TW201946650A - 針對腹內感染之疫苗 - Google Patents
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Abstract
描述了用於針對大腸桿菌腹內感染進行疫苗接種之組成物和方法。該等組成物包含FimH多肽、一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物、和佐劑。
Description
本發明涉及用於針對尿路感染和腹內感染的疫苗接種之組成物和方法。具體而言，本發明的實施方式涉及含有FimH多肽、與載體蛋白共價結合的大腸桿菌O-抗原多糖之軛合物（conjugate）以及佐劑的多價疫苗，以及該等疫苗用於保護免受由大腸桿菌引起的尿路感染和腹內感染之用途。
尿路感染（UTI）係年輕女性和老年人中的重要醫療保健問題。尿路致病性大腸桿菌（UPEC）（一種類型的腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）係許多該等感染的原因。現今，症狀性UTI主要使用抗生素進行治療。儘管一線抗生素治療在大多數情況下是有效的，但抗生素抗性菌株的增加導致這種治療方法變得更容易失敗，這可能導致更難以治療疾病。此外，已知大腸桿菌即使在具有抗生素治療史的患者中也會引起復發性感染。鑒於該等情況，顯然需要替代治療選擇，並且更較佳的是用於預防UTI。可有效預防大腸桿菌UTI的疫苗目前尚不可獲得。UPEC群體之間的高度多樣性使疫苗設計複雜化（Brumbaugh AR和Mobley HLT, 2012,Expert Rev Vaccines [ 疫苗專家評論 ]
, 11: 663-676）。此外，膀胱係免疫耐受的免疫隔室，並且通常藉由疫苗接種誘導黏膜免疫係相當困難的任務。
包含與載體蛋白共價結合的四種不同的大腸桿菌O-抗原的針對ExPEC的生物軛合物疫苗的1b期（首次在人中）臨床試驗證明了在具有復發性UTI病史的女性中針對所有疫苗血清型的功能性調理吞噬抗體的引發（Huttner A, 等人, 2017,Lancet Infect Dis
[柳葉刀：傳染病], dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(17)30108-1）。作為次要結果，這一研究證明了針對具有高（≥ 105
cfu/mL）細菌負荷的復發性UTI的部分保護有效性。血液中功能性抗體的誘導提出了以下預期：此類ExPEC軛合物可能能夠預防包括菌血症的侵襲性疾病，但是對於旨在預防UTI的疫苗接種而言，可能需要進一步改進疫苗的功效。
FimH黏附素（adhesin）蛋白已顯示在針對UTI的各種臨床前模型中誘導保護（Langermann S, 等人, 1997,Science [ 科學 ]
, 276: 607-611；Langermann S, 等人, 2000,J Infect Dis [ 傳染病雜誌 ]
, 181: 774-778；O’Brien VP等人, 2016,Nat Microbiol [ 自然微生物學 ]
, 2:16196）。在1999年，醫學免疫公司（Medimmune）將含有FimH的亞單位疫苗用於II期試驗，但是由於缺乏在預防UTI方面的功效，該疫苗的開發於2003年停止（參見例如，Brumbaugh AR和Mobley HLT，同上）。儘管如此，紅杉科學公司（Sequoia Sciences）似乎目前正在臨床開發用於復發性UTI的疫苗，該疫苗由FimH蛋白與新的佐劑配製物的組合組成。該公司報告說，這種疫苗具有高免疫原性和良好的耐受性，並且可以降低UTI的頻率，儘管仍需要確立安全性和功效（https://www.sequoiasciences.com/uti-vaccine-program）。
如上所述，本領域中仍然需要能夠降低UTI的發病率的疫苗。
ExPEC菌株還與可能導致ExPEC菌血症的腹內感染（IAI）相關（Russo等人, 2003,Microbes Infect [ 微生物與感染 ]
, 5(5):449-56）。針對UTI有效的疫苗針對此類IAI也可以是有效的。
本發明的一個目的是提供新穎的疫苗組成物，該等疫苗組成物能夠誘導針對大腸桿菌UTI和IAI的廣泛保護並且由此有助於降低大腸桿菌UTI和IAI的發病率。
本發明提供了FimH多肽和/或與載體蛋白共軛的大腸桿菌O-抗原和視需要的佐劑的疫苗或疫苗組合，該等疫苗或疫苗組合用於保護免受大腸桿菌IAI。此類疫苗組合提供了不同作用機制的組合，即抑制細菌黏附至膀胱上皮細胞的FimH特異性抗體的誘導與介導細菌殺死的O-抗原特異性和FimH特異性調理吞噬抗體的誘導的組合。因此預期該等組合相對於每種單獨抗原具有組合效應（即至少係相加的）並且可以產生協同效應。預期佐劑（例如，TLR4-激動劑）增加至少對FimH的免疫應答，可能還增加對O-抗原的免疫應答，並且可以活化T細胞應答，在黏膜部位具有主要Th1-炎性功能。
因此，在一個總體方面中，本發明涉及疫苗組合，該疫苗組合包含 (i) FimH多肽；(ii) 一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物；以及 (iii) 佐劑。在一個實施方式中，該疫苗組合包含第一組成物，該第一組成物包含 (i)；第二組成物，該第二組成物包含 (ii)；以及第三組成物，該第三組成物包含 (iii)。在另一個實施方式中，該疫苗組合包含第一組成物，該第一組成物包含 (i) 和 (ii)；以及第二組成物，該第二組成物包含 (iii)。在另一個實施方式中，該疫苗組合包含第一組成物，該第一組成物包含 (i) 和 (iii)；以及第二組成物，該第二組成物包含 (ii)。在另一個實施方式中，該疫苗組合包含第一組成物，該第一組成物包含 (i)；以及第二組成物，該第二組成物包含 (ii) 和 (iii)。在一個較佳的實施方式中，該疫苗組合包含組成物，該組成物包含 (i)、(ii) 和 (iii)。在另一個較佳的實施方式中，該疫苗組合包含如上所述的第一組成物和第二組成物，或如上所述的第一組成物、第二組成物和第三組成物，其中該第一組成物和第二組成物或該第一組成物、第二組成物和第三組成物用於在允許將該等疫苗組合組分引流至同一淋巴結的時間範圍內和位置處給予至受試者。
在一個方面中，本發明涉及一種用於在有需要的受試者中誘導針對由大腸桿菌引起的腹內感染（IAI）的免疫應答之方法，該方法包括向該受試者給予疫苗或疫苗組合，該疫苗或疫苗組合包含一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物、和/或FimH多肽以及視需要的佐劑。在較佳的實施方式中，該方法包括向該受試者給予疫苗組合，該疫苗組合包含FimH多肽、一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物、和佐劑。
在某些實施方式中，該IAI係炎症性腸病。
在某些實施方式中，該IAI係克羅恩氏病（Crohn’s disease）。
在某些實施方式中，該一種或多種軛合物包含大腸桿菌O25B抗原多糖。
在某些實施方式中，該一種或多種軛合物包含大腸桿菌O25B抗原多糖、大腸桿菌O1A抗原多糖、大腸桿菌O2抗原多糖以及大腸桿菌O6A抗原多糖。
在某些實施方式中，該一種或多種軛合物包含大腸桿菌O25B抗原多糖、大腸桿菌O1A抗原多糖、大腸桿菌O2抗原多糖、大腸桿菌O6A抗原多糖以及1至20（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20）種另外大腸桿菌O-抗原多糖。在某些非限制性實施方式中，該1至20種另外大腸桿菌O-抗原多糖中的一種或多種包括O4、O7、O9、O11、O12、O22、O75、O8、O15、O16或O18抗原多糖中的一種或多種。
在某些實施方式中，該載體蛋白係去毒的銅綠假單胞菌
外毒素A（EPA）。在較佳的實施方式中，該載體蛋白包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該FimH多肽包含截短的FimH。在某些實施方式中，該FimH多肽包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。在某些實施方式中，該FimH多肽包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列。在某些實施方式中，該FimH多肽包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列。在某些實施方式中，該FimH多肽包含呈高親和力構象的FimH。在某些實施方式中，該FimH多肽包含呈低親和力構象的FimH，例如具有突變R60P的FimH變體（其中編號對應於SEQ ID NO: 9中的胺基酸編號）。在某些實施方式中，該FimH多肽與FimC複合（稱為FimCH）。
在某些較佳的實施方式中，該佐劑包含基於皂苷的佐劑，如含有來自皂樹
（Quillaja saponaria
）的皂苷的水可提取部分的佐劑。在某些實施方式中，該佐劑包含QS21。
在某些較佳的實施方式中，該佐劑包含脂質體，在某些實施方式中，此類脂質體包含皂苷，如QS21。
在某些較佳的實施方式中，該佐劑包含TLR4激動劑。在某些實施方式中，該佐劑包含脂質A類似物。在其某些實施方式中，該TLR4激動劑包括MPL、3D-MPL、RC529、GLA、SLA、E6020、PET-脂質A、PHAD、3D-PHAD、3D-(6-醯基)-PHAD、ONO4007或OM-174。
本發明的還一方面係提供一種用於在有需要的受試者中針對由大腸桿菌引起的UTI或IAI進行疫苗接種之方法，該方法包括向該受試者給予本發明的疫苗組合。該FimH多肽、該至少一種與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖和該佐劑可以在一種組成物中給予，或者它們可以由多種組成物組合給予。在某些實施方式中，該FimH多肽、該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物和該佐劑存在於單一組成物中。在其他實施方式中，該等組分存在於多種組成物中，例如：a) 該FimH多肽和該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物存在於第一組成物中，並且該佐劑存在於第二組成物中；或者b) 該FimH多肽和該佐劑存在於第一組成物中，並且該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物存在於第二組成物中；或者c) 該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物和該佐劑存在於第一組成物中，並且該FimH多肽存在於第二組成物中；或者d) 該FimH多肽存在於第一組成物中，該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物存在於第二組成物中，並且該佐劑存在於第三組成物中。在該等組分存在於多種組成物的此類實施方式中，較佳的是該第一組成物和第二組成物，或該第一組成物、第二組成物和第三組成物在允許將該等疫苗組合組分引流至同一淋巴結的時間範圍內和位置處給予。
在另一方面中，本發明提供了一種用於製備本發明的疫苗組合之方法，該方法包括將 (i)（該FimH多肽）、(ii)（該至少一種與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖）和 (iii)（該佐劑）組合，以由此獲得該疫苗組合。在某些實施方式中，該疫苗組合的該等組分存在於套組（kit）中。在某些實施方式中，該用於製備本發明的疫苗組合的方法包括將 (i)、(ii) 和藥學上可接受的載體組合在第一組成物中，製備包含 (iii) 的第二組成物，並且將該第一組成物與該第一組成物組合以獲得該疫苗組合。在一個實施方式中，該第一組成物和該第二組成物在給予至受試者之前不久組合成混合組成物。在其他實施方式中，該疫苗組合藉由多種組成物給予，該等多種組成物各自包含總疫苗組合的該等組分的部分，該總疫苗組合包含 (i) FimH多肽、(ii) 一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物和 (iii) 佐劑，例如其中該等多種組成物中的第一種包含 (i)，該等多種組成物中的第二種包含 (ii)，並且該等多種組成物中的第三種包含 (iii)；或者其中該等多種組成物中的第一種包含 (i) 和 (iii)，並且該等多種組成物中的第二種包含 (ii)；或者其中該等多種組成物中的第一種包含 (i) 和 (ii)，並且該等多種組成物中的第二種包含 (iii)；或者其中該等多種組成物中的第一種包含 (ii) 和 (iii)，並且該等多種組成物中的第二種包含 (i)；其中該等多種組成物在允許將該等疫苗組合組分引流至同一淋巴結的時間範圍內和位置處給予至受試者。
本發明還涉及根據本發明的疫苗組合用於製造在有需要的受試者中用於預防UTI或IAI、或用於降低患有UTI或IAI的可能性、或用於降低與UTI或IAI相關的一種或多種症狀的嚴重性的疫苗或藥物之用途。本發明還涉及一種根據本發明的疫苗組合，其用於在有需要的受試者中預防UTI或IAI、或用於降低患有UTI或IAI的可能性、或用於降低與UTI或IAI相關的一種或多種症狀的嚴重性。
在背景中和貫穿本說明書中引用或描述各種出版物、文章和專利；該等參考文獻各自藉由引用以其全文結合在此。包括在本說明書中的文件、法案、材料、裝置、物品或類似物的討論用於提供本發明的背景的目的。這種討論不承認任何或所有該等事項形成關於所揭露或要求保護的任何發明的先前技術的一部分。
除非另外定義，否則在此所使用的所有科學和技術術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。否則，在此引用的某些術語具有如說明書中闡述的含義。在此引用的所有專利案、公開的專利申請案和出版物如同完全列出一樣藉由引用結合在此。必須注意，除非上下文另外明確規定，否則如在此和所附申請專利範圍中所使用，單數形式“一個/一種（a/an）”和“該”包括複數指示物。
