動物RTEL1序列，諸如SEQ ID NO:1及/或2之序列。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸能夠經由抑制或下調目標之表現來調節目標表現。較佳地，相比於目標之正常表現量，此類調節產生至少20%之表現抑制，更佳相比於目標之正常表現量至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%抑制。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可能能夠在PXB-PHH細胞中使用10 µM來在活體外抑制RTEL1 mRNA之表現量達至少60%或70%。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可能能夠使用10µM PXB-PHH細胞來在活體外抑制RTEL1蛋白質之表現量達至少50%，此目標降低範圍就選擇與cccDNA減少具有良好相關性之核酸分子而言為有利的。適當地，實例提供可用於量測RTEL1 RNA或蛋白質抑制之檢定(例如實例1)。目標抑制係藉由寡核苷酸之連續核苷酸序列與目標核酸之間的雜交觸發。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸在寡核苷酸與目標核酸之間包含錯配。儘管存在錯配，但與目標核酸之雜交仍可足以顯示對RTEL1表現之所需抑制。由錯配產生之減少的結合親和力可有利地藉由寡核苷酸中增加之核苷酸數目及/或增加之能夠提高與目標之結合親和力的經修飾核苷(諸如經2'糖修飾中之核苷，包括存在於寡核苷酸序列內之LNA)數目來補償。
本發明之一態樣係關於一種具有12至60個核苷酸長度之寡核苷酸，其包含具有至少10個核苷酸長度，諸如至少12至30個核苷酸長度之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與哺乳動物RTEL1目標核酸，尤其人類RTEL1核酸至少95%互補，諸如完全互補。此等寡核苷酸能夠抑制RTEL1之表現。
本發明之一態樣係關於一種為具有12至30個核苷酸長度之反義寡核苷酸的根據本發明之寡核苷酸，其為包含至少10個核苷酸，諸如10至30個核苷酸長度之連續核苷酸序列，其與哺乳動物RTEL1至少90%互補，諸如完全互補。
本發明之另一態樣係關於一種根據本發明之寡核苷酸，其包含與SEQ ID NO:1之目標核酸至少90%互補(諸如完全互補)之具有12至20 (諸如15至22)個核苷酸長度的連續核苷酸序列。
在一些實施例中，寡核苷酸包含10至30核苷酸長度個連續序列，其與目標核酸或目標序列區至少90%互補，諸如至少91%，諸如至少92%，諸如至少93%，諸如至少94%，諸如至少95%，諸如至少96%，諸如至少97%，諸如至少98%或100%互補。
若本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸序列與目標核酸區完全互補(100%互補)，或在一些實施例中可在寡核苷酸與目標核酸之間包含一或兩個錯配，則為有利的。
在一些實施例中反義寡核苷酸序列與SEQ ID NO:1之對應目標核酸100%互補。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或連續核苷酸序列與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之目標核酸至少95%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸包含與存在於SEQ ID NO:1中之對應目標序列至少90%互補(諸如100%互補)之具有15至22個核苷酸長度的連續核苷酸序列，其中目標序列選自由SEQ ID NO:3至21 (表4)或表5A中區1A至959A組成之群。 表5A：可使用本發明之寡核苷酸靶向之SEQ ID NO 1區
Figure 108124604-A0304-0006
在一些實施例中，寡核苷酸包含與存在於SEQ ID NO:1中之對應目標序列至少90%互補(諸如100%互補性)之具有16至20 (諸如15至22)個核苷酸長度的連續核苷酸序列，其中目標序列選自由SEQ ID NO:3至21 (表4)或表5B中區B1至B28組成之群。 表5B：可使用本發明之寡核苷酸靶向之SEQ ID NO 1區
Figure 108124604-A0304-0007
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含或由以下組成：12至60個核苷酸長度，諸如13至50，諸如14至35，諸如15至30，諸如16至20個連續核苷酸長度。在一較佳實施例中，寡核苷酸包含或由15、16、17、18、19或20個核苷酸長度組成。
在一些實施例中，與目標核酸互補之寡核苷酸之連續核苷酸序列包含或由以下組成：12至30，諸如13至25，諸如15至23，諸如16至22個連續核苷酸長度。
在一些實施例中，與目標核酸互補之siRNA或shRNA之連續核苷酸序列包含或由以下組成：18至28，諸如19至26，諸如20至24，諸如21至23個連續核苷酸長度。
在一些實施例中，與目標核酸互補之單股反義寡核苷酸之連續核苷酸序列包含或由以下組成：12至22，諸如14至20，諸如16至20，諸如15至21，諸如15至18，諸如16至18，諸如16至17個連續核苷酸長度。
在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸序列包含或由選自由在表6中所列出之序列組成之群的序列組成(材料及方法章節)。
在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸序列包含或由以下組成：與選自由SEQ ID NO:22至237組成之群之序列具有至少90%一致性、較佳100%一致性的10至30個核苷酸長度(參見在表6中所列出之基元序列)。在一特定實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸序列選自SEQ ID NO：22；23；24；25；26；27；28；29；32；35；36；37；38；39；40；41；42；42；42；43；43；46；49；83；109；130；203；及232。
應理解，連續寡核苷酸序列(基元序列)可經修飾以例如增加核酸酶耐性及/或與目標核酸之結合親和力。
其中經修飾核苷(諸如高親和力經修飾核苷)併入至寡核苷酸序列中之圖案一般稱為寡核苷酸設計。
本發明之寡核苷酸可設計有經修飾核苷及RNA核苷(尤其對於siRNA及shRNA分子)或DNA核苷(尤其對於單股反義寡核苷酸)。有利地，使用高親和力經修飾核苷。
在一實施例中，寡核苷酸包含至少1個經修飾核苷，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16個經修飾核苷。在一實施例中，寡核苷酸包含1至10個經修飾核苷，諸如2至9個經修飾核苷，諸如3至8個經修飾核苷，諸如4至7個經修飾核苷，諸如6或7個經修飾核苷。適合的修飾描述於「定義」章節中之「經修飾核苷」、「高親和力經修飾核苷」、「糖修飾」、「2'糖修飾」及「鎖核酸(LNA)」下。
在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個經糖修飾之核苷，諸如經2'糖修飾之核苷。較佳地，本發明之寡核苷酸包含一或多個獨立地選自由以下組成之群的經2'糖修飾之核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA及LNA核苷。若經修飾核苷中之一或多者為鎖核酸(LNA)，則為有利的。
