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KR102699853B1 - 핵산의 표적화된 통합 - Google Patents

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KR102699853B1
KR102699853B1 KR1020207021429A KR20207021429A KR102699853B1 KR 102699853 B1 KR102699853 B1 KR 102699853B1 KR 1020207021429 A KR1020207021429 A KR 1020207021429A KR 20207021429 A KR20207021429 A KR 20207021429A KR 102699853 B1 KR102699853 B1 KR 102699853B1
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에이미 선
메이시아 조우
브래들리 알. 스네데코어
샨람 미사기
알버트 에릭 가오
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 명세서에 개시된 주제는 재조합 단백질의 발현에 적합한 표적화된 통합(TI) 숙주 세포뿐만 아니라 상기 TI 숙주 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

핵산의 표적화된 통합
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 12월 22일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/609,806호 및 2018년 7월 27일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/711,272호의 이득을 주장하고, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조에 의해 원용된다.
기술 분야
본 명세서에 개시된 주제는 재조합 단백질의 발현에 적합한 표적화된 통합(targeted integration: TI) 숙주 세포뿐만 아니라 상기 TI 숙주 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
서열 목록
본 명세서는 서열 목록(2018년 12월 21일자로 "00B2060779SEQ.txt"이라는 명칭의 txt 파일로 전자적으로 제출됨)을 참조한다. 00B2060779SEQ.txt 파일은 2018년 12월 20일자로 생성되었고, 1,251,240 바이트의 크기이다. 서열 목록의 전체 내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
세포 생물학 및 면역학에서의 신속한 발달로 인하여, 암, 심혈관 질환 및 대사 질환을 포함하는 다양한 질환을 위한 신규한 치료용 재조합 단백질을 개발하는 것에 대한 증가하는 요구가 있어왔다. 이들 생물약제학적 후보들은 관심대상 단백질을 발현할 수 있는 상업적인 세포주에 의해 흔히 제조된다. 예를 들면, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포는 단일클론 항체를 제조하기 위하여 폭넓게 개조되었다.
상업적인 세포주를 개발하기 위한 통상적인 전략은 관심대상 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 무작위 통합 후, 관심대상 폴리펩타이드를 제조하는 세포주의 선택 및 단리를 포함한다. 그러나, 이러한 접근법은 몇 가지 단점을 갖는다. 첫번째로, 이러한 통합은 희귀한 사건일 뿐만 아니라, 뉴클레오타이드 서열이 통합되는 곳에 관한 무작위성을 고려할 때, 이러한 희귀한 사건은 다양한 유전자 발현 및 세포 성장 표현형을 야기할 수 있다. "위치 효과 변동"으로 알려진 이러한 변동은, 적어도 부분적으로, 진핵 세포 게놈에 존재하는 복합 유전자 조절 네트워크 및 통합 및 유전자 발현을 위한 특정한 게놈 좌위의 접근성으로부터 유래된다. 두번째로, 무작위 통합 전략은 일반적으로 숙주 세포 게놈으로 통합되는 유전자 카피의 수에 대한 제어를 제공하지 않는다. 사실, 유전자 증폭 방법은 종종 높은 생산성의 세포를 달성하는데 사용된다. 그러나, 이러한 유전자 증폭은 원치않는 세포 표현형, 예를 들면, 불안정한 세포 성장 및/또는 생성물 발현을 야기할 수 있다. 세번째로, 무작위 통합 공정에 내재하는 통합 좌위 이질성(integration loci heterogeneity) 때문에, 관심대상 폴리펩타이드의 원하는 수준의 발현을 증명하는 세포주를 단리시키기 위하여 형질감염 후 수 천개의 클론을 스크리닝하는 것은 시간 소모가 크고 노동 집약적이다. 심지어 이러한 세포주를 단리한 후에도, 관심대상 폴리펩타이드의 안정한 발현은 보장되지 않고, 안정한 상업적인 세포주를 수득하기 위하여 추가의 스크리닝이 필요할 수 있다. 마지막으로, 무작위로 통합된 세포주로부터 생성된 폴리펩타이드는 고도의 서열 변이를 나타내고, 이는, 부분적으로, 관심대상 폴리펩타이드의 높은 수준의 발현을 위하여 선택하기 위하여 사용되는 선택제의 돌연변이유발성으로 인한 것일 수 있다.
본 명세서에 개시된 주제는 재조합 단백질의 발현에 적합한 표적화된 통합(TI) 숙주 세포에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 주제는 높은 생산성을 갖는 숙주 세포 TI 부위를 제공할 뿐만 아니라, 재조합효소-매개된 카세트 교환(RMCE)에 의해 숙주 세포에서 단일 TI 좌위로 관심대상 다중 서열을 도입하는 신규한 방법을 제공한다. RMCE 방법의 이점은 증가된 생산성 및 동일한 TI 좌위로부터 다양한 비로 다중 폴리펩타이드를 공동발현하는 유연성을 포함한다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, 본 명세서에 개시된 RMCE 전략은 TI 좌위에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 서열(예를 들면, 항체 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC) 서열)의 삽입을 가능하게 한다. 8개 이상의 서열을 동시에 표적화하는 능력과 함께, 2-플라스미드 RMCE는 생산성을 개선하기 위한 mAb의 HC 및 LC 쇄 비의 조절, 다중 쇄를 갖는 복합체 분자의 발현, 및 세포성 경로를 변형하기 위한 항체에 의한 전이유전자, 내인성 유전자 또는 RNAi의 표적화를 가능하게 한다.
특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 41190-45269, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 63590 내지 207911, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 253831 내지 491909, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 69303 내지 79768, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 293481 내지 315265, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2650443 내지 2662054, 및 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 82214 내지 97705와 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270-45490, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 207912-792374, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 491910-667813, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 79769-100059, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 315266-362442, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2662055-2701768, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 97706-105117과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된다.
특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 LOC107977062(서열번호 1), LOC100768845(서열번호 2), ITPR2(서열번호 3), ERE67000.1(서열번호 4), UBAP2(서열번호 5), MTMR2(서열번호 6), XP_003512331.2(서열번호 7), 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내에서 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 LOC107977062(서열번호 1), LOC100768845(서열번호 2), ITPR2(서열번호 3), ERE67000.1(서열번호 4), UBAP2(서열번호 5), MTMR2(서열번호 6), XP_003512331.2(서열번호 7), 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자에 작동가능하게 연결된 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 측접(flanking)한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열의 모두 또는 일부분에 바로 인접한 통합 부위에서 통합된다.
특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포이다. 특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포 또는 CHO K1M 숙주 세포이다.
특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 재조합 인식 서열(recombination recognition sequence: RRS)을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 2개의 RRS를 포함한다. RRS는 재조합효소, 예를 들면, Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxb1 인테그라제, 또는 φC31 인테그라제에 의해 인식될 수 있다. RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열 및 φC31 attB 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제3 RRS를 더 포함하고, 여기서 제3 RRS는 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치하고, 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제1 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제2 선택 마커를 더 포함하고, 제1 및 제2 선택 마커는 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제3 선택 마커 및 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES)를 더 포함할 수 있고, 여기서 IRES는 제3 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 제3 선택 마커는 제1 또는 제2 선택 마커와 상이할 수 있다. 선택 마커는 아미노글리코사이드 포스포트랜스페라제(APH)(예를 들면, 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티딘올 탈수소효소(히스티딘올 D), 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신, 및 마이코페놀산에 대한 저항성 인코딩 유전자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 선택 마커는 또한 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP) 마커, 증강된 GFP(eGFP) 마커, 합성 GFP 마커, 황색 형광 단백질(YFP) 마커, 증강된 YFP(eYFP) 마커, 시안 형광 단백질(CFP) 마커, m플럼(mPlum) 마커, m체리(mCherry) 마커, td토마토(tdTomato) 마커, m스트로베리(mStrawberry) 마커, J-red 마커, DsRed-단량체 마커, m오렌지(mOrange) 마커, mKO 마커, m시트린(mCitrine) 마커, 비너스(Venus) 마커, YPet 마커, 에메랄드6(Emerald6) 마커, CyPet 마커, mCFPm 마커, 시룰리안(Cerulean) 마커, 및 T-사파이어(T-Sapphire) 마커로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 선택 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 마커, 증강된 GFP(eGFP) 마커, 합성 GFP 마커로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 관심대상 서열(sequence of interest: SOI)을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1 RRS 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1 RRS, 제2 RRS 및 제3 RRS, 제1 RRS와 제3 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI, 및 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 관심대상 서열은 본 명세서에 열거된 예시를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 임의의 관심대상 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. SOI는 동일할 수 있거나 이들은 상이할 수 있고, 예를 들면, SOI는 항체의 양 쇄에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 2개 이상의 상이한 폴리펩타이드가 발현되는 경우에, 관심대상 서열은 다양한 비율의 2개의 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 예를 들면, 8개의 코딩 서열이 상이한 폴리펩타이드를 인코딩하는 경우, 이는 1:7, 2:6 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. SOI는 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩할 수 있다.
본 명세서에 개시된 주제는 또한 관심대상 폴리펩타이드의 발현을 촉진하기 위한 숙주 세포로의 외인성 핵산의 표적화된 통합의 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 재조합효소-매개된 재조합을 통한 숙주 세포로의 외인성 핵산 표적화된 통합을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 관한 것이다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 관한 것이고, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) TI 숙주 세포의 게놈의 좌위 내 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS와 정합(matching)하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공된 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 제1 및 제2 폴리펩타이드(여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있음)를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하고, 여기서 제1, 제2, 및 제3 RRS는 이종특이성이고, 즉, 제1, 제2, 및 제3 RRS 정합된 RRS가 아니고, 따라서 제1, 제2, 및 제3 RRS 중 임의의 2개는 재조합효소-매개된 재조합을 수용할 수 없을 것인, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제1 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공된 세포에 도입하는 단계; c) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공된 세포에 도입하는 단계; d) 하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 e) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 제1 및 제2 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드의 발현 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합된 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; 및 b) SOI를 발현하는데 적합한 조건하에 a)에서의 세포를 배양하고, 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드의 발현 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합된 적어도 2개의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 적어도 하나의 외인성 SOI 및 하나의 선택 마커는 제1 및 제3 RRS에 측접하고, 적어도 하나의 외인성 SOI는 제2 및 제3 RRS에 측접한, 단계; 및 b) SOI를 발현하는데 적합한 조건하에 a)에서의 세포를 배양하고, 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 개시된 주제는 또한 TI 숙주 세포의 사용을 통해 관심대상 폴리펩타이드를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 조성물 및 방법은 TI 숙주 세포뿐만 아니라 TI 숙주 세포들로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 통합을 촉진하는 폴리뉴클레오타이드 및 벡터, 및 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 특정한 실시형태에 있어서, 벡터는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 전위효소 벡터, 인테그라제 기질 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 방법은 상동성 재조합, 상동성 지정 복구(HDR), 및/또는 비상동성 말단 접합(NHEJ)을 통한 숙주 세포로의 관심대상 폴리펩타이드를 인코딩하는 외인성 핵산의 표적화된 통합을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 LOC107977062(서열번호 1), LOC100768845(서열번호 2), ITPR2(서열번호 3), ERE67000.1(서열번호 4), UBAP2(서열번호 5), MTMR2(서열번호 6), XP_003512331.2(서열번호 7), 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내에 부위에서 세포로의 관심대상 폴리펩타이드를 인코딩하는 외인성 핵산의 통합을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 숙주 세포의 게놈의 좌위 내 부위에서 세포로의 관심대상 폴리펩타이드를 인코딩하는 외인성 핵산의 통합을 포함하고, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 벡터는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함하는, 단계; 및 c) 선택 마커를 선택하여 게놈의 좌위에서 통합된 SOI를 갖는 TI 숙주 세포를 단리시키고, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 표적화된 통합을 촉진하는 외인성 뉴클레아제의 사용을 포함한다. 외인성 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 조작된 메가뉴클레아제, 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR)-관련(Cas) 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) TI 숙주 세포의 게놈의 하나 이상의 좌위 내 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 RRS를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 하나 이상의 RRS에 정합하고 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 외인성 SOI에 측접한 하나 이상의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공된 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는 단계; 및 d) 유발인자의 존재하에 외인성 SOI를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드의 발현 방법으로서, a) 2개의 RRS에 측접한 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합된 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; 및 b) 세포를 SOI를 발현하는데 적합한 조건하에 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드(여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있음)를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1, 제2 RRS, 및 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하고, 여기서 제1, 제2, 및 제3 RRS는 이종특이성이고, 즉, 제1, 제2, 및 제3 RRS는 정합된 RRS가 아니고, 따라서 제1, 제2, 및 제3 RRS 중 임의의 2개는 재조합효소-매개된 재조합을 수용할 수 없을 것인, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제1 외인성 SOI에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공된 세포에 도입하는 단계; c) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공된 세포에 도입하는 단계; d) 하나 이상의 재조합효소, 또는 하나 이상의 재조합효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 e) 유발인자의 존재하에 외인성 SOI를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
도 1은 항체의 안정하고 높은 발현을 가능하게 하는 CHO TI 좌위를 동정하기 위한 게놈-와이드(genome-wide) 스크리닝 단계의 개요를 보여주는 다이어그램이다.
도 2A 및 도 2B는 표적화된 항체 발현 집단을 생성하는데 사용된 2개의 이중 선택 계획을 도시한다. 전위효소 생성된 TI 숙주는 도 2A에 도시되고, 무작위 통합 생성된 TI 숙주는 도 2B에 도시된다.
도 3은 2개의 특정한 TI 숙주에 의해 생성된 상위 클론의 생산성을 도시한다.
도 4는 2개의 독립적인 RMCE를 동시에 수행하기 위하여 3개의 RRS 부위의 사용을 포함하는 2-플라스미드 RMCE 전략을 도시한다. 하나의 벡터(앞)는 RRS1, 제1 SOI 및 프로모터(P) 후, 개시 코돈(ATG) 및 RRS3를 포함한다. 다른 벡터(뒤)는 개시 코돈(ATG), SOI 2 및 RRS2 없이 마커의 코딩 서열에 융합된 RRS3을 포함한다. 2개의 플라스미드가 정확하게 표적화되는 경우에만 선택 마커의 완전한 발현 카세트가 조립되고, 따라서 선택에 대한 세포 저항성을 부여할 것이다.
도 5는 항체 D, E, F, G, 및 J의 발현과 관련되어 단일-벡터 또는 2-벡터 RMCE를 사용하는 것의 결과를 도시한다. FACS, 게놈 PCR, 및 유전자 카피 분석을 평가하여 플라스미드 카세트가 둘 다 TI 부위에 정확하게 표적화되었다는 것을 확인하였다. 단일 플라스미드 RMCE와 비교하여 2-플라스미드 RMCE에서 더 많은 총 HC 및 LC 카피가 TI 부위에 표적화되었다.
도 6은 6개의 분자의 역가를 도시한다.
도 7은 복합체 mAb 포맷을 발현하기 위하여 2-벡터 RMCE를 사용하는 것의 결과를 도시한다. 각각 4개의 상이한 쇄(2개의 HC 및 2개의 LC)를 필요로 하는 2개의 이중특이적 분자를 생성 및 % 이중특이적 형성에 대하여 검정하였다. 두 경우 모두에서, 세포주는 80% 초과의 이중특이적 함량으로 1.5g/ℓ초과를 나타내는 것으로 발달하였다.
도 8은 4개의 이중특이적 분자의 제14일 역가를 도시한다.
도 9A 및 도 9B는 RTI 시스템에서 mAb-I 또는 mAb-II를 발현하는 세포주의 발생을 도시한다. 세포주 발달에 대한 조직학적 결과는 도 9A에 도시되고, RTI 세포주 발달(CLD) 공정의 도식은 도 9B에 도시된다.
도 10A 내지 도 10C는 mAb-I 또는 mAb-II를 발현하는 세포주의 역가 및 특이적 생산성 결과를 도시한다. 생산 종료 역가는 도 10A에 도시되고, 생산 종료 IVCC는 도 10B에 도시되고, 생산 종료 특이적 생산성은 도 10C에 도시된다.
도 11A 및 도 11B는 mAb-I 및 mAb-II 발현 세포주의 HC 및 LC mRNA의 발현 수준을 도시한다. HC mRNA의 발현 수준은 도 11A에 도시되고, HL mRNA의 발현 수준은 도 11B에 도시된다.
도 12A 내지 도 12D는 mAb-I 또는 mAb-II를 발현하는 세포주에서 HC, HL 및 BiP 분자의 세포내 수준을 도시한다. RTI 시스템에 대한 사이클로헥스이미드 및 Dox 효과의 도식은 도 12A에 도시된다. HC, LC 및 BiP의 세포내 수준뿐만 아니라 mAb-A 또는 mAb-B를 발현하는 세포주의 상청액 중의 HC 및 LC 수준은 도 12B에 도시된다. 밤새 CHX 처리 후, mAb-I 또는 mAb-II을 발현하는 세포주의 HC, LC 및 BiP의 세포내 수준은 도 12C에 도시된다. 배양 배지로부터의 독시사이클린 제거 후, mAb-I 또는 mAb-II를 발현하는 세포주의 HC, LC 및 BiP의 세포내 수준은 도 12D에 도시된다.
도 13A 내지 도 13D는 BiP와 mAb-I LC 발현의 세포내 축적 사이의 상관관계를 도시한다. 생산 종료 역가는 도 13A에 도시되고, HC, LC 및 BiP의 축적은 도 13B에 도시된다. 체인-스왑(chain-swap) 실험의 도식적 표현은 도 13C에 도시된다. mAb-I, mAb-II를 발현하는 RTI 풀의 HC, LC 및 BiP의 세포내 수준, 또는 이들 분자의 체인-스왑된 버전은 도 13D에 도시된다.
도 14A 내지 도 14C는 이러한 분자의 풀 발현에 대한 mAb-A HC 및 HL의 기여를 도시한다. 생산 종료 역가는 도 14A에 도시되고, 생산 종료 IVCC는 도 13B에 도시되고, 생산 종료 특이적 생산성은 도 14C에 도시된다.
도 15A 내지 도 15B는 불량한 발현에 기여할 수 있는 LC 및 HC의 CDR 영역을 도시한다. mAb-I 및 mAb-II LC 아단위의 도식적 표현은 도 15A에 도시된다. mAb-I 및 mAb-II HC 영역의 도식적 표현은 도 15B에 도시된다.
도 16A 내지 도 16C는 HCA의 발현과 관련하여 HC 불변 영역에서 2개의 점 돌연변이를 사용하는 것의 결과를 도시한다. mAb-I 및 mAb-II HC 및 LC 아단위 사이의 다양한 체인 스왑의 생산 종료 역가는 도 16A에 도시된다. 다양한 RTI 풀의 HC, LC 및 BiP의 세포내 수준은 도 16B에 도시된다. 낮은 단백질 발현을 위한 진단 도구로서 RTI 시스템 이용의 도식은 도 16C에 도시된다.
도 17은 2개의 상이한 세포 배양 공정을 사용하는 생산을 도시한다.
도 18A 내지 도 18D는 3개의 mAb의 RMCE 풀에 대한 역가 및 특이적 생산성 결과를 도시한다. HL 및 HLL 구성을 비교하는 3개의 mAb의 RMCE 풀에 대한 제14일 역가는 도 18A에 도시된다. HL 및 HLL 구성을 비교하는 3개의 mAb에 대한 RMCE 풀에 대한 제14일 특이적 생산성(Qp)은 도 18B에 도시된다. 도 18A의 풀로부터 생성된 클론에 대한 제14일 역가는 도 18C에 도시된다. 도 18A의 풀로부터 생성된 클론에 대한 제14일 Qp는 도 18D에 도시된다. 도 18C 및 D에 있어서 구성당 6개의 클론이 시험되었다.
도 19A 내지 도 19F는 3개의 상이한 플라스미드 구성을 비교하는 mAb Y의 RMCE 풀에 대한 역가, Qp, 및 성장(생존 가능한 세포 농도의 적분으로 표시, IVCC), mRNA 발현 및 단백질 발현을 도시한다. 제14일 역가, Qp, 및 성장(생존 가능한 세포 농도의 적분으로 표시, IVCC)은 각각 도 19 A, B 및 C에 도시된다. 각각의 막대는 단일 풀로부터의 데이터를 나타낸다. 풀로부터의 시드 트레인 mRNA 발현 및 세포내 항체 단백질 발현은 19A에 있다. 중쇄 및 경쇄에 대한 mRNA 발현은 HLL-HL 구성에 대하여 정규화되었고; 중쇄 및 경쇄에 대한 4개의 기술적 복제(오류 막대는 표준 편차이다) mRNA 발현의 각각의 막대 평균은 HLL-HL 구성에 대하여 정규화되었다. 웨스턴 블롯으로부터 정량화되고 HLL-HL 구성에 대하여 정규화된 모든 풀로부터의 세포내 중쇄 및 경쇄 단백질 발현은 도 19E에 도시되고; 각각의 막대는 3개의 기술적 복제(오류 막대는 표준 편차이다)의 평균이다. 도 19E에 도시된 데이터의 대표적인 웨스턴 블롯 이미지는 도 19F에 도시된다.
도 20A 내지 도 20F는 3개의 상이한 구성을 갖는 RMCE 풀로부터 생성된 mAb Y 또는 mAb III 발현 단일클론에 대한 역가, Qp, 및 성장(생존 가능한 세포 농도의 적분으로 표시됨, IVCC)을 도시한다. mAb Y 발현 단일클론에 대한 제14일 역가는 도 20A에 도시된다. mAb Y 발현 단일클론에 대한 제14일 Qp는 도 20B에 도시된다. mAb Y 발현 클론에 대한 제14일 IVCC는 도 20C에 도시된다. mAb III 발현 단일클론에 대한 제14일 역가는 도 20D에 도시된다. mAb III 발현 단일클론에 대한 제14일 Qp는 도 20E에 도시된다. mAb III 발현 클론에 대한 제14일 IVCC는 도 20F에 도시된다.
도 21A 내지 도 21D는 다양한 구성의 RMCE 풀의 발현 수준, 역가 및 Qp를 도시한다. 쇄 발현에 대한 플라스미드 위치의 효과를 평가하기 위하여 형질감염된 하나의 중쇄, 하나의 경쇄 플라스미드의 도식은 도 21A에 도시된다. 항체 중쇄(H로 축약됨) 및 경쇄(L로 축약됨)는 동일한 플라스미드 상에서 발현되거나 앞 및 뒤 플라스미드로 분할되었다. 뒤 플라스미드에서 pac 퓨로마이신 저항성 유전자와 마찬가지로, L3, Loxfas, 및 2L 부위가 기록된다. 도 21A에 기술된 DNA 구성을 갖는 풀로부터의 중쇄 및 경쇄의 시드 트레인 mRNA 발현은 도 23B에 도시된다. 다양한 구성의 RMCE 풀에 대한 제14일 역가는 도 21C에 도시된다. 다양한 구성의 제14일 Qp는 도 21D에 도시된다. 풀에 대한 중쇄 및 경쇄 DNA 카피 수는 도 21E에 도시된다.
도 22A 내지 도 22D는 mAb의 고분자량 종(HMWS) 퍼센트에 대한 HC:LC 비의 효과는 TI 부위로부터 독립적이라는 것을 도시한다. 숙주 7 세포 상의 항체 S에 대한 제14일 역가는 도 22A에 도시된다. 숙주 7 세포 상의 항체 S의 고분자량 종(HMWS) 퍼센트는 도 22B에 도시된다. 숙주 4 세포 상의 항체 S에 대한 제14일 역가는 도 22C에 도시된다. 숙주 4 세포 상의 항체 S의 고분자량 종(HMWS) 퍼센트는 도 22D에 도시된다.
도 23A 및 도 23B는 항체 IV의 생산성 및 고분자량 종(HMWS)에 대한 HC:LC 비의 효과를 도시한다. 숙주 4 세포 상의 항체 IV에 대한 제14일 역가는 도 23A에 도시된다. 숙주 4 세포 상의 항체 IV의 고분자량 종(HMWS) 퍼센트는 도 23B에 도시된다.
도 24A 및 도 24B는 2-부위 TI 숙주 세포에서 항체 VI의 생산성 및 고분자량 종(HMWS)에 대한 HC:LC 비의 효과를 도시한다. 2-부위 TI 숙주 세포 상의 항체 VI에 대한 제14일 역가는 도 24A에 도시된다. 2-부위 TI 숙주 세포 상의 항체 VI의 고분자량 종(HMWS) 퍼센트는 도 24B에 도시된다.
도 25는 각각 7.4% 및 5.6% 응집과 함께 8.4 및 8.7 g/ℓ의 역가를 갖는 2개의 클론을 도시한다.
도 26은 상이한 조절된 표적화된 통합 세포주에서 항체 Z의 제14일 역가를 도시한다.
도 27은 상이한 조절된 표적화된 통합 세포주에서 항체 Z의 특이적 생산성을 도시한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 숙주 세포, 유전적 작제물(예를 들면, 벡터), 조성물, 및 방법은 표적화된 통합(TI) 숙주 세포의 개발 및/또는 사용에서 이용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 TI 숙주 세포는 숙주 세포의 게놈의 특정 유전자 또는 특정 좌위 내에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
제한의 방식이 아닌 개시내용의 명확성을 목적으로, 상세한 설명은 하기 세부항목으로 나누어진다:
1. 정의
2. 통합 부위
3. 외인성 뉴클레오타이드 서열
4. 숙주 세포
5. 표적화된 통합
6. TI 숙주 세포의 제조 및 사용
7. 생성물
8. 예시적인 비제한적인 실시형태
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 분야의 숙련가에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 충돌하는 경우, 정의를 포함하는 본 문서가 지배할 것이다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 명세서에 개시된 주제의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직한 방법 및 물질은 하기 기재된다. 모든 문헌, 특허 출원, 특허 및 본 명세서에 언급된 다른 참조는 그 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다. 본 명세서에 개시된 물질, 방법, 및 실시예는 오로지 설명적이고, 제한되는 것을 의도하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "포함하다(comprise)", "포함하다(include)", "갖는", "갖다", "할 수 있다", "함유하다", 및 이의 변형은 추가의 작용 또는 구조의 가능성을 불가능하게 하지 않는 개방 종결형 전이 문구, 용어, 또는 단어를 의도한다. 문맥에서 달리 명백하게 기재되지 않는 한, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 복수의 지시대상을 포함한다. 본 개시내용은 또한, 명확하게 기재되든 기재되지 않든, 본 명세서에 나타낸 실시형태 또는 요소를 "포함하고", "이들로 구성되고", "이들로 본질적으로 구성되는" 다른 실시형태를 고려한다.
본 명세서에서 수치 범위의 기재에 있어서, 동일한 정밀도로 그 사이에 있는 각각의 수는 명확하게 고려된다. 예를 들면, 6 내지 9 범위에 있어서, 6 및 9 이외에 수 7 및 8이 고려되고, 6.0 내지 7.0 범위에 있어서, 수 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명확하게 고려된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 당해 분야의 숙련가에 의해 결정되는 바와 같은 특정한 값에 대한 수용 가능한 오류 범위 내를 의미하고, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방식, 즉, 측정 시스템의 한계에 따라 좌우될 것이다. 예를 들면, "약"은 당해 분야에서 실시당 3 또는 3 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더 바람직하게는 5% 이하, 더 바람직하게는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 관하여, 용어는 값의 자릿수, 바람직하게는 5배, 더 바람직하게는 2배 내를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선택 마커"는 상응하는 선택제의 존재하에 유전자를 보유한 세포가 이에 대하여 또는 대항하여 특이적으로 선택되는 것을 가능하게 하는 유전자일 수 있다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, 선택 마커는 선택 마커에 의해 형질전환된 숙주 세포가 유전자의 존재하에 양성으로 선택되는 것을 가능하게 할 수 있고; 비-형질전환된 숙주 세포는 선택적 조건하에 성장 또는 생존할 수 없을 것이다. 선택 마커는 양성, 음성 또는 이작용성일 수 있다. 양성 선택 마커는 마커를 보유한 세포에 대한 선택을 가능하게 할 수 있는 반면, 음성 선택 마커는 마커를 보유한 세포가 선택적으로 제거될 수 있게 한다. 선택 마커는 숙주 세포에서 약물에 대한 저항성을 부여하거나 대사 또는 이화 결함을 보충할 수 있다. 원핵 세포에서, 그 중에서도, 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신 또는 클로람페니콜에 대항하는 저항성을 부여하는 유전자가 사용될 수 있다. 진핵 세포에서 선택 마커로서 유용한 저항성 유전자는 아미노글리코사이드 포스포트랜스페라제(APH)(예를 들면, 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티딘올 탈수소효소(히스티딘올 D)에 대한 유전자, 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신, 및 마이코페놀산에 대한 저항성 인코딩 유전자를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 추가의 마커 유전자는 제WO 92/08796호 및 제WO 94/28143호에 기재된다.
상응하는 선택제의 존재하에 선택을 촉진하는 것 이후에, 선택 마커는 대안적으로 세포에 정상적으로 존재하지 않는 분자, 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP), 증강된 GFP(eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 YFP(eYFP), 시안 형광 단백질(CFP), m플럼, m체리, td토마토, m스트로베리, J-red, DsRed-단량체, m오렌지, mKO, m시트린, 비너스, YPet, 에메랄드, CyPet, mCFPm, 시룰리안, 및 T-사파이어를 인코딩하는 유전자를 제공할 수 있다. 이러한 유전자를 보유한 세포는 이러한 유전자를 보유하지 않은 세포와, 예를 들면, 인코딩된 폴리펩타이드에 의해 방출된 형광의 검출에 의해, 구별될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 구성요소가 이들의 의도된 방식으로 이들이 기능하는 것을 허용하는 관계에 있는 2개의 구성요소의 근접부위를 나타낸다. 예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서는 프로모터 및/또는 인핸서가 코딩 서열의 전사를 조절하도록 작용하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, "작동가능하게 연결된" DNA 서열은 단일 염색체에 근접하고 인접하다. 특정한 실시형태에 있어서, 예를 들면, 2개의 단백질 인코딩 영역, 예를 들면, 분비 리더 및 폴리펩타이드가 결합될 필요가 있는 경우, 서열은 근접하고, 인접하고, 동일한 리딩 프레임에 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 서열의 상류에 위치하고, 이에 인접할 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 예를 들면, 코딩 서열의 발현을 조절하는 인핸서 서열에 관하여, 2개의 구성요소는 인접하지 않음에도 불구하고 작동가능하게 연결될 수 있다. 인핸서는 인핸서가 코딩 서열의 전사를 증가시키는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열의 상류, 그 사이 또는 하류에 위치할 수 있고, 코딩 서열의 프로모터로부터 상당한 거리에 위치할 수 있다. 작동가능한 연결은 당해 분야에 공지된 재조합 방법에 의해, 예를 들면, PCR 방법론을 사용하여 및/또는 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성될 수 있다. 편리한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 실시에 따라 사용될 수 있다. 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 5' 말단-독립적인 방식으로 내부 위치에서 ORF의 번역의 개시를 허용하는 경우에 개방형 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 전사 및/또는 번역을 나타낸다. 특정한 실시형태에 있어서, 원하는 생성물의 전사의 수준은 존재하는 상응하는 mRNA의 양을 기반으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 관심대상 서열로부터 전사된 mRNA는 PCR 또는 노던 혼성화에 의해 정량될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 서열에 의해 인코딩된 단백질은 다양한 방법에 의해, 예를 들면, ELISA, 단백질의 생물학적 활성을 위한 검정에 의해, 또는 이러한 활성화와 독립적인 검정, 예를 들면, 웨스턴 블로팅 또는 방사면역검정을 사용하는 검정에 의해, 단백질을 인식하고 이에 결합하는 항체를 사용하여 정량될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), 절반 항체, 및 항체 단편을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들면, scFv); 단일 도메인 항체(dAb) 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 특정한 항체 단편의 검토를 위하여, 문헌[Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)]을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 포함되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 추가로, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887(1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628(1991)]을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중쇄"는 면역글로불린 중쇄를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경쇄"는 면역글로불린 경쇄를 나타낸다.
