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TW201920250A - 用於以基因方式修飾且擴展淋巴球以及調節其活性之方法及組合物 - Google Patents

用於以基因方式修飾且擴展淋巴球以及調節其活性之方法及組合物 Download PDF

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TW201920250A
TW201920250A TW107132811A TW107132811A TW201920250A TW 201920250 A TW201920250 A TW 201920250A TW 107132811 A TW107132811 A TW 107132811A TW 107132811 A TW107132811 A TW 107132811A TW 201920250 A TW201920250 A TW 201920250A
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TW
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cells
cell
polypeptide
genetically modified
domain
Prior art date
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TW107132811A
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葛傑瑞 伊恩 芙羅斯
詹姆士 喬瑟夫 奧納佛
法扎德 哈爾紮德
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美商Ｆ１腫瘤股份有限公司
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Abstract

本發明提供用於以基因方式修飾淋巴球之方法及組合物以及包括以基因方式修飾T細胞及/或NK細胞之相關方法。該等方法使用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，該等非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件及視情況選用之膜結合T細胞活化元件(諸如抗CD3)，且編碼可包括淋巴增殖性元件及/或嵌合抗原受體(CAR)的一或多個工程化信號傳導多肽。該等方法可包括使PBMC與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸不同例示性時段，諸如少於24小時或在一些說明性實施例中少於15分鐘。提供能夠在不添加IL-2之情況下促進培養物中T細胞或NK細胞之存活及/或增殖的說明性嵌合淋巴增殖性元件。此外，提供額外調節元件，諸如抑制性RNA分子。

Description

用於以基因方式修飾且擴展淋巴球以及調節其活性之方法及組 合物 【相關申請案之交叉參考】
此申請案為2018年3月3日申請之國際申請案第PCT/US2018/020818號之部分接續申請案；且主張以下申請案之權益：2017年9月18日申請之美國臨時申請案第62/560,176號；2017年9月27日申請之美國臨時申請案第62/564,253號；2017年9月28日申請之美國臨時申請案第62/564,991號；以及2018年9月6日申請之美國臨時申請案第62/728,056號；國際申請案第PCT/US2018/020818號為2017年3月19日申請之國際申請案第PCT/US2017/023112號之部分接續申請案；2017年7月8日申請之國際申請案第PCT/US2017/041277號之部分接續申請案；2017年3月19日申請之美國申請案第15/462,855號之部分接續申請案；以及2017年7月8日申請之美國申請案第15/644,778號之部分接續申請案；且主張以下申請案之權益：2017年3月3日申請之美國臨時申請案第62/467,039號；2017年9月18日申請之美國臨時申請案第62/560,176號；2017年9月27日申請之美國臨時申請案第62/564,253號；以及2017年9月28日申請之美國臨時申請案第62/564,991號；國際申請案第PCT/US2017/023112號主張以下申請案之權益：2016年3月19日申請之美國臨時申請案第62/390,093號；2016年7月8日申請之美國臨時申請案第62/360,041號；以及2017年3月3日 申請之美國臨時申請案第62/467,039號；國際申請案第PCT/US2017/041277號主張以下申請案之權益：2017年3月19日申請之國際申請案第PCT/US2017/023112號；2017年3月19日申請之美國專利申請案第15/462,855號；2016年7月8日申請之美國臨時申請案第62/360,041號；以及2017年3月3日申請之美國臨時申請案第62/467,039號；美國申請案第15/462,855號主張以下申請案之權益：2016年3月19日申請之美國臨時申請案第62/390,093號；2016年7月8日申請之美國臨時申請案第62/360,041號；以及2017年3月3日申請之美國臨時申請案第62/467,039號；且美國申請案第15/644,778號為2017年3月19日申請之國際申請案第PCT/US2017/023112號之部分接續申請案；及2017年3月19之申請之美國專利申請案第15/462,855號之部分接續申請案；且主張以下申請案之權益：2016年7月8日申請之美國臨時申請案第62/360,041號及2017年3月3日申請之美國臨時申請案第62/467,039號。此等申請案以其全文引用之方式併入本文中。
序列表
本申請案在此以引用之方式併入與本申請案一起提交之電子序列表之材料。電子序列表中之材料提交為於2018年9月17日創建之標題為「F1_001_TW_04_Sequence_Listing_2018_09_17」的文字(.txt)檔案(其檔案大小為529KB)，且以其全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於免疫學領域，或更特定言之，係關於T淋巴球或其他免疫細胞之基因修飾，及製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒及控制其中之基因之表現的方法。
自個體(例如，患者)分離之淋巴球可在活體外活化且經基因修飾以表現合成蛋白，該等合成蛋白能夠基於所併入之基因程式而與其他細胞及環境重定向接合。此合成蛋白之一實例為嵌合抗原受體(CAR)。目前使用之一種CAR為胞外識別域(例如，抗原結合域)、跨膜域及由非複製勝任型重組反轉錄病毒編碼之一或多個胞內信號傳導域的融合。
儘管重組反轉錄病毒已在感染非分裂細胞上展示功效，但休眠CD4及CD8淋巴球對此等載體的基因轉導不敏感。為了克服此等困難，通常在可出現對CAR基因載體之基因修飾之前使用刺激劑來在活體外活化此等細胞。在刺激及轉導之後，經基因修飾之細胞在活體外擴展且隨後再引入至淋巴消耗的患者中。在體內抗原接合之後，CAR之胞內信號傳導部分可在免疫細胞中開始活化相關之反應且釋放細胞溶解分子以誘導腫瘤細胞死亡。
此類目前方法需要廣泛的操縱及在T細胞再輸注至患者中之前在活體外製造增殖性T細胞，以及淋巴消耗化學療法以釋放細胞介素及消耗競爭性受體以有助於T細胞移植。一旦引入至身體中，此類CAR療法另外不能控制體內傳播速率，亦不能安全地定向亦在腫瘤外表現之靶標。因此，現今CAR療法一般由使用1×105個細胞/公斤至1×108個細胞/公斤之劑量離體擴展12天至28天之細胞輸注，且定向靶標(例如，腫瘤靶標)，對於該CAR療法離開腫瘤在靶標毒性上一般係可接受的。此等相對較長離體擴展時間產生細胞存活性及無菌性問題，以及除可調性之挑戰以外的樣本一致問題。因此，顯著需要一種更安全、更有效可調T細胞或NK細胞療法。
由於吾等對驅動淋巴球之轉導、增殖和存活的過程的理解為涉及免疫過程之各種潛在商業用途的核心，因此需要經改良方法及組合物以供研究淋巴球。舉例而言，其將有助於識別可用於更好的表徵及理解淋巴球可如何經基因方式修飾的方法及組合物以及影響其存活及增殖的因素。此外，其將有助於識別驅動淋巴球增殖及存活的組合物。此等組合物可用於研究對此等過程之調節。除用於研究淋巴球之方法及組合物以外，需要經改良病毒封裝細胞株及製造及使用其的方法。舉例而言，此等細胞株及方法將適用於分析重組病毒(諸如重組反轉錄病毒顆粒)之不同組分，以及用於使用封裝細胞株以供生產重組反轉錄病毒顆粒的方法。
本文中提供幫助克服關於用於轉導及/或以基因方式修飾淋巴球(諸如T細胞及/或NK細胞)的有效性及安全性的方法、組合物及套組。此等方法之某些實施例適用於用此等細胞執行過繼性細胞療法。因此，在一些態樣中，本文中提供用於以基因方式修飾及/或轉導淋巴球(尤其T細胞及/或NK細胞)及/或用於調節經轉導及/或經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞的方法、組合物及套組。此等方法、組合物及套組提供優於目前技術之經改良功效及安全性，尤其關於表現嵌合抗原受體(CAR)及在說明性實施例中微環境限制生物CAR之T細胞及/或NK細胞。利用本文提供之方法及/或使用該方法生產之經轉導及/或經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞包括，在經由反轉錄病毒(例如，慢病毒)顆粒自反轉錄病毒(例如，慢病毒)基因組遞送之說明性實施例中，為此類細胞及為利用此類細胞之方法(諸如研究方法、商業生產方法及過繼性細胞療法)提供經改良特徵的功能性及功 能性組合。舉例而言，此等細胞可離體在較短時間內產生，及該等細胞具有可被更好調節之經改良生長特性。
在一些態樣中，本文中提供用於調節CAR、mRNA、抑制性RNA之調節元件，及/或在淋巴球(諸如B細胞、T細胞及NK細胞)中之淋巴增殖性元件，例如嵌合淋巴增殖性元件。此外，在一些態樣中，本文中提供表現各種功能元件且在其表面上攜載各種功能元件之重組反轉錄病毒，以及用於生產該等重組反轉錄病毒之方法及封裝細胞株。此等重組反轉錄病毒及用於生產其之方法及細胞克服了先前技術關於基因組之數目及大小的限制，具有在遞送至T細胞及/或NK細胞中時提供益處的不同功能元件。
在一些態樣中，提供用於轉導及/或以基因方式修飾淋巴球(諸如T細胞及/或NK細胞)的方法，且在說明性實施例中，提供用於轉導及/或以基因方式修飾休眠T細胞及/或NK細胞的離體方法。此等態樣中之一些可比先前方法更快速地執行，此可有助於更有效的研究、更有效的商業生產以及經改良之患者護理方法。此外，本文中提供在一些實施例中利用在一些態樣在本文提供之重組反轉錄病毒以及藥用試劑以提供經改良安全性機制以幫助調節經轉導及/或經基因方式修飾之淋巴球(諸如T細胞及/或NK細胞)的活性的方法。此等方法、組合物及套組可在商業生成中及在用表現CAR之經轉導及/或經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞的過繼性細胞療法中用作研究工具。
貫穿本專利申請案提供關於本發明之態樣及實施例之另外的細節。章節及章節標題係為易於閱讀的且不意欲限制本發明之組合，諸如方法、組合物及套組或其中貫穿章節之功能元件。
100‧‧‧封裝細胞
110‧‧‧重組聚核苷酸
200‧‧‧非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒
210‧‧‧活化元件
220‧‧‧活化元件
230‧‧‧膜結合細胞介素
240‧‧‧假型化元件
250‧‧‧Src-FLAG-Vpx/Vpx多肽
260‧‧‧HIV gag基質
270‧‧‧HIV gag衣殼
280‧‧‧RNA
290‧‧‧HIV pol
300‧‧‧休眠T細胞/休眠NK細胞及/或T細胞/NK細胞
310‧‧‧IL-7Rα/細胞介素受體
320‧‧‧輔助受體
330‧‧‧SLAM及CD46
340‧‧‧CD3
350‧‧‧SAMHD1/SAMHD1限制因子
360‧‧‧CAR
370‧‧‧淋巴增殖性元件
圖1展示包括封裝細胞(100)及本發明之一個例示性、非限制性實施例之由封裝細胞(100)產生之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)的說明性組合物的示意圖。在圖1中，能夠編碼本發明之態樣之各種載體(被稱為重組聚核苷酸(110))經封裝至重組反轉錄病毒顆粒(200)中，該重組反轉錄病毒顆粒在其基因組中包括第一工程化信號傳導多肽(其包括一或多個淋巴增殖性元件)及在一些實施例中第二工程化信號傳導多肽(其為嵌合抗原受體或CAR)。非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其膜上表現：允許非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與靶細胞結合並融合之假型化元件(在一非限制性實施例中，麻疹病毒凝血素(H)多肽及麻疹病毒融合(F)多肽、或其細胞質域缺失變體)(240)；能夠結合並活化休眠T細胞之活化元件(在非限制性實施例中，具有能夠結合CD28之多肽及能夠結合CD3之多肽的活化元件)(分別為210及220)；及膜結合細胞介素(在一非限制性實施例中，IL-7 DAF融合多肽)(230)。標記為(250)、(260)、(270)、(280)及(290)之部分分別為Src-FLAG-Vpx、HIV gag基質、HIV gag衣殼、RNA及HIV pol。
圖2展示包括由封裝細胞(100)產生之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)及由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)轉染之休眠T細胞(300)之非限制性說明性組合物之示意性圖。非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)之表面上之元件與休眠T細胞之表面上之受體及/或配位體結合。在非限制性實施例中，假型化元件可包括有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)與T細胞結合及融合之結合多肽及促融合多肽(在非限制性實施例中，麻疹病毒凝血 素(H)多肽及麻疹病毒融合(F)多肽、或其細胞質域缺失變體)。在非限制性實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)在其表面上包括能夠藉由接合T細胞受體複合物及視情況存在之輔助受體(320)來活化休眠T細胞的活化元件(在非限制性實施例中，具有能夠結合CD28之多肽及能夠結合CD3之多肽之活化元件)。此外，存在於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)之表面上之膜結合細胞介素(在非限制性實施例中，IL-7 DAF融合多肽)與休眠T細胞之表面上之IL-7Rα(310)結合。與T細胞融合之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)及編碼包括淋巴增殖性元件(在說明性實施例中，組成性活性IL-7Rα)(370)之第一工程化信號傳導多肽之聚核苷酸，在遷移至待併入至經活化T細胞之DNA中的細胞核之前在胞溶質中經反轉錄。不受理論限制，在一些非限制性實施例中，用病毒封裝之Src-FLAG-Vpx(250)進入休眠T細胞之胞溶質且促進SAMHD1(350)降解，從而導致可用於反轉錄之細胞質dNTP庫增加。在一些實施例中，聚核苷酸亦可編碼包括CAR(360)之第二工程化信號傳導多肽。在一些實施例中，在化合物與調節其表現之控制元件(在非限制性實例中，該控制元件為結合核苷類似物之核糖開關)結合時，表現淋巴增殖性元件。在一些實施例中，CAR之表現亦受控制元件調節。部分(330)為SLAM及CD46。部分(340)為CD3。
圖3A至圖3E展示用於轉染封裝細胞以產生本文描述之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒的非限制性、例示性載體構築體的示意圖。圖3A展示含有編碼融合至NFκB p65活化子域(p65 AD)之FRB域及融合至組成性表現之三個FKBP重複的ZFHD1 DNA結合域的聚核苷酸序列的構築體。圖3A中之構築體亦包括HIV1 REV及作為 在雷帕黴素誘導型ZFHD1/p65 AD啟動子下之SrcFlagVpx融合的Vpx。圖3B展示含有在ZFHD1/p65 AD啟動子之控制下編碼rtTA序列之聚核苷酸的構築體。圖3C展示含有編碼側接有loxP位點之嘌呤黴素抗性基因及側接有lox2272位點之胞外MYC標記的聚核苷酸的構築體。兩個可選標記均在BiTRE啟動子之控制下，該BiTRE啟動子側接有FRT位點。圖3D展示含有編碼側接有在TRE啟動子之控制下的loxP位點及在TRE啟動子與RFP之5’loxP位點之間的單個FRT位點之RFP的聚核苷酸的構築體。圖3E展示含有編碼側接有在TRE啟動子之控制下的loxP位點及在TRE啟動子與GEP之5’loxP位點之間的單個FRT位點之GFP的聚核苷酸的構築體。圖3C至圖3E中之構築體充當其他聚核苷酸序列插入至封裝細胞株之基因組中的著陸點。
圖4A至圖4C展示用於轉染封裝細胞以產生本文描述之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之非限制性、例示性載體構築體的示意圖。圖4A展示含有編碼具有CD14 GPI錨連接位點之抗CD3(純系UCHT1)scFvFc之三順反子聚核苷酸、能夠使CD28與CD16B GPI錨連接位點結合之CD80胞外域(ECD)及融合至衰變加速因子(DAF)之IL-7(其中，轉座子序列側接聚核苷酸區以用於整合至HEK293S基因組中)的構築體。圖4B展示含有具有BiTRE啟動子之聚核苷酸及在一個方向上編碼gag多肽及pol多肽之聚核苷酸區以及在另一方向上編碼麻疹病毒F△x蛋白質及H△y蛋白質的聚核苷酸區的構築體。圖4C展示含有編碼CAR及在CD3Z啟動子(其在HEK293S細胞中不具有活性)之控制下之淋巴增殖性元件IL7Rα-insPPCL的聚核苷酸序列的構築體，其中CAR及IL7Rα-insPPCL由編碼T2A核糖體跳躍序列之聚核苷酸序列隔開，且IL7Rα-insPPCL具有阿昔洛韋(acyclovir)核糖開關控制 的核糖核酸酶。含CAR之構築體進一步包括cPPT/CTS、RRE序列及編碼HIV-1 Psi(Ψ)之聚核苷酸序列。待被整合至基因組中之含CAR之構築體上之整個聚核苷酸序列側接有FRT位點。
圖5展示編碼GFP、抗CD19嵌合抗原受體及eTAG(本文中稱為F1-0-03)之慢病毒表現載體的示意圖。
圖6A及6B展示在用編碼F1-0-03且如所指示於其表面上顯現GPI錨定抗CD3 scFvFc之VSV-G假型化慢病毒顆粒轉導來自供體12M之新鮮分離且未經刺激之PBMC 14小時後之第3天、第6天、第9天、第13天及第17天的總CD3+群體中的CD3+GFP+細胞之百分比(%)的直方圖(圖6A)及CD3+GFP+群體之每孔絕對細胞計數的直方圖(圖6B)。各條柱表示兩個重複之平均值+/- SD。
圖7A及7B展示在用編碼F1-0-03之所指示慢病毒顆粒轉導來自供體13F之新鮮分離且未經刺激之PBMC 14小時後之第3天及第6天的總CD3+群體中的CD3+GFP+細胞之百分比(%)的直方圖(圖7A)及CD3+GFP+群體之每孔絕對細胞計數的直方圖(圖7B)。請注意，「A」展示使用VSV-G假型化慢病毒顆粒(三個重複實驗)之結果；「B」展示在向轉導介質添加OKT3 Ab(1μg/mL)之情況下使用VSV-G假型化慢病毒顆粒(兩個重複實驗)之結果；「C」展示使用於其表面上表現GPI錨定UCHT1scFvFc的VSV-G假型化慢病毒顆粒(三個重複實驗)之結果；且「D」展示使用於其表面上顯現GPI錨定UCHT1scFvFc及GPI錨定CD80的VSV-G假型化慢病毒顆粒(兩個重複試驗)之結果。各條柱表示兩個重複或三個重複之平均值+/- SD，如圖7A所指示。
圖8A及8B展示在用編碼F1-0-03且如所指示於其表面上顯現GPI錨定UCHT1scFvFc及GPI錨定CD80的VSV-G假型化慢病 毒顆粒轉導來自供體12M之新鮮分離且未刺激之PBMC持續所指示暴露時間(2h至20h)後之第3天、第6天及第9天的總CD3+群體中的CD3+GFP+細胞之百分比(%)的直方圖(圖8A)及CD3+GFP+群體之每孔絕對細胞計數的直方圖(圖8B)。轉導係在如所指示之盤或振盪燒瓶中執行。各條柱表示用VSV-G(「VSV-G」)假型化慢病毒顆粒之兩個重複的平均值+/- SD；其他實驗不具有重複。
圖9A及圖9B展示在用編碼F1-0-03之所指示慢病毒顆粒轉導來自供體18之新鮮分離且未刺激之PBMC後之第3天的活CD3+群體中的CD3+GFP+細胞之百分比(%)的直方圖(圖9A)及總的活群體之每微升絕對細胞計數的直方圖(圖9B)。各條柱表示兩個重複之平均值+/- SD。
圖10A及圖10B展示在由不同非複製勝任型慢病毒顆粒以1 MOI轉導未刺激之PBMCS 4小時後之第6天的總的活細胞群體中之GFP+細胞之百分比(%)的直方圖(圖10A)及培養物之每微升GFP+細胞數目(圖10B)。VSV-G假型化慢病毒顆粒編碼F1-0-03[VSV-G]且如所指示單獨顯現UCHT1scFvFc-GPI[VSV-G+U]或與CD80-GPI[VSV-G+U+CD80]一起顯示。如所指示用抗反轉錄病毒藥物達普利寧(dapivirine)及度魯特韋(dolutegravir)來處理樣本。包括「僅細胞」(未轉導)作為對照。
圖11A及圖11B展示在由不同非複製勝任型慢病毒顆粒轉導未刺激之PBMC 4小時後之第6天的總的活細胞群體中之FLAG+細胞之百分比(%)的直方圖(圖11A)及培養物之每微升FLAG+細胞數目(圖11B)。慢病毒顆粒編碼F1-3-219且以1 MOI使用。慢病毒顆粒用VSV-G[VSV-G]、BaEV[BaEV]或BaEV假型化，其中對融合抑 制性R肽刪除[BaEV△R(HA)]及[BaEV△R(HAM)]。包括未經轉導之PBMC(「細胞」)作為對照。
圖12A及圖12B展示在由不同非複製勝任型慢病毒顆粒轉導未刺激之PBMC 4小時後之第6天的總的活細胞群體中之CD3+FLAG+細胞之百分比(%)的直方圖(圖12A)及培養物之每微升CD3+FLAG+細胞數目(圖12B)。慢病毒顆粒編碼F1-3-451且以1 MOI使用。用VSV-G[VSV-G]、MuLV[MuLV]或UCHT1scFv與MuLV[U-MuLV]之融合來假型化慢病毒顆粒。慢病毒[VSV-G+U]及[MuLV+U]分別用VSV-G及MuLV假型化，且進一步顯現UCHT1scFvFc-GPI。包括未經轉導之PBMC(「細胞」)作為對照。
圖13為展示在由不同非複製勝任型慢病毒顆粒以1 MOI轉導未刺激之PBMC持續所指示時段後之第6天的培養物的每微升CD3+FLAG+細胞數目的直方圖。F1-3-253編碼抗CD19 CAR且F1-3-451編碼除相同CAR之以外的CLE。慢病毒顆粒用VSV-G[VSV-G]假型化且如所指示視情況顯現UCHT1ScFvFc-GPI[VSV-G+U]如所指示，用達普利寧(反轉錄(RT inb)之抑制劑)或度魯特韋(整合抑制劑(INT Inb))來處理樣本。
圖14A提供在PBMC中表現時針對淋巴增殖性/存活活性測試之IL7Rα變體的示意圖。圖14B提供展示IL-2之存在及不存在下PBMC之存存力之百分比的柱狀圖。
圖15為含有編碼CAR及庫3A、3B、3.1A及3.1B之候選CLE的聚核苷酸序列之非限制性例示性轉基因表現卡匣的示意圖。
圖16為含有編碼CAR及庫1A、1.1A及1.1B之候選嵌合淋巴增殖性元件(CLE)的聚核苷酸序列之非限制性例示性轉基因表現 卡匣的示意圖。
圖17為含有編碼庫2B及2.1B之候選CLE的聚核苷酸序列之非限制性例示性轉基因表現卡匣的示意圖。
圖18為含有編碼庫4B及4.1 B之候選CLE的聚核苷酸序列之非限制性例示性轉基因表現卡匣的示意圖。
圖19為展示PBMC用編碼個別CLE之慢病毒顆粒轉導且在不存在外源細胞介素之情況下培養35天的倍數擴展的圖式。
圖20為展示PBMC用編碼抗CD19 CAR構築體及個別CLE之慢病毒顆粒轉導且在存在經供體匹配之PBMC但不存在外源性細胞介素之情況下培養35天的PBMC之倍數擴展的圖式。
圖21為展示所指示慢病毒顆粒於4小時內轉導休眠PBMC之效率的圖式。在不存在外源性細胞介素之情況下，轉導效率在6天後在培養物中經量測為CAR+ PBMC%，如藉由FACS所測定。各慢病毒顆粒編碼CAR及CLE。慢病毒顆粒F1-1-228U及F1-3-219U在其表面上顯現UCHT1scFvFc-GPI。
圖22A及圖22B為展示在休眠PBMC用所指示慢病毒顆粒轉導4小時且在不存在外源性細胞介素之情況下活體外培養6天後活細胞之總數目之時間過程的圖式。各慢病毒顆粒編碼CAR及CLE。慢病毒顆粒F1-1-228U及F1-3-219U在其表面上顯現UCHT1scFvFc-GPI。
圖23A、圖23B及圖23C為展示來自給藥有用所指示慢病毒顆粒轉導4小時之人類PBMC且經靜脈內注射而無需離體擴展PBMC的攜帶腫瘤之NSG小鼠之血液的每微克基因組DNA之慢病毒基因組之複本之時間過程的圖式。各慢病毒顆粒編碼CAR。 F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-219U亦編碼CLE。慢病毒顆粒F1-1-228U及F1-3-219U亦在其表面上顯現UCHT1scFvFc-GPI。
圖24為展示給藥有用所指示慢病毒顆粒轉導4小時之人類PBMC且經靜脈內注射而無需離體擴展PBMC的攜帶腫瘤之NSG小鼠的每200μl血液之CAR+細胞之數目的圖式。。在將小鼠安樂死的時候取樣血液。各慢病毒顆粒編碼CAR。F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-219U亦編碼CLE。慢病毒顆粒F1-1-228U及F1-3-219U亦在其表面上顯現UCHT1scFvFc-GPI。
圖25A為展示靜脈內給藥有用編碼抗ROR2 MRB CAR及CLE之所指示慢病毒顆粒轉導4小時之PBS或人類PBMC而無需離體擴展PBMC的NSG小鼠中之CHO-ROR2腫瘤之平均體積的圖式。圖25B為展示靜脈內給藥有用編碼抗CD19 CAR及CLE之所指示慢病毒顆粒轉導4小時之PBS或人類PBMC而無需離體擴展PBMC的NSG小鼠中之Raji腫瘤之平均體積的圖式。慢病毒顆粒F1-1-228U及F1-3-219U在其表面上顯現UCHT1scFvFc-GPI。
圖26A為慢病毒載體主鏈F1-0-02之示意圖，其包括驅動GFP及eTag之表現的轉基因表現卡匣以及合成EF-1α啟動子及GFP上游之內含子A的。圖26B展示將miRNA插入至F1-0-02主鏈之EF1α內含子A中。「1」表示EF1α重疊；「2」表示5'臂；「3」表示miRNA1 5'莖；「4」表示環；「5」表示miRNA1 3'莖；「6」表示3’臂；「7」表示連接子；「8」表示miRNA2 5'莖；「9」表示miRNA2 3'莖；「10」表示miRNA3 5'莖；「11」表示miRNA3 3'莖；「12」表示miRNA4 5'莖；且「13」表示miRNA4 3'莖。
圖27為展示靶向位於EF-1α啟動子內含子中之CD3ζ之 miRNA能夠阻斷CD3複合物之表現的圖。
圖28為展示用含有非複製勝任型慢病毒顆粒之miR-TCRα轉導之樣本之△△Ct的直方圖。△△Ct值表示相對於未經轉導對照物之各經轉導樣本中之經處理miR-TCRa miRNA的量。
定義
如本文中所使用，術語「嵌合抗原受體」或「CAR」或「CARs」係指工程化受體，其將抗原特異性移植至細胞上，例如T細胞、NK細胞、巨噬細胞及幹細胞。本發明之CAR包括至少一個抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域(TM)及胞內活化域(IAD)，且可包括柄及一或多個共刺激域(CSD)。在另一實施例中，CAR為對兩種不同抗原或抗原決定基具有特異性之雙特異性CAR。在ASTR與靶標抗原特異性結合之後，IAD活化胞內信號傳導。舉例而言，IAD可以非MHC限制的方式將T細胞特異性及反應性重定向於所選擇之靶標，從而利用抗體之抗原結合特性。非MHC限制的抗原識別給與表現CAR之T細胞不依賴於抗原處理而識別抗原的能力，因此繞過腫瘤逃逸的主要機制。此外，當在T細胞中表現時，CAR有利地不與內源性T細胞受體(TCR)α鏈及β鏈二聚。
如本文中所使用，術語「微環境」意謂與其他組織區或身體區具有恆定或時間的、物理的或化學的差異的組織或身體之任何部分或區。舉例而言，如本文中所使用之「腫瘤微環境」係指腫瘤存在於其中之環境，該環境為腫瘤內之非細胞區域，且正好位於腫瘤組織外部之區域並不屬於癌細胞自身之胞內區室。腫瘤微環境可指代腫瘤環境之任何及所有條件，該等條件包括為惡化過程創建結構性及 /或功能性環境以存活及/或擴展及/或擴散的條件。舉例而言，腫瘤微環境可包括條件之更改，該等條件諸如(但不限於)：壓力、溫度、pH、離子強度、滲透壓、重量莫耳滲透濃度、氧化應激、一或多種溶質之濃度、電解質之濃度、葡萄糖之濃度、透明質酸之濃度、乳酸或乳酸鹽之濃度、白蛋白之濃度、腺苷之水準、R-2-羥基戊二酸之水準、丙酮酸之濃度、氧氣之濃度及/或氧化劑、還原劑或輔助因子之存在，以及熟練的業內人士將理解之其他條件。
如本文中交換地使用，術語「聚核苷酸」及術語「核酸」係指任何長度之核苷酸(核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸)之聚合形式。因此，此術語包括(但不限於)：單鏈、雙鏈或多鏈的DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體，或包含嘌呤鹼基及嘧啶鹼基或其他天然、經化學方式或生物化學方式修飾之非天然或衍生之核苷酸鹼基的聚合物。
如本文中所使用，術語「抗體」包括多株抗體及單株抗體，該等多株抗體及單株抗體包括完整的抗體及保留與抗原特異性結合的抗體片段。抗體片段可為(但不限於)：片段抗原結合片段(Fab)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、Fab’-SH片段、(Fab’)2Fv片段、Fd片段、重組IgG(rIgG)片段、單鏈抗體片段，包括單鏈可變片段(scFv)、二價scFv、三價scFv及單域抗體片段(例如，sdAb、sdFv、奈米抗體)。該術語包括免疫球蛋白之基因方式工程化及/或其他修飾形式，諸如：胞內抗體、肽抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、全人類抗體、人類化抗體、包括抗體及非抗體蛋白質之抗原特異性靶向區之融合蛋白質、雜結合抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體)、串聯雙-scFv及串聯三-scFv。除非另 外陳述，否則術語「抗體」應理解為包括其功能性抗體片段。該術語亦包括完整或全長抗體，其包括任何類別或子類別之抗體，包括IgG及其子類別、IgM、IgE、IgA及IgD。
如本文中所使用，術語「抗體片段」包括完整抗體之一部分，例如，完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段(稱為「Fab」片段，每一者具有單個抗原結合位點)及一殘餘「Fe」片段(一種反映容易結晶之能力的指示)。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原之F(ab’)2片段。
如本文中交換地使用，術語「單鏈Fv」、「scFv」或「sFv」抗體片段包括抗體之VH域及VL域，其中此等域存在於單個多肽鏈中。在一些實施例中，Fv多肽進一步包括在VH域與VL域之間的，使得sFv能夠形成針對抗原結合之所需結構的多肽連接子或間隔區。對於sFv之綜述，參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York,第269至315頁(1994)。
如本文中所使用，「天然存在」之VH域及VL域係指已自宿主分離而不進一步分子進化以改變其在特殊條件下以scFv形式產生時之親和性的VH域及VL域，諸如美國專利8709755B2及申請案WO/2016/033331A1中所揭示之彼等。
如本文中所使用，術語「親和性(affinity)」係指兩種試劑之可逆結合的平衡常數，且被表達為解離常數(Kd)。親和性可比 抗體針對不相關胺基酸序列之親和性高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍，或更高。抗體對於靶蛋白之親和性可為(例如)約100奈莫耳(nM)至約0.1nM、約100nM至約1皮莫耳(pM)，或約100nM至約1飛莫耳(fM)或更高。如本文中所使用，術語「親合力(avidity)」係指兩種或更多種試劑之複合物在稀釋後對於解離的抗性。關於抗體及/或抗原結合片段，術語「免疫反應性」及「優先結合」在本文中互換地使用。
如本文中所使用，術語「結合(binding)」係指歸因於(例如)共價相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用及離子相互作用及/或氫鍵相互作用(包括諸如鹽橋鍵及水橋鍵之相互作用)而在兩個分子之間的直接締合。非特異性結合應係指親和性低於約10-7M之結合，例如，親和性低於10-6M、10-5M、10-4M等之結合。
如本文中所使用，提及「細胞表面表現系統(cell surface expression system)」或「細胞表面展示系統(cell surface display system)」係指蛋白質或其部分在細胞表面上之展示或表現。通常，生成表現與細胞表面蛋白質融合之相關蛋白質的細胞。舉例而言，蛋白質表現為具有跨膜域之融合蛋白質。
如本文中所使用，術語「元件」包括多肽(包括多肽之融合體、多肽之區及其功能性突變體或片段)及聚核苷酸(包括微小RNA及shRNA，以及其功能性突變體或片段)。
如本文中所使用，術語「區」為多肽或聚核苷酸之任何區段。
如本文中所使用，「域」為具有功能性及/或結構性特性之多肽或聚核苷酸之區。
如本文中所使用，術語「柄」或「柄域」係指提供結構性可撓性且與側翼多肽區間隔的可撓性多肽連接區，且可由天然或合成的多肽組成。柄可衍生自免疫球蛋白(例如，IgG1)之鉸鏈或鉸鏈區，其一般被定義為自人類IgG1之Glu216拉伸至Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.,22：161-206)。可藉由使第一個半胱胺酸與最後一個半胱胺酸在相同位置形成重鏈間二硫鍵(S-S)來將其他IgG同型之鉸鏈區與IgG1序列進行比對。柄可為天然存在或非天然存在的，其包括(但不限於)經改變的鉸鏈區，如美國專利第5,677,425號所揭示。柄可包括衍生自任何類別或子類別之抗體的完整鉸鏈區。柄亦可包括衍生自CD8、CD28或在提供可撓性且與側翼區間隔上提供類似功能的其他受體的區。
如本文中所使用，術語「(經)分離」意謂，材料係自其原始環境(例如，當其為天然存在時，則係自天然環境)移除。舉例而言，存在於活體動物中之天然存在之聚核苷酸或多肽係未經分離的，但自天然系統中之共存材料之一些或全部分離的相同聚核苷酸或多肽則係經分離的。此類聚核苷酸可為載體之部分，及/或此類聚核苷酸或多肽可為組合物之部分，且仍係經分離的，此係因為載體或組合物並非其天然環境之部分。
如本文中所使用，「多肽」係由肽鍵連接之單鏈胺基酸殘基。多肽既不摺疊成固定結構，亦不具有任何轉譯後修飾。「蛋白質」為摺疊成固定結構之多肽。「多肽」及「蛋白質」在本文中互換地使用。
如本文中所使用，多肽可經「純化」以移除多肽之天然環境之雜質組分，例如，將干擾多肽之診斷或治療用途之材料，諸如，酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。多肽可(1)純化至按抗體重量計高於90%、高於95%或高於98%，如利用洛瑞法(Lowry method)所測定，例如，高於99重量%，(2)藉助於旋轉杯序列分析儀純化至足以獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，或(3)利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在還原條件或非還原條件下使用庫馬斯藍或銀染料純化至均一性。
如本文中所使用，術語「免疫細胞」一般包括衍生自骨髓中產生之造血幹細胞(HSC)之白血細胞(白血球)。「免疫細胞」包括(例如)淋巴球(T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞)及衍生自骨髓之細胞(嗜中性細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞)。
如本文中所使用，「T細胞」包括表現CD3之所有類型之免疫細胞，其包括輔助T細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+細胞)、調節性T細胞(Treg)及γ-δ T細胞。
如本文中所使用，「細胞毒性細胞」包括CD8+ T細胞、自然殺傷(NK)細胞、NK-T細胞、γδ T細胞(一種CD4+細胞之子群)及嗜中性細胞(其為能夠介導細胞毒性反應之細胞)。
如本文中所使用，術語「幹細胞」一般包括分化多能或多潛能幹細胞(pluripotent or multipotent stem cell)。「幹細胞」包括(例如)胚胎幹細胞(ES)、間充質幹細胞(MSC)、誘導型分化多能性幹細胞(iPS)及定型祖細胞(造血幹細胞(HSC)、骨髓衍生細胞等)。
如本文中所使用，術語「治療(treatment/treating)及類 似者」係指獲得所需藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分地預防疾病或其症狀而言可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病及/或由疾病引起之不良影響而言可為治療性的。如本文中所使用之「治療」涵蓋哺乳動物中之(例如，人類中之)疾病之任何治療，且包括：(a)預防在易患疾病但尚未被診斷為患有其之個體中發生疾病；(b)抑制疾病，亦即，遏止其發展；及(c)減輕疾病，亦即，引起疾病消退。
如本文中互換地使用，術語「個體(individual)」、「個體者(subject)」、「宿主」及「患者」係指哺乳動物，其包括(但不限於)人類、鼠類(例如，大鼠、小鼠)、兔類(例如，兔)、非人類靈長類、人類、犬、貓、有蹄類動物(例如，馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。
如本文中所使用，術語「治療有效量」或「有效量」係指在向哺乳動物或其他個體投予以用於治療疾病時足以影響疾病之此類治療的試劑之量或兩種試劑之組合量。「治療有效量」將視試劑、疾病及其嚴重程度以及待治療之個體之年齡、體重等而變化。
如本文中所使用，術語「進化(evolution/evolving)」係指使用一或多種突變方法以產生編碼不然多肽之不同聚核苷酸，該多肽自身為經改良生物分子及/或有助於產生另一經改良生物分子。「生理學」或「正常」或「正常生理學」條件為諸如(但不限於)以下之條件：壓力、溫度、pH、離子強度、滲透壓、重量莫耳滲透濃度、氧化應激、一或多種溶質之濃度、電解質之濃度、葡萄糖之濃度、透明質酸之濃度、乳酸或乳酸鹽之濃度、白蛋白之濃度、腺苷之水準、R-2-羥基戊二酸之水準、丙酮酸之濃度、氧氣之濃度及/或氧化劑、還原劑或輔助因子之存在，以及將被視為在投予部位處或在作用部位處之 組織或器官處對於個體係在正常範圍內的其他條件。
如本文中所使用，「以基因方式修飾之細胞」包括含有外源性核酸之細胞，無論是否將該等外源性核酸整合至細胞之基因組中。
如本文中所使用之「多肽」可包括蛋白質分子之部分或完整蛋白質分子以及任何轉譯後或其他修飾。
如本文中所使用之假型化元件可包括：「結合多肽」，其包括識別且結合靶標宿主細胞之一或多種多肽(通常糖蛋白)；及一或多種「促融合多肽」，其介導反轉錄病毒與靶標宿主細胞膜融合，從而使反轉錄病毒基因組進入靶標宿主細胞。如本文中所使用之「結合多肽」亦可被稱為「T細胞及/或NK細胞結合多肽」或「靶標接合元件」，且「促融合多肽」亦可被稱為「促融合元件」。
「休眠」淋巴球(諸如，休眠T細胞)為細胞週期之並不表現活化標記(諸如Ki-67)之G0階段中之淋巴球。休眠淋巴球可包括從未接觸特異性抗原之原生T細胞及已由與抗原之先前接觸而更改之記憶T細胞。「休眠」淋巴球亦可被稱為「靜態」淋巴球。
如本文中所使用，「淋巴消耗」涉及(例如利用投予淋巴消耗試劑)減少個體中之淋巴球之數目的方法。部分身體或全身分級輻射療法亦可導致淋巴消耗。淋巴消耗試劑可為能夠在將其向哺乳動物投予時減少該哺乳動物中之功能性淋巴球之數目的化學化合物或組合物。此類試劑之一個實例為一或多種化學治療劑。此類試劑及劑量為已知的，且可視待治療之個體而定由治療醫師來選擇。淋巴消耗試劑之實例可包括(但不限於)氟達拉濱(fludarabine)、環磷醯胺、克拉屈濱(cladribine)、地尼介白素(denileukin diftitox)或其組合。
RNA干擾(RNAi)為一種生物學過程，在其中RNA分子藉由中和經靶標RNA分子來抑制基因表現或轉譯。RNA靶標可為mRNA，或其可為對RNAi之功能性抑制敏感之任何其他RNA。如本文中所使用，「抑制性RNA分子」係指其存在在細胞內產生RNAi且致使抑制性RNA分子靶向之轉錄物之表現降低的RNA分子。如本文中所使用之抑制性RNA分子具有能夠形成RNA雙螺旋之5’莖及3’莖。抑制性RNA分子可為(例如)miRNA(內源性或人工的)或shRNA、miRNA之前體(亦即Pri-miRNA或pre-miRNA)或shRNA、或作為經分離核酸直接轉錄或引入至細胞或個體之dsRNA。
如本文中所使用，「雙鏈RNA」或「dsRNA」或「RNA雙螺旋」係指由兩條鏈組成之RNA分子。雙鏈分子包括由雜交以形成雙螺旋RNA結構之兩條RNA鏈組成之彼等，或其自身摺疊以形成雙螺旋結構的單鏈RNA。大多數但未必的係，雙螺旋區中之所有鹼基為鹼基配對的。雙螺旋區包含與靶標RNA互補之序列。與靶標RNA互補之序列為反義序列，且通常為18至29、19至29、19至21或25至28個核苷酸長，或在一些實施例中在低端上為18、19、20、21、22、23、24、25個與高端上為21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個之間，其中給定範圍通常具有低於高端之低端。此類結構通常包括5’莖、環及由與各莖相鄰之環(其並非雙螺旋之部分)連接之3’莖。在某些實施例中，該環包含至少3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在其他實施例中，該環包含2至40、3至40、3至21或19至21個核苷酸；或在一些實施例中，在低端為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與高端為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40個之間，其中給定範圍通 常具有低於高端之低端。
如本文中所使用之術語「微小RNA側翼序列」係指包括微小RNA處理元件之核苷酸序列。微小RNA處理元件為有助於由前體微小RNA產生成熟微小RNA之最小核酸序列。此等元件通常位於側接微小RNA莖環結構之40個核苷酸序列之內。在一些情況下，在側接微小RNA莖環結構之長度在5與4,000個核苷酸之間的核苷酸序列之延伸內發現微小RNA處理元件。
術語「連接子」在用於提及多重抑制性RNA分子時係指加入兩個抑制性RNA分子之連接構件。
如本文中所使用，除非將其明確地指出為可複製反轉錄病毒，否則「重組反轉錄病毒」係指不可複製的或「非複製勝任型」反轉錄病毒。術語「重組反轉錄病毒」及「重組反轉錄病毒顆粒」在本文中互換地使用。此類反轉錄病毒/反轉錄病毒顆粒可為任何類型之反轉錄病毒顆粒，其包括(例如)γ反轉錄病毒及(在說明性實施例中)慢病毒。眾所周知，此類反轉錄病毒顆粒(例如慢病毒顆粒)通常係在封裝細胞中藉由用質粒(其包括諸如Gag、Pol及Rev之封裝組分)及包膜或假型化質粒(其編碼假型化元件)及轉移的、基因組的或反轉錄病毒(例如慢病毒)表現載體(該表現載體通常為在其上編碼基因或其他相關編碼序列之質粒)轉染該等封裝細胞來形成。因此，反轉錄病毒(例如慢病毒)表現載體包括在轉染至細胞中後促進表現及封裝之序列(例如，側接例如psi封裝元件及靶標異源編碼序列之5’LTR及3’LTR)。術語「慢病毒」及「慢病毒顆粒」在本文中互換地使用。
miRNA之「構架」由圍繞miRNA之「5’微小RNA側翼序列」及/或「3’微小RNA側翼序列」及(在一些情況下)將miRNA中之 莖環結構之莖隔開之環序列構成。在一些實例中，「構架」衍自天然存在之miRNA，諸如，miR-155。術語「5’微小RNA側翼序列」及「5’臂」在本文中互換地使用。術語「3’微小RNA側翼序列」及「3’臂」在本文中互換地使用。
如本文中所使用，術語「miRNA前體」係指可以酶促方式加工成miRNA之任何長度之RNA分子，諸如初級RNA轉錄物、pri-miRNA或pre-miRNA。
如本文中所使用，術語「構築體」係指經分離多肽或編碼多肽之經分離聚核苷酸。聚核苷酸構築體可編碼多肽，例如淋巴增殖性元件。技術人員將理解，構築體係指經分離聚核苷酸抑或經分離多肽，其視上下文而定。
應理解，本發明及本文提供之態樣及實施例並不限於所揭示之特定實例，因此當然可能有變化。亦應理解，本文中所使用之技術僅係出於揭示特定實例及實施例之目的，且並不意欲為限制性的，此係由於本發明之範疇將僅有隨附申請專利範圍所限定。
當提供值之範圍時，應理解，在該範圍之上限與下限之間的各中間值(除非上下文另外明確指示，否則為下限單位之十分之一)與該陳述範圍中之任何其他值或中間值均涵蓋在本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括在較小範圍中，且亦涵蓋在本發明內，該陳述範圍中之任何特異性排除之極限除外。當所陳述範圍包括極限之一個或兩個時，排除彼等所包括之極限之一個或兩個之範圍亦包括在本發明中。當針對範圍給定重疊的多個低值及多個高值時，熟習的技術者應認識到，所選擇範圍將包括低於高值之低值。本說明書中之所有標題均為易於閱讀起見，且並非為限制性的。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者所通常理解相同之含義。儘管類似於或等效於本文描述之彼等的任何方法亦可用於本發明之實踐或測試，但現在描述較佳的方法及材料。本文所提及之所有公開案均以引用之方式併入本文中以揭示及描述與所引用之公開案相關之方法及/或材料。
必須注意的係，除非上下文另外明確指示，否則如本文所使用及在隨附申請專利範圍中，單數形式「a」、「an」及「the」包括複數個指示物。因此，例如，提及「嵌合抗原受體」包括複數個此類嵌合抗原受體及熟習此項技術者已知之其等效物等。應進一步注意，申請專利範圍可能被設計成排除任何視情況可選用之要素。因此，此陳述意欲充當使用與申請專利範圍要素之引用相關之諸如「單獨」、「僅」及類似者之排他性術語或使用「陰性」限制的前提基礎。
應理解，為清楚起見在獨立實施例之上下文中描述之本發明之某些特徵亦可以組合方式提供於單個實施例中。相反地，為簡潔起見在單個實施例之上下文中描述之本發明之各種特徵亦可單獨提供或以任何適合的子組合方式提供。屬於本發明之實施例之所有組合均特異性地包涵在本發明中，且正如各組合及每一組合單獨及清楚地揭示一樣揭示於本文中。另外，各種實施例及其要素之所有子組合亦均特異性地包涵在本發明中，且正如各子組合及每一此類子組合單獨及清楚地揭示一樣揭示於本文中。
本發明藉由提供用於以基因方式修飾淋巴球(例如NK細胞，且在說明性實施例中，T細胞)之經改良方法及組合物來克服先 前技術挑戰。舉例而言，此等方法中之一些不包括預活化淋巴球，且此等方法中之一些在比先前方法更少的時間內執行。此外，提供具有許多用途(包括其在此等經改良方法中之用途)的組合物。此等組合物中之一些為以基因方式修飾之淋巴球，其具有經改良增殖及存活品質，包括在活體外培養時，例如在缺失生長因子之情況下。此等以基因方式修飾之淋巴球將具有例如以下的用途：作為研究工具，以更好的理解影響T細胞增殖及存活的因素；及商業生產，例如可經採集及測試或用於商業產品之某些因子(諸如生長因子及免疫調節劑)的生產。
本文提供之一些實施例為用於執行過繼性細胞療法之方法，其包括離體需要少許時間(例如，24小時、12小時或8小時或更少)轉導T細胞及/或NK細胞，且在一些實施例中不需要進行預先離體刺激。此等方法較佳適合於離體處理來自個體之血液的封閉系統，且可對於存在於與一些實施例相同之房間中之個體及/或在一些實施例中之個體在其血液或其經分離血細胞之其視線之內在執行該方法期間之所有時間內執行。更具體言之，本文中之揭示內容之態樣及實施例藉由提供用於轉導休眠T細胞及/或休眠NK細胞之方法克服了與目前過繼性細胞療法相關的問題，該等方法通常利用有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與休眠T細胞及/或休眠NK細胞結合及融合之假型化元件，以利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒有助於休眠T細胞及/或休眠NK細胞之基因修飾。此外，本文提供之方法藉由在說明性實施例中利用嵌合抗原受體及一或多個淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件克服了本領域之問題，該等淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之表現係在控制元件之控制下，使得個體暴露於結合控制元件之化 合物，或終止此類暴露促進體內經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之擴展。
由於本文中詳細揭示之此等及其他改良，在一個態樣中，本文中提供一種用於以基因方式修飾個體(諸如患有疾病或病症之患者)之休眠T細胞及/或休眠NK細胞之方法，其中收集來自個體之血液；休眠T細胞及/或NK細胞藉由使其與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸來以基因方式修飾；且通常在比先前技術方法中更短時間段(例如在24小時內及在一些非限制性實施例中為在12小時內)內且/或不進一步離體擴展經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之群而將經基因方式修飾之細胞再引入至個體中，例如使得經基因方式修飾之休眠T細胞及/或NK細胞並不經歷多於4次離體細胞分裂。因此，本文提供之方法可在比目前CAR療法短很多之時間內執行，從而提供個體可在離體步驟之整個時間內留在診所中的方法。此有助於在封閉系統中執行離體步驟，此降低了污染及混合患者樣本之機會且可更容易地由臨床實驗室執行。
因此，圖1及圖2提供用於本文提供之方法中之說明性組合物的示意性框圖。圖1提供封裝細胞(100)及由此類封裝細胞產生之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)的框圖。封裝細胞(100)包括併入至其基因組(其包括表現反轉錄病毒蛋白質之重組轉錄元件)中之重組聚核苷酸(110)及在可誘導啟動子(其由結合配位體且有配位體活化之反式活化子調節)之控制下的各種不同膜結合多肽。此等反式活化子、可誘導啟動子及配位體用於誘導依序表現及細胞膜結合多肽之積聚，該等細胞膜結合多肽將被併入至非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜以及為封裝及組裝非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒所 必需之反轉錄病毒組分中。
由於如下文中詳細論述之各種聚核苷酸之依序誘導表現，產生圖1中說明之說明性封裝細胞(100)，且可將該封裝細胞用於說明性方法以產生用於轉染本文提供之休眠T細胞及/或NK細胞(圖2中之(300))之方法中的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。在非限制性實施例中，封裝細胞(100)在其基因組中包括編碼可封裝反轉錄病毒RNA基因組之核酸，該可封裝反轉錄病毒RNA基因組包括為封裝及組裝非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(作為非限制性說明性實例，反轉錄病毒psi元件、反轉錄病毒gag多肽及反轉錄病毒pol多肽)所必需之反轉錄病毒基因組之元件中的至少一些。
與封裝細胞之細胞膜結合或締合之一些膜結合多肽將併入或締合至非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中，但並不由反轉錄病毒基因組編碼。舉例而言，封裝細胞及尤其形成之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括：反轉錄病毒Vpx多肽(250)，在非限制性實施例中其可表現為膜締合之融合蛋白質，例如Src-Flag-Vpx多肽；可包括結合多肽及促融合多肽之假型化元件(240)，在非限制性實施例中，其包括麻疹病毒凝血素(H)多肽及麻疹病毒融合(F)多肽、或其細胞質域缺失變體；視情況可選用之一或多個活化元件(210、220)，在非限制性實施例中，其包括能夠與CD3結合之膜結合多肽及能夠與CD28結合之膜結合多肽；及/或視情況選用之膜結合細胞介素(230)，其之非限制性實施例為包括融合於DAF或其片段之IL-7之融合多肽。本文中提供此等膜結合多肽之各種其他特異性類型。
作為藉由封裝細胞依序表現轉錄元件之結果，產生非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。變為非複製勝任型重組反轉錄病毒 顆粒之基因組之封裝細胞之基因組內且通常被整合至其中之RNA反轉錄病毒基因組包括為反轉錄病毒產生、感染及及整合至宿主細胞(其通常為休眠T細胞及/或NK細胞)之基因組中所必需的反轉錄病毒組分(作為非限制性說明性實施例，反轉錄病毒Gag及Pol聚核苷酸)。此外，反轉錄病毒基因組進一步包括編碼本文提供之一個或通常兩個工程化信號傳導多肽的聚核苷酸。工程化信號傳導多肽中之一者通常編碼至少一個淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件(在非限制性實例中，組成性介白素7受體突變)且其他工程化信號傳導多肽通常編碼嵌合抗原受體。
