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TW201932600A - 核酸之靶向整合 - Google Patents

核酸之靶向整合 Download PDF

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TW201932600A
TW201932600A TW107146569A TW107146569A TW201932600A TW 201932600 A TW201932600 A TW 201932600A TW 107146569 A TW107146569 A TW 107146569A TW 107146569 A TW107146569 A TW 107146569A TW 201932600 A TW201932600 A TW 201932600A
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永平 郭 克勞福德
艾咪 申
美霞 周
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夏藍 米沙海
艾伯特 艾瑞克 高
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美商建南德克公司
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Abstract

本發明所揭示之標的物係關於適於表現重組蛋白之靶向整合(TI)宿主細胞，以及產生及使用該等TI宿主細胞之方法。

Description

核酸之靶向整合
本發明所揭示之標的物係關於適於表現重組蛋白之靶向整合(TI)宿主細胞，以及產生及使用該等TI宿主細胞之方法。
由於細胞生物學及免疫學之快速發展，業內對開發用於多種疾病(包括癌症、心血管疾病及代謝疾病)之新穎治療性重組蛋白之需求日益增加。該等生物醫藥候選物通常由能夠表現所關注蛋白質之商業細胞株來製造。舉例而言，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞已廣泛適用於產生單株抗體。
用於產生商業細胞株之習用策略涉及編碼所關注多肽之核苷酸序列之隨機整合，之後選擇且分離產生所關注多肽之細胞株。然而，此方法具有若干缺點。首先，此整合不僅係罕見事件，且鑒於核苷酸序列整合位置之隨機性，該等罕見事件可產生多種基因表現及細胞生長表現型。此稱為「位置效應變異」之變異至少部分地源自真核細胞基因體中所存在之複雜基因調控網絡及某些基因體基因座對於整合及基因表現之可及性。其次，隨機整合策略通常不能控制整合至宿主細胞基因體中之基因拷貝數。實際上，通常使用基因擴增方法來達成高產細胞。然而，此基因擴增會導致不期望之細胞表現型，諸如不穩定之細胞生長及/或產物表現。第三，由於隨機整合過程中固有之整合基因座異質性，因此在轉染後篩選數千個純系以分離展示所關注多肽之合意表現水準之細胞株係耗時且勞動密集的。即使在分離此等細胞株後，亦不能保證所關注多肽之穩定表現，且可需要進一步篩選以獲得穩定之商業細胞株。最後，自隨機整合之細胞株產生的多肽展現高程度之序列變異，此可部分地係由於用於選擇所關注多肽之高表現水準的選擇劑之誘變性所致。
本發明所揭示之標的物係關於適於表現重組蛋白之靶向整合(TI)宿主細胞。本發明所揭示之標的物不僅提供具有高生產力之宿主細胞TI位點，其亦提供藉由重組酶介導之盒交換(RMCE)將多個所關注序列引入至宿主細胞中之單一TI基因座中之新方法。RMCE方法之優點包括生產力增加及自同一TI基因座以不同比率共表現多種多肽之靈活性。舉例而言但不加以限制，本文所揭示之RMCE策略容許將一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多個序列(例如，抗體重鏈(HC)或輕鏈(LC)序列)插入至TI基因座中。由於能夠同時靶向八個或更多個序列，因此雙質體RMCE使得能夠調節mAb之HC及LC鏈比率以改良生產力、表現具有多條鏈之複合分子且利用抗體靶向轉殖基因、內源基因或RNAi以修改細胞路徑。
在某些實施例中，TI宿主細胞包含外源核苷酸序列，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內之整合位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源。在某些實施例中，緊接經整合之外源核苷酸序列之5’的核苷酸序列係選自由與以下各項至少約90%同源之序列組成之群：NW_006874047.1之核苷酸41190-45269、NW_006884592.1之核苷酸63590-207911、NW_006881296.1之核苷酸253831-491909、NW_003616412.1之核苷酸69303-79768、NW_003615063.1之核苷酸293481-315265、NW_006882936.1之核苷酸2650443-2662054及NW_003615411.1之核苷酸82214-97705。在某些實施例中，緊接經整合之外源核苷酸序列之3’的核苷酸序列係選自由與以下各項至少約90%同源之序列組成之群：NW_006874047.1之核苷酸45270-45490、NW_006884592.1之核苷酸207912-792374、NW_006881296.1之核苷酸491910-667813、NW_003616412.1之核苷酸79769-100059、NW_003615063.1之核苷酸315266-362442、NW_006882936.1之核苷酸2662055-2701768或NW_003615411.1之核苷酸97706-105117。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列可操作地連接至選自由與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之序列組成之群的核苷酸序列。
在某些實施例中，TI宿主細胞包含外源核苷酸序列，該外源核苷酸序列整合在內源基因內之整合位點處，該內源基因係選自由以下組成之群：LOC107977062 (SEQ ID NO. 1)、LOC100768845 (SEQ ID NO. 2)、ITPR2 (SEQ ID NO. 3)、ERE67000.1 (SEQ ID NO. 4)、UBAP2 (SEQ ID NO. 5)、MTMR2 (SEQ ID NO. 6)、XP_003512331.2 (SEQ ID NO. 7)及與其至少約90%同源之序列。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在可操作地連接至內源基因之整合位點處，該內源基因係選自由以下組成之群：LOC107977062 (SEQ ID NO. 1)、LOC100768845 (SEQ ID NO. 2)、ITPR2 (SEQ ID NO. 3)、ERE67000.1 (SEQ ID NO. 4)、UBAP2 (SEQ ID NO. 5)、MTMR2 (SEQ ID NO. 6)、XP_003512331.2 (SEQ ID NO. 7)及與其至少約90%同源之序列。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸側接有選自由與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之序列組成之群的核苷酸序列。在某些實施例中，外源核苷酸序列所整合之整合位點緊鄰選自由與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之序列組成之群的序列之全部或一部分。
在某些實施例中，TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。在某些實施例中，TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。在某些實施例中，TI宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
在某些實施例中，TI宿主細胞包含經整合之外源核苷酸序列，其中該外源核苷酸序列包含一或多個重組識別序列(RRS)。在某些實施例中，外源核苷酸序列包含至少兩個RRS。RRS可由重組酶識別，例如Cre重組酶、FLP重組酶、Bxb1整合酶或φC31整合酶。RRS可選自由以下組成之群：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、φC31 attP序列及φC31 attB序列。
在某些實施例中，外源核苷酸序列包含第一及第二RRS以及至少一種位於該第一與該第二RRS之間的選擇標記物。在某些實施例中，外源核苷酸序列進一步包含第三RRS，其中該第三RRS位於該第一與該第二RRS之間，且該第三RRS不同於該第一或該第二RRS。在某些實施例中，外源核苷酸序列包含第一及第二RRS以及位於該第一與該第二RRS之間的第一選擇標記物。在某些實施例中，外源核苷酸序列進一步包含第二選擇標記物，且該第一及該第二選擇標記物不同。在某些實施例中，外源核苷酸序列可進一步包含第三選擇標記物及內部核糖體進入位點(IRES)，其中該IRES可操作地連接至該第三選擇標記物。該第三選擇標記物可不同於該第一或該第二選擇標記物。選擇標記物可選自由以下組成之群：胺基醣苷磷酸轉移酶(APH) (例如，潮黴素(hygromycin)磷酸轉移酶(HYG)、新黴素(neomycin)及G418 APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、麩醯胺酸合成酶(GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、組胺醇去氫酶(組胺醇D)以及編碼對嘌呤黴素(puromycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、博來黴素(bleomycin)、腐草黴素(phleomycin)、氯黴素(chloramphenicol)、吉歐黴素(Zeocin)及黴酚酸(mycophenolic acid)之抗性之基因。選擇標記物亦可選自由以下組成之群：綠色螢光蛋白(GFP)標記物、增強之GFP (eGFP)標記物、合成GFP標記物、黃色螢光蛋白(YFP)標記物、增強之YFP (eYFP)標記物、青色螢光蛋白(CFP)標記物、mPlum標記物、mCherry標記物、tdTomato標記物、mStrawberry標記物、J-red標記物、DsRed-單體標記物、mOrange標記物、mKO標記物、mCitrine標記物、Venus標記物、YPet標記物、Emerald6標記物、CyPet標記物、mCFPm標記物、Cerulean標記物及T-Sapphire標記物。在一些實施例中，選擇標記物係選自由以下組成之群：綠色螢光蛋白(GFP)標記物、增強之GFP (eGFP)標記物、合成GFP標記物。
在某些實施例中，外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物及至少一個外源所關注序列(SOI)。在某些實施例中，外源核苷酸序列包含第一及第二RRS以及至少一個選擇標記物及至少一個位於該第一與該第二RRS之間的外源SOI。在某些實施例中，外源核苷酸序列包含第一、第二及第三RRS、至少一個選擇標記物及至少一個位於該第一與該第三RRS之間的外源SOI以及至少一個位於該第三與該第二RRS之間的外源SOI。所關注序列可編碼任何所關注多肽，包括(但不限於)本文中所列示之實例。該等SOI可相同或其可不同，例如該等SOI可包括抗體之兩條鏈之編碼序列。在表現兩種或更多種不同多肽之情形下，所關注序列可包括各種比率之兩種多肽，例如在八種編碼序列編碼兩種不同多肽(包括(但不限於) 1:7、2:6等)時。該等SOI可編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
本發明所揭示之標的物亦提供將外源核酸靶向整合至宿主細胞中以促進所關注多肽之表現之方法。在某些實施例中，此等方法包括經由重組酶介導之重組將外源核酸靶向整合至宿主細胞中。在某些實施例中，此等方法係關於包含外源核苷酸序列之細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之位點處：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。在某些實施例中，此等方法係關於包含外源核苷酸序列之細胞，該外源核苷酸序列整合在宿主細胞基因體之基因座內，其中該基因座包含與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之核苷酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，該方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含兩個RRS，該兩個RRS側接至少一個第一選擇標記物；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備表現第一及第二所關注多肽(其中該第一及第二多肽可相同或不同)之TI宿主細胞之方法，該方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，其中該第一、第二及第三RRS係異種特異性的，亦即，該第一、第二及第三RRS不係匹配之RRS且因此該第一、第二及第三RRS中之任兩者將不適於重組酶介導之重組；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI；d) 引入一或多種重組酶，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及e) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供表現所關注多肽之方法，該方法包括：a) 提供包含至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物之宿主細胞，該至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物側接有兩個RRS且整合在該宿主細胞基因體之基因座內，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；及b) 在適於表現該SOI之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。
在某些實施例中，本揭示案提供表現所關注多肽之方法，該方法包括：a) 提供包含至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物之宿主細胞，該至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物整合在該宿主細胞基因體之基因座內，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中至少一個外源SOI及一個選擇標記物側接有第一及第三RRS且至少一個外源SOI側接有第二及該第三RRS；及b) 在適於表現該SOI之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。
本發明所揭示之標的物亦提供組合物及經由使用TI宿主細胞產生所關注多肽之方法。此等組合物及方法包括(但不限於)促進外源核苷酸序列整合至一個TI宿主細胞以及多個TI宿主細胞中之多核苷酸及載體及包含外源核苷酸序列之組合物以及使用該等之方法。在某些實施例中，載體可包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。載體可選自由以下組成之群：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
在某些實施例中，本揭示案之方法包括經由同源重組、同源定向修復(HDR)及/或非同源性末端接合(NHEJ)將編碼所關注多肽之外源核酸靶向整合至宿主細胞中。在某些實施例中，此等方法涉及在選自由以下組成之群之內源基因內之位點將編碼所關注多肽之外源核酸整合至細胞中：LOC107977062 (SEQ ID NO. 1)、LOC100768845 (SEQ ID NO. 2)、ITPR2 (SEQ ID NO. 3)、ERE67000.1 (SEQ ID NO. 4)、UBAP2 (SEQ ID NO. 5)、MTMR2 (SEQ ID NO. 6)、XP_003512331.2 (SEQ ID NO. 7)及與其至少約90%同源之序列。在某些實施例中，此等方法涉及在宿主細胞基因體之基因座內之位點將編碼所關注多肽之外源核酸整合至細胞中，其中該基因座包含與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之核苷酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，該方法包括：a) 提供宿主細胞，其包含該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；b) 向該宿主細胞中引入載體，其中該載體包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI；及c) 針對選擇標記物進行選擇以分離SOI整合於基因體之基因座中之TI宿主細胞，且表現所關注多肽。在某些實施例中，此等方法涉及使用外源核酸酶以促進靶向整合。外源核酸酶可選自由以下組成之群：鋅指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚體、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)、TAL效應物結構域融合蛋白、RNA引導之DNA核酸內切酶、經改造之大範圍核酸酶及成簇規律間隔之短迴文重複序列(CRISPR)關聯蛋白(Cas)核酸內切酶。
在某些實施例中，本揭示案提供製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，該方法包括：a) 提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中該一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含一或多個RRS；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含一或多個RRS之載體，該一或多個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之一或多個RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之外源SOI；c) 引入重組酶或編碼重組酶之核酸，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 在誘導物存在下選擇表現外源SOI之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供表現所關注多肽之方法，該方法包括：a) 提供宿主細胞，其包含整合在該宿主細胞基因體之基因座內之至少一個外源SOI，該至少一個外源SOI側接有兩個RRS且可操作地連接至可調控啟動子，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；及b) 在適於表現該SOI之條件下培養該細胞且自其回收所關注多肽。
在某些實施例中，本揭示案提供製備表現第一及第二所關注多肽(其中該第一及第二多肽可相同或不同)之TI宿主細胞之方法，該方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含第一、第二RRS及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，其中該第一、第二及第三RRS係異種特異性的，亦即，該第一、第二及第三RRS不係匹配之RRS且因此該第一、第二及第三RRS中之任兩者將不適於重組酶介導之重組；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之第一外源SOI；c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之第二外源SOI；d) 引入一或多種重組酶，或編碼一或多種重組酶之一或多種核酸，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及e) 在誘導物存在下選擇表現外源SOI之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2017年12月22日提出申請之美國臨時申請案第62/609,806號及2018年7月27日提出申請之美國臨時申請案第62/711,272號之權益，該等臨時申請案各自之揭示內容係以全文引用的方式併入本文中。
序列表
本說明書參考序列表(在2018年12月21日以電子方式提交之命名為「00B2060779SEQ.txt」之.txt文件)。該00B2060779SEQ.txt文件係在2018年12月20日生成，且大小為1,251,240個位元組。序列表之全部內容係以引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，本文所述之宿主細胞、基因構築體(例如，載體)、組合物及方法可用於開發及/或使用靶向整合(TI)宿主細胞。在某些實施例中，此等TI宿主細胞包含整合在宿主細胞基因體之特定基因或特定基因座內之外源核苷酸序列。
出於使本申請案清晰之目的且並不具有限制性，將本實施方式劃分為以下子部分：
1. 定義
2. 整合位點
3. 外源核苷酸序列
4. 宿主細胞
5. 靶向整合
6. TI宿主細胞之製備及使用
7. 產物
8. 例示性非限制性實施例
1. 定義
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與熟習此項技術者所通常理解之含義相同之含義。倘若出現衝突，則以本文件(包括定義)為準。下文闡述較佳方法及材料，但可使用與本文所述之方法及材料類似或等效之彼等方法及材料來實踐或測試本發明所揭示之標的物。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均係以全文引用的方式併入。本文所揭示之材料、方法及實例僅為說明性且不意欲具有限制性。
如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有(having、has)」、「可」、「含有」及其變體意欲為不排除其他行為或結構之可能性之開放式過渡片語、術語或詞語。除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a、an)」及「該」包括複數個提及物。本揭示案亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或要素、「由其組成」及「基本上由其組成」之其他實施例，無論是否明確陳述。
對於本文中數值範圍之引用，明確涵蓋其間具有相同精確度之每一中間數值。舉例而言，對於6-9之範圍，除6及9以外，亦涵蓋數值7及8，且對於6.0-7.0之範圍，明確涵蓋數值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及7.0。
如本文所用，術語「約」或「大約」意指在如熟習此項技術者所測定之特定值之可接受誤差範圍內，該誤差範圍將部分地取決於該值係如何量測或測定的(亦即，量測系統之限值)。舉例而言，根據此項技術中之實踐，「約」可意指在3個或3個以上之標準偏差內。或者，「約」可意指與給定值相差至多20%、較佳至多10%、更佳至多5%且更佳至多1%之範圍。或者，尤其對於生物系統或過程而言，該術語可意指在一數值之一個數量級內、較佳在5倍內，且更佳在2倍內。
如本文所用，術語「選擇標記物」可係基因，其容許在對應選擇劑存在下特異性地選擇或不選擇攜帶該基因之細胞。舉例而言但不加以限制，選擇標記物可容許經選擇標記物基因轉型之宿主細胞在該基因存在下被陽性選擇；未轉型之宿主細胞在選擇性條件下將不能生長或存活。選擇標記物可係陽性、陰性或雙功能的。陽性選擇標記物可容許選擇攜帶該標記物之細胞，而負性選擇標記物可容許選擇性地排除攜帶該標記物之細胞。選擇標記物可賦予對藥物之抗性或補償宿主細胞中之代謝或異化缺陷。在原核細胞中，可使用尤其賦予對胺苄青黴素(ampicillin)、四環素(tetracycline)、康黴素(kanamycin)或氯黴素之抗性之基因。可用作真核細胞中之選擇標記物之抗性基因包括(但不限於)針對以下之基因：胺基醣苷磷酸轉移酶(APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶(HYG)、新黴素及G418 APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、麩醯胺酸合成酶(GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、組胺醇去氫酶(組胺醇D)，以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟菌素、博來黴素、腐草黴素、氯黴素、吉歐黴素及黴酚酸之抗性之基因。其他標記物基因闡述於WO 92/08796及WO 94/28143中。
除在對應選擇劑存在下促進選擇以外，選擇標記物亦可替代地提供編碼通常不存在於細胞中之分子之基因，該分子係(例如)綠色螢光蛋白(GFP)、增強之GFP (eGFP)、合成GFP、黃色螢光蛋白(YFP)、增強之YFP (eYFP)、青色螢光蛋白(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean及T-Sapphire。攜載此一基因之細胞可與不攜載此基因之細胞區分開，例如藉由偵測所編碼多肽發出之螢光。
如本文所用，術語「可操作地連接」係指兩種或更多種組分之並置，其中該等組分處於允許其以預期方式起作用之關係。舉例而言，若啟動子及/或增強子起調節編碼序列之轉錄之作用，則該啟動子及/或增強子可操作地連接至該編碼序列。在某些實施例中，「可操作地連接」之DNA序列係鄰接序列且在單一染色體上毗鄰。在某些實施例中，例如當需要接合兩個蛋白質編碼區(諸如分泌前導序列及多肽)時，序列係鄰接的、毗鄰的且處於同一閱讀框中。在某些實施例中，可操作連接之啟動子位於編碼序列之上游且可與其毗鄰。在某些實施例中，例如關於調節編碼序列之表現之增強子序列，該兩種組分可以可操作地連接但不毗鄰。若增強子增加編碼序列之轉錄，則該增強子可操作地連接至該編碼序列。可操作連接之增強子可位於編碼序列之上游、位於編碼序列內或位於編碼序列之下游，且可位於距編碼序列之啟動子相當遠之距離。可操作連接可藉由此項技術中已知之重組方法來完成，例如使用PCR方法及/或藉由在便捷限制位點處連接。若不存在便捷限制位點，則可根據習用實踐使用合成寡核苷酸銜接子或連接體。若內部核糖體進入位點(IRES)容許以5’端非依賴性方式在內部位置起始ORF之轉譯，則其可操作地連接至開放閱讀框(ORF)。
如本文所用，術語「表現」係指轉錄及/或轉譯。在某些實施例中，可基於所存在之相應mRNA之量來測定期望產物之轉錄水準。舉例而言，可藉由PCR或藉由北方雜交(Northern hybridization)來定量自所關注序列轉錄之mRNA。在某些實施例中，可藉由各種方法來定量由所關注序列編碼之蛋白質，例如使用識別該蛋白質且結合至該蛋白質之抗體，藉由ELISA、藉由分析該蛋白質之生物活性或藉由採用獨立於此活性之分析(諸如西方墨點法或放射免疫分析)來實施。
本文術語「抗體」係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、半抗體及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可。
如本文所用，術語「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合該完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；雙功能抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Holliger及Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。
如本文所用，術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH 及VL )通常具有類似結構，其中每一結構域包含四個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(例如，參見Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H. Freeman及Co.，第91頁(2007)。)單一VH 或VL 結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合至特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH 或VL 結構域來分離以分別篩選互補VL 或VH 結構域之文庫。例如，參見Portolano等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628 (1991)。
如本文所用，術語「重鏈」係指免疫球蛋白重鏈。
如本文所用，術語「輕鏈」係指免疫球蛋白輕鏈。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干種可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為a、d、e、g及m。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群體獲得之抗體，亦即，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基，可能之變異體抗體(例如，含有天然突變或在生產單株抗體製劑期間產生)除外，此等變異體通常以較小量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定子。因此，修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上同源之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任一特定方法來生產該抗體。舉例而言，本發明之單株抗體可藉由多種技術來製得，包括(但不限於)雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之基因轉殖動物之方法，用於製備單株抗體之此等方法及其他例示性方法闡述於本文中。
「多特異性抗體」係對至少兩個不同位點(亦即，不同抗原上之不同抗原決定基或相同抗原上之不同抗原決定基)具有結合特異性之單株抗體。在某些態樣中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。多特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用以指具有實質上類似於天然抗體結構之結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合該完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv及scFab)；單一結構域抗體(dAbs)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Holliger及Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種之抗體。
「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列之胺基酸序列之抗體：其係由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類化」抗體係指包含來自非人類CDR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些態樣中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之CDR對應於非人類抗體之彼等CDR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群體獲得之抗體，亦即，包含該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基，可能之變異體抗體(例如，含有天然突變或在生產單株抗體製劑期間產生者)除外，此等變異體通常以較小量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上同源之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任一特定方法來生產該抗體。
術語「治療性抗體」係指用於治療疾病之抗體。治療性抗體可具有各種作用機制。治療性抗體可結合且中和與抗原締合之靶標之正常功能。舉例而言，阻斷為癌細胞存活所需之蛋白質活性之單株抗體會引起細胞死亡。另一治療性單株抗體可結合且活化與抗原締合之靶標之正常功能。舉例而言，單株抗體可結合至細胞上之蛋白質且觸發細胞凋亡信號。而另一單株抗體可結合至僅在患病組織上表現之靶抗原；將有毒有效載荷藥(有效劑)(諸如化學治療劑或放射性劑)結合至單株抗體可產生用於將有毒有效載荷藥特異性遞送至患病組織之劑，從而降低對健康組織之傷害。治療性抗體之「生物學上具功能之片段」將展現至少一種(若不為一些或全部)歸於完整抗體之生物學功能，該功能包含至少特異性結合至靶抗原。
術語「診斷性抗體」係指用作疾病之診斷試劑之抗體。診斷性抗體可結合至與特定疾病特異性相關之靶抗原或在特定疾病中顯示表現增加。診斷性抗體可用於(例如)偵測來自患者之生物樣品中之靶標，或用於患者中疾病部位(諸如腫瘤)之診斷性成像。診斷性抗體之「生物學上具功能之片段」將展現至少一種(若不為一些或全部)歸於完整抗體之生物學功能，該功能包含至少特異性結合至靶抗原。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指向其中引入外源核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型之細胞」，其包括原代轉型之細胞及源自其之子代，而不考慮傳代次數。子代之核酸含量可與親代細胞並不完全相同，但可含有突變。本文包括如經篩選或選擇用於原始轉型細胞中之具有相同功能或生物學活性之突變子代。
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括包含核苷酸聚合物之任何化合物及/或物質。每一核苷酸係由以下構成：鹼基、具體而言嘌呤鹼基或嘧啶鹼基(亦即胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(亦即去氧核糖或核糖)及磷酸酯基。通常，核酸分子係由鹼基序列來描述，其中該等鹼基表示核酸分子之一級結構(直鏈結構)。鹼基序列通常自5’至3’來表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋去氧核糖核酸(DNA)，包括(例如)互補DNA (cDNA)及基因體DNA；核糖核酸(RNA)、尤其信使RNA (mRNA)；DNA或RNA之合成形式；及包含該等分子中之兩者或更多者之混合聚合物。核酸分子可為直鏈或環狀的。另外，術語核酸分子包括有義股及反義股兩者以及單股及雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可含有天然或非天然核苷酸。非天然核苷酸之實例包括具有衍生糖或磷酸酯主鏈鍵聯或經化學修飾殘基之經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子亦涵蓋適宜作為用於在(例如)宿主或患者中活體外及/或活體內直接表現本發明抗體之載體之DNA及RNA分子。此等DNA (例如cDNA)或RNA (例如mRNA)載體可不經修飾或經修飾。舉例而言，mRNA可經化學修飾以增強RNA載體及/或所編碼分子之表現之穩定性，從而使得mRNA可注射至個體中以在活體內產生抗體(例如，參見Stadler等人，Nature Medicine 2017，2017年6月12日網上公佈，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
「經分離」核酸係指已自其自然環境中之組分分離之核酸分子。經分離核酸包括含於通常含有核酸分子之細胞中之核酸分子，但該核酸分子係存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。
如本文所用，術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入引入其之宿主細胞基因體中之載體。在某些實施例中，載體引導其所可操作連接之核酸之表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用，術語「同源序列」係指共享如藉由序列之比對所測定之顯著序列相似性之序列。舉例而言，兩個序列可為約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或99.9%同源。該比對係藉由包括(但不限於) BLAST、FASTA及HMME之算法及電腦程式來實施，其比較序列且基於諸如序列長度、序列同一性及相似性以及序列失配及空位之存在及長度等因素來計算匹配之統計顯著性。同源序列可係指DNA及蛋白質序列兩者。