貫穿本說明書和以下申請專利範圍，除非上下文另有要求，否則詞語“包含（comprise）”以及變化形式如“包含（comprises）”和“包含（comprising）”將理解為隱含包括所陳述的整體或步驟或一組整體或步驟，但不排除任何其他整體或步驟或任何其他組整體或步驟。當在此使用時，術語“包含（comprising）”可以被術語“含有（containing）”或“包括（including）”替代或者當在此使用時有時被術語“具有（having）”替代。
當在此使用時，“由……組成”不包括未在申請專利範圍要素中指定的任何要素、步驟或成分。當在此使用時，“基本上由……組成”並不排除不會實質性地影響申請專利範圍的基本和新穎特徵的材料或步驟。無論何時在此在本發明的一個方面或實施方式的上下文中使用時，前述術語包含（comprising）、含有（containing）、包括（including）和具有（having）中的任一種可以被術語“由……組成（consisting of）”或“基本上由……組成”替代以改變本揭露的範圍。
如在此所使用的，多個引用的要素之間的連接術語“和/或”應被理解為涵蓋單獨的和組合的選項兩者。例如，當兩種要素由和/或連接時，第一選項係指在不具有第二要素的情況下第一要素的應用。第二選項係指在不具有第一要素的情況下第二要素的應用。第三選項係指第一要素和第二要素一起的應用。該等選項中的任一個應被理解為屬於該含義之內，並且因此滿足如在此所使用的術語“和/或”的要求。該等選項中的多於一個的同時應用也應被理解為屬於該含義之內，並且因此滿足術語“和/或”的要求。
如在此所使用，術語“藥學上可接受的載體”係指不會干擾根據本發明的組成物的有效性或根據本發明的組成物的生物活性的無毒材料。“藥學上可接受的載體”可以包括任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑、油、脂質、含脂質的囊泡、微球、脂質體包封物或本領域中熟知的用於藥物配製物中的其他材料。應理解，藥學上可接受的載體的特徵將取決於特定應用的給藥途徑。根據特定實施方式，鑒於本揭露內容，適合用於疫苗的任何藥學上可接受的載體均可用於本發明中。合適的賦形劑包括但不限於無菌水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它們的組合，以及穩定劑，例如人血清白蛋白（HSA）或其他適合的蛋白質和還原糖。
如在此所使用，術語“有效量”係指在受試者中引發所希望的生物或藥物反應的活性成分或組分的量。關於所闡述的目的，有效量可以根據經驗並且以常規方式來確定。例如，體外測定可以視需要用於幫助鑒定最佳劑量範圍。
如在此所使用，術語“組合”在向受試者給予一種或多種O-抗原、FimH和佐劑或包含該等組分的組成物的背景下不限制O-抗原、FimH和佐劑或包含該等的組成物被給予至受試者的順序。例如，第一組成物（例如包含第一組分，例如O-抗原和FimH的軛合物）可以在向受試者給予第二組成物（例如包含第二組分，例如佐劑）之前（例如，之前5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時或12小時）、同時或之後（例如，之後5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時或12小時）給予。在某些實施方式中，大腸桿菌O-抗原和FimH多肽存在於第一組成物中，佐劑存在於第二組成物中，並且該第一組成物和第二組成物在給予之前不久組合在混合並注射（mix-and-shoot）應用中。
在某些實施方式中，該疫苗組合藉由多種組成物給予，該等多種組成物各自包含總疫苗組合的一部分，該總疫苗組合包含 (i) FimH多肽、(ii) 一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物和 (iii) 佐劑，例如其中該等多種組成物中的第一種包含 (i)，該等多種組成物中的第二種包含 (ii)，並且該等多種組成物中的第三種包含 (iii)；或者其中該等多種組成物中的第一種包含 (i) 和 (iii)，並且該等多種組成物中的第二種包含 (ii)；或者其中該等多種組成物中的第一種包含 (i) 和 (ii)，並且該等多種組成物中的第二種包含 (iii)；或者其中該等多種組成物中的第一種包含 (ii) 和 (iii)，並且該等多種組成物中的第二種包含 (i)；其中在其較佳的實施方式中，該等多種組成物在同一肢體中以彼此短距離（例如在彼此30 cm內、20 cm內、10 cm內、5 cm內、2 cm內）並且在彼此幾天內（例如在72小時、48小時、24小時、8小時內，較佳的是2小時內、1小時內、30分鐘內、10分鐘內，較佳的是5分鐘內、2分鐘內）給予至受試者，較佳的是基本上同時地共同給予。這將使該等疫苗組分能夠引流至同一淋巴結，其將確保來自佐劑的最大益處，即使在沒有物理組合或混合並注射的情況下。當在抗原的幾天內提供佐劑時，這也起作用。因此在某些實施方式中，該疫苗組合藉由多種組成物在允許將該等疫苗組合組分引流至同一淋巴結的時間範圍內和位置處給予至受試者。
如在此所使用，術語“腸外致病性大腸桿菌”或“ExPEC”係指遺傳相關的致病性大腸桿菌菌株，該等菌株通常在胃腸道外部的身體部位中侵襲、定殖並誘導疾病。ExPEC細菌包括尿路致病性（UPEC）大腸桿菌、新生兒腦膜炎（NMEC）大腸桿菌、敗血症相關（SePEC）的大腸桿菌、黏附侵襲性（AIEC）大腸桿菌、以及禽致病性（APEC）大腸桿菌。與ExPEC或ExPEC感染相關的疾病包括但不限於尿路感染、手術部位感染、菌血症、腹部或盆腔感染，如腹內感染、肺炎、醫院獲得性肺炎、骨髓炎、蜂窩組織炎、腎盂腎炎、傷口感染、腦膜炎、新生兒腦膜炎、腹膜炎、膽管炎、軟組織感染、膿性肌炎、膿毒性關節炎、以及敗血症。
如在此所使用，術語“尿路感染”或“UTI”係指影響身體的產生和/或攜帶尿液的部分（即尿路，例如腎、輸尿管、膀胱和/或尿道）的細菌感染。當它影響下尿路時，它也被稱為膀胱感染（膀胱炎），並且當它感染上尿路時，它也被稱為腎臟感染（腎盂腎炎）。下UTI的症狀可以包括排尿疼痛、尿頻、以及儘管膀胱排空也感覺需要排尿，而腎臟感染的症狀可以包括發熱和腰部疼痛，通常伴有下UTI的症狀。UTI還可能導致危及生命的侵襲性大腸桿菌疾病，例如菌血症、敗血症或尿膿毒病。UTI的最常見原因係大腸桿菌。風險因素包括女性解剖學結構、性交、糖尿病、肥胖和家族史。UTI在女性中比在男性中更常見，並且經常在16歲與35歲的年齡之間發生。UTI也經常發生在老年男性和女性中。UTI的復發係常見的，並且“復發性UTI”或“rUTI”係指六個月內至少兩次感染或一年內至少三次感染。導管插入術也是UTI的風險因素（CAUTI：導管相關的UTI），並且也是總體醫療保健相關感染（HAI）的主要促成因素。
大腸桿菌也被懷疑係炎症性腸病和其他腹內感染的致病因子（例如Boudeau J等人, 1999, Infect Immun [感染與免疫] 67: 4499-4509；Nash JHE等人, 2010, BMC Genomics [BMC基因組學] 11: 667；Conte MP等人, 2014, BMC Research Notes [BMC研究筆記] 7: 748；Desilets M等人, 2016, Inflamm Bowel Dis [炎症性腸病] 22: 1-12；Martinez-Medina M和LJ Garcia-Gil, 2014, World J Gastrointest Pathophysiol. [世界胃腸病理生理學雜誌] 15: 213-227）。如在此所使用，術語“腹內感染”或“IAI”係指響應於微生物的腹膜炎症，從而導致腹膜腔中的膿液。基於感染的程度，IAI被分類為不複雜的或複雜的。不複雜的IAI涉及胃腸（GI）道的內部炎症而無解剖學破壞。複雜的IAI涉及已經延伸超出源器官進入腹膜間隙的感染。複雜的IAI引起腹膜炎症，並且與局部或彌漫性腹膜炎相關。IAI的實例包括炎症性腸病（IBD）和克羅恩氏病。
如在此所使用，“受試者”或“患者”意指將或已經藉由根據本發明的實施方式的方法或組成物疫苗接種的任何動物，較佳的是哺乳動物，最較佳的是人。如在此所使用的術語“哺乳動物”涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限於牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更較佳的是人。在某些實施方式中，受試者係成年人。如在此所使用的，術語“成年人”係指18歲或18歲以上的人。
如在此所使用的，對抗原或組成物的“免疫學應答”或“免疫應答”係指在受試者中發展對該抗原或該組成物中存在的抗原的體液和/或細胞免疫應答。
流行病學
如在此所使用的，對抗原或組成物的“免疫學應答”或“免疫應答”係指在受試者中發展對該抗原或該組成物中存在的抗原的體液和/或細胞免疫應答。
流行病學
關於引起UTI的大腸桿菌血清型的分佈的研究鑒定了在目標群體中發現的最普遍的大腸桿菌血清型中的血清型O1、O2、O6和O25（參見例如，WO 2017/035181的揭露內容，其藉由引用結合在此）。還描述了，對於由不同、但結構上和抗原相關的亞型組成的O-抗原血清型，一種亞型在臨床分離株中比其他亞型更普遍。例如，O1A、O6A和O25B抗原被確定為分別針對O1、O6和O25血清型最近分析的臨床菌株或分離株中更頻繁的亞型。參見WO 2015/124769中關於流行病學研究的相關揭露內容，其揭露內容藉由引用結合在此。
包含大腸桿菌 O- 抗原軛合物、 FimH 和佐劑的組成物
包含大腸桿菌 O- 抗原軛合物、 FimH 和佐劑的組成物
在一個總體方面中，本發明涉及包含一種或多種大腸桿菌O-抗原軛合物、FimH多肽和佐劑的多價疫苗。
大腸桿菌
O-
抗原和軛合物
O-抗原血清型係基於O多糖抗原，其係革蘭氏陰性細菌中脂多糖（LPS）的表面多糖部分。已經報導了超過180種大腸桿菌O-抗原（Stenutz等人, 2006,FEMS Microbial Rev
[FEMS微生物學評論], 30: 382-403）。如在此使用的，術語“O多糖”、“O-抗原”、“O-抗原多糖”、“O-多糖抗原”和縮寫“OPS”全部係指革蘭氏陰性細菌的O-抗原，該O-抗原係LPS的外膜部分並且對革蘭氏陰性細菌的每種血清型或血清（亞）型具有特異性，該革蘭氏陰性細菌在此係大腸桿菌。O-抗原通常含有重複單元（RU）的聚合物，RU典型地由二至七個糖殘基組成。如在此所使用的，RU被設定為等於生物重複單元（BRU）。BRU描述了O-抗原的RU，因為它在體內合成。
如在此所使用的，術語“軛合物”和“糖軛合物”係指含有與載體蛋白共價結合的大腸桿菌O-抗原的共軛產物。軛合物可以是生物軛合物，其係在宿主細胞中製備的共軛產物，其中宿主細胞機器產生O-抗原和載體蛋白，並且例如經由N-鍵聯酶促地將O-抗原與載體蛋白連接。在較佳的實施方式中，軛合物係生物軛合物，其可以根據例如WO 2015/124769中描述的方法來製備。軛合物也可以藉由其他方式製備，例如，藉由純化的載體蛋白和O-抗原或含O-抗原的結構的化學連接。在化學共軛的情況下，起始多糖可以從細菌中純化，或者多糖可以在體外化學和/或酶促地合成且然後該多糖可以化學或酶促地與載體蛋白共軛。
在某些實施方式中，O-抗原軛合物含有主要在大腸桿菌臨床分離株中發現的O-抗原血清型，該等O-抗原軛合物可以用於提供主動免疫以預防由具有疫苗中含有的O-抗原血清型的大腸桿菌引起的疾病。較佳的是，根據本發明實施方式的組成物包含多於一種大腸桿菌O-抗原的軛合物，該等O-抗原在大腸桿菌臨床分離株中係普遍的。此類O-抗原的實例包括但不限於大腸桿菌O1、O2、O4、O6、O7、O8、O9、O11、O12、O15、O16、O17、O18、O21、O22、O25、O44、O73、O75、O77、O101、以及O153抗原。根據需要，該組成物可以包含多於一種大腸桿菌O-抗原，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種或更多種大腸桿菌O-抗原，以提供針對多種大腸桿菌血清型的免疫保護。在一個較佳的實施方式中，該組成物至少包含具有來自大腸桿菌O25B血清型的O-抗原的軛合物。在一個較佳的實施方式中，另外的大腸桿菌O-抗原選自下組，該組由以下組成：大腸桿菌O1、O2和O6抗原。更較佳的是，該組成物包含來自大腸桿菌O25B、O1A、O2和O6A的大腸桿菌O-抗原的軛合物。在某些實施方式中，除O25B、O1A、O2和O6A O-抗原軛合物外，該組成物還包含1-16種，例如1-10種另外的具有來自另外的大腸桿菌血清型的O-抗原的軛合物。在一個示例性和非限制性實施方式中，此類另外的血清型包括來自O4、O7、O9、O11、O12、O22、O75、O8、O18、O15、以及O16的一種或多種。可以例如基於目標群體中的流行病學研究添加或代替上述的那些使用包含其他大腸桿菌血清型的O-抗原的軛合物。
Cryz等人, 1995, Vaccine [疫苗] 13: 449-453揭露了包含大腸桿菌LPS血清型O1、O2、O4、O6、O7、O8、O12、O15、O16、O18、O25(A)以及O75的O-抗原的12價組成物。Fattom等人, 1999,同上
揭露了包含大腸桿菌LPS血清型O1、O4、O6、O7、O8、O11、O15、O16、O18、O22、O25（可能O25A）以及O75的O-抗原的12價組成物。
如在此所使用的，“大腸桿菌O25B抗原”係指對大腸桿菌O25B血清型具有特異性的O-抗原。在一個實施方式中，大腸桿菌O25B抗原包含式O25B’的結構：
，
其中式O25B’中的n係1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整數。在本發明的一個實施方式中，式O25B’中的n係10-20的整數。
，
其中式O25B’中的n係1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整數。在本發明的一個實施方式中，式O25B’中的n係10-20的整數。
較佳的是，具有式O25B’的結構的大腸桿菌O25B抗原的群體用於根據本發明實施方式之組成物和方法中，其中該群體中至少80%的大腸桿菌O25B抗原的n係1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整數。在本發明的一個實施方式中，該群體中至少80%的大腸桿菌O25B抗原的n係10-20的整數。
