TW202020142A

TW202020142A - 包含阿卡波糖或水蘇糖之哺乳動物細胞保存用液

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Publication number: TW202020142A
Application number: TW108134583A
Authority: TW
Inventors: 白川智景; 西村益浩; 土居雅子
Original assignee: 日商大塚製藥工場股份有限公司
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2020-06-01
Also published as: SG11202102876XA; TWI732298B; JPWO2020066991A1; CA3112902A1; WO2020066991A1; KR20210045443A; CN112739207A; EP3858975A1; AU2019345595A1; US20210345602A1

Abstract

本發明之課題在於提供一種可有效地抑制於液體中保存哺乳動物細胞時所產生之細胞存活率降低或細胞凝集，且向哺乳動物之活體內投予之情形時對哺乳動物之生態造成不良影響之可能性較低的物質、或包含該物質之哺乳動物細胞保存用液等。若將包含阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽之液用於保存哺乳動物細胞，則可有效地抑制於液體中保存哺乳動物細胞時所產生之細胞存活率降低或細胞凝集。進而，於上述液中保存之哺乳動物細胞可不移至新的移植用液中而直接向哺乳動物之活體內投予。

Description

包含阿卡波糖或水蘇糖之哺乳動物細胞保存用液

本發明係關於一種包含阿卡波糖或其鹽(以下有時稱為「阿卡波糖類」)、及/或水蘇糖或其鹽(以下有時稱為「水蘇糖類」)之哺乳動物細胞保存用液(以下有時稱為「本案哺乳動物細胞保存用液」)、或使用本案哺乳動物細胞保存用液保存哺乳動物細胞之方法。

近年來，因幹細胞研究之急速發展而使向再生醫療發展之趨勢高漲，其知識或理解不僅侷限於研究者，亦廣泛普及至一般民眾。使用幹細胞之再生醫療係利用幹細胞所具有之自我複製能力與多分化能力、或幹細胞所分泌之因子，以使因各種疾病而受到損傷之細胞或組織之功能恢復為目的之醫療。若對白血病或再生不良性貧血等血液頑疾之患者進行骨髓移植，則造血系幹細胞於患者體內植活，能夠大致一生維持造血能力。又，最近很多研究者以使用造血幹細胞以外之幹細胞之臨床應用為目標，鑑定中樞神經、末梢神經、骨髓、小腸等中之幹細胞，開始實踐針對外傷性疾病或組織變性疾病之組織幹細胞之移植治療(非專利文獻1～3)。另一方面，癌症免疫細胞療法係將具有攻擊癌之作用之免疫細胞取出至體外，強化其作用後，再次放回至體內的最尖端之細胞醫療，實踐有樹狀細胞疫苗療法、阿爾法・貝塔T細胞療法(αβT細胞療法)、伽馬・德爾塔T細胞療法(γδT細胞療法)、CTL療法、自然殺手細胞療法(NK細胞療法)等使用T細胞之療法。

於長期保存用於移植治療之幹細胞或T細胞之情形時，液體中之保存無法良好地保持細胞存活率。例如，報告有若將人骨髓幹細胞於生理鹽水中進行冷藏保存(4℃)，則細胞存活率於48小時後降低至40%以下，於72小時後降低至20%以下(非專利文獻4)。因此，於長期保存移植用幹細胞或移植用T細胞之情形時，通常進行冷凍保存。然而，於冷凍保存液中，通常添加有DMSO、甘油等冷凍保存劑，故而必須於將經冷凍保存之幹細胞或T細胞解凍後且進行移植治療前去除移植冷凍保存劑，有耗時耗力之問題。又，即便向冷凍保存液中添加冷凍保存劑，由冷凍時之水之結晶化引起之細胞骨架之損壞亦較大，亦有冷凍融解後之細胞存活率降低之問題。因此，簡便性優異且可抑制細胞存活率之降低之細胞保存液之開發成為當務之急。

本發明者等人於報告中指出海藻糖具有抑制於液體中保存哺乳動物細胞時所產生之細胞存活率降低或細胞凝集之作用(專利文獻1及2)。然而，迄今為止未知阿卡波糖或水蘇糖具有該作用。先前技術文獻專利文獻

專利文獻1：日本專利特開2012-115253號公報專利文獻2：國際公開第2014/208053號說明書非專利文獻

非專利文獻1：Gage, F.H., Science 287: 1433-1438 (2000) 非專利文獻2：Morrison, S.J. et al., Cell 96: 737-749 (1999) 非專利文獻3：Batle, E. et al., Cell 111: 251-263 (2002) 非專利文獻4：Lane, T.A. et al., Transfusion 49: 1471-1481 (2009)

[發明所欲解決之問題]

本發明之課題在於提供一種可有效地抑制於液體中保存哺乳動物細胞時所產生之細胞存活率降低或細胞凝集且向哺乳動物之活體內投予之情形時對哺乳動物之生態造成不良影響之可能性較低的物質、或包含該物質之哺乳動物細胞保存用液等。 [解決問題之技術手段]

本發明者等人為了解決上述課題而持續銳意研究。於其過程中，自93種糖類之中發現阿卡波糖與水蘇糖作為抑制哺乳動物細胞之存活率降低且其作用效果高於海藻糖者。進而，亦確認該等四糖具有抑制哺乳動物細胞之細胞凝集之作用。本發明係基於該等見解而完成者。

即，本發明如以下所示。 [1]一種哺乳動物細胞保存用液，其包含阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽。 [2]如上述[1]中記載之液，其於等張液中包含阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽。 [3]如上述[2]中記載之液，其中等張液中之阿卡波糖或其鹽之濃度至少為40 mM。 [4]如上述[2]或[3]中記載之液，其中等張液中之水蘇糖或其鹽之濃度至少為40 mM。 [5]如上述[2]至[4]中任一項記載之液，其中等張液為乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、林格氏液、或生理食鹽液。 [6]如上述[1]至[5]中任一項記載之液，其係用以於0～40℃下保存哺乳動物細胞。 [7]如上述[1]至[6]中任一項記載之液，其係用以將哺乳動物細胞保存6小時～30天。 [8]如上述[1]至[7]中任一項記載之液，其係用於抑制哺乳動物細胞之存活率降低。 [9]如上述[1]至[8]中任一項記載之液，其係用於抑制哺乳動物細胞之凝集。 [10]如上述[1]至[9]中任一項記載之液，其係用於哺乳動物細胞之移植。 [11]如上述[1]至[10]中任一項記載之液，其中哺乳動物細胞為哺乳動物幹細胞、哺乳動物淋巴球細胞、或哺乳動物肝細胞。 [12]如上述[11]中記載之液，其中哺乳動物幹細胞為哺乳動物間質系幹細胞或哺乳動物淋巴球細胞。 [13]一種哺乳動物細胞之保存方法，其包括於包含阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽之液中保存哺乳動物細胞之步驟。 [14]如上述[13]中記載之保存方法，其中液為等張液。 [15]如上述[14]中記載之保存方法，其中等張液中之阿卡波糖或其鹽之濃度至少為40 mM。 [16]如上述[14]或[15]中記載之保存方法，其中等張液中之水蘇糖或其鹽之濃度至少為40 mM。 [17]如上述[14]至[16]中任一項記載之保存方法，其中等張液為乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、林格氏液、或生理食鹽液。 [18]如上述[13]至[17]中任一項記載之保存方法，其特徵在於：於0～40℃下保存哺乳動物細胞。 [19]如上述[13]至[18]中任一項記載之保存方法，其特徵在於：將哺乳動物細胞保存6小時～30天。 [20]如上述[13]至[19]中任一項記載之保存方法，其中哺乳動物細胞為哺乳動物幹細胞、哺乳動物淋巴球細胞、或哺乳動物肝細胞。 [21]如上述[20]中記載之保存方法，其中哺乳動物幹細胞為哺乳動物間質系幹細胞或哺乳動物淋巴球細胞。 [22]一種用以製備如上述[1]至[12]中任一項記載之液之粉末製劑，其包含阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽。