接著，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)用於以本文提供之方法來轉導休眠T細胞及/或休眠NK細胞(300)。如圖2所展示，在使休眠T細胞及/或NK細胞(300)與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)接觸之後，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上之上文所論述之膜多肽與休眠T細胞及/或NK細胞(300)之表面上之受體及/或配位體結合。舉例而言，如上文所指示可包括與休眠T細胞及/或休眠NK細胞之表面上之分子結合之結合多肽及促融合多肽之假型化元件有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)與T細胞及/或NK細胞膜之結合及融合。活化元件(210、220)藉由接合T細胞受體複合物(一種在接觸之時程中發生之過程或其後之培育物)來使休眠T細胞及/或NK細胞(300)活化。此外，膜結合細胞介素(230)可存在於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上，且結合休眠T細胞及/或NK細胞(300)之表面上之細胞介素受體(310)，從而進一步促進結合及活化。因此，不受理論限制，在本文提供之說明性實施例中，由於此等非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)組分中之一或多者，不需要利 用尚未在非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(200)中或上之元件之離體刺激或活化。此轉而幫助縮減完成本文提供之此等說明性方法中之方法所需的離體時間。
在與T細胞及/或NK細胞(200)結合後，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接著與T細胞及/或NK細胞(300)融合，且非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之多肽及核酸進入T細胞及/或NK細胞(300)。如上文所指示，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之此等多肽中之一者為Vpx多肽(250)。Vpx多肽(250)與降解細胞質中之游離dNTP之SAMHD1限制因子(350)結合且誘導其降解。因此，細胞質中之游離dNTP之濃度隨著Vpx降解SAMHD1而增加，且增加反轉錄活性，從而有助於反轉錄病毒基因組之反轉錄及整合至T細胞及/或NK細胞基因組中。
在將反轉錄病毒基因組整合至T細胞及/或NK細胞(200)中之後，T細胞及/或NK細胞基因組包括編碼信號傳導多肽(其編碼淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件(370))之核酸及視情況選用之編碼CAR(360)之信號傳導多肽。淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件及視情況選用之CAR之表現係在控制元件之控制下。暴露於結合控制元件之化合物中(此可藉由將該化合物投予轉導其T細胞及/或NK細胞(300)之個體中來在體外或體內發生)藉由表現淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件及視情況由於CAR之表現以及CAR與其靶細胞之結合來促進體外或體內中的T細胞及/或NK細胞(300)的增殖。因此，本文中用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導之T細胞及/或NK細胞具有驅動增殖及/或抑制細胞死亡(在說明性實施例中，此轉而避免在將經轉導T細胞及/或NK細胞返回個體中之前需要先前方法以使宿主淋巴消耗) 之一或多個信號。在說明性實施例中，此轉而進一步降低在將經轉導T細胞及/或NK細胞再引入至個體中之前處理所需天數。因此，在說明性實施例中，自個體採集血液至將血液再引入至個體所需時間不多於36小時、24小時、12小時，或在一些情況下甚至不多於8小時，此從根本上改變來自先前技術方法之CAR-T方法。此外，控制元件亦提供本文提供之安全性機制中之一者。舉例而言，停止投予化合物可下調或甚至終止淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件及視情況選用之CAR之表現，從而結束對於經轉導T細胞及/或NK細胞及其子代之增殖及/或存活信號。
用於轉導及/或以基因方式修飾淋巴球的方法
在某些態樣中，本文中提供一種轉導及/或以基因方式修飾周邊血單個核細胞(PBMC)或淋巴球，通常T細胞及/或NK細胞，且在某些說明性實施例中通常休眠T細胞及/或休眠NK細胞的方法，其包括使淋巴球與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒通常包含在其表面上之假型化元件，其中該接觸(及在接觸條件下之培育)有助於藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。該等假型化元件通常能夠結合休眠T細胞及/或NK細胞且可有助於其自身之膜融合或與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之其他蛋白質結合。
本文中(例如在此章節及例示性實施例章節中)提供用於轉導及/或以基因方式修飾PBMC、淋巴球、T細胞及/或NK細胞之此類方法態樣之各種元件或步驟，且如本文中進一步論述，此類方法包括貫穿此說明書所提供之實施例，舉例而言，例如為此章節中及例 示性實施例章節中之實例所提供的用於轉導及/或以基因方式修飾PBMC或淋巴球(例如NK細胞，或在說明性實施例中，T細胞)之態樣中之任一者的實施例可包括本文中所提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒的實施例中之任一者，包括包括以下之彼等：一或多個淋巴增殖性元件、CAR、假型化元件、核糖開關、活化元件、膜結合細胞介素、miRNA、Kozak型序列、WPRE元件、三重終止密碼子及或本文中所揭示之其他元件，且可與用於使用封裝細胞來產生反轉錄病毒顆粒的本文中之方法組合。在某些說明性實施例中，反轉錄病毒顆粒為慢病毒顆粒。用於以基因方式修飾及/或轉導PBMC或淋巴球(諸如T細胞及/或NK細胞)之此種方法可活體外或離體執行。技術人員將認識到，用於轉導及/或以基因方式修飾PBMC或淋巴球(諸如T細胞及/或NK細胞)的本文中所提供之細節可應用於包括此類步驟之任何態樣。
在某些說明性實施例中，在無需預先活體內、活體外或離體活化或刺激之情況下，以基因方式修飾及/或轉導細胞。在某些說明性實施例中，細胞在接觸期間活化，且在接觸之前完全不活化或活化超過15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時或8小時。在某些說明性實施例中，藉由不存在於反轉錄病毒顆粒表面上之元件的活化不需要以基因方式修飾及/或轉導細胞。因此，在接觸之前、期間或之後，除在反轉錄病毒顆粒上之外，不需要此類活化或刺激元件。因此，如本文中更詳細地論述，不需要預活化或刺激之此等說明性實施例提供快速執行旨在較佳理解T細胞及其中之生物機制之活體外實驗的能力。此外，此類方法提供對使用PBMC、淋巴球、T細胞或NK細胞所生產之生物產品之更有效的商業生產及此類商業生產方法之發 展。最終，此類方法提供針對過繼細胞療法更快速離體處理PBMC，例如藉由提供護理點方法來基本簡化此類療法之遞送。
本文中所提供的用於轉導之方法及/或用於以基因方式修飾之方法的接觸步驟通常包括初始步驟，其中反轉錄病毒顆粒(通常反轉錄病毒顆粒群體)在含懸浮液之液體緩衝液及/或介質中時與細胞(通常細胞群體)接觸以形成轉導反應混合物，隨後為在包括懸浮液中之反轉錄病毒顆粒及細胞的此反應混合物中的視情況選用之培育時段。可例如在適用於處理PMBC的封閉系統之腔室中進行接觸，如本文中更詳細論述。轉導反應混合物可包括一或多種緩衝液或離子，且在說明性實施例中包括培養介質，諸如此項技術中已知的用於涉及淋巴球之離體處理的彼等培養介質，如本文中之進一步詳述中所提供。
轉導反應混合物可在23℃與39℃之間，且在一些說明性實施例中在37℃下培育。在某些實施例中，轉導反應可在37℃至39℃下進行以供較快融合/轉導。當在轉導反應混合物中接觸時，細胞及反轉錄病毒顆粒可經立即處理以自細胞移除在懸浮液中保持游離且不與細胞相關聯之反轉錄病毒顆粒。視情況，將無論在懸浮液中游離抑或在懸浮液中與細胞相關聯的懸浮液中之細胞及反轉錄病毒顆粒培育不同時間長度，如本文中所提供以用於本文中所提供之方法中的接觸步驟中。在其他步驟之前，可進行洗滌，諸如用於轉導反應中之介質中的洗滌，而不管此類細胞是否將於活體外、離體研究或引入至個體中。
在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可進一步包括活化元件，該活化元件可為本文中所提供之任何活化元 件。在說明性實施例中，活化元件可為抗CD3，諸如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。
在一些實施例中，轉導及/或以基因方式修飾PBMC或淋巴球(通常T細胞及/或NK細胞)的本文中所提供之方法中之接觸步驟可進行(或可發生)1與24小時之間，例如1與12小時之間，或1與6小時之間。在一些說明性實施例中，接觸可進行少於24小時，例如少於12小時、少於8小時、少於4小時、少於2小時、少於1小時、少於30分鐘或少於15分鐘，但在各情況下，至少存在一個初始接觸步驟，其中反轉錄病毒顆粒與細胞在轉導反應混合物中之懸浮液中接觸。此類懸浮液可包括使細胞及反轉錄病毒顆粒沈降，或經由施加諸如離心力之力的造成容器或腔室底部之此類沈降。在此類初始接觸之後，可在不移除在溶液中保持游離且不與細胞相關聯之反轉錄病毒顆粒的情況下，存在於反應混合物(在反應混合物中懸浮液中含有細胞及反轉錄病毒顆粒)中進行額外視情況選用之培育。在說明性實施例中，接觸可進行(或發生)範圍之低端為30秒或1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘或45分鐘，或1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時或8小時與範圍之高端為10分鐘、15分鐘、30分鐘，或1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、18小時、24小時、36小時、48小時及72小時之間。在某些說明性實施例中，接觸步驟可進行範圍之低端為30秒、1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘或30分鐘與範圍之高端為1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時或12小時之間。在一些實施例中，接觸步驟進行範圍之高端為30秒、1分鐘及5分鐘與範圍之高端為10分鐘之間。在另一說明性實施例中，接觸僅在初始接觸步驟(不在包括在懸浮液中游離之反轉錄病毒顆粒 及懸浮液中之細胞的反應混合物中進行任何另外的培育)之間進行而不在反應混合物中進行任何另外的培育，或在反應混合物之進行5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘或1小時培育之間。
本文中所提供之對細胞之基因修飾及/或轉導的方法通常包括將包含編碼CAR或淋巴增殖性元件，或在說明性實施例中，編碼根據本文中所提供之CAR及淋巴增殖性元件實施例中之任一者之CAR及淋巴增殖性元件兩者的一或多個轉錄單元的聚核苷酸插入至細胞中。如本文中之實例中所說明，淋巴增殖性元件促進存活及/或增殖，其引起經基因方式修飾及/或經轉導之細胞在包括但不限於本文中所提供之實例中所提供之彼等的適當條件下的存活及/或擴展。因此，相較於在其經基因方式修飾及/或經轉導之前與經基因方式修飾及/或經轉導細胞相同之對照細胞，或在一些實施例中，相較於經與用以產生能夠提高存活或擴展的經基因方式修飾及/或經轉導細胞之重組反轉錄病毒顆粒相同的對照重組反轉錄病毒顆粒修飾及/或轉導的對照細胞，本文中用編碼CAR或CAR和淋巴增殖性元件兩者的一或多種核酸進行基因修飾的PBMC、淋巴球、NK細胞或T細胞在不存在一種或多種添加的細胞介素(諸如IL-2、IL-15或IL-7)或添加的淋巴球有絲分裂劑的情況下能夠、適用於、擁有以下特性和/或經修飾以供改善在培養介質中離體或活體外培養的存活或擴增，除對照反轉錄病毒顆粒不包含編碼CAR、淋巴增殖性元件或其胞內域，或CAR及淋巴增殖性元件或其胞內域兩者之轉錄單元以外。在活體外或離體進行之說明性實施例中，培養之對照細胞及條件經選擇以使得在此等條件下，該(該等)對照細胞之存活及/或增殖將藉由以下操作來促進：將該一或多種細胞介素(諸如IL-2、IL-15或IL-7)，或該淋巴球有絲分 裂劑添加至培養介質，儘管實際上並未針對比較而添加此類細胞介素或有絲分裂劑。
因此，在說明性實施例中，本文中用於以基因方式修飾及/或轉導的方法提供一種快速手段，該等手段藉由將核酸插入至細胞中提供新的功能性，該等核酸在表現時提供如本文中所論述之CAR及/或淋巴增殖性元件之功能。舉例而言，如本文中之實例中所提供，與對照細胞相比，此類細胞能夠在活體外及活體內更佳地存活及/或擴展，該等對照細胞與經基因方式修飾之細胞相同但不包含編碼淋巴增殖性元件及視情況選用之CAR的核酸。舉例而言，本文中之實例證實，與未經基因方式修飾之相同對照細胞相比，在接觸之後在培養物中前7天期間，經基因方式修飾以表現CAR或表現CAR及淋巴增殖性元件兩者之PBMC存活及/或增殖更多，其中培養在不存在任何所添加細胞介素(諸如但不限於IL-2、IL-15或IL-7)或所添加淋巴球有絲分裂劑的情況下進行。此外，此實例展示，與未經基因方式修飾之相同對照細胞相比，在此等條件下接觸之後，經基因方式修飾以表現CAR及淋巴增殖性元件之T細胞在第7天與第14天或第21天之間具有增加之存活。事實上，相較於經基因方式修飾以表現CAR而非淋巴增殖性元件之相同細胞，在此等條件下接觸之後，經基因方式修飾以表現CAR(例如，抗CD19 CAR)及驅動子(如針對本文中所識別之大量驅動子所例示)之T細胞在第7天與第21天之間具有增加之存活特性。
在某些實施例中，相較於與在其經基因方式修飾及/或經轉導之前經基因方式修飾及/或經轉導細胞相同的對照細胞，經基因方式修飾及/或經轉導之細胞在不存在任何外源添加之T細胞刺激劑(例如，IL-2、IL-7、IL-15、抗CD3或抗CD28)或其他外源添加之 淋巴球有絲分裂劑的情況下呈現出、能夠、適用於、擁有以下特性或經修飾以供改善介質中之擴展。在某些實施例中，在不存在外源添加之細胞介素、不存在藉由視情況選用之由反轉錄病毒顆粒之基因組編碼的CAR結合之抗原及/或不存在淋巴球有絲分裂劑的情況下，與在接觸後離體培養的第3天與第6天之間的對照細胞相比，經基因方式修飾之細胞呈現出、能夠、適用於、擁有以下特性或經修飾以更佳的擴展。在某些實施例中，在不存在外源添加之細胞介素及不存在藉由視情況選用之由反轉錄病毒顆粒之基因組編碼的CAR結合之抗原的情況下，經基因方式修飾之細胞在接觸後離體培養的第3天與第6天之間呈現出、能夠、適用於、擁有以下特性或經修飾以供擴展至少兩倍。
舉例而言，當細胞及反轉錄病毒顆粒最初與反轉錄病毒顆粒(包括含懸浮液之介質中之反轉錄病毒顆粒及細胞)接觸時或其後在視情況選用之培育時段期間與其接觸時，可包括於接觸步驟中之介質或可在細胞培養期間及/或在各種洗滌步驟期間使用之介質可包括基底介質，諸如用於離體T細胞及/或NK細胞培養的市售可得之介質。此類介質之非限制性實例包括：X-VIVOTM 15化學上定義之無血清造血細胞介質(Lonza)(2018目錄號BE02-060F、BE02-00Q、BE-02-061Q、04-744Q或04-418Q)、ImmunoCultTM-XF T細胞擴展介質(STEMCELL Technologies)(2018目錄號10981)、PRIME-XV® T細胞擴展XSFM(Irvine Scientific)(2018目錄號91141)、AIM V®介質CTSTM(Therapeutic Grade)(Thermo Fisher Scientific(本文中稱為「Thermo Fisher」)或CTSTM OptimizerTM介質(Thermo Fisher)(2018目錄號A10221-01(基底介質(瓶))及A10484-02(補充物)、A10221-03(基底介質(袋))、A1048501(基底介質及補充物套組(瓶))以及A1048503(基底 介質及補充物套組(袋))。此類介質可為遵照cGMP製造之化學上定義之無血清調配物。介質可為無異源的及且完整的。在一些實施例中，基底介質已由管理機構清除，以用於離體細胞處理，諸如FDA 510(k)清楚器件。在一些實施例中，介質為具有或不具有均可獲自Thermo Fisher(Waltham,MA)之2018目錄號A1048501(CTSTM OpTmizerTM T細胞擴展SFM，瓶型式)或A1048503(CTSTM OpTmizerTM T細胞擴展SFM，袋型式)之經補充T細胞擴展補充物的基底介質。可將諸如人類血清白蛋白、人類AB+血清及/或源自個體之血清的添加劑添加至轉導反應混合物。可將支援性細胞介素添加至轉導反應混合物，該等支援性細胞介素諸如IL2、IL7或IL15或發現於人類血清中之彼等。可將dGTP添加至某些實施例中之轉導反應物中。
在此類方法之例示性實施例中，能夠將經基因方式修飾之T細胞或NK細胞活體內移植於小鼠中及/或活體內富集於小鼠中至少7天、14天或28天。技術人員將認識到，此類小鼠可經治療或以其他方式經基因方式修飾，使得在經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之間的任何免疫學差異並不導致小鼠針對藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導之淋巴球之任何組分所引發的免疫反應。
封裝細胞(且在說明性實施例中，封裝細胞株，且在特定說明性實施例中，本文中某些態樣中所提供之封裝細胞)用以產生非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。在一些實施例中，封裝細胞株可為懸浮細胞株。在說明性實施例中，封裝細胞株可在無血清介質中生長。在一些實施例中，淋巴球可來自個體。在說明性實施例中，淋巴球可來自個體之血液。
因此，在一個態樣中，本文中提供一種用於轉導(及/ 或以基因方式修飾)淋巴球(一般來自經分離血液之休眠T細胞及/或休眠NK細胞)之方法，該方法包含：A. 自個體收集血液；B. 分離包含休眠T細胞及/或休眠NK細胞之周邊血單核細胞(PBMC)；及C. 使個體之休眠T細胞及/或休眠NK細胞與非複製型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸，其中非複製型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之能夠結合休眠T細胞及/或休眠NK細胞且有助於非複製型重組反轉錄病毒顆粒與其之膜融合的假型化元件，其中該接觸有助於利用非複製型重組反轉錄病毒顆粒轉導至少5%之休眠T細胞及/或休眠NK細胞，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，從而轉導休眠T細胞及/或NK細胞。
在包括轉導T細胞及/或NK細胞之步驟的本文中之任何方法的一些實施例中，可使細胞在無需預先活化之情況下與反轉錄病毒顆粒接觸。在包括轉導T細胞及/或NK細胞之步驟的本文中之任何方法的一些實施例中，在轉導之前，在黏著於單核球之基質上培育T細胞及/或NK細胞在一個實施例中多於4小時，或在另一實施例中多於6小時，或在又一實施例中多於8小時。在一個說明性實施例中，在轉導之前，在黏著物基質上培育T細胞及/或NK細胞隔夜以移除單核球。在另一實施例中，該方法可包括，在轉導之前在結合單核球之黏著物基質上培育T細胞及/或NK細胞不多於30分鐘、1小時或2小時。在另一實施例中，在該轉導步驟之前，T細胞及/或NK細胞不暴露於藉由在黏著物基質上培育來移除單核球的步驟。在另一實施例中，在轉導之前或在轉導期間，T細胞及/或NK細胞並不與牛血清(諸如細胞 培養牛血清，例如胎牛血清)一起培育或不暴露於其中。
因此，在另一態樣中，本文中提供一種用於以基因方式修飾或轉導個體之淋巴球(在說明性實施例中，T細胞及/或NK細胞，或T細胞及/或NK細胞群)的方法，該方法包括使一般個體之T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸，該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其基因組中包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標的兩個或更多個抑制性RNA分子，且該一或多個核酸序列中之第二核酸序列編碼包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域的嵌合抗原受體(CAR)，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞或休眠T細胞及/或NK細胞中之至少一些，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
在另一態樣中，本文中提供一種用於以基因方式修飾或轉導個體之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或其群的方法，該方法包括使個體之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或其群與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸，該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其基因組中包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標的一或多個(例如兩個或更多個)抑制性RNA分子，且該一或多個核酸序列中之第二核酸序列編碼包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域的嵌合抗原受體(CAR)，其中該接觸有 助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒基因修飾及/或轉導淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)中之至少一些，從而產生經基因方式修飾及/或經轉導之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)。
在緊接著上文提供之方法之一些實施例中，將經基因方式修飾及/或經轉導之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或其群引入至個體中。在一些實施例中，經基因方式修飾及/或經轉導之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或其群在引入或再引入至個體中之前，離體進行4次或更少之細胞分裂。在一些實施例中，淋巴球為與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸1小時與12小時之間的休眠T細胞及/或休眠NK細胞。在一些實施例中，自個體收集血液之時間與將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞再引入至個體中之時間之間不多於8小時。在一些實施例中，在收集血液之後及再引入血液之前的所有步驟均在封閉系統中執行，在整個處理期間人監測該封閉系統。
在緊接著上文所提供之包括聚核苷酸之方法態樣的任一者中，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標的一或多個(例如兩個或更多個)抑制性RNA分子，且該一或多個核酸序列中之第二核酸序列編碼包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域的嵌合抗原受體(CAR)，該聚核苷酸可進一步包括編碼不為抑制性RNA分子之至少一個淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件的第三核酸序列。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為細胞介素或細胞介素受體多肽，或其包含信號傳導域之片段。在一些實施例中，淋巴增殖性 元件淋巴增殖性元件為組成性活性。在某些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為IL-7受體或其片段。在說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為組成性活性IL-7受體或其組成性活性片段。
在緊接著上文提供之包括聚核苷酸之方法態樣中之任一者中，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，抑制性RNA分子在一些實施例中可包括與彼此部分或完全互補之5’鏈及3’鏈，其中該5’鏈及該3’鏈能夠形成18至25個核苷酸RNA雙螺旋。在一些實施例中，5’鏈長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸，且3’鏈長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，5’鏈及3’鏈長度可相同或不同。在一些實施例中，RNA雙螺旋可包括一或多個錯配。在替代實施例中，RNA雙螺旋不具有錯配。
在緊接著上文提供之包括聚核苷酸之方法態樣中之任一者中，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，抑制性RNA分子可為miRNA或shRNA。在一些實施例中，抑制性分子可為miRNA之前體，諸如Pri-miRNA或Pre-miRNA，或shRNA的前體。在一些實施例中，抑制性分子可為人工衍生之miRNA或shRNA。在其他實施例中，抑制性RNA分子可為經處理成siRNA之dsRNA(經轉錄或人工引入)或siRNA本身。在一些 實施例中，抑制性RNA分子可為miRNA或shRNA，其具有在自然界中未發現之序列，或具有在自然界中未發現之至少一個功能片段，或具有在自然界中未發現之功能區段的組合。在說明性實施例中，抑制性RNA分子中之至少一者或全部為miR-155。
在緊接著上文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之方法態樣中之任一者中，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或多個)抑制性RNA分子，在一些實施例中，抑制性RNA分子可自5’至3’定向包含：5’臂、5’莖、環、與該5’莖部分或完全互補之3’莖，及3’臂。在一些實施例中，該兩個或更多個抑制性RNA分子中之至少一者具有此排列。在其他實施例中，所有該兩個或更多個抑制性RNA分子皆具有此排列。在一些實施例中，5’莖長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，3’莖長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，環長度可為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸。在一些實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自天然存在之miRNA。在一些實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自天然存在之miRNA，該miRNA選自由以下組成之群：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在說明性實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自miR-155。在一些實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自小家鼠miR-155或智人miR-155。在一些實施例中，5’-臂具有SEQ ID NO：256中所闡述之序列或為其功能性變體，諸如與SEQ ID NO：256長 度相同，或為SEQ ID NO：256之長度的95%、90%、85%、80%、75%，或50%，或為100個核苷酸或更少、95個核苷酸或更少、90個核苷酸或更少、85個核苷酸或更少、80個核苷酸或更少、75個核苷酸或更少、70個核苷酸或更少、45個核苷酸或更少、40個核苷酸或更少、35個核苷酸或更少、30個核苷酸或更少、或25個核苷酸或更少的序列；且與SEQ ID NO：256至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致。在一些實施例中，3’臂具有闡述於SEQ ID NO：260中之序列或其功能性變體，諸如與SEQ ID NO：260長度相同，或為SEQ ID NO：260之長度的95%、90%、85%、80%、75%，或50%，或為100個核苷酸或更少、95個核苷酸或更少、90個核苷酸或更少、85個核苷酸或更少、80個核苷酸或更少、75個核苷酸或更少、70個核苷酸或更少、65個核苷酸或更少、60個核苷酸或更少、55個核苷酸或更少、50個核苷酸或更少、45個核苷酸或更少、40個核苷酸或更少、35個核苷酸或更少、30個核苷酸或更少，或25個核苷酸或更少的序列；且與SEQ ID NO：260至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致。在一些實施例中，3’臂包含小家鼠BIC之核苷酸221至283。
在緊接著上文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之方法態樣中之任一者中，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之兩個或更多個抑制性RNA分子，在一些實施例中，該兩個或更多個抑制性RNA分子可連續地位於第一核酸序列中。在一些實施例中，抑制性RNA分子可利用非功能性連接子序列直接或間接地與彼此連接。在一些實施例中，連接子序列長度可 在5個與120個核苷酸之間，或長度在10個與40個核苷酸之間。
在緊接著上文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之方法態樣中之任一者中，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之兩個或更多個抑制性RNA分子，在一些實施例中，該第一核酸序列編碼兩個至四個抑制性RNA分子。在說明性實施例中，第一核酸序列中包括2個與10個之間、2個與8個之間、2個與6個之間、2個與5個之間、2個與4個之間、3個與5個之間或3個與6個之間的抑制性RNA分子。在一說明性實施例中，第一核酸序列中包括四個抑制性RNA分子。
在緊接著上文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之方法態樣中之任一者中，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如兩個或更多個)抑制性RNA分子，該一或多個(例如兩個或更多個)抑制性RNA分子可處於內含子中。在一些實施例中，內含子在啟動子中。在說明性實施例中，內含子為EF-1α內含子A。在一些實施例中，內含子與啟動子相鄰且在啟動子下游，在說明性實施例中，該內含子在用於產生非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之封裝細胞中為無活性的。
在緊接著上文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之方法態樣中之任一者中，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之兩個或更多個抑制性RNA分子，在一些實施例中，該兩個或更多個抑制性RNA分子可針對不同靶標。在 一替代實施例中，兩個或更多個抑制性RNA分子針對同一靶標。在一些實施例中，RNA靶標為自由T細胞表現之基因轉錄之mRNA，該等mRNA諸如(但不限於)：PD-1(防止失活)；CTLA4(防止失活)；TCRa(安全地防止自體免疫)；TCRb(安全-防止自體免疫)；CD3Z(安全-防止自體免疫)；SOCS1(防止失活)；SMAD2(防止失活)；miR-155靶標(促進活化)；IFN γ(減少CRS)；cCBL(延長信號傳導)；TRAIL2(防止死亡)；PP2A(延長信號傳導)；ABCG1(藉由限制膽固醇之清除來增加膽固醇微含量)。在一些實施例中，RNA靶標為自編碼T細胞受體(TCR)複合物之組分之基因轉錄之mRNA。在一些實施例中，兩個或更多個抑制性RNA分子中之至少一者可減少T細胞受體(在說明性實施例中，T細胞之一或多個內源性T細胞受體)之表現。在某些實施例中，RNA靶標可為自T細胞之內源性TCRα或TCRβ基因轉錄之mRNA，該T細胞之基因組包含編碼一或多個miRNA之第一核酸序列。在說明性實施例中，RNA靶標為自TCRα基因轉錄之mRNA。
在緊接著上文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之方法態樣中之任一者中，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如兩個或更多個)抑制性RNA分子，且該一或多個核酸序列中之第二核酸序列編碼包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域的嵌合抗原受體(CAR)，在一些實施例中，CAR為受微環境限制之生物(MRB)-CAR。在其他實施例中，CAR之ASTR與腫瘤相關之抗原結合。在其他實施例中，CAR之ASTR為微環境受限之生物(MRB)-ASTR。在本文中所揭示之包含MRB-ASTR或MRB-CAR的態樣及實施例中之任一者中， MRB-ASTR在某些異常條件下較佳地或僅結合其同源抗原，諸如存在於腫瘤微環境中之彼等。在腫瘤微環境之異常條件下較佳或唯一結合的MRB-ASTR可提供減少的靶向腫瘤外效應(on-target off-tumor effect)，此係因為在正常生理條件下與抗原之結合減少，在某些情況下減少至低於藉由免疫分析檢測之水準。正常生理條件可包括針對個體而言被認為在給藥位點或在作用位點之組織或器官處之正常範圍內的溫度、pH、滲透壓、重量莫耳滲透濃度、氧化應力及電解質濃度之彼等。異常條件為偏離正常可接受範圍之條件。在一些實施例中，MRB-ASTR在正常條件下可逆或不可逆地失活。如本文中所使用，MRB-ASTR可為抗體、抗原、配位體、配位體之受體結合域、受體、受體之配位體結合域或親和體。在其中MRB-ASTR為抗體的實施例中，MRB-ASTR可為全長抗體、單鏈抗體、Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段、二價單鏈抗體或雙抗體，其中ASTR包含來自抗體之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，MRB-ASTR為單鏈可變片段。
在緊接著上文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之方法態樣中之任一者中，其中該一或多個核酸序列中之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如兩個或更多個)抑制性RNA分子，且該一或多個核酸序列中之第二核酸序列編碼包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域的嵌合抗原受體(CAR)，且在一些情況下，該一或多個核酸序列中之第三核酸序列編碼不為抑制性RNA分子之至少一個淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件，在一些實施例中，該第一核酸序列、該第二核酸序列及該第三核酸序列中之任一者或所有可操作地連接至核糖開關。在一些實施例中，核糖開關能 夠結合核苷類似物。在一些實施例中，核苷類似物為抗病毒藥物。
在一些實施例中，提供方法以用於藉由使細胞與本文中揭示之反轉錄病毒顆粒及呈25ng/ml至200ng/ml、50ng/ml至150ng/ml、75ng/ml至125ng/ml或100ng/ml之可溶性抗CD3抗體接觸來活化及/或以基因方式修飾且通常轉導休眠T細胞或NK細胞(在說明性實施例中，休眠T細胞)。在說明性實施例中，此等方法在無需預先活化之情況下執行，且可進行例如8小時或更少，4小時或更少，或2小時與8小時、2小時與4小時之間，或2小時與3小時之間。
在某些態樣中，本文提供用於對於個體執行過繼性細胞療法之方法，作為一說明性實例，該方法可包括以下：A. 自個體收集血液；B. 分離包含休眠T細胞及/或休眠NK細胞之周邊血單核細胞(PBMC)；C. 使個體之休眠T細胞及/或休眠NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之能夠結合休眠T細胞及/或NK細胞且有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與其之膜融合的假型化元件，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；及D. 在自個體採集血液之36小時、24小時、12小時或甚至8小時內，將經基因方式修飾之細胞再引入至個體中，從而在個體中執行過繼性細胞療法。
本文提供之一些態樣中，具有類似步驟之方法被稱為 用於以基因方式修飾及擴展個體之淋巴球的方法。熟練的業內人士應理解，本文中之論述在其應用於執行過繼性細胞療法之方法及組合物時亦應用於以基因方式修飾且擴展個體之淋巴球的方法。
通常，本發明之過繼性細胞療法係利用自體性轉移來進行，其中細胞經分離及/或以另外方式自接受細胞療法之個體或自衍自此類個體之樣本來製備。因此，在一些態樣中，細胞係衍自需要治療之個體(例如，患者)及在給與相同個體分離及處理之後的細胞。在本文揭示之方法及組合物之一些實施例中，患有疾病或病症之個體進入使用已知方法(諸如靜脈穿刺)抽取個體之血液的醫療機構中。在某些實施例中，自個體抽取之血液之體積在範圍之低端為10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、50ml、75ml或100ml與範圍之高端為200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、500ml、750ml、1000ml、2000ml或2500ml之間。在一些實施例中，自個體抽取10ml與400ml之間的血液。在一些實施例中，自個體抽取20ml與250ml之間的血液。在一些實施例中，血液在處理時為新鮮的。在本文所揭示之實施例中之任一者中，新鮮血液可為自之前少於15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、150分鐘或180分鐘之個體抽取的血液。在一些實施例中，以本文提供之方法處理血液而不儲存。
T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之間的接觸通常有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導T細胞及/或NK細胞。貫穿本發明中經轉導T細胞及/或NK細胞包括離體經轉導細胞之保持在離體轉導期間被併入至細胞中之核酸或聚核苷酸中之至少一些的子代。在引用「再引入」經轉導細胞之本文中之方法中，應理解，此類細胞在其自個體之血液收集時通常並不處 於經轉導狀態。本文揭示之態樣中之任一者中之個體可為(例如)動物、哺乳動物及在說明性實施例中人類。
不受理論限制，在非限制性說明性方法中，將編碼淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之聚核苷酸(諸如IL7組成性活性突變體)(其可整合至T細胞及/或NK細胞之基因組中)離體遞送至休眠T細胞及/或NK細胞提供了具有用於體內擴展之驅動子的細胞而無需使宿主淋巴消耗。因此，在說明性實施例中，個體在執行接觸之1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天內或1個月、2個月、3個月或6個月內，接觸期間及/或在將經修飾之T細胞及/或NK細胞再引回至個體後之1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天內或1個月、2個月、3個月或6個月內並不暴露於淋巴消耗試劑中。此外，在非限制性實施例中，可執行本文提供之方法而不在其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與個體之休眠T細胞及/或NK細胞接觸之步驟期間或在整個離體方法期間使個體暴露於淋巴消耗試劑中。
因此，活體內擴展個體中之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞為本發明之一些實施例的特徵。在說明性實施例中，此等方法為離體無傳播的或基本上無傳播的。
在本文之非限制性說明性實施例中，自個體抽取血液至離體轉導T細胞及/或NK細胞後將血液再引入回至個體之此整個方法/過程可在以下時間段內發生：少於48小時、少於36小時、少於24小時、少於12小時、少於11小時、少於10小時、少於9小時、少於8小時、少於7小時、少於6小時、少於5小時、少於4小時、少於3小時、2小時或少於2小時。在其他實施例中，自個體抽取/收集血液至離體 轉導(在本文之非限制性說明性實施例中)T細胞及/或NK細胞後將血液再引入回至個體之此整個方法/過程在以下時間段內發生：1小時與12小時之間、或2小時與8小時之間、或1小時與3小時之間、或2小時與4小時之間、或2小時與6小時之間、或4小時與12小時之間、或4小時與24小時之間、或8小時與24小時之間、或8小時與36小時之間、或8小時與48小時之間、或12小時與24小時之間、或12小時與36小時之間、或12小時與48小時之間；或在以下時間段內發生：在範圍之低端為15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、180分鐘及240分鐘與範圍之高端為120分鐘、180分鐘、及240分鐘、300分鐘、360分鐘、420分鐘及480分鐘之間。在其他實施例中，自個體抽取/收集血液至離體轉導T細胞及/或NK細胞後將血液再引入回至個體之此整個方法/過程在以下時間段內發生：在範圍之低端為1小時、2小時、3小時、4小時、6小時、8小時、10小時及12小時與範圍之高端為8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時或48小時之間。在一些實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞係在發生接觸之時間段後自非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒分離。
在本文中之任何方法(其包括血液收集之步驟及轉導淋巴球(在說明性實施例中，T細胞及/或NK細胞，包括休眠T細胞及NK細胞)之步驟)之一些實施例中，自血液收集至轉導T細胞及/或NK細胞之方法並不包括藉由在黏著物基質上培育在一個實施例中多於4小時、或在另一實施例中多於6小時或在又一實施例中多於8小時來移除單核球的步驟。在一個說明性實施例中，自血液收集至轉導T細胞及/或NK細胞之方法並不包括在黏著物基質上隔夜培育以移除單核球。在另一實施例中，自血液收集至轉導T細胞及/或NK細胞之方法 包括藉由在黏著物基質上培育不多於30分鐘、1小時或2小時來移除單核球的步驟。在另一實施例中，自個體進行血液收集至轉導淋巴球(在說明性實施例中，T細胞及/或NK細胞，包括休眠T細胞及/或NK細胞)的方法不包括藉由在黏著物基質上培育移除單核球的步驟。在另一實施例中，自個體進行血液收集至轉導淋巴球(在說明性實施例中，T細胞及/或NK細胞，包括休眠T細胞及/或NK細胞)的方法包括，該方法期間T細胞及/或NK細胞不與牛血清(諸如細胞培養牛血清，例如胎牛血清)一起培育或不暴露於其中。
在本文中之任何方法(其包括血液收集之步驟及轉導淋巴球(在說明性實施例中，T細胞及/或NK細胞，包括休眠T細胞及NK細胞)之步驟)之一些實施例中，自個體進行血液收集至再引入T細胞及/或NK細胞至個體中之方法並不包括藉由在黏著物基質上培育在一個實施例中超過4小時、或在另一實施例中多於6小時或在又一實施例中多於8小時來移除單核球的步驟。在一個說明性實施例中，自個體進行血液收集至再引入T細胞及/或NK細胞至個體中之方法並不包括在黏著物基質上培育隔夜以移除單核球。在另一實施例中，自個體進行血液收集至再引入T細胞及/或NK細胞之方法包括藉由在黏著物基質上培育不多於30分鐘、1小時或2小時來移除單核球的步驟。在另一實施例中，自個體進行血液收集至再引入T細胞及/或NK細胞至個體中之方法並不包括藉由在黏著物基質上培育隔夜來移除單核球的步驟。在另一實施例中，自個體進行血液收集至再引入T細胞及/或NK細胞至個體中之方法，在該方法期間T細胞及/或NK細胞並不與牛血清(諸如細胞培養牛血清，例如胎牛血清)一起培育或並不暴露於其中。
因為本文提供之用於過繼性細胞療法之方法，及用於在活體內擴展T細胞及/或NK細胞之前離體修飾休眠該等T細胞及/或NK細胞的相關方法，可以顯著短於先前方法之時間來執行，使得患者護理及安全性以及產品製造性的基本改良成為可能。因此，在負責於批准在活體內進行用於治療性目的時之此類方法的法規機構看來，此類方法預期係有利的。舉例而言，在非限制性實例中，在經修飾之T細胞及/或NK細胞再引入至患者中之前，在樣本處理之整個時間，個體可留在與處理其血液或樣本之機構之相同建築(例如輸注診所)或房間中。在非限制性說明性實施例中，在自個體進行血液抽取/收集至離體轉導T細胞及/或NK細胞後將血液再引入至個體的整個方法/過程中，個體保持在位置線內及/或其正被處理之血液或細胞之100、50、25或12呎或臂之距離內。在其他非限制性說明性實施例中，在自個體進行血液抽取/收集至離體轉導T細胞及/或NK細胞後將血液再引入至個體的整個方法/過程中及/或連續地，個體保持清醒及/或至少一個人可繼續監測個體之正被處理之血液或細胞。因為本文提供之改良，用於過繼性細胞療法及/或轉導休眠T細胞及/或NK細胞之自個體進行血液抽取/收集至離體轉導T細胞及/或NK細胞後將血液再引入至個體的整個方法/過程，可與人類之連續監測一起執行。在其他非限制性說明性實施例中，在自個體進行血液抽取/收集至離體轉導T細胞及/或NK細胞後將血液再引入至個體的整個方法/過程之任何點處，均不會將血液細胞培育在無個人存在之房間中。在其他非限制性說明性實施例中，自個體進行血液抽取/收集至離體轉導T細胞及/或NK細胞後將血液再引入至個體的整個方法/過程係緊挨著個體及/或在與個體相同之房間中及/或緊接著個體之床或椅子上執行。因此， 可避免樣本一致性混亂，以及避免超過數天或數週之長且昂貴的培育。本文提供之方法容易地適用於封閉及自動化血液處理系統之事實進一步證實此優點，其中將再引入至個體中之血液樣本及其組分僅與單次、一次性使用之組分進行接觸。
用於執行本文提供之過繼性細胞療法之方法一般包括1)轉導淋巴球(諸如T細胞及/或NK細胞，其在說明性實施例中為休眠T細胞及/或NK細胞)之方法，及/或包括2)用於以基因方式修飾淋巴球(諸如T細胞及/或NK細胞，其在說明性實施例中為休眠T細胞及/或NK細胞)之方法，其兩者(1及2)自身各自形成本發明之不同態樣。此類方法可在具有或不具有在本文中經識別用於執行過繼性細胞療法之其他步驟之情況下來執行。在用於過繼性細胞療法之方法及本文中提供之包括離體轉導休眠T細胞及/或休眠NK細胞的任何方法中，通常在將細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之前，自血細胞分離出嗜中性細胞/粒細胞。在一些實施例中，使用例如血球分離術及/或密度梯度離心法，自血液樣本之其他組分分離出包括周邊血淋巴球(PBL)(諸如T細胞及/或NK細胞)之周邊血單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，在PBMC及/或T細胞及/或NK細胞被處理、與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸、轉導或轉染之前，移除嗜中性細胞。關於待治療之個體，細胞可為異體性及/或自體性的。
作為非限制性實例，在本文中用於轉導或以基因方式修飾之方法的一些實施例中，使用Sepax或Sepax 2細胞處理系統(BioSafe)分離PBMC。在一些實施例中，使用CliniMACS Prodigy細胞處理器(Miltenyi Biotec)分離PBMC。在一些實施例中，使用自動血球分離器，自個體採集血液，使血液穿過挑選出周邊細胞類型(諸如， PBMC)之裝置，且使剩餘部分返回至個體中。密度梯度離心可在血球分離之後執行。在一些實施例中，使用去除白血球的過濾器器件分離PBMC。在一些實施例中，接著使用磁珠活化細胞分類術以根據細胞表型(亦即陽性選擇)來純化來自PBMC(諸如，PBL或其子集)之特異性細胞群。亦可使用用於純化之其他方法，諸如，基質黏著，其利用模擬T細胞在補充期間遭遇之環境的基質，從而使其黏著及遷移，或陰性選擇，其中不需要之細胞利用抗體複合物(靶向不需要之細胞)來移除。在一些實施例中，紅細胞玫瑰花結術可用於純化細胞。
在本文中之相關態樣之任一者之一些說明性實施例中，PBL包括T細胞及/或NK細胞。在本文中之某些實施例期間，例如在修飾淋巴球之方法及執行過繼性細胞療法之方法中，與本發明之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之T細胞及/或NK細胞主要為休眠T細胞。在一些實施例中，T細胞及/或NK細胞包含95%與100%之間的休眠細胞(Ki-67-)。在一些實施例中，與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之T細胞及/或NK細胞包括在範圍之低端為90%、91%、92%、93%、94%及95%休眠細胞與範圍之高端為96%、97%、98%、99%或100%休眠細胞之間。在一些實施例中，T細胞及/或NK細胞包括原生細胞。
在本文揭示之方法及組合物之一些實施例中，T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸以以基因方式修飾T細胞及/或NK細胞，以在再引入至個體中時在個體中引起靶向免疫反應。在接觸時段期間，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒識別T細胞及/或NK細胞且與T細胞及/或NK細胞結合，此時反轉錄病毒與宿主細胞膜開始融合。接著，經由轉導程序，來自非複製勝任 型重組反轉錄病毒顆粒之基因材料進入T細胞及/或NK細胞，且併入至宿主細胞DNA中。慢病毒轉導之方法為已知的。例示性方法描述於例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9)：689-701，Cooper等人(2003)Blood.101：1637-1644，Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506：97-114，及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2)：497-505中。
本文提供之方法中之許多方法包括轉導T細胞及/或NK細胞。在此項技術中已知用於離體用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(諸如非複製勝任型重組慢病毒顆粒)轉導T細胞及/或NK細胞的方法。在說明性實施例中，本文中提供之方法並不需要離體刺激或活化。因此，在本方法中可避免先前方法中之此常規步驟，但在轉導期間可存在離體刺激性分子(諸如抗CD3及/或抗CD28珠粒)。然而，利用本文提供之說明性方法，不需要離體刺激。在某些例示性方法中，可使用在3重與10重感染(MOI)之間，且在一些實施例中，在5 MOI與10 MOI之間的單位的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，例如慢病毒。
轉導反應可在封閉系統(諸如如本文所論述之Sepax系統)中進行，其中轉導反應可在該系統上裝載之一次性袋子中進行。一旦自粒細胞(包括嗜中性細胞)分開、分離及/或純化出自個體收集之血液樣本之血細胞(諸如PBMC)，此等血液細胞可與本文揭示之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在袋子中接觸，該等粒細胞在接觸步驟(亦即轉導反應)期間通常不存在。
非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可再引入至含有經分離PBMC之袋中，從而接觸PBMC。自個體收集血液之時間至將血細胞(諸如PBMC)添加至轉導反應袋之時間可在30分鐘與4小時之 間、在30分鐘與2小時之間，或在一些實例中大約1小時。
在其中將細胞輸注至個體中之某些實施例中，在轉導後，在將經轉導T細胞及/或NK細胞輸注回至個體中之前，洗滌細胞以在輸注回至個體中之前移除轉導反應混合物。舉例而言，在將經轉導之細胞輸注回個體之前，系統(諸如Sepax儀器)可用於例如用10ml至50ml之洗滌溶液來洗滌細胞。在一些實施例中，在PBMC及/或T細胞及/或NK細胞經處理、與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸、轉導或轉染之前，移除嗜中性細胞。
在用於執行過繼性細胞療法之一說明性實施例中，將血液自個體收集至血袋中，且將該血袋連接至細胞處理系統，諸如Sepax細胞處理系統。將使用細胞處理系統分離之PBMC收集至袋子中，使該等PBMC與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在足以轉導T細胞及/或NK細胞之條件下接觸，並對其進行培育。在培育之後，將含有PBMC與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之混合物之袋子連接至細胞處理系統，且洗滌PBMC。將經洗滌之PBMC收集至袋子中，且再輸注至個體中。在一些實施例中，自收集血液至再輸注經轉導T細胞及/或NK細胞之整個方法係在1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、15小時、18小時或24小時內執行。在說明性實施例中，整個方法係在12小時內執行。
在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之靶標細胞為PBL。在一些實施例中，靶細胞為T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，T細胞為輔助T細胞及/或殺傷T細胞。