在另一實施例中，寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷間鍵。適合的核苷間修飾描述於「定義」章節中之「經修飾核苷間鍵」中。若寡核苷酸之5'或3'端處之至少2至3個核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵，則為有利的。就單股反義寡核苷酸而言，若連續核苷酸序列內之至少75%核苷間鍵(諸如所有)為硫代磷酸酯核苷間鍵，則為有利的。在一些實施例中，單股反義寡核苷酸之連續序列中之所有核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個LNA核苷，諸如1、2、3、4、5、6、7或8個LNA核苷，諸如2至6個LNA核苷，諸如3至7個LNA核苷，4至8個LNA核苷，或3、4、5、6、7或8個LNA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸中之至少75%經修飾核苷為LNA核苷，諸如80%、諸如85%、諸如90%經修飾核苷為LNA核苷。在另一實施例中，寡核苷酸中之所有經修飾核苷為LNA核苷。在又一實施例中，寡核苷酸可同時包含β-D-氧基-LNA與以下LNA核苷中之一或多者：呈β-D或α-L組態之硫基-LNA、胺基-LNA、氧基-LNA、ScET及/或ENA或其組合。在又一實施例中，所有LNA胞嘧啶單元為5-甲基-胞嘧啶。對於寡核苷酸或連續核苷酸序列之核酸酶穩定性有利的係，在核苷酸序列之5'端處具有至少1個LNA核苷，且在核苷酸序列之3'端處具有至少2個LNA核苷。
在本發明之一實施例中，本發明之寡核苷酸能夠募集RNase H。
在本發明中，有利的結構設計為如「定義」章節中之例如「間隔體」、「LNA間隔體」及「MOE間隔體」中所描述之間隔體設計。在本發明中，若本發明之反義寡核苷酸為具有F-G-F'設計之間隔體，則為有利的。在一些實施例中，間隔體為具有均一側翼序列之LNA間隔體。
在本發明之一些實施例中，LNA間隔體選自以下均一側翼序列設計：2-12-3、4-14-2、3-10-3、3-9-3、2-15-2、2-12-4、1-13-2、3-13-2、4-13-2、2-12-2、3-12-2、3-15-2、3-14-2、3-13-3、2-14-4、3-12-3、1-14-3、3-14-3、2-14-3、2-15-3、3-11-3、1-12-3、1-11-4、1-13-2、2-13-2、2-16-2、1-14-2、1-17-3及1-18-2。
表6 (材料及方法章節)列出各基元序列之較佳設計。
在所有情況下，F-G-F'設計可進一步包括如「定義」章節中「寡核苷酸中之區D'或D''」下所描述的區D'及/或D''。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸在間隔體區之5'或3'端處具有1、2或3個磷酸二酯鍵聯之核苷單元，諸如DNA單元。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸由以下組成：兩個5'磷酸二酯鍵聯之DNA核苷，隨後為如「定義」章節中所定義之F-G-F'間隔體區。在5'或3'端處含有磷酸二酯鍵聯之DNA單元的寡核苷酸適用於共軛且可進一步包含如本文中所描述之共軛部分。就遞送至肝臟而言，ASGPR靶向部分作為共軛部分為尤其有利的。
在本發明之一些實施例中，寡核苷酸選自具有以下CMP-ID-NO之寡核苷酸化合物之群組：22_1；23_1；24_1；25_1；26_1；27_1；28_1；29_1；30_1；31_1；32_1；33_1；34_1；35_1；36_1；37_1；38_1；39_1；40_1；41_1；42_1；42_2；42_3；43_1；43_2；44_1；45_；46_1；47_1；48_1；49_1；130_1；109_1；83_1；203_1及232_1 (參見表6)。
共軛物 由於HBV感染主要影響肝臟中之肝細胞，相比於未共軛抑制劑，將RTEL1抑制劑共軛至將增加抑制劑至肝臟之遞送的共軛部分係有利的。在一個實施例中，肝臟靶向部分選自包含膽固醇或其他脂質或之部分或能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之共軛部分。
在一些實施例中，本發明提供一種包含共價附接至共軛部分之本發明之核酸分子的共軛物。
去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)共軛部分包含能夠以等於或大於半乳糖之親和力的親和力結合至去唾液酸醣蛋白受體之一或多個碳水化合物部分(ASPGR靶向部分)。已研究諸多半乳糖衍生物對去唾液酸醣蛋白受體之親和力(參見例如：Jobst, S.T.及Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686)，或容易使用此項技術中典型的方法來測定。
在一個實施例中，共軛部分包含至少一個選自由以下組成之群的去唾液酸醣蛋白受體靶向部分：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖及N-異丁醯基半乳胺糖。有利地，去唾液酸醣蛋白受體靶向部分為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。
為了產生ASGPR共軛部分，可將ASPGR靶向部分(較佳GalNAc)附接至共軛物架構。一般而言，ASPGR靶向部分可位於架構之同一端。在一個實施例中，共軛部分由鍵聯至間隔基之二至四個末端GalNAc部分組成，該間隔基將各GalNAc部分鍵聯至可與反義寡核苷酸共軛的分支鏈分子。
在又一實施例中，共軛部分相對於去唾液酸醣蛋白受體靶向部分為單價、二價、三價或四價的。有利地，去唾液酸醣蛋白受體靶向部分包含N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)部分。
GalNAc共軛部分可包括例如WO 2014/179620及WO 2016/055601以及PCT/EP2017/059080 (特此以引用之方式併入)中所描述之彼等共軛部分，以及附接有GalNAc部分之小肽，諸如Tyr-Glu-Glu-(胺基己基GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3；與肝細胞上之去唾液酸醣蛋白受體結合的醣三肽，參見例如Duff等人, Methods Enzymol, 2000, 313, 297)；基於離胺酸之半乳糖簇(例如，L3G4；Biessen等人, Cardovasc. Med., 1999, 214)；及基於膽烷之半乳糖簇(例如，去唾液酸醣蛋白受體之碳水化合物識別基元)。
ASGPR共軛部分，尤其三價GalNAc共軛部分可使用此項技術中已知之方法附接至寡核苷酸之3'端或5'端。
在一個實施例中，ASGPR共軛部分鍵聯至寡核苷酸之5'端。
在一個實施例中，共軛部分為三價的N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)，諸如圖1中所示之彼等共軛部分，尤其如圖1D中所示。
製造方法 在另一態樣中，本發明提供用於製造本發明之寡核苷酸之方法，其包含使核苷酸單元反應且藉此形成包含於寡核苷酸中之共價鍵聯連續核苷酸單元。較佳地，該方法使用胺基磷酸酯化學方法(參見例如Caruthers等人, 1987, Methods in Enzymology 第154卷, 第287-313頁)。在另一實施例中，該方法進一步包含使連續核苷酸序列與共軛部分(配位體)反應以將共軛部分共價附接至寡核苷酸。在另一態樣中，提供一種用於製造本發明之組合物之方法，其包含將本發明之寡核苷酸或共軛寡核苷酸與醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑混合。
醫藥鹽 根據本發明之化合物可以其醫藥學上可接受之鹽之形式存在。術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留本發明化合物之生物有效性及特性的習知酸加成鹽或鹼加成鹽，且由適合的無毒有機酸或無機酸或有機鹼或無機鹼形成。酸加成鹽包括例如衍生自無機酸之彼等酸加成鹽，該等無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、胺磺酸、磷酸及硝酸；及衍生自有機酸之彼等酸加成鹽，該等有機酸諸如對甲苯磺酸、水楊酸、甲磺酸、草酸、丁二酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、反丁烯二酸及類似酸。鹼加成鹽包括衍生自氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉及氫氧化四級銨之彼等鹼加成鹽，諸如氫氧化四甲基銨。醫藥化合物變成鹽之化學修飾為醫藥化學家所熟知之技術，以便獲得化合物之經改良物理及化學穩定性、吸濕性、流動性及溶解度。舉例而言描述於Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435或Ansel, In：Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第6版 (1995), 第196及1456-1457頁中。舉例而言，本文中所提供之化合物之醫藥學上可接受之鹽可為鈉鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種反義寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽或其共軛物。在一較佳實施例中，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