又，作為本發明之其他實施形態，可列舉：一種哺乳動物細胞之移植方法，其包括向需要移植哺乳動物細胞之對象(例如外傷性疾病患者、組織變性疾病患者、癌症患者)投予包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液之步驟；一種哺乳動物細胞之移植方法，其包括如下步驟：向包含阿卡波糖類及/或水蘇糖類之液(較佳為等張液)中添加哺乳動物細胞，或者向包含哺乳動物細胞之液(較佳為等張液)中添加阿卡波糖類及/或水蘇糖類，藉此製備本案哺乳動物細胞保存用液；於所製備之本案哺乳動物細胞保存用液中保存哺乳動物細胞；及向需要移植哺乳動物細胞之對象(例如外傷性疾病患者、組織變性疾病患者、癌症患者)投予包含所保存之哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液；一種阿卡波糖類及/或水蘇糖類之用途，其用於製造本案哺乳動物細胞保存用液；一種阿卡波糖類及/或水蘇糖類之用途，其用以抑制液體中之哺乳動物細胞之存活率降低；一種阿卡波糖類及/或水蘇糖類之用途，其用以抑制液體中之哺乳動物細胞之細胞凝集；一種包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液，其用於治療需要哺乳動物細胞移植治療之疾病(例如外傷性疾病、組織變性疾病、癌症)；一種包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液之製備方法，其包括如下步驟：向包含阿卡波糖類及/或水蘇糖類之液(較佳為等張液)中添加哺乳動物細胞，或者向包含哺乳動物細胞之液(較佳為等張液)中添加阿卡波糖類及/或水蘇糖類，藉此製備本案哺乳動物細胞保存用液；以及一種包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液。再者，上述移植方法之保存哺乳動物細胞之步驟通常將包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液於該保存用液以液體之狀態存在之溫度條件下進行保存，不包括將該保存用液以固體之狀態保存之步驟(例如進行冷凍保存之步驟、進行冷凍乾燥保存之步驟等以休眠狀態保存哺乳動物細胞之步驟)。 [發明之效果]

根據本發明，藉由向液體中添加阿卡波糖類或水蘇糖類，可有效地抑制於液體中保存哺乳動物細胞時所產生之細胞存活率降低或細胞凝集。進而，該等阿卡波糖類及水蘇糖類係向哺乳動物之活體內投予之情形時對哺乳動物之生態造成不良影響之可能性較低之四糖類，故而於本案哺乳動物細胞保存用液中保存哺乳動物細胞後，可不置換成新的移植用液而直接向哺乳動物之活體內投予。

本發明之哺乳動物細胞保存用液係被特定於「用以保存哺乳動物細胞」之用途之包含阿卡波糖類及/或水蘇糖類之液(即本案哺乳動物細胞保存用液)。

作為本案哺乳動物細胞保存用液，只要為能夠保存哺乳動物細胞之液(例如等張液、低張液、高張液)即可，可良好地例示等張液。於本說明書中，所謂「等張液」，意指具有與體液或細胞液之滲透壓力大致相同之滲透壓力之液，具體而言，意指具有250～380 mOsm/L之範圍內之滲透壓力之液。又，於本說明書中，所謂「低張液」，意指具有低於體液或細胞液之滲透壓力之滲透壓力之液，具體而言，意指具有未達250 mOsm/L之滲透壓力之液。作為該低張液，較佳為細胞不會破裂之程度之低張液(具體而言，具有100～未達250 mOsm/L之範圍內之滲透壓力之液)。又，於本說明書中，所謂「高張液」，意指具有高於體液或細胞液之滲透壓力之滲透壓力之液，具體而言，意指滲透壓力超過380 mOsm/L(較佳為超過380 mOsm/L～1000 mOsm/L之範圍內)。

作為上述等張液，只要為以變得與體液或細胞液之滲透壓力大致相同之方式藉由鈉離子、鉀離子、鈣離子等調整鹽濃度或糖濃度等而成之等張液，則並無特別限制，具體而言，可列舉：生理鹽水、或具有緩衝效果之生理鹽水(例如PBS、三羥甲基胺基甲烷緩衝生理鹽水[Tris Buffered Saline；TBS]、HEPES緩衝生理鹽水)、林格氏液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、碳酸氫鹽林格氏液、5%葡萄糖水溶液、動物細胞培養用基礎培養基(例如DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199)、等張劑(例如葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、乳糖、氯化鈉)等，該等之中，較佳為乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、林格氏液、或生理鹽水(生理食鹽液)。等張液可為市售者，亦可為自行製備者。作為市售者，可列舉：Otsuka Normal Saline(大塚製藥工廠公司製造)(生理食鹽液)、林格氏液「OTSUKA」(大塚製藥工廠公司製造)(林格氏液)、LACTEC(註冊商標)Injection(大塚製藥工廠公司製造)(乳酸林格氏液)、乳酸林格氏液「KS」(共立製藥公司製造)(乳酸林格氏液)、VEEN F Injection(扶桑藥品工業公司製造)(乙酸林格氏液)、大塚糖液5%(大塚製藥工廠公司製造)(5%葡萄糖水溶液)、BICANATE Injection(大塚製藥工廠公司製造)(碳酸氫鹽林格氏液)。

所謂上述阿卡波糖(Acarbose)，係D-葡萄糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖、及(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-三羥基-3-(羥基甲基)-2-環己烯連接而成之四糖，更具體而言，係以下之式所表示之物質。阿卡波糖可藉由化學合成、利用微生物之生產(例如遊動放線菌[Actinoplanes]屬之胺基糖產生菌之培養)、利用酵素之生產等任意公知之方法製造，亦可使用市售品。例如可列舉阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)、阿卡波糖(商品名：Glucobay)(Bayer Yakuhin公司製造)等市售品。

[化1]

作為上述阿卡波糖之鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、蘋果酸鹽等酸加成鹽；鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等金屬鹽；銨鹽、烷基銨鹽等。再者，該等鹽於使用時以溶液之形式使用，較佳為其作用與阿卡波糖同效者。該等鹽類可形成水合物或溶劑合物，又，可單獨使用任1種或適當組合2種以上使用。

於本發明中，作為等張液中之阿卡波糖類之濃度，只要為發揮阿卡波糖類產生之細胞存活率降低之抑制效果之濃度即可，例如為至少40 mM、較佳為至少80 mM、更佳為至少150 mM、進而較佳為至少160 mM、進而更佳為至少170 mM。又，就成本效益之方面而言，等張液中之阿卡波糖類之濃度例如為1000 mM以下、較佳為700 mM以下、更佳為600 mM以下、進而較佳為500 mM以下、進而更佳為400 mM以下。因此，等張液中之阿卡波糖類濃度例如為40～1000 mM之範圍內、較佳為80～700 mM、更佳為150～600 mM、進而較佳為160 m～500 mM、進而更佳為170～400 mM。

所謂上述水蘇糖(Stachyose)，係D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、及D-半乳糖連接而成之四糖，更具體而言，係以下之式所表示之物質。水蘇糖可藉由化學合成、利用植物之生產(例如自大豆等豆類或瓜科植物進行熱水萃取)、利用酵素之生產等任意公知之方法製造，亦可使用市售品。例如可列舉水蘇糖n水合物(和光純藥工業公司製造)、水蘇糖水合物(東京化成工業公司製造)等市售品。

[化2]

作為上述水蘇糖之鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、蘋果酸鹽等酸加成鹽；鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等金屬鹽；銨鹽、烷基銨鹽等。再者，該等鹽於使用時以溶液之形式使用，較佳為其作用與水蘇糖同效者。該等鹽類可形成水合物或溶劑合物，又，可單獨使用任1種或適當組合2種以上使用。