如在此所使用的，“大腸桿菌O1抗原”係指對大腸桿菌O1血清型具有特異性的O-抗原。在一個實施方式中，大腸桿菌O1抗原係大腸桿菌O1A抗原。
如在此所使用的，“大腸桿菌O1A抗原”係指對大腸桿菌O1A血清型具有特異性的O-抗原。在一個實施方式中，大腸桿菌O1A抗原包含式O1A’的結構：
，
其中式O1A’中的n係1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整數。在一個實施方式中，式O1A’中的n係7-15的整數。
，
其中式O1A’中的n係1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整數。在一個實施方式中，式O1A’中的n係7-15的整數。
較佳的是，具有式O1A’的結構的大腸桿菌O1A抗原的群體用於根據本發明實施方式之組成物和方法中，其中該群體中至少80%的大腸桿菌O1A抗原的n係 1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20。在一個實施方式中，該群體中至少80%的大腸桿菌O1A抗原的n係5-15的整數。
如在此所使用的，“大腸桿菌O2抗原”係指對大腸桿菌O2血清型具有特異性的O-抗原。在一個實施方式中，大腸桿菌O2抗原包含式O2’的結構：
，
其中式O2’中的n係1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整數。在一個實施方式中，式O2’中的n係8-16的整數。
，
其中式O2’中的n係1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整數。在一個實施方式中，式O2’中的n係8-16的整數。
較佳的是，具有式O2’的結構的大腸桿菌O2抗原的群體用於根據本發明實施方式之組成物和方法中，其中該群體中至少80%的大腸桿菌O2抗原的n係 1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20。在一個實施方式中，該群體中至少80%的大腸桿菌O2抗原的n係5-20的整數。
如在此所使用的，“大腸桿菌O6抗原”係指對大腸桿菌O6血清型具有特異性的O-抗原。在一個實施方式中，大腸桿菌O6抗原係大腸桿菌O6A。
如在此所使用的，“大腸桿菌O6A抗原”，也稱為“大腸桿菌O6K2抗原”或“大腸桿菌O6Glc抗原”，係指對大腸桿菌O6A血清型具有特異性的O-抗原。在一個實施方式中，大腸桿菌O6A抗原包含式O6A’的結構：
，
其中β1,2鍵聯也稱為β2鍵聯，式O6A’中的n係1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整數。在一個實施方式中，式O6A’中的n係8-18的整數。
，
其中β1,2鍵聯也稱為β2鍵聯，式O6A’中的n係1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整數。在一個實施方式中，式O6A’中的n係8-18的整數。
較佳的是，具有式O6A’的結構的大腸桿菌O6A抗原的群體用於根據本發明實施方式之組成物和方法中，其中該群體中至少80%的大腸桿菌O6A抗原的n係 1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20。在一個實施方式中，該群體中至少80%的大腸桿菌O6A抗原的n係5-20的整數。
在一個較佳的實施方式中，本發明的組成物包含具有式O25B’的結構的大腸桿菌O25B抗原，其中該群體中至少80%的大腸桿菌O25B抗原的n係10-20的整數；具有式O1A’的結構的大腸桿菌O1A抗原，其中該群體中至少80%的大腸桿菌O1A抗原的n係5-15的整數；具有式O2’的結構的大腸桿菌O2抗原，其中該群體中至少80%的大腸桿菌O2抗原的n係5-20的整數；以及具有式O6A’的結構的大腸桿菌O6A抗原，其中該群體中至少80%的大腸桿菌O6A抗原的n係5-20的整數，其中該等O-抗原中的每種共價結合至具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列的EPA載體蛋白。
可用於本發明中的大腸桿菌O-抗原可以藉由本領域中已知的方法鑒於本揭露內容來生產。例如，它們可以由細胞生產，較佳的是被優化用於O-抗原的生物合成的重組細胞。參見例如，WO 2006/119987、WO 2009/104074、WO 2015/124769、Ihssen等人, 2010,Microbial Cell Factories [ 微生物細胞工廠 ]
, 9:61中關於用於大腸桿菌O-抗原生物合成的核酸、蛋白質、宿主細胞、生產方法等的相關揭露內容，它們的揭露內容藉由引用結合在此。可用於本發明中的大腸桿菌O-抗原也可以藉由傳統的提取方法生產，包括使用例如三氯乙酸、水性丁醇、triton/Mg+2
、冷乙醇或100°C的水、苯酚、氯仿、石油醚或甲醇的那些方法（參見例如，Apicella等人, 1994,Methods Enzymol
[酶學方法], 235:242-52）。可用於本發明中的大腸桿菌O-抗原也可以使用本領域中已知的方法藉由多糖的體外化學合成來生產（參見例如，Woodward等人, 2010,Nat Chem Biol
[自然化學生物學], 6(6): 418-423）。
軛合物的有效量或劑量係基於軛合物中的多糖部分來定義的。在包含多於一種軛合物的組成物中，每種軛合物的濃度可以是大約相同的，或者不同的軛合物可以按不同的濃度存在。
對於包含O25B抗原的軛合物和例如O1A、O2和O6A抗原的軛合物的組成物，該O1A、O2和O6A抗原軛合物的濃度或劑量典型地在O25B抗原軛合物的20%與100%之間。包含O25B、O1A、O2和O6A的軛合物的組成物的一些非限制性實例包含1 : 1 : 1 : 1、或2 : 1 : 1 : 1、或4 : 1 : 1 : 1、或4 : 2 : 1 : 1的重量比（的相應抗原多糖）的該等軛合物。
向受試者單次給予的非限制性示例性劑量例如係每單獨多糖約2與25微克（ug）之間，例如每多糖約4與16 ug之間。
藉由注射給予至人受試者的典型體積係約0.1-1.5之間，最典型地是約0.5 mL。
在某些實施方式中，該組成物中O25B軛合物的濃度係約5與約50微克（ug）/mL之間，較佳的是8 ug/mL與32 ug/mL之間，例如8 ug/mL、12 ug/mL、16 ug/mL、20 ug/mL、24 ug/mL、28 ug/mL或32 ug/mL，更較佳的是8與16 ug/mL之間。
組成物（其中O25B將例如以16 ug/mL存在並且包含例如2 : 1 : 1 : 1重量比（的相應抗原多糖）的O25B、O1A、O2和O6A的軛合物）的非限制性和示例性給予劑量對於O25B : O1A : O2 : O6A軛合物將是8 : 4 : 4 : 4 ug多糖。組成物（包含其中O25B將例如以8 ug/mL存在並且包含例如1 : 1 : 1 : 1重量比的相應抗原多糖的O25B : O1A : O2 : O6A的軛合物）的另一個非限制性和示例性給予劑量對於相應軛合物將是4 : 4 : 4 : 4 ug多糖等。此類組成物和劑量已經在藉由引用而結合的WO 2017/035181中進行了更詳細地描述並且已經在人中進行了測試。
對於包含其他或另外的O-抗原軛合物的組成物，在典型實施方式中，該等其他或另外的O-抗原軛合物的濃度或劑量係O25B抗原軛合物的20%與400%之間，較佳的是25%與200%之間，例如O25B抗原軛合物的50%與100%之間。對於每種單獨的O-抗原軛合物，給予的最佳劑量（和組成物中的相應濃度）可以由熟練的技術人員基於免疫學測定和臨床試驗，遵循藉由引用而結合的WO 2017/035181中針對O25B、O1A、O2和O6A描述的基本原理和方案來確定。用於單次給予至受試者的組成物中每種單獨的另外O-抗原軛合物的典型劑量在該軛合物中將是2與25 ug之間的另外O-抗原多糖，例如每多糖4與16 ug之間。
載體蛋白
可以用於共軛O-抗原的載體蛋白可以選自熟悉該項技術者已知的任何載體蛋白，例如去毒的銅綠假單胞菌
外毒素A（EPA；參見例如，Ihssen等人，同上）、FimH、鞭毛蛋白（FliC）、CRM197、麥芽糖結合蛋白（MBP）、白喉類毒素、破傷風類毒素、去毒的金黃色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素的去毒變體、霍亂毒素B亞單位（CTB）、霍亂毒素、霍亂毒素的去毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白的過客結構域（passenger domain）、肺炎鏈球菌肺炎球菌
溶血素及其去毒變體等。較佳的實例係CRM197和EPA，EPA係特別較佳的。在一個特別較佳的實施方式中，該載體蛋白係具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的EPA。
根據本發明的某些實施方式，每種大腸桿菌O-抗原與EPA載體蛋白共價結合（參見例如，Ihssen等人，同上）。對於EPA，各種去毒蛋白質變體已經在文獻中進行了描述並且可以用作載體蛋白。
在某些實施方式中，在本發明的軛合物中使用的EPA載體蛋白以蛋白質毒性較低和/或對糖基化更敏感的這樣一種方式進行修飾。例如，根據Lukac等人, 1988,Infect Immun
[感染與免疫], 56: 3095-3098；和Ho等人, 2006,Hum Vaccin [ 人類疫苗 ]
, 2:89-98，可以藉由使催化必需殘基L552V和ΔE553突變和缺失來實現去毒。在一個具體實施方式中，對用於產生本發明的軛合物的載體蛋白進行修飾，以使得該等載體蛋白中糖基化位點的數量以允許例如在免疫原性組成物中以其生物軛合物形式給予較低濃度的蛋白質的方式進行優化。
在某些實施方式中，將EPA或其他載體蛋白修飾為包含比通常將與載體蛋白相關的多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個糖基化位點（例如，相對於與呈其天然/自然，例如“野生型”狀態的載體蛋白相關的糖基化位點的數量）。在具體實施方式中，糖基化位點的引入藉由以下來實現：在蛋白質的一級結構中的任何地方插入糖基化共有序列（例如，Asn-X-Ser(Thr)（SEQ ID NO: 3）），其中X可以是除Pro之外的任何胺基酸；或較佳的是Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)（SEQ ID NO: 2），其中X和Z獨立地選自除Pro之外的任何天然胺基酸（參見例如，WO 2006/119987）。在一個特定實施方式中，EPA載體蛋白包含序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr的4個共有糖基化序列，並且具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
可用於本發明中的EPA載體蛋白可以藉由本領域中已知的方法鑒於本揭露內容來生產。參見例如，例如Ihssen等人，同上以及WO 2006/119987、WO 2009/104074和WO 2015/124769中的相關揭露內容，它們的揭露內容藉由引用結合在此。在某些實施方式中，EPA載體蛋白可以與信號序列（如大腸桿菌DsbA、大腸桿菌外膜孔蛋白A（OmpA）、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白（MalE）等的訊息肽）一起產生，該信號序列使載體蛋白靶向表現該載體蛋白的宿主細胞的周質空間。EPA載體蛋白也可以被修飾為含有“標籤”，即允許分離和/或鑒定載體蛋白的胺基酸序列。
其他載體蛋白可以藉由類似的方式來製備。對於化學共軛，載體蛋白不需要上述糖基化共有序列，並且典型地可以根據本領域中已知的方法藉由重組蛋白質產生而獲得。
根據本發明的某些實施方式，大腸桿菌O-抗原經由生物共軛與載體蛋白共價結合。因此，在某些實施方式中，宿主細胞可以產生大腸桿菌O-抗原和EPA載體蛋白，並且使O-抗原共價結合至EPA載體蛋白以形成可用於本發明中的生物軛合物。參見例如，例如Ihssen等人，同上以及WO 2006/119987、WO 2009/104074和WO 2015/124769中的相關揭露內容，它們的揭露內容藉由引用結合在此。
根據本發明的一個實施方式，大腸桿菌O-抗原經由在包含Asp (Glu)-X-Asn-Z-Ser (Thr)（SEQ ID NO: 2）的糖基化序列的Asn殘基處的生物共軛與載體蛋白共價結合，其中X和Z獨立地選自除Pro之外的任何天然胺基酸。
在一個具體實施方式中，EPA載體蛋白N-連接至可用於本發明中的大腸桿菌O-抗原。例如，大腸桿菌O-抗原連接至載體蛋白的糖基化序列中的Asn殘基，該糖基化序列如Asn-X-Ser(Thr)（SEQ ID NO: 3），其中X可以是除Pro之外的任何胺基酸，較佳的是Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)（SEQ ID NO: 2），其中X和Z獨立地選自除Pro之外的任何天然胺基酸。
根據其他實施方式，O-多糖可以藉由化學合成來製備，即在宿主細胞外部體外製備。在其他實施方式中，(脂)多糖係從宿主細胞中純化的。例如，本發明的大腸桿菌O-抗原係從宿主細胞中純化的或化學合成的，可以使用熟悉該項技術者已知的方法與載體蛋白共軛，包括藉由在多糖/寡糖以及蛋白質載體中使用活化反應性基團。參見例如，Pawlowski等人, 2000,Vaccine [ 疫苗 ],
18:1873-1885；和Robbins等人, 2009,Proc Natl Acad Sci USA
, 106:7974-7978，該等文獻的揭露內容藉由引用結合在此。此類方法包括化學合成或從宿主細胞中提取抗原多糖/寡糖，純化該等多糖/寡糖，化學活化該等多糖/寡糖，並且使該等多糖/寡糖與載體蛋白共軛。用於化學軛合物的化學共軛和製備的O-抗原的製備已在本領域中進行了描述，例如，US 5,370,872；Cryz SJ等人, 1995,同上