醫藥組合物 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含前述寡核苷酸及/或寡核苷酸共軛物或其鹽中之任一者及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，且醫藥學上可接受之鹽包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥學上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸係以50 - 300 µM溶液之濃度用於醫藥學上可接受之稀釋劑中。
適用於本發明中之調配物見於例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版 (1985)中。就藥物遞送方法之簡要綜述而言，參見例如Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。WO 2007/031091提供醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑之其他適合且較佳實例(特此以引用之方式併入)。WO2007/031091中亦提供適合的劑量、調配物、投與途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽呈固體形式，諸如粉末，諸如凍乾粉末。
本發明之化合物、寡核苷酸或寡核苷酸共軛物可與醫藥學上可接受之活性或惰性物質混合以用於製備醫藥組合物或調配物。用於調配醫藥組合物之組合物及方法視多個準則而定，該等準則包括但不限於投與途徑、疾病程度或待投與之劑量。
此等組合物可藉由習知滅菌技術滅菌，或可經無菌過濾。所得水溶液可經封裝以按原樣使用，或凍乾，經凍乾製劑在投與之前與無菌溶液合併。製劑之pH通常將在3與11之間、更佳在5與9之間或在6與8之間，且最佳在7與8之間，諸如7至7.5。呈固體形式之所得組合物可以多個單一劑量單位封裝，各自含有固定量之上文所提及之一或多者劑，諸如封裝於錠劑或膠囊之密封封裝中。呈固體形式之組合物亦可封裝於用於彈性數量之容器中，諸如封裝於經設計以用於可局部適用的乳膏或軟膏之可擠壓的試管中。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物係為前藥。特定言之，就寡核苷酸共軛物而言，在前藥遞送至作用部位(例如目標細胞)時，共軛部分自寡核苷酸裂解。
投與 本發明之化合物、寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可局部投與(諸如，投與至皮膚、吸入劑、經眼或耳)或經腸(諸如，經口或經由胃腸道)或非經腸(諸如，靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內)。
在一較佳實施例中，本發明之寡核苷酸或醫藥組合物係藉由非經腸途徑投與，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸液、鞘內或顱內(例如腦內或室內)、玻璃體內投與。在一個實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經靜脈內投與。在另一實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經皮下投與。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物係以0.1-15 mg/kg，諸如0.2 - 10 mg/kg，諸如0.25 - 5 mg/kg之劑量投與。投與可為一週一次、每兩週一次、每三週一次或甚至每月一次。
本發明亦提供如針藥劑之製造對所描述之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物的用途，其中該藥劑呈用於皮下投與之劑型。
組合療法 在一些實施例中，本發明之抑制劑，諸如本發明之化合物、寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物係用於與另一治療劑之組合治療。治療劑可例如為用於上文所描述之疾病或病症之標準護理。
藉助於實例，本發明之寡聚物或寡聚物共軛物可與其他活性劑組合使用，該等活性劑諸如基於寡核苷酸之抗病毒劑，諸如基於序列特異性寡核苷酸之抗病毒劑，其經由反義(包括其他LNA寡聚物)、siRNA (諸如ARC520)、適體、嗎啉核酸或任何其他抗病毒的核苷酸序列依賴性作用模式而起作用。
藉助於其他實例，本發明之寡聚物或寡聚物共軛物可與其他活性劑組合使用，該等活性劑諸如免疫刺激抗病毒化合物，諸如干擾素(例如，聚乙二醇化干擾素α)、TLR7促效劑(例如，GS-9620)或治療性疫苗。
藉助於其他實例，本發明之寡聚物或寡聚物共軛物可與其他活性劑組合使用，該等活性劑諸如具有抗病毒活性之小分子。此等其他活性劑可例如為核苷/核苷酸抑制劑(例如恩替卡韋或泰諾福韋(tenofovir disoproxil fumarate))、衣殼化抑制劑、進入抑制劑(例如米魯德西B (Myrcludex B))。
在某些實施例中，額外治療劑可為HBV藥劑、C型肝炎病毒(HCV)藥劑、化學治療劑、抗生素、止痛劑、非類固醇消炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、止吐劑、止瀉劑或免疫抑制劑。
在特定相關實施例中，額外HBV試劑可為干擾素α-2b、干擾素α-2a及干擾素αcon-1 (聚乙二醇化及未聚乙二醇化)、利巴韋林；HBV RNA複製抑制劑；第二反義寡聚物；HBV治療性疫苗；HBV防治性疫苗；拉米夫定(3TC)；恩替卡韋(ETV)；泰諾福韋(TDF)；替比夫定(LdT)；阿德福韋；或HBV抗體療法(單株或多株)。
在其他特定相關實施例中，額外HCV藥劑可為干擾素α-2b、干擾素α-2a及干擾素αcon-1 (聚乙二醇化及未聚乙二醇化)；利巴韋林；派羅欣(pegasys)；HCV RNA複製抑制劑(例如，ViroPharma之VP50406系列)；HCV反義藥劑；HCV治療性疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；或HCV單株或多株抗體療法。
應用 本發明之寡核苷酸可用作例如診斷、治療及防治之研究試劑。
在研究中，此類寡核苷酸可用於特異性調節細胞(例如活體外細胞培養物)及實驗動物中RTEL1蛋白質之合成，藉此有助於對目標之功能分析或評估其作為治療性干預之目標的有用性。通常，目標調節係藉由降解或抑制mRNA生成蛋白質，藉此防止蛋白質形成來實現，或藉由降解或抑制基因或mRNA生成蛋白質之調節劑來實現。
若在研究或診斷學中採用本發明之寡核苷酸，則目標核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。
本發明亦涵蓋用於調節表現RTEL1目標細胞中之RTEL1表現的活體內或活體外方法，該方法包含以有效量向該細胞投與本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物。
在一些實施例中，目標細胞為哺乳動物細胞，尤其人類細胞。目標細胞可為活體外細胞培養物或形成哺乳動物中之組織之部分的活體內細胞。在較佳實施例中，目標細胞存在於肝臟中。目標細胞可為肝細胞。
本發明之一個態樣係關於適用作藥劑之本發明之反義寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物。
在本發明之一態樣中，本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物能夠降低經感染細胞中之cccDNA含量且因此抑制HBV感染。特定言之，反義寡核苷酸能夠影響以下參數中之一或多者：i)減少經感染細胞中之cccDNA及/或ii)減少經感染細胞中之pgRNA及/或iii)減少經感染細胞中之HBV DNA及/或iv)減少經感染細胞中之HBV病毒抗原。