於本發明中，作為等張液中之水蘇糖類之濃度，只要為發揮水蘇糖類產生之細胞存活率降低之抑制效果之濃度即可，例如為至少40 mM、較佳為至少80 mM、更佳為至少150 mM、進而較佳為至少160 mM、進而更佳為至少170 mM。又，就成本效益之方面而言，等張液中之水蘇糖類之濃度例如為1000 mM以下、較佳為700 mM以下、更佳為600 mM以下、進而較佳為500 mM以下、進而更佳為400 mM以下。因此，等張液中之水蘇糖類濃度例如為40～1000 mM之範圍內、較佳為80～700 mM、更佳為150～600 mM、進而較佳為160 m～500 mM、進而更佳為170～400 mM。

本案哺乳動物細胞保存用液用於將哺乳動物細胞於包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液以液體之狀態存在之溫度條件下保存任意期間。本案哺乳動物細胞保存用液中所含之阿卡波糖類或水蘇糖類係具有有效地抑制於液體中保存哺乳動物細胞時所產生之細胞存活率降低或細胞凝集之作用，且向哺乳動物之活體內投予之情形時對哺乳動物之生態造成不良影響之可能性較低的物質。因此，本案哺乳動物細胞保存用液較佳為進一步經特定為選自「用以抑制哺乳動物細胞之存活率降低」之用途；「用以抑制哺乳動物細胞之細胞凝集」之用途；及「用以移植哺乳動物細胞」之用途中的1種或2種以上之用途者。

本案哺乳動物細胞保存用液可除了阿卡波糖類及水蘇糖類以外，亦包含具有哺乳動物細胞之存活率降低抑制作用之成分，由於即便僅為阿卡波糖類或水蘇糖類亦發揮哺乳動物細胞之存活率降低抑制效果，故而亦可除了阿卡波糖類及水蘇糖類以外，不包含具有哺乳動物細胞之存活率降低抑制作用之成分(例如海藻糖、羥基乙基澱粉[Hydroxyethyl starch；HES]、葡萄糖)。

本案哺乳動物細胞保存用液通常可不包含具有抑制將哺乳動物細胞進行冷凍保存或冷凍乾燥保存時之哺乳動物細胞之存活率降低之作用的成分、例如二甲基亞碸[Dimethyl sulfoxide；DMSO]、甘油、乙二醇、三亞甲基二醇、二甲基乙醯胺、聚乙二醇[PEG]、聚乙烯吡咯啶酮、血清或來自血清之成分(例如白蛋白)等冷凍保護劑或冷凍乾燥保護劑。

作為本案哺乳動物細胞保存用液，於將包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液直接用於移植之情形時，較佳為適於哺乳動物細胞移植之液，該適於哺乳動物細胞移植之液較佳為不包含不適於哺乳動物細胞移植之物質、例如來自活體之成分(例如血清或來自血清之成分[例如白蛋白])、或上述冷凍保護劑或冷凍乾燥保護劑。

作為本案哺乳動物細胞保存用液，可為單獨包含阿卡波糖類或水蘇糖類之液，亦可為包含選自阿卡波糖類及水蘇糖類中之2種以上之四糖之液、或除了阿卡波糖類或水蘇糖類以外進而包含任意成分之液。

於本說明書中，作為「任意成分」，例如可列舉：等張劑(例如葡萄糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、氯化鈉)、螯合劑(例如EDTA、EGTA、檸檬酸、水楊酸酯)、增溶劑、保存劑、抗氧化劑、胺基酸(例如脯胺酸、麩胺酸)、聚合物(例如聚醚)、磷脂質(例如溶血磷脂酸[LPA；Lysophosphatidic acid])。於本說明書中，所謂「任意成分」，意指可包含亦可不包含之成分。又，本發明包括含有阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽之用以製備本案哺乳動物細胞保存用液之粉末製劑。於該粉末製劑中可包含上述之任意成分。

本發明之哺乳動物細胞之保存方法包括將哺乳動物細胞於包含阿卡波糖類及/或水蘇糖類之液(即本案哺乳動物細胞保存用液)中保存任意期間之步驟(以下，有時稱為「本案保存方法」)。本案保存方法通常將包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液於該保存用液以液體之狀態存在之溫度條件下進行保存，不包括於該保存用液以固體之狀態存在之溫度條件下進行保存之步驟(例如進行冷凍保存之步驟、進行冷凍乾燥保存之步驟等以休眠狀態保存哺乳動物細胞之步驟)。又，本案哺乳動物細胞保存用液中之哺乳動物細胞之密度例如為10³ ～10¹⁰ 個/mL之範圍內。

作為本案保存方法，可進而包括如下步驟：於在本案哺乳動物細胞保存用液中保存哺乳動物細胞之前，向包含阿卡波糖類及/或水蘇糖類之液(較佳為等張液)中添加哺乳動物細胞，或者向包含哺乳動物細胞之液(較佳為等張液)中添加阿卡波糖類及/或水蘇糖類，藉此製備包含阿卡波糖類及/或水蘇糖類之液。

於本發明中，作為保存哺乳動物細胞之任意期間，較佳為於以液體之狀態保存包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液時，可抑制該保存用液中之哺乳動物細胞之細胞存活率降低而提高活細胞之比率的期間，例如為6小時以上、12小時以上、24小時(1天)以上、36小時(1.5天)以上、48小時(2天)以上、3天以上、7天以上、10天以上，又，若哺乳動物細胞之保存期間過長則存在對細胞之存活造成不良影響之可能性，故而就避免對細胞之存活率之不良影響之觀點而言，通常為30天以下、較佳為20天以下、更佳為10天以下、進而較佳為6天以下。因此，作為上述任意之保存期間，通常為6小時～30天之範圍內、12小時～30天之範圍內、24小時～30天之範圍內、36小時～30天之範圍內、48小時～30天之範圍內、3～30天之範圍內、7～30天之範圍內、或10～30天之範圍內，較佳為6小時～20天、12小時～20天、24小時～20天、36小時～20天、48小時～20天、3～20天、7～20天、或10～20天，更佳為6小時～10天、12小時～10天、24小時～10天、36小時～10天、48小時～10天、3～10天、或7～10天，進而較佳為6小時～6天、12小時～6天、24小時～6天、36小時～6天、48小時～6天、或3～6天。

於本發明中，作為「包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液以液體之狀態存在之溫度」，只要為包含哺乳動物細胞之本案哺乳動物細胞保存用液不冷凍而以液體之狀態存在，且該保存用液中之哺乳動物細胞能夠生長之溫度即可，通常為0～40℃之範圍內、較佳為0～30℃(室溫)之範圍內。

作為本發明之哺乳動物細胞，例如為於針對需要哺乳動物細胞移植治療之疾病(癌症、I型糖尿病、肝疾病等器官疾病等)之再生醫療中經由血管所投予之哺乳動物細胞，具體而言，可例示：幹細胞、胰島細胞、肝細胞、白血球(例如樹狀細胞、淋巴球細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球)等；較佳為幹細胞、淋巴球細胞、或肝細胞。此處，所謂「淋巴球細胞」，係哺乳動物細胞之免疫系統中之白血球之亞型之一，指識別抗原，具有免疫能力之細胞。於淋巴球細胞中，具體而言，包含T細胞(例如阿爾法・貝塔[αβ]T細胞、伽馬・德爾塔[γδ]T細胞、細胞毒性T細胞[cytotoxic T lymphocyte；CTL]、輔助T細胞)、B細胞、自然殺手(NK)細胞。

上述哺乳動物細胞可利用公知之一般方法單離。例如白血球、或白血球中所含之淋巴球細胞(例如T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、γδT細胞)可視需要於IL-2或抗CD3抗體之存在下進行擴大培養後，藉由使用針對白血球之細胞表面標記物(CD45)、T細胞之細胞表面標記物(CD3)、輔助T細胞之細胞表面標記物(CD4)、細胞毒性T細胞(CD8)、γδT細胞之細胞表面標記物(CD39)之抗體的螢光活化細胞分選儀(FACS)、或使用經螢光物質或生物素、抗生物素蛋白等標記物質標記之針對上述細胞表面標記物之抗體、及針對該標記物質之抗體與MACS珠粒(磁珠)之結合抗體(conjugate antibody)的自動磁性細胞分離裝置(autoMACS)，使各標記物作為陽性之細胞自經溶血處理之末梢血或臍帶血試樣單離。作為上述螢光物質，可列舉：別藻藍蛋白(APC)、藻紅素(PE)、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、PE-Texas Red、PE-Cy5、PE-Cy7等。