在一些實施例中，本文提供之非複製勝任型重組反轉 錄病毒顆粒在其表面上具有假型化元件，該等假型化元件能夠結合T細胞及/或NK細胞且有助於與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜融合。在其他實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上具有能夠結合休眠T細胞及/或NK細胞之活化元件。在又其他實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上具有膜結合細胞介素。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包括聚核苷酸，該聚核苷酸具有編碼一或多個工程化信號傳導多肽之一或多個轉錄單元，該等工程化信號傳導多肽中之一或多者包括一或多個淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件。在其他實施例中，當利用兩種信號傳導多肽時，一種包括至少一個淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件，且另一種通常為包括抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域之嵌合抗原受體(CAR)。如本文所指示，通常與本文提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面締合之活化元件能夠接觸休眠T細胞及/或NK細胞足夠時段，且由於該接觸及在適當條件下活化休眠T細胞及/或NK細胞。應理解，此活化在本文中之方法之接觸步驟期間隨時間推移而發生。此外，應理解，在其中假型化元件係發現在結合T細胞及/或NK細胞之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上之一些實施例中，在本文中之方法中，活化可藉由結合假型化元件來誘導。活化元件在彼等實施例中視情況存在。
關於假型化元件、活化元件、膜結合細胞介素、工程化信號傳導多肽、淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件及CAR之其他描述提供於本文中之其他部分中。
在本文揭示之方法及組合物之一些實施例中，自血液收集之總淋巴球之5%與90%之間經轉導。在某些實施例中，經轉導之 淋巴球之百分比係在範圍之低端為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%及60%與範圍之高端為50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%及90%之間。在一些實施例中，經轉導之淋巴球之百分比為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
在本文揭示之方法及組合物之一些實施例中，將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引回、再引入或再輸注至個體中而無需額外離體操縱，諸如刺激及/或活化T細胞及/或NK細胞。在先前技術方法中，離體操縱用於刺激/活化T細胞及/或NK細胞，及用於在將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中之前擴展經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。在先前技術方法中，此通常花費數天或數週，且需要個體在初始血液抽取之後返回診所以血液輸注數天或數週。在本文揭示之方法及組合物之一些實施例中，在T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之前，T細胞及/或NK細胞並不藉由暴露於抗CD3/抗CD28固體載體(諸如，塗佈有抗CD3/抗CD28之珠粒)而離體進行刺激。因此，本文中提供一種離體無傳播方法。在其他實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞並不離體擴展，或僅擴展較小數目之細胞分裂(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10輪之細胞分裂)，而相反係指活體內(亦即在個體內)擴展或主要在活體內擴展。在一些實施例中，不添加額外介質以允許細胞之另外擴展。在一些實施例中，在PBL與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸時，不發生PBL之細胞製造。在說明性實施例中，當PBL離體時不發生PBL之細胞製造。在過繼性細胞療法之先前方法 中，個體在再輸注經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之前進行淋巴消耗。在一些實施例中，患者或個體在抽取血液之前並不進行淋巴消耗。在一些實施例中，患者或個體在再輸注經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之前並不進行淋巴消耗。然而，本文中所揭示方法及組合物之實施例亦可用於經預活化或經預刺激之T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，可藉由在使T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之前暴露於抗CD3/抗CD28固體支援物來離體刺激T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，在T細胞及/或NK細胞接觸非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之前，可使T細胞及/或NK細胞暴露於抗CD3/抗CD28固體支援物少於1小時、2小時、3小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時或24小時。在說明性實施例中，在T細胞及/或NK細胞接觸非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之前，可使T細胞及/或NK細胞暴露於抗CD3/抗CD28固體支援物少於1小時、2小時、3小時、4小時、6小時或8小時。
在本文揭示之實施例中之任一者中，待再輸注至個體中之T細胞及/或NK細胞的數目可在範圍之低端為1×103、2.5×103、5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106及1×107個細胞/公斤與範圍之高端為5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107及1×108個細胞/公斤之間。在說明性實施例中，待再輸注至個體中之T細胞及/或NK細胞的數目可在範圍之低端為1×104、2.5×104、5×104及1×105個細胞/公斤與範圍之高端為2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105及1×106個細胞/公斤之間。在一些實施例中，待再輸注至個體中之PBL的數目 可少於範圍之低端為5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107及1×108個細胞，與範圍之高端為2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108及1×109個細胞。在一些實施例中，可用於再輸注至70kg個體或患者中之T細胞及/或NK細胞之數目在7×105個細胞與2.5×108個細胞之間。在其他實施例中，可用於轉導之T細胞及/或NK細胞之數目大約為7×106個加或減10%。
在本文揭示之方法中，整個過繼性細胞療法程序(自抽取血液至再輸注經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞)可有利地在比先前方法更短的時間中執行。在一些實施例中，整個過繼性細胞療法程序可在少於1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、15小時、18小時或24小時中執行。在說明性實施例中，整個過繼性細胞療法程序可在少於1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時或12小時中執行。在一些實施例中，整個過繼性細胞療法程序可在範圍之低端為1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時或15小時與範圍之高端為1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、15小時、18小時或24小時之間執行。
在本文中之一些實施例中，封閉系統用於處理PBMC，例如在包括以基因方式修飾PBMC、NK細胞且在說明性實施例中T細胞的方法中，例如藉由轉導PBMC或其子集。此等方法可用於以基因方式修飾待用於科學研究、商業生產或治療方法之淋巴球。舉例而言，此等方法可包括將周邊血液單核細胞(PBMC)(包括NK細 胞、T細胞或兩者，且在一些實施例中，休眠T細胞及/或休眠NK細胞)自容器轉移至封閉系統內之轉導反應混合物中，其因此不需要環境暴露。該容器例如可為管、袋、注射器或其他容器。在一些實施例中，容器為用於研究設施之容器。在一些實施例中，容器為用於商業生產之容器。在其他實施例中，容器可為永夜血液收集過程之收集容器。本文中用於以基因方式修飾的方法通常涉及其中淋巴球與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸的接觸步驟。在一些實施例中，該接觸可在容器中(例如，在血袋內)執行。在其他實施例中，可將PBMC或其子部分自容器轉移至封閉系統內之另一容器(例如自第一容器轉移至第二容器)以供接觸。第二容器可為封閉裝置(諸如G-Rex裝置)之細胞處理區室。在一些實施例中，在接觸後，可將經基因方式修飾(例如，經轉導)之細胞轉移至封閉系統內之不同容器(亦即無需暴露於環境)。在此轉移之前或之後，通常在封閉系統內洗滌細胞以基本上移除所有或所有反轉錄病毒顆粒。在一些實施例中，在接觸之後將PBMC或其部分轉移至其中接觸(例如，轉導)將經由洗滌細胞發生的容器中的此段落中所揭示之過程在12小時內進行。在一些實施例中，其在範圍之低端為1小時、2小時、3小時或4小時與範圍之高端為4小時、8小時、10小時或12小時之間進行。
在本文提供之一些實施例中，自個體抽取血液樣本、使T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸、及/或將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中的步驟，發生在封閉系統中。封閉系統為一種對污染通常封閉或完全封閉的培養方法。由此，此系統或過程不會將細胞暴露於環境。本發明之一優勢為，本文中提供用於在封閉系統中執行CAR療法的方法。對於細胞處 理程序中之安全性及調控之最高風險中之一者為經由頻繁暴露於環境之污染的風險，如在傳統開放式細胞培養系統中所發現的。為了緩和此風險，尤其在不存在抗生素時，已研發出致力於使用一次性(單次使用)設備的一些商業方法。然而，即使在無菌條件下使用，打開燒瓶以取樣或添加額外生長介質總是存在污染風險。為了克服此問題，本文中提供一種封閉系統方法，一種經設計且可經操作使得產物並不暴露於外部環境的方法。此係重要的，因為外部環境通常不係無菌的。經由無菌連接或焊接管進行材料轉移。用於氣體交換之空氣經由透氣膜或類似其他添加物經由0.2μm過濾器來進行以防止環境暴露。
在一些實施例中，封閉系統包括連接至個體之活體內循環系統之離體循環系統，使得抽取血液，且接著在被引回至個體之前循環至離體循環系統。在一些實施例中，離體循環系統包括與用於將細胞暴露於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之系統或裝置結合的用於分離PBL之系統或裝置及/或用於分離T細胞及/或NK細胞之系統或裝置。在一些實施例中，封閉系統並不允許T細胞及/或NK細胞暴露於空氣。
此類封閉系統方法可利用可商購的器件來執行。舉例而言，該方法可在適用於封閉系統T細胞製造之器件中進行。此類器件包括G-RexTM、WAVEBioreactorTM、OriGen PermaLifeTM袋及VueLife®袋。
在本文揭示之方法及組合物之一些實施例中，將個體內之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞暴露於與其中存在之活體內控制元件結合的化合物，其中控制元件為由非複製勝任型重組反轉 錄病毒顆粒引入之基因材料的一部分。在一些實施例中，控制元件可為核糖開關，且化合物可結合核糖開關之適體域。在一些實施例中，控制元件可為分子伴侶。分子伴侶為通常藉由結合來直接影響淋巴增殖性元件或本文中之第一或第二工程化信號傳導多肽之其他組分之活性的化合物。在本文所揭示之實施例中之任一者中，化合物可為核苷類似物。在一些實施例中，核苷類似物可為核苷類似抗病毒藥物，其中抗病毒藥物為一種由食品與藥物管理局(Food and Drug Administration)針對抗病毒治療批准之化合物或一種美國抗病毒臨床試驗中之化合物。在說明性實施例中，化合物可為阿昔洛韋或噴昔洛韋。在一些實施例中，化合物可為泛昔洛韋(famciclovir)(噴昔洛韋之口服前體藥物)或伐昔洛韋(valaciclovir)(阿昔洛韋之口服前體藥物)。化合物與控制元件之結合影響經引入之基因材料之表現，且因此影響經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之傳播。
在一些實施例中，在自個體之血液分離PBL之前、同時及/或之後，且在T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之前，將核苷類似抗病毒藥物或前體藥物(例如阿昔洛韋、伐昔洛韋、噴昔洛韋或泛昔洛韋)投予至個體。在一些實施例中，在自血液分離PBL之前或在T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之前，在範圍之低端為5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘及60分鐘與範圍之高端為1.5小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、12小時或24小時之間，將核苷類似抗病毒藥物或前體藥物投予至個體。在其他實施例中，在自血液分離PBL及在T細胞及/或NK細胞與本文所提供之方法中之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之後，在範圍之低端為1.5小時、2小時、3小時、4小 時、5小時、6小時、8小時、12小時或24小時與範圍之高端為½天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天之間，將核苷類似抗病毒藥物或前體藥物投予至個體。在一些實施例中，在自血液分離PBL及在T細胞及/或NK細胞與本文所提供之方法中的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之後的至少1.5小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、12小時或24小時，或至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天，將核苷類似抗病毒藥物或前體藥物投予至個體。在一些實施例中，在已將PBL再輸注至個體之後的至少1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、28天、30天、60天、90天或120天，或5個月、6個月、9個月、12個月、24個月、36個月、48個月、60個月、72個月、84個月、96個月、120個月或無限期，將核苷類似抗病毒藥物或前體藥物投予至個體。在本文所揭示之實施例中之任一者中，在PBL再輸注之前及/或期間及/或已將PBL再輸注之後，可投予核苷類似抗病毒藥物或前體藥物。
在一些實施例中，向個體每日投予與控制元件結合之化合物一次、兩次、三次或四次。在一些實施例中，提供日劑量之化合物1週、2週、4週、3個月、6個月、1年，直至個體無病(諸如無癌症)或無限期地提供。在說明性實施例中，藥物為與核苷類似物結合之核苷類似抗病毒藥物，諸如核糖開關，如在WO2017/165245A2、WO2018/009923A1及WO2018/161064A1中進一步詳細揭示。
用於遞送藥物之方法在此項技術中為已知的，該藥物無論為小分子抑或生物製劑且可用於本文提供之方法。任何此類方法均可用於遞送用於本發明之方法中之藥物或候選化合物或抗體。舉例 而言，投藥之常規路徑包括非侵襲性經口(經由口)、局部(皮膚)、經黏膜(鼻、頰/舌下、陰道、眼及直腸)及吸入途徑。許多蛋白質及肽藥物(諸如單株抗體)必須藉由注射或奈米針陣列來遞送。舉例而言，許多免疫接種係基於蛋白質藥物之遞送，且通常藉由注射來進行。
工程化信號傳導多肽
在一些實施例中，用於接觸T細胞及/或NK細胞之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒具有聚核苷酸，該聚核苷酸具有編碼一或多種工程化信號傳導多肽之一或多個轉錄單元。在一些實施例中，工程化信號傳導多肽包括胞外域(例如，抗原特異性靶向區或ASTR)、柄及跨膜域之任何組合，與一或多個胞內活化域、視情況選用之一或多個調節域(諸如共刺激域)及視情況選用之一或多個T細胞存活基元組合。在說明性實施例中，工程化信號傳導多肽中之至少一者、兩者或全部為嵌合抗原受體(CAR)或淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件(LE)(諸如嵌合淋巴增殖性元件(CLE))。在一些實施例中，當利用兩個信號傳導多肽時，一個編碼淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件且另一個編碼包括抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域之嵌合抗原受體(CAR)。一般熟習此項技術者將能夠針對本文揭示之方法及組合物，將系統進行組態以利用類似或不類似的控制元件來將淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件及CAR放在不同的聚核苷酸上。熟習的技術者應認識到，工程化多肽亦可稱作重組多肽。
胞外域
在一些實施例中，工程化信號傳導多肽包括胞外域，其為特異性結合對之成員。舉例而言，在一些實施例中，胞外域可為細胞介素受體或其突變體或激素受體或其突變體之胞外域。此突變型 胞外域在一些實施例中經報導在至少一些細胞類型中表現時為組成性活性的。在說明性實施例中，此胞外域及跨膜域不包括配位體結合區。咸信，此等域在存在於工程化信號傳導多肽中且表現於B細胞、T細胞及/或NK細胞中時不結合配位體。此等受體突變體中之突變可發生於胞外近膜區中。不受理論限制，本文提供之工程化信號傳導多肽之至少一些胞外域(及一些胞外-跨膜域)中之突變藉由使通常不在一起之活化鏈集合在一起而在不存在配位體之情況下負責工程化信號傳導多肽之信號傳導。關於包含胞外域中之突變的胞外域之另外的實施例可發現於例如本文中之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件章節中。
在某些說明性實施例中，胞外域包含二聚基元。在一說明性實施例中，二聚基元包含白胺酸拉鏈。在一些實施例中，白胺酸拉鏈來自jun多肽，例如c-jun。關於包含二聚基元之胞外域之另外的實施例可發現於例如本文中之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件章節中。
在某些實施例中，胞外域為抗原特異性靶向區(ASTR)，有時在本文中稱為抗原結合域。特異性結合對包括(但不限於)抗原-抗體結合對；配位體-受體結合對；以及類似者。因此，適用於本發明之工程化信號傳導多肽中之特異性結合對之成員包括ASTR，該ASTR為抗體、抗原、配位體、配位體之受體結合域、受體、受體之配位體結合域，以及親和抗體。
適用於本發明之工程化信號傳導多肽中之ASTR可為任何抗原結合多肽。在某些實施例中，ASTR為抗體，諸如全長抗體、單鏈抗體、Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段，以及二價單 鏈抗體或雙功能抗體。
在一些實施例中，ASTR為單鏈Fv(scFv)。在一些實施例中，重鏈位於工程化信號傳導多肽中的輕鏈之N端。在其他實施例中，輕鏈位於工程化信號傳導多肽中的重鏈之N端。在所揭示之實施例中之任一者中，重鏈及輕鏈可由之連接子隔開，如本文中更詳細論述。在所揭示之實施例中之任一者中，重鏈或輕鏈可在工程化信號傳導多肽之N端且通常為另一域(諸如信號序列或信號肽)之C端。
其他基於抗體之識別域(cAb VHH(駱駝抗體可變域)及人類化版本，IgNAR VH(鯊魚抗體可變域)及人類化版本，sdAb VH(單一域抗體可變域)及「駱駝化」抗體可變域)適宜與工程化信號傳導多肽一起使用且適用於使用本發明之工程化信號傳導多肽的方法中。在一些情況下，亦適宜使用基於T細胞(TCR)之識別域，諸如單鏈TCR(scTv，含有VαVβ之單鏈兩域TCR)。
在一些實施例中，ASTR可為多特異性的，例如雙特異性抗體。多特異性抗體具有針對至少兩個不同位點之結合特異性。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對一種靶標抗原且另一者係針對另一種靶標抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至ta靶向抗原之兩個不同的抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒劑定位至表現靶標抗原之細胞中。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。
適用於本發明之工程化信號傳導多肽中之ASTR可具有多種抗原結合特異性。在一些情況下，抗原結合域對於由靶標細胞表現(由其合成)之抗原中存在的抗原決定基具有特異性。在一個實例中，靶標細胞為癌細胞相關之抗原。癌細胞相關之抗原可為與以下相 關之抗原：例如乳癌細胞、B細胞淋巴瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤細胞、卵巢癌細胞、前列腺癌細胞、間皮瘤、肺癌細胞(例如，小細胞肺癌細胞)、非霍奇金B細胞淋巴瘤(B-NHL)細胞、卵巢癌細胞、前列腺癌細胞、間皮瘤細胞、肺癌細胞(例如，小細胞肺癌細胞)、黑色素瘤細胞、慢性淋巴細胞白血病細胞、急性淋巴細胞白血病細胞、神經母細胞瘤細胞、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、神經管胚細胞瘤、結腸癌細胞等。癌細胞相關之抗原亦可由非癌細胞表現。
工程化信號傳導多肽之ASTR可結合之抗原的非限制，性實例包括例如CD19、CD20、CD38、CD30、ERBB2、CA125、MUC-1、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏著分子、間皮素、癌胚抗原(CEA)、表皮生長因子受體(EGFR)、EGFRvIII、血管內皮生長因子受體-2(VEGFR2)、高分子量黑素瘤相關之抗原(HMW-MAA)、MAGE-Al、IL-13R-a2、GD2、Axl、Ror2，以及類似者。
在一些情況下，適用於工程化信號傳導多肽中之特異性結合對之成員為受體之配位體的ASTR。配位體包括(但不限於)：激素(例如，紅細胞生成素、生長激素、瘦素等)；細胞介素(例如，干擾素、介白素、某些激素等)；生長因子(例如，調節蛋白；血管內皮生長因子(VEGF)；以及類似者)；整合素結合肽(例如，包含序列Arg-Gly-Asp之肽)；以及類似者。
當工程化信號傳導多肽中之特異性結合對之成員為配位體時，可在特異性結合對之第二成員之存在下使工程化信號傳導多肽活化，其中特異性結合對之第二成員為該配位體之受體。舉例而言，當配位體為VEGF時，特異性結合對之第二成員可為包括可溶性VEGF受體之VEGF受體。
如上文所提及，在一些情況下，包括在工程化信號傳導多肽中之特異性結合對之成員為ASTR，該ASTR為受體，例如配位體之受體、共受體等。該受體可為受體之配位體結合片段。合適受體包括(但不限於)：生長因子受體(例如，VEGF受體)；殺傷細胞凝集素樣受體子家族K；成員1(NKG2D)多肽(MICA、MICB及ULB6之受體)；細胞介素受體(例如，IL-13受體；IL-2受體等)；CD27；自然細胞毒性受體(NCR)(例如，NKP30(NCR3/CD337)多肽(HLA-B相關之轉錄物3(BAT3)及B7-H6)之受體等)等。
在包括ASTR的本文提供之態樣中之任一者的某些實施例中，可將ASTR定位於連接ASTR與表現與靶細胞上之靶向分子的中間蛋白質。中間蛋白質可經內源性地表現或外源性地引入，且可為天然地、經工程化或化學修飾的。在某些實施例中，ASTR可為抗標記ASTR，使得至少一個經標記中間物(通常抗標記共軛物)包括於由ASTR識別之標記與靶向分子(通常為表現於靶細胞上之蛋白質靶標)之間。因此，在此等實施例中，ASTR結合標記且標記共軛至針對靶細胞(諸如癌細胞)上之抗原之抗體。標記之非限制性實例包括異硫氰酸螢光素(FITC)、鏈黴親和素、生物素、組胺酸、二硝基苯酚、多甲藻素葉綠素蛋白複合物、綠色螢光蛋白、藻紅蛋白(PE)、辣根過氧化酶、棕櫚醯化、亞硝基化、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶以及麥芽糖結合蛋白。由此，ASTR包韓結合標記之分子。
柄
在一些實施例中，工程化信號傳導多肽包括位於工程化信號傳導多肽之部分中的柄，該部分位於細胞外部且插入在ASTR與跨膜域之間。在一些情況下，該柄與野生型CD8柄區 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFA(SEQ ID NO：79))具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，與野生型CD28柄區(FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO：80))具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，或與野生型免疫球蛋白重鏈柄區具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在工程化信號傳導多肽中，所用柄允許抗原特異性靶向區及通常整個工程化信號傳導多肽保持與靶標抗原之結合增加。
柄區長度可為約4至約50個胺基酸，例如約4個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約15個胺基酸至約20個胺基酸、約20個胺基酸至約25個胺基酸、約25個胺基酸至約30個胺基酸、約30個胺基酸至約40個胺基酸，或約40個胺基酸至約50個胺基酸。
在一些情況下，工程化信號傳導多肽之柄包括至少一個半胱胺酸。舉例而言，在一些情況下，柄可包括序列Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：62)。若存在，第一工程化信號傳導多肽之柄中的半胱胺酸可以能夠與第二工程化信號傳導多肽中之柄形成二硫鍵。
柄可包括此項技術中已知之免疫球蛋白鉸鏈區胺基酸序列；參見例如Tan等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：162；及Huck等人(1986)Nucl.Acids Res.14：1779。作為非限制性實例，免疫球蛋白鉸鏈區可包括與以下胺基酸序列中之任一者之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：DKTHT(SEQ ID NO：63)；CPPC(SEQ ID NO：62)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO：64)；(參見例如Glaser等人(2005)J.Biol.Chem.280：41494)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：65)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO：66)；KCCVDCP(SEQ ID NO：67)；KYGPPCP(SEQ ID NO：68)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：69)(人類IgG1鉸鏈)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：70)(人類IgG2鉸鏈)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：71)(人類IgG3鉸鏈)；SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO：72)(人類IgG4鉸鏈)；以及類似者。柄可包括具有人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈區之胺基酸序列的鉸鏈區。柄與野生型(天然存在之)鉸鏈區相比可包括一或多個胺基酸取代及/或插入及/或缺失。舉例而言，人類IgG 1鉸鏈之His229可經Tyr取代，使得柄包括序列EPKSCDKTYTCPPCP(參見例如Yan等人(2012)J.Biol.Chem.287：5891)。柄可包括來源於人類CD8之胺基酸序列；例如，該柄可包括胺基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：73)，或其變體。
跨膜域
本發明之工程化信號傳導多肽可包括用於插入至真核細胞膜中之跨膜域。跨膜域可插入在ASTR與共刺激域之間。跨膜域可插入在柄與共刺激域之間，使得嵌合抗原受體自胺基端(N端)至羧基端(C端)依次包括：ASTR、柄、跨膜域以及活化域。
提供將多肽插入至真核(例如，哺乳動物)細胞之細胞膜中的任何跨膜(TM)域適用於本文所揭示之態樣及實施例。適用於本 文提供之態樣或實施例中之任一者的TM域之非限制性實例包括與以下TM域或經組合柄及TM域中之任一者之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：a)CD8 α TM(SEQ ID NO：46)；b)CD8 β TM(SEQ ID NO：47)；c)CD4柄(SEQ ID NO：48)；d)CD3Z TM(SEQ ID NO：49)；e)CD28 TM(SEQ ID NO：50)；f)CD134(OX40)TM(SEQ ID NO：51)；g)CD7 TM(SEQ ID NO：52)；h)CD8柄及TM(SEQ ID NO：75)；及i)CD28柄及TM(SEQ ID NO：76)。
作為非限制性實例，本發明之一態樣之跨膜域可與SEQ ID NO：46跨膜域具有至少80%、90%或95%或可具有100%的序列一致性，或可分別與來自以下基因之跨膜域中之任一者具有100%的序列一致性：CD8 β跨膜域、CD4跨膜域、CD3 ζ跨膜域、CD28跨膜域、CD134跨膜域，或CD7跨膜域。
胞內活化域
適用於本發明之工程化信號傳導多肽中之胞內活化域在活化時通常誘導產生一或多種細胞介素；增加細胞死亡；及/或增加CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、NKT細胞、γδ T細胞及/或嗜中性細胞之增殖。活化域亦可在本文中稱為活化域。活化域可用於本文提供之CAR中或淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中。
在一些實施例中，胞內活化域包括如下文所描述之至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個等)ITAM基元。在一些實施例中，胞內活化域可與如下文所描述之CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70域具有至少80%、90%或95%或可具有100%的 序列一致性。
適用於本發明之工程化信號傳導多肽中之胞內活化域包括含有基於免疫酪胺酸之活化基元(ITAM)之胞內信號傳導多肽。ITAM基元為YX1X2L/I，其中X1及X2獨立地為任何胺基酸。在一些情況下，工程化信號傳導多肽之胞內活化域包括1個、2個、3個、4個或5個ITAM基元。在一些情況下，ITAM基元在胞內活化域中重複兩次，其中ITAM基元之第一個例與第二個例彼此由6個至8個胺基酸(例如，(YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I)，其中n為整數6至8，且6個至8個X3中之每一者可為任何胺基酸)分隔開。在一些情況下，工程化信號傳導多肽之胞內活化域包括3個ITAM基元。
合適之胞內活化域可為含有ITAM基元之部分，該部分來源於含有ITAM基元之多肽。舉例而言，合適之胞內活化域可為來自任何含有ITAM基元之蛋白質的含有ITAM基元之域。因此，合適之胞內活化域不需要含有其源自之整個蛋白質的整個序列。合適之含有ITAM基元之多肽的實例包括(但不限於)：CD3Z(CD3 ζ)；CD3D(CD3 δ)；CD3E(CD3 ε)；CD3G(CD3 γ)；CD79A(抗原受體複合物相關之蛋白質α鏈)；CD79B(抗原受體複合物相關之蛋白質β鏈)DAP12；以及FCERlG(Fcε受體I γ鏈)。
在一些實施例中，胞內活化域來源於T細胞表面糖蛋白CD3 ζ鏈(亦稱為CD3Z、T細胞受體T3 ζ鏈、CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。舉例而言，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段或與以下胺基酸序列(2個同功異型物)中之任一者之約100個胺基酸至約110個胺基酸(aa)、約110aa至約115aa、約115aa至約120aa、約120aa至約130 aa、約130aa至約140aa、約140aa至約150aa或約150aa至約160aa一連續段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO：11)或MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO：12)，其中用括號將ITAM基元括起來。
同樣，合適之胞內活化域多肽可包括全長CD3 ζ胺基酸序列之含有ITAM基元之部分。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段或與以下胺基酸序列中之任一者之約100個胺基酸至約110個胺基酸(aa)、約110aa至約115aa、約115aa至約120aa、約120aa至約130aa、約130aa至約140aa、約140aa至約150aa或約150aa至約160aa之一連續段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKRRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO：13)；RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDP EMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO：81)；NQL[YNELNLGRREEYDVL]DKR(SEQ ID NO：14)；EGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMK(SEQ ID NO：15)；或DGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQ(SEQ ID NO：16)，其中用括號將ITAM基元括起來。
在一些情況下，胞內活化域來源於T細胞表面糖蛋白CD3 δ鏈(亦稱為CD3D、CD3-δ、T3D、CD3抗原、δ子單元、CD3 δ、CD3d抗原、δ多肽(TiT3複合物)、OKT3、δ鏈、T細胞受體T3 δ鏈、T細胞表面糖蛋白CD3 δ鏈等)。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段或與以下胺基酸序列中之任一者之約100個胺基酸至約110個胺基酸(aa)、約110aa至約115aa、約115aa至約120aa、約120aa至約130aa、約130aa至約140aa、約140aa至約150aa或約150aa至約160aa之一連續段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO：17)或MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO：18)，其中用括號將ITAM基元括起來。
同樣，合適之胞內活化域多肽可包含全長CD3 δ胺基酸序列之含有ITAM基元之部分。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：DQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGN(SEQ ID NO：19)，其中用括號將ITAM基元括起來。
在一些情況下，胞內活化域來源於T細胞表面糖蛋白CD3 ε鏈(亦稱為CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4 ε鏈、T細胞表面糖蛋白CD3 ε鏈、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段或與以下胺基酸序列之約100個胺基酸至約110個胺基酸(aa)、約110aa至約115aa、約115aa至約120aa、約120aa至約130aa、約130aa至約140aa、約140aa至約150aa或約150aa至約160aa之一連續段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQRRI(SEQ ID NO：20)，其中用括號將ITAM基元括起來。
同樣，合適之胞內活化域多肽可包含全長CD3 ε胺基 酸序列之含有ITAM基元之部分。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：NPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQR(SEQ ID NO：21)，其中用括號將ITAM基元括起來。
在一些情況下，胞內活化域來源於T細胞表面糖蛋白CD3 γ鏈(亦稱為CD3G、T細胞受體T3 γ鏈、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3複合物)等)。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段或與以下胺基酸序列之約100個胺基酸至約110個胺基酸(aa)、約110aa至約115aa、約115aa至約120aa、約120aa至約130aa、約130aa至約140aa、約140aa至約150aa或約150aa至約160aa之一連續段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGNQLRRN(SEQ ID NO：22)，其中用括號將ITAM基元括起來。
同樣，合適之胞內活化域多肽可包含全長CD3 γ胺基酸序列之含有ITAM基元之部分。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：DQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGN(SEQ ID NO：23)，其中用括號將 ITAM基元括起來。
在一些情況下，胞內活化域來源於CD79A(亦稱為B細胞抗原受體複合物相關之蛋白質α鏈；CD79a抗原(免疫球蛋白相關之α)；MB-1膜糖蛋白；Ig-α；膜結合之免疫球蛋白相關之蛋白質；表面IgM相關之蛋白質等)。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段或與以下胺基酸序列中之任一者之約100個胺基酸至約110個胺基酸(aa)、約110aa至約115aa、約115aa至約120aa、約120aa至約130aa、約130aa至約140aa、約140aa至約150aa或約150aa至約160aa之一連續段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO：24)或MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO：25)，其中用括號將ITAM基元括起來。
同樣，合適之胞內活化域多肽可包含全長CD79A胺基酸序列之含有ITAM基元之部分。因此，合適之胞內活化域可包括與 以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：ENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRG(SEQ ID NO：26)，其中用括號將ITAM基元括起來。
在一些情況下，胞內活化域來源於DAP12(亦稱為TYROBP；TYRO蛋白質酪胺酸激酶接合蛋白質；KARAP；PLOSL；DNAX活化蛋白質12；KAR相關蛋白質；TYRO蛋白質酪胺酸激酶結合蛋白質；殺傷活化受體相關之蛋白質；殺傷活化受體相關之蛋白質等)。舉例而言，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段或與以下胺基酸序列(4個同功異型物)中之任一者之約100個胺基酸至約110個胺基酸(aa)、約110aa至約115aa、約115aa至約120aa、約120aa至約130aa、約130aa至約140aa、約140aa至約150aa或約150aa至約160aa之一連續段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO：27)、MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO：28)、MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO：29)或 MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO：30)，其中用括號將ITAM基元括起來。
同樣，合適之胞內活化域多肽可包含全長DAP12胺基酸序列之含有ITAM基元之部分。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：ESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO：31)，其中用括號將ITAM基元括起來。
在一些情況下，胞內活化域來源於FCERlG(亦稱為FCRG；Fc ε受體Iγ鏈；Fc受體γ鏈；fc-ε RI-γ；fcRγ；fceRIγ；高親和性免疫球蛋白ε受體子單元γ；免疫球蛋白E受體、高親和性γ鏈等)。舉例而言，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段或與以下胺基酸序列之約50個胺基酸至約60個胺基酸(aa)、約60aa至約70aa、約70aa至約80aa或約80aa至約88aa之一連續段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV[YTGLSTRNQETYETL]KHEKPPQ(SEQ ID NO：32)，其中用括號將ITAM基元括起來。
同樣，合適之胞內活化域多肽可包含全長FCER1G胺基酸序列之含有ITAM基元之部分。因此，合適之胞內活化域可包括與以下序列中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%序列一致性的域：DGV[YTGLSTRNQETYETL]KHE(SEQ ID NO：33)，其中用括號將ITAM基元括起來。
適用於本發明之工程化信號傳導多肽中之胞內活化域包括DAP10/CD28型信號傳導鏈。DAP10信號傳導鏈之一實例為胺基酸SEQ ID NO：34。在一些實施例中，合適之胞內活化域可包括與SEQ ID NO：34中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
CD28信號傳導鏈之一實例為胺基酸SEQ ID NO：35。在一些實施例中，合適之胞內活化域可包括與SEQ ID NO：35中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
適用於本發明之工程化信號傳導多肽中之胞內活化域包括ZAP70多肽，例如，合適之胞內活化域可包括與SEQ ID NO：36中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段或與以下胺基酸序列之約300個胺基酸至約400個胺基酸、約400個胺基酸至約500個胺基酸或約500個胺基酸至約619個胺基酸之一連續段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
調節域
調節域可改變工程化信號傳導多肽中之胞內活化域之作用，包括增強或抑制活化域之下游作用或改變反應之性質。適用於本發明之工程化信號傳導多肽中之調節域包括共刺激域。適合於工 程化信號傳導多肽中之包涵體之調節域之長度可為約30個胺基酸至約70個胺基酸(aa)，例如，調節域之長度可為約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa或約65aa至約70aa。在其他情況下，調節域之長度可為約70aa至約100aa、約100aa至約200aa，或大於200aa。
共刺激域通常增強及/或改變活化域之反應的性質。適用於本發明之工程化信號傳導多肽中之共刺激域通常為衍生自受體之多肽。在一些實施例中，共刺激域同源二聚。個體共刺激域可為跨膜蛋白質之胞內部分(亦即，共刺激域可衍生自跨膜蛋白質)。合適之共刺激多肽之非限制性實例包括(但不限於)4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用於Lck結合(IC△)缺失之CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM。舉例而言，本發明之態樣之共刺激域可與4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用於Lck結合(IC△)缺失之CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR或HVEM之共刺激域具有至少80%、90%或95%序列一致性。舉例而言，本發明之態樣之共刺激域可與合適之共刺激多肽之非限制性實例的共刺激域具有至少80%、90%或95%序列一致性，該等實例包括(但不限於)4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用於Lck結合(IC△)缺失之CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM。舉例而言，本發明之態樣之共刺激域可與4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用於Lck結合(IC△)缺失之CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR或HVEM之共刺激域具有至少80%、90%或95%序列一致性。
適合於工程化信號傳導多肽中之包涵體之共刺激域 之長度可為約30個胺基酸至約70個胺基酸(aa)，例如，共刺激域之長度可為約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa或約65aa至約70aa。在其他情況下，共刺激域之長度可為約70aa至約100aa、約100aa至約200aa，或大於200aa。
在一些情況下，共刺激域衍生自跨膜蛋白質CD137(亦稱為TNERSE9；CD137；4-lBB；CDwl37；ILA等)之胞內部分。舉例而言，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：1中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在此等實施例中之一些中，共刺激域之長度為約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa或約65aa至約70aa。
在一些情況下，共刺激域衍生自跨膜蛋白質CD28(亦稱為Tp44)之胞內部分。舉例而言，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：2中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在此等實施例中之一些中，共刺激域之長度為約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa或約65aa至約70aa。
在一些情況下，共刺激域衍生自為用於Lck結合(IC△)所缺失之跨膜蛋白質CD28的胞內部分。舉例而言，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：3中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一 段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在此等實施例中之一些中，共刺激域之長度為約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa或約65aa至約70aa。
在一些情況下，共刺激域衍生自跨膜蛋白質ICOS(亦稱為AILIM、CD278及CVIDl)之胞內部分。舉例而言，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：4中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在此等實施例中之一些中，共刺激域之長度為約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa或約65aa至約70aa。
在一些情況下，共刺激域衍生自跨膜蛋白質OX40(亦稱為TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX-40、TXGPlL)之胞內部分。OX40在SEQ ID NO：504之各殘基34至57處含有p85 PI3K結合基元，且在殘基76至102處含有TRAF結合基元。在一些實施例中，共刺激域可包括OX40之p85 PI3K結合基元。在一些實施例中，共刺激域可包括OX40之TRAF結合基元。對應於SEQ ID NO：504之胺基酸17及41的賴胺酸為充當泛素靶向基元之部分的潛在負性調節位點。在一些實施例中，OX40之共刺激域中之此等賴胺酸中之一者或兩者為突變精胺酸或另一種胺基酸。在一些實施例中，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：5中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在此等實施例中之一些中，共刺激域之長度為約20aa至約25aa、約25aa至約30aa、30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa。在說明性實施例中，共刺激域之長度為20aa至約50aa，例如20aa至45aa或20aa至42aa。
在一些情況下，共刺激域衍生自跨膜蛋白質CD27(亦稱為S 152、T 14、TNFRSF7及Tp55)之細胞內部分。舉例而言，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：6中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在此等實施例中之一些中，共刺激域之長度為約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa。
在一些情況下，共刺激域衍生自跨膜蛋白質BTLA(亦稱為BTLAl及CD272)之胞內部分。舉例而言，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：7中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
在一些情況下，共刺激域衍生自跨膜蛋白質CD30(亦稱為TNFRSF8、DlS166E及Ki-1)之胞內部分。舉例而言，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：8中之約100個胺基酸至約110個胺基酸(aa)、約110aa至約115aa、約115aa至約120aa、約120aa至約130aa、約130aa至約140aa、約140aa至約150aa、約150aa至約160aa或約160aa至約185aa之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
在一些情況下，共刺激域衍生自跨膜蛋白質GITR(亦稱為TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357及GITR-D)之胞內部分。舉例而言，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：9中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在此等實施例中之一些中，共刺激域之長度為約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa或約65aa至約70aa。