항체의 "클래스"는 이의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인의 유형을 나타낸다. 항체의 5개의 주요 클래스가 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 이들 중 몇몇은 하위클래스(아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
용어 "단일클론 항체"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내고, 즉, 가능한 변이 항체, 예를 들면, 자연적으로 발생하거나 단일클론 항체의 제제의 제조 동안 생기는 돌연변이를 함유하는 것을 제외하고, 집단을 포함하는 개별적인 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토크에 결합하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 일반적으로 상이한 결정요인(에피토프)에 관하여 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일한 결정요인에 관한 것이다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 좌위 모두 또는 이의 부분을 함유하는 유전자도입 동물을 사용하는 방법을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있고, 이러한 방법 및 단일클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법은 본 명세서에 기재된다.
"다중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 부위, 즉, 상이한 항원 상의 상이한 에피토프 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정한 측면에 있어서, 다중특이적 항체는 3개 이상의 결합 특이성을 갖는다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본 명세서에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타내는데 상호교환적으로 사용된다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들면, scFv, 및 scFab); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 특정한 항체 단편의 검토를 위하여, 문헌[Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)]을 참조한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 나타낸다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유한 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정하게 배제한다.
"인간화" 항체는 비인간 CDR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 나타낸다. 특정한 측면에 있어서, 인간화 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내고, 즉, 가능한 변이 항체, 예를 들면, 자연적으로 발생하거나 단일클론 항체의 제제의 제조 동안 생기는 돌연변이를 함유하는 것을 제외하고, 집단을 포함하는 개별적인 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토크에 결합하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 일반적으로 상이한 결정요인(에피토프)에 관하여 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일한 결정요인에 관한 것이다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다.
용어 "치료용 항체"는 질환의 치료에 사용되는 항체를 나타낸다. 치료용 항체는 다양한 작용 메커니즘을 가질 수 있다. 치료용 항체는 결합하고 항원과 연관된 표적의 정상 기능을 중화시킬 수 있다. 예를 들면, 암 세포의 생존에 필요한 단백질의 활성을 차단하는 단일클론 항체는 세포의 사멸을 유발한다. 또 다른 치료용 단일클론 항체는 결합하고 항원과 연관된 표적의 정상 기능을 활성화할 수 있다. 예를 들면, 단일클론 항체는 세포 상의 단백질에 결합할 수 있고, 아폽토시스 신호를 촉발할 수 있다. 또 다른 단일클론 항체는 환부 조직에서만 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있고; 단일클론 항체에 대한 독성 페이로드(유효 제제), 예를 들면, 화학치료제 또는 방사능제의 접합은 건강한 조직에 대한 해로움을 감소시키는, 환부 조직에 대한 독성 페이로드의 특이적 전달을 위한 제제를 생성할 수 있다. 치료용 항체의 "생물학적 기능성 단편"은 생물학적 기능의 일부 또는 전부가 온전한 항체로 인한 것이 아닐 경우를 적어도 나타낼 것이고, 기능은 적어도 표적 항원에 대한 특이적인 결합을 포함한다.
용어 "진단용 항체"는 질환의 진단 시약으로서 사용되는 항체를 나타낸다. 진단용 항체는 특정한 질환과 특이적으로 연관되거나 증가된 발현을 나타내는 표적 항원에 결합할 수 있다. 진단용 항체는, 예를 들면, 환자로부터의 생물학적 샘플에서, 또는 환자의 종양과 같은 질환 부위의 진단 이미지에서 표적을 검출하는데 사용될 수 있다. 진단용 항체의 "생물학적 기능성 단편"은 적어도 생물학적 기능의 일부 또는 모두가 온전한 항체로부터 기인하는 경우를 나타낼 것이고, 기능은 적어도 표적 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양"은 이러한 세포의 자손을 포함하는, 외인성 핵산이 이에 도입된 세포를 나타내는데 상호교환적으로 사용된다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대의 수와 상관없이 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포에 대하여 핵산 함량에서 완전히 동일하기 않지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되고 선택되는 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손은 여기에 포함된다.
용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 성분을 포함한다. 각각의 뉴클레오타이드는 염기, 구체적으로 퓨린- 또는 피리미딘 염기(즉, 사이토신(C), 구아닌(G), 아데닌(A), 티민(T) 또는 우라실(U)), 당(즉, 데옥시리보스 또는 리보스), 및 포스페이트기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기의 서열로 기재되고, 이로써 상기 염기는 핵산 분자의 일차 구조(선형 구조)를 나타낸다. 염기의 서열은 전형적으로 5'부터 3'로 나타낸다. 여기서, 용어 핵산 분자는, 예를 들면, 상보적 DNA(cDNA) 및 게놈 DNA를 포함하는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 특히 메신저 RNA(mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 및 이들 분자 중 둘 이상을 포함하는 혼합된 중합체를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다. 추가로, 용어 핵산 분자는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 포함할 뿐만 아니라 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 게다가, 본 명세서에 기재된 핵산 분자는 천연 발생 또는 비천연 발생 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 비천연 발생 뉴클레오타이드의 예는 유도체화된 당 또는 포스페이트 뼈대 연결기 또는 화학적으로 개질된 잔기를 갖는 개질된 뉴클레오타이드 염기를 포함한다. 핵산 분자는 또한 시험관내 및/또는 생체내, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA 및 RNA 분자를 포함한다. 이러한 DNA(예를 들면, cDNA) 또는 RNA(예를 들면, mRNA) 벡터는 개질되지 않거나 개질될 수 있다. 예를 들면, mRNA가 대상체에 주입되어 생체내에서 항체를 생성할 수 있도록, mRNA는 화학적으로 개질되어 RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 강화시킬 수 있다(예를 들면, 문헌[Stadler et al, Nature Medicine 2017, published online 12 June 2017, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1] 참조).
"단리된" 핵산은 이의 천연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 나타낸다. 단리된 핵산은 일반적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 존재하거나 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 이에 연결된 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 용어는 자가복제 핵산 구조로서의 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 도입된 벡터를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시한다. 이러한 벡터는 "발현 벡터"로 본 명세서에서 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성 서열"은 서열의 정렬에 의해 결정되는 바와 같은 유의미한 서열 유사성을 공유하는 서열을 나타낸다. 예를 들면, 2개의 서열은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 99.9% 상동성일 수 있다. 정렬은 BLAST, FASTA 및 HMME를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램에 의해 수행되고, 이는 서열을 비교하여 서열 길이, 서열 정체성 및 유사성, 및 서열 부정합 및 갭의 존재 및 길이와 같은 인자를 기반으로 정합의 통계적 유의미성을 계산한다. 상동성 서열은 DNA 및 단백질 서열 둘 다를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "측접한"은 제1 뉴클레오타이드 서열이 제2 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 중 하나, 또는 두 말단 모두에 위치되는 것을 나타낸다. 측접한 뉴클레오타이드 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열에 인접하거나 이로부터 정의된 거리에 있을 수 있다. 측접한 뉴클레오타이드 서열의 길이에 특정한 제한은 존재하지 않는다. 예를 들면, 측접한 서열은 수개의 염기쌍 또는 수천개의 염기쌍일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 측접한 뉴클레오타이드 서열의 길이는 약 적어도 15개의 염기쌍, 적어도 20개의 염기쌍, 적어도 30개의 염기쌍, 적어도 40개의 염기쌍, 적어도 50개의 염기쌍, 적어도 75개의 염기쌍, 적어도 100개의 염기쌍, 적어도 150개의 염기쌍, 적어도 200개의 염기쌍, 적어도 300개의 염기쌍, 적어도 400개의 염기쌍, 적어도 500개의 염기쌍, 적어도 1,000개의 염기쌍, 적어도 1,500개의 염기쌍, 적어도 2,000개의 염기쌍, 적어도 3,000개의 염기쌍, 적어도 4,000개의 염기쌍, 적어도 5,000개의 염기쌍, 적어도 6,000개의 염기쌍, 적어도 7,000개의 염기쌍, 적어도 8,000개의 염기쌍, 적어도 9,000개의 염기쌍, 적어도 10,000개의 염기쌍일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성"은 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포로부터 기원하지 않고, 숙주 세포로 전통적인 DNA 전달 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 또는 형질전환 방법에 의해 도입되는 것을 나타낸다. 용어 "내인성"은 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포로부터 기원한다는 것을 나타낸다. "외인성" 뉴클레오타이드 서열은 염기 조성이 동일한 "내인성" 대응물을 가질 수 있지만, "외인성" 서열은 숙주 세포에, 예를 들면, 재조합 DNA 기술을 통해 도입된다.
2. 통합 부위
본 명세서에 개시된 주제는 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합에 적합한 숙주 세포를 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 숙주 세포, 즉, TI 숙주 세포의 게놈 상의 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"통합 부위"는 외인성 뉴클레오타이드 서열이 삽입되는 숙주 세포 게놈 내의 핵산 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 숙주 세포 게놈 상의 2개의 인접한 뉴클레오타이드 사이에 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 그 사이에 임의의 외인성 뉴클레오타이드 서열이 삽입될 수 있는 뉴클레오타이드의 스트레치를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 TI 숙주 세포의 게놈의 특정 좌위 내에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 TI 숙주 세포의 내인성 유전자 내에 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 TI 숙주 세포의 게놈의 특정 좌위 내 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열이 통합되는 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 TI 숙주 세포의 게놈의 특정 좌위 내 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열이 통합되는 좌위는 콘틱(Contig) NW_006874047.1, NW_006884592.1, NW_006881296.1, NW_003616412.1, NW_003615063.1, NW_006882936.1, 및 NW_003615411.1로부터 선택된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 1,000 bp; 1,000 내지 2,000 bp; 2,000 내지 3,000 bp; 3,000 내지 4,000 bp; 및 4,000 내지 4,301 bp로부터 선택된 위치 내에 위치한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 100,000 bp; 100,000 내지 200,000 bp; 200,000 내지 300,000 bp; 300,000 내지 400,000 bp; 400,000 내지 500,000 bp; 500,000 내지 600,000 bp; 600,000 내지 700,000 bp; 및 700,000 내지 728785 bp로부터 선택된 위치 내에 위치한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 100,000 bp; 100,000 내지 200,000 bp; 200,000 내지 300,000 bp; 300,000 내지 400,000 bp; 및 400,000 내지 413,983으로부터 선택된 위치 내에 위치한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 10,000 bp; 10,000 내지 20,000 bp; 20,000 내지 30,000 bp; 및 30,000 내지 30,757 bp로부터 선택된 위치 내에 위치한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 10,000 bp; 10,000 내지 20,000 bp; 20,000 내지 30,000 bp; 30,000 내지 40,000 bp; 40,000 내지 50,000 bp; 50,000 내지 60,000 bp; 및 60,000 내지 68,962 bp로부터 선택된 위치 내에 위치한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 10,000 bp; 10,000 내지 20,000 bp; 20,000 내지 30,000 bp; 30,000 내지 40,000 bp; 40,000 내지 50,000 bp; 및 50,000 내지 51,326 bp로부터 선택된 위치 내에 위치한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 10,000 bp; 10,000 내지 20,000 bp; 및 20,000 내지 22,904 bp로부터 선택된 위치 내에 위치한 통합 부위에서 통합된다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 41190 내지 45269, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 63590 내지 207911, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 253831 내지 491909, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 69303 내지 79768, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 293481 내지 315265, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2650443 내지 2662054, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 82214 내지 97705 및 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 41190 내지 45269, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 63590 내지 207911, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 253831 내지 491909, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 69303 내지 79768, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 293481 내지 315265, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2650443 내지 2662054, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 82214 내지 97705와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270 내지 45490, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 207912 내지 792374, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 491910 내지 667813, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 79769 내지 100059, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 315266 내지 362442, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2662055 내지 2701768, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 97706 내지 105117 및 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270 내지 45490, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 207912 내지 792374, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 491910 내지 667813, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 79769 내지 100059, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 315266 내지 362442, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2662055 내지 2701768, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 97706 내지 105117과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 7 및 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열은 무작위로 통합된 SOI와 비교하여 SOI의 발현 수준을 증가시킨다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 SOI는 무작위로 통합된 SOI보다 약 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 2배, 3배, 5배 또는 10배 더 높게 발현된다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 41190 내지 45269, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 63590 내지 207911, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 253831 내지 491909, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 69303 내지 79768, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 293481 내지 315265, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2650443 내지 2662054, 및 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 82214 내지 97705 및 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 5'에 측접하고, NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270 내지 45490, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 207912 내지 792374, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 491910 내지 667813, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 79769 내지 100059, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 315266 내지 362442, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2662055 내지 2701768, 및 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 97706 내지 105117 및 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 3'에 측접한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5'에 측접한 뉴클레오타이드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 41190 내지 45269, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 63590 내지 207911, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 253831 내지 491909, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 69303 내지 79768, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 293481 내지 315265, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2650443 내지 2662054, 및 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 82214 내지 97705와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이고, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3'에 측접한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270 내지 45490, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 207912 내지 792374, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 491910 내지 667813, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 79769 내지 100059, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 315266 내지 362442, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2662055 내지 2701768, 및 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 97706 내지 105117과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열의 모두 또는 부분에 바로 인접한 좌위에 통합된다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 7 및 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 인접한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 7 및 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로부터 약 100 bp, 약 200 bp, 약 500 bp, 약 1 kb의 거리 내에 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열에 인접한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 1,000 bp; 1,000 내지 2,000 bp; 2,000 내지 3,000 bp; 3,000 내지 4,000 bp; 및 4,000 내지 4,301 bp로부터 선택된 위치에 인접한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 100,000 bp; 100,000 내지 200,000 bp; 200,000 내지 300,000 bp; 300,000 내지 400,000 bp; 400,000 내지 500,000 bp; 500,000 내지 600,000 bp; 600,000 내지 700,000 bp; 및 700,000 내지 728785 bp로부터 선택된 위치에 인접한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 100,000 bp; 100,000 내지 200,000 bp; 200,000 내지 300,000 bp; 300,000 내지 400,000 bp; 및 400,000 내지 413,983로부터 선택된 위치에 인접한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 10,000 bp; 10,000 내지 20,000 bp; 20,000 내지 30,000 bp; 및 30,000 내지 30,757 bp로부터 선택된 위치에 인접한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 10,000 bp; 10,000 내지 20,000 bp; 20,000 내지 30,000 bp; 30,000 내지 40,000 bp; 40,000 내지 50,000 bp; 50,000 내지 60,000 bp; 및 60,000 내지 68,962 bp로부터 선택된 위치에 인접한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 10,000 bp; 10,000 내지 20,000 bp; 20,000 내지 30,000 bp; 30,000 내지 40,000 bp; 40,000 내지 50,000 bp; 및 50,000 내지 51,326 bp로부터 선택된 위치에 인접한 통합 부위에서 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 번호 1 내지 10,000 bp; 10,000 내지 20,000 bp; 및 20,000 내지 22,904 bp로부터 선택된 위치에 인접한 통합 부위에서 통합된다.
특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열의 통합 부위를 포함하는 좌위는 개방형 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하지 않는다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열의 통합 부위를 포함하는 좌위는 시스-작용 요소, 예를 들면, 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열의 통합 부위를 포함하는 좌위는 유전자 발현을 증강시키는 임의의 시스-작용 요소, 예를 들면, 프로모터 및 인핸서를 함유하지 않는다.
특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내에 통합 부위에 통합된다. 내인성 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자는 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자의 야생형 및 모든 상동성 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자의 상동성 서열은 야생형 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자와 적어도 약자와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자는 야생형 포유동물 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자이다. 특정한 실시형태에 있어서, LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자는 야생형 인간 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자이다. 특정한 실시형태에 있어서, LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자는 야생형 햄스터 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2 유전자이다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이의 적어도 약 90% 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이의 적어도 약 90% 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자에 측접한다.
표 1은 예시적인 TI 숙주 세포 통합 부위를 제공한다:
TI 숙주 세포 통합 부위
숙주 콘틱 콘틱
크기(kb) 		통합
부위(bp) 		유전자(서열번호)
1 NW_006874047.1 727 45269 LOC107977062(서열번호 1)
2 NW_006884592.1 931 207911 LOC100768845(서열번호 2)
3 NW_006881296.1 1016 491909 ITPR2(서열번호 3)
4 NW_003616412.1 127 79768 ERE67000.1(서열번호 4)
5 NW_003615063.1 372 315265 UBAP2(서열번호 5)
6 NW_006882936.1 3042 2662054 MTMR2(서열번호 6)
7 NW_003615411.1 277 97706 XP_003512331.2(서열번호 7)
특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접한 뉴클레오타이드 서열은 실험적으로 동정될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접한 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 외인성 뉴클레오타이드 서열로 통합된 하나 이상의 SOI에 의해 인코딩된 관심대상 폴리펩타이드를 바람직한 수준으로 발현하는 숙주 세포를 단리시키기 위한 게놈-와이드 스크리닝 접근법에 의해 동정될 수 있고, 여기서 외인성 서열은 그 자체로 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 좌위에 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접한 뉴클레오타이드 서열은 전위효소 기반 카세트 통합 이벤트 후 게놈-와이드 스크리닝 접근법에 의해 동정될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접한 뉴클레오타이드 서열은 완력 무작위 통합 스크리닝에 의해 동정될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접한 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 시퀀싱 접근법, 예를 들면, 표적 좌위 증폭(target locus amplification: TLA) 후, 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing: NGS) 및 전체 게놈 NGS에 의해 결정될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 염색체 상의 통합 부위의 위치는 통상적인 세포 생물학 접근, 예를 들면, 형광 동일 반응계 혼성화(fluorescence in-situ hybridization: FISH) 분석에 의해 결정될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 TI 숙주 세포의 게놈에서 특이적인 제1 좌위 내에 제1 통합 부위에서 통합된 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 게놈에서 특이적인 제2 좌위 내에 제2 통합 부위에서 통합된 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 TI 숙주 세포의 게놈에서 다중 통합 부위에서 통합된 다중 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 TI 숙주 세포는 적어도 2개의 별개의 외인성 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 적어도 하나의 RRS를 포함하는 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개 이상의 외인성 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 SOI의 도입을 위하여 표적화될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, SOI는 동일한 것이다. 특정한 실시형태에 있어서, SOI는 별개의 것이다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 부모 TI 숙주 세포는 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열의 통합 부위와 상이한 통합 부위에서 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 동일한 염색체 상에 있을 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 동일한 염색체에서 서로 1 내지 1,000개의 뉴클레오타이드, 1,000 내지 100,000개의 뉴클레오타이드, 100,000 내지 1,000,000개의 뉴클레오타이드 또는 그 초과 내에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 부위는 상이한 염색체 상에 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 하나의 통합 부위에서 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포는 동일하거나 상이한 통합 부위에서 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 그 초과의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 위하여 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 적어도 2개의 통합 부위의 재조합효소-매개된 카세트 교환(RMCE)의 실행가능성은 각각의 부위에 대하여 개별적으로 평가될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 적어도 2개의 통합 부위의 RMCE의 실행가능성은 동시에 평가될 수 있다. 다중 부위에서 RMCE의 실행가능성은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 폴리펩타이드 역가, 또는 폴리펩타이드 특이적 생산의 측정에 의해 평가될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 평가는 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들면, SOI(들)를 발현하는 TI 숙주 세포의 배양의 역가 및/또는 특이적 생산성을 평가함으로써 수행될 수 있다. 예시적인 배양 전략은 유가식 셰이크 플라스크 배양 및 생물반응기 유가식 배양을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 역가 및 특이적 생산성은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 이에 한정되지 않지만, ELISA, FACS, 형광계 마이크로볼륨 검정 기술(FMAT), 단백질-A 친화력 크로마토그래피, 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가될 수 있다.
3. 외인성 뉴클레오타이드 서열
외인성 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포로부터 기인하지는 않지만 전통적인 DNA 전달 방법에 의해, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 또는 형질전환 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있는 뉴클레오타이드 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 관심대상 서열(SOI), 예를 들면, 관심대상 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, 그러나, 본 개시내용의 맥락에서 사용되는 외인성 뉴클레오타이드 서열은 추가의 핵산 서열, 예를 들면, SOI의 도입을 촉진하는 요소, 예를 들면, 하나 이상의 재조합 인식 서열(RRs) 및 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 추가의 핵산 서열의 도입을 촉진하는 외인성 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 "랜딩 패드(landing pad)"로 지칭한다. 따라서, 특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 (1) 하나 이상의 SOI, 예를 들면, 외인성 부위-특이적 뉴클레아제 매개된(예를 들면, CRISPR/Cas9-매개된) 표적화된 통합을 통해 숙주 세포 게놈에서 특정한 좌위로 도입된 SOI를 포함하는 외인성 뉴클레오타이드 서열; (2) 하나 이상의 랜딩 패드를 포함하는 외인성 뉴클레오타이드 서열; 또는 (3) 하나 이상의 SOI가 도입된 하나 이상의 랜딩 패드를 포함하는 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, TI 숙주 세포는 TI 숙주 세포의 게놈에서 하나 이상의 통합 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열은 TI 숙주 세포의 게놈의 특정한 좌위 내에 하나 이상의 통합 부위에서 통합된다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, 적어도 하나의 외인성 핵산 서열은 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성인 하나 이상의 좌위에서 통합된다.
3.1 랜딩 패드
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 재조합 인식 서열(RRS)을 포함하고, 여기서 RRS는 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 2개의 RRS를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 2개의 RRS를 포함하고, 2개의 RRS는 동일하다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 2개의 RRS를 포함하고, 2개의 RRS는 이종특이성이고, 즉, 동일한 재조합효소에 의해 인식되지 않는다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 3개의 RRS를 포함하고, 여기서 제3 RRS는 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 RRS는 동일하고, 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 모든 3개의 RRS는 이종특이성이다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 RRS를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 다중 RRS를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 다중 2개 이상의 RRS는 동일하다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개 이상의 RRS는 이종특이성이다. 특정한 실시형태에 있어서, 각각의 RRS는 별개의 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS의 총 수의 하위세트는 단일특이성이고, 즉, 동일한 재조합효소에 의해 인식되고, RRS의 총 수의 하위세트는 이종특이성이고, 즉, 동일한 재조합효소에 의해 인식되지 않는다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS 또는 RRS들은 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열 및 φC31 attB 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 하나의 RRS 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1 및 제2 RRS, 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개의 RRS는 적어도 하나의 선택 마커에 측접하고, 즉, 제1 RRS는 5' 상류에 위치하고, 제2 RRS는 선택 마커의 3' 하류에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 RRS는 선택 마커의 5' 말단에 인접하고, 제2 RRS는 선택 마커의 3' 말단에 인접한다.
특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 제1와 제2 RRS 사이에 위치하고, 2개의 측접한 RRS는 동일하다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커에 측접한 2개의 RRS는 둘 다 LoxP 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커에 측접한 2개의 RRS는 둘 다 FRT 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치하고, 2개의 측접 RRS는 이종특이성이다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 측접 RRS는 LoxP L3 서열이고, 제2 측접 RRS는 LoxP 2L 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, LoxP L3 서열은 선택 마커의 5'에 위치하고, LoxP 2L 서열은 선택 마커의 3'에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 측접 RRS는 야생형 FRT 서열이고, 제2 측접 RRS는 돌연변이 FRT 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 측접 RRS는 Bxb1 attP 서열이고, 제2 측접 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 측접 RRS는 φC31 attP 서열이고, 제2 측접 RRS는 φC31 attB 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개의 RRS는 동일한 방향으로 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개의 RRS는 둘 다 정 또는 역 방향이다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개의 RRS는 반대 방향으로 위치한다.
특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 아미노글리코사이드 포스포트랜스페라제(APH)(예를 들면, 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티딘올 탈수소효소(히스티딘올 D), 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신, 또는 마이코페놀산에 대한 저항성 인코딩 유전자일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 GFP, eGFP, 합성 GFP, YFP, eYFP, CFP, m플럼, m체리, td토마토, m스트로베리, J-red, DsRed-단량체, m오렌지, mKO, m시트린, 비너스, YPet, 에메랄드, CyPet, mCFPm, 시룰리안, 또는 T-사파이어 마커일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 적어도 2개의 선택 마커를 포함하는 융합 구조체일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커 또는 선택 마커의 단편을 인코딩하는 유전자는 상이한 선택 마커 또는 이의 단편을 인코딩하는 유전자에 융합될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 2개의 RRS에 측접한 2개의 선택 마커를 포함하고, 여기서 제1 선택 마커는 제2 선택 마커와 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개의 선택 마커는 둘 다 글루타민 합성효소 선택 마커, 티미딘 키나제 선택 마커, HYG 선택 마커, 및 퓨로마이신 저항성 선택 마커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 티미딘 키나제 선택 마커 및 HYG 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 선택 마커는 아미노글리코사이드 포스포트랜스페라제(APH)(예를 들면, 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티딘올 탈수소효소(히스티딘올 D), 및 퓨로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신, 및 마이코페놀산에 대한 저항성 인코딩 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 선택 마커는 GFP, eGFP, 합성 GFP, YFP, eYFP, CFP, m플럼, m체리, td토마토, m스트로베리, J-red, DsRed-단량체, m오렌지, mKO, m시트린, 비너스, YPet, 에메랄드, CyPet, mCFPm, 시룰리안, 및 T-사파이어 마커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 선택 마커는 글루타민 합성효소 선택 마커이고, 제2 선택 마커는 GFP 마커이다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개의 RRS 측접 선택 마커는 둘 다 동일하다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개의 RRS 측접 선택 마커는 둘 다 상이하다.
특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 SV40 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 선택 마커 및 IRES를 포함하고, 여기서 IRES는 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, IRES에 작동가능하게 연결된 선택 마커는 GFP, eGFP, 합성 GFP, YFP, eYFP, CFP, m플럼, m체리, td토마토, m스트로베리, J-red, DsRed-단량체, m오렌지, mKO, m시트린, 비너스, YPet, 에메랄드, CyPet, mCFPm, 시룰리안, 및 T-사파이어 마커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에 있어서, IRES에 작동가능하게 연결된 선택 마커는 GFP 마커이다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 IRES, 및 2개의 RRS에 측접한 2개의 선택 마커를 포함하고, 여기서 IRES는 제2 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 IRES 및 2개의 RRS에 측접한 3개의 선택 마커를 포함하고, 여기서 IRES는 제3 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 IRES 및 2개의 RRS에 측접한 3개의 선택 마커를 포함하고, 여기서 IRES는 제3 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, 제3 선택 마커는 제1 또는 제2 선택 마커로부터 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 선택 마커 및 IRES에 작동가능하게 연결된 제2 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 SV40 프로모터에 작동가능하게 연결된 글루타민 합성효소 선택 마커 및 IRES에 작동가능하게 연결된 GFP 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 티미딘 키나제 선택 마커 및 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된 HYG 선택 마커 및 IRES에 작동가능하게 연결된 GFP 선택 마커를 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 3개의 RRS를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제3 RRS는 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 모든 3개의 RRS는 동일하다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 RRS는 동일하고, 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 모든 3개의 RRS는 이종특이성이다.
3.2 관심대상 서열(SOI)
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 선택 마커, 적어도 하나의 외인성 SOI, 및 적어도 하나의 RRS를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 그 초과의 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, SOI는 동일하다. 특정한 실시형태에 있어서, SOI는 상이하다.
특정한 실시형태 SOI는 단쇄 항체 또는 이의 단편을 인코딩한다. 특정한 실시형태에 있어서, SOI는 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩한다. 특정한 실시형태에 있어서, SOI는 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI 및 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI, 제2 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI, 및 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI, 제2 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI, 제1 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI 및 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 제2 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 중쇄 및 경쇄 서열을 인코딩하는 SOI의 수는, 예를 들면, 이중특이적 항체 생산의 원하는 양을 달성하기 위하여, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 원하는 발현 수준을 달성하도록 선택될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 중쇄 및 경쇄 서열을 인코딩하는 개별적인 SOI는, 예를 들면, 단일 통합 부위에 존재하는 단일 외인성 핵산 서열, 단일 통합 부위에 존재하는 다중 외인성 핵산 서열, 또는 TI 숙주 세포 내에 별개의 통합 부위에서 통합된 다중 외인성 핵산 서열로 통합될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 선택 마커, 적어도 하나의 외인성 SOI, 및 하나의 RRS를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS는 적어도 하나의 선택 마커 또는 적어도 하나의 외인성 SOI에 인접하게 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 선택 마커, 적어도 하나의 외인성 SOI, 및 2개의 RRS를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커 및 외인성 SOI에 측접한 2개의 RRS는 동일하다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커 및 외인성 SOI에 측접한 2개의 RRS는 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 측접 RRS는 LoxP L3 서열이고, 제2 측접 RRS는 LoxP 2L 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, L3 LoxP 서열은 선택 마커 및 외인성 SOI의 5'에 위치하고, LoxP 2L 서열은 선택 마커 및 외인성 SOI의 3'에 위치한다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 3개의 RRS 및 2개의 외인성 SOI를 포함하고, 제3 RRS는 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 SOI는 제1과 제3 RRS 사이에 위치하고, 제2 SOI는 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 SOI는 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 RRS는 동일하고, 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 모든 3개의 RRS는 이종특이성이다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 RRS는 LoxP L3 부위이고, 제2 RRS는 LoxP 2L 부위이고, 제3 RRS는 LoxFas 부위이다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 3개의 RRS, 1개의 외인성 SOI, 및 1개의 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, SOI는 제1 RRS와 제3 RRS 사이에 위치하고, 선택 마커는 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 3개의 RRS, 2개의 외인성 SOI, 및 1개의 선택 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 SOI 및 선택 마커는 제1과 제3 RRS 사이에 위치하고, 제2 SOI는 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다.
특정한 실시형태에 있어서, 외인성 SOI는 관심대상 폴리펩타이드를 인코딩한다. 이러한 관심대상 폴리펩타이드는 항체, 효소, 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 백신 단백질, 또는 치료 기능을 가진 단백질을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 SOI는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 SOI는 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 SOI(또는 SOI들)는 표준 항체를 인코딩한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 SOI(또는 SOI들)는 절반-항체, 예를 들면, 이에 한정되지는 않지만 본 개시내용의 항체 B, Q, T 및 mAb I를 인코딩한다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 SOI(또는 SOI들)는 복합체 항체를 인코딩한다. 특정한 실시형태에 있어서, 복합체 항체는 이중특이적 항체, 예를 들면, 이에 한정되지는 않지만, 본 개시내용의 이중특이적 분자 A, 이중특이적 분자 B, 이중특이적 분자 C, 또는 이중특이적 분자 D일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 SOI는 적어도 하나의 시스-작용 요소, 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서에 작동가능하게 연결된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 SOI는 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 2개의 RRS 및 2개의 RRS 사이에 위치된 적어도 2개의 외인성 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 2개의 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 항체의 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 2개의 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 카피의 상이한 조합을 인코딩하는 SOI는 2개의 RRS 사이에 위치한다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 3개의 RRS 및 적어도 2개의 외인성 SOI를 포함하고, 제3 RRS는 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 SOI은 제1과 제3 RRS 사이에 위치하고, 적어도 하나의 SOI는 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 RRS는 동일하고, 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 모든 3개의 RRS는 이종특이성이다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 제1과 제3 RRS 사이에 위치하고, 제2 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 제1과 제3 RRS 사이에 위치하고, 제2 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 항체의 1개의 중쇄 및 3개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 제1과 제3 RRS 사이에 위치하고, 제1 항체의 1개의 경쇄 및 제2 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 항체의 1개의 중쇄 및 3개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 제1과 제3 RRS 사이에 위치하고, 제1 항체의 2개의 경쇄 및 제2 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정한 실시형태에 있어서, 다중 항체의 중쇄 및 경쇄의 카피의 상이한 조합을 인코딩하는 SOI는 제1과 제3 RRS 사이에 위치하고, 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한다.
특정한 실시형태에 있어서, SOI의 수는 SOI를 발현하는 숙주 세포의 역가 및/또는 특이적 생산성을 증가시키도록 선택된다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 초과의 SOI의 도입은 증가된 역가 및/또는 특이적 생산성을 야기할 수 있다.