又，所謂上述「幹細胞」，意指具有自我複製能力及分化/增生能力之未成熟之細胞。於幹細胞中，根據分化能力，包含萬能幹細胞(pluripotent stem cell)、多能幹細胞(multipotent stem cell)、單能幹細胞(unipotent stem cell)等亞群。所謂萬能幹細胞，意指其自身無法成為個體，但具有可向構成生物體之全部組織或細胞分化之能力的細胞。所謂多能幹細胞，意指具有雖並非向全部種類但可向複數種組織或細胞分化之能力的細胞。所謂單能幹細胞，意指具有可向特定之組織或細胞分化之能力的細胞。

作為萬能幹細胞，可列舉：胚胎幹細胞(Embryonic stem cell；ES細胞)、胚胎生殖細胞(Embryonic germ cell；EG細胞)、誘導性萬能幹細胞(Induced pluripotent stem cell；iPS細胞)等。ES細胞可藉由將內部細胞塊於飼養細胞(feeder cell)上或包含LIF之培養基中進行培養而製造。ES細胞之製造方法例如記載於WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等中。EG細胞可藉由將原始生殖細胞於包含mSCF、LIF及bFGF之培養基中進行培養而製造(Cell, 70: 841-847, 1992)。iPS細胞可藉由向體細胞(例如纖維母細胞、皮膚細胞等)中導入Oct3/4、Sox2及Klf4(視需要進而導入c-Myc或n-Myc)等重編程因子而製造(Cell, 126: p.663-676, 2006; Nature, 448: p.313-317, 2007; Nat Biotechnol, 26: p.101-106, 2008; Cell 131: p.861-872, 2007; Science, 318: p.1917-1920, 2007; Cell Stem Cells 1: p.55-70, 2007; Nat Biotechnol, 25: p.1177-1181, 2007; Nature, 448: p.318-324, 2007; Cell Stem Cells 2: p.10-12, 2008; Nature 451: p.141-146, 2008; Science, 318: p.1917-1920, 2007)。藉由培養由將體細胞之核進行核移植所製作之初期胚胎而確立之幹細胞亦作為萬能幹細胞而言較佳(Nature, 385, 810(1997); Science, 280, 1256(1998); Nature Biotechnology, 17, 456(1999); Nature, 394, 369(1998); Nature Genetics, 22, 127(1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999)), Rideout III等人(Nature Genetics, 24, 109(2000))。

作為多能幹細胞，可列舉：能夠分化成脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等細胞之間質系幹細胞、能夠分化成白血球、紅血球、血小板等血球系細胞之造血系幹細胞、能夠分化成神經元、星形細胞、寡樹突膠細胞等細胞之神經系幹細胞、骨髓幹細胞、生殖幹細胞等成體幹細胞等。多能幹細胞較佳為間質系幹細胞。所謂間質系幹細胞，意指能夠分化成骨原細胞、軟骨原細胞及脂母細胞之全部或若干種之幹細胞。多能幹細胞可藉由自身公知之方法自活體單離。例如，間質系幹細胞可利用公知之一般方法自哺乳動物之骨髓、脂肪組織、末梢血、臍帶血等採取。例如，可藉由骨髓穿刺後之造血幹細胞等之培養、繼代而單離人間質系幹細胞(Journal of Autoimmunity, 30(2008)163-171)。多能幹細胞亦可藉由在適當之誘導條件下培養上述萬能幹細胞而獲得。

作為本發明之哺乳動物，可例示：小鼠、大鼠、倉鼠、土撥鼠等嚙齒類、兔等兔形目、豬、牛、山羊、馬、綿羊等有蹄目、狗、貓等食肉目、人、猿猴、恆河獼猴、食蟹獼猴、狨猴、紅毛猩猩、黑猩猩等靈長類等，其中可良好地例示小鼠、豬、人。

作為本發明之哺乳動物細胞，可例示附著性(亦稱為「接著性」)之細胞。於本說明書中，所謂「附著性」細胞，意指可藉由接著於支架而存活、增生、進行物質之生產之支架依賴性之細胞。作為附著性幹細胞，例如可列舉萬能幹細胞、間質系幹細胞、神經系幹細胞、骨髓幹細胞、生殖幹細胞等，可良好地例示間質系幹細胞。

本發明之哺乳動物細胞(群)可為自活體內分離者，亦可為於體外(in vitro)進行繼代培養而成者，較佳為經單離或純化。於本說明書中，所謂「單離或純化」，意指實施將目標成分以外之成分去除之操作。經單離或純化之哺乳動物細胞之純度(哺乳動物幹細胞數等目標細胞相對於總細胞數之比率)通常為30%以上、較佳為50%以上、更佳為70%以上、進而較佳為90%以上(例如100%)。

保存於本案哺乳動物細胞保存用液中之哺乳動物細胞(群)可為單一細胞(single cell)之狀態。於本說明書中，所謂「單一細胞之狀態」，意指不與其他細胞聚集而形成塊(即未凝集之狀態)。單一細胞之狀態之哺乳動物細胞可藉由利用胰蛋白酶/EDTA等對在體外培養之哺乳動物細胞進行酵素處理而製備。哺乳動物細胞中所含之單一細胞之狀態之哺乳動物細胞之比率例如為70%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為99%以上(例如100%)。單一細胞之狀態之細胞之比率可藉由使哺乳動物細胞於PBS中分散，於顯微鏡下對其進行觀察，對隨機地選擇之複數個(例如1000個)細胞調查凝集之有無而確定。

保存於本案哺乳動物細胞保存用液中之哺乳動物細胞(群)可浮游。於本說明書中，所謂「浮游」，係指哺乳動物細胞不與收容保存用液之容器之內壁接觸而保持於液中。

於保持於本案哺乳動物細胞保存用液中之哺乳動物細胞凝集或沈澱之情形時，較佳為於移植前藉由移液或輕敲(taping)等該技術領域中周知之方法使哺乳動物細胞懸浮。

以下，藉由實施例更具體地對本發明進行說明，但本發明之技術範圍不限定於該等例示。實施例

實施例1：阿卡波糖及水蘇糖之篩選本發明者等人此前報告有若向包含哺乳動物細胞之液中添加海藻糖則可抑制以溶液之狀態保存時之細胞存活率降低(日本專利特開2012-115253號公報、國際公開第2014/208053號說明書)。因此，於本實施例中，自海藻糖以外之糖類探索顯示細胞存活率降低之抑制效果者。

1-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 選擇93種糖類，關於分子量明確之糖類，以成為87.5 mM之濃度之方式分別添加至作為乳酸林格氏液之LACTEC(註冊商標)Injection(大塚製藥工廠公司製造)中加以融解進行製備，又，關於分子量不明之糖類，以成為4～5%之濃度之方式分別添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含93種糖類之等張液。又，將海藻糖(林原股份有限公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解進行製備，而製備包含88 mM海藻糖之等張液。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用來自骨髓之人間質系幹細胞(Lonza Walkersville公司製造)(以下稱為「hMSC」)。

[包含hMSC之PBS之製備] 包含hMSC之PBS係依照以下之程序[1]～[8]製備。 [1]將4×10⁵ 個hMSC添加至75 cm² 燒瓶中，於培養基存在下在37℃、5%CO₂ 保溫箱進行培養。於顯微鏡下觀察細胞之狀態，進行培養直至達到約80%程度融合。 [2]去除培養基，利用8 mL之PBS(-)對hMSC進行沖洗。 [3]去除PBS(-)，添加3.75 mL之胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司製造)，於室溫下靜置5分鐘。 [4]一面於顯微鏡下進行觀察，一面緩慢搖晃直至hMSC剝離90%程度。 [5]添加3.75 mL之培養基，停止胰蛋白酶反應，藉由移液回收hMSC，移至50 mL離心管中。 [6]於600×g、5分鐘、22℃之條件下進行離心分離。 [7]去除上清液(培養基)，添加1.5 mL之PBS(-)，使沈澱物(hMSC)懸浮。 [8]測量細胞數，以成為5×10⁵ cells/mL之方式利用PBS(-)進行調整，製備包含hMSC之PBS。