在一些情況下，共刺激域衍生自跨膜蛋白質HVEM(亦稱為TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR及TR2)之胞內部分。舉例而言，合適之共刺激域可包括與SEQ ID NO：10中之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在此等實施例中之一些中，第一多肽及第二多肽之共刺激域之長度為約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa或約65aa至約70aa。
連接子
在一些情況下，工程化信號傳導多肽包括在任何兩個相鄰域之間的連接子。舉例而言，連接子可在跨膜域與第一刺激域之間。作為另一實例，ASTR可為抗體，且連接子可在重鏈與輕鏈之間。作為另一實例，連接子可在ASTR與跨膜域及共刺激域之間。作為另一實例，連接子可在第二多肽之共刺激域與胞內活化域之間。作為另一實例，連接子可在ASTR與胞內信號傳導域之間。
連接子肽可具有多種胺基酸序列中之任一者。蛋白質可藉由通常具有可撓性性質之間隔肽連接，但不排除其他化學鍵。連接子可為長度在約1個與約100個胺基酸之間，或長度在約1個與約25個胺基酸之間的肽。此等連接子可藉由使用合成的編碼連接子之寡核苷酸偶合該等蛋白質來產生。可使用具有一定程度可撓性之肽連接子。連接肽可實際上具有任何胺基酸序列，考慮到合適之連接子將具有產生通常可撓性肽的序列。較小胺基酸(諸如甘胺酸及丙胺酸)之用途為用於創建可撓性肽。此類序列之創建對於熟悉此項技術者而言為常規的。
合適之連接子可易於選擇且可為合適之不同長度中之任一者，諸如1個胺基酸(例如Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸，且可為1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個胺基酸。
例示性可撓性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n、GSGGSn、GGGSn及GGGGSn，其中n為至少一之整數)，甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物，及此項技術中已知之其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物係令人感興趣的，此係由於此等胺基酸之兩者均為相對非結構化的，且因此可作為組分之間的中性鏈。甘胺酸聚合物尤其令人感興趣，此係由於甘胺酸比甚至丙胺酸具有顯著更多的phi-psi空間，且比具有較長側鏈之殘基受到更少限制(參見Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。例示性可撓性連接子包括(但不限於)GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：53)、 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：54)、GGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、GGSG(SEQ ID NO：56)、GGSGG(SEQ ID NO：57)、GSGSG(SEQ IDNO：58)、GSGGG(SEQ ID NO：59)、GGGSG(SEQ ID NO：60)、GSSSG(SEQ ID NO：61)，以及類似者。一般熟練技術人員將認識到，將肽結合至上文所描述之任何元件的設計可包括為完全或部分可撓性的連接子，使得連接子可包括可撓性連接子以及賦予較低可撓性結構之一或多個部分。
組合
在一些實施例中，藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒提供之聚核苷酸具有編碼一或多種工程化信號傳導多肽之某些組合的一或多個轉錄單元。在本文所提供之一些方法及組合物中，在藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉錄T細胞之後，經基因方式修飾之T細胞包括一或多種工程化信號傳導多肽之組合。將理解，第一多肽、第二多肽、第三多肽等之參考係出於方便性，且「第一多肽」上之元件及「第二多肽」上之彼等意謂，該等元件在不同多肽上，該等多肽稱為第一或第二以通常在特異性多肽之其他元件或步驟中僅供參考及方便性。
在一些實施例中，第一工程化信號傳導多肽包括能夠結合抗原之胞外抗原結合域，及胞內信號傳導域。在其他實施例中，第一工程化信號傳導多肽亦包括T細胞存活基元及/或跨膜域。在一些實施例中，第一工程化信號傳導多肽不包括共刺激域，而在其他實施例中，第一工程化信號傳導多肽的確包括共刺激域。
在一些實施例中，第二工程化信號傳導多肽包括淋巴增殖性基因產物及視情況選用之胞外抗原結合域。在一些實施例中， 第二工程化信號傳導多肽亦包括以下中之一或多者：T細胞存活基元、胞內信號傳導域，及一或多個共刺激域。在其他實施例中，當使用兩種工程化信號傳導多肽時，至少一者為CAR。
在一個實施例中，一或多種工程化信號傳導多肽在相同轉錄物下在T細胞特異性啟動子或一般啟動子下表現，其中在該轉錄物中，編碼工程化信號傳導多肽之核酸由編碼一或多種內部核糖體進入位點(IRE)或一或多種蛋白酶裂解肽之核酸分隔開。
在某些實施例中，聚核苷酸編碼兩種工程化信號傳導多肽，其中第一工程化信號傳導多肽包括能夠結合第一抗原之第一胞外抗原結合域，及第一胞內信號傳導域而非共刺激域，且第二工程化信號傳導多肽包括能夠結合VEGF之第二胞外抗原結合域，及第二胞內信號傳導域，諸如共刺激分子之信號傳導域。在某一實施例中，第一抗原為PSCA、PSMA或BCMA。在某一實施例中，第一胞外抗原結合域包含抗體或其片段(例如scFv)，例如對PSCA、PSMA或BCMA具有特異性的抗體或其片段。在某一實施例中，結合VEGF之第二胞外抗原結合域為VEGF之受體，亦即VEGFR。在某些實施例中，VEGFR為VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3。在某一實施例中，VEGFR為VEGFR2。
在某些實施例中，聚核苷酸編碼兩種工程化信號傳導多肽，其中第一工程化信號傳導多肽包括胞外腫瘤抗原結合域及CD3ζ信號傳導域，且第二工程化信號傳導多肽包括抗原結合域(其中該抗原為血管生成或血管原性因子)，及一或多個共刺激分子信號傳導域。血管生成因子可為例如VEGF。一或多個共刺激分子信號傳導基元可包含例如來自CD27、CD28、OX40、TCOS及4-1BB中之每一者 的共刺激信號傳導域。
在某些實施例中，聚核苷酸編碼兩種工程化信號傳導多肽，其中第一工程化信號傳導多肽包括胞外腫瘤抗原結合域及CD3ζ信號傳導域，第二多肽包含能夠結合VEGF之抗原結合域之抗原結合域，及來自CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中之每一者的共刺激信號傳導域。在另一實施例中，第一信號傳導多肽或第二信號傳導多肽亦具有T細胞存活基元。在一些實施例中，T細胞存活基元為IL-7受體(IL-7R)之胞內信號傳導域、IL-12受體之胞內信號傳導域、IL-15受體之胞內信號傳導域、IL-21受體之胞內信號傳導域，或轉變生長因子β(TGFβ)受體或TGFβ誘餌受體(TGF-β-顯性-負型受體II(DNRII))之胞內信號傳導域或衍生自其等。
在某些實施例中，聚核苷酸編碼兩種工程化信號傳導多肽，其中第一工程化信號傳導多肽包括胞外腫瘤抗原結合域及CD3ζ信號傳導域，且第二工程化信號傳導多肽包含能夠結合VEGF之抗原結合域、IL-7受體胞內T細胞存活基元、及來自CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中之每一者的共刺激信號傳導域。
在一些實施例中，由聚核苷酸編碼超過兩種信號傳導多肽。在某些實施例中，僅工程化信號傳導多肽中之一者包括結合至腫瘤相關之抗原或腫瘤特異性抗原的抗原結合域；該等工程化信號傳導多肽中之剩餘者之每一者包含結合至非腫瘤相關之抗原或非腫瘤特異性抗原的抗原結合域。在其他實施例中，工程化信號傳導多肽中之兩者或更多者包括結合至一或多種腫瘤相關之抗原或腫瘤特異性抗原的抗原結合域，其中該等工程化信號傳導多肽中之至少一者包含未結合至腫瘤相關之抗原或腫瘤特異性抗原的抗原結合域。
在一些實施例中，腫瘤相關之抗原或腫瘤特異性抗原為Her2、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PSMA(前列腺特異性膜抗原)、B細胞成熟抗原(BCMA)α-胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌症抗原-125(CA-125)、CA19-9、鈣視網膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、酪胺酸酶、黑素瘤相關之抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜鉻粒蛋白、細胞角蛋白、結蛋白、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、大囊性疾病流體蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白黑色素A(T淋巴球識別之黑素瘤抗原；MART-1)、肌凝蛋白-D1、肌肉特異性肌動蛋白(MSA)、神經纖毛、神經元特異性烯醇酶(NSE)、胎盤鹼性磷酸酶、突觸泡蛋白、甲狀腺球蛋白、甲狀腺轉錄因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型(腫瘤M2-PK)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神經節苷脂G2)、EphA2、CSPG4、CD138、FAP(纖維母細胞活化蛋白)、CD171、κ整合素、λ整合素、5T4整合素、αvβ6整合素、整合素αvβ3(CD61)、泌乳激素K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因)、Ral-B、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD20、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、EGFR、EGP2、EGP40、EpCAM、胚胎AchR、FRα、GD3、HLA-A1+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、路易斯-Y(Lewis-Y)、Muc16、NCAM、NKG2D配位體、NY-ESO-1、PRAME、ROR1、存活素、TAG72、TEMs、VEGFR2、EGFRvIII(表皮生長因子變體III、精子蛋白17(Sp17)、間皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺卵白、TARP(T細胞受體γ替代讀取框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺1之六跨膜上皮抗原)、異常鼠蛋白或異常p53蛋白。
在一些實施例中，第一工程化信號傳導多肽包括結合 第一抗原之第一胞外抗原結合域，及第一胞內信號傳導域；且第二工程化信號傳導多肽包括結合第二抗原或結合第二抗原之受體之第二胞外抗原結合域，及第二胞內信號傳導域，其中該第二工程化信號傳導多肽不包含共刺激域。在某一實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域獨立地為受體之抗原結合部分或抗體之抗原結合部分。在某一實施例中，第二抗原結合域或第二抗原結合域中之一者或兩者為scFv抗體片段。在某些實施例中，第一工程化信號傳導多肽及/或第二工程化信號傳導多肽額外包含跨膜域。在某一實施例中，第一工程化信號傳導多肽或第二工程化信號傳導多肽包含T細胞存活基元，例如本文所描述之T細胞存活基元中之任一者。
在另一實施例中，第一工程化信號傳導多肽包括結合HER2之第一胞外抗原結合域，且第二工程化信號傳導多肽包括結合MUC-1之第二胞外抗原結合域。
在另一實施例中，第二工程化信號傳導多肽之第二胞外抗原結合域結合介白素。
在另一實施例中，第二工程化信號傳導多肽之第二胞外抗原結合域結合損傷相關之分子模式分子(DAMP；亦稱為警報素(alarmin))。在另一實施例中，DAMP為熱休克蛋白質、染色質相關之蛋白質高遷移率組盒1(HMGB1)、S100A8(亦稱為MRP8或鈣粒蛋白A)、S100A9(亦稱為MRP14或鈣粒蛋白B)、血清澱粉樣蛋白A(SAA)、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸或硫酸肝素。
在某些實施例中，該第二抗原為抗體上之抗原，該抗體結合由腫瘤細胞呈遞之抗原。
在一些實施例中，經由第二工程化信號傳導多肽之信 號轉導活化為非抗原性的，但與低氧有關。在某些實施例中，低氧係藉由低氧誘導因子-1α(HIF-1α)、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β之活化誘導的。
在一些實施例中，一或多種工程化信號傳導多肽之表現係由在本文中更詳細地揭示之控制元件調節的。
額外序列
工程化信號傳導多肽(諸如CAR)可進一步包括一或多種額外多肽域，其中此類域包括(但不限於)信號序列、抗原決定基標記、親和域，及可例如藉由抗體分析法或由於其為產生可偵測信號之多肽而偵測(可偵測標記)其存在或活性的多肽。對於本文所提供之態樣或實施例中之任一者的額外域之非限制性實例包括與如下文所描述之以下序列中之任一者具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：信號序列、抗原決定基標記、親和域或產生可偵測信號之多肽。
適用於個體CAR(例如個體CAR之第一多肽)中之信號序列包括任何真核信號序列，其包括天然存在之信號序列、合成的(例如，人造的)信號序列等。在一些實施例中，舉例而言，信號序列可為CD8信號序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：74)。
合適之抗原決定基標記包括(但不限於)凝血素(HA；例如YPYDVPDYA；SEQ ID NO：37)、FLAG(例如DYKDDDDK；SEQ ID NO：38)、c-myc(例如EQKLISEEDL；SEQ ID NO：39)以及類似者。
親和域包括可與結合搭配物(例如在固體載體上固定之一者)相互作用之適用於識別或純化的肽序列。編碼多個連續的單一胺基酸(例如組胺酸)之DNA序列當與所表現蛋白質融合時，可用於 藉由高親和力結合至樹脂柱(諸如瓊脂糖凝膠)之重組蛋白質的一步純化。例示性親和域包括His5(HHHHH；SEQ ID NO：40)、HisX6(HHHHHH；SEQ ID NO：41)、c-myc(EQKLISEEDL；SEQ ID NO：39)、Flag(DYKDDDDK；SEQ ID NO：38)、Strep標記(WSHPQFEK；SEQ ID NO：42)、凝血素(例如，HA標記(YPYDVPDYA；SEQ ID NO：37))、GST、硫氧還蛋白、纖維素結合域、RYIRS(SEQ ID NO：43)、Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO：44)、甲殼素結合域、S肽、T7肽、SH2域、C端RNA標記、WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO：45)、金屬結合域，例如鋅結合域或鈣結合域，諸如來自鈣結合蛋白質之彼等例如鈣調蛋白、肌鈣蛋白C、鈣調神經磷酸酶B、肌球蛋白輕鏈、恢復蛋白、S調節素、視錐蛋白、VILIP、神經鈣蛋白、海馬鈣結合蛋白、聚集蛋白、鈣牽蛋白(caltractin)、鈣蛋白酶大亞基、S100蛋白，小白蛋白、鈣結合蛋白D9K、鈣結合蛋白D28K及鈣視蛋白、內含肽、生物素、鏈黴親和素、MyoD、Id、白胺酸拉鏈序列以及麥芽糖結合蛋白。
合適之可偵測信號產生蛋白質包括例如螢光蛋白質、催化產生可偵測信號作為產物之反應的酶，以及類似者。
合適之螢光蛋白質包括(但不限於)綠色螢光蛋白質(GFP)或其變體、GFP之藍色螢光變體(BFP)、GFP之青色螢光變體(CFP)、GFP之黃色螢光變體(YFP)、增強型GFP(EGFP)、增強型CFP(ECFP)、增強型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz(TYFP)、Venus、Citrine、mCitrine、GFPuv、不穩定之EGFP(dEGFP)、不穩定之ECFP(dECFP)、不穩定之EYFP(dEYFP)、mCFPm、Cerulean、T-Sapphire、CyPet，Ypet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、 DsRed-單體、J-Red、二聚體2、t-二聚體2(12)、mRFP1、珊瑚、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白質及點燃蛋白質、藻膽蛋白及藻膽蛋白偶聯物，包括B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白及別藻藍蛋白。螢光蛋白質之其他實例包括mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrapel、mRaspberry、mGrape2、mPlum(Shaner等人(2005)Nat.Methods 2：905-909)，以及類似者。適宜使用來自Anthozoan物種之多種螢光及有色蛋白質中之任一者，如例如Matz等人(1999)Nature Biotechnol.17：969-973中所描述。
合適之酶包括(但不限於)辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶、β-N-乙醯胺基葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、轉化酶、黃嘌呤氧化酶、螢火蟲螢光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)，以及類似者。
識別域及/或消除域
本文所提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之任一者可包括編碼識別域或消除域之核酸，該識別域或消除域作為編碼本文所提供之工程化信號傳導多肽中之任一者的核酸之部分或與其隔開。因此，本文所提供之工程化信號傳導多肽中之任一者可包括識別域或消除域。舉例而言，本文所揭示之CAR中之任一者可包括識別域或消除域。此外，識別域或消除域可與本文所揭示之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中之任一者一起表現，或甚至與其融合。識別域或消除域在T細胞及/或NK細胞上表現，但不在非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒上表現。
在一些實施例中，識別域或消除域可來源於單純疱疹病毒衍生的酶胸苷激酶(HSV-tk)或誘導型半胱天冬酶9。在一些實施例 中，識別域或消除域可包括經修飾之內源細胞表面分子，例如如美國專利8,802,374中所揭示。經修飾之內源細胞表面分子可為任何細胞表面相關之受體、配位體、糖蛋白、細胞黏著分子、抗原、整合素或經修飾之分化簇(CD)。在一些實施例中，經修飾之內源細胞表面分子為經截斷之酪胺酸激酶受體。在一個態樣中，經截斷酪胺酸激酶受體為表皮生長因子受體(EGFR)家族中之成員，例如ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4。在一些實施例中，識別域可為由抗體識別之多肽，該抗體識別EGFR成員之胞外域。在一些實施例中，識別域可為EGFR家族成員之至少20個連續胺基酸，或在例如EGFR家族成員之20個與50個連續胺基酸之間。舉例而言，SEQ ID NO：78為由識別EGFR成員之胞外域的抗體結合且在適當條件下識別的例示性多肽。此類胞外EGFR抗原決定基有時在本文中稱為eTag。在說明性實施例中，此類抗原決定基由可市購抗EGFR單株抗體識別。
亦稱為EGFR、ErbB1及HER1之表皮生長因子受體為胞外配位體之表皮生長因子家族之成員的細胞表面受體。EGFR活性之改變已涉及某些癌症。在一些實施例中，編碼包括人類表皮生長因子受體(EGFR)的EGFR多肽之基因係由移除編碼包括膜遠端EGF結合域及細胞質信號傳導尾之多肽但保留由抗EGFR抗體識別之胞外膜近端抗原決定基的核酸序列來構築的。較佳地，抗體為已知可市購的抗EGFR單株抗體，諸如西妥昔單抗(cetuximab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、尼西珠單抗(necitumumab)或帕尼單抗(panitumumab)。
其他已展示，生物素標記之西妥昔單抗結合抗生物素微珠應用於免疫磁選擇成功地豐富T細胞，該T細胞已用含有EGFRt之構築體自低至2%之群體慢病毒轉導至大於90%的純度，而對細胞製 劑無可觀測毒性。此外，其他已展示，此惰性EGFR分子之組成性表現不影響T細胞表型或如由協調表現之嵌合抗原受體(CAR)，CD19R引導之效應功能。此外，其他已展示，經由流式細胞術分析，EGFR成功地用作小鼠中之T細胞移植之體內的追蹤標記物。此外，已藉由Erbitux®介導之抗體依賴型細胞毒性(ADCC)路徑論證EGFR具有自殺基因潛力。本發明之發明者已使用慢病毒載體在PBMC中成功地表現eTag，且已發現暴露於西妥昔單抗的PBMC在活體外表現eTag，提供一種PBMC之有效的消除機制。因此，EGFR可用作具有免疫治療潛力之轉導性T細胞的非免疫基因選擇工具、追蹤標記物及自殺基因。EGFR核酸亦可藉由此項技術中熟知之方法來偵測。
在本文所提供之一些實施例中，EGFR表現為亦包括CAR之單一多肽之部分或表現為包括淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件的單一多肽之部分。在一些實施例中，可藉由裂解信號及/或核糖體跳躍序列將編碼EGFR識別域之胺基酸與編碼嵌合抗原受體之胺基酸隔開。核糖體跳躍及/或裂解信號可為此項技術中已知的任何核糖體跳躍及/或裂解信號。不受理論限制，核糖體跳躍序列可為例如具有胺基酸序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：77)之T2A(亦稱為2A-1)。不受理論限制，裂解信號及核糖體跳躍序列之其他實例包括FMDV 2A(F2A)、馬A型鼻病毒2A(簡稱E2A)、豬捷申病毒1 2A(P2A)及扁刺蛾屬(Thoseaasigna)病毒2A(T2A)。在一些實施例中，編碼識別域之聚核苷酸序列可與CAR或淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件在相同的轉錄物上，但藉由內部核糖體進入位點與編碼CAR或淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之聚核苷酸序列隔開。
在如本文中例示性列舉之其他實施例中，識別域可表 現為與淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件融合的融合多肽之部分。此類構築體與單獨的多肽相比提供，尤其結合本文中提供之其他「空間節省」元件，在RNA基因組上佔用更少的基因組空間的優勢。在一個說明性實施例中，eTag表現為與IL7Rα突變體融合的融合多肽，如在本文中實驗地論證。
嵌合抗原受體
在本發明之一些態樣中，工程化信號傳導多肽為嵌合抗原受體(CAR)或編碼CAR之聚核苷酸，為簡單起見，其在本文稱為「CAR」。本發明之CAR包括：a)至少一個抗原特異性靶向區(ASTR)；b)跨膜域；及c)胞內活化域。在說明性實施例中，CAR之抗原特異性靶向區為抗體針對靶標抗原之scFv部分。在說明性實施例中，胞內活化域來自CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70，且在一些其他說明性實施例中，來自CD3z。在說明性實施例中，CAR進一步包含共刺激域，例如上文在調節域章節中所提供之共刺激域中之任一者，且在其他說明性實施例中，共刺激域為4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM之胞內共刺激域。在一些實施例中，CAR包括上文列於跨膜域章節中之跨膜域中之任一者。
本發明之CAR可存在於真核細胞(例如，哺乳動物細胞)之質膜中，其中合適之哺乳動物細胞包括(但不限於)細胞毒性細胞、T淋巴球、幹細胞、幹細胞之子代、祖細胞、祖細胞之子代及NK細胞、NK-T細胞及巨噬細胞。當存在於真核細胞之質膜中使，本發明之CAR在存在一或多個靶標抗原(在某些條件下，結合ASTR)下經 活化。靶標抗原為特異性結合對之第二成員。特異性結合對之靶標抗原可為可溶性(例如，未結合至細胞)因子；存在於諸如靶標細胞之細胞之表面上的因子；存在於實體表面上之因子；存在於脂質雙層上之因子；以及類似者。當ASTR為抗體，且特異性結合對之第二成員為抗原時，抗原可為可溶性(例如，未結合至細胞)抗原；存在於諸如靶標細胞之細胞之表面上的抗原；存在於實體表面上之抗原；存在於脂質雙層上之抗原；以及類似者。
在一些情況下，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，使細胞中之至少一個核酸之表現增加。舉例而言，在一些情況下，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，與在不存在一或多種靶標抗原下的核酸之轉錄水準相比，使細胞中之至少一個核酸之表現增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約75%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍，或大於10倍。
作為一實例，本發明之CAR可包括含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)之胞內信號傳導多肽。
在一些情況下，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，可使得細胞產生一或多種細胞介素增加。舉例而言，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，與在不存在一或多種靶標抗原下細胞所產生之細胞介素量相比，可使得細胞產生細胞介素增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約75%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少 約10倍，或大於10倍。其產量可增加之細胞介素包括(但不限於)干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-a)、IL-2、IL-15、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10；趨化因子；生長因子；以及類似者。
在一些情況下，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，可導致細胞中之核酸之轉錄增加及細胞產生細胞介素增加兩者。
在一些情況下，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，產生細胞朝向靶標細胞之細胞毒性活性，該靶標細胞在其細胞表面上表現抗原，該抗原與CAR之第一多肽之抗原結合域結合。舉例而言，當真核細胞為細胞毒性細胞(例如，NK細胞或細胞毒性T淋巴球)時，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，使細胞朝向靶標細胞之細胞毒性活性增加，該靶標細胞在其細胞表面上表現一或多種靶標抗原。舉例而言，當真核細胞為NK細胞或T淋巴球時，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，與在不存在一或多種靶標抗原下的細胞之細胞毒性活性相比，使得細胞之細胞毒性活性增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約75%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍，或大於10倍。
在一些情況下，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，可產生與其他CAR活化相關之事件，諸如增殖及擴展(由於細胞分裂或抗凋亡反應增強)。
在一些情況下，本發明之CAR在存在於真核細胞之質膜中時且由一或多種靶標抗原活化時，可產生與其他CAR活化相關之 事件，諸如胞內信號傳導調節、胞分化或細胞死亡。
在一些情況下，本發明之CAR受微環境限制。此特性通常為CAR之ASTR域之受微環境限制性質的結果。因此，本發明之CAR可具有較低結合親和力或，在說明性實施例中，在微環境之條件下比在正常生理環境之條件下可具有針對一或多種靶標抗原之更高結合親和力。
淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件
儘管細胞連續增加，但周邊T淋巴球數在整個成年期間維持非常穩定的水準，此係由於自胸腺移出及回應於抗原遭遇之增殖，及由於在抗原清除之後去除抗原特異性效應的細胞之損耗(Marrak,P.等人.2000.Nat Immunol 1：107-111；Freitas,A.A.等人.2000.Annu Rev Immunol 18：83-111)。周邊T細胞區室之尺寸由影響增殖及存活兩者之多個因素來調節。然而，在淋巴球減少的環境下，T淋巴球獨立於同源抗原分裂，此係由於維持周邊T細胞區室之尺寸的「急性恆定增殖」機制。已藉由活體內增殖T細胞且將其等引入至淋巴消耗的個體中而在過繼細胞療法期間之個體或患者中建立淋巴球減少症之條件，從而導致經轉移T細胞之植入及抗腫瘤功能增強。然而，個體之淋巴消耗係不希望的，此係由於其可引起嚴重的副作用，包括免疫紊亂及死亡。
研究已展示，淋巴消耗移除作為穩定細胞介素之細胞槽的內源性淋巴球，從而釋放細胞介素以誘導過繼轉移之細胞的存活及增殖。已知一些諸如IL-7及IL-15之細胞介素介導T細胞之抗原非依賴性增殖且因此能夠在非淋巴球減少的環境中誘發穩定增殖。然而，此等細胞介素及其受體具有在穩態下防止淋巴增殖性疾病的固有控 制機制。
本文提供之許多態樣包括淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件，或編碼其之核酸，通常作為工程化信號傳導多肽之部分。因此，在本發明之一些態樣中，工程化信號傳導多肽為淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件(LE)，諸如嵌合淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件(CLE)。通常，LE包含胞外域、跨膜域及驅動增殖之至少一個胞內信號傳導域，且在說明性實施例中，包含第二胞內信號傳導域。如本文中(參見例如實例11及實例12)所例示，其中存在CLE之第一及第二胞內信號傳導域，第一胞內信號傳導域定位於膜相關基元與第二胞內域之間。在說明性實施例中，LE之胞內域或LE中具有兩個或多於兩個胞內域之第一胞內域不為來自含ITAM胞內域之功能性胞內活化域，例如來自CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70之胞內域，且在其他說明性子實施例中，CD3z之胞內域。在說明性實施例中，LE之第二胞內域不為4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM之共刺激域。在說明性實施例中，LE之胞外域不包含單鏈可變片段(scFv)。在其他說明性實施例中，在與結合配偶體結合時活化LE的LE之胞外域不包含單鏈可變片段(scFv)。
CLE不包含ASTR及來自以下之活化域兩者：CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70。不受理論限制，咸信胞外域及跨膜域在LE中起支援作用，確保胞內信號傳導域在有效構象/定向/定位中以供驅動增殖。因此，咸信LE驅動增殖的能力由LE之胞內域提供，且咸信胞外域及跨膜域相對於胞內域起次要作用。淋巴增殖性元件包 括作為信號傳導多肽之胞內域，該信號傳導多肽能夠經由膜相關基元(例如跨膜域)驅動與膜相關聯的T細胞或NK細胞之增殖，且定向於活性構象中或能夠定向至活性構象中。在說明性實施例中，LE之ASTR不包括scFv。本文中提供用於將胞內域與膜相關聯的策略，諸如藉由包括跨膜域、GPI錨定物、肉豆蔻醯化區、棕櫚醯化區及/或異戊二烯化區。在一些實施例中，淋巴增殖性元件不包括胞外域。
LE之胞外域、跨膜域及胞內域可改變其各別胺基酸長度。舉例而言，對於包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之實施例，存在對可封裝至反轉錄病毒顆粒中以使具有較短胺基酸序列之LE可在某些說明性實施例中有利的聚核苷酸之長度的限制。在一些實施例中，LE之總長度可在3個與4000個胺基酸之間，例如在10個與3000個胺基酸、10個與2000個胺基酸、50個與2000個胺基酸、250個與2000個胺基酸之間，且在說明性實施例中，在50個與1000個胺基酸、100個與1000個胺基酸或250個與1000個胺基酸之間。當存在以形成胞外域及跨膜域時，胞外域可在1個與1000個胺基酸之間，且通常在4個與400個胺基酸之間，在4個與200個胺基酸之間，在4個與100個胺基酸之間，在4個與50個胺基酸之間，在4個與25個胺基酸之間或在4個與20個胺基酸之間。在一個實施例中，對於本發明之此態樣的胞外域及跨膜域，胞外區為GGGS。跨膜域或胞外域及跨膜域之跨膜區可在10個與250個胺基酸之間，且更通常長度為至少15個胺基酸，且長度可例如在15個與100個胺基酸、15個與75個胺基酸、15個與50個胺基酸、15個與40個胺基酸、15個與30個胺基酸之間。胞內信號傳導域可例如在10個與1000個胺基酸、10個與750個胺基酸、10個與500個胺基酸、10個與250個胺基酸或10個與100個胺基酸之間。在說明性 實施例中，胞內信號傳導域可為至少30個胺基酸，或在30個與500個胺基酸、30個與250個胺基酸、30個與150個胺基酸、30個與100個胺基酸、50個與500個胺基酸、50個與250個胺基酸、50個與150個胺基酸或50個與100個胺基酸之間。在一些實施例中，特定基因之胞內信號傳導域與來自彼胞內信號傳導域之序列(諸如本文中針對該胞內域提供之序列)的至少10個、25個、30個、40個或50個胺基酸至少90%、95%、98%、99%、100%一致，該序列達至整個胞內域序列之大小，且可包括例如達至額外的1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個或25個胺基酸，其限制條件為此類序列仍能夠提供本文中所揭示LE特性中之任一者。
在本文中之實例10、實例11及實例12中識別出CLE促進用慢病毒顆粒轉導之PBMC細胞培養物的增殖，該等慢病毒顆粒在轉導後的第7天與第21天、28天、35天及/或42天之間編碼CLE。此等實例提供測試及/或標準，其可用以識別任何測試多肽，包括LE或LE之測試域，諸如第一胞內域或第二胞內域或第一及第二胞內域兩者是否確實為LE或LE之有效胞內域，或特別有效之LE或LE之胞內域。因此，在某些實施例中，本文中所提供之包括LE或編碼LE之聚核苷酸或核酸的任何態樣或其他實施例可陳述LE滿足或提供以下特性或能夠提供及/或擁有以下特性：用於識別本文中所提供之LE的所識別測試或標準中之任一個或多個的特性，或用反轉錄病毒顆粒(諸如編碼LE之慢病毒顆粒)經基因方式修飾及/或經轉導之細胞能夠提供、適應、擁有以下特性及/或經修飾以供實現所陳述測試中之一或多者的結果。在一個實施例中，LE提供、能夠提供及/或擁有以下特性(或用編碼LE之反轉錄病毒顆粒經基因方式修飾及/或經轉導之細胞能夠、 適用於、擁有以下特性及或經修飾以供)：相較於在相同條件下之對照反轉錄病毒顆粒(例如，慢病毒顆粒)，在不存在外源性添加之細胞介素的情況下在轉導後活體內培養之第7天與第21天、第28天、第35天及/或42天之間提高對用慢病毒轉導之預活化PBMC的擴展，該等慢病毒包含編碼LE之核酸和包含CD3ζ胞內活化域但不包含共刺激域的抗CD19 CAR。在一些實施例中，可基於與對照細胞之比較來進行針對用具有編碼測試構築體(編碼推定LE(測試細胞))之基因組的反轉錄病毒顆粒(例如，慢病毒顆粒)轉導之細胞的經改良或增強存活、擴展及/或增殖的淋巴增殖性元件測試，該等對照細胞可為例如未經轉導之細胞，或用與慢病毒顆粒相同之對照反轉錄(例如，慢病毒)顆粒轉導的細胞，該慢病毒顆粒包含編碼淋巴增殖性元件之核酸，但缺少淋巴增殖性元件，或缺少測試多肽構築體之一或多個胞內域，但包含相同胞外域(若存在)及各別測試多肽構築體之相同跨膜區或膜靶向區。在一些實施例中，用具有編碼本文中如例示淋巴增殖性元件所識別的淋巴增殖性元件或其胞內域之基因組的反轉錄病毒顆粒(例如，慢病毒顆粒)轉導對照細胞。在此實施例中，測試標準可包括：當使用具有相對於編碼對照淋巴增殖性元件編碼測試構築體之基因組的反轉錄病毒顆粒(例如，慢病毒顆粒)，通常藉由分析經其轉導之細胞進行測試時，存在至少足夠多的富集、存活及/或擴展，或不存在富集、存活及/或擴展的統計差異。在一些實施例中，本文中之淋巴增殖性元件的例示性或說明性實施例為針對此測試之對照淋巴增殖性元件的說明性實施例。
在一些實施例中，藉由進行複製及/或進行統計測試來進行針對推定或測試淋巴增殖性元件之經改良特性的此測試。技術人 員將認識到，許多統計測試可用於此淋巴增殖性元件測試。設想此等實施例中之此測試將為此項技術中所已知的任何此類測試。在一些實施例中，統計測試可為T測試或Mann-Whitney-Wilcoxon測試。在一些實施例中，測試構築體之標準化富集水準在小於0.1或小於0.05或小於0.01之p值下為顯著的。
在另一實施例中，LE提供、能夠提供及/或擁有以下特性(或用LE以基因方式修飾及/或轉導之細胞能夠提供、適用於、擁有以下特性及/或經修飾以供)：在不存在外源添加之細胞介素的情況下，在活體內培養之第7天與第21天、第28天、第35天及/或第42天之間，當與包含CD3ζ胞內活化域但不包含共刺激域之抗CD19 CAR一起轉導時，用編碼LE之核酸轉導之預活化PBMC的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍擴展，或在1.5倍與25倍擴展之間，或在2倍與20倍擴展之間，或在2倍與15倍擴展之間，或在5倍與25倍擴展之間，或在5倍與20倍擴展之間，或在5倍與15倍擴展之間。在一些實施例中，於PBMC之存在下，例如以經轉導細胞與PBMC(其可例如來自經匹配供體)之1：1比率進行測試，且在一些實施例中，該測試不存在PBMC之情況下進行。在一些實施例中，如實例11或實例12中所提供進行此等測試中任一者的擴展分析。在一些實施例中，測試可包括其他統計測試及截止值，諸如低於0.1、0.05或0.01之P值，其中測試多肽或編碼該測試多肽之核酸需要滿足一個或兩個臨限值(亦即倍數擴展及統計截止值)。
對於本文中所提供之淋巴增殖性元件測試中之任一者，在轉導後的第7天與第14天、第21天、第28天、第35天、第42天或第60天之間，將測試細胞之數目與對照細胞之數目進行比較。在一 些實施例中，可藉由對DNA進行測序及對存在於各構築體中之標識符進行計數來測定測試及對照細胞之數目。在一些實施例中，可例如用血細胞計數器或細胞計數器直接地計數測試及對照細胞之數目。在一些實施例中，所有測試細胞及對照細胞可生長於相同容器、孔或燒瓶內。在一些實施例中，可將測試細胞接種於一或多個孔、燒瓶或容器中，且可將對照細胞接種於一或多個燒瓶或容器中。在一些實施例中，可將測試及對照細胞可單獨接種至孔或燒瓶中，例如每孔一個細胞。在一些實施例中，可使用富集水準將測試細胞與對照細胞之數目進行比較。在一些實施例中，可藉由各構築體將稍後時間點處(第14天、第21天、28天、35天或第45天)之細胞數除以第7天之細胞數來計算測試或對照構築體之富集水準。在一些實施例中，可藉由針對未經轉導之細胞將一時間點處(第14天、第21天、28天、35天或第45天)之細胞數除以在彼時間點處之細胞數來計算測試或對照構築體之富集水準。在一些實施例中，可將各測試構築體之富集水準標準化為各別對照構築體之富集水準以產生經標準化之富集水準。在一些實施例中，在測試構築體中編碼之LE提供(或用具有編碼LE之基因組的反轉錄病毒顆粒(例如，慢病毒顆粒)以基因方式修飾及/或轉導的細胞能夠提供、適用於、擁有以下特性及/或經修飾以供)至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍經標準化富集水準，或在1.5倍與25倍經標準化富集水準之間，或在3倍與20倍經標準化富集水準之間，或在5倍與25倍經標準化富集水準之間，或在5倍與20倍經標準化富集水準之間，或在5倍與15倍經標準化富集水準之間。可例如藉由直接細胞計數來量測富集。截止值可基於單次測試，或兩次、三次、四次或五次重複，或基於許多次重複。當淋巴增殖性元件滿足一或多 次重複測試，或滿足或超出所有重複之截止值時，可滿足截止值。在一些實施例中，富集經量測為log2((測試日之標準化計數資料+1)/(第7天之標準化計數資料+1))。
如實例10、實例11及實例12中所證實，CLE經識別來自包括編碼測試嵌合多肽(經設計以包含咸信誘導淋巴或骨髓細胞之增殖及/或存活的胞內域)及抗CD19 CAR(包含胞內活化域但不包含共刺激域)之構築體之構築體庫。在包含PBMC、淋巴細胞之商業介質(完整OpTmizerTM CTSTM T-細胞擴展SFM)、重組人類介白素-2(100IU/ml)及抗CD3 Ab(OKT3)(50ng/ml)的預活化反應混合物中進行預活化，該預活化在37℃下執行隔夜。在預活化後，在將測試及對照慢病毒顆粒添加至預活化反應混合物之後，在在37℃下以5之感染複數(MOI)進行轉導隔夜。一些對照慢病毒顆粒含有編碼具有胞外域及跨膜域但不具有胞內域之多肽的構築體。相反，測試慢病毒顆粒包含編碼具有胞外域及跨膜域以及一個或兩個胞內域之多肽的構築體。在轉導後，將添加完整OpTmizerTM CTSTM T-細胞擴展SFM以將反應混合物稀釋5倍至20倍，且在37℃下培養細胞多達45天。在轉導後的第7天之後，對培養物「饋入」或不(「未饋入」)額外未經轉導供體匹配之PBMC。在初始地形成轉導反應混合物之後，不將額外細胞介素(例如，IL-2、IL-7或IL-15且無其他淋巴有絲分裂劑)添加至未存在於商業介質中之此等培養物。藉由分析實際上計數為經混合培養PBMC細胞群中各構築體的唯一標識符之核酸序列計數的細胞計數之富集來量測擴展，使得富集為正，計算為分析之最後一天之標準化計數加一與第7天之計數加一之間的比率的以2為底的對數。關於經執行以識別LE之測試的額外細節提供於實例10、實例11及實例12中，包括實驗條件。
如實例10、實例11及實例12中所展示，將構築體識別為CLE，此係因為CLE在此等饋入或未饋入培養物中誘導增殖/擴展，而無需在第7天與第21天、第28天、35天及/或42天之間添加細胞介素(諸如IL-2)。舉例而言，相較於不包括任何胞內域之對照構築體，在轉導後第7天與第21天、第28天、第35天及/或第42天之間，實例10藉由識別提供此等活體外培養物之經增加擴展的測試CLE來識別有效CLE，而不論是否饋入或未饋入有經未經轉導之PBMC。實例10揭示，與轉導後之第7天存在的各對照構築體(不包括胞內域)相反，至少一個且通常多於一個包括來自測試基因之胞內域的測試CLE提供更多擴展。實例10進一步提供統計方法，該統計方法用以識別關於第一胞內域以及來自此等基因之一或多個例示性胞內域的異常有效之基因。該方法使用Mann-Whitney-Wilcoxon測試及小於0.1或小於0.05之假髮現截止率。實例12例如藉由分析經計算為具有基因之所有構築體的組合得分的彼基因得分來識別第一胞內域或第二胞內域的特別有效之基因。如實例12中所進行之測試中之一些所展示，此類分析可使用以下截止值：大於1，或大於陰性對照構築體且無任何胞內域，或大於2。
如由本文中之實例所展示，在包括LE(其通常包括CAR)之例示性態樣及實施例中，諸如本文中所提供之用於以基因方式修飾及/或轉導、以基因方式修飾及/或轉導細胞的方法及其用途，經基因方式修飾之細胞經修飾以便擁有在基因修飾及/或轉導之前細胞不預先擁有之新特性。此特性可由使用編碼CAR或LE(且在說明性實施例中，CAR及LE兩者)之核酸的基因修飾來提供。舉例而言，在某些實施例中，在不存在所添加IL-2之情況下或不存在所添加細胞介素(諸如IL-2、IL-15或IL-7之)的情況下，且在某些說明性實施例中， 在由CAR識別之抗原的存在下，經基因方式修飾及/或經轉導之細胞能夠、適用於、擁有以下特性及/或經修飾以供在離體培養物中存活及/或增殖至少7天、14天、21天、28天、35天、42天或60天，或在轉導後的第7天與第14天、第21天、第28天、第35天、第42天或第60天之間，其中方法包含使用於其表面上具有假型化元件及視情況選用之分離或融合活化域的反轉錄病毒顆粒以基因方式修飾及/或轉導，且通常不需要預活化。
藉由在某些實施例中能夠增進存活及/或增殖，意謂相較於與在其經基因方式修飾及/或經轉導之前經基因方式修飾及/或經轉導之細胞或與用反轉錄病毒顆粒(與包含LE或推定LE但不具有LE或LE之胞內域的受測試反轉錄病毒顆粒相同)轉導之對照細胞相同的對照細胞，在不存在一或多種所添加細胞介素(諸如IL-2、IL-15或IL-7)或所添加淋巴球有絲分裂劑的情況下，經基因方式修飾及/或經轉導之細胞呈現出、能夠、適用於、擁有以下特性及或經修飾以供改善培養介質中離體或活體外培養的存活或擴展，其中藉由向培養介質添加之該一或多種細胞介素(諸如IL-2、IL-15或IL-7)或該淋巴球有絲分裂劑來促進該(該等)對照細胞之該存活或增殖。藉由所添加細胞介素或淋巴球有絲分裂劑，意謂將細胞介素或淋巴球有絲分裂劑自外源添加至培養介質，使得相較於初始培養介質，在培養細胞期間，該細胞介素或淋巴球有絲分裂劑之濃度在培養介質中增加，且在一些實施例中，在該添加之前可不存在初始培養介質。藉由「添加」或「外源添加」，意謂將此類細胞介素或淋巴球有絲分裂劑添加至用於在以基因方式修飾及/或轉導之後培養經基因方式修飾及/或經轉導之細胞的淋巴球介質，其中該培養介質可或可能尚未擁有細胞介素或淋巴球有絲 分裂劑。在無外源性添加之細胞介素或淋巴球有絲分裂劑的情況下，包括多種介質組分之混合物的所有或部分介質通常經儲存，且在說明性實施例中，運送至培養發生的位點。在一些實施例中，淋巴球介質購自供應商，且諸如未由供應商僱傭且未定位於供應商機構內之技術人員的使用者將外源性添加之細胞介素或淋巴球有絲分裂劑添加至淋巴球介質，且隨後在存在或不存在此類外源性添加之細胞介素或淋巴球有絲分裂劑的情況下培養經基因方式修飾及/或經轉導之細胞。
在一些實施例中，經改良或增進之存活、擴展及/或增殖可展示為：藉由對來自用具有編碼CLE之基因組的反轉錄病毒顆粒(例如，慢病毒顆粒)轉導之細胞的DNA進行測序及對存在於來自各CLE之唯一標識符中的序列之出現進行計數所測定之細胞數的增加。在一些實施例中，可藉由於每一時間點處用血細胞計數器或細胞計數器直接對細胞計數來測定經提高之存活及/或經提高之擴展。在一些實施例中，可藉由針對各構築體將稍後時間點處(第21天、第28天、第35天及/或第45天)之細胞數除以第7天之細胞數來計算經改良之存活及/或經改良之擴展及/或富集。在一些實施例中，可藉由血細胞計數器或細胞計數器來對細胞進行計數。在一些實施例中，可使用各特定測試構築體之核酸計數或細胞計數所測定的富集水準標準化為各別對照構築體(亦即，具有相同胞外域及跨膜域但缺少存在於測試構築體中之胞內域的構築體)之富集水準。在此等實施例中，在構築體中編碼之LE提供(或用具有編碼LE之基因組的反轉錄病毒顆粒(例如，慢病毒顆粒)經基因方式修飾及/或經轉導的細胞能夠提供、適用於、擁有以下特性及/或經修飾以供)至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍經標準化富集水準，或在1.5倍與25倍經 標準化富集水準之間，或在3倍與20倍經標準化富集水準之間，或在5倍與25倍經標準化富集水準之間，或在5倍與20倍經標準化富集水準之間，或在5倍與15倍經標準化富集水準之間。
在本文中之說明性實施例中，通常藉由用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒以基因方式修飾及/或轉導T細胞及/或NK細胞，將一或多個淋巴增殖性元件引入至T細胞及/或NK細胞中，該等非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之基因組編碼淋巴增殖性元件作為工程化信號傳導多肽之部分。淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包括信號傳導胞內域或可包括多於一個胞內域。淋巴增殖性元件在某些說明性實施例中，淋巴增殖性元件包括兩個胞內域。本文中所提供且在實例10、實例11及實例12中所論述之表8至25為CLE提供一個胞內域，且為CLE提供使用本文中所提供之實驗方法識別之兩個胞內域。對於在此等實例中包括兩個胞內信號傳導域之CLE，第一胞內信號傳導域在跨膜域與第二胞內信號傳導域之間。LE之「胞內信號傳導域」有時在本文中稱為LE之「胞內域」。此等實例確認，絕大多數所測試第一胞內域(P3部分)增進經基因方式修飾的PBMC之增殖/擴展之效果，且發現，所有所測試之第二胞內域(P4部分)均發現於至少一個且通常更有效之CLE構築體中(例如，參見表25)。此等P4部分中之一些經識別為能夠促進不具有P3部分的經基因方式修飾的PBMC之增殖/擴展，且因而能夠充當LE之第一胞內信號傳導域。此外，所測試候選嵌合多肽包括表7中所識別且經展示存在於前100個構築體中之至少一者中的胞外域與胞內域之不同組合(表25)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件胞內域可包括表7中所列的之胞內部分(S036至S216)中的任一者，該等胞內部分包括為實例10、實例11或實例12中之P3部 分，或在不存在P3部分的情況下，在實例10、實例11或實例12中識別為在第7天與第21天之間或稍後時間點具有誘導擴展之活性的任何P4部分。不受理論限制，在含有兩個胞內信號傳導域之CLE中，第一胞內信號傳導域(實例10、實例11或實例12及圖15至圖18中之P3)經選擇以對CLE誘導經轉導細胞之增殖的能力具有更大影響，且可稱為CLE之核心或主要信號傳導域。第二胞內信號傳導域(實例10、實例11及實例12以及圖15至圖18中之P4)經選擇以作為第一胞內信號傳導域之共刺激域。此外，胞外域及跨膜域(實例11及圖16至圖17中之P1/2；及分別於實例10及實例12以及圖15至圖18中之P1及P2)經設計以在將第一胞內信號傳導域定向於活性構象或定向中起作用。在一些實施例中，胞內信號傳導域可與SEQ ID NO：404至509中之任一者具有至少80%、90%或95%或可具有100%序列一致性。在一些實施例中，胞內信號傳導域可與來自以下之胞內域具有至少80%、90%或95%或可具有100%序列一致性：BTLA、CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD8A、CD8B、CD27、突變型δLck CD28、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CD137、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、DAP10/CD28、DAP12、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、FCGRA2、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR、PRLR、TNERSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、 TNFRSF14、TNFRSF18或ZAP70，或促進信號傳導之變體或片段。在一些實施例中，胞內域可與來自以下之胞內域具有至少80%、90%或95%或可具有100%序列一致性：CD2、CD4、CD8A、CD8B、CD40、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、FCGR2A、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR及PRLR，或促進信號傳導之變體或片段。
在一些說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為或可包含細胞介素，或在另外的說明性實施例中，細胞介素受體，或包括其信號傳導域之片段，其活化STAT3路徑、STAT4路徑，或甚至在另外的說明性實施例中，Jak/STAT5路徑。由此，在非限制性實例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為細胞介素受體或包括其信號傳導域之活性片段，諸如介白素受體，或包括活化STAT5之其信號傳導域之活性片段。因此，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為促進增殖且視情況存活(抗凋亡)並視情況提供增強淋巴球之分化狀態、增殖潛能或對細胞死亡之抗性之共刺激信號的多肽。在說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為誘導T細胞及/或NK細胞之增殖的多肽。說明性淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件藉由活化STAT5誘導增殖。因此，此淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之片段在說明性實施例中保留藉由活化STAT5誘導T細胞及/或NK細胞之增殖的能力。
在說明性實施例中，當存在於經基因方式修飾之PBMC、淋巴球或經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞中時，淋巴增殖性元件能夠促進淋巴球增殖/擴展且在不存在細胞至細胞介素(諸如IL-15、IL-7，或在說明性實施例中，IL-2)之暴露的情況下，在一些說明性實施例中，進一步在不存在由細胞表現之CAR之ASTR之靶標的情況下，或在某些說明性實施例中，在由CAR識別之抗原之存在下(其中方法包含使用反轉錄病毒顆粒以基因方式及/或轉導，該逆轉錄病毒顆粒在其表面上具有假分化元件和視情況選用之分離或融合活化域，且通常不需要預活化)，在培養6天、7天、14天、21天或35天期間視情況離體或活體外存活於培養物中。