舉例而言，相比於對照物，抑制HBV感染之核酸分子可降低i)經感染細胞中之cccDNA含量達至少40%，諸如50%、60%、70%、80%、或90%降低；或相比於對照物，降低ii) pgRNA之含量達至少40%，諸如50%、60%、70%、80%或90%降低。對照物可為未經治療之細胞或動物，或用適當對照物治療之細胞或動物。
對HBV感染之抑制可在活體外使用感染HBV之原發性人類肝細胞或在活體內使用人類化肝細胞PXB小鼠模型來量測(可在PhoenixBio獲得, 參見Kakuni等人 2014 Int. J. Mol. Sci. 15:58-74)。對HBsAg及/或HBeAg分泌之抑制可藉由ELISA量測，例如藉由根據製造商之說明書使用CLIA ELISA套組(Autobio Diagnostic)。胞內cccDNA或HBV mRNA及pgRNA之減少可藉由qPCR量測，例如如材料及方法章節中所描述。用於評價測試化合物是否抑制HBV感染之其他方法為藉由qPCR量測HBV DNA分泌，例如如WO 2015/173208中所描述或使用北方墨點(Northern Blot)；原位雜交或免疫螢光。
由於RTEL1含量之降低，本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物可用於抑制HBV感染之發展或可用於治療HBV感染。特定言之，cccDNA之不穩定及減少，相比於僅減少HBsAg分泌之化合物，本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物更有效地抑制罹患慢性HBV感染或治療慢性HBV感染。
因此，本發明之一個態樣係關於本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物之用途，其用於減少感染HBV之個體之cccDNA及/或pgRNA。
本發明之另一態樣係關於本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物之用途，其用於抑制罹患慢性HBV感染或治療慢性HBV感染。
本發明之另一態樣係關於本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物之用途，其用於降低感染HBV之個人的感染性。在本發明之一特定態樣中，本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物抑制罹患慢性HBV感染。
待用本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物治療(或防治性地接受本發明之反義寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物)之個體較佳為人類，更佳為HBsAg陽性且/或HBeAg陽性的人類患者，甚至更佳為HBsAg陽性且HBeAg陽性的人類患者。
因此，本發明係關於一種治療HBV感染之方法，其中該方法包含投與有效量之本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物。本發明進一步係關於一種預防由慢性HBV感染引起之肝硬化及肝細胞癌之方法。
本發明亦提供本發明之寡核苷酸、共軛物化合物或醫藥組合物之用途，其用於製造藥劑，尤其用於治療感染HBV之個人之HBV感染或慢性HBV感染或降低感染性之藥劑。在較佳實施例中，藥劑係以用於皮下投與之劑型製造。
本發明亦提供本發明之寡核苷酸、共軛物化合物該醫藥組合物之用途，其用於製造藥劑，其中該藥劑呈用於靜脈內投與之劑型。
本發明之寡核苷酸、共軛物或醫藥組合物可用於組合療法。舉例而言，本發明之寡核苷酸、共軛物或醫藥組合物可與其他抗HBV藥劑組合，該等其他藥劑諸如用於治療及/或防治HBV之干擾素α-2b、干擾素α-2a及干擾素αcon-1 (聚乙二醇化及未聚乙二醇化)、利巴韋林(ribavirin)、拉米夫定(lamivudine；3TC)、恩替卡韋、替諾福韋、替比夫定(LdT)、阿德福韋；或其他新出現的抗HBV藥劑，諸如HBV RNA複製抑制劑、HBsAg分泌抑制劑、HBV蛋白殼抑制劑、反義寡聚物(例如，如WO2012/145697、WO 2014/179629及WO2017/216390中所描述)、siRNA (例如，WO 2005/014806、WO 2012/024170、WO 2012/2055362、WO 2013/003520、WO 2013/159109、WO 2017/027350及WO2017/015175中所描述)、HBV治療性疫苗、HBV防治性疫苗、HBV抗體療法(單株或多株)或TLR 2、3、7、8或9促效劑。
本發明之實施例 本發明之以下實施例可與本文中所描述之任何其他實施例組合使用。 1.      一種RTEL1抑制劑，其用於治療及/或預防B型肝炎病毒(HBV)感染。 2.      如實施例1之用途的RTEL1抑制劑，其中該RTEL1抑制劑係以有效量投與。 3.      如實施例1或2之用途的RTEL1抑制劑，其中該HBV感染為慢性感染。 4.      如實施例1至3之用途的RTEL1抑制劑，其中該RTEL1抑制劑能夠降低經感染細胞中之cccDNA及/或pgRNA。 5.      如實施例1至4中任一例之用途的RTEL1抑制劑，其中該RTEL1抑制劑防止或減少RTEL1與DNA，諸如cccDNA之結合。 6.      如實施例5之用途的RTEL1抑制劑，其中該抑制劑為特異性結合於RTEL1蛋白質之小分子，其中該抑制劑防止或減少RTEL1蛋白質與cccDNA之結合。 7.      如實施例1至5中任一例之用途的RTEL1抑制劑，其中該抑制劑為包含或由以下組成之具有12至60個核苷酸長度的寡核苷酸：具有至少10個核苷酸長度之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與哺乳動物RTEL1目標核酸至少90%互補。 8.       如實施例7之用途的RTEL1抑制劑，其能夠降低該RTEL1目標核酸之含量。 9.      如實施例7或8之用途的RTEL1抑制劑，其中該目標核酸為RNA。 10.    如實施例9之用途的RTEL1抑制劑，其中該RNA為前體mRNA。 11.    如實施例7至10中任一例之用途的RTEL1抑制劑，其中該寡核苷酸選自反義寡核苷酸、siRNA或shRNA。 12.    如實施例11之用途的RTEL1抑制劑，其中該寡核苷酸為單股反義寡核苷酸或雙股siRNA。 13.    如實施例7至12中任一例之用途的RTEL1抑制劑，其中該哺乳動物RTEL1目標核酸選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。 14.    如實施例7至12中任一例之用途的RTEL1抑制劑，其中該寡核苷酸之該連續核苷酸序列與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之該目標核酸至少98%互補。 15.    如實施例1至14中任一例之用途的RTEL1抑制劑，其中當相比於對照物時，感染HBV之細胞中之該cccDNA降低至少50%，諸如60%，諸如70%，諸如80%，諸如90%，諸如95%，諸如100%。 16.    如實施例7至15中任一例之用途的寡核苷酸，其中當相比於對照物時，該RTEL1 mRNA降低至少50%，諸如60%，諸如70%，諸如80%，諸如90%，諸如95%，諸如100%。 17.    一種具有12至60個核苷酸長度之寡核苷酸，包含或由以下組成：具有12至30個核苷酸長度之連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與哺乳動物RTEL1目標核酸至少90%互補，諸如95%，諸如98%，諸如完全互補。 18.    如實施例17之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係以化學方法產生。 19.    如實施例17或18之寡核苷酸，其中該哺乳動物RTEL1目標核酸選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。 20.    如實施例17或18之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之該目標核酸至少98%互補。 