如本文所用，術語「側接」係指第一核苷酸序列位於第二核苷酸序列之5’或3’端或兩端。側接核苷酸序列可毗鄰該第二核苷酸序列或在距該第二核苷酸序列之界定距離處。對側接核苷酸序列之長度無具體限制。舉例而言，側接序列可為幾個鹼基對或為幾千個鹼基對。在某些實施例中，側接核苷酸序列之長度可為約至少15個鹼基對、至少20個鹼基對、至少30個鹼基對、至少40個鹼基對、至少50個鹼基對、至少75個鹼基對、至少100個鹼基對、至少150個鹼基對、至少200個鹼基對、至少300個鹼基對、至少400個鹼基對、至少500個鹼基對、至少1,000個鹼基對、至少1,500個鹼基對、至少2,000個鹼基對、至少3,000個鹼基對、至少4,000個鹼基對、至少5,000個鹼基對、至少6,000個鹼基對、至少7,000個鹼基對、至少8,000個鹼基對、至少9,000個鹼基對、至少10,000個鹼基對。
如本文所用，術語「外源性」指示核苷酸序列不來源於宿主細胞且係藉由傳統DNA遞送方法(例如，藉由轉染、電穿孔或轉型方法)引入至宿主細胞中。術語「內源性」係指核苷酸序列來源於宿主細胞。「外源性」核苷酸序列可具有在鹼基組成上相同之「內源性」對應體，但其中「外源性」序列係(例如)經由重組DNA技術引入至宿主細胞中。
2. 整合位點
本發明所揭示之標的物提供適於靶向整合外源核苷酸序列之宿主細胞。在某些實施例中，該宿主細胞包含外源核苷酸序列，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞(亦即，TI宿主細胞)基因體上之整合位點處。
「整合位點」包含宿主細胞基因體內之核酸序列，其中插入外源核苷酸序列。在某些實施例中，整合位點位於宿主細胞基因體上之兩個毗鄰核苷酸之間。在某些實施例中，整合位點包括一段核苷酸，在其任一者之間可插入外源核苷酸序列。在某些實施例中，整合位點位於TI宿主細胞基因體之特定基因座內。在某些實施例中，整合位點在TI宿主細胞之內源基因內。
在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在TI宿主細胞基因體之特定基因座內之位點處。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合至其中之基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源。
在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在TI宿主細胞基因體之特定基因座內之位點處。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合至其中之基因座與選自以下之序列至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源：片段重疊群NW_006874047.1、NW_ 006884592.1、NW_ 006881296.1、NW_ 003616412.1、NW_ 003615063.1、NW_ 006882936.1及NW_ 003615411.1。
在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在位於選自SEQ ID No. 1之以下核苷酸編號位置內之整合位點處：1-1,000 bp；1,000-2,000 bp；2,000-3,000 bp；3,000-4,000 bp；及4,000-4,301 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在位於選自SEQ ID No. 2之以下核苷酸編號位置內之整合位點處：1-100,000 bp；100,000-200,000 bp；200,000-300,000 bp；300,000-400,000 bp；400,000-500,000 bp；500,000-600,000 bp；600,000-700,000 bp；及700,000-728785 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在位於選自SEQ ID No. 3之以下核苷酸編號位置內之整合位點處：1-100,000 bp；100,000-200,000 bp；200,000-300,000 bp；300,000-400,000 bp；及400,000-413,983 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在位於選自SEQ ID No. 4之以下核苷酸編號位置內之整合位點處：1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；及30,000-30,757 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在位於選自SEQ ID No. 5之以下核苷酸編號位置內之整合位點處：1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；30,000-40,000 bp；40,000-50,000 bp；50,000-60,000 bp；及60,000-68,962 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在位於選自SEQ ID No. 6之以下核苷酸編號位置內之整合位點處：1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；30,000-40,000 bp；40,000-50,000 bp；及50,000-51,326 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在位於選自SEQ ID No. 7之以下核苷酸編號位置內之整合位點處：1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；及20,000-22,904 bp。
在某些實施例中，緊接經整合之外源序列之5’的核苷酸序列係選自由以下組成之群：NW_006874047.1之核苷酸41190-45269、NW_006884592.1之核苷酸63590-207911、NW_006881296.1之核苷酸253831-491909、NW_003616412.1之核苷酸69303-79768、NW_003615063.1之核苷酸293481-315265、NW_006882936.1之核苷酸2650443-2662054或NW_003615411.1之核苷酸82214-97705及與其至少50%同源之序列。在某些實施例中，緊接經整合之外源序列之5’的核苷酸序列與NW_006874047.1之核苷酸41190-45269、NW_006884592.1之核苷酸63590-207911、NW_006881296.1之核苷酸253831-491909、NW_003616412.1之核苷酸69303-79768、NW_003615063.1之核苷酸293481-315265、NW_006882936.1之核苷酸2650443-2662054或NW_003615411.1之核苷酸82214-97705至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源。
在某些實施例中，緊接經整合之外源序列之3’的核苷酸序列係選自由以下組成之群：NW_006874047.1之核苷酸45270-45490、NW_006884592.1之核苷酸207912-792374、NW_006881296.1之核苷酸491910-667813、NW_003616412.1之核苷酸79769-100059、NW_003615063.1之核苷酸315266-362442、NW_006882936.1之核苷酸2662055-2701768或NW_003615411.1之核苷酸97706-105117及與其至少50%同源之序列。在某些實施例中，緊接經整合之外源序列之3’的核苷酸序列與NW_006874047.1之核苷酸45270-45490、NW_006884592.1之核苷酸207912-792374、NW_006881296.1之核苷酸491910-667813、NW_003616412.1之核苷酸79769-100059、NW_003615063.1之核苷酸315266-362442、NW_006882936.1之核苷酸2662055-2701768或NW_003615411.1之核苷酸97706-105117至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列可操作地連接至選自由SEQ ID. No. 1-7及與其至少50%同源之序列組成之群之核苷酸序列。在某些實施例中，核苷酸序列可操作地連接至與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源之外源核苷酸序列。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個SOI。在某些實施例中，與隨機整合之SOI相比，可操作地連接之核苷酸序列增加SOI之表現水準。在某些實施例中，經整合之外源SOI較隨機整合之SOI表現高約20%、30%、40%、50%、100%、2倍、3倍、5倍或10倍。
在某些實施例中，經整合之外源序列在5’側接有選自由以下組成之群之核苷酸序列：NW_006874047.1之核苷酸41190-45269、NW_006884592.1之核苷酸63590-207911、NW_006881296.1之核苷酸253831-491909、NW_003616412.1之核苷酸69303-79768、NW_003615063.1之核苷酸293481-315265、NW_006882936.1之核苷酸2650443-2662054及NW_003615411.1之核苷酸82214-97705以及與其至少50%同源之序列，且在3’端側接有選自由以下組成之群之核苷酸序列：NW_006874047.1之核苷酸45270-45490、NW_006884592.1之核苷酸207912-792374、NW_006881296.1之核苷酸491910-667813、NW_003616412.1之核苷酸79769-100059、NW_003615063.1之核苷酸315266-362442、NW_006882936.1之核苷酸2662055-2701768及NW_003615411.1之核苷酸97706-105117以及與其至少50%同源之序列。在某些實施例中，側接經整合之外源核苷酸序列之5’的核苷酸序列與NW_006874047.1之核苷酸41190-45269、NW_006884592.1之核苷酸63590-207911、NW_006881296.1之核苷酸253831-491909、NW_003616412.1之核苷酸69303-79768、NW_003615063.1之核苷酸293481-315265、NW_006882936.1之核苷酸2650443-2662054及NW_003615411.1之核苷酸82214-97705至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源，且側接經整合之外源核苷酸序列之3’的核苷酸序列與SEQ ID No. NW_006874047.1之核苷酸45270-45490、NW_006884592.1之核苷酸207912-792374、NW_006881296.1之核苷酸491910-667813、NW_003616412.1之核苷酸79769-100059、NW_003615063.1之核苷酸315266-362442、NW_006882936.1之核苷酸2662055-2701768及NW_003615411.1之核苷酸97706-105117至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸整合至基因座中，該基因座緊鄰選自由與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之序列組成之群的序列之全部或一部分。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列毗鄰選自由SEQ ID. No. 1-7及與其至少50%同源之序列組成之群之核苷酸序列。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列在距選自由SEQ ID. No. 1-7及與其至少50%同源之序列組成之群之序列約100 bp、約200 bp、約500 bp、約1 kb距離內。在某些實施例中，毗鄰外源核苷酸序列之核苷酸序列與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源。
在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在毗鄰選自SEQ ID No. 1之以下核苷酸編號位置之整合位點處：1-1,000 bp；1,000-2,000 bp；2,000-3,000 bp；3,000-4,000 bp；及4,000-4,301 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在毗鄰選自SEQ ID No. 2之以下核苷酸編號位置之整合位點處：1-100,000 bp；100,000-200,000 bp；200,000-300,000 bp；300,000-400,000 bp；400,000-500,000 bp；500,000-600,000 bp；600,000-700,000 bp；及700,000-728785 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在毗鄰選自SEQ ID No. 3之以下核苷酸編號位置之整合位點處：1-100,000 bp；100,000-200,000 bp；200,000-300,000 bp；300,000-400,000 bp；及400,000-413,983。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在毗鄰選自SEQ ID No. 4之以下核苷酸編號位置之整合位點處：1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；及30,000-30,757 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在毗鄰選自SEQ ID No. 5之以下核苷酸編號位置之整合位點處：1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；30,000-40,000 bp；40,000-50,000 bp；50,000-60,000 bp；及60,000-68,962 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在毗鄰選自SEQ ID No. 6之以下核苷酸編號位置之整合位點處：1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；30,000-40,000 bp；40,000-50,000 bp；及50,000-51,326 bp。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在毗鄰選自SEQ ID No. 7之以下核苷酸編號位置之整合位點處：1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；及20,000-22,904 bp。
在某些實施例中，包含外源核苷酸序列之整合位點之基因座不編碼開放閱讀框(ORF)。在某些實施例中，包含外源核苷酸序列之整合位點之基因座包括順式作用元件，例如啟動子及增強子。在某些實施例中，包含外源核苷酸序列之整合位點之基因座不含增強基因表現之任何順式作用元件，例如啟動子及增強子。
在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之整合位點處：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2。內源性LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因包括LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因之野生型及所有同源序列。在某些實施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因之同源序列可與野生型LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源。在某些實施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因係野生型哺乳動物LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因。在某些實施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因係野生型人類LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因。在某些實施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因係野生型倉鼠LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2基因。
在某些實施例中，整合位點可操作地連接至選自由以下組成之群之內源基因：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及其至少約90%同源之序列。在某些實施例中，整合位點側接有選自由以下組成之群之內源基因：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及其至少約90%同源之序列。
表1提供例示性TI宿主細胞整合位點：
表 1 - TI 宿主細胞整合位點
在某些實施例中，整合位點及/或側接該整合位點之核苷酸序列可以實驗方式來鑑別。在某些實施例中，整合位點及/或側接該整合位點之核苷酸序列可藉由全基因體篩選方法來鑑別以分離宿主細胞，該等宿主細胞以合意水準表現由整合至一或多個外源核苷酸序列中之一或多個SOI編碼之所關注多肽，其中該等外源序列自身整合至宿主細胞基因體之一或多個基因座中。在某些實施例中，整合位點及/或側接整合位點之核苷酸序列可在基於轉位酶之盒整合事件後藉由全基因體篩選方法來鑑別。在某些實施例中，整合位點及/或側接整合位點之核苷酸序列可藉由強力隨機整合篩選來鑑別。在某些實施例中，整合位點及/或側接整合位點之核苷酸序列可藉由習用測序方法來測定，諸如靶基因座擴增(TLA)、之後下一代測序(NGS)及全基因體NGS。在某些實施例中，染色體上整合位點之位置可藉由習用細胞生物學方法(諸如螢光原位雜交(FISH)分析)來測定。
在某些實施例中，TI宿主細胞包含第一外源核苷酸序列，該第一外源核苷酸序列整合在TI宿主細胞基因體中之特定第一基因座內之第一整合位點處；及第二外源核苷酸序列，該第二外源核苷酸序列整合在基因體中特定第二基因座內之第二整合位點處。在某些實施例中，TI宿主細胞包含多個外源核苷酸序列，該等序列整合在TI宿主細胞基因體中之多個整合位點處。
在某些實施例中，本揭示案之TI宿主細胞包含至少兩種不同之外源核苷酸序列，例如包含至少一個RRS之外源核苷酸序列。在某些實施例中，可靶向該兩種或更多種外源核苷酸序列以引入一或多個SOI。在某些實施例中，SOI係相同的。在某些實施例中，SOI不同。在某些實施例中，包含第一外源核苷酸序列之親代TI宿主細胞可在不同於該第一外源核苷酸序列之整合位點之整合位點處包含第二外源核苷酸序列。
在某些實施例中，整合位點與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源。在某些實施例中，整合位點可在同一染色體上。在某些實施例中，整合位點在同一染色體中彼此位於1-1,000個核苷酸、1,000-100,000個核苷酸、100,000-1,000,000個核苷酸或更多個核苷酸內。在某些實施例中，整合位點係在不同染色體上。在某些實施例中，在一個整合位點處包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞可用於在相同或不同整合位點處插入至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少7個、至少8個或更多個外源核苷酸序列。
在某些實施例中，可個別地評估每一位點之至少兩個整合位點之重組酶介導之盒交換(RMCE)之可行性。在某些實施例中，可同時評估至少兩個整合位點處之RMCE可行性。多個位點處之RMCE可行性可藉由此項技術中已知之方法來評估，例如量測多肽效價或多肽比產量。在某些實施例中，評估可藉由此項技術中已知之方法來實施，例如藉由評估表現一或多個SOI之TI宿主細胞培養物之效價及/或比生產力。例示性培養策略包括(但不限於)補料分批搖瓶培養物及生物反應器補料分批培養物。表現所關注多肽之TI宿主細胞之效價及比生產力可藉由此項技術中已知之方法來評估，該等方法例如(但不限於) ELISA、FACS、螢光微量體積分析技術(FMAT)、蛋白質A親和層析、西方墨點分析。
3. 外源核苷酸序列
外源核苷酸序列係不來源於宿主細胞但可藉由傳統DNA遞送方法(例如，藉由轉染、電穿孔或轉型方法)引入至宿主細胞中之核苷酸序列。在某些實施例中，外源核苷酸序列係所關注序列(SOI)，例如編碼所關注多肽之核苷酸序列。然而，在某些實施例中，本揭示案之背景中所採用之外源核苷酸序列包含促進其他核酸序列(例如，SOI)之引入之元件，例如一或多個重組識別序列(RRs)及一或多個選擇標記物。在某些實施例中，促進其他核酸序列之引入之外源核苷酸序列在本文中稱為「著陸墊(landing pad)」。因此，在某些實施例中，TI宿主細胞可包含：(1) 包括一或多個SOI之外源核苷酸序列，該(等)SOI係例如經由外源性位點特異性核酸酶介導(例如，CRISPR/Cas9介導)之靶向整合併入至宿主細胞基因體中之特定基因座中之SOI；(2) 包括一或多個著陸墊之外源核苷酸序列；或(3) 包括一或多個其中已併入一或多個SOI之著陸墊之外源核苷酸序列。
在某些實施例中，TI宿主細胞包含至少一個外源核苷酸序列，該(等)外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體中之一或多個整合位點處。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在TI宿主細胞基因體之特定基因座內之一或多個整合位點處。舉例而言但不加以限制，至少一個外源核酸序列可整合在一或多個與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源之基因座處。
3.1 著陸墊
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含一或多個重組識別序列(RRS)，其中該RRS可由重組酶識別。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少兩個RRS。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含兩個RRS，且該兩個RRS相同。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含兩個RRS，且該兩個RRS係異種特異性的，亦即不由相同重組酶識別。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含三個RRS，其中第三RRS位於第一與第二RRS之間。在某些實施例中，第一與第二RRS係相同的，且第三RRS不同於該第一或該第二RRS。在某些實施例中，所有三個RRS均係異種特異性的。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含四個、五個、六個、七個或八個RRS。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含多個RRS。在某些實施例中，該多個兩個或更多個RRS係相同的。在某些實施例中，該兩個或更多個RRS係異種特異性的。在某些實施例中，每一RRS可由獨特重組酶識別。在某些實施例中，RRS總數之子組係同種的，亦即由相同重組酶識別，且RRS總數之子組係異種特異性的，亦即不由相同重組酶識別。在某些實施例中，該(等) RRS可選自由以下組成之群：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、φC31 attP序列及φC31 attB序列。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含一個RRS及至少一個選擇標記物。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含第一及第二RRS以及至少一個選擇標記物。在某些實施例中，選擇標記物位於該第一與該第二RRS之間。在某些實施例中，兩個RRS側接至少一個選擇標記物，亦即第一RRS位於選擇標記物之5’上游且第二RRS位於選擇標記物之3’下游。在某些實施例中，第一RRS毗鄰選擇標記物之5’端且第二RRS毗鄰選擇標記物之3’端。
在某些實施例中，選擇標記物位於第一與第二RRS之間且該兩個側接RRS係相同的。在某些實施例中，側接選擇標記物之兩個RRS均係LoxP序列。在某些實施例中，側接選擇標記物之兩個RRS均係FRT序列。在某些實施例中，選擇標記物位於第一與第二RRS之間且該兩個側接RRS係異種特異性的。在某些實施例中，第一側接RRS係LoxP L3序列且第二側接RRS係LoxP 2L序列。在某些實施例中，LoxP L3序列位於選擇標記物之5’且LoxP 2L序列位於選擇標記物之3’。在某些實施例中，第一側接RRS係野生型FRT序列且第二側接RRS係突變FRT序列。在某些實施例中，第一側接RRS係Bxb1 attP序列且第二側接RRS係Bxb1 attB序列。在某些實施例中，第一側接RRS係φC31 attP序列且第二側接RRS係φC31 attB序列。在某些實施例中，兩個RRS定位在相同定向上。在某些實施例中，兩個RRS二者均為正向或反向定向。在某些實施例中，兩個RRS定位在反向定向上。
在某些實施例中，選擇標記物可係胺基醣苷磷酸轉移酶(APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶(HYG)、新黴素及G418 APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、麩醯胺酸合成酶(GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、組胺醇去氫酶(組胺醇D)以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟菌素、博來黴素、腐草黴素、氯黴素、吉歐黴素或黴酚酸之抗性之基因。在某些實施例中，選擇標記物可係GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean或T-Sapphire標記物。在某些實施例中，選擇標記物可係包含至少兩個選擇標記物之融合構築體。在某些實施例中，編碼選擇標記物或選擇標記物之片段之基因可融合至編碼不同選擇標記物或其片段之基因。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含側接有兩個RRS之兩個選擇標記物，其中第一選擇標記物不同於第二選擇標記物。在某些實施例中，該兩個選擇標記物均係選自由以下組成之群：麩醯胺酸合成酶選擇標記物、胸苷激酶選擇標記物、HYG選擇標記物及嘌呤黴素抗性選擇標記物。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含胸苷激酶選擇標記物及HYG選擇標記物。在某些實施例中，第一選擇標記物係選自由以下組成之群：胺基醣苷磷酸轉移酶(APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶(HYG)、新黴素及G418 APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、麩醯胺酸合成酶(GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、組胺醇去氫酶(組胺醇D)以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟菌素、博來黴素、腐草黴素、氯黴素、吉歐黴素及黴酚酸之抗性之基因，且第二選擇標記物係選自由以下組成之群：GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean及T-Sapphire標記物。在某些實施例中，第一選擇標記物係麩醯胺酸合成酶選擇標記物且第二選擇標記物係GFP標記物。在某些實施例中，側接兩個選擇標記物之兩個RRS係相同的。在某些實施例中，側接兩個選擇標記物之兩個RRS不同。
在某些實施例中，選擇標記物可操作地連接至啟動子序列。在某些實施例中，選擇標記物可操作地連接至SV40啟動子。在某些實施例中，選擇標記物可操作地連接至巨細胞病毒(CMV)啟動子。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物及一個IRES，其中該IRES可操作地連接至該選擇標記物。在某些實施例中，可操作地連接至IRES之選擇標記物係選自由以下組成之群：GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean及T-Sapphire標記物。在某些實施例中，可操作地連接至IRES之選擇標記物係GFP標記物。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含IRES及側接有兩個RRS之兩個選擇標記物，其中該IRES可操作地連接至第二選擇標記物。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含IRES及側接有兩個RRS之三個選擇標記物，其中該IRES可操作地連接至第三選擇標記物。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含IRES及側接有兩個RRS之三個選擇標記物，其中該IRES可操作地連接至第三選擇標記物。在某些實施例中，第三選擇標記物不同於第一或第二選擇標記物。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含可操作地連接至啟動子之第一選擇標記物及可操作地連接至IRES之第二選擇標記物。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含可操作地連接至SV40啟動子之麩醯胺酸合成酶選擇標記物及可操作地連接至IRES之GFP選擇標記物。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含可操作地連接至CMV啟動子之胸苷激酶選擇標記物及HYG選擇標記物以及可操作地連接至IRES之GFP選擇標記物。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含三個RRS。在某些實施例中，第三RRS位於第一與第二RRS之間。在某些實施例中，所有三個RRS均係相同的。在某些實施例中，第一與第二RRS係相同的，且第三RRS不同於第一或第二RRS。在某些實施例中，所有三個RRS均係異種特異性的。
3.2 所關注序列 (SOI)
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個外源SOI。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物、至少一個外源SOI以及至少一個RRS。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或更多個SOI。在某些實施例中，SOI係相同的。在某些實施例中，SOI不同。
在某些實施例中，SOI編碼單鏈抗體或其片段。在某些實施例中，SOI編碼抗體重鏈序列或其片段。在某些實施例中，SOI編碼抗體輕鏈序列或其片段。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含編碼抗體重鏈序列或其片段之SOI及編碼抗體輕鏈序列或其片段之SOI。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含編碼第一抗體重鏈序列或其片段之SOI、編碼第二抗體重鏈序列或其片段之SOI及編碼抗體輕鏈序列或其片段之SOI。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含編碼第一抗體重鏈序列或其片段之SOI、編碼第二抗體重鏈序列或其片段之SOI、編碼第一抗體輕鏈序列或其片段之SOI及編碼抗體輕鏈序列或其片段之第二SOI。在某些實施例中，編碼重鏈及輕鏈序列之SOI之數目可經選擇以達成重鏈及輕鏈多肽之期望表現水準，例如以達成期望量之雙特異性抗體生產。在某些實施例中，編碼重鏈及輕鏈序列之個別SOI可整合至(例如)存在於單一整合位點處之單一外源核酸序列中、存在於單一整合位點處之多個外源核酸序列中或整合在TI宿主細胞內之不同整合位點處之多個外源核酸序列中。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物、至少一個外源SOI及一個RRS。在某些實施例中，該RRS毗鄰至少一個選擇標記物或至少一個外源SOI定位。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物、至少一個外源SOI及兩個RRS。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物及至少一個位於第一與第二RRS之間的外源SOI。在某些實施例中，側接選擇標記物及外源SOI之兩個RRS係相同的。在某些實施例中，側接選擇標記物及外源SOI之兩個RRS不同。在某些實施例中，第一側接RRS係LoxP L3序列且第二側接RRS係LoxP 2L序列。在某些實施例中，L3 LoxP序列位於選擇標記物及外源SOI之5’，且LoxP 2L序列位於選擇標記物及外源SOI之3’。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含三個RRS及兩個外源SOI，且第三RRS位於第一與第二RRS之間。在某些實施例中，第一SOI位於第一與第三RRS之間，且第二SOI位於第三與第二RRS之間。在某些實施例中，第一與第二SOI不同。在某些實施例中，第一與第二RRS係相同的，且第三RRS不同於第一或第二RRS。在某些實施例中，所有三個RRS均係異種特異性的。在某些實施例中，第一RRS係LoxP L3位點，第二RRS係LoxP 2L位點，且第三RRS係LoxFas位點。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含三個RRS、一個外源SOI及一個選擇標記物。在某些實施例中，SOI位於第一與第三RRS之間，且選擇標記物位於第三與第二RRS之間。在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含三個RRS、兩個外源SOI及一個選擇標記物。在某些實施例中，第一SOI及選擇標記物位於第一與第三RRS之間，且第二SOI位於第三與第二RRS之間。
在某些實施例中，外源SOI編碼所關注多肽。此等所關注多肽可選自包括(但不限於)以下各項之群：抗體、酶、細胞介素、生長因子、激素、病毒蛋白、細菌蛋白質、疫苗蛋白質或具有治療功能之蛋白質。在某些實施例中，外源SOI編碼抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，外源SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。在某些實施例中，外源SOI (或多個SOI)編碼標準抗體。在某些實施例中，外源SOI (或多個SOI)編碼半抗體，例如(但不限於)本揭示案之抗體B、Q、T及mAb I。在某些實施例中，外源SOI (或多個SOI)編碼複合抗體。在某些實施例中，複合抗體可係雙特異性抗體，例如(但不限於)本揭示案之雙特異性分子A、雙特異性分子B、雙特異性分子C或雙特異性分子D。在某些實施例中，外源SOI可操作地連接至至少一個順式作用元件，例如啟動子或增強子。在某些實施例中，外源SOI可操作地連接至CMV啟動子。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含兩個RRS及位於該兩個RRS之間的至少兩個外源SOI。在某些實施例中，編碼抗體之一條重鏈及一條輕鏈之SOI位於兩個RRS之間。在某些實施例中，編碼抗體之一條重鏈及兩條輕鏈之SOI位於兩個RRS之間。在某些實施例中，編碼抗體之重鏈及輕鏈拷貝之不同組合之SOI位於兩個RRS之間。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含三個RRS及至少兩個外源SOI，且第三RRS位於第一與第二RRS之間。在某些實施例中，至少一個SOI位於第一與第三RRS之間，且至少一個SOI位於第三與第二RRS之間。在某些實施例中，第一與第二RRS係相同的，且第三RRS不同於第一或第二RRS。在某些實施例中，所有三個RRS均係異種特異性的。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈及一條輕鏈之SOI位於第一與第三RRS之間，且編碼第二抗體之一條重鏈及一條輕鏈之SOI位於第三與第二RRS之間。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈及兩條輕鏈之SOI位於第一與第三RRS之間，且編碼第二抗體之一條重鏈及一條輕鏈之SOI位於第三RRS與第二RRS之間。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈及三條輕鏈之SOI位於第一與第三RRS之間，且編碼該第一抗體之一條輕鏈及第二抗體之一條重鏈及一條輕鏈之SOI位於第三RRS與第二RRS之間。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈及三條輕鏈之SOI位於第一與第三RRS之間，且編碼該第一抗體之兩條輕鏈及第二抗體之一條重鏈及一條輕鏈之SOI位於第三RRS與第二RRS之間。在某些實施例中，編碼多個抗體之重鏈及輕鏈拷貝之不同組合之SOI位於第一與第三RRS之間，且位於第三與第二RRS之間。