；Fattom A等人, 1999, Vaccine [疫苗] 17: 126-133；Micoli F等人, 2013, Anal Biochem [分析生物化學] 434: 136-145；Stefanetti G等人, 2014, Vaccine [疫苗] 32: 6122-6129；Stefanetti G等人, 2015, Angew. Chem. Int. Ed. [應用化學國際版] 54, http://dx.doi.org/10.1002/anie.201506112；Stefanetti G等人, 2015, Bioconjug Chem [生物共軛化學] 26: 2507-2513；Meloni E等人, 2015, J Biotechnol [生物技術雜誌] 198: 46-52；Rondini S等人, 2015, Infect Immun [感染與免疫] 83: 996-1007；Baliban SM等人, 2017, PLoS Neglected Tropical Diseases [公共科學圖書館·被忽視的熱帶病], doi.org/10.1371/journal.pntd.0005493。
生物軛合物具有相對於使用來自宿主細胞的純化多糖在體外化學合成的糖軛合物的有利性質，例如，生物軛合物在製造中需要更少的化學品並且就產生的最終產物而言更一致和均勻。生物軛合物可以藉由相對通用的方法來生產，而合成的軛合物將需要針對每種單獨結構的結構依賴性定製方法，這尤其對於高價產物係重要的問題。因此，生物軛合物相對於此類化學生產的糖軛合物係較佳的。
在某些實施方式中，大腸桿菌O-抗原以1 : 20至20 : 1、較佳的是1 : 10至10 : 1、更較佳的是1 : 3至3 : 1的多糖與蛋白質重量/重量比共價結合至載體蛋白。在O25B、O1A、O2和O6A的生物軛合物的某些非限制性實施方式中，多糖/蛋白質的比率在約0.1與0.5之間（即多糖:蛋白質係1 : 10至1 : 2），這取決於O-抗原血清型。
本發明的軛合物可以藉由本領域中已知用於純化蛋白質的任何方法進行純化，例如，藉由層析法（例如，離子交換層析法、陰離子交換層析法、親和層析法和尺寸分級柱層析法）、離心、差異溶解度、或藉由用於純化蛋白質的任何其他標準技術進行純化。參見例如，Saraswat等人, 2013,Biomed. Res. Int
. [國際生物醫學研究], ID#312709（第1-18頁）；還參見WO 2009/104074中描述的方法。用於純化特定軛合物的實際條件將部分地取決於合成策略（例如，合成生產對比重組生產）以及諸如軛合物的淨電荷、疏水性和/或親水性的因素，並且對於熟悉該項技術者將是顯而易見的。
FimH
多肽
如在此所使用的，術語“FimH多肽”、“FimH蛋白”、“FimH抗原”和“FimH”全部係指FimH黏附素多肽、其變體或其抗原性片段。FimH係在自然界中可以在大腸桿菌表面上的1型傘毛或菌毛的尖端處發現的黏附素，其中它促進黏附和附著至細胞或表面如膀胱上皮細胞。FimH負責D-甘露糖敏感性黏附。成熟的FimH作為1型傘毛細胞器的組分展示在細菌表面上。根據本發明的“FimH”多肽包含促進黏附過程的結構域的至少一部分，其在自然界中朝向N-末端定位。包含FimH或其片段的疫苗組成物在給予後可以誘導針對FimH的抗體，該等抗體可以經由調理吞噬作用預防或減少細菌黏附和/或介導細菌殺死。FimH可以從天然大腸桿菌細胞中純化。在較佳的實施方式中，FimH在適合的宿主細胞如大腸桿菌中重組表現並產生。如在此所使用的，術語“FimHt”和“FimHLD
”係指截短形式的FimH，其中成熟蛋白質的C-末端的一部分缺失（例如，Langermann等人, 1997, 同上；Schembri等人, 2000, FEMS Microbiol Letters [FEMS微生物學通訊] 188: 147-51；Rabbani等人, 2010, Anal Biochem [分析生物化學] 407: 188-195；Schwartz等人, 2013, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊] 110: 15530-15537）。在某些非限制性實施方式中，FimH多肽係FimHt並且包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。在另一個非限制性實施方式中，FimH多肽係FimHLD
並且包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列。在另一非限制性實施方式中，FimHLD
包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列。
本發明的組成物包含FimH。可以用於根據本發明的組成物中的FimH可以是任何FimH或其變體，包括FimH的任何構象或形式。FimH多肽的結構分析證明存在展示差異甘露糖結合親和力的不同構象狀態（例如Le Trong等人, 2010, Cell [細胞] 141: 645-655；Kalas等人, Sci Adv. [科學進展] 2017年2月10日; 3(2):e1601944, doi: 10.1126/sciadv.1601944. eCollection 2017年2月, PMID: 28246638；Choudhury等人, 1999, Science [科學] 285: 1061-1066）。在某些實施方式中，FimH採用緊湊構象，其中甘露糖結合結構域處於低親和力狀態，如藉由淺結合口袋表徵的。在另一個實施方式中，FimH多肽採用細長構象，其中甘露糖結合結構域呈高親和力構象，如藉由較窄的結合口袋表徵的。在某些實施方式中，FimH被截短並展示高親和力構象。在某些實施方式中，FimH與其分子伴侶FimC複合並表現出高親和力構象。定位至甘露糖結合結構域的某些胺基酸取代已經證明在不存在配位基的情況下影響截短的FimH的構象狀態（例如Kisiela等人, 2013, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊] 110: 19089-19094；Rabbani等人, 2018, J Biol Chem [生物化學雜誌] 293: 1835-1849）。在某些實施方式中，截短的FimH包含一個或多個胺基酸突變，該一個或多個胺基酸突變使其在低親和力構象中穩定，特別是在不存在配位基（甘露糖）的情況下。此類胺基酸突變的非限制性實例係位置60處的胺基酸取代，如位置60處的精胺酸至脯胺酸取代（R60P）。
在某些實施方式中，FimH係全長FimH。全長FimH（300個胺基酸）序列的一個實例提供於SEQ ID NO: 4中。其他非限制性實例提供於SEQ ID NO: 6（其與US 6,500,434的SEQ ID NO: 2相同）和SEQ ID NO: 10中。
在某些實施方式中，FimH包含成熟形式的FimH，其缺少全長FimH蛋白的N-末端的一部分（例如成熟FimH缺少N-末端信號序列）。在某些實施方式中，成熟FimH包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列（其與US 6,737,063的SEQ ID NO: 29相同）。另一個非限制性實例係SEQ ID NO: 11。
在某些實施方式中，FimH係截短形式的FimH，如FimHt或FimHLD
，其包含成熟FimH的N-末端胺基酸但缺少C-末端的一部分。在某些實施方式中，截短的FimH含有成熟FimH蛋白的胺基酸1-157、1-160、1-161、1-181、1-186、1-196、1-207或1-223，例如，如在SEQ ID NO: 7中所揭露的。在一個特定實施方式中，截短的FimH包含成熟FimH蛋白的N-末端186個胺基酸。在另一個特定實施方式中，截短的FimH包含成熟FimH蛋白的N-末端160個胺基酸。在某些實施方式中，截短的FimH包含SEQ ID NO: 7的胺基酸26至186。在一個實施方式中，截短的FimH包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。在另一個實施方式中，截短的FimH包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列。
熟練的技術人員能夠藉由從該等示例性FimH實施方式中的任一個中缺失、添加和/或取代胺基酸來製備適合的變體，並且此類變體也被認為係根據本發明的FimH蛋白。也可以使用天然FimH變體。
在某些實施方式中，藉由本領域中已知的方法來使FimH穩定。在特定實施方式中，FimH與其分子伴侶FimC複合，也稱為FimCH（例如Choudhury D等人, 1999, Science [科學] 285: 1061-1066）。在其他實施方式中，FimH係與FimH菌毛蛋白結構域（FimH-PD）組合的FimHLD
，其代表或實際上係成熟或全長FimH。在其他實施方式中，藉由FimG (DsG)的供體鏈肽（即，FimG殘基1-13或1-14）（參見例如，Barnhart MM等人, 2000,Proc Natl Acad Sci USA [ 美國國家科學院院刊 ],
97: 7709-7714；Sauer MM等人, 2016,Nat Commun [ 自然通訊 ]
, 7:10738）或全長FimG（例如Barnhart MM等人, 2003,J Bacteriol. [ 細菌學雜誌 ]
185: 2723-2730）的添加或融合來使FimH穩定。
FimCH和截短的FimH已經顯示能夠在臨床前模型中產生針對大腸桿菌UTI的抗體和有效免疫應答（例如Langermann S等人, 1997和2000, 同上；O’Brien VP等人, 同上）。事實上，紅杉科學公司報告，由FimH蛋白和佐劑組成的研究性疫苗具有高免疫原性和良好的耐受性，並且基於來自女性中1期臨床試驗的初步結果可以降低UTI的頻率（https://www.sequoiasciences.com/uti-vaccine-program）。
本發明組成物中的FimH可以從細菌菌毛中分離，該等細菌菌毛在它們的尖端天然地包含FimH。在某些實施方式中，FimH係化學合成的，或者在其他實施方式中，FimH係藉由體外
或離體
蛋白質生物合成而合成的。在較佳的實施方式中，FimH係例如根據本領域中已知的方法，在驅動FimH表現的啟動子控制下在已經用編碼FimH的核酸轉化的細菌細胞中重組表現的。例如，可以將編碼FimH或FimH的一部分的DNA選殖到表現載體中，並且在轉化適合的宿主細胞（如大腸桿菌）後，可以根據本領域中已知的標準方法從宿主細胞或培養基表現和純化FimH。FimH的重組表現的實例可以例如在WO 2002/004496和Rabbani S等人, 2010, Anal Biochem [分析生物化學] 407: 188-195中找到，其各自藉由引用結合在此。在某些實施方式中，FimH可以連接至例如用於純化或識別的多肽標籤，例如His-標籤。
在某些實施方式中，FimH以每次給藥（劑量）約1至約200 ug，例如每個劑量1-150 ug，例如每個劑量約1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150 ug給予至人。在某些實施方式中，本發明的組成物包含濃度為約2-400 ug/mL（例如用於給予0.5 mL的單劑量），例如約2-200 ug/mL，例如約2,5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 ug/mL的FimH。關於FimH的劑量，還參見例如，US20030138449。
佐劑
如在此所使用的，術語“佐劑”係指當與本發明組成物結合給予或作為本發明組成物的一部分給予時增加、增強和/或加強對包含與載體蛋白偶合的大腸桿菌O-抗原的軛合物和/或對FimH的免疫應答、但是當單獨給予佐劑化合物時不會產生對該軛合物和/或FimH的免疫應答的化合物。佐劑可以藉由若干機制增強免疫應答，該等機制包括例如淋巴細胞募集、B細胞和/或T細胞的刺激以及抗原呈遞細胞的刺激。
本發明的組成物（例如，免疫原性組成物）包含佐劑或與佐劑組合給予。用於與本發明組成物組合給予的佐劑可以在給予免疫原性組成物之前、同時或之後給予。