在本文所呈現之方法及組合物中之一些中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件用於促進經基因方式修飾之T細胞活體內之增殖或擴展而不必使個體淋巴消耗。由此，可執行本文所提供之方法(包括通常藉由轉導此類T細胞及/或NK細胞而將淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件插入至個體之休眠T細胞及/或NK細胞中)之非限制性說明實施例，而不在執行該方法之前、期間及/或之後使個體淋巴消耗，或不在執行此方法之前自個體收集血液之前、期間及/或之後使個體淋巴消耗，或不離體以基因方式修飾來自個體之T細胞及/或NK細胞之前、期間及/或之後，及/或在將該等經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞再引入至個體中之前、期間及/或之後使個體淋巴消耗。促進T細胞活體內之增殖的因子包括細胞介素及其受體，其中受體通常包括配位體結合域及信號傳導域。在一些實施例中，用於本文所揭示之方法及組合物中的淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為細胞介素及/或細胞介素受體。細胞介素可為介白素，且細胞介素受體可為介白素受體。 淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為細胞介素之功能性片段及/或細胞介素受體之功能性片段(諸如其信號傳導域)，其中該片段能夠例如藉由活化STAT5來促進T細胞之增殖。
在一些實例中，本文中之方法及組合物中的細胞介素淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件包括以下中之一或多者：介白素-7(IL-7)或其受體(IL-7R)，或其信號傳導域；介白素-12(IL-12)或其受體(IL-12R)，或其信號傳導域；介白素-23(IL-23)或其由IL-12R β1及IL-23R組成之受體，或其信號傳導域；介白素-27(IL-27)或其受體(IL-27R)，或其信號傳導域；介白素-15(IL-15)或其受體(IL-15R)，或其信號傳導域；介白素-21(IL-21)或其受體(IL-21R)，或其信號傳導域；或轉變生長因子β(TGFβ)或其受體(TGFβR)或其信號傳導域；或TGFβ誘餌受體(TGF-β-顯性-負型受體II(DNRII))。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為IL-12R或TGFβ誘餌受體(TGF-β-顯性負型受體II(DNRII))。
IL-7結合至IL-7受體(一種由IL-7R α及常見的γ鏈組成之雜二聚體)。結合產生對於胸腺內之T細胞發育及周邊內之存活至關重要的信號級聯。已知IL-7與IL-7受體之結合使Jak/STAT5路徑活化。
IL-12涉及原生T細胞分化成Th1細胞(Hsieh CS等人.1993.Science.260(5107)：547-9)且稱為T細胞刺激因子。IL-12結合至IL-12受體(其為由IL-12R-β1及IL-12R-β2形成之雜二聚體受體)。IL12可藉由活化STAT4而起作用，但經展示同樣活化T細胞中之STAT5(Ahn,H.等人.1998.J.Immun.161：5893-5900)。IL-12家族由細胞介素IL-12、IL-23及IL-27組成。IL-23之受體由IL-12R β1及IL-23R組成。IL-27為由兩種不同基因(Epstein-Barr病毒誘導之基因3(EBI3) 及IL-27p28)組成之雜二聚體細胞介素。IL-27與IL-27受體相互作用。
IL-15為結構及功能上類似於IL-2之T細胞及NK細胞刺激因子。兩種細胞介素均誘導T細胞之增殖；且認為其共用功能係由使用IL-2/IL-15Rβ及常見γ鏈之兩種受體產生的。IL-15之信號傳導路徑藉由與IL-15Rα受體結合，且隨後向其細胞表面上帶有IL-15Rβγc複合物之周圍細胞呈遞來開始。在結合IL-15β後，子單元即活化詹納斯激酶1(Janus kinase 1；Jak1)及γc子單元詹納斯激酶3(Jak3)，該γc子單元詹納斯激酶3導致STAT3及STAT5之磷酸化及活化。
IL-21在經活化之人類CD4+T細胞及NKT細胞中表現，且IL-21表現在T輔助細胞之Th2及Th17子集中經上調。IL-21受體(IL-21R)在T細胞、B細胞及NK細胞之表面上表現且在結構上類似於如同IL-2R或IL-15的其他I型細胞介素之受體。IL-21R需要與常見γ鏈(γc)二聚合以便結合IL-21。當結合至IL-21時，IL-21受體經由Jgk/STAT路徑起作用，從而活化STAT1、STAT3及STAT5。
TGFβ誘餌受體(TGF-β-顯性-負型受體II(DNRII))藉由與天然受體競爭TGFβ結合來阻斷TGFβ信號傳導。TGFβ-DNRII為激酶失活之截斷形式之RII，其含有RII之胞外TGFβ結合域及跨膜域。TGFβ-DNRII結合配位體但並不使RI磷酸化及活化，此從而減少或消除Smad磷酸化。
已在患有B細胞及T細胞急性淋巴母細胞白血病(B-ALL及T-ALL)之個體中識別出IL-7Rα之功能性增加的突變(Zenatti PP等人.2011.Nat Genet 43：932-939；Snochat,C.等人.2011.J Exp Med 208：901-908；McElroy,C.A.等人.2012.PNAS 109(7)：2503-2508)。突變包括在IL-7Rα TMD之N端區中之插入及缺失，其中幾乎所有的序列 均含有額外的Cys殘基，及S165至C165突變。半胱胺酸導致受體之組成性活化。所有T群組中之突變中的一些使JAK1活化。此等功能性增加的IL-7R突變體可在本文所提供之態樣中之任一者中用作淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中之一者。
因此，在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為經突變之IL-7受體。在其他實施例中，經突變之IL-7受體為組成性活性的，從而在不存在細胞介素配位體之情況下使JAK-STAT5路徑活化。在又其他實施例中，經突變之IL-7受體包含在237與254之間的位置處的1個至10個胺基酸插入，該插入包括半胱胺酸殘基，該半胱胺酸殘基包括組成性活化STAT5路徑之能力。在一些實施例中，經突變之IL-7受體為IL-7Rα-insPPCL(由SEQ ID NO：82表示)。此外，在本文提供之一些嵌合淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件(CLE)實施例中，域中之一或多個(但並非所有)來自IL-7Rα-insPPCL。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為嵌合細胞介素受體，諸如但不限於連接至其受體之細胞介素，該受體通常組成性活化與對應經活化野生型細胞介素受體(諸如STAT3、STAT4，以及在說明性實施例中，STAT5)相同的STAT路徑。在一些實施例中，嵌合細胞介素受體為介白素或其片段，該介白素或其片段經由連接子連接至或共價連接至其同源受體。在一些實施例中，嵌合細胞介素受體為連接至IL-7Rα之IL-7。在其他實施例中，嵌合細胞介素受體為連接至IL-7Rα域的IL-7，諸如IL-7Rα之胞外域及/或IL-7Rα之跨膜域。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為未連接至細胞介素之細胞介素受體，且實際上在一些實施例中，本文所提供之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為未連接至細胞介素之組成性 活性的細胞介素受體。此等嵌合IL-7受體在表現時通常組成性活化STAT5。
在本文提供之包括淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，其中淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為細胞介素或細胞介素受體多肽或其包含信號傳導域之片段，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包含經由連接子共價連接至其同源介白素受體多肽之部分。通常，同源介白素受體之此部分包括能夠結合介白素細胞介素之胞外域及跨膜域之功能性部分。在一些實施例中，胞內域為同源介白素受體之胞內部分。在一些實施例中，胞內域為能夠促進淋巴球增殖之不同細胞介素受體之胞內部分。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為經由連接子共價連接至其全長同源介白素受體多肽之介白素多肽。
在本文所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自跨膜蛋白CD40之胞內部分。CD40蛋白含有TRAF蛋白之若干結合位點。不受理論限制，TRAF1、TRAF2及TRAF3之結合位點定位於CD40之胞內部分的膜遠端域且包括胺基酸序列PXQXT(SEQ ID NO：522)，其中各X可為任何胺基酸(對應於SEQ ID NO：416之胺基酸35至39)(Elgueta等人，Immunol Rev.2009年5月；229(1)：152-72)。TRAF2亦經展示以與共有序列SXXE(SEQ ID NO：523)結合，其中各X可為任何胺基酸(對應於SEQ ID NO：416之胺基酸57至60)(Elgueta等人，Immunol Rev.2009年5月；229(1)：152-72)。TRAF6之顯著結合位點位於CD40之胞內部分的膜近端域且包括共有序列QXPXEX(SEQ ID NO：524)，其中各X可為任何胺基酸(對應於SEQ ID NO：416之胺基酸16至21)(Lu等人，J Biol Chem. 2003年11月14日；278(46)：45414-8)。在說明性實施例中，跨膜蛋白CD40之胞內部分可包括TRAF蛋白之所有結合位點。TRAF結合位點為此項技術中所已知的，且技術人員將能夠在類似CD40多肽中識別對應TRAF結合位點。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：416或SEQ ID NO：417中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自CD40之胞內域具有約30個胺基酸(aa)至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa或約60aa至約65aa之長度。在說明性實施例中，源自CD40之胞內域具有約30aa至約66aa，例如30aa至65aa或50aa至66aa之長度。在包括源自CD40之第一胞內域之淋巴增殖性元件的說明性實施例中，第二胞內域可不為源自以下之胞內域：MyD88、CD28家族成員(例如，CD28、ICOS)、模式識別受體、C反應性蛋白受體(亦即，Nodi、Nod2、PtX3-R)、TNF受體(亦即，CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB)、HSP受體(Lox-1及CD91)或CD28。模式識別受體包括(但不限於)胞吞模式識別受體(亦即，甘露糖受體、清道夫受體(亦即，Mac-1、LRP、肽聚糖、磷壁酸、毒素、CD1 1 c/CR4))；外部信號模式識別受體(Toll樣受體(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10)、肽聚糖識別蛋白(PGRP結合細菌肽聚糖及CD14))；外部信號模式識別受體(亦即NOD受體1與2)及RIG1。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自CD27之胞內部分。全長CD27之胺基酸219處的絲胺酸(對應於SEQ ID NO：413之胺基酸6 處的絲胺酸)經展示為經磷酸化。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：413或SEQ ID NO：413中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自CD27之胞內域具有約30個胺基酸(aa)至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa或約45aa至約50aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自CSF2RB之胞內部分。全長CSF2RB含有胺基酸474至482(對應於SEQ ID NO：421之胺基酸14至22)處的Box 1基元。全長CSF2RB之胺基酸766處的酪胺酸(對應於SEQ ID NO：421之胺基酸306處的酪胺酸)經展示為經磷酸化。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：421中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自CSF2RB之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa、約70aa至約100aa、約100aa至約125aa、約125aa至150aa、約150aa至約175aa、約175aa至約200aa、約200aa至約250aa、約250aa至300aa、約300aa至350aa、約350aa至約400aa或約400aa至約450aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自IL2RB之胞內部分。全長IL2RB含有胺基酸278至286(對應於SEQ ID NO：448之胺基酸13 至21)處的Box 1基元。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：448中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自IL2RB之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa、約70aa至約100aa、約100aa至約125aa、約125aa至150aa、約150aa至約175aa、約175aa至約200aa、約200aa至約250aa或約250aa至300aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自IL6ST之胞內部分。全長IL6ST含有胺基酸651至659(對應於SEQ ID NO：455之胺基酸10至18)處的Box 1基元。全長IL6ST之胺基酸661、胺基酸667、胺基酸782、胺基酸789、胺基酸829及胺基酸839處的絲胺酸(分別對應於SEQ ID NO：455之胺基酸20、胺基酸26、胺基酸141、胺基酸148、胺基酸188及胺基酸198處之絲胺酸)經展示為經磷酸化。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：454或SEQ ID NO：455中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自IL6ST之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa、約70aa至約100aa、約100aa至約125aa、約125aa至150aa、約150aa至約175aa、約175aa至約200aa、約200aa至約250aa或約250aa至300aa 之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自IL17RE之胞內部分。全長IL17RE含有胺基酸372至495(對應於SEQ ID NO：473之胺基酸13至136)處的TIR域。在一些實施例中，適的合胞內域可包括與SEQ ID NO：473中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自IL17RE之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa、約70aa至約100aa、約100aa至約125aa、約125aa至150aa、約150aa至約175aa或約175aa至約200aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自IL2RG之胞內部分。全長IL2RG含有胺基酸286至294(對應於SEQ ID NO：449之胺基酸3至11)處的box 1基元。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：449中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自IL2RG之胞內域具有約30個胺基酸(aa)至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa或約70aa至約100aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組 合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自IL18R1之胞內部分。全長IL18R1含有胺基酸222至364(對應於SEQ ID NO：474之胺基酸28至170)處的TIR域。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：474中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自IL18R1之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa或約70aa至約100aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自IL27RA之胞內部分。全長IL27RA含有胺基酸554至562(對應於SEQ ID NO：481之胺基酸17至25)處的box 1基元。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：481或SEQ ID NO：482中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自IL27RA之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa或約70aa至約100aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自IFNGR2之胞內部分。全長IFNGR2含有胺基酸276至277(對應於SEQ ID NO：438之胺基酸8至9)處的雙亮胺酸內化基元。在一些實施例中，適合的胞內域可 包括與SEQ ID NO：438中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自IFNGR21之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa或約65aa至約70aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自MyD88之胞內部分。MyD88蛋白具有介導與其他含死亡域之蛋白相互作用的N端死亡域(對應於SEQ ID NO：492之胺基酸29至106)、與IL-1R相關激酶相互作用的中間域(對應於SEQ ID NO：492之胺基酸107至156)及與TLR-TIR域相關聯之C端TIR域(對應於SEQ ID NO：492之胺基酸160至304)(Biol Res.2007；40(2)：97-112)。MyD88亦具有典範的核定位及輸出基元。點突變已在MyD88中識別出，且包括功能缺失突變L93P及R193C(對應於SEQ ID NO：492中之L93P及R196C)及功能獲得突變L265P(對應於SEQ ID NO：492中之L260P)(Deguine及Barton.F1000Prime Rep.2014年11月4日；6：97)。在一些實施例中，蛋白MyD88之部分可包括本文中所揭示之所有域。MyD88之域、基元及點突變為此項技術中所已知的，且技術人員將能夠在類似MyD88多肽中識別對應域、基元及點突變。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：492至501中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自MyD88之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa 至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa、約70aa至約100aa、約100aa至約125aa、約125aa至150aa、約150aa至約175aa、約175aa至約200aa、約200aa至約250aa、約250aa至300aa或約300aa至350aa之長度。在說明性實施例中，源自MyD88之胞內域具有約30aa至約350aa之長度，例如50aa至350aa，或100aa至350aa、100aa至304aa、100aa至296aa、100aa至251aa、100aa至191aa、100aa至172aa、100aa至146aa或100aa至127aa之長度。在包括源自MyD88之第一胞內域之淋巴增殖性元件的說明性實施例中，第二胞內域可不為源自以下之胞內域：CD28家族成員(例如，CD28、ICOS)、模式識別受體、C反應性蛋白受體(亦即，Nodi、Nod2、PtX3-R)、TNF受體(亦即，CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB)、HSP受體(Lox-1及CD91)或CD28。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自跨膜蛋白MPL之部分。跨膜MPL蛋白含有Box1基元PXXP(SEQ ID NO：525)及Box2基元，其為具有增加之絲胺酸及穀胺酸含量(對應於SEQ ID NO：491中之胺基酸46至64)的區域，在PXXP中，各X可為任何胺基酸(對應於SEQ ID NO：491中之胺基酸17至20)(Drachman及Kaushansky.Proc Natl Acad Sci U S A.1997年3月18日；94(6)：2350-5)。即便BoX2基元存在並不總需要增殖信號，但Box1及Box2基元亦參與結合至JAK及信號轉導(Murakami等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1991年12月15日；88(24)：11349-53；Fukunaga等人，EMBO J.1991年10月；10(10)：2855-65；及O’Neal及Lee.Lymphokine Cytokine Res.1993年10月；12(5)：309-12)。許多細胞介素受體在與Box1基元(對應於SEQ ID NO：491之各胺基酸16、15及11)相關之位置-1、-2及-6處具有疏水性殘基，該等疏水性殘基形成需要經細胞介素誘導之JAK2活化但無需JAK2結合的「切換基元」(Constantinescu等人，Mol Cell.2001年2月；7(2)：377-85；及Huang等人，Mol Cell.2001年12月；8(6)：1327-38)。缺失涵蓋SEQ ID NO：491中之胺基酸70至95之區域經展示以支援v-mpl之情形中之病毒轉化(Benit等人J Virol.1994年8月；68(8)：5270-4)，因此指示此區域於此情形中並非mpl之功能所必需。使用相同缺失的Morello等人，Blood 1995年7月；86(8)：557-71展示，此區域不為刺激紅細胞生成素受體反應性CAT受體基因構築體之轉錄所需要，且進一步看出，此缺失導致輕微增強之轉錄，該轉錄預期移除此區域中如由Drachman及Kaushansky所建議之非必需元件及負性元件。因此，在一些實施例中，MPL胞內信號傳導域不包含包含SEQ ID NO：491中之胺基酸70至95的區域。在全長MPL中，賴胺酸K553(對應於SEQ ID NO：491之K40)及K573(對應於SEQ ID NO：491之K60)經展示為充當泛素化靶向基元之部分的負性調節位點(Saur等人，Blood 2010年2月11日；115(6)：1254-63)。因此，在本文中之一些實施例中，MPL胞內信號傳導域不包含此等泛素化靶向基元殘基。在全長MPL中，酪胺酸Y521(對應於SEQ ID NO：491之Y8)、Y542(對應於SEQ ID NO：491之Y29)、Y591(對應於SEQ ID NO：491之Y78)、Y626(對應於SEQ ID NO：491之Y113)及Y631(對應於SEQ ID NO：491之Y118)經展示為經磷酸化(Varghese等人，Front Endocrinol(Lausanne).2017n年3月31日；8：59)。全長MPL之Y521及Y591為充當溶酶體靶向基元(Y521)或經由與適體蛋白AP2(Y591)之相互作用的負性調節位點(Drachman及Kaushansky,Proc Natl Acad Sci U S A.1997年3月18日； 94(6)：2350-5；及Hitchcock等人，Blood.2008年9月15日；112(6)：2222-31)。全長MPL之Y626及Y631為正性調節位點(Drachman及Kaushansky,Proc Natl Acad Sci U S A.1997年3月18日；94(6)：2350-5)，且Y626之鼠類同系物為Shc之細胞分化及磷酸化所需要(Alexander等人，EMBO J.1996年12月2日；15(23)：6531-40)，且Y626亦為在MPL中用下文所描述之W515A突變進行組成性信號傳導所需要(Pecquet等人，Blood.2010年2月4日；115(5)：1037-48)。MPL含有結合Shc磷酸酪胺酸之結合基元NXXY(SEQ ID NO：526)，其中各X可為任何胺基酸(對應於SEQ ID NO：491之胺基酸110至113)，且此酪胺酸經磷酸化且對於Shc、SHIP及STAT3之TPO依賴性磷酸化至關重要(Laminet等人，J Biol Chem.1996年1月5日；271(1)：264-9；及van der Geer等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1996年2月6日；93(3)：963-8)。MPL亦含有STAT3共有結合序列YXXQ(SEQ ID NO：527)，其中各X可為任何胺基酸(對應於SEQ ID NO：491之胺基酸118至121)(Stahl等人，Science.1995年3月3日；267(5202)：1349-53)。此序列之酪胺酸可經磷酸化，且1MPL能夠進行部分STAT3募集(Drachman及Kaushansky,Proc Natl Acad Sci U S A.1997年3月18日；94(6)：2350-5)。MPL亦含有序列YLPL(SEQ ID NO：528)(對應於SEQ ID NO：491之胺基酸113至116)，該序列YLPL與STAT5募集pYLXL(SEQ ID NO：529)之共有結合位點類似，其中pY為磷酸酪胺酸且X可為任何胺基酸(May等人，FEBS Lett.1996年3月30日；394(2)：221-6)。使用計算機模擬，Lee等人發現，MPL之跨膜域的臨床相關突變應按以下次序之活化效果活化MPL：W515K(對應於SEQ ID NO：491之胺基酸取代W2K)>S505A(對應於SEQ ID NO：395之胺基酸取代S14A)>W515I(對應於SEQ ID NO：491 之胺基酸取代W2I)>S505N(對應於SEQ ID NO：395之胺基酸取代S14N，其在實例12中經測試為T075(SEQ ID NO：396))(PLoS One.2011；6(8)：e23396)。預測此等突變之模擬可能造成JAK2(MPL之激酶配偶體)之組成性活化。在一些實施例中，MPL之胞內部分可包括本文中所描述之存在於SEQ ID NO：491中之所有域及基元。在一些實施例中，MPL之跨膜部分可包括本文中所描述之存在於SEQ ID NO：395中之所有域及基元。本文中所提供的MPL之域、基元及點突變為此項技術中所已知的，且技術人員將認識到，本文中之MPL胞內信號傳導域在說明性實施例中將包括經展示促進增殖活性之對應域、基元及點突變，且將不包括經展示抑制MPL增殖活性之彼等。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：491中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自MPL之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa、約70aa至約100aa、約100aa至約125aa、約125aa至150aa、約150aa至約175aa、約175aa至約200aa、約200aa至約250aa、約250aa至300aa、約300aa至350aa、約350aa至約400aa、約400aa至約450aa、約450aa至約500aa、約500aa至約550aa、約550aa至約600aa或約600aa至約635aa之長度。在說明性實施例中，源自MPL之胞內域具有約30aa至約200aa之長度，例如30aa至150aa、30aa至119aa、30aa至121aa、30aa至122aa或50aa至125aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組 合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自跨膜蛋白CD79B之部分，該跨膜蛋白亦稱為B29；IGB；AGM6。CD79B含有殘基193至212(對應於SEQ ID NO：419之胺基酸16至30)處的ITAM基元。CD79B具有已知經磷酸化之兩個酪胺酸Y196及Y207(對應於SEQ ID NO：419之Y16及Y27)。在一些實施例中，跨膜蛋白CD79B之胞內部分可包括本文中所描述之ITAM基元及已知磷酸化位點。CD79B之基元及可磷酸化酪胺酸為此項技術中所已知的，且技術人員將能夠在類似CD79B多肽中識別對應基元及可磷酸化酪胺酸。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：419中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自CD79B之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa或約45aa至約50aa之長度。在說明性實施例中，源自CD79B之胞內域具有約30aa至約50aa之長度。在一些實施例中，適合的CD79B胞內活化域可包括與以下序列之至少10個、15個、20個或全部胺基酸之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域：LDKDDSKAGMEEDHT[YEGLDIDQTATYEDI]VTLRTGEVKWSVGEHPGQE(SEQ ID NO：419)，其中ITAM基元闡述於括號中。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自跨膜蛋白OSMR之部分。OSMR含有同種型3之胺基酸771至779(對應於SEQ ID NO：502之胺基酸16至30)處的Box 1基元。OSMR具有已知經磷酸化的同種型3之胺基酸829及890處的兩個絲胺酸(SEQ ID NO：502之胺基酸65及128 處之絲胺酸)。在一些實施例中，蛋白OSMR之胞內部分可包括本文中所描述之box 1基元及已知磷酸化位點。OSMR之基元及可磷酸化酪胺酸為此項技術中所已知的，且技術人員將能夠在類似OSMR多肽中識別對應基元及可磷酸化絲胺酸。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：502中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自OSMR之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa、約70aa至約100aa、約100aa至約125aa、約125aa至150aa、約150aa至約175aa、約175aa至約200aa或約200aa至約250aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中任一者的說明性實施例中，胞內域可源自跨膜蛋白PRLR之部分。PRLR含有同種型6之胺基酸185至261(對應於SEQ ID NO：503之胺基酸28至104)處的生長荷爾蒙受體結合域。PRLR之生長荷爾蒙受體結合域為此項技術中所已知的，且技術人員將能夠在類似PRLR多肽中識別對應域。在一些實施例中，適合的胞內域可包括與SEQ ID NO：503中之胺基酸中之至少10個、15個、20個或全部之一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在一些實施例中，源自PRLR之胞內域具有約30aa至約35aa、約35aa至約40aa、約40aa至約45aa、約45aa至約50aa、約50aa至約55aa、約55aa至約60aa、約60aa至約65aa、約65aa至約70aa、約70aa至約100aa、約100aa至約125aa、 約125aa至150aa、約150aa至約175aa、約175aa至約200aa、約200aa至約250aa、約250aa至300aa、約300aa至350aa或約350aa至約400aa之長度。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件之方法、用途及組合物態樣中任一者的說明性實施例中，胞內域可為、淋巴增殖性元件可包括包括來自以下之信號傳導域的胞內域或其片段：CSF2RB、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MyD88、OSMR或PRLR。此等基因中之每一者具有胞內域，該胞內域存在於庫3.1之複本中之至少一者的前100個命中者中的至少一個構築體上的P3位置處。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CSF2RB、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MyD88、OSMR或PRLR。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、IFNGR1、 IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL5RA、IL6R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA2、IL15RA、IL17RD、IL21R、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、MyD88或OSMR。此等基因中之每一者具有胞內域，該胞內域存在於在P4位置中不具有胞內域之至少一個構築體上的P3位置處且在庫3.1之重複之至少一個之前100個命中者中。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL5RA、IL6R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RD、IL31RA、LEPR、MPL、MyD88或OSMR。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CSF2RB、CSF3R、IFNAR1、IFNGR1、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL10RA、IL12RB2、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、MPL、MyD88、OSMR或PRLR(表1)。此等基因中之每一者具有胞內域，該胞內域在橫跨庫3.1之重複之P3位置處顯著地富集(p<0.1)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CSF2RB、CSF3R、IFNAR1、IFNGR1、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL10RA、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL22RA1、IL31RA、MPL、MyD88、OSMR或PRLR。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CSF2RB、CSF3R、IFNGR1、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL10RA、IL12RB2、IL17RE、IL18R1、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、MPL、MyD88、OSMR或PRLR(表1)。此等基因中之每一者具有胞內 域，該胞內域在橫跨庫3.1之重複之P3位置處顯著地富集(p<0.05)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CSF2RB、CSF3R、IFNGR1、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL10RA、IL17RE、IL18R1、IL22RA1、IL31RA、MPL、MyD88、OSMR或PRLR。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CSF2RB、CSF3R、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL27RA、IL31RA、MPL或MyD88。此等基因中之每一者具有胞內域，該胞內域在橫跨庫3.1之至少2個重複之P3位置處顯著地富集(p<0.05)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CSF2RB、CSF3R、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL31RA、MPL或MyD88。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括以下之序列：S054、S057、S058、S059、S062、S063、S064、S069、S072、S077、S081、S082、S083、S084、S085、S086、S087、S098、S099、S100、S101、S102、S103、S104、S105、S106、S109、S115、S116、S117、S120、S121、S126、S129、S130、S135、S136、S137、S138、S141、S142、S143、S145、S147、S148、S154、S155、S156、S157、S158、S161、S165、S168、S169、S170、S171、S174、S175、S176、S177、S180、S183、S186、S189、S190、S191、S192、S193、S194、S195、S196、S197、S198、S199或S202(如表7中所展示)，或包括信號傳導域之其任何片段。此等部分中之每一者存在於庫3.1之重複中之至少一者的前100個命中者中的至少一個構築體上的P3位置處。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括以下之序列：S057、S058、 S059、S064、S069、S072、S084、S085、S099、S100、S101、S102、S104、S106、S115、S116、S126、S130、S135、S137、S138、S142、S143、S148、S158、S165、S168、S169、S170、S171、S174、S175、S176、S177、S186、S190、S191、S192、S193、S197、S198或S199(如表7中所展示)，或包括信號傳導域之其任何片段。此等部分中之每一者存在於在P4位置中不具有胞內域之至少一個構築體上的P3位置處且在庫3.1之重複中之至少一者的前100個命中者中。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括如表7中所展示之以下序列：S057、S062、S063、S064、S081、S084、S105、S106、S117、S129、S138、S149、S161、S168、S169、S170、S186、S190、S191、S192、S194、S196、S197、S198、S199或S202(表1)，或包括信號傳導域之其任何片段。此等部分中之每一者在橫跨庫3.1之重複的P3位置處顯著地富集。
在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法、用途及組合物態樣中任一者的說明性實施例中，胞內域可包括包括來自以下之信號傳導域的胞內域或其片段：CD3D、CD3E、CD3G、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2C、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18。此等基因中之每一者具有胞內域，該胞內域存在於庫3.1之重複中之至少一者的前100個命中者中的至少一個構築體上的P4位置處。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CD40、CD79B、FCGR2C或FCGRA2。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CD3D、CD3G、CD40、CD79A、ICOS、TNFRSF8或TNFRSF9。此等基因中之每一者具有胞內域，該 胞內域存在於在P3位置中不具有胞內域的至少一個構築體上的P4位置處且在庫3.1之重複之至少一者的前100個命中者中。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自CD40之信號傳導域。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自TNF受體家族成員之信號傳導域，且在說明性實施例中作為第二胞內信號傳導域，例如表2中所展示之TNF受體家族成員。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自以下之信號傳導域：CD27、CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9或TNFRSF18(表2)。此等基因中之每一者具有胞內域，該胞內域在橫跨庫3.1之重複的P4位置處顯著地富集(p<0.1)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包括來自CD40或CD79B之信號傳導域。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括以下之序列：S037、S038、S039、S047、S048、S049、S050、S051、S052、S053、S074、S075、S076、S080、S211、S212、S213、S214、S215或S216(如表7中所展示)，或包括信號傳導域之其任何片段。此等部分中之每一者存在於庫3.1之重複中之至少一者的前100個命中者中的至少一個構築體上之P4位置處。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括以下之序列：S037、S039、S050、S051、S052、S080、S212或S213(如表7中所展示)，或包括信號傳導域之其任何片段。此等部分中之每一者存在於在P3位置中不具有胞內域之至少一個構築體上的P4位置處且在庫3.1之重複中之至少一者的前100個命中者中。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括如表7中所展示之以下序列：S047、S050、S051、S053、S211、S212、S213或S215(表2)， 或包括信號傳導域之其任何片段。此等部分中之每一者在橫跨庫3.1之重複的P4位置處顯著地富集。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括細胞介素受體或片段，該細胞介素受體或片段包括其信號傳導域。在一些實施例中，細胞介素受體可為CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2R、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7R、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13R、1L13RA1、IL13RA2、IL15R、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL、OSMR、PRLR、TGFβR、TGFβ誘餌受體、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18。在一些實施例中，細胞介素受體可為CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18。在實例11及實例12中測試包括上文所列細胞介素受體之功能性胞內域之嵌合細胞介素受體的例示性實施例，以確認包括此等功能性胞內域之嵌合細胞介素受體可充當淋巴增殖性元件。
對於8個庫3.1重複，當對與P4部分無關之所有構築體進行分析時，表1提供最有效第一胞內信號傳導域(P3)部分及對應基因的標識符。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第一胞內域或其變體或片段，該第一胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，其藉由此統計分析(P<0.1)最有效：CSF2RB(S057)、CSF3R(S062、S063及S064)、IFNAR1(S081)、IFNGR1(S084)、IL2RB(S105)、IL2RG(S106)、IL6ST(S117)、IL10RA(S129)、IL12RB2(S138)、IL17RE(S149)、IL22RA1(S161)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170)、MPL(S186)、MyD88(S190、S191、S192、S194、S196、S197、S198)、OSMR(S199)及PRLR(S202)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第一胞內域或其變體或片段，該第一胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，其藉由至少2個庫之此統計分析(P<0.1)最有效：CSF2RB(S057)、CSF3R(S062、S063及S064)、IL2RB(S105)、IL2RG(S106)、IL6ST(S117)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170)、MPL(S186)及MyD88(S190、S191、S192、S194、S196、S197、S198)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其變體或片段，該胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域：CSF2RB(S057)、CSF3R(S062、S063及S064)、IL2RB(S105)、IL6ST(S117)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170)、MPL(S186)及MyD88(S190、S191、S192、S194、S196、S197、S198)。此等基因中之每一者表示在構築體中，該構築體藉由至少2個庫之此統計分析最有效，即使在P之統計截止值小於0.05時之。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括胞內域或其片段，該胞內域或其片段包 括來自以下之信號傳導域：CSF3R、1L6ST、IL27RA、MPL或MyD88。此等基因中之每一者表示在構築體中，該構築體藉由實例10之至少2個庫之此統計分析最有效，即使在P之統計截止值小於0.05時，其中該等庫不為來自相同重複之經饋入/未饋入對。如表1中所提及，P3處之一些基因及部分在胞內域存在於P4處時為顯著的，P3處之一些基因及部分在終止密碼子存在於P4處時為顯著的，且P3處之一些基因及部分在胞內域或終止密碼子存在於P4處時為顯著的。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第一胞內域或其變體或片段，該第一胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，當P4部分為第二胞內域時，其在小於0.1之p值下為顯著的：CSFS2RB(S057)、CSF3R(S062及S064)、IL2RB(S105)、IL2RG(S106)、IL6ST(S117)、IL10RA(S129)、IL17RC、IL17RE(S149)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170)、MPL(S186)、MyD88(S190、S192、S194、S196及S197)、OSMR(S199)及PRLR(S202)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第一胞內域或其變體或片段，該第一胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，當P4部分為第二胞內域時，其在小於0.05之p值下為顯著的：CSFS2RB(S057)、CSF3R(S062及S064)、IL2RB(S105)、IL2RG(S106)、IL6ST(S117)、IL10RA(S129)、IL17RE(S149)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170)、MPL(S186)、MyD88(S190、S194及S197)、OSMR(S199)及PRLR(S202)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第一胞內域或其變體或片段，該第一胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，當P4部分為終止密碼子X002時，其在小於0.1之p值下為顯著的：CSF3R(S063)、IFNAR1(S081)、 IFNGR1(S084)、IL2RB(S105)、IL2RG(S106)、IL6ST(S117)、IL12RB2(S138)、IL17RE(S149)、IL18R1、IL22RA1(S161)、IL27RA(S169)、IL31RA(S170)、MyD88(S191、S196及S198)及PRLR(S202)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第一胞內域或其變體或片段，該第一胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，當P4部分為終止密碼子X002時，其在小於0.05之p值下為顯著的：CSF3R(S063)、IFNGR1(S084)、IL2RB(S105)、IL2RG(S106)、IL6ST(S117)、IL12RB2(S138)、IL17RE(S149)、IL18R1、IL22RA1(S161)、IL27RA(S169)、IL31RA(S170)、MyD88(S191及S198)及PRLR(S202)。
對於實例10中之8個庫3.1重複，當對與P3部分無關之所有構築體進行分析時，表2提供對最有效之第二胞內信號傳導域(P4)部分及對應基因的標識符。以下基因由第二胞內信號傳導域部分來表示，該等第二胞內信號傳導域部分經識別在藉由此統計分析(P<0.1或p<0.05)展示為最有效的構築體中，其中部分數字在圓括號中：CD27(S047)、CD40(S050及S051)、CD79B(S053)、TNFRSF4(S211)、TNFRSF8(S212)、TNFRSF9(S213)及TNFRSF18(S215)。以下第二胞內域基因由第二胞內信號傳導域部分來表示，該等第二胞內信號傳導域部分為藉由至少2個庫之此統計分析(P<0.1)最有效，其中部分數字在圓括號中：CD40(S050及S051)、TNFRSF8(S212)及TNFRSF18(S215)。以下第二胞內域基因由第二胞內信號傳導域部分來表示，該等第二胞內信號傳導域部分即使在P之統計截止值小於0.05時藉由至少2個庫之此統計分析最有效：CSF2RB(S057)、CSF3R(S062、S063及S064)、IL2RB(S105)、 IL6ST(S117)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170)、MPL(S186)及MyD88(S190、S191、S192、S194、S196、S197、S198)。如表2中所指出，P4處之一些基因及部分在胞內域存在於P3處時為顯著的，P4處之一些基因及部分在鏈接子X001存在於P3處時為顯著的，且P4處之一些基因及部分在胞內域或鏈接子存在於P3處時為顯著的。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第二胞內域或其變體或片段，該第二胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，當P3部分為第一胞內域時，其在小於0.1之p值下為顯著的：CD27(S047)、CD40(S050及S051)、CD79B(S053)、TNFRSF4(S211)、TNFRSF8(S212)及TNFRSF18(S215)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第二胞內域或其變體或片段，該第二胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，當P3部分為第一胞內域時，其在小於0.05之p值下為顯著的：CD27(S047)、CD40(S050及S051)、CD79B(S053)、TNFRSF4(S211)、TNFRSF8(S212)及TNFRSF18(S215)。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第二胞內域或其變體或片段，該第二胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，當P3部分為鏈接子X001時，其在小於0.1之p值下為顯著的：CD27(S047)、CD40(S050)、TNFRSF9(S213)及TNFRSF18。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括第二胞內域或其變體或片段，該第二胞內域或其變體或片段包括來自以下基因或圓括號中之各別部分的信號傳導域，當P3部分為鏈接子X001時，其在小於0.05之p值下為顯著的：CD27(S047)、CD40(S050)、TNFRSF9(S213)及TNFRSF18。