항체 발현의 맥락에서, 추가의 중쇄 또는 경쇄 인코딩 SOI의 포함은 증가된 역가 및/또는 특이적 생산성을 야기할 수 있다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄(HL)에서 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄 인코딩 서열(HLL)로의 카피 수가 증가하는 경우, 역가 및/또는 특이적 생산성에서의 증가가 달성될 수 있다. 유사하게, 하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, HLL(3개의 SOI)에서 HLL-HL(5개의 SOI) 또는 HLL-HLL(6개의 SOI)로의 증가는 역가 및/또는 특이적 생산성에서의 증가를 제공할 수 있다. 추가로, HLL-HL(5개의 SOI) 또는 HLL-HLHL(7개의 SOI)로의 카피 수의 증가는 역가 및/또는 특이적 생산성에서의 증가를 제공할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 SOI 카피 수에 대한 추가의 선택사항은 HHL; HHL-H; HLL-H; HHL-HH; HHL-HL; HHL-LL; HLL-HH; HLL-HL; HLL-LL; HHL-HHL; HHL-HHH; HHL-HLL; HHK-LLL; HLL-HHL; HLL-HHH; HLL-LLL; HHL-HHHL; HHL-HHHH; HHL-HHLL; HHL-HLLL; HHL-LLLL; HLL-HHHL; HLL-HHHH; HLL-HLLL; 및 HLL-LLLL을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 특정한 실시형태에 있어서, 추가의 카피의 포함은 단일 게놈 좌위에서 발생하고, 특정한 실시형태에 있어서, SOI 카피는 2개 이상의 좌위에서 통합될 수 있고, 예를 들면, 다중 카피는 단일 좌위에서 통합될 수 있고, 하나 이상의 카피는 하나 이상의 추가의 좌위에서 통합될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, SOI의 위치는, 예를 들면, 하나의 SOI가 또 다른 SOI에 관하여 3' 또는 5'에 위치하는지 여부와 관계없이, SOI를 발현하는 숙주 세포의 역가 및/또는 특이적 생산성을 증가시키도록 선택된다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, 항체 생산의 맥락에서, 중쇄 및 경쇄 SOI의 통합된 위치는 증가된 역가 및/또는 특이적 생산성을 야기할 수 있다. 도 23A 내지 도 23D 및 하기 나타낸 실시예에 기술된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 SOI의 상대적인 위치는 SOI 카피 수의 변화가 없음에도 불구하고 역가 및 특이적 생산성에 영향을 미칠 수 있다.
4. 숙주 세포
본 명세서에 개시된 주제는 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합 및 관심대상 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포를 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 및 이들과 적어도 50% 상동성인 서열, 또는 숙주 세포의 게놈의 좌위로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자를 포함하고, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7 및 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포이다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포이다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포 또는 CHO K1M 숙주 세포이다.
특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주(COS-7), 인간 배아 신장 주(예를 들면, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59(1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양(MMT 060562), 예를 들면, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)]에 기재된 바와 같은TRI 세포, MRC 5 세포, FS4 세포, Y0 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포 및 PER.C6® 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 세포주이다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 특정한 세대 수 동안 배양된 세포주이다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 일차 세포이다.
특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 폴리펩타이드의 발현은 10, 20, 30, 50, 100, 200, 또는 300 세대 동안 발현 수준의 특정한 수준으로 유지되거나, 20% 미만으로 증가 또는 감소하는 경우에 안정하다. 특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 폴리펩타이드의 발현은 배양이 임의의 선택 없이 유지될 수 있는 경우에 안정하다. 특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 폴리펩타이드의 발현은 관심대상 유전자의 폴리펩타이드 생성물이 약 1 g/ℓ, 약 2 g/ℓ, 약 3 g/ℓ, 약 4 g/ℓ, 약 5 g/ℓ, 약 10 g/ℓ, 약 12g/ℓ, 약 14 g/ℓ, 또는 약 16g/ℓ를 도달하는 경우에 높다.
본 명세서에 개시된 주제는 또한 관심대상 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에 통합된 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; 및 b) SOI를 발현하는데 적합한 조건하에 a)에서의 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에 통합된 적어도 2개의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 적어도 하나의 외인성 SOI 및 하나의 선택 마커는 제1 및 제3 RRS에 측접하고, 적어도 하나의 외인성 SOI는 제2 및 제3 RRS에 측접하는, 단계; 및 b) SOI를 발현하는데 적합한 조건하에 a)에서의 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 a) LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이의 적어도 약 90% 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내에 통합된 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 b) SOI를 발현하는데 적합한 조건하에 a)에서의 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 a) LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내에 통합된 적어도 2개의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 외인성 SOI 및 하나의 선택 마커는 제1 및 제3 RRS에 측접하고, 적어도 하나의 외인성 SOI는 제2 및 제3 RRS에 측접하는, 단계; 및 b) SOI를 발현하는데 적합한 조건하에 a)에서의 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 폴리펩타이드는 세포 배양 배지로부터 생성되고 이로 분비된다. 특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 폴리펩타이드는 숙주 세포 내에서 발현되고 유지된다. 특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 폴리펩타이드는 숙주 세포막에서 발현되고, 이에 삽입되고, 유지된다.
관심대상 외인성 뉴클레오타이드 또는 벡터는 형질감염, 형질도입, 전기천공, 또는 주입을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 통상적인 세포 생물학 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 외인성 뉴클레오타이드 또는 벡터는 지질 기반의 형질감염 방법, 인산칼슘 기반의 형질감염 방법, 양이온성 중합체 기반의 형질감염 방법, 또는 나노입자 기반의 형질감염을 포함하는 화학 기반의 형질감염 방법에 의해 숙주 세포에 도입된다. 특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 외인성 뉴클레오타이드는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스-매개된 형질도입을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 바이러스-매개된 형질도입에 의해 숙주 세포에 도입된다. 특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 외인성 뉴클레오타이드 또는 벡터는 유전자 건-매개된 주입을 통해 숙주 세포에 도입된다. 특정한 실시형태에 있어서, DNA 및 RNA 분자는 둘 다 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입된다.
5. 표적화된 통합
표적화된 통합은 외인성 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 미리 결정된 부위로 통합되는 것을 가능하게 한다. 특정한 실시형태에 있어서, 표적화된 통합은 하나 이상의 RRS를 인식하는 재조합효소에 의해 매개된다. 특정한 실시형태에 있어서, 표적화된 통합은 상동성 재조합에 의해 매개된다. 특정한 실시형태에 있어서, 표적화된 통합은 외인성 부위-특이적 뉴클레아제 후, HDR 및/또는 NHEJ에 의해 매개된다.
5.1. 재조합효소-매개된 재조합을 통한 표적화된 통합
"재조합 인식 서열"(RRS)은 재조합효소에 의해 인식된 뉴클레오타이드 서열이고, 재조합효소-매개된 재조합 사건에 필요하고 충분하다. RRS는 뉴클레오타이드 서열에서 발생할 위치를 정의하는데 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열 및 φC31 attB 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시형태에 있어서, RRS는 Cre 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS는 FLP 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS는 Bxb1 인테그라제에 의해 인식될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS는 φC31 인테그라제에 의해 인식될 수 있다.
RRS가 LoxP 부위인 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위하여 Cre 재조합효소를 필요로 한다. RRS가 FRT 부위인 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위하여 FLP 재조합효소를 필요로 한다. RRS가 Bxb1 attP 또는 Bxb1 attB 부위인 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위하여 Bxb1 인테그라제를 필요로 한다. RRS가 φC31 attP 또는 φC31attB 부위인 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위하여 φC31 인테그라제를 필요로 한다. 재조합효소는 효소의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 숙주 세포에 도입될 수 있다.
Cre-LoxP 부위-특이적 재조합 시스템은 다수의 생물학적 실험 시스템에서 널리 사용되어 왔다. Cre는 34 bp LoxP 서열을 인식하는 38-kDa 부위-특이적 DNA 재조합효소이다. Cre는 박테리오파지 P1로부터 유래되고, 티로신 패밀리 부위-특이적 재조합효소에 속한다. Cre 재조합효소는 LoxP 서열 사이의 분자내 및 분자간 재조합 둘 다를 매개할 수 있다. LoxP 서열은 2개의 13 bp 역 반복에 측접한 8 bp 비재발성 코어 영역으로 구성된다. Cre 재조합효소는 13 bp 반복에 결합하고, 이로써 8 bp 코어 영역 내의 재조합을 매개한다. Cre-LoxP-매개된 재조합은 높은 효율로 발생하고, 임의의 다른 숙주 인자를 필요로 하지 않는다. 2개의 LoxP 서열이 동일한 same 뉴클레오타이드 서열 상에 동일한 방향으로 위치하는 경우, Cre-매개된 재조합은 공유적으로 폐쇄된 원으로서 2개의 LoxP 서열 사이에 위치한 DNA 서열을 절단할 것이다. 2개의 LoxP 서열이 동일한 뉴클레오타이드 서열 상의 역 위치에 위치하는 경우, Cre-매개된 재조합은 2개의 서열 사이에 위치한 DNA 서열의 방향을 역전시킬 것이다. LoxP 서열은 또한 상이한 염색체 사이의 재조합을 촉진하기 위하여 상이한 염색체 상에 위치할 수 있다. 2개의 LoxP 서열이 2개의 상이한 DNA 분자 상에 있는 경우 및 하나의 DNA 분자가 원형인 경우, Cre-매개된 재조합은 원형 DNA 서열의 통합을 야기할 것이다.
특정한 실시형태에 있어서, LoxP 서열은 야생형 LoxP 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, LoxP 서열은 돌연변이 LoxP 서열이다. 돌연변이 LoxP 서열은 Cre-매개된 통합 또는 교체의 효율을 증가시키도록 개발되었다. 특정한 실시형태에 있어서, 돌연변이 LoxP 서열은 LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, 및 Lox66 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들면, Lox71 서열은 좌측 13 bp 반복에서 돌연변이된 5 bp를 갖는다. Lox66 서열은 우측 13 bp 반복에서 돌연변이된 5 bp를 갖는다. 야생형 및 돌연변이 LoxP 서열 둘 다는 Cre-의존성 재조합을 매개할 수 있다.
FLP-FRT 부위-특이적 재조합 시스템은 Cre-Lox 시스템과 유사하다. 이는 플립파제(FLP) 재조합효소를 포함하고, 이는 이스트 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 2 μm 플라스미드로부터 유래된다. FLP는 또한 티로신 패밀리 부위-특이적 재조합효소에 속한다. FRT 서열은 각각 8 bp 스페이서에 측접한 13 bp의 2개의 재발성 서열로 구성된 34 bp 서열이다. FLP는 13 bp 재발성 서열에 결합하고, 8 bp 스페이서 내에서 DNA 파괴, 교환 및 결찰을 매개한다. Cre 재조합효소와 유사하게, 2개의 FRT 서열의 위치 및 방향은 FLP-매개된 재조합의 결과를 결정한다. 특정한 실시형태에 있어서, FRT 서열은 야생형 FRT 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, FRT 서열은 돌연변이 FRT 서열이다. 야생형 및 돌연변이 FRT 서열은 둘 다 FLP-의존성 재조합을 매개할 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, FRT 서열은 반응성 수용체 도메인 서열, 예를 들면, 한정되지는 않지만, 타목시펜 반응성 수용체 도메인 서열에 융합된다.
Bxb1 및 φC31은 세린 재조합효소 패밀리에 속한다. 이들은 둘 다 박테리오파지로부터 유래되고, 박테리아 게놈으로의 파지 게놈의 부위-특이적 통합을 촉진하기 위하여 용원성을 설정하기 위하여 이들 박테리오파지에 의해 사용된다. 이들 인테그라제는 각각 파지 DNA 및 박테리아 DNA에 위치한 원래 부착 부위인 attP 및 attB 서열로 지칭되는 짧은(40 내지 60 bp) DNA 기질 사이에서 부위-특이적 재조합 사전을 촉매한다. 재조합 후, 2개의 새로운 서열이 형성되고, 이는 attL 및 attR 서열로 지칭되고, 각각은 attP 및 attB로부터 유래된 절반 서열을 함유한다. 재조합은 또한 attL과 attR 서열 사이에서 발생하여 박테리아 DNA의 통합된 파지를 절단할 수 있다. 인테그라제는 둘 다 임의의 추가의 숙주 인자의 보조 없이 재조합을 촉매할 수 있다. 임의의 보조 인자의 부재하에, 이들 인테그라제는 80% 초과의 효율로 attP와 attB 사이에서 단일방향 재조합을 매개한다. 이들 인테그라제 및 단일방향 재조합에 의해 인식될 수 있는 짧은 DNA 서열로 인하여, 이들 재조합 시스템은 유전자 조작 목적을 위하여 널리 사용되는 Cre-LoxP 및 FRT-FLP 시스템에 대한 보충으로서 개발되었다.
용어 "정합 RRS" 및 "단일특이적 RRS"는 재조합이 2개의 RRS 사이에서 발생한다는 것을 나타낸다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개의 정합 RRS는 동일하다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS는 둘 다 야생형 LoxP 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS는 둘 다 돌연변이 LoxP 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS는 둘 다 야생형 FRT 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, RRS는 둘 다 돌연변이 FRT 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, 2개의 정합 RRS는 상이한 서열이지만, 동일한 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 정합 RRS는 Bxb1 attP 서열이고, 제2 정합 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 정합 RRS는 φC31 attB 서열이고, 제2 정합 RRS는 φC31 attB 서열이다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 2개의 RRS를 포함하고, 벡터는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하는 2개의 RRS를 포함하고, 즉, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 RRS는 벡터 상의 제1 RRS에 정합하고, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 RRS는 벡터 상의 제2 RRS에 정합한다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 RRS 및 벡터 상의 제1 RRS는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 RRS 및 벡터 상의 제2 RRS와 동일하다. 이러한 "단일-벡터 RMCE" 전략의 비제한적인 예는 도 2A에 도시된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 RRS 및 벡터 상의 제1 RRS는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 RRS 및 벡터 상의 제2 RRS와 상이하다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 RRS 및 벡터 상의 제1 RRS는 둘 다 LoxP L3 서열이고, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 RRS 및 벡터 상의 제2 RRS는 둘 다 LoxP 2L 서열이다.
특정한 실시형태에 있어서, "2-벡터 RMCE" 전략이 사용된다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열은 3개의 RRS, 예를 들면, 제3 RRS("RRS3")가 제1 RRS("RRS1")와 제2 RRS("RRS2") 사이에 존재하고, 제1 벡터는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하는 2개의 RRS를 포함하고, 제2 벡터는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제3 및 제2 RRS에 정합하는 2개의 RRS를 포함하는 배열을 포함할 수 있다. 2개의 벡터 RMCE 전략의 예는 도 4에 도시된다. 이러한 예에서, RRS1, RRS2, 및 RRS3은 이종특이성이고, 예를 들면, 이들은 서로 교차 반응하지 않는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 하나의 벡터(앞)는 RRS1, 제1 SOI 및 프로모터 후, 개시 코돈 및 RRS3(이 순서로)를 포함한다. 다른 벡터(뒤)는 개시 코돈(ATG)이 없는 마커의 코딩 서열에 융합된 RRS3, SOI 2 및 RRS2(이 순서로)를 포함한다. 추가의 뉴클레오타이드는 RRS3 부위와 선택 마커 서열 사이에 삽입되어 융합 단백질을 위한 프레임 번역을 보장할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1 SOI는 항체를 인코딩한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제2 SOI는 항체를 인코딩한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질이다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 SOI에 의해 인코딩된 항체는 쌍을 이루어 다중특이적, 예를 들면, 이중특이적 항체를 형성한다.
이러한 2개의 벡터 RMCE 전략은 RRS의 각각의 쌍 사이에 SOI의 적절한 수를 도입함으로써 8개 이상의 SOI의 도입을 가능하게 한다.
단일-벡터 및 2-벡터 RMCE는 둘 다 숙주 세포 게놈의 미리 결정된 부위로의 하나 이상의 도너 DNA 분자(들)의 단일방향 통합, 및 통합 부위가 거주하는 숙주 게놈 상의 DNA 카세트를 갖는 도너 DNA 상에 존재하는 DNA 카세트의 정확한 교환을 가능하게 한다. DNA 카세트는 적어도 하나의 선택 마커(특정한 2-벡터 RMCE 예에서 "스플리트 선택 마커"가 본 명세서에 기술된 바와 같이 사용될 수 있음에도 불구하고) 및/또는 적어도 하나의 외인성 SOI에 측접한 2개의 이종특이성 RRS를 특징으로 한다. RMCE는 표적 게놈 좌위 및 도너 DNA 분자 내의 2개의 이종특이성 RRS 사이에서 재조합 효소에 의해 촉매되는 이중 재조합 교차 사건을 포함한다. RMCE는 숙주 세포 게놈의 미리 결정된 좌위로의 SOI 또는 선택 마커의 카피를 도입하도록 설계된다. 단지 하나의 교차 사건을 포함하는 재조합과 달리, RMCE는 원핵 벡터 서열이 숙주 세포 게놈으로 도입되지 않고, 따라서 숙주 면역 또는 방어 메커니즘의 원치않는 촉발을 감소 및/또는 방지하도록 실시될 수 있다. RMCE 절차는 다중 DNA 카세트로 반복될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 표적화된 통합은 하나의 교차 재조합 사건에 의해 달성되고, 여기서 적어도 하나의 외인성 SOI 또는 적어도 하나의 선택 마커에 인접한 하나의 RRS를 포함하는 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포 게놈의 미리 결정된 부위로 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 표적화된 통합은 하나의 RMCE에 의해 달성되고, 여기서 2개의 이종특이성 RRS에 측접한 적어도 외인성 SOI 또는 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 DNA 카세트는 숙주 세포 게놈의 미리 결정된 부위로 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 표적화된 통합은 2개의 RMCE에 의해 달성되고, 여기서 2개의 이종특이성 RRS에 측접한 적어도 외인성 SOI 또는 적어도 하나의 선택 마커를 각각 포함하는 2개의 상이한 DNA 카세트는 둘 다 숙주 세포 게놈의 미리 결정된 부위로 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 표적화된 통합은 다중 RMCE에 의해 달성되고, 여기서 2개의 이종특이성 RRS에 측접한 적어도 외인성 SOI 또는 적어도 하나의 선택 마커를 각각 포함하는 다중 벡터로부터의 DNA 카세트는 숙주 세포 게놈의 미리 결정된 부위로 모두 통합된다. 특정한 실시형태에 있어서, 선택 마커는 RMCE 둘 다의 통합이 선택 마커의 발현을 가능하게 하도록 제1 벡터 상에 부분적으로 인코딩되고, 제2 벡터 상에 부분적으로 인코딩될 수 있다. 이러한 시스템의 예는 도 4에 도시된다.
특정한 실시형태에 있어서, 재조합효소-매개된 재조합을 통한 표적화된 통합은 원핵 벡터로부터의 서열과 함께 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 미리 결정된 통합 부위로 통합된 선택 마커 또는 하나 이상의 외인성 SOI를 야기한다. 특정한 실시형태에 있어서, 재조합효소-매개된 재조합을 통한 표적화된 통합은 원핵 벡터로부터의 서열을 갖지 않는 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 미리 결정된 통합 부위로 통합된 선택 마커 또는 하나 이상의 외인성 SOI를 야기한다.
5.2 상동성 재조합, HDR, 또는 NHEJ를 통한 표적화된 통합
본 명세서에 개시된 주제는 또한 상동성 재조합 또는 외인성 부위-특이적 뉴클레아제 후, HDR 또는 NHEJ에 의하여 매개된 표적화된 통합에 관한 것이다.
상동성 재조합은 광범위한 서열 상동성을 공유하는 DNA 분자 사이의 재조합이다. 이는 이중 가닥 DNA의 무오류 복구가 파괴되고 감수분열 동안 생식체에서 서열 변동을 발생시키도록 지정하는데 사용될 수 있다. 상동성 재조합은 2개의 상동성 DNA 분자 사이의 유전적 정보의 교환을 포함하기 때문에, 이는 염색체 상의 유전자의 전체 배열을 변경하지 않는다. 상동성 재조합 동안, 이중 가닥 DNA(dsDNA)에서 흠 또는 파괴 형태 후, 단일 가닥 DNA 말단에 의한 상동성 dsDNA 분자의 침입, 상동성 서열의 짝지음, 홀리데이 접합부를 형성하는 가지 이동, 및 홀리데이 접합부의 최종 해결이 뒤따른다.
이중 가닥 파괴(DSB)는 DNA 손상의 가장 심각한 형태이고, 이러한 DNA 손상의 복구는 모든 유기체에서 게놈 완전성의 유지를 위하여 필수적이다. DSB를 복구하기 위하여 두 가지 주요 복구 경로가 존재한다. 제1 복구 경로는 상동성 지정 복구(HDR) 경로이고, 상동성 재조합은 HDR의 가장 흔한 형태이다. HDR이 세포에 존재하는 상동성 DNA의 존재를 필요로 하기 때문에, 이러한 복구 경로는 세포 주기의 S 및 G2 기에서 정상적으로 활성이고, 여기서 새로 복제된 자매 염색분체는 상동성 주형으로 이용 가능하다. HDR은 또한 DNA 복제 동안 붕괴된 복제 포크를 복구하는 주요 복구 경로이다. HDR은 상대적으로 무오류 복구 경로로 간주된다. DSB에 대한 제2 복구 경로는 비상동성 말단 접합(NHEJ)이다. NHEJ는 파괴된 DNA의 말단이 상동성 DNA 주형에 대한 필요 없이 함께 결찰되는 복구 경로이다.
표적화된 통합은 외인성 부위-특이적 뉴클레아제 후, HDR에 의해 촉진될 수 있다. 이는 상동성 재조합의 빈도가 특이적 표적 게놈 부위에서 DSB를 도입함으로써 증가될 수 있기 때문이다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 조작된 메가뉴클레아제, 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(CRISPR)-관련(Cas) 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
CRISPR/Cas 및 TALEN 시스템은 가장 용이한 건설 및 높은 효율을 제공하는 2개의 게놈 편집 도구이다. CRISPR/Cas는 박테리오파지 침입에 대항하는 박테리아의 면역 방어 메커니즘으로 확인되었다. Cas는 합성 가이드 RNA(gRNA)에 의해 가이드되는 경우, 세포에서 특이적 뉴클레오타이드 서열과 연관될 수 있고, 뉴클레오타이드 서열에서 또는 근처에서, 예를 들면, 단일 가닥 파괴, DSB, 및/또는 점 돌연변이 중 하나 이상을 만듦으로써, DNA를 편집할 수 있는 뉴클레아제이다. TALEN은 TALE(전사 활성인자-유사 이펙터)의 DNA-결합 도메인 및 제한 엔도뉴클레아제 FokI의 촉매 도메인으로 구성된 조작된 부위-특이적 뉴클레아제이다. DNA 결합 도메인의 단량체의 높은 가변성의 잔여 영역에 존재하는 아미노산을 변경함으로써, 다양한 뉴클레오타이드 서열을 표적화하는 상이한 인공 TALEN이 생성될 수 있다. DNA 결합 도메인은 후속적으로 뉴클레아제를 표적 서열에 지정하고 DSB를 생성한다.
상동성 재조합 또는 HDR을 통한 표적화된 통합은 통합 부위에 상동성 서열의 존재를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 상동성 서열은 벡터 상에 존재한다. 특정한 실시형태에 있어서, 상동성 서열은 폴리뉴클레오타이드 상에 존재한다.
특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합을 위한 벡터는 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자, 또는 적어도 하나의 선택 마커에 측접하는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합을 위한 벡터는 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자, 또는 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합을 위한 벡터는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합을 위한 벡터는 DNA 카세트에 측접하는 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자와 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 벡터 뉴클레오타이드 서열은 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자, 또는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다. 특정한 실시형태에 있어서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 전위효소 벡터, 인테그라제 기질 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합을 위한 폴리뉴클레오타이드는 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자, 또는 적어도 하나의 선택 마커에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합을 위한 폴리뉴클레오타이드는 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자, 또는 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합을 위한 폴리뉴클레오타이드는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합을 위한 폴리뉴클레오타이드는 DNA 카세트에 측접한 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자와 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 측접 뉴클레오타이드 서열은 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 XP_003512331.2로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자, 또는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정한 실시형태에 있어서, 상동성 재조합은 임의의 보조 인자 없이 수행된다. 특정한 실시형태에 있어서, 상동성 재조합은 통합할 수 있는 벡터의 존재에 의해 촉진된다. 특정한 실시형태에 있어서, 통합 벡터는 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 통합 파지 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5.3 조절된 표적화된 통합
주로 인코딩된 단백질이 발현되기 어렵기 때문에 단백질 발현 수준이 최적이 아닌 경우가 많이 있다. 발현되지 어려운 단백질의 낮은 발현 수준은 다양할 수 있고, 원인을 확인하기 어려울 수 있다. 한 가지 가능성은 숙주 세포에서 발현된 단백질의 독성이다. 이러한 경우에, 조절된 발현 시스템은 단백질을 인코딩하는 관심대상 서열이 유도성 프로모터의 제어하에 있는 독성 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들 시스템에서, 발현되기 어려운 단백질의 발현은 조절제, 예를 들면, 소분자, 예를 들면, 이에 한정되지는 않지만, 테트라사이클린 또는 이의 아날로그, 독시사이클린(DOX)이 배양에 첨가되는 경우에만 오직 촉진된다. 독성 단백질의 발현의 조절은 독성 효과를 완화시킬 수 있고, 배양이 생산 전에 원하는 세포 성장을 달성하게 할 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 조절된 표적 통합(RTI) 시스템은 특정 좌위에서 통합되는 SOI, 예를 들면, 하나 이상의 RRS를 포함하는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 이에 작동가능하게 연결된 조절된 프로모터하에 전사된다. 특정한 실시형태에 있어서, RTI 시스템은 발현되기 어려운 분자, 예를 들면, 이에 한정되지는 않지만, 항체에 대한 낮은 단백질 발현의 근본적인 원인을 결정하는데 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, RTI 시스템에서 SOI의 발현을 선택적으로 끄는 능력은 SOI의 발현을 관찰된 부작용과 연결짓는데 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 발현되기 어려운 분자의 근본 원인 분석 동안 전사 및 세포주 가변성 효과를 최소화하기 위하여, 조절된 표적 통합(RTI) 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, TI 숙주에서 SOI의 발현은 조절제, 예를 들면, 독시사이클린의 배양에 첨가함으로써 촉발될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, RTI 벡터는 테트라사이클린-조절된 프로모터를 이용하여 SOI를 발현하고, 이는, 예를 들면, 그 자체가 숙주 세포의 게놈에서 통합 부위로 통합된 RRS를 포함하는 외인성 핵산 서열로 통합될 수 있고 이는 SOI의 조절된 발현을 가능하게 한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용에 기재된 RTI 시스템은 대조군 세포주와 비교하여 SOI, 예를 들면, 치료용 항체의 낮은 단백질 발현의 근본적인 원인(들)을 성공적으로 결정하는데 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, RTI 세포주에서 SOI, 예를 들면, 치료용 항체의 더 낮은 상대적인 발현이 확인되면, SOI의 세포내 축적 및 분비 수준은 레버리징 단백질 번역 억제인자 처리, 예를 들면, Dox 및 사이클로헥스이미드에 의해 평가될 수 있다.
5.4 조절된 시스템
본 명세서에 개시된 주제는 또한 TI에서 사용하기 위한 조절된 시스템에 관한 것이다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, 이러한 조절은 구성요소이거나 최소한의 프로모터에 대한 전사 억제인자 또는 활성제의 조절된 커플링에 의해 mRNA 합성을 차단하거나 활성화하는 유전자 스위치를 기반으로 할 수 있다. 특정한 비제한적인 실시형태에 있어서, 억제는 억제인자 단백질, 예를 들면, 단백질이 전사 개시를 입체적으로 차단하는 억제인자 단백질의 결합에 의해, 또는 전사 사일런서를 통해 적극적으로 전사를 억제함으로써 달성될 수 있다. 특정한 비제한적인 실시형태에 있어서, 포유동물 또는 바이러스 인핸서가 없는 최소 프로모터의 활성화는 활성 도메인에 대한 조절된 커플링에 의해 달성될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 전사 억제인자 또는 활성제의 조건부 커플링은 외부 자극에 대한 반응으로 프로모터에 결합하는 알로스테릭 단백질을 사용하여 달성될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 전사 억제인자 또는 활성제의 조건부 커플링은 격리 단백질로부터 방출되고, 따라서 표적 프로모터에 결합할 수 있는 세포내 수용체를 사용하여 달성될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 전사 억제인자 또는 활성제의 조건부 커플링은 화학적으로 유도된 이량체화제를 사용하여 달성될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 TI 시스템에서 사용되는 알로스테릭 단백질은 항생제, 박테리아 쿼럼-감지 메신저(bacterial quorum-sensing messenger), 이화생성물(catabolite), 또는 배양 파라미터, 예를 들면, 온도, 예를 들면, 차가운 또는 열에 대한 반응으로 전사 활성을 조절하는 단백질일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 이러한 RTI 시스템은 이화생성물 기반일 수 있고, 예를 들면, 여기서 대안적인 탄소원을 위하여 이화작용 유전자를 조절하는 박테리아 억제인자는 포유동물 세포로 이동된다. 특정한 실시형태에 있어서, 표적 프로모터의 억제는 억제인자 CymR의 큐메이트-반응성 결합에 의해 달성될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 이화생성물 기반의 시스템은 헤르페스 단순 VP16 전사활성화 도메인에 융합된 원핵 억제인자 HdnoR의 6-하이드록시니코틴-반응성 결합에 의한 키메라 프로모터의 활성화에 의존할 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, TI 시스템은 쿼럼-감지 분자에 의해 집단내 및 집단간 소통을 관리하는 원핵생물로부터 기원한 쿼럼-감지 기반의 발현 시스템일 수 있다. 이들 쿼럼-감지 분자는 표적 세포에서 수용체에 결합하고, 특이적인 레굴론 스위치의 개시를 야기하는 동족 프로모터에 대한 수용체의 친화력을 조절한다. 특정한 실시형태에 있어서, 쿼럼-감지 분자는 N-(3-옥소-옥타노일)-호모세린 락톤은 이의 존재하에 TraR-p65 융합 단백질이 TraR-특이적 오퍼레이터 서열에 융합된 최소 프로모터로부터의 발현을 활성화시킨다. 특정한 실시형태에 있어서, 쿼럼-감지 분자는 SCB1의 부재하에 이의 동족 오퍼레이터 OScbR에 결합하는 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor) A3(2) ScbR 억제인자를 기반으로 한 시스템에서 부티로락톤 SCB1(라세미 2-(1'-하이드록시-6-메틸헵틸)-3-(하이드록시메틸)-부타놀리드)일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 쿼럼-감지 분자는 RTI 시스템에서 사용되는 호모세린-유래된 유발인자일 수 있고, 여기서 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 쿼럼-감지 억제인자 RhlR 및 LasR은 SV40 T-항원 핵 위치화 서열 및 헤르페스 단순 VP16 도메인에 융합되고, 특이적인 오퍼레이터 서열(las 박스)를 함유하는 프로모터를 활성화시킬 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 RTI 시스템에서 사용되는 알로스테릭 단백질을 조절하는 유도 분자는 큐메이트, 아이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG), 매크롤라이드, 6-하이드록시니코틴, 독시사이클린, 스트렙토그라민, NADH, 테트라사이클린일 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 RTI 시스템에서 사용되는 세포내 수용체는 세포질 또는 핵 수용체일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 RTI 시스템은 소분자를 사용하여 단백질을 격리하고 억제하는 것으로부터 전사 입자의 방출을 이용할 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 RTI 시스템은 스테로이드-조절에 의존할 수 있고, 여기서 호르몬 수용체는 사이토졸에서 HSP90로부터 방출될 수 있는 천연 또는 인공 전사 인자에 융합되고, 핵으로 이동하고, 선택된 프로모터를 활성화시킨다. 특정한 실시형태에 있어서, 돌연변이 수용체는 내인성 스테로이드 호르몬에 의한 혼선을 피하기 위하여 합성 스테로이드 아날로그에 의해 조절되는 것을 사용할 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 수용체는 4-하이드록시타목시펜에 반응성인 에스트로겐 수용체 변이체 또는 RU486에 의해 유도될 수 있는 프로게스테론-수용체 돌연변이일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 인간 핵 퍼옥시좀 증식체-활성화된 수용체 γ(PPARγ)를 기반으로 한 핵 수용체-유래된 로시글리타존-반응성 전사 스위치는 본 개시내용의 RTI 시스템에서 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 스테로이드-반응성 수용체의 변이체는 RheoSwitch일 수 있고, 이는 개질된 코리스토네우라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana) 엑디손 수용체(ecdysone receptor) 및 Gal4 DNA 결합 도메인 및 VP16 트랜스-활성제에 융합된 마우스 레티노이드 X 수용체(RXR)를 기반으로 한다. 합성 엑디손의 존재하에, RheoSwitch 변이체는 Gal4-반응 요소의 몇몇 반복에 융합된 최소 프로모터에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 RTI 시스템은 DNA-결합 단백질의 화학적으로 유도된 이량체화 및 동족 오퍼레이터와 융합된 최소 코어 프로모터의 활성화를 위한 전사 활성제를 이용할 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 RTI 시스템은 FRB를 갖는 FKBP의 라파마이신-조절된 이량체화를 이용할 수 있다. 이러한 시스템에서, FRB는 p65 트랜스-활성제에 융합되고, FKBP는 조작된 최소 인터류킨-12 프로모터의 상류에 위치한 동족 오퍼레이터 부위에 특이적인 징크 핑거 도메인에 융합된다. 특정한 실시형태에 있어서, FKBP는 돌연변이될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 RTI 시스템은 박테리아 자이라제 B 아단위(GyrB)를 이용할 수 있고, 여기서 GyrB는 항생제 코우메르마이신의 존재하에 이량체화되고 노보바이오신과 해리된다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 RTI 시스템은 조절된 siRNA 발현을 위하여 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 조절된 siRNA 발현 시스템은 테트라사이클린, 매크롤라이드, 또는 OFF- 및 ON-유형 QuoRex 시스템일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, RTI 시스템은 제노푸스(Xenopus) 말단 올리고피리미딘 요소(TOP)를 이용할 수 있고, 이는 5' 미번역 영역에서 헤어핀 구조를 형성함으로써 번역 개시를 차단한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용에 기재된 RTI 시스템은 기체상 조절된 발현, 예를 들면, 아세트알데히드-유도된 조절(AIR) 시스템을 이용할 수 있다. AIR 시스템은 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) AlcR 전사 인자를 이용할 수 있고, 이는 비독성 농도에서 기체 또는 액체 아세트알데히드의 존재하에 최소 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터에 융합된 AlcR-특이적 오퍼레이터로부터 조립된 PAIR 프로모터를 특이적으로 활성화한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 RTI 시스템은 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템을 이용할 수 있다. 이러한 시스템에서, 하나 이상의 SOI의 발현은 테트라사이클린 또는 이의 아날로그, 독시사이클린에 의해 조절될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 RTI 시스템은 PIP-on 또는 PIP-off 시스템을 이용할 수 있다. 이러한 시스템에서, SOI의 발현은, 예를 들면, 프리스티나아미신, 테트라사이클린 및/또는 에리트로마이신에 의해 조절될 수 있다.