佐劑的具體實例包括但不限於鋁鹽（明礬）（如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁和氧化鋁，包括包含明礬的奈米顆粒或奈米明礬（nanoalum）配製物）、磷酸鈣（例如Masson JD等人, 2017, Expert Rev Vaccines [疫苗專家評論] 16: 289-299）、單磷醯基脂質A（MPL）或3-脫-O-醯化單磷醯基脂質A（3D-MPL）（參見例如，英國專利GB 2220211、EP 0971739、EP 1194166、US 6491919）、AS01、AS02、AS03和AS04（全部葛蘭素史克公司（GlaxoSmithKline）；對於AS04參見例如EP 1126876、US 7357936，對於AS02參見例如EP 0671948、EP 0761231、US 5750110）、咪唑并吡啶化合物（參見WO 2007/109812）、咪唑并喹㗁啉化合物（參見WO 2007/109813）、δ-菊糖（例如Petrovsky N和PD Cooper, 2015, Vaccine [疫苗] 33: 5920-5926）、STING活化合成環狀二核苷酸（例如US 20150056224）、卵磷脂與卡波姆均聚物的組合（例如US 6676958）和皂苷如Quil A和QS21（參見例如Zhu D和W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res [天然產物化學研究] 3: e113（doi:10.4172/2329-6836.1000e113），視需要與QS7組合（參見Kensil等人, 於Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach [疫苗設計：亞單位和佐劑方法]中（Powell和Newman編輯, Plenum Press [普萊紐姆出版社], 紐約, 1995）；US 5,057,540）。在一些實施方式中，佐劑係弗氏佐劑（完全或不完全）。在某些實施方式中，佐劑包含Quil-A，例如像可從邦泰公司（Brenntag）（現在禾大公司（Croda））或Invivogen公司商購獲得。QuilA含有來自皂樹Molina樹的皂苷的水可提取部分。該等皂苷屬於三萜皂苷的組，該等三萜皂苷具有共同的三萜主鏈結構。已知皂苷誘導對T依賴性抗原以及T非依賴性抗原的強佐劑應答，以及強細胞毒性CD8+淋巴細胞應答，並且增強對黏膜抗原的應答。它們還可以與膽固醇和磷脂組合，以形成免疫刺激複合物（ISCOM），其中QuilA佐劑可以活化對來自不同起源的廣泛抗原的抗體介導的免疫應答和細胞介導的免疫應答兩者。某些佐劑包含乳液，該等乳液係兩種不混溶流體（例如油和水）的混合物，其中一種作為小液滴懸浮在另一種內部，並且藉由表面活性劑穩定。水包油乳液具有形成連續相、圍繞小油滴的水，而油包水乳液具有形成連續相的油。某些乳液包含角鯊烯（可代謝的油）。某些佐劑包含嵌段共聚物，該等嵌段共聚物係當兩種單體聚集在一起並形成重複單元的嵌段時形成的共聚物。包含嵌段共聚物、角鯊烯和微粒穩定劑的油包水乳液的實例係TiterMax®，其可以從西格瑪-奧德里奇公司（Sigma-Aldrich）商購獲得。視需要，乳液可以與其他免疫刺激組分（如TLR4激動劑）組合或包含其他免疫刺激組分。某些佐劑係也用於MF59（參見例如EP0399843、US 6299884、US 6451325）和AS03中的水包油乳液（如角鯊烯或花生油），視需要與免疫刺激劑如單磷醯基脂質A和/或QS21組合（如在AS02中）（參見Stoute等人, 1997, N. Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 336, 86-91）。佐劑的其他實例係含有免疫刺激劑如MPL和QS21的脂質體，如在AS01E和AS01B中（例如US 2011/0206758）。佐劑的其他實例係CpG（Bioworld Today [今日生物世界]，1998年11月15日）和咪唑并喹啉（如咪喹莫特和R848）。參見例如，Reed G等人, 2013,Nature Med
[自然醫學], 19: 1597-1608。
在某些較佳的實施方式中，佐劑包含皂苷，較佳的是從皂樹獲得的皂苷的水可提取部分。在某些實施方式中，佐劑包含QS-21。
在某些較佳的實施方式中，佐劑含有toll樣受體4（TLR4）激動劑。TLR4激動劑係本領域中熟知的，參見例如Ireton GC和SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines [疫苗專家評論] 12: 793-807。在某些較佳的實施方式中，佐劑係包含脂質A或其類似物或衍生物的TLR4激動劑。
佐劑（較佳的是包含TLR4激動劑）可以按各種方式配製在例如乳液如油包水（w/o）乳液或水包油（o/w）乳液（實例係MF59、AS03）、穩定（奈米）乳液（SE）、脂質懸浮液、脂質體、（聚合物）奈米顆粒、病毒顆粒、明礬吸附的水性製劑（AF）等中，代表用於佐劑中的免疫調節分子和/或用於免疫原的各種遞送系統（參見例如Reed等人, 2013, 同上；Alving CR等人, 2012, Curr Opin Immunol [免疫學當前觀點] 24: 310-315）。
免疫刺激性TLR4激動劑可以視需要與其他免疫調節組分組合，該等免疫調節組分如皂苷（例如QuilA、QS7、QS21、基質M、Iscoms、Iscomatrix等）、鋁鹽、其他TLR的活化劑（例如咪唑并喹啉、鞭毛蛋白、CpG、dsRNA類似物等）以及類似物質（參見例如Reed等人, 2013, 同上）。
如在此所使用的，術語“脂質A”係指LPS分子的疏水性脂質部分，該疏水性脂質部分包含葡糖胺並且藉由酮苷鍵連接至LPS分子的內核中的酮基-去氧辛酮糖酸，其將LPS分子錨定在革蘭氏陰性細菌外膜的外葉中。關於LPS和脂質A結構的合成的概述，參見例如，Raetz, 1993, J. Bacteriology [細菌學雜誌] 175:5745-5753；Raetz CR和C Whitfield, 2002, Annu Rev Biochem [生物化學年評] 71: 635-700；US 5,593,969和US 5,191,072。如在此所用的脂質A包括天然存在的脂質A、其混合物、類似物、衍生物和先質。該術語包括單糖，例如脂質A的先質，稱為脂質X；二糖脂質A；七醯基脂質A；六醯基脂質A；五醯基脂質A；四醯基脂質A，例如脂質A的四醯基先質，稱為脂質IVA；去磷酸化脂質A；單磷醯基脂質A；二磷醯基脂質A，如來自大腸桿菌和類球紅細菌的脂質A。若干免疫活化脂質A結構含有6個醯基鏈。直接附接至葡糖胺糖的四個一級醯基鏈係通常長度在10與16個碳之間的3-羥基醯基鏈。兩個另外的醯基鏈通常附接至一級醯基鏈的3-羥基基團。作為一個實例，大腸桿菌脂質A典型地具有附接至糖的四個C14 3-羥基醯基鏈，以及分別在2’和3’位置連接至一級醯基鏈的3-羥基基團的一個C12和一個C14。
如在此所使用的，術語“脂質A類似物或衍生物”係指類似於脂質A的結構和免疫活性、但不一定天然存在於自然界中的分子。脂質A類似物或衍生物可以修飾成例如縮短或縮合，和/或使其葡糖胺殘基被另一個胺糖殘基（例如半乳糖胺殘基）取代，以在還原端含有2-去氧-2-胺基葡糖酸代替葡糖胺-1-磷酸，在位置4’帶有半乳糖醛酸部分而不是磷酸。脂質A類似物或衍生物可以從分離自細菌的脂質A製備，例如藉由化學衍生；或化學合成，例如藉由首先確定較佳的脂質A的結構並且合成其類似物或衍生物。脂質A類似物或衍生物也可用作TLR4激動劑佐劑（參見，例如Gregg KA等人, 2017, MBio [分子生物學] 8, eDD492-17, doi: 10.1128/mBio.00492-17）。
例如，脂質A類似物或衍生物可以藉由野生型脂質A分子的脫醯化，例如藉由鹼處理而獲得。脂質A類似物或衍生物可以例如由分離自細菌的脂質A製備。此類分子也可以化學合成。脂質A類似物或衍生物的另一個實例係從細菌細胞分離的脂質A分子，該等細菌細胞具有參與脂質A生物合成和/或脂質A修飾的酶中的突變或缺失或插入。
MPL和3D-MPL係經修飾以減弱脂質A毒性的脂質A類似物或衍生物。脂質A、MPL和3D-MPL具有糖主鏈，長脂肪酸鏈附接到該主鏈上，其中該主鏈含有糖苷鍵聯中的兩個6-碳糖以及4位置處的磷醯基部分。典型地，五至八個長鏈脂肪酸（通常12-14個碳原子）附接至糖主鏈。由於天然來源的衍生，MPL或3D-MPL可以作為多種脂肪酸取代模式（例如七醯基、六醯基、五醯基等）的複合物或混合物存在，具有不同的脂肪酸長度。對於在此描述的一些其他脂質A類似物或衍生物也是如此，然而合成脂質A變體也可以是限定的和均勻的。MPL及其製造例如在US 4,436,727中進行了描述。3D-MPL例如在US 4,912,094 B1中進行了描述，並且與MPL的不同之處在於選擇性除去與位置3處的還原端葡糖胺酯連接的3-羥基肉豆蔻酸醯基殘基（比較例如US 4,912,094 B1的第1列中的MPL對比第6列中的3D-MPL的結構）。在本領域中，通常使用3D-MPL，但是有時稱為MPL（例如，Ireton GC和SGReed，2013，同上的表1中的第一結構，這種結構被稱為MPL®，但實際上描繪了3D-MPL的結構）。
根據本發明的脂質A（類似物、衍生物）的實例包括MPL、3D-MPL、RC529（例如EP1385541）、PET-脂質A、GLA（哌喃糖基脂質佐劑，一種合成二糖糖脂；例如US 20100310602、US 8722064）、SLA（例如Carter D等人, 2016, Clin Transl Immunology [臨床與轉化免疫學] 5: e108（doi: 10.1038/cti.2016.63），其描述了用於優化人疫苗的TLR4配位基的結構-功能方法）、PHAD（磷酸化的六醯基二糖；其結構與GLA的結構相同）、3D-PHAD、3D-(6-醯基)-PHAD（3D(6A)-PHAD）（PHAD、3D-PHAD和3D(6A)PHAD係合成脂質A變體，參見例如avantilipids.com/divisions/adjuvants，其還提供該等分子的結構）、E6020（CAS編號287180-63-6）、ONO4007、OM-174等。關於3D-MPL、RC529、PET-脂質A、GLA/PHAD、E6020、ONO4007和OM-174的示例性化學結構，參見例如Ireton GC和SG Reed，2013，同上中的表1。關於SLA的結構，參見例如Reed SG等人, 2016, Curr Opin Immunol [免疫學當前觀點] 41: 85-90中的圖1。在某些較佳的實施方式中，TLR4激動劑佐劑包含選自3D-MPL、GLA或SLA的脂質A類似物或衍生物。
包含脂質A類似物或衍生物的示例性佐劑包括GLA-LSQ（合成MPL [GLA]、QS21、脂質，配製為脂質體）、SLA-LSQ（合成MPL [SLA]、QS21、脂質，配製為脂質體）、GLA-SE（合成MPL [GLA]，角鯊烯油/水乳液）、SLA-SE（合成MPL [SLA]，角鯊烯油/水乳液）、SLA-奈米明礬（合成MPL [SLA]，鋁鹽）、GLA-奈米明礬（合成MPL [GLA]，鋁鹽）、SLA-AF（合成MPL [SLA]，水性懸浮液）、GLA-AF（合成MPL [GLA]，水性懸浮液）、SLA-明礬（合成MPL [SLA]，鋁鹽）、GLA-明礬（合成MPL [GLA]，鋁鹽）以及GSK ASxx系列佐劑中的幾種，包括AS01（MPL、QS21，脂質體）、AS02（MPL、QS21，油/水乳液）、AS25（MPL，油/水乳液）、AS04（MPL，鋁鹽）和AS15（MPL、QS21、CpG，脂質體）。參見例如，WO 2013/119856、WO 2006/116423、US 4,987,237、U.S. 4,436,727、US 4,877,611、US 4,866,034、US 4,912,094、US 4,987,237、US 5191072、US 5593969、US 6,759,241、US 9,017,698、US 9,149,521、US 9,149,522、US 9,415,097、US 9,415,101、US 9,504,743；Reed G, 等人, 2013, 同上；Johnson等人, 1999,J Med Chem [ 藥物化學雜誌 ]
, 42:4640-4649；以及Ulrich和Myers, 1995,Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach [ 疫苗設計：亞單位和佐劑方法 ]
; Powell和Newman, 編輯; Plenum [普萊紐姆出版社]: 紐約, 495-524。
非糖脂分子也可以用作TLR4激動劑佐劑，例如合成分子如新賽普酊（Neoseptin）-3或天然分子如LeIF，參見例如Reed SG等人，2016，同上。
賦形劑和載體
本發明的組成物可用於治療和預防受試者（例如，人受試者）中由大腸桿菌引起的UTI和/或IAI。在某些實施方式中，除了包含一種或多種與載體蛋白共價結合的大腸桿菌O-抗原、FimH和佐劑外，本發明的組成物還包含藥學上可接受的載體。鹽水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可以用作液體載體，特別是對於可注射溶液而言。適合的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。適合的藥物載體的實例描述於“Remington’s pharmaceutical sciences [雷明頓藥物科學],” 第XIII版.總編輯Eric W. Martin. Mack Publishing Co. [麥克出版公司], Easton [伊斯頓], Pa. [賓夕法尼亞州], 1965中。
在某些實施方式中，本發明的組成物另外包含一種或多種緩衝液，例如Tris緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝液和蔗糖磷酸鹽麩胺酸鹽緩衝液。
在某些實施方式中，本發明的組成物另外包含一種或多種鹽，例如Tris-鹽酸鹽、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、磷酸鈉、麩胺酸一鈉和鋁鹽（例如，氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁鉀、或此類鋁鹽的混合物）。在一個實施方式中，本發明的組成物包含Tris緩衝鹽水（TBS）pH 7.4（例如含有例如分別25 mM、137 mM和2.7 mM的Tris、NaCl和KCl）中的本發明的生物軛合物。在其他實施方式中，本發明的組成物包含約10 mM KH2
PO4
/Na2
HPO4
緩衝液（pH為約7.0）、約5%（w/v）山梨糖醇、約10 mM甲硫胺酸以及約0.02%（w/v）聚山梨醇酯80中的本發明的生物軛合物。在其他實施方式中，本發明的組成物包含約10 mM KH2
PO4
/Na2
HPO4
緩衝液（pH為約7.0）、約8%（w/v）蔗糖、約1 mM EDTA以及約0.02%（w/v）聚山梨醇酯80中的本發明的生物軛合物。
本發明的組成物可以用於在向其給予該組成物的宿主中引發免疫應答，即具有免疫原性。因此，本發明的組成物可以用作針對UTI和/或IAI的疫苗，並且可以包含適用於疫苗中的任何另外組分。
在某些實施方式中，本發明的組成物另外包含防腐劑，如苯酚、氯化本索寧、2-苯氧基乙醇或硫柳汞。在一個具體實施方式中，本發明的藥物組成物包含0.001%至0.01%的防腐劑。在其他實施方式中，本發明的藥物組成物不包含防腐劑。
疫苗組合
/
組成物
在一個具體實施方式中，本發明的疫苗組合含有多價配製物，例如，至少四價（相對於O-抗原血清型）配製物，該等配製物包含在同一或不同組成物中的O25B、O1A、O6A和O2血清型/亞血清型的大腸桿菌O-抗原的生物軛合物、FimH和佐劑。