[各種受驗用等張液中之hMSC之保存方法] 各種受驗用等張液中之hMSC之保存係依照以下之程序[1]～[2]進行。 [1]將所製備之包含hMSC之PBS向各管中各分注0.5 mL，進行離心分離(600×g、5分鐘)。 [2]去除上清液(PBS)，使沈澱物(hMSC)於0.5 mL之各種受驗用等張液中懸浮，於4℃下保存3天。

[利用錐蟲藍染色法之hMSC之細胞存活率之解析] 利用錐蟲藍染色法之hMSC之細胞存活率之解析係依照以下之程序[1]～[2]進行。 [1]自於4℃下保存3天後之包含hMSC之各種受驗用等張液各者採取20 μL(相當於1×10⁴ cells)，移至管中後，混合錐蟲藍染色液(Gibco公司製造)20 μL。再者，作為比較對照，自懸浮於各種受驗用等張液中前(於4℃下保存前)之包含hMSC之PBS各者採取20 μL(相當於1×10⁴ cells)，移至管中後，混合錐蟲藍染色液20 μL。 [2]於顯微鏡下使用單一細胞計數器(Biomedical Science公司製造)進行總細胞數與錐蟲藍陽性細胞(死細胞)數之測定，算出錐蟲藍陰性細胞相對於總細胞數之比率、即細胞存活率。

1-2.結果於93種糖類之中，作為細胞存活率降低之抑制效果高於海藻糖者，獲得阿卡波糖與水蘇糖。另一方面，關於D-乳糖酸、(-)-2,3-O-亞異丙基-D-蘇糖醇、D-半乳糖醛酸、及D-甘露胺糖，較之於乳酸林格氏液中保存hMSC之情形，細胞存活率降低。

實施例2：阿卡波糖及水蘇糖所產生之細胞存活率降低抑制效果之確認阿卡波糖與水蘇糖在同為四糖類上共通。因此，為了亦確認阿卡波糖與水蘇糖以外之四糖類是否具有細胞存活率降低抑制效果，使用2種四糖(蔗果四糖及麥芽四糖)進行研究。

2-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含175 mM阿卡波糖之等張液。又，將水蘇糖n水合物(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含175 mM水蘇糖之等張液。又，將蔗果四糖三水合物(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含175 mM蔗果四糖之等張液。又，將麥芽四糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含175 mM麥芽四糖之等張液。再者，作為比較對照，使用LACTEC Injection。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用實施例1中使用之hMSC。

[包含hMSC之PBS之製備] 包含hMSC之PBS係依照實施例1中記載之方法製備。

[各種受驗用等張液中之hMSC之保存方法] 依照實施例1中記載之方法，將hMSC於各種受驗用等張液中以4℃保存2天。

[利用錐蟲藍染色法之hMSC之細胞存活率之解析] 利用錐蟲藍染色法之hMSC之細胞存活率之解析係依照實施例1中記載之方法進行。

2-2.結果若於包含阿卡波糖或水蘇糖之LACTEC Injection中保存hMSC，則與保存於LACTEC Injection中之情形相比，確認到細胞存活率上升，與此相對，即便於包含蔗果四糖或麥芽四糖之LACTEC Injection中保存hMSC，亦未確認到該細胞存活率之上升(參照表1及圖1)。該結果顯示，阿卡波糖及水蘇糖所產生之細胞存活率降低抑制效果並非四糖類所共通者，而是阿卡波糖及水蘇糖特別具有之效果。

[表1]

實施例3：阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果之確認1 對阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果與海藻糖或葡萄糖所產生之細胞存活率降低抑制效果進行比較研究。

3-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含88 mM阿卡波糖之等張液、及包含175 mM阿卡波糖之等張液。又，將海藻糖(林原股份有限公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解進行製備，而製備包含88 mM海藻糖之等張液、及包含175 mM海藻糖之等張液。又，將葡萄糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含88 mM葡萄糖之等張液、及包含175 mM葡萄糖之等張液。再者，作為比較對照，使用作為生理食鹽液之Otsuka Normal Saline(大塚製藥工廠公司製造)、LACTEC Injection、及人間質系幹細胞專用培養基套組(MSCGM BulletKit，以下稱為「培養基」)(Lonza Walkersville公司製造，PT-3001)。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用實施例1中使用之hMSC。

[各種受驗用等張液中之hMSC之保存方法] 依照實施例1中記載之方法，將hMSC於各種受驗用等張液中以4℃保存3天。

[利用XTT法之hMSC之細胞存活率之解析] 利用XTT(3'-[1-(苯基胺基羰基)-3,4-四唑鎓]-雙(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉水合物)法之細胞存活率之解析係依照以下之程序[1]～[3]進行。 [1]自於4℃下保存3天後之包含hMSC之各種受驗用等張液各者採取100 μL(相當於5×10⁴ cells)，移至管中後，於600×g、5分鐘、22℃之條件下進行離心分離。 [2]去除上清液(各種受驗用等張液)，添加100 μL之培養基，使沈澱物(hMSC)懸浮後，移至96孔板。 [3]向各孔中各加入50 μL細胞增生套組II(Cat. No. 1465015，Roche公司製造)之XTT混合試劑(將XTT試劑與電子耦合液以50：1之比率進行混合而成者)。 [4]24分鐘後，使用微量盤偵測系統(Viento XS [KC junior]，大日本製藥公司製造)，測定作為藉由活細胞代謝、產生之甲臢色素之吸光度的480 nm之吸光度(A₄₈₀ )、及作為對照波長之吸光度的650 nm之吸光度(A₆₅₀ )，算出利用A₆₅₀ 修正過之A₄₈₀ 之吸光度(A₄₈₀ －A₆₅₀ )。

3-2.結果若於包含88 mM或175 mM之阿卡波糖之LACTEC Injection(乳酸林格氏液)中保存hMSC，則與保存於LACTEC Injection中之情形相比，作為活細胞之指標之「A₄₈₀ －A₆₅₀ 」值較高(參照表2及圖2)。又，若於包含88 mM或175 mM之海藻糖或葡萄糖之LACTEC Injection中保存hMSC，則與保存於LACTEC Injection中之情形相比，「A₄₈₀ －A₆₅₀ 」值較高，但於包含相同濃度之阿卡波糖之LACTEC Injection中保存hMSC之情形時有意義地高(參照表2及圖2)。該結果顯示，若將阿卡波糖添加至等張液中而據此保存哺乳動物細胞，則與於未添加阿卡波糖之等張液、或添加有海藻糖或葡萄糖之等張液中保存哺乳動物細胞之情形相比，可有效地抑制該液中之哺乳動物細胞之細胞死亡，提高活細胞之比率。

[表2]

實施例4：阿卡波糖之最佳濃度之研究使用包含44～350 mM阿卡波糖之等張液，研究阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果之最佳濃度。

4-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含44 mM阿卡波糖之等張液、包含88 mM阿卡波糖之等張液、包含175 mM阿卡波糖之等張液、及包含350 mM阿卡波糖之等張液。再者，作為比較對照，使用LACTEC Injection。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用實施例1中使用之hMSC。

4-2.結果若於包含44～175 mM之阿卡波糖之LACTEC Injection中保存hMSC，則細胞存活率依賴於阿卡波糖之濃度地上升，與此相對，若於包含175～350 mM之阿卡波糖之LACTEC Injection中保存hMSC，則細胞存活率幾乎無變化(參照表3及圖3)。該結果顯示，若將至少44 mM前後(較佳為至少175 mM前後)之阿卡波糖添加至等張液中而保存哺乳動物細胞，則可有效地抑制該液中之哺乳動物細胞之細胞死亡。