在某些實施例中，選擇SOI之數目以增加表現SOI之宿主細胞之效價及/或比生產力。舉例而言但不加以限制，併入兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多個SOI可使得效價及/或比生產力增加。
在抗體表現之背景中，納入編碼SOI之另一重鏈或輕鏈可使得效價及/或比生產力增加。舉例而言但不加以限制，當將拷貝數自一條重鏈及一條輕鏈(HL)增加至一條重鏈及兩條輕鏈編碼序列(HLL)，可達成效價及/或比生產力之增加。類似地，如下文實例中所概述，自HLL (三個SOI)增加至HLL-HL (五個SOI)或HLL-HLL (六個SOI)可提供效價及/或比生產力之增加。另外，將拷貝數增加至HLL-HL (五個SOI)或HLL-HLHL (七個SOI)可提供效價及/或比生產力之增加。重鏈及輕鏈SOI拷貝數之其他選項包括(但不限於)：HHL；HHL-H；HLL-H；HHL-HH；HHL-HL；HHL-LL；HLL-HH；HLL-HL；HLL-LL；HHL-HHL；HHL-HHH；HHL-HLL；HHK-LLL；HLL-HHL；HLL-HHH；HLL-LLL；HHL-HHHL；HHL-HHHH；HHL-HHLL；HHL-HLLL；HHL-LLLL；HLL-HHHL；HLL-HHHH；HLL-HLLL；及HLL-LLLL。在某些實施例中，其他拷貝之納入在單一基因體基因座處發生，而在某些實施例中，SOI拷貝可整合在兩個或更多個基因座處，例如多個拷貝可整合在單一基因座處且一或多個拷貝整合在一或多個其他基因座處。
在某些實施例中，選擇SOI之位置(例如，一個SOI相對於另一SOI是否位於3’或5’)以增加表現SOI之宿主細胞之效價及/或比生產力。舉例而言但不加以限制，在抗體生產之背景中，重鏈及輕鏈SOI之整合位置可使得效價及/或比生產力增加。如圖23A至圖23D及下文所呈現之實例中所概述，重鏈及輕鏈SOI之相對位置可影響效價及比生產力，儘管SOI拷貝數無變化。
4. 宿主細胞
本發明所揭示之標的物提供適於靶向整合核苷酸序列且表現所關注多肽之宿主細胞。在某些實施例中，宿主細胞包含：內源基因，該內源基因選自由以下組成之群：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少50%同源之序列；或該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座包含選自由SEQ ID No. 1-7及與其至少50%同源之序列組成之群之核苷酸序列。
在某些實施例中，宿主細胞係真核宿主細胞。在某些實施例中，宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。在某些實施例中，宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。在某些實施例中，宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
在某些實施例中，宿主細胞係選自由以下組成之群：由SV40轉型之猴腎CV1系(COS-7)、人類胚腎系(293或293細胞，如(例如) Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所述)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、小鼠支持細胞(TM4細胞，如(例如) Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所述)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人類子宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell) (BRL 3A)、人類肺細胞(W138)、人類肝細胞(Hep G2)、小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)、TRI細胞(如(例如) Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所述)、MRC 5細胞、FS4細胞、Y0細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞及PER.C6®細胞。
在某些實施例中，宿主細胞係細胞株。在某些實施例中，宿主細胞係已培養一定代數之細胞株。在某些實施例中，宿主細胞係原代細胞。
在某些實施例中，若經10、20、30、50、100、200或300代，所關注多肽之表現水準維持在一定水準、增加或減少小於20%，則其表現係穩定的。在某些實施例中，若可在無任何選擇之情形下維持培養物，則所關注多肽之表現係穩定的。在某些實施例中，若所關注基因之多肽產物達到約1 g/L、約2 g/L、約3 g/L、約4 g/L、約5 g/L、約10 g/L、約12 g/L、約14 g/L或約16 g/L，則所關注多肽之表現較高。
本發明所揭示之標的物亦係關於產生所關注多肽之方法。在某些實施例中，此方法包括：a) 提供包含至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物之宿主細胞，該至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物側接有兩個RRS且整合在該宿主細胞基因體之基因座內，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；及b) 在適於表現該SOI之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。在某些實施例中，此方法包括：a) 提供包含至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物之宿主細胞，該至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物整合在該宿主細胞基因體之基因座內，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中至少一個外源SOI及一個選擇標記物側接有第一及第三RRS且至少一個外源SOI側接有第二及該第三RRS；及b) 在適於表現該SOI之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。在某些實施例中，此方法包括：a) 提供包含至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物之宿主細胞，該至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物側接有兩個RRS且整合在選自由以下組成之群之內源基因內：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及其至少約90%同源之序列；及b) 在適於表現該SOI之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。在某些實施例中，此方法包括：a) 提供包含至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物之宿主細胞，該至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物整合在選自由以下組成之群之內源基因內：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列，其中至少一個外源SOI及一個選擇標記物側接有第一及第三RRS且至少一個外源SOI側接有第二及該第三RRS；及b) 在適於表現該SOI之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。
在某些實施例中，所關注多肽產生且分泌至細胞培養基中。在某些實施例中，所關注多肽在宿主細胞內表現且保留。在某些實施例中，所關注多肽表現在宿主細胞膜中、插入至宿主細胞膜中且保留在宿主細胞膜中。
所關注外源核苷酸或載體可藉由習用細胞生物學方法引入至宿主細胞中，該等方法包括(但不限於)轉染、轉導、電穿孔或注射。在某些實施例中，所關注外源核苷酸或載體藉由基於化學之轉染方法引入至宿主細胞中，該等方法包括基於脂質之轉染方法、基於磷酸鈣之轉染方法、基於陽離子聚合物之轉染方法或基於奈米粒子之轉染。在某些實施例中，所關注外源核苷酸藉由病毒介導之轉導引入至宿主細胞中，該病毒介導之轉導包括(但不限於)慢病毒屬、反轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒介導之轉導。在某些實施例中，所關注外源核苷酸或載體經由基因槍介導之注射引入至宿主細胞中。在某些實施例中，DNA及RNA分子二者均使用本文所述之方法引入至宿主細胞中。
5. 靶向整合
靶向整合容許外源核苷酸序列整合至宿主細胞基因體之一或多個預定位點處。在某些實施例中，靶向整合藉由識別一或多種RRS之重組酶介導。在某些實施例中，靶向整合藉由同源重組介導。在某些實施例中，靶向整合藉由外源性位點特異性核酸酶介導，之後進行HDR及/或NHEJ。
5.1. 經由重組酶介導之重組之靶向整合
「重組識別序列」(RRS)係由重組酶識別之核苷酸序列，且對於重組酶介導之重組事件係必需且足夠的。RRS可用於界定核苷酸序列中將發生重組事件之位置。
在某些實施例中，RRS係選自由以下組成之群：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、φC31 attP序列及φC31 attB序列。
在某些實施例中，RRS可由Cre重組酶識別。在某些實施例中，RRS可由FLP重組酶識別。在某些實施例中，RRS可由Bxb1整合酶識別。在某些實施例中，RRS可由φC31整合酶識別。
在某些實施例中，當RRS係LoxP位點時，宿主細胞需要Cre重組酶以進行重組。在某些實施例中，當RRS係FRT位點時，宿主細胞需要FLP重組酶以進行重組。在某些實施例中，當RRS係Bxb1 attP或Bxb1 attB位點時，宿主細胞需要Bxb1整合酶以進行重組。在某些實施例中，當RRS係φC31 attP或φC31attB位點時，宿主細胞需要φC31整合酶以進行重組。可使用包含酶編碼序列之表現載體將重組酶引入至宿主細胞中。
Cre-LoxP位點特異性重組系統已廣泛用於許多生物實驗系統中。Cre係識別34 bp LoxP序列之38-kDa位點特異性DNA重組酶。Cre係源自噬菌體P1且屬於酪胺酸家族位點特異性重組酶。Cre重組酶可介導LoxP序列之間的分子內及分子間重組。LoxP序列係由側接有兩個13 bp反向重複序列之8 bp非迴文核心區構成。Cre重組酶結合至該13 bp重複序列，藉此介導該8 bp核心區內之重組。Cre-LoxP介導之重組以高效率發生，且不需要任何其他宿主因子。若兩個LoxP序列以相同定向置於相同核苷酸序列上，則Cre介導之重組將切除位於該兩個LoxP序列之間的DNA序列作為共價閉合環。若兩個LoxP序列置於相同核苷酸序列上之倒置位置，則Cre介導之重組將使位於該兩個序列之間的DNA序列之定向反轉。LoxP序列亦可置於不同染色體上以促進不同染色體之間的重組。若兩個LoxP序列在兩個不同DNA分子上且若一個DNA分子係環狀的，則Cre介導之重組將引起環狀DNA序列之整合。
在某些實施例中，LoxP序列係野生型LoxP序列。在某些實施例中，LoxP序列係突變LoxP序列。已開發突變LoxP序列以增加Cre介導之整合或置換之效率。在某些實施例中，突變LoxP序列係選自由以下組成之群：LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列及Lox66序列。舉例而言，Lox71序列在左側13 bp重複序列中有5 bp突變。Lox66序列在右側13 bp重複序列中有5 bp突變。野生型及突變LoxP序列二者均可介導Cre依賴性重組。
FLP-FRT位點特異性重組系統與Cre-Lox系統類似。其涉及翻轉酶(FLP)重組酶，該重組酶係源自酵母啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )之2 µm質體。FLP亦屬於酪胺酸家族位點特異性重組酶。FRT序列係34 bp序列，其由各自側接8 bp間隔區之兩個13 bp迴文序列組成。FLP結合至該13 bp迴文序列且介導該8 bp間隔區內之DNA斷裂、交換及連接。與Cre重組酶類似，兩個FRT序列之位置及定向確定FLP介導之重組之結果。在某些實施例中，FRT序列係野生型FRT序列。在某些實施例中，FRT序列係突變FRT序列。野生型及突變FRT序列二者均可介導FLP依賴性重組。在某些實施例中，FRT序列融合至反應性受體結構域序列，諸如(但不限於)他莫昔芬(tamoxifen)反應性受體結構域序列。
Bxb1及φC31屬於絲胺酸重組酶家族。其均源自噬菌體且為該等噬菌體所使用以建立溶原性，從而促進噬菌體基因體位點特異性整合至細菌基因體中。該等整合酶催化稱為attP 及attB 序列之短(40-60 bp) DNA受質之間的位點特異性重組事件，該等attP 及attB 序列係分別位於噬菌體DNA及細菌DNA上之最初附著位點。重組後，形成兩個新的序列，其稱為attL 及attR 序列，且各自含有源自attP 及attB 之半序列。重組亦可在attL 與attR 序列之間發生，以自細菌DNA切除整合之噬菌體。兩種整合酶均可在無任何其他宿主因子幫助下催化重組。在不存在任何輔助因子下，該等整合酶以大於80%之效率介導attP 與attB 之間的單向重組。由於可由該等整合酶識別之短DNA序列及單向重組，已開發出該等重組系統作為廣泛使用之Cre-LoxP及FRT-FLP系統之補充以用於遺傳工程目的。
術語「匹配RRS」及「同種RRS」指示重組在兩個RRS之間發生。在某些實施例中，該兩個匹配RRS係相同的。在某些實施例中，兩個RRS均係野生型LoxP序列。在某些實施例中，兩個RRS均係突變LoxP序列。在某些實施例中，兩個RRS均係野生型FRT序列。在某些實施例中，兩個RRS均係突變FRT序列。在某些實施例中，該兩個匹配RRS係不同序列，但可由相同重組酶識別。在某些實施例中，第一匹配RRS係Bxb1attP 序列且第二匹配RRS係Bxb1attB 序列。在某些實施例中，第一匹配RRS係φC31attB 序列且第二匹配RRS係φC31attB 序列。
在某些實施例中，經整合之外源核苷酸序列包含兩個RRS，且載體包含與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配之兩個RRS，亦即，該經整合之外源核苷酸序列上之第一RRS與該載體上之第一RRS匹配，且該經整合之外源核苷酸序列上之第二RRS與該載體上之第二RRS匹配。在某些實施例中，該經整合之外源核苷酸序列上之第一RRS及該載體上之第一RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之第二RRS及該載體上之第二RRS相同。此一「單一載體RMCE」策略之非限制性實例呈現於圖2A中。在某些實施例中，該經整合之外源核苷酸序列上之第一RRS及該載體上之第一RRS不同於該經整合之外源核苷酸序列上之第二RRS及該載體上之第二RRS。在某些實施例中，該經整合之外源核苷酸序列上之第一RRS及該載體上之第一RRS二者均係LoxP L3序列，且該經整合之外源核苷酸序列上之第二RRS及該載體上之第二RRS二者均係LoxP 2L序列。
在某些實施例中，採用「雙載體RMCE」策略。舉例而言但不加以限制，經整合之外源核苷酸序列可包含三個RRS，例如其中第三RRS (「RRS3」)存在於第一RRS (「RRS1」)與第二RRS (「RRS2」)之間之排列，而第一載體包含與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配之兩個RRS，且第二載體包含與該經整合之外源核苷酸序列上之該第三及該第二RRS匹配之兩個RRS。雙載體RMCE策略之實例圖解說明於圖4中。在此一實例中，RRS1、RRS2及RRS3係異種特異性的，例如其彼此不交叉反應。在一些實施例中，一個載體(前端)包含RRS1、第一SOI及啟動子，之後為起始密碼子及RRS3 (以此順序)。另一載體(後端)包含與無起始密碼子(ATG)之標記物之編碼序列融合之RRS3、SOI 2及RRS2 (以此順序)。其他核苷酸可插入在RRS3位點與選擇標記物序列之間以確保融合蛋白之框架內轉譯。在一些實施例中，第一SOI編碼抗體。在一些實施例中，抗體係單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。在一些實施例中，第二SOI編碼抗體。在一些實施例中，抗體係單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。在某些實施例中，由第一及第二SOI編碼之抗體配對以形成多特異性(例如雙特異性)抗體。
此等雙載體RMCE策略容許藉由在每一對RRS之間併入適當數量之SOI引入八個或更多個SOI。
單一載體及雙載體RMCE二者均容許將一或多個供體DNA分子單向整合至宿主細胞基因體之預定位點中，且將供體DNA上所存在之DNA盒與整合位點所位於之宿主基因體上之DNA盒精確交換。DNA盒之特徵在於兩個異種特異性RRS側接至少一個選擇標記物(儘管在某些雙載體RMCE實例中，可如本文所概述使用「分裂選擇標記物」)及/或至少一個外源SOI。RMCE涉及在靶基因體基因座及供體DNA分子內之兩個異種特異性RRS之間由重組酶催化之雙重重組交叉事件。RMCE經設計以將SOI或選擇標記物之拷貝引入至宿主細胞基因體之預定基因座中。與僅涉及一個交叉事件之重組不同，可實施RMCE從而使得原核載體序列不引入至宿主細胞基因體中，由此降低及/或防止宿主免疫或防禦機制之不期望觸發。可用多個DNA盒來重複RMCE程序。
在某些實施例中，藉由一個交叉重組事件來達成靶向整合，其中將一個外源核苷酸序列整合至宿主細胞基因體之預定位點中，該外源核苷酸序列包含一個RRS，其毗鄰至少一個外源SOI或至少一個選擇標記物。在某些實施例中，藉由一次RMCE來達成靶向整合，其中將DNA盒整合至宿主細胞基因體之預定位點中，該DNA盒包含側接有兩個異種特異性RRS之至少一個外源SOI或至少一個選擇標記物。在某些實施例中，藉由兩次RMCE來達成靶向整合，其中將兩個不同DNA盒二者均整合至宿主細胞基因體之預定位點中，該兩個DNA盒各自包含側接有兩個異種特異性RRS之至少一個SOI或至少一個選擇標記物。在某些實施例中，藉由多次RMCE來達成靶向整合，其中將來自多個載體之DNA盒全部整合至宿主細胞基因體之預定位點中，該等DNA盒各自包含側接有兩個異種特異性RRS之至少一個SOI或至少一個選擇標記物。在某些實施例中，選擇標記物可在第一載體上部分編碼且在第二載體上部分編碼，從而使得兩次RMCE之整合容許表現選擇標記物。此一系統之實例呈現於圖4中。
在某些實施例中，經由重組酶介導之重組之靶向整合導致選擇標記物或一或多個外源SOI連同來自原核載體之序列一起整合至宿主細胞基因體之一或多個預定整合位點中。在某些實施例中，經由重組酶介導之重組之靶向整合導致選擇標記物或一或多個外源SOI整合至宿主細胞基因體之一或多個預定整合位點中而不含來自原核載體之序列。
5.2 經由同源重組、 HDR 或 NHEJ 之靶向整合
本發明所揭示之標的物亦係關於藉由同源重組或藉由外源性位點特異性核酸酶介導、之後進行HDR或NHEJ之靶向整合。
同源重組係共享廣泛序列同源性之DNA分子之間的重組。其可用於指導雙股DNA斷裂之無差錯修復且在減數分裂期間產生配子中之序列變異。由於同源重組涉及兩個同源DNA分子之間的遺傳資訊之交換，因此其並不改變染色體上基因之總體排列。在同源重組期間，在雙股DNA (dsDNA)中形成切口或斷裂，之後藉由單股DNA端侵入同源dsDNA分子、同源序列配對、分支遷移以形成霍利迪連結體(Holliday junction)且最終拆分霍利迪連結體。
雙股斷裂(DSB)係最嚴重之DNA損害形式，且此DNA損害之修復對於維持所有生物體中之基因體完整性至關重要。存在兩種修復DSB之主要修復路徑。第一修復路徑係同源定向修復(HDR)路徑，且同源重組係HDR之最常見形式。由於HDR需要存在於細胞中之同源DNA之存在，因此此修復路徑通常在細胞週期之S及G2期具有活性，在其中新近複製之姊妹染色分體可用作同源模板。HDR亦係在DNA複製期間修復垮塌複製叉之主要修復路徑。HDR視為相對無差錯之修復路徑。DSB之第二修復路徑係非同源性末端接合(NHEJ)。NHEJ係其中斷裂DNA之各端連接在一起而不需要同源DNA模板之修復路徑。
靶向整合可藉由外源性位點特異性核酸酶、之後HDR來促進。此係由於同源重組之頻率可藉由在特定靶基因體位點引入DSB而增加。在某些實施例中，外源核酸酶可選自由以下組成之群：鋅指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚體、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)、TAL效應物結構域融合蛋白、RNA引導之DNA核酸內切酶、經改造之大範圍核酸酶及成簇規律間隔之短迴文重複序列(CRISPR)關聯蛋白(Cas)核酸內切酶。
CRISPR/Cas及TALEN系統係兩種基因體編輯工具，其提供最佳之構築簡便性及高效率。CRISPR/Cas鑑別為細菌抵抗入侵噬菌體之免疫防禦機制。Cas係一種核酸酶，其在由合成引導RNA (gRNA)引導時，能夠與細胞中之特定核苷酸序列締合且編輯該核苷酸序列中或其周圍之DNA，例如藉由形成單股斷裂、DSB及/或點突變中之一或多者。TALEN係經改造之位點特異性核酸酶，其係由TALE (類轉錄激活因子效應物)之DNA結合結構域及限制核酸內切酶FokI之催化結構域構成。藉由改變DNA結合結構域之單體之高度可變殘基區中存在之胺基酸，可產生不同人工TALEN以靶向各種核苷酸序列。DNA結合結構域隨後將核酸酶引導至靶序列且產生DSB。
經由同源重組或HDR之靶向整合涉及在整合位點存在同源序列。在某些實施例中，同源序列存在於載體上。在某些實施例中，同源序列存在於多核苷酸上。
在某些實施例中，用於將外源核苷酸序列靶向整合至宿主細胞中之載體包含側接至少一個選擇標記物之與以下同源之核苷酸序列：選自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2組成之群之內源基因或選自SEQ ID No. 1-7之序列。在某些實施例中，用於將外源核苷酸序列靶向整合至宿主細胞中之載體包含側接至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI之與以下同源之核苷酸序列：選自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2組成之群之內源基因或選自SEQ ID No. 1-7之序列。在某些實施例中，用於將外源核苷酸序列靶向整合至宿主細胞中之載體包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。在某些實施例中，用於將外源核苷酸序列靶向整合至宿主細胞中之載體包含側接DNA盒之與選自由以下組成之群之內源基因至少50%同源之核苷酸序列：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2，其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。在某些實施例中，載體核苷酸序列與選自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2組成之群之內源基因或與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源。在某些實施例中，載體係選自由以下組成之群：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
在某些實施例中，用於將外源核苷酸序列靶向整合至宿主細胞中之多核苷酸包含側接至少一個選擇標記物之與以下同源之核苷酸序列：選自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2組成之群之內源基因或選自SEQ ID No. 1-7之序列。在某些實施例中，用於將外源核苷酸序列靶向整合至宿主細胞中之多核苷酸包含側接至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI之與以下同源之核苷酸序列：選自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2組成之群之內源基因或選自SEQ ID No. 1-7之序列。在某些實施例中，用於將外源核苷酸序列靶向整合至宿主細胞中之多核苷酸包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。在某些實施例中，用於將外源核苷酸序列靶向整合至宿主細胞中之多核苷酸包含側接DNA盒之與選自由以下組成之群之內源基因至少50%同源之核苷酸序列：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2，其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。在某些實施例中，側接核苷酸序列與選自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及XP_003512331.2組成之群之內源基因或與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%同源。
在某些實施例中，同源重組係在無任何輔助因子之情形下實施。在某些實施例中，同源重組由存在能夠整合之載體來促進。在某些實施例中，整合載體係選自由以下組成之群：腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體及整合噬菌體載體。
5.3 受調控之靶向整合
在許多情形中蛋白質表現水準不佳，此主要係由於所編碼之蛋白質難以表現。難以表現蛋白質之低表現水準可具有多種且難以鑑別之原因。一種可能性係所表現之蛋白質在宿主細胞中之毒性。在此等情形中，受調控之表現系統可用於表現毒性蛋白質，其中編碼該等蛋白質之所關注序列在誘導型啟動子之控制下。在該等系統中，僅在將調節劑(例如小分子，諸如(但不限於)四環素或其類似物去氧羥四環素(DOX))添加至培養物中時才能促進難以表現蛋白質之表現。調控毒性蛋白質之表現可緩和毒性效應，從而容許培養物在生產之前達成期望之細胞生長。在某些實施例中，受調控之靶向整合(RTI)系統包含整合至特定基因座中之SOI (例如，包含一或多個RRS之外源核酸序列)，且在與其可操作地連接之受調控之啟動子下轉錄。在某些實施例中，RTI系統可用於確定難以表現之分子(諸如(但不限於)抗體)的低蛋白質表現之潛在原因。在某些實施例中，選擇性地關閉RTI系統中SOI之表現之能力可用於將SOI之表現與所觀察到的不良效應相關聯。
在某些實施例中，為在難以表現之分子的根本原因分析期間使轉錄及細胞株可變性效應最小化，可使用受調控之靶向整合(RTI)系統。舉例而言但不加以限制，SOI在TI宿主中之表現可藉由向培養物中添加調節劑(例如，去氧羥四環素)來觸發。在某些實施例中，RTI載體利用四環素調控啟動子來表現SOI，其可整合至(例如)包含RRS之外源核酸序列中，該外源核酸序列自身整合至宿主細胞基因體之整合位點處，從而容許SOI之受調控表現。
在某些實施例中，與對照細胞株相比，本揭示案中所述之RTI系統可用於成功地確定SOI (例如，治療性抗體)之低蛋白質表現之一或多種潛在原因。在某些實施例中，一旦確認RTI細胞株中SOI (例如，治療性抗體)之較低相對表現，則可藉由利用蛋白質轉譯抑制劑處理(例如，Dox及環己醯亞胺)來評估SOI之細胞內累積及分泌水準。
5.4 受調控系統
本發明所揭示之標的物亦係關於用於TI中之受調控系統。舉例而言但不加以限制，此調控可基於用於阻斷或活化mRNA合成之基因開關，阻斷或活化mRNA合成可藉由使轉錄抑制子或活化子調控偶合至組成型或最小啟動子來實施。在某些非限制性實施例中，抑制可藉由結合抑制蛋白(例如，蛋白質在空間上阻斷轉錄起始之情形)或藉由經由轉錄沈默子主動抑制轉錄來達成。在某些非限制性實施例中，可藉由調控偶合至活化結構域來達成無哺乳動物或病毒增強子之最小啟動子之活化。
在某些實施例中，轉錄抑制子或活化子之條件化偶合可藉由使用因應外部刺激結合啟動子之別位蛋白質來達成。在某些實施例中，轉錄抑制子或活化子之條件化偶合可藉由使用自隔離蛋白質釋放且因此可結合靶標啟動子之細胞內受體來達成。在某些實施例中，轉錄抑制子或活化子之條件化偶合可藉由使用化學誘導之二聚化物來達成。
在某些實施例中，本揭示案之TI系統中所用之別位蛋白質可係因應抗生素、細菌群體感測信使、分解代謝物或培養參數(諸如溫度，例如冷或熱)調節轉錄活性之蛋白質。在某些實施例中，此等RTI系統可係基於分解代謝物的，例如，其中控制替代碳源之分解代謝基因之細菌抑制因子已轉移至哺乳動物細胞。在某些實施例中，靶啟動子之抑制可藉由抑制因子CymR之cumate反應性結合來達成。在某些實施例中，基於分解代謝物之系統可依賴於藉由融合至單純疱疹(Herpes simplex) VP16反式活化結構域之原核抑制因子HdnoR之6-羥基尼古丁反應性結合來活化嵌合啟動子。
在某些實施例中，TI系統可係基於群體感測之表現系統，其源自藉由群體感測分子管控群體內及群體間通訊之原核生物。該等群體感測分子結合至靶細胞中之受體，調節該等受體對同源啟動子之親和力，從而起始特定調節子開關。在某些實施例中，群體感測分子可係N-(3-側氧基-辛醯基)-高絲胺酸內酯，在其存在下，TraR-p65融合蛋白活化融合至TraR特異性操縱子序列之最小啟動子之表現。在某些實施例中，群體感測分子在基於天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor ) A3(2) ScbR抑制因子(其在SCB1不存在下結合其同源操縱子OScbR)之系統中可係丁內酯SCB1 (外消旋2-(1’-羥基-6-甲基庚基)-3-(羥基甲基)-丁內酯)。在某些實施例中，群體感測分子可係RTI系統中所用之高絲胺酸源誘導物，其中綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )群體感測抑制子RhlR及LasR融合至SV40 T抗原核定位序列，且單純疱疹VP16結構域可使含有特定操縱子序列(las盒)之啟動子活化。
在某些實施例中，調節本揭示案之RTI系統中所用之別位蛋白質之誘導分子可係(但不限於) cumate、異丙基-β-D-半乳糖吡喃醣苷(IPTG)、巨環內酯、6-羥基尼古丁、去氧羥四環素、鏈黴殺陽素、NADH、四環素。
在某些實施例中，本揭示案之RTI系統中所用之細胞內受體可係細胞質或核受體。在某些實施例中，本揭示案之RTI系統可藉由使用小分子來利用轉錄因子自隔離及抑制蛋白質之釋放。在某些實施例中，本揭示案之RTI系統可依賴於類固醇調控，其中激素受體融合至天然或人工轉錄因子，該轉錄因子可自胞質液中之HSP90釋放，遷移至細胞核中且使所選擇之啟動子活化。在某些實施例中，可使用受合成類固醇類似物調控之突變受體以避免內源性類固醇激素之串擾。在某些實施例中，受體可係因應於4-羥基他莫昔芬或可由RU486誘導之助孕酮-受體突變體之雌激素受體變異體。在某些實施例中，基於人類核過氧化體增殖物活化受體γ(PPARγ)之核受體源羅格列酮(rosiglitazone)反應性轉錄開關可用於本揭示案之RTI系統中。在某些實施例中，類固醇反應性受體之變異體可係RheoSwitch，其係基於經修飾之雲杉捲葉蛾(Choristoneura fumiferana )蛻皮激素受體及融合至Gal4 DNA結合結構域及VP16反式活化因子之小鼠類視色素X受體(RXR)。在合成蛻皮激素存在下，RheoSwitch變異體可結合且活化融合至Gal4反應元件之若干重複序列之最小啟動子。
在某些實施例中，本文所揭示之RTI系統可利用DNA結合蛋白及轉錄活化因子之化學誘導二聚化來活化與同源操縱子融合之最小核心啟動子。在某些實施例中，本文所揭示之RTI系統可利用FKBP與FRB之雷帕黴素調控之二聚化。在此系統中，FRB融合至p65反式活化因子且FKBP融合至鋅指結構域，該鋅指結構域對於位於經改造之最小介白素-12啟動子上游之同源操縱子位點具有特異性。在某些實施例中，FKBP可係突變的。在某些實施例中，本文所揭示之RTI系統可利用細菌迴旋酶B次單元(GyrB)，其中GyrB在抗生素香豆黴素(coumermycin)存在下二聚化且與新生黴素(novobiocin)解離。
在某些實施例中，本揭示案之RTI系統可用於受調控之siRNA表現。在某些實施例中，受調控之siRNA表現系統可係四環素、巨環內酯或關閉及開啟型QuoRex系統。在某些實施例中，RTI系統可利用爪蟾(Xenopus)末端寡嘧啶元件(TOP)，其藉由在5’非轉譯區中形成髮夾結構來阻斷轉譯起始。
在某些實施例中，本揭示案中所闡述之RTI系統可利用氣相控制表現，例如乙醛誘導之調控(AIR)系統。AIR系統可採用小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans ) AlcR轉錄因子，其在無毒濃度之氣態或液體乙醛存在下特異性地活化PAIR啟動子，該PAIR啟動子係自融合至最小人類巨細胞病毒啟動子之AlcR特異性操縱子組裝。
在某些實施例中，本揭示案之RTI系統可利用Tet開啟或Tet關閉系統。在此等系統中，一或多個SOI之表現可受四環素或其類似物去氧羥四環素調控。
在某些實施例中，本揭示案之RTI系統可利用PIP開啟或PIP關閉系統。在此等系統中，SOI之表現可受(例如)普那黴素(pristinamycin)、四環素及/或紅黴素調控。
6. TI 宿主細胞之製備及使用
本發明所揭示之標的物係關於將外源核苷酸序列靶向整合至宿主細胞中之方法。在某些實施例中，該等方法係關於將外源核苷酸序列整合至宿主細胞中以產生適於後續靶向整合SOI之宿主細胞。在某些實施例中，該等方法包括重組酶介導之重組。在某些實施例中，該等方法涉及同源重組、HDR及/或NHEJ。
6.1 使用重組酶介導之重組之 TI 宿主細胞之製備