本發明涉及一種疫苗組合，較佳的是多價疫苗，該疫苗組合包含 (i) FimH多肽；(ii) 一種或多種軛合物，該一種或多種軛合物包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖；以及 (iii) 佐劑。在一個實施方式中，該疫苗組合包含第一組成物，該第一組成物包含 (i)；第二組成物，該第二組成物包含 (ii)；以及第三組成物，該第三組成物包含 (iii)，即該組合的組分 (i)-(iii) 中的每種存在於單獨組成物中。在另一個實施方式中，該疫苗組合包含第一組成物，該第一組成物包含 (i) 和 (ii)；以及第二組成物，該第二組成物包含 (iii)。在另一個實施方式中，該疫苗組合包含第一組成物，該第一組成物包含 (i) 和 (iii)；以及第二組成物，該第二組成物包含 (ii)。在另一個實施方式中，該疫苗組合包含第一組成物，該第一組成物包含 (i)；以及第二組成物，該第二組成物包含 (ii) 和 (iii)。在一個較佳的實施方式中，該疫苗組合包含組成物，該組成物包含 (i)、(ii) 和 (iii)。這種實施方式較佳的是包含穩定的組成物，該組成物包含 (i)、(ii) 和 (iii)，但是可替代地，如果這種組成物在較長時期內將不穩定，則可以藉由就在混合並注射免疫程序中給予至受試者之前混合該等組分來產生這種組成物。該等組成物可以進一步包含藥學上可接受的載體。如果組分 (i)、(ii) 和 (iii) 不存在於單一組成物中，則它們可以組合給予至受試者。當該組合中存在多於一種軛合物時，該等軛合物較佳的是存在於單一組成物中。
在一個具體實施方式中，在此提供的疫苗組合含有組成物，該組成物包含：(a) FimH，(b，i) 大腸桿菌O25B生物軛合物，該生物軛合物包含與EPA載體蛋白共價結合的大腸桿菌O25B抗原；(b，ii) 大腸桿菌O1A生物軛合物，該生物軛合物包含與EPA載體蛋白共價結合的大腸桿菌O1A抗原；(b，iii) 大腸桿菌O2生物軛合物，該生物軛合物包含與EPA載體蛋白共價結合的大腸桿菌O2抗原；和 (b，iv) 大腸桿菌O6A生物軛合物，該生物軛合物包含與EPA載體蛋白共價結合的大腸桿菌O6A抗原，以及 (c) 佐劑。再次，這種組成物可以在製造過程中預先配製，其中所有組分都存在於單一組成物中，或者可替代地，這種組成物可以藉由就在使用之前混合包含該等組分中的一種或多種的組成物來製備。
在某些實施方式中，本發明的組成物被配製成適合於給予至受試者的預期途徑。例如，本發明的組成物可以被配製成適合於皮下、胃腸外、口服、皮內、經皮、結腸直腸、腹膜內、陰道內或直腸給予。在一個具體實施方式中，該藥物組成物可以被配製用於靜脈內、口服、經頰、腹膜內、鼻內、氣管內、皮下、肌肉內、局部、皮內、經皮或肺部給予，較佳的是肌肉內給予。
本發明的組成物可以與用於給藥的說明書一起包括在容器、包裝、或分配器中。
在某些實施方式中，本發明的組成物可以在使用之前儲存，例如，該等組成物可以冷凍儲存（例如，在約-20°C或在約-70°C）；儲存在冷藏條件下（例如，在約2°C-8°C，例如約4°C）；或儲存在室溫下。可替代地，包含組分 (i)、(ii) 和 (iii) 中的一種或多種的單獨組成物可以儲存並且在使用之前混合成包含 (i)、(ii) 和 (iii) 中的所有三者的疫苗組合組成物。在又一個替代方案中，該等單獨組成物以組合給藥方案提供。
方法和用途
方法和用途
在另一個總體方面中，本發明涉及一種在有需要的受試者中誘導對大腸桿菌的免疫應答的方法。較佳的是，該免疫應答可有效預防或治療有需要的受試者中與UTI或IAI相關的一種或多種症狀。該方法包括向該受試者給予一種或多種包含與一種或多種載體蛋白共價偶合的一種或多種大腸桿菌O-抗原的軛合物、FimH多肽和佐劑。該軛合物、FimH和佐劑及其方面如上所述。
較佳的是，用於本發明的方法和用途中的至少一種大腸桿菌O-抗原在引起UTI或IAI的大腸桿菌臨床分離株中係普遍的，如上所述，如大腸桿菌O25B抗原。
包含O-抗原的軛合物能夠在有需要的受試者中誘導針對大腸桿菌的調理吞噬抗體的產生，參見例如WO 2015/124769和WO 2017/035181。
在一個具體實施方式中，在本發明的受試者中誘導免疫應答的方法產生該受試者的疫苗接種以誘導針對大腸桿菌菌株感染的保護性免疫，該等大腸桿菌菌株的O-抗原存在於該一種或多種組成物中。當使用O-抗原亞型時，本發明的方法還可以誘導對具有相似抗原性的另一種O-抗原亞型的免疫應答。
在一個具體實施方式中，由本發明的方法或組成物誘導的免疫應答可有效預防由O25血清型（例如O25B和/或O25A）和以下大腸桿菌血清型：O1（例如，O1A、O1B和/或O1C）、O2和/或O6（例如，O6A和/或O6GlcNAc）的大腸桿菌引起的至少UTI或IAI和/或降低其發病率。
為了使受試者針對UTI或IAI免疫或治療患有UTI或IAI的受試者，可以向該受試者給予本發明的單一組成物，其中該組成物包含各自與載體蛋白如EPA共價結合的至少一種大腸桿菌O-抗原，和視需要的一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種或更多種另外的大腸桿菌O-抗原；和FimH多肽以及佐劑。可替代地，為了治療患有UTI或IAI的受試者或使受試者針對UTI或IAI免疫，可以向該受試者一起組合給予本發明的多種組成物，該等多種組成物包含一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的一種或多種大腸桿菌O-抗原的軛合物、FimH多肽和佐劑。例如，可以向該受試者給予包含FimH和與載體蛋白共軛的大腸桿菌O-抗原的組成物，與給予包含佐劑的組成物組合。在向受試者組合給予本發明的多種組成物的實施方式中，較佳的是在允許將該等疫苗組合組分引流至同一淋巴結的時間範圍內和位置處給予多種組成物，例如藉由在同一肢體中在短距離內（例如在彼此30 cm、20 cm內、10 cm內、5 cm內、2 cm內）並且在彼此幾天內（例如在72小時、48小時、24小時、8小時、2小時、1小時內）給予該等組成物。最實際的是例如在一個療程中，例如在30分鐘內、10分鐘內、較佳的是5分鐘內、2分鐘內藉由肌肉內注射給予，較佳的是基本上同時共同給予。
在某些實施方式中，在給予本發明的組成物後在受試者中誘導的免疫應答可有效消除UTI或IAI。
在某些實施方式中，在給予本發明的組成物後在受試者中誘導的免疫應答可較佳的是在至少30%、更較佳的是至少40%、如至少50%的給予該組成物的受試者中有效預防UTI或IAI或減輕它們的症狀。UTI的症狀可以根據感染的性質而變化，並且可以包括但不限於：排尿困難、增加的尿頻或尿急、膿尿、血尿、背痛、骨盆疼痛、排尿時疼痛、發熱、寒戰和/或噁心。IAI的症狀可以根據感染的性質而變化，並且可以包括但不限於：發熱、心動過速、呼吸急促、低血壓、腹痛、厭食、噁心和嘔吐、腹瀉、腹部飽脹感、腫脹、頑固性便秘、休克、酸中毒和腹外器官衰竭。
在某些實施方式中，在給予本發明的組成物後在受試者中誘導的免疫應答可有效預防或減輕由UTI或IAI引起的器官衰竭。在某些實施方式中，在給予本發明的組成物後在受試者中誘導的免疫應答可有效降低患有UTI或IAI的受試者住院的可能性。在一些實施方式中，在給予本發明的組成物後在受試者中誘導的免疫應答可有效降低患有UTI或IAI的受試者住院的持續時間。
組合療法
在某些實施方式中，本發明的組成物與一種或多種其他療法（例如，抗細菌療法或免疫調節療法）組合給予至受試者。該一種或多種其他療法可以有益於治療或預防UTI或IAI，或者可以改善與UTI或IAI相關的症狀或病狀。在一些實施方式中，該一種或多種其他療法包括給予可用於治療UTI或IAI的抗生素。在一些實施方式中，該一種或多種其他療法係止痛藥或退燒藥物。在某些實施方式中，相隔少於5分鐘至相隔少於1周給予該等療法。熟悉該項技術者已知的任何抗菌劑（例如抗生素）可以與本發明的組成物組合使用。
在某些實施方式中，在給予本發明的組成物後在受試者中誘導的免疫應答可有效增強或改善另一種療法的預防或治療作用。
給藥劑量和頻率
本發明組成物的給予可以經由臨床醫生已知的各種途徑進行，例如皮下、胃腸外、靜脈內、肌肉內、局部、口服、皮內、經皮，鼻內等。在一個實施方式中，給予係經由肌肉內注射。
如在此在使用根據本發明實施方式的方法向受試者給予O-抗原或FimH的背景下所使用的，術語“有效量”係指足以在該受試者中誘導所希望的免疫作用或免疫應答的O-抗原或FimH的量。在某些實施方式中，“有效量”係指足以在受試者中產生免疫力以在該受試者中實現一種或多種以下作用的O-抗原和FimH的量：(i) 預防UTI或IAI或與其相關的症狀的發展或發作；(ii) 預防或減少UTI或IAI或與其相關的症狀的復發；(iii) 預防UTI或IAI或與其相關的症狀、降低或改善其嚴重性；(iv) 減少感染UTI或IAI或與其相關的症狀的持續時間；(v) 預防UTI或IAI或與其相關的症狀的臨床進展；(vi) 引起UTI或IAI或與其相關的症狀的消退；(vii) 預防或減輕由UTI或IAI引起的器官衰竭；(viii) 降低患有UTI或IAI的受試者住院的可能性或頻率；(ix) 減少患有UTI或IAI的受試者的住院時間；(x) 消除UTI或IAI；和/或 (xi) 增強或改善另一種療法的預防或治療作用。
基於若干因素的考慮，包括待治療或預防的疾病、所涉及的症狀、受試者的病史、受試者的身體狀況（如受試者的年齡、體重和/或免疫狀態）、所給予的組成物（如靶O-抗原、FimH多肽、佐劑等)、以及熟練的技術人員已知的其他因素，熟悉該項技術者可以確定（例如，經由臨床試驗）特定有效劑量的選擇。配製物中採用的精確劑量還將取決於給藥途徑（如口服或胃腸外）和疾病的嚴重性，並且應當根據執業醫師的判斷和每一患者的情況來決定。可以從來源於體外或動物模型測試系統的劑量-反應曲線外推出有效劑量。上文提供了疫苗組成物的O-抗原軛合物和FimH組分的可能劑量範圍的指導。
在本發明的某些實施方式中，向有需要的受試者給予0.5 mL的根據本發明的組成物。
在某些實施方式中，對於每次給予至人受試者的示例性劑量對應於0.5 mL的組成物，該組成物含有約1-50 ug/mL、例如約8-48 ug/mL、例如約8、12、16、20、24、28、32、36、40、44或48 ug/mL的第一濃度的與EPA載體蛋白共價結合的大腸桿菌O25B抗原，對於與EPA載體蛋白共價結合的一種或多種另外的大腸桿菌O-抗原中的每一種，濃度為該第一濃度的20%至200%；以及約1-200 ug/mL、例如約1-100 ug/mL、例如約1、2、4、8、12、16、20、30、40、50、60、70、80、90或100 ug/mL濃度的FimH。在某些實施方式中，佐劑含有TLR4激動劑，例如MPL、3D-MPL、RC529、GLA、SLA、E6020、PET-脂質A、PHAD、3D-PHAD、3D-(6-醯基)-PHAD、ONO4007、OM-174等，該等中的任一種視需要配製在水包油（AS02樣）中或脂質體（AS01樣）中，有或沒有皂苷QS21。TLR4激動劑佐劑組分的最佳劑量可以由技術人員根據對從業者來說常規的熟知方法確定，並且在示例性實施方式中可以是例如每次給予0.1與1000之間、典型地1與100之間、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100 ug的TLR4激動劑組分。
在某些實施方式中，組成物或作為本發明的單獨組成物的其成分的疫苗組合作為單劑量給予至受試者一次。在某些實施方式中，本發明的組成物或作為單獨組成物的其成分的疫苗組合作為單劑量給予至受試者，隨後在3至8周後給予第二劑量。根據某些實施方式，可以視需要在第一次或第二次接種後以6至24個月的間隔向受試者給予加強接種。在某些實施方式中，加強接種可以使用不同的大腸桿菌O-抗原、生物軛合物、FimH多肽、佐劑或組成物。在某些實施方式中，本發明的組成物作為單劑量每n年一次給予至受試者，n係例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20。
患者群體
在某些實施方式中，將本發明的組成物或方法給予或應用於初次接受實驗的（naïve）受試者，即不具有大腸桿菌感染或之前未患UTI或IAI的受試者。在一個實施方式中，在症狀出現或症狀變得嚴重之前，將本發明的組成物或方法給予或應用於處於獲得或發展UTI或IAI的風險的受試者，例如免疫受損或免疫缺陷的個體。在某些實施方式中，將本發明的組成物或方法給予或應用於已經被診斷或先前被診斷患有UTI或IAI的受試者。
如在此所使用的，術語“處於風險的人”係指比平均成年人群體更易患病狀的人。“處於風險的人”的實例包括具有一種或多種UTI風險因素的人，該等人可以包括但不限於老年人、免疫受損的人、患有糖尿病的人、具有已知rUTI病史的人、在尿路中具有障礙物（如腎結石）的人、性活躍女性、絕經後女性、使用導管的人、失禁的人、最近經歷泌尿系統手術（如關於尿路的外科手術）的人等。
在某些實施方式中，將本發明的組成物或方法給予或應用於已經被診斷或先前被診斷患有UPEC感染的受試者。在一些實施方式中，將本發明的組成物或方法給予或應用於患有復發性UTI的受試者。在一些實施方式中，將本發明的組成物或方法給予或應用於患有復發性UTI、但在治療時健康的受試者。在一些實施方式中，將本發明的組成物或方法給予或應用於患有大腸桿菌菌血症或敗血症或處於獲得大腸桿菌菌血症或敗血症的風險的受試者。在一些實施方式中，待給予或應用本發明的組成物或方法的受試者患有需要他們使用導管，如導尿管的病狀（其導致CAUTI的風險，即導管相關的UTI）。在一些實施方式中，將本發明的組成物或方法給予或應用於經歷預先安排的手術的受試者。類似地，患有IAI如IBD或克羅恩氏病的患者可以用本發明的組成物或方法進行治療。
在一些實施方式中，待給予或應用本發明的組成物或方法的受試者係動物。在某些實施方式中，該動物係哺乳動物，例如馬、豬、兔、小鼠或靈長類動物。在一個較佳的實施方式中，受試者係人。
在一些實施方式中，待給予或應用本發明的組成物或方法的受試者係動物。在某些實施方式中，該動物係哺乳動物，例如馬、豬、兔、小鼠或靈長類動物。在一個較佳的實施方式中，受試者係人。
在某些實施方式中，待給予或應用本發明的組成物或方法的受試者係人受試者，較佳的是，處於患有疾病UTI或IAI的風險的人受試者。
在某些實施方式中，待給予或應用本發明的組成物或方法的受試者係超過50歲的成年人。在某些實施方式中，待給予或應用本發明的組成物或方法的受試者係超過55歲、超過60歲或超過65歲的成年人。