6. TI 숙주 세포의 제조 및 사용
본 명세서에 개시된 주제는 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 통합의 방법에 관한 것이다. 특정한 실시형태에 있어서, 방법은 SOI의 후속적인 표적화된 통합에 적합한 숙주 세포를 생성하기 위한 숙주 세포로의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 통합에 관한 것이다. 특정한 실시형태에 있어서, 상기 방법은 재조합효소-매개된 재조합을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 상기 방법은 상동성 재조합, HDR, 및/또는 NHEJ를 포함한다.
6.1 재조합효소-매개된 재조합을 사용하는 TI 숙주 세포의 제조
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공된 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이의 적어도 약 90% 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) TI 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 이종특이성 RRS를 포함하는 제1 DNA 카세트를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 이종특이성 RRS를 포함하는 제2 DNA 카세트를 포함하느 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하고, 하나의 RMCE를 수행하는, 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이의 적어도 약 90% 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접하는 2개의 이종특이성 RRS를 포함하는 제1 DNA 카세트를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 이종특이성 RRS를 포함하는 제2 DNA 카세트를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하고, 하나의 RMCE를 수행하는, 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드(여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일하거나 상이함)를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하고, 모든 RRS는 이종특이성인, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제1 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; d) 하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 e) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 벡터 상의 전체 선택 마커보다는, 제1 벡터는 제1 SOI가 상류에 측접하고 RRS가 하류에 측접하여 위치된 코돈 ATG에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 제2 벡터는 RRS가 상류에 측접하고 제2 SOI가 하류에 측접한 ATG 전사 개시 코돈이 결핍된 선택 마커를 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드(여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있음)를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이의 적어도 약 90% 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접하는 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하고, 모든 RRS는 이종특이성인, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제1 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; d) 하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 e) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 벡터 상의 전체 선택 마커를 갖기 보다는, 제1 벡터는 제1 SOI가 상류에 측접하고 RRS가 하류에 측접하여 위치된 코돈 ATG에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고; 제2 벡터는 RRS가 상류에 측접하고 제2 SOI가 하류에 측접한 ATG 전사 개시 코돈이 결핍된 선택 마커를 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드(여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있음)를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하는 제1 DNA 카세트를 포함하고, 모든 3개의 RRS는 이종특이성인, 단계; b) 제2 DNA 카세트를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 제2 DNA 카세트는 제1 DNA 카세트의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제1 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 이종특이성 RRS를 포함하는, 단계; c) 제3 DNA 카세트를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 제3 DNA 카세트는 제1 DNA 카세트의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접하는 2개의 이종특이성 RRS를 포함하는, 단계; d) 하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하고 2개의 RMCE를 수행하는, 단계; 및 e) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 벡터 상의 전체 선택 마커를 갖기 보다는, 제1 벡터는 제1 SOI가 상류에 측접하고 RRS가 하류에 측접하여 위치된 코돈 ATG에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고; 제2 벡터는 RRS가 상류에 측접하고 제2 SOI가 하류에 측접한 ATG 전사 개시 코돈이 결핍된 선택 마커를 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드(여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있음)를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하는 제1 DNA 카세트를 포함하고, 모든 3개의 RRS는 이종특이성인, 단계; b) 제2 DNA 카세트를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 제2 DNA 카세트는 제1 DNA 카세트의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제1 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 이종특이성 RRS를 포함하는, 단계; c) 제3 DNA 카세트를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 제3 DNA 카세트는 제1 DNA 카세트의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접하는 2개의 이종특이성 RRS를 포함하는, 단계; d) 하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하고 2개의 RMCE를 수행하는, 단계; 및 e) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 벡터 상의 전체 선택 마커를 갖기 보다는, 제1 벡터는 제1 SOI가 상류에 측접하고 RRS가 하류에 측접하여 위치된 코돈 ATG에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고; 제2 벡터는 RRS가 상류에 측접하고 제2 SOI가 하류에 측접한 ATG 전사 개시 코돈이 결핍된 선택 마커를 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 인접한 1개의 RRS를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 인접한 1개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단게로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 인접한 1개의 RRS를 포함하고; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 인접한 1개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 개시된 주제는 또한 관심대상 폴리펩타이드의 제조 방법으로서, a) 본 명세서에 기재된 TI 숙주 세포를 제공하는 단계; b) a)에서 TI 숙주 세포를 SOI의 발현에 적합한 조건하에 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 제1 및 제2 RRS를 포함하는, 단계; b) 3개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 벡터의 제1 RRS는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 RRS에 정합하고, 벡터의 제2 RRS는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 제2 선택 마커에 정합하는, 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 벡터 및 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 둘 다 상의 제1 및 제2 RRS를 인식하는, 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 숙주 세포를 선택함으로써, 하위서열 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 제1 및 제2 RRS를 포함하는, 단계; b) 3개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 벡터의 제1 RRS는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 RRS에 정합하고, 벡터 상의의 제2 RRS는 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 제2 선택 마커에 정합하는, 단계; c) 재조합효소를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 벡터 및 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 둘 다 상의 제1 및 제2 RRS를 인식하는, 단계; 및 d) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 숙주 세포를 선택함으로써, 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
6.2 상동성 재조합, HDR, 또는 NHEJ를 사용하는 숙주 세포의 표적화된 개질의 방법
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위를 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; b) 벡터를 TI 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 벡터는 DNA 카세트에 측접하는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함하는, 단계; c) 선택 마커를 선택하여 게놈의 좌위에서 통합된 SOI를 갖는 TI 숙주 세포를 단리시키고, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 벡터의 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 추가로 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위를 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; b) 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함하는, 단계; c) 선택 마커를 선택하여 게놈의 좌위에서 통합된 SOI를 갖는 TI 숙주 세포를 단리시키고, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 벡터의 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 추가로 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 상동성 재조합은 벡터의 통합에 의해 촉진된다. 특정한 실시형태에 있어서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 전위효소 벡터, 인테그라제 기질 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에 있어서, 트랜스포존은 PiggyBac(PB) 트랜스포존 시스템일 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 통합은 외인성 뉴클레아제에 의해 촉진된다. 특정한 실시형태에 있어서, 외인성 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 조작된 메가뉴클레아제, 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(CRISPR)-관련(Cas) 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위를 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; b) 벡터를 TI 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 벡터는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는, 단계; c) 선택 마커를 선택하여 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위를 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; b) 폴리뉴클레오타이드를 TI 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는, 단계; c) 선택 마커를 선택하여 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위를 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; b) 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 벡터는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 3개의 RRS를 포함하고, 여기서 제3 RRS 및 적어도 하나의 선택 마커는 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치하는, 단계; 및 c) 선택 마커를 선택하여 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위를 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; b) 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 3개의 RRS를 포함하고, 여기서 제3 RRS 및 적어도 하나의 선택 마커는 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치하는, 단계; 및 c) 선택 마커를 선택하여 후속적인 표적화된 통합에 적합한 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 적어도 하나의 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) TI 숙주 세포의 게놈의 하나 이상의 좌위 내의 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 적어도 하나의 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 적어도 하나의 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드(여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있음)를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 하나 이상의 좌위 내의 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하고, 모든 RRS는 이종특이성인, 단계; b) 적어도 하나의 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제1 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 적어도 하나의 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; d) 하나 이상의 재조합효소, 또는 하나 이상의 재조합효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 e) 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 적어도 하나의 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 벡터 상의 전체 선택 마커보다는, 제1 벡터는 제1 SOI가 상류에 측접하고 RRS가 하류에 측접하여 위치된 코돈 ATG에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고; 제2 벡터는 RRS가 상류에 측접하고 제2 SOI가 하류에 측접한 ATG 전사 개시 코돈이 결핍된 선택 마커를 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) TI 숙주 세포의 게놈의 하나 이상의 좌위 내의 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 RRS를 포함하고; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 하나 이상의 RRS에 정합하고 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 외인성 SOI에 측접하는 하나 이상의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 d) 유발인자의 존재하에 외인성 SOI를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 관심대상 폴리펩타이드의 발현 방법으로서, a) 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 외인성 SOI 및 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합된 조절가능한 프로모터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; 및 b) SOI를 발현하는데 적합한 조건하에 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드(여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있음)를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1, 제2 RRS 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하고, 모든 RRS는 이종특이성인, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제1 외인성 SOI에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제2 SOI에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; d) 하나 이상의 재조합효소, 또는 하나 이상의 재조합효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 e) 유발인자의 존재하에 적어도 제1 및 제2 외인성 SOI를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 제1 벡터 상의 전체 선택 마커를 갖기 보다는, 제1 벡터는 제1 SOI가 상류에 측접하고 RRS가 하류에 측접하여 위치된 코돈 ATG에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고; 제2 벡터는 RRS가 상류에 측접하고 제2 SOI가 하류에 측접한 ATG 전사 개시 코돈이 결핍된 선택 마커를 포함한다.
7. 생성물
본 개시내용의 숙주 세포는 임의의 관심대상 분자, 예를 들면, 관심대상 폴리펩타이드의 발현을 위하여 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 폴리펩타이드, 예를 들면, 포유동물 폴리펩타이드의 발현을 위하여 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 호르몬, 수용체, 융합 단백질, 조절 인자, 성장 인자, 보체 시스템 인자, 효소, 응고 인자, 항응고 인자, 키나제, 사이토킨, CD 단백질, 인터류킨, 치료용 단백질, 진단용 단백질 및 항체를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 단일클론 항체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 치료용 항체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 진단용 항체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 인간 항체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 인간화 항체이다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 정의 내에 포함된 폴리펩타이드의 예는 포유동물 폴리펩타이드, 예를 들면, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 모낭 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 렙틴; 응고 인자, 예를 들면, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예를 들면, 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예를 들면, 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직 유형의 플라스미토겐 활성제(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 종양 괴사 인자 수용체, 예를 들면, 사멸 수용체 5 및 CD120; TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL); B-세포 성숙 항원(BCMA); B-림프구 자극제(BLyS); 증식-유도 리간드(APRIL); 엔케팔리나제; RANTES(정상적으로 T-세포가 발현되고 분비되면 활성화가 조절됨); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들면, 인간 혈청 알부민; 뮬러리안-억제 성분; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩타이드; 미생물 단백질, 예를 들면, 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 예를 들면, CTLA-4; 인히빈; 악티빈; 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF); 혈관 내피 성장 인자 패밀리 단백질(예를 들면, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 및 P1GF); 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 패밀리 단백질(예를 들면, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, 및 이의 이량체); 피브로플라스트 성장 인자(FGF) 패밀리, 예를 들면, aFGF, bFGF, FGF4, 및 FGF9; 표피 성장 인자(EGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체, 예를 들면, VEGF 수용체(들)(예를 들면, VEGFR1, VEGFR2, 및 VEGFR3), 표피 성장 인자(EGF) 수용체(들)(예를 들면, ErbB1, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4 수용체), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 수용체(들)(예를 들면, PDGFR-α 및 PDGFR-β), 및 피브로플라스트 성장 인자 수용체(들); TIE 리간드(안지오포이에틴, ANGPT1, ANGPT2); 안지오포이에틴 수용체, 예를 들면, TIE1 및 TIE2; 단백질 A 또는 D; 류머티즘 인자; 신경영양 인자, 예를 들면, 뼈-유래된 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들면, NGF-b; 형질전환 성장 인자(TGF), 예를 들면, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP); CD 단백질, 예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 뼈 전도성 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질(BMP); 케모카인, 예를 들면, CXCL12 및 CXCR4; 인터페론, 예를 들면, 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자(CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 사이토킨, 예를 들면, 인터류킨(IL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 미드킨; 초과산화물 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들면, AIDS 엔벨로프의 일부; 수송 단백질; 호밍 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예를 들면, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 에프린; Bv8; 델타-유사 리간드 4(DLL4); Del-1; BMP9; BMP10; 폴리스타틴; 간세포 성장 인자(HGF)/스캐터 인자(SF); Alk1; Robo4; ESM1; 페를레칸; EGF-유사 도메인, 다중 7(EGFL7); CTGF 및 이의 패밀리의 멤버; 트롬보스폰딘, 예를 들면, 트롬보스폰딘1 및 트롬보스폰딘2; 콜라겐, 예를 들면, 콜라겐 IV 및 콜라겐 XVIII; 뉴로필린, 예를 들면, NRP1 및 NRP2; 플레이로트로핀(PTN); 프로그라눌린; 프롤리페린; 노치 단백질, 예를 들면, 노치1 및 노치4; 세마포린, 예를 들면, Sema3A, Sema3C 및 Sema3F; 종양 연관 항원, 예를 들면, CA125(난소암 항원); 면역접착체; 및 임의의 상기 열거된 폴리펩타이드 뿐만 아니라, 예를 들면, 임의의 상기 열거된 단백질을 포함하는 하나 이상의 단백질에 결합하는 항체 단편을 포함하는 항체의 단편 및/또는 변이체를 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, 관심대상 폴리펩타이드는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 폴리펩타이드, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체를 위한 다양한 분자 포맷은 당해 분야에 공지되어 있고 본 명세서에 포함된다(예를 들면, 문헌[Spiess et al., Mol Immunol 67(2015) 95-106] 참조). 또한 본 명세서에 포함되는 다중특이적 항체의 특정한 유형은 표적 세포, 예를 들면, 종양 세포 상의 표면 항원에 동시에 결합하고, 표적 세포를 살해하기 위하여 T 세포의 재표적화를 위하여, T 세포 수용체(TCR) 복합체, 예를 들면, CD3의 불변 요소를 활성화시키도록 설계된 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체 포맷의 다른 예는 2개의 scFv 분자가 가요성 링커에 의해 융합되는 소위 "BiTE"(이중특이적 T 세포 관여자(bispecific T cell engager)) 분자(예를 들면, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261, 및 WO 2008/119567, 문헌[Nagorsen and , Exp Cell Res 317, 1255-1260(2011)] 참조); 다이아바디(Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305(1996)) 및 이의 유도체, 예를 들면, 탠덤 다이아바디("TandAb"; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56(1999)); 다이아바디 포맷을 기반으로 하지만 추가의 안정화를 위하여 C-말단 이황화 브릿지를 특징으로 하는 "DART"(이중 친화력 재표적화) 분자 (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449(2010)), 및 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자인 소위 트리오맙(문헌[Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467(2010)]에서 검토됨)를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 명세서에 포함된 특정한 T 세포 이중특이적 항체 포맷은 제WO 2013/026833호, 제WO 2013/026839호, 제WO 2016/020309호; 문헌[Bacac et al., Oncoimmunology 5(8)(2016) e1203498]에 기재되어 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 구성적으로 관심대상이거나 조절된 치료용 단백질 또는 분자를 발현하면서, 샤프론, 단백질 개질 효소, shRNA, gRNA 또는 기타 단백질 또는 펩타이드의 발현을 위하여 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포에 의해 발현되는 폴리펩타이드는 8MPI, 8MP2, 8MP38(GDFIO), 8MP4, 8MP6, 8MP8, CSFI(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(G-CSF), EPO, FGF1(αFGF), FGF2(βFGF), FGF3(int-2), FGF4(HST), FGF5, FGF6(HST-2), FGF7(KGF), FGF9, FGF1 0, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFN81, IFNG, IFNWI, FEL1, FEL1(EPSELON), FEL1(ZETA), IL 1A, IL 1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL1 0, IL 11, IL 12A, IL 12B, IL 13, IL 14, IL 15, IL 16, IL 17, IL 17B, IL 18, IL 19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBb3, LTA(TNF-β), LTB, TNF(TNF-α), TNFSF4(OX40 리간드), TNFSF5(CD40 리간드), TNFSF6(FasL), TNFSF7(CD27 리간드), TNFSF8(CD30 리간드), TNFSF9(4-1 BB 리간드), TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(TRANCE), TNFSF12(APO3L), TNFSF13(April), TNFSF13B, TNFSF14(HVEM-L), TNFSF15(VEGI), TNFSF18, HGF(VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL 11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP(렙틴), PTN, 및 THPO.k로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토킨, 사이토킨-관련 단백질, 및 사이토킨 수용체를 제한 없이 포함하는 임의의 단백질에 결합하거나 이와 상호작용할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포에 의해 발현되는 폴리펩타이드는 CCLI(1-309), CCL2(MCP-1/MCAF), CCL3(MIP-Iα), CCL4(MIP-Iβ), CCL5(RANTES), CCL7(MCP-3), CCL8(mcp-2), CCL11(에오탁신), CCL 13(MCP-4), CCL 15(MIP-Iδ), CCL 16(HCC-4), CCL 17(TARC), CCL 18(PARC), CCL 19(MDP-3b), CCL20(MIP-3α), CCL21(SLC/엑소더스-2), CCL22(MDC/STC-1), CCL23(MPIF-1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL25(TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27(CTACK/ILC), CCL28, CXCLI(GROI), CXCL2(GR02), CXCL3(GR03), CXCL5(ENA-78), CXCL6(GCP-2), CXCL9(MIG), CXCL 10(IP 10), CXCL 11(1-TAC), CXCL 12(SDFI), CXCL 13, CXCL 14, CXCL 16, PF4(CXCL4), PPBP(CXCL7), CX3CL 1(SCYDI), SCYEI, XCLI(림포탁틴), XCL2(SCM-Iβ), BLRI(MDR15), CCBP2(D6/JAB61), CCRI(CKRI/HM145), CCR2(mcp-IRB IRA), CCR3(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7(CKR7/EBII), CCR8(CMKBR8/ TER1/CKR- L1), CCR9(GPR-9-6), CCRL1(VSHK1), CCRL2(L-CCR), XCR1(GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1(RDC1), CX3CR1(V28), CXCR4, GPR2(CCR10), GPR31, GPR81(FKSG80), CXCR3(GPR9/CKR-L2), CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA(IL8Rα), IL8RB(IL8Rβ), LTB4R(GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5, C5R1, CSF3, GRCC10(C10), EPO, FY(DARC), GDF5, HDF1, HDF1α, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2 및 VHL로 이루어진 군으로부터 선택된 케모카인, 케모카인 수용체, 또는 케모카인-관련 단백질을 결합하거나 이와 상호작용할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포에 의해 발현되는 폴리펩타이드는 0772P(CA125, MUC16)(즉, 난소암 항원), ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; 아밀로이드 베타; ANGPTL; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; ASLG659; ASPHD1(아스파르테이트 베타-하이드록실라제 도메인 함유 1; LOC253982); AZGP1(아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF-R(B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI(MDR15); BMP1; BMP2; BMP3B(GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B(뼈 형성 단백질 수용체형 IB); BMPR2; BPAG1(플렉틴); BRCA1; 브레비칸; C19orf10(IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2(D6/JAB61); CCL1(1-309); CCL11(에오탁신); CCL13(MCP-4); CCL15(MIP1δ); CCL16(HCC-4); CCL17(TARC); CCL18(PARC); CCL19(MIP-3β); CCL2(MCP-1); MCAF; CCL20(MIP-3α); CCL21(MTP-2); SLC; 엑소더스-2; CCL22(MDC/STC-1); CCL23(MPIF-1); CCL24(MPIF-2/에오탁신-2); CCL25(TECK); CCL26(에오탁신-3); CCL27(CTACK/ILC); CCL28; CCL3(MTP-Iα); CCL4(MDP-Iβ); CCL5(RANTES); CCL7(MCP-3); CCL8(mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1(CKRI/HM145); CCR2(mcp-IRβRA);CCR3(CKR/CMKBR3); CCR4; CCR5(CMKBR5/ChemR13); CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6); CCR7(CKBR7/EBI1); CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1); CCR9(GPR-9-6); CCRL1(VSHK1); CCRL2(L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD22(B-세포 수용체 CD22-B 아이소형); CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A(CD79α, 면역글로불린-관련 알파, B 세포-특이적 단백질); CD79B; CDS; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1(E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A(p21/WAF1/Cip1); CDKN1B(p27/Kip1); CDKN1C; CDKN2A(P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; Chitinase; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3;CLDN7(클라우딘-7); CLL-1(CLEC12A, MICL, 및 DCAL2); CLN3; CLU(클러스테린); CMKLR1; CMKOR1(RDC1); CNR1; COL 18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; 보체 인자 D; CR2; CRP; CRIPTO(CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자); CSFI(M-CSF); CSF2(GM-CSF); CSF3(GCSF); CTLA4; CTNNB1(b-카테닌); CTSB(카텝신 B); CX3CL1(SCYDI); CX3CR1(V28); CXCL1(GRO1); CXCL10(IP-10); CXCL11(I-TAC/IP-9); CXCL12(SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2(GRO2); CXCL3(GRO3); CXCL5(ENA-78/LIX); CXCL6(GCP-2); CXCL9(MIG); CXCR3(GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR5(버킷 림프종 수용체 1, G 단백질-커플링 수용체); CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLI; DPP4; E16(LAT1, SLC7A5); E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EphB2R; EPO; ERBB2(Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; ETBR(엔도텔린 B형 수용체); F3(TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FcRH1(Fc 수용체-유사 단백질 1); FcRH2(IFGP4, IRTA4, SPAP1A(SH2 도메인 함유 포스포타제 앵커 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C); FGF; FGF1(αFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2(bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3(int-2); FGF4(HST); FGF5; FGF6(HST-2); FGF7(KGF); FGF8; FGF9; FGFR; FGFR3; FIGF(VEGFD); FELl(EPSILON); FILl(ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI(피브로넥틴); FLT1; FOS; FOSL1(FRA-1); FY(DARC); GABRP(GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GDNF-Ra1(GDNF 패밀리 수용체 알파 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-알파1; GFR-알파-1); GEDA; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2(CCR10); GPR19(G 단백질-커플링 수용체 19; Mm.4787); GPR31; GPR44; GPR54(KISS1 수용체; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12); GPR81(FKSG80); GPR172A(G 단백질-커플링 수용체 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e);GRCCIO(C10); GRP; GSN(겔솔린); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HOP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DOB(MHC 클래스 II 분자의 베타 아단위(Ia 항원); HLA-DRA; HM74; HMOXI ; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; DFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-l; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; ILIF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20Rα, IL21 R; IL22; IL-22c; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST(당단백질 130); 인플루엔자 A; 인플루엔자 B; EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRTA2(면역글로불린 수퍼패밀리 수용체 전좌 관련 2); ERAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6(a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4(b4 인테그린); α4β7 및 αEβ7 인테그린 이종이량체; JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5(GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19(케라틴 19); KRT2A; KHTHB6(헤어-특이적 H형 케라틴); LAMAS; LEP(렙틴); LGR5(류신-풍부 반복-함유 G 단백질-커플링 수용체 5; GPR49, GPR67); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA(TNF-b); LTB; LTB4R(GPR16); LTB4R2; LTBR; LY64(림프구 항원 64(RP105), 류신 풍부 반복(LRR) 패밀리의 I형 막 단백질); Ly6E(림프구 항원 6 복합체, 좌위 E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1); Ly6G6D(림프구 항원 6 복합체, 좌위 G6D; Ly6-D, MEGT1); LY6K(림프구 항원 6 복합체, 좌위 K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226); MACMARCKS; MAG 또는 OMgp; MAP2K7(c-Jun); MDK; MDP; MIB1; midkine; MEF; MIP-2; MKI67;(Ki-67); MMP2; MMP9; MPF(MPF, MSLN, SMR, 거핵세포 효력증가 인자, 메소텔린); MS4A1; MSG783(RNF124, 가상 단백질 FLJ20315);MSMB; MT3(메탈로티오넥틴-111); MTSS1; MUC1(점액); MYC; MY088; Napi3b(또한 NaPi2b로도 알려짐)(NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 패밀리 34(인산나트륨), 멤버 2, II형 나트륨-의존성 포스페이트 트랜스포터 3b); NCA; NCK2; 뉴로칸; NFKB1; NFKB2; NGFB(NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR- Nogo66(Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1(NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR112; NR113; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRD1; OX40; P2RX7; P2X5(퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트 이온 채널 5); PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PD-L1; PD-L2; PD-1; POGFA; POGFB; PECAM1; PF4(CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU(uPA); PLG; PLXDC1; PMEL17(은 상동체; SILV; D12S53E; PMEL17; SI; SIL); PPBP(CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA hlg(2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자); PTAFR; PTEN; PTGS2(COX-2); PTN; RAC2(p21 Rac2); RARB; RET(ret 원종양 형성 유전자; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1); RGSI; RGS13; RGS3; RNF110(ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2(리포필린 B); SCGB2A1(매마글로빈 2); SCGB2A2(매마글로빈 1); SCYEI(내피 단핵구-활성화 사이토킨); SDF2; Sema 5b(FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, sema 도메인, 7개의 트롬보스폰딘 반복(1형 및 1형-유사), 막투과 도메인(TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B); SERPINA1; SERPINA3; SERP1NB5(마스핀); SERPINE1(PAI-1); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRR1B(Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP(전립선의 6개의 막투과 상피 항원); STEAP2(HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관 유전자 1, 전립선암 연관 단백질 1, 전립선의 6개의 막투과 상피 항원 2, 6개의 막투과 전립선 단백질); TB4R2; TBX21; TCPIO; TOGFI; TEK; TENB2(추정상 막투과 프로테오글리칸); TGFA; TGFBI; TGFB1II; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI(트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE(Tie-1); TMP3; 조직 인자; TLR1; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TLR10; TMEFF1(EGF-유사 및 2개의 폴리스타틴-유사 도메인 1을 갖는 막투과 단백질; 토모레굴린-1); TMEM46(시사 상동체 2); TNF; TNF-a; TNFAEP2(B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6(Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10(TRAIL); TNFSF11(TRANCE); TNFSF12(AP03L); TNFSF13(April); TNFSF13B; TNFSF14(HVEM-L); TNFSF15(VEGI); TNFSF18; TNFSF4(OX40 리간드); TNFSF5(CD40 리간드); TNFSF6(FasL); TNFSF7(CD27 리간드); TNFSFS(CD30 리간드); TNFSF9(4-1 BB 리간드); TOLLIP; Toll-유사 수용체; TOP2A(토포아이소머라제 Ea); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TMEM118(링 핑거 단백질, 막투과 2; RNFT2; FLJ14627); TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TrpM4(BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널, 서브패밀리 M, 멤버 4); TRPC6; TSLP; TWEAK; 티로시나제(TYR; OCAIA; OCA1A; 티로시나제; SHEP3);VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1(림포탁틴); XCL2(SCM-1b); XCRI(GPR5/ CCXCRI); YY1; 및/또는 ZFPM2에 결합하거나 이와 상호작용할 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라 제조된 항체(또는 이중특이적 항체)를 위한 표적 분자는 CD 단백질, 예를 들면, CD3, CD4, CDS, CD16, CD19, CD20, CD21(CR2(보체 수용체 2) 또는 C3DR(C3d/엡스타인 바 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792); CD33; CD34; CD64; CD72(B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2); CD79b(CD79B, CD79β), IGb(면역글로불린-관련 베타), B29); EGF 수용체, HER2, HER3, 또는 HER4 수용체와 같은 ErbB 수용체 패밀리의 CD200 멤버; 세포 접착 분자, 예를 들면, LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 이의 알파 또는 베타 아단위를 포함하는 알파v/베타3 인테그린(예를 들면, 항-CD11a, 항-CD18, 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예를 들면, VEGF-A, VEGF-C; 조직 인자(TF); 알파 인터페론(알파IFN); TNF알파, 인터류킨, 예를 들면, IL-1 베타, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL 17 AF, IL-1S, IL-13R 알파1, IL13R 알파2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; 혈액군 항원; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; RANKL, RANK, RSV F 단백질, 단백질 C 등을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 제공된 방법은 보체 단백질 C5에 특이적으로 결합하는 항체(또는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체)를 생성하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 인간 C5에 특이적으로 결합하는 항-C5 효능제 항체).