在實例10中，構築體經統計分析以測定哪些P4部分對 特定P3部分最有效，且結果列於表3中。如實例10中所展示，用編碼淋巴增殖性元件之聚核苷酸轉導的細胞含有在小於0.1之p值下富集的源自以下對基因之胞內信號傳導域的胞內信號傳導域：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSF2RA及TNFRSF8；CSF2RA及CD27；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL1RAP及CD79A；IL3RA及CD40；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL13RA2及TNFRSF14；IL18RAP及CD3G；IL27RA及FCGRA2；LEPR及CD3G；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD79A；MPL及CD3G；MyD88及CD79B；或MyD88及CD3D，其中來自每對之第一基因的胞內信號傳導域為P3部分，且來自每對之第二基因的胞內信號傳導域為P4部分。除非另外陳述，或已在最廣泛態樣中陳述，否則在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，淋巴增殖性元件包含源自以下對基因之胞內信號傳導域：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSF2RA及TNFRSF8；CSF2RA及CD27；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL1RAP及CD79A；IL3RA及CD40；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL13RA2及TNFRSF14；IL18RAP及CD3G；IL27RA及FCGRA2；LEPR及CD3G；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD79A；MPL及CD3G；MyD88及CD79B；或MyD88及CD3D。除非另外陳述，或已在最廣泛態樣中陳述，否則在本文中所提供之包括編碼淋巴增殖性元件之聚核苷酸的方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，聚核苷酸可編碼源自以下對基因之胞內信號傳導域：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSF2RA及TNFRSF8；CSF2RA及CD27；CSFR3及 CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL1RAP及CD79A；IL3RA及CD40；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL13RA2及TNFRSF14；IL18RAP及CD3G；IL27RA及FCGRA2；LEPR及CD3G；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD79A；MPL及CD3G；MyD88及CD79B；或MyD88及CD3D。如實例10中所展示，用編碼淋巴增殖性元件之聚核苷酸轉導的細胞含有在小於0.05之p值下富集的源自以下對基因之胞內信號傳導域的胞內信號傳導域：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL27RA及FCGRA2；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD79A；MPL及CD3G；以及MyD88及CD79B，其中來自每對之第一基因的胞內信號傳導域為P3部分，且來自每對之第二基因的胞內信號傳導域為P4部分。除非另外陳述，或已在最廣泛態樣中陳述，否則在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，淋巴增殖性元件包含源自以下對基因之胞內信號傳導域：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL27RA及FCGRA2；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD79A；MPL及CD3G；以及MyD88及CD79B。除非另外陳述，或已在最廣泛態樣中陳述，否則在本文中所提供之包括編碼淋巴增殖性元件之聚核苷酸的方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，聚核苷酸可編碼源自以下對基因之胞內信號傳導域：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSFR3及CD79B；IFNAR2 及TNFRSF14；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL27RA及FCGRA2；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD79A；MPL及CD3G；以及MyD88及CD79B。如實例10中所展示，用編碼淋巴增殖性元件之聚核苷酸轉導之細胞含有在小於0.1之p值下富集的以下對胞內信號傳導域(其之胺基酸序列展示於表7中)：S058及S211；S058及S049；S059及S212；S059及S047；S064及S053；S083及S214；S101及S052；S109及S050；S129及S053；S135及S076；S142及S214；S155及S039；S169及S076；S177及S039；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186及S039；S192及S053；S194及S037；以及S195及S053。除非另外陳述，或已在最廣泛態樣中陳述，否則在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，淋巴增殖性元件包含以下對胞內信號傳導域：S058及S211；S058及S049；S059及S212；S059及S047；S064及S053；S083及S214；S101及S052；S109及S050；S129及S053；S135及S076；S142及S214；S155及S039；S169及S076；S177及S039；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186及S039；S192及S053；S194及S037；以及S195及S053。除非另外陳述，或已在最廣泛態樣中陳述，否則在本文中所提供之包括編碼淋巴增殖性元件之聚核苷酸的方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，聚核苷酸包含以下對胞內信號傳導域：S058及S211；S058及S049；S059及S212；S059及S047；S064及S053；S083及S214；S101及S052；S109及S050；S129及S053；S135及S076；S142及S214；S155及S039；S169及S076；S177及S039；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186 及S039；S192及S053；S194及S037；以及S195及S053。如實例10中所展示，用編碼淋巴增殖性元件之聚核苷酸轉導之細胞含有在小於0.05之p值下富集的以下對胞內信號傳導域(其之胺基酸序列展示於表7中)：S058及S211；S058及S049；S064及S053；S083及S214；S129及S053；S135及S076；S169及S076；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186及S039；以及S195及S053。除非另外陳述，或已在最廣泛態樣中陳述，否則在本文中所提供之包括淋巴增殖性元件的方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，淋巴增殖性元件包含以下對胞內信號傳導域：S058及S211；S058及S049；S064及S053；S083及S214；S129及S053；S135及S076；S169及S076；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186及S039；以及S195及S053。除非另外陳述，或已在最廣泛態樣中陳述，否則在本文中所提供之包括編碼淋巴增殖性元件之聚核苷酸的方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，聚核苷酸包含以下對胞內信號傳導域：S058及S211；S058及S049；S064及S053；S083及S214；S129及S053；S135及S076；S169及S076；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186及S039；以及S195及S053。
在某些說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件包含細胞介素受體或包括活化Jak/STAT5路徑之信號傳導域的其片段。舉例而言，此淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包括IL21R、IL27R、IL31RA、LIFR及OSMR之胞內域。如實例11及實例12之實驗及表8至18中所展示，在候選嵌合多肽中發現包括此等基因之胞內域的嵌合淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件，該等候選嵌合多肽在不存在 諸如IL-2之外源性細胞介素之情況下培養的PBMC中誘導最高程度之增殖。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包含為介白素或介白素受體且為在實例11及12(表8至18)中之庫1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B及/或4.1B中識別之最優構築體之部分的胞內域。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包含為細胞介素受體且為在實例11及12(表8至18)中之庫1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B及/或4.1B中識別之最優構築體之部分的胞內域。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包含包括至少一個ITAM基元且為在實例11及實例12(表8至18)之庫1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B及/或4.1B中識別之最優構築體之部分的胞內域。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包含以下胞內域中之一者，該等胞內域為庫3A、3.1A、3B、3.1B、4B或4.1B中之至少一者中之頂部構築體的部分。
在說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包含來自IL7R、IL12RB1、IL15RA或IL27RA之胞內域，其存在於如實例11及12(表20至24)中詳述之在初始篩檢及重複篩檢中顯示尤其值得注意之富集(亦即，引起最高程度之增殖)的構築體中。
在說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包含來自以下細胞介素受體之胞內域：CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RB、IL18R1、IL18RAP、IL20RB、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、 OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在於如實例11及12(表20至24)中詳述之在初始篩檢及重複篩檢中顯示尤其值得注意之富集的構築體中。
在說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包含來自CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A或FCGR2C之胞內域，其包括至少一個ITAM基元且存在於如實例11及12(表20至24)中詳述之在初始篩檢及重複篩檢中顯示尤其值得注意之富集的構築體中。
在一些實施例中，此段落中之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件(其在實例11及12中展示在具有僅單一胞內域之構築體中具有活性)可為具有兩個或更多個胞內域，或在說明性實施例中具有單一胞內域(亦即，該淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件不包含兩個或更多個胞內域)的淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之胞內域。在說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中之胞內域包含來自以下之域：CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、MYD88、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在於如在作為單一胞內信號傳導域之實例12(表23及24)中詳述之在初始篩檢及重複篩檢中顯示尤其值得注意之富集的構築體中。在說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中之胞內域包含來自IL7R或IL12RB1之域，其存在於如實例12(表23及24)中詳述之在初始篩檢及重複篩檢中顯示尤其值得注意之富集的構築體中。在一些實施例中，具有單一胞內域之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中之胞內域可為細胞介素受體。在說明性實施例中，具有單一 胞內域之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中之細胞介素受體包含來自以下之域：CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在於如實例12(表23及24)中詳述之在初始篩檢及重複篩檢中顯示尤其值得注意之富集的構築體中。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中之胞內域可包括至少一個ITAM基元。在說明性實施例中，包括至少一個ITAM基元之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中之胞內域包含來自FCGR2A之域，其存在於如實例12(表23)中詳述之在初始篩檢及重複篩檢中顯示尤其值得注意之富集的構築體中。
在說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包含來自CD27、CD28、OX40(亦稱為TNFRSF4)、GITR(亦稱為TNFRSF18)或HVEM(亦稱為TNFRSF14)之共刺激域，其存在於如實例11及12(表20至24)中詳述之在初始篩檢及重複篩檢中顯示尤其值得注意之富集的構築體中。在一些實施例中，包含來自OX40之共刺激域的淋巴增殖性元件不包含來自CD3Z、CD28、4-1BB、ICOS、CD27、BTLA、CD30、GITR或HVEM的胞內域。在一些實施例中，包含來自GITR之共刺激域的淋巴增殖性元件不包含來自CD3Z、CD28、4-1BB、ICOS、CD27、BTLA、CD30或HVEM的胞內域。在一些實施例中，包含來自CD28之共刺激域的淋巴增殖性元件不包含來自CD3Z、4-1BB、ICOS、CD27、BTLA、CD30或HVEM的胞內域。在一些實施例中，包含來自OX40、CD3Z、CD28、4-1BB、ICOS、CD27、BTLA、CD30、GITR或HVEM之共刺激域的淋巴增殖性元件不包含跨膜域之捲曲螺旋間隔子域。在一些實施例中，包含來自GITR之共 刺激域的淋巴增殖性元件不包含來自CD3Z之胞內域，該CD3Z為GITR之共刺激域之N端。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為以下構築體中之一者：M024-S190-S047、M025-S050-S197、M036-S170-S047、M012-S045-S048、M049-S194-S064、M025-S190-S050、M025-S190-S05、E013-T041-S186-S051、E013-T028-S186-S051、E014-T015-S186-S051、E011-T016-S186-S050、E011-T073-S186-S050或E013-T011-S186-S211，其全部如實例13(圖19至20)中所示在轉導之後刺激休眠淋巴球之增殖。在某些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件包含來自CSF3R、IL3RA、ICOS、CRLF、CSF2RA、LIFR或CD40之胞外域；來自MyD88、CD40或MPL之第一胞內域，及/或來自CD27或MyD88之第二胞內域。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為構築體E013-T041-S186-S051，其如實例16(圖22A及圖22B)中所展示及分析在用顯示UCHT1scFvFc-GPI之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之後刺激休眠淋巴球之增殖。在其他實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為IL7-IL7RA-IL2RB，如實例16中所示出且分析。
如實例11中詳述，對於庫1A及1.1A，具有來自細胞介素受體CD27、IL1RL1、IL6R、IL31RA、TNFRSF4或TNFRSF18之域的構築體在庫1A及1.1A(表20)中皆顯示尤其值得注意之富集。
如實例11中詳述，對於庫2B及2.1B，具有來自細胞介素受體CD40、IFNGR2、GHR、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RB、IL22RA1、TNFRSF14或TNFRSF9之域的構築體在庫2B及2.1B(表21)中皆顯示尤其值得注意之富集。
如實例12中詳述，對於庫3A及3.1A，具有來自細胞介素受體CD27、CD40、CSF2RA、MPL、OSMR、TNFRSF4或TNFRSF18之域的構築體在庫3A及3.1A(表22)中皆顯示尤其值得注意之富集。
如實例12中詳述，對於庫3B及3.1B，具有來自細胞介素受體CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1RL1、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL18RAP、IL20RB、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18之域的構築體在庫3B及3.1B(表23)中皆顯示尤其值得注意之富集。
如實例12中詳述，對於庫4B及4.1B，具有來自細胞介素受體CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL2RA、IL3RA、IL2RG、IL6R、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL31RA、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、MPL、OSMR、TNFRSF4、TNFRSF9或TNFRSF18之域的構築體在庫4B及4.1B(表24)中皆顯示尤其值得注意之富集。
在某些說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件包含CD40、MPL及IL2Rb之胞內域，其在本文中之實例中經證實以促進PBMC增殖。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可不為細胞介素受體。在一些實施例中，除細胞介素受體以外之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可包括來自以下之胞內信號傳導域：CD2、CD3D、CD3G、CD3Z、CD4、CD8RA、CD8RB、CD28、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C或ICOS。包括此等所敍述基 因的嵌合淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之例示性實施例提供於實例11及實例12及其中引用之表中。
在一些實施例中，CLE不為連接至IL-2/IL-15受體之IL-15。
在本文所揭示之方法及組合物之一些中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之表現係藉由化合物與控制元件(如在WO2017/165245A2、WO2018/009923A1及WO2018/161064A1中所論述)之結合來誘導且甚至可依賴於該結合，該控制元件在非限制性實施例中為核糖開關。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件由在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子表現。對於本文所提供之方法及組合物，熟練技術人員將認識到，啟已知動子在T細胞及/或NK細胞中具有活性且可用於表現第一工程化信號傳導多肽或第二工程化信號傳導多肽，或其任何組分。在說明性實施例中，此啟動子在封裝細胞株(諸如本文所揭示之封裝株)中為無活性的。在一些實施例中，啟動子為EF1α啟動子或鼠幹細胞病毒(MSCV)啟動子(Jones等人，Human Gene Therapy(2009)20：630-40)。在說明性實施例中，啟動子為T細胞特異性CD3 ζ啟動子。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件受微環境限制。舉例而言，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為在異常條件相對於生理條件下差異性結合其各別細胞介素的突變受體。舉例而言，可使用在腫瘤環境下比在正常生理環境下可更強烈地結合IL7之IL-7R。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件融合至識別域或消除域。在本文中更詳細地揭示此類識別域或消除域。 此融合提供了，尤其在使用經截斷或其他突變之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件時，在反轉錄病毒基因組中需要更少的聚核苷酸的優勢。此在本文所提供之說明性實施例中為重要的，此係由於其有助於允許編碼功能性元件之更多核酸包括於反轉錄病毒基因組中且由於其添加了機制，若不再需要其之增殖或其之增殖對有機體有害，則可藉由該機制殺滅表現淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之細胞。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件(包括CLE)包含如上文所揭示之胞內活化域。在一些說明性實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為包含胞內活化域之CLE，該胞內活化域包含含ITAM域。由此，CLE可包含胞內活化域，該胞內活化域與本文所提供之CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70域具有至少80%、90%、95%、98%或100%序列一致性，其中CLE不包含ASTR。在某些說明性實施例中，胞內活化域為來自以下之含ITAM域：CD3D、CD3G、CD3Z、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A或FCGR2C。包含胞內活化域之CLE在證實於本文中之實例11及實例12及相關表19至24中，其在不存在外源性細胞介素(諸如外源性IL-2)之情況下在培養物中離體促進PBMC之增殖時為有效的。在一些實施例中，本文提供包含來自以下之胞內域的CLE：CD3D、CD3G、CD3Z、CD79A、FCER1G。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之一或多個域融合至CAR之調節域(諸如共刺激域)及/或胞內活化域。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之一或多個胞內域可為與CAR相同的多肽之部分或可融合或視情況功能性地連接至CAR 之一些組分。在又其他實施例中，工程化信號傳導多肽可包括ASTR、胞內活化域(諸如CD3 ζ信號傳導域)、共刺激域及淋巴增殖域。關於共刺激域、胞內活化域、ASTR及其他CAR域之其他細節揭示於本文中之其他地方中。
在本文之說明性實施例中，通常藉由用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或休眠NK細胞而將T細胞及/或NK細胞存活元件引入至休眠T細胞及/或休眠NK細胞中，該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之基因組編碼作為工程化信號傳導多肽之部分的T細胞及/或NK細胞存活元件。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件亦為T細胞及/或NK細胞存活元件。如上文所論述，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件中之一些不僅促進增殖，而且其同樣促進細胞存活。在一些實施例中，T細胞及/或NK存活細胞基元不為淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件。在一些實施例中，T細胞及/或NK細胞存活基元可為CD28 T細胞存活基元或CD137細胞存活基元。此等T細胞存活基元可發現於包括ASTR(諸如scFv)之工程化信號傳導多肽中。在一說明性實施例中，T細胞存活基元為經由CD8a跨膜域或CD28跨膜域連接至scFv之CD28 T細胞存活基元或CD137基元。在某些實施例中，該胞內信號傳導域包含多肽序列，該多肽序列包含基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。在某一實施例中，該多肽序列為CD3ζ信號傳導域。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件不為多肽，相反包含抑制性RNA。在一些實施例中，根據本文中之任何態樣之過程的方法、用途、組合物及產物包括包含抑制性RNA之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件及為工程化信號傳導多肽之淋巴增殖性 元件淋巴增殖性元件。在淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為抑制性RNA之實施例中，該抑制性RNA可為通常藉由利用使SOCS路徑中之負調節子降解或下調而增強STAT5之活化來刺激STAT5路徑的miRNA。在一些實施例中，miRNA係指編碼影響增殖之蛋白質的mRNA，諸如但不限於ABCG1、SOCS1、TGFbR2、SMAD2、cCBL及PD1。在說明性實施例中，如本文所例示，此抑制性RNA(例如miRNA)可定位於封裝細胞及/或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒基因組及/或反轉錄病毒載體中的內含子中，且通常藉由在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子驅動來表現。不受理論之限制，認為轉錄單元中之內含子之包涵體導致轉錄物之更高表現及/或穩定性。由此，將miRNA置放於反轉錄病毒基因組之內含子中的能力增加了本發明之教示，該教示克服了先前技術中試圖使最大活性達到反轉錄病毒(諸如慢病毒基因組)之大小限制的挑戰。在一些實施例中，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個miRNA(在說明性實施例中，2個與5個之間的(例如4個)miRNA(其中之一或多者各自結合編碼ABCG1、SOCS1、TGFbR2、SMAD2、cCBL及PD1中之一或多者的核酸))可包括於重組反轉錄病毒基因組中且使用本文所提供之方法傳遞至靶標細胞，例如T細胞及/或NK細胞。實際上，如本文所提供，1個、2個、3個或4個miRNA可傳遞於單個內含子(諸如EF1a內含子)中。
ABCG1為對胸腺細胞及周邊淋巴球增殖進行負調節之ATP結合卡匣轉運蛋白(Armstrong等人.2010.J Immunol 184(1)：173-183)。
SOCS1為抑制Jak/Stat路徑(諸如STAT5)之細胞介素信 號轉導之負調節子之SOCS(細胞介素信號傳導之抑制因子)家族之一成員。SOCS1亦稱為JAB(Janus激酶結合蛋白質)、SSI-1(Stat誘導之Stat抑制劑-1)及TIP3(Tec相互作用蛋白質)。
TGFbR2為絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶家族之一成員，該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶家族結合TGF-β，從而形成使蛋白質磷酸化之複合物，隨後進入細胞核且調節與增殖相關的基因之轉錄。
SMAD2介導轉變生長因子(TGF)-β之信號且調節多個細胞過程，諸如細胞增殖、凋亡及分化。
cCBL為藉由使ZAP-70去磷酸化且失活且經由TCR之內化來抑制TCR信號傳導的E3泛素連接酶。
PD1(CD279)為在T細胞及ProB細胞上表現之細胞表面受體。PD-1結合兩種配位體，PD-L1及PD-L2。經由PD-1進行信號傳導起防止細胞活化的作用。
在一些實施例中，本文中之淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為包含表19之基因中之任一者胞內區的多肽。在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件包含或為在表19之嵌合多肽中所識別之胞內域。在此等實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為多肽，該多肽為嵌合多肽(參加下文CLE)，或不為CLE，但包含或為在表19之P3(第一胞內域)位置中所識別之基因之胞內域。表19識別在第7天與第二胞內域不存在於構築體上只最後一天之間促進PBMC之增殖的CLE構築體。在此實施例之一些子實施例中，在具有或不具有包含二聚基元之胞外域之情況下，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件為包括跨膜域及胞內域之組合的嵌合多肽(亦即CLE，參見下文)。
在一些實施例中，淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件包 含MPL或為MPL或其變體或片段，包括在具有或不具有MPL之跨膜域及/或胞外域之情況下包括至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之MPL之胞內域，及/或在具有或不具有MPL之跨膜域及/或胞外域之情況下與MPL之胞內域具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的變體或片段，其中變體及/或片段保留促進PBMC(且在一些實施例中，T細胞)之細胞增殖的能力。在說明性實施例中，淋巴增殖性元件包含MPL之胞內域或其變體或片段，該變體或片段包括MPL之胞內域之至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，且淋巴增殖性元件不包含MPL之跨膜域。在一些實施例中，淋巴增殖性元件包含MPL之胞內域或其變體或片段，該變體或片段包括MPL之胞內域之至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，且淋巴增殖性元件包含MPL之跨膜域。在一些實施例中，包括於本文中之組合物及方法中之MPL片段具有及/或保留JAK-2結合域。在一些實施例中，包括於本文中之MPL片段具有或保留活化STAT之能力。MPL之全胞內域為SEQ ID NO：491(表8至19中之部分S186)。MPL為促血小板生成素之受體。諸如促血小板生成素及EPO之若干細胞介素在文獻及本文中稱作激素或細胞介素。
在一些實施例中(其提供本發明之單獨態樣)，本文提供為嵌合淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件(CLE)之嵌合多肽以及經分離聚核苷酸及編碼其之核酸序列。CLE可包括該等域中之任一者及/或源自該章節中所論述之特定基因的域。類似地，經分離聚核苷酸及編碼CLE之核酸序列可編碼該等域中之任一者及/或源自此章節中所論述之特定基因的域作為CLE之部分。例示性CLE說明於圖15至圖18 中。本文中之CLE促進T細胞及/或NK細胞之增殖且可視情況亦促進T細胞及/或NK細胞之存活。一些CLE促進增殖且視情況亦促進其他類型之PBMC(例如B細胞)之存活。包括編碼CLE及CAR之核酸序列的本文所提供之實施例在本文中稱作出於設計方便之CLE CAR聚核苷酸實施例。在一些實施例中，CLE可包括跨膜域及第一胞內域。此外，在說明性實施例中，如圖15至圖18所展示，CLE包括胞外域及/或第二胞內域(且在另外的實施例中，第三胞內域、第四胞內域等等)。本文中之嵌合多肽為嵌合的，此係由於至少一個域來自與其他域中之至少一者不同的多肽且此嵌合體在無人類干預之情況不能自然地發現於有機體中。一些CLE包括受體之配位體且一些CLE不包括受體之配位。
不受理論限制，此等CLE經設計以組成性方式(亦即，不需要用於活化之配位體結合)促進B細胞、NK細胞及/或T細胞之增殖及視情況細胞存活。CLE中之無一者發現於自然中，且許多CLE具有通常不在B細胞、T細胞及/或NK細胞中活體內表現之組分，及/或一些候選CLE不通常已知用於特異性地促進B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖及/或細胞存活信號傳導。舉例而言，MPL通常不在B細胞、T細胞及/或NK細胞中表現。出人意料地，如實例11及實例12中所闡述藉由篩檢大量候選嵌合多肽所識別之新CLE促進PBMC細胞增殖。此等CLE有助於滿足識別刺激B細胞、T細胞及/或NK細胞之增殖以及視情況存活之機制的長期需求，諸如對重要的臨床相關技術而言將為有益的，諸如以基因方式工程化以表現所定義TCR之CAR-T及T細胞。由此，咸信一些CLE將向T細胞及/或NK細胞提供活體內擴展且無需使宿主淋巴消耗之能力。
本文所提供之嵌合淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件及經分離聚核苷酸及編碼其之核酸可包括於包括淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之本文所提供之任何態樣中。舉例而言，第一工程化信號傳導多肽可為或可包括本文所提供之態樣中之CLE，該CLE包括編碼由控制元件調節之第一工程化信號傳導多肽之一或多個轉錄單元。此外，提供本發明之單獨態樣，其特異性地包括CLE。舉例而言，此等態樣包括經分離嵌合淋巴增殖多肽、經分離聚核苷酸及編碼其之核酸，以及載體，該等載體包括質體、病毒及反轉錄病毒載體(包括此等核酸序列或經分離聚核苷酸)。此等態樣進一步包括用於用經分離聚核苷酸及包含其之載體轉導或轉染PBMC(諸如B細胞，或特定而言T細胞及NK細胞)之方法。此等細胞可為經分離未更改之細胞，或其可為經修飾之細胞，諸如經基因方式修飾諸如以表現所定義TCR或CAR-T細胞的細胞。
本文中所提供之淋巴增殖性元件通常包括跨膜域。舉例而言，跨膜域可與來自以下基因及代表性序列之跨膜域中之任一者具有80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性：CD8 β(SEQ ID NO：47)、CD4(SEQ ID NO：48)、CD3 ζ(SEQ ID NO：49)、CD28(SEQ ID NO：50)、CD134(SEQ ID NO：51)、CD7(SEQ ID NO：51)、CD2(SEQ ID NO：322)、CD3D(SEQ ID NO：323)、CD3E(SEQ ID NO：324)、CD3G(SEQ ID NO：325)、CD3Z(SEQ ID NO：326)、CD4(SEQ ID NO：327)、CD8A(SEQ ID NO：328)、CD8B(SEQ ID NO：329)、CD27(SEQ ID NO：330)、CD28(SEQ ID NO：331)、CD40(SEQ ID NO：332)、CD79A(SEQ ID NO：333)、CD79B(SEQ ID NO：334)、CRLF2(SEQ ID NO：335)、CRLF2(SEQ ID NO：336)、CSF2RA(SEQ ID NO：337)、CSF2RB(SEQ ID NO：338)、CSF2RB(SEQ ID NO：339)、CSF3R(SEQ ID NO：340)、CSF3R(SEQ ID NO：341)、EPOR(SEQ ID NO：342)、EPOR(SEQ ID NO：343)、FCER1G(SEQ ID NO：344)、FCGR2C(SEQ ID NO：345)、FCGRA2(SEQ ID NO：346)、GHR(SEQ ID NO：347)、GHR(SEQ ID NO：348)、ICOS(SEQ ID NO：349)、IFNAR(SEQ ID NO：350)、IFNAR2(SEQ ID NO：351)、IFNGR1(SEQ ID NO：352)、IFNGR2(SEQ ID NO：353)、IFNLR1(SEQ ID NO：354)、IL1R1(SEQ ID NO：355)、IL1RAP(SEQ ID NO：356)、IL1RL1(SEQ ID NO：357)、IL1RL2(SEQ ID NO：358)、IL2RA(SEQ ID NO：359)、IL2RB(SEQ ID NO：360)、IL2RG(SEQ ID NO：361)、IL3RA(SEQ ID NO：362)、IL4R(SEQ ID NO：363)、IL5RA(SEQ ID NO：364)、IL6R(SEQ ID NO：365)、IL6ST(SEQ ID NO：366)、IL7RA(SEQ ID NO：367)、IL7RA(SEQ ID NO：368)、IL9R(SEQ ID NO：369)、IL10RA(SEQ ID NO：370)、IL10RB(SEQ ID NO：371)、IL11RA(SEQ ID NO：372)、IL12RB1(SEQ ID NO：373)、IL12RB2(SEQ ID NO：374)、IL13RA1(SEQ ID NO：375)、IL13RA2(SEQ ID NO：376)、IL15RA(SEQ ID NO：377)、IL17RA(SEQ ID NO：378)、IL17RB(SEQ ID NO：379)、IL17RC(SEQ ID NO：380)、IL17RD(SEQ ID NO：381)、IL17RE(SEQ ID NO：382)、IL18R1(SEQ ID NO：383)、IL18RAP(SEQ ID NO：384)、IL20RA(SEQ ID NO：385)、IL20RB(SEQ ID NO：386)、IL21R(SEQ ID NO：387)、IL22RA1(SEQ ID NO：388)、IL23R(SEQ ID NO：389)、IL27RA(SEQ ID NO：390)、IL27RA(SEQ ID NO：391)、IL31RA(SEQ ID NO：392)、LEPR(SEQ ID NO：393)、LIFR(SEQ ID NO：394)、MPL(SEQ ID NO：395)、MPL(SEQ ID NO：396)、OSMR(SEQ ID NO：397)、PRLR(SEQ ID NO：398)、TNFRSF4(SEQ ID NO：399)、TNFRSF8(SEQ ID NO：400)、TNFRSF9(SEQ ID NO：401)、TNFRSF14(SEQ ID NO：402)及TNFRSF18(SEQ ID NO：403)。適用於任何工程化信號傳導多肽中之TM域包括(但不限於)組成性活性細胞介素受體、來自LMP1之TM域及來自包含二聚化基元之1型TM蛋白的TM域，如本文中更詳細地論述。在本文中所揭示含有來自I型跨膜蛋白的跨膜域之態樣中之任一者中，跨膜域可為I型生長因子受體、荷爾蒙受體、T細胞受體或TNF家族受體。
在一些實施例中，CLE包括來自相同部分(在說明性實施例中，相同受體)之胞外部分及跨膜部分兩者，其中之一者在說明性實施例中為突變體，因此形成胞外域及跨膜域。此等域可來自細胞介素受體或其突變體，或激素受體或其突變體，在一些實施例中，當在至少一些細胞類型中表現時，其經報導為組成性活性的。在說明性實施例中，此胞外域及跨膜域不包括配位體結合區。咸信，此等域在存在於CLE中並表現於B細胞、T細胞及/或NK細胞中時不結合配位體。此等受體突變體中之突變可發生於跨膜區中或胞外近膜區中。不受理論限制，本文提供之CLE之至少一些胞外-跨膜域中之突變藉由使通常不在一起之活化鏈集合在一起或藉由改變經連接跨膜域及/或胞內域之確認而在不存在配位體之情況下負責CLE之信號傳導。
本文所提供之利用受體突變體之此等跨膜域的一個態樣為包含一或多個核酸序列之經分離聚核苷酸，其中：該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中包含以下之嵌合多肽，(a)來自細胞介素受體或激素受體之胞外域及跨膜域，其中胞外 域及跨膜域中之至少一者包含在細胞介素受體之組成性活性突變體上發現之突變，且其中胞外序列不結合細胞介素受體之配位體；及(b)選自具有表8至12中所識別之經選擇多肽之第一胞內域且視情況第二胞內域之基因之胞內域的第一胞內域，其中該嵌合多肽促進B細胞、T細胞及/或NK之細胞增殖。
此等實施例中之此胞外域及跨膜域之胞外區通常足夠長以形成連接子，在說明性實施例中，跨膜域與另一功能性肽區之間的可撓性連接子，諸如間隙域，其在一些實施例中連接至胞外區之胺基端。因此，胞外區在存在以形成胞外域及跨膜域時長度可在1個胺基酸與1000個胺基酸之間，且通常在4個胺基酸與400個胺基酸之間，在4個胺基酸與200個胺基酸之間，在4個胺基酸與100個胺基酸之間，在4個胺基酸與50個胺基酸之間，在4個胺基酸與25個胺基酸之間或在4個胺基酸與20個胺基酸之間。在一個實施例中，胞外區為針對本發明之此態樣之胞外域及跨膜域之GGGS。
如以下更詳細論述，無論作為包括胞外域及跨膜域之實施例之部分(作為例如如實例11之庫1A、1.1A、1.1B、2B及2.1B所展示之一個部分)或作為包括胞外二聚基元之實施例之部分(如實例12之庫3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B所展示)，跨膜域通常至少足夠長以穿過質膜。因此，跨膜域或胞外域及跨膜域之跨膜區可在10個胺基酸與250個胺基酸之間，且更通常長度為至少15個胺基酸，且可例如在15個胺基酸與100個胺基酸之間，15個胺基酸與75個胺基酸之間、在15個胺基酸與50個胺基酸之間，在15個胺基酸與40個胺基酸之間或在15個胺基酸與30個胺基酸之間。
包括此等域(在說明性實施例中，胞外域)的實施例之 CLE之例示性胞外域及跨膜域通常少於來自經報導為組成性的突變體受體之膜近端胞外域連同跨膜域的30個胺基酸，其不需要用於活化相關胞內域之配位體結合。在說明性實施例中，此等胞外域及跨膜域包括IL7RA Ins PPCL、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHR E260C I270C、IL27RA F523C以及MPL S505N。此胞外域及跨膜域之另外的非限制性實例提供於表7中且例示於實例11及對應表中。在一些實施例中，胞外域及跨膜域不包含在序列中與IL7RA或其突變體之胞外域及/或跨膜域之部分相同的多於10、20、25、30或50個組成性胺基酸。在一些實施例中，胞外域及跨膜域不為IL7RA Ins PPCL。在一些實施例中，胞外域及跨膜域不包含在序列中與IL15R之胞外域及/或跨膜域之部分相同的多於10、20、25、30或50個組成性胺基酸。
額外例示性跨膜域提供於實例12中。說明性實施例中之此等跨膜域來自類型I跨膜蛋白。
因此，本文在一個態樣提供包含一或多個核酸序列之經分離聚核苷酸，其中：該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中包含以下之嵌合多肽，a)來自類型I跨膜蛋白之跨膜域；及b)選自具有表13至18中所識別之經選擇多肽之第一胞內域之基因之胞內域的第一胞內域，其中該嵌合多肽促進B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖。
在說明性實施例中，該嵌合多肽促進PBMC(例如B細胞及/或NK細胞，及/或在說明性實施例中，T細胞)之細胞增殖。如實 例12所展示，此等嵌合多肽能夠在培養期間(例如在添加IL-2至表現編碼嵌合多肽之核酸之PBMC(例如B細胞、T細胞或NK細胞)之培養介質的缺失下)在PBMC至外源性細胞介素(諸如IL-2、IL-15或IL-7)之暴露的缺失下促進PBMC之細胞增殖。如實例12所說明，對於此等實施例，可在轉導PBMC期間，但不在後續培養中添加IL-2。舉例而言，本文揭示之嵌合多肽為淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件，此係由於其能夠促進PBMC(且在說明性實施例中，T細胞)之細胞增殖及視情況細胞存活，且無需在視情況用編碼嵌合淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之核酸轉導PBMC後，在培養第1天、第2天、第3天、第4天、第5天或第7天後的培養PBMC(亦即，T細胞)期間添加IL-2實例13提供可用於識別識別且分析淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件且闡述淋巴增殖性元件之性質或能力的方法之另一實例。此分析可包括例如量測此淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之相關淋巴增殖活性，例如藉由分析由與不表現此等淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之對照淋巴球相比表現此等淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之經基因方式修飾之淋巴球所提供之富集幅度。
在此態樣之一個實施例中，第一核酸序列進一步編碼胞外域，且在說明性實施例中，胞外域包含二聚基元。在此態樣之說明性實施例中，胞外域包含白胺酸拉鏈。在一些實施例中，白胺酸拉鏈來自jun多肽，例如c-jun。在某些實施例中，c-jun多肽為ECD-11之c-jun多肽區。
在其中跨膜域為類型I跨膜蛋白之此等態樣中之任一者之實施例中，跨膜域可為類型I生長因子受體、激素受體、T細胞受體或TNF家族受體。在其中嵌合多肽包含胞外域且其中胞外域包含二 聚基元之態樣及實施例中之任一者之一實施例中，跨膜域可為類型I細胞介素受體、激素受體、T細胞受體或TNF家族受體。
例示性跨膜域包括用於實例12中之任何跨膜域。在一些實施例中，跨膜域來自CD4、CD8RB、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6ST、IL7RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL22RA1、IL31RA、LEPR、PRLR及TNFRSF8或在此等突變體存在於實例12中所提供之構築體中時已知促進某些細胞類型中之信號傳導活性的其突變體。在一些實施例中，跨膜域來自CD40、ICOS、FCGR2C、PRLR、IL3RA或IL6ST。在一些實施例中，跨膜域為針對表13至18中之任何一或多者之構築體中之此等基因所提供之特定跨膜域或來自彼等表之前50個、25個或10個所列構築體中之構築體中之任一者的跨膜域。在說明性實施例中，跨膜域來自CD40或ICOS(作為非限制性實例，針對此等基因之跨膜域提供於表7中)或保留跨膜之能力的其片段，及/或已知促進某些細胞類型中之組成性信號傳導活性之其突變體。
來自此態樣之例示性跨膜域展示為表13至18中之P2。對於庫3A，當發現於本文中之候選嵌合多肽元件之跨膜域位置(P2)處時，來自CD40、CD8B、CRLF2、CSF2RA、GCGR2C、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IL10RB、IL18R1、IL18RAP、IL3RA、LEPR及PRLR之跨膜域(P2)或當此等突變體存在於實例12中所提供之構築體中時已知促進某些細胞類型中之組成性信號傳導活性的其突變體，在以組合方式考慮具有來源於該基因之跨膜域之所有構築體的資料 時，在第7天與最後一天之間促進PBMC之增殖。在實例11及實例12中提供之篩檢中，用含有庫之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導細胞且接著饋入PBMC或不饋入PBMC，如實例11及實例12中所論述。在庫數字後用「A」識別其中細胞饋入PBMC的篩檢，例如庫1A，在庫數字後用「B」識別其中細胞不饋入PBMC的篩檢，例如庫1.1B。此外，以相同方式執行識別為含有「.1」之庫(例如，庫1.1A)的篩檢以篩檢不具有「.1」的對應庫，例如，庫1.1A為庫1A之重複篩檢。對於庫3B，來自CD40、ICOS、CSF2RA、IL18R1、IL3RA及TNFRSF14之跨膜域或當此等突變體存在於實例12中所提供之構築體中時已知促進某些細胞類型中之組成性信號傳導活性的其突變體最能夠促進細胞增殖。對於庫4B，來自IL3RA、CSFR2RA、IL18R1、CD8B、CD40、ICOS之跨膜域或當此等突變體存在於實例12中所提供之構築體中時已知促進某些細胞類型中之組成性信號傳導活性的其突變體最能夠促進細胞增殖。在說明性實施例中，本文提供之CLE中之跨膜域為來自CD40及ICOS之跨膜域。跨膜域或存在於針對庫3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B促進細胞增殖的構築體中之其部分及/或突變體的實例提供於實例12中所提供之表中。
在本文中之任何態樣之一些實施例中，嵌合多肽包含除CSF2RB之跨膜域突變體V449E以外之在展示於表13至18中之構築體中之任一者中所識別之跨膜域。
在一些實施例中，胞外域及跨膜域為病毒蛋白LMP1或其突變體及/或片段。LMP1為已知在靶向脂質筏時或在融合至CD40時獨立於配位體活化細胞信號傳導的多跨跨膜蛋白(Kaykas等人，EMBO J.20：2641(2001))。LMP1之片段通常足夠長以跨越質膜且 活化所連接胞內域。舉例而言，LMP1可在15個胺基酸與386個胺基酸之間、15個胺基酸與200個胺基酸之間、15個胺基酸與150個胺基酸之間、15個胺基酸與100個胺基酸之間、18個胺基酸與50個胺基酸之間、18個胺基酸與30個胺基酸之間、20個胺基酸與200個胺基酸之間、20個胺基酸與150個胺基酸之間、20個胺基酸與50個胺基酸之間、20個胺基酸與30個胺基酸之間、20個胺基酸與100個胺基酸之間、20個胺基酸與40個胺基酸之間或20個胺基酸與25個胺基酸之間。LMP1之突變體及/或片段在包括於本文提供之CLE中時保留其活化胞內域之能力。此外，若存在，胞外域包括至少1個，但通常至少4個胺基酸且其通常連接至另一個功能性多肽，諸如間隙域，例如eTag。在一些實施例中，淋巴增殖性元件包含LMP1跨膜域。在說明性實施例中，淋巴增殖性元件包含LMP1跨膜域，且一或多個胞內域不包含來自以下之胞內域：TNFRSF蛋白(亦即，CD40、4-IBB、RANK、TACI、OX40、CD27、GITR、LTR及BAFFR)、TLR1至TLR13、整聯蛋白、FcyRIII、Dectinl、Dectin2、NOD1、NOD2、CD16、IL-2R、I型及II型干擾素受體、諸如CCR5及CCR7之趨化因子受體、G蛋白偶聯受體、TREM1、CD79A、CD79B、Ig-α、IPS-1、MyD88、RIG-1、MDA5、CD3Z、MyD88△TIR、TRIF、TRAM、TIRAP、MAL、BTK、RTK、RAC1、SYK、NALP3(NLRP3)、NALP3△LRR、NALP1、CARD9、DAI、IPAG、STING、Zap70或LAT。