在某些實施方式中，待給予或應用本發明的組成物或方法的受試者係年齡在約16至50歲之間、例如年齡在約16歲與35歲之間的女性。
在某些實施方式中，待給予或應用本發明的組成物或方法的受試者患有糖尿病。
測定
測定
本發明的組成物在受試者中產生免疫應答的能力可以使用熟悉該項技術者已知的任何方法鑒於本揭露內容來評估，並且例如在WO 2015/124769和WO 2017/035181中進行了描述。
用於測試本發明的組成物預防UTI的功效的動物模型已經例如在Langermann S等人，1997和2000，同上和O’Brien VP等人，2016，同上中進行了描述，該等文獻的揭露內容藉由引用結合在此。
套組
套組
在此提供了包裝或套組，該包裝或套組包括一個或多個填充有本發明組成物的一種或多種成分的容器，如根據本發明實施方式的一種或多種大腸桿菌O-抗原和/或與載體蛋白共價結合的大腸桿菌O-抗原的軛合物、或FimH多肽、或佐劑。視需要，與這樣一個或多個容器相關聯的可以是由管理藥物或生物製品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的公告或說明書，該公告反映針對人類給予的機構對製造、使用或銷售的許可。在此涵蓋的套組可以用於受試者的上述治療和免疫方法中。
實施方式
實施方式
本發明還提供了以下非限制性實施方式。
實施方式1係一種疫苗組合，該疫苗組合包含FimH多肽、一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物、和佐劑。
實施方式2係實施方式1的疫苗組合，其中該一種或多種軛合物包含大腸桿菌O25B抗原多糖。
實施方式3係實施方式2的疫苗組合，其中該一種或多種軛合物進一步包含大腸桿菌O1A抗原多糖、大腸桿菌O2抗原多糖和大腸桿菌O6A抗原多糖。
實施方式4係實施方式2或3中任一項之疫苗組合，其中該一種或多種軛合物進一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種其他大腸桿菌抗原多糖。
實施方式5係實施方式4的疫苗組合，其中這1至16種其他大腸桿菌抗原多糖包括O4、O7、O9、O11、O12、O22、O75、O8、O15、O16或O18中的一種或多種。
實施方式6係實施方式1-5中任一項之疫苗組合，其中該一種或多種軛合物係生物軛合物。
實施方式7係實施方式3-6中任一項之疫苗組合，其中該等其他大腸桿菌多糖中的每種的量係大腸桿菌O25抗原多糖的量的20%-100%。
實施方式8係實施方式2至7中任一項的疫苗組合，該疫苗組合包含1-50 ug/mL的該等O抗原多糖中的每種。
實施方式9係實施方式1至8中任一項之疫苗組合，其中該載體蛋白係去毒的銅綠假單胞菌外毒素A（EPA）。
實施方式10係實施方式9的疫苗組合，其中該大腸桿菌O-抗原多糖連接至EPA中的Asn-X-Ser(Thr)（SEQ ID NO: 3）、較佳的是Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)（SEQ ID NO: 2）的Asn殘基，其中X和Z獨立地選自除Pro之外的任何天然胺基酸。
實施方式11係實施方式9或10的疫苗組合，其中該EPA具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
實施方式12係實施方式1至11中任一項之疫苗組合，其中該FimH多肽包含截短形式的FimH。
實施方式13係實施方式1至11中任一項之疫苗組合，其中該FimH多肽包含FimCH。
實施方式14係實施方式1至11中任一項之疫苗組合，其中FimH係成熟FimH多肽。
實施方式15係實施方式14的疫苗組合，其中該成熟FimH多肽藉由FimG或藉由FimG (DsG) 的供體鏈肽穩定。
實施方式16係實施方式15的疫苗組合，其中FimG (DsG) 的供體鏈肽經由柔性接頭與成熟FimH融合。
實施方式17係實施方式1-16中任一項的疫苗組合，該疫苗組合包含約2-200 ug/mL的FimH多肽。
實施方式18係實施方式1-12中任一項之疫苗組合，其中該FimH多肽包含SEQ ID NO: 7的胺基酸1-157、1-160、1-161、1-181、1-186、26-186、1-196、1-207或1-223。
實施方式19係實施方式1至18中任一項之疫苗組合，其中該佐劑包含TLR4激動劑。
實施方式20係實施方式19的疫苗組合，其中該佐劑包含水包油乳液和TLR4激動劑。
實施方式21係實施方式19的疫苗組合，其中該佐劑包含具有QS21和TLR4激動劑的脂質體。
實施方式22係實施方式19至21中任一項之疫苗組合，其中該TLR4激動劑係脂質A類似物或衍生物。
實施方式23係實施方式22的疫苗組合，其中該TLR4激動劑包括MPL、3D-MPL、RC529、GLA、SLA、E6020、PET-脂質A、PHAD、3D-PHAD、3D-(6-醯基)-PHAD、ONO4007或OM-174中的一種或多種。
實施方式24係實施方式1至23中任一項之疫苗組合，其中該FimH多肽存在於第一組成物中，該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物存在於第二組成物中，並且該佐劑存在於第三組成物中，較佳的是，該第一組成物、第二組成物和第三組成物在給予前不久組合。
實施方式25係實施方式1至23中任一項之疫苗組合，其中該FimH多肽和該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物存在於第一組成物中，該佐劑存在於第二組成物中，較佳的是，該第一組成物和第二組成物在給予前不久組合。
實施方式26係實施方式1至23中任一項之疫苗組合，其中該FimH多肽和該佐劑存在於第一組成物中，該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物存在於第二組成物中，較佳的是，該第一組成物和第二組成物在給予前不久組合。
實施方式27係實施方式1至23中任一項之疫苗組合，其中該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物和該佐劑存在於第一組成物中，該FimH多肽存在於第二組成物中，較佳的是，該第一組成物和第二組成物在給予前不久組合。
實施方式28係實施方式1至23中任一項之疫苗組合，其中該FimH多肽、該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物和該佐劑存在於單一組成物中。
實施方式29係一種用於在有需要的受試者中誘導針對由大腸桿菌引起的尿路感染或腹內感染的免疫應答之方法，該方法包括向該受試者給予實施方式1至28中任一項的疫苗組合。
實施方式30係實施方式29之方法，其中該受試者係約16與約50歲之間、例如約16與約35歲之間的人類女性。
實施方式31係實施方式29之方法，其中該受試者係超過50歲、或超過55歲、或超過60歲、或超過65歲的成年人。
實施方式32係實施方式29之方法，其中該受試者係患有復發性UTI和/或復發性腹內感染的人受試者。
實施方式33係實施方式29之方法，其中該受試者係患有大腸桿菌菌血症或敗血症或處於獲得大腸桿菌菌血症或敗血症的風險的人受試者。
實施方式34係實施方式29之方法，其中該受試者係患有需要導管使用的病狀的人受試者。
實施方式35係實施方式29之方法，其中該受試者係經歷預先安排的手術的人受試者。
實施方式36係實施方式29之方法，其中該受試者係患有糖尿病的人受試者。
實施方式37係實施方式29至36中任一項之方法，其中該方法預防尿路感染或減輕尿路感染的症狀。
實施方式38係一種用於在有需要的受試者中誘導針對由大腸桿菌引起的腹內感染的免疫應答之方法，該方法包括向該受試者給予實施方式1至28中任一項的疫苗組合。
實施方式39係實施方式38之方法，其中該腹內感染係炎症性腸病或克羅恩氏病。
實施方式40係實施方式38或39之方法，其中該方法預防腹內感染或減輕腹內感染的症狀。
實施方式41係實施方式1至28中任一項的疫苗組合在製造用於在有需要的受試者中誘導對腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）的免疫應答的藥物中之用途。
實施方式42係實施方式1至28中任一項的疫苗組合在有需要的受試者中用於預防尿路感染（UTI）、或用於降低患有UTI的可能性、或用於降低與UTI相關的一種或多種症狀的嚴重性之用途。
實施方式43係實施方式1至28中任一項的疫苗組合在有需要的受試者中用於預防腹內感染（IAI）、或用於降低患有IAI的可能性、或用於降低與IAI相關的一種或多種症狀的嚴重性之用途。
實施方式44係一種用於製備實施方式1至23或28中任一項的疫苗組合之方法，該方法包括將該FimH多肽、該一種或多種包含與載體蛋白共價偶合的大腸桿菌O-抗原多糖的軛合物和該佐劑組合，以獲得該疫苗組合。
實施方式45係實施方式1-12中任一項之疫苗組合，其中該FimH多肽包含SEQ ID NO: 9。
實施方式46係實施方式1-12中任一項之疫苗組合，其中該FimH多肽包含位置60處的精胺酸至脯胺酸的突變，其中胺基酸與SEQ ID NO: 9一致編號。
實施方式47係實施方式29之方法，其中該疫苗組合藉由多種組成物在允許將該等疫苗組合組分引流至同一淋巴結的時間範圍內和位置處給予至受試者。
實例
實例
本發明的以下實例係為了進一步說明本發明的性質。應當理解，以下實例不限制本發明，並且本發明的範圍由所附申請專利範圍確定。
實例 1 ：組成物組分
實例 1 ：組成物組分
抗原生物軛合物
分別含有與EPA蛋白載體的糖基化位點共價連接的大腸桿菌O1A、O2、O6A和O25B的O1A-EPA，O2-EPA，O6A-EPA和O25B-EPA生物軛合物可以如例如Ihssen等人，2010，同上和WO 2006/119987、WO 2009/104074、並且特別是WO 2015/124769和WO 2017/035181（該等參考文獻的揭露內容藉由引用結合在此）中所描述來生產、純化和表徵。使用重組大腸桿菌細胞和蛋白載體（EPA）合成該等生物軛合物，該等重組大腸桿菌細胞在寡糖基轉移酶PglB存在下表現不同O-血清型的多糖合成酶。在這種方法中，糖軛合物疫苗可以在大腸桿菌的周質中表現，藉由生物化學過程提取並純化（例如WO 2017/035181的圖1和圖2中所示）。表1指示可以用於產生根據本發明的一個實施方式的軛合物的宿主菌株的實例。
[表1].用於生產生物軛合物的宿主菌株的實例
例如，對於O25B-EPA生產，構建了具有基因組整合的O25B簇的菌株，所得重組宿主細胞用於在周質中產生O25B-EPA生物軛合物，並且對O25B-EPA生物軛合物進行純化，全部如WO 2017/035181中所描述。類似地，如WO 2017/035181中所描述製備了O1A-EPA、O2-EPA和O6A-EPA生物軛合物。
藉由如WO 2017/035181中所描述，以1 : 1 : 1 : 1或2 : 1 : 1 : 1的比例混合四種生物軛合物來製備包含所有四種生物軛合物O25B-EPA、O1A-EPA、O2-EPA和O6A-EPA的組成物。為簡潔起見，此類組成物在此稱為ExPEC4V。
FimH
FimH可以藉由常規方法重組表現，以在大腸桿菌中產生重組蛋白。對於在此的實驗，使用分別具有SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9（在此稱為FimHLD
23-10）中提供的序列的FimHt或FimHLD
（該等係高親和力FimH變體的實例）。此外，還使用在位置60具有脯胺酸至精胺酸取代（R60P）的FimHLD
23-10序列（這係低親和力FimH變體的實例，參見例如Rabbani等人, 2018, J Biol Chem [生物化學雜誌], 同上）。
將編碼FimHt、FimHLD
23-10和FimHLD
23-10（R60P）的序列（各自前面有訊息肽並且含有（可裂解的）His-標籤）根據本領域中已知的方法選殖到表現載體中並在滲透壓休克後使用Ni-親和純化從周質中純化（參見例如Schembri等人，2000，同上）。
佐劑
所使用的佐劑包括Quil-A®佐劑（皂苷疫苗佐劑，從Invivogen公司獲得，目錄# vac-quil）或明礬（氫氧化鋁，Alhydrogel 2%®，從Invivogen公司獲得，目錄# vac-alu-250）。在另外的實驗中，使用TLR4激動劑佐劑AS01B
（具有來自明尼蘇達沙門氏菌（Salmonella minnesota
）的5 ug 3-O-脫醯基-4’-單磷醯基脂質A（MPL）和5 ug QS-21的懸浮液；參見例如https://www.ema.europa.eu/documents/product-information/shingrix-epar-product-information_en.pdf；Didierlaurent AM, 等人, 2017, Expert Review of Vaccines [疫苗專家評論], 16:1, 55-63, DOI: 10.1080/14760584.2016.1213632）。
組成物
包含ExPEC4V、FimH和/或佐劑的組成物藉由在注射前將單獨相應組分中的每種混合在一起來製備。例如，ExPEC4V和FimH可以混合到抗原組成物中，而佐劑係分開的並且可以就在給予前與抗原組成物混合。所使用的佐劑在以下實例的表中進行了描述。
實例 2 ：方法
實例 2 ：方法
FimH ELISA
將96孔板用1 ug/mL的FimH包被過夜。在洗滌後，將包被的孔與封閉緩衝液[磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）+ 2%牛血清白蛋白（BSA）]一起在室溫下孵育2小時。在用PBS + 0.05% Tween 20洗滌後，將血清添加至板中，然後將該等板在室溫下孵育1小時。在洗滌後，將在含有2% BSA的PBS中稀釋的與辣根過氧化物酶共軛的山羊抗小鼠抗體在室溫下添加至各孔中1小時。在最終洗滌後，用四甲基聯苯胺底物使反應物顯影。用1M磷酸終止反應，並測量450 nm處的吸光度。
O-
抗原和
EPA ELISA