21.    如實施例17至20中任一例之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為12至30個核苷酸長度。 22.    如實施例17至21中任一例之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為RNAi分子，諸如雙股siRNA或shRNA。 23.     如實施例17至21中任一例之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為單股反義寡核苷酸。 24.    如實施例17至23中任一例之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與選自SEQ ID NO:3至21 (表4)之目標序列互補。 25.    如實施例17至24之寡核苷酸，其能夠雜交至ΔG°低於-15千卡之SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之目標核酸。 26.    如實施例17至25中任一例之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含或由以下組成：至少14個連續核苷酸，尤其15、16、17、18、19、20、21或22個連續核苷酸。 27.    如實施例17至25中任一例之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含或由14至22個核苷酸組成。 28.    如實施例27之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含或由16至20個核苷酸組成。 29.    如實施例17至28中任一例之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含或由14至25個核苷酸長度組成。 30.    如實施例29之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含或由16至22個核苷酸長度組成。 31.    如實施例17至30中之任一例之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:22-237之序列。 32.    如實施例17至31中任一例之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與同其互補之該等目標核酸相比具有零至三個錯配。 33.    如實施例32之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與該等目標核酸相比具有一個錯配。 34.    如實施例32之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與該等目標核酸相比具有兩個錯配。 35.    如實施例32之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與兩個目標核酸序列完全互補。 36.    如實施例17至35之寡核苷酸，其包含一或多個經修飾核苷。 37.    如實施例36之寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷為高親和力經修飾核苷。 38.    如實施例36或37之寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷為經2'糖修飾之核苷。 39.    如實施例38之寡核苷酸，其中該一或多個經2'糖修飾之核苷獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、2'-氟-ANA及LNA核苷。 40.    如實施例36至39之寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷為LNA核苷。 41.    如實施例40之寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷選自氧基-LNA、胺基-LNA、硫基-LNA、cET及ENA。 42.    如實施例40或41之寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷為具有以下2'-4'橋鍵-O-CH2 -之氧基-LNA。 43.    如實施例42之寡核苷酸，其中該氧基-LNA為β-D-氧基-LNA。 44.    如實施例40或41之寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷為具有以下2'-4'橋鍵-O-CH(CH3 )-之cET。 45.    如實施例44之寡核苷酸，其中該cET為(S)cET，亦即6'(S)甲基-β-D-氧基-LNA。 46.    如實施例40或41之寡核苷酸,其中該LNA為具有以下2'-4'橋鍵-O-CH2 -CH2 -之ENA。 47.    如實施例17至46中任一例之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷間鍵。 48.    如實施例47之寡核苷酸，其中該經修飾核苷間鍵聯為耐核酸酶的。 49.    如實施例47或48之寡核苷酸，其中該經修飾核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。 50.    如實施例17至49中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為能夠募集RNase H之反義寡核苷酸。 51.    如實施例50之寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或該連續核苷酸序列為間隔體。 52.     如實施例51之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列由以下組成或包含以下：式5'-F-G-F'-3'之間隔體，其中區F及區F'獨立地包含或由1至4個經2'糖修飾之核苷組成，且G為6至18個能夠募集RNaseH之核苷的區。 53.    如實施例52之反義寡核苷酸，其中該經2'糖修飾之核苷獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA及LNA核苷。 54.    如實施例52或53之反義寡核苷酸，其中區F及區F'中之該等經2'糖修飾之核苷中之一或多者為LNA核苷。 55.    如實施例54之反義寡核苷酸，其中區F及區F'中之所有經2'糖修飾之核苷為LNA核苷。 56.    如實施例53至55之寡核苷酸，其中該LNA核苷選自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-胺基-LNA、α-L-胺基-LNA、β-D-硫基-LNA、α-L-硫基-LNA、(S)cET、(R)cET β-D-ENA及α-L-ENA。 57.    如實施例53至56之反義寡核苷酸，其中區F及區F'由相同LNA核苷組成。 58.    如實施例53至57之反義寡核苷酸，其中區F及區F'中之所有經2'糖修飾之核苷為氧基-LNA核苷。 59.    如實施例52至58中任一例之反義寡核苷酸，其中區G中之該等核苷為DNA及/或α-L-LNA核苷。 60.    如實施例59之反義寡核苷酸，其中區G由至少75% DNA核苷組成。 61.    如實施例60之反義寡核苷酸，其中區G中之所有核苷為DNA核苷。 62.    如實施例17至62中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸選自以下CMP ID NO：22_1；23_1；24_1；25_1；26_1；27_1；28_1；29_1；30_1；31_1；32_1；33_1；34_1；35_1；36_1；37_1；38_1；39_1；40_1；41_1；42_1；42_2；42_3；43_1；43_2；44_1；45_1；46_1；49_1；130_1；109_1；83_1；203_1及232_1，或其醫藥學上可接受之鹽。 63.    