KR20150060986A

KR20150060986A - 비선형 사카라이드 컨주게이트

Info

Publication number: KR20150060986A
Application number: KR1020157011597A
Authority: KR
Inventors: 프란체스코 베르티; 줄리아 브로지오니; 파올로 코스탄티노; 주세페 델 쥬디체; 마리아 로마노
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2012-10-02
Filing date: 2013-10-02
Publication date: 2015-06-03
Also published as: IL237826A0; WO2014053521A3; CA2885625A1; MX2015004171A; AU2013326584B2; EP2903650A2; BR112015007126A2; EA201590427A1; EP2903650B1; US20160101187A1; ES2672996T3; TR201808684T4; JP2015532276A; AU2013326584A1; WO2014053521A2; CN105307684A; SG11201502197XA

Abstract

본 명세서는 T-세포 에피토프를 포함하며 입체형태적 B-세포 에피토프를 갖지 않는 적어도 2개의 펩티드에 연결된 폴리사카라이드를 포함하는 비선형 사카라이드 컨주게이트로서, 펩티드 중 하나가 내부 사카라이드에 연결되어 컨주게이트가 분지된 (즉, 비선형) 구조를 갖는 컨주게이트에 관한 것이다. 본 명세서는 또한, 이러한 컨주게이트를 제조하는 방법, 백신으로서 사용하기 위한 조성물에서 이들 컨주게이트를 제형화시키는 방법, 및 이러한 조성물을 사용하여 캡슐 사카라이드에 대한 면역 반응을 유발시키는 방법을 제공한다. 본 명세서는 또한, 폴리오 바이러스로부터의 PV1 에피토프를 포함하는 신규한 폴리에피토프 담체 펩티드를 제공한다. 신규한 폴리에피토프 담체 펩티데칸은 선형 사카라이드 컨주게이트 및 비선형 사카라이드 컨주게이트 둘 모두에 사용될 수 있다.

Description

비선형 사카라이드 컨주게이트 {NONLINEAR SACCHARIDE CONJUGATE}

관련 출원

본 출원은 2012년 10월 2일 출원된 미국 가출원 번호 61/709,093의 이익을 청구한다. 상기 출원의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 통합된다.

기술 분야

본 발명은 T-세포 에피토프를 포함하며, 입체형태적 B-세포 에피토프를 갖지 않는 적어도 2개의 담체 펩티드에 연결된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 포함하는 비선형 사카라이드 컨주게이트로서, 담체 펩티드 중 하나는 내부 사카라이드에 연결되는 컨주게이트를 이용한 면역화에 관한 것이다. 박테리아 및 진균 감염 및 질환에 대한 백신으로서 이러한 조성물의 사용이 특히 흥미롭다. 본 발명은 또한, 적어도 2개의 PV1 T-세포 에피토프를 포함하며, 입체형태적 B-세포 에피토프를 갖지 않는 적어도 하나의 담체 펩티드에 연결된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 포함하는 선형 사카라이드 컨주게이트를 이용한 면역화에 관한 것이다.

배경 기술

담체 단백질은 폴리사카라이드 면역원에 대한 면역 반응을 향상시키는데 사용된다. 이러한 담체 단백질은 소아에서의 면역 반응 유도에 특히 유리할 수 있으며, 따라서 많은 소아용 백신에서 발견된다. 권고되는 소아 예방접종 스케줄은 출생시의 B형 간염 백신; 6주에 시작되는 디프테리아/파상풍/백일해 (DTaP), 로타바이러스, H. 인플루엔자 타입 b (Hib) 컨주게이트, 불활성화된 폴리오바이러스 및 뉴모코커스 컨주게이트 모두; 6개월에 시작하는, 불활성화된 인플루엔자 백신; 12개월에 시작하는 홍역/볼거리/풍진 (MMR), 수두, 및 A형 간염; 및 2년 후의 메닝고코커스 컨주게이트를 포함하는 상당한 수의 백신을 포함한다. 이러한 목록중에, 폴리사카라이드 컨주게이트: Hib 컨주게이트 (예를 들어, VaxemHib - 디프테리아 CRM₁₉₇ 컨주게이트); 뉴모코커스 컨주게이트 (예를 들어, Prevnar - 디프테리아 CRM₁₉₇ 컨주게이트); 및 메닝고코커스 컨주게이트 (예를 들어, Menveo - 디프테리아 CRM₁₉₇ 컨주게이트)가 그 뒤를 잇는다.

현재 소아 예방접종 스케줄에 새로운 백신의 부가는 논의되어야 할 2개의 잠재적인 문제에 부딪힐 수 있다. 첫 번째는, 담체-유도된 에피토프 억제 (또는 일반적으로 공지된 바와 같은 "담체 억제") 문제, 특히 담체 프라이밍으로부터 발생하는 억제가 논의되어야 한다. "담체 억제"는 담체 단백질로의 동물의 사전-면역화가 그러한 담체 상에 제시된 새로운 항원성 에피토프에 대한 면역 반응을 후에 유도하는 것을 방해하는 현상이다 (Herzenberg et al. (1980) Nature 285: 664-667).

문헌 [Schutze et al. (1985) J Immunol 135:2319-2322]에 보고된 바와 같이, 수개의 백신 항원은 동일한 단백질 성분 (컨주게이트에서 면역원 및/또는 담체 단백질로서 사용되는)을 함유하며, 그렇다면 이들 항원 사이를 간섭할 가능성이 존재한다. 슛츠 (Schutze) 등은 파상풍 톡소이드 (Tt) 담체에 컨주게이팅된 항원에 대한 면역 반응이 Tt에 대한 사전-존재하는 면역성에 의해 억제됨을 관찰하였다.

다간 (Dagan) 등은 Hib 컨주게이트에 대한 담체가 DTP 백신으로부터의 파상풍 항원과 동일한 경우 DTP 백신과 Hib 컨주게이트 백신의 조합물은 악영향을 받음을 관찰하였다 ((1998) Infect Immun 66:2093-2098). 다간 등은 공통의 단백질 담체에 의한 간섭으로부터 발생하는 이러한 "담체 억제" 현상이 다중 컨주게이트를 포함하는 백신을 도입할 경우 고려되어야한다는 결론을 내렸다.

슛츠 등 및 다간 등에 반해, 바링턴 (Barington) 등은 파상풍 톡소이드로의 프라이밍은 후속-투여된 Hib-Tt 컨주게이트에 대한 면역 반응에 부정적인 영향을 끼치지 않으나, 모체 획득된 항-Tt 항체를 갖는 환자에서 억제가 관찰되었다고 보고하였다 ((1994) Infect Immun 62:9-14). 그러나, 디 존 (Di John) 등은 존재하는 항-Tt 항체를 갖는 환자에서 Tt-기반 펩티드 컨주게이트에 대한 "에피토프 억제" 효과가 파상풍 백신접종으로부터 유도됨을 관찰하였다 ((1989) Lancet 2(8677):1415-8).

그라노프 (Granoff) 등은 담체로서 CRM₁₉₇ (디프테리아 독소의 탈독소화된 변이체)를 갖는 컨주게이트는 백신의 일부로서 (예를 들어, DTP 또는 DT 백신의 일부로서) 이전에 디프테리아 독소를 수용하지 않은 아동에서 비효과적일 수 있음을 시사하였다 ((1993) Vaccine Suppl 1: S46-51). 이러한 작업은 문헌 [Granoff et al. (1994) JAMA 272:1116-1121]에서 추가로 개발되었으며, 여기에서 D-T 면역화에 의한 담체 프라이밍 효과는 Hib 컨주게이트로의 후속 면역화에 대해 지속되는 것으로 관찰되었다.

문헌 [Barington et al. (1993) Infect Immun 61:432-438]에서, 저자는 디프테리아 또는 파상풍 톡소이드 담체 단백질로의 사전-면역화가 이들 담체에 컨주게이팅된 Hib 캡슐 사카라이드로의 후속 면역화 후에 항-Hib 항체 수준 증가를 축소시키며, IgG1 및 IgG2가 동일하게 영향을 받음을 발견하였다. 컨주게이트의 담체 부분에 대한 반응이 또한 억제되었다. 추가로, 더욱 일반적인 비-에피토프-특이적 억제가 관찰되었는데, 한 컨주게이트로의 사전-면역화가 4주 후에 투여되었던 제 2 컨주게이트의 담체 및 사카라이드 부분 둘 모두에 대한 면역 반응에 영향을 끼치는 것으로 관찰되었기 때문이다.

따라서, "담체 억제"의 영향에 대한 혼동을 고려해 볼 때, 컨주게이션에 이용가능한 추가적인 담체 단백질은 갖는 것은 이러한 해로운 상호작용을 감소시키는데 이로울 것이다. 이상적으로, 담체 단백질은 그 자체에 대한 항체 반응을 유발시키지 않으면서 컨주게이팅된 B-세포 에피토프 (예를 들어, 폴리사카라이드)에 대한 강한 헬퍼 효과를 유도해야 한다. 담체 단백질에 대한 대안으로서, 대부분의 주조직접합성 복합체 클래스 II 분자의 경우에서 면역원성인 범용적 펩티드 에피토프의 사용이 이러한 목표에 대한 하나의 방법이다 [예를 들어, 문헌 [Alexander et al. (2000) J Immunol 164:1625-1633] 참조]. 이러한 펩티드 에피토프는 TT 및 다른 단백질 내에 확인되었다. 그러나, 단일 에피토프의 사용은 강한 T-세포 의존적 면역 반응을 유발시키는데 전형적으로 충분하지 않다. 이러한 문제를 대처하기 위해, 다중 T-세포 에피토프를 포함하나 입체형태적 B-세포 에피토프는 결여된 폴리에피토프 담체 펩티드가 개별 사카라이드는 물론 별개의 병원체로부터의 사카라이드의 조합물 둘 모두에 대한 담체로서 특히 유용함을 입증하였다. 추가로, 이들 폴리에피토프 담체 펩티드가 다수의 공지된 병원체성 에피토프를 포함하나 이들 폴리에피토프 담체 펩티드에 대해 단지 낮은 면역원성 반응이 관찰됨이 밝혀졌으며, 반면 면역원성 반응이 병원체성 에피토프의 수와 비례하여 증가할 것임이 예측될 것이다 [예를 들어, 미국 특허 공개 2008/0260773 참조].

두 번째로, 이미 혼잡해진 예방접종 스케줄을 고려해 볼 때, 예방접종 스케줄로의 새로운 백신의 부가는 가능한 해로운 상호작용 및 또한, 단순히 요구되는 별도의 접종 수로 인해 어려움을 증가시킬 것이다. 따라서, 백신을 DTaP 또는 MMR 백신과 같이 단일 접종으로 조합할 수 있는 것이 이롭다. 폴리사카라이드 면역원에 대한 면역 반응을 향상시키면서 그 자체에 대한 면역 반응을 유발시키지 않는 추가적인 담체 펩티드를 갖는다는 것은, 새로운 사카라이드 기반 백신과 현존하는 백신의 단일 주입 조성물로의 부가를 단순화시킬 수 있기 때문에 이로울 것이다.

본 발명의 목적은 폴리사카라이드 면역원으로의 컨주게이션을 위한 추가의 및/또는 더욱 우수한 담체 펩티드, 및 폴리사카라이드 길이에 따라 펩티드 에피토프를 분포시키기 위한 더욱 우수한 컨주게이션 모드를 제공하는 것이다.

발명의 개요

일 구체예에서, 본 발명은 적어도 2개의 담체 펩티드에 연결된 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 선택된 사카라이드를 갖는 비선형 사카라이드 컨주게이트를 포함하는 조성물로서, 적어도 2개의 담체 펩티드 각각은 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 가지나 입체형태적 B-세포 에피토프는 갖지 않으며, 적어도 2개의 펩티드 중 적어도 하나는 사카라이드에 내부적으로 연결된 조성물을 제공한다. 특정 경우에서, 적어도 2개의 펩티드는 선형 B-세포 에피토프를 포함한다. 또 다른 경우에서, 적어도 2개의 펩티드는 선형의 B-세포 에피토프를 포함하지 않는다. 이전의 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 적어도 2개의 펩티드중 적어도 하나는 PV1 T-세포 에피토프를 갖는다. PV1 T-세포 에피토프를 갖는 특정 경우에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9을 포함하며, 이는 선택적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 단일 아미노산 변경을 갖는다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 적어도 2개의 펩티드는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 적어도 2개의 펩티드는 사카라이드에 직접 연결되거나 적어도 2개의 펩티드는 링커를 통해 사카라이드에 연결된다. 링커에 대한 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 적어도 2개의 펩티드에 대한 링커는 동일하거나 상이하다. 링커에 대한 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 링커는 선형 (예를 들어, 1 내지 10개 탄소 원자 (예를 들어, C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀)의 직쇄 알킬)이다. 링커에 대한 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 링커는 N-카파-말레이미도운데칸산 하이드라지드-TFA (KMUH) 또는 N-β-말레이미도프로피온산 하이드라지드-TFA (BMPH)이다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 특정 경우에서, 사카라이드는 담체 단백질에 연결되지 않는다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 사카라이드는 5 내지 35개 사카라이드 당 적어도 하나 펩티드, 5 내지 25개 사카라이드 당 적어도 하나 펩티드, 5 내지 20개 사카라이드 당 적어도 하나 펩티드, 또는 7 내지 15개 사카라이드 당 적어도 하나 펩티드에 연결된다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 특정 경우에서, 사카라이드는 적어도 3개의 펩티드, 적어도 4개의 펩티드, 적어도 5개의 펩티드, 적어도 6개의 펩티드, 적어도 7개의 펩티드, 적어도 8개의 펩티드, 적어도 9개의 펩티드, 또는 적어도 10개의 펩티드에 연결된다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 사카라이드는 예컨대, N. 메닌기티디스 (N. meningitidis), S. 뉴모니애 (S. pneumoniae), S. 피오게네스 (S. pyogenes), S. 아갈락티애 (S. agalactiae), H. 인플루엔자, P. 애루기노사 (P. aeruginosa), S. 아우레우스 (S.　 aureus), E. 패칼리스 (E. faecalis), E. 패시움 (E. faecium), Y. 엔테라콜리티카 (Y. enteracolitica), V. 콜레라 (V. cholerae ) 또는 S. 타이피 (S. typhi)로부터의 캡슐 사카라이드이다. 선행의 경우와 조합될 수 있는 또 다른 경우에서, 사카라이드는 예컨대, C. 알비칸스 (C. albicans ), 콕키디오이데스 임미티스 (Coccidioides immitis), 트리코파이톤 베루코섬 (Trichophyton verrucosum), 블라스토마이세스 데르마티디스 (Blastomyces dermatidis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라즈마 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum), 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 파라콕키디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 또는 피티움 인시디오섬 (Pythiumn insidiosum)으로부터의 글루칸이다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 사카라이드는 적어도 10개의 사카라이드, 적어도 15개 사카라이드, 적어도 20개 사카라이드, 적어도 25개 사카라이드, 적어도 30개 사카라이드, 적어도 35개 사카라이드, 적어도 40개 사카라이드, 적어도 50개 사카라이드, 적어도 75개 사카라이드, 또는 적어도 백개의 사카라이드를 포함한다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 조성물은 또한, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 특정 경우에서, 조성물은 또한 애주번트를 포함한다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 조성물은 또한 하기로부터 선택된 추가적인 성분을 포함한다: 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis ) 항원, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae ) 항원, 스트렙토코커스 피오게네스 항원, 모락셀라 카타르할리스 (Moraxella catarrhalis) 항원, 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis) 항원, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 항원, 스타필로코커스 에피데르미스 (Staphylococcus epidermis) 항원, 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani) 항원, 코르니네박테리움 디프테리아 (Cornynebacterium diphtheriae ) 항원, 해모필루스 인플루엔자 타입 B (Hib) 항원, 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 항원, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) 항원, 스트렙토코커스 아갈락티애 항원, 네이세리아 고노르호애 (Neiserria gonorrhoeae) 항원, 클라미디아 트라초마티스 (Chlamydia trachomatis) 항원, 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) 항원, 해모필루스 두크레이 (Haemophilus ducreyi) 항원, 엔테로코커스 패칼리스 항원, 엔테로코커스 패시움 항원, 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori) 항원, 스타필로코커스 사프로피티쿠스 (Staphylococcus saprophyticus) 항원, 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) 항원, E. 콜라이 항원, 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 항원, 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 항원, 릭켓치아 (Rickettsia) 항원, 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes) 항원, 클라미디아 뉴모니애 (Chlamydia pnenumoniae) 항원, 비브리오 콜레라 항원, 살모넬라 타이피 항원, 보렐리아 버그도르페리 (Borrelia burgdorferi) 항원, 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 항원, 쉬겔라 (Shigella) 항원 및 클레브시엘라 (Klebsiella) 항원.

본 발명의 또 다른 양태는 이의 다양한 경우에서의 앞선 임의의 양태의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하여 면역 반응을 유발시키는 방법을 포함한다. 특정 경우에, 대상체는 인간이다. 선행의 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 면역 반응는 사카라이드를 인식한다. 선행의 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 사카라이드에 대한 면역 반응은 담체 단백질 또는 그 밖의 T-세포 에피토프에 연결되지 않은 사카라이드에 의해 유발된 면역 반응보다 더욱 T-세포 의존적이다.

본 발명의 또 다른 양태는 포유동물 대상체에서 사카라이드에 대한 향상된 면역 반응을 유발하는 이의 다양한 경우에서의 앞선 임의의 양태의 조성물의 용도를 포함한다. 특정 경우에, 포유동물 대상체는 인간이다. 선행의 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 향상된 면역 반응는 사카라이드를 인지한다. 선행의 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 사카라이드에 대한 향상된 면역 반응은 담체 단백질 또는 그 밖의 T-세포 에피토프에 연결되지 않은 사카라이드에 의해 유발된 면역 반응보다 더욱 T-세포 의존적이다.

본 발명의 또 다른 양태는 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 선택된 사카라이드를 포함하는 사카라이드 컨주게이트를 포함하는 조성물로서, 펩티드에 연결된 사카라이드는 입체형태적 B-세포 에피토프는 갖지 않으며 적어도 2개의 T-세포 에피토프를 포함하는 펩티드에 연결되며, T-세포 에피토프 중 적어도 하나는 PV1 에피토프이다. 특정 경우에서, 펩티드는 선형 B-세포 에피토프를 포함한다. 또 다른 경우에서, 펩티드는 선형의 B-세포 에피토프를 포함하지 않는다. 이전의 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, PV1 에피토프의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9을 포함하며, 이는 선택적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 단일 아미노산 변경을 갖는다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 펩티드는 사카라이드에 직접 연결되거나 펩티드는 링커를 통해 사카라이드에 연결된다. 링커에 대한 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 링커는 동일하거나 상이하다. 링커에 대한 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 링커는 선형 (예를 들어, 1 내지 10개 탄소 원자 (예를 들어, C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀)의 직쇄 알킬)이다. 링커에 대한 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 링커는 N-카파-말레이미도운데칸산 하이드라지드-TFA (KMUH) 또는 N-β-말레이미도프로피온산 하이드라지드-TFA (BMPH)이다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 특정 경우에서, 사카라이드는 담체 단백질에 연결되지 않는다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 펩티드는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 T-세포 에피토프를 갖는다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 사카라이드는 예컨대, N.　메닌기티디스, S. 뉴모니애, S. 피오게네스, S. 아갈락티애, H. 인플루엔자, P. 애루기노사, S.　아우레우스, E. 패칼리스, E. 패시움, Y. 엔테라콜리티카, V. 콜레라 또는 S. 타이피로부터의 캡슐 사카라이드이다. 선행의 경우와 조합될 수 있는 또 다른 경우에서, 사카라이드는 예컨대, C. 알비칸스, 콕키디오이데스 임미티스, 트리코파이톤 베루코섬, 블라스토마이세스 데르마티디스, 크립토코커스 네오포르만스, 히스토플라즈마 캅술라툼, 사카로마이세스 세레비시애, 파라콕키디오이데스 브라실리엔시스, 또는 피티움 인시디오섬으로부터의 글루칸이다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 사카라이드는 적어도 10개 사카라이드, 적어도 15개 사카라이드, 적어도 20개 사카라이드, 적어도 25개 사카라이드, 적어도 30개 사카라이드, 적어도 35개 사카라이드 또는 적어도 40개 사카라이드를 포함한다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 조성물은 또한, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 특정 경우에서, 조성물은 또한 애주번트를 포함한다. 앞선 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 조성물은 또한 하기로부터 선택된 추가적인 성분을 포함한다: 나이세리아 메닌기티디스 항원, 스트렙토코커스 뉴모니애 항원, 스트렙토코커스 피오게네스 항원, 모락셀라 카타르할리스 항원, 보르데텔라 퍼투시스 항원, 스타필로코커스 아우레우스 항원, 스타필로코커스 에피데르미스 항원, 클로스트리듐 테타니 항원, 코르니네박테리움 디프테리애 항원, 해모필루스 인플루엔자 타입 B (Hib) 항원, 슈도모나스 애루기노사 항원, 레지오넬라 뉴모필라 항원, 스트렙토코커스 아갈락티애 항원, 네이세리아 고노르호애 항원, 클라미디아 트라초마티스 항원, 트레포네마 팔리둠 항원, 해모필루스 두크레이 항원, 엔테로코커스 패칼리스 항원, 엔테로코커스 패시움 항원, 헬리코박터 파이로리 항원, 스타필로코커스 사프로피티쿠스 항원, 예르시니아 엔테로콜리티카 항원, E. 콜라이 항원, 바실러스 안트라시스 항원, 예르시니아 페스티스 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원, 릭켓치아 항원, 리스테리아 모노사이토게네스 항원, 클라미디아 뉴모니애 항원, 비브리오 콜레라 항원, 살모넬라 타이피 항원, 보렐리아 버그도르페리 항원, 포르피로모나스 긴기발리스 항원, 쉬겔라 항원 및 클레브시엘라 항원.

본 발명의 또 다른 양태는 이의 다양한 경우의 바로 앞의 임의의 양태의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하여 면역 반응을 유발시키는 방법을 포함한다. 특정 경우에서, 대상체는 인간이다. 선행의 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 면역 반응은 사카라이드를 인식한다. 선행의 경우와 조합될 수 있는 일부 경우에서, 사카라이드에 대한 면역 반응은 담체 단백질 또는 그 밖의 T-세포 에피토프에 연결되지 않은 사카라이드에 의해 유발된 면역 반응보다 더욱 T-세포 의존적이다.

상세한 설명

순수한 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드는 종종 불량한 면역원이며, 따라서 종종 담체 펩티드에 컨주게이팅되어야 한다. 심지어 폴리사카라이드가 충분한 면역원성을 갖는다 하더라도, 담체 단백질로의 컨주게이션은 면역원성을 향상시킬 수 있어 더 적은 폴리사카라이드가 전달될 필요가 있게 한다. 게다가, 소아에서의 보호 효능을 위해, 담체 펩티드로의 컨주게이션이 종종 요구된다. 탄수화물 항원의 면역원성을 향상시키기 위해 담체 단백질로의 컨주게이션 이용은 널리 공지되어 있으며 (예를 들어, 문헌 [Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36, Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34: 163-8, Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13: 113-33, vii, Goldblatt (1998) J. Med . Microbiol. 47:563-567, EP-B-0477508, US Pat. No. 5,306,492, WO98/42721, Dick et al. in Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, Vol. 10, 48-1 14, Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego CA (1996), etc.] 참조); 특히 소아 백신에 이용된다 (Ramsay et al. (2001) Lancet 357(9251):195-6).

담체 단백질에 대한 대안으로서, 대부분의 주조직접합성 복합체 클래스 II 분자의 경우에서 면역원성인 범용적 펩티드 에피토프의 사용이 탐구되었다 [예를 들어, 문헌 [Alexander et al. (2000) J Immunol 164:1625-1633] 참조]. 이러한 펩티드 에피토프는 TT 및 다른 단백질 내에서 확인되었다. 그러나, 단일 에피토프의 사용은 강한 T-세포 의존적 면역 반응을 유발시키는데 전형적으로 충분하지 않다. 이러한 문제를 대처하기 위해, 다중 T-세포 에피토프를 포함하나 입체형태적 B-세포 에피토프는 결여된 폴리에피토프 담체 펩티드가 개별 사카라이드는 물론 별개의 병원체로부터의 사카라이드의 조합물 둘 모두에 대한 담체로서 특히 유용함을 입증하였다. 추가로, 이들 폴리에피토프 담체 펩티드가 다수의 공지된 병원체성 에피토프를 포함하더라도 이들 폴리에피토프 담체 펩티드가 단지 최대한 낮은 면역원성 반응을 유발시킴이 밝혀졌으며, 반면 면역원성 반응은 병원체성 에피토프의 수와 비례하여 증가할 것임이 예측될 것이다 [예를 들어, 미국 특허 공개 2008/0260773 참조]. 이와 같이, 선형 배열의 다중 T-세포 에피토프를 갖는 경우에라도, 폴리에피토프 담체 펩티드는 이들 자체에 대한 면역 반응을 유발시키지 않으면서 이들이 컨주게이팅된 사카라이드에 대한 면역 반응만을 유발시킨다.

본 발명자들은 사카라이드 항원이, 적어도 하나의 에피토프가 내부 사카라이드에 연결되어 비선형의 컨주게이트를 형성하도록 사카라이드에 컨주게이팅된 적어도 2개의 펩티드 에피토프를 갖는 경우, 사카라이드 항원에 대한 강력한 T-세포 의존적 면역 반응을 유도하는데 있어서 효과적일 수 있음을 놀랍게도 발견하였다.

따라서, 본 발명의 양태는 적어도 2개의 담체 펩티드로서 각각 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 포함하는 담체 펩티드에 컨주게이팅된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드 및 선택적으로 애주번트 (하기 정의된 바와 같음)를 포함하는 사카라이드 컨주게이트를 제공한다.

따라서, 본 발명의 추가적인 양태는 적어도 2개의 T-세포 에피토프 (이중 하나는 PV1 에피토프임)를 포함하는 적어도 하나의 담체 펩티드에 컨주게이팅된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드 및 선택적으로 애주번트 (하기 정의된 바와 같음)를 포함하는 사카라이드 컨주게이트를 제공한다.

담체 펩티드는 직접적으로 또는 링커를 통해 사카라이드에 공유적으로 컨주게이팅될 수 있다. 필요에 따라 임의의 적합한 링커와의 임의의 적합한 컨주게이션 반응이 이용될 수 있다.

담체 펩티드로의 사카라이드의 부착은 바람직하게는, N- 또는 C-말단에서 또는 이 부근에서 -SH 기를 통해 예를 들어, 시스테인 잔기(들)의 측쇄(들)를 통해서이다. 부착은 대안적으로, 담체 펩티드에서 -NH₂ 기를 통해 예를 들어, 리신 잔기(들) 또는 아르기닌 잔기(들)의 측쇄(들)를 통해 이루어질 수 있다. 폴리사카라이드가 자유 알데하이드 기를 갖는 경우, 이러한 기는 담체 펩티드의 아민과 반응하여 환원적 아민화에 의한 컨주게이트를 형성할 수 있다. 대안적으로, 폴리사카라이드는 링커 분자를 통해 담체 단백질에 부착될 수 있다.

사카라이드는 전형적으로, 컨주게이션 전에 활성화되거나 작용기화될 것이다. 활성화는 예를 들어, 시아닐화 시약 예컨대, CDAP (1-시아노-4-디메틸아미노 피리디듐 테트라플루오로보레이트)를 포함할 수 있다. 기타 적합한 기법은 카르보디이미드, 하이드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-하이드록시숙신이미드, S-NHS, EDC, TSTU (예를 들어, WO98/42721 도입부 참조)를 사용한다.

담체 펩티드로의 직접 결합은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,761,283 및 미국 특허 번호 4,356,170에 기술된 바와 같이, 사카라이드의 산화에 이은 담체 펩티드로의 환원적 아민화를 포함할 수 있다.