將ELISA板用PBS中的2.5 ug/mL純化的O-LPS和5 ug/mL甲基化牛血清白蛋白或用PBS中的1 ug/mL的EPA包被。將與辣根過氧化物酶共軛的抗小鼠IgG抗體添加至板中，然後添加底物四甲基聯苯胺。用1M H2SO4終止反應，並測量450 nm處的吸光度。
調理吞噬測定（
OPA
）
將熱滅活的血清樣品在具有大約103
CFU/孔的相應大腸桿菌血清型的緩衝液中連續稀釋，並在振盪器上孵育30分鐘。將預吸收的人補體（12.5%最終濃度）和分化的HL60細胞以600 : 1的細胞與細菌比例添加至測定板中。在33°C下孵育16小時後，將反應混合物點樣到瓊脂板上，並且計數生長的菌落。
膀胱細胞的黏附
將細菌（大腸桿菌J96）用異硫氰酸螢光素（FITC）標記。將標記的細菌與膀胱尿路上皮細胞（5637細胞系）一起在37°C孵育1小時。藉由流式細胞術測量附著細菌的%。為了評價血清抑制，將細菌先與血清樣品在37°C孵育30分鐘，且然後與5637細胞混合。
藉由
ELISpot
進行的分泌抗體的細胞（
ASC
）和記憶
B
細胞計數
用去脂化的O-LPS（2.5 ug/ml）、CpG（3 ug/ml）和IL2（50UI/ml）刺激總脾細胞5天。在孵育後，將細胞懸浮液調節至107
個細胞/mL。將ELISpot板用PBS中的O-LPS（5 μg/mL）包被，並在4°C下孵育過夜。在洗滌（PBS）並在室溫下封閉2小時後，將細胞懸浮液以3倍連續稀釋一式三份添加至板（3 × 106
個細胞/孔）。將板在37°C下孵育5小時。在洗滌後，將檢測抗體HRP-共軛的抗-IgG添加至該等板並在4°C下孵育過夜。然後將底物溶液添加至該等板，並使反應物在黑暗中顯影10分鐘；在用雙蒸餾水洗滌10-20次後，將板乾燥並計算對應於單獨ASC的斑點的數量。
T
細胞增殖和細胞因子分泌
使脾細胞在補充有5%胎牛血清的RPMI 1640中分離，並藉由無菌鋼篩網以除去大顆粒。在除去上清液和紅細胞溶解後，將細胞懸浮液在補充有5%胎牛血清的RPMI 1640中洗滌三次，並以1000 rpm離心。將細胞懸浮液調節至2 × 106
個細胞/mL，並在37°C、5% CO2
下用5和10 ug/ml的FimH或EPA體外刺激24、48和72小時。未刺激的脾細胞在相同條件下培養並用作陰性對照；用抗CD3/CD28刺激的細胞用作陽性對照。在抗原特異性刺激開始時，用CFSE標記細胞，並在每個時間點（24、48和72小時）收穫細胞並用單株抗體抗CD3、CD4、CD8、IFNg、TNFa、IL10、IL4和IL2染色。此外，藉由ELISA測定在體外用FimH或EPA（5和10 ug/mL）刺激72小時的脾細胞的培養物上清液中分泌的細胞因子（IFNg和IL5）的水平。
實例
3
：在動物中用
O-
軛合物
+ FimH
進行的初始實驗。
在C3H/HeN小鼠中建立初步實驗（使用肌肉內（i.m.）免疫接種，使用在第0天（初免）和第28天（加強）單獨或與佐劑QuilA（15 ug/劑量）組合給予的FimH（25 ug/劑量）的劑量，或使用在第0天（初免）、第14天（加強1）和第28天（加強2）單獨或與QuilA組合給予的分別含有8、4、8和16 ug的O1A、O2、O6A和O25B多糖/劑量的ExPEC4V，或無或有QuilA佐劑的ExPEC4V與FimH的組合[或使用比較佐劑Alhydrogel（氫氧化鋁，150 ug/劑量）]；在某些實驗中，由疫苗的不同配製物誘導的血清抗體水平在第0天（疫苗接種前）、第14天、第28天和第42天（疫苗接種後）進行評價；在某些實驗中，在免疫後第42天使用總脾細胞收穫來評價FimH和載體（EPA）介導的T細胞應答和記憶B細胞，並且在某些實驗中，在疫苗接種後第42天藉由OPA和藉由抗體介導的對膀胱細胞黏附/侵襲的抑制來評價血清抗體的功能性。
找到這種小鼠品系中該等組分中的每種、特別是ExPEC4V組分的最佳劑量似乎並不簡單。但是，從該等初始研究中可以得出一些結論。C3H/HeN小鼠中的初步結果確實顯示所有測試的配製物有效地誘導抗原特異性抗體的產生，並且當該等配製物與佐劑組合時抗體應答的幅度顯著增加。與此一致，當該等配製物與佐劑組合給予時，分泌抗體的細胞（ASC）的數量也顯著增加。值得注意的是，含佐劑的配製物藉由用EPA或FimH體外再刺激的脾細胞誘導IFNg的顯著分泌。該等初步發現表明，含佐劑的配製物主要活化Th1效應T細胞應答。
儘管該等實驗顯示出令人鼓舞的結果，但需要另外的研究來進一步優化用於這種小鼠品系的每種疫苗組分和佐劑的劑量。代替使用這種小鼠模型，使用不同的臨床前模型可以證實在小鼠中獲得的數據，並且可以更好地瞭解疫苗誘導的免疫應答。在第二臨床前模型（即斯普拉格道利（Sprague Dawley）大鼠）中進行的實驗在下面的實例4中進行了描述（表2和圖2）。
在史－道二氏大鼠中進行的初始實驗顯示，ExPEC4V誘導針對所有疫苗相關血清型的高水平O-抗原特異性抗體（例如van den Dobbelsteen, Vaccine [疫苗], 34: 4152-4160, 2016）。重要的是，疫苗誘導的抗體的功能性藉由它們介導細菌調理吞噬殺死的能力得到證實（表2）。史－道二氏大鼠在第0天、第14天和第28天接受用含有4或0.4 ug每種O1A、O2、O6A和O25B多糖/劑量的ExPEC4V的3次肌肉內免疫。對調理抗體的評價顯示與用4 μg/劑量免疫的動物相比，用0.4 μg的ExPEC4V免疫的大鼠具有針對O2和O25B大腸桿菌菌株的平均更高的調理滴度（表2）。在所測試的任一疫苗劑量下，針對O6A大腸桿菌菌株觀察到的調理滴度係相似的（表2）。總之，ExPEC4V在大鼠中具有免疫原性；在疫苗接種後檢測到高水平的O-抗原特異性抗體，並且重要的是，該等抗體係功能性的，能夠介導大腸桿菌的調理吞噬殺死。
在進行該等研究時，僅針對三種大腸桿菌菌株（O2、O6A和O25B）開發了OPA測定。因此，藉由O1A軛合物誘導的抗體的功能性未在表2中描述。然而，當進一步開發該測定並且適合與人血清樣品一起使用時，證實了針對疫苗中包含的所有血清型的功能性（O1A、O2、O6A和O25B，未示出）。
[表2].在大鼠中藉由ExPEC4V誘導的抗體的功能性。
[表2].在大鼠中藉由ExPEC4V誘導的抗體的功能性。
使用這種臨床前大鼠模型獲得的結果與這種疫苗在人類中的發現（1b期臨床試驗）一致，其中ExPEC4V誘導穩健的免疫應答，並且證實了針對所有疫苗相關血清型的抗體功能性（例如Huttner A，等人，2017，同上）。
在大鼠中的進一步初始實驗顯示FimH免疫誘導抑制細菌黏附至膀胱上皮細胞的抗體。用4種肌肉內劑量的2種不同的FimH變體（FimHLD
23-10和FimHLD
23-10（R60P）免疫威斯達（Wistar）大鼠；作為Speedy 28天模型（Eurogentec, secure.eurogentec.com/speedy.htlm）的一部分與非弗氏佐劑組合的60 ug每種變體/劑量誘導功能性抗體，該等功能性抗體能夠減少細菌黏附至膀胱上皮細胞的（圖1）。
因此據信，與基於任一O-抗原的疫苗或單獨含佐劑的FimH相比，在佐劑存在下大腸桿菌O-軛合物與FimH的組合藉由組合不同的作用模式而產生針對UTI的改進的疫苗。
實例
4.
大鼠中
O-
軛合物和
FimH
的免疫原性和功效
史－道二氏大鼠（雌性，6-7周）接受在第0天、第14天和第28天單獨或與佐劑AS01B
組合給予的FimH（60 ug/劑量）的3次肌肉內免疫（第1組和第2組，表3，圖2）。第3組和第4組接受在第0天、第14天和第28天單獨或與AS01B
組合給予的3個劑量的ExPEC4V，該ExPEC4V含有0.4 ug的每種多糖（O1A、O2、O6B和O25B）（第3組和第4組，表3，圖2）。第5組和第6組接受含有FimH（60 ug/劑量）和ExPEC4V（0.4 ug的每種多糖）的組合配製物，有或無佐劑（第5組和第6組，表3，圖2）。佐劑AS01B
以5 ug MPL和5 ug QS21（即人劑量的1/10）給予（表3）。作為對照組，僅用佐劑AS01B
（第7組）或鹽水（第8組）對動物進行免疫。
由疫苗的不同配製物誘導的血清抗體水平在第0天（疫苗接種前）以及第14天、第28天和第42天（疫苗接種後）進行評價。在免疫後第42天使用總脾細胞收穫來評價FimH和載體（EPA）介導的T細胞應答和記憶B細胞。此外，在疫苗接種後第42天藉由OPA和藉由抗體介導的對膀胱細胞黏附的抑制來評價血清抗體的功能性。
在免疫後第43天，經由經尿道導管插入用107
CFU的大腸桿菌激發動物。在激發後4小時和6天測定膀胱和腎CFU。
[表3].史－道二氏大鼠中的免疫原性和功效研究。
FimH：60 ug/劑量；AS01B：每劑量5 ug MPL和5 ug QS21；ExPEC4V含有每劑量0.4 ug的每種多糖（O1A、O2、O6A和O25B）。
序列
[表3].史－道二氏大鼠中的免疫原性和功效研究。
序列
本發明的實施方式旨在僅是示例性的，並且熟悉該項技術者將認識到或僅使用常規實驗就能夠確定本發明的具體程序的許多等效方案。所有這類等效方案被認為在本發明的範圍內並且由以下申請專利範圍涵蓋。
在此引用的所有參考文獻（包括專利申請、專利和公開）均藉由引用以其全文結合在此，並且其程度正如出於所有目的將每個單獨的公開或專利或專利申請具體地且單獨地指明出於所有目的藉由引用以其全文結合。
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無
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述概述以及本發明的以下詳述。應理解的是本發明不限於附圖中示出的準確實施方式。
[圖1]示出由FimH特異性抗體介導的對細菌黏附至膀胱上皮細胞的抑制。數據示出來自用2種不同的FimH變體（FimHLD
23-10和FimHLD
23-10 R60P）疫苗接種前和疫苗接種後大鼠的細菌（大腸桿菌J96）黏附至無血清（虛線）的膀胱上皮細胞（5637細胞系）的%和藉由血清樣品介導的對黏附的抑制（平均值 ± SD）。
[圖2]示出免疫原性和功效研究的實驗設計（關於細節，參見實例4）。*
：抽血和血清抗體測量的時間點。＃
：評價抗體的功能性、T細胞和B細胞應答的時間點。&
在感染後4小時和6天測定膀胱和腎CFU。
無
Claims (17)
- 疫苗或疫苗組合用於製造用以在受試者中誘導針對由大腸桿菌引起的腹內感染的免疫應答的藥物之用途，該疫苗或疫苗組合包含一種或多種包含與載體蛋白共價偶聯的大腸桿菌O-抗原多糖的共軛物、和/或FimH多肽以及視需要的佐劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組合之用途，其中該疫苗組合包含FimH多肽、一種或多種包含與載體蛋白共價偶聯的大腸桿菌O-抗原多糖的共軛物、和佐劑。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該腹內感染係炎症性腸病。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該腹內感染係克羅恩氏病。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該一種或多種共軛物包含大腸桿菌O25B抗原多糖。
- 如申請專利範圍第5項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該等共軛物進一步包含大腸桿菌O1A抗原多糖、大腸桿菌O2抗原多糖和大腸桿菌O6A抗原多糖。
- 如申請專利範圍第5項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該等共軛物進一步包含來自O4、O7、O9、O11、O12、O22、O75、O8、O15、O16或O18抗原多糖中的一種或多種的大腸桿菌O-抗原多糖。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該載體蛋白係去毒的銅綠假單胞菌外毒素A（EPA）。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該FimH多肽包含截短形式的FimH。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該FimH多肽與FimC複合（FimCH）。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該FimH多肽例如藉由胺基酸位置60處的精胺酸至脯胺酸的突變（R60P）而呈低親和力構象，其中胺基酸編號與SEQ ID NO: 9的FimH序列一致。
- 如申請專利範圍第1或2的疫苗或疫苗組合之用途，其中該佐劑包含皂苷，例如QS21。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該佐劑包含TLR4激動劑。
- 如申請專利範圍第13項所述之疫苗或疫苗組合之用途，其中該FimH多肽例如藉由胺基酸位置60處的精胺酸至脯胺酸的突變（R60P）而呈低親和力構象，其中胺基酸編號與SEQ ID NO: 9的FimH序列一致。
- 如申請專利範圍第2項中任一項所述之疫苗組合之用途，其中該FimH多肽、該一種或多種包含與載體蛋白共價偶聯的大腸桿菌O-抗原多糖的共軛物和該佐劑存在於單一組成物中。
- 如申請專利範圍第2項中任一項所述之疫苗組合之用途，其中： a) 該FimH多肽和該一種或多種包含與載體蛋白共價偶聯的大腸桿菌O-抗原多糖的共軛物存在於第一組成物中，並且該佐劑存在於第二組成物中；或者 b) 該FimH多肽和該佐劑存在於第一組成物中，並且該一種或多種包含與載體蛋白共價偶聯的大腸桿菌O-抗原多糖的共軛物存在於第二組成物中；或者 c) 該一種或多種包含與載體蛋白共價偶聯的大腸桿菌O-抗原多糖的共軛物和該佐劑存在於第一組成物中，並且該FimH多肽存在於第二組成物中；或者 d) 該FimH多肽存在於第一組成物中，該一種或多種包含與載體蛋白共價偶聯的大腸桿菌O-抗原多糖的共軛物存在於第二組成物中，並且該佐劑存在於第三組成物中。
- 如申請專利範圍第16項所述之疫苗組合之用途，其中該第一組成物和該第二組成物，或該第一組成物、該第二組成物和該第三組成物用於在允許將該等疫苗組合組分引流至同一淋巴結的時間範圍內和位置處給予。
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