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 제공된 방법은 인플루엔자 바이러스 B 헤마글루티닌, 즉, "fluB"에 특이적으로 결합하는 항체(또는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체)를 생성하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 시험관내 및/또는 생체내에서 인플루엔자 B 바이러스의 야마가타 계통으로부터의 헤마글루티닌에 결합하거나, 인플루엔자 B 바이러스의 빅토리아 계통으로부터의 헤마글루티닌에 결합하거나, 인플루엔자 B 바이러스의 선조 계통으로부터의 헤마글루티닌에 결합하거나, 인플루엔자 B 바이러스의 야마가타 계통, 빅토리아 계통, 및 선조 계통으로부터의 헤마글루티닌에 결합하는 항체). 항-FluB 항체에 관한 추가의 세부사항은 제WO 2015/148806호에 기재되고, 이는 본 명세서에 그 전문이 참조로서 포함된다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법에 따라 제조된 항체(또는 이중특이적 항체)는 저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질(LRP)-1 또는 LRP-8 또는 트랜스페린 수용체, 및 베타-세크레타제(BACE1 또는 BACE2), 알파-세크레타제, 감마-세크레타제, tau-세크레타제, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 사멸 수용체 6(DR6), 아밀로이드 베타 펩타이드, 알파-신클레인, 파킨, 헝팅틴, p75 NTR, CD40 및 카스파제-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 표적에 결합한다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법에 따라 제조된 항체는 CD40에 대항하는 인간 IgG2 항체이다. 특정한 실시형태에 있어서, 항-CD40 항체는 RG7876이다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법에 따라 제조된 폴리펩타이드는 표적화된 면역사이토킨이다. 특정한 실시형태에 있어서, 표적화된 면역사이토킨은 CEA-IL2v 면역사이토킨이다. 특정한 실시형태에 있어서, CEA-IL2v 면역사이토킨은 RG7813이다. 특정한 실시형태에 있어서, 표적화된 면역사이토킨은 FAP-IL2v 면역사이토킨이다. 특정한 실시형태에 있어서, FAP-IL2v 면역사이토킨은 RG7461이다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법에 따라 제조된 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체)는 CEA 및 적어도 하나의 추가의 표적 분자에 결합한다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법에 따라 제조된 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체)는 종양 표적화된 사이토킨 및 적어도 하나의 추가의 표적 분자에 결합한다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법에 따라 제조된 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체)는 IL2v(즉, 인터류킨 2 변이체)에 융합되고, IL1-기반의 면역사이토킨 및 적어도 하나의 추가의 표적 분자에 결합한다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법에 따라 제조된 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체)는 T-세포 이중특이적 항체(즉, 이중특이적 T-세포 관여자 또는 BiTE)이다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 방법에 따라 제조된 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체)는 IL-1 알파 및 IL- 1 베타, IL-12 및 IL-1S; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1베타; IL-13 및 IL- 25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF-~; IL-13 및 LHR 효능제; IL-12 및 TWEAK, IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAMS, IL-13 및 PED2, IL17A 및 IL17F, CEA 및 CD3, CD3 및 CD19, CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD3S 및 CD13S; CD3S 및 CD20; CD3S 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-S 및 IL-6; CD20 및 BR3, TNF 알파 및 TGF-베타, TNF 알파 및 IL-1 베타; TNF 알파 및 IL-2, TNF 알파 및 IL-3, TNF 알파 및 IL-4, TNF 알파 및 IL-5, TNF 알파 및 IL6, TNF 알파 및 IL8, TNF 알파 및 IL-9, TNF 알파 및 IL-10, TNF 알파 및 IL-11, TNF 알파 및 IL-12, TNF 알파 및 IL-13, TNF 알파 및 IL-14, TNF 알파 및 IL-15, TNF 알파 및 IL-16, TNF 알파 및 IL-17, TNF 알파 및 IL-18, TNF 알파 및 IL-19, TNF 알파 및 IL-20, TNF 알파 및 IL-23, TNF 알파 및 IFN 알파, TNF 알파 및 CD4, TNF 알파 및 VEGF, TNF 알파 및 MIF, TNF 알파 및 ICAM-1, TNF 알파 및 PGE4, TNF 알파 및 PEG2, TNF 알파 및 RANK 리간드, TNF 알파 및 Te38, TNF 알파 및 BAFF, TNF 알파 및 CD22, TNF 알파 및 CTLA-4, TNF 알파 및 GP130, TNF a 및 IL-12p40, VEGF 및 안지오포이에틴, VEGF 및 HER2, VEGF-A 및 HER2, VEGF-A 및 PDGF, HER1 및 HER2, VEGFA 및 ANG2,VEGF-A 및 VEGF-C, VEGF-C 및 VEGF-D, HER2 및 DR5,VEGF 및 IL-8, VEGF 및 MET, VEGFR 및 MET 수용체, EGFR 및 MET, VEGFR 및 EGFR, HER2 및 CD64, HER2 및 CD3, HER2 및 CD16, HER2 및 HER3; EGFR(HER1) 및 HER2, EGFR 및 HER3, EGFR 및 HER4, IL-14 및 IL-13, IL-13 및 CD40L, IL4 및 CD40L, TNFR1 및 IL-1 R, TNFR1 및 IL-6R 및 TNFR1 및 IL-18R, EpCAM 및 CD3, MAPG 및 CD28, EGFR 및 CD64, CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTN02; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; POL-l 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B로부터 선택된 적어도 2개의 표적 분자에 결합한다.
특정한 실시형태에 있어서, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체)는 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체이다. 특정한 실시형태에 있어서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 RG7802이다. 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체에 관한 추가의 세부사항은 제WO 2014/121712호에 제공되고, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.
특정한 실시형태에 있어서, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체)는 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체이다. 특정한 실시형태에 있어서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체 이중특이적 항체는 크로스맙(Crossmab)이다. 특정한 실시형태에 있어서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체는 RG7716이다.
특정한 실시형태에 있어서, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체)는 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체이다. 특정한 실시형태에 있어서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 RG7221이다. 특정한 실시형태에 있어서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 CAS 번호 1448221-05-3이다.
많은 다른 항체 및/또는 다른 단백질이 본 개시내용에 따른 숙주 세포에 의해 발현될 수 있고, 상기 목록은 제한을 의미하지 않는다.
본 개시내용의 숙주 세포는 제조 규모의 관심대상 분자의 생산에서 사용될 수 있다. 치료용 단백질, 또는 다른 단백질의 "제조 규모" 생산은 제조되는 단백질 및 필요에 따라 약 400 L 내지 약 80,000 L 범위의 세포 배양을 사용한다. 전형적으로, 이러한 제조 규모 생산은 약 400 L 내지 약 25,000 L의 세포 배양 크기를 사용한다. 이러한 범위 내에서, 특정한 세포 배양 크기, 예를 들면, 4,000 L, 약 6,000 L, 약 8,000, 약 10,000, 약 12,000 L, 약 14,000 L, 또는 약 16,000 L가 사용될 수 있다.
본 개시내용의 숙주 세포는 현재 세포 배양 방법에서 사용되는 비-TI 세포와 비교하여 더 짧은 기간 동안 관심대상 분자의 대량 제조에서 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 현재 세포 배양 방법에서 사용되는 비-TI 세포와 비교하여 관심대상 분자의 개선된 품질을 위하여 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 시간이 지남에 따라 세포 스트레스 및 클론 불안정성을 유발할 수 있는 생성물에 의해 유발될 수 있는 만성 독성을 방지함으로써 시드 트레인 안정성을 개선시킬 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 급성 독성 생성물의 최적 발현을 위하여 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포, TI 시스템은 세포 배양 공정 최적화 및/또는 공정 개발을 위하여 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 통상적인 세포 배양 방법에서 사용되는 비-TI 세포와 비교하여 약 1 주, 약, 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 또는 약 10 주 만큼 관심대상 분자의 제조를 가속화하기 위하여 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 통상적인 세포 배양 방법에서 사용되는 비-TI 세포와 비교하여 약 1 주, 약, 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 또는 약 10 주 만큼 분자의 수확을 가속화하기 위하여 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 실시형태의 숙주 세포는 통상적인 세포 배양 방법에서 사용되는 비-TI 세포와 비교하여 관심대상 분자의 응집물 수준을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 무작위로 통합된 숙주 세포에 비하여 관심대상 폴리펩타이드(또는 폴리펩타이드들)의 증가된 발현을 달성하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만, 본 개시내용의 숙주 세포는 적어도 3g/ℓ, 3.5g/ℓ, 4g/ℓ, 4.5g/ℓ, 5g/ℓ, 5.5g/ℓ, 6g/ℓ, 6.5g/ℓ, 7g/ℓ, 7.5g/ℓ, 8g/ℓ, 8.5g/ℓ, 9g/ℓ, 9.5g/ℓ, 10g/ℓ, 10.5g/ℓ, 11g/ℓ, 또는 그 초과의 역가로 표준 및 절반 항체의 발현, 및 적어도 1.5g/ℓ, 2g/ℓ, 2.5g/ℓ, 3g/ℓ, 3.5g/ℓ, 4g/ℓ, 4.5g/ℓ, 5g/ℓ, 5.5g/ℓ, 6g/ℓ, 또는 그 초과의 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체의 발현을 달성할 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 무작위 통합 숙주 세포에 비하여 증가된 이중특이적 함량을 달성할 수 있다. 예를 들면, 제한의 방식은 아니지만 본 개시내용의 숙주 세포는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 그 초과의 이중특이적 함량을 달성할 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 치료제 분자의 선택된 아단위의 구성적 발현 및 동일한 치료제 분자의 다른, 상이한 아단위의 조절된 발현을 위하여 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 치료제 분자는 융합 단백질일 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 완전히 조립된 항체 분자의 발현 및 분비에서 각각의 항체 아단위의 역할 및 효과를 이해하기 위하여 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 조사 도구로서 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 다양한 세포에서 문제가 있는 낮은 단백질 발현의 근본 원인을 구상하기 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 세포에서 전이유전자 발현에 대하여 관찰된 현상 또는 세포 거동을 직접적으로 연결짓기 위하여 사용될 수 있다. 본 개시내용의 숙주 세포는 또한 관찰된 거동이 세포에서 가역적인지 아닌지 여부를 증명하기 위하여 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 세포에서 전이유전자(들) 전사 및 발현에 관하여 문제를 확인하고 완화하기 위하여 이용될 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 숙주 세포는 문제가 있는 아단위(들)을 확인하기 위하여 TI 시스템에서 평균 ㄱ분자의 것을 갖는 발현되기 어려운 분자의 항체의 전이유전자 아단위, 예를 들면, 이에 한정되지는 않지만, HC 및 LC 아단위를 스와핑하기 위하여 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 그 다음, 아미노산 서열 분석은 낮은 단백질 발현의 이유가 될 수 있는 아미노산 잔기 또는 영역으로 좁히고 집중하기 위하여 사용될 수 있다.
8. 예시적인 비제한적 실시형태
A. 숙주 세포의 게놈의 특정 좌위 내 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화된 통합(TI) 숙주 세포로서, 여기서 좌위가 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, TI 숙주 세포.
A1. A에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 41190-45269, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 63590 내지 207911, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 253831 내지 491909, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 69303 내지 79768, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 293481 내지 315265, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2650443 내지 2662054, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 82214 내지 97705와 적어도 약 90% 상동성으로 이루어진 군으로부터 선택되는, TI 숙주 세포.
A2. A에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 207911, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 491909, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 79768, NW_003615063.1의ㅜ 뉴클레오타이드 315265, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2662054, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 97705로부터 적어도 15 염기쌍, 적어도 20 염기쌍, 적어도 30 염기쌍, 적어도 40 염기쌍, 적어도 50 염기쌍, 적어도 75 염기쌍, 적어도 100 염기쌍, 적어도 150 염기쌍, 적어도 200 염기쌍, 적어도 300 염기쌍, 적어도 400 염기쌍, 적어도 500 염기쌍, 적어도 1,000 염기쌍, 적어도 1,500 염기쌍, 적어도 2,000 염기쌍, 적어도 3,000 염기쌍의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, TI 숙주 세포.
A3. A에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270-45490, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 207912-792374, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 491910-667813, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 79769-100059, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 315266-362442, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2662055-2701768, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 97706-105117과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, TI 숙주 세포.
A4. A에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 207912, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 491910, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 79769, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 315266, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2662055, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 97706로부터의 적어도 15 염기쌍, 적어도 20 염기쌍, 적어도 30 염기쌍, 적어도 40 염기쌍, 적어도 50 염기쌍, 적어도 75 염기쌍, 적어도 100 염기쌍, 적어도 150 염기쌍, 적어도 200 염기쌍, 적어도 300 염기쌍, 적어도 400 염기쌍, 적어도 500 염기쌍, 적어도 1,000 염기쌍, 적어도 1,500 염기쌍, 적어도 2,000 염기쌍, 적어도 3,000 염기쌍의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, TI 숙주 세포.
A5. A 내지 A4 중 어느 하나에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되는, TI 숙주 세포.
A6. LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포.
A7. LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자에 작동가능하게 연결된 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포.
A8. 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열의 모두 또는 일부분에 바로 인접한 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포.
A9. A 내지 A8 중 어느 하나에 있어서, TI 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포인, TI 숙주 세포.
A10. A9에 있어서, TI 숙주 세포가 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인, TI 숙주 세포.
A11. A9 또는 A10에 있어서, TI 숙주 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포 또는 CHO K1M 숙주 세포인, TI 숙주 세포.
A12. A 내지 A11 중 어느 하나에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 재조합 인식 서열(RRS)을 포함하고, RRS가 재조합효소에 의해 인식될 수 있는, TI 숙주 세포.
A13. A12에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열이 적어도 2개의 RRS를 포함하는, TI 숙주 세포.
A14. A12 또는 A13에 있어서, 재조합효소가 Cre 재조합효소 또는 FLP 재조합효소인, TI 숙주 세포.
A15. A12 또는 A13에 있어서, 재조합효소가 Bxb1 인테그라제 또는 φC31 인테그라제인, TI 숙주 세포.
A16. A12 내지 A15 중 어느 하나에 있어서, RRS가 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열 및 φC31 attB 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, TI 숙주 세포.
A17. A13 내지 A16 중 어느 하나에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열이 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는, TI 숙주 세포.
A18. A17에 있어서, 제1 선택 마커를 포함하고, 제1 선택 마커가 아미노글리코사이드 포스포트랜스페라제(APH), 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HYG), 네오마이신, G418 APH), 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티딘올 탈수소효소(히스티딘올 D), 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신, 및 마이코페놀산로 이루어진 군으로부터 선택되는, TI 숙주 세포.
A19. A17 또는 A18에 있어서, 제2 선택 마커를 더 포함하고, 제1 및 제2 선택 마커가 상이한, TI 숙주 세포.
A20. A19에 있어서, 제2 선택 마커가 아미노글리코사이드 포스포트랜스페라제(APH), 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HYG), 네오마이신, G418 APH), 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티딘올 탈수소효소(히스티딘올 D), 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신, 및 마이코페놀산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, TI 숙주 세포.
A21. A19 또는 A20에 있어서, 제3 선택 마커 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 더 포함하고, IRES가 제3 선택 마커에 작동가능하게 연결되는, TI 숙주 세포.
A22. A21에 있어서, 제3 선택 마커가 제1 또는 제2 선택 마커와 상이한, TI 숙주 세포.
A23. A21 또는 A22에 있어서, 제3 선택 마커가 녹색 형광 단백질(GFP) 마커, 증강된 GFP(eGFP) 마커, 합성 GFP 마커, 황색 형광 단백질(YFP) 마커, 증강된 YFP(eYFP) 마커, 시안 형광 단백질(CFP) 마커, m플럼 마커, m체리 마커, td토마토 마커, m스트로베리 마커, J-red 마커, DsRed-단량체 마커, m오렌지 마커, mKO 마커, m시트린 마커, 비너스 마커, YPet 마커, 에메랄드6 마커, CyPet 마커, mCFPm 마커, 시룰리안 마커, 및 T-사파이어 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는, TI 숙주 세포.
A24. A17 내지 A23 중 어느 하나에 있어서, 제3 RRS를 더 포함하고, 제3 RRS가 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치하고, 제3 RRS가 제1 또는 제2 RRS에 대하여 이종특이성인, TI 숙주 세포.
A25. A12 내지 A24 중 어느 하나에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 관심대상 서열(SOI)을 포함하는, TI 숙주 세포.
A26. A12 내지 A25 중 어느 하나에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 외인성 SOI를 더 포함하는, TI 숙주 세포.
A27. A26에 있어서, 외인성 SOI가 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치하는, TI 숙주 세포.
A28. A26 또는 A27에 있어서, SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는, TI 숙주 세포.
A29. A24 내지 A28 중 어느 하나에 있어서, 외인성 뉴클레오타이드 서열이 제1과 제3 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 외인성 SOI, 및 제3 RRS와 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 외인성 SOI를 더 포함하는, TI 숙주 세포.
A30. A29에 있어서, SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는, TI 숙주 세포.
A31. A26에 있어서, SOI가 무작위로 통합된 숙주 세포에 비하여 더 높은 수준으로 발현되는 항체를 인코딩하는, TI 숙주 세포.
A32. A31에 있어서, 항체가 적어도 3g/ℓ, 3.5g/ℓ, 4g/ℓ, 4.5g/ℓ, 5g/ℓ, 5.5g/ℓ, 6g/ℓ, 6.5g/ℓ, 7g/ℓ, 7.5g/ℓ, 8g/ℓ, 8.5g/ℓ, 9g/ℓ, 9.5g/ℓ, 10g/ℓ, 10.5g/ℓ, 11g/ℓ, 또는 그 초과의 역가에서 발현된 표준 또는 절반 항체인, TI 숙주 세포.
A33. A31에 있어서, 항체가 적어도 1.5g/ℓ, 2g/ℓ, 2.5g/ℓ, 3g/ℓ, 3.5g/ℓ, 4g/ℓ, 4.5g/ℓ, 5g/ℓ, 5.5g/ℓ, 6g/ℓ의 역가에서 발현된 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체인, TI 숙주 세포.
A34. A31에 있어서, 항체가 이중특이적 항체이고, 이중특이적 함량이 무작위 통합 숙주 세포에 비하여 증가되는, TI 숙주 세포.
A35. A1에 있어서, 항체가 이중특이적 항체이고, 이중특이적 함량이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 그 초과인, TI 숙주 세포.
B. 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, TI 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는, 단계; 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법.
B1. B에 있어서, 재조합효소가 Cre 재조합효소 또는 FLP 재조합효소인 방법.
B2. B에 있어서, 재조합효소가 Bxb1 인테그라제 또는 φC31 인테그라제인 방법.
B3. B 내지 B2 중 어느 하나에 있어서, SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
B4. B 내지 B3 중 어느 하나에 있어서, TI 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포인 방법.
B5. B4에 있어서, TI 숙주 세포가 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인 방법.
B6. B4 또는 B5에 있어서, TI 숙주 세포가 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포 또는 CHO K1M 숙주 세포인 방법.
C. 관심대상 폴리펩타이드의 발현 방법으로서, 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커는 TI 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합된 2개의 RRS에 측접하고, 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; 및 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는데 적합한 조건하에 a)에서의 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
C1. C에 있어서, 적어도 하나의 외인성 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
D. 적어도 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접하는 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하고, 모든 RRS는 이종특이성인, 단계; 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제1 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; 하나 이상의 재조합효소, 또는 하나 이상의 재조합효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법.
D1. D에 있어서, 재조합효소가 Cre 재조합효소 또는 FLP 재조합효소인 방법.
D2. D에 있어서, 재조합효소가 Bxb1 인테그라제 또는 φC31 인테그라제인 방법.
D3. D에 있어서, 제1 벡터가 제1 SOI가 상류에 측접하고 RRS가 하류에 측접하여 위치된 코돈 ATG에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 더 포함하고; 제2 벡터가 RRS가 상류에 측접하고 제2 SOI가 하류에 측접한 ATG 전사 개시 코돈이 결핍된 선택 마커를 더 포함하는, 방법.
D4. D 내지 D3 중 어느 하나에 있어서, 제1 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
D5. D 내지 D3 중 어느 하나에 있어서, 제2 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
D6. C 또는 D 내지 D5 중 어느 하나에 있어서, TI 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포인 방법.
D7. D6에 있어서, TI 숙주 세포가 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인 방법.
D8. D7에 있어서, TI 숙주 세포가 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포 또는 CHO K1M 숙주 세포인 방법.
E. 관심대상 폴리펩타이드의 발현 방법으로서, 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합된 적어도 2개의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 적어도 하나의 외인성 SOI 및 하나의 선택 마커는 제1 및 제3 RRS에 측접하고, 적어도 하나의 외인성 SOI는 제2 및 제3 RRS에 측접하는, 단계; 및 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는데 적합한 조건하에 a)에서의 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
E1. E에 있어서, 제1 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
E2. E 또는 E1에 있어서, 제2 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
E3. E 내지 E2 중 어느 하나에 있어서, TI 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포인 방법.
E4. E3에 있어서, TI 숙주 세포가 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인 방법.
E5. E4에 있어서, TI 숙주 세포가 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포 또는 CHO K1M 숙주 세포인 방법.
F. a) 서열번호 1의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
b) 서열번호 2의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
c) 서열번호 3의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
d) 서열번호 4의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
e) 서열번호 5의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
f) 서열번호 6의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열; 또는
g) 서열번호 7의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열
와 적어도 50% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로서, 여기서 상기 서열은 DNA 카세트에 측접하고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함하는, 벡터.
F1. F에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 60% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
F2. F에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 70% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
F3. F에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 80% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
F4. F에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 90% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
F5. F에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 95% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
F6. F에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 99% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
F7. F 내지 F6 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 전위효소 벡터, 인테그라제 기질 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
F8. F 내지 F7 중 어느 하나에 있어서, SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는, 벡터.
G. 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, 숙주 세포의 게놈의 좌위를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 여기서 벡터는 DNA 카세트에 측접한 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 50% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 카세트는 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함하는, 단계; 및 선택 마커를 선택하여 게놈의 좌위에서 통합된 SOI를 갖는 TI 숙주 세포를 단리시키고, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 단계를 포함하는 방법.
G1. G에 있어서, 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 전위효소 벡터, 인테그라제 기질 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
G2. G 또는 G1에 있어서, 적어도 하나의 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
G3. G 내지 G2 중 어느 하나에 있어서, TI 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포인 방법.
G4. G3에 있어서, TI 숙주 세포가 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인 방법.
G5. G3 또는 G4에 있어서, TI 숙주 세포가 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포 또는 CHO K1M 숙주 세포인 방법.
G6. G1 내지 G5 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 SOI 및 선택 마커를 포함하는 핵산의 통합이 외인성 뉴클레아제에 의해 촉진되는, 방법.
G7. G6에 있어서, 외인성 뉴클레아제가 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 조작된 메가뉴클레아제, 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(CRISPR)-관련(Cas) 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
G8. G에 있어서, 관심대상 폴리펩타이드가 다중특이적 항체인 방법.
G9. G8에 있어서, 다중특이적 항체가 이중특이적 항체인 방법.
H. 숙주 세포의 게놈의 하나 이상의 특정 좌위 내의 통합 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, TI 숙주 세포.
H1. LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 내의 하나 이상의 통합 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포.
H2. H 내지 H1 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 재조합 인식 서열(RRS)을 포함하고, RRS가 재조합효소에 의해 인식될 수 있는, TI 숙주 세포.
H3. H2에 있어서, 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 외인성 SOI를 더 포함하는, TI 숙주 세포.
H4. H-H3 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 제1 숙주 세포의 게놈의 좌위에서 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 하나 이상의 제2 숙주 세포의 게놈의 좌위에서 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H5. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H5.1. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H5.2. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H5.3. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H5.4. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H5.5. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H5.6. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H6. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H6.1. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H6.2. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H6.3. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H6.4. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H6.5. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H6.6. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H7. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H7.1. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H7.2. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H7.3. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H7.4. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H7.5. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H7.6. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H8. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H8.1. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H8.2. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H8.3. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H8.4. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H8.5. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H8.6. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H9. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H9.1. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H9.2. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H9.3. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H9.4. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H9.5. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H9.6. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H10. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H10.1. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H10.2. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H10.3. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H10.4. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H10.5. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H10.6. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H11. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H11.1. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 1의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H11.2. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 2의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H11.3. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 3의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H11.4. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 4의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H11.5. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 5의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H11.6. H4에 있어서, 제1 좌위가 서열번호 7의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함하고, 제2 좌위가 서열번호 6의 모두 또는 일부분과 적어도 90% 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, TI 숙주 세포.
H12. H4에 있어서, 제1 좌위가 LOC107977062 유전자 내의 통합 부위이고, 제2 좌위가 하기 군 LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로부터 선택된 유전자 내의 통합 부위인, TI 숙주 세포.
H13. H4에 있어서, 제1 좌위가 LOC100768845 유전자 내의 통합 부위이고, 제2 좌위가 하기 군 LOC107977062, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로부터 선택된 유전자 내의 통합 부위인, TI 숙주 세포.
H14. H4에 있어서, 제1 좌위가 ITPR2 유전자 내의 통합 부위이고, 제2 좌위가 하기 군 LOC107977062, LOC100768845, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로부터 선택된 유전자 내의 통합 부위인, TI 숙주 세포.
H15. H4에 있어서, 제1 좌위가 ERE67000.1 유전자 내의 통합 부위이고, 제2 좌위가 하기 군 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로부터 선택된 유전자 내의 통합 부위인, TI 숙주 세포.
H16. H4에 있어서, 제1 좌위가 UBAP2 유전자 내의 통합 부위이고, 제2 좌위가 하기 군 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, MTMR2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로부터 선택된 유전자 내의 통합 부위인, TI 숙주 세포.
H17. H4에 있어서, 제1 좌위가 MTMR2 유전자 내의 통합 부위이고, 제2 좌위가 하기 군 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, XP_003512331.2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로부터 선택된 유전자 내의 통합 부위인, TI 숙주 세포.
H18. H4에 있어서, 제1 좌위가 XP_003512331.2 유전자 내의 통합 부위이고, 제2 좌위가 하기 군 LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, 및 이들과 적어도 약 90% 상동성인 서열로부터 선택된 유전자 내의 통합 부위인, TI 숙주 세포.
H19. H4 내지 H18 중 어느 하나에 있어서, 제1 좌위에서 도입된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열이 조절가능한 프로모터를 포함하는, TI 숙주 세포.
H20. H4 내지 H18 중 어느 하나에 있어서, 제2 좌위에서 도입된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열이 조절가능한 프로모터를 포함하는, TI 숙주 세포.
H21. H4 내지 H18 중 어느 하나에 있어서, 제1 좌위에서 도입된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 제2 좌위에서 도입된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열이 조절가능한 프로모터를 포함하는, TI 숙주 세포.
J. 적어도 하나의 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, TI 숙주 세포의 게놈의 하나 이상의 좌위 내의 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는, 단계; 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산를 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택하여, 적어도 하나의 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법.
J1. 적어도 하나의 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, 숙주 세포의 게놈의 하나 이상의 좌위 내의 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 제1 및 제2 RRS, 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하고, 모든 RRS는 이종특이성인, 단계; 적어도 하나의 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제1 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; 적어도 하나의 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; 하나 이상의 재조합효소 또는 하나 이상의 재조합효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산를 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택하여, 적어도 하나의 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법.
J2. 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) TI 숙주 세포의 게놈의 하나 이상의 좌위 내의 부위에서 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 RRS를 포함하는, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 하나 이상의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI에 측접하고 적어도 하나의 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 RRS를 포함하는 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 d) 유발인자의 존재하에 외인성 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법.
J3. 관심대상 폴리펩타이드의 발현 방법으로서, a) 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 외인성 SOI 및 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합된 조절가능한 프로모터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성인, 단계; 및 b) SOI를 발현하는데 적합한 조건하에 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
J4. 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법으로서, a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 좌위는 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 상동성이고, 여기서 외인성 뉴클레오타이드 서열은 제1, 제2 RRS 및 제1 RRS와 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS을 포함하고, 모든 RRS는 이종특이성인, 단계; b) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 정합하고 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제1 외인성 SOI에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제1 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; c) 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 제2 및 제3 RRS에 정합하고 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제2 벡터를 a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계; d) 하나 이상의 재조합효소, 또는 하나 이상의 재조합효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 재조합효소는 RRS를 인식하는, 단계; 및 e) 유발인자의 존재하에 제1 및 제2 외인성 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 관심대상 제1 및 제2 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계를 포함하는 방법.
J5. J, J2 및 J3 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 SOI를 포함하는 핵산의 통합이 외인성 뉴클레아제에 의해 촉진되는, 방법.
J6. J1 또는 J4에 있어서, 제1 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하고; 제2 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
J7. J5에 있어서, 외인성 뉴클레아제가 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질, RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제, 조작된 메가뉴클레아제, 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(CRISPR)-관련(Cas) 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
J8. J 내지 J4 중 어느 하나에 있어서, 조절가능한 프로모터가 SV40 및 CMV 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
J9. J2 및 J4 중 어느 하나에 있어서, 제1 벡터가 제1 SOI가 상류에 측접하고 RRS가 하류에 측접하여 위치된 코돈 ATG에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 더 포함하고; 제2 벡터가 RRS가 상류에 측접하고 제2 SOI가 하류에 측접한 ATG 전사 개시 코돈이 결핍된 선택 마커를 더 포함하는, 방법.
K. a) 서열번호 1의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
b) 서열번호 2의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
c) 서열번호 3의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
d) 서열번호 4의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
e) 서열번호 5의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열;
f) 서열번호 6의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열; 또는
g) 서열번호 7의 임의의 부분으로부터 선택된 2개의 참조 서열
과 적어도 50% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로서, 여기서 2개의 뉴클레오타이드 서열은 DNA 카세트에 측접하고, 여기서 DNA 카세트는 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결되고 2개의 RRS에 측접한 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함하는, 벡터.
K1. K에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 60% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
K2. K에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 70% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
K3. K에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 80% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
K4. K에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 90% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
K5. K에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 95% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
K6. K에 있어서, 벡터가 2개의 참조 서열과 적어도 99% 상동성인 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
K7. K 내지 K6 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 전위효소 벡터, 인테그라제 기질 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
K8. K 내지 K7 중 어느 하나에 있어서, SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는, 벡터.
실시예
하기 실시예는 단지 본 명세서에 개시된 주제를 설명하기 위한 것이고, 어떠한 방식으로도 제한으로 간주되지 않아야 한다.
실시예 1: 임상적 및 상업적 세포주 개발을 위한 CHO 숙주 세포를 위한 고생산성 표적화된 통합 부위의 발견
이 실시예는 높은 생산성을 갖는 CHO 게놈에서 표적화된 통합 좌위를 동정하는 방법을 기재한다. 통상적인 세포주 개발(CLD)은 흥미잇는 서열(SOI)을 보유한 플라스미드의 무작위 통합(RI)에 의존한다. 이러한 공정은 예측 불가능하고, 노동 집약적이다. 마찬가지로, 고 생산성 RI 클론을 확인하는데 많은 노력이 필요하다. 통상적인 RI CLD와 달리, 표적화된 통합(TI) CLD는 정의된 카피 수(일반적으로 1-2 카피)를 갖는 CHO 게놈에서 미리 결정된 "핫-스팟"에서 전이유전자를 도입한다. 낮은 카피 수 및 미리 시험된 통합 부위를 고려하여, TI 세포주는 RI 주와 비교하여 더 우수한 안정성을 가져야 한다. 게다가, 선택적 마커가 이유전자 발현의 높은 수준을 갖는 세포를 선택하는 것이 아닌 적절한 TI를 갖는 세포를 선택하는 것에만 사용되기 때문에, 덜 돌연변이 유발성인 마커는 서열 변이체(SV)의 변화를 최소화하기 위하여 적용될 수 있고, 이는 부분적으로 메토트렉세이트(MTX) 또는 메티오닌 설폭시민(MSX)과 같은 선택적 제제의 돌연변이 유발성으로 인한 것이다.
도 1은 항체의 안정하고 높은 발현을 허용하는 CHO TI 좌위를 동정하기 위한 게놈-와이드 스크리닝 단계의 개요를 보여주는 다이어그램이다. CHO 게놈에서 전사 활성 서열을 스크리닝하기 위하여, 2개의 접근법은 항체 카세트를 CHO 게놈으로 도입하는데 이용되었고, 이는 항체 A 또는 항체 B를 발현하고, 여기서 항체 서열은 RRS1 및 RRS2에 측접하였다. 하나의 접근법은 통상적인 무작위 통합 방법이었고, 다른 것은 플라스미드 및 항체 플라스미드를 발현하는 전위효소의 공동형질감염을 필요로 하는 전위효소-기반의 통합이었다. 15k-20k 감염체를 각각의 방법에 대하여 스크리닝하였다. 온전한 IgG ELISA 검정 및 유전자 카피 분석을 기반으로, 높은 항체 역가 및 낮은 HC 유전자 카피 수를 갖는 총 ~300개의 클론을 셰이크 플라스크에서 유가식 평가를 위하여 확장하였다. 그 다음, 허용되는 역가 및 생성물 품질 속성을 갖는 2개의 방법에 의해 동정된 40개의 잠재적으로 상이한 높은 전사 활성 통합 부위를 나타내는 40개의 클론을 GFP 랜딩 패드 스와핑을 위하여 선택하여 TI 숙주를 생성하였다.