링커 기를 통한 결합은 임의의 공지된 절차 예를 들어, 미국 특허 번호 4,882,317 및 미국 특허 번호 4,695,624에 기술된 절차를 사용하여 이루어질 수 있다. 전형적으로, 링커는 사카라이드의 아노머 탄소를 통해 부착된다. 바람직한 유형의 결합은 아디프산 링커이며, 이는 자유 -NH2 기 (예를 들어, 아민화에 의해 폴리사카라이드에 도입됨)를 아디프산 (예를 들어, 디이미드 활성화 이용)과 커플링시키고, 이어서 단백질을 생성 사카라이드-아디프산 중간체에 커플링시킴으로써 형성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [EP-B-0477508, Mol . Immunol, (1985) 22, 907-919] 및 EP-A-0208375 참조). 유사한 바람직한 유형의 결합은 글루타르산 링커이며, 이는 자유 -NH 기를 글루타르산과 동일한 방식으로 커플링시킴으로써 형성될 수 있다. 아디프산 및 글루타르산 링커는 또한, 폴리사카라이드로의 직접 커플링 즉, 자유 기 예를 들어, 자유 -NH 기의 폴리사카라이드로의 사전 도입 없이 직접 커플링에 이은 생성 사카라이드-아디프산/글루타르산 중간체로의 단백질의 커플링에 의해 형성될 수 있다. 또 다른 바람직한 유형의 결합은 카르보닐 링커이며, 이는 변형된 폴리사카라이드의 자유 하이드록실 기와 CDI의 반응 (Bethell G.S. et al. (1979) J Biol Chem 254, 2572-4 and Hearn M.T.W. (1981) J. Chromatogr 218, 509-18), 이어서 단백질과의 반응에 의해 카르바메이트 결합을 형성함으로써 형성될 수 있다. 또 다른 링커는 β-프로피온아미도 (WO00/10599), 니트로페닐-에틸아민 (Gever et al. (1979) Med Microbiol Immunol 165, 171-288), 할로아실 할라이드 (U.S. Pat. No. 4,057,685), 글리코시드 결합 (미국 특허 번호 4,673,574; 4,761,283; 및 4,808,700), 6-아미노카프로산 (미국 특허 번호 4,459,286), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트 (SPDP) (미국 특허 번호 5,204,098), 아디프산 디하이드라지드 (ADH) (미국 특허 번호 4,965,338), C4 내지 C12 모이어티 (미국 특허 번호 4,663, 160), 등을 포함한다. 카르보디이미드 축합이 또한 이용될 수 있다 (WO2007/000343).

사카라이드에서 아민 기로의 커플링을 위한 제 1 기 (예를 들어, 아민화에 의해 폴리사카라이드로 유입됨) 및 담체에 커플링하기 위한 제 2 기 (전형적으로, 담체의 아민에 커플링시키기 위한)를 제공하기 위해 이작용성 링커가 사용될 수 있다. 대안적으로, 제 1 기는 직접 즉, 기 예를 들어, 아민 기의 폴리사카라이드로의 사전 도입 없이 폴리사카라이드로 직접 커플링될 수 있다.

일부 구체예에서, 따라서 이작용성 링커의 제 1 기는 폴리사카라이드상에서 아민 기 (-NH2)와 반응할 수 있다. 이러한 반응은 전형적으로 아민의 수소의 친전자성 치환을 포함할 것이다. 또 다른 구체예에서, 이작용성 링커에서 제 1 기는 폴리사카라이드와 직접적으로 반응할 수 있다. 두 세트 모두의 구체예에서, 이작용성 링커의 제 2 기는 전형적으로 담체 펩티드 상의 아민 기와 반응할 수 있다. 이러한 반응은 다시 전형적으로 아민의 친전자성 치환을 포함할 것이다.

폴리사카라이드 및 담체 단백질 둘 모두와의 반응이 아민을 포함하는 경우, 그러면 이작용성 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 화학식 X-L-X의 동종이작용성 링커가 사용될 수 있다: 여기에서, 2개의 X 기는 서로 동일하며, 아민과 반응할 수 있으며; L은 링커의 결합 모이어티이다. 유사하게는, 화학식 X-L-X의 이종이작용성 링커가 사용될 수 있다: 여기에서, 2개의 X 기는 상이하며, 아민과 반응할 수 있으며; L은 링커의 결합 모이어티이다. 바람직한 X 기는 N-옥시숙신이미드이다. L은 바람직하게는, 화학식 L'-L²-L'을 가지며, 여기에서 L'는 카르보닐이다. 바람직한 L² 기는 1 내지 10개 탄소 원자 (예를 들어, C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀)의 직쇄 알킬 예를 들어, -(CH₂)₄- 또는 -(CH₂)₃-이다.

선행 문단에 기술된 이작용성 링커에 사용하기 위한 그 밖의 X 기는 HO-L-OH과 조합되는 경우 에스테르를 형성하는 것들 예컨대, 노르보란, p-니트로벤조산 및 설포-N-하이드록시숙신이미드이다.

본 발명에 사용하기 위한 추가의 이작용성 링커는 아크릴로일 할라이드 (예를 들어, 클로라이드) 및 할로아실할라이드를 포함한다.

링커는 일반적으로 폴리사카라이드로의 커플링 동안 폴리사카라이드에 몰 과량으로 첨가될 것이다.

컨주게이션 후, 자유 및 컨주게이팅된 사라카이드가 분리될 수 있다. 많은 적합한 방법 예를 들어, 암모늄 설페이트 침전, 소수성 크로마토그래피, 접선 초미세여과, 투석여과 등이 존재한다 (또한, 문헌 [Lei et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264] 및 WO00/38711 참조). 접선 흐름 초미세여과가 바람직하다.

컨주게이트의 사카라이드 모이어티는 하기 정의된 바와 같이 고분자량, 저분자량 및 중간 분자량 폴리사카라이드일 수 있다 (사카라이드 면역원에 대한 섹션 참조). 올리고사카라이드는 전형적으로 컨주게이션 전에 크기 결정될 것이다.

담체 펩티드-사카라이드 컨주게이트는 바람직하게는, 물 및/또는 생리 완충액에 용해성이다.

일부 사카라이드에 있어서, 폴리사카라이드와 담체 단백질 사이에 스페이서가 존재하는 경우 면역원성이 향상될 수 있다. 이러한 상황에서, "스페이서"는 단일 공유 결합보다 긴 모이어티이다. 이러한 스페이서는 상기 기술된 바와 같이 링커 (예를 들어, KMUH 링커)일 수 있다. 대안적으로, 폴리사카라이드와 링커 사이에 공유적으로 결합된 모이어티일 수 있다. 전형적으로, 모이어티는 링커 또는 담체로의 커플링 전에 폴리사카라이드에 공유적으로 결합될 것이다. 예를 들어, 스페이서는 모이어티 Y일 수 있으며, 여기에서 Y는 1 내지 15개의 탄소 원자 (예를 들어, C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅), 전형적으로, 6 내지 12개의 탄소 원자 (예를 들어, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂)의 직쇄 알킬을 포함한다. 본 발명자들은 10개 탄소 원자의 직쇄 알킬 (즉, -(CH₂)₁₀)이 특히 적합하며, 더 짧은 사슬 (예를 들어, -(CH₂)₂)보다 더 큰 면역원성을 제공할 수 있다. 전형적으로, Y는 일반적으로, -O-결합을 통해 폴리사카라이드의 아노머 탄소에 부착된다. 그러나, Y는 폴리사카라이드의 다른 부분에 및/또는 다른 결합을 통해 연결될 수 있다. Y의 다른 말단은 임의의 적합한 결합에 의해 링커에 결합된다. 전형적으로, Y는 상기 기술된 바와 같이 이작용성 링커로의 결합을 조장하기 위한 아민 기로 종결된다. 이들 구체예에서, 따라서, Y는 -NH- 결합을 통해 링커에 결합된다. 따라서, 하기 구조를 갖는 컨주게이트는 본 발명에 사용될 것으로 특별히 예상된다: 여기에서, n+2는 2-60, 예를 들어, 10-50 또는 2-40의 범위이다. 바람직하게는, n+2는 25-30 또는 11-19, 예를 들어, 13-17의 범위이다. 본 발명자들은 n+2 = 15가 적합함을 발견하였다. Y는 상기 기술된 바와 같다.

일 양태에서, 본 발명은 담체 펩티드(들)에 컨주게이팅된 사카라이드를 제조하는 방법으로서, 컨주게이션 단계가 >10mM 포스페이트를 갖는 포스페이트 완충액에서 수행되는 방법; 및 이러한 방법에 의해 수득된 컨주게이트를 제공한다. 본 발명자들은 소듐 포스페이트가 완충액을 위한 포스페이트의 적합한 형태인 것으로 밝혀졌다. 완충액의 pH는 7.0-7.5, 특히, 7.2로 조절될 수 있다. 컨주게이션 단계는 전형적으로, 20-200 mM 포스페이트, 예를 들어, 50-150 mM 포스페이트를 갖는 포스페이트 완충액에서 수행된다. 특히, 본 발명자들은 90-110 mM, 예를 들어, 약 100 mM 포스페이트를 갖는 포스페이트 완충액이 적합함을 발견하였다. 컨주게이션 단계는 일반적으로 실온에서 수행된다. 유사하게는, 컨주게이션 단계는 일반적으로 실온에서 수행된다. 전형적으로, 사카라이드는 컨주게이션 단계 전에 상기 기술된 바와 같은 링커에 부착된다. 특히, 사카라이드는 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 이작용성 링커에 부착될 수 있다. 링커(들)의 자유 말단은 담체 펩티드(들)로의 컨주게이션을 조장하기 위한 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 링커의 자유 말단이 에스테르 기 예를 들어, N-하이드록시숙신이미드 에스테르 기를 포함할 수 있음을 발견하였다.

본원에 기재된 사카라이드 컨주게이트는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 기재된 사카라이드 컨주게이트는 애주번트를 추가로 포함할 수 있다. 애주번트는 하기 기술된 애주번트 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

사카라이드 컨주게이트가 또한, 본 발명의 조성물을 포유동물 (또는 조류)에 투여하는 것을 포함하여, 포유동물 (또는 조류)에서 면역 반응을 발생시키는 방법에 사용될 수 있다.

사카라이드 면역원

포유동물 또는 조류에서 면역 반응을 유발시킬 수 있는 임의의 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드는 본원에 기술된 바와 같이 비선형 사카라이드 컨주게이트 및 선형 사카라이드 컨주게이트 (즉, 사카라이드 면역원)에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 사카라이드는 관심 병원체에 대한 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 사카라이드는 분지형 또는 선형일 수 있다.

저분자량 사카라이드 특히, 100 kDa 미만 (예를 들어, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 또는 15 kDa 미만)의 분자량을 갖는 사카라이드가 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, 60 개 또는 그 미만 (예를 들어, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4)의 모노사카라이드 단위체를 함유하는 올리고사카라이드를 사용하는 것이 가능하다. 이러한 범위내에서, 10 내지 50 또는 20 내지 40개 모노사카라이드 단위체를 갖는 올리고사카라이드가 바람직하다.

고분자량 또는 심지어 천연 폴리사카라이드 특히, 50 kDa 초과 (예를 들어, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 270, 300, 350, 또는 400 kDa 초과)의 분자량을 갖는 폴리사카라이드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 20개 또는 그 초과 (예를 들어, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100)의 모노사카라이드 단위체를 함유하는 사카라이드를 사용하는 것이 또한 가능하다. 이러한 범위내에서, 50개 초과 또는 심지어 100개 초과의 모노사카라이드 단위체를 갖는 사카라이드가 바람직하다.

예시적인 사카라이드 면역원이 하기 상세히 설명되어 있다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물 중 컨주게이트의 사카라이드 면역원은 박테리아 사카라이드이며, 특히 박테리아 캡슐 사카라이드이다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 박테리아 캡슐 사카라이드의 예는 나이세리아 메닌기티디스 (혈청군 A, B, C, W135 및/또는 Y), 스트렙토코커스 뉴모니애 (혈청군 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F, 특히, 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및/또는 23F), 스트렙토코커스 아갈락티애 (타입 1a, 1b, II, III, IV, V, VI, VII, 및/또는 VIII, 예컨대, 참고 문헌 20-23에 기재된 사카라이드 항원), 해모필루스 인플루엔자 (피막형 균주: a, b, c, d, e 및/또는 f), 슈도모나스 애루기노사 (예를 들어, PA01, O5 혈청형으로부터 분리된 LPS), 스타필로코커스 아우레우스 (예를 들어, 혈청군 5 및 8로부터), 엔테로코커스 패칼리스 또는 E. 패시움 (트리사카라이드 반복부), 예르시니아 엔테로콜리티카, 비브리오 콜레라, 살모넬라 타이피, 클레브시엘라 종, 등으로부터의 캡슐 사카라이드를 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 그 밖의 사카라이드는 글루칸 (예를 들어, 진균 글루칸 예컨대, 캔디다 알비칸스의 글루칸) 및 진균 캡슐 사카라이드 예를 들어, 크립토코커스 네오포르만스의 캡슐로부터의 사카라이드를 포함한다.

N. 메닌기티디스: 특정 구체예에서, 컨주게이트 조성물은 나이세리아 메닌기티디스의 혈청군 A, C, W135 및 Y중 적어도 2개로부터의 캡슐 사카라이드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 이러한 조성물은 하기 중 하나 이상으로부터의 항원을 추가로 포함한다: (a) N. 메닌기티디스; (b) 해모필루스 인플루엔자 타입 B; 스타필로코커스 아우레우스, 그룹 A 및 B 스트렙토코커스, 병원체 E. 콜라이, 및/또는 (c) 스트렙토코커스 뉴모니애.

천연 N. 메닌기티디스 혈청군 A (MenA) 캡슐은 C3 및 C4 위치에서 부분 O-아세틸화된 (a1→6)-연결된 N-아세틸-D-만노스아민-1-포스페이트의 호모폴리머이다. N. 메닌기티디스 혈청군 B (MenB) 캡슐은 (a2→8)-연결된 살리신산의 호모폴리머이다. N. 메닌기티디스 혈청군 C (MenC) 캡슐 사카라이드는 7번 및/또는 8번 위치에서 가변성 O-아세틸화된 (a2→9) 연결된 살리실산의 호모폴리머이다. N. 메닌기티디스 혈청군 W135 사카라이드는 살리실산-갈락토스 디사카라이드 단위체 [→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→)를 갖는 폴리머이다. 이는 살리실산의 7번 및 9번 위치에서 가변적으로 O-아세틸화된 것이다. N. 메닌기티디스 혈청군 Y 사카라이드는 디사카라이드 반복 단위체가 갈락토스 대신에 글루코스 [→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→)를 포함한다는 점을 제외하고는 혈청군 W135 사카라이드와 유사하다. 이는 또한, 살리실산의 7번 및 9번 위치에서 가변적으로 O-아세틸화된 것이다.

특정 구체예에서, 컨주게이트 조성물은 N. 메닌기티디스의 혈청군 C, W135 & Y로부터의 캡슐 사카라이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 컨주게이트 조성물은 N. 메닌기티디스의 혈청군 A, C, W135 & Y로부터의 캡슐 사카라이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 컨주게이트 조성물은 H. 인플루엔자 타입 B 및 N. 메닌기티디스의 혈청군 C, W135 & Y로부터의 캡슐 사카라이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 컨주게이트 조성물은 H. 인플루엔자 타입 B 및 N. 메닌기티디스의 혈청군 A, C, W135 & Y로부터의 캡슐 사카라이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 컨주게이트 조성물은 S. 뉴모니애 및 N. 메닌기티디스의 혈청군 C, W135 & Y로부터의 캡슐 사카라이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 컨주게이트 조성물은 S. 뉴모니애 및 N. 메닌기티디스의 혈청군 A, C, W135 & Y로부터의 캡슐 사카라이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 컨주게이트 조성물은 H. 인플루엔자 타입 B, S. 뉴모니애 및 N. 메닌기티디스의 혈청군 C, W135 & Y로부터의 캡슐 사카라이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 컨주게이트 조성물은 H. 인플루엔자 타입 B, S. 뉴모니애 및 N. 메닌기티디스의 혈청군 A, C, W135 & Y로부터의 캡슐 사카라이드를 포함한다.

스트렙토코커스 뉴모니애: 스트렙토코커스 뉴모니애 사카라이드 컨주게이트는 사카라이드 (폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드 포함) 및 선택적으로 스트렙토코커스 뉴모니애로부터의 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 사카라이드 항원은 혈청군 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 1OA, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로부터 선택될 수 있다. 선택적인 단백질 항원은 WO98/18931, WO98/18930, 미국 특허 번호 6,699,703, 미국 특허 번호 6,800,744, WO97/43303, 및 WO97/37026에서 확인된 단백질로부터 선택될 수 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질은 폴리 히스티딘 트라이드 (Poly Histidine Triad) 패밀리 (PhtX), 콜린 바인딩 프로테인 (Choline Binding Protein) 패밀리 (CbpX), CbpX 절두물, LytX 패밀리, LytX 절두물, CbpX 절두물-LytX 절두물 키메라 단백질, 뉴모라이신 (Ply), PspA, PsaA, Spl28, SpIOl, Spl30, Spl25 또는 Spl33로부터 선택될 수 있다.

스타필로코커스 아우레우스: 스타필로코커스 아우레우스 사카라이드 컨주게이트는 S. 아우레우스 타입 5, 8 및 336 캡슐 사카라이드 및 이의 단편, 및 선택적으로 표면 단백질로부터의 단백질 항원, 인베이신 (류코시딘, 키나제, 히알루로니다제), 포식세포 포식을 억제하는 표면 인자 (캡슐, 단백질 A), 카로테노이드, 카탈라제 생성, 단백질 A, 코아굴라제, 응고 인자 및/또는 진핵세포 세포 막을 용해시키는 막-손상 독소 (선택적으로 탈소화됨) (헤모라이신, 류코톡신, 류코시딘)을 포함할 수 있다. S. 아우레우스 캡슐 사카라이드의 단편을 생성시키는 예시적인 탈중합 방법은 미국 일련 번호 61/247,518 ("Conjugation of Staphylococcus Aureus 타입 5 and 타입 8 Capsular Polysaccharides", filed Sept. 30, 2009, from page 5, line 6 through page 6, line 23)에서 찾아볼 수 있으며, 이는 이러한 탈중합 기법의 이러한 교시에 대한 참조로 통합된다.

해모필루스 인플루엔자 B ( Hib ) : Hib 사카라이드 컨주게이트는 Hib 사카라이드 항원을 포함할 수 있다.

스트렙토코커스 아갈락티애 (그룹 B 스트렙토코커스 ): 그룹 B 스트렙토코커스 사카라이드 컨주게이트는 WO04/041157에서 확인된 바와 같은 혈청군 Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII로부터 유래된 사카라이드 항원 및 선택적으로, 비제한적으로 WO02/34771, WO03/093306, WO04/041157, 또는 WO05/002619에서 확인된 바와 같은 것을 포함하는 하나 이상의 단백질 항원 (예를 들어, 단백질 GBS 80, GBS 104, GBS 276 및 GBS 322 포함)을 포함할 수 있다.

비브리오 콜레라: V. 콜레라 사카라이드 컨주게이트는 LPS 특히, 비브리오 콜레라 II, O1 Inaba O-특이적 폴리사카라이드를 포함할 수 있다.

살모넬라 타이피 (장티푸스): 사카라이드 컨주게이트는 캡슐 폴리사카라이드 예컨대, Vi를 포함할 수 있다.

글루칸 사카라이드: 컨주게이트를 위한 사카라이드는 글루칸을 포함한다. 글루칸은 특히, 병원체, 진균 세포 벽에서 발견된 글루코스-함유 폴리사카라이드이다. β-글루칸은 글루코스 아단위체 간의 하나 이상의 α-결합을 포함하는 반면, β-글루칸은 글루코스 아단위체간의 하나 이상의 β-결합을 포함한다. 본 발명에 따라 사용된 글루칸은 β-결합을 포함하며, 단지 β-결합만 함유할 수 있다 (즉, α 결합 비함유).

글루칸은 하나 이상의 β-l,3-결합 및/또는 하나 이상의 β-l,6-결합을 포함할 수 있다. 이는 또한, 하나 이상의 β-l,2-결합 및/또는 β-l,4-결합을 포함할 수 있으나, 일반적으로 이의 유일한 β 결합은 β-1,3-결합 및/또는 β-l,6-결합일 것이다.

글루칸은 분지형 또는 선형일 수 있다.

전장 천연 β-글루칸은 불용성이며, 메가달톤 범위의 분자량을 갖는다. 본 발명의 면역원성 조성물에 가용성 글루칸을 사용하는 것이 바람직하다. 용해화는 긴 불용성 글루칸을 절편화함으로써 달성될 수 있다. 이는 가수분해 또는, 더욱 편리하게는, 글루카나제 (예를 들어, β-1,3-글루카나제 또는 β-1,6-글루카나제)로의 분해에 의해 달성될 수 있다. 대안으로서, 짧은 글루칸이 모노사카라이드 빌딩 블록을 연결함으로써 합성적으로 제조될 수 있다.

저분자량 글루칸 특히, 100 kDa 미만 (예를 들어, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 또는 15 kDa 미만)의 분자량을 갖는 글루칸이 사용될 수 있다. 예를 들어, 60개 또는 그 미만 (예를 들어, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4개)의 글루코스 모노사카라이드 단위체를 함유하는 올리고사카라이드를 사용하는 것이 또한 가능하다. 이러한 범위내에서, 10 내지 50개 또는 20 내지 40개 모노사카라이드 단위체를 갖는 올리고사카라이드가 바람직하다.

고분자량 또는 심지어 글루칸 특히, 50 kDa 초과 (예를 들어, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 270, 300, 350, 또는 400 kDa 초과)의 분자량을 갖는 글루칸이 또한, 사용될 수 있다. 예를 들어, 20개 또는 그 초과 (예를 들어, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개) 모노사카라이드 단위체를 함유하는 사카라이드를 사용하는 것이 또한 가능하다. 이러한 범위내에, 50개 초과 또는 100개 초과의 모노사카라이드 단위체를 갖는 사카라이드가 바람직하다.

글루칸은 진균류 글루칸일 수 있다. "진균류 글루칸"은 일반적으로, 진균류로부터 수득될 것이며, 여기에서 특정 글루칸 구조가 진균류 및 비-진균류 (예를 들어, 박테리아, 하등 식물 또는 조류 (algae)) 둘 모두에서 발견되며, 따라서, 비-진균류 유기체가 대안적 공급원으로서 사용될 수 있다. 따라서, 글루칸은 캔디다 예컨대, C. 알비칸스의 세포 벽, 또는 콕키디오이데스 임미티스, 트리코파이톤 베루코섬, 블라스토마이세스 데르마티디스, 크립토코커스 네오포르만스 , 히스토플라즈마 캅술라툼, 사카로마이세스 세레비시애, 파라콕키디오이데스 브라실리엔시스, 또는 피티움 인시디오섬으로부터 유래될 수 있다. 진균류 β-글루칸의 예시적인 공급원은 WO2009/077854에서 찾아볼 수 있다.

일부 구체예에서, 글루칸은 예를 들어, 라미나린에서 볼 수 있는 일부 β-1,6 분지를 갖는 β-1,3 글루칸이다. 라미나린은 갈색 조류 및 해조에서 발견된다. 라미나린의 β(1-3):β(1-6) 비는 다양한 공급원간에 다양하며, 예를 들어, 비는 아이세니아 비사이클리스 (Eisenia bicyclis) 라미나린에서 3:2로 낮으나, 라미나리아 디기티타타 (Laminaria digititata) 라미나린에서는 7:1로 높다 (Pang et al. (2005) Biosci Biotechnol Biochem 69:553-8). 따라서, 본 발명에 사용되는 글루칸은 1.5:1 내지 7.5:1 (예를 들어, 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 또는 7:1)의 β(1-3):β(1-6) 비를 가질 수 있다. 선택적으로, 글루칸은 말단 만니톨 아단위체 예를 들어, 1,1-α-연결된 만니톨 잔기를 가질 수 있다 (Read et al. (1996) Carbohydr Res. 281:187-201). 글루칸은 또한 만노스 아단위체를 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 글루칸은 커들란에서 볼 수 있는 바와 같은 β-1,3 결합을 독점적인 또는 대부분 갖는다. 본 발명자들은 이들 글루칸이 다른 결합을 포함하는 글루칸 특히, β-1,3 결합 및 더 높은 비율의 β-1,6 결합을 포함하는 글루칸보다 더욱 면역원성일 수 있음을 발견하였다. 따라서, 글루칸은 β-1,3-연결된 글루코스 잔기 (독점적으로 1,3 결합을 갖는 선형의 β-D-글루코피라노스) 단독으로 이루어질 수 있다. 그렇지만 선택적으로, 글루칸은 β-1,3-연결된 글루코스 잔기가 아닌 모노사카라이드 잔기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 이는 β-1,6-연결된 글루코스 잔기를 포함할 수 있다. β-1,3-연결된 글루코스 잔기 대 이들 다른 잔기의 비는 적어도 8:1 (예를 들어, >9:1, >10:l, > 11:1, >12:1, >13:1, >14:1, >15:1, >16:1, >17:1, >18:1, >19:1, >20:l, >25:1, >30:l, >35:1, >40:l, >45:1, >50:l, >75:1, >100:l, 등등)이어야 하며/거나 단지 β-1,3 결합에 의해서만 다른 잔기에 연결된 하나 이상 (예를 들어, >1, >2, >3, >4, >5, >6, >7, >8, >9, >10, > 11, >12, 등등)의 서열의 적어도 5개 (예를 들어, >5, >6, >7, >8, >9, >10, >11, >12, >13, >14, >15, >16, >17, >18, >19, >20, >30, >40, >50, >60, 등등)의 근접한 비-말단 잔기가 존재한다. "비-말단"은, 이러한 잔기가 글루칸의 자유 말단에 존재하지 않음을 의미한다. 일부 구체예에서, 근접한 비-말단 잔기는 하기 기술된 바와 같은 담체 분자, 링커 또는 그 밖의 스페이서로 컨주게이팅된 임의의 잔기를 포함할 수 있다. 단지 β-1,3 결합에 의해서만 다른 잔기에 연결된 5개의 근접한 비-말단 잔기의 존재는 예를 들어, C. 알비칸스에 대한 보호성 항체 반응을 제공할 수 있음이 밝혀졌다.

추가의 구체예에서, 조성물은 2개의 상이한 글루칸 예를 들어, 1.5:1 내지 7.5:1의 β(1-3):β(1-6) 비를 갖는 제 1 글루칸 및 β-1-3 결합을 갖는 제 2 글루칸을 독점적으로 또는 대부분 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 라미나린 글루칸 및 커들란 글루칸 둘 모두를 포함할 수 있다.

β-글루칸을 제조하기 위한 예시적인 방법은 WO2009/077854에서 찾아볼 수 있다.

라미나린 및 커들란은 전형적으로, 고분자량 폴리머로서 예를 들어, 적어도 100kDa의 분자량을 갖는 폴리머로서 자연에서 발견된다. 이들은 종종 수성 매질에서 불용성이다. 따라서, 이들의 천연 형태에서, 이들은 면역화에 매우 적합하지 않다. 더욱 친수성인 펩티드와의 비선형 폴리컨주게이션은 이러한 용해성 문제를 극복하여 이러한 고분자량 폴리머가 컨주게이트로서 면역화에 적합하도록 할 수 있다. 특히, 하기 구조식 (A) 또는 (B)를 갖는 글루칸이 특히 본 발명에 사용되는 것으로 예상된다:

상기 식에서, n+2는 2-60, 예를 들어, 10-50 또는 2-40의 범위이다. 바람직하게는, n+2는 25-30 또는 11-19, 예를 들어, 13-17의 범위이다. 본 발명자들은 n+2 = 15이 적합함을 발견하였다.

상기 식에서, n은 0-9, 예를 들어, 1-7 또는 2-6의 범위이다. 바람직하게는, n은 3-4 또는 1-3의 범위이다. 본 발명자들은 n = 2이 적합함을 발견하였다.

글루칸 (상기 정의된 바와 같음)은 바람직하게는, 단일 분자 종이다. 이러한 구체예에서, 글루칸 분자 모두는 서열에 있어서 동일하다. 따라서, 글루칸 분자 모두는 분자량 등을 포함하는 이들의 구조적 특성에 있어서 동일하다. 전형적으로, 이러한 형태의 글루칸은 예를 들어, 상기 기술된 방법을 이용하는 화학 합성에 의해 달성된다. 예를 들어, 문헌 [Jamois et al. (2005) Glycobiology 15(4):393-407]은 단일 β-1,3 연결된 종의 합성을 기술한다. 대안적으로, 또 다른 구체예에서, 글루칸은 천연 글루칸, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 L. 디지타타, 아그로박테리움 또는 유글레나 (Euglena)로부터의 클루칸으로부터 수득될 수 있으며, 글루칸은 요망되는 단일 분자 종이 수득 될 때까지 정제된다. 이러한 방식으로 정제된 천연 글루칸은 시중에서 입수가능하다. 단일 분자 종인 글루칸은 글루칸 샘플의 다분산도 (Mw/Mn)를 측정함으로써 식별될 수 있다. 이러한 변수는 편리하게는, 예를 들어, 문헌 [Bardotti et al . (2008) Vaccine 26:2284-96]에 기술된 바와 같이 SEC-MALLS에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 이러한 구체예에 사용하는데 적합한 글루칸은 약 1 예를 들어, 1.01 또는 그 미만의 분산도를 갖는다.