[表3]

實施例5：長期保存哺乳動物細胞之情形時阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果之確認為了確認於長期保存哺乳動物細胞時是否亦可確認到阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果，將hMSC於包含阿卡波糖之等張液中以4℃保存28天，解析細胞存活率。

5-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含44 mM阿卡波糖之等張液、包含88 mM阿卡波糖之等張液、及包含175 mM阿卡波糖之等張液。又，將海藻糖(林原股份有限公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解進行製備，而製備包含88 mM海藻糖之等張液。再者，作為比較對照，使用LACTEC Injection。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用實施例1中使用之hMSC。

[各種受驗用等張液中之hMSC之保存方法] 依照實施例1中記載之方法，將hMSC於各種受驗用等張液中以4℃保存28天。

5-2.結果若將hMSC於LACTEC Injection中保存28天，則細胞存活率為0%，與此相對，若將hMSC於包含88 mM之阿卡波糖之LACTEC Injection中保存28天，則細胞存活率上升至15.9±5.90%(參照表4及圖4)。又，將hMSC於包含海藻糖之LACTEC Injection中保存28天之情形時，細胞存活率亦上升，但將hMSC於包含阿卡波糖之LACTEC Injection中保存28天之情形時，其比率較高(參照表4及圖4)。進而顯示，若於包含175 mM之阿卡波糖之LACTEC Injection中保存hMSC，則與於包含88 mM之阿卡波糖之LACTEC Injection中保存hMSC之情形相比，細胞存活率進一步上升(參照表4及圖4)。該等結果顯示，於將阿卡波糖添加至等張液而長期(4℃下28天)保存哺乳動物細胞之情形時，亦可較將海藻糖添加至該等張液而長期保存哺乳動物細胞之情形有效地抑制哺乳動物細胞之存活率降低。

[表4]

實施例6：阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果之確認2 使用hMSC以外之哺乳動物細胞(大鼠肝細胞)，確認阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果。

6-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含175 mM阿卡波糖之等張液。又，將海藻糖(林原股份有限公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解進行製備，而製備包含175 mM海藻糖之等張液。又，將葡萄糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含175 mM葡萄糖之等張液。再者，作為比較對照，使用Otsuka Normal Saline、LACTEC Injection、及培養基。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用以下之表5所示之大鼠肝細胞。

[表5]

[包含大鼠肝細胞之洗淨用培養基之製備] 包含大鼠肝細胞之洗淨用培養基係依照以下之程序[1]～[6]製備。 [1]將大鼠肝細胞之存儲管自液態氮罐取出，於37℃恆溫槽中進行融解。 [2]融解後，立即靜置於冰上，移至50 mL離心管。 [3]滴加25 mL之經冰浴冷卻之肝細胞洗淨用培養基(Hepatocyte Wash Medium，以下稱為「洗淨用培養基」)(GIBCO公司製造)。 [4]於50×g、3分鐘、4℃之條件下進行離心分離。 [5]去除上清液(洗淨用培養基)，添加6 mL之洗淨用培養基，藉由2～3次移液使沈澱物(大鼠肝細胞)懸浮。 [6]測量細胞數，以成為5×10⁵ cells/mL之方式利用洗淨用培養基進行調整，製備包含大鼠肝細胞之洗淨用培養基。

[各種受驗用等張液中之大鼠肝細胞之保存方法] 各種受驗用等張液中之大鼠肝細胞之保存係依照以下之程序[1]～[2]進行。 [1]將所製備之包含大鼠肝細胞之洗淨用培養基向各管中各分注0.5 mL，進行離心分離(50×g、3分鐘、4℃)。 [2]去除上清液(洗淨用培養基)，使沈澱物(大鼠肝細胞)於0.5 mL之各種受驗用等張液中懸浮，於4℃下保存24小時。

[利用錐蟲藍染色法之大鼠肝細胞之細胞存活率之解析] 利用錐蟲藍染色法之大鼠肝細胞之細胞存活率之解析係於實施例1中記載之方法中，將hMSC替換為大鼠肝細胞進行。

6-2.結果若於包含阿卡波糖之LACTEC Injection中保存大鼠肝細胞，則與保存於LACTEC Injection中之情形、或保存於包含海藻糖或葡萄糖之LACTEC Injection中之情形相比，細胞存活率有意義地上升(參照表6及圖5)。根據該結果，阿卡波糖所產生之細胞死亡抑制效果不限於間質系幹細胞(hMSC)，於肝細胞中亦被確認到，故而認為可於所有哺乳動物細胞中被確認到。

[表6]

實施例7：阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果之確認3 阿卡波糖具有鍵結於α葡萄糖苷酶之活性部位，抑制糖之水解之作用。因此，為了確認阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果是否為抑制哺乳動物細胞中之α葡萄糖苷酶活性之結果所產生者，使用阿卡波糖以外之作為α-葡萄糖苷酶抑制藥之2種物質(米格列醇及伏格列波糖)進行研究。

7-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含175 mM阿卡波糖之等張液。又，將米格列醇(東京化成工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含175 mM米格列醇之等張液。又，將伏格列波糖(東京化成工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含175 mM伏格列波糖之等張液。再者，作為比較對照，使用LACTEC Injection。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用實施例1中使用之hMSC。

7-2.結果於包含阿卡波糖之LACTEC Injection中保存hMSC之情形時，與保存於LACTEC Injection中之情形相比，確認到細胞存活率上升，與此相對，於包含米格列醇或伏格列波糖之LACTEC Injection中保存hMSC之情形時，與保存於LACTEC Injection中之情形相比，細胞存活率幾乎無變化(參照表7及圖6)。該結果顯示，阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果並非抑制哺乳動物細胞中之α葡萄糖苷酶活性之效果所產生者。

[表7]

實施例8：阿卡波糖所產生之細胞凝集抑制效果為了確認阿卡波糖是否具有細胞凝集抑制效果，於包含阿卡波糖之等張液中保存hMSC，解析細胞凝集水準。

8-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含88 mM阿卡波糖之等張液。再者，作為比較對照，使用LACTEC Injection。

[各種受驗用等張液中之hMSC之保存方法] 依照實施例1中記載之方法，將hMSC於各種受驗用等張液中以25℃保存48小時。

[細胞凝集水準之解析法] 採取一部分保存後之包含hMSC之各種受驗用等張液，於相位差顯微鏡下觀察3個以上之細胞聚集而成之細胞凝集塊之有無。

8-2.結果若於LACTEC Injection中保存hMSC，則確認到大量細胞凝集塊之形成(參照圖7之上段、以黑圓圈包圍之部位)。另一方面，若於包含阿卡波糖之LACTEC Injection中保存hMSC，則幾乎未確認到細胞凝集塊之形成(參照圖7之下段)。該結果顯示，若將阿卡波糖添加至等張液而保存哺乳動物細胞，則可有效地抑制該液中之哺乳動物細胞之細胞凝集。

實施例9：hMSC以外之哺乳動物細胞之研究為了確認於保存hMSC以外之哺乳動物細胞時亦可確認到阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果，使用作為淋巴球細胞之一之CD8陽性T細胞進行研究。

9-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含88 mM阿卡波糖之等張液。又，作為比較對照，將海藻糖(林原股份有限公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解進行製備，而製備包含88 mM海藻糖之等張液。再者，作為比較對照，使用LACTEC Injection。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用CD8陽性T細胞(VERITAS公司製造)。

[CD8陽性T細胞之擴大培養法] CD8陽性T細胞之擴大培養係依照以下之程序[1]～[3]進行。 [1]將經冷凍保存之CD8陽性T細胞融解後，利用淋巴球培養基(LGM3，Lonza公司製造)洗淨，於該培養基中溫育約1小時(37℃、5%CO₂ )。 [2]分取包含CD8陽性T細胞之培養基，進行離心分離(300×g、10分鐘、室溫)。 [3]去除上清液，使之於TLY CULTURE套組25(GC Lymphotec公司製造)中浮游，將CD8陽性T細胞於37℃、5%CO₂ 條件下擴大培養7天。