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與SEQ ID No. 1-7至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含兩個RRS，該兩個RRS側接至少一個第一選擇標記物；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及其至少約90%同源之序列，其中該外源核苷酸序列包含兩個RRS，該兩個RRS側接至少一個第一選擇標記物；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與SEQ ID No. 1-7至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含含有兩個異種特異性RRS之第一DNA盒，該兩個異種特異性RRS側接至少一個第一選擇標記物；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含含有兩個異種特異性RRS之第二DNA盒之載體，該兩個異種特異性RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該等RRS且進行一次RMCE；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及其至少約90%同源之序列，其中該外源核苷酸序列包含含有兩個異種特異性RRS之第一DNA盒，該兩個異種特異性RRS側接至少一個第一選擇標記物；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含含有兩個異種特異性RRS之第二DNA盒之載體，該兩個異種特異性RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該等RRS且進行一次RMCE；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現第一及第二所關注多肽(其中該第一及第二多肽可相同或不同)之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與SEQ ID No. 1-7至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI；d) 引入一或多種重組酶，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及e) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。在某些實施例中，與其使全部選擇標記物在第一載體上，不如：第一載體包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接第一SOI且下游側接RRS；且第二載體包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接第二SOI。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現第一及第二所關注多肽(其中該第一及第二多肽可相同或不同)之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及其至少約90%同源之序列，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI；d) 引入一或多種重組酶，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及e) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。在某些實施例中，與其使全部選擇標記物在第一載體上，不如：第一載體包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接第一SOI且下游側接RRS；且第二載體包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接第二SOI。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現第一及第二所關注多肽(其中該第一及第二多肽可相同或不同)之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與SEQ ID No. 1-7至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含第一DNA盒，該第一DNA盒包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有三個RRS均係異種特異性的；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含第二DNA盒之第一載體，其中該第二DNA盒包含兩個異種特異性RRS，該兩個異種特異性RRS與該第一DNA盒之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含第三DNA盒之第二載體，其中該第三DNA盒包含兩個異種特異性RRS，該兩個異種特異性RRS與該第一DNA盒之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI；d) 引入一或多種重組酶，其中該一或多種重組酶識別該等RRS且進行兩次RMCE；及e) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。在某些實施例中，與其使全部選擇標記物在第一載體上，不如：第一載體包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接第一SOI且下游側接RRS；且第二載體包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接第二SOI。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現第一及第二所關注多肽(其中該第一及第二多肽可相同或不同)之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列，其中該外源核苷酸序列包含第一DNA盒，該第一DNA盒包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有三個RRS均係異種特異性的；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含第二DNA盒之第一載體，其中該第二DNA盒包含兩個異種特異性RRS，該兩個異種特異性RRS與該第一DNA盒之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含第三DNA盒之第二載體，其中該第三DNA盒包含兩個異種特異性RRS，該兩個異種特異性RRS與該第一DNA盒之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI；d) 引入一或多種重組酶，其中該一或多種重組酶識別該等RRS且進行兩次RMCE；及e) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。在某些實施例中，與其使全部選擇標記物在第一載體上，不如：第一載體包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接第一SOI且下游側接RRS；且第二載體包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接第二SOI。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含一個毗鄰至少一個第一選擇標記物之RRS；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含一個RRS之載體，該一個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之RRS匹配且毗鄰至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列，其中該外源核苷酸序列包含一個毗鄰至少一個第一選擇標記物之RRS；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含一個RRS之載體，該一個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之RRS匹配且毗鄰至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。
本發明所揭示之標的物亦係關於產生所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供本文所闡述之TI宿主細胞；b) 在適於表現SOI之條件下培養a)中之該TI宿主細胞且自其回收所關注多肽。
在某些實施例中，本揭示案提供製備適於後續靶向整合之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個外源SOI及至少一個第一選擇標記物之兩個RRS；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離適於後續靶向整合之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備適於後續靶向整合之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個外源SOI及至少一個第一選擇標記物之兩個RRS；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離適於後續靶向整合之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備適於後續靶向整合之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個外源SOI及至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含三個RRS之載體，其中該載體之第一RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之第一RRS匹配，該載體之第二RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之第二RRS匹配且至少一個第二選擇標記物位於該第一與該第二RRS之間；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該載體及該經整合之外源核苷酸序列二者上之第一及第二RRS；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI宿主細胞以藉此分離適於子序列靶向整合之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備適於後續靶向整合之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個外源SOI及至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含三個RRS之載體，其中該載體之第一RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之第一RRS匹配，該載體之第二RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之第二RRS匹配且至少一個第二選擇標記物位於該第一與該第二RRS之間；c) 引入重組酶，其中該重組酶識別該載體及該經整合之外源核苷酸序列二者上之第一及第二RRS；及d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI宿主細胞以藉此分離適於後續靶向整合之TI宿主細胞。
6.2 使用同源重組、 HDR 或 NHEJ 靶向修飾宿主細胞之方法
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供TI宿主細胞，該TI宿主細胞包含該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座與SEQ ID No. 1-7至少約90%同源；b) 向該TI宿主細胞中引入載體，其中該載體包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI；c) 針對選擇標記物進行選擇以分離SOI整合於基因體之基因座中之TI宿主細胞，且表現所關注多肽。在某些實施例中，載體之DNA盒進一步包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。
在某些實施例中，本揭示案提供製備TI宿主細胞以表現所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供TI宿主細胞，該TI宿主細胞包含該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；b) 向該宿主細胞中引入多核苷酸，其中該多核苷酸包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI；c) 針對選擇標記物進行選擇以分離SOI整合於基因體之基因座中之TI宿主細胞，且表現所關注多肽。在某些實施例中，載體之DNA盒進一步包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。
在某些實施例中，同源重組由整合載體來促進。在某些實施例中，載體係選自由以下組成之群：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。在某些實施例中，轉位子可係PiggyBac (PB)轉位子系統。
在某些實施例中，藉由外源核酸酶來促進整合。在某些實施例中，該外源核酸酶係選自由以下組成之群：鋅指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚體、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)、TAL效應物結構域融合蛋白、RNA引導之DNA核酸內切酶、經改造之大範圍核酸酶及成簇規律間隔之短迴文重複序列(CRISPR)關聯蛋白(Cas)核酸內切酶。
在某些實施例中，本揭示案提供製備適於後續靶向整合之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供TI宿主細胞，該TI宿主細胞包含該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；b) 向該TI宿主細胞中引入載體，其中該載體包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含側接有兩個RRS之至少一個選擇標記物；c) 針對選擇標記物進行選擇以分離適於後續靶向整合之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備適於後續靶向整合之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供TI宿主細胞，該TI宿主細胞包含該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；b) 向該TI宿主細胞中引入多核苷酸，其中該多核苷酸包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含側接有兩個RRS之至少一個選擇標記物；c) 針對選擇標記物進行選擇以分離適於後續靶向整合之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備適於後續靶向整合之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供TI宿主細胞，該TI宿主細胞包含該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；b) 向該宿主細胞中引入載體，其中該載體包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含三個RRS，其中第三RRS及至少一個選擇標記物位於第一與第二RRS之間；及c) 針對選擇標記物進行選擇以分離適於後續靶向整合之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備適於後續靶向整合之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供TI宿主細胞，該TI宿主細胞包含該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；b) 向該宿主細胞中引入多核苷酸，其中該多核苷酸包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含三個RRS，其中第三RRS及至少一個選擇標記物位於第一與第二RRS之間；及c) 針對選擇標記物進行選擇以分離適於後續靶向整合之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備表現至少一種所關注多肽之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中該一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該至少一個外源核苷酸序列包含兩個RRS，該兩個RRS側接至少一個第一選擇標記物；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 引入重組酶或編碼重組酶之核酸，其中該重組酶識別該等RRS；及選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現至少一種所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供製備表現至少一種第一及第二所關注多肽(其中該第一及第二多肽可相同或不同)之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該至少一個經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物；c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該至少一個經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI；d) 引入一或多種重組酶，或編碼一或多種重組酶之一或多種核酸，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及e) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現至少一種第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。在某些實施例中，與其使全部選擇標記物在第一載體上，不如：第一載體包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接第一SOI且下游側接RRS；且第二載體包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接第二SOI。
在某些實施例中，本揭示案提供製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中該一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含一或多個RRS；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含一或多個RRS之載體，該一或多個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之一或多個RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之外源SOI；c) 引入重組酶或編碼重組酶之核酸，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 在誘導物存在下選擇表現外源SOI之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。
在某些實施例中，本揭示案提供表現所關注多肽之方法，該等方法包括：a) 提供宿主細胞，其包含整合在該宿主細胞基因體之基因座內之至少一個外源SOI，該至少一個外源SOI側接有兩個RRS及一個可調控啟動子，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；及b) 在適於表現該SOI之條件下培養該細胞且自其回收所關注多肽。
在某些實施例中，本揭示案提供製備表現第一及第二所關注多肽(其中該第一及第二多肽可相同或不同)之TI宿主細胞之方法，該等方法包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含第一、第二RRS及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之第一外源SOI；c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之第二SOI；d) 引入一或多種重組酶，或編碼一或多種重組酶之一或多種核酸，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及e) 在誘導物存在下選擇表現該至少第一及第二外源SOI之TI細胞以藉此分離表現所關注多肽之TI宿主細胞。在某些實施例中，與其使全部選擇標記物在第一載體上，不如：第一載體包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接第一SOI且下游側接RRS；且第二載體包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接第二SOI。
7. 產物
本揭示案之宿主細胞可用於表現任一所關注分子，例如所關注多肽。在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可用於表現多肽，例如哺乳動物多肽。此等多肽之非限制性實例包括激素、受體、融合蛋白、調控因子、生長因子、補體系統因子、酶、凝血因子、抗凝血因子、激酶、細胞介素、CD蛋白、介白素、治療性蛋白質、診斷性蛋白質及抗體。在一些實施例中，抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗體係治療性抗體。在一些實施例中，抗體係診斷性抗體。在一些實施例中，抗體係人類抗體。在一些實施例中，抗體係人類化抗體。
在某些實施例中，涵蓋於本文定義內之多肽之實例包括哺乳動物多肽，諸如腎素；生長激素，包括人類生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；副甲狀腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；激濾泡素；降鈣素；黃體促素；升糖素；瘦素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子及馮威里氏因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，諸如蛋白質C；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖維蛋白溶酶原活化因子，諸如尿激酶或人類尿或組織型纖維蛋白溶酶原活化因子(t-PA)；鈴蟾素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；腫瘤壞死因子受體，諸如死亡受體5及CD120；TNF有關之細胞凋亡誘導配位體(TRAIL)；B細胞成熟抗原(BCMA)；B淋巴球刺激因子(BLyS)；增殖誘導配位體(APRIL)；腦啡肽酶；RANTES (調控活化正常T細胞表現及分泌因子)；人類巨噬細胞發炎蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白；苗勒氏抑制物(Muellerian-inhibiting substance)；鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺激素所關注肽；微生物蛋白，諸如β-內醯胺酶；DNase；IgE；細胞毒性T淋巴球所關注抗原(CTLA)，諸如CTLA-4；抑制素；活化素；血小板源內皮細胞生長因子(PD-ECGF)；血管內皮生長因子家族蛋白(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及P1GF)；血小板源生長因子(PDGF)家族蛋白(例如，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其二聚體)；纖維母細胞生長因子(FGF)家族，諸如aFGF、bFGF、FGF4及FGF9；表皮生長因子(EGF)；激素或生長因子之受體，諸如VEGF受體(例如，VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3)、表皮生長因子(EGF)受體(例如，ErbB1、ErbB2、ErbB3及ErbB4受體)、血小板源生長因子(PDGF)受體(例如，PDGFR-α及PDGFR-β)及纖維母細胞生長因子受體；TIE配位體(血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受體，諸如TIE1及TIE2；蛋白質A或D；類風濕因子；神經營養因子，諸如骨源性神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-5或神經營養蛋白-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經生長因子，諸如NGF-b；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II (IGF-I及IGF-II)；des (1-3)-IGF-I (腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、CD19及CD20；促紅血球生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態生成蛋白(BMP)；趨化介素，諸如CXCL12及CXCR4；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；細胞介素，諸如介白素(IL)，例如IL-1至IL-10；中期因子；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒性抗原，諸如AIDS被膜之一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調控蛋白；整聯蛋白，諸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及VCAM；艾普林(ephrin)；Bv8；δ樣配位體4 (DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；濾泡抑素；肝細胞生長因子(HGF)/擴散因子(SF)；Alk1；Robo4；ESM1；串珠素(Perlecan)；EGF樣結構域多重7 (EGFL7)；CTGF及其家族之成員；凝血酶敏感蛋白，諸如凝血酶敏感蛋白1及凝血酶敏感蛋白2；膠原，諸如膠原IV及膠原XVIII；神經纖毛蛋白(neuropilin)，諸如NRP1及NRP2；多效生長因子(Pleiotrophin，PTN)；顆粒蛋白前體；增殖蛋白；Notch蛋白，諸如Notch1及Notch4；信號素(semaphorin)，諸如Sema3A、Sema3C及Sema3F；腫瘤所關注抗原，諸如CA125 (卵巢癌抗原)；免疫黏附素；及結合至一或多種蛋白質(包括(例如)以上所列示蛋白質中之任一者)之以上所列示多肽以及抗體(包括抗體片段)中之任一者之片段及/或變異體。
在某些實施例中，所關注多肽係雙特異性、三特異性或多特異性多肽，例如雙特異性抗體。多特異性抗體之各種分子形式為此項技術中所已知且包括在本文中(例如，參見Spiess等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。特定類型之多特異性抗體(亦包括在本文中)係雙特異性抗體，其經設計以同時結合至靶細胞(例如，腫瘤細胞)上之表面抗原以及T細胞受體(TCR)複合物之活化、不變組分(諸如CD3)，以用於重新靶向T細胞以殺死靶細胞。雙特異性抗體形式之其他實例包括(但不限於)所謂的「BiTE」(雙特異性T細胞銜接器)分子，其中兩個scFv分子由撓性連接體融合(例如，參見WO 2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261及WO 2008/119567、Nagorsen及Bäuerle，Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011))；雙功能抗體(Holliger等人，Prot Eng 9, 299-305 (1996))及其衍生物，諸如串聯雙功能抗體(「TandAb」；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293, 41-56 (1999))；「DART」(雙重親和力重新靶向)分子，其基於雙功能抗體形式但特徵在於C末端二硫橋以用於額外穩定(Johnson等人，J Mol Biol 399, 436-449 (2010))，及所謂的三功能抗體(triomab)，其係全雜合小鼠/大鼠IgG分子(綜述於Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)中)。本文所包括之特定T細胞雙特異性抗體形式闡述於WO 2013/026833、WO 2013/026839、WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498中。
在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可用於在組成型地或受調控地表現所關注治療性蛋白質或分子的同時表現伴護蛋白、蛋白質修飾酶、shRNA、gRNA或其他蛋白質或肽。
在一些實施例中，由本揭示案之宿主細胞表現之多肽可結合至任一蛋白質或與任一蛋白質相互作用，該任一蛋白質包括(但不限於)選自由以下組成之群之細胞介素、細胞介素相關蛋白及細胞介素受體：8MPI、8MP2、8MP38 (GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI (M-CSF)、CSF2 (GM-CSF)、CSF3 (G-CSF)、EPO、FGF1 (αFGF)、FGF2 (βFGF)、FGF3 (int-2)、FGF4 (HST)、FGF5、FGF6 (HST-2)、FGF7 (KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1 (ε)、FEL1 (ζ)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL1 0、IL 11、IL 12A、IL 12B、IL 13、IL 14、IL 15、IL 16、IL 17、IL 17B、IL 18、IL 19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA (TNF-β)、LTB、TNF (TNF-α)、TNFSF4 (OX40配位體)、TNFSF5 (CD40配位體)、TNFSF6 (FasL)、TNFSF7 (CD27配位體)、TNFSF8 (CD30配位體)、TNFSF9 (4-1 BB配位體)、TNFSF10 (TRAIL)、TNFSF11 (TRANCE)、TNFSF12 (APO3L)、TNFSF13 (April)、TNFSF13B、TNFSF14 (HVEM-L)、TNFSF15 (VEGI)、TNFSF18、HGF (VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP (瘦素)、PTN及THPO.k。
在一些實施例中，由本揭示案之宿主細胞表現之多肽可結合至選自由以下組成之群之趨化介素、趨化介素受體或趨化介素相關蛋白，或與其相互作用：CCLI (1-309)、CCL2 (MCP -1/MCAF)、CCL3 (MIP-Iα)、CCL4 (MIP-Iβ)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP-3)、CCL8 (mcp-2)、CCL11 (伊紅趨素(eotaxin))、CCL 13 (MCP-4)、CCL 15 (MIP-Iδ)、CCL 16 (HCC-4)、CCL 17 (TARC)、CCL 18 (PARC)、CCL 19 (MDP-3b)、CCL20 (MIP-3α)、CCL21 (SLC/艾克杜斯-2 (exodus-2))、CCL22 (MDC/STC-1)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2 /伊紅趨素-2)、CCL25 (TECK)、CCL26 (伊紅趨素-3)、CCL27 (CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI (GROI)、CXCL2 (GR02)、CXCL3 (GR03)、CXCL5 (ENA-78)、CXCL6 (GCP-2)、CXCL9 (MIG)、CXCL 10 (IP 10)、CXCL 11 (1-TAC)、CXCL 12 (SDFI)、CXCL 13、CXCL 14、CXCL 16、PF4 (CXCL4)、PPBP (CXCL7)、CX3CL 1 (SCYDI)、SCYEI、XCLI (淋巴細胞趨化蛋白(lymphotactin))、XCL2 (SCM-Iβ)、BLRI (MDR15)、CCBP2 (D6/JAB61 )、CCRI (CKRI/HM145)、CCR2 (mcp-IRB IRA)、CCR3 (CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5 (CMKBR5/ChemR13)、CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7 (CKR7/EBII)、CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR- L1)、CCR9 (GPR-9-6)、CCRL1 (VSHK1)、CCRL2 (L-CCR)、XCR1 (GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1 (RDC1)、CX3CR1 (V28)、CXCR4、GPR2 (CCR10)、GPR31、GPR81 (FKSG80)、CXCR3 (GPR9/CKR-L2)、CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA (IL8Rα)、IL8RB (IL8Rβ)、LTB4R (GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10 (C10)、EPO、FY (DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2及VHL。在一些實施例中，由本揭示案之宿主細胞表現之多肽可結合至以下各項或與以下各項相互作用：0772P (CA125，MUC16) (亦即，卵巢癌抗原)，ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚醣(Aggrecan)；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；類澱粉β；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；ASLG659；ASPHD1 (含有天冬胺酸β-羥基酶結構域之蛋白1；LOC253982)；AZGP1 (鋅-a-醣蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF-R (B細胞活化因子受體，BLyS受體3，BR3；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI (MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B (GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B (IB型骨形成蛋白受體)；BMPR2；BPAG1 (網蛋白)；BRCA1；短蛋白聚醣(Brevican)；C19orf10 (IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2 (D6/JAB61)；CCL1 (1-309)；CCL11 (伊紅趨素)；CCL13 (MCP-4)；CCL15 (MIP1δ)；CCL16 (HCC-4)；CCL17 (TARC)；CCL18 (PARC)；CCL19 (MIP-3β)；CCL2 (MCP-1)；MCAF；CCL20 (MIP-3α)；CCL21 (MTP-2)；SLC；艾克杜斯-2；CCL22 (MDC/STC-1)；CCL23 (MPIF-1)；CCL24 (MPIF-2/伊紅趨素-2)；CCL25 (TECK)；CCL26 (伊紅趨素-3)；CCL27 (CTACK/ILC)；CCL28；CCL3 (MTP-Iα)；CCL4 (MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7 (MCP-3)；CCL8 (mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1 (CKRI/HM145)；CCR2 (mcp-IRβ/RA)；CCR3 (CKR/CMKBR3)；CCR4；CCR5 (CMKBR5/ChemR13)；CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7 (CKBR7/EBI1)；CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9 (GPR-9-6)；CCRL1 (VSHK1)；CCRL2 (L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22 (B細胞受體CD22-B同種型)；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A (CD79α，免疫球蛋白相關α，一種B細胞特異性蛋白)；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1 (E-鈣黏蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A (p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B (p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A (P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；幾丁質酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7 (密連蛋白-7)；CLL-1 (CLEC12A，MICL及DCAL2)；CLN3；CLU (聚集素)；CMKLR1；CMKOR1 (RDC1)；CNR1；COL 18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；補體因子D；CR2；CRP；CRIPTO (CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸形癌源生長因子)；CSFI (M-CSF)；CSF2 (GM-CSF)；CSF3 (GCSF)；CTLA4；CTNNB1 (b-連環蛋白)；CTSB (細胞自溶酶B)；CX3CL1 (SCYDI)；CX3CR1 (V28)；CXCL1 (GRO1)；CXCL10 (IP-10)；CXCL11 (I-TAC/IP-9)；CXCL12 (SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2 (GRO2)；CXCL3 (GRO3)；CXCL5 (ENA-78/LIX)；CXCL6 (GCP-2)；CXCL9 (MIG)；CXCR3 (GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR5 (柏基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)受體1，一種G蛋白偶合受體)；CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E16 (LAT1，SLC7A5)；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EphB2R；EPO；ERBB2 (Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；ETBR (內皮素B型受體)；F3 (TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FcRH1 (Fc受體樣蛋白1)；FcRH2 (IFGP4，IRTA4，SPAP1A (含SH2結構域之磷酸酶錨定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)；FGF；FGF1 (αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2 (bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3 (int-2)；FGF4 (HST)；FGF5；FGF6 (HST-2)；FGF7 (KGF)；FGF8；FGF9；FGFR；FGFR3；FIGF (VEGFD)；FELl (Ε)；FILl (ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI (纖連蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1 (FRA-1)；FY (DARC)；GABRP (GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GDNF-Ra1 (GDNF家族受體α 1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-Α-1)；GEDA；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2 (CCR10)；GPR19 (G蛋白偶合受體19；Mm.4787)；GPR31；GPR44；GPR54 (KISS1受體；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；GPR81 (FKSG80)；GPR172A (G蛋白偶合受體172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GRCCIO (C10)；GRP；GSN (凝膠溶素(Gelsolin))；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；組織胺及組織胺受體；HLA-A；HLA-DOB (MHC II類分子之β次單元(Ia抗原)；HLA-DRA；HM74；HMOXI ；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2，ILIRN；IL2；IL20；IL20Rα；IL21 R；IL22；IL-22c；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST (醣蛋白130)；流行性感冒A；流行性感冒B；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRTA2 (易位相關免疫球蛋白超家族受體2)；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6 (a6整聯蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4 (b4整聯蛋白)；α4β7及αEβ7整聯蛋白異二聚體；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5 (GC Box BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19 (角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6 (毛髮特異性H型角蛋白)；LAMAS；LEP (瘦素)；LGR5 (含有富含白胺酸之重複序列之G蛋白偶合受體5；GPR49，GPR67)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA (TNF-b)；LTB；LTB4R (GPR16)；LTB4R2；LTBR；LY64 (淋巴球抗原64 (RP105)，一種富含白胺酸重複序列(LRR)家族之I型膜蛋白)；Ly6E (淋巴球抗原6複合物，基因座E；Ly67，RIG-E，SCA-2，TSA-1)；Ly6G6D (淋巴球抗原6複合物，基因座G6D；Ly6-D，MEGT1)；LY6K (淋巴球抗原6複合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；MACMARCKS；MAG或OMgp；MAP2K7 (c-Jun)；MDK；MDP；MIB1；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MPF (MPF，MSLN，SMR，巨核細胞強化因子，間皮素)；MS4A1；MSG783 (RNF124，假定蛋白FLJ20315)；MSMB；MT3 (金屬硫蛋白-111)；MTSS1；MUC1 (黏蛋白)；MYC；MY088；Napi3b (亦稱為NaPi2b) (NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶質載劑家族34 (磷酸鈉)，成員2，II型鈉依賴性磷酸酯運輸蛋白3b)；NCA；NCK2；神經蛋白聚醣(neurocan)；NFKB1；NFKB2；NGFB (NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR- Nogo66 (Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1 (NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；OX40；P2RX7；P2X5 (嘌呤能受體P2X配位體門控離子通道5)；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-L1；PD-L2；PD-1；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4 (CXCL4)；PGF；PGR；磷酸蛋白聚醣(phosphacan)；PIAS2；PIK3CG；PLAU (uPA)；PLG；PLXDC1；PMEL17 (銀同源物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；PPBP (CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA hlg (2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA 2700050C12，RIKEN cDNA 2700050C12基因)；PTAFR；PTEN；PTGS2 (COX-2)；PTN；RAC2 (p21 Rac2)；RARB；RET (ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110 (ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2 (親脂素B)；SCGB2A1 (乳腺珠蛋白2)；SCGB2A2 (乳腺珠蛋白1)；SCYEI (內皮單核球活化細胞介素)；SDF2；Sema 5b (FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，信號素5b Hlog，sema結構域，七個凝血酶敏感蛋白重複序列(1型及1型樣)，跨膜結構域(TM)及短細胞質結構域，(信號素) 5B)；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5 (乳腺絲抑蛋白(maspin))；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B (Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP (前列腺之六次跨膜上皮抗原)；STEAP2 (HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，前列腺癌相關基因1，前列腺癌相關蛋白1，前列腺之六次跨膜上皮抗原2，六次跨膜前列腺蛋白)；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TENB2 (推定跨膜蛋白多醣)；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI (凝血酶敏感蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE (Tie-1)；TMP3；組織因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TMEFF1 (具有EGF樣及兩個濾泡抑素樣結構域之跨膜蛋白1；腫瘤調節蛋白-1 (Tomoregulin-1))；TMEM46 (shisa同源物2)；TNF；TNF-a；TNFAEP2 (B94)；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6 (Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10 (TRAIL)；TNFSF11 (TRANCE)；TNFSF12 (AP03L)；TNFSF13 (April)；TNFSF13B；TNFSF14 (HVEM-L)；TNFSF15 (VEGI)；TNFSF18；TNFSF4 (OX40配位體)；TNFSF5 (CD40配位體)；TNFSF6 (FasL)；TNFSF7 (CD27配位體)；TNFSFS (CD30配位體)；TNFSF9 (4-1 BB配位體)；TOLLIP；類鐸受體；TOP2A (拓樸異構酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TMEM118 (環指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TrpM4 (BR22450；FLJ20041；TRPM4；TRPM4B；瞬時受體電位陽離子通道，亞家族M，成員4)；TRPC6；TSLP；TWEAK；酪胺酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪胺酸酶；SHEP3)；VEGF；VEGFB；VEGFC；多功能蛋白聚醣(versican)；VHL C5；VLA-4；XCL1 (淋巴細胞趨化蛋白)；XCL2 (SCM-1b)；XCRI(GPR5/CCXCRI)；YY1；及/或ZFPM2。
在某些實施例中，根據本文所揭示之方法產生之抗體(或雙特異性抗體)之靶分子包括CD蛋白，諸如CD3、CD4、CDS、CD16、CD19、CD20、CD21 (CR2 (補體受體2)或C3DR (C3d/艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr病毒)受體)或Hs.73792)；CD33；CD34；CD64；CD72 (B細胞分化抗原CD72，Lyb-2)；CD79b (CD79B，CD79β，IGb (免疫球蛋白相關β)，B29)；ErbB受體家族之CD200成員，諸如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細胞黏著分子，諸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/beta7整聯蛋白及包括其α或β次單元之αv/β3整聯蛋白(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；生長因子，諸如VEGF-A、VEGF-C；組織因子(TF)；α干擾素(αIFN)；TNFα、介白素，諸如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL 17 AF、IL-1S、IL-13R α1、IL13R α2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F蛋白、蛋白質C等。在某些實施例中，本文所提供之方法可用於產生特異性結合至補體蛋白C5之抗體(或多特異性抗體，諸如雙特異性抗體) (例如，特異性結合至人類C5之抗C5促效劑抗體)。
在某些實施例中，本文所提供之方法可用於產生特異性結合至B型流行性感冒病毒血球凝集素之抗體(或多特異性抗體，諸如雙特異性抗體)，亦即「fluB」(例如，在活體外及/或活體內結合來自流行性感冒B病毒之Yamagata譜系之血球凝集素、結合來自流行性感冒B病毒之Victoria譜系之血球凝集素、結合來自流行性感冒B病毒之祖先譜系之血球凝集素或結合來自流行性感冒B病毒之Yamagata譜系、Victoria譜系及祖先譜系之血球凝集素之抗體)。關於抗FluB抗體之其他細節闡述於WO 2015/148806中，其係以全文引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，根據本文所提供之方法產生之抗體(或雙特異性抗體)結合低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)-1或LRP-8或運鐵蛋白受體以及至少一種選自由以下組成之群之靶標：β-分泌酶(BACE1或BACE2)、α-分泌酶、γ-分泌酶、τ-分泌酶、類澱粉前體蛋白(APP)、死亡受體6 (DR6)、類澱粉β肽、α-突觸核蛋白、帕金蛋白(Parkin)、亨庭頓蛋白(Huntingtin)、p75 NTR、CD40及半胱天冬酶-6。
在某些實施例中，根據本文所提供之方法產生之抗體係針對CD40之人類IgG2抗體。在某些實施例中，該抗CD40抗體係RG7876。
在某些實施例中，根據本文所提供之方法產生之多肽係靶向免疫細胞介素。在某些實施例中，該靶向免疫細胞介素係CEA-IL2v免疫細胞介素。在某些實施例中，該CEA-IL2v免疫細胞介素係RG7813。在某些實施例中，該靶向免疫細胞介素係FAP-IL2v免疫細胞介素。在某些實施例中，該FAP-IL2v免疫細胞介素係RG7461。
在某些實施例中，根據本文所提供之方法產生之多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)結合CEA及至少一種其他靶分子。在某些實施例中，根據本文所提供之方法產生之多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)結合腫瘤靶向細胞介素及至少一種其他靶分子。在某些實施例中，根據本文所提供之方法產生之多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)融合至IL2v (亦即，介白素2變異體)且結合基於IL1之免疫細胞介素及至少一種其他靶分子。在某些實施例中，根據本文所提供之方法產生之多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)係T細胞雙特異性抗體(亦即，雙特異性T細胞銜接器或BiTE)。
在某些實施例中，根據本文所提供之方法產生之多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)結合至至少兩種選自以下之靶分子：IL-1α及IL-1β、IL-12及IL-1S；IL-13及IL-9；IL-13及IL-4；IL-13及IL-5；IL-5及IL-4；IL-13及IL-1β；IL-13及IL-25；IL-13及TARC；IL-13及MDC；IL-13及MEF；IL-13及TGF-~；IL-13及LHR促效劑；IL-12及TWEAK、IL-13及CL25；IL-13及SPRR2a；IL-13及SPRR2b；IL-13及ADAMS、IL-13及PED2、IL17A及IL17F、CEA及CD3、CD3及CD19、CD138及CD20；CD138及CD40；CD19及CD20；CD20及CD3；CD3S及CD13S；CD3S及CD20；CD3S及CD40；CD40及CD20；CD-S及IL-6；CD20及BR3、TNFα及TGF-β、TNFα及IL-1β；TNFα及IL-2、TNFα及IL-3、TNFα及IL-4、TNFα及IL-5、TNFα及IL6、TNFα及IL8、TNFα及IL-9、TNFα及IL-10、TNFα及IL-11、TNFα及IL-12、TNFα及IL-13、TNFα及IL-14、TNFα及IL-15、TNFα及IL-16、TNFα及IL-17、TNFα及IL-18、TNFα及IL-19、TNFα及IL-20、TNFα及IL-23、TNFα及IFNα、TNFα及CD4、TNFα及VEGF、TNFα及MIF、TNFα及ICAM-1、TNFα及PGE4、TNFα及PEG2、TNFα及RANK配位體、TNFα及Te38、TNFα及BAFF、TNFα及CD22、TNFα及CTLA-4、TNFα及GP130、TNF a及IL-12p40、VEGF及血管生成素、VEGF及HER2、VEGF-A及HER2、VEGF-A及PDGF、HER1及HER2、VEGFA及ANG2、VEGF-A及VEGF-C、VEGF-C及VEGF-D、HER2及DR5、VEGF及IL-8、VEGF及MET、VEGFR及MET受體、EGFR及MET、VEGFR及EGFR、HER2及CD64、HER2及CD3、HER2及CD16、HER2及HER3；EGFR (HER1)及HER2、EGFR及HER3、EGFR及HER4、IL-14及IL-13、IL-13及CD40L、IL4及CD40L、TNFR1及IL-1 R、TNFR1及IL-6R及TNFR1及IL-18R、EpCAM及CD3、MAPG及CD28、EGFR及CD64、CSPG及RGM A；CTLA-4及BTN02；IGF1及IGF2；IGF1/2及Erb2B；MAG及RGM A；NgR及RGM A；NogoA及RGM A；OMGp及RGM A；POL-l及CTLA-4；及RGM A及RGM B。
在某些實施例中，該多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)係抗CEA/抗CD3雙特異性抗體。在某些實施例中，該抗CEA/抗CD3雙特異性抗體係RG7802。關於抗CEA/抗CD3雙特異性抗體之其他細節提供於WO 2014/121712中，其係以全文引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，該多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)係抗VEGF/抗血管生成素雙特異性抗體。在某些實施例中，該抗VEGF/抗血管生成素雙特異性抗體雙特異性抗體係Crossmab。在某些實施例中，該抗VEGF/抗血管生成素雙特異性抗體係RG7716。
在某些實施例中，該多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)係抗Ang2/抗VEGF雙特異性抗體。在某些實施例中，該抗Ang2/抗VEGF雙特異性抗體係RG7221。在某些實施例中，該抗Ang2/抗VEGF雙特異性抗體係CAS編號1448221-05-3。
本揭示案之宿主細胞可表現許多其他抗體及/或其他蛋白質，且上文列表不意欲具有限制性。
本揭示案之宿主細胞可以製造規模用於所關注分子之生產。治療性蛋白質或其他蛋白質之「製造規模」生產利用約400 L至約80,000 L範圍內之細胞培養物，此取決於所生產之蛋白質及需求。通常，此製造規模生產利用約400 L至約25,000 L之細胞培養規模。在此範圍內，可利用諸如4,000 L、約6,000 L、約8,000、約10,000、約12,000 L、約14,000 L或約16,000 L等具體細胞培養規模。
與當前細胞培養方法中所使用之非TI細胞相比，本揭示案之宿主細胞可在更短之時間範圍內用於生產大量之所關注分子。在某些實施例中，與當前細胞培養方法中所使用之非TI細胞相比，本揭示案之宿主細胞可用於改良所關注分子之品質。在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可藉由防止可由產物引起之慢性毒性來用於增強種子培養穩定性，該慢性毒性可隨時間引起細胞應激及純系不穩定性。在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可用於急性毒性產物之最佳表現。
在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞(亦即TI系統)可用於細胞培養過程最佳化及/或過程開發。
在某些實施例中，與習用細胞培養方法中所用之非TI細胞相比，本揭示案之宿主細胞可用於使所關注分子之生產加速約1週、約、2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週或約10週。在某些實施例中，與習用細胞培養方法中所用之非TI細胞相比，本揭示案之宿主細胞可用於使所關注分子之收穫加速約1週、約、2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週或約10週。
在某些實施例中，與習用細胞培養方法中所用之非TI細胞相比，本發明實施例之宿主細胞可用於降低所關注分子之聚集水準。
在某些實施例中，相對於隨機整合之宿主細胞，本揭示案之宿主細胞可用於達成所關注一種多肽(或多種多肽)之增加的表現。舉例而言但不加以限制，本揭示案之宿主細胞可以以下效價達成標準及半抗體之表現：至少3 g/L、3.5 g/L、4 g/L、4.5 g/L、5 g/L、5.5 g/L、6 g/L、6.5 g/L、7 g/L、7.5 g/L、8 g/L、8.5 g/L、9 g/L、9.5 g/L、10 g/L、10.5 g/L、11 g/L或更大，且以以下效價達成多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)之表現：至少1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L、4 g/L、4.5 g/L、5 g/L、5.5 g/L、6 g/L或更大。在某些實施例中，相對於隨機整合之宿主細胞，本揭示案之宿主細胞可達成增加之雙特異性物含量。舉例而言但不加以限制，本揭示案之宿主細胞可達成至少80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或更多之雙特異性物含量。
在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可用於組成型表現治療性分子之所選次單元及調控型表現同一治療性分子之其他不同次單元。在某些實施例中，治療性分子可係融合蛋白。在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可用於理解每一抗體次單元在完全組裝抗體分子之表現及分泌中之作用及效應。
在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可用作研究工具。在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可用作診斷工具以指出各種細胞中有問題分子之低蛋白質表現之根本原因。在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可用於將所觀察到之現象或細胞行為與細胞中之轉殖基因表現直接關聯。本揭示案之宿主細胞亦可用於展示所觀察到之行為在細胞中是否可逆。在某些實施例中，可利用本揭示案之宿主細胞以鑑別且減輕關於細胞中一或多個轉殖基因轉錄及表現之問題。
在某些實施例中，本揭示案之宿主細胞可用於將難以表現之分子的轉殖基因次單元(諸如(但不限於)抗體之HC及LC次單元)與TI系統中之一般分子之轉殖基因次單元交換以鑑別有問題次單元。在某些實施例中，然後可使用胺基酸序列分析以縮小且聚焦可能導致低蛋白質表現之胺基酸殘基或區。
8. 例示性非限制性實施例
A. 一種包含外源核苷酸序列之靶向整合(TI)宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之特定基因座內之整合位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源。
A1. 如A之TI宿主細胞，其中緊接該經整合之外源核苷酸序列之5’的核苷酸序列係選自由與以下各項至少約90%同源之序列組成之群：NW_006874047.1之核苷酸41190-45269、NW_006884592.1之核苷酸63590-207911、NW_006881296.1之核苷酸253831-491909、NW_003616412.1之核苷酸69303-79768、NW_003615063.1之核苷酸293481-315265、NW_006882936.1之核苷酸2650443-2662054或NW_003615411.1之核苷酸82214-97705。
A2. 如A之TI宿主細胞，其中緊接該經整合之外源核苷酸序列之5’的核苷酸序列係選自由來自NW_006874047.1之核苷酸45269、NW_006884592.1之核苷酸207911、NW_006881296.1之核苷酸491909、NW_003616412.1之核苷酸79768、NW_003615063.1之核苷酸315265、NW_006882936.1之核苷酸2662054或NW_003615411.1之核苷酸97705之至少15個鹼基對、至少20個鹼基對、至少30個鹼基對、至少40個鹼基對、至少50個鹼基對、至少75個鹼基對、至少100個鹼基對、至少150個鹼基對、至少200個鹼基對、至少300個鹼基對、至少400個鹼基對、至少500個鹼基對、至少1,000個鹼基對、至少1,500個鹼基對、至少2,000個鹼基對、至少3,000個鹼基對之序列組成之群。
A3. 如A之TI宿主細胞，其中緊接該經整合之外源核苷酸序列之3’的核苷酸序列係選自由與以下各項至少約90%同源之序列組成之群：NW_006874047.1之核苷酸45270-45490、NW_006884592.1之核苷酸207912-792374、NW_006881296.1之核苷酸491910-667813、NW_003616412.1之核苷酸79769-100059、NW_003615063.1之核苷酸315266-362442、NW_006882936.1之核苷酸2662055-2701768或NW_003615411.1之核苷酸97706-105117。
A4. 如A之TI宿主細胞，其中緊接該經整合之外源核苷酸序列之3’的核苷酸序列係選自由來自NW_006874047.1之核苷酸45270、NW_006884592.1之核苷酸207912、NW_006881296.1之核苷酸491910、NW_003616412.1之核苷酸79769、NW_003615063.1之核苷酸315266、NW_006882936.1之核苷酸2662055或NW_003615411.1之核苷酸97706之至少15個鹼基對、至少20個鹼基對、至少30個鹼基對、至少40個鹼基對、至少50個鹼基對、至少75個鹼基對、至少100個鹼基對、至少150個鹼基對、至少200個鹼基對、至少300個鹼基對、至少400個鹼基對、至少500個鹼基對、至少1,000個鹼基對、至少1,500個鹼基對、至少2,000個鹼基對、至少3,000個鹼基對之序列組成之群。
A5. 如A至A4中任一項之TI宿主細胞，其中該經整合之外源核苷酸序列可操作地連接至選自由與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之序列組成之群的核苷酸序列。
A6. 一種包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之整合位點處：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
A7. 一種包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列所整合之整合位點可操作地連接至選自由以下組成之群之內源基因：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
A8. 一種包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列所整合之整合位點緊鄰選自由與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之序列組成之群的序列之全部或一部分。
A9. 如A至A8中任一項之TI宿主細胞，其中該TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。
A10. 如A9之TI宿主細胞，其中該TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
A11. 如A9或A10之TI宿主細胞，其中該TI宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
A12. 如A至A11中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列包含一或多個重組識別序列(RRS)，其中該RRS可由重組酶識別。
A13. 如A12之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列包含至少兩個RRS。
A14. 如A12或A13之TI宿主細胞，其中該重組酶係Cre重組酶或FLP重組酶。
A15. 如A12或A13之TI宿主細胞，其中該重組酶係Bxb1整合酶或φC31整合酶。
A16. 如A12至A15中任一項之TI宿主細胞，其中該RRS係選自由以下組成之群：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、φC31 attP序列及φC31 attB序列。
A17. 如A13至A16中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列包含第一及第二RRS以及至少一種位於該第一與該第二RRS之間的選擇標記物。
A18. 如A17之TI宿主細胞，其包含第一選擇標記物，其中該第一選擇標記物係選自由以下組成之群：胺基醣苷磷酸轉移酶(APH)、潮黴素磷酸轉移酶(HYG)、新黴素、G418 APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、麩醯胺酸合成酶(GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、組胺醇去氫酶(組胺醇D)、殺稻瘟菌素、博來黴素、腐草黴素、氯黴素、吉歐黴素及黴酚酸。
A19. 如A17或A18之TI宿主細胞，其進一步包含第二選擇標記物，其中該第一與該第二選擇標記物不同。
A20. 如A19之TI宿主細胞，其中該第二選擇標記物係選自由以下組成之群：胺基醣苷磷酸轉移酶(APH)、潮黴素磷酸轉移酶(HYG)、新黴素、G418 APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、麩醯胺酸合成酶(GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、組胺醇去氫酶(組胺醇D)、殺稻瘟菌素、博來黴素、腐草黴素、氯黴素、吉歐黴素及黴酚酸。
A21. 如A19或A20之TI宿主細胞，其進一步包含第三選擇標記物及內部核糖體進入位點(IRES)，其中該IRES可操作地連接至該第三選擇標記物。
A22. 如A21之TI宿主細胞，其中該第三選擇標記物不同於該第一或該第二選擇標記物。
A23. 如A21或A22之TI宿主細胞，其中該第三選擇標記物係選自由以下組成之群：綠色螢光蛋白(GFP)標記物、增強之GFP (eGFP)標記物、合成GFP標記物、黃色螢光蛋白(YFP)標記物、增強之YFP (eYFP)標記物、青色螢光蛋白(CFP)標記物、mPlum標記物、mCherry標記物、tdTomato標記物、mStrawberry標記物、J-red標記物、DsRed-單體標記物、mOrange標記物、mKO標記物、mCitrine標記物、Venus標記物、YPet標記物、Emerald6標記物、CyPet標記物、mCFPm標記物、Cerulean標記物及T-Sapphire標記物。
A24. 如A17至A23中任一項之TI宿主細胞，其進一步包含第三RRS，其中該第三RRS位於該第一與該第二RRS之間，且該第三RRS相對於該第一或該第二RRS係異種特異性的。
A25. 如A12至A24中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物及至少一個外源所關注序列(SOI)。
A26. 如A12至A25中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列進一步包含至少一個外源SOI。
A27. 如A26之TI宿主細胞，其中該外源SOI位於該第一與該第二RRS之間。
A28. 如A26或A27之TI宿主細胞，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
A29. 如A24至A28中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列進一步包含至少一個位於該第一與該第三RRS之間的外源SOI以及至少一個位於該第三與該第二RRS之間的外源SOI。
A30. 如A29之TI宿主細胞，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
A31. 如A26之TI宿主細胞，其中該SOI編碼相對於隨機整合之宿主細胞以更高水準表現之抗體。
A32. 如A31之TI宿主細胞，其中該抗體係以以下效價表現之標準抗體或半抗體：至少3 g/L、3.5 g/L、4 g/L、4.5 g/L、5 g/L、5.5 g/L、6 g/L、6.5 g/L、7 g/L、7.5 g/L、8 g/L、8.5 g/L、9 g/L、9.5 g/L、10 g/L、10.5 g/L、11 g/L或更多。
A33. 如A31之TI宿主細胞，其中該抗體係以至少1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L、4 g/L、4.5 g/L、5 g/L、5.5 g/L、6 g/L之效價表現之多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。
A34. 如A31之TI宿主細胞，其中該抗體係雙特異性抗體且相對於隨機整合之宿主細胞，雙特異性物含量增加。
A35. 如A1之TI宿主細胞，其中該抗體係雙特異性抗體且該雙特異性物含量為至少80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或更多。
B. 一種製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括：提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含兩個RRS，該兩個RRS側接至少一個第一選擇標記物；向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；引入重組酶或編碼重組酶之核酸，其中該重組酶識別該等RRS；及選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該多肽之TI宿主細胞。
B1. 如B之方法，其中該重組酶係Cre重組酶或FLP重組酶。
B2. 如B之方法，其中該重組酶係Bxb1整合酶或φC31整合酶。
B3. 如B至B2中任一項之方法，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
B4. 如技術方案B至B3中任一項之方法，其中該TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。
B5. 如B4之方法，其中該TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
B6. 如B4或B5之方法，其中該TI宿主細胞係CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
C. 一種表現所關注多肽之方法，其包括：提供包含至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物之TI宿主細胞，其中該至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物側接有兩個RRS，其整合在該TI宿主細胞基因體之基因座內，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；及在適於表現該所關注多肽之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。
C1. 如C之方法，其中該至少一個外源SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
D. 一種製備表現至少第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括：提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的；向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物；向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI；引入一或多種重組酶，或編碼一或多種重組酶之一或多種核酸，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。
D1. 如D之方法，其中該重組酶係Cre重組酶或FLP重組酶。
D2. 如D之方法，其中該重組酶係Bxb1整合酶或φC31整合酶。
D3. 如D之方法，其中：該第一載體進一步包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接該第一SOI且下游側接RRS；且該第二載體進一步包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接該第二SOI。
D4.