천연 글루칸 예컨대, 커들란의 용해도는 이온 기를 도입함으로써 (예를 들어, 특히 커들란의 0-6번에서 황산화시킴으로써) 증가될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명에 이용될 수 있으나, 이들이 글루칸의 항원성을 변경시킬 수 있기 때문에 이상적으로는 회피된다.

글루칸이 천연 공급원으로부터 분리되는 경우, 이들은 오염물과 조합되어 분리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 글루칸이 자외선-가시선 (UV/VIS) 분광학에 의해 식별가능한 플로로탄닌으로 오염될 수 있음을 발견하였다. 이러한 문제는 글루칸이 갈색 조류 또는 해조류로부터 분리되는 경우 특히 일반적이다. 예를 들어, 라미나리아 디지타타로부터 추출된 시중에서 입수가능한 라미나린의 UV 스펙트럼은 플로로탄닌 오염물의 존재로부터 발생한 흡수 피크를 포함한다. 유사하게는, 아르티에 라미나리알리스 (Artie laminarialis), 사코르히자 데르마토데아 (Saccorhiza dermatodea) 및 알라리아 에스쿨렌타 (Alaria esculenta)로부터 추출된 글루칸은 플로로탄닌 오염물로부터 발생한 흡수 피크를 포함하는 UV 스펙트럼을 갖는다.

글루칸 샘플중의 플로로탄닌의 존재는 글루칸의 생물학적 특성에 영향을 끼칠 수 있다. 따라서, 특히, 글루칸이 본 발명의 많은 양태에서 의학적 용도를 위한 경우 샘플로부터 플로로탄닌을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. β-글루칸으로부터 플로로탄닌을 제거하는 예시적인 방법은 WO2009/077854에서 찾아볼 수 있다.

담체 펩티드

상기 논의된 바와 같이, 폴리사카라이드는 전형적으로 약한 T-의존성 항원이다. 이러한 면역원성은 단백질 담체로의 컨주게이션에 의해 양 및 질에 있어서 증가될 수 있으며, 이러한 담체는 면역 반응을 더욱 T-세포 의존적인 반응으로 이동시킨다. 도 1에 도시된 바와 같이, 최근 모델은 컨주게이트가 항원 제시 세포 내부에서 처리되고, 펩티드 또는 글리코펩티드로 분해되고, 이들이 주조직접합성 복합체 (MHC) 클래스 II 단백질에 의해 제시되는 것이다: 이어서, 담체-특이적 T 세포와의 추가의 상호작용은 폴리사카라이드-특이적 B-세포 분화를 유도하여 항체 생성 및 기억에 대한 자극을 제공한다. 결과적으로, 컨주게이트 백신은 생애 초기에 이미 T-세포 의존성 (TD) 반응을 유도하며, 이는 면역학적 기억 및 백신의 추가 접종에 의한 반응의 부스팅으로 이어진다 [Costantino, P. et al. Expert Opin . Drug Discov. 2011, 6(10), 1045-1066].

대안적 담체의 연구에서, 다른 연구자들은 담체 단백질을 선택된 CD4+ T 세포 에피토프를 함유하는 합성 펩티드로 대체시켰다 [Falugi, F. et al. Eur . J. Immunol, 2001, 31, 3816-3824]. 문헌에서, 일부 논문은 글리코펩티드의 제조를 보고하였으며, 여기에서 전체 담체 단백질은 통상적인 글리코컨주게이트 백신에 필적하거나 더 높은 면역 반응을 유도하는 T-세포 에피토프 펩티드로 치환되었다. 해모필루스 인플루엔자 타입 b (Hib)에 대한 백신의 개발에 있어서, 캡슐 폴리사카라이드의 합성 단편인 폴리-3-β-D-리보스-(1,1)-D-리비톨-5-포스페이트 (sPRP)는 Hib 외막 단백질 P1, P2 및 P6로부터 유래된 합성 펩티드에 컨주게이팅되었다. 이러한 합성 글리코펩티드는 항-PRP 항체 반응을 유발시키는 면역원성이며, 게다가, 이들은 항-PRP 항체의 보호 수준을 유도하였다 [Kandil, A.A. et al . Glycoconjugate Journal, 1997, 14, 13-17].

스트렙토코커스 뉴모니애 타입 17F에 대한 백신에 있어서, 담체 단백질을 치환하기 위해, 일부 펩티드는 이들의 입증되거나 예측된 Th-세포-자극 특성을 기반으로 선택되었다: HSP, 마이코박테리아 hsp65로부터의 우세한 Th 에피토프; 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌으로부터의 HAG; 뉴모라이신 (또는 이의 톡소이드). 사카라이드 항원으로서, 뉴모코커스 폴리사카라이드 타입 17F (PS)이 선택되었으며, 생성된 글리코펩티드는 마우스에서 항-PS IgM 및 IgG 반응을 일관되게 유발시켰다 [De Velasco, E.A. et al. Infection and Immunity, 1995, 63, 961-968].

도 2에 도시된 바와 같이, 아브실 (Avcil) 등은 글리코컨주게이트 백신에 대한 새로운 작업 모델을 제안하였으며, 여기에서 글리코컨주게이트의 단백질 및 탄수화물 부분 둘 모두의 처리는 글리칸_p-펩티드를 발생시켰다. 글리칸_p-펩티드의 펩티드 부분의 MHCII 결합은 더욱 친수성인 탄수화물의 MHCII에 의한 CD4+ T 세포의 αβ 수용체 (αβTCR)로의 제시를 허용하였다. CD4+ T 헬퍼 세포의 αβ 수용체는 MHCII의 상황에서 제시된 글리칸_p 에피토프를 인식하고 이에 반응하였다. 공동-자극과 함께 탄수화물-MHCII에 의한 T 세포의 활성화는 사이토카인 예컨대, IL-4 및 IL-2의 T 세포 생성을 발생시켰으며, 이는 이어서 동종 B 세포의 성숙을 유도하여 기억 B 세포가 되게 하고, 그 결과 하기 도면에 보고된 바와 같이 탄수화물-특이적 IgG 항체를 생성하였다. 요약하자면, 이러한 작업 모델에 따르면, 원형 GBS 타입 III-TT 컨주게이트상에서 결합되는 T 세포가 펩티드와 상관없이 순수한 탄수화물 에피토프의 T 세포 클론의 인식에 의해 입증되는 바와 같이, T 세포는 폴리사카라이드 및 가능하게는, 이들이 펩티드 앵커에 의해 공유적으로 결합되는 경우 다른 구조물을 인식할 수 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 컨주게이트에 사용하기 위한 T-세포 에피토프의 선택에 대해 당업자에게 설명해 줄 수 있는 상당한 양의 문헌이 존재한다.

담체 펩티드는 하나의 이상의 T-세포 에피토프 (예를 들어. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 그 초과)를 포함할 수 있다. 컨주게이트에 있어서, 담체 펩티드는 바람직하게는, 6개 또는 그 미만의 T-세포 에피토프, 5개 또는 그 미만의 T-세포 에피토프, 4개 또는 그 미만의 T-세포 에피토프, 3개 또는 그 미만의 T-세포 에피토프, 6개 또는 그 미만의 T-세포 에피토프, 또는 단지 하나의 T-세포 에피토프를 갖는다. 폴리에피토프 담체 펩티드에 있어서, 담체 펩티드는 바람직하게는, 6개 또는 그 초과의 T-세포, 에피토프 또는 10개 또는 그 초과의 T-세포 에피토프를 포함하며, 여기에서, 적어도 하나의 에피토프는 PV1 에피토프이다. 더욱 바람직하게는, 폴리에피토프 담체 펩티드는 19개 또는 그 초과의 T-세포 에피토프를 포함하며, 여기에서 적어도 하나 에피토프는 PV1 에피토프이다. 담체 펩티드는 바람직하게는, 적어도 하나의 PV1 T-세포 에피토프, 적어도 2개의 PV1 T-세포 에피토프, 적어도 3개의 PV1 T-세포 에피토프, 적어도 4개의 PV1 T-세포 에피토프, 적어도 5개의 PV1 T-세포 에피토프, 적어도 하나의 PV1 T-세포 에피토프를 포함하거나, T-세포 에피토프 모두는 PV1 T-세포 에피토프일 수 있다. 각각의 담체 펩티드는 특정 에피토프의 단지 하나의 복사체를 가질 수 있거나 특정 에피토프의 하나 초과의 복사체를 가질 수 있다. 에피토프는 CD4⁺ T-세포 에피토프이다. 바람직하게는, 폴리에피토프 담체 펩티드는 PV1 바이러스 에피토프 이외에 적어도 하나 박테리아 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 에피토프는 인간 개체군이 천연 감염 또는 백신화에 의해 빈번하게 노출되는 항원으로부터 유래되며, 예를 들어, 에피토프는 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수두-조스터 바이러스, 폴리오바이러스, 마이코박테리움 보비스로부터의 열 쇼크 단백질 및 M. 레프래 및/또는 스트렙토코커스 균주 등으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 에피토프는 파상풍 독소 (TT), 플라스모듐 팔시파럼 (Plasmodium falciparum) CSP (PfC), B형 간염 바이러스 핵 캡시드 (HBVnc), 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA), HBV 표면 항원 (HBsAg) 및 인플루엔자 매트릭스 (MT)로부터 선택된다. 담체 펩티드에 사용된 에피토프는 바람직하게는, 하기 표 1에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 에피토프는 PV1 에피토프이다.

에피토프 서열중 임의의 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 (또는 그 초과)의 단일 아미노산 변경 (결실, 삽입, 치환)을 가질 수 있으며, 이는 SEQ ID NO 1-18 대비 분리되어 위치할 수 있거나 연속성일 수 있다.

T 세포 에피토프는 널리 공지되어 있으며, 주조직접합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 제시되는 경우, 항원-제시 세포의 표면으로 수송된 후의 T 세포 수용체와 상호작용하는 병원체로부터 전형적으로 유래된 항원성 펩티드 단편을 특성결정한다. 실험적으로 측정된 친화성 데이타는 다양한 MHC 결합 예측 알고리즘을 개발하기 위해 사용되었으며, 이는 펩티드 서열을 기반으로 하는 비-결합제로부터 결합제를 구별할 수 있다 [Davies, m.N.; Flower, D.R. Harnessing bioinformatics to discover new vaccines Drug Discovery Today, 2007, 12 (9/10) , 389-395;]. 이러한 알고리즘은 본원에 기재된 컨주게이트에 사용하기 위한 추가적인 T-세포 에피토프를 선택하는데 이용될 수 있다.

담체 펩티드에 다중 에피토프가 존재하는 경우, 에피토프는 바람직하게는 스페이서에 의해 연결된다. 바람직하게는, 스페이서는 에피토프가 아닌 짧은 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개) 아미노산 서열이다. 바람직한 스페이서는 하나 이상의 글리신 잔기 예를 들어, -KG-를 포함한다. 바람직하게는, 더 긴 담체 펩티드는 담체 펩티드를 스크리닝하거나 정제하는데 유용한 면역친화성 태그인 6-His 테일 (예를 들어, 서열 "MDYKDDDD" [SEQ ID NO: 18]이 사용될 수 있음), 및/또는 프로테아제 절단 서열을 포함하는 N- 또는 C-말단 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단백질가수분해 서열은 인자 Xa 인식 부위이다.

바람직하게는, 담체 펩티드는 억제제 T 세포 에피토프를 포함하지 않는다.

T-세포 에피토프 이외에, 담체 펩티드는 그 밖의 펩티드 또는 단백질 단편 예컨대, 인터류킨-2 (IL-2) 또는 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)와 같은 면역조절 사이토카인으로부터의 에피토프를 포함할 수 있다.

본 발명에 사용되는 담체 펩티드는 다양한 방법 (예를 들어, 재조합 발현, 세포 배양물로부터의 정제, 화학 합성, 등등)으로부터 제조될 수 있다. 화학적으로 합성된 펩티드가 바람직한데, 특히, 담체 펩티드가 단지 하나 또는 소수개의 에피토프를 갖는 경우 바람직하다.

본 발명에 사용된 담체 펩티드는 바람직하게는, 정제된 또는 실질적으로 정제된 형태 즉, 실질적으로 다른 펩티드가 존재하지 않는 형태로 제공되며, 일반적으로 적어도 약 50% 순도 (중량 기준), 및 일반적으로 적어도 약 90% 순도이며, 즉 조성물의 약 50% 미만 및 더욱 바람직하게는, 약 10% 미만 (예를 들어, 5%)이 다른 발현된 펩티드로 이루어진다. 의혹을 없애고자, 사카라이드에 컨주게이팅된 정제된 또는 실질적으로 정제된 담체 펩티드가 백신의 성분으로서 사용되는 경우, 담체 펩티드는 다른 단백질 항원 및 세포 성분 (예를 들어, 다른 폴리사카라이드, 외막 수포, 등)의 존재에도 불구하고 여전히 "정제"되거나 "실질적으로 정제"된 것이다.

용어 "펩티드"는 임의의 길이의 아미노산 폴리머를 나타낸다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 비-아미노산에 의해 간섭될 수 있다. 이러한 용어는 또한, 천연적으로 또는 중재에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다; 예를 들어, 이황화물 결합 형성, 글리코실화, 리피드화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형 예컨대, 라벨링 성분과의 컨주게이션. 또한, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함)는 물론 당해 분야에 공지된 그 밖의 변형물을 함유하는 펩티드가 포함된다. 펩티드는 단일 사슬 또는 결합된 사슬로서 발생할 수 있다.

컨주게이트에 의해 대상체에서 발생한 면역 반응과 사카라이드 단독에 의해 발생한 면역 반응의 비교는 당업자가 이용가능한 임의의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 하기 실시예에 사용된 바와 같은 한 단순한 방법은 마우스와 같은 모델 대상체의 면역화 이어서, 치사량의 관심 병원체로의 챌린지를 포함한다. 메닝고코커스 컨주게이트와 같은 많은 조성물에 있어서, 마우스의 면역화 및 이어서 마우스 혈청의 박테리아 항체 포함의 입증이 전형적으로, 조성물이 보호성 면역 반응을 유발시킬 수 있음을 입증하는데 충분하다. 적합한 비교를 위해, 당업자는 알루미늄 애주번트와 같은 동일한 애주번트를 자연스럽게 선택할 것이다.

본 발명은 펩티드의 적어도 일부를 화학 수단에 의해 합성하는 단계를 포함하여, 본 발명의 담체 펩티드를 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 펩티드 발현을 유도하는 조건하에서 본 발명의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 본 발명의 펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 이어서, 펩티드는 예를 들어, 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다.

본 발명의 담체 펩티드의 발현이 동종 숙주에서 발생할 수 있지만, 본 발명은 일반적으로 발현을 위해 이종 숙주를 이용할 것이다. 이종 숙주는 원핵생물 (예를 들어, 박테리아) 또는 진핵생물일 수 있다. 적합한 숙주는 비제한적으로, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 비브리오 콜레라, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피무리움, 나이세리아 락타미카, 나이세리아 시네레아, 마이코박테리아 (예를 들어, M. 투베르쿨로시스), 효모 등을 포함한다.

면역원성 조성물 및 의약

본 발명의 사카라이드 컨주게이트는 면역원성 조성물에서 활성 성분 (면역원)으로서 유용하며, 이러한 조성물은 백신으로서 유용할 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 예방적 (즉, 감염 예방) 또는 치료적 (즉, 감염 치료)일 수 있으나, 전형적으로 예방적일 것이다.

면역원성 조성물은 약제학적으로 허용가능할 것이다. 이들은 일반적으로 항원 이외의 성분을 포함할 것이며, 예를 들어, 이들은 전형적으로 하나 이상의 약제학적 담체(들), 부형제(들) 및/또는 애주번트(들)을 포함한다. 담체 및 부형제에 대한 면밀한 논의는 참고 문헌 96에서 이용가능하다. 백신 애주번트의 면밀한 논의는 참고 문헌 1 및 2에서 이용가능하다.

조성물은 일반적으로, 수성 형태로 포유동물에 투여될 것이다. 그러나, 투여 전에 조성물은 비-수성 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 백신은 수성 형태로 제작되며, 이어서 수성 형태로 충전되고 분포되고 또한 투여되지만, 다른 백신은 제작 동안 동결건조되고, 사용 시점에 수성 형태로 재구성된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 동결건조된 제형과 같이 건조될 수 있다.

조성물은 보존제 예컨대, 티오머살 또는 2-페톡시에탄올을 포함할 수 있다. 그러나, 백신에는 수은 물질이 실질적으로 함유되지 않아야 하며 (즉, 5㎍/ml 미만), 예를 들어, 티오머살-비함유이다. 수은 비함유 백신이 더욱 바람직하다. 보존제-비함유 백신이 특히 바람직하다.

열 안정성을 향상시키기 위해, 조성물은 온도 보호제를 포함할 수 있다.

긴장성을 제어하기 위해, 생리학적 염 예컨대, 소듐 염을 포함하는 것이 바람직하다. 소듐 클로라이드 (NaCl)이 바람직하며, 이는 1 내지 20 mg/ml 예를 들어, 약 10±2mg/ml NaCl로 제공될 수 있다. 제공될 수 있는 그 밖의 염은 포타슘 클로라이드, 포타슘 디하이드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트 탈수화물, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 등을 포함한다.

조성물은 일반적으로, 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는, 240-360 mOsm/kg의 삼투압을 가질 것이며, 더욱 바람직하게는, 290-310 mOsm/kg의 범위내에 속할 것이다.

조성물은 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 전형적인 완충액은 하기를 포함한다: 포스페이트 완충액; Tris 완충액; 보레이트 완충액; 숙시네이트 완충액; 히스티딘 완충액 (특히, 알루미늄 하이드록시드 애주번트와 함께); 또는 시트레이트 완충액. 완충액은 전형적으로 5-20mM 범위로 포함될 것이다.

조성물의 pH는 일반적으로, 5.0 내지 8.1, 및 더욱 전형적으로, 6.0 내지 8.0, 예를 들어, 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다.

조성물은 바람직하게는, 멸균된다. 조성물은 바람직하게는, 비-발열성이며 예를 들어, 용량 당 <1 EU (내독소 단위, 표준 척도) 및 바람직하게는, 용량 당 <0.1 EU을 함유한다. 조성물은 바람직하게는, 글루텐을 함유하지 않는다.

조성물은 단일 면역화를 위한 재료를 포함할 수 있거나, 다중 면역화를 위한 재료 (즉, '다중용량' 키트)를 포함할 수 있다. 다중용량 방식에서는 보존제를 포함하는 것이 바람직하다. 다중용량 조성물에 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로 (또는 이에 더하여), 조성물은 재료 제거를 위한 무균 어댑터를 갖는 컨테이너 내에 함유될 수 있다.

인간 백신은 전형적으로 약 0.5ml의 투여량 부피로 투여되며, 아동에게는 절반 용량 (즉, 약 0.25ml)이 투여될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 또한, 하나 이상의 면역조절제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역조절제중 하나 이상은 하나 이상의 애주번트를 포함한다. 애주번트는 추가로 하기에 논의된 TH1 애주번트 및/또는 TH2 애주번트를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 애주번트는 비제한적으로 하기를 포함한다:

A. 미네랄-함유 조성물

본 발명에서 애주번트로서 사용하기에 적합한 미네랄 함유 조성물은 미네랄 염 예컨대, 알루미늄 염 및 칼슘 염 (또는 이의 혼합물)을 포함한다. 칼슘 염은 칼슘 포스페이트 (예를 들어, 참고 문헌 3에 기재된 "CAP" 입자)를 포함한다. 알루미늄 염은 하이드록시드, 포스페이트, 설페이트 등을 포함하며, 염은 임의의 적합한 형태를 취한다 (예를 들어, 겔, 결정질, 무정형 등). 이들 염으로의 흡착이 바람직하다. 미네랄 함유 조성물은 또한, 금속 염의 입자로서 제형화될 수 있다 (4).

알루미늄 하이드록시드 및 알루미늄 포스페이트로서 공지된 애주번트가 사용될 수 있다. 이들 명은 통상적이나, 단지 편의를 위해 사용되며, 이들 어느 것도 제공되는 실제 화학 화합물의 정확한 서술이 아니다 (예를 들어, 참고 문헌 1의 챕터 9 참조). 본 발명은 애주번트로서 일반적으로 사용되는 "하이드록시드" 또는 "포스페이트" 애주번트 중 임의의 것을 사용할 수 있다. "알루미늄 하이드록시드"로서 공지된 애주번트는 전형적으로, 알루미늄 옥시하이드록시드 염이며, 이는 일반적으로 적어도 부분적으로 결정질이다. "알루미늄 포스페이트"로서 공지된 애주번트는 전형적으로, 알루미늄 하이드록시포스페이트이며, 이는 종종 또한 소량의 설페이트를 함유한다 (즉, 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트). 이들은 침전에 의해 수득될 수 있으며, 침전 동안의 반응 조건 및 농도는 염에서 하이드록실로의 포스페이트 치환도에 영향을 끼친다.

섬유 형태 (예를 들어, 투과 전자 현미경사진에서 관찰된 바와 같음)는 알루미늄 하이드록시드 애주번트에 있어서 전형적이다. 알루미늄 하이드록시드 애주번트의 pI는 전형적으로 약 11이며, 즉, 애주번트 자체는 생리학적 pH에서 양성 표면 전하를 갖는다. 알루미늄 하이드록시드 애주번트에 있어서 pH 7.4에서 mg Al⁺⁺⁺ 당 1.8-2.6 mg 단백질의 흡착능이 보고되었다.

알루미늄 포스페이트 애주번트는 일반적으로, 0.3 내지 1.2, 바람직하게는, 0.8 내지 1.2, 및 더욱 바람직하게는, 0.95±0.1의 PO₄/Al 몰 비를 갖는다. 알루미늄 포스페이트는 특히, 하이드록시포스페이트 염에 있어서, 일반적으로 무정형일 것이다. 전형적인 애주번트는 0.6mg　Al³ ⁺/ml를 포함하며 0.84 내지 0.92의 PO₄/Al 몰 비를 갖는 무정형 알루미늄 하이드록시포스페이트이다. 알루미늄 포스페이트는 일반적으로 미립자일 것이다 (예를 들어, 투과 전자 현미경 사진에서 관찰되는 바와 같은 플레이트형 형태). 입자의 전형적인 직경은 임의의 항원 흡착 후 0.5-20㎛ (예를 들어, 약 5-10㎛) 범위이다. pH 7.4에서 mg Al⁺⁺⁺ 당 0.7-1.5 mg 단백질의 흡착능이 알루미늄 포스페이트 애주번트에 있어서 보고되었다.

알루미늄 포스페이트의 영점 전하 (PZC)는 하이드록실로의 포스페이트 치환도에 역비례로 관련되며, 이러한 치환도는 치환에 의한 염 제조에 사용되는 반응물의 농도 및 반응 조건에 따라 변화될 수 있다. PZC는 또한 용액중 자유 포스페이트 이온의 농도를 변화시킴으로써 (더 많은 포스페이트 = 더 높은 산성 PZC) 또는 히스티딘 완충액과 같은 완충액을 첨가함으로써 (PZC를 더욱 염기성으로 만듬) 변경된다. 본 발명에 따라 사용된 알루미늄 포스페이트는 일반적으로 4.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는, 5.0 내지 6.5, 예를 들어, 약 5.7의 PZC를 가질 것이다.

본 발명의 조성물을 제조하는데 사용된 알루미늄 염의 현탁액은 완충액 (예를 들어, 포스페이트 또는 히스티딘 또는 Tris 완충액)을 함유할 수 있으나, 이는 반드시 그럴 필요는 없다. 현탁액은 바람직하게는 멸균이며, 발열인자를 비함유한다. 현탁액은 예를 들어, 1.0 내지 20　mM, 바람직하게는, 5 내지 15　mM, 및 더욱 바람직하게는, 약 10 mM 농도로 제공되는 자유 수성 포스페이트 이온을 포함할 수 있다. 현탁액은 또한 소듐 클로라이드를 포함할 수 있다.

본 발명은 알루미늄 하이드록시드 및 알루미늄 포스페이트 둘 모두의 혼합물을 사용할 수 있다. 이러한 경우, 하이드록시드 보다 더 많은 알루미늄 포스페이트가 존재할 수 있으며, 예를 들어, 적어도 2:1의 중량비, 예를 들어, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, 등등이다.

환자에 투여하기 위한 조성물 중 Al⁺⁺⁺의 농도는 바람직하게는, 10mg/ml 미만, 예를 들어, <5　mg/ml, <4　mg/ml, <3　mg/ml, <2　mg/ml, <1　mg/ml, 등등이다. 바람직한 범위는 0.3 내지 1mg/ml이다. 최대 0.85mg/용량이 바람직하다.

B. 오일 에멀젼

본 발명에서 애주번트로서 사용하기에 적합한 오일 에멀젼 조성물은 스쿠알렌-물 에멀젼 예컨대, MF59(TM) (참고 문헌 1의 챕터 10; 또한, 참고 문헌 5 참조) (5% 스쿠알렌, 0.5% TWEEN 80(TM), 및 0.5% SPAN 85(TM), 미세유동화기를 사용하여 서브마이크론 입자로 제형화됨)를 포함한다. 완전 프로인트 애주번트 (CFA) 및 불완전 프로인트 애주번트 (IFA)가 또한 사용될 수 있다.

다양한 수중유 에멀젼 애주번트는 공지되어 있으며, 이들은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하며, 오일(들) 및 계면활성제(들)는 생분해성 (대사작용성) 및 생체적합성이다. 에멀젼 중 오일 소적은 일반적으로, 직경이 5㎛ 미만이며, 이상적으로는 서브-마이크론 직경을 가지며, 이러한 작은 크기는 미세유동화기를 사용하여 달성되어 적합한 에멀젼을 제공한다. 220nm 미만 크기의 소적이 바람직한데, 이들이 여과살균 처리될 수 있기 때문이다.

에멀젼은 오일 예컨대, 동물 (예컨대, 어류) 또는 식물성 공급원으로부터의 오일을 포함할 수 있다. 식물성 오일의 공급원은 땅콩, 씨앗 및 곡물을 포함한다. 가장 일반적으로 이용가능한 땅콩유, 대두유, 코코넛유 및 올리브유는 견과유에 대한 전형적인 예이다. 예를 들어, 호호바 콩으로부터 수득된 호호바 오일이 사용될 수 있다. 씨앗 유는 홍화씨 오일, 목화씨 오일, 해바라기씨 오일, 참깨 오일 및 기타 등등을 포함한다. 곡물 군에서, 옥수수유가 가장 용이하게 입수가능하나, 다른 시리얼 곡물 예컨대, 밀, 오트, 호밀, 쌀, 테프, 라이밀 및 기타 등등의 오일이 또한 사용될 수 있다. 씨앗 유에서 천연적으로는 발생하지 않지만, 1,2-프로판디올 및 글리세롤의 6-10개 탄소 지방산 에스테르가 콩 및 씨앗 유로부터 출발하는 적당한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유동물 젖으로부터의 지방 및 오일은 대사작용가능하며, 따라서 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 동물 공급원으로부터 순수한 오일을 수득하는데 필요한 분리, 정제, 사포닌화 및 기타 방법의 절차는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 대부분의 어류는 대사작용가능한 오일을 함유하며 이는 용이하게 회수될 수 있다. 예를 들어, 대구간 오일, 상어간 오일 및 고래 오일 예컨대, 스펌아세티 (spermaceti)는 본원에 사용될 수 있는 여러 어류 오일에 대한 전형적인 예이다. 많은 분지된 사슬 오일은 5-탄소 이소프렌 단위체에서 생화학적으로 합성되며, 일반적으로 테르페노이드로서 언급된다. 상어간 오일은 스쿠알렌으로 공지된 분지되고 불포화된 테르페노이드, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산을 함유하며, 이는 특히 본원에 바람직하다. 스쿠알렌에 대한 포화된 유사체인 스쿠알란이 또한 바람직한 오일이다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하는 어류 오일은 시중의 공급원으로부터 용이하게 입수가능하거나 당해 분야에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 그 밖의 바람직한 오일은 토코페롤 (하기 참조)이다. 오일의 혼합물이 사용될 수 있다.