전사 활성 좌위에서 항체 카세트를 교체하기 위하여, 동일한 RRS1 및 RRS2에 측접한 GFP 유전자 및 적절한 선택 마커를 인코딩하는 랜딩 패드를 RMCE를 위하여 건설하였다. RMCE를 개시하기 위하여, 재조합효소 및 GFP 랜딩 패드를 40개의 상위 클론의 각각으로 공동형질감염시켰다. 2개의 선택 마커를 사용하여 표적화된 통합 사건을 풍부하게 만들었다. 성공적인 RMCE는 전사 활성 좌위로 표적화되고 항체 카세트를 교체하는 GFP 랜딩 패드를 야기하여야 하고, 이는 GFP 발현의 증가 및 항체 발현의 좌위의 손실을 야기한다. GFP-/mAB+에서 GFP+/mAb-로의 표현형의 변화는 FACS 분석을 사용하여 용이하게 검출 가능하여야 한다. GFP+/mAb- 풍부화는 FACS 분석을 사용하는 40개의 RMCE 풀 중에서 14에서 검출되었다. 개별적인 TI 숙주 후보를 단리시키기 위하여, 그 다음, 이들 14개의 RMCE 풀 각각을 단일 세포 클로닝하였다. 14개의 풀로부터 총 90개의 잠재적인 TI 숙주 후보를 FACS 및 원래 항체 카세트가 제거되고 관심대상 통합 부위에서 GFP 랜딩 패드에 의해 교체되는 게놈 PCR 확인을 기반으로 선택하였다. 후속적으로, 이들 후보 숙주 중 일부를 동일한 RRS1 및 RRS2에 측접한 시험 항체 C를 사용하는 이들의 RMCE 능력 및 효율에 대하여 평가하였다. 전사 활성 좌위가 확인되는 방법에 따라 2개의 이중 선택 계획을 사용하여 표적화된 항체 발현 집단을 생성하였다(도 2A 및 도 2B). 랜딩 패드의 구성은 2개의 스크리닝 방법에 있어서 약간 상이하였다. RMCE 효율뿐만 아니라 TI 형질감염 풀의 항체 생산성을 기준으로, 7개의 최종 숙주를 선택하였고, 이는 높은 항체 발현을 위하여 CHOK1M 숙주에서 7개의 고유한 통합 부위를 나타낸다.
이들 7개의 숙주를 표적화된 좌위 증폭/차세대 시퀀싱(TLA/NGS)에 의해 분석하여 통합 부위에 측접한 CHO 게놈 서열을 확인하였고, 따라서 관심대상 통합 부위가 거주하는 잠재적인 유전자 서열을 제공한다.
TI 숙주 세포 통합 부위
숙주 콘틱 콘틱
크기(kb) 		통합
부위(bp) 		유전자(서열번호)
1 NW_006874047.1 727 45269 LOC107977062(서열번호 1)
2 NW_006884592.1 931 207911 LOC100768845(서열번호 2)
3 NW_006881296.1 1016 491909 ITPR2(서열번호 3)
4 NW_003616412.1 127 79768 ERE67000.1(서열번호 4)
5 NW_003615063.1 372 315265 UBAP2(서열번호 5)
6 NW_006882936.1 3042 2662054 MTMR2(서열번호 6)
7 NW_003615411.1 277 97706 XP_003512331.2(서열번호 7)
통합 부위를 기준으로, 5' 측접 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 41190-45269, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 63590 내지 207911, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 253831 내지 491909, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 69303 내지 79768, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 293481 내지 315265, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2650443 내지 2662054, 및 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 82214 내지 97705를 포함할 수 있다.
통합 부위를 기준으로, 3' 측접 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270-45490, NW_006884592.1의 뉴클레오타이드 207912-792374, NW_006881296.1의 뉴클레오타이드 491910-667813, NW_003616412.1의 뉴클레오타이드 79769-100059, NW_003615063.1의 뉴클레오타이드 315266-362442, NW_006882936.1의 뉴클레오타이드 2662055-2701768, 및 NW_003615411.1의 뉴클레오타이드 97706-105117을 포함할 수 있다.
숙주 중 2개, 숙주 4 및 7에 있어서, 추가의 분석은 단일 GFP 랜딩 패드가 CHO 숙주 게놈으로 삽입되었다는 것을 나타냈다. 이들 2개의 숙주에서 항체 서열이 확인되지 않았고, 이는 전사 활성 좌위를 동정하는데 사용되는 초기 항체 카세트의 완전한 제거를 나타낸다. 추가로, 전체 게놈 시퀀싱은 이들 2개의 TI 숙주로부터 단리된 게놈 DNA을 위하여 가내에서 수행되었다. 항체 특이적 서열은 이들 2개의 TI 숙주에서 검출되지 않았고, GFP 서열(랜딩 패드로부터의 것)은 용이하게 검출되었다. 63x 초과의 게놈 범위는 TI 숙주에 대하여 달성되었다. TI 숙주에서 항체 A 및 B의 부재의 추가의 보장을 제공하기 위하여, LC-MS 연구를 사용하여 항체 A 및 B가 아닌 다른 항체를 발현하는 TI 세포주로부터의 다중 HCCF 샘플을 평가하였다. LC-MS/MS에 의한 서열 변이체 분석에 대한 유사한 접근을 사용하여 LC-MS 데이터를 분석하였고, 이는 0.5% 초과의 수준에서 변이체 펩타이드를 검출하는 능력을 갖는다. 항체 A 또는 B 펩타이드는 TI 세포주로부터 수확된 모든 샘플에서 검출되지 않았다. 마지막으로, 형광 동일 반응계 혼성화(FISH) 분석은 크롬비오스(Chrombios)로 수행하여 이들 2개의 TI 숙주의 게놈에서 GFP 랜딩 패드의 염색체 위치를 결정하였다.
이들 2개의 잘 특성화된 TI 숙주를 추가로 총 16개의 상이한 표준 항체에 의한 임상적 세포주 개발에서 이의 RMCE 견고함에 대하여 추가로 평가하였다. 도 3은 이들 TI 숙주에 의해 생성된 상위 클론의 생산성을 보여준다. 역사적으로 무작위 통합에 의해 생성된 세포주의 평균 생산성은 ~3g/ℓ이었다. 시험된 대부분의 경우에, TI 세포주는 평균적으로 RI 클론과 유사하거나 더 우수한 생산성을 보여주었다.
TI 세포주는 더 낮은 항체 유전자 카피 수로 인하여 더 우수한 안정성 및 RI 세포주보다 낮은 SV를 가질 것으로 예상되었다. 클론 안정성에 있어서, 매달 유가식 제조는 생산성을 모니터링하기 위하여 4 개월 동안 매달 설정되었다. 표 3은 TI 숙주 중 하나에 의해 생성된 TI 세포주의 겨우 10%만이 PSB로부터 120 일 후 20% 초과의 역가 강하를 가졌다는 것을 보여주었다. 역사적으로, RI 세포주의 60%는 유사한 역가 강하를 가질 것이다. 이는 동정된 통합 부위가 안정한 항체 발현에 매우 적합하다는 것을 강하게 제시한다. TI 세포주에 또한 NAT-기반의 서열 변이 분석을 수행하였다. RI 세포주(4% 대 15%, 표 3)와 비교하는 경우, TI 세포주에서 SV > 5%의 유의미하게 더 낮은 빈도가 존재하였다.
TI 대 RI의 이점
특징 RI TI
카피# 클론 의존성 낮음
클론 안정성
(PSB로부터 120일 후 20% 초과의 역가 강하)		 클론의 대략 60% 클론의 대략 10%
서열 변이(SV)
(>5%)		 클론의 대략 5% 클론의 대략 4%
실시예 2: 2-플라스미드 RMCE 전략
표준 항체를 위한 높은 역가 발현을 달성하고 다중-쇄 복합체 포맷을 발현하는 도전을 해결하기 위하여, 혁신적인 2-플라스미드 RMCE 전략을 개발하였다. 2-플라스미드 RMCE 방법은 8개 이상의 쇄가 TI 부위에서 동시에 표적화되는 것을 가능하게 한다. 이러한 접근법은 항체의 HC 및 LC 쇄 비를 조절하는 유연성을 증가시켜 생산성을 개선시킬 뿐만 아니라, 다중 쇄를 갖는 복합체 분자를 가능하게 할 뿐만 아니라 세포 경로를 개질하기 위하여 항체로 전이유전자, 내인성 유전자 또는 RNAi를 표적화하는 것을 가능하게 한다.
2-플라스미드 RMCE 전략은 3개의 RRS 부위를 사용하여 2개의 독립적인 RMCE를 동시에 수행하는 것을 포함한다(도 4). 따라서, 상기 기재된 TI 숙주에서 GFP 랜딩 패드를 RRS1 또는 RRS2 부위를 갖는 교차 활성을 갖지 않는 제3 RRS 부위(RRS3)를 포함하도록 교체하였다. 표적화되는 2개의 발현 플라스미드는 RRS1 및 RRS3에 측접한 하나의 발현 플라스미드(앞) 및 RRS3 및 RRS2에 측접한 다른 것(뒤)를 효율적으로 표적화하기 위하여 동일한 측접 RRS 부위를 필요로 한다. 2-플라스미드 RMCE 효율이 낮을 것으로 예상되기 때문에, 엄격한 선택 계획은 희귀한 RMCE 특이적 사건을 풍부하게 만드는데 유용하다. 적어도 2개의 선택 마커가 2-플라스미드 RMCE에서 필요하다. 특정한 실시형태에 있어서, 3개의 선택 마커가 사용되고, 이 중 하나의 선택 마커 발현 카세트는 2개의 부분으로 분할된다(예를 들면, 도 4 참조). 분할 선택 마커 발현 카세트를 포함하는 특정한 실시형태에 있어서, 앞 플라스미드는 프로모터 후, 개시 코돈 및 RRS3 서열을 함유할 것이다. 뒤 플라스미드는 ATG 개시를 제외한, 선택 마커 코딩 영역의 N-말단에 융합된 RRS3 서열을 가질 것이다. 추가의 뉴클레오타이드는 융합 단백질을 위하여 프레임 번역을 보장하기 위하여 RRS3 부위와 선택 마커 서열 사이에 삽입될 필요가 있을 수 있다. 2개의 플라스미드가 정확하게 표적화되는 경우만이 선택 마커의 완전한 발현 카세트이 조립되고 따라서 선택에 대하여 세포 저항성을 부여할 것이다. 도 4는 2개의 플라스미드 RMCE 전략을 나타내는 도식 다이어그램이다. 물론, 단일-플라스미드 RMCE는 필요한 경우 여전히 RRS1 및 RRS2를 사용하여 수행될 수 있다.
2-플라스미드 RMCE 접근법의 견고성을 시험하기 위하여, 원래 GFP 랜딩 패드를 이전에 동정된 TI 숙주, 숙주 4를 사용하여 3개의 RRS 부위를 갖는 새로운 GFP 랜딩 패드로 교체하였다. 2-플라스미드 RMCE에 대하여 더 낮은 초기 RMCE 효율과 일치하게, 더 심한 생존능 딥과 더 긴 회수 기간이 단일-플라스미드 RMCE와 비교하여 2-플라스미드 RMCE에 대하여 관찰되었다. 일단 풀이 회수되면, FACS, 게놈 PCR 및 유전자 카피 분석을 평가하여 플라스미드 카세트가 둘 다 TI 부위에 정확하게 표적화되었는지를 평가하였다. 단일-플라스미드 RMCE 및 2-플라스미드 RMCE 둘 다를 사용하여 총 5개의 표준 항체(Q, R, S, T 및 U)를 생산성에 대하여 시험하였다(도 5). 2-플라스미드 RMCE에서, 더 많은 총 HC 및 LC 카피가 단일 플라스미드 RMCE와 비교하여 TI 부위에 표적화되었다. 모두 5개의 경우에, 2-플라스미드 TI 형질감염 풀의 생산성은 일정하게 더 높았고, 단일 플라스미드 풀의 것과 비교하여 200%까지 증가하였다. 2-플라스미드 RMCE에서 역가의 증가는 주로 특이적 생산성에서 기인하였고, 이는 이의 수준이 단일-플라스미드 RMCE의 것과 비교하여 300% 만큼 개선되는 것으로 보였다.
잘 특성화된 TI 숙주, 예를 들면, 숙주 4를 5개의 상이한 항체의 높은 역가를 달성하는 이들의 능력에 대하여 상이한 세포 배양 플랫폼에서 추가로 평가하였다. 도 6은 이들 TI 숙주에 의한 이들의 항체의 생산성을 나타낸다. 대부분의 항체에서 10 g/ℓ보다 높은 생산성은 제14일에 달성되었고, 12 g/ℓ보다 높은 것은 제16일에 달성되었다.
복합체 mAb 포맷을 발현하는 2-플라스미드 RMCE를 사용하여 평가하기 위하여, 이중특이적 어셈블리에 대하여 동일한 세포에서 발현되는 4개의 상이한 쇄(2개의 HC 및 2개의 LC)를 필요로 하는 2개의 이중특이적 분자를 시험하였다. 동시에 표적화되는 2개의 별개의 발현 플라스미드를 가능하게 하기 위하여, 상이한 쇄의 플라스미드 구성을 균형을 맞춘 발현을 위하여 최적 쇄 비를 달성하도록 조작할 수 있다. 두 경우에, 숙주 4로부터 유래된 세포주는 2-플라스미드 RMCE를 사용하여 80% 초과의 이중특이적 함량(도 7)과 함께 1.5g/ℓ 초과를 갖도록 발달하였다.
이중특이적 어셈블리에 대하여 동일한 세포에서 발현되는 4개의 상이한 쇄(2개의 HC 및 2개의 LC)를 필요로 하는 4개의 이중특이적 분자의 제14일 역가를 또한 평가하였다. 숙주 4로부터 유래된 모든 세포주는 2-플라스미드 RMCE를 사용하여 80% 초과의 이중특이적 함량과 함께 1.5g/ℓ 초과의 역가(도 8)를 갖도록 발달하였다.
실시예 3: mAb-I(발현되기 어려운) 대 mAb-II(평균-발현) 항체 분자를 발현하는 RTI 세포주의 발현 및 성장 분석
발현되기 어려운 분자는 몇몇 CLD 시도 후, 모든 발생된 세포주는 일반적으로 표준 CLD 플랫폼 공정으로부터 예상되는 것보다 낮은 역가를 달성하는 경우와 같이 정의된다. 미리 정의된 발현되기 어려운 하나의 항체(mAb-I)에 대하여, 예를 들면, 4개의 별개의 CLD 시도로부터 120 초과의 세포주를 유가식 생산 배양에서 평가하였다. 그러나, 가장 높은 mAb-I 발현 세포주는 평균 항체 분자(mAb-II)와 비교되는 경우, 오직 50%의 전형적인 역가를 달성할 수 있고, 이에 대하여 오직 24개의 세포주가 스크리닝되었다(도 9A 표). 불행하게도, 주로 상이한 세포주 사이의 전이유전자 카피 수 및 유전자 통합 부위의 차이로 인하여 무작위 통합 시스템에서 발현되기 어려운 분자를 만들 수 있는 근본 원인(들)을 추적하는 것은 매우 어렵다.
mAb-I가 발현되기 어렵게 만드는 근본 요인(들)을 확인하기 위하여, RTI 시스템을 사용하여 mAb-I 및 mAb-II 분자 둘 다에 대하여 CLD를 개시하였다. HC 및 LC 구조체를 둘 다 유도성 CMV-TO 프로모터 조절하에 발현 벡터로 클로닝하고, 전이유전자 전사의 유사한 수준으로 세포주를 단리시킬 가능성을 증가시키기 위하여 이들 벡터를 TI 숙주로 형질감염시켰다. mAb-I 및 mAb-II에 대한 RTI CLD 접근법의 전체 도식은 도 9B에 도시된다. 형질감염된 세포주를 CLD 공정 전체에서 세포주가 1) Dox(유도됨)의 존재하에 유래되거나, 2) Dox(유도되지 않은)의 부재하에 유래되는 2개의 별개의 조건을 사용하여 선택에 대하여 수행하였다. Dox의 부재하에 유래된 세포주는 시드 트레인 역가를 기반으로 또는 지시된 생산 검정 동안 순위가 매겨지도록 일시적으로 유도되었다. 이는 선택 공정 동안 항체 발현(발현 압력)의 역할의 평가를 가능하게 하였다(도 9B).
독시사이클린의 존재 또는 부재하에 "유도된" 및 "유도되지 않은" 시드 트레인 암 둘 다로부터 숙주 7로부터 유래된 2개의 대표적인 mAb-I 및 mAb-II 세포주를 사용하여 생산 검정을 수행하였다. 후자는 유도의 부재하에 프로모터 누수성 및 기본 항체 생산 수준을 평가하는데 사용하였다. 독시사이클린의 부재하에 항체 발현의 더 단단한 조절이 관찰되었고, 이는 이들 세포주에서 조절된 발현 시스템이 효과적으로 기능하였다는 것을 제시한다(도 10A 및 도 10C). 독시사이클린 부재하에 성장 프로파일이 약간 더 우수한 것으로 나타났음에도 불구하고, 독시사이클린의 존재 또는 부재하에 모든 세포주의 성장(도 10B) 프로파일을 유사하였다. "유도된" 또는 "유도되지 않은" 시드-트레인 조건하에 유래된 세포주는 생산 동안 상대적으로 유사한 역가 및 특이적인 생산성을 나타냈고(도 10A 및 도 10C, mAb-I 또는 mAb-II에 대하여 세포주 1 및 2를 3 및 4와 비교함), 이는 선택 동안 구성적 항체 발현이 높은 역가 세포주의 단리에서 유의미한 역할을 하지 않았다는 것을 나타낸다(도 10). 추가로, RI CLD 시도와 유사하게, mAb-I RTI 세포주의 역가 및 특이적 생산성은 mAb-II RTI 세포주보다 여전히 50% 낮았다(도 10A 및 도 10C). 이러한 관찰은 mAb-I의 "유도된" 및 "유도되지 않은" RTI 배양이 둘 다 mAb-II 대조군 세포주와 비교하여 더 낮은 역가를 유사하게 나타냈기 때문에 mAb-I의 낮은 발현에 대한 범인으로 만성 독성을 제외하였다.
실시예 4: mAb-I 세포주에서 더 낮은 항체 발현은 더 낮은 전사로 인한 것이 아니었다
mAb-I 발현 세포주에서 관찰된 더 낮은 항체 발현을 분석하기 위하여, qRT-PCR 실험을 수행하여 독시사이클린 유도 및 비유도 조건하에, mAb-I 또는 mAb-II를 발현하는 RTI 세포주에서 항체 HC 및 LC의 mRNA 수준을 측정하였다. Dox의 부재하에, mAb-I 또는 mAb-II 세포주는 적은 HC 또는 LC mRNA를 발현하거나 발현하지 않았고, 이는 유도성 프로모터에 의한 상대적으로 단단한 전사 조절을 나타낸다(도 11). Dox의 존재하에, mAb-I 발현 세포주의 항체 HC 및 LC 전사 수준은 mAb-II 발현 세포주의 것보다 유사하거나 더 높았다(도 11A 및 11B). 이들 결과는 전이유전자 전사의 감소된 수준이 mAb-I 발현 세포주에서 낮은 항체 발현에 대한 이유가 아니었다는 것을 확인해주었다. 추가로, "유도된" 또는 "유도되지 않은" 조건하에 단리된 세포주가 유사한 HC 또는 LC mRNA 수준을 갖기 때문에 CLD 공정 동안 시드-트레인 배양에서 독시사이클린 부재 또는 존재는 전이유전자 전사 속도에 영향을 미치지 않았다(도 11A 및 11B).
실시예 5: mAb-I 발현의 유도는 세포내 BiP의 가역적 축적을 야기하였고, 항체 HC 분해를 나타냈다
mAb-I 발현에 영향을 미치는 근본 인자를 확인하기 위하여, 사이클로헥스이미드(CHX) 처리 및 제거와 함께 Dox 유도를 사용하여 항체 분비, 폴딩, 및 분해를 조사하였다. 이들 실험을 위하여, "유도된" 배양을 CHX로 처리하여 단백질 합성을 중단시키고, 5시간 후, 세포를 세척하고 오로지 Dox(CHX 없음)를 함유하는 배지로 재현탁시켜, 단백질 합성을 재개시켰다(도 12A). CHX 제거 후 대략 60분 동안 이들 배양의 상청액에서 HC 또는 LC가 검출되지 않았고, 항체 분비에서 점진적인 증가가 120분 후 유사한 속도로 검출되었다(도 12B, 상부 패널). 이는 적절하게 폴딩되고 조립된 항체 분자가 mAb-I 및 mAb-II 세포주 post CHX 제거 후 mAb-I와 mAb-II 세포주 사이에서 유사하였다는 것을 제시한다. 항체 LC의 세포내 수준은 또한 mAb-I 및 mAb-II 발현 세포주 사이에서 상당히 유사하였다(도 12B, LC 패널). 그러나, 심지어 CHX 처리 5시간 후에도 mAb-I 발현 세포주에서 mAb-II 발현 주와 비교하여 유의미하게 높은 수준의 세포내 항체 HC가 검출되었다(도 12B, HC 패널). 이는 mAb-I 발현 세포주에서 폴딩되거나 미스폴딩된 항체 HC의 분해 및 제거에서 지연 또는 문제를 암시하였다. 흥미롭게도, CHX 처리 전과 후에 mAb-II 세포주에 비하여 mAb-I에서 세포내 BiP의 매우 높은 수준이 검출되었다(도 12B, 하부 패널, BiP). 샤프론으로서 BiP는 폴딩되지 않은 단백질 반응(UPR) 뿐만 아니라 항체 HC 또는 LC 폴딩에서 암시되었고, 시드 트레인 배양에서 이의 존재는 ER 관련 세포 스트레스의 지시자가 될 수 있다.
mAb-I 발현과 세포내 BiP 축적 사이의 상관관계를 더 조사하기 위하여, "유도된" 시드 트레인 배양을 밤새 독시사이클린을 함유하는 배지에서 CHX로 처리하거나 처리하지 않고, 이들 샘플에서 세포내 HC, LC 및 BiP 수준을 평가하였다. CHX 처리의 부재하에, 세포내 항체 HC 분자의 기저 수준은 mAb-II 세포주에 비하여 mAb-I에서 더 높았고, 세포내 LC의 수준은 모든 샘플 세트 사이에서 유사하였다. 다른 한편으로는 BiP 수준은 mAb-II 발현 세포주에 비하여 mAb-I에서 상당히 더 높았다(도 12C, -CHX 샘플). CHX에 의한 이들 배양의 밤새 처리는 mAb-I 발현 세포주에서 특히 BiP 수준의 동시적인 감소와 함께 모든 세포주에서 HC 및 LC의 수준의 감소를 야기하였다(도 12C, +CHX 샘플). 이는 이전 발견과 일치하였다(도 12B). 사이클로헥스이미드가 모든 진핵 단백질의 합성을 무차별로 억제하기 때문에, mAb-I 세포주에서 더 높은 BiP 수준은 항체 HC 또는 LC 아단위의 축적과 직접적으로 연결될 수 없다. 그러나, 조절된 발현 시스템은 세포내 BiP와 항체 HC 또는 LC 수준 사이의 연결을 직접적으로 시험할 수 있는 능력을 제공하였다. 이를 위하여 독시사이클린을 6일 동안 배지로부터 제거하여, 다른 내인성 단백질의 발현에 영향을 미치지 않고 항체 발현을 특이적으로 끄고, 세포내 HC, LC, 및 BiP 수준을 모니터링하였다. 항체(HC 및 LC) 발현과 mAb-I 세포주에 대한 세포내 BiP의 축적 사이의 직접적이고 특이적인 연결이 관찰되었고, mAb-II의 발현은 세포내 BiP 수준에 영향을 미치지 않는 것을 보여주었다(도 12D).
실시예 6: mAb-I LC 발현이 세포내 BiP 축적을 촉발함에도 불구하고, mAb-I HC는 또한 별개로 이러한 항체의 낮은 발현에 기여하였다
mAb-I LC가 세포내 BiP의 축적에서 역할을 하는지 여부를 결정하기 위하여, 조절된 프로모터하에 mAb-I HC를 발현하고 LC가 구성적으로 발현되는 구조체를 생성하였다. mAb-I 또는 mAb-II(대조군)의 조절된 HC/LC를 발현하는 구조체와 함께 구조체를 CHO 세포로 형질감염시키고, 각각의 형질감염으로부터 2개의 분리된 풀을 유도하였다. 풀 역가를 생산 배양에서 평가하고(도 13A), 시드 트레인 배양을 독시사이클린의 존재 및 부재하에 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다(도 13B). 생산 검정 동안, 각각의 풀을 Dox로 유도하거나 유도되지 않은 채로 두었다. 유도되지 않은 풀은 제조 동안 매우 적은 항체를 발현하였고, 이는 단단한 발현 조절을 나타낸다(도 13A, -Dox). 제조 동안 Dox 유도된 배양의 분석은 "유도되지 않은" 시드 트레인 배양으로부터 유래된 조절된-HC/구성적-LC mAb-I 발현 풀이 시드 트레인 동안 "유도된" 조절된 HC/LC mAb-I 풀 및 조절된-HC/구성적-LC mAb-I 풀에 비하여 상당히 낮은 역가를 가졌다는 것으로 드러냈다(도 13A). "유도되지 않은" 배양의 웨스턴 블롯 분석은 모든 조건하에 항체 HC가 Dox가 배지에 추가되는 경우에만 발현되었다는 것을 보여주었다. 추가로, mAb-I HC 없이 mAb-I LC 단독의 구성적 발현은 세포내 BiP의 축적을 촉발하였다(도 13B). 이들 결과는 mAb-I LC 아단위의 발현과 세포내 BiP의 축적 사이의 직접적인 연결을 암시하였다. HC의 부재하에 구성적으로 발현되는 경우, mAb-I의 LC 분자는 BiP 샤프론과 상호작용하는 ER 내의 폴딩되지 않은 응집물을 형성하는 것 같고, 이는 이들 세포에서 BiP의 세포내 수준의 증가를 촉발한다. 제조 단계 동안 mAb-I HC의 발현은 이들 세포에 더 부담이 되고, 이는 HC 및 LC 분자 둘 다의 폴딩을 수용하는 세포내 BiP에 대한 요구를 증가시키고, 비효율적인 항체 어셈블리, 폴딩 및 분비 효율을 야기한다(도 13A).
이들 발견이 mAb-I LC 발현과 세포성 ER 스트레스 사이의 연결을 지적하고, 세포내 BiP의 축적에 의해 지시되는 바와 같이, mAb-I LC의 발현과 mAb-I 세포주의 낮은 역가 사이의 직접적인 연결은 확립될 필요가 있었다. 이를 위하여, mAb-I 및 mAb-II 중쇄 및 경쇄가 스와핑되어 HCILCI, HCIILCII, HCILCII, 및 HCIILCI 항체 조합을 발생시키는 항체 분자를 생성하였다. HCILCII 구조체는 mAb-I HC 및 mAb-II LC를 갖는 항체를 발현하였고, HCIILCI 구조체는 mAb-II HC 및 mAb-I LC를 갖는 항체를 발현하였다. 모든 이들 구조체에 대하여 항체 HC 및 LC 발현은 RTI 벡터 시스템에서 CMV-TO 프로모터의 조절하에 있었다(도 13C). 그 다음, 이들 구조체를 우리의 CHO TI 숙주 세포 및 2개의 분리된 RTI 풀로 형질감염시키고, 각각의 구조체에 있어서 생성하고, mAb-I, 또는 mAb-II, 또는 이들 항체의 하이브리드 버전의 발현을 시험하였다. 이전에 기재된 바와 같이(도 13B), mAb-I LC 발현과 세포내 BiP의 축적 사이의 분명하고 직접적인 상관관게가 관찰되었다(도 13D, LC 및 BiP 블롯). 흥미롭게도, 세포내 BiP는 또한 HCIILCII와 비교하여 HCILCII 하이브리드 항체를 발현하는 풀에서 덜 강하지만 현저한 방식으로 축적되었고, 이는 아마도 HCI의 발현으로 인하여 이들 풀에서 ER 스트레스의 일부 수준을 암시한다(도 13D, HCIILCII 및 HCILCI 샘플에서 긴 노출 BiP 수준과 비교하여). Dox 제거를 통하여 항체 발현을 끄는 것은 mAb-II(HCBLCB) 풀을 제외하고 모든 RTI 풀에서 세포내 BiP 수준의 감소를 야기하였고, 여기서 세포내 HC 및 BiP 둘 다의 초기 수준은 심지어 Dox 제거 전에도 상당히 낮았다(도 13D, 다른 풀에 대하여 HCIILCII 풀에서 제0일에 HC 및 BiP 수준을 비교).
전체 항체 발현에 대하여 mAb-I HC 및 LC의 역할을 평가하기 위하여, HCILCI, HCIILCII, HCILCII, 및 HCIILCI RTI 풀을 생산 검정에서 평가하였다. 독시사이클린의 부재하에, 모든 RTI 풀은 적은 항체를 발현하였고, 이는 항체 발현의 단단한 조절을 나타낸다(도 14A, -Dox). 모든 RTI 풀에 대하여 성장 속도는 유사하고, 유도된 배양은 유도되지 않은 배양에 비하여 약간 낮은 성장 속도를 가졌다(도 14B). 이전에 관찰된 바와 같이, mAb-I 및 mAb-II RTI 풀은 각각 최저 및 최고 역가 및 특이적 생산성을 가졌다(도 14A 및 14C). 흥미롭게도, HCIILCI 및 HCILCII RTI 풀은 둘 다 HCILCI보다 높지만 HCIILCII RTI 풀보다 낮은 역가 및 특이적 생산성을 나타냈다(도 14A 및 14C). 이들 결과는 mAb-I HC 및 LC 아단위 둘 다가 개별적으로 mAb-II에 비하여 이러한 항체의 낮은 발현에 기여했다는 것을 나타냈다. 우리의 예상과 반대로, LCI 아단위를 발현하는 하이브리드 RTI 풀은 HCI 아단위를 발현하는 풀에 비하여 약간 더 높은 역가 및 특이적 생산성을 가졌다(도 14A 및 14C). 이는 mAb-I HC가 LC 아단위에 비하여 이러한 항체의 낮은 발현에서 약간 더 유의미한 역할을 하였다는 것을 나타냈다. RTI 시스템과 조합으로 항체 체인 스왑 접근법의 사용은, 심지어 생물학적 스트레스의 명백한 지시자(예를 들면, 세포내 BiP 축적)가 확인될 수 없는 경우에도, mAb-I HC 아단위의 발현과 연관된 부정적인 효과를 드러냈다.