一種共軛物化合物，其包含如實施例17至50中任一項之寡核苷酸或如實施例51至62中任一項之反義寡核苷酸，及共價附接至該反義寡核苷酸之至少一個共軛部分。 64.    如實施例63之共軛物化合物，其中該寡核苷酸為雙股siRNA且該共軛部分共價附接至該siRNA之有義股。 65.    如實施例63或64之共軛物化合物，其中該共軛部分選自碳水化合物、細胞表面受體配位體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素、維生素、病毒蛋白或其組合。 66.    如實施例63或65之共軛物化合物，其中該共軛部分能夠與去唾液酸醣蛋白受體結合。 67.    如實施例66之共軛物化合物，其中該共軛部分包含至少一個選自由以下組成之群的去唾液酸醣蛋白受體靶向部分：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖及N-異丁醯基半乳胺糖。 68.    如實施例67之共軛物化合物，其中該去唾液酸醣蛋白受體靶向部分為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。 69.    如實施例67或68之共軛物化合物，其中該共軛部分相對於去唾液酸醣蛋白受體靶向部分為單價、二價、三價或四價的。 70.    如實施例69之共軛物化合物，其中該共軛部分由二至四個末端GalNAc部分及間隔基組成，該間隔基將各GalNAc部分鍵聯至可與該反義化合物共軛的分支鏈分子。 71.    如實施例70之共軛物化合物，其中該間隔基為PEG間隔基。 72.    如實施例66至71之共軛物化合物，其中該共軛部分為三價N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)部分。 73.    如實施例66至72之共軛物化合物，其中該共軛部分選自圖1中之三價GalNAc部分中之一者。 74.    如實施例73之共軛物化合物，其中該共軛部分為圖1D中之三價GalNAc部分。 75.    如實施例63至74之共軛物化合物，其包含定位於該寡核苷酸或該反義寡核苷酸與該共軛部分之間的連接子。 76.    如實施例75之共軛物化合物，其中該連接子為生理學上不穩定的連接子。 77.    如實施例76之共軛物化合物，其中該生理學上不穩定的連接子為易受核酸酶影響的連接子。 78.    如實施例76或77之寡核苷酸共軛物，其中該生理學上不穩定的連接子由2至5個連續磷酸二酯鍵構成。 79.    如實施例66至78之共軛物化合物，其展現肝臟相比於腎臟之間的經改良細胞分佈，或肝臟對共軛物化合物相比於未共軛寡核苷酸或反義寡核苷酸之經改良細胞吸收。 80.    一種醫藥組合物，其包含如實施例17至50中任一例之寡核苷酸或如實施例51至61中任一例之反義寡核苷酸、如實施例63至79之共軛物化合物或其可接受之鹽及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。 81.    一種用於鑑別預防、改善及/或抑制B型肝炎病毒(HBV)感染之化合物的方法，其包含： a. 使測試化合物與以下接觸： i.  RTEL1多肽；或 ii. 表現RTEL1之細胞； b. 在存在及不存在該測試化合物之情況下量測RTEL1之表現及/或活性；及 c. 鑑別減少RTEL1表現及/或活性且減少cccDNA之化合物。 82.    一種用於調節表現RTEL1之目標細胞中之RTEL1表現的活體內或活體外方法，該方法包含以有效量向該細胞投與如實施例17至50中任一例之寡核苷酸或如實施例51至61中任一例之反義寡核苷酸、如實施例63至79之共軛物化合物或如實施例80之醫藥組合物。 83.    如實施例82之方法，其中該RTEL1表現相比於無任何治療或經對照物治療之水準在該目標細胞中降低至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%。 84.    如實施例82之方法，其中該目標細胞感染有HBV且感染HBV之細胞中之該cccDNA相比於無任何治療或經對照物處理之水準在該感染HBV之目標細胞中降低至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%。 85.    一種用於治療或預防疾病之方法，其包含向罹患或易受該疾病影響的個體投與治療或防治有效量之如實施例17至50中任一例之寡核苷酸或如實施例51至61中任一例之反義寡核苷酸、如實施例63至79之共軛物化合物或如實施例80之醫藥組合物。 86.    如實施例17至50中任一例之寡核苷酸或如實施例51至61中任一例之反義寡核苷酸或如實施例63至79中任一例之共軛物化合物或如實施例80之醫藥組合物，其用作用於治療或預防個體中之疾病的藥劑。 87.    如實施例17至50中任一例之寡核苷酸或如實施例51至61中任一例之反義寡核苷酸，或如實施例63至79中任一例之共軛物化合物的用途，其用於製備用於治療或預防個體中之疾病的藥劑。 88.    如實施例85至87之方法、寡核苷酸、反義寡核苷酸、共軛物或用途，其中該個體為哺乳動物。 89.    如實施例88之方法、寡核苷酸、反義寡核苷酸、共軛物或用途，其中該哺乳動物為人類。
現將藉由以下不具有限制性質之實例來說明本發明。
實例 材料及方法 寡核苷酸基元序列及寡核苷酸化合物 表6：寡核苷酸基元序列(由SEQ ID NO指示)、此等之設計、以及基於基元序列設計之特異性寡核苷酸化合物(由CMP ID NO指示)
Figure 108124604-A0304-0008
基元序列表示寡核苷酸中存在的核鹼基之連續序列。
設計係指間隔體設計，F-G-F'，其中各數目表示連續經修飾核苷(例如經2'修飾之核苷)之數目(第一數目= 5'側翼序列)，隨後為DNA核苷之數目(第二數目=間隙區)，隨後為經修飾核苷(例如經2'修飾之核苷)之數目(第三數目= 3'側翼序列)，視情況前面為或隨後為其他DNA及LNA重複區，該等重複區未必為與目標核酸互補之連續序列之部分。
寡核苷酸化合物表示基元序列之特定設計。大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母表示DNA核苷，所有LNA C均為5-甲基胞嘧啶，且5-甲基胞嘧啶DNA由「e」表示，且所有核苷間鍵均為硫代磷酸酯核苷間鍵。
寡核苷酸合成 寡核苷酸合成在此項技術中總體上已知。下文為可應用之方案。本發明之寡核苷酸可已藉由在設備、載體及所用濃度方面略微改變的方法來製備。
寡核苷酸使用胺基磷酸酯方法在Oligomaker 48上在尿苷通用載體上以1 μmol等級合成。在合成結束時，在60℃下使用氨水持續5-16小時使寡核苷酸自固體載體裂解。寡核苷酸係藉由逆相HPLC (RP-HPLC)或固相萃取純化，且藉由UPLC特徵化，且分子量係藉由ESI-MS進一步確認。
寡核苷酸之伸長 β-氰基乙基-胺基磷酸酯(DNA-A(Bz)、DNA- G(ibu)、DNA- C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA- G(dmf)或之偶合LNA-T)係藉由使用作為活化劑之0.1 M於乙腈中之5'-O-DMT-保護之胺基酸酯及於乙腈中之DCI (4,5-二氰基咪唑) (0.25 M)的溶液來執行。就最終循環而言，可使用具有所需修飾之胺基磷酸酯，例如用於附接共軛物基團或如所指的共軛物基團的C6連接子。用於引入硫代磷酸酯鍵之硫醇化係藉由使用氫化黃原素(xanthane hydride) (0.01 M於9:1之乙腈/吡啶中)進行。磷酸二酯鍵可使用0.02 M於7:2:1之THF/吡啶/水中之碘來引入。試劑之其餘部分為通常用於寡核苷酸合成之試劑。
久後固相合成共軛而言，在固相合成之最終循環中可使用市售C6胺基連接子胺基磷酸酯，且在去除保護基及自固體載體裂解之後，胺基鍵聯之去保護寡核苷酸經分離。共軛物係經由使用標準合成方法活化官能基來引入。
藉由 RP-HPLC 純化 ： 粗化合物係藉由Phenomenex Jupiter C18 10µ 150×10 mm管柱上之製備型RP-HPLC純化。0.1 M pH 8之乙酸銨及乙腈以5 mL/min之流動速率用作緩衝液。將所收集之溶離份凍乾，以得到通常呈白色固體狀之經純化化合物。
縮寫： DCI:             4,5-二氰基咪唑 DCM:            二氯甲烷 DMF:            二甲基甲醯胺 DMT:            4,4'-二甲氧基三苯甲基 THF:             四氫呋喃 Bz:               苄醯基 Ibu:               異丁醯基 RP-HPLC:     逆相高效液相層析