계면활성제는 이들의 "HLB" (친수성/친지성 균형)에 의해 분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게는, 적어도 15 및 더욱 바람직하게는, 적어도 16의 HLB를 갖는다. 본 발명은 비제한적으로 하기를 포함하는 계면활성제와 사용될 수 있다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (보통 Tweens로서 불림), 특히, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 에틸렌 옥사이드 (EO), 프로필렌 옥사이드 (PO), 및/또는 부틸렌 옥사이드 (BO)의 코폴리머 (DOWFAXT^TM 상표명으로 판매됨), 예컨대, 선형 EO/PO 블록 코폴리머; 반복되는 에톡시 (옥시-1,2-에탄디일) 군의 수가 변화될 수 있는 옥톡시놀 (옥톡시놀-9 (Triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)이 특히 흥미로움); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 포스포리피드 예컨대, 포스파티딜콜린 (레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트 예컨대, Tergitol^TM NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (Brij 계면활성제로서 공지됨), 예컨대, 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30); 및 소르비탄 에스테르 (일반적으로 SPAN로서 공지됨), 예컨대, 소르비탄 트리올레이트 (SPAN 85(TM)) 및 소르비탄 모노라우레이트. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함시키기 위한 바람직한 계면활성제는 TWEEN 80(TM) (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트), SPAN 85(TM) (소르비탄 트리올레에이트), 레시틴 및 Triton X-100이다.

계면활성제의 혼합물 예를 들어, TWEEN 80(TM)/SPAN 85(TM) 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN 80(TM)) 및 옥톡시놀 예컨대, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100)의 조합물이 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합물은 라우레스 9와 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.

바람직한 양의 계면활성제 (중량%)는 다음과 같다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (예컨대 TWEEN 80(TM)) 0.01 내지 1%, 특히, 약 0.1 %; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예컨대, Triton X-100, 또는 Triton 시리즈의 그 밖의 세정제) 0.001 내지 0.1 %, 특히, 0.005 내지 0.02 %; 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대, 라우레스 9) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는, 0.1 내지 10 %, 및 특히, 0.1 내지 1 % 또는 약 0.5%.

바람직한 에멀젼 에주번트는 <1㎛ 예를 들어, <750nm, <500nm, <400nm, <300nm, <250nm, <220nm, <200nm, 또는 그 미만의 평균 소적 크기를 갖는다. 이러한 소적 크기는 편리하게는 미세유동화와 같은 기법에 의해 달성될 수 있다.

본 발명에 유용한 특정한 수중유 에멀젼 에주번트는 비제한적으로 하기를 포함한다:

·스쿠알렌, TWEEN 80(TM), 및 SPAN 85(TM)의 서브마이크론 에멀젼. 에멀젼중의 용적 조성은 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% SPAN 85(TM)일 수 있다. 중량에 있어서, 이들 비는 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% SPAN 85(TM)가 된다. 이러한 애주번트는 참고 문헌 8의 챕터 10 및 참고 문헌 9의 챕터 12에 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 'MF59(TM)' (6-7)으로서 공지된다. MF59(TM) 에멀젼은 유리하게는 시트레이트 이온 예를 들어,　10mM 소듐 시트레이트 완충액을 포함한다.

·스쿠알렌, 토코페롤, 및 TWEEN 80(TM)의 에멀젼. 에멀젼은 포스페이트 완충된 염수를 포함할 수 있다. 이는 또한, SPAN 85(TM) (예를 들어, 1%) 및/또는 레시틴을 포함할 수 있다. 이들 에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% TWEEN 80(TM)을 가질 수 있으며, 스쿠알렌:토코페롤의 중량 비는 바람직하게는, <1인데, 이는 더욱 안정한 에멀젼을 제공하기 때문이다. 스쿠알렌 및 TWEEN 80(TM)은 약 5:2의 부피 비로 제공될 수 있다. 이러한 한 에멀젼이 PBS중에 TWEEN 80(TM)를 용해시켜 2% 용액을 제공하고, 이어서 90ml의 이러한 용액을 (5g의 DL-α-토코페롤 및 5ml 스쿠알렌)의 혼합물과 혼합시킨 후, 혼합물을 미세유동화시킴으로써 제조될 수 있다. 생성 에멀젼은 평균 직경이 100 내지 250nm, 바람직하게는, 약 180nm인 서브마이크론 오일 소적을 가질 수 있다.

·스쿠알렌, 토코페롤, 및 Triton 세정제 (예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL (하기 참조)를 포함할 수 있다. 에멀젼은 포스페이트 완충액을 함유할 수 있다.

·폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세정제 (예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤 (예를 들어, 토코페롤 숙시네이트)을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 이들 3개의 성분을 약 75:11:10 (예를 들어, 750㎍/ml 폴리소르베이트 80, 110㎍/ml Triton X-100 및 100㎍/ml α-토코페롤 숙시네이트)의 질량 비로 포함할 수 있으며, 이들 농도는 항원으로부터의 이들 성분의 임의의 분포를 포함해야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 또한, 3d-MPL (하기 참조)를 포함할 수 있다. 수성상은 포스페이트 완충액을 함유할 수 있다.

·스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401 ("PLURONIC(TM) L121")의 에멀젼. 에멀젼은 포스페이트 완충된 염수, pH 7.4에서 제형화될 수 있다. 이러한 에멀젼은 무라밀 디펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이며, "SAF-1" 애주번트 (10) (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알란, 2.5% PLURONIC(TM) L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서 트레오닐-MDP와 사용될 수 있다. 또한, "AF" 애주번트 (11) (5% 스쿠알란, 1.25% PLURONIC(TM) L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서와 같이, Thr-MDP 없이 사용될 수 있다. 미세유동화가 바람직하다.

·스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성의 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예컨대, 소르비탄 모노올레에이트 또는 'SPAN 80(TM)')을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게는, 열가역적이고/거나 200 nm 미만의 크기를 갖는 적어도 90%의 오일 소적 (부피)을 갖는다 (12). 에멀젼은 또한 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 알디톨; 동결보호제 (예를 들어, 당, 예컨대, 도데실말토시드 및/또는 수크로스); 및/또는 알킬 폴리글리코시드. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다.

·스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼 (13). 애주번트 처리된 백신에서 이들 성분들의 최종 농도 (중량)는 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105 플루로닉 폴리올) 및 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴/카프르산 트리글리세리드)이다.

·0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 포스포리피드, 및 0.05-5%의 비-이온성 계면활성제를 갖는 에멀젼. 참고 문헌 14에 기술된 바와 같이, 바람직한 포스포리피드 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고마이엘린 및 카르디올리핀이다. 서브마이크론 소적 크기가 유리하다.

·비-대사작용성 오일 (예컨대, 라이트 미네랄 오일) 및 적어도 하나 계면활성제 (예컨대, 레시틴, TWEEN 80(TM) 또는 SPAN 80(TM))의 서브마이크론 수중유 에멀젼. 첨가제 예컨대, QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친지성 컨주게이트 (예컨대, 글루쿠론산의 카르복실 기를 통한 지방족 아민의 데스아실사포닌의 첨가에 의해 생성된 참고 문헌 15에 기술된 GPI-0100), 디메티아이디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스(2-하이드록시에틸)프로판디아민이 포함될 수 있다.

·사포닌 (예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 마이셀로서 결합된 에멀젼 (16).

·미네랄 오일, 비-이온성 친지성 에톡실화된 지방 알코올 및 비-이온성 친수성 계면활성제 (예를 들어, 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머)를 포함하는 에멀젼 (1[17]　WO2006/113373.7).

·미네랄 오일, 비-이온성 친수성 에톡실화된 지방 알코올 및 비-이온성 친수성 계면활성제 (예를 들어, 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머)를 포함하는 에멀젼 (17).

일부 구체예에서, 에멀젼은 전달시에 즉석으로 항원과 혼합될 수 있으며, 따라서, 애주번트 및 항원은 패키징되거나 분포된 백신에 별도로 보관될 수 있어, 사용시점에 최종 제형화를 위해 준비된다. 또 다른 구체예에서, 에멀젼은 제작 동안 항원과 혼합되며, 따라서, 조성물은 액체 애주번트 처리된 형태로 패키징된다. 항원은 일반적으로, 백신이 두 액체를 혼합함으로써 최종적으로 제조되도록 수성 형태로 존재할 것이다. 혼합을 위한 두 액체의 부피 비는 변화될 수 있으나 (예를 들어, 5:1 내지 1:5), 일반적으로 약 1:1이다. 상기 특정 에멀젼의 설명에서 성분들의 농도가 주어지는 경우, 이러한 농도는 전형적으로 비희석된 조성물에 대한 것이며, 따라서, 항원 용액과의 혼합 후 농도는 감소될 것이다.

조성물이 토코페롤을 포함하는 경우, α, β, γ, δ, ε 또는 ξ토코페롤 중 임의의 것이 사용될 수 있으나, α-토코페롤이 바람직하다. 토코페롤은 여러 형태 예를 들어, 상이한 염 및/또는 이성질체를 취할 수 있다. 염은 유기 염 예컨대, 숙시네이트, 아세테이트, 니코티네이트 등을 포함한다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤 둘 모두가 이용될 수 있다. 토코페롤은 유리하게는, 노인 환자 (예를 들어, 60세 또는 그 초과)에 사용하기 위한 백신에 포함되는데, 이는 비타민 E가 이러한 환자 군의 면역 반응에 긍정적인 효과를 갖는 것으로 보고되었기 때문이다 (18). 이들은 또한, 에멀젼의 안정화를 도울 수 있는 항산화제 특성을 갖는다 (19). 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이며, 이러한 토코페롤의 바람직한 염은 숙시네이트이다. 숙시네이트 염은 생체내에서 TNF-관련 리간드와 상호작동하는 것으로 밝혀졌다.

C. 사포닌 제형 (참고 문헌 1의 챕터 22)

사포닌 제형은 또한 본 발명에 애주번트로서 사용될 수 있다. 사포닌은 광범위한 식물 종의 나무껍질, 잎, 줄기, 뿌리 및 심지어 꽃에서 발견되는 트리테르페노이드 글리코시드 및 스테롤 글리코시드의 불균일 군이다. 퀼라이아 사포나리아 몰리나 (Quillaia saponaria Molina) 나무의 나무껍질로부터의 사포닌은 애주번트로서 광범위하게 연구되었다. 사포닌은 또한 스밀락스 오르나타 (Smilax ornata) (사르사프릴라(sarsaprilla)), 자이포스필라 파니쿨라타 (Gypsophilla paniculata) (브라이드스 베일 (brides veil)), 및 사포나리아 오피시아날리스 (Saponaria officianalis) (솝 루트 (soap root))로부터 통상적으로 수득될 수 있다. 사포닌 애주번트 제형은 정제된 제형 예컨대, QS21은 물론 리피드 제형 예컨대, ISCOM을 포함한다. QS21은 Stimulon^TM로서 판매된다.

사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC을 사용하여 정제되었다. 이러한 기법을 이용하여 특정한 정제된 분획물을 확인하였으며, 이는 QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C을 포함한다. 바람직하게는, 사포닌은 QS21이다. QS21의 생성 방법은 참고 문헌 20에 기재되어 있다. 사포닌 제형은 또한, 스테롤 예컨대, 콜레스테롤을 포함할 수 있다 (21).

사포닌 및 콜레스테롤의 조합물은 독특한 입자 소위 면역자극 복합물 (ISCOM)을 형성하는데 사용될 수 있다 (참고 문헌 1의 챕터 23). ISCOM은 또한, 전형적으로 포스포리피드 예컨대, 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 포함한다. 임의의 공지된 사포닌이 ISCOM에 사용될 수 있다. 바람직하게는, ISCOM은 QuilA, QHA & QHC 중 하나 이상을 포함한다. ISCOM은 추가로 참고 문헌 21-22에 기술되어 있다. 선택적으로, ISCOM은 추가적인 세정제를 함유하지 않을 수 있다 (23).

사포닌 기반 애주번트의 개발에 대한 개관은 참고 문헌 24 & 25에서 찾아볼 수 있다.

D. 바이로솜 및 바이러스-유사 입자

바이로솜 및 바이러스-유사 입자 (VLP)는 또한 본 발명에서 애주번트로서 사용될 수 있다. 이러한 구조물은 일반적으로, 포스포리피드와 선택적으로 조합되거나 제형화된 바이러스로부터의 하나 이상의 단백질을 함유한다. 이들은 일반적으로, 비-병원체성, 비-복제성이며, 일반적으로 천연 바이러스 게놈 어느 것도 함유하지 않는다. 바이러스 단백질은 재조합으로 생성될 수 있거나 전체 바이러스로부터 분리될 수 있다. 바이로솜 또는 VLP에 사용하기에 적합한 이러한 바이러스 단백질은 인플루엔자 바이러스 (예컨대, HA 또는 NA), B형 간염 바이러스 (예컨대, 코어 또는 캡시드 단백질), E형 간염 바이러스, 홍역 바이러스, 신드비스 (Sindbis) 바이러스, 로타바이러스, 구제역 바이러스, 레트로바이러스, 노워크 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, HIV, RNA-파지, Qβ-파지 (예컨대, 코트 단백질), GA-파지, fr-파지, AP205 파지, 및 Ty (예컨대, 레트로트랜스포손 Ty 단백질 p1)로부터 유래된 단백질을 포함한다. VLP은 추가로 참고 문헌 26-27에서 논의된다. 바이로솜은 예를 들어, 참고 문헌 28에 추가로 논의된다.

E. 박테리아 또는 미생물 유도체

본 발명에 적합한 애주번트는 박테리아 또는 미생물 유도체 예컨대, 엔테로박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS), 리피드 A 유도체, 면역자극 올리고누클레오티드 및 ADP-리보실화 독소의 비-독성 유도체 및 이들의 탈독소화된 유도체를 포함한다.

LPS의 비-독성 유도체는 모노포스포릴 리피드 A (MPL) 및 3-O-탈아실화된 MPL (3dMPL)을 포함한다. 3dMPL은 3 탈-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A와 4, 5 또는 6 아실화된 사슬의 혼합물이다. 바람직한 "소 입자" 형태의 3 탈-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A는 참고 문헌 29에 기재되어 있다. 3dMPL의 이러한 "소 입자"는 0.22㎛ 막을 통과하여 멸균 여과시키기에 충분히 작다 (39). 그 밖의 비-독성 LPS 유도체는 모노포스포릴 리피드 A 모방체, 예컨대, 아미노알킬 글루코스아미니드 포스페이트 유도체, 예를 들어, RC-529를 포함한다 (30,31).

리피드 A 유도체는 에스체리치아 콜라이로부터의 리피드 A의 유도체 예컨대, OM-174를 포함한다. OM-174는 예를 들어, 참고 문헌 32 & 33에 기술되어 있다.

본 발명에 애주번트로서 사용하기에 적합한 면역자극 올리고누클레오티드는 CpG 모티프를 함유하는 누클레오티드 서열을 포함한다 (포스페이트 결합에 의해 구아노신에 연결된 연결된 비메틸화된 사이토신을 함유하는 디누클레오티드 서열). 팔린드롬 또는 폴리(dG) 서열을 함유하는 이중-가닥 RNA 및 올리고누클레오티드가 또한 면역자극성인 것으로 밝혀졌다.

CpG는 누클레오티드 변형물/유사체 예컨대, 포스포로티오에이트 변형물을 포함할 수 있으며, 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 참고 문헌 34, 35 및 36은 가능한 유사체 치환 예를 들어, 2'-데옥시-7-데아자구아노신으로의 구아노신의 대체를 기재하고 있다. CpG 올리고누클레오티드의 애주번트 효과는 참고 문헌 37-38에 추가로 논의되어 있다.

CpG 서열 예컨대, 모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT은 TLR9으로 인도될 수 있다 (39). CpG-A ODN과 같은 CpG 서열은 Th1 면역 반응을 유도하는데 특이적일 수 있거나, CpG-B ODN와 같은 CpG 서열은 B 세포 반응을 유도하는데 더욱 특이적일 수 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN은 참고 문헌 40-41에 논의되어 있다. 바람직하게는, CpG는 CpG-A ODN이다.

바람직하게는, CpG 올리고누클레오티드는 5' 말단이 수용체 인식을 위해 접근가능하게 되도록 작제된다. 선택적으로, 2개의 CpG 올리고누클레오티드 서열은 이들의 3' 말단에 부착되어 "이뮤노머 (immunomer)"를 형성할 수 있다. 예를 들어, 참고 문헌 39 & 42-43 참조.

유용한 CpG 애주번트는 또한, ProMune^TM(Coley Pharmaceutical Group, Inc.)으로 공지된 CpG7909이다. 또 다른 것은 CpG1826이다. CpG 서열 사용에 대안적으로 또는 추가적으로, TpG 서열이 이용될 수 있으며 (44), 이러한 올리고누클레오티드는 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하지 않을 수 있다. 면역자극 올리고누클레오티드는 피리미딘-풍부할 수 있다. 예를 들어, 이는 하나 초과의 연속적인 티미딘 누클레오티드 (예를 들어, 참고 문헌 44에 기재된 바와 같이, TTTT)를 포함할 수 있으며/거나 >25% 티미딘 (예를 들어, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, 등등)을 갖는 누클레오티드 조성물을 가질 수 있다. 예를 들어, 이는 하나 초과의 연속적인 시토신 누클레오티드 (예를 들어, 참고 문헌 44에 기재된 바와 같이, CCCC)를 포함할 수 있으며/거나 >25% 시토신 (예를 들어, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, 등등)을 갖는 누클레오티드 조성물을 가질 수 있다. 이들 올리고누클레오티드는 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하지 않을 수 있다. 면역자극 올리고누클레오티드는 전형적으로 적어도 20개의 누클레오티드를 포함할 것이다. 이들은 100개 미만의 누클레오티드를 포함할 수 있다.

면역자극 올리고누클레오티드를 기반으로 하는 특히 유용한 애주번트는 IC-31^TM으로 알려져 있다 (45). 따라서 본 발명에 사용된 애주번트는 (i) 적어도 하나의 (및 바람직하게는 다수의) CpI 모티프 (즉, 디누클레오티드를 형성하기 위해 이노신에 결합한 사이토신)를 포함하는 올리고누클레오티드 (예를 들어, 15-40개 누클레오티드) 및 (ii) 적어도 하나의 (및 바람직하게는 다수의) Lys-Arg-Lys 트리펩티드 서열(들)을 포함하는 올리고펩티드 (예를 들어, 5-20 개 아미노산) 같은 폴리양이온성 (polycationic) 폴리머의 혼합물을 포함할 수 있다. 올리고누클레오티드는 26-mer 서열 5'-(IC)₁₃-3' (SEQ ID NO : 51)을 포함하는 데옥시누클레오티드일 수 있다. 폴리양이온성 폴리머는 11-mer 아미노산 서열 KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 52)을 포함하는 펩티드일 수도 있다.

박테리아 ADP-리보실화 독소 및 이의 탈독소화된 유도체는 본 발명에서 애주번트로서 사용될 수도 있다. 바람직하게, 단백질은 E. 콜라이 (E. 콜라이 열 불안정 장독소 "LT"), 콜레라 ("CT") 또는 퍼투시스 ("PT")로부터 유래된다. 탈독소화된 ADP-리보실화 독소의 점막 애주번트로서의 사용은 참고 문헌 46에 기술되어 있고, 비경구 애주번트로서의 사용은 참고 문헌 47에 기술되어 있다. 독소 또는 톡소이드는 바람직하게 A 및 B 서브유닛 둘 모두를 포함하는 홀로톡신의 형태이다. 바람직하게, A 서브유닛은 탈독소화 돌연변이를 함유하고; 바람직하게 B 서브유닛은 돌연변이 되지 않는다. 바람직하게, 애주번트는 LT-K63, LT-R72 및 LT-G192와 같은 탈독소화된 LT 변이체이다. 애주번트로서 ADP-리보실화 독소 및 이의 탈독소화된 유도체, 특히, LT-K63 및 LT-R72의 사용은 참고 문헌 48-49에서 찾아볼 수 있다. 유용한 CT 변이체는 CT-E29H이다 (50). 아미노산 치환에 관한 번호 기준은 바람직하게는, 참고 문헌 51에 제시된 ADP-리보실화 독소의 A 및 B 서브유닛의 정렬에 기초하고, 이는 본원에서 정렬 및 아미노산 넘버링 목적에 있어서 단독으로 그 전체가 참조로 특별하게 통합된다.

F. 인간 면역조절인자

본 발명에서 애주번트로서 사용하기에 적합한 인간 면역조절인자는 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (52) 등) (53), 인터페론 (예를 들어, 인터페론-γ), 마크로파지 콜로니 자극 인자 및 종양 괴사 인자 같은 사이토카인을 포함한다. 바람직한 면역조절인자는 IL-12이다.

G. 생부착제 및 점막부착제

본 발명에서 생부착제 및 점막부착제가 또한 애주번트로서 사용될 수도 있다. 적합한 생부착제는 에스테르화된 히알루론산 마이크로스피어 (54) 또는 점막부착제 예컨대, 폴리(아크릴산), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리사카라이드 및 카르복시메틸셀룰로스의 가교된 유도체를 포함한다. 본 발명에서 키토산 및 이의 유도체가 또한 애주번트로서 사용될 수 있다 (55).

H. 극미립자

본 발명에서 극미립자가 또한 애주번트로서 사용될 수 있다. 극미립자 (즉, 직경 ~100 nm 내지 ~150 μm, 더욱 바람직하게는, 직경 ~200 nm 내지 ~30 μm 및 가장 바람직하게는, 직경 ~500 nm 내지 ~10 μm인 입자)는 생분해성 및 비독성 (예를 들어, 폴리(α-하이드록시 산), 폴리하이드록시부티르 산, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리카프로락톤 등)인 물질로부터 형성되며, 폴리(락티드-코-글리콜리드)가 바람직하고, 이는 선택적으로 음으로 하전된 표면 (예를 들어, SDS로 처리) 또는 양으로 하전된 표면 (예를 들어, CTAB 같은 양이온 세제로 처리)을 갖도록 처리된다.

I. 리포솜 (참고 문헌 5의 챕터 13 & 14)

애주번트로서 사용하기에 적합한 리포솜 제형의 예는 참고 문헌 56-57에 설명되어 있다.

J. 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르 제형

본 발명에 사용하기에 적합한 애주번트는 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함한다 (5[58] WO99/52549.8). 이러한 제형은 옥톡시놀과 조합되는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (59)는 물론 옥톡시놀과 같은 적어도 하나의 추가적인 비-이온성 계면활성제와 조합되는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제 (60)를 추가로 포함한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 하기 군으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 (라우레스 9), 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시테일렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르.

K. 포스파젠

예를 들어, 참고 문헌 61 및 62에 기술된 바와 같은 포스파젠 예컨대, 폴리(디(카르복실레이토페녹시)포스파젠) ("PCPP")이 사용될 수 있다.

L. 무라밀 펩티드

본 발명에서 애주번트로서 사용하기에 적합한 무라밀 펩티드의 예는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (노르-MDP), 및 N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE)을 포함한다.

M. 이미다조퀴놀론 화합물

본 발명에서 애주번트로서 사용하기에 적합한 이미다조퀴놀론 화합물의 예는 이미퀴모드 ("R-837") (63, 64), 레시퀴모드 ("R-848") (65) 및 이들의 유사체; 및 이들의 염 (예를 들어, 하이드로클로라이드 염)를 포함한다. 면역자극 이미다조퀴놀린에 대한 추가의 상세한 내용은 참고 문헌 66 및 67에서 찾아볼 수 있다.

N. 치환된 우레아

애주번트로서 유용한 치환된 우레아는 참고 문헌 68에 정의된 바와 같은 화학식 I, II 또는 III의 화합물 또는 이들의 염을 포함한다:

(예컨대, 'E 803058', 'E 803732', 'E 804053', 'ER 804058', 'E 804059', 'E 804442', 'E 804680', 'E 804764', 'ER 803022' 또는 'E 804057'예를 들어,:

).

O. 추가의 애주번트

본 발명에 사용될 수 있는 추가의 애주번트는 하기를 포함한다:

·아미노알킬 글루코스아미니드 포스페이트 유도체 예컨대, RC-529 (69, 70).

·티오세미카르바존 화합물 예컨대, 참고 문헌 71에 기술된 것들. 활성 화합물을 제형화시키고, 제작하고 스크리닝하는 방법이 또한 참고 문헌 71에 기술되어 있다. 티오세미카르바존은 사이토카인 예컨대, TNF-α의 생성을 위한 인간 말초혈 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.

·트립탄트린 화합물 예컨대, 참고 문헌 72에 기술된 것들. 활성 화합물을 제형화시키고, 제작하고 스크리닝하는 방법이 또한 참고 문헌 72에 기술되어 있다. 티오세미카르바존은 사이토카인 예컨대, TNF-α의 생성을 위한 인간 말초혈 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.

·누클레오시드 유사체 예컨대: (a) 이사토라빈 (Isotorabine) (ANA-245; 7-티아-8-옥소구아노신):

및 이의 프로드러그; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) 참고 문헌 73 내지 74에 기재된 화합물. 록소리빈 (7-알릴-8-옥소구아노신) (75):

·하기를 포함하는 참고 문헌 76에 기재된 화합물: 아실피페라진 화합물, 인돌리돈 화합물, 테트라하이드라이소퀴놀린 (THIQ) 화합물, 벤조사이클로디온 화합물, 아미노아자비닐 화합물, 아미노벤즈이미다졸 퀴놀리논 (ABIQ) 화합물 (77, 78), 하이드라프탈아미드 화합물, 벤조페논 화합물, 이속사졸 화합물, 스테롤 화합물, 퀴나질리논 화합물, 피롤 화합물 (7[7]　WO2004/018455.9), 안트라퀴논 화합물, 퀴녹살린 화합물, 트리아진 화합물, 피라잘로피리미딘 화합물, 및 벤즈아졸 화합물 (8[8]　WO03/082272.0).

·포스페이트-함유 비사이클릭 (acyclic) 주쇄에 연결된 리피드를 함유하는 화합물, 예컨대, TLR4 길항제 E5564 (81, 82):

· 폴리옥시도늄 폴리머 (83.84) 또는 그 밖의 N-산화된 폴리에틸렌-피페라진 유도체.

· 메틸 이노신 5'-모노포스페이트 ("MIMP") (85)

· 폴리하이드록실화된 피롤리지딘 화합물 (86), 예컨대, 하기 화학식을 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 유도체:

상기 식에서, R은 수소, 직쇄 또는 분지쇄의 비치환되거나 치환되고 포화되거나 불포화된 아실, 알킬 (예를 들어, 사이클로알킬), 알케닐, 알키닐 및 아릴 기를 포함하는 군으로부터 선택된다. 예로는 비제한적으로 하기를 포함한다: 카수아린, 카수아린-6-α-D-글루코피라노스, 3-epi-카수아린, 7-epi-카수아린, 3,7-디epi-카수아린, 등.

· CD1d 리간드 예컨대, α-글리코실세라미드 (87-88) (예를 들어, α-갈락토실세라미드), 파이토스핑고신-함유 α-글리코실세라미드, OCH, KRN7000 ((2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-(N-헥사코사노일아미노)-1,3,4-옥타데칸트리올), CRONY-101, 3"-O-술포-갈락토실세라미드, 등.

· 감마 이눌린 (89) 또는 이의 유도체 예컨대, 알가물린 (algammulin).

애주번트 조합물

본 발명은 또한 상기 확인된 애주번트중 하나 이상의 양태의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기의 애주번트 조성물이 본 발명에 사용될 수 있다: (1) 사포닌과 수중유 에멀젼 (90); (2) 사포닌 (예를 들어,QS21) + 비독성 LPS 유도체 (예를 들어, 3dMPL) (91); (3)사포닌 (예를 들어, QS21) + 비독성 LPS 유도체 (예를 들어, 3dMPL) + 콜레스테롤; (4) 사포닌 (예를 들어, QS21) + 3dMPL + IL-12 (선택적으로, + 스테롤) (92); (5) 3dMPL과 예를 들어, QS21 및/또는 수중유 에멀젼의 조합물 (93); (6) 10% 스쿠알렌, 0.4% Tween 80^TM, 5% 플루로닉-블록 폴리머 L121 및 thr-MDP를 함유하는 SAF로서, 서브마이크론의 에멀젼으로 미세유동화되거나 볼텍싱되어 더 큰 미립자 크기의 에멀젼을 발생시킴. (7) 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80, 및 모노포스포릴리피드 A (MPL), 트리할로스 디마이콜레이트 (TDM) 및 세포벽 골격 (CWS), 바람직하게 MPL + CWS (Detox^TM)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분을 함유한 Ribi^TM 애주번트 시스템 (RAS), (Ribi Innunochem); 및 (8) 하나 이상의 무기염 (예를 들어, 알루미늄 염) + LPS의 비독성 유도체 (예를 들어, 3dMPL).