在本文提供之CLE的其他實施例中，胞外域包括二聚部分。文中所揭示之許多不同二聚部分可用於此等實施例中。在說明性實施例中，二聚部分能夠同源二聚。不受理論限制，二聚部分可對經由跨膜域連接至其的胞內域提供活化功能。此活化可在例如二聚二 聚部分之後提供，其可使得改變經由跨膜域連接至其的胞內域之定向，或其可使得胞內域接近。具有二聚部分之胞外域亦可充當將識別標記連接至表現CLE之細胞的功能。在一些實施例中，二聚劑可位於胞內而非胞外。在一些實施例中，可使用多於一個或多個二聚域。
其中胞外域具有二聚基元之實施例的胞外域足夠長以形成二聚物，諸如白胺酸拉鏈二聚物。由此，包括二聚部分之胞外域可為15個胺基酸至100個胺基酸、20個胺基酸至50個胺基酸、30個胺基酸至45個胺基酸或35個胺基酸至40個胺基酸，在說明性實施例中為表7中所提供之c-Jun胞外域之c-Jun部分。包括二聚部分之多肽之胞外域可不保留其他功能性。舉例而言，對於白胺酸拉鏈二聚物，此等白胺酸拉鏈能夠形成二聚物，此係由於其保留沿著α隔開7個殘基的白胺酸之基元。然而，本文提供之CLE之某些實施例之白胺酸拉鏈部分可或可不保留其之DNA結合功能。
此類型之一個例示性胞外域為來自Jun部分(諸如c-Jun)之白胺酸拉鏈域。舉例而言，胞外域可為發現於NM_002228_3(表7)中之c-Jun之變體。此胞外域用於實例18中所論述之構築體中。
1個丙胺酸與4個丙胺酸之間的間隔子可包括於具有二聚部分之胞外域與跨膜域之間的CLE中。不受理論限制，咸信，丙胺酸間隔子藉由改變胞內域之定向來影響經由跨膜域連接至白胺酸拉鏈胞外區的胞內域之信號傳導。
本文提供之CLE之第一胞內域及第二胞內域為已知在至少一些細胞類型中之基因之胞內信號傳導域，以促進增殖、存活(抗凋亡)及/或提供增強分化狀態、增殖潛能或對細胞死亡之抗性的共 刺激信號。由此，此等胞內域可為來自淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件之胞內域及本文提供之共刺激域。已知候選嵌合多肽之胞內域中之一些可活化JAK1/JAK2信號傳導、JAK3、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5及STAT6。來自IFNAR1、IFNGR1、IFNLR1、IL2RB、IL4R、IL5RB、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL21R、IL27R、IL31RA、LIFR及OSMR之胞內域在此項技術中已知用於活化JAK1信號傳導。來自CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IFNGR2、IL3RA、IL5RA、IL6ST、IL20RA、IL20RB、IL23R、IL27R、LEPR、MPL及PRLR之胞內域在此項技術中已知用於活化JAK2。來自IL2RG之胞內域在此項技術中已知用於活化JAK3。來自GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IL2RB、IL2RG、IL4R、IL5RA、IL5RB、IL7RA、IL9R、IL21R、IL22RA1、IL31RA、LIFR、MPL及OSMR之胞內域在此項技術中已知用於活化STAT1。來自IFNAR1及IFNAR2之胞內域在此項技術中已知用於活化STAT2。來自GHR、IL2RB、IL2RG、IL6R、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27R、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL及OSMR之胞內域在此項技術中已知用於活化STAT3。來自IL12RB1之胞內域在此項技術中已知用於活化STAT4。來自CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL5RB、IL7RA、IL9R、IL15RA、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL31RA、LIFR、MPL、OSMR及PRLR之胞內域在此項技術中已知用於活化STAT5。來自IL4R及OSMR之胞內域在此項技術中已知用於活化STAT6。發現於第一胞內域中之基因及其胞內域與第二胞內域相同，除若第一胞內域及第二胞內域相同，則至少一個且通常跨膜域及胞外域兩者不來自 相同基因以外。
例示性胞內域包括來自表8至表12中所列之構築體之彼等。來自經經驗上判定為在實例11之實驗中為活性的此等基因之例示性胞內域提供於實例11中所提供之表之第一胞內域(P3)及第二胞內域(P4)位置中且如以下此章節中進一步所列舉。在針對實例11篩檢之最優命中者中所識別之說明性胞內域包括CD40、CSF2RA、IFNAR1、IL1RAP、IL4R、IL6ST、IL11RA、IL12RB2、IL17RA、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL21R、IL23R、MPL及MyD88。在針對實例12篩檢之最優命中者中所識別之說明性胞內域包括CD40、LEPR、MyD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA。在某些說明性實施例中，第一胞內域為MPL、LEPR、MyD88或IFNAR2。對於此等某些說明性實施例，非限制性例示性第二胞內域(P4)域為連接至對應MPL、LEPR、MyD88、IFNAR2、CD40、CD79B或CD27第一胞內域(P3)(提供於表13至18中)之基因的彼等，在一些非限制實例中包括此等表中所提供之彼等基因之第一胞內域及/或第二胞內域。對於此等某些說明性實施例，其他非限制例示性第二胞內域(P4)域為連接至實例12中所提供之表中之對應MPL、LEPR、MYD88、IFNAR2、CD40、CD79B或CD27第一胞內域，包括(作為非限制性實例)此等表中所提供之彼等基因之第一胞內域及/或第二胞內域。在一些實施例中，嵌合淋巴增殖性元件淋巴增殖性元件可為實例11及實例12之表19至23中之多肽中之任一者。
在某些說明性實施例中，第二胞內域來自CD3D、CD3G、CD27、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4及TNFRSF8，或當此等突變體存在於實例12中所提供之構 築體中時已知促進某些細胞類型中之信號傳導活性的其突變體。在某些說明性實施例中，第二胞內域來來自CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27，在說明性實例中包括CD40、CD79B及CD27之胞內域。對於此等某些說明性實施例，非限制性例示性第一胞內域(P3)為連接至CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27之基因之彼等，在說明性實例中包括表13至18中之CD40、CD79B或CD27之胞內域，包括(作為非限制性實例)此等表中所提供之彼等基因之第一胞內域及/或第二胞內域。對於此等某些說明性實施例，其他非限制性例示性第一胞內(P3)域為連接至CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27之基因之彼等，在說明性實例中包括作為實例12中所提供之P3的此等基因之表中之CD40、CD79B及CD27第二胞內域之胞內域，包括(作為非限制性實例)此等表中所提供之彼等基因之第一胞內域及/或第二胞內域。
在說明性實施例中，第一胞內域來自MPL，且第二胞內域來自OX40、CD40、CD79A或CD79B。如實例10中所展示，在0.05之假發現率下，當包括為含有MPL作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自此等基因之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者中的增殖。在其他說明性實施例中，第一胞內域來自MPL，且第二胞內域來自OX40、CD40或CD79B。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S186(SEQ ID NO：491)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自以下之序列中之一者：S050、S051、S052、S053或S211(分別為SEQ ID NO：416至419及504)，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來 自CSF2RA，且第二胞內域來自OX40、CD27、CD28或CD30。如實例10中所展示，在0.1之假發現率下，當包括為含有CSF2RA作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自此等基因之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在其他說明性實施例中，第一胞內域來自CSF2RA，且第二胞內域來自OX40或CD28。如實例10中所展示，在0.05之假發現率下，當包括為含有CSF2RA作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自此等基因之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S059(SEQ ID NO：423)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自以下之序列中之一者：S047(SEQ ID NO：413)或S212(SEQ ID NO：505)，或促進信號傳導之其變體或片段。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S058(SEQ ID NO：422)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S211(SEQ ID NO：504)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自CSF3R，且第二胞內域來自CD79B。如實例10中所展示，在0.05之假發現率下，當包括為含有CSF3R作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自CD79B之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S064(SEQ ID NO：426)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S053(SEQ ID NO：419)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自IL11RA，且第二胞內域來自FCGRA2。如實例10中所展示，在0.05之假發現率下，當包括為含有IL11RA作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時， 來自FCGRA2之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S135(SEQ ID NO：461)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S076(SEQ ID NO：431)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自LIFR，且第二胞內域來自GITR。如實例10中所展示，在0.05之假發現率下，當包括為含有LIFR作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自GITR之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S180(SEQ ID NO：489)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S216(SEQ ID NO：509)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自MyD88，且第二胞內域來自CD3D或CD79B。如實例10中所展示，在0.1之假發現率下，當包括為含有MyD88作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自此等基因之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S192(SEQ ID NO：495)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S053(SEQ ID NO：419)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S194(SEQ ID NO：497)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S037(SEQ ID NO：405)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S195(SEQ ID NO：498)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S053(SEQ ID NO：419)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。
關於在促進細胞存活及增殖的構築體內在實例11及 實例12中識別之以上基因之例示性胞內域的詳細資訊(包括序列資訊)提供於表7中。可包括於本文中所提供之CLE實施例中的胞內域包括所陳述基因之胞內域之突變體及/或片段，限制條件為此類突變體及/或片段保持促進增殖、存活(抗凋亡)及/或提供加強分化狀態、增殖潛能或對細胞死亡之抗性之共刺激信號的能力。如此，胞內域可例如在10個與1000個胺基酸、10個與750個胺基酸、10個與500個胺基酸、10個與250個基酸或10個與100個胺基酸之間。在說明性實施例中，胞內域可為至少30個胺基酸，或在30個與500個胺基酸、30個與250個胺基酸、50個與500個胺基酸、50個與250個胺基酸之間。在說明性實施例中，第一胞內域來自IFNAR2，且第二胞內域來自HVEM。如實例10中所展示，在0.05之假發現率下，當包括為含有IFNAR2作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自HVEM之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S083(SEQ ID NO：436)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S214(SEQ ID NO：507)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自IL1RAP，且第二胞內域來自CD79A。如實例10中所展示，在0.1之假發現率下，當包括為含有IL1RAP作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自CD79A之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S101(SEQ ID NO：444)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S052(SEQ ID NO：418)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自IL3RA，且第二胞內域來自CD40。如實例10中所展示，在0.1之假發現率下，當 包括為含有IL3RA作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自CD40之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S109(SEQ ID NO：450)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S050(SEQ ID NO：416)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自IL10RA，且第二胞內域來自CD79B。如實例10中所展示，在0.05之假發現率下，當包括為含有IL10RA作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自CD79B之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S129(SEQ ID NO：450)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S050(SEQ ID NO：416)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自IL13RA2，且第二胞內域來自HVEM。如實例10中所展示，在0.1之假發現率下，當包括為含有IL13RA2作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自HVEM之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S142(SEQ ID NO：466)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S214(SEQ ID NO：507)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自IL18RAP，且第二胞內域來自CD3G。如實例10中所展示，在0.1之假發現率下，當包括為含有IL18RAP作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自CD3G之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S155(SEQ ID NO：475)之 序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S039(SEQ ID NO：407)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自IL27RA，且第二胞內域來自FCGRA2。如實例10中所展示，在0.05之假發現率下，當包括為含有IL27RA作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自FCGRA2之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S169(SEQ ID NO：482)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S076(SEQ ID NO：431)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，第一胞內域來自LEPR，且第二胞內域來自CD3G。如實例10中所展示，在0.1之假發現率下，當包括為含有LEPR作為第一胞內域之嵌合淋巴增殖性元件的第二胞內域時，來自CD3G之胞內域經展示顯著增加庫3.1或庫4.1中之至少一者的增殖。在一些實施例中，第一胞內域含有來自S177(SEQ ID NO：488)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且第二胞內域含有來自S039(SEQ ID NO：407)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。
在一些實施例中，CLE之所有域不為IL-7受體或其突變體，及/或具有IL-7受體之至少10個、15個、20個或25個連續胺基酸之其片段，或不為IL-15受體或其突變體，及/或具有IL-15受體之至少10個、15個、20個或25個連續胺基酸之其片段。在一些實施例中，CLE不包含CD40及MyD88之第一胞內域及第二胞內域的組合。
在說明性實施例中，CLE包括識別域及/或消除域。關於識別域及/或消除域之細節提供於本文中之其他章節中。本文提供之識別域及/或消除域中之任一者可為CLE之部分。通常，識別域連接 至胞外域之N端。不受理論限制，在一些實施例中，胞外域包括提供連接子(在說明性實施例中，可撓性連接子)的功能，從而將識別域連接至表現CLE之細胞。
在說明性實施例中，如圖15及圖16所說明，本文提供之CLE與可根據本文提供之CAR實施例中之任一者設計或此項技術中另外已知之CAR共表現。
本文提供之一些實施例為經分離聚核苷酸及編碼本文提供之CLE中之任一者的核酸序列，如圖15至圖18中所例示。此等經分離聚核苷酸可包括此項技術中已知之任何元件，以用於提供轉錄物(諸如編碼CLE之轉錄物)之表現。舉例而言，經分離聚核苷酸可包括在B細胞、T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子元件。對於此等實施例而言為合適的此等啟動子在此項技術中為已知的，其中之一些在本發明之其他章節中識別。舉例而言，熟習的技術者將如實例11及實例12中更詳細論述所理解，如何涉及經分離聚核苷酸及含有其之載體，以用於表現本文提供之CLE實施例中之任一者。舉例而言，在一些實施例中，將Kozak序列提供於ATG起始位點上游的10個核苷酸內，該起始位點編碼CLE或位於相同轉錄單元上之CLE上游之CAR的胺基末端胺基酸。在一些實施例中，聚核苷酸可為轉譯起始序列。在一些實施例中，聚核苷酸可為轉譯起始序列，該轉譯起始序列可為AGAGGATCCATG(SEQ ID NO：533)。在一些實施例中，轉譯起始序列可為Kozak型序列，本文中亦稱為Kozak。在一些實施例中，Kozak型序列可為CCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO：515)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：516)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：517)或GCCGCCGCCAT/U(G)(SEQ ID NO：531)。在本文中所揭示 之實施例中之任一者中，可使用內部核糖體結合位點代替Kozak型序列。因此，在包含編碼本文提供之CLE之核酸的聚核苷酸實施例中，聚核苷酸可進一步包含Kozak相關序列、WPRE元件及多個終止序列中之一或多者，例如二重終止序列或三重終止序列。在一些實施例中，編碼CLE之核酸的三重終止序列可在CLE之啟動子上游。在說明性實施例中，三重終止序列可包括在10個、25個、50個或100個核苷酸內之啟動子的5’末端上游。在一些實施例中，編碼CLE之核酸中之三重終止序列可在啟動子之後且在相關聯之Kozak相關序列之前被包括。在說明性實施例中，三重終止序列可包括在10個、25個、50個或100個核苷酸內之啟動子的3’末端下游，及/或在10個、25個、50個或100個核苷酸內之Kozak相關序列的5’末端上游。在一些實施例中，編碼CLE之核酸的三重終止序列可在CLE之編碼序列後被包括。在說明性實施例中，三重終止序列可包括在10個、25個、50個或100個核苷酸內之CLE之終止密碼子的3’末端下游。在一些實施例中，三重終止序列可在CLE之編碼序列的3’末端處。編碼CLE之核酸可包括一個、兩個、三個或更多個三重終止序列。在說明性實施例中，編碼CLE之核酸可包括啟動子上游之三重終止序列、啟動子下游及Kozak相關序列上游之三重終止序列以及CLE之編碼序列下游的三重終止序列。在本文中所揭示之實施例中之任一者中，三重終止序列可包括處於相同讀取框中之三個終止密碼子。在說明性實施例中，三重終止序列可為SEQ ID NO：520。當使用在相同讀取框中具有多個終止密碼子之多重終止序列時，技術人員將理解，多重終止序列應在與CLE及/或CAR之編碼序列相同的讀取框中。在本文中所揭示之實施例中任一者的說明性實施例中，三重終止序列可包括不同讀取框中之三個終止密碼 子。在說明性實施例中，三重終止序列可為SEQ ID NO：534。
此外，包括編碼本文提供之CLE之核酸序列的聚核苷酸通常亦包含信號序列以直接表現質膜。例示性信號序列通常提供在本文中提供於其他章節中。可在轉錄物上提供元件，使得CAR及CLE兩者自相同轉錄物表現。此構築體在比此等元件自不同轉錄物表現時需要更少的核酸方面為有利的，其為使得此等構築體存在於載體(諸如反轉錄病毒基因組)中的重要特徵，例如用於轉染或轉導B細胞T細胞及/或NK細胞。
眾多嵌合多肽候選物經涉及及識別為本文中之實例11及實例12中之淋巴增殖性元件。對於庫1A(其包括編碼嵌合多肽及CAR之構築體)，172個頂部候選嵌合多肽經識別(參見表8)，在不存在IL-2之情況下培養時，在第7天與最後一天之間促進PBMC增殖。對於庫2B(其包括編碼嵌合多肽但不包括CAR之構築體)，167個頂部候選嵌合多肽經識別(參見表9)，在不存在IL-2之情況下培養時，在第7天與最後一天之間促進PBMC增殖。某些說明性CLE以及聚核苷酸以及編碼其之核酸序列，以及包括此等中之任一者的方法包括在表8至12中所提供之構築體上之來自來自具有經匹配域之基因(例如，跨膜基因及第一胞內基因及視情況第二胞內基因)的胞內域以及(在非限制性實例中)在此等表上提供之特定經匹配域，其中之一些闡述於本文中之例示性實施例章節中。在說明性實施例中，可使用在具有相同P1至P2、P3及P4域(例如，庫1A及1.1A)之首次篩檢及重複篩檢中具有尤其值得注意的富集度之構築體上的來自具有經匹配域之CLE(例如，跨膜基因及第一胞內基因及視情況第二胞內基因)的胞內域，如表8至12中所展示。對於庫1A及1.1A，構築體M001-S116-S044、 M024-S192-S045、M001-S047-S102、M048-S195-S043、M012-S216-S211及M030-S170-S194在兩次篩檢中具有尤其值得注意的富集度。
關於在對庫1A及庫1.1A兩者之篩檢中的具有尤其值得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表20中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個ITAM基元。如實例17中所展示，具有來自IL6R、MYD88、CD27、MYD88、TNFRSF18或IL31RA之胞內域的構築體(當存在於第一胞內域(P3)時)及具有來自CD8B、IL1RL1、CD8A、TNFRSF4或MYD88之胞內域的構築體(當存在於第二胞內域(P4)時)，在庫1A及1.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表20)。具有來自細胞介素受體IL6R、CD27、TNFRSF18或IL31RA之結構域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自細胞介素受體IL1RL1或TNFRSF4之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫1A及1.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表20)。
對於庫2B及2.1B，構築體M007-S049-S051、M007-S050-S039、M012-S050-S043、M012-S161-S213、M030-S142-S049、M001-S145-S130、M018-S085-S039、M018-S075-S053、M012-S135-S074及M007-S214-S077在兩個篩檢中具有尤其值得注意的富集度。出於重複篩檢之目的，具有尤其值得注意的富集度之構築體為具有log2((在最後一天之標準化計數資料+1)/(在第7天之標準化計數資料+1))值大於2之彼等構築體。
關於在對庫2B及庫2.1B兩者之篩檢中的具有尤其值 得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表21中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個ITAM基元。具有來自CD28、CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD40、CD3G、CD8A、TNFRSF9、CD28、IL10RB、CD79B、FCER1G或GHR之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫2B及2.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表21)。在本文中所提供之一些實施例中，淋巴組織增殖性元件之胞內域來自CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IFNGR2及FCGR2C。具有來自細胞介素受體CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、IL11RA或TNFRSF14之結構域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自細胞介素受體TNFRSF9、IL10RB、GHR或CD40之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫2B及2.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表21)。具有含有FCGR2C之ITAM基元之結構域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有含有CD3G、CD79B或FCER1G之ITAM基元之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫2B及2.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表21)。
在一初始中期分析中，對於庫3A(其包括編碼嵌合多肽及CAR之構築體)，126個頂部候選嵌合多肽經識別(參見表13)，在不存在IL-2之情況下培養時，如實例12中所闡述在用未經轉導之PBMC刺激之經轉導PBMC的第7天與最後一天之間促進PBMC增殖。對於庫3B(其包括編碼嵌合多肽及CAR之構築體)之初始中期分 析，127個頂部候選嵌合多肽經識別(參見表14)，在不存在IL-2之情況下培養時，如實例12中所闡述在未用未經轉導之PBMC刺激之經轉導PBMC的第7天與最後一天之間促進PBMC增殖。對於庫4B(其包括編碼嵌合多肽而非CAR之構築體)，154個頂部候選嵌合多肽經識別(參見表17)，在不存在IL-2之情況下培養時，如實例12中所闡述在未用未經轉導之PBMC刺激之經轉導PBMC的第7天與最後一天之間促進PBMC增殖。
在進一步解碼之後(其提供深度解碼)，在庫3A及3B中，其包括編碼嵌合多肽及CAR及補充有(庫3A)或未補充有(庫3B)新鮮經轉導PBMC之經轉導PBMC的構築體，在第21天對於庫3A識別到134個頂部候選物，在第35天對於庫3A識別到124個頂部候選物，且第21天對於庫3B識別到131個頂部候選物(分別參見表13及表14)在不存在IL-2(亦即，在初始轉導後的培養期間不將IL-2添加至培養介質)、IL-7或任何其他外源性細胞介素之情況下培養時，在第7天與最後一天之間促進PBMC增殖。
某些說明性CLE以及聚核苷酸以及編碼其的核酸序列以及包括此等中之任一的方法包括在表13至18中所提供之構築體上之來自來自具有經匹配域之基因(例如，跨膜基因及第一胞內基因及視情況第二胞內基因)的胞內域以及(在非限制性實例中)在此等表上提供之特定經匹配域，其中之一些闡述於本文中之例示性實施例章節中。在例示性CLE實施例中設想，來自第一胞內域或第二胞內域位置的在實例11及實例12中所提供之資料中所識別之胞內域可互換地作為第一胞內域或第二胞內域。在說明性實施例中，可使用在具有相同P1、P2、P3及P4域(例如，庫3A及3.1A)之首次篩檢及重複篩檢中具 有尤其值得注意的富集度之構築體上之來自具有經匹配域之基因(例如，跨膜基因及第一胞內基因及視情況第二胞內基因)的胞內域。對於庫3A及3.1A，構築體E008/E013-T041-S186-S050、E006/E011-T077-S186-S211、E007/E012-T021-S186-S051、E009/E014-T041-S186-S053、E007/E012-T073-S186-S053、E006/E011-T017-S186-S051、E006/E011-T031-S186-S211、E006/E011-T011-S186-S050、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T001-S186-S050、E006/E011-T041-S186-S051、E008/E013-T028-S186-S076、E009/E014-T029-S199-S053、E009/E014-T062-S186-S216、E007/E012-T006-S058-S051、E009/E014-T076-S186-S211及E007/E012-T001-S186-S047在兩個篩檢中均具有尤其值得注意的富集度，其中藉由此處之斜杠間隔開之P1部分包括如表7、13及15中所示之庫3A及3.1A的不同標籤。出於重複篩檢之目的，具有尤其值得注意的富集度之構築體為具有log2((在最後一天之標準化計數資料+1)/(在第7天之標準化計數資料+1))值大於2之彼等構築體。
關於在對庫3A及庫3.1A兩者之篩檢中的具有尤其值得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表22中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個ITAM基元。具有來自MPL、OSMR或CSF2RA之胞內域之構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD40、TNFRSF4、CD79B、CD27、FCGR2A或TNFRSF18之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3A及3.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表22)。具有來自細 胞介素受體MPL、OSMR或CSF2RA之結構域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自細胞介素受體CD40、TNFRSF4、CD27或TNFRSF18之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3A及3.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表22)。具有含有MPL或OSMR之ITAM基元之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3A及3.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表22)。
對於3B及3.1B，構築體E007/E012-T017-S186-S051、E007/E012-T073-S186-S053、E008/E013-T028-S186-S047、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T082-S176-S214、E006/E011-T046-S186-S052、E008/E013-T029-S186-S052、E009/E014-T011-S186-S053、E008/E013-T032-S186-S039、E007/E012-T034-S186-S051、E007/E012-T041-S192-S213、E006/E011-T014-S069-S213、E006/E011-T022-S186-S053、E006/E011-T023-S115-S075、E006/E011-T029-S106-S213、E006/E011-T032-S155-S080、E006/E011-T041-S186-S216、E006/E011-T057-S135-S080、E006/E011-T072-S191-X002、E006/E011-T077-S186-S216、E006/E011-T080-S141-S080、E007/E012-T001-X001-S214、E007/E012-T007-S059-S211、E007/E012-T016-S186-S052、E007/E012-T031-S186-S053、E007/E012-T044-S102-S052、E007/E012-T044-S142-X002、E007/E012-T055-S069-S053、E007/E012-T063-S176-S216、E007/E012-T065-S157-S075、E008/E013-T008-S085-X002、E008/E013-T011-S085-S048、E008/E013-T021-S109-X002、E008/E013-T021-S168-S211、E008/E013-T032-S064-S214、 E008/E013-T037-S170-S215、E008/E013-T038-S176-S048、E008/E013-T039-S137-S216、E008/E013-T041-S141-S053、E008/E013-T045-S177-S048、E008/E013-T048-S109-S074、E008/E013-T073-S199-S075、E009/E014-T001-S157-S074、E009/E014-T005-S196-S049、E009/E014-T011-S130-X002、E009/E014-T013-S155-X002、E009/E014-T017-S186-S076、E009/E014-T021-S142-S080、E009/E014-T023-S082-S076、E009/E014-T038-S196-S037、E009/E014-T055-S186-S052、E009/E014-T060-S175-S053、E009/E014-T070-S085-S212、E008/E013-T026-S054-S213、E009/E014-T007-S120-S053、E007/E012-T045-S186-S211、E008/E013-T073-S186-X002、E008/E013-T074-S186-X002、E007/E012-T055-S186-S053、E008/E013-T036-S186-S053、E007/E012-T017-S058-S053、E008/E013-T030-S189-S080、E006/E011-T029-S081-S047、E009/E014-T044-S194-S050、E006/E011-T028-S121-X002、E008/E013-T028-S186-S053、E009/E014-T078-S142-S213、E009/E014-T041-S186-S051、E008/E013-T006-S186-S050、E006/E011-T028-S186-S075、E006/E011-T040-S120-S038、E007/E012-T044-S115-S211、E009/E014-T039-S176-S075、E007/E012-T028-S186-S050、E008/E013-T031-S202-S050、E007/E012-T072-S192-S053、E006/E011-T065-X001-S051、E007/E012-T030-S062-X002、E007/E012-T073-S186-X002、E009/E014-T056-S186-S053、E008/E013-T046-S137-X002、E006/E011-T016-S136-S076、E007/E012-T032-S142-S037、 E007/E012-T065-S120-S215、E009/E014-T077-S186-S047、E009/E014-T001-S126-S051、E006/E011-T030-S121-S039、E008/E013-T006-S176-S213、E009/E014-T032-S130-S215、E008/E013-T041-S186-S039、E009/E014-T021-S186-S047、E008/E013-T026-S137-S214、E007/E012-T029-S116-S075、E008/E013-T026-S106-S049以及E007/E012-T032-S168-S075在兩次篩檢中具有尤其值得注意的富集度，其中由此處之斜線隔開的P1部分包括庫3B及3.1B之不同標記，如表7、14及16中所展示。出於重複篩檢之目的，具有尤其值得注意的富集度之構築體為具有log2((在最後一天之標準化計數資料+1)/(在第7天之標準化計數資料+1))值大於2之彼等構築體。
關於在對庫3B及庫3.1B兩者之篩檢中的具有尤其值得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表23中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個ITAM基元。具有來自MPL、LEPR、MYD88、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD40、CD79B、CD27、TNFRSF14、CD79A、CD3G、TNFRSF9、FCGR2C、ICOS、TNFRSF18、TNFRSF4、CD28、FCER1G、FCGR2A、CD3D、TNFRSF8或CD3E之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3B及3.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表23)。具有來 自MPL、LEPR、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD40、CD27、TNFRSF14、TNFRSF9、TNFRSF18、TNFRSF4或TNFRSF8之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3B及3.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表23)。具有含有CD79B、CD79A、CD3G、FCGR2C、FCER1G、FCGR2A、CD3D或CD3E之ITAM基元之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3B及3.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表23)。
對於庫4B及4.1B，構築體E007/E012-T078-S154-S047、E008/E013-T062-S186-X002、E008/E013-T055-S186-S050、E009/E014-T057-S186-S050、E007/E012-T077-S054-S053、E007/E012-T034-S135-S211、E009/E014-T071-X001-S216、E009/E014-T011-S141-S037、E008/E013-T041-S186-S037、E006/E011-T038-S106-S039、E006/E011-T011-S121-X002、E007/E012-T007-S085-S215、E006/E011-T041-S186-S050、E007/E012-T008-S064-S051、E006/E011-T041-S186-S047、E008/E013-T045-S186-S051、E008/E013-T003-S104-S216、E006/E011-T019-S186-S053、E008/E013-T071-S064-S080、E006/E011-T021-S054-X002、E006/E011-T003-S135-X002、E009/E014-T020-S199-S213、E008/E013-T027-S121-S211、E009/E014-T032-S195-X002、 E009/E014-T050-S171-X002、E008/E013-T069-S083-X002、E008/E013-T026-S116-S038、E009/E014-T072-S195-X002、E007/E012-T047-S058-S211、E008/E013-T046-S142-S080、E006/E011-T065-S186-S076、E006/E011-T062-S069-X002、E007/E012-T047-S098-X002、E009/E014-T069-S099-S048、E008/E013-T039-S141-S050、E006/E011-T052-S130-S052、E008/E013-T041-S186-X002、E007/E012-T019-S120-X002、E008/E013-T045-S186-S053、E006/E011-T003-S170-S039、E007/E012-T047-S058-S051、E007/E012-T069-S109-X002、E009/E014-T019-S130-S075以及E006/E011-T047-S054-S053在兩次篩檢中具有尤其值得注意的富集度，其中由此處之斜線隔開的P1部分包括庫4B及4.1B之不同標記，如表7、17及18中所展示。出於重複篩檢之目的，具有尤其值得注意的富集度之構築體為具有log2((在最後一天之標準化計數資料+1)/(在第7天之標準化計數資料+1))值大於2之彼等構築體。關於在對庫4B及庫4.1B兩者之篩檢中的具有尤其值得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表24中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個ITAM基元。具有來自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、MYD88、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD27、CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF18、CD3D、CD3G、CD27、ICOS、TNFRSF9、CD3E、FCGR2A、CD28、CD79A或FCGR2C之胞內域的 構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫4B及4.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表24)。具有來自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD27、CD40、TNFRSF4、TNFRSF18或TNFRSF9之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫4B及4.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表24)。具有含有CD79B、CD3D、CD3G、CD3E、FCGR2A、CD79A或FCGR2C之ITAM基元之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫4B及4.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表24)。
在說明性實施例中，CLE包含來自表19至23之構築體中之任一者中的胞內域。在一些說明性實施例中，CLE包含來自僅具有單個胞內域(其他P3或P4為連接子或終止)之表19至23之構築體中之任一者中的胞內域。
關於本文中所提供之各種例示性CLE域的資訊發現於表7中。舉例而言，標識於表8中之第一CLE為M008-S212-S075。對於此CLE，胞外域及跨膜域(P1-2)為M008，第一胞內域(P3)為S212，且第二胞內域(P4)為S075。當考慮編碼其之核酸時，例如M008，關於此等域及模組之標識符的詳細資訊發現於表7中。表7揭示M008為ECDTM-8，且更特定而言為具有PPCL插入之介白素7受體α(IL7RA)突變體且構築體包括eTag。
對於庫1A，當發現於候選嵌合多肽之第一胞內域位置(P3)處時，來自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8及TNFRSF9之胞內域或具有信 號傳導活性之其突變體，在以組合方式考慮具有來源於該基因之第一胞內域(P3)之所有構築體的資料時，在第7天與最後一天之間促進PBMC之增殖。因此，本文中所提供之CLE之例示性實施例具有來自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8及TNFRSF9的胞內域，包括作為第二胞內域(或在說明性實施例中，第一胞內域)保留信號傳導活性之其突變體。
對於庫1A，當發現於候選嵌合多肽之第二胞內域位置(P4)處時，來自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18之胞內域或已知具有信號傳導活性之其突變體，在以組合方式考慮具有來源於該基因之第二胞內域(P4)之所有構築體的資料時，在第7天與最後一天之間促進PBMC之增殖。存在於促進細胞增殖之構築體中之第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於實例11中之表中。因此，本文提供之CLE之例示性實施例具有來自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞內域，包括作為第一胞內域(或在說明性實施例中，第二胞內域)保留信號傳導活性之其突變體。
對於庫3A，當發現於本文中之候選嵌合多肽元件之第一胞內域(P3)處時，來自CSF2RA、IFNAR1、IL1RAP、IL4R、IL6ST、IL11RA、IL12RB2、IL17RA、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL21R、IL23R、MPL及MyD88之第一胞內(P3)域或當此等突變體存在於實例12中所提供之構築體中時已知促進某些細胞類型中之信號傳導活性 之其突變體，在以組合方式考慮具有來源於該基因之第一胞內域之所有構築體的資料時，在第7天與最後一天之間或第7天與第21天之間促進PBMC之增殖。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，使得當針對一個基因將所有構築體之結果組合時，對於庫3A，以表上指示之最後一天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為至少2。對於庫3B，當以此方式進行分析時，來自CSF2RB、IL4R及MPL之第一胞內域或當此等突變體存在於實例12中所提供之構築體中時已知促進某些細胞類型中之信號傳導活性之其突變體效能最佳。存在於針對庫3A、3B、3.1A及3.1B促進細胞增殖的構築體中之第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表13至表16中。
對於庫3A，當發現於本文中之候選嵌合多肽元件之第二胞內域(P4)處時，來自CD3D、CD3G、CD27、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4及TNFRSF8之第二胞內(P4)域或當此等突變體存在於實例12中所提供之構築體中時已知促進某些細胞類型中之信號傳導活性之其突變體，在以組合方式考慮具有來源於該基因之第二胞內域之所有構築體的資料時，在表上所指示之第7天與第21天之間或第7天與最後一天之間促進PBMC之增殖。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，使得當針對一個基因將所有構築體之結果組合時，對於庫3A，以表上指示之最後一天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為至少2。存在於針對庫3A及3B促進細胞增殖的構築體中之第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表13至表18中。
在一初始中期解碼分析後，對於庫3A，當發現於本文中之候選嵌合多肽元件之第一胞內域(P3)處時，來自IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL之第一胞內(P3)域或已知促進某些細胞類型中之信號傳導活性之其突變體，在以組合方式考慮具有來源於該基因之第一胞內域之所有構築體的資料時，在第7天與第21天之間促進PBMC之增殖。對於庫3B，當以此方式進行分析時，來自IL21R、MPL或OSMR之第一胞內域或已知促進某些細胞類型中之信號傳導活性之其突變體效能最佳。存在於針對庫3A及3B促進細胞增殖的構築體中之第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於實例12中之表中。因此，本文提供之CLE之例示性實施例具有來自IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL F9之胞內域，包括作為第二胞內域(或在說明性實施例中，第一胞內域)保留信號傳導活性之其突變體。