Tm 檢定： 寡核苷酸及RNA目標(磷酸酯鍵聯，PO)雙螺旋體在500 ml無核糖核酸酶之水中稀釋至3 mM，且與500 ml 2 × Tm -緩衝液(200 mM NaCl、0.2 mM EDTA、20 mM磷酸鈉，pH 7.0)混合。將溶液加熱至95℃持續3 min，且接著允許在室溫下退火30 min。雙螺旋體熔融溫度(Tm )係在配備有帕爾貼(Peltier)溫度程式設計器PTP6之Lambda 40 UV/VIS分光光度計上使用PE Templab軟體(Perkin Elmer)量測。溫度自20℃逐漸上升至95℃且接著降至25℃，在260 nm下記錄吸光值。熔融與退火兩者之一階導數及局部最大值用於評估雙螺旋體Tm 。
純系生長介質(dHCGM)。dHCGM為含有100 U/ml青黴素、100 µg/ml鏈黴素、20 mM Hepes、44 mM NaHCO3、15 µg/ml L-脯胺酸、0.25 µg/ml胰島素、50 nM地米松(Dexamethazone)、5 ng/ml EGF、0.1 mM Asc-2P、2% DMSO及10% FBS之DMEM介質(Ishida等人, 2015)。在37℃下在具有5% CO2 之潮濕氛圍中培養細胞。培養基在平板接種後24 h及每2天更換一次，直至收穫為止。
原發性人類肝細胞 (PXB-PHH) 自人類化小鼠(uPA/SCID小鼠)收集之新鮮原發性人類肝細胞(PXB-PHH) (在本文中稱為PHH)獲自PhoenixBio Co., Ltd (Japan)。在經修飾肝細胞純系生長介質(dHCGM)中在以下細胞密度下將細胞接種在塗佈膠原蛋白I之培養盤上：35,000個細胞/孔(384孔)、70,000個細胞/孔(96孔)或400,000個細胞/孔(24孔)。dHCGM為含有100 U/ml青黴素、100 µg/ml鏈黴素、20 mM Hepes、44 mM NaHCO3、15 µg/ml L-脯胺酸、0.25 µg/ml胰島素、50 nM地米松(Dexamethazone)、5 ng/ml EGF、0.1 mM Asc-2P、2% DMSO及10% FBS之DMEM介質(Ishida等人, 2015)。在37℃下在具有5% CO2 之潮濕氛圍中培養細胞。培養基在平板接種後24 h及每2天更換一次，直至收穫為止。
HBV 感染及寡核苷酸治療 在40之感染倍率(MOI)將PHH與HBV (自CHB個體純化)以及4% PEG一起培育24小時；第二天移除病毒接種體。為允許cccDNA建立，在HBV感染後第3天開始PHH中之化合物治療。每2天補給(實例1)溶解於介質中之新鮮寡核苷酸或在第3、5、7及9天補給新鮮寡核苷酸且此後每2天補給介質(實例2)，直至在第19天收集細胞為止。
HBV 抗原量測 為了評估對HBV抗原表現及分泌之影響，在第19天收集清液層。根據製造商之方案使用CLIA ELISA套組(Autobio Diagnostic，#CL0310-2、#CL0312-2)來量測HBV繁殖參數HBsAg及HBeAg含量。簡言之，將每孔25 µL清液層轉移至各別塗佈抗體之微量滴定盤中，且添加25 µL酶共軛物試劑。將培養盤在室溫下於振盪器上培育60 min，之後使用自動洗滌器用洗滌緩衝液將該等孔洗滌五次。向各孔中添加25 µL基質A及B。將培養盤在室溫下於振盪器上培育10 min，之後使用Envision螢光讀取器(Perkin Elmer)來量測螢光。
CCK8 細胞毒性量測 為評估細胞毒性對寡核苷酸治療之影響，如HBV感染及寡核苷酸治療中所描述處理細胞，且在第18天在37℃下在具有5% CO2 之潮濕氛圍中預培養細胞24小時。在96孔盤之各孔中將10 ul CCK-8溶液添加至100 ul且培育1-4小時。針對各培養盤量測使用微量培養盤讀取器(Tecan)之在450 nM下之吸光度且值計算為對照物(未處理細胞)之百分比。
胞內 HBV pgRNA 及 RTEL1 RNA 之即時 PCR 根據製造商之方案使用Qiagen BioRobot通用系統及RNeasy 96孔提取培養盤(RNeasy 96 BioRobot 8000套組(12)/目錄號/ID：967152)來自細胞中提取mRNA。在ABI QuantStudio 12k Flex上使用即時PCR來分析相對HBV及細胞mRNA表現量。
β-肌蛋白(ACT B)及HBV pgRNA係藉由qPCR在技術上一式三份地使用aqMan Fast Advanced Master Mix (Life Technologies, 目錄號4444558)來定量。相對於人類ACT B內源性對照物使結果正規化。使用相對於參考基因ACT B且相對於未經轉染細胞正規化之比較循環臨限值2-ΔΔCt方法來分析mRNA表現。用於ACTB RNA及HBV pgRNA定量之引子在表7中列出。 表7：ACT B及HBV pgRNA qPCR引子
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HBV cccDNA 定量 使用SDS裂解緩衝液自感染HBV之原發性人類肝細胞提取DNA及使用ZymoResearch Genomic DNA Clean & Concentrator套組(ZymoResearch，目錄號D4067)方案純化。在20 ul總體積中在37℃下針對500 ng DNA使用10 U之T5來用T5核酸外切酶(New England Biolabs, MA, USA)分解1小時之後確定cccDNA含量。在分解之後，樣品經稀釋至50 ul，其中4 ul用於qPCR反應。使用相對於參考基因粒線體DNA且相對於未經轉染細胞正規化之比較循環臨限值2-ΔΔCt方法來分析mRNA表現。在QuantStudio 12K Flex PCR System (Applied Biosystems)上執行定量即時聚合酶鏈反應量測。用Fast SYBR™ Green Master Mix (Life Technologies，目錄號4385612)執行qPCR。引子顯示於表8中。 表8：cccDNA qPCR引子.
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實例 1 ： 靶向 RTEL1 之 反義寡核苷酸對感染 HBV 之 PHH 中之 HBV 參數的作用 在以下實驗中，RTEL1阻斷基因表現對HBV參數、HBsAg、HBeAg、HBV pgRNA及cccDNA之作用係使用表6中之寡核苷酸化合物來測試。
如材料及方法章節中所描述培養PHH。在HBV感染後第3天以溶解於dHCGM介質中之10µM之最終寡核苷酸濃度對細胞進行給藥，其中最終培養物體積為100 µl/孔。在生物上一式三份地執行實驗且在HBV感染後第19天收集每2天補給寡核苷酸之細胞。根據材料及方法，使用CCK8確定細胞毒性，收集清液層以量測HBsAg及HBeAg且分兩個溶離份收集細胞；一個用於使用一種裂解緩衝液的RTEL1 mRNA及pgRNA量測且一個用於使用如材料及方法中所描述之另一溶解緩衝液的cccDNA量測。所有值在表9中均顯示為對照物(未處理細胞)之百分比，亦即就RTEL1 mRNA、cccDNA及pgRNA而言，值愈小，抑制愈大。
如材料及方法章節中所描述量測CCK8細胞毒性以確認病毒參數之任何減少不為細胞死亡之原因，值愈接近100%，毒性愈低。結果顯示於表9中。 表9：下游產物之RTEL1介導之cccDNA降解及抑制
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 * RTEL1及HBV pgRNA經正規化至管家基因。
所有所測試之靶向RTEL1之反義寡核苷酸顯示量測之單一時間點的目標阻斷基因表現及HBV抗病毒功效對參數cccDNA、pgRNA、HBsAg及HBeAg中之至少一者，其中未觀測到由藉由CCK8量測之細胞毒性。
實例 2 ： 針對對經感染 PHH 中 cccDNA 之作用所測試之靶向 RTEL1 的額外寡核苷酸庫 在以下實驗中，產生靶向跨越RTEL1轉錄物之236種寡核苷酸之額外庫，其中表6中顯示為CMP ID NO：50_1至237_1。測試減少RTEL1以及cccDNA之能力。
如材料及方法章節中所描述培養PHH。在HBV感染後第3、5、7及9天以溶解於dHCGM介質中之10µM之最終寡核苷酸濃度對細胞進行給藥，其中最終培養物體積為100 µl/孔。在生物上一式三份地執行實驗且在HBV感染後第19天收集每2天補給介質直至第19天為止之細胞。