면역자극제로서 작용하는 다른 물질은 참고문헌 1의 챕터 7에 개시되어 있다.

알루미늄 하이드록시드 및/또는 알루미늄 포스페이트 애주번트의 사용이 특히 바람직하며, 항원은 일반적으로 이들 염으로 흡착된다. 칼슘 포스페이트는 또 다른 바람직한 애주번트이다. 그 밖의 바람직한 애주번트 조합물은 Th1 및 Th2 애주번트의 조합물 예컨대, CpG & Alum 또는 레시퀴모드 & Alum의 조합물을 포함한다. 알루미늄 포스페이트와 3dMPL의 조합물이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 세포 매개된 면역 반응은 물론 체액성 면역 반응 둘 모두를 유발시킬 수 있다. 이러한 면역 반응은 바람직하게는, 길게 지속되는 (예를 들어, 중화되는) 항체 및 세포 매개된 면역성을 유발시킬 것이며, 이는 병원체에 노출시 신속하게 반응할 수 있으며 이에 대해 면역화된다.

두 유형의 T 세포인 CD4 및 CD8 세포는 일반적으로, 세포 매개된 면역성 및 체액 면역성을 개시하고/거나 향상시키는데 필요한 것으로 여겨진다. CD8 T 세포는 CD8 공동-수용체를 발현할 수 있으며, 보통 세포독성 T 림프구 (CTL)로 불린다. CD8 T 세포는 MHC Class I 분자상에 나타난 항원을 인식하거나 이와 상호작용할 수 있다.

CD4 T 세포는 CD4 공동-수용체를 발현할 수 있으며, 보통 T 헬퍼 세포로 불린다. CD4 T 세포는 MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원성 펩티드를 인식할 수 있다. MHC 클래스 II 분자와의 상호작용시, CD4 세포는 사이토카인과 같은 인자를 분비할 수 있다. 이들 분비된 사이토카인은 B 세포, 세포독성 T 세포, 마크로파지, 및 면역 반응에 참여하는 그 밖의 세포를 활성화시킬 수 있다. 헬퍼 T 세포 또는 CD4+ 세포는 2개의 기능적으로 별개의 서브셋으로 추가로 분할될 수 있다: 이들의 사이토카인 및 이펙터 기능이 상이한 TH1 표현형 및 TH2 표현형.

활성화된 TH1 세포는 세포 면역성 (항원-특이적 CTL 생성을 포함)을 향상시키며, 따라서, 세포내 감염에 대한 반응에서 특히 중요하다. 활성화된 TH1 세포는 IL-2, IFN-γ 및 TNF-β중 하나 이상을 분비할 수 있다. TH1 면역 반응을 마크로파지, NK (자연 살해) 세포, 및 CD8 세포독성 T 세포 (CTL)를 활성화시킴으로써 국소 염증 반응을 발생시킬 수 있다. TH1 면역 반응은 또한, B 및 T 세포의 성장을 IL-12로 자극함으로써 면역 반응을 확장시키는 작용을 할 수 있다. TH1 자극된 B 세포는 IgG2a를 분비할 수 있다.

활성화된 TH2 세포는 항체 생성을 향상시키며, 따라서 세포외 감염에 대한 반응에서 중요하다. 활성화된 TH2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-10중 하나 이상을 분비할 수 있다. TH2 면역 반응은 IgG1, IgE, IgA 및 미래 보호를 위한 기억 B 세포의 생성을 발생시킬 수 있다.

향상된 면역 반응은 향상된 TH1 면역 반응 및 TH2 면역 반응중 하나 이상을 포함할 수 있다.

TH1 면역 반응은 CTL 증가, TH1 면역 반응과 관련된 사이토카인 (예컨대, IL-2, IFN-γ 및 TNF-β) 중 하나 이상의 증가, 활성화된 마크로파지의 증가, NK 활성 증가 또는 IgG2a 생성 증가중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 향상된 TH1 면역 반응은 IgG2a 생성 증가를 포함할 것이다.

TH1 면역 반응은 TH1 애주번트를 사용하여 유도될 수 있다. TH1 애주번트는 일반적으로, 애주번트 없이 항원의 면역화에 대해 IgG2a 생성의 증가된 수준을 유발시킬 것이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 TH1 애주번트는 예를 들어, 사포닌 제형, 바이로솜 및 바이러스 유사 입자, 엔테로박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS)의 비-독성 유도체, 면역자극 올리고누클레오티드를 포함할 수 있다. 면역자극 올리고누클레오티드 예컨대, CpG 모티프를 함유하는 올리고누클레오티드가 본 발명에 사용하기에 바람직한 TH1 애주번트이다.

TH2 면역 반응은 TH2 면역 반응과 관련된 사이토카인 (예컨대, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)중 하나 이상의 증가, 또는 IgG1, IgE, IgA 및 기억 B 세포의 생성 증가 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 향상된 TH2 면역 반응은 IgG1 생성 증가를 포함할 것이다.

TH2 면역 반응은 TH2 애주번트를 사용하여 유도할 수 있다. TH2 애주번트는 일반적으로, 애주번트 없는 항원의 면역화에 비해 IgG1 생성의 증가된 수준을 유발시킬 것이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 TH2 애주번트는 예를 들어, 미네랄 함유 조성물, 오일-에멀젼, 및 ADP-리보실화 독소 및 이의 탈독소화된 유도체를 포함한다. 미네랄 함유 조성물, 예컨대, 알루미늄 염이 본 발명에 사용하기에 바람직한 TH2 애주번트이다.

바람직하게는, 본 발명은 TH1 애주번트와 TH2 애주번트의 조합물을 포함하는 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 향상된 TH1 및 향상된 TH2 반응 즉, 애주번트 없는 면역화에 비해 IgG1 및 IgG2a 생성 둘 모두의 증가를 유도한다. 더욱 더 바람직하게는, TH1 애주번트와 TH2 애주번트의 조합물을 포함하는 조성물은 단일 애주번트로의 면역화에 비해 (즉, TH1 애주번트 단독으로의 면역화 또는 TH2 애주번트 단독으로의 면역화에 비해) 증가된 TH1 및/또는 증가된 TH2 면역 반응을 유도한다.

면역 반응은 TH1 면역 반응 및 TH2 반응 중 하나 또는 둘 모두일 수 있다. 바람직하게는, 면역 반응은 향상된 TH1 반응 및 향상된 TH2 반응 중 하나 또는 둘 모두를 제공한다.

향상된 면역 반응은 전신 및 점막 면역 반응 중 하나 또는 둘 모두일 수 있다. 바람직하게는, 면역 반응은 향상된 전신 및 향상된 점막 면역 반응 중 하나 또는 둘 모두를 제공한다. 바람직하게는, 점막 면역 반응은 TH2 면역 반응이다. 바람직하게는, 점막 면역 반응은 IgA의 생성 증가를 포함한다.

약제 조성물

본 발명의 일 양태는 (a) 본원에 기재된 바와 같은 사카라이드 컨주게이트, (b) 약제학적으로 허용되는 담체, 및 선택적으로 상기 섹션에 기술된 바와 같은 애주번트를 포함하는 약제 조성물을 포함한다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 주사가 가능한 형태, 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 주사하기 전, 액체 비히클, 용액 또는 현탁액에 존재하기 적합한 고체 형태로 또한 제조될 수 있다 (예를 들어, 동결건조된 조성물 또는 분무-냉동 건조된 조성물). 조성물은 예를 들어, 연고, 크림 또는 분말로서 국부 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 정제 또는 캡슐, 스프레이, 또는 시럽 (선택적으로 향이 첨가됨)으로서 경구 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 흡입기로서 미세 분말 또는 스프레이를 이용하여 폐 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물는 좌약 또는 패서리로서 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 소적으로서 코, 귀 또는 눈 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 조합된 조성물이 환자로 투여되기 직전에 재구성되도록 설계된 키트 형태로 존재할 수 있다. 이러한 키트는 액체 형태의 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 동결건조된 항원을 포함할 수 있다.

조성물이 사용 전에 즉석에서 준비되어야 하며 (예를 들어, 성분이 동결건조된 형태로 제공되는 경우) 키트로서 제공되는 경우, 키트는 2개의 바이알을 포함할 수 있거나, 이는 하나의 레디-필드 시린지 (ready-filled syringe) 및 하나의 바이알을 포함할 수 있으며, 시린지의 내용물은 주입 전에 바이알의 내용물을 재활성화시키는데 사용된다.

백신으로서 사용된 면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 항원(들) (예를 들어, 폴리사카라이드 및/또는 담체 단백질)은 물론 필요에 따라, 임의의 다른 성분을 포함한다. '면역학적 유효량'이란, 단일 용량 또는 계속 투여의 일부로 개체에게 그 양의 투여가 치료 또는 예방에 효과적임을 의미한다. 이러한 양은 치료 받을 개체의 건강 및 물리적 상태, 연령, 치료 받을 개체의 분류학적 그룹 (예를 들어, 인간외 영장류, 영장류, 등), 개체 면역 시스템의 항체 합성 능력, 요망되는 보호의 정도, 백신 제형, 의료 상황에서 치료 의사의 평가 및 다른 관련된 요인에 의존하여 달라진다. 그 양은 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 예상되며, 이는 관례적인 평가를 통해 결정될 수 있다.

치료 방법 및 백신 투여

본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 면역 반응을 발생시키는 방법을 제공한다. 면역 반응은 바람직하게는, 보호성이며, 바람직하게는, 항체 및/또는 세포-매개된 면역성을 포함한다. 본 방법은 부스터 반응을 발생시킬 수 있다.

본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 예를 들어, 포유동물에서 면역 반응을 발생시키는데 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 포유동물에서 면역 반응을 발생시키기 위한 의약 제조에서 본 발명의 펩티드의 사용을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 면역원성 조성물로 프리-필드 (pre-filled) 전달 장치를 제공한다.

글루칸 (및 특히, β-글루칸)은 대부분의 모든 병원체 진균류 특히, 면역약화된 대상체에서 감염과 관련된 것들, 및 또한 박테리아 병원체 및 원생 동물의 필수의 근본적인 폴리사카라이드 성분이기 때문에, 항-글루칸 면역성은 광범위한 병원체 및 질환에 대한 효능을 가질 수 있다. 예를 들어, S. 세레비시애 (S. cerevisiae)로의 면역화 후 발생한 항-글루칸 혈청은 C. 알비칸스와 교차-반응적이다. 광범위 면역성이 특히 유용한데, 이들 인간 감염성 진균 제제에 있어서, 화학요법은 불충분하며, 항진균 약물 내성이 출현하고 있으며, 예방 및 치료 백신에 대한 요구가 더욱더 인식되고 있기 때문이다.

따라서, 본원에 기술된 폴리사카라이드 컨주게이트의 폴리사카라이드 면역원이 글루칸인 경우, 본원에 기술된 글루칸 폴리사카라이드 컨주게이트의 사용 및 방법은 캔디다 종 예컨대, C. 알키반스; 크립토코커스 종 예컨대, C. 네오포르만스 (C. neoformans); 엔테로코커스 종 예컨대, E. 패칼리스; 스트렙토코커스 종 예컨대, S. 뉴모니애, S. 뮤탄츠 (S. mutans), S. 아갈락티애 및 S. 피오게네스; 레쉬마니아 종 예컨대, L. 메이저 (L. major); 아칸타모에바 (Acanthamoeba) 종 예컨대, A. 카스텔라니 (A. castellani); 아스퍼길루스 (Aspergillus) 종 예컨대, A. 푸미가투스 (A. fumigatus) 및 A. 플라부스 (A. flavus); 뉴모사이스티스 (Pneumocystis) 종 예컨대, P. 카리니 (P. carinii); 마이코박테리움 종 예컨대, M. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis); 슈도모나스 종 예컨대, P. 애루기노사; 스타필로코커스 종 예컨대, S. 아우레우스; 살모넬라 종 예컨대, S. 타이피무리움; 콕키디오이데스 (Coccidioides) 종 예컨대, C. 이미티스 (C. immitis); 트리초파이톤 (Trichophyton) 종 예컨대, T. 베루코숨 (T. verrucosum); 블라스토마이세스 종 예컨대, B. 데르마티디스 (B. dermatidis); 히스토플라즈마 종 예컨대, H. 캅술라툼 (H. capsulatum); 파라콕키디오이데스 (Paracoccidioides) 종 예컨대, P. 브라실리엔시스 (P. brasiliensis); 피티움 (Pythium) 종 예컨대, P. 인시디오숨 (P. insidiosum); 및 에스체리치아 종 예컨대, E. 콜라이의 감염에 대한 치료/보호에 특히 유용하다.

본 용도 및 방법은 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 질환의 예방/치료에 특히 유용하다: 칸디다증 (간비장 칸디다증, 침습성 칸디다증, 만성 점막피부 칸디다증 및 파종성 칸디다증 포함); 칸디다혈증; 아스페르길루스증, 크립토코쿠스증, 피부진균증, 스포로트릭스증 및 그 밖의 피하 진균증, 분아균증, 히스토플라스마증, 콕시디오이데스진균증, 파라콕시디오이데스진균증, 폐포자충증, 아구창, 결핵, 미코박테륨증, 호흡기 감염, 성홍열, 폐렴, 고름딱지증, 류마티스 열, 폐혈증 (sepsis), 패혈증 (septicaemia), 피부 및 내장 리슈만편모충증, 각막 가시아메바증, 낭성 섬유증, 장티푸스, 위창자염 및 용혈요독증후군. 항-C. 알키반스 활성이 AIDS 환자에서 감염을 치료하는데 특히 유용하다.

면역화의 효능은 조성물의 투여 후 β-글루칸에 대한 면역 반응 (예를 들어, 항-β-글루칸 항체)을 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 치료학적 처치의 효능은 본 발명의 조성물의 투여 후 미생물 감염을 모니터링함으로써 평가될 수 있다.

포유동물은 바람직하게는 인간이나, E. 콜라이 질환이 또한 이들 종에 문제가 될 수 있기 때문에 예를 들어, 소, 돼지, 고양이 또는 개일 수 있다. 본 명세서는 포유동물 및 포유류 대상체를 언급하나, 본원에 기재된 폴리사카라이드 컨주게이트는 또한, 조류 종 예컨대, 닭 및 오리에 유용하며, 따라서, 본원에 포유동물 또는 포유류가 언급되어 있다면, 조류 또한 포함될 수 있다. 백신이 예방용인 경우, 인간은 바람직하게는 아동 (예를 들어, 토들러 또는 유아) 또는 십대이며; 백신이 치료용인 경우, 인간은 바람직하게는 십대 또는 성인이다. 아동용 백신은 예를 들어, 안전성, 투여량, 면역원성 등을 평가하기 위해 성인에게 투여될 수 있다.

치료학적 처치의 효능을 검사하기 위한 한 방법은 본 발명의 조성물의 투여 후 E. 콜라이 감염을 모니터링하는 것을 포함한다. 예방학적 처치의 효능을 검사하기 위한 한 방법은 조성물의 투여 후 본 발명의 조성물 중의 항원에 대한 전신적 (예컨대, IgG1 및 IgG2a 생성 수준 모니터링) 및/또는 점막 (예컨대, IgA 생성 수준 모니터링) 면역 반응을 모니터링하는 것을 포함한다. 전형적으로, 항원-특이적 혈청 항체 반응은 면역화 후 그러나, 챌린지 전에 측정되는 반면, 항원-특이적 점막 항체 반응은 면역화 후 및 챌린지 후에 측정된다.

본 발명의 조성물의 면역원성을 평가하기 위한 또 다른 방법은 면역블롯 및/또는 마이크로어레이에 의해 환자 혈청 또는 점막 분비를 스크리닝하기 위한 단백질을 재조합적으로 발현시키는 것이다. 단백질과 환자 샘플 간의 양성 반응은 환자가 해당 단백질에 대한 면역 반응을 시작하였음을 나타낸다. 이러한 방법은 또한 면역지배적 항원 및/또는 항원 내의 에피토프를 검정하는데 이용될 수 있다.

백신 조성물의 효능은 또한 E. 콜라이 감염의 동물 모델 예를 들어, 기니아 피그 또는 마우스를 백신 조성물로 챌린지함으로써 생체내에서 측정될 수 있다. ExPEC 및 치명적 폐혈증의 쥣과 모델이 참고 문헌 94에 기술되어 있다. 코튼 랫 모델은 참고 문헌 95에 기술되어 있다.

본 발명의 조성물은 일반적으로 환자에 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 (예를 들어, 피하, 복강내, 정맥내, 근육내 또는 조직의 사이 공간에) 주입, 또는 점막으로 예를 들어, 직장, 경구 (예를 들어, 정제, 스프레이), 질, 국부, 경피 또는 피부 통과, 비내, 안구, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 달성될 수 있다. 신규한 직접 전달 형태는 또한, 식품에 본원에 기술된 펩티드의 유전자이식 발현 예를 들어, 감자에서의 유전자이식 발현을 포함할 수 있다.

본 발명은 전신 및/또는 점막 면역성을 유도하는데 바람직하게는, 향상된 전신 및/또는 점막 면역성을 유도하는데 이용될 수 있다.

바람직하게는, 향상된 전신 및/또는 점막 면역성은 향상된 TH1 및/또는 TH2 면역 반응에 반영된다. 바람직하게는, 향상된 면역 반응은 IgG1 및/또는 IgG2a 및/또는 IgA의 생성 증가를 포함한다.

투여는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄에 의해 이루어질 수 있다. 다중 용량은 일차 면역화 스케줄 및/또는 부스터 면역화 스케줄에 이용될 수 있다. 다중 용량 스케줄에서, 다양한 용량이 동일하거나 상이한 경로 예를 들어, 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 주어질 수 있다. 다중 용량은 전형적으로, 적어도 1주 (예를 들어, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 6 주, 약 8 주, 약 10 주, 약 12 주, 약 16 주, 등) 간격을 두고 투여될 것이다.

본 발명의 백신은 아동 및 성인 둘 모두를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 인간 환자는 1 세, 1-5 세, 5-15 세, 15-55 세 미만, 또는 적어도 55 세일 수 있다. 백신을 수용하기에 바람직한 환자는 노인 예를 들어, >50 세, >60 세, 및 바람직하게는 >65 세), 어린이 (예를 들어, <5 세), 입원 환자, 보건 전문가, 병과 또는 군 요원, 임산부, 만성 환자 또는 멱역결핍 환자이다. 백신은 이들 군에 대해 전적으로 적합한 것은 아니나, 개체군에서 더욱 일반적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 백신은 특히 외과 수술이 예상되는 환자 또는 기타 입원 환자에 유용하다. 이들은 또한, 카테터 삽입될 환자에 유용하다. 이들은 또한 청소년 여성 (예를 들어, 11-18 세) 및 만성 요로 감염 환자에 유용하다.

본 발명의 백신은 다른 백신과 실질적으로 동시에 (예를 들어, 동일한 의학적 진찰 동안 또는 보건 전문 또는 백신접종 센터로의 외래 동안), 예를 들어, 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 컨주게이팅된 H. 인플루엔자 타입 b 백신, 불활성화된 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 메닝고코커스 컨주게이트 백신 (예컨대, 4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 등과 실질적으로 동시에 환자에 투여될 수 있다.

일반적 사항

본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당해 기술 내에서 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 통상적인 방법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 참고 문헌 96-97 등 참조.

용어 "포함하는"은 "구성하는" 뿐만 아니라 "포함하는"을 포함하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 오로지 X만으로 구성될 수도 있고, 추가적인 어떤 것, 예를 들어, X + Y를 포함할 수 있다.

숫자 x와 관련된 용어 "약"은 예를 들어, x ± 10%를 의미한다.

"GI" 넘버링이 본원에 사용된다. GI 번호, 또는 "GenInfo Identifier"는, 서열이 이의 데이터베이스에 추가되었을 때 NCBI에 의해 처리된 각 서열 기록에 연속적으로 할당된 숫자 시리즈이다. GI 번호는 서열 기록의 접근 번호와 유사성을 갖지 않는다. 서열이 업데이트 될 때 (예를 들어, 정정 또는 더 많은 주석 또는 정보를 추가하기 위해) 그때 새로운 GI 번호를 받게 된다. 따라서 주어진 GI 번호에 관계된 서열은 절대 변하지 않는다.

2개 아미노산 서열 사이의 백분율 서열 동일성에 관한 기준은 정렬했을 때, 아미노산의 백분율이 두 서열을 비교했을 때와 같다는 것을 의미한다. 이러한 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성 퍼센트는 당해 기술분야에 공지된 소프트웨어 프로그램 예를 들어, 참고문헌 98의 7.7.18 섹션 설명된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 갭 오픈 패널티가 12이고 갭 익스텐션 페널티가 2, BLOSUM 매트릭스가 62인 아핀 갭 검색 (affine gap search)을 이용한 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 참고 문헌 99에 개시되어 있다.

당업자는 "분리된"이 이의 천연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변경됨을 의미하며, 즉, 자연적으로 발생하는 경우, 이의 원래 환경으로부터 교체되거나 제거되거나 교체되고 제거되는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 생 유기체에 자연적으로 존재하는 폴리누클레오티드 또는 펩티드는 이러한 생 유기체에 존재하는 경우 "분리"되지 않으나, 이의 자연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리누클레오티드 또는 펩티드는 "분리"된다 (본 용어가 본 발명에 사용되는 경우). 또한, 형질전환, 유전자 조작 또는 그 밖의 재조합 방법에 의해 유기체로 유입되는 폴리누클레오티드 또는 펩티드는 살아있거나 살아있지 않을 수 있는 상기 유기체에 여전히 존재한다 하더라도 "분리"된 것으로 이해될 것이며, 단 이러한 형질전환, 유전자 조작 또는 그 밖의 재조합 방법이 자연 발생 유기체로부터 달리 구분가능하지 않는 유기체를 생성하는 경우는 제외한다.

도 1은 사카라이드 컨주게이트 백신에 대한 제안된 작용 메카니즘을 보여준다.
도 2는 사카라이드 컨주게이트 백신에 대한 새로운 제안된 작용 메카니즘을 보여준다.
도 3은 하기 기술된 실시예에 사용된 선형 컨주게이트 및 컨주게이트에 대한 바람직한 연결 지점을 보여준다.
도 4는 2개 유형의 글리코펩티드를 보여준다: 올리고MenC 컨주게이트에 대한 선형 컨주게이트 구조 및 폴리MenC 컨주게이트에 대한 비선형 컨주게이트 구조.
도 5는 선형 올리고MenC-펩티드 컨주게이트를 제조하기 위한 화학적 도식을 보여준다. (a) 50mM 최종 농도의 암모늄 아세테이트, 1의 10% DMSO 90% MeOH 용액중 10mM 최종 농도의 소듐 시아노보로하이드리드 (5mg/ml, 50℃, 24-72h). (b) 아미노 기에 대해 10 당량의 술포-EMCS 링커, 5 당량의 Et₃N, DMSO:H₂O (9:1). (c) PBS 1X에서 3 당량의 펩티드 (펩티드에 있어서 3mg/ml).
도 6은 말레이미도 기의 도입 후 올리고MenC의 ¹H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 7은 펩티드 단독 (레인 2)과 비교하여 글리코펩티드 올리고MenC-펩티드 (레인 3)의 런닝 완충액으로서 MES를 사용한 SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris를 보여준다; 실시예에 기술된 모든 컨주게이트는 유사한 SDS-PAGE 프로파일을 가졌다.
도 8은 펩티드 Met6 (청색 라인) 및 올리고MenC (적색 라인)과 비교하여 올리고MenC-Met6 컨주게이트 (핑크 라인)의 RP-HPLC 용리 프로파일을 보여준다 (Jupiter C18 칼럼, 95%의 H₂O 및 5% ACN으로부터 45%의 ACN까지의 0.1% TFA를 이용한 H₂O - ACN의 구배; 유량 0.1 ml/min. 실시예에 기술된 모든 컨주게이트는 유사한 프로파일을 보여주었다.
도 9는 폴리MenC-펩티드 컨주게이트를 제조하는데 사용된 화학 공정을 보여준다: (a) MES 완충액 pH4.56중 EDAC 20%, KMUH 20%, 사카라이드에 있어서 2mg/ml; (b) PBS 1X pH 7중에 도입된 링커의 몰에 대한 3 당량의 펩티드, 펩티드에 있어서 3mg/ml.
도 10은 사카라이드 사슬 몰 당 약 35 mol 말레이미도 기의 혼입을 보여주는 KMUH로의 유도체화 후의 폴리사카라이드의 대표적인 ¹H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 11은 펩티드 단독 (레인 2)과 비교하여 폴리MenC-펩티드 컨주게이트 (레인 3)의 런닝 완충액으로서 MES를 사용한 대표적인 SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris를 보여준다. 모든 컨주게이트는 유사한 성향을 보여주었다.
도 12는 펩티드 Met6 단독 (청색 라인) 및 폴리MenC 단독 (흑색 라인)과 비교한 폴리MenC-Met6 컨주게이트 (핑크 라인)의 대표적인 RP-HPLC 프로파일 세트를 보여준다. Jupiter C18 칼럼, 95%의 H₂O 및 5% ACN으로부터 45%의 ACN까지의 0.1% TFA를 이용한 H₂O - ACN의 구배; 유량 0.1 ml/min. 모든 컨주게이트는 유사한 프로파일을 보여주었다.
도 13은 폴리MenC-Met6 컨주게이트 (적색 라인)와 비교하여 올리고MenC-Met6 컨주게이트(핑크 라인)의 RP-HPLC 프로파일을 보여주며, C18 칼럼과의 상이한 상호작용을 보여준다. Jupiter C18 칼럼, 95%의 H₂O 및 5% ACN으로부터 45%의 ACN까지의 0.1% TFA를 이용한 H₂O - ACN의 구배; 유량 0.1 ml/min. 모든 컨주게이트는 유사한 프로파일을 보여주었다.
도 14는 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)으로서 보고된, ELISA 검정 (펩티드를 갖는 코팅 플레이트)에 의해 측정된 바와 같은 Met6 및 Fba 펩티드에 대한 폴리MenC 컨주게이트에 의해 유도된 IgG 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 0.2).
도 15는 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)으로서 보고된, ELISA 검정 (글리코펩티드를 갖는 코팅 플레이트)에 의해 측정된 각 글리코컨주게이트에 대한 폴리MenC 컨주게이트에 의해 유도된 IgG 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 0.2).
도 16은 사카라이드 약 16 mol 당 1 mol의 링커의 도입을 보여주는 KMUH 링커로의 유도체화 후의 폴리사카라이드의 대표적인 ¹H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 17은 펩티드 단독 (레인 2)과 비교하여 폴리MenC-펩티드 컨주게이트 (레인 3)의 런닝 완충액으로서 MES를 사용한 대표적인 SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris를 보여준다. 모든 컨주게이트는 유사한 성향을 보여주었다.
도 18은 폴리MenC-펩티드 컨주게이트를 제조하는데 사용된 공정을 보여준다: (a) MES 완충액 pH4.56중 EDAC 20%, 2.3 당량 KMUH 링커, 사카라이드에 있어서 2mg/ml; (b) PBS 1X pH 7중에 도입된 링커의 몰에 대한 3 당량의 펩티드, 펩티드에 있어서 3mg/ml.
도 19는 자유 펩티드 (청색 라인) 및 폴리사카라이드 단독 (흑색 라인)과 비교한 폴리MenC-PV1 N-말단 컨주게이트 (핑크 라인)의 HPLC 프로파일을 보여준다; HPLC-SEC, Superdex Peptide 칼럼, NaPi 20mM, NaCl 250mM pH7, 0.05ml/min, 등용매 조건. 모든 컨주게이트는 유사한 프로파일을 보여주었다.
도 20은 사카라이드 약 17 mol 당 1 mol의 링커의 도입을 보여주는, BMPH 링커로의 유도체화 후의 폴리사카라이드의 대표적인 ¹H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 21은 펩티드 단독 (레인 2)과 비교하여 폴리MenC-펩티드 컨주게이트 (레인 3)의 런닝 완충액으로서 MES를 사용한 대표적인 SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris를 보여준다. 모든 컨주게이트는 유사한 성향을 보여주었다.
도 22는 폴리MenC-펩티드 컨주게이트를 제조하는데 사용된 공정을 보여준다: (a) MES 완충액 pH4.56중 EDAC 20%, 2.3 당량 BMPH 링커, 사카라이드에 있어서 2mg/ml; (b) PBS pH 7중에 도입된 링커의 몰에 대한 3 당량의 펩티드, 펩티드에 있어서 3mg/ml.
도 23은 펩티드의 혼합물 (레인 2)과 비교하여 폴리MenC-MIX 펩티드 컨주게이트 (레인 3)의 런닝 완충액으로서 MES를 사용한 대표적인 SDS-PAGE 4-12% B-T를 보여준다.
도 24는 폴리MenC-MIX 펩티드 컨주게이트를 제조하는데 사용된 공정을 보여준다: (a) MES 완충액 pH4.56중 EDAC 20%, 2.3 당량 BMPH 링커, 사카라이드에 있어서 2mg/ml; (b) 1 당량의 각 펩티드의 혼합물 (링커의 몰 대비 전체 3 당량) PBS pH 7.
도 25는 Fba 펩티드의 ¹H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 26은 Met6 펩티드의 ¹H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 27은 Hpw1 펩티드의 ¹H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 28은 1:1:2 비의 Fba, Hpw1 및 Met6에 연결된 컨주게이트의 ¹H NMR을 보여준다.
도 29는 제 2 세트의 면역원성 검정으로 비교한 다양한 컨주게이트를 보여준다.
도 30은 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)으로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 CPS 메닝고코커스 혈청군 C에 대한 폴리MenC 컨주게이트에 의해 유도된 IgG 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 1).
도 31은 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)으로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 포스트2 (청색) 및 포스트3 (적색)에서 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C에 대한 폴리MenC-PV1 C- 및 N-말단 컨주게이트에 의해 유도된 IgG 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 1).
도 32는 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)으로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 IgG 역가 (녹색)와 비교한 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C (적색)에 대한 폴리MenC-PV1 C- 및 N-말단 컨주게이트에 의해 유도된 IgM 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 1).
도 33은 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)으로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 각 펩티드에 대한 폴리MenC-PV1 C- 및 N-말단 컨주게이트에 의해 유도된 IgG 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 1).
도 34는 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C, W-135 및 Y의 반복 단위체의 화학 구조를 보여준다.
도 35는 폴리MenW 및 폴리MenY와 Ova 펩티드의 컨주게이트를 제조하는데 사용된 화학 공정을 보여준다:(a) 사카라이드에 있어서 10mg/ml를 수득하기 위한 NaPi 10mM pH 7중 NaIO4 0.1M, 30 몰%의 시알산 (2h, 실온, 어둠하에) (b) NaBH3CN (2 당량), NaPi 50mM중 Ova 펩티드 (1.5당량), NaCl 200mM, pH7, 5일, 37℃.
도 36은 시알산 (30%)의 산화 후 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 W-135의 ¹H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 37은 시알산 (30%)의 산화 후 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 Y의 ¹H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 38은 Ova 펩티드 (레인 2)와 비교한 컨주게이트 12 (레인 3) 및 13 (레인 4)의 런닝 완충액으로서 MES를 사용한 대표적인 SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris를 보여준다.
도 39는 폴리MenC-Ova 펩티드 컨주게이트를 제조하는데 사용된 화학 공정을 보여준다: (a) MES 완충액 pH4.56중 EDAC 20%, 2.3 당량 KMUH 링커 또는 BMPH 링커, 사카라이드에 있어서 2mg/ml; (b) PBS 1X pH 7에 도입된 링커 몰에 대한 3 당량의 Ova 펩티드 GGC, 펩티드에 있어서 3mg/ml.
도 40은 컨주게이트 14 및 15의 런닝 완충액으로서 MES를 사용한 SDS-Page 4-12% Bis-Tris를 보여준다.
도 41은 폴리MenC-Ova 펩티드 컨주게이트를 제조하는데 사용된 화학 공정을 보여준다: (a) MES 30mM pH 6에서 EDAC 1 당량, 술포 NHS 1당량, Ova 펩티드 1 당량, 펩티드에 있어서 3mg/ml.
도 42는 컨주게이트 폴리MenC-Ovap 16의 진행 완충액으로서 MES를 사용한 SDS-Page 4-12% Bis-Tris를 보여준다.
도 43은 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)으로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C에 대한 폴리MenC-Ova 펩티드 컨주게이트에 의해 유도된 IgG 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 1).
도 44는 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)으로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 포스트2 (청색) 및 포스트3 (적색)에서 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C에 대한 폴리MenC-Ova 펩티드 컨주게이트에 의해 유도된 IgG 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 1).
도 45는 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 각 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 W 및 Y에 대한 폴리MenW-Ova 펩티드 및 폴리MenY-Ova 펩티드 폴리컨주게이트에 의해 유도된 IgG 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 1).
도 46은 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 Ova 펩티드에 대한 폴리MenC- W- Y-Ova 펩티드 컨주게이트에 의해 유도된 IgG 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 1).
도 47은 GMT (신뢰 구간 95%를 갖는 기하평균)로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C에 대한 폴리MenC-PV1 C- 및 N-말단 컨주게이트에 의해 유도된 다양한 IgG 서브타입에 있어서의 역가를 보여준다 (컷 오프 OD 1).
도 48은 혈청군 C로부터의 천연 메닝코코커스 폴리사카라이드간의 경쟁 ELISA를 보여주며, (A) 폴리MenC 컨주게이트 (주황색 라인), (B) N-말단 링커를 단독으로 갖는 PV1 에피토프 (청색) 및 (C) 억제율로서 보고된, ELISA 검정에 의해 측정된 라미나린 사카라이드 음성 대조군 (녹색).