실시예 7: mAb-I 및 mAb-II HC 및 LC 아단위 사이의 아미노산 서열의 차이
특정한 아미노산 잔기가 mAb-I HC 및 LC의 문제가 있는 발현에 기여할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, mAb-I 및 mAb-II LC(도 15A) 및 HC(도 15B) 아단위의 아미노산 서열을 정렬하였다. mAb-I 및 mAb-II HC 및 LC 분자의 모든 CDR 영역에 대하여 아미노산 조성물은 이들이 상이한 항원을 표적화하도록 개발되었기 때문에 서로 상이하였다. LC 아단위에서, 나머지 가변 및 모든 불변 영역에 대하여 mAb-I와 mAb-II 분자 사이의 아미노산 서열의 차이가 없다. LCI의 CDR1 절편은 LCII보다 긴 6 아미노산이고, 여기서 LCII의 CDR3 절편은 LCI보다 긴 하나의 아미노산이다(도 15A). 항체 HC 아단위에 관해서는, CDR 절편을 배제하고, HCI 및 HCII의 나머지 가변 및 불변 영역은 4개의 아미노산 잔기를 제외하고 동일하다(도 15B). 이들 아미노산 중 2개의 변화는 상당히 보존성이었고(T→S 및 L→A), 따라서 HCI의 낮은 발현에 기여하지 않을 것 같다. HCI에서 N→G 변화는 항체 HC 글리코실화를 방지한다. 따라서, HCI의 발현에 대한 HCII와 HCI 사이의 N→G 및 Y→V 아미노산 차이의 효과를 조사하였다. 2개의 점 돌연변이를 생성하고, HCI의 G 및 V 아미노산 잔기를 N 및 Y로 각각 변경하였다(HCA 이중 돌연변이 또는 HCIdm). HCIdm을 LCI 및 LCII과 함께 사용하여 RTI 풀을 생성하고, 이들 풀에서 항체 발현을 제조 배양에서 평가하였다(도 16A). 발견은 HCIILCII에 대하여 관찰된 수준으로 LCI 증가된 항체 발현과 함께 HCIdm의 공동 발현을 나타냈고, 이는 이들 돌연변이가 HCA 항체의 낮은 발현 수준을 복구할 수 있다는 것을 제시한다(도 16A). 흥미롭게도, LCII와 공동발현되는 경우, HCIdm은 HCIILCII의 것보다 훨씬 더 높은 역가를 달성하였고, HCIdm이 HCII와 비교하여 발현 및 폴딩에서 우수하다는 것을 제시한다(도 16A). 이전에 관찰되는 바와 같이, HCILCI는 가장 낮은 역가를 가졌고, HCILCII은 중간체 항체 발현 프로파일에서 나타났다(도 16A). 웨스턴 블롯 분석은 LCI의 발현이 여전히 심지어 HCIdm와의 공동발현되는 경우에도, 증가된 세포내 BiP 축적과 연관되었다는 것을 드러냈다(도 16B). 도 16C는 RTI 시스템이 발현하기 어려운 분자를 발현하는 세포주에서 문제의 근원을 분석하고 확인하는데 어떻게 사용될 수 있는지의 진단 지침을 도시한다.
실시예 8: 2개의 별개의 독립적인 랜딩 패드를 함유하는 TI 숙주 세포의 발생
숙주 8은 2개의 별개의 독립적인 랜딩 패드를 함유하는 표적화된 통합(TI) 숙주이고, 이는 항체 유전자의 발현을 개별적으로 또는 동시에 표적화할 수 있다. 숙주 8에 대한 부모 세포주는 단일 랜딩 패드를 함유하는 숙주 7(표 2 참조)이다. 제2 랜딩 패드를 숙주 8로 게놈 위치에 삽입하였고, 여기서 랜딩 패드는 숙주 4 TI 숙주(표 2 참조)에 위치한다. 이러한 삽입은 숙주 7 TI 숙주 내에서 숙주 4 TI 부위 위치로 새로운 랜딩 패드의 CRISPR/Cas9-기반의 녹-인(knock-in)에 의해 수행되었다.
이를 달성하기 위하여, 숙주 4 TI 부위의 게놈 영역을 TI 숙주 4 및 TI 숙주 7 내에서 특성화하였다. 이러한 정보를 기반으로, 이러한 특이적 게놈 영역이 CRISPR/Cas9-기반의 녹-인을 촉진하도록 가이드 RNA를 건설하였다. 별개로, 새롭게 생성된 랜딩 패드를 함유하는 도너 플라스미드를 이러한 부위에 녹-인되도록 생성하였고, 표적화된 녹-인 부위의 게놈 영역 상류 및 하류에 상응하는 상동성 암과 함께 건설하여 녹-인을 촉진하고, 녹-인 클론의 스크리닝을 위하여 추가의 유전자를 허용한다. gRNA 및 Cas9를 위한 유전자를 함유하는 플라스미드의 공동형질감염, 및 도너 플라스미드를 새로운 랜딩 패드의 CRISPR/Cas9-기반의 녹-인을 촉진하기 위하여 수행하였다.
CRISPR/Cas9-기반의 녹-인을 겪은 클론의 선택 및 스크리닝 후, 숙주 8은 최종적으로 확인되고, 추가의 평가를 겪었다. 기존의 숙주 7 랜딩 패드는 온전한 것으로 결정되었고, 숙주 4 부위 위치에서 새로운 녹-인 랜딩 패드는 또한 존재하고, 온전하고, 정확한 위치에 있는 것으로 확인되었다.
그 다음, 두 부위에서 재조합효소-매개된 카세트 교환(RMCE)의 실행가능성을 각각 부위에 대하여 개별적으로, 그 다음, 동시에 평가하였다. 숙주 7 랜딩 패드 단독, 숙주 4 랜딩 패드 단독, 및 두 부위에서 동시에 RMCE에 의해 클론을 생성하고, 그 다음, 제14일 유가식 셰이크 플라스크 평가로 평가하였다. 두 부위에서 동시에 항체를 발현하는 클론의 역가 및 특이적 생산성은 각각의 부위에서 개별적인 발현과 비교하여 더 높았다. 추가의 평가는 상이한 세포 배양 공정, 세포 배양 플랫폼 B에서 수행하여 세포 배양 플랫폼 A와 비교하여 모든 클론에 대하여 추가의 역가 증가를 보여주었다(도 17). 숙주 4 부위의 제14일 역가의 평균은 3.0 g/ℓ였고, 숙주 7 부위의 경우 1.9 g/ℓ였고, 동시에 두 부위인 경우 플랫폼 A 세포 배양에서 3.9 g/ℓ였다.
최종적으로, TI 숙주 8는 TI 숙주 4의 랜딩 패드의 게놈 위치에 위치한 제2 랜딩 패드의 첨가에 의해 TI 숙주 7로부터 생성되었다. 추가의 조사는 랜딩 패드의 녹-인 및 RMCE의 실행가능성을 기존의 및 새로운 랜딩 패드 둘 다에서 확인한다. 추가로, 각각의 부위에서 개별적으로 및 두 부위에서 동시에 숙주 8로부터 생성된 클론의 평가는 항체 발현의 생산성을 보여준다. 동시에 두 부위 대 각각 개별적인 부위에서 항체 유전자의 발현은 세포 배양 플랫폼 A 및 세포 배양 플랫폼 B 둘 다에서 보이는 추가의 생산성 효과를 갖는다(도 17).
방법
항체 플라스미드 DNA 구조체 구성: 하나의 플라스미드 항체 구조체를 건설하기 위하여, 항체 HC 및 LC 단편을 L3 및 2L 서열 뿐만 아니라 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스페라제(pac) 선택성 마커를 함유하는 벡터 뼈대로 클로닝하였다. 2-플라스미드 항체 구조체를 건설하기 위하여, 항체 HC 및 LC 단편을 L3 및 LoxFAS 서열을 함유하는 앞 벡터 뼈대, 및 LoxFAS 및 2L 서열 및 pac 선택성 마커를 함유하는 뒤 벡터로 클로닝하였다. Cre 재조합효소 플라스미드 pOG231(Wong ET et al., 핵산s Res 2005, 33,(17), e147; O'Gorman S et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94,(26), 14602-7, 각각의 전문은 본 명세서에 참조로서 포함됨)을 모든 RMCE 공정에 대하여 사용하였다.
세포 배양: CHO 세포를 150 rpm으로 셰이킹하는 125 mL 세이크 플라스크 용기에서, 37℃ 및 5% CO2에서 독점적인 DMEM/F12-기반의 배지에서 배양하였다. 세포를 3-4일 마다 3x105 세포/mL의 시딩 밀도에서 계대하였다.
RMCE 안정한 세포주 개발: 발현 플라스미드를 MaxCyte STX® 전기천공(MaxCyte, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)에 의해 TI 숙주로 형질감염시켰다. 그 다음, RMCE 형질감염 풀을 퓨로마이신 및 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-1-베타-D-아라비노푸라노실-5-요오도)우라실(FIAU)(Moravek)와 함께 선택하였다. 풀 선택 후, 단일 세포 클로닝(SCC)을 수행하여 추가의 평가를 위하여 TI 세포주를 생성하였다.
유가식 생산 검정: 유가식 생산 배양을 독점적인 화학적으로 정의된 생산 배지로 세이크 플라스크 또는 ambr15 용기(Sartorius Stedim)에서 수행하였다. 세포를 제0일에 1x106 세포/ml로 시딩하고, 제3일에 37℃에서 35℃로 온도를 변화시켰다. 배양은 제3일, 제7일, 및 제10일에 독점적인 공급 배지를 제공받았다. 배양에서 세포의 생존 가능한 세포 계수(VCC) 및 퍼센트 생존능은 Vi-Cell™ XR 장치(Beckman Coulter)를 사용하여 제0일, 제3일, 제7일, 제10일, 및 제14일에 측정하였다. 포도당 및 락테이트 농도는 바이오프로필(Bioprofile) 400 분석기(Nova Biomedical)를 사용하여 제7일, 제10일 및 제14일에 측정하였다. 제14일 역가는 UV 검출과 함께 단백질 A 친화력 크로마토그래피를 사용하여 결정하였다.
소적 PCR에 의한 유전자 카피 수 결정: 소적 PCR 검정은 ddPCR™ 수퍼믹스 키트(Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다. 각각의 ddPCR 반응은 ddPCR 마스터 믹스, 900nM 정 프라이머, 900nM 역 프라이머, 250uM 프로브, 3 단위 HaeIII 제한 효소 및 샘플 DNA를 함유한다. 실온에서 10분 동안 배양 후, 자동 소적 발생기(Bio-Rad)로 소적을 생성하였다. 효소를 불활성화하기 위한 PCR 열 사이클링 조건은 95℃에서 10분 후, 30초 동안 94℃ 및 1분 동안 60℃ 후, 10분 동안 98℃의 40 사이클이었다. PCR 반응 후, 소적을 QX200TM 소적 리더(Bio-Rad)에서 판독하였다. 콴타소프트웨어(Quantasoftware)를 사용하여 데이터를 수집하고 분석하였다. 참조 유전자 Bax, 알부민, Hprt 및 b-마이크로글로불린의 정의된 카피 수를 기반으로 HC 및 LC 유전자 카피 수를 정규화하였다. 이 연구에서 사용된 프라이머는 프라이머 익스프레스(Primer Express) v3.0(Life Technologies)를 사용하여 설계되었다. 프라이머의 서열은 표 4에 열거된다.
소적 PCR의 프라이머 서열
프라이머 서열
중쇄 - 정 프라이머 TCA AGG ACT ACT TCC CCG AAC C
중쇄 - 역 프라이머 TAG AGT CCT GAG GAC TGT AGG ACA GC
중쇄 - 프로브 VIC-ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GC-TAMRA
경쇄 - 정 프라이머 GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC T
경쇄 - 역 프라이머 GCA CAC AAC AGA AGC AGT TCC A
경쇄 - 프로브 VIC-CCC GCC ATC TGA TGA GCA GTT GAA-TAMRA
Bax - 정 프라이머 ACA CTG GAC TTC CTC CGA GA
Bax - 역 프라이머 GCA TTA GGA AGT TTG AGA ACC A
Bax - 프로브 FAM-CCC AGC CAC CCT GGT CTT GG-TAMRA
알부민 - 정 프라이머 TTC GTG ACA GCT ATG GTG AAC TG
알부민 - 역 프라이머 GGT CAT CCT TGT GTT TCA GGA AA
알부민 - 프로브 FAM- CTG TGC AAA ACA AGA ACC CGA AAG AAA CC-TAMRA
Hprt - 정 프라이머 AAA GGA CAT AAT TGA CAC TGG TAA A
Hprt - 역 프라이머 CAA TTG CTT ATT GCT CCC AA
Hprt - 프로브 FAM-CTG CTT TCC CTG GTC AAG CGG-TAMRA
β-마이크로글로불린 - 정 프라이머 CTT CCT GAA CTG CTA TGT GTC TCA A
β-마이크로글로불린 - 역 프라이머 CCA TCT TCT TTC CAT TCT TCA ACA
β-마이크로글로불린 - 프로브 VIC- TTC ATC CCC CCC AAA TTG AAA TCG A-BHQ1
정량적 실시간 PCR(qRT-PCR 또는 Taqman) 분석: 제조사의 설명에 따라 Qiagen RNeasy 플러스 미니 키트를 사용하여 시드 트레인 배양으로부터의 RNA 샘플을 정제하였다. TaqMan One® 스텝 RT-PCR 마스터 믹스 키트(Life Technologies)를 사용하여 TaqMan RT-PCR 검정을 수행하였다. 각각의 RT-TaqMan PCR 반응은 RT-PCR 마스터 믹스, 역 트랜스크립타제, 300nM 정 프라이머, 300nM 역 프라이머, 100nM 프로브, 및 10ng 정제된 RNA 샘플을 함유하였다. 열 사이클링 조건은 48℃에서 30분 및 95℃에서 10분 후, 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 40 사이클이었다. 모든 반응은 7900 HT 빠른 실시간 PCR 시스템(Life Technologies)에서 진행되었다. 데이터를 SDS v2.4 소프트웨어(Life Technologies) 후, TaqMan RT-PCR 증폭을 사용하여 분석하였다. HC 및 LC의 상대적인 발현 수준을 델타 Ct 분석 방법을 기반으로 결정하였다. 하우스 키핑 유전자, 사이클로필린의 발현 수준을 참조 유전자로서 사용하여 각각의 반응에서 상이한 RNA 샘플을 정규화하였다. 이 연구에서 사용된 프라이머는 프라이머 익스프레스 v3.0(Life Technologies)를 사용하여 설계되었다. 프라이머의 서열은 표 5에 열거된다.
정량적 실시간 PCR에 대한 프라이머 서열
프라이머 서열
중쇄 - 정 프라이머 TCA AGG ACT ACT TCC CCG AAC C
중쇄 - 역 프라이머 TAG AGT CCT GAG GAC TGT AGG ACA GC
중쇄 - 프로브 FAM-ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GC-TAMRA
경쇄 - 정 프라이머 TGA CGC TGA GCA AAG CAG AC
경쇄 - 역 프라이머 CAG GCC CTG ATG GGT GAC
경쇄 - 프로브 FAM-ACG AGA AAC ACA AAG TCT ACG CCT GCG A-TAMRA
햄스터 사이클로필린 - 정 프라이머 GCG TTT CGG GTC CAG GA
햄스터 사이클로필린 - 역 프라이머 GAG TTG CCC ACA GTC GGA A
햄스터 사이클로필린 - 프로브 FAM-TGG CAA AAC CAG CAA GAA GAT CAC CA-TAMRA
웨스턴 블롯 분석: 시드 트레인 배양으로부터의 세포 펠렛을 PBS로 세척하고, 프로테아제 억제인자의 미니 cOmplete™ 칵테일(Roche)과 함께 NP-40 용해 버퍼 중에 재현탁시켰다. 세포 용해물을 10분 동안 13000 RPM에서 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 각각의 용해물에 대한 단백질 농도를 피어스(Pierce) BCA 단백질 검정 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 결정하였다. 각각의 용해물의 동일한 단백질 농도를 95℃에서 5분 동안 열 변성하기 전에 SDS-PAGE 버퍼 및 NuPage 샘플 환원제(Invitrogen)와 혼합하였다. 그 다음, 용해물을 NuPage 프리캐스트 4-12% Bis-Tris 겔(Invitrogen) 상에 로딩하고, 전기영동하였다. iBlot 시스템(Invitrogen)을 사용하여 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 0.1% 트윈(Tween) 20(TBS-T)을 함유하는 tris-완충 염수 중의 5% 탈지유 용액을 사용하여 막을 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 차단 후, 막을 특이적 일차 항체를 사용하여 1시간 동안 실온에서 배양한 다음, TBS-T로 10분 동안 3회 세척하였다. 제2 겨자무 과산화효소 접합된 항체를 1시간 동안 실온에서 가한 후, 15분 동안 3회 TBS-T로 세척하였다. 아머샴(Amersham) ECL 검출 시약 또는 아머샴 ECL 프라임 검출 시약(GE Life Sciences)을 사용하여 막을 발달시켰다. 이미지 랩(Image Lab) 5.1(Biorad)을 대역 신호 정량화에 사용하였다. 하기 일차 항체를 사용하였다: 1:3000 염소 항-인간 IgG-HRP(MP Biomedicals) 및 1:2500 마우스 항-β 액틴(Sigma Alrdich). 하기 이차 항체를 사용하였다: 1:10000 양 항-마우스(GE Healthcare UK).
실시예 9: 하나의 중쇄, 하나의 경쇄 플라스미드 DNA 구성에 대한 추가 경쇄의 첨가는 항체 역가 및 특이적 생산성을 개선시킨다.
TI 숙주에서 생산성에 대한 항체 카피 수의 효과를 시험하기 위하여, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄(HL 구성) 또는 하나의 중쇄 및 2개의 경쇄(HLL 구성)를 함유하는 단일 플라스미드를 형질감염시킴으로써 RMCE 풀을 생성하였다. 선택, 회수, 및 유세포 분석에 의해 RMCE의 입증 후, 풀의 생산성을 제14일 유가식 생산 검정에서 평가하였다. 3개의 별개의 항체(mAb-Q, mAb-S, 및 mAb-T)에 있어서, HL 풀과 비교하여 HLL 풀에 있어서 역가에서 대략 2배 증가가 관찰되었고, 특이적 생산성에서 1.5 - 2.5배 증가를 가져왔다(도 18A 및 도 18B). 제한 희석을 사용하여 형질감염된 풀로부터 추가의 단일 세포 클론을 생성하고, 역가 및 특이적 생산성이 또한 HL 구성으로부터의 것보다 HLL 구성 유래 클론에서 더 높다는 것을 확인하였다(도 18C, 도 18D).
실시예 10: RMCE 풀에서 7개 이하의 항체 쇄를 갖는 형질감염은 항체 특이적 생산성 및 역가를 증가시킨다.
항체 발현시 항체 쇄 수를 증가시키는 효과를 평가하였다. HLL 단일 플라스미드 구성을 5개의 항체에 대하여 HLL-HL 또는 HLL-HLL 이중 플라스미드 구성과 비교하였다.
mAb Y에 대하여 HLL-HL(5-쇄), HLL-HLL(6-쇄) 및 HLL-HLHL(7-쇄) 구성을 비교하였다. 생산에서 RMCE 풀의 역가 및 Qp는 HLL-HL로부터 HLL-HLL 및 HLL-HLHL 구성으로 일반적으로 증가하였고(도 19A, 도 19B), 상이한 풀 중에서 성장(생존 가능한 세포 계수의 적분으로 나타냄, IVCC)은 상대적으로 동등하였다(도 19C). 이들 풀에서 시드 트레인 항체 mRNA 발현을 보면, HLL-HL에서 HLL-HLL 및 HLL-HLHL로 경쇄 mRNA 증가, 뿐만 아니라 HLL-HL 및 HLL-HLL 풀과 비교하여 HLL-HLHL 풀에서 중쇄 mRNA가 관찰되었다(도 19D). 이들 RMCE 풀로부터 중쇄 및 경쇄의 세포내 단백질 수준은 또한 웨스턴 블롯을 사용하여 측정하였다. 세포내 경쇄 단백질 수준은 경쇄 mRNA에 대하여 관찰된 것과 밀접하게 일치하였고, 5개에서 6 및 7개의 쇄 구성으로 증가하였다(도 19E, 도 19F).
실시예 11: 7개의 쇄 HLL-HLHL 구성을 갖는 단일 세포 클론는 2개의 시험된 항체에서 높은 역가 및 특이적 생산성을 갖는다.
7개의 쇄 구성 HLL-HLHL의 높은 역가 및 생산성이 단일 세포 클로닝 후에도 유지되는지 여부를 평가하기 위하여, mAb Y의 HLL-HL, HLL-HLL, 및 HLL-HLHL RMCE 풀로부터의 단일 세포 단일클론을 생성하였다. 그 다음, 이들 단일클론을 제14일 유가식 생산 검정에서 평가하였다. 각각의 구성으로부터 상위 6개의 클론을 보면, HLL-HL 구성에서 HLL-HLL 및 HLL-HLHL으로 약간 증가된 역가 및 Qp가 확인되었고(도 20A, 도 20B), 성장은 유사하게 유지되었다(도 20C).
HLL-HLHL 구성이 높은 단일클론 역가를 야기하는지를 확인하기 위하여, 숙주 4로부터, HLL-HL(5-쇄) 및 HLL-HLHL(7-쇄) RMCE 풀로부터 유도된 상이한 mAb, mAb III을 사용하여 단일 세포 클론을 생성하고, 14일 유가식 생산 검정에서 평가 후, HLL-HL 클론에 비하여 HLL-HLHL 클론의 분명한 역가 이점이 관찰되었고(도 20D), 이는 mAb U에서 보이는 것보다 크다. 역가 증가는 HLL-HLHL 클론의 더 높은 Qp에 의해 우선적으로 구동되는 것으로 나타났고(도 20E), 2개의 구성 사이에 IVCC에서 작은 평균 차이가 있었다(도 20F).
실시예 12: 형질감염된 플라스미드에서 항체 쇄 위치는 이의 생산성에 영향을 미친다.
항체 발현시 형질감염된 플라스미드에서 중쇄 및 경쇄의 위치 또는 배열의 효과를 평가하였다. 이를 위하여, mAb Z의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄의 몇몇 상이한 구성을 갖는 플라스미드로 RMCE 풀을 생성하였다. 본 개시내용의 TI 숙주는 동일한 통합 부위에서 2개의 상이한 플라스미드의 통합을 지지하기 때문에, 중쇄 및 경쇄 둘 다가 동일한 플라스미드로부터 발현되는 경우뿐만 아니라 이들이 앞 또는 뒤 상이한 플라스미드로 분리되는 경우에 대해서도 위치 효과를 시험하였다(도 21A).
RMCE 풀을 생성한 후, 시드 트레인 배양에서 항체 Z 중쇄 및 경쇄의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 중쇄의 mRNA 발현은 경쇄가 선행하는 경우에 감소하였고, both 앞 및 뒤 플라스미드 둘 다에서 LH 구성이 HL 구성보다 낮은 중쇄 mRNA 발현을 갖는다. 그러나, 경쇄에 대한 위치 효과는 플라스미드가 이로부터 발현하는지 여부에 따라 좌우되고, 앞 플라스미드에서, 경쇄 mRNA 발현은 HL에 비하여 LH 구성에서 증가했지만, 반대 경우가 뒤 플라스미드에서 참이었다. 또한 앞 플라스미드에서 경쇄 카세트는 그 자체로 경쇄 mRNA의 높은 수준을 발현하였고, 뒤 플라스미드에서 단일 경쇄 카세트는 임의의 구성의 최저 경쇄 mRNA 수준을 가졌다는 것이 관찰되었다(도 21B). 일반적으로, 앞 플라스미드와 비교하여 뒤 플라스미드에서 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 낮은 mRNA 발현 수준이 관찰되었다.
이들 상이한 RMCE 풀의 유가식 생산 검정은 항체 mRNA 발현에서의 경향과 유사한 역가 및 특이적 생산성 범위를 생성하였다(도 21C, 도 21D). LH-no mAb 구성은 HL-no mAb보다 높은 Qp 및 역가를 가졌고, H-L 및 no mAb-LH인 LC mRNA 발현의 최저 수준을 갖는 풀은 또한 최저 Qp 및 역가를 가졌다.
관찰된 mRNA 및 항체 생산성 차이가 항체 쇄 위치로 인한 것이지 절대적인 카피 수에서의 변동으로 인한 것이 아니라는 것을 확인하기 위하여, 디지털 소적 PCR을 사용하여 풀의 중쇄 및 경쇄 카피 수를 측정하였다. 예상되는 바와 같이, 모든 풀은 대략 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 DNA 카피를 가졌다(도 21E).
실시예 13: mAb 상의 % 고분자량 종에 대한 HC 대 LC 비의 효과.
생산성 및 고분자량 종(HMWS), 예를 들면, 응집물에 대한 항체의 HC:LC 비의 효과를 평가하였다. 추가로, TI 부위에 대한 효과는 상이한 TI 부위를 갖는 세포를 사용하여 평가하였다. 이를 위하여, TI 숙주 4 또는 숙주 7 위치에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄(HL 구성) 또는 하나의 중쇄 및 2개의 경쇄(HLL 구성)를 함유하는 단일 플라스미드를 형질감염시켜 RMCE 풀을 생성하였다. 풀의 생산성은 14일 유가식 생산 검정으로 평가하였다(도 22A 및 도 22B). HC:LC 비의 효과는 통합 부위와 독립적이라는 것을 보여주는 %HMWS를 평가하였다(도 22B 및 도 22D).
mAb IV와 관련하여, 생산성 및 고분자량 종(HMWS)에 대한 항체의 LC 카피의 증가 효과를 평가하였다. 이를 위하여, 숙주 4 부위 위치 또는 숙주 4 및 7 부위 위치에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄(HL 구성), 하나의 중쇄 및 2개의 경쇄(HLL 구성), 2개의 중쇄 및 3개의 경쇄(HLL-HL 구성), 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄(HLL-HLL 구성), 2개의 중쇄 및 5개의 경쇄(HLL-HLLL 구성), 3개의 중쇄 및 6개의 경쇄(HLLL-HLLHL 구성), 또는 3개의 중쇄 및 7개의 경쇄(HLLL-HLLHLL 구성)를 함유하는 단일 플라스미드를 형질감염시켜 RMCE 풀을 생성하였다(도 23 및 도 24).
역가의 수 및 생산 평가 검정을 통해, 클론의 수를 확인하고, 특이적 생산 공정으로 ambr15 생산 평가에서 평가하였다. 이러한 평가로부터, 세포 배양 성능, 역가, 및 생성물 품질 요인(퍼센트 응집 포함)에 의해 확인된 상위 10개의 클론을 선택하여 추가의 평가를 위하여 보관하였다. 최종적으로, 높은 역가, 낮은 퍼센트 응집, 및 이전에 생성된 mAb-VI 세포주와 유사한 생산 품질을 갖는 mAb-VI를 발현하는 2-부위 통합 세포주를 생성하였다. 도 25는 각각 7.4% 및 5.6% 응집과 함께 8.4 및 8.7 g/ℓ의 역가를 갖는 상위 2개의 클론을 보여준다.
실시예 14: 조절된 표적화된 통합: 클론 평가.
이 실험에서, 항체를 인코딩하는 서열의 조절된 표적화된 통합을 수행한 후, 숙주 4의 조절된 유도체에서 항체 Z의 발현을 평가하였다. 항체 Z의 평가의 조절을 위하여 사용된 시스템은 세 가지 주요 구성요소로 구성된다: 1) 신호 서열 전에 탠덤 tet-오페론 서열을 포함하는 조절된 프로모터, 2) 프로모터 및 Tet-억제인자 단백질 코딩 서열, 및 3) 항체 Z의 발현을 가능하게 하는 유발인자, 예를 들면, 독시사이클린.
항체 Z를 인코딩하는 서열의 표적화된 통합을 확인하기 위하여, 제3일, 제7일 및 제10일에 세이크 플라스크 공정 A 10% 공급(총 용적의)에서 클론 평가를 수행하였다. 하나의 생산 배양 검정을 수행하여 클론을 평가하였다. 모든 클론을 제0일에 3 x 106 세포/mL의 시딩 밀도로 접종하였다. 제3일, 제7일, 및 제10일에, 1μg/mL 독시사이클린을 모든 36개의 배양에 가하여 항체 Z의 발현을 유도하였다.
최종 역가 및 특이적 생산성(Qp)은 각각 도 26 및 27에 나타낸다. 제14일 수확 세포 배양 유체(HCCF)를 역가 분석을 위하여 제출하였다. 역가는 1 내지 3.68 g/ℓ 범위였다(클론 7 제외). 보관을 위한 클론 선택은 역가에 의해 먼저 순위가 매겨지고, 최종 선택은 Qp 및 다른 파라미터를 포함하는 세포 배양 성능을 기반으로 하였다. 보관을 위해 선택된 클론은 2.69 내지 3.68 g/ℓ 범위의 역가를 생성하였다.
도시되고 주장된 다양한 실시형태 이외에, 개시된 주제는 또한 본 명세서에 개시되고 주장된 특징의 다른 조합을 갖는 다른 실시형태에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 명세서에 나타낸 특정한 특징은 개시된 주제가 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 적합한 조합을 포함하도록 개시된 주제의 범위 내에 다른 방식으로 서로 조합될 수 있다. 개시된 주제의 특정한 실시형태의 상기 설명은 설명 및 기술의 목적으로 나타낸 것이다. 이는 철저한 것이나 개시된 주제를 개시된 실시형태로 제한하는 것을 의도하지 않는다.
당해 분야의 숙련가에게 다양한 변형 및 변화가 개시된 주제의 취지 또는 범위를 벗어나지 않고 개시된 주제의 조성물 및 방법에서 만들어질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 개시된 주제는 첨부된 청구항의 범위 및 이의 등가물에 속하는 변형 및 변화를 포함하는 것이 의도된다.