[經擴大培養之CD8陽性T細胞之保存及細胞存活率之測定] 經擴大培養之CD8陽性T細胞之保存及細胞存活率之測定係依照以下之程序[1]～[3]進行。 [1]將擴大培養7天之CD8陽性T細胞(細胞濃度為約1.1×10⁶ 細胞/5 mL)利用包含88 mM海藻糖之LACTEC Injection洗淨，向Stemfull管(住友電木公司製造)中分注後，進行離心分離(300×g、10分鐘、室溫)。 [2]去除上清液，使沈澱物(CD8陽性T細胞)於3種受驗用等張液(包含88 mM阿卡波糖之LACTEC Injection、包含88 mM海藻糖之LACTEC Injection、及LACTEC Injection)中懸浮後，於5℃下保存24小時。再者，為了測定保存前之細胞存活率，於懸浮後立即自各Stemfull管回收CD8陽性T細胞懸浮液之一部分(20 μL)，混合錐蟲藍染色液20 μL後，於顯微鏡下使用單一細胞計數器(Biomedical Science公司製造)，測量1處之細胞計數部之四角之細胞計數室之區域之合計細胞數與錐蟲藍陽性細胞(死細胞)數，算出錐蟲藍陰性細胞相對於總細胞數之比率(細胞存活率)。 [3]保存24小時後，依照上述[2]中記載之方法測量細胞存活率。

9-2.結果若於包含阿卡波糖之LACTEC Injection中保存CD8陽性T細胞，則與保存於LACTEC Injection中之情形相比，細胞存活率有意義地上升(參照表8及圖8)。又，於包含海藻糖之LACTEC Injection中保存CD8陽性T細胞之情形時，雖細胞存活率亦上升，但於包含阿卡波糖之LACTEC Injection中保存CD8陽性T細胞之情形時，其比率有意義地高(參照表8及圖8)。該結果顯示，阿卡波糖所產生之存活率降低之抑制效果於保存CD8陽性T細胞等淋巴球細胞之情形時亦發揮，並且顯示該效果高於海藻糖。

[表8]

實施例10：水蘇糖之最佳濃度之研究使用包含44～150 mM水蘇糖之等張液，研究水蘇糖所產生之細胞存活率降低抑制效果之最佳濃度。

10-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將水蘇糖n水合物(和光純藥工業公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解，製備包含44 mM水蘇糖之等張液、包含88 mM水蘇糖之等張液、及包含175 mM水蘇糖之等張液。又，作為比較對照，將海藻糖(林原股份有限公司製造)添加至LACTEC Injection中加以融解進行製備，而製備包含88 mM海藻糖之等張液。再者，作為比較對照，使用LACTEC Injection。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用實施例1中使用之hMSC。

[各種受驗用等張液中之hMSC之保存方法] 依照實施例1中記載之方法，將hMSC於各種受驗用等張液中以5℃保存4天。

10-2.結果顯示若於包含水蘇糖之LACTEC Injection中保存hMSC，則與保存於LACTEC Injection中之情形相比，於任一濃度之水蘇糖中細胞存活率均有意義地上升，或細胞存活率依賴於水蘇糖之濃度地上升(參照表9及圖9)。又，於包含海藻糖之LACTEC Injection中保存hMSC之情形時，雖細胞存活率亦上升，但於包含水蘇糖之LACTEC Injection中保存hMSC之情形時，其比率較高(參照表9及圖9)。該結果顯示，水蘇糖所產生之細胞存活率降低之抑制效果於等張液中之水蘇糖濃度至少為44 mM前後時發揮，並且顯示該效果高於海藻糖。

[表9]

實施例11：等張液之研究作為等張液，亦對LACTEC Injection以外之等張液進行研究。

11-1.材料及方法 [受驗用等張液之製備] 將阿卡波糖(和光純藥工業公司製造)分別添加至4種等張液(LACTEC Injection、作為生理食鹽液之Otsuka Normal Saline[大塚製藥工廠公司製造]、林格氏液「OTSUKA」[大塚製藥工廠公司製造]、作為乙酸林格氏液之VEEN F Injection[扶桑藥品工業公司製造])中加以融解，製備包含88 mM阿卡波糖之上述4種等張液。又，作為比較對照，使用上述4種等張液。

[哺乳動物細胞] 哺乳動物細胞使用實施例1中使用之hMSC。

[各種受驗用等張液中之hMSC之保存方法] 依照實施例1中記載之方法，將hMSC於各種受驗用等張液中以5℃保存3天(參照圖10B)或9天(參照圖10C)。

11-2.結果顯示若將hMSC於包含阿卡波糖之4種等張液(LACTEC Injection、Otsuka Normal Saline、林格氏液「OTSUKA」、VEEN F Injection)中保存3天，則與於該4種等張液中保存3天之情形相比，細胞存活率上升，尤其是於使用LACTEC Injection及VEEN F Injection之情形時，細胞存活率明顯上升(參照表10及圖10B)。又，若將hMSC於包含阿卡波糖之上述4種等張液中保存9天，則與於該4種等張液中保存9天之情形相比，細胞存活率明顯上升(參照表10及圖10C)。該結果顯示，阿卡波糖所產生之細胞存活率降低抑制效果不限於LACTEC Injection(即乳酸林格氏液)，於Otsuka Normal Saline(即生理食鹽液)、林格氏液「OTSUKA」(即林格氏液)、VEEN F Injection(即乙酸林格氏液)等所有等張液中均發揮該效果。

[表10]

[產業上之可利用性]

根據本發明，藉由將阿卡波糖類或水蘇糖類添加至液體中，可有效地抑制於液體中保存哺乳動物細胞時所產生之細胞存活率降低或細胞凝集。進而，該等阿卡波糖類及水蘇糖類係向哺乳動物之活體內投予之情形時對哺乳動物之生態造成不良影響之可能性較低之四糖類，故而於本案哺乳動物細胞保存用液中保存哺乳動物細胞後，可不置換成新的移植用液而直接向哺乳動物之活體內投予。