실시예

개요

수막구균성 질환은 이의 극도로 빠른 발병 및 진행으로 인해 대중 보건에 대한 현저한 관심을 받고 있다; 질환은 수시간에 치명적일 수 있다. 표면 폴리사카라이드는 주요 질환-초래 메닝고코커스 혈청군 A, C, W-135 및 Y에 대한 백신을 위한 오래된 주요 항원이었다 [Bardotti, A. et al . Vaccine, 2008, 26(18), 2284-2296; Broker, M. et al . Vaccine, 2009, 27(41), 5574-5580; Fusco, P.C. et al . Clin Vaccine Immunol. 2007, 14(5), 577-584]. 담체 단백질로의 폴리사카라이드의 컨주게이션은 이의 면역원성을 향상시키고 T-세포 의존성 (TD) 반응의 유도를 허용하는 중요한 대중 건강 이점을 부여하였다 [Pollard, A.J. et al . Nat . Rev . Immunol. 2009, 9(3), 213-220; Ada, G. et al . Clin . Microbiol . Infect. 2003, 9(2), 79-85]. 따라서, 메닝고코커스 혈청군으로부터의 사카라이드는 본원에 기재된 컨주게이트를 설명하기 위한 예시적 사카라이드를 제공한다. 비선형 컨주게이트 및 PV1 폴리에피토프 컨주게이트를 조사하기 위해, 본 발명자들은 사카라이드 컨주게이트의 면역학적 특성을 연구하였으며, 여기에서 전체 담체 단백질은 선형 또는 비선형 컨주게이션을 갖는 합성 T-세포 에피토프 펩티드로 치환하였다.

하기 기술된 바와 같이, 제 1 패널의 펩티드는 이들의 C-말단에서 메닝고코커스 혈청군 C로부터의 올리고사카라이드에 컨주게이팅되었다. 펩티드는 캔디다 알비칸스의 세포 벽 단백질 [Xin, H. et al . PNAS 2008, 105, 13526-13531] 및 N19 폴리에피토프 담체 펩티드에 사용된 파상풍 독소 에피토프 [Baraldo, K. et al . Infect. Immun . 2004, 72,4884-4887]로 유래되었다. 펩티드는 2개의 상이한 메닝고코커스 혈청군 C 사카라이드에 컨주게이팅되었다: 올리고사카라이드 (올리고MenC) 및 폴리사카라이드 (폴리MenC). 컨주게이트 (애주번트로서 알루미늄 하이드록시로 제형화되거나 제형화되지 않은) 어느 것도 사카라이드에 대한 IgG 반응을 유도하지 못하였다. 단지 폴리MenC-Fba 컨주게이트 및 폴리MenC-Met6 컨주게이트 만이 펩티드에 대한 IgG 반응을 유도하였다 (둘 모두 캔디다 알비칸스의 세포 벽 단백질로부터).

컨주게이트의 면역원성 및 컨주게이트는, 모든 펩티드가 사카라이드에 연결된 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프인지의 여부에 상관없이, 여러 변수 예컨대, 펩티드의 결합, 이의 N-말단 대 C-말단에서 또는 이 근부에서의 펩티드, 사카라이드 사슬로의 펩티드 로딩 정도, 링커 또는 스페이서 길이에 의해 영향을 받을 수 있다[예를 들어, 문헌 [Chong, P. et al . Infection and Immunity, 1997, 65, 4918-4925] 참조]. 이들 변수 모두는 하기 실시예에서 평가되었으나, 이들 변수 어느 것도 관련성을 입증하지 못하였다 (아마도 T-세포 에피토프로서 단지 낮은 면역원성을 제공하는 제 1 세트의 실험에 있어서 선택된 펩티드로 인해). 제 2 패널 펩티드의 평가로부터, 본 발명자들은 단백질 폴리오바리어스 타입1으로부터 유래된 PV1 펩티드가 전통적인 담체 단백질에 대한 효과적인 치환기이며; 특히 이의 N-말단에 연결된 PV1 펩티드는 통상적인 담체 단백질 (MenC-CRM 컨주게이트)에 필적하는 항체 역가를 유도함을 발견하였다.

추가로, 오브알부민 단백질 (OVA)로부터 유래된 펩티드가 또한 폴리사카라이드 GBS 타입 III에 대한 효과적인 담체 펩티드인 것으로 밝혀졌기 때문에 [Avci1, F.Y. et al . Nature Medicine, 2011, 17, 1602-1610], 본 발명자들은 이러한 펩티드가 전형적인 전체 담체 단백질-사카라이드 컨주게이트 예컨대, 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C, W-135 및 Y 컨주게이트를 대체할 수 있음을 하기 실시예에서 입증하였다. 하기 면역학적 평가는 Ova 펩티드가 혈청군 C로부터의 메닝고코커스 폴리사카라이드에 대한 우수한 담체이나, 혈청군 W-135 및 Y로부터의 메닝고코커스 폴리사카라이드에 대해서는 우수하지 않았음을 보여준다.

도입

1차 실험에 있어서, T-세포 에피토프를 선형 컨주게이트로서 혈청군 C로부터의 메닝고코커스 올리고사카라이드 및 비선형 컨주게이트로서 혈청군 C로부터의 메닝고코커스 폴리사카라이드에 컨주게이팅하였다. 본 발명자들은 T-세포 에피토프를 사용하였으며, N19 폴리에피토프 담체 펩티드로부터 2개의 파상풍 유래된 펩티드 (P30TT 및 P32TT), 상이한 병원체로부터 유래된 다중 CD4+ T 세포 에피토프를 갖도록 설계된 재조합 펩티드를 선택하였다. 본 발명자들은 또한 캔디다 알비칸스의 세포벽 단백질로부터 유래된 5개 펩티드 (Hpw1, Eno1, Gap1, Fba, Met6)를 평가하였다.

이러한 합성 펩티드는 외부 실험실에서 구입하였다. 펩티드는 사카라이드에 부착하기 위한 C-말단에서 펩티드 링커를 갖도록 합성하였다.

이들 실시예에 사용된 P30TT 및 P32TT 펩티드는 N19 펩티드에서 발견된 파상풍 독소 에피토프로부터 유래되었다. N19 펩티드는 에스체리치아 콜라이에서 발현된 유전적으로 조작된 폴리에피토프 담체 펩티드이며, 수개의 인간 CD4+ T-세포 범용 에피토프로 구성되며, 이는 Hib 폴리사카라이드에 컨주게이팅되는 경우 강한 담체로서 작용한다. 시험관 내에서 인간 세포의 연구에서 N19 펩티드에서의 이러한 에피토프가 올바르게 처리되고 인식되고 에피토프-특이적 T 세포 증식을 유도할 수 있음을 보여줬다. 후속 연구에서는 에피토프 (P32TT, P30TT, P23TT) 특이적 T-세포 전구체가 N19-MenACWY 컨주게이트로의 면역화 후 마우스의 생체내에서 발생하였음을 보여줬다; 그 밖의 결과는 시험관 내에서 마우스 항원-제시 세포가 N19 펩티드를 처리하고 올바른 에피토프를 발생시킬 수 있으며, 이는 이어서 단일 펩티드로 생체내 면역화에 의해 프라이밍된 특이적 T 세포를 재활성화시킬 수 있음을 명백히 입증하였다 [Baraldo, K. et al . Infect Immun. 2005, 73(9), 5835-5841].

이러한 제 1 세트 실시예에 대한 추가적인 펩티드는 인간 파종성 칸디다증의 발병 동안 이들의 공지된 발현을 기반으로 하여 캔디다 알키반스 세포 벽 단백질로부터 선택되었으며, 하기를 포함한다: 균사 벽 단백질-1 (Hpw1), 에놀라제 (Eno1), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (Gap1), 프룩토스-비스포스페이트 알돌라제 (Fba) 및 메틸테트라하이드로프테로일트리글루타메이트 (Met6). 마우스 면역화 후, 항원-펄싱된 수지상 세포 (DC)-기반 백신 요법을 이용하여, 각 합성 펩티드에 커플링된 합성 β-1,2-연결된 만노트리오스를 갖는 컨주게이트는 면역원성이었으며; 게다가, 백신화는 실험 파종성 칸디다증에 대한 보호를 보여주었다 [Xin, H. et al . PNAS, 2008, 105, 13526-13531]. 추가의 연구는 모든 이러한 펩티드중, Fba 단독이 칸디다증에 대한 항체 반응 및 보호를 유도하였음을 보여주었다.

제 1 세트의 실험에 있어서, 본 발명자들은 박테리아로부터 추출되고 정제된 나이세리아 메닌기티디스 혈청군　C로부터의 천연 폴리사카라이드 (전장) 및 av DP18 (평균 중합도)의 올리고사카라이드를 사용하였다.

일가 메닝고코커스 혈청군 컨주게이트 백신은 전세계 많은 국가에 성공적으로 도입되었다 (Menjugate^® 및 Meningitec^TM (여기에서 담체 단백질은 CRM₁₉₇임) 또는 NeisVac-C^TM (여기에서, 담체는 TT임) 또는 Menitorix^® (여기에서, MenC는 Hib와 조합되어 TT에 컨주게이팅됨)) [Trotter, C.L. et al . Lancet, 2004, 364(9431), 365-7; Balmer, P. et al . J Med Microbiol, 2002, 51(9), 717-22]. 게다가, 혈청군 A, C, W135 및 Y을 아우르는 사가 컨주게이트 백신이 개발되었으며, 이는 전세계 뇌수막염 발생의 현격한 저하에 기여하였다. 현재 시중에서 입수가능한 사가 메닝고코커스 컨주게이트 백신인 Menactra^TM, Menveo^® 및 Nimenrix^TM는 사카라이드 사슬 길이, 담체 단백질 (각각 DT, CRM₁₉₇ 및 TT) 및 컨주게이션 화학반응에 있어서 상이하다 [Gasparini, R. and Panatto, D. Human Vaccines 2011, 7(2), 170-82; Jackson, L.A. et al . Clin Infect Dis 2009, 49(1), 1-10; Reisinger , K.S. et al. Clin Vaccine Immunol 2009, 16(12),1810-5; Halperin, S.A. et al. Vaccine 2010, 28(50), 7865-72]. 이와 같이, 본 발명의 컨주게이트에 필적할 수 있는 전통적인 담체 단백질에 컨주게이팅된 메닝고코커스 혈청군 C 사카라이드에 대한 많은 데이타가 존재한다.

글리코펩티드의 면역원성에 영향을 끼치는 일부 특징 예컨대, N-말단에 연결된 펩티드 대 C-말단에 연결된 펩티드, 사카라이드 사슬에 연결된 펩티드 밀도, 펩티드를 사카라이드에 컨주게이팅시키기 위한 다양한 링커 길이, 동일한 사카라이드 사슬에 연결된 다양한 에피토프를 갖는 펩티드의 사용을 평가하는 제 2 세트의 실험은 수행하였다. 어떻게 이러한 변수들이 본원에 기재된 컨주게이트의 면역원성에 영향을 끼칠 것인가에 대한 추가적인 안내를 당업자에게 제공할 수 있는 상당한 양의 문헌이 존재한다. 예를 들어, 해모필루스 인플루엔자 타입 b 글리코컨주게이트를 사용하여 수득된 결과는 T-세포 에피토프에 대한 사카라이드 부분의 배향이 사카라이드에 대한 숙주 면역 반응에 영향을 끼칠 수 있음을 시사하였다. 펩티드의 C-말단에서 사카라이드에 연결된 펩티드를 갖는 사카라이드 컨주게이트는 펩티드의 N-말단을 통해 연결된 이들의 위치 이성질체보다 5-10배 더 낮은 항-사카라이드 항체 반응을 유도하였다 [Chong, P. et al. Infection and Immunity, 1997, 65, 4918-4925]. 이들 결과는 Alonso De Velasco의 작업에 의해 지지되며, 여기에서 T-세포 에피토프의 N-말단에 컨주게이팅된 스트렙토코커스 뉴모니애의 폴리사카라이드는 펩티드의 C-말단에 커플링된 PS를 갖는 컨주게이트에 유도된 것보다 현저하게 더 높은 항-PS 항체 반응을 유도하였다. C-말단에서 PS를 갖는 컨주게이트에 대한 면역원성의 차이는 PS로부터 T-세포 에피토프 (C-말단)를 효과적으로 절단하여 이를 주조직접합성 복합체 (MHC) 클래스 II 분자에 있어서 헬퍼 T 세포에 제시할 수 없는 항원-제시 세포의 무능력으로 인한 것이었다 [De Velasco, E.A. et al. Infection and Immunity, 1995, 63, 961-968]. 글리코펩티드의 작업 모델에 대한 연구는 이러한 후자의 컨주게이트가 클래스 II MHC 분자에 결합할 수 있으며, 특이적 T 세포 반응을 유도함을 보여줬다. 실제로, 글리코펩티드에 대한 특이적 T 세포 하이브리도마를 생성할 수 있으나 상응하는 비-글리코실화된 펩티드에 대한 것은 생성할 수 없다. 게다가, 탄수화물 모이어티는 T 세포에 의해 인식된 결정인자에 중요한 입체형태적 영향을 끼쳤다; T-세포는 탄수화물 영향하에 펩티드 잔기를 인식하였으며, 펩티드 내 합텐의 위치는 T 세포 인식에 결정적이었다. 또한, 사카라이드 합텐과 펩티드간의 간격은 면역원성에 영향을 끼칠 수 있다 [Harding, C.V. et al. The Journal of Immunology, 1993, 151, 2419-2425].

이러한 배경을 염두해 두고, 본 발명자들은 B 세포 (사카라이드)와 T 세포 에피토프 (펩티드) 간의 간격을 감소시키기 위해 다양한 길이의 링커를 갖는 컨주게이트를 평가하였다.

펩티드 로딩에 있어서, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b 컨주게이트에서, 저자는 폴리라이신 주쇄 (MAP) 시스템 상의 펩티드 항원의 다중 복사체의 제시가 이의 면역원성을 향상시킬 수 있어; MHC 클래스 II 유전적 제한을 극복하기 위해 다중 T-세포 에피토프를 작제물 내로 혼입하였음 기술하였다. 이러한 연구는 글리코펩티드의 면역원성이 담체로서 MAP 시스템을 선형 펩티드 대신에 사용하는 경우 향상될 수 있음을 보여줬다 [Chong, P. et al . Infection and Immunity, 1997, 65, 4918-4925].

이를 기반으로 하여, 본 발명자들은 펩티드가 비선형 컨주게이트 형태의 폴리사카라이드 사슬에 커플링되어 더 높은 펩티드 로딩을 허용하고 다양한 펩티드가 동일한 사카라이드에 커플링되게 하며, N19 펩티드와 같은 폴리에피토프 담체 펩티드와 다른 별개의 펩티드에 커플링되는 컨주게이트를 제조하였다.

이러한 세트의 실험에서, 본 발명자들은 또한 N19 펩티드에 사용된 파상풍 독소 에피토프로부터의 또 다른 펩티드인 P2TT 펩티드 [Baraldo, K. et al. Infect. Immun. 2004, 72, 4884-4887]⁴ 및 폴리오바이러스 타입 1의 VP1 단백질의 T-세포 에피토프로서 검정된 PV1 펩티드 [Leclerc, C. et al . Journal of Virology, 1991, 65, 711-718.]를 포함하는, 그 밖의 합성 T-세포 에피토프 펩티드를 평가하였다. 암 백신 조사 분야에서, PV1 펩티드는 글리코시드 종양 마커인 Tn 항원에 컨주게이팅된 수지상 다중 항원 글리코단백질 (MAG) 구조로 사용되었다. MAG:Tn-PV는 인간 종양 세포주를 인식하는 항-Tn IgG 항체를 유도할 수 있으며, 이러한 완전한 합성 면역원으로 수행된 치료학적 면역화 프로토콜은 종양-내포 마우스의 생존을 증가시켰다 [Bay, S. et al. J. Peptide Res. 1997, 49, 620-625; Lo-Man, R. et al. Cancer Research, 1999, 59, 1520-1524].

최종적으로, 실시예는 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 W-135, Y 및 C와 같은 사카라이드에 컨주게이팅된 전통적인 전체 담체 단백질을 대체할 수 있는, 오브알부민 단백질로부터 유래된 Ova 펩티드의 면역학적 능력을 입증하였다. 실제로, 아브실 (Avcil) 등은 이러한 Ova 펩티드가 폴리사카라이드 GBS 타입 III에 대한 우수한 담체임을 보여줬다 [Avci1, F.Y. et al. Nature Medicine, 2011, 17, 1602-1610].

아브실 등은 폴리사카라이드 GBS 타입 III-OVAp 백신의 면역 반응을 여러 백신의 산업적 제작에 현재 사용되는 기법에 의해 작제된 폴리사카라이드 GBS 타입 III-OVA 글리코컨주게이트의 면역 반응과 비교하였다. 이러한 연구는 탄수화물-특이적 T-세포 에피토프의 제시를 최대화시키도록 작제된 III-Ovap가 백신 산업에 의해 현재 이용되는 방법에 의해 작제된 백신에 비해 그룹 B 스트렙토코커스 감염의 신생 마우스 모델에서 50-100배 더욱 강력하며 실질적으로 더욱 보호성임을 보여줬다 [Avci, F.Y. and Kasper, D.L. Annu . Rev. Immunol. 2010, 28, 107-130; Paoletti, L.C. and Kasper, D.L. Expert Opin . Biol . Ther. 2003, 3(6), 975-984].

결과

C-말단 방향을 이용한 T-세포 에피토프 펩티드의 스크리닝: 물리-화학적 특성분석 및 마우스 모델에서 면역학적 평가

컨주게이트의 효능을 입증하기 위해, 본 발명자들은 다양한 공급원으로부터 T-세포 에피토프를 함유하며 펩티드의 공간적 배향, 사카라이드 사슬상의 펩티드 밀도 및 다양한 유형의 펩티드의 다중제시와 같은 면역원성 에 영향을 끼칠 수 있는 여러 특징을 조합시킨 합성 펩티드를 평가하였다.

제 1 세트의 실험에서, 7개의 펩티드를 선택하였다: 이들중 2개는 파상풍 독소로부터 유래된 에피토프이며, N19 펩티드에 사용되며, 이들중 5개는 캔디다 알비칸스의 세포 벽 단백질로부터 유래된 에피토프이다.

표 2는 각 펩티드에 대한 아미노산 서열 및 유기체 공급원을 보여준다.

C-말단상에 사카라이드 항원을 도입시키기 위한 자유 티올 기 (Gly-Gly-Cys)를 갖춘 링커를 함유하는 이들 펩티드를 외부 실험실로부터 구입하였다. 이들은 역상의 HPLC에 의한 정제 후 적어도 85%의 순수 생성물로서 제공되었다.

사카라이드는 (컨주게이트에 사용하기 위한) 혈청군 C로부터 메닝고코커스 올리고사카라이드 avDP 18 및 (컨주게이트에 사용하기 위한) 혈청군 C로부터의 메닝고코커스 폴리사카라이드였다. 이들의 천연 사슬은 반복 단위체로서 시알산 분자의 어셈블리를 특징으로 한다 (예를 들어, 도 3 참조).

컨주게이트를 위한 올리고사카라이드 ("올리고MenC") 및 컨주게이트를 위한 폴리사카라이드 ("폴리MenC")로의 상이한 펩티드를 컨주게이팅시켜 2개의 상이한 구조를 수득하여 컨주게이트를 제조하였다: 선형 컨주게이트 또는 비선형 컨주게이트. 올리고MenC-펩티드 컨주게이트는 올리고사카라이드 및 펩티드 에피토프간의 1:1 몰 비를 가짐을 특징으로 하는 선형 컨주게이트로서 합성되는데, 이는 사카라이드가 단지 환원 말단에 링커로 유도되기 때문이다. 폴리MenC-펩티드 컨주게이트는 사카라이드 사슬을 따라 시알산 분자의 카르복실 기 상으로의 링커 도입으로 인해 천연 폴리사카라이드의 사슬을 따라 연결되는 펩티드 에피토프를 특징으로 하는 비선형 컨주게이트로서 합성되었다 (예를 들어, 도 4 참조).

올리고 MenC 컨주게이트

환원적 아민화 후 메닝고코커스 올리고사카라이드 혈청군 C를 술포-EMCS (N-엡실론-말레이미도카프로일-옥시술포숙신이미드 에스테르) 링커를 사용하여 유도체화시켰다. 따라서, 말레이미도를 각 펩티드의 자유 티올 기와 반응할 수 있는 사카라이드 사슬의 환원 말단에 도입하였다 (도 5).

유도체화 후 올리고사카라이드를 아세톤으로의 침전에 의해 정제하고 이어서, ¹H NMR에 의해 특성분석하고, 환원 말단에서 말레이미도 모이어티의 도입을 확인하였다 (도 6).

밤새 유도체화 및 컨주게이션 후, 컨주게이션 반응을 SDS-Page 4-12% Bis-Tris에 의해 확인하였다 (예를 들어, 도 7 참조). 상이한 펩티드와 이의 C-말단을 통해 연결된 모두 7개 올리고MenC 컨주게이트 각각을 수득하였다.

컨주게이트를 사전-패킹된 Superdex Peptide 칼럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하여 자유 펩티드를 제거하고 이어서, 암모늄 술페이트로 침전시켜 자유 사카라이드를 제거하였다.

정제된 글리코펩티드는 Jupiter C18 칼럼을 사용하는 RP-HPLC 분석에 의해 특성분석하였다 (도 8). 올리고MenC-Met6 컨주게이트에 대한 단지 하나의 예시적인 HPLC 프로파일이 포함된다; 모든 컨주게이트는 유사한 프로파일을 보여주었다.

HPLC 프로파일에서 알 수 있는 바와 같이, 컨주게이션 후 올리고MenC 컨주게이트는 펩티드와 올리고MenC 단독간의 중간체 성향을 나타냈는데, 왜냐하면 이는 올리고MenC 보다는 긴 시간 동안 그러나 펩티드보다는 짧은 시간 동안 칼럼상에 유지되기 때문이다 (핑크 라인).

정제 후, 단백질 함량을 MicroBCA 비색 검정에 의해 추정하고 레조르시놀 비색 검정에 의해 시알산 함량을 추정하였다. 올리고MenC 모이어티가 다분산성임을 고려하고 선형 구조체의 제조물과 일치되게 사카라이드 및 펩티드의 비는 모든 글리코펩티드에 있어서 표 3에 보고된 바와 같이 대략 1:1이었다.