다양한 문헌, 특허 및 특허 출원이 본 명세서에 기재되고, 이들의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> TARGETED INTEGRATION OF NUCLEIC ACIDS <130> WO2919/126634 <140> PCT/US18/67070 <141> 2018-12-21 <150> US 62/609,806 <151> 2017-12-22 <150> US 62/711,272 <151> 2018-07-27 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3974 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 cgcgacaccg attctcactc tcatttggag ttgggctctg agataatcca atcactgtcg 60 ctctggtttg taaatttgcc caagatctgc ccagaaccag actctcagtg tccccaagga 120 tgggggccac tgtgcaccct gctctcctcc tgctgcttgc agaccctgtg ttctgggctc 180 caacccgcgc aggtgagtgc cacccagggg aaaaatggcc tcggcggcaa ggggtggggg 240 cggcacccgg gaagccgcat cttccaaact ctcagccaga actttcagat ccattctcca 300 cctgcatccc tagacccgtg ccctgctccc ttaccagccc ggtgcacctg ccaagaggtg 360 cgggtctcac cgctcaccgc ccccaggctc acactcgctg ctgtatttct acaccaccgt 420 gtcccggccc ggcctcgggg atccccggtt cattttcgtg ggctacgtgg acgacacgca 480 gttcgtgcgc ttcgacagcg acgcggagac gcccagagtg gagccctgtg tagggtggat 540 ggaacaggag aggcctgagt attgggagct gcagacccag atggcctgga 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1440 ctttacttgg gcaatggacc tggacccata ggaggttttt tctctcaggc ctcctccagt 1500 gtatctggag tctggatcct gcttttctga gtctcctggc cctccctcag ctcaggacca 1560 gaaaactcct cccatccatc agtctgcaga gccctgaagc cccctaccct agagcacccc 1620 aaagaacaga ttacccccag tgcctgctct acttggggtc tattaatata tggacaccta 1680 atcccacccc agttctgctg tccattccta gaatggtcac atgaacactg ctgagtcccc 1740 aggaaaaagc cagatgcctg atcttcccaa ctctccccct cagacccccc aaaggcacat 1800 gtgacccatc atcctggata taaaggtgat gtcaccctga ggtgctgggc tctgggcttc 1860 tatcctgctg agatttccct gacctggcag ttggatgggg aggacctgat ccaggaaatg 1920 gagtttgtgg aaaccagacc agcaggggat ggaaacttcc agaagtgggc agccgtggtg 1980 gtgccttctg gggaggaaca gaaatacaca tgccatgtgc accatgaggg gctgcctgag 2040 cccctcaccc tgagatgggg taaggaggaa gtgggtgcag agctggaggc agctgtagtc 2100 agagcttaga actgggtggt cctcatctcc ccctcctttc ccagagcctc cttggaacaa 2160 gaaatattgg tttctcctcc ttatcctcat cctcatcaca gtttgggtgc tttgcatatg 2220 taagaagaag gatgcaggta ggatgctgag tttacttgtc ccactgaggg cttcaagcca 2280 taggtggcag tgtcctgcct aggtaatggg atgtaccatc cacagctctg tgtctccttc 2340 atttgtgacc tttttgttta ggcttcaaaa gtagagaagg gaagatttgc ttgggggatg 2400 gttctggtga ctgagatctc atgtccagct gtcgcaagca gaggtctcac taaggacaaa 2460 cctccaggaa gctattacaa tgtctcagtt ctcgaaattt cccttgggct agggactaag 2520 gttcccaacc ctttggaggt cacattaaga tatccttcgt atcagacttg cattatgatt 2580 catagaagca aaatgacagt tacgaagcag caacacaata attttatggc cggtggctca 2640 ccacagcatg aggagctgtg tttaagggtg gcagcatgag gaagtgcctg ctcccatgat 2700 acccatacat ggatttcttt cctcaggtgg gagaggaagg agccacactc aggaagaagg 2760 taagtgtggt gagaggtggt gtctgagact cttggagtcc atgagagctc acccagccca 2820 tagtcccccc tcaacctcca gtcttctgaa gcctgaccag gtcctgctct gttctttcct 2880 aggcaggaac agtggccagg actctggtga gacggccgtg gatgatgagg tgatatgtgg 2940 ggaaagacag acgacacagg ttggggctgg agagagtctt tgcactcaga catttagagt 3000 gaggaggaag ctattcagaa tgtcaccact ataccgtgac atctgcctta atcttgtagg 3060 agatggtcat tctctctggg gagcctgagc cctctcggaa tcgtccagac cactccttca 3120 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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 103800 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 103860 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 103920 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 103980 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt ttttgacaaa gatgctaaat ctatacaatg 104040 gaagaaagat agcatcttca acaaatggtg ctggcacaac ttgattcaga catggagaag 104100 attgcagata gatccatacc tgtcaccaaa cacaaaactg aagtgcaaat ggatcaaaga 104160 tctcaacata aatccggcca cactgaatct tctagaagag aaagtgggag atacccttga 104220 tcgaattggc acaggagact gctttctgaa cattacacca gtagcagaca ttgaaatctg 104280 caattaataa atggaacctc ctgaaactga gaagcttctg taaggcaaag gacatggtca 104340 gtaagacaaa acaacagtcc agagaatggg aaaacagcct ctctaactga cagggggctg 104400 atttccaaaa tatacattga actcaagaag gtagccacca aaacacaaaa cacagnnnnn 104460 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 104520 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 104580 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 104640 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 104700 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 104760 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 104820 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 104880 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 104940 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 105000 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 105060 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 105120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 105180 ngaggagaga agaggaggaa atggagtagc agaaatattg agttggggga agaatagagg 105240 agagcaggat gagggatacc acattagagg gagccatttt aggtccaagg agagatctgg 105300 cactagggag annnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt aaggggagcc 105360 attataggtc caaggagaga tctgacacta gggagatttc cagagaccta 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tcatcatttc attttttatt aactgcccct 165300 ttccatgata tcctcttaaa ggtacagtct caatcctgct tcacataaag cccctccctt 165360 ctgttagaat actgtttctt atgtcctcgc aatgcttctt ctggtatgga tttcttgtat 165420 ttcctgtggt agttctccat ctgttgcttt tctgatagta aatttgtagg ctggatataa 165480 gcatactata ttgaacgcag ttgcaccttt ggaaataaat gggaattggt tcgggattcc 165540 taactgagca gtcccatatg tgaggaaaat gacacatatt aaataccaac taggtagttt 165600 gtgtacatga tcttatgtag tattggcaat aatattctat aggttgtgga gtgcttccat 165660 tttagagagg aaatccagct ttgtaaagtg attgcattat ccatttcgcc tacttagtaa 165720 atatcatatt tcaaattgga atccaagttt gaatgaagaa tgcctccttg tatttaaatg 165780 tacacattta aggggaagat atactttggt gggtgtagaa agcaatggtc tctgctaact 165840 gacagggatg ataaactcat gactagtatt aaagtatagg cacttcttga aagccctact 165900 tcctttccca aagtttgtat tgctgttttc atctttccat gttagtgcgt attaaacttt 165960 gtaaaagtta cgactgatat tgtactgata ggaaatgtgt tttggtaaaa gttgactata 166020 caggtaaaaa cttgtaaatt agcaaaaaca aaaagtggaa ttacactttc ctttttgaag 166080 gcagcttggt 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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 210420 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 210480 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 210540 nntatagtgg ctccctctga tattgtatct ctcatcctgc tctctctcct ctattcttcc 210600 cccaactcaa tatttcttcc cctccatttc ctctcctcta ctcttcttct cttgctctta 210660 ttgtagcagc tccctccccc ctaccctcat gctcccaatt agttcaggag ttcatgccac 210720 ttccattcct gggaaccatt tatcccttgt ttttttttaa caattgaata aatgaatata 210780 ctttattgtt gggagttctc ttatcccatc atggttttgt atctctgccg tgtgcatatg 210840 atctggagtc acctttgaca gtgtatttca tcttatttgc tcttactttt gttgttttga 210900 tcactcccag agcttttcta tttcattact gaacttttgt tcacacctta gtccttttgg 210960 aaaaggacat cattgaaaga ggatgggggt tggttttgca aaacaaaaaa ggaagtcatt 211020 caatttattg aaaattggga aatttgaaat ttgaaattca aagagatgat gaagtaagga 211080 agttagtgga cagggatggc acatgacagt ctgcaacatt ctggctgagt agagaattct 211140 gtaatgtcaa acaagcactg ctattcccaa accaaaaaca actattacat 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cacacacaca cacacacaca 39660 cacacacaca cgagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agattttaaa 39720 gtaatacact attaaagatg taaaattatg taaggcatgt ttttctgcaa ataatttttg 39780 cagaataaat acaatataaa actagtttca acccagcatt aattgcactg atggtatttt 39840 tcagtgacat aatcattgca catgataaaa tgtattagtg taaccctatc taagttgttt 39900 gtttgacata cacacatacc accctgaagt acagtaggag tcctccctct ccctactgtt 39960 agagacagct gctttcaatc acagatatcc aaagcactgt ggtgtgattt cactgtgcat 40020 ggcatacata taccctctgt taactggcac catctgccca ttgccttttc taggaaatcc 40080 agacttaatc agtaaaccat tatcatggtt tgagacgaca aactaactct cttaatggtg 40140 acacaactga attctcttat actataatat gtatttgcaa taatctctgg aataggtgca 40200 gtcattatat tttatgttaa tgaaatcata gtaaaagtct catccctaga caaaaaaata 40260 taataactat taactggaga gagagagaag atacttaaac caaaggaaaa gatgctgtca 40320 gtctgagagt gggggccatg caaaatgaag ggtttagaca gaaggtaagc ctggaggagg 40380 aaaaaggaat gagaaaagca gtgcaattat attttaattt aaatgtatat aatttttaaa 40440 aagagatcaa aagtatcaag caatgtgatg 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nnnnnnnnnn 165840 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 165900 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 165960 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166020 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166080 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166140 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166200 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166260 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166320 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166380 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166440 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166500 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166560 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 166620 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 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ccaccagtat tactaatggc tctctacaag tgtggtaccc atagcttctc 44640 tcagttcttt agtgaaatgg aattatgtcc tccttgaaaa gagaaaacat aattgccttt 44700 gcttccttgt actatgcttt ggactcaggg cattcttcag tgggatgtta aatctgctca 44760 aggctgtatt ggaatcagga aacatgggaa cactttacct tgtggatctc tgtcttcctc 44820 atgttatcca tctgtgttat tgtattggaa tcagagtgaa cactggggtc ctgttcccag 44880 gaaggagaag taggataagc agatgtctgg gttaagaatg agtaataacc aaggcaggaa 44940 tctggagtct agaggaggga gaagccagag cattagaggc ctggaaggca ctgaggagat 45000 gggtcctggc atctgcatag gtgctcttta atattattag tctttccttc gaaacactgt 45060 ttactagcag tgtttatagg taattttaaa gaactagaac ttgaaattgg ttgcctcttt 45120 ttgaatgtca actgtcaagc aaaactaggc agctgaggca tctccctcag tgcctcacac 45180 tttcccattt tttaagaaat taaaaaaatt tcttccttaa aagtgtcatg tgttgctggg 45240 gcagtggtgg cgcgcgcctt taatcccagc actcagaggc agaggcaggt ggatctctga 45300 gtttgaggcc agcctggtct acagagtgag ttccaggatg ccaggactat ttcacagaga 45360 aaccctgttt caaccccccc ccccaaaaaa aatgtcatgt gtttcaaaac cataaactcc 45420 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taccagtgct 46260 actcactggg aaaggtgaac caaaacaaca tcttagcagt atgactgtat tttttttttt 46320 tttttacatg gaaacctgcc ccagaacttt tatgccccac tttttaaatg aatccctgct 46380 ttgggatttt tcagttgcat ggttgggaac ccatttgtgt gaaaaacaga tccaagtact 46440 tctgaaagat cttgagattt gtgctaatgt agctatcttc ttaggaggtg ctttttgtcc 46500 cagtgacctt tcataacgaa tatcttgtca taggaagtta aatctctaga acaaaactct 46560 gggctctaag gctcctctgt tgttttagaa tctgggtttc atttaagtag caatgtgaca 46620 gttttgagga aattaaaaat actgaccaaa ttatactttt agaaaataag attctactaa 46680 gtaaaatatc ttacatgtga catttcattc tttgcttcag agagttggcc atggagataa 46740 gaaccatgca gatgcagaca gatcacctgt tttccttcaa tttattgact gtgtctggca 46800 gatgacaaga caggtaacgc atcatctatt aatacccttc tcacacatct ctaagctcaa 46860 agtggggaaa cttgatcact gtttggcttg tgattcttgg gtagaattcc cagtgataac 46920 agctgttact gttgggcatt aaaacttttt agaagtttta atatgaataa agagcttgat 46980 actagtagca tcgcaaccag gggaactgat aaaaatgaag attcctcctg tataataata 47040 gtcctttgct cactgaaagc tctgtatact ttgctaagga agatgaagaa acgagctaca 47100 ttgattccag tcggaaccag acactatttt gagtcctttt agctgtttta aagaaagaag 47160 tatttggaca gagtatcaag gcagcgatca cttggcccct tctcaatgtg gagctgttag 47220 aaccctgtaa cagcctttga agtagttggg taaactgacc agtcttgaaa ggtactagaa 47280 gataacactt ggttttacaa taggaaacgg ggctgcaggg tcttgaaaat ggtttcagga 47340 gtagggttaa gcctgaaggc atagttcttg ttactggaga cataccagta agataaataa 47400 ggcaagaatt tgacccagct gtctgattgg taggatccac caaggtcact aggtataacc 47460 tgggagctgt gactgactag agtgctgttt gggtaggatg gggagacatt ttttagaaat 47520 ttaattctaa actaagaagg gggaaaaaaa aaaccagaag ttgaaagtta atttaatcag 47580 cattttaatt acttagcaaa acaagcatta gcagtaaact acatgtctcc atagatttta 47640 gttgacagga actttttcta aaataccaag acagtatttt ccaggttgtt gtggaatttt 47700 tcacaaacta ttcagattta caagtatgtt tctgaatgat tttgaaataa taacagggtg 47760 gattaaatta agccttttac taccttttgg tggtctgtaa tttaattctt cctttggtcc 47820 tccaaaattg gattgtataa aattaagata cccactgaag cttgtatagg ggtgaattct 47880 gtgttggact gatgttgcca attgtgaatt acaaggacct gttcttcaac aagataaata 47940 ggttgacttg taagttgact gcatagctgc acagttactt acttctgtgt atatagtgat 48000 ggcatttgcc aaacacattt gttattttta attcttagaa ataagatgtg atgaaaacta 48060 ataaacatgg aagaccagac tcatcagaat tgctccaagt cataagtcag tggctggcaa 48120 ctatagggtc aaggcagagc agacacaaaa ccagcattaa gtccactcaa tacttgctgc 48180 atgagagaaa ctctaccttg caaaggaaaa catgccacaa atgcttaggt agtttcaaat 48240 ctgtctaagt attattacag aggatctact cacgacaggg ataattatcc ctgaaaaatg 48300 tcttaaattt gtgtgctcaa ttttgcagtt ccctactgcg tttgaattca atgaatattt 48360 cctcattacc atcctggacc acttgtacag ctgtttattt gggacattcc tctgtaacag 48420 cgaacagcag agggggaagg aggtaaggta tagctctggc tcttactctg gtatttggtt 48480 ttttgtatct cacaagatat actagtatat acttccatcc gtgaagtgtg ggggtgagaa 48540 aatcacacct ataatcccag atactccaga gggtaaggta gaaggatcac aaatctgagg 48600 ccagcctttt taaacagatc ccatctcaaa agacgtctga agaaaagagg atgctggaga 48660 tgtagagttc agtgatggac tgcttgccta gtgctgtgaa gtgctgggtt caatcctgct 48720 acaacaaaaa caaacaaaag aaccactctg tagaagcatc actgttggtg gtactggtag 48780 ttccctccat gcacatcaat gttcatccta aaaactgtca gaaaataagg gtactcacac 48840 tgaaaagcct tgctaccagg ttcagatgtt actcactaat atgcatgttc attcttattt 48900 ctgtaaagca ggcaagtaga tgaaaattaa gtgcttctta gactgtactt tgcaggtatt 48960 gtatcttaca gtgaatgtat ttctgtgcat ggtaggcttt ccatatgtta cgtggtacta 49020 gataatcacc aatagagcac tgcagtgttc taattactat cacttttgag aaaccccctt 49080 gatttaagtc ttagctgtaa tttaaatacc ataagccctc ttttaaagtg gtaatttaat 49140 ggtatagcca cagaattgga accatcaaaa tttagagcat tttcatcaca ccagtcaccc 49200 atacctgtct atccacattc tctcaggttt gggtagatac taacctggtt tctcaggaat 49260 tatgcactgt cattcaccat gtgaaatttg tgtctagctc cttgcattat cttttcaaca 49320 tttatgtcat agtactttct tttcttcatg gtcaaataat cttccattgt ctcaaatcaa 49380 tcttcctttg ggttctttat tttggttgtt gtgaatagta ttgctttaaa catatggagc 49440 acttttattt tttgtgtatg ggcatgtgtg tttgtgcatg ggagaccaga gaggatatta 49500 gatgccctgc agctaatgtt ttgagctacc caatgtggat aaattttgat cctatctcca 49560 gcactgaggc actttatgta ccagtgtttt tcaatctgca aatacaactg ttgggcattt 49620 catgttaact gtgttcattt ccatcaaagt aggtctatta gcagttagtt tcctctattg 49680 ttgactttaa taatcacaca gtacacaagt actgctgatg tggtggggaa tctttaccag 49740 ttttttcctc ttgcagaatc ttcctaagag gacagtgtca ttatggtcct acataaacag 49800 ccagctggaa gatttcacca atcctctcta tggaagctac tccaatcatg tcctttaccc 49860 agtagccagc atgcgccacc ttgaactctg ggtaggatat tacataaggt ggaacccccg 49920 aatgaaacca caggtacaga tctacaatat acagtataac tctactaggt ctgtcacact 49980 ctctctgtcc attagtaatt acaatccaca gagtcacaga agcactgcat aagacaggag 50040 actttcccaa gtgcacacat cctgaagaaa ataactttat aaaagcctaa aaacagcagg 50100 tccacagttc tgaagagttt tagctagatg atgtatttgt aaagtagcat cttccagaaa 50160 cgtaaagaca ttgaaagatc agtgatgaca ataaaacctt gctttaattc cactgaggaa 50220 ctcggtgtca caaagccaga cgaatggtta agatcttgtt tggctgggat tcctattaca 50280 gtaattttgt ttgctcttgc aggaacccat ccacaacaga tacaaagaac ttcttgccaa 50340 aagagcagag cttcagagaa aagtagaaga acttcaaaga gaaatttcca accgctcaac 50400 ctcctcctca gagagagcca gctctcctgc acagtgtgtg actcctgttc aaactgttgt 50460 atgaaaggac tattaggtca agggcctcac tgccaggaac ttgacattac agcaccttac 50520 gggtagaaag ccttccatgt ttttaaaccc atctatggga gaaaccttca gatgctgtat 50580 ttatttcaag tctctcttag atgagtttgg aaatgtctgg tgcaggtgac aatggaaatc 50640 atttcatttg taattaaagt atgacactaa cttaagtcac ccaaagaata ctaaagtact 50700 ggagtcctat ttccacagtg gggacacgtt tttaatttta aaatgtctta aaaaccaagc 50760 acctggtaag atctctaggt gggagaaaag aaagagcagc tgttctaata cccaagagca 50820 tatgtctggg ccttcatgta aatgtcagat caaattactc ccttctcaga tttctcaatt 50880 tttgtggtat ttaacagtaa aaaccattgt tttgagatta ttactgcata tcaatagtta 50940 aaaattgctg ctgacattgt aactagggta ttttcaacag cagttaggaa atgatgcctt 51000 atatatgtgc tttgggggga tgaggggaca aagcagtatc tgtcatccag gaattcaaag 51060 aacattccac acccttcaga ctaatttaca tttgtgtgtt aatcgctaac atcacagaag 51120 acattttaga aactattact ctattttatc ttagtgataa ttggcaagtt ttaaagtctg 51180 actttagtgc tatgtttaaa tttcacatga acagtttacc aaagaacaca ctgcatgtaa 51240 ggaattacaa tctaagtgcc agcaagtaaa gccttgtttc tctattcacc tgagttgggt 51300 gctggtgtga acaactgacc tcctggtatc cattttactc tgtataagag ccatatgtaa 51360 tgtactgtaa caaaggagct tattaccact tggtctttta attaaatgac ttcaaacttt 51420 g 51421 <210> 7 <211> 2317 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 7 tctttggttc agtgcggtgg cagcggcggc ggcggcagtg gctgctgtgg tgaaggagga 60 ggaggagccg agcgggcgtt ggtaccaagg cctgaccatg gacgaggaat acgatgtgat 120 agtactgggg acaggtctta ccgaatgcat cttgtctggc atcatgtctg tgaatggaaa 180 gaaggtgctg cacatggacc ggaaccctta ctatgggggt gagagctctt ccatcacacc 240 cctggaagag ctatataaac gttttcagtt gctggaaggg ccccctgagt caatgggccg 300 gggccgagac tggaatgttg acttgatccc caaatttctc atggccaatg gtcagctggt 360 aaagatgctg ctgtatacag aagtgactcg ttatctggac ttcaaggtgg ttgagggcag 420 ctttgtatac aagggaggca agatctacaa agtaccatcc actgagactg aggccttggc 480 ttctaatctg atgggcatgt ttgaaaaacg acgcttccgg aaattcttgg tgtttgtggc 540 aaactttgat gagaatgacc ccaaaacctt tgagggtgtc gacccccaga ccaccagcat 600 gcgtgatgtc tacaggaagt ttgatctggg ccaagatgtc attgatttca ctggccatgc 660 cttggcgctc taccgcactg atgactacct ggatcagccc tgtcttgaga ctattaaccg 720 tatcaagttg tacagtgagg tcctggccag gtctggcaag agcccatatt tgtacccact 780 ctatggcctg ggcgagctgc cccagggctt tgcaagattg agtgccatat atgggggaac 840 atatatgctg aacaaacctg tggatgaaat catcatggag aatggcaagg tggtgggtgt 900 gaaatctgag ggagaggtgg cccgctgtaa gcagctgatc tgtgacccta gctacatccc 960 agaccgtgta cggaaggctg gccaggttat tcgtatcatc tgtatcctca gccaccccat 1020 caagaacacc aatgatgcca attcttgcca aattatcatc cctcagaacc aggtcaacag 1080 gaagtcagac atctatgtgt gcatgatctc ctatgcacac aacgtggcag cacagggcaa 1140 atacatcgcc attgccagca ccaccgtgga gactgcagaa ccggaaaagg aggttgagcc 1200 tgcattggag ctgttggaac ccattgacca gaagtttgtg gctatcagtg atttgtatga 1260 gcctattgat gatggttctg agagtcaggt gttttgttcg tgctcctatg atgccaccac 1320 acactttgag actacttgca atgacatcaa agatatctac aaacgcatgg ctgggtctgc 1380 ctttgatttt gagaacatga agcgcaaaca gaatgatgtc tttggagagg ctgatcagtg 1440 attgctgact cccctcctcc agcccctgct cccctttccc caacctgtat gtcctttggg 1500 gcagggaaga tggtatggct gggtatccct gtttccagca tcttctgttt cccccaccac 1560 attctgatca cttaccttgt tgatttgatt cactgaccaa atccttaacc ttagtgatgg 1620 tttgggagat gggggttggg tagtatcctc tttcttggtt ctaggaaaag aggattcctg 1680 tgtgtgagca catgtgctca cgagtgtgtg agtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1740 tgtgtgtgtg tgtgtgtgta tacacgtgta caccctaatt ctgctgtttg ggaaggagtg 1800 gaggaaaagc tgactctgcc cccactgttc ttactcctaa tgtagtggcc tttggagata 1860 ccccatctcc acccccaact cttatgtgtt ggagagaagg ggccctccca gcacaaaatt 1920 gcattcctct tcccccttat aatttattct aatttattaa ctttgaccta tctgtctgag 1980 ccttcagcct ttctgtgcag cctggggctg tagagttagc tgccctggcc tttcccatcc 2040 ctggcaaagt ctgggttggg tgaaggttta tgtgtggccc cctttgggag ttgatctatt 2100 tttaatttct tgtctttgtg ttgtgttctt tgagaaaacg taaatgtgag caaagcagaa 2160 ggaggtggga aagtggatcc aaaccccagt gtgccctgcc caatgccttt tcctttagtg 2220 gttggaaacc cttatcttgc aaagtgaatg tgtccccttc cccaacctct agtgtatttc 2280 aaaataaaac ccctccaata aaactgttga aacctga 2317 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain - Forward Primer <400> 8 tcaaggacta cttccccgaa cc 22 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain - Reverse Primer <400> 9 tagagtcctg aggactgtag gacagc 26 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain - Probe <400> 10 acggtgtcgt ggaactcagg cgc 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain - Forward Primer <400> 11 gctgcaccat ctgtcttcat ct 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain - Reverse Primer <400> 12 gcacacaaca gaagcagttc ca 22 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain - Probe <400> 13 cccgccatct gatgagcagt tgaa 24 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax - Forward Primer <400> 14 acactggact tcctccgaga 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax - Reverse Primer <400> 15 gcattaggaa gtttgagaac ca 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax - Probe <400> 16 cccagccacc ctggtcttgg 20 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin - Forward Primer <400> 17 ttcgtgacag ctatggtgaa ctg 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin - Reverse Primer <400> 18 ggtcatcctt gtgtttcagg aaa 23 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin - Probe <400> 19 ctgtgcaaaa caagaacccg aaagaaacc 29 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hprt - Forward Primer <400> 20 aaaggacata attgacactg gtaaa 25 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hprt - Reverse Primer <400> 21 caattgctta ttgctcccaa 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hprt - Probe <400> 22 ctgctttccc tggtcaagcg g 21 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b -microglobulin - Forward Primer <400> 23 cttcctgaac tgctatgtgt ctcaa 25 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b -microglobulin - Reverse Primer <400> 24 ccatcttctt tccattcttc aaca 24 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b -microglobulin -Probe <400> 25 ttcatccccc ccaaattgaa atcga 25 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain - Forward Primer <400> 26 tcaaggacta cttccccgaa cc 22 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain - Reverse Primer <400> 27 tagagtcctg aggactgtag gacagc 26 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain - Probe <400> 28 acggtgtcgt ggaactcagg cgc 23 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain - Forward Primer <400> 29 tgacgctgag caaagcagac 20 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain - Reverse Primer <400> 30 caggccctga tgggtgac 18 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain - Probe <400> 31 acgagaaaca caaagtctac gcctgcga 28 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hamster Cyclophilin - Forward Primer <400> 32 gcgtttcggg tccagga 17 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hamster Cyclophilin - Reverse Primer <400> 33 gagttgccca cagtcggaa 19 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hamster Cyclophilin - Probe <400> 34 tggcaaaacc agcaagaaga tcacca 26

Claims (77)

  1. 표적화된 통합(targeted integration: TI) 숙주 세포이며, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 41190-45269와 적어도 90% 상동성인 서열인 TI 숙주 세포.
  2. TI 숙주 세포이며, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 3,000 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 2,000 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  4. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 1,500 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  5. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 1,000 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  6. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 500 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  7. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 400 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  8. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 300 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  9. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 200 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  10. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 100 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  11. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 75 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  12. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 50 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  13. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 40 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  14. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 30 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  15. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 20 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  16. 제2항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 15 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  17. TI 숙주 세포이며, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270-45490과 적어도 90% 상동성인 서열인 TI 숙주 세포.
  18. TI 숙주 세포이며, 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 3,000 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 2,000 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  20. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 1,500 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  21. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 1,000 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  22. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 500 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  23. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 400 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  24. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 300 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  25. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 200 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  26. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 100 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  27. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 75 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  28. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 50 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  29. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 40 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  30. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 30 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  31. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 20 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  32. 제18항에 있어서, 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 15 염기쌍 내인 것인 TI 숙주 세포.
  33. 제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 숙주 세포, 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포, 마우스 숙주 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포인 TI 숙주 세포.
  34. 제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 재조합 인식 서열(recombination recognition sequence: RRS) 또는 적어도 2개의 RRS를 포함하고, 상기 RRS가 재조합효소에 의해 인식될 수 있는 것인, TI 숙주 세포.
  35. 제34항에 있어서, 상기 재조합효소가 Cre 재조합효소 또는 FLP 재조합효소이거나; Bxb1 인테그라제 또는 φC31 인테그라제이고/거나;
    상기 RRS가 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열 및 φC31 attB 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 TI 숙주 세포.
  36. 제34항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레오타이드 서열이 제1 RRS 및 제2 RRS, 및 상기 제1 RRS와 상기 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 것인 TI 숙주 세포.
  37. 제36항에 있어서, 제 1 선택 마커를 포함하고,
    상기 제1 선택 마커는 아미노글리코사이드 포스포트랜스페라제(APH), 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HYG), 네오마이신, G418 APH, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티딘올 탈수소효소(히스티딘올 D), 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신, 및 마이코페놀산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 TI 숙주 세포.
  38. 제37항에 있어서, 제2 선택 마커를 더 포함하고,
    상기 제1 선택 마커와 상기 제2 선택 마커는 상이한 것인 TI 숙주 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 제2 선택 마커가 아미노글리코사이드 포스포트랜스페라제(APH), 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HYG), 네오마이신, G418 APH, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티딘올 탈수소효소(히스티딘올 D), 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신, 및 마이코페놀산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 TI 숙주 세포.
  40. 제38항에 있어서, 제3 선택 마커 및 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES)를 더 포함하고, 상기 IRES는 상기 제3 선택 마커에 작동가능하게 연결되는 것인 TI 숙주 세포.
  41. 제40항에 있어서, 상기 제3 선택 마커가 상기 제1 선택 마커 또는 상기 제2 선택 마커와 상이한 것인 TI 숙주 세포.
  42. 제40항에 있어서, 상기 제3 선택 마커가 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP) 마커, 증강된 GFP(eGFP) 마커, 합성 GFP 마커, 황색 형광 단백질(YFP) 마커, 증강된 YFP(eYFP) 마커, 시안 형광 단백질(CFP) 마커, m플럼(mPlum) 마커, m체리(mCherry) 마커, td토마토(tdTomato) 마커, m스트로베리(mStrawberry) 마커, J-red 마커, DsRed-단량체 마커, m오렌지(mOrange) 마커, mKO 마커, m시트린(mCitrine) 마커, 비너스(Venus) 마커, YPet 마커, 에메랄드6(Emerald6) 마커, CyPet 마커, mCFPm 마커, 시룰리안(Cerulean) 마커, 및 T-사파이어(T-Sapphire) 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 TI 숙주 세포.
  43. 제36항에 있어서, 제3 RRS를 더 포함하고,
    상기 제3 RRS는 상기 제1 RRS와 상기 제2 RRS 사이에 위치하고, 상기 제3 RRS는 상기 제1 RRS 또는 상기 제2 RRS에 대하여 이종특이성인
    TI 숙주 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레오타이드 서열이
    (a) 적어도 하나의 외인성 관심대상 서열(sequence of interest: SOI) 또는
    (b) 상기 제1 RRS와 상기 제3 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 외인성 SOI, 및 상기 제3 RRS와 상기 제2 RRS 사이에 위치된 적어도 하나의 외인성 SOI
    를 더 포함하는 것인 TI 숙주 세포.
  45. 제44항에 있어서, 상기 외인성 SOI가 상기 제1 RRS와 상기 제2 RRS 사이에 위치하는 것인 TI 숙주 세포.
  46. 제44항에 있어서, 상기 (a) 및 (b)에서 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 TI 숙주 세포.
  47. 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법이며,
    (a) TI 숙주 세포의 게놈의 좌위(locus) 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계이며, 여기서
    (i) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 3,000 염기쌍 내이고; 및/또는
    (ii) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 3,000 염기쌍 내이고;
    상기 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 것인 단계,
    (b) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 2개의 RRS에 정합하고 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 벡터를 (a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계,
    (c) 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계이며, 상기 재조합효소는 상기 RRS를 인식하는 것인 단계, 및
    (d) 상기 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 상기 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  48. 적어도 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포의 제조 방법이며,
    (a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내의 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계이며, 여기서
    (i) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 3,000 염기쌍 내이고; 및/또는
    (ii) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 3,000 염기쌍 내이고;
    상기 외인성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접한 제1 및 제2 RRS, 및 상기 제1과 상기 제2 RRS 사이에 위치한 제3 RRS를 포함하고, 모든 상기 RRS는 이종특이성인 단계,
    (b) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 상기 제1 RRS 및 상기 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제1 외인성 SOI 및 적어도 하나의 제2 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS를 포함하는 제1 벡터를 (a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계,
    (c) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열 상의 상기 제2 RRS 및 상기 제3 RRS에 정합하고 적어도 하나의 제2 외인성 SOI에 측접한 2개의 RRS를 포함하는 제2 벡터를 (a)에서 제공되는 세포에 도입하는 단계,
    (d) 하나 이상의 재조합효소, 또는 하나 이상의 재조합효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계이며, 상기 하나 이상의 재조합효소는 상기 RRS를 인식하는 것인 단계, 및
    (e) 상기 제2 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, 상기 제1 및 제2 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 제1 벡터가 상기 제1 외인성 SOI가 상류에 측접하고 RRS가 하류에 측접하여 위치된 코돈 ATG에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 더 포함하고,
    상기 제2 벡터가 RRS가 상류에 측접하고 상기 제2 외인성 SOI가 하류에 측접한 ATG 전사 개시 코돈이 결핍된 선택 마커를 더 포함하는 것인
    방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 재조합효소가 Cre 재조합효소 또는 FLP 재조합효소, Bxb1 인테그라제 또는 φC31 인테그라제이고/거나
    (ii) 상기 SOI가 단쇄 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단쇄 Fv 단편(scFv) 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것이고/거나
    (iii) 상기 TI 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포, 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포, 마우스 숙주 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포 또는 CHO K1M 숙주 세포인
    방법.
  51. 관심대상 폴리펩타이드의 발현 방법이며,
    (a) 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계이며, 상기 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커는 상기 TI 숙주 세포 게놈의 좌위 내에서 통합된 2개의 RRS에 측접하고, 여기서
    (i) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 3,000 염기쌍 내이고; 및/또는
    (ii) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 3,000 염기쌍 내인 단계, 및
    (b) 상기 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 조건하에 (a)에서의 상기 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  52. 관심대상 폴리펩타이드의 발현 방법이며,
    (a) 숙주 세포의 게놈의 좌위 내에서 통합된 적어도 2개의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계이며, 여기서
    (i) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 5' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45269로부터의 3,000 염기쌍 내이고; 및/또는
    (ii) 상기 통합된 외인성 뉴클레오타이드 서열의 3' 바로 옆 뉴클레오타이드 서열이 NW_006874047.1의 뉴클레오타이드 45270으로부터의 3,000 염기쌍 내이고;
    적어도 하나의 외인성 SOI 및 하나의 선택 마커는 제1 RRS 및 제3 RRS에 측접하고, 적어도 하나의 외인성 SOI는 제2 RRS 및 상기 제3 RRS에 측접하는 것인 단계, 및
    (b) 상기 관심대상 폴리펩타이드를 발현하는 조건하에 (a)에서의 상기 세포를 배양하고, 이로부터 관심대상 폴리펩타이드를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
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