根據材料及方法，分兩個溶離份收集細胞；一個用於使用一種裂解緩衝液之RTEL1 mRNA且一個用於使用如材料及方法中所描述之另一溶解緩衝液的cccDNA量測。所有值在表10中均顯示為對照物(未處理細胞)之百分比，亦即就RTEL1 mRNA及cccDNA而言，值愈小，抑制/減少愈大。 表10：寡核苷酸治療後之RTEL1減少及cccDNA降解
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如材料及方法章節中所描述量測CCK8細胞毒性以評估病毒參數之減少是否可能為細胞死亡之原因，值愈接近100%，毒性愈低。結果顯示於表11中。就高於對照物之80%的CCK8值而言，不大可能認為細胞死亡對表10中所示之RTEL1及cccDNA減少具有影響。 表11：CCK8細胞毒性
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 #NA意謂未量測所指示化合物之CCK8。
結果顯示，在庫中之236種寡核苷酸中，僅5%不能夠將RTEL1或cccDNA減少至對照物之至少80%。由此可見，有可能產生靶向跨越整個RTEL1轉錄物之寡核苷酸，其能夠降低RTEL1及/或cccDNA，一般而言，儘管RTEL1及cccDNA之減少不歸因於細胞死亡，但少數化合物可能為該情況。
圖1：說明例示性反義寡核苷酸共軛物，其中寡核苷酸表示為波浪線(A-D)或「寡核苷酸」(E-H)或T2 (I)，且去唾液酸醣蛋白受體靶向共軛部分為三價N-乙醯基半乳胺糖部分。化合物A至D包含二離胺酸分支鏈分子、PEG3間隔基及三個末端GalNAc碳水化合物部分。在化合物A及B中，寡核苷酸在無連接子之情況下直接附接至去唾液酸醣蛋白受體靶向共軛部分。在化合物C及D中，寡核苷酸經由C6連接子附接至去唾液酸醣蛋白受體靶向共軛部分。化合物E-I包含市售的三倍分支鏈分子及具有不同長度及結構之間隔基以及三個末端GalNAc碳水化合物部分。
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Claims (31)

  1. 一種RTEL1抑制劑之用途，其用於製造用於治療及/或預防B型肝炎病毒(HBV)感染之藥劑。
  2. 如請求項1之用途，其中該HBV感染為慢性感染。
  3. 如請求項1之用途，其中該RTEL1抑制劑能夠降低經感染細胞中之cccDNA。
  4. 如請求項1之用途，其中該抑制劑為包含具有至少10個核苷酸長度之連續核苷酸序列之具有12至60個核苷酸長度的寡核苷酸，該連續核苷酸序列與哺乳動物RTEL1目標核酸，尤其人類RTEL1核酸至少95%互補，且能夠降低RTEL1 mRNA。
  5. 如請求項1之用途，其中該RTEL1抑制劑選自單股反義寡核苷酸、siRNA或shRNA分子。
  6. 如請求項4之用途，其中該哺乳動物RTEL1目標核酸選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
  7. 如請求項4至6中任一項之用途，其中該連續核苷酸序列與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之目標核酸至少98%互補。
  8. 如請求項3至6中任一項之用途，其中當相比於對照物時，感染HBV之細胞中之該cccDNA降低至少60%。
  9. 如請求項4至6中任一項之用途，其中當相比於對照物時，該RTEL1 mRNA降低至少60%。
  10. 一種具有12至30個核苷酸長度之單股反義寡核苷酸，其包含至少10個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與哺乳動物RTEL1，尤其人類RTEL1互補，其中該寡核苷酸能夠抑制RTEL1之表現。
  11. 如請求項10之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與SEQ ID NO:1至少90%互補，諸如完全互補。
  12. 如請求項10或11之反義寡核苷酸，其包含具有12至25個，尤其15至21個核苷酸長度之連續核苷酸序列。
  13. 如請求項11之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與選自SEQ ID NO:3-21之目標序列100%互補。
  14. 如請求項10、11及13中任一項之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含選自由SEQ ID NO:22-237組成之群的序列。
  15. 如請求項10、11及13中任一項之反義寡核苷酸，其包含一或多個經2'糖修飾之核苷。
  16. 如請求項15之反義寡核苷酸，其中該一或多個經2'糖修飾之核苷獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA及LNA核苷。
  17. 如請求項15之反義寡核苷酸，其中該一或多個經2'糖修飾之核苷為LNA核苷。
  18. 如請求項10、11及13中任一項之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵。
  19. 如請求項18之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸內之所有核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。
  20. 如請求項10、11及13中任一項之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠募集RNase H。
  21. 如請求項10、11及13中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列由以下組成或包含以下：式5'-F-G-F'-3'之間隔體，其中區F及區F'獨立地包含1-4個經2'糖修飾之核苷，且G為6至16個能夠募集RNaseH之核苷的區，諸如包含6至18個DNA核苷的區。
  22. 一種共軛物，其包含如請求項10至21中任一項之寡核苷酸及至少一個共價附接至該寡核苷酸之共軛部分。
  23. 如請求項22之共軛物，其中該共軛部分選自圖1中之三價GalNAc部分中之一者。
  24. 如請求項22或23之共軛物，其包含由2至5個包含至少兩個連續磷酸二酯鍵之鍵聯核苷構成的生理學上不穩定連接子，其中該生理學上不穩定連接子共價結合在寡核苷酸組分之5'末端或3'末端處。
  25. 一種如請求項10至21中任一項之寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽或如請求項22至24中任一項之共軛物之醫藥學上可接受之鹽。
  26. 一種醫藥組合物，其包含如請求項10至21中任一項之寡核苷酸，或如請求項22至24中任一項之共軛物，或如請求項25之醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之賦形劑。
  27. 一種用於調節表現RTEL1之目標細胞中之RTEL1表現的活體外方法，該方法包含以有效量向該細胞投與如請求項10至21中任一項之寡核苷酸或如請求項22至24中任一項之共軛物、如請求項25之醫藥學上可接受之鹽或如請求項26之醫藥組合物。
  28. 一種如請求項10至21中任一項之寡核苷酸或如請求項22至24中任一項之共軛物、如請求項25之醫藥學上可接受之鹽或如請求項26之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療或預防疾病之藥劑。
  29. 如請求項28之用途，其中該疾病為B型肝炎病毒(HBV)。
  30. 一種如請求項10至21中任一項之寡核苷酸或如請求項22至24中任一項之共軛物、如請求項25之醫藥學上可接受之鹽或如請求項26之醫藥組合物之用途，其用於製備用於治療或預防B型肝炎病毒HBV之藥劑。
  31. 一種如請求項10至21中任一項之寡核苷酸或如請求項22至24中任一項之共軛物、如請求項25之醫藥學上可接受之鹽或如請求項26之醫藥組合物之用途，其用於製造用於調節表現RTEL1之目標細胞中之RTEL1表現的藥劑。
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