폴리MenC 컨주게이트

메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C를 유도체화하여 각 펩티드의 티올 기와 반응할 수 있는 말레이미도 모이어티를 도입하였다. KMUH (N-카파-말레이미도운데칸산 하이드라지드-TFA) 링커를 사용하였으며, 이는 EDAC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드) 화학반응을 이용하여 시알산의 카르복실 기와 반응할 수 있기 때문이다 (도 9는 반응식을 보여줌). 제 1 세트의 실험에서, 약 35 mol의 사카라이드 당 1 mol의 KMUH 링커를 ¹H NMR 스펙트럼에 의해 입증된 바와 같이 도입하였다 (도 10 참조).

이러한 제 1 세트의 실험에서, 10개 탄소 원자를 갖는 KMUH를 링커에 사용하여 펩티드와의 컨주게이션 반응에서 입체 장애 문제점을 회피하였다.

사카라이드 사슬 상으로의 말레이미도 모이어티의 도입 후, 각 펩티드와의 컨주게이션 반응을 완충액 포스페이트에서 적당하게 수행하고, 하룻밤 후 글리코펩티드가 SDS-Page 4-12% Bis-Tris에 의해 입증되는 바와 같이 형성되었다 (도 11).

7개의 글리코펩티드를 vivaspin 컷 오프 30kDa에 의해 정제하여 자유 펩티드를 제거하고, 이어서 이들을 C18 칼럼을 사용하는 RP-HPLC에 의해 특성분석하였다. HPLC 프로파일 중 단지 하나의 예만이 폴리MenC-Met6 컨주게이트에 대해 제공되며; 모든 컨주게이트는 유사한 프로파일을 나타냈다 (도 12).

아마도 사카라이드 사슬상의 더 많은 펩티드의 존재로 인해 칼럼과의 증가된 소수성 상호작용 때문에 단독의 펩티드보다 더 긴 이들 컨주게이트는 RP-HPLC 칼럼상에 보유되었다. 다른 한편으로, 폴리MenC 사카라이드 단독은 칼럼에 의해 보유되지 않았으며, 이는 허공 용적의 칼럼에서 용리되었다.

정제 후, 컨주게이트의 사카라이드 함량 및 단백질 함량을 비색 검정 특히, 각각 레조르시놀 및 마이크로 BCA 검정을 이용하여 측정하였다.

표 4에 보고된 바와 같이, 폴리MenC로 제조된 7개의 글리코펩티드는 사카라이드 사슬 상에 펩티드 에피토프가 다중제시되는 비선형 구조체를 나타냈다.

이러한 방법으로, 7개의 선형 컨주게이트를 대략 1:1 올리고-MenC:펩티드 비로 수득하였으며, 각 폴리MenC 사카라이드 사슬 상에 동일한 펩티드 에피토프의 다중 복사체를 갖는 7개의 비선형 컨주게이트를 수득하였다. HPLC 프로파일로 이들의 구조를 확인하였으며, 이는 사카라이드-펩티드의 상이한 비로 인한 올리고MenC 컨주게이트 및 폴리MenC 컨주게이트간의 C18 칼럼과의 상이한 상호작용을 입증한다 (도 13). 따라서, 올리고MenC 컨주게이트 및 폴리MenC 컨주게이트는 펩티드 T-세포 에피토프를 다르게 제시하였다.

제 1 세트의 컨주게이트의 면역학적 평가

상기 기술된 제조된 컨주게이트를 마우스에서의 면역학적 연구로 평가하였다.

면역원성을 Balb/c 마우스에서 평가하였다. 8마리 마우스 군을 사용하였다. 컨주게이트를 애주번트로서의 알루미늄 하이드록시드와 제형화시켰다. 이들을 단독으로 또는 사카라이드에 있어서 투여량 1 ㎍ 또는 0.2 ㎍과 혼합하여 제형화시켰다 (표 5); 애주번트 없이 폴리MenC 컨주게이트의 혼합물로 백신화시킨 마우스 군을 또한 포함시켰다. 올리고MenC-CRM와 올리고MenC-TT 컨주게이트를 양성 대조군으로서 사용하였다; PBS 플러스 애주번트를 음성 대조군으로서 사용하였다. 컨주게이트를 1, 14 및 28일에 피하 투여하였다. 백신접종된 및 대조군 동물을 이차 및 삼차 컨주게이트 주입 후 14일에 채혈하였다.

먼저, ELISA 검정에 의한 삼차 면역화 후 혈청 풀을 분석하여 IgG 항-폴리MenC의 함량을 측정하였다. 올리고MenC 컨주게이트 또는 폴리MenC 컨주게이트 어느 것도 사카라이드에 대한 IgG 반응을 유도할 수 없었다.

글리코펩티드의 투여가 또한 펩티드 모이어티에 대한 IgG 반응을 유도할 수 있는 것으로 보고되었으며, IgG 항-펩티드 반응을 또한 분석하였다. ELISA 검정에 의한 혈청 분석 후, 펩티드에 대한 단지 IgG 반응이 애주번트 존재 및 부재하에 Met6 및 Fba에 컨주게이팅된 폴리MenC 단독에 의해 또는 혼합물에 의해 유도되었다 (도 14).

이들 두 컨주게이트는 또한 도 15에 도시된 바와 같이 각 글리코펩티드에 대한 IgG 역가를 유도할 수 있다.

C-말단 배향을 갖는 이러한 T-세포 에피토프의 스크리닝으로부터, 컨주게이트에 대한 IgG 반응이 Fba 및 Met6 펩티드 (캔디다 알비칸스의 세포 벽 단백질의 에피토프)에 대해서만 관찰되었으며, 이는 단지 펩티드 모이어티를 인식하는 면역 반응의 이동을 나타낸다.

펩티드 배향, 사카라이드 사슬 상으로의 펩티드 로딩, 링커 길이 및 다양한 펩티드의 다중제시의 영향: 물리-화학적 특성분석 및 마우스 모델에서의 면역학적 평가

글리코펩티드의 면역원성에 영향을 끼칠 수 있는 추가적인 변수를 평가하기 위해 추가의 연구를 수행하였다.

이전 실시예로부터 출발하여, 컨주게이트 중 단지 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C를 평가하였다.

여러 특징을 평가하였다: N-말단에 연결된 펩티드 대 C-말단에 연결된 펩티드; 사카라이드 사슬 상의 더 높은 밀도의 펩티드; B-세포와 T-세포 에피토프 간의 간격을 감소시키는, 펩티드를 폴리MenC와 컨주게이팅하는 상이한 링커 길이; 동일한 사카라이드 사슬 상의 다양한 펩티드의 다중제시. 추가로, 또한 P2TT (파상풍 독소 및 사용된 N19 단백질로부터 유래된 또 다른 펩티드 에피토프) 및 PV1 (폴리오바이러스 타입 1의 VP1 단백질로부터 유래된 펩티드 T-세포 에피토프)를 포함하는 합성 T-세포 에피토프 펩티드를 평가하였다 (표 6).

본 연구에서, 자유 티올 기가 구비된 링커를 선택된 펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 도입하여 이들의 상이한 공간 배향을 유도하였다.

더 높은 펩티드 밀도를 갖는 글리코펩티드

사카라이드 사슬 상의 펩티드 밀도를 증가시키기 위해, 폴리사카라이드 사슬의 유도체화 정도를, 동일한 링커 KMUH를 사용하여 증가시켜 ¹H NMR에 의해 확인된 바와 같이 약 16 mol의 사카라이드 당 약 1 mol의 링커를 도입시켜 증가시켰다 (도 16).

각 펩티드와의 후속 컨주게이션 반응 (N- 및 C-말단)이 실온에서 하룻밤 후 완료된 것으로 SDS-Page 4-12% Bis-Tris (예를 들어, 도 17 참조)를 사용하여 확인되었으며, 면역학적 연구에서의 평가를 위해 사카라이드 상에 에피토프 펩티드가 더 많이 로딩된 비선형 컨주게이트를 수득하였다 (도 18 참조).

컨주게이트를 vivaspin 30 kDa에 의해 정제하여 자유 펩티드를 제거하였다. C-말단에서 연결된 PV1을 갖는 컨주게이트 만이 회수되지 않았다. 정제 동안, 겔이 형성되었으며 이는 재용해시키기 어려웠다. 이러한 문제는 아마도 더 긴 친지성 링커 KMUH를 사용한 사카라이드의 증가된 유도체화 및 수개의 소수성 아미노산을 갖는 펩티드의 후속 도입으로 인한 것이다.

정제 후, 글리코펩티드를 Superdex Peptide 칼럼을 사용한 HPLC-SEC에 의해 특성분석하였다. 단지 하나의 대표적인 예가 제공되었다 (PV1 펩티드 N-말단); 모든 컨주게이트는 유사한 프로파일을 나타냈다 (도 19).

C18 jupiter 칼럼은 이들 컨주게이트에 적합하지 않은데 왜냐하면 사카라이드 사슬상의 펩티드 밀도로 인해 칼럼과의 더 높은 소수성 상호작용이 증가하기 때문이다.

마지막으로, 사카라이드 함량을 시알산 검정에 의해 측정하였으며, 단백질 함량은 PV1 C- 및 N-말단 결합에 대해 마이크로 BCA 검정 또는 Lowry 검정에 의해 측정하였다; 이들 데이타는 사카라이드 약 16 mol 당 1 mol의 펩티드의 도입을 확인시켜주었다 (표 7 참조).

더 짧은 링커 ( BMPH )를 갖는 컨주게이트

사카라이드 항원과 T-세포 에피토프 펩티드 사이의 간격을 감소시키기 위해 KMUH 보다 짧은 또 다른 이작용성 링커를 또한 사용하여 폴리사카라이드를 유도체화시켰다. BMPH (N-β-말레이미도프로피온산 하이드라지드-TFA)를 링커로서 사용하여, 사카라이드 사슬의 카르복실 기 상으로 말레이미도 기를 EDAC 화학반응을 이용하여 도입하였으며, 이는 사카라이드와 T-세포 에피토프의 간격을 단지 2개 탄소 원자로 감소시켰다.

BMPH 링커로의 폴리사카라이드 MenC의 유도체화 후, 본 발명자들은 사카라이드 약 17 mol 당 1 mol의 말레이미도 기를 도입하였으며, 이는 또한 이러한 링커를 사용하여 더 높은 펩티드 밀도를 갖는 글리코펩티드의 제조를 허용한다 (도 20).

일단 유도체화되면, 각 펩티드와의 컨주게이션 반응은 SDS-Page 4-12% Bis-Tris에 의해 입증된 바와 같이 실온에서 하룻밤에 걸쳐 완료된 것으로 확입되었다 (도 21 및 도 22).

컨주게이트를 vivaspin 30 kDa로 정제하여 자유 펩티드를 제거하였다; 예외적으로 C-말단 및 N-말단에서 PV1가 연결된 컨주게이트는 사전-패킹된 칼럼 Superdex Peptide를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제 후, 사카라이드 및 단백질 함량을 각각 시알산 및 마이크로 BCA 또는 Lowry 비색 검정에 의해 측정하였다; 이들 데이타는 사카라이드 약 17 mol 당 1 mol의 펩티드 도입을 확인시켜준다 (표 8).

따라서, 다양한 특징들을 조합시킨 6개의 글리코펩티드를 수득하였다: 더 높은 밀도 펩티드, 사카라이드 항원과 에피토프 펩티드 간의 더 짧은 간격 및 상이한 공간 배향을 갖는 펩티드 사용.

동일한 사카라이드 사슬 상의 다양한 펩티드가 다중제시되는 컨주게이트

다양한 펩티드를 동일한 폴리MenC 사카라이드에 컨주게이팅시켜 사카라이드 사슬 상의 다양한 펩티드의 동시적 존재가 MenC에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는지의 여부를 평가하였다. 하기 펩티드를 사용하였다: 그 구조가 표 2에 기록된 Fba, Met6, 및 Hpw1 (C-말단). 이들 펩티드를 각 펩티드에 대해 공통적이지 않은 별개의 ¹HNMR 시그널을 기반으로 하여 선택하였으며, 이는 이들의 컨주게이션 후 ¹H NMR 실험에 의한 용이한 평가를 가능하게 한다.

BMPH 링커를 갖는 말레이미도 모이어티의 도입 후 이들 펩티드를 폴리MenC에 컨주게이팅하였다 (도 24에서 화합물 7a).

컨주게이션 반응은 SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris에 의해 입증되는 바와 같이 실온에서 하룻밤에 수행되었다 (도 23). 펩티드 혼합물을 폴리사카라이드 용액에 첨가하여 반응을 수행하였다 (도 24).

컨주게이트를 vivaspin 컷 오프 30 kDa에 의해 정제하여 자유 펩티드를 제거하고, 컨주게이트의 ¹H NMR 스펙트럼으로 3개의 상이한 펩티드의 도입을 확인하였다 (도 28).

사카라이드 사슬 상의 Met6, Hpw1 및 Fba 간을 구별하기 위해, 본 발명자들은 각 펩티드의 ¹H NMR 스펙트럼을 분석하는 ¹H NMR 분석을 이용하고 일부 대표적인 시그널을 평가하였다.

도 25에 도시된 바와 같이 Fba의 아미노산 서열에는 양성자가 6 내지 7.5 ppm의 시그널을 나타내는 2 Tyr (8H) 및 1 Phe (5H)이 존재하며, 약 1 ppm의 시그널을 갖는 1 Leu (6H) 및 1 Val (6H)이 존재하였다.

Met6 펩티드 구조에서, 본 발명자들은 약 1 ppm 시그널을 갖는 2 Ile (12H) 및 1 Leu (6H)을 확인하였다 (도 22).

Hpw1 펩티드에 있어서, 양성자가 약 7 ppm인 1 Tyr (4H), 약 1 ppm 시그널을 갖는 1 Ile (6H) 및 1 Leu (6H)이 존재하였다 (도 23).

글리코펩티드의 ¹H NMR 스펙트럼으로부터, 본 발명자들은 상이한 펩티드 간의 비가 Fba : Hpw1 : Met6 = 1:1:2임을 측정하였다.

도 28에 도시된 바와 같이, 방향족 양성자의 통합에 의해 본 발명자들은 Fba 및 Hpw1 간의 비 1:1을 확인하였다. Val, Ile, Leu의 양성자의 배치는 Fba 및 Hpw1에 대비 Met6의 양을 규정하게 해준다. 시그널의 통합은 본 발명자들이 Fba 및 Hpw1 펩티드에 대해 2 mol의 Met6 펩티드를 도입시켰음을 보여줬다 (도 28).

순수 컨주게이트의 사카라이드 함량은 시알산 비색 검정에 의해 추정하였으며, 단백질 함량은 마이크로 BCA 비색 검정에 의해 측정하였다.

동일한 폴리MenC 사슬에 컨주게이팅된 다양한 합성 펩티드를 갖는 이러한 컨주게이트의 면역원성을 사카라이드 사슬에 컨주게이팅된 단지 하나의 타입의 펩티드를 갖는 컨주게이트와 비교하였다.

폴리MenC-_BMPH 7a를 사용하여 각각 Met6 및 Hpw1을 갖는 컨주게이트를 제조하였다; 컨주게이트 Fba-MenC 8a를 미리 제조하였다 (표 8).

제 2 세트의 컨주게이트의 면역학적 평가

컨주게이트를 마우스에서의 제 2 면역학적 연구에 평가하였다. 면역원성은 8마리 마우스 군을 사용하여 Balb/c 마우스에서 평가하였다. 컨주게이트를 (사카라이드 함량을 기준으로 하여) 1 ㎍의 용량을 갖는 애주번트로서의 알루미늄 하이드록시드와 제형화시켰다. 올리고MenC-CRM을 양성 대조군으로서 사용하였다; PBS 플러스 애주번트를 음성 대조군으로서 사용하였다. 컨주게이트를 1, 14 및 28일에 피하 투여하였다. 백신화 및 대조군 동물을 이차 및 삼차 컨주게이트 주입 후 14일에 채혈하였다.

포스트 3에서의 혈청을 ELISA 검정에 의해 분석하여 IgG 항-폴리MenC의 함량을 측정하였다.

Fba, P2TT, Met6 및 Hpw1 펩티드로 제조된 모든 컨주게이트는 마우스에서 단지 낮은 면역원성을 나타냈다. 게다가, 이들 합성 펩티드의 다양한 변수의 평가 (N-배향을 갖는 펩티드, 사카라이드 사슬 상의 더 높은 펩티드 밀도, 다양한 길이를 갖는 링커, 동일한 사카라이드 사슬 상의 다양한 펩티드의 다중제시)는 관찰된 낮은 면역원성으로 인해 현저한 차이를 유도하지 못하였다. 이렇게 선택된 펩티드는 아마도 T-세포 에피토프로서 단지 불량하게 인식되었으며, 따라서 이들 자체로 전체 담체 단백질을 대체하기 위한 우수한 후보자이다 (도 30).

한 T-세포 에피토프 펩티드, 단백질 폴리오 바이러스 타입 1으로부터 유래된 합성 PV1 펩티드는 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C에 대한 우수한 담체인 것으로 밝혀졌다. 도 30에 도시된 바와 같이, PV1 펩티드로 제조된 컨주게이트 8f 및 8g는 고도로 면역원성이며, PBS 플러스 애주번트로 면역화된 대조군 마우스와 비교하여 폴리MenC에 대해 현저한 IgG 역가를 유도하였다 (P 값 = 0.0007).

특히, N-말단에 연결된 PV1 펩티드는 통상적인 올리고MenC-CRM 컨주게이트에 의해 유도된 것에 필적하는 IgG 수준을 유도하였다 (MenC-CRM 컨주게이트 vs MenC-PV1 N-term 컨주게이트 간에 현저한 차이는 없음, P 값 = 0.5625). 더욱 중요하게는, 하기 표 14에 기재된 바와 같이, PV1 펩티드 컨주게이트는 통상적인 올리고MenC-CRM 컨주게이트 만큼 강한 혈청 박테리아 반응을 유도할 수 있다.

이차 및 삼차 면역화 후 혈청 분석 (도 31)은 두 컨주게이트 모두에 대한 부스터 효과를 나타냈다 (포스트2 및 포스트3 간의 현저한 차이는 없음 (PV1 C-term 컨주게이트에 있어서 ^**P = 0.0036 및 PV1 N-term 컨주게이트에 있어서 ^***P = 0.0008).

게다가, 포스트3에 대한 추가의 혈청 분석 (도 32)은 컨주게이트에 의해 유도된 항-MenC IgM의 함량이 매우 낮음을 보여줬다. 이러한 데이타는 IgG 아이소타입으로의 IgM 이동이 발생하며, PV1 펩티드를 갖는 글리코펩티드가 기억 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증하였다.

추가적인 중요한 관찰은 이러한 펩티드에 대한 IgG 역가가 PV1 C-말단에 대해 매우 낮으며, PV1 N-말단에 있어서는 거의 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다는 점이며 (도 33), 이는 본 펩티드가 전체 담체 단백질에 대한 치환에서 담체로서의 우수한 후보물질일 수 있음을 보여준다. 도 48은 또한, PV1 펩티드 비선형 컨주게이트에 의해 유도된 다양한 IgG 서브타입을 보여준다.

담체로서 Ova 펩티드로 제조된 글리코펩티드의 물리-화학적 특성 분석 및 마우스 모델에서 면역원성 평가

담체로서 Ova 펩티드를 평가하기 위한 다양한 B-세포 에피토프의 스크리닝

추가적인 예는 담체 단백질로서 오브알부민 (OVA)로부터의 합성 펩티드 사용을 포함한다. Ova 펩티드가 폴리사카라이드 GBS 타입 III에 대한 우수한 담체인 것으로 입증된 문헌으로부터 출발하여, 다른 B-세포 항원 예컨대, 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 W-135, Y 및 C와 조합한, 전체 담체 단백질에 대한 치환 능력을 또한 평가하였다.

본 실시예에서, 합성 Ova 펩티드는 이의 C-말단에서 연결되었다.

표에 기록된 바와 같이, C-말단에서 2개의 상이한 링커를 갖는 합성 Ova 펩티드를 사용하였다:

- 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 W-135 및 Y (시알산의 산화 후 환원적 아민화) 및 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C (카르복실 기의 유도체화 후)를 갖는 컨주게이트를 제조하기 위한, 자유 아미노기를 갖는 링커 E-S-G-K.

- 말레이미도 기로 유도체화된 폴리MenC를 사용하여 컨주게이트를 제조하기 위한, 자유 티올 기를 갖는 링커 G-G-C (이전 실시예에 사용된 화합물 7a 및 5a) (이전 실시예와 비교하기 위함).

메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 W-135 및 Y을 갖는 Ova 펩티드 컨주게 이트의 합성

폴리MenW-135 및 Y을 갖는 컨주게이트를 제조하기 위해, 시알산의 산화 반응 (반복 단위체에 대해 30% 산화)을 수행하고 이어서, 소듐시아노보로하이드리드의 존재하에 Ova 펩티드로 환원적 아민화를 수행하였다 (도 35).

먼저, 본 발명자들은 시알 산과 소듐 메타-페리오데이트의 산화 반응을 수행하여 요망되는 목표와 일치되는 30%의 산화도를 수득하였다. 산화된 폴리사카라이드는 vivaspin 컷 오프 30 kDa로 정제하고, ¹H NMR로 특성분석하여 산화 백분율을 추정하였다 (도 36-37).

도 36-37에 도시된 바와 같이, 알데하이드 하이드레이트의 양성자에 대한 시그널을 고려하여 산화 백분율을 추정하였다; 실제로, 알데하이드 및 하이드레이트 알데하이드 형태 둘 모두에 대해 예측된 양성자 NMR 시그널이 5.15 ppm에서 단지 하이드레이트 알데하이드에 대해서만 나타났는데, 이는 실험을 수집하는데 사용된 실험 조건이 이쪽으로 평형을 이동시키기 때문이다.

시알산의 산화 후, 펩티드와의 뒤따르는 컨주게이션 반응을 소듐 소듐 시아노보로하이드리드의 존재하에 환원적 아민화에 의해 수행하였다. 두 반응 모두는 37℃에서 5일 동안 수행하였으며, 이들은 SDS-Page 4-12% Bis-Tri에 의해 입증된 바와 같이 적당하게 작용하였다 (도 38).

컨주게이트 둘 모두를 vivaspin 컷 오프 30 kDa에 의해 정제하여 과량의 펩티드를 제거하였다. 정제 후, 2개의 컨주게이트를 각각 레조르시놀 및 Lowry 비색 검정을 이용하여 사카라이드 및 펩티드 함량에 있어서 특성분석하였다.

이러한 데이타는 4 mol의 시알산 당 약 1 mol의 펩티드가 도입됨을 보여주며 (표 12), 사카라이드 사슬 상에 높은 밀도의 T-세포 에피토프를 갖는 글리코펩티드를 수득하였다.

메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C를 갖는 Ova 펩티드 컨주게이트의 합성

2개의 상이한 합성 방법을 이용하여 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C를 갖는 Ova 펩티드의 컨주게이트를 제조하였다:

1 - C-말단에서 G-G-C 링커를 갖는 Ova 펩티드를 말레이미도 기로 유도체화된 폴리MenC에 컨주게이팅하였다 (화합물 7a 및 5a);

2 - C-말단에서 E-S-G-K 링커를 갖는 Ova 펩티드를 EDAC 화학반응을 이용하여 폴리MenC의 카르복실 기에 컨주게이팅하였다.

제 1 방법에 있어서, KMUH 링커 (5a) 또는 BMPH (7a)로 유도체화된 폴리MenC을 사용하고, 시알산 약 16-17 mol 당 1 mol의 말레이미도 기를 도입하였다. 따라서, 펩티드 상의 자유 티올 기가 사카라이드 사슬의 말레이미도 모이어티와 반응할 수 있으며, 컨주게이션 반응은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (도 39).

두 반응을 SDS-Page 4-12 % Bis-Tris (도 33)에 의해 입증되는 바와 같이 실온에서 밤새 수행하여, T-세포 에피토프와 B-세포 에피토프 간에 2개의 상이한 링커 (KMUH 및 BMPH)를 갖는 2개의 컨주게이트를 수득하였다 (14 및 15).

글리코펩티드를 vivaspin 컷 오프 30 kDa에 의해 정제하여 자유 펩티드를 제거하였다.

순수한 컨주게이트를 각각 레조르시놀 및 Lowry 비색 검정을 이용하여 사카라이드 및 펩티드 함량에 있어서 특성분석하였다. 이들 데이타는 시알산 약 15-18 mol 당 1 mol의 링커 도입을 보여줬다 (표 13).

제 2 방법에 있어서, 링커 E-S-G-K를 갖는 펩티드를 사용한 컨주게이트 폴리MenC-Ovap, MenC의 카르복실 기와 펩티드의 자유 아미노 기 사이의 축합 반응을 이용하여 아미드 결합을 수득하였다.

EDAC 및 술포-NHS의 존재하에 반응을 수행하여, 펩티드의 아미노 기와의 반응을 위한 사카라이드 상의 카르복실 기를 활성화시켰다 (식 8).

제 1 단계로서, EDAC와 술포-NHS의 혼합물 (사카라이드 mol에 대해 일 당량)을 MES 0.03 M pH 6 중 폴리사카라이드 용액에 첨가하였다. 반응을 15분 동안 어둠하에 완만하게 교반하면서 수행하고, 이어서 물중의 Ova 펩티드 (1 eq)의 용액을 첨가하였다.

실온에서 하룻밤 후, SDS-Page는 반응이 이루어졌음을 보여줬다 (도 42).

컨주게이트 16을 vivaspin 컷 오프 30 kDa에 의해 정제하고, 순수한 컨주게이트를 사카라이드 함량 및 펩티드 함량에 있어서 특성분석하였다. Ovap-MenC 컨주게이트 16은 80의 낮은 비의 Sacc/펩티드 (mol 사카라이드/mol 펩티드)를 가졌다. MenC 상으로의 펩티드 로딩을 증가시키고자 하는 시도는 성공적이지 못하였으며, 실제로 EDAC 양의 증가는 폴리사카라이드가 일종의 겔의 형성을 초래하였으며, 이는 부-반응으로 인해 재-용해되지 않았다. 펩티드 양의 증가는 정제 단계 동안 문제를 초래하였다.

따라서, 본 발명자들은 또한, 펩티드의 로딩이 12, 13, 14 및 15 컨주게이트에 대비 낮은 경우 이러한 컨주게이트를 마우스에서의 면역학적 연구에 사용하였다.

담체로서 Ova 펩티드를 갖는 컨주게이트의 면역학적 평가

담체로서 Ova 펩티드를 갖는 컨주게이트를 마우스에서의 면역학적 연구에 평가하였다. 면역원성은 8 마리 마우스 군을 이용한 Balb/c 마우스에 평가하였다. 컨주게이트를 (사카라이드 함량을 기준으로 하여) 1 ㎍의 용량을 갖는 애주번트로서의 알루미늄 하이드록시드로 제형화시켰다. 올리고MenC-CRM, 올리고MenW-CRM 및 올리고MenY-CRM을 양성 대조군으로서 사용하였다; PBS 플러스 애주번트를 음성 대조군으로서 사용하였다. 폴리 컨주게이트를 1, 14 및 28일에 피하 투여하였다. 백신화 및 대조군 동물을 이차 및 삼차 컨주게이트 주입 후 14일에 채혈하였다.

포스트 3 혈청의 ELISA 검정은 도 43에 보고된 바와 같이, 단지 메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C에 컨주게이팅된 Ova 펩티드를 갖는 글리코펩티드만이 PBS 플러스 애주번트로 면역화시킨 대조군 마우스와 비교하여 마우스에서 면역원성인 것으로 밝혀짐을 보여줬다 (P 값 < 0.05). 특히, KMUH 링커를 사용하여 커플링된 Ova 펩티드를 갖는 Ovap-MenC 컨주게이트가 가장 면역원성이었다 (대조군 마우스 대비 P 값 = 0.006).

포스트3과 비교하여 포스트2에서 항-사카라이드 IgG의 분석은, 컨주게이트 14 및 15에 있어서, 부스터 효과가 존재하며 (P 값 < 0.05), 특히 Ovap-MenC (KMUH 링커)에 있어서, P 값은 0.0033임을 입증하였다. 이에 반해, 컨주게이트 Ovap(ESGK)-MenC (16)는 부스터 효과 (P 값 0.0594)을 유도하지 않았다 (도 44).

그러나, Ova 펩티드를 갖는 모든 컨주게이트는 MenC-CRM 컨주게이트 대비 더 낮은 항-MenC IgG 반응을 유도하였다 (MenC-CRM vs Ovap-MenC 컨주게이트 간의 현저한 차, ^***P = 0.0009).