D5. 如D至D3中任一項之方法，其中該第一SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
D6. 如D至D3中任一項之方法，其中該第二SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
D7. 如C或D至D6中任一項之方法，其中該TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。
D8. 如D7之方法，其中該TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
D9. 如D8之方法，其中該TI宿主細胞係CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
E. 一種表現所關注多肽之方法，其包括：提供包含至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物之宿主細胞，該至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物整合在該宿主細胞基因體之基因座內，其中該基因座與選自SEQ ID No 1-7之序列至少約90%同源，其中至少一個外源SOI及一個選擇標記物側接有第一及第三RRS且至少一個外源SOI側接有第二及該第三RRS；及在適於表現該所關注多肽之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。
E1. 如E之方法，其中該第一SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
E2. 如E或E1之方法，其中該第二SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
E3. 如E至E2中任一項之方法，其中該TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。
E4. 如E3之方法，其中該TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
E5. 如E4之方法，其中該TI宿主細胞係CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
F. 一種載體，其包含與以下至少50%同源之兩個核苷酸序列：
a) 選自SEQ ID No. 1之任一部分之兩個參照序列；
b) 選自SEQ ID No. 2之任一部分之兩個參照序列；
c) 選自SEQ ID No. 3之任一部分之兩個參照序列；
d) 選自SEQ ID No. 4之任一部分之兩個參照序列；
e) 選自SEQ ID No 5之任一部分之兩個參照序列；
f) 選自SEQ ID No. 6之任一部分之兩個參照序列；或
g) 選自SEQ ID No. 7之任一部分之兩個參照序列，
其中該等序列側接DNA盒，其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。
F1. 如F之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少60%同源之兩個核苷酸序列。
F2. 如F之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少70%同源之兩個核苷酸序列。
F3. 如F之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少80%同源之兩個核苷酸序列。
F4. 如F之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少90%同源之兩個核苷酸序列。
F5. 如F之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少95%同源之兩個核苷酸序列。
F6. 如F之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少99%同源之兩個核苷酸序列。
F7. 如F至F6中任一項之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
F8. 如F至F7中任一項之載體，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
G. 一種製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括：提供宿主細胞，其包含該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；向該宿主細胞中引入載體，其中該載體包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI；及針對該選擇標記物進行選擇以分離該SOI整合於該基因體之該基因座中且表現該所關注多肽之TI宿主細胞。
G1. 如G之方法，其中該載體係選自由以下組成之群：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
G2. 如G或G1之方法，其中該至少一個SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
G3. 如G至G2中任一項之方法，其中該TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。
G4. 如G3之方法，其中該TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
G5. 如G3或G4之方法，其中該TI宿主細胞係CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
G6. 如G1至G5中任一項之方法，其中藉由外源核酸酶來促進包含該至少一個SOI及選擇標記物之該核酸之整合。
G7. 如G6之方法，其中該外源核酸酶係選自由以下組成之群：鋅指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚體、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)、TAL效應物結構域融合蛋白、RNA引導之DNA核酸內切酶、經改造之大範圍核酸酶及成簇規律間隔之短迴文重複序列(CRISPR)關聯蛋白(Cas)核酸內切酶。
G8. 如G之方法，其中該所關注多肽係多特異性抗體。
G9. 如G8之方法，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
H. 一種包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之一或多個特定基因座內之整合位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源。
H1. 一種包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之一或多個整合位點處：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
H2. 如技術方案62至63中任一項之TI宿主細胞，其中該至少一個外源核苷酸序列包含一或多個重組識別序列(RRS)，其中該RRS可由重組酶識別。
H3. 如技術方案64之TI宿主細胞，其中該至少一個外源核苷酸序列進一步包含至少一個外源SOI。
H4. 如H至H3中任一項之TI宿主細胞，其中該宿主細胞包含至少一個在該宿主細胞基因體之第一基因座處之外源核苷酸序列及至少一個在該宿主細胞基因體之一或多個第二基因座處之外源核苷酸序列。
H5. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H5.1. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列。
H5.2. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列。
H5.3. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列。
H5.4. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列。
H5.5. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列。
H5.6. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H6. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H6.1. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列。
H6.2. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列。
H6.3. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列。
H6.4. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列。
H6.5. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列。
H6.6. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H7. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H7.1. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列。
H7.2. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列。
H7.3. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列。
H7.4. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列。
H7.5. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列。
H7.6. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H8. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H8.1. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列。
H8.2. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列。
H8.3. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列。
H8.4. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列。
H8.5. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列。
H8.6. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H9. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H9.1. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列。
H9.2. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列。
H9.3. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列。
H9.4. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列。
H9.5. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列。
H9.6. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H10. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H10.1. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列。
H10.2. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列。
H10.3. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列。
H10.4. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列。
H10.5. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列。
H10.6. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列。
H11. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列。
H11.1. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 1之全部或一部分至少90%同源之序列。
H11.2. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 2之全部或一部分至少90%同源之序列。
H11.3. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 3之全部或一部分至少90%同源之序列。
H11.4. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 4之全部或一部分至少90%同源之序列。
H11.5. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 5之全部或一部分至少90%同源之序列。
H11.6. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座包含與SEQ ID No. 7之全部或一部分至少90%同源之序列，且該第二基因座包含至少一個與SEQ ID No. 6之全部或一部分至少90%同源之序列。
H12. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座係LOC107977062基因內之整合位點，且該第二基因座係選自以下群組之基因內之整合位點：LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
H13. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座係LOC100768845基因內之整合位點，且該第二基因座係選自以下群組之基因內之整合位點：LOC107977062、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
H14. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座係ITPR2基因內之整合位點，且該第二基因座係選自以下群組之基因內之整合位點：LOC107977062、LOC100768845、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
H15. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座係ERE67000.1基因內之整合位點，且該第二基因座係選自以下群組之基因內之整合位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
H16. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座係UBAP2基因內之整合位點，且該第二基因座係選自以下群組之基因內之整合位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
H17. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座係MTMR2基因內之整合位點，且該第二基因座係選自以下群組之基因內之整合位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
H18. 如H4之TI宿主細胞，其中該第一基因座係XP_003512331.2基因內之整合位點，且該第二基因座係選自以下群組之基因內之整合位點：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及與其至少約90%同源之序列。
H19. 如H4至H18之TI宿主細胞，其中併入在該第一基因座處之該至少一個外源核苷酸序列包含可調控啟動子。
H20. 如H4至H18之TI宿主細胞，其中併入在該第二基因座處之該至少一個外源核苷酸序列包含可調控啟動子。
H21. 如H4至H18之TI宿主細胞，其中併入在該第一基因座處之該至少一個外源核苷酸序列及併入在該第二基因座處之該至少一個核苷酸序列包含可調控啟動子。
J. 一種製備表現至少一種所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括：提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中該一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該至少一個外源核苷酸序列包含兩個RRS，該兩個RRS側接至少一個第一選擇標記物；向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物；引入重組酶或編碼重組酶之核酸，其中該重組酶識別該等RRS；及選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該至少一種所關注多肽之TI宿主細胞。
J1. 一種製備表現至少一種第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括：提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的；向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該至少一個經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物；向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該至少一個經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI；引入一或多種重組酶，或編碼一或多種重組酶之一或多種核酸，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該至少一種第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。
J2. 一種製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括：a) 提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中該一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含一或多個RRS；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含一或多個RRS之載體，該一或多個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之一或多個RRS匹配且側接至少一個外源SOI且可操作地連接至至少一個可調控啟動子；c) 引入重組酶或編碼重組酶之核酸，其中該重組酶識別該等RRS；及d) 在誘導物存在下選擇表現該外源所關注多肽之TI細胞以藉此分離表現該所關注多肽之TI宿主細胞。
J3. 一種表現所關注多肽之方法，其包括：a) 提供宿主細胞，其包含整合在該宿主細胞基因體之基因座內之至少一個外源SOI，該至少一個外源SOI側接有兩個RRS及一個可調控啟動子，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；及b) 在適於表現該SOI之條件下培養該細胞且自其回收所關注多肽。
J4. 一種製備表現第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括：a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含第一、第二RRS及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的；b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之第一外源SOI；c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之第二外源SOI；d) 引入一或多種重組酶，或編碼一或多種重組酶之一或多種核酸，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及e) 在誘導物存在下選擇表現該第一及第二外源所關注多肽之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。
J5. 如技術方案J、J2及J3中任一項之方法，其中藉由外源核酸酶來促進包含至少一個SOI之核酸之整合。
J6. 如技術方案J1或J4之方法，其中該第一SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白；且該第二SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
J7. 如J5之方法，其中該外源核酸酶係選自由以下組成之群：鋅指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚體、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)、TAL效應物結構域融合蛋白、RNA引導之DNA核酸內切酶、經改造之大範圍核酸酶及成簇規律間隔之短迴文重複序列(CRISPR)關聯蛋白(Cas)核酸內切酶。
J8. 如技術方案J至J4中任一項之方法，其中該可調控啟動子係選自由SV40及CMV啟動子組成之群。
J9. 如技術方案J2及J4中任一項之方法，其中：該第一載體進一步包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接該第一SOI且下游側接RRS；且該第二載體進一步包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接該第二SOI。
K. 一種載體，其包含與以下至少50%同源之兩個核苷酸序列：
a) 選自SEQ ID No. 1之任一部分之兩個參照序列；
b) 選自SEQ ID No. 2之任一部分之兩個參照序列；
c) 選自SEQ ID No. 3之任一部分之兩個參照序列；
d) 選自SEQ ID No. 4之任一部分之兩個參照序列；
e) 選自SEQ ID No 5之任一部分之兩個參照序列；
f) 選自SEQ ID No. 6之任一部分之兩個參照序列；或
g) 選自SEQ ID No. 7之任一部分之兩個參照序列，
其中該兩個核苷酸序列側接DNA盒，其中該DNA盒包含至少一個外源SOI，該至少一個外源SOI可操作地連接至可調控啟動子且側接有兩個RRS。
K1. 如K之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少60%同源之兩個核苷酸序列。
K2. 如K之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少70%同源之兩個核苷酸序列。
K3. 如K之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少80%同源之兩個核苷酸序列。
K4. 如K之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少90%同源之兩個核苷酸序列。
K5. 如K之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少95%同源之兩個核苷酸序列。
K6. 如K之載體，其中該載體包含與該兩個參照序列至少99%同源之兩個核苷酸序列。
K7. 如K至K6中任一項之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
K8. 如K至K7中任一項之載體，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
實例
以下實例僅說明本發明所揭示之標的物且不應視為以任何方式進行限制。
實例 1 ：發現針對 CHO 宿主細胞之高產靶向整合位點以用於臨床及商業細胞株開發
此實例闡述用於鑑別具有高生產力之CHO基因體中之靶向整合基因座之方法。習用細胞株開發(CLD)依賴於攜帶所關注序列(SOI)之質體之隨機整合(RI)。此過程不可預測且費力。因此，需要較大努力來鑑別高產RI純系。不同於習用RI CLD，靶向整合(TI) CLD在CHO基因體中之預定「熱點」處以確定之拷貝數(通常1-2個拷貝)引入轉殖基因。鑒於低拷貝數及預先測試之整合位點，與RI系相比，TI細胞株應具有更佳穩定性。此外，由於選擇性標記物僅用於選擇具有適當TI之細胞且不用於選擇具有高轉殖基因表現水準之細胞，因此可應用誘變性較小之標記物以使序列變異體(SV)之機會最小化，序列變異體部分地係由於如胺甲喋呤(MTX)或甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)等選擇劑之誘變性所致。
圖1係顯示用於鑑別容許抗體之穩定及高表現之CHO TI基因座之全基因體篩選步驟概述之圖表。為篩選CHO基因體中之轉錄活性序列，利用兩種方法將抗體盒(表現抗體A或抗體B，且其中抗體序列側接有RRS1及RRS2)引入至CHO基因體中。一種方法為習用隨機整合方法，且另一種方法為基於轉位酶之整合，該整合需要表現轉位酶之質體及抗體質體之共轉染。每一方法篩選15 k至20 k個轉染子。基於完整IgG ELISA分析及基因拷貝分析，於搖瓶中擴增總計約300個具有高抗體效價及低HC基因拷貝數之純系以進行補料分批評估。隨後選擇由該兩種方法鑑別出之具有可接受效價及產物品質屬性之40個純系(代表40個可能不同之高轉錄活性整合位點)進行GFP著陸墊交換以產生TI宿主。
為替代轉錄活性基因座中之抗體盒，構築編碼GFP基因及適當選擇標記物之著陸墊(其側接有相同RRS1及RRS2)以進行RMCE。為起始RMCE，將重組酶及GFP著陸墊共轉染至該40個優勢純系中之每一者中。使用兩種選擇標記物以富集靶向整合事件。成功之RMCE應使得GFP著陸墊靶向至轉錄活性基因座且替代抗體盒，從而使得GFP表現增加且抗體表現缺失。使用FACS分析可容易地偵測到表現型自GFP-/mAB+至GFP+/mAb-之變化。使用FACS分析，在40個RMCE庫中之14個中偵測到GFP+/mAb-富集。為分離個別TI宿主候選者，隨後對該等14個RMCE庫中之每一者進行單細胞選殖。基於FACS及基因體PCR確認選擇出總計90個來自14個庫之潛在TI宿主候選者，其原始抗體盒去除且在所關注整合位點處由GFP著陸墊替代。隨後，使用側接有相同RRS1及RRS2之測試抗體C評估該等候選宿主中之一些宿主之RMCE性能及效率。利用兩種雙選擇方案來產生目標抗體表現群體(圖2A及2B)，此取決於鑑別轉錄活性基因座之方法。該兩種篩選方法之著陸墊之構形略有不同。基於RMCE效率以及TI轉染庫之抗體生產力，選擇7個最終宿主，其代表CHOK1M宿主中之7個獨特高抗體表現整合位點。
藉由靶向基因座擴增/下一代測序(TLA/NGS)分析該7個宿主以鑑別側接整合位點之CHO基因體序列，由此提供所關注整合位點所在之潛在基因序列。
表 2 - TI 宿主細胞整合位點
基於整合位點，5’側接序列可包括：NW_006874047.1之核苷酸41190-45269、NW_006884592.1之核苷酸63590-207911、NW_006881296.1之核苷酸253831-491909、NW_003616412.1之核苷酸69303-79768、NW_003615063.1之核苷酸293481-315265、NW_006882936.1之核苷酸2650443-2662054及NW_003615411.1之核苷酸82214-97705。
基於整合位點，3’側接序列可包括：NW_006874047.1之核苷酸45270-45490、NW_006884592.1之核苷酸207912-792374、NW_006881296.1之核苷酸491910-667813、NW_003616412.1之核苷酸79769-100059、NW_003615063.1之核苷酸315266-362442、NW_006882936.1之核苷酸2662055-2701768及NW_003615411.1之核苷酸97706-105117。
對於該等宿主中之兩者(亦即宿主4及7)，進一步分析指示單一GFP著陸墊插入至CHO宿主基因體中。該兩個宿主中未發現抗體序列，此指示用於鑑別轉錄活性基因座之初始抗體盒之完全去除。另外，對自該兩個TI宿主分離之基因體DNA內部實施全基因體測序。在該兩個TI宿主中未偵測到抗體特異性序列，而GFP序列(來自著陸墊)可容易地偵測。TI宿主達成63×以上之基因體覆蓋率。為進一步確保TI宿主中不存在抗體A及B，使用LC-MS研究評估來自表現除抗體A及B外之抗體之TI細胞株的多個HCCF樣品。使用與藉由LC-MS/MS之序列變異體分析類似之方法分析LC-MS數據，該方法具有偵測＞ 0.5%水準之變異體肽之能力。在自TI細胞株收穫之所有樣品中均未偵測到抗體A或B肽。最後，亦藉由Chrombios實施螢光原位雜交(FISH)分析以確定該兩個TI宿主之基因體中GFP著陸墊之染色體位置。
利用總計16種不同之標準抗體進一步評價該兩個充分表徵之TI宿主在臨床細胞株開發中之RMCE穩健性。圖3顯示由該等TI宿主產生之優勢純系之生產力。以往藉由隨機整合產生之細胞株之平均生產力為約3 g/L。在所測試之大多數情形中，TI細胞株平均顯示與RI純系相當或更佳之生產力。
由於較低之抗體基因拷貝數，因此預期TI細胞株具有優於RI細胞株之穩定性及低於RI細胞株之SV。對於純系穩定性，每月設置每月補料分批生產持續4個月以監測生產力。表3顯示，在由該等TI宿主中之一者產生之TI細胞株中僅10%在120天後自PSB具有大於20%之效價下降。以往60%之RI細胞株將具有類似之效價下降。此強烈表明，所鑑別之整合位點高度適於穩定抗體表現。亦使TI細胞株經受基於NAT之序列變異體分析。當與RI細胞株相比時，TI細胞株中SV ＞5%之頻率顯著更低(4%對15%，表3)。
表 3 TI 相對於 RI 之優點
實例 2 ：雙質體 RMCE 策略
為解決達成標準抗體之高效價表現及表現多鏈複合物形式之挑戰，開發創新型雙質體RMCE策略。該雙質體RMCE方法容許8條或更多條鏈同時靶向至TI位點。此方法不僅增加調節抗體之HC及LC鏈比率以改良生產力之靈活性，且亦使得具有多條鏈之複合分子成為可能以及利用抗體靶向轉殖基因、內源基因或RNAi以修改細胞路徑。
雙質體RMCE策略涉及使用三個RRS位點以同時實施兩次獨立的RMCE (圖4)。因此，上文所述TI宿主中之GFP著陸墊經替代以包括第三RRS位點(RRS3)，該RRS3與RRS1或RRS2位點無交叉活動。欲靶向之兩種表現質體需要相同側接RRS位點以進行有效靶向，一種表現質體(前端)側接有RRS1及RRS3，且另一表現質體(後端)側接RRS3及RRS2。由於預期雙質體RMCE效率較低，因此嚴格之選擇方案可用於富集罕見RMCE特異性事件。雙質體RMCE中需要至少兩種選擇標記物。在某些實施例中，採用三種選擇標記物，其中一種選擇標記物表現盒分成兩部分(例如，參見圖4)。在涉及分裂選擇標記物表現盒之某些實施例中，前端質體將含有啟動子，之後為起始密碼子及RRS3序列。後端質體將具有融合至減去ATG起始之選擇標記物編碼區之N末端之RRS3序列。可能需要其他核苷酸插入在RRS3位點與選擇標記物序列之間，以確保融合蛋白之框架內轉譯。僅在該兩種質體均正確靶向時，選擇標記物之完整表現盒才能組裝，由此使細胞對選擇具有抗性。圖4係顯示雙質體RMCE策略之示意圖。當然，若需要，則仍可使用RRS1及RRS2來實施單質體RMCE。