圖1係表示藉由錐蟲藍染色法對將來自骨髓之人間質系幹細胞(hMSC；Human Mesenchymal Stem Cell)於5種受驗用等張液(LACTEC Injection[LR]、包含175 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋175A]、包含175 mM蔗果四糖(Nystose)之LACTEC Injection[LR＋175N]、包含175 mM麥芽四糖之LACTEC Injection[LR＋175Ma]、及包含175 mM水蘇糖之LACTEC Injection[LR＋175S])中以4℃保存2天後之細胞存活率進行解析所得之結果(n＝3)的圖(參照表1)。圖中之「Pre」表示於4℃下保存前之包含hMSC之磷酸緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline；PBS)中之hMSC之細胞存活率(94.7±2.1)。圖中之「**」及「***」表示進行Dunnett多重比較檢定，分別於統計學上具有有意義差(p＜0.01及p＜0.001)。圖2係表示藉由XTT法對將hMSC於9種受驗用等張液(Otsuka Normal Saline[S]、LACTEC Injection[LR]、包含88 mM海藻糖之LACTEC Injection[LR＋88T]、包含88 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋88A]、包含88 mM葡萄糖之LACTEC Injection[LR＋88G]、包含175 mM海藻糖之LACTEC Injection[LR＋175T]、包含175 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋175A]、包含175 mM葡萄糖之LACTEC Injection[LR＋175G]、及培養基[M])中以4℃保存3天後之細胞存活率進行解析所得之結果(培養基以外n＝3、培養基n＝2)的圖(參照表2)。圖中之「*」、「**」及「***」表示進行Dunnett多重比較檢定，分別於統計學上具有有意義差(p＜0.05、p＜0.01及p＜0.001)。又，圖中之「##」及「###」表示於88 mM之3群(LR＋88T、LR＋88A及LR＋88G)之間、及175 mM之3群(LR＋175T、LR＋175A、及LR＋175G)之間進行Tukey型多重比較檢定，分別於統計學上具有有意義差(p＜0.01及p＜0.001)。圖3係表示藉由錐蟲藍染色法對將hMSC於5種受驗用等張液(LACTEC Injection[LR]、包含44 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋44A]、包含88 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋88A]、包含175 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋175A]、及包含350 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋350A])中以4℃保存3天後之細胞存活率進行解析所得之結果(n＝3)的圖(參照表3)。圖中之「Pre」表示於4℃下保存前之包含hMSC之PBS中之hMSC之細胞存活率(95.0%)。圖中之「**」及「***」表示進行Dunnett多重比較檢定，分別於統計學上具有有意義差(p＜0.01及p＜0.001)。圖4係表示藉由錐蟲藍染色法對將hMSC於5種受驗用等張液(LACTEC Injection[LR]、包含88 mM海藻糖之LACTEC Injection[LR＋88T]、包含44 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋44A]、包含88 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋88A]、及包含175 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋175A])中以4℃保存28天後之細胞存活率進行解析所得之結果(n＝3)的圖(參照表4)。圖中之「Pre」表示於4℃下保存前之包含hMSC之PBS中之hMSC之細胞存活率(94.1%)。圖中之「**」及「***」表示進行Dunnett多重比較檢定，分別於統計學上具有有意義差(p＜0.01及p＜0.001)。圖5係表示藉由錐蟲藍染色法對將大鼠肝細胞於6種受驗用等張液(Otsuka Normal Saline[S]、LACTEC Injection[LR]、包含175 mM海藻糖之LACTEC Injection[LR＋175T]、包含175 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋175A]、包含175 mM葡萄糖之LACTEC Injection[LR＋175G]、及培養基[M])中以4℃保存24小時後之細胞存活率進行解析所得之結果(n＝6)的圖(參照表6)。圖中之「Pre」表示於4℃下保存前之包含大鼠肝細胞之洗淨用培養基中之大鼠肝細胞之細胞存活率(70.8±3.32)。圖中之「***」表示進行Dunnett多重比較檢定，於統計學上具有有意義差(p＜0.001)。又，圖中之「###」表示於175 mM之3群(LR＋175T、LR＋175A及LR＋175G)之間進行Tukey型多重比較檢定，於統計學上具有有意義差(p＜0.001)。圖6係表示藉由錐蟲藍染色法對將hMSC於4種受驗用等張液(LACTEC Injection[LR]、包含175 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋175A]、包含175 mM米格列醇(miglitol)之LACTEC Injection[LR＋175Mi]、及包含175 mM伏格列波糖(voglibose)之LACTEC Injection[LR＋175V])中以4℃保存3天後之細胞存活率進行解析所得之結果(n＝3)的圖(參照表7)。圖中之「Pre」表示於4℃下保存前之包含hMSC之PBS中之hMSC之細胞存活率(98.5±0.6)。圖中之「***」表示進行Dunnett多重比較檢定，於統計學上具有有意義差(p＜0.001)。圖7係表示將hMSC於2種受驗用等張液(LACTEC Injection[LR]、及包含88 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋88A])中以25℃保存48小時後之相位差顯微鏡圖像的圖。對各受驗用等張液拍攝複數個不同視野之圖像，表示代表性之3個圖像。圖像中之以黑圓圈包圍之部位表示細胞凝集塊。圖8係表示藉由錐蟲藍染色法對將經擴大培養之CD8陽性T細胞於3種受驗用等張液(LACTEC Injection[LR]、包含88 mM海藻糖之LACTEC Injection[LR＋88T]、及包含88 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋88A])中以5℃保存前之細胞存活率(圖8A)或保存24小時後之細胞存活率(圖8B)進行解析所得之結果(n＝3)的圖(參照表8)。圖中之「*」及「**」表示進行學生t檢定，分別於統計學上具有有意義差(p＜0.05及p＜0.01)，圖中之「n.s」表示進行學生t檢定，於統計學上無有意義差(p≧0.05)。圖9A表示於5℃下保存前之包含hMSC之PBS中之hMSC之細胞存活率(93.7±2.0%)。圖9B係表示藉由錐蟲藍染色法對將該hMSC於5種受驗用等張液(LACTEC Injection[LR]、包含44 mM水蘇糖之LACTEC Injection[LR＋44S]、包含88 mM水蘇糖之LACTEC Injection[LR＋88S]、包含175 mM水蘇糖之LACTEC Injection[LR＋175S]、及包含88 mM海藻糖之LACTEC Injection[LR＋88T])中以5℃保存4天後之細胞存活率進行解析所得之結果(n＝3)的圖(參照表9)。圖中之「**」及「***」表示進行Dunnett多重比較檢定，分別於統計學上具有有意義差(p＜0.01及p＜0.001)。圖10A表示於5℃下保存前之包含hMSC之PBS中之hMSC之細胞存活率(93.7±3.2%)。圖10B及10C係表示藉由錐蟲藍染色法對將該hMSC於8種受驗用等張液(LACTEC Injection[LR]、包含88 mM阿卡波糖之LACTEC Injection[LR＋88A]、Otsuka Normal Saline[S]、包含88 mM阿卡波糖之Otsuka Normal Saline[S＋88A]、林格氏液「OTSUKA」[R]、包含88 mM阿卡波糖之林格氏液「OTSUKA」[R＋88A]、VEEN F Injection[AR]、及包含88 mM阿卡波糖之VEEN F Injection[AR＋88A])中以5℃分別保存3天及9天後之細胞存活率進行解析所得之結果(n＝3)的圖(參照表10)。圖中之「*」、「**」、及「***」表示進行學生t檢定，分別於統計學上具有有意義差(p＜0.05、p＜0.01、及p＜0.001)，圖中之「n.s」表示進行學生t檢定，於統計學上無有意義差(p≧0.05)。

Claims

一種哺乳動物細胞保存用液，其包含阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽。
如請求項1之液，其於等張液中包含阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽。
如請求項2之液，其中等張液中之阿卡波糖或其鹽之濃度至少為40 mM。
如請求項2或3之液，其中等張液中之水蘇糖或其鹽之濃度至少為40 mM。
如請求項2至4中任一項之液，其中等張液為乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、林格氏液、或生理食鹽液。
如請求項1至5中任一項之液，其係用以於0～40℃下保存哺乳動物細胞。
如請求項1至6中任一項之液，其係用以將哺乳動物細胞保存6小時～30天。
如請求項1至7中任一項之液，其係用於抑制哺乳動物細胞之存活率降低。
如請求項1至8中任一項之液，其係用於抑制哺乳動物細胞之凝集。
如請求項1至9中任一項之液，其係用於哺乳動物細胞之移植。
如請求項1至10中任一項之液，其中哺乳動物細胞為哺乳動物幹細胞、哺乳動物淋巴球細胞、或哺乳動物肝細胞。
如請求項11之液，其中哺乳動物幹細胞為哺乳動物間質系幹細胞或哺乳動物淋巴球細胞。
一種哺乳動物細胞之保存方法，其包括於包含阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽之液中保存哺乳動物細胞之步驟。
如請求項13之保存方法，其中液為等張液。
如請求項14之保存方法，其中等張液中之阿卡波糖或其鹽之濃度至少為40 mM。
如請求項14或15之保存方法，其中等張液中之水蘇糖或其鹽之濃度至少為40 mM。
如請求項14至16中任一項之保存方法，其中等張液為乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、林格氏液、或生理食鹽液。
如請求項13至17中任一項之保存方法，其於0～40℃下保存哺乳動物細胞。
如請求項13至18中任一項之保存方法，其將哺乳動物細胞保存6小時～30天。
如請求項13至19中任一項之保存方法，其中哺乳動物細胞為哺乳動物幹細胞、哺乳動物淋巴球細胞、或哺乳動物肝細胞。
如請求項20之保存方法，其中哺乳動物幹細胞為哺乳動物間質系幹細胞或哺乳動物淋巴球細胞。
一種用以製備如請求項1至12中任一項之液之粉末製劑，其包含阿卡波糖或其鹽、及/或水蘇糖或其鹽。