메닝고코커스 혈청군 W 및 Y 폴리사카라이드 (12 및 13)를 갖는 그 밖의 컨주게이트는 단지 불량한 면역원성을 띠거나 면역원성인 것으로 관찰되지 않았다 (도 45). 도 45에 보고된 바와 같이, 포스트3 혈청은 항-사카라이드 IgG 역가를 유도하지 않았다; PBS 플러스 애주번트로 면역화시킨 대조군 마우스와 비교하여 차이가 없었다 (P>0.05). 삼차 면역화 후, 심지어 역가가 매우 높지 않더라도 항-Ovap IgG 역가는 모든 글리코펩티드가 펩티드에 대한 항체 반응을 유도함을 보여줬으며; 특히 KMUH 링커로 컨주게이팅된 폴리MenC을 갖는 글리코펩티드는 도 46에 보고된 바와 같이 가장 높은 항-펩티드 IgG 역가를 유도하였다.

실시예에 사용된 재료 및 방법

메닝고코커스 혈청군 C, W 및 Y 올리고 및 폴리사카라이드의 생성

환원적 아민화에 의한 메닝고코커스 혈청군 C 올리고사카라이드의 환원 말단으로의 일차 아미노 기의 도입

올리고사카라이드 1을 환원적 아민화로 처리하여 사카라이드의 환원 말단에 아미노 기를 도입하였다. 이러한 반응은 유기 용매중에서 수행하여, 올리고사카라이드가 반대-이온으로서 테트라부틸암모늄 브로미드 (TAB)와 교환되게 하였다. 이러한 반대-이온을 도입하기 위해, 본 발명자들은 CAPTO S 수지를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피를 수행하고, TAB 0.7M로 평형화시키고, 반대-이온으로서 TAB⁺를 사용하여 칼럼으로부터 올리고사카라이드를 용리시켰다. 이어서, 건조된 생성물 (20 mg)을 5mg/ml 살리실산의 최종 농도로 10% DMSO, 90% 메탄올에 용해시켰다. 이어서 암모늄 아세테이트 (최종 농도 50　mM) 및 소듐 시아노보로하이드리드 (최종 농도 10 mM)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 24-72 시간 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 부피가 환원적 아민화 전에 첨가된 DMSO의 양의 두배 또는 그 미만이 될 때까지 과량의 메탄올을 진공하에 회전 증발기에 의해 제거하였다. 그 후, 반응 혼합물을 0.5M의 NaCl로 희석하여 20%의 MeOH를 갖는 용액을 수득하였다. 이어서, 사카라이드를 G10 수지를 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하여 아민화된 올리고MenC로부터 환원적 아민화 시약을 제거하였다. 마지막으로, 반대-이온 TAB를 NaCl 1 M로 평형화된 CAPTO S 수지와 다시 교환하여, 올리고사카라이드 1a를 반대-이온으로서 Na⁺를 사용하여 칼럼으로부터 용리시켰다. 도입된 아미노 기의 양은 비색 검정법으로 추정하였으며 [Habeeb AF Anal Biochem 1966, 14, 328-38], 이는 아민화가 약 50%인 것으로 나타냈다 (후속적으로 이의 ¹H NMR 스펙트럼에 의해 확인됨).

N-ε- 말레이미도카프로일 - 옥시술포숙신이미드 에스테르 ( 술포 - EMCS )를 사용한 올리고 MenC - NH ₂ 의 유도체화

환원적 아민화 후, 올리고사카라이드 1a를 H₂O-DMSO 1:9의 혼합물에 용해시키고, 이어서 5 당량의 Et₃N를 첨가하고, 이어서 10 당량의 술포-EMCS 링커를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 완만하게 교반하면서 실온에서 유지하였다. 이어서, 유도체화된 올리고사카라이드 1b를 1:4 아세톤으로의 침전에 의해 시약으로부터 분리하고, 이어서 1:4 아세톤으로 침전물을 세척하고 진공하에 건조하였다.

올리고사카라이드 사슬 상의 말레이미도 기의 도입은 ¹H NMR 스펙트럼에 의해 확인하였다.

N-κ- 말레이미도운데칸산 하이드라지드 - TFA ( KMUH )로의 폴리사카라이드 MenC의 유도체화

메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C 3의 시알산의 카르복실 기를 KMUH 링커상의 하이드라지드 기와 반응시켜 사카라이드 사슬 상의 말레이미도 모이어티를 도입시켜 에피토프 펩티드가 비선형 형태로 연결될 수 있도록 하였다. 반응을 수행하기 위해, 폴리사카라이드 3을 2mg/ml의 최종 농도에서 MES 0.1M pH 4.56에 용해시키고; 이어서 EDAC (20 mol%)를 첨가하고, 반응을 어둠하에 완만하게 교반하면서 유지하였다. 10분 후, KMUH (각각 약 35 mol의 시알산 당 또는 약 17 mol의 시알산 당 1 mol의 링커를 도입시키기 위해 20 mol% 또는 46 mol%)를 혼합물에 첨가하고, 완만하게 교반하면서 2시간 동안 실온에서 반응을 수행하였다. 최종적으로, 유도체화된 폴리사카라이드를 30 kDa 컷-오프 막 (Sartorius)을 사용한 접선 유동 여과에 의해 정제하고, 유도체화된 폴리사카라이드를 투석유물에서 회수하였다.

사카라이드 사슬 상의 말레이미도 기의 양은 ¹H NMR 스펙트럼에 의해 추정하였다: 본 발명자들은 반응에 사용된 링커의 양에 따라, 약 35 mol의 시알산 당 1 mol의 말레이미도 모이어티 (3a) 또는 약 16 mol의 시알산 당 약 1 mol의 말레이미도 모이이어티 (5a)를 도입하였다.

N-β- 말레이미도프로피온산 하이드라지드- TFA ( BMPH )로의 폴리사카라이드 MenC의 유도체화

메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 C 3의 시알산의 카르복실 기를 BMPH 링커상의 하이드라지드 기와 반응시켜 사카라이드 사슬 상에 말레이미도 모이어티를 도입하였다. 반응을 수행하기 위해, 폴리사카라이드 3을 2mg/ml의 최종 농도에서 MES 0.1M pH 4.56에 용해시키고; 이어서 EDAC (20 mol%)를 첨가하고, 반응을 어둠하에 완만하게 교반하면서 유지하였고; 10분 후, BMPH (46 mol%)를 혼합물에 첨가하고, 완만하게 교반하면서 2시간 동안 실온에서 반응을 수행하였다. 최종적으로, 유도체화된 폴리사카라이드를 30 kDa 컷-오프 막 (Sartorius)을 사용한 접선 유동 여과에 의해 정제하고, 유도체화된 폴리사카라이드를 투석유물에서 회수하였다.

사카라이드 사슬 상의 말레이미도 기의 양은 ¹H NMR 스펙트럼에 의해 추정하였으며: 본 발명자들은 약 17 mol의 시알산 당 1 mol의 말레이미도 모이어티 (7a)를 도입하였음을 확고히 하였다.

메닝고코커스 폴리사카라이드 혈청군 W 및 Y의 산화

폴리사카라이드 MenW 10 및 MenY 11의 시알산을 산화시켜 환원적 아민화 반응에 의해 펩티드의 아미노 기와 반응할 수 있는 알데하이드 기를 도입하였다. 두 폴리사카라이드 모두를 10mg/ml 농도로 NaPi 10mM pH 7에 용해시켰다. 30% 산화를 달성하기 위해 30 mol%에 해당하는 양의 NaIO₄ 0.1M을 첨가하였다. 반응을 2시간 동안 실온에서 완만하게 교반하면서 어둠하에 유지시켰다. 이러한 시간 후, 산화된 폴리사카라이드 10a 및 11a를 30kDa 컷-오프 막을 사용하는 Vivaspin 시스템 (Sartorius)으로의 초미세여과에 의해 정제하였다. 순수 화합물의 산화도는 ¹H NMR 스펙트럼에 의해 추정되며, 이는 요망되는 목표과 일치하는 30% 산화를 보여준다.

컨주게이트의 제조

올리고 MenC -펩티드 컨주게이트 (2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g)의 합성

사카라이드 상의 말레이미도 모이어티와 펩티드 상의 티올 기 간의 반응성을 활용하는 올리고사카라이드 1b와 합성 펩티드 간의 컨주게이션 반응을 적당하게 작동시켰다 (표 1). 컨주게이션을 PBS 완충액 pH 7 (펩티드에 있어서 3 mg/ml)중 3:1의 펩티드 mol: 사카라이드 사슬 상의 말레이미도 mol 비로 수행하였으며, 완만하게 교반하면서 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 컨주게이트는 Superdex Peptide 사전-팩킹된 칼럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하여 자유 펩티드를 제거하고 이어서 암모늄 술페이트로 침전시켜 자유 사카라이드를 제거하였다.

폴리MenC _KMUH -펩티드 컨주게이트 (4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g)의 합성

사카라이드 상의 말레이미도 모이어티와 펩티드 상의 티올 기 간의 반응성을 활용하는 폴리사카라이드 3a와 합성 펩티드 간의 컨주게이션 반응을 적당하게 작동시켰다 (표 1). 컨주게이션을 PBS 완충액 pH 7 (펩티드에 있어서 3 mg/ml)중 3:1의 펩티드 mol: 사카라이드 사슬 상의 말레이미도 mol 비로 수행하였으며, 완만하게 교반하면서 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 컨주게이트는 30kDa 컷-오프 막을 사용하는 Vivaspin 시스템 (Sartorius)로의 초미세여과에 의해 정제하였다.

폴리MenC _KMUH -펩티드 컨주게이트 (6a, 6b, 6c, 6d, 6e)의 합성

폴리사카라이드 5a와 합성 펩티드 간의 컨주게이션 반응 (표 5)을 폴리사카라이드 3a에 대해 상기 보고된 바와 같이 수행하였다. 모든 컨주게이트는 30kDa 컷-오프 막을 사용하는 Vivaspin 시스템 (Sartorius)로의 초미세여과에 의해 정제하였다.

폴리MenC _BMPH -펩티드 컨주게이트 (8a, 8b, 8c, 8d, 8e, 8f, 8g)의 합성

폴리사카라이드 7a와 합성 펩티드 간의 컨주게이션 반응 (표 5)을 폴리사카라이드 3a에 대해 상기 보고된 바와 같이 수행하였다. 모든 컨주게이트는 30kDa 컷-오프 막을 사용하는 Vivaspin 시스템 (Sartorius)로의 초미세여과에 의해 정제하였으며, 단 VP1 C- 및 N-말단 펩티드를 갖는 컨주게이트 8f 및 8g는 슈퍼덱스 펩티드 사전-팩킹된 칼럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

폴리MenC _BMPH -MIX Met6 + Fba + Hpw1 펩티드 컨주게이트 (9)의 합성

컨주게이션의 반응을 펩티드의 제조된 혼합물을 사용하고, 이러한 혼합물을 폴리사카라이드 7a에 첨가하여 수행하였다. 본 발명자들은 반응을 1:1:1:1의 사카라이드 사슬상의 mol Met6 펩티드: mol Hpw1 펩티드: mol Fba 펩티드: mol 말레이미도 비로 수행하였다. 반응을 PBS 완충액 pH 7 (펩티드에 있어서 3 mg/ml)에서 수행하고, 완만하게 교반하면서 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 30kDa 컷-오프 막을 사용하는 Vivaspin 시스템 (Sartorius)로의 초미세여과에 의해 컨주게이트 9를 정제하였다.

컨주게이트 폴리MenW - Ovap 및 폴리MenY - Ovap (12 및 13)의 합성

컨주게이트에 대한 컨주게이션 반응은 산화된 폴리사카라이드 둘 모두의 알데하이드 모이어티 상에 Ovap-_ESGK의 아미노 기를 도입하는 환원적 아민화에 의해 수행하였다. NaPi 10 mM pH7중의 폴리사카라이드 (10 또는 11) 1 mg/ml 용액에, 소듐 시아노보로하이드리드 (30 당량)를 첨가하고, 이어서 Ova 펩티드 (3 eq), 완충액 컨주게이션 NaPi 60Mm NaCl 250mM pH7를 첨가하였다. 컨주게이션 반응물 둘 모두를 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 30kDa 컷-오프 막을 사용하는 Vivaspin 시스템 (Sartorius)로의 초미세여과에 의해 컨주게이트 12 및 13을 정제하였다.

컨주게이트 폴리MenC _KMUH - Ovap 및 폴리MenC _BMPH - Ovap (14 및 15)의 합성

컨주게이션 반응을 폴리사카라이드 3a에 대해 상기 보고된 바와 같이 수행하였다. 본 발명자들은 각각 폴리사카라이드 5a (KMUH 링커를 사용하여 유도체화됨)를 사용하여 컨주게이트 14를 제조하고, 폴리사카라이드 7a (BMPH 링커로 유도체화됨)를 사용하여 컨주게이트 15를 제조하였다. 30kDa 컷-오프 막을 사용하는 Vivaspin 시스템 (Sartorius)로의 초미세여과에 의해 두 컨주게이트 모두를 정제하였다.

컨주게이트 폴리MenC - Ovap (16)의 합성

펩티드 Ovap-_ESGK가 사카라이드 사슬에 직접 컨주게이팅되는 글리코펩티드 16를 제조하기 위해, 본 발명자들은 펩티드의 자유 아미노 기와 폴리사카라이드 3의 카르복실 기 간의 축합 반응을 활용하여 아미드 결합을 삽입하였다. MES 30mM pH 6중 사카라이드 3　mg/ml 용액에, EDAC (3 eq)와 술포-NHS (3 eq)의 혼합물을 첨가하고, 완만하게 교반하면서 실온에서 반응을 수행하였다; 15분 후, Ova 펩티드 (3 eq.)를 혼합 반응물에 첨가하였다. 혼합물을 완만하게 교반하면서 밤새 실온에서 유지시켰다. 30kDa 컷-오프 막을 사용하는 Vivaspin 시스템 (Sartorius)로의 초미세여과에 의해 컨주게이트 16을 정제하였다.

분석 방법

소듐 도데실 술페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-Page)

프리-캐스트 폴리아크릴아미드 겔 (NuPAGE®Invitrogen) 4-12% Bis-Tris을 사용하여 SDS-Page를 수행하였다. 전기영동 진행을 2.5-5㎍의 펩티드 각 샘플을 로딩한 MES SDS 런닝 완충액 (NuPAGE®Invitrogen)에서 수행하였으며, 약 40분 동안 150V 전압을 이용한 전기영동 챔버를 사용하였다. 샘플을 3 ㎕의 NuPAGE®LDS 샘플 완충액을 첨가함으로써 제조하였다. 전기영동 후, 겔을 H₂O로 3회 세척한 후, 겔을 50% MeOH 및 10% 아세트산 용액중에 30분 동안 고정하였다. 고정 후, 겔을 물에서 3회 세척하고, 마지막으로 코마시에 염료로 염색하였다.

비색 분석

컨주게이트 상의 펩티드 함량을 사용된 펩티드의 유형에 따라 Micro BCA (Thermo)[Smith, P.K. et al. Anal . Biochem. 1985, 150, 76-85] 또는 Lowry (Thermo)[Lowry, O.H. et al. J. Biol . Chem . 1951, 193, 265-275] 비색 검정에 의해 측정하였다.

시알산 함량을 레조르시놀 비색 검정에 의해 측정하였다 [Svennerholm, L. Biochim. Biophys . Acta 1957, 24(3), 604-611].

아미노 기를 비색 검정에 의해 측정하였다 [Habeeb, A.F. Anal Biochem 1966, 14, 328-38].

고성능 크기 배제 액체 크로마토그래피 (SEC- HPLC )

PDA, RF2000 Fluorescence Detector 및 RI-101 Shodex Detector가 구비된 ULTIMATET^TM 3000 HPLC 시스템 (Dionex part of Thermo Fisher Scientific)에서 SEC-HPLC를 수행하였다. 0.05 ml/min 유속으로 Superdex Peptide 분석 칼럼상에서의 크로마토그래피를 0.02M NaPi 0.250M NaCl pH 7.2에서 수행하였으며, 50 ㎕의 주입 용적은 15-25 ㎍의 단백질 함량 샘플을 로딩한다. 생성된 크로마토그래피 데이타는 CHROMELEON^TM 6.7 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.

고성능 역상 액체 크로마토그래피 ( RP - HPLC )

PDA, RF2000 Fluorescence Detector가 구비된 ULTIMATET^TM 3000 HPLC 시스템 (Dionex part of Thermo Fisher Scientific)에서 RP-HPLC를 수행하였다. 크로마토그래피를 0.1 ml/min의 유속으로 Jupiter C18 분석 칼럼상에서 5%로부터 45% 까지의 H₂O중 아세토니트릴 구배 + 0.1%TFA를 사용하여 수행하였으며, 주입 부피는 50㎕이다. 생성된 크로마토그래피 데이타는 CHROMELEON^TM 6.7 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.

NMR 분석

¹H NMR 실험을 고정밀 온도 제어기가 구비되고, 5-mm 브로드밴드 프로브 (Bruker)를 사용하는 Bruker Avance III 400 MHz 분광기에서 25±0.1℃에서 기록하였다. 모든 샘플을 0.75 mL의 듀테리움 옥시드 (D₂O, 99.9% 원자 D, Aldrich)에서 용해시키고, 5-mm NMR 튜브 (Wilmad)에 삽입하였다. 데이타 획득 및 처리를 위해, TopSpin 버젼 2.6 소프트웨어 (Bruker)를 사용하였다.

¹H NMR 스펙트럼을 10 ppm 스펙트럼 폭에 걸쳐 400 MHz에서 수집하였으며, 약 128 스캔을 축적하였다. 트랜스미터를 기준 시그널로서 사용된 HDO 주파수로 설정하였다 (4.79 ppm). 모든 NMR 스펙트럼을 총 재순환 시간을 이용하여 정량적 방식으로 수득하여 각 시그널에 대한 전체 회수를 보장하였다 (5 x Longitudinal Relaxation Time T1).

백신 제형 및 면역학적 연구

글리코컨주게이트 제형의 제조

항원 제형을 멸균 장치 및 용액을 사용하여 멸균 후드 하에서 제조하였다. 모든 제형을 완충액으로서 PBS pH7.2를 사용하여 제조하고, 여기에서 백신을 총 200㎕ 부피에서 마우스 당 요망되는 투여량의 사카라이드를 획득하도록 희석하였다.

알루미늄 하이드록시드 (AlumOH)를 애주번트로서 사용하고 2x 용액으로서 제조하여 PBS 전체 용적에 대해 1:1로 혼합되게 하였다. 각 용량은 0.36 mg의 알루미늄 하이드록시드를 함유하였다.

컨주게이트 및 컨주게이트 백신을 투여량 당 1㎍의 사카라이드 함량으로 8 마리 암컷 Balb/c 마우스 군에 투여하였다.

마우스를 1, 14 및 28일에 피하로 면역화시켰다. 0일 (면역 전), 28일 (포스트 2) 및 42일 (포스트 3)에서 채혈을 수행하였다. 대조군에는 PBS와 애주번트만 투여하였다. 모든 동물 연구를 수행하는데 있어서 Novartis Animal Care Department에 의한 동물 실험 가이드라인 세트에 따랐다.

반응의 면역화학적 평가

상동성 폴리사카라이드 및 펩티드에 대한 글리코컨주게이트에 의해 유도된 항체 반응을 ELISA 검정에 의해 측정하였다. 96-웰 Maxisorp 플레이트 (Nunc, Thermo Fisher Scientific)를 pH 8.2의 PBS 완충액중 5 ㎍/ml 폴리사카라이드 용액 100 ㎕/웰 또는 pH 7.2의 PBS 완충액중 10 ㎍/ml 펩티드 용액을 100 ㎕/웰로 첨가하여 상이한 메닝고코커스 폴리사카라이드 또는 펩티드로 코팅하고, 이어서 4℃에서 밤새 (o.n.) 인큐베이션하였다. 코팅 후, 플레이트를 웰당 300 ㎕의 TPBS (0.05% Tween 20을 갖는 PBS, pH 7.4)로 3회 세척하고, 100 ㎕/웰의 3% BSA (Sigma-Aldrich)로 1시간 동안 37℃에서 차단하였다. 후속하여, 각 인큐베이션 단계에 이어 3중의 TPBS 세척이 뒷따른다. TPBS중에 1:25, 1:100, 1:200로 사전희석된 혈청을 코팅된-플레이트 (200 ㎕)로 옮기고, 이어서, 2배 연속 희석하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. TPBS로 3회 세척 후, 이차 항체 알칼리성 포스페이트 컨주게이트의 100 ㎕ TPBS 용액 (항 마우스 IgG 1:10000)를 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. TPBS로 3회 더 세척한 후, 0.5 M 디-에탄올 아민 완충액 pH 9.8중의 p-NPP (Sigma) 1mg/ml을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, Biorad 플레이트 해독기를 사용하여 405nm에서 플레이트를 해독하였다. 원자료 (raw data) 수득을 Microplate Manager Software (Biorad)에 의해 수행하였다. 혈청 역가는 컷-오프 OD = 1 또는 컷-오프 OD=0.2에 상응하는 상호 혈청 희석으로서 표현하였다. 각 면역화 군은 단일 마우스 역가의 기하 평균 (GMT)으로서 표현하였다. 통계 및 그래프 분석을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

본 발명은 단지 예에 의해 설명되었으며, 본 발명의 범위 및 사상 내에 유지되면서 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다.

참고 문헌 (이의 내용은 그 전체가 본원에 통합됨)

SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> NONLINEAR SACCHARIDE CONJUGATES <130> PAT055281-WO-PCT <140> PCT/EP2013/070496 <141> 2013-10-02 <150> 61/709,093 <151> 2012-10-02 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 1 Leu Lys Phe Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 2 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala His Leu Glu 20 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 3 Gln Gly Glu Thr Glu Glu Ala Leu Ile Gln Lys Arg Ser Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 4 Asp Ser Arg Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Phe Thr Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 5 Asn Arg Ser Pro Ser Thr Gly Glu Gln Lys Ser Ser Gly Ile 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 6 Tyr Gly Lys Asp Val Lys Asp Leu Phe Asp Tyr Ala Gln Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT 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Claims

폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 선택된 사카라이드를 포함하는 비선형 사카라이드 컨주게이트를 포함하는 조성물로서, 사카라이드는 적어도 2개의 담체 펩티드에 연결되며, 적어도 2개의 담체 펩티드는 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 포함하며, 입체형태적 B-세포 에피토프를 함유하지 않으며, 적어도 2개의 펩티드 중 적어도 하나는 사라카리드에 내부적으로 연결된 조성물.
제 1항에 있어서, 적어도 2개의 펩티드가 선형 B-세포 에피토프를 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서, 적어도 2개의 펩티드가 선형 B-세포 에피토프를 포함하지 않는 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 펩티드 중 적어도 하나가 PV1 T-세포 에피토프를 포함하는 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 펩티드가 동일한 아미노산 서열을 갖는 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 펩티드가 상이한 아미노산 서열을 갖는 조성물.
제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 펩티드가 사카라이드에 직접 연결된 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 펩티드가 링커를 통해 사카라이드에 연결된 조성물.
제 8항에 있어서, 적어도 2개의 펩티드에 대한 링커가 동일한 링커인 조성물.
제 8항에 있어서, 적어도 2개의 펩티드에 대한 링커가 상이한 링커인 조성물.
제 8항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 링커가 선형인 링커인 조성물.
제 8항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 있어서, 링커가 N-카파-말레이미도운데칸산 하이드라지드-TFA (KMUH) 또는 N-β-말레이미도프로피온산 하이드라지드-TFA (BMPH)인 조성물.
제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 담체 단백질에 연결되지 않은 조성물.
제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 5개 내지 35개 사카라이드 당 적어도 하나의 펩티드, 5개 내지 25개 사카라이드 당 적어도 하나의 펩티드, 5개 내지 20개 사카라이드 당 적어도 하나의 펩티드, 또는 7개 내지 15개 사카라이드 당 적어도 하나의 펩티드에 연결된 조성물.
제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 적어도 3개의 펩티드, 적어도 4개의 펩티드, 적어도 5개의 펩티드, 적어도 6개의 펩티드, 적어도 7개의 펩티드, 적어도 8개의 펩티드, 적어도 9개의 펩티드, 또는 적어도 10개의 펩티드에 연결된 조성물.
제 1항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 캡슐 사카라이드인 조성물.
제 16항에 있어서, 캡슐 사카라이드가 N.　메닌기티디스 (N.　 meningitidis), S. 뉴모니애 (S. pneumoniae), S. 피오게네스 (S. pyogenes), S. 아갈락티애 (S. agalactiae), H. 인플루엔자 (H. influenzae), P. 애루기노사 (P. aeruginosa), S.　아우레우스 (S.　 aureus), E. 패칼리스 (E. faecalis), E. 패시움 (E. faecium), Y. 엔테라콜리티카 (Y. enteracolitica), V. 콜레라 (V. cholerae) 또는 S. 타이피 (S. typhi)로부터 비롯되는 조성물.
제 1항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 글루칸인 조성물.
제 18항에 있어서, 글루칸이 C. 알비칸스 (C. albicans), 콕키디오이데스 임미티스 (Coccidioides immitis), 트리코파이톤 베루코섬 (Trichophyton verrucosum), 블라스토마이세스 데르마티디스 (Blastomyces dermatidis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라즈마 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum), 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 파라콕키디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 또는 피티움 인시디오섬 (Pythiumn insidiosum)으로부터 비롯되는 조성물.
제 1항 내지 제 19항 중의 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 적어도 10개의 사카라이드, 적어도 15개의 사카라이드, 적어도 20개의 사카라이드, 적어도 25개의 사카라이드, 적어도 30개의 사카라이드, 적어도 35개의 사카라이드 또는 적어도 40개의 사카라이드를 포함하는 조성물.
제 1항 내지 제 20항 중의 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 애주번트를 추가로 포함하는 조성물.
제 1항 내지 제 22항 중의 어느 한 항에 있어서, 나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis) 항원, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 항원, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) 항원, 모락셀라 카타르할리스 (Moraxella catarrhalis) 항원, 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis) 항원, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 항원, 스타필로코커스 에피데르미스 (Staphylococcus epidermis) 항원, 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani) 항원, 코르니네박테리움 디프테리아 (Cornynebacterium diphtheriae) 항원, 해모필루스 인플루엔자 타입 B (Hib) 항원, 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 항원, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) 항원, 스트렙토코커스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae) 항원, 네이세리아 고노르호애 (Neiserria gonorrhoeae) 항원, 클라미디아 트라초마티스 (Chlamydia trachomatis) 항원, 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) 항원, 해모필루스 두크레이 (Haemophilus ducreyi) 항원, 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 항원, 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium ) 항원, 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori) 항원, 스타필로코커스 사프로피티쿠스 (Staphylococcus saprophyticus) 항원, 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) 항원, E. 콜라이 (E. coli) 항원, 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 항원, 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 항원, 릭켓치아 (Rickettsia) 항원, 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes) 항원, 클라미디아 뉴모니애 (Chlamydia pneumoniae) 항원, 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) 항원, 살모넬라 타이피 (Salmonella typhi) 항원, 보렐리아 버그도르페리 (Borrelia burgdorferi) 항원, 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 항원, 쉬겔라 (Shigella) 항원 및 클레브시엘라 (Klebsiella) 항원으로부터 선택된 추가적인 성분을 추가로 포함하는 조성물.
제 1항 내지 제 23항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하여 면역 반응을 유발시키는 방법.
제 24항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
제 24항 또는 제 25항에 있어서, 면역 반응이 폴리사카라이드를 인식하는 방법.
제 26항에 있어서, 폴리사카라이드에 대한 면역 반응이 담체 단백질 또는 다른 T-세포 에피토프에 연결되지 않은 폴리사카라이드에 의해 유발된 면역 반응보다 더욱 T-세포 의존적인 방법.
포유동물 대상체에서 사카라이드에 대한 향상된 면역 반응을 유발시키기 위한 제 1항 내지 제 23항 중의 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 선택된 사카라이드를 포함하는 사카라이드 컨주게이트를 포함하는 조성물로서, 사카라이드가, 적어도 2개의 T-세포 에피토프를 포함하며 입체형태적 B-세포 에피토프는 함유하지 않는 펩티드에 연결되며, T-세포 에피토프 중 적어도 하나는 PV1 에피토프인 조성물.