為測試雙質體RMCE方法之穩健性，使用先前鑑別之TI宿主(宿主4)，用具有三個RRS位點之新GFP著陸墊替代原始GFP著陸墊。與單質體RMCE相比，觀察到雙質體RMCE之存活率下降更嚴重且恢復時間更長，此與雙質體RMCE之較低初始RMCE效率一致。一旦各庫恢復，則評價FACS、基因體PCR及基因拷貝分析以確認兩個質體盒均正確靶向至TI位點。使用單質體RMCE及雙質體RMCE二者測試總計五種標準抗體(Q、R、S、T及U)之生產力(圖5)。與單質體RMCE相比，在雙質體RMCE中，更多之總HC及LC拷貝靶向至TI位點。在所有五種情形中，與單質體庫之彼等生產力相比，雙質體TI轉染庫之生產力始終較高，最高增加200%。雙質體RMCE中效價之增加主要歸因於比生產力，與單質體RMCE之比生產力相比，其水準提高多達300%。
在不同細胞培養平台中進一步評價充分表徵之TI宿主(例如，宿主4)之達成5種不同抗體之高效價之能力。圖6顯示該等TI宿主對該等抗體之生產力。大多數抗體在第14天達成高於10 g/L之生產力且在第16天達成高於12 g/L之生產力。
為評價使用雙質體RMCE以表現複合mAb形式，測試需要在同一細胞中表現四條不同鏈(兩條HC及兩條LC)以進行雙特異性組裝之兩種雙特異性分子。藉由使兩個單獨之表現質體能夠同時靶向，可操縱不同鏈之質體構形以達成平衡表現之最佳鏈比率。在兩種情形下，使用雙質體RMCE開發出源自宿主4之細胞株，其具有＞1.5 g/L及＞80%之雙特異性物含量(圖7)。
亦評估需要在同一細胞中表現四條不同鏈(兩條HC及兩條LC)以進行雙特異性組裝之四種雙特異性分子之第14天效價。使用雙質體RMCE開發出之源自宿主4之所有細胞株均具有＞1.5 g/L之效價(圖8)及＞80%之雙特異性物含量。
實例 3 ：表現 mAb-I ( 難以表現 ) 與 mAb-II ( 平均表現 ) 抗體分子之 RTI 細胞株之表現及生長分析
難以表現之分子如此定義：在若干次CLD嘗試之後，所有產生之細胞株所達成之效價均低於通常自標準CLD平台製程所預期之效價。舉例而言，對於一種先前鑑別之難以表現之抗體(mAb-I)而言，在補料分批生產培養物中評估來自4次單獨CLD嘗試之超過120種細胞株。然而，當與平均抗體分子(mAb-II)相比時，表現mAb-I最高之細胞株僅能達成典型效價之50%，其中針對平均抗體分子僅篩選24個細胞株(圖9A表格)。不幸的是，追蹤可使分子在隨機整合系統中難以表現之潛在原因極難，此主要係由於不同細胞株之間轉殖基因拷貝數及基因整合位點之差異所致。
為鑑別使mAb-I難以表現之潛在因素，使用RTI系統起始針對mAb-I及mAb-II分子二者之CLD。將HC及LC構築體二者均選殖至誘導型CMV-TO啟動子控制下之表現載體中，且將該等載體轉染至TI宿主中以增加分離具有相似轉殖基因轉錄水準之細胞株之可能性。針對mAb-I及mAb-II之RTI CLD方法之整體示意圖繪示於圖9B中。在整個CLD過程中使用兩種單獨條件使經轉染之細胞株經受選擇，其中在該等條件下得到細胞株：1) 在Dox存在下(經誘導)，或2) 在Dox不存在下(未誘導)。在不存在Dox之情形下得到之細胞株僅暫時或若指示在生產分析期間經誘導以基於種子培養效價進行排序。此使得能夠在選擇過程期間評估抗體表現(表現壓力)之作用(圖9B)。
在存在或不存在去氧羥四環素之情形下，使用來自「經誘導」及「未誘導」種子培養小組二者之兩種代表性mAb-I及mAb-II細胞株(源自宿主7)實施生產分析。使用mAb-II細胞株在不存在誘導之情形下評估啟動子洩露及基礎抗體生產水準。在不存在去氧羥四環素之情形下觀察到相當嚴格之對抗體表現之調控，此表明受調控之表現系統在該等細胞株中有效地起作用(圖10A及10C)。在存在或不存在去氧羥四環素之情形下，所有細胞株之生長(圖10B)概況均相當，但在去氧羥四環素不存在下生長概況似乎略微更佳。在「經誘導」或「未誘導」種子培養條件下得到之細胞株在生產期間展示相對相當之效價及比生產力(圖10A及10C，比較mAb-I或mAb-II之細胞株1及2與3及4)，此指示選擇期間之組成型抗體表現在高效價細胞株之分離方面不起重要作用(圖10)。另外，與RI CLD嘗試類似，mAb-I RTI細胞株之效價及比生產力較mAb-II RTI細胞株仍低50% (圖10A及10C)。此觀察結果排除慢性毒性為mAb-I之低表現之原因，此乃因與mAb-II對照細胞株相比，mAb-I之「經誘導」及「未誘導」之RTI培養物二者均同樣地展示更低之效價。
實例 4 ： mAb-I 細胞株中之較低抗體表現不係由於較低轉錄
為分析在mAb-I表現細胞株中所觀察到之較低抗體表現，在去氧羥四環素誘導及未誘導條件下實施qRT-PCR實驗以量測表現mAb-I或mAb-II之RTI細胞株中抗體HC及LC之mRNA水準。在不存在Dox之情形下，mAb-I或mAb-II細胞株表現極少或不表現HC或LC mRNA，此指示誘導型啟動子之相對嚴格之轉錄調控(圖11)。在存在Dox之情形下，mAb-I表現細胞株之抗體HC及LC轉錄水準與mAb-II表現細胞株之彼等轉錄水準相當或高於mAb-II表現細胞株之彼等轉錄水準(圖11A及11B)。該等結果確認，轉殖基因轉錄之水準降低不係mAb-I表現細胞株中抗體表現低之原因。另外，在CLD過程期間，種子培養培養物中存在或不存在去氧羥四環素對轉殖基因轉錄速率並無影響，此乃因在「經誘導」或「未誘導」條件下分離之細胞株具有相當之HC或LC mRNA水準(圖11A及圖11B)。
實例 5 ：誘導 mAb-I 表現使得細胞內 BiP 可逆累積且抗體 HC 降解延遲
為鑑別影響mAb-I表現之潛在因素，使用Dox誘導連同環己醯亞胺(CHX)處理及去除來研究抗體分泌、摺疊及降解。在該等實驗中，利用CHX處理「經誘導」培養物以停止蛋白質合成，且在5小時後，洗滌細胞且重新懸浮至僅含有Dox (無CHX)之培養基中以繼續蛋白質合成(圖12A)。在CHX去除後大約60 min內，在該等培養物之上清液中未偵測到HC或LC，且僅在120 min後偵測到抗體分泌之逐漸增加且速率相似(圖12B，上圖)。此表明，在CHX去除後，經適當摺疊且組裝之抗體分子之分泌在mAb-I與mAb-II細胞株之間係相當的。抗體LC之細胞內含量在mAb-I與mAb-II表現細胞株之間亦在很大程度上相當(圖12B，LC圖)。然而，即使在CHX處理5小時後，與mAb-II表現株相比，在mAb-I表現細胞株中亦偵測到顯著更高之細胞內抗體HC水準(圖12B，HC圖)。此暗示在mAb-I表現細胞株中，未摺疊或錯誤摺疊之抗體HC之降解及清除存在延遲或問題。令人感興趣的是，在CHX處理之前及之後，相對於mAb-II細胞株，在mAb-I中偵測到極高之細胞內BiP水準(圖12B，下圖，BiP)。BiP作為伴護蛋白與未摺疊蛋白反應(UPR)以及抗體HC或LC摺疊有關，且其在種子培養培養物中之存在可指示ER相關之細胞應激。
為進一步研究mAb-I表現與細胞內BiP累積之間的關聯，於含有去氧羥四環素之培養基中使「經誘導」之種子培養培養物經或不經CHX處理隔夜，且評估該等樣品中之細胞內HC、LC及BiP水準。在不存在CHX處理之情形下，相對於mAb-II細胞株，細胞內抗體HC分子之基礎水準在mAb-I中更高，而細胞內LC之水準在所有樣品組之間相當。另一方面，相對於mAb-II表現細胞株，BiP水準在mAb-I中相當高(圖12C，-CHX樣品)。利用CHX隔夜處理該等培養物使得所有細胞株中之HC及LC水準降低，且特異性地在mAb-I表現細胞株中BiP水準同時降低(圖12C，+CHX樣品)。此與先前發現一致(圖12B)。由於環己醯亞胺不加選擇地抑制所有真核蛋白質之合成，因此mAb-I細胞株中之較高BiP水準不能直接與抗體HC或LC次單元之累積相關。然而，受調控之表現系統提供直接測試細胞內BiP與抗體HC或LC含量之間的關聯之能力。為此，將去氧羥四環素自培養基去除6天以特異性地關閉抗體表現而不影響其他內源性蛋白質之表現，且監測細胞內HC、LC及BiP水準。觀察到mAb-I細胞株之抗體(HC及LC)表現與細胞內BiP累積之間的直接且具體之關聯，而mAb-II之表現顯示對細胞內BiP水準無效應(圖12D)。
實例 6 ：儘管 mAb-I LC 表現觸發細胞內 BiP 累積，但 mAb-I HC 亦明顯地促成此抗體之低表現
為測定mAb-I LC是否在細胞內BiP之累積中起作用，產生在受調控之啟動子下表現mAb-I HC同時組成型地表現LC之構築體。將此構築體連同表現mAb-I或mAb-II之受調控HC/LC之構築體(對照)轉染至CHO細胞中，且得到兩個來自每次轉染之單獨庫。在生產培養物中評估庫效價(圖13A)，同時在存在及不存在去氧羥四環素之情形下藉由西方墨點分析評估種子培養培養物(圖13B)。在生產分析期間，每一庫經Dox誘導或保持未誘導。未誘導庫在生產期間表現極少之抗體，此指示嚴格之表現調控(圖13A，-Dox)。在生產期間對經Dox誘導之培養物之分析揭示，相對於在種子培養期間「經誘導」之受調控之HC/LC mAb-I庫及受調控之HC/組成型LC mAb-I庫，源自「未誘導」之種子培養培養物之受調控之HC/組成型LC mAb-I表現庫具有顯著更低之效價(圖13A)。「未誘導」培養物之西方墨點分析顯示，在所有條件下，僅在向培養基中添加Dox時才表現抗體HC。另外，單獨之mAb-I LC而無mAb-I HC之組成型表現觸發細胞內BiP之累積(圖13B)。該等結果暗示mAb-I LC次單元之表現與細胞內BiP之累積之間的直接關係。當在不存在HC之情形下組成型表現時，mAb-I之LC分子有可能在ER內形成與BiP伴護蛋白相互作用之未摺疊聚集體，從而在該等細胞中觸發BiP之細胞內水準之增加。生產階段期間mAb-I HC之表現可進一步使該等細胞負擔加重，此增加對細胞內BiP之需求以適應HC及LC分子二者之摺疊，從而導致抗體組裝、摺疊及分泌效率低效(圖13A)。
雖然該等發現指出如細胞內BiP之累積所指示之mAb-I LC表現與細胞ER應激之間的關係，但需要確立mAb-I LC之表現與mAb-I細胞株之低效價之間的直接關係。為此，產生抗體分子，其中交換mAb-I及mAb-II重鏈及輕鏈以產生HCI LCI 、HCII LCII 、HCI LCII 及HCII LCI 抗體組合。HCI LCII 構築體表現具有mAb-I HC及mAb-II LC之抗體，而HCII LCI 構築體表現具有mAb-II HC及mAb-I LC之抗體。所有該等構築體之抗體HC及LC表現均在RTI載體系統中之CMV-TO啟動子之控制下(圖13C)。接著將該等構築體轉染至CHO TI宿主細胞中且產生針對每一構築體之兩個單獨RTI庫，且測試mAb-I或mAb-II或該等抗體之雜合形式之表現。如先前所注意到的(圖13B)，觀察到mAb-I LC表現與細胞內BiP累積之間的清晰且直接之關聯(圖13D，LC及BiP印跡)。令人感興趣的是，與HCII LCII 相比，在表現HCI LCII 雜交抗體之庫中，細胞內BiP亦以較不強烈但明顯之方式累積，此暗示該等庫中存在某些水準之ER應激，其有可能係由於HCI 之表現所致(圖13D，比較HCII LCII 及HCI LCI 樣品中之長暴露BiP水準)。經由Dox去除關閉抗體表現導致所有RTI庫中之細胞內BiP水準降低，mAb-II (HCB LCB )庫除外，在該庫中，即使在Dox去除之前，細胞內HC及BiP二者之初始水準亦相當更低(圖13D，比較HCII LCII 庫與其他庫中第0天之HC及BiP水準)。
為評估mAb-I HC及LC對總體抗體表現之作用，在生產分析中評估HCI LCI 、HCII LCII 、HCI LCII 及HCII LCI RTI庫。在不存在去氧羥四環素之情形下，所有RTI庫均表現極少之抗體，此展現抗體表現之嚴格調控(圖14A，-Dox)。所有RTI庫之生長速率均類似，其中經誘導之培養物相對於未誘導之培養物具有略低之生長速率(圖14B)。如先前所觀察，mAb-I及mAb-II RTI庫分別具有最低及最高之效價及比生產力(圖14A及圖14C)。令人感興趣的是，HCII LCI 及HCI LCII RTI庫二者均展示高於HCI LCI 但低於HCII LCII RTI庫之效價及比生產力(圖14A及圖14C)。該等結果指示，相對於mAb-II，mAb-I HC及LC次單元二者均個別地促成此抗體之較低表現。與吾人預期相反，與表現HCI 次單元之庫相比，表現LCI 次單元之雜交RTI庫具有略高之效價及比生產力(圖14A及圖14C)。此指示，相對於LC次單元，mAb-I HC在此抗體之較低表現中起略微更顯著之作用。即使在無法鑑別生物應激之明確指標(諸如細胞內BiP累積)時，使用抗體鏈交換方法與RTI系統之組合仍揭示出與mAb-I HC次單元之表現相關之負效應。
實例 7 ： mAb-I 與 mAb-II HC 及 LC 次單元之間的胺基酸序列差異
為評價某些胺基酸殘基是否可促成mAb-I HC及LC之有問題表現，將mAb-I及mAb-II LC (圖15A)及HC (圖15B)次單元之胺基酸序列進行比對。mAb-I與mAb-II HC及LC分子之所有CDR區之胺基酸組成彼此不同，此乃因其經開發以靶向不同抗原。在LC次單元中，對於可變區之其餘部分及所有恆定區，在mAb-I與mAb-II分子之間並不存在胺基酸序列差異。LCI 之CDR1區段較LCII 長6個胺基酸，而LCII 之CDR3區段較LCI 長1個胺基酸(圖15A)。至於抗體HC次單元(不包括CDR區段)，HCI 及HCII 之可變區及恆定區之其餘部分相同，惟4個胺基酸殘基除外(圖15B)。該等胺基酸變化中之兩者係相當保守的(T-＞S及L-＞A)，且因此不太可能促成HCI 之低表現。HCI 中之N-＞G變化防止抗體HC醣基化。因此，研究HCII 與HCI 之間的N-＞G及Y-＞V胺基酸差異對HCI 之表現之效應。產生兩個點突變，從而將HCI 之G及V胺基酸殘基分別變為N及Y (HCA 雙突變體或HCI dm)。HCI dm連同LCI 及LCII 一起用於產生RTI庫，且在生產培養物中評估該等庫中之抗體表現(圖16A)。該發現顯示，HCI dm連同LCI 之共表現使抗體表現增加至針對HCII LCII 所觀察到之水準，此表明該等突變可恢復HCA 抗體之低表現水準(圖16A)。令人感興趣的是，當與LCII 共表現時，HCI dm所達成之效價甚至高於HCII LCII 之效價，此表明與HCII 相比，HCI dm在表現及摺疊方面更優(圖16A)。如先前所觀察，HCI LCI 具有最低效價，而HCI LCII 展示中間抗體表現譜(圖16A)。西方墨點分析揭示，即使在與HCI dm共表現時，LCI 之表現仍與增加之細胞內BiP累積相關(圖16B)。圖16C繪示RTI系統如何用於在表現難以表現之分子的細胞株中剖析且鑑別問題來源之診斷路線圖。
實例 8 ：含有兩個不同且獨立的著陸墊之 TI 宿主細胞之產生。
宿主8係含有兩個不同且獨立的著陸墊之靶向整合(TI)宿主，該等著陸墊可經靶向以個別地或同時地表現抗體基因。宿主8之親代細胞株係宿主7 (參見表2)，其含有單一著陸墊。將第二著陸墊在著陸墊位於宿主4 TI宿主中之基因體位置處插入至宿主8中(參見表2)。此插入係藉由基於CRISPR/Cas9將新的著陸墊敲入至宿主7 TI宿主內之宿主4 TI位點位置來實施。
為實現此目的，在TI宿主4及TI宿主7內對宿主4 TI位點之基因體區進行表徵。基於此資訊，構築引導RNA以靶向此特定基因體區來促進基於CRISPR/Cas9之敲入。單獨地，產生含有新近產生著陸墊之供體質體以敲入至此位點中且與對應於靶向敲入位點之上游及下游基因體區之同源臂一起構築以促進敲入，且敲入其他基因以容許篩選敲入純系。實施含有gRNA及Cas9基因之質體及供體質體之共轉染以促進基於CRISPR/Cas9之新著陸墊之敲入。
在選擇並篩選經歷基於CRISPR/Cas9之敲入之純系後，最終鑑別宿主8且經歷進一步評估。現有宿主7著陸墊經確定係完整的，且在宿主4位點位置處新近敲入之著陸墊亦確認存在、完整且在正確位置中。
接著針對每一位點個別地評估重組酶介導之盒交換(RMCE)在兩個位點之可行性，且接著同時評估。RMCE在僅宿主7著陸墊、僅宿主4著陸墊及兩個位點同時產生純系，且接著在14天補料分批搖瓶評估中進行評估。與個別地在每一位點處之表現相比，在兩個位點同時表現抗體之純系之效價及比生產力更高。在不同細胞培養製程(亦即細胞培養平台B)中實施進一步評估，以顯示與細胞培養平台A相比之所有純系之額外效價增加(圖17)。在平台A細胞培養下，宿主4位點之平均14天效價為3.0 g/L，宿主7位點為1.9 g/L且兩個位點同時之平均14天效價為3.9 g/L。
最終，TI宿主8係藉由在位於TI宿主4之著陸墊之基因體位置處添加第二著陸墊自TI宿主7產生。進一步研究證實著陸墊之敲入及在現有及新著陸墊兩者處進行RMCE之可行性。此外，對在每一位點個別地且在兩個位點同時地自宿主8產生之純系之評估顯示抗體表現之生產力。相對於每一個別位點，抗體基因在兩個位點處之同時表現具有加性生產力效應，此可在細胞培養平台A及細胞培養平台B二者中觀察到(圖17)。
方法
抗體質體DNA構築體構形：為構築單質體抗體構築體，將抗體HC及LC片段選殖至含有L3及2L序列以及嘌呤黴素N-乙醯基-轉移酶(pac )可選標記物之載體主鏈中。為構築雙質體抗體構築體，將抗體HC及LC片段選殖至含有L3及LoxFAS序列之前端載體主鏈以及含有LoxFAS及2L序列及pac 可選標記物之後端載體中。使用Cre重組酶質體pOG231 (Wong ET等人，Nucleic Acids Res 2005, 33, (17), e147；O'Gorman S等人，Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94, (26), 14602-7，其各自之內容係以引用的方式併入本文中)用於所有RMCE過程。
細胞培養：於125 mL搖瓶容器中將CHO細胞於基於DMEM/F12之專有培養基中在150 rpm、37℃及5% CO2 下振盪培養。每3-4天以3×105 個細胞/mL之接種密度使細胞傳代。
RMCE穩定細胞株開發：藉由MaxCyte STX®電穿孔(MaxCyte, Gaithersburg, MD)將表現質體轉染至TI宿主中。接著利用嘌呤黴素及1-(2'-去氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基-5-碘)尿嘧啶(FIAU) (Moravek)選擇RMCE轉染庫。在庫選擇之後，實施單細胞選殖(SCC)以產生TI細胞株用於進一步評估。
補料分批生產分析：於搖瓶或ambr15容器(Sartorius Stedim)中利用專有化學限定之生產培養基來實施補料分批生產培養。在第0天以1×106 個細胞/mL接種細胞，其中在第3天溫度自37℃變至35℃。在第3天、第7天及第10天，培養物接受專有補料培養基。在第0天、第3天、第7天、第10天及第14天使用Vi-Cell™ XR儀器(Beckman Coulter)量測培養物中之活細胞計數(VCC)及細胞存活率百分比。在第7天、第10天及第14天使用Bioprofile 400分析儀(Nova Biomedical)來量測葡萄糖及乳酸鹽濃度。使用蛋白質A親和層析利用UV偵測來測定第14天效價。
藉由液滴PCR測定基因拷貝數：使用ddPCR™ Supermix套組(Bio-Rad)實施液滴PCR分析。每一ddPCR反應液含有ddPCR混合母液、900 nM正向引子、900 nM反向引子、250 uM探針、3單位HaeIII限制酶及樣品DNA。在室溫下培育10 min後，利用自動液滴產生器(Bio-Rad)產生液滴。PCR熱循環條件為在95℃下10 min，之後為94℃下30 sec及60℃下1 min之40個循環，接著98℃下10 min以使酶鈍化。PCR反應後，在QX200TM液滴讀數器(Bio-Rad)上讀取液滴。收集數據且使用Quanta軟體進行分析。基於參考基因Bax、白蛋白、Hprt及b-微球蛋白之確定拷貝數正規化HC及LC基因拷貝數。使用Primer Express v3.0 (Life Technologies)設計此研究中所用之引子。引子之序列列示於表4中。
表 4. 用於液滴 PCR 之引子序列。
定量即時PCR (qRT-PCR或Taqman)分析：根據製造商之說明書，使用Qiagen RNeasy plus mini套組純化來自種子培養培養物之RNA樣品。使用TaqMan One® Step RT-PCR混合母液套組(Life Technologies)來實施TaqMan RT-PCR分析。每一RT-TaqMan PCR反應液含有RT-PCR混合母液、反轉錄酶、300 nM正向引子、300 nM反向引子、100 nM探針及10 ng經純化之RNA樣品。熱循環條件為在48℃下30 min且在95℃下10 min，之後為95℃下15 sec及60℃下1 min之40個循環。所有反應均在7900 HT快速即時PCR系統(Life Technologies)上處理。在TaqMan RT-PCR擴增之後，使用SDS v2.4軟體(Life Technologies)分析數據。基於ΔCt分析方法測定HC及LC之相對表現水準。使用看家基因親環素之表現水準作為參考基因以正規化每一反應液中之不同RNA樣品。使用primer express v3.0 (Life Technologies)設計此研究中所用之引子。引子之序列列示於表5中。
表 5. 用於定量即時 PCR 之引子序列
西方墨點分析：將來自種子培養培養物之細胞糰粒用PBS洗滌且與蛋白酶抑制劑之mini cOmplete™混合液(Roche)一起重新懸浮於NP-40溶解緩衝液中。使細胞溶解物在13000 RPM下離心10分鐘且收集上清液。使用Pierce BCA蛋白質分析套組(Thermo Scientific)測定每一溶解物之蛋白質濃度。使相等蛋白質濃度之每一溶解物與SDS-PAGE緩衝液及NuPage樣品還原劑(Invitrogen)混合，之後在95℃下熱變性5分鐘。接著將溶解物加載至NuPage預製4%-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上且進行電泳。使用iBlot系統(Invitrogen)將蛋白質轉移至硝化纖維素膜上。使用於含有0.1% Tween 20之tris緩衝鹽水(TBS-T)中之5%脫脂乳溶液將膜在室溫下封阻1小時。封阻之後，使用特異性一級抗體將膜在室溫下培育1小時，且接著用TBS-T洗滌3次達10分鐘。在室溫下添加二級辣根過氧化物酶結合之抗體1小時，之後用TBS-T洗滌3次，每次15分鐘。使用Amersham ECL偵測試劑或Amersham ECL Prime偵測試劑(GE Life Sciences)使膜顯影。使用Image Lab 5.1 (Biorad)用於帶信號量化。使用以下一級抗體：1:3000山羊抗人類IgG-HRP (MP Biomedicals)及1:2500小鼠抗β肌動蛋白(Sigma Alrdich)。使用以下二級抗體：1:10000綿羊抗小鼠(GE Healthcare UK)。
實例 9 ：向一重鏈一輕鏈質體 DNA 構形添加額外之輕鏈改良抗體效價及比生產力。
為檢驗在TI宿主中抗體拷貝數對生產力之效應，藉由轉染含有一條重鏈及一條輕鏈(HL構形)或一條重鏈及兩條輕鏈(HLL構形)之單質體來產生RMCE庫。在藉由流式細胞術選擇、回收且驗證RMCE後，於14天補料分批生產分析中評估各庫之生產力。對於三種單獨抗體(mAb-Q、mAb-S及mAb-T)，觀察到與HL庫相比，HLL庫之效價增加大約2倍，此在很大程度上係由比生產力增加1.5至2.5倍所驅動(圖18A及18B)。藉由使用有限稀釋法自轉染庫產生其他單細胞純系，且確認源自HLL構形之純系之效價及比生產力亦高於來自HL構形之彼等純系(圖18C、18D)。
實例 10 ：在 RMCE 庫中以多達七條抗體鏈進行轉染增加抗體比生產力及效價。
評估增加抗體鏈數對抗體表現之效應。比較五種抗體之HLL單質體構形與HLL-HL或HLL-HLL雙質體構形。
比較mAb Y之HLL-HL (五鏈)、HLL-HLL (六鏈)及HLL-HLHL (七鏈)構形。生產中之RMCE庫之效價及Qp通常自HLL-HL至HLL-HLL及HLL-HLHL構形增加(圖19A、19B)，而不同庫之間的生長(表示為活細胞計數積分(IVCC))相對等值(圖19C)。觀察該等庫中之種子培養抗體mRNA表現，觀察到輕鏈mRNA自HLL-HL至HLL-HLL及HLL-HLHL增加，且與HLL-HL及HLL-HLL庫相比，HLL-HLHL庫中之重鏈mRNA增加(圖19D)。亦使用西方墨點量測來自該等RMCE庫之重鏈及輕鏈之細胞內蛋白質水準。細胞內輕鏈蛋白質水準與輕鏈mRNA之觀察結果極匹配，自五鏈至六鏈及七鏈構形增加(圖19E、19F)。
實例 11 ：具有七鏈 HLL-HLHL 構形之單細胞純系在兩種測試抗體中具有高效價及比生產力。
為評估七鏈構形HLL-HLHL之高效價及生產力是否在單細胞選殖後得以維持，產生來自mAb Y之HLL-HL、HLL-HLL及HLL-HLHL RMCE庫之單細胞單純系。接著於14天補料分批生產分析中評估該等單純系。觀察來自每一構形之6種優勢純系，發現效價及Qp自HLL-HL構形至HLL-HLL及HLL-HLHL略微增加(圖20A、20B)，同時生長保持相似(圖20C)。
為確認HLL-HLHL構形產生高單純系效價，使用不同mAb (亦即mAb III)自HLL-HL (五鏈)及HLL-HLHL (七鏈) RMCE庫產生源自宿主4之單細胞純系。在14天補料分批生產分析中評估後，觀察到HLL-HLHL純系相對於HLL-HL純系之明顯效價優勢(圖20D)，此大於mAb U所見之效價優勢。效價增加似乎主要由HLL-HLHL純系之較高Qp驅動(圖20E)，其中在兩種構形之間IVCC之平均差異極小(圖20F)。
實例 12 ：轉染質體中之抗體鏈位置影響其生產力。
亦評估轉染質體中重鏈及輕鏈之位置或排列對抗體表現之效應。為此，利用含有mAb Z之若干不同構形之一條重鏈及一條輕鏈之質體來產生RMCE庫。由於本揭示案之TI宿主支持在同一整合位點整合兩種不同質體，故檢查在重鏈及輕鏈二者自同一質體表現時以及其在前端或後端不同質體上分開時之位置效應(圖21A)。
在產生RMCE庫之後，量測種子培養培養物中抗體Z重鏈及輕鏈之mRNA表現水準。當重鏈在輕鏈後面時，重鏈之mRNA表現降低，前端及後端質體二者中之LH構形之重鏈mRNA表現低於HL構形。然而，位置對輕鏈之效應取決於其之表現質體：在前端質體中，相對於HL，LH構形中之輕鏈mRNA表現增加，但在後端質體中則相反。亦觀察到，在前端質體中輕鏈盒自身表現高水準之輕鏈mRNA時，後端質體中之單一輕鏈盒之任何構形均具有最低之輕鏈mRNA水準(圖21B)。一般而言，觀察到與前端質體相比，後端質體中之重鏈及輕鏈二者之mRNA表現水準較低。
該等不同RMCE庫之補料分批生產分析產生一系列與抗體mRNA表現趨勢類似之效價及比生產力(圖21C、21D)。LH-無mAb構形具有高於HL-無mAb之Qp及效價，而LC mRNA表現水準最低之庫(亦即H-L及無mAb-LH)亦具有最低之Qp及效價。
為確認所觀察到之mRNA及抗體生產力差異係由於抗體鏈位置而非絕對拷貝數之變化所致，使用數位液滴PCR來量測各庫之重鏈及輕鏈拷貝數。如所預期，所有庫均具有大約一條重鏈及一條輕鏈DNA拷貝(圖21E)。
實例 13 ： HC 對 LC 比率對 mAb 上高分子量物質 % 之效應。
評估抗體之HC:LC比率對生產力及對高分子量物質(HMWS，諸如聚集體)之效應。此外，藉由使用具有不同TI位點之細胞評估對TI位點之效應。為此，藉由在TI宿主4或宿主7位置中轉染含有一條重鏈及一條輕鏈(HL構形)或一條重鏈及兩條輕鏈(HLL構形)之單質體來產生RMCE庫。於14天補料分批生產分析中評估各庫之生產力(圖22A及圖22B)。評估HMWS% (圖22B及圖22D)，顯示HC:LC比率之效應與整合位點無關。
評估mAb IV之增加抗體LC拷貝對生產力及對高分子量物質(HMWS)之效應。為此，藉由在宿主4位點位置中或在宿主4及7位點位置中轉染含有一條重鏈及一條輕鏈(HL構形)、一條重鏈及兩條輕鏈(HLL構形)、兩條重鏈及三條輕鏈(HLL-HL構形)、兩條重鏈及四條輕鏈(HLL-HLL構形)、兩條重鏈及五條輕鏈(HLL-HLLL構形)、三條重鏈及6條輕鏈(HLLL-HLLHL構形)或三條重鏈及7條輕鏈(HLLL-HLLHLL構形)之單質體來產生RMCE庫(圖23及圖24)。
經由多個效價及生產評估分析，在具有特定生產製程之ambr15生產評估中鑑別且評估多個純系。自此評估中，選擇藉由細胞培養效能、效價及產物品質屬性(包括聚集百分比)鑑別出之10種優勢純系進行建庫以用於進一步評估。最終，產生2位點整合細胞株，其以高效價、更低之聚集百分比及與先前所產生之mAb-VI細胞株相當之生產品質表現mAb-VI。圖25顯示效價為8.4 g/L及8.7 g/L之2種優勢純系，其聚集體分別為7.4%及5.6%。
實例 14 ：受調控之靶向整合：純系評估。
在此實驗中，在實施編碼抗體Z之序列之受調控靶向整合之後，評估該抗體在受調控之宿主4衍生物中之表現。用於調控抗體Z之表現之系統係由3個關鍵組分構成以容許表現抗體Z：1) 受調控之啟動子，其在信號序列之前包括串聯tet操縱子序列，2) 啟動子及Tet抑制蛋白編碼序列，及3) 誘導物(諸如去氧羥四環素)。
在確認編碼抗體Z之序列之靶向整合後，在搖瓶製程中實施純系評估。在第3天、第7天及第10天實施(總體積)之10%饋料。進行一次生產培養物分析以評估純系。在第0天，以3 × 106 個細胞/mL之接種密度接種所有純系。在第3天、第7天及第10天，向所有36種培養物添加1 µg/mL去氧羥四環素以誘導抗體Z之表現。
最終效價及比生產力(Qp)分別示於圖26及圖27中。第14天收穫細胞培養液(HCCF)被呈送以進行效價分析。效價範圍為1 g/L至3.68 g/L (不包括純系7)。首先按效價對用於建庫之純系選擇進行排序，且最終選擇係基於細胞培養效能，包括Qp及其他參數。所選用於建庫之純系產生2.69 g/L至3.68 g/L範圍內之效價。
除所繪示及主張之各個實施例以外，所揭示之標的物亦係關於具有本文所揭示及主張特徵之其他組合之其他實施例。因此，本文所呈現之具體特徵可以所揭示標的物範圍內之其他方式彼此組合，從而使得所揭示之標的物包括本文所揭示特徵之任一適宜組合。出於說明及描述之目的，已呈現對所揭示標的物之特定實施例之先前描述。本文並不意欲為窮盡性的或將所揭示之標的物限於所揭示之彼等實施例。
熟習此項技術者將明瞭，可在不背離所揭示標的物之精神或範圍之情形下對所揭示標的物之組成及方法作出各種修改及變化。因此，所揭示標的物意欲包括在隨附申請專利範圍及其等效內容之範圍內之修改及變化。
本文引用各種公開案、專利及專利申請案，其內容在此以全文引用的方式併入。
圖 1 係顯示用於鑑別CHO TI基因座之全基因體篩選步驟概述之圖表，該等CHO TI基因座容許抗體之穩定及高表現。
圖 2A 及圖 2B 繪示用於產生目標抗體表現群體之兩種雙選擇方案。圖2A中繪示轉位酶產生之TI宿主且圖2B中繪示隨機整合產生之TI宿主。
圖 3 繪示由兩種特定TI宿主產生之優勢純系之生產力。
圖 4 繪示雙質體RMCE策略，該策略涉及使用三個RRS位點以同時實施兩次獨立的RMCE。一個載體(前端)包含RRS1、第一SOI及啟動子(P)，之後為起始密碼子(ATG)及RRS3。另一載體(後端)包含與無起始密碼子(ATG)之標記物之編碼序列融合之RRS3、SOI 2及RRS2。僅在該兩種質體均正確靶向時，選擇標記物之完整表現盒才能組裝，由此使細胞對選擇具有抗性。
圖 5 繪示關於抗體D、E、F、G及J之表現，使用單一載體或雙載體RMCE之結果。評價FACS、基因體PCR及基因拷貝分析以確認兩個質體盒均正確靶向至TI位點。與單質體RMCE相比，在雙質體RMCE中，更多的總HC及LC拷貝靶向至TI位點。
圖 6 繪示六種分子之效價。
圖 7 繪示使用雙載體RMCE來表現複合mAb形式之結果。分析兩種雙特異性分子(各自需要四條不同鏈(兩條HC及兩條LC))之產生及雙特異性形成%。在兩種情形下，開發出展現＞1.5 g/L及＞80%雙特異性物含量之細胞株。
圖 8 繪示四種雙特異性分子之第14天效價。
圖 9A 及圖 9B 繪示在RTI系統中表現mAb-I或mAb-II之細胞株之產生。圖9A中繪示細胞株開發之組織學結果，且圖9B中繪示RTI細胞株開發(CLD)過程之示意圖。
圖 10A 至圖 10C 繪示表現mAb-I或mAb-II之細胞株之效價及比生產力結果。圖10A中繪示生產終點效價，圖10B中繪示生產終點IVCC且圖10C中繪示生產終點比生產力。
圖 11A 及圖 11B 繪示mAb-I及mAb-II表現細胞株之HC及LC mRNA之表現水準。圖11A中繪示HC mRNA之表現水準，且圖11B中繪示HL mRNA之表現水準。
圖 12A 至圖 12D 繪示表現mAb-I或mAb-II之細胞株中HC、HL及BiP分子之細胞內水準。圖12A中繪示環己醯亞胺及Dox對RTI系統之效應之示意圖。圖12B中繪示表現mAb-A或mAb-B之細胞株之細胞內HC、LC及BiP水準以及上清液中之HC及LC水準。圖12C中繪示在隔夜CHX處理之後，表現mAb-I或mAb-II之細胞株之細胞內HC、LC及BiP水準。圖12D中繪示在自培養基去除去氧羥四環素之後，表現mAb-I或mAb-II之細胞株之細胞內HC、LC及BiP水準。
圖 13A 至圖 13D 繪示BiP之細胞內累積與mAb-I LC表現之間的相關性。圖13A中繪示生產終點效價，且圖13B中繪示HC、LC及BiP之累積。圖13C中繪示鏈交換實驗之示意圖。圖13D中繪示表現mAb-I、mAb-II或該等分子之鏈交換形式之RTI庫(pool)之細胞內HC、LC及BiP水準。
圖 14A 至圖 14C 繪示mAb-A HC及HL對此分子之庫表現之貢獻。圖14A中繪示生產終點效價，圖13B中繪示生產終點IVCC且圖14C中繪示生產終點比生產力。
圖 15A 至圖 15B 繪示可導致表現較差之LC及HC之CDR區。圖15A中繪示mAb-I及mAb-II LC次單元之示意圖。圖15B中繪示mAb-I及mAb-II HC區之示意圖。
圖 16A 至圖 16C 繪示關於HCA 之表現，在HC恆定區中使用兩個點突變之結果。圖16A中繪示mAb-I及mAb-II HC與LC次單元之間的各種鏈交換之生產終點效價。圖16B中繪示各種RTI庫之細胞內HC、LC及BiP水準。圖16C中繪示利用RTI系統作為用於低蛋白質表現之診斷工具之示意圖。
圖 17 繪示使用兩種不同的細胞培養過程之生產。
圖 18A 至圖 18D 繪示三種mAb之RMCE庫之效價及比生產力結果。圖18A中繪示比較HL及HLL構形之三種mAb之RMCE庫的第14天效價。圖18B中繪示比較HL及HLL構形之三種mAb之RMCE庫的第14天比生產力(Qp)。圖18C中繪示自圖18A之庫產生的純系之第14天效價。圖18D中繪示自圖18A之庫產生的純系之第14天Qp。在圖18C及圖18D中，每種構形測試六種純系。
圖 19A 至圖 19F 繪示比較三種不同質體構形之mAb Y之RMCE庫之效價、Qp及生長(如由活細胞濃度之積分IVCC所表示)、mRNA表現及蛋白質表現。圖19A、圖19B及圖19C中分別繪示第14天效價、Qp及生長(如由活細胞濃度之積分IVCC所表示)。每一條形代表來自單一庫之數據。來自19A中之庫之種子培養(seed train) mRNA表現及細胞內抗體蛋白質表現。將重鏈及輕鏈之mRNA表現正規化為HLL-HL構形；每一條形為重鏈及輕鏈之四個技術重複mRNA表現平均值(誤差槓係標準偏差)正規化為HLL-HL構形。圖19E中繪示來自所有自西方墨點(western blot)量化且正規化為HLL-HL構形之庫之細胞內重鏈及輕鏈蛋白質表現；每一條形係三個技術重複之平均值(誤差槓係標準偏差)。圖19F中繪示圖19E中所示數據之代表性西方墨點影像。
圖 20A 至圖 20F 繪示自具有三種不同構形之RMCE庫所產生之表現mAb Y或mAb III之單純系之效價、Qp及生長(如由活細胞濃度之積分IVCC所表示)。圖20A中繪示表現mAb Y之單純系之第14天效價。圖20B中繪示表現mAb Y之單純系之第14天Qp。圖20C中繪示表現mAb Y之純系之第14天IVCC。圖20D中繪示表現mAb III之單純系之第14天效價。圖20E中繪示表現mAb III之單純系之第14天Qp。圖20F中繪示表現mAb III之純系之第14天IVCC。
圖 21A 至圖 21E 繪示各種構形之RMCE庫之表現水準、效價及Qp。圖21A中繪示轉染一重鏈一輕鏈質體以評價質體位置對鏈表現之效應之示意圖。抗體重鏈(縮寫為H)及輕鏈(縮寫為L)在同一質體上表現或在前端質體與後端質體之間分開。如同後端質體中之pac 嘌呤黴素抗性基因，亦注意到L3、Loxfas及2L位點。圖23B中繪示來自DNA構形概述於圖21A中之庫之重鏈及輕鏈之種子培養mRNA表現。圖21C中繪示各種構形之RMCE庫之第14天效價。圖21D中繪示各種構形之第14天Qp。圖21E中繪示各庫之重鏈及輕鏈DNA拷貝數。
圖 22A 至圖 22D 繪示HC:LC比率對mAb之高分子量物質(HMWS)百分比之效應與TI位點無關。圖22A中繪示宿主7細胞上之抗體S之第14天效價。圖22B中繪示宿主7細胞上之抗體S之高分子量物質(HMWS)百分比。圖22C中繪示宿主4細胞上之抗體S之第14天效價。圖22D中繪示宿主4細胞上之抗體S之高分子量物質(HMWS)百分比。
圖 23A 及圖 23B 繪示HC:LC比率對抗體IV之生產力及高分子量物質(HMWS)之效應。圖23A中繪示宿主4細胞上之抗體IV之第14天效價。圖23D中繪示宿主4細胞上之抗體IV之高分子量物質(HMWS)百分比。
圖 24A 及圖 24B 繪示在雙位點TI宿主細胞中HC:LC比率對抗體VI之生產力及高分子量物質(HMWS)之效應。圖24A中繪示雙位點TI宿主細胞上之抗體VI之第14天效價。圖24B中繪示雙位點TI宿主細胞上之抗體VI之高分子量物質(HMWS)百分比。
圖 25 繪示效價為8.4 g/L及8.7 g/L之2個純系，其聚集體分別為7.4%及5.6%。
圖 26 繪示不同受調控之靶向整合細胞株中抗體Z之第14天效價。
圖 27 不同受調控之靶向整合細胞株中抗體Z之比生產力。

Claims (77)

  1. 一種包含外源核苷酸序列之靶向整合(TI)宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之特定基因座內之整合位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源。
  2. 如申請專利範圍第1項之TI宿主細胞，其中緊接該經整合之外源核苷酸序列之5’的核苷酸序列係選自由與以下各項至少約90%同源之序列組成之群：NW_006874047.1之核苷酸41190-45269、NW_006884592.1之核苷酸63590-207911、NW_006881296.1之核苷酸253831-491909、NW_003616412.1之核苷酸69303-79768、NW_003615063.1之核苷酸293481-315265、NW_006882936.1之核苷酸2650443-2662054或NW_003615411.1之核苷酸82214-97705。
  3. 如申請專利範圍第1項之TI宿主細胞，其中緊接該經整合之外源核苷酸序列之5’的核苷酸序列係選自由來自NW_006874047.1之核苷酸45269、NW_006884592.1之核苷酸207911、NW_006881296.1之核苷酸491909、NW_003616412.1之核苷酸79768、NW_003615063.1之核苷酸315265、NW_006882936.1之核苷酸2662054或NW_003615411.1之核苷酸97705之至少15個鹼基對、至少20個鹼基對、至少30個鹼基對、至少40個鹼基對、至少50個鹼基對、至少75個鹼基對、至少100個鹼基對、至少150個鹼基對、至少200個鹼基對、至少300個鹼基對、至少400個鹼基對、至少500個鹼基對、至少1,000個鹼基對、至少1,500個鹼基對、至少2,000個鹼基對、至少3,000個鹼基對之序列組成之群。
  4. 如申請專利範圍第1項之TI宿主細胞，其中緊接該經整合之外源核苷酸序列之3’的核苷酸序列係選自由與以下各項至少約90%同源之序列組成之群：NW_006874047.1之核苷酸45270-45490、NW_006884592.1之核苷酸207912-792374、NW_006881296.1之核苷酸491910-667813、NW_003616412.1之核苷酸79769-100059、NW_003615063.1之核苷酸315266-362442、NW_006882936.1之核苷酸2662055-2701768或NW_003615411.1之核苷酸97706-105117。
  5. 如申請專利範圍第1項之TI宿主細胞，其中緊接該經整合之外源核苷酸序列之3’的核苷酸序列係選自由來自NW_006874047.1之核苷酸45270、NW_006884592.1之核苷酸207912、NW_006881296.1之核苷酸491910、NW_003616412.1之核苷酸79769、NW_003615063.1之核苷酸315266、NW_006882936.1之核苷酸2662055或NW_003615411.1之核苷酸97706之至少15個鹼基對、至少20個鹼基對、至少30個鹼基對、至少40個鹼基對、至少50個鹼基對、至少75個鹼基對、至少100個鹼基對、至少150個鹼基對、至少200個鹼基對、至少300個鹼基對、至少400個鹼基對、至少500個鹼基對、至少1,000個鹼基對、至少1,500個鹼基對、至少2,000個鹼基對、至少3,000個鹼基對之序列組成之群。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之TI宿主細胞，其中該經整合之外源核苷酸序列可操作地連接至選自由與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之序列組成之群的核苷酸序列。
  7. 一種包含外源核苷酸序列之靶向整合(TI)宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之整合位點處：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
  8. 一種包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列所整合之整合位點可操作地連接至選自由以下組成之群之內源基因：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
  9. 一種包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列所整合之整合位點緊鄰選自由與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源之序列組成之群的序列之全部或一部分。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之TI宿主細胞，其中該TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。
  11. 如申請專利範圍第10項之TI宿主細胞，其中該TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  12. 如申請專利範圍第10項或第11項之TI宿主細胞，其中該TI宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
  13. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列包含一或多個重組識別序列(RRS)，其中該RRS可由重組酶識別。
  14. 如申請專利範圍第13項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列包含至少兩個RRS。
  15. 如申請專利範圍第13項或第14項之TI宿主細胞，其中該重組酶係Cre重組酶或FLP重組酶。
  16. 如申請專利範圍第13項或第14項之TI宿主細胞，其中該重組酶係Bxb1整合酶或φC31整合酶。
  17. 如申請專利範圍第13項至第16項中任一項之TI宿主細胞，其中該RRS係選自由以下組成之群：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、φC31 attP序列及φC31 attB序列。
  18. 如申請專利範圍第14項至第17項中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列包含第一及第二RRS以及至少一種位於該第一與該第二RRS之間的選擇標記物。
  19. 如申請專利範圍第18項之TI宿主細胞，其包含第一選擇標記物，其中該第一選擇標記物係選自由以下組成之群：胺基醣苷磷酸轉移酶(APH)、潮黴素(hygromycin)磷酸轉移酶(HYG)、新黴素(neomycin)、G418 APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、麩醯胺酸合成酶(GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、組胺醇去氫酶(組胺醇D)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、博來黴素(bleomycin)、腐草黴素(phleomycin)、氯黴素(chloramphenicol)、吉歐黴素(Zeocin)及黴酚酸(mycophenolic acid)。
  20. 如申請專利範圍第18項或第19項之TI宿主細胞，其進一步包含第二選擇標記物，其中該第一與該第二選擇標記物不同。
  21. 如申請專利範圍第20項之TI宿主細胞，其中該第二選擇標記物係選自由以下組成之群：胺基醣苷磷酸轉移酶(APH)、潮黴素磷酸轉移酶(HYG)、新黴素、G418 APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、麩醯胺酸合成酶(GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、組胺醇去氫酶(組胺醇D)、殺稻瘟菌素、博來黴素、腐草黴素、氯黴素、吉歐黴素及黴酚酸。
  22. 如申請專利範圍第20項或第21項之TI宿主細胞，其進一步包含第三選擇標記物及內部核糖體進入位點(IRES)，其中該IRES可操作地連接至該第三選擇標記物。
  23. 如申請專利範圍第22項之TI宿主細胞，其中該第三選擇標記物不同於該第一或該第二選擇標記物。
  24. 如申請專利範圍第22項或第23項之TI宿主細胞，其中該第三選擇標記物係選自由以下組成之群：綠色螢光蛋白(GFP)標記物、增強之GFP (eGFP)標記物、合成GFP標記物、黃色螢光蛋白(YFP)標記物、增強之YFP (eYFP)標記物、青色螢光蛋白(CFP)標記物、mPlum標記物、mCherry標記物、tdTomato標記物、mStrawberry標記物、J-red標記物、DsRed-單體標記物、mOrange標記物、mKO標記物、mCitrine標記物、Venus標記物、YPet標記物、Emerald6標記物、CyPet標記物、mCFPm標記物、Cerulean標記物及T-Sapphire標記物。
  25. 如申請專利範圍第18項至第24項中任一項之TI宿主細胞，其進一步包含第三RRS，其中該第三RRS位於該第一與該第二RRS之間，且該第三RRS相對於該第一或該第二RRS係異種特異性的。
  26. 如申請專利範圍第13項至第25項中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記物及至少一個外源所關注序列(SOI)。
  27. 如申請專利範圍第13項至第26項中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列進一步包含至少一個外源SOI。
  28. 如申請專利範圍第27項之TI宿主細胞，其中該外源SOI位於該第一與該第二RRS之間。
  29. 如申請專利範圍第27項或第28項之TI宿主細胞，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  30. 如申請專利範圍第25項至第29項中任一項之TI宿主細胞，其中該外源核苷酸序列進一步包含至少一個位於該第一與該第三RRS之間的外源SOI以及至少一個位於該第三與該第二RRS之間的外源SOI。
  31. 如申請專利範圍第30項之TI宿主細胞，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  32. 一種製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括： a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含兩個RRS，該兩個RRS側接至少一個第一選擇標記物； b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物； c) 引入重組酶或編碼重組酶之核酸，其中該重組酶識別該等RRS；及 d) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該多肽之TI宿主細胞。
  33. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該重組酶係Cre重組酶或FLP重組酶。
  34. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該重組酶係Bxb1整合酶或φC31整合酶。
  35. 如申請專利範圍第32項至第34項中任一項之方法，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  36. 如申請專利範圍第32項至第35項中任一項之方法，其中該TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。
  37. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  38. 如申請專利範圍第36項或第37項之方法，其中該TI宿主細胞係CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
  39. 一種表現所關注多肽之方法，其包括： a) 提供包含至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物之TI宿主細胞，其中該至少一個外源SOI及至少一個選擇標記物側接有兩個RRS，其整合在該TI宿主細胞基因體之基因座內，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；及 b) 在適於表現該所關注多肽之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。
  40. 一種製備表現至少第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括： a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的； b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物； c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI； d) 引入一或多種重組酶，或編碼一或多種重組酶之一或多種核酸，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及 e) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。
  41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該重組酶係Cre重組酶或FLP重組酶。
  42. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該重組酶係Bxb1整合酶或φC31整合酶。
  43. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該第一載體進一步包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接該第一SOI且下游側接RRS；且該第二載體進一步包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接該第二SOI。
  44. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該至少一個SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  45. 如申請專利範圍第40項至第43項中任一項之方法，其中該第一SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  46. 如申請專利範圍第40項至第43項中任一項之方法，其中該第二SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  47. 如申請專利範圍第39項至第46項中任一項之方法，其中該TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。
  48. 如申請專利範圍第47項之方法，其中該TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  49. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該TI宿主細胞係CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
  50. 一種表現所關注多肽之方法，其包括： a) 提供包含至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物之宿主細胞，該至少兩個外源SOI及至少一個選擇標記物整合在該宿主細胞基因體之基因座內，其中該基因座與選自SEQ ID No 1-7之序列至少約90%同源，其中至少一個外源SOI及一個選擇標記物側接有第一及第三RRS且至少一個外源SOI側接有第二及該第三RRS；及 b) 在適於表現該所關注多肽之條件下培養a)中之該細胞且自其回收所關注多肽。
  51. 一種載體，其包含與以下至少50%同源之兩個核苷酸序列： a. 選自SEQ ID No. 1之任一部分之兩個參照序列； b. 選自SEQ ID No. 2之任一部分之兩個參照序列； c. 選自SEQ ID No. 3之任一部分之兩個參照序列； d. 選自SEQ ID No. 4之任一部分之兩個參照序列； e. 選自SEQ ID No 5之任一部分之兩個參照序列； f. 選自SEQ ID No. 6之任一部分之兩個參照序列；或 g. 選自SEQ ID No. 7之任一部分之兩個參照序列， 其中該等序列側接DNA盒，且其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI。
  52. 如申請專利範圍第51項之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
  53. 如申請專利範圍第51項或第52項之載體，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  54. 一種製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括： a) 提供宿主細胞，其包含該宿主細胞基因體之基因座，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源； b) 向該宿主細胞中引入載體，其中該載體包含側接DNA盒之與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少50%同源之核苷酸序列，其中該DNA盒包含兩側為兩個RRS之至少一個選擇標記物及至少一個外源SOI；及 c) 針對該選擇標記物進行選擇以分離該SOI整合於該基因體之該基因座中且表現該所關注多肽之TI宿主細胞。
  55. 如申請專利範圍第54項之方法，其中該載體係選自由以下組成之群：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
  56. 如申請專利範圍第54項或第55項之方法，其中該至少一個SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  57. 如申請專利範圍第53項至第56項中任一項之方法，其中該TI宿主細胞係哺乳動物宿主細胞。
  58. 如申請專利範圍第57項之方法，其中該TI宿主細胞係倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  59. 如申請專利範圍第57項或第58項之方法，其中該TI宿主細胞係CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
  60. 如申請專利範圍第54項至第57項中任一項之方法，其中藉由外源核酸酶來促進包含該至少一個SOI及選擇標記物之該核酸之整合。
  61. 如申請專利範圍第57項之方法，其中該外源核酸酶係選自由以下組成之群：鋅指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚體、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)、TAL效應物結構域融合蛋白、RNA引導之DNA核酸內切酶、經改造之大範圍核酸酶及成簇規律間隔之短迴文重複序列(CRISPR)關聯蛋白(Cas)核酸內切酶。
  62. 一種包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之一或多個特定基因座內之整合位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源。
  63. 一種包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在選自由以下組成之群之內源基因內之一或多個整合位點處：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及與其至少約90%同源之序列。
  64. 如申請專利範圍第62項至第63項中任一項之TI宿主細胞，其中該至少一個外源核苷酸序列包含一或多個重組識別序列(RRS)，其中該RRS可由重組酶識別。
  65. 如申請專利範圍第64項之TI宿主細胞，其中該至少一個外源核苷酸序列進一步包含至少一個外源SOI。
  66. 一種製備表現至少一種所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括： e) 提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中該一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該至少一個外源核苷酸序列包含兩個RRS，該兩個RRS側接至少一個第一選擇標記物； f) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之兩個RRS匹配且側接至少一個外源SOI及至少一個第二選擇標記物； g) 引入重組酶或編碼重組酶之核酸，其中該重組酶識別該等RRS；及 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該至少一種所關注多肽之TI宿主細胞。
  67. 一種製備表現至少一種第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括： a) 提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含側接至少一個第一選擇標記物之第一及第二RRS，及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的； b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該至少一個經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記物； c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該至少一個經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個第二外源SOI； d) 引入一或多種重組酶，或編碼一或多種重組酶之一或多種核酸，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及 e) 選擇表現該第二選擇標記物之TI細胞以藉此分離表現該至少一種第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。
  68. 一種製備表現所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括： a) 提供包含至少一個外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該至少一個外源核苷酸序列整合在該TI宿主細胞基因體之一或多個基因座內之位點處，其中該一或多個基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含一或多個RRS； b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含一或多個RRS之載體，該一或多個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之一或多個RRS匹配且側接至少一個外源SOI且可操作地連接至至少一個可調控啟動子； c) 引入重組酶或編碼重組酶之核酸，其中該重組酶識別該等RRS；及 d) 在誘導物存在下選擇表現該外源所關注多肽之TI細胞以藉此分離表現該所關注多肽之TI宿主細胞。
  69. 一種表現所關注多肽之方法，其包括： a) 提供宿主細胞，其包含整合在該宿主細胞基因體之基因座內之至少一個外源SOI，該至少一個外源SOI側接有兩個RRS及一個可調控啟動子，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源；及 b) 在適於表現該SOI之條件下培養該細胞且自其回收所關注多肽。
  70. 一種製備表現第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞之方法，其包括： a) 提供包含外源核苷酸序列之TI宿主細胞，該外源核苷酸序列整合在該宿主細胞基因體之基因座內位點處，其中該基因座與選自SEQ ID No. 1-7之序列至少約90%同源，其中該外源核苷酸序列包含第一、第二RRS及位於該第一與該第二RRS之間的第三RRS，且所有RRS均係異種特異性的； b) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第一載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第一及該第三RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之第一外源SOI； c) 向a)中所提供之該細胞中引入包含兩個RRS之第二載體，該兩個RRS與該經整合之外源核苷酸序列上之該第二及該第三RRS匹配且側接至少一個可操作地連接至可調控啟動子之第二外源SOI； d) 引入一或多種重組酶，或編碼一或多種重組酶之一或多種核酸，其中該一或多種重組酶識別該等RRS；及 e) 在誘導物存在下選擇表現該第一及第二外源所關注多肽之TI細胞以藉此分離表現該第一及第二所關注多肽之TI宿主細胞。
  71. 如申請專利範圍第66項、第68項及第69項中任一項之方法，其中藉由外源核酸酶來促進包含至少一個SOI之核酸之整合。
  72. 如申請專利範圍第67項或第70項之方法，其中該第一SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白；且該第二SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  73. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該外源核酸酶係選自由以下組成之群：鋅指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚體、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)、TAL效應物結構域融合蛋白、RNA引導之DNA核酸內切酶、經改造之大範圍核酸酶及成簇規律間隔之短迴文重複序列(CRISPR)關聯蛋白(Cas)核酸內切酶。
  74. 如申請專利範圍第66項至第70項中任一項之方法，其中該可調控啟動子係選自由SV40及CMV啟動子組成之群。
  75. 如申請專利範圍第67項及第70項中任一項之方法，其中： a. 該第一載體進一步包含可操作地連接至密碼子ATG之啟動子序列，該啟動子序列之位置為上游側接該第一SOI且下游側接RRS；且 b. 該第二載體進一步包含缺少ATG轉錄起始密碼子之選擇標記物，該選擇標記物上游側接RRS且下游側接該第二SOI。
  76. 一種載體，其包含與選自SEQ ID No. 1-7之任一部分之兩個序列至少50%同源之兩個核苷酸序列， a. 選自SEQ ID No. 1之任一部分之兩個參照序列； b. 選自SEQ ID No. 2之任一部分之兩個參照序列； c. 選自SEQ ID No. 3之任一部分之兩個參照序列； d. 選自SEQ ID No. 4之任一部分之兩個參照序列； e. 選自SEQ ID No 5之任一部分之兩個參照序列； f. 選自SEQ ID No. 6之任一部分之兩個參照序列；或 g. 選自SEQ ID No. 7之任一部分之兩個參照序列， 其中該等序列側接DNA盒，且其中該DNA盒包含至少一個外源SOI，該至少一個外源SOI可操作地連接至可調控啟動子且側接有兩個RRS。
  77. 如申請專利範圍第76項之載體，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
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