在一初始解碼分析後，對於庫3A，當發現於本文中之候選嵌合多肽元件之第二胞內域(P4)處時，來自CD27、CD3G、CD40及CE79B之第二胞內(P4)域或已知促進某些細胞類型中之信號傳導活性之其突變體，在以組合方式考慮具有來源於該基因之第二胞內域之所有構築體的資料時，在表上所指示之第7天與最後一天之間促進PBMC之增殖。對於庫3B，當以此方式進行分析時，來自CD40之第二胞內域或已知促進某些細胞類型中之信號傳導活性之其突變體效能最佳。因此，本文提供之CLE之例示性實施例具有來自CD27、CD3G、CD40及CE79B之胞內域，包括作為第一胞內域(或在說明性實施例中，第二胞內域)保留信號傳導活性之其突變體。
如表13至18所展示，當發現於本文中之候選嵌合多肽之第一胞內域(P3)處時，來自MPL、LEPR、MYD88、IFNAR2之第一 胞內(P3)域或在一些情況中保留信號傳導活性之其突變體，在考慮最頻繁出現在頂部候選構築體中之第一胞內域時，在第7天與實驗結束之間促進PBMC之增殖。存在於針對庫3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B促進細胞增殖的構築體中之第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於實例12中之表中。因此，本文提供之CLE之例示性實施例具有來自MPL、LEPR、MYD88、IFNAR2之胞內域，包括作為第二胞內域(或在說明性實施例中，第一胞內域)保留信號傳導活性之其突變體。
如表13至18所展示，當發現於本文中之候選嵌合多肽之第二胞內域(P4)處時，來自CD40、CD79B、CD27之第二胞內(P4)域或在一些情況中保留信號傳導活性之其突變體，在考慮最頻繁出現在頂部候選構築體中之第一胞內域時，在第7天與表上所指示之最後一天之間促進PBMC之增殖。存在於針對庫3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B促進細胞增殖的構築體中之第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於實例12中之表中。因此，本文提供之CLE之例示性實施例具有來自CD40、CD79B、CD27之胞內域，包括作為第一胞內域(或在說明性實施例中，第二胞內域)保留信號傳導活性之其突變體。
在說明性實施例中，CLE之構築體編碼來自P3處之MPL的胞內域及來自P4處之OX40、CD40、CD79A或CD79B的胞內域。如實例10中所展示，來自此等基因之胞內域展示，當包括在含有P3處之MPL的嵌合淋巴組織增殖性元件之P4處時，在庫3.1或庫4.1中之至少一者中在0.05之假發現率下顯著地增加增殖。在說明性實施例中，構築體編碼來自P3處之MPL的胞內域及來自P4處之OX40、CD40或CD79B的胞內域。在一些實施例中，構築體編碼P3處之S186(SEQ ID NO：491)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且構築體編碼P4處之S050、S051、S052、S053或S211(分別為SEQ ID NO：416至419及504)之序列，或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，CLE之構築體編碼來自P3處之CSF2RA的胞內域及來自P4處之OX40、CD27或CD30的胞內域。如實例10中所展示，來自此等基因之胞內域展示，當包括在含有P3處之CSF2RA的嵌合淋巴組織增殖性元件中之P4處時，在庫3.1或庫4.1中之至少一者中在0.1之假發現率下顯著地增加增殖。在其他說明性實施例中，構築體編碼來自P3處之CSF2RA的胞內域及來自P4處之OX40的胞內域。如實例10中所展示，來自OX40之胞內域展示，當包括在含有P3處之CSF2RA的嵌合淋巴組織增殖性元件之P4處時，在庫3.1或庫4.1中之至少一者中在0.05之假發現率下顯著地增加增殖。在一些實施例中，構築體編碼P3處之S059(SEQ ID NO：423)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且構築體編碼P4處之S047(SEQ ID NO：413)或S212(SEQ ID NO：505)之序列或促進信號傳導之其變體或片段。在一些實施例中，構築體編碼P3處之S058(SEQ ID NO：422)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且構築體編碼P4處之S211(SEQ ID NO：504)之序列或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，CLE之構築體編碼來自P3處之CSF3R的胞內域及來自P4處之CD79B的胞內域。如實例10中所展示，來自CD79B之胞內域展示，當包括在含有P3處之CSF3R的嵌合淋巴組織增殖性元件之P4處時，在庫3.1或庫4.1中之至少一者中在0.05之假發現率下顯著地增加增殖。在一些實施例中，構築體編碼P3處之S064(SEQ ID NO：426)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且構築體編碼P4處之S053(SEQ ID NO：419)之序列，或促進信號傳導之其 變體或片段。在說明性實施例中，CLE之構築體編碼來自P3處之IL1RL1的胞內域及來自P4處之GITR的胞內域。如實例10中所展示，來自GITR之胞內域展示，當包括在含有P3處之IL1RL1的嵌合淋巴組織增殖性元件之P4處時，在庫3.1或庫4.1中之至少一者中在0.1之假發現率下顯著地增加增殖。在一些實施例中，構築體編碼P3處之S102(SEQ ID NO：445)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且構築體編碼P4處之S216(SEQ ID NO：509)之序列或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，CLE之構築體編碼來自P3處之IL5RA的胞內域及來自P4處之δ Lck CD28的胞內域。如實例10中所展示，來自突變δ Lck CD28之胞內域展示，當包括在含有P3處之IL5RA的嵌合淋巴組織增殖性元件之P4處時，在庫3.1或庫4.1中之至少一者中在0.05之假發現率下顯著地增加增殖。在一些實施例中，構築體編碼P3處之S115(SEQ ID NO：453)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且構築體編碼P4處之S048(SEQ ID NO：414)之序列或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，CLE之構築體編碼來自P3處之IL11RA之的胞內域及來自P4處之FCGRA2的胞內域。如實例10中所展示，來自FCGRA2之胞內域展示，當包括在含有P3處之IL11RA的嵌合淋巴組織增殖性元件之P4處時，在庫3.1或庫4.1中之至少一者中在0.05之假發現率下顯著地增加增殖。在一些實施例中，構築體編碼P3處之S135(SEQ ID NO：461)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且構築體編碼P4處之S076(SEQ ID NO：431)之序列或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，CLE之構築體編碼來自P3處之LIFR的胞內域及來自P4處之GITR的胞內域。如實例10中所展示，來自GITR之胞內域展示，當包括在含有P3處之LIFR的嵌合淋巴 組織增殖性元件之P4處時，在庫3.1或庫4.1中之至少一者中在0.05之假發現率下顯著地增加增殖。在一些實施例中，構築體編碼P3處之S180(SEQ ID NO：489)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且構築體編碼P4處之S216(SEQ ID NO：509)之序列或促進信號傳導之其變體或片段。在說明性實施例中，CLE之構築體編碼來自P3處之MyD88的胞內域及來自P4處之CD3D的胞內域。如實例10中所展示，來自CD3D之胞內域展示，當包括在含有P3處之MyD88的嵌合淋巴組織增殖性元件之P4處時，在庫3.1或庫4.1中之至少一者中在0.1之假發現率下顯著地增加增殖。在一些實施例中，構築體編碼P3處之S194(SEQ ID NO：497)之序列或促進信號傳導之其變體或片段，且構築體編碼P4處之S037(SEQ ID NO：405)之序列或促進信號傳導之其變體或片段。
在說明性實施例中，CLE之構築體編碼來自以下對基因中之兩個基因的胞內域或其變體或片段：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSF2RA及TNFRSF8；CSF2RA及CD27；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL1RAP及CD79A；IL3RA及CD40；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL13RA2及TNFRSF14；IL18RAP及CD3G；IL27RA及FCGRA2；LEPR及CD3G；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD3G；MyD88及CD79B；以及MyD88及CD3D。在小於0.1之p下，編碼來自此等對基因之胞內域的部分在實例10中最有效(表3)。在一些實施例中，CLE之構築體編碼來自以下對基因中之兩個基因的胞內域或其變體或片段：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL27RA及FCGRA2；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40； MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD3G；以及MyD88及CD79B。在小於0.05之p下，編碼來自此等對基因之胞內域的部分在實例10中為最有效的對(表3)。在一些實施例中，CLE之構築體編碼來自以下對部分中之兩個部分的序列(如表7中所展示)或其變體或片段：S058及S211；S058及S049；S059及S212；S059及S047；S064及S053；S083及S214；S101及S052；S109及S050；S129及S053；S135及S076；S142及S214；S155及S039；S169及S076；S177及S039；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186及S039；S192及S053；S194及S037；以及S195及S053。在小於0.1之p下，此等對部分在實例10中為最有效之部分(表3)。在一些實施例中，CLE之構築體編碼來自以下對部分中之兩個部分的序列(如表7中所展示)或其變體或片段：S058及S211；S058及S049；S064及S053；S083及S214；S129及S053；S135及S076；S169及S076；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186及S039；以及S195及S053。在小於0.05之p下，此等對部分在實例10中為最有效之部分(表3)。
在經分離多肽中之任一者之值得注意的實施例或包含編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞(亦即，CLE)之細胞增殖的嵌合多肽之第一核酸序列及編碼包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域之嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列的本文提供之載體態樣及實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可由核糖體跳躍序列隔開。在一些實施例中，核糖體跳躍序列為F2A、E2A、P2A或T2A。
如本文中所揭示，淋巴增殖性元件(如在本文中與CLE 一起例示)在一些說明性實施例中可包括二聚基元，以有助於增強及/或調節其活性，例如以影響細胞中之信號，諸如影響蛋白質活性或基因表現之信號。此二聚基元通常為其部分或整個胞外域。在一些實施例中，二聚部分可連接至本文中之CLE之胞外域之識別及間隙序列。實際上，在一些實施例中，淋巴增殖性元件可包括來自一種蛋白質之整個淋巴增殖性元件，除胞外域包括二聚部分以外。
在包括二聚劑及聚核苷酸及編碼其之核酸之淋巴增殖性元件及CLE的一些實施例中，二聚基元可包括來自作為同源二聚物天然地存在之跨膜同源二聚多肽的胺基酸序列。舉例而言，二聚基元可為白胺酸拉鏈多肽，例如Jun多肽，如本文中實例12所例示。在一些實施例中，此等跨膜同源二聚多肽可包括早期活化抗原CD69(CD69)、轉移受體蛋白1(CD71)、B細胞分化抗原(CD72)、T細胞表面蛋白觸覺(CD96)、內皮因子(Cd105)、殺傷細胞凝集素樣受體子族B成員1(Cd161)、P-選凝素糖蛋白配位體1(Cd162)、穀胺醯基胺基肽酶(Cd249)、腫瘤壞死因子受體超家族成員16(CD271)、鈣黏蛋白-1(上皮鈣黏蛋白)(Cd324)或其活性片段。在一些實施例中，二聚基元可包括來自在配位體(在本文中亦稱為二聚物或二聚劑)結合後二聚之跨膜蛋白的胺基酸序列。在一些實施例中，二聚基元及二聚物可包括(其中二聚物在二聚物結合對後之圓括號裏)：FKBP及FKBP(雷帕黴素(rapamycin))；GyrB及GyrB(香豆黴素(coumermycin))；DHFR及DHFR(甲胺喋呤(methotrexate))；或DmrB及DmrB(AP20187)。如上文所提及，雷帕黴素可用作二聚物。替代地，可使用雷帕黴素衍生物或類似物(參見例如WO96/41865、WO 99/36553、WO 01/14387；及Ye等人(1999)Science 283：88-91)。舉例而言，類似物、同源物、衍生物 及結構上與雷帕黴素相關之其他化合物(「雷帕黴素類似物」)除此之外包括具有一或多個與雷帕黴素相關之以下修飾的雷帕黴素之變體：在C7、C42及/或C29處去甲基化、消除或替換甲氧基；在C13、C43及/或C28處消除、衍生或替換羥基；在C14、C24及/或C30處還原、消除或衍生酮；用5員脯胺醯基環替換6員甲基哌啶環；且對環己基環進行替代取代或用經取代環戊基環替換環己基環。額外資訊呈現於例如美國專利第5,525,610號、第5,310,903號、第5,362,718號及第5,527,907號中。描述了C-28羥基之選擇性差向異構(參見例如WO 01/14387)。適用作雷帕黴素之替代物的額外合成二聚劑包括描述於美國專利公開案第2012/0130076號中之彼等。如以上所提及，香豆黴素可用作二聚劑。替代地，可使用香豆黴素類似物(參見例如Farrar等人(1996)Nature 383：178-181；及美國專利第6,916,846號)。如以上所提及，在一些情況中，二聚劑為甲胺喋呤，例如無細胞毒性、同源雙功能性甲胺喋呤二聚物(參見例如美國專利第8,236,925號)。
在一些實施例中，當存在於真核細胞之質膜中時，包括二聚基元之淋巴增殖性元件(在一說明性實施例中，CLE)可在不存在二聚劑之情況下為活性的。舉例而言，包括含白胺酸拉鏈之二聚基元或包括來自跨膜同源二聚多肽之二聚基元的淋巴增殖性元件可在不存在二聚劑之情況下為活性的，該等跨膜同源二聚多肽包括CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突變體及/或其活性片段。在一些實施例中，當存在於真核細胞之質膜中時，包括二聚基元之淋巴增殖性元件可在二聚劑之存在下為活性的。舉例而言，包括來自FKBP、GyrB、DHFR或DmrB之二聚基元的淋巴增殖性元件可分別在個別二聚劑或其類似物(例 如，雷帕黴素、香豆黴素、甲胺喋呤及AP20187)之存在下為活性的。
在包括淋巴增殖性元件(例如，CLE)(其包括用於二聚包含二聚基元之多肽之二聚物)之方法實施例中，可使用能夠產生所需效果之便利手段向宿主(個體)投予二聚物。因此，可將二聚物併入至多種調配物種以供投予。更特定而言，可藉由與合適醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑組合將二聚物調配為醫藥組合物，且可調配為呈固體、半固體、液體或氣態形式之製劑，諸如錠劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、藥膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑及氣霧劑。
熟習之技術者將容易瞭解到，劑量水準可根據特定二聚物、症狀之嚴重程度及個體對副作用之敏感性而變化。可利用多種手段藉由熟習此項技術者來容易地確定給定化合物之較佳劑量。
使用適用於藥物遞送之任何可用方法及途徑向個體投予二聚物，包括活體內劑離體方法以及全身性及局部投予途徑。
在其中CLE之胞外域包含二聚基元之任何態樣或實施例中，二聚基元可選自由以下組成之群：含白胺酸拉鏈基元之多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324，以及其保留二聚能力之突變體及/或活性片段。在其中CLE之胞外域包含二聚基元之態樣或實施例中之任一者中，二聚基元可需要二聚劑，且二聚基元及相關二聚劑可選自由以下組成之群：FKBP及雷帕黴素或其類似物、GyrB及香豆黴素或其類似物、DHFR及甲胺喋呤或其類似物或DmrB及AP20187或其類似物，以及保留二聚能力之所述二聚蛋白之突變體及/或活性片段。
在其中CLE之胞外域包含二聚基元之任何態樣或實施例之說明性實施例中，胞外域可包含白胺酸拉鏈基元。在一些實施 例中，白胺酸拉鏈基元來自jun多肽，例如c-jun。在某些實施例中，c-jun多肽為ECD-11之c-jun多肽區。
在包括淋巴增殖性元件之本文所提供之態樣或實施例中之任一者中，淋巴增殖性元件可為包含膜靶向區、二聚(多聚)域、第一胞內域及視情況選用之第二胞內域及另外視情況選用之第三胞內域及視情況選用之第四胞內域的多肽，其中第一胞內域及視情況選用之第二胞內域、第三胞內域及第四胞內域來自具有表8至18中所識別之胞內域的任何基因，或選自表8至18中所識別之第一胞內域及第二胞內域中之任一者，且其中該內部二聚及/或多聚淋巴增殖性元件促進PBMC(且在說明性實施例中，B細胞、T細胞及/或NK細胞)之細胞增殖。此多肽可在本文中稱作內部二聚及/或多聚淋巴增殖性元件。在某些實施例中，可將連接子添加在域中之任一者之間。在某些實施例中，第一胞內域及第二胞內域為MyD88及CD40。在某些實施例中，第一胞內域及第二胞內域不為MyD88及CD40。在一些實施例中，胞內域為MPL或保留促進PBMC細胞增殖之能力的其胞內片段。在一些實施例中，胞內域不為MPL或保留促進PBMC細胞增殖之能力的其胞內片段。在一些實施例中，胞內域為IL2Rb，或保留促進PBMC細胞增殖之能力的其胞內片段。在一些實施例中，胞內域不為IL2Rb，或保留促進PBMC細胞增殖之能力的其胞內片段。在一些實施例中，胞內域為IL2Ra，或保留促進PBMC細胞增殖之能力的其胞內片段。在一些實施例中，胞內域不為IL2Ra，或保留促進PBMC細胞增殖之能力的其胞內片段。在一些實施例中，胞內域為MyD88，或保持促進PBMC細胞增殖之能力的其胞內片段。在一些實施例中，胞內域不為MyD88或保留促進PBMC細胞增殖之能力的其胞內片段。
說明性實施例中之此內部二聚及/或多聚多肽淋巴增殖性元件之二聚域可位於膜靶向區與第一胞內域之間或在胞內域之後(參見例如Spencer等人J Clin Invest.2011年4月；121(4)：1524-34)或位於胞內域之間。在某些實施例中，二聚(或多聚)域包含多聚或二聚配位體結合位點，諸如FKBP區，例如FKBP12。在一些實施例中，多肽可包含胞外域，諸如本文提供之胞外域中之任一者，例如在實例11之表8至12中或在實例12之表13至18中，其具有或不具有識別域及間隙域。在某些實施例中，膜靶向區選自由豆蔻醯化區、棕櫚醯化區、異戊二烯化區及受體之跨膜序列組成之群。在某些實施例中，膜靶向區為豆蔻醯化區。內部二聚及/或多聚淋巴增殖性元件通常經由膜靶向區連接至質膜，例如連接至具有N端肉豆蔻酸鹽之膜。在說明性實施例中，FKBP區結合FK506。
一個實施例中之內部二聚及/或多聚淋巴增殖性元件為使用脂質可滲透二聚免疫抑制劑藥物FK506之類似物的系統之整體部分，其損失其正常生物活性，同時獲得交聯以基因方式融合至FK506結合蛋白FKBP12之分子的能力。藉由將一或多個FKBP及豆蔻醯化序列融合至靶受體之胞質信號傳導域，吾人可以二聚物藥物依賴型但配位體及胞外域獨立型方式刺激信號傳導。此為系統提供時間控制、使用單體藥物類似物之可逆性，且增強特異性。第三代AP20187/AP1903二聚物藥物對於其結合域FKBP12之高親和力允許活體內特異性活化重組受體，且無需經由內源性FKBP12誘導非特異性副作用。亦可使用與二聚物藥物結合之具有胺基酸取代及缺失的FKBP12變體(諸如FKBP12V36)。另外，合成配位體對蛋白酶分解具有抗性，使得其在活體內活化受體時比大多數所遞送蛋白劑更有效。
假型化元件
本文所提供之方法及組合物中之多者包括假型化元件。具有異源包膜糖蛋白之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒的假型化通常改變病毒之向性且有助於宿主細胞之轉導。如本文所使用之假型化元件可包括：「結合多肽」，其包括識別且結合靶標宿主細胞之一或多種多肽(通常糖蛋白)；及一或多種「促融合多肽」，其介導反轉錄病毒與靶標宿主細胞膜融合，從而使反轉錄病毒基因組進入靶標宿主細胞。在本文所提供之一些實施例中，假型化元件提供為多肽/蛋白質，或提供為編碼多肽/蛋白質的核酸序列。
在一些實施例中，假型化元件為貓內源性病毒(RD114)包膜蛋白質、雙嗜性包膜蛋白質、嗜親性包膜蛋白質、疱疹性口腔病毒包膜蛋白質(VSV-G)、狒狒反轉錄包膜糖蛋白(BaEV)、鼠白血病病毒包膜蛋白(MuLV)及/或副黏液麻疹包膜蛋白質H及F。
在一些實施例中，假型化元件可為野生型BaEV。不受理論限制，BaEV含有經展示抑制轉導之R肽。在一些實施例中，BaEV可含有R肽之缺失。在一些實施例中，在核苷酸編碼胺基酸序列HA(本文中稱為BaEV△R(HA))之後，BaEV可含有抑制性R肽之缺失。在一些實施例中，在核苷酸編碼胺基酸序列HAM(本文中稱為BaEV△R(HAM))之後，BaEV可含有抑制性R肽之缺失。
在一些實施例中，假型化元件包括結合多肽及來源於不同蛋白質的融合多肽。舉例而言，本文所揭示之方法及組合物中的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可藉由麻疹病毒(MV)之融合(F)多肽及凝血素(H)多肽來假型化，作為非限制性實例，MV之臨床野生型菌株，及包括艾德蒙斯頓菌株(Edmonston strain；MV-Edm)或其片段 之疫苗菌株。不受理論限制，認為凝血素(H)及融合(F)多肽兩者均可在進入宿主細胞中發揮作用，其中該H蛋白質在靶標細胞上將MV與受體CD46、SLAM及Nectin-4結合，且F介導反轉錄病毒及宿主細胞膜之融合。在一說明性實施例中，尤其在靶標細胞為T細胞及/或NK細胞時，結合多肽為麻疹病毒H多肽，且融合多肽為麻疹病毒F多肽。
在一些研究中，經截斷F及H多肽假型化之慢病毒顆粒在效價及轉導效率上顯著增大(Funke等人.2008.Molecular Therapy.16(8)：1427-1436)、(Frecha等人.2008.Blood.112(13)：4843-4852)。在F胞質尾區被30個殘基(亦稱為MV(Ed)-F△30(SEQ ID NO：105))截斷時獲得最高效價。針對H變體，在缺失18個或19個殘基(MV(Ed)-H△18(SEQ ID NO：106)或(MV(Ed)-H△19))時出現最佳截斷，但具有24個殘基之截斷的變體在缺失殘基經丙胺酸置換下及未置換下(MV(Ed)-H△24(SEQ ID NO：235)及MV(Ed)-H△24+A)亦產生最佳效價。
在一些實施例中，包括針對轉導T細胞及/或NK細胞之彼等，本文揭示之方法及組合物中的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒經麻疹病毒融合(F)多肽及凝血素(H)多肽之突變或變異版本(在說明性實例中，麻疹病毒F及H多肽之胞質域缺失變體)假型化。在一些實施例中，經突變F及H多肽為「經截斷H」或「經截斷F」多肽，其之胞質部分已經截斷，亦即，胺基酸殘基(或編碼蛋白質之對應核酸分子之編碼核酸)已經缺失。「H△Y」及「F△X」分別表示此類經截斷H及F多肽，其中「Y」係指已自胺基端缺失的1個至34個殘基，且「X」係指已自胞質域之羧基端缺失的1個至35個殘基。在另一實施例中，「經截斷F多肽」為F△24或F△30及/或「經截斷H蛋白質」選自 由以下組成之群：H△14、H△15、H△16、H△17、H△18、H△19、H△20、H△21+A、H△24及H△24+4A，更佳地H△18或H△24。在一說明性實施例中，經截斷F多肽為MV(Ed)-F△30，且經截斷H多肽為MV(Ed)-H△18。
在一些實施例中，融合多肽包括表現為一種多肽之多種元件。在一些實施例中，結合多肽及融合多肽自相同的轉錄物但自單獨的核糖體結合位點轉譯；在其他實施例中，結合多肽及融合多肽由裂解肽位點(其不受理論限制，在轉譯之後裂解，如文獻中常見)或核糖體跳躍序列隔開。在一些實施例中，結合多肽及融合多肽自分離的核糖體結合位點之轉譯產生比結合多肽更高量之融合多肽。在一些實施例中，融合多肽與結合多肽之比率為至少2：1、至少3：1、至少4：1、至少5：1、至少6：1、至少7：1或至少8：1。在一些實施例中，融合多肽與結合多肽之比率在1.5：1、2：1或3：1之範圍之低端與3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1或10：1之範圍之高端之間。
活化元件
本發明之方法及組合物態樣中之多者包括活化元件(在本文中亦稱作T細胞活化元件)，或編碼活化元件之核酸。與慢病毒(LV)轉導進入休眠T細胞中相關之限制歸因於一系列進入前及進入後障壁以及細胞限制因子(Strebel等人2009.BMC Medicine 7：48)。一個限制為包膜假型化LV顆粒不能識別潛在受體並介導與細胞膜融合。然而，在某些條件下，休眠T細胞經基於HIV-1之慢病毒載體之轉導最可能在T細胞受體(TCR)CD3複合物及CD28共刺激後(Korin及Zack.1998.Journal of Virology.72：3161-8，Maurice等人.2002.Blood 99：2342-50)，以及經由暴露於細胞介素(Cavalieri等人2003)。
免疫系統之細胞(諸如T淋巴球)經由受體或受體複合物識別特異性抗原並與其相互作用，在識別或與此類抗原相互作用時，使得細胞在體內活化並擴展。此受體之實例為抗原特異性T淋巴球受體複合物(TCR/CD3)。T細胞受體(TCR)在T淋巴球之表面上表現。一種組分(CD3)負責在TCR由配位體佔據之後的胞內信號傳導。針對抗原CD3複合物(TCR/CD3)之T淋巴球受體識別藉由主要組織相容性複合物(MHC)之蛋白質呈遞至其的抗原性肽。MHC及肽之複合物在抗原呈現細胞及其他T淋巴球標靶之表面上表現。TCR/CD3複合物之刺激導致T淋巴球之活化及隨後的抗原特異性免疫反應。TCR/CD3複合物在免疫系統之效應功能及調節上發揮重要作用。因此，本文提供之活化元件藉由與T細胞受體相關複合物之一或多種組分結合，例如藉由與CD3結合來活化T細胞。在一些情況中，活化元件可單獨活化。在其他情況中，活化需要經由TCR受體複合物活化，以便進一步活化細胞。
T淋巴球亦需要第二、共刺激信號以於活體內變得完全活性。在無此信號下，T淋巴球對結合至TCR之抗原無反應，或變得無變應性。
然而，T細胞之轉導及擴展不需要第二共刺激信號。此共刺激信號例如由CD28、在產生抗原細胞上與CD80及CD86相互作用的T淋巴球蛋白質提供。如本文所使用，CD80之功能性胞外片段保留其與CD28相互作用的能力。OX40、4-1BB及ICOS(誘導性共刺激劑)(其他T淋巴球蛋白質)在結合至其對應配位體OX40L、4-1BBL及ICOSLG時提供共刺激信號。
T細胞受體(TCR)CD3複合物之活化及經CD28之共刺 激可藉由離體暴露於用抗CD3及抗CD28塗佈之固體表面(例如，珠粒)上來發生。在本文所揭示之方法及組合物中的一些實施例中，休眠T細胞藉由暴露於用抗CD3及抗CD28離體塗佈之固體表面上來活化。在其他實施例中，休眠T細胞或NK細胞(說明性實施例中，T細胞)藉由暴露於可溶性抗CD3抗體(例如，呈50ng/ml至150ng/ml，或75ng/ml至125ng/ml，或100ng/ml)來活化。在此實施例中，其可為用於以基因方式修飾或轉導(在說明性實施例中無需預先活化)之方法之部分，可進行此活化及/或接觸例如8小時或更少、4小時或更少，或2小時與8小時之間、2小時與4小時之間，或2小時與3小時之間。
在本文所提供之方法及組合物之某些說明性實施例中，能夠結合CD3及/或CD28之多肽在本文所揭示之方法及組合物中的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上呈現為「活化元件」，其亦為本發明之態樣。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上的活化元件可包括能夠結合OX40、4-1BB或ICOS之一或多個多肽。在一些實施例中，活化元件可為T細胞表面蛋白促效劑。活化元件可包括充當T細胞表面蛋白之配位體的共刺激多肽。在一些實施例中，共刺激多肽可包括OX40L、4-1BBL或ICOSLG中之一或多者。在一些實施例中，此等活化元件中之一個或典型地多個複本可在非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上表現為與假型化元件隔開且不同的多肽。在一些實施例中，活化元件可在非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒上表現為融合多肽。在說明性實施例中，融合多肽包括一或多個活化元件及一或多個假型化元件。在其他說明性實施例，融合多肽包括抗CD3及病毒包膜蛋白，例如融合至MuLV包膜蛋白之胺基末端的OKT-3scFv，如於Maurice等人(2002)中所展示。因為 其活化休眠T細胞之能力，所以結合CD3、CD28、OX40、4-1BB或ICOS之多肽被稱為活化元件。在某些實施例中，編碼此活化元件之核酸發現於在其表面上含有活化元件之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒的基因組中。在其他實施例中，編碼活化元件之核酸未發現於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒基因組中。在又其他實施例中，編碼活化元件之核酸發現於病毒封裝細胞之基因組中。
在一些實施例中，活化元件為能夠結合CD3之多肽。在一些實施例中，能夠結合CD3之多肽為抗CD3抗體，或其保留結合至CD3之能力的片段。在說明性實施例中，抗CD3抗體或其片段為單鏈抗CD3抗體，諸如但不限於抗CD3scFv。在另一說明性實施例中，能夠結合至CD3之多肽為抗CD3scFvFc。
大量抗人類CD3單株抗體及其抗體片段為可用的，且可用於本發明，包括(但不限於)UCHT1、OKT-3、HIT3A、TRX4、X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW24B6、OKT3D、M-T301、SMC2及F101.01。
在一些實施例中，活化元件為能夠結合至CD28之多肽。在一些實施例中，能夠結合至CD28之多肽為抗CD28抗體，或其保留結合至CD28之能力的片段。在其他實施例中，能夠結合至CD28之多肽為CD80、CD86，或其能夠結合CD28且誘導CD28介導的Akt之活化的片段，諸如CD80之外部片段。在本文中之一些態樣中，CD80之外部片段意謂通常存在於保留結合至CD28之能力的CD80之標準細胞位置中之細胞外部的片段。在說明性實施例中，抗CD28抗體或 其片段為單鏈抗CD28抗體，諸如但不限於抗CD28 scFv。在另一說明性實施例中，能夠結合至CD28之多肽為CD80，或CD80之片段，諸如CD80之外部片段。
抗CD28抗體在此項技術中為已知的且可包括作為非限制性實例的單株抗體9.3、IgG2a抗體(Dr.Jeffery Ledbetter,Bristol Myers Squibb Corporation,Seattle,Wash.)、單株抗體KOLT-2(IgG1抗體)、15E8(IgG1抗體)、248.23.2(IgM抗體)及EX5.3D10(IgG2a抗體)。
在一說明性實施例中，活化元件包括兩種多肽，能夠結合至CD3之多肽及能夠結合至CD28之多肽。
在某些實施例中，能夠結合至CD3或CD28之多肽為抗體(單鏈單株抗體)或抗體片段(例如單鏈抗體片段)。因此，抗體片段可為例如單鏈片段可變區(scFv)、抗體之抗體結合(Fab)片段、單鏈抗原結合片段(scFab)、無半胱胺酸之單鏈抗原結合片段(scFab△C)、片段可變區(Fv)、對抗原之相鄰抗原決定基具有特異性的結構(CRAb)或單域抗體(VH或VL)。
在本文所揭示之實施例中之任一者中，活化元件或編碼其之核酸可包括二聚或更高級多聚基元。二聚或多聚基元在此項技術中已知且熟習之技術者將理解如何將其併入至多肽中以供有效二聚或多聚。舉例而言，在一些實施例中，包括二聚基元之活化元件可為能夠與CD3及/或CD28結合之一或多個多肽。在一些實施例中，能夠與CD3結合之多肽為抗CD3抗體或保留與CD3結合之能力的其片段。在說明性實施例中，抗CD3抗體或其片段為單鏈抗CD3抗體，諸如(但不限於)抗CD3 scFv。在另一說明性實施例中，能夠與CD3結合之多肽為抗CD3scFvFc，其在一些實施例中被視為具有二聚基元但不 具有任何額外二聚基元之抗CD3，此係由於已知抗CD3scFvFc構築體能夠在不需要單獨二聚基元之情況下二聚。
在一些實施例中，二聚或多聚基元或編碼其之核酸序列可為來自作為同源二聚物或多聚物天然地存在之跨膜多肽的胺基酸序列。在一些實施例中，二聚或多聚基元或編碼其之核酸序列可為來自天然蛋白質或經工程化蛋白質之片段的胺基酸序列。在一個實施例中，同源二聚多肽為含白胺酸拉鏈基元之多肽(白胺酸拉鏈多肽)。舉例而言，白胺酸拉鏈來源於c-JUN，其之非限制性實例經揭示與本文中之嵌合淋巴增殖性元件(CLE)有關。
在一些實施例中，此等跨膜同源二聚多肽可包括早期活化抗原CD69(CD69)、轉移受體蛋白1(CD71)、B細胞分化抗原(CD72)、T細胞表面蛋白觸覺(CD96)、內皮因子(Cd105)、殺傷細胞凝集素樣受體子族B成員1(Cd161)、P-選凝素糖蛋白配位體1(Cd162)、穀胺醯基胺基肽酶(Cd249)、腫瘤壞死因子受體超家族成員16(CD271)、鈣黏蛋白-1(上皮鈣黏蛋白)(Cd324)或其活性片段。在一些實施例中，二聚基元及編碼其之核酸可包括來自在配位體(在本文中亦稱為二聚物或二聚劑)結合後二聚之跨膜蛋白的胺基酸序列。在一些實施例中，二聚基元及二聚物可包括(其中二聚物在二聚物結合對後之圓括號裏)：FKBP及FKBP(雷帕黴素)；GyrB及GyrB(香豆黴素)；DHFR及DHFR(甲胺喋呤)；或DmrB及DmrB(AP20187)。如上文所提及，雷帕黴素可用作二聚物。替代地，可使用雷帕黴素衍生物或類似物(參見例如WO96/41865、WO 99/36553、WO 01/14387；及Ye等人(1999)Science 283：88-91)。舉例而言，類似物、同源物、衍生物及結構上與雷帕黴素相關之其他化合物(「雷帕黴素類似物」)除此之 外包括具有一或多個與雷帕黴素相關之以下修飾的雷帕黴素之變體：在C7、C42及/或C29處去甲基化、消除或替換甲氧基；在C13、C43及/或C28處消除、衍生或替換羥基；在C14、C24及/或C30處還原、消除或衍生酮；用5員脯胺醯基環替換6員甲基哌啶環；且對環己基環進行替代取代或用經取代環戊基環替換環己基環。額外資訊呈現於例如美國專利第5,525,610號、第5,310,903號、第5,362,718號及第5,527,907號中。描述了C-28羥基之選擇性差向異構(參見例如WO 01/14387)。適用作雷帕黴素之替代物的額外合成二聚劑包括描述於美國專利公開案第2012/0130076號中之彼等。如以上所提及，香豆黴素可用作二聚劑。替代地，可使用香豆黴素類似物(參見例如Farrar等人(1996)Nature 383：178-181；及美國專利第6,916,846號)。如以上所提及，在一些情況中，二聚劑為甲胺喋呤，例如無細胞毒性、同源雙功能性甲胺喋呤二聚物(參見例如美國專利第8,236,925號)。
在一些實施例中，當存在於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上時，包括二聚基元之活化元件可在不存在二聚劑之情況下為活性的。舉例而言，包括來自跨膜同源二聚多肽之二聚基元的活化元件可在不存在二聚劑之情況下為活性的，該等跨膜同源二聚多肽包括CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突變體及/或其活性片段。在一些實施例中，活化元件可為抗CD3單鏈片段且包括選自由以下組成之群的二聚基元：CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突變體及/或其活性片段。
在一些實施例中，當存在於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上時，包括二聚基元之活化元件可在二聚劑之存在下 為活性的。舉例而言，包括來自FKBP、GyrB、DHFR或DmrB之二聚基元的活化元件可分別在個別二聚劑或其類似物(例如，雷帕黴素、香豆黴素、甲胺喋呤及AP20187)之存在下為活性的。在一些實施例中，活化元件可為針對抗CD3或抗CD28之單鏈抗體片段或結合CD3或CD28之另一分子，且二聚基元及二聚劑可選自由以下組成之群：FKBP及雷帕黴素或其類似物、GyrB及香豆黴素或其類似物、DHFR及甲胺蝶呤或其類似物，或DmrB及AP20187或其類似物。
在一些實施例中，活化元件與異源信號序列及/或異源膜黏附序列融合，其中之兩者幫助將活化元件引導至膜上。異源信號序列將活化元件靶向內質網，其中異源膜黏附序列共價連接至一種或多種脂肪酸(亦稱為轉譯後脂質修飾)使得與異源膜黏附序列融合之活化元件錨定在質膜之脂質筏中。在一些實施例中，轉譯後脂質修飾可經由豆蔻醯化、棕櫚醯化或GPI錨定來發生。豆蔻醯化為對應於14-碳飽和脂肪酸(肉豆蔻酸)與真核或病毒蛋白質之N端甘胺酸的共價連接的轉譯後蛋白質修飾。棕櫚醯化為對應於C16醯基鏈與半胱胺酸，且較少地與蛋白質之絲胺酸及蘇胺酸殘基之共價連接的轉譯後蛋白質修飾。GPI錨定係指在轉譯後修飾期間糖基磷脂醯肌醇或GPI與蛋白質C端的連接。
在一些實施例中，異源膜連接序列為GPI錨定連接序列。異源GPI錨定連接序列可來源於任何已知的經GPI錨定之蛋白質(評論於Ferguson MAJ,Kinoshita T,Hart GW.Glycosylphosphatidylinositol Anchors.In：Varki A,Cummings RD,Esko JD等人編.Essentials of Glycobiology.第2版.Cold Spring Harbor(NY)：Cold Spring Harbor Laboratory Press；2009.第11章)。在一些實施例 中，異源GPI錨定連接序列為來自CD14、CD16、CD48、CD55(DAF)、CD59、CD80及CD87之GPI錨定連接序列。在一些實施例中，異源GPI錨定連接序列來源於CD16。在說明性實施例中，異源GPI錨定連接序列來源於Fc受體FcγRIIIb(CD16b)或衰變加速因子(DAF)，另外稱為補體衰變加速因子或CD55。
在一些實施例中，活化元件中之一者或兩者包括幫助將活化元件引導至細胞膜之表現的異源信號序列。可使用在封裝細胞株中具有活性的任何信號序列。在一些實施例中，信號序列為DAF信號序列。在說明性實施例中，活化元件與在其N端之DAF循環序列及在其C端之GPI錨定連接序列融合。
在一說明性實施例中，活化元件包括與來源於CD14之GPI錨定連接序列融合之抗-CD3 scFvFc，及與來源於CD16b之GPI錨定連接序列融合之CD80；且兩者表現於本文所提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上。在一些實施例中，抗CD3 scFvFc與其N端之DAF信號序列及其C端之來源於CD14的GPI錨定連接序列融合，且CD80與其N端之DAF信號序列及其C端之來源於CD16b的GPI錨定連接序列融合；且兩者皆表現於本文所提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上。在一些實施例中，DAF信號序列包括DAF蛋白質之胺基酸殘基1-30。
膜結合之細胞介素
本文所提供之方法及組合物態樣中的一些實施例包括膜結合細胞介素，或編碼膜結合細胞介素之聚核苷酸。細胞介素通常但不總為分泌性蛋白質。天然分泌之細胞介素可經工程化為膜結合的融合蛋白質。膜結合細胞介素融合多肽包括在本文所揭示之方法及 組合物中，且亦為本發明之態樣。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒具有在其表面上之能夠結合T細胞及/或NK細胞且促進其增殖及/存活的膜結合細胞介素融合多肽。通常地，將膜結合多肽併入至非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜中，且在細胞藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導時，反轉錄病毒及宿主細胞膜之融合產生結合至經轉導細胞之膜的多肽。
在一些實施例中，細胞介素融合多肽包括IL-2、IL-7、IL-15或其活化片段。膜結合細胞介素融合多肽通常為與異源信號序列及/或異源膜連接序列融合之細胞介素。在一些實施例中，異源膜連接序列為GPI錨定連接序列。異源GPI錨定連接序列可來源於任何已知的經GPI錨定之蛋白質(評論於Ferguson MAJ,Kinoshita T,Hart GW.Glycosylphosphatidylinositol Anchors.In：Varki A,Cummings RD,Esko JD等人編.Essentials of Glycobiology.第2版.Cold Spring Harbor(NY)：Cold Spring Harbor Laboratory Press；2009.第11章)。在一些實施例中，異源GPI錨定連接序列為來自CD14、CD16、CD48、CD55(DAF)、CD59、CD80及CD87之GPI錨定連接序列。在一些實施例中，異源GPI錨定連接序列來源於CD16。在一些實施例中，異源GPI錨定連接序列來源於Fc受體FcγRIIIb(CD16b)。在一些實施例中，GPI錨定為DAF之GPI錨定。
在說明性實施例中，膜結合細胞介素為與DAF融合之細胞介素的融合多肽。已知DAF積聚在併入至自封裝細胞萌芽之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜中的脂質筏中。因此，不受理論限制，認為DAF融合蛋白質較佳靶向封裝細胞之膜之部分，該封裝細胞將變成重組反轉錄病毒膜之部分。
在非限制說明性實施例中，細胞介素融合多肽為IL-7，或其與DAF融合之活性片段。在一特定非限制說明性實施例中，融合細胞介素多肽依次包括：DAF信號序列(DAF之殘基1-31)、無其信號序列之IL-7，及DAF之殘基36-525。
製造重組反轉錄病毒顆粒之封裝細胞株/方法
本發明提供產生非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之哺乳動物封裝細胞及封裝細胞株。產生非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之該等細胞株在本文中亦稱作封裝細胞株。此方法之一非限制性實例提供於本文之實例1中。封裝細胞株之細胞可為黏著細胞或懸浮細胞。在說明性實施例中，封裝細胞株可為懸浮細胞株，亦即在生長期間不黏著至表面之細胞株。該等細胞可在化學上定義之介質及/或無血清介質中生長。在一些實施例中，封裝細胞株可為來源於黏著細胞株之懸浮細胞株，例如HEK293可在根據此項技術中已知之方法產生適應懸浮之HEK293細胞株之條件下生長。封裝細胞株通常在化學上定義之介質中生長。在一些實施例中，封裝細胞株介質可包括血清。在一些實施例中，封裝細胞株介質可包括血清替代物，如此項技術中已知。在說明性實施例中，封裝細胞株介質可為無血清介質。此介質可為按照美國食品及藥物管理局(US Food and Drug Administration；FDA)之現行藥品優良製造實踐(Current Good Manufacturing Practice；CGMP)條例製造之化學上定義之無血清調配物。封裝細胞株介質可為無異源的及完整的。在一些實施例中，封裝細胞株介質由管理機構清除以用於離體細胞處理，諸如FDA 510(k)清除裝置。在本文中(其中陳述介質包括基底介質與包括介質補充物之目錄編號諸如A1048501 or A1048503之介質補充物的組合物)應理 解，所述組合物意欲意謂介質與所添加補充物之組合物。通常，製造介質及補充物提供關於所添加補充物之體積的說明書。
因此，在一個態樣中，本文提供一種製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法，其包括：A.在含懸浮液之無血清介質中培養封裝細胞，其中該封裝細胞包含編碼非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之可封裝RNA基因組、REV蛋白質、gag多肽、pol多肽及假型化元件的核酸序列；及B.自無血清介質採集非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。在另一態樣中，本文提供一種用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導淋巴球的方法，其包含：A.在含懸浮液之無血清介質中培養封裝細胞，其中該封裝細胞包含編碼非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之可封裝RNA基因組、REV蛋白質、gag多肽、pol多肽及假型化元件的核酸序列；B.自無血清介質採集非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒；及C.使淋巴球與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中執行該接觸少於24小時、20小時、18小時、12小時、8小時、4小時或2小時(或在範圍之低端為1小時、2小時、3小時或4小時與範圍之高端為4小時、6小時、8小時、12小時、18小時、20小時或24小時之間)，由此轉導淋巴球。
在另一個態樣中，本文提供反轉錄病毒封裝系統，其包括：哺乳動物細胞，其包括：a)第一反式活化子，其由組成性啟動子表現且能夠結合第一配位體及第一可誘導啟動子以在存在與不存在第一配位體的情況下影響可操作地連接至其之核酸序列的表現；b)第二反式活化子，其能夠結合第二配位體及第二可誘導啟動子，且在存在與不存在第二配位體的情況下影響可操作地連接至其之核酸序列的表現；及c)反轉錄病毒顆粒之可封裝RNA基因組，其中該第一反 式活化子調節該第二反式活化子之表現，且其中該第二反式活化子調節包含於病毒封裝中之反轉錄病毒多肽之表現，該反轉錄病毒多肽為諸如gag多肽、pol多肽及/或假型化元件及視情況可選之將併入非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中或併入非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒上且被認為對封裝細胞株具有毒性的其他多肽，例如HEK-293。在某些態樣中，第二反式活化子自身對於封裝細胞株具有細胞毒性。假型化元件通常能夠結合至靶細胞之細胞膜且有助於其融合，如本文所詳細論述。因此，不受理論限制，系統提供積聚無法抑制或無法實質上抑制或被認為無法抑制哺乳動物細胞之增殖或存活的某些多肽/蛋白質(例如非毒性蛋白質)之能力，同時培養哺乳動物細胞種群持續數天或無限期，且控制期望用於反轉錄病毒產物但對哺乳動物細胞之存活及/或增殖具有抑制性或可具有抑制性或已經報道具有抑制性之多肽(例如毒性多肽)的誘導，直至接近將產生並採集非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒時的較晚時間。可封裝RNA基因組通常由可操作地連接至啟動子(出於方便起見有時在本文中稱為第三啟動子)之聚核苷酸編碼，其中該第三啟動子通常可由第一反式活化子抑或第二反式活化子誘導。在說明性實施例中，可封裝RNA基因組由可操作地連接至第三啟動子之聚核苷酸編碼，其中該第三啟動子由第二反式活化子誘導。因此，可封裝RNA基因組可在接近將採集非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒時的較晚時間點處產生。
熟習此項技術者將理解，許多不同的反式活化子、配位體，及可誘導啟動子可用於反轉錄病毒封裝系統中。此類可誘導啟動子可分離且來源於許多生物，例如真核生物及原核生物。對用於第二生物中之來源於第一生物之可誘導啟動子(例如第一原核生物及第 二真核生物、第一真核生物及第二原核生物，等)的修飾為此項技術中已知的。此類可誘導啟動子，及基於此類可誘導啟動子但亦包括其他控制蛋白質之系統包括(但不限於)醇調節之啟動子(例如醇脫氫酶I(alcA)基因啟動子、對醇反式活化子蛋白質具有反應性之啟動子(AlcR)等)、四環素調節之啟動子(例如包括TetActivators、TetON、TetOFF等之啟動子系統)、類固醇調節之啟動子(例如大鼠糖皮質激素受體啟動子系統、人類雌性激素受體啟動子系統、類視黃素啟動子系統、甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素啟動子系統、米非司酮啟動子系統等)、金屬調節之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子系統等)、相關病原調節之啟動子(例如水楊酸調節之啟動子、乙烯調節之啟動子、苯并噻二唑調節之啟動子等)、溫度調節之啟動子(例如熱休克可誘導啟動子(例如HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等))、光調節之啟動子、合成可誘導啟動子，及類似者。在一些實施例中，可使用米非司酮調節之系統。在一些實施例中，可使用具有自動調節反饋環路之米非司酮可誘導系統。在一些實施例中，GAL4調節融合蛋白質由亦含有轉座子端重複位點及lox位點及FRT位點之一個構築體表現。在一些實施例中，GAL4調節融合蛋白質控制反向tet反式活化子(rtTA)及BiTRE之表現。在一些實施例中，具有lox位點及FRT位點之另一構築體含有GAL4上游活化序列(UAS)及驅動如mCherry之報道子的E1b TATA盒啟動子。在一些實施例中，GAL4調節融合蛋白在控制GAL4調節融合蛋白之表現的啟動子及控制靶聚核苷酸之表現的啟動子兩者上結合GAL4上游活化序列(UAS)。在一些實施方案中，米非司酮、多西環素及嘌呤黴素將用於封裝細胞株之誘導及選擇。
在一些實施例中，反式活化子中之任一者或兩者可以 分成兩個或更多個多肽。在一些實施例中，該兩個或更多個多肽可包括DNA結合域及能夠刺激單獨多肽上之轉錄的活化域。此「活化域」不與「活化元件」混淆，諸如結合CD3之多肽，其能夠活化T細胞及/或NK細胞，且在與此T細胞及/或NK細胞接觸時通常將其活化，如本文所詳細論述。分離之多肽可進一步包括具有能夠藉由添加配位體而二聚之多肽的融合物。在一些實施例中，活化域可為p65活化域或其功能片段。在本文之封裝系統之說明性實施例中，DNA結合域可為來自ZFHD1之DNA結合域或其功能片段。在一些實施例中，一個多肽可為具有FKBP或其功能突變體及/或其片段或多個FKBP之融合物，且另一多肽可為具有mTOR之FRB域或其功能突變體及/或其片段之融合物，且配位體可為雷帕黴素或功能性雷帕類似物。在一些實施例中，FRB含有突變體K2095P、T2098L及/或W2101F。在一些實施例中，分離的多肽可為FKBP或其功能片段，及CalcineurinA或其功能片段，且二聚劑可為FK506。在一些實施例中，分離的多肽可為FKBP或其功能片段，及CyP-Fas或其功能片段，且二聚劑可為FKCsA。在一些實施例中，分離的多肽可為GAI或其功能片段，及GID1或其功能片段，且二聚劑可為赤黴素。在一些實施例中，分離的多肽可為Snap-tag及HaloTag或其功能片段且二聚劑可為HaXS。在一些實施例中，分離的多肽可包括相同的多肽。舉例而言，DNA結合域及活化結構域可表現為具有FKBP或GyrB之融合蛋白，且二聚劑可分別為FK1012或香豆黴素。在一些實施例中，可誘導啟動子可為DNA結合域通常結合之DNA序列。在一些實施例中，可誘導啟動子可不同於DNA結合域通常結合之DNA序列。在一些實施例中，反式活化子可為rtTA，配位體可為四環素或多西環素，且可誘導啟動子可為TRE。在說明性實施例 中，第一反式活化子為融合至FRB之p65活化域及融合至三個FKBP多肽之ZFHD1 DNA結合域，且第一配位體為雷帕黴素。在其他說明性實施例中，第二反式活化子可為rtTA，第二配位體可為四環素或多西環素，且可誘導啟動子可為TRE。
在一些實施例中，第一反式活化子可調節元件之表現以控制含有共有序列之轉錄物的核輸出，諸如HIV Rev，且該共有序列可為Rev反應元件。在說明性實施例中，靶細胞為T細胞。
在一些實施例中，假型化元件為反轉錄病毒包膜多肽。假型化元件通常包括用於將靶細胞與病毒膜結合並促進靶細胞與病毒膜之膜融合的結合多肽及融合多肽，如本文更詳細地論述。在一些實施例中，假型化元件為貓內源性病毒(RD114)包膜蛋白質、腫瘤反轉錄病毒雙嗜性包膜蛋白質、腫瘤反轉錄嗜親性包膜蛋白質及/或水泡性口炎病毒包膜蛋白質(VSV-G)。在說明性實施例中，假型化元件包括結合多肽及衍生自不同蛋白質之融合多肽，如本文進一步詳細論述。舉例而言，在說明性實施例中，尤其在靶細胞為T細胞及/或NK細胞時，結合多肽為麻疹病毒之凝血素(H)多肽(例如麻疹病毒之艾德蒙斯頓菌株(Edmonston strain))或其細胞質域缺失變體，且其他融合多肽為麻疹病毒之融合(F)多肽(例如麻疹病毒之艾德蒙斯頓菌株)或其細胞質域缺失變體。在一些實施例中，融合多肽可包括表現為一個多肽之多個元件。在一些實施例中，結合多肽及融合多肽可轉譯自同一轉錄物，但轉譯自不同核糖體結合位點，或在轉譯後使用肽裂解信號或核糖體跳過序列來裂解多肽，如本文其他處所揭示，以產生結合多肽及融合多肽。在一些實施例中，當結合多肽為麻疹病毒H多肽或其細胞質域缺失，且融合多肽為麻疹病毒F多肽或其細胞質域缺失時，F 多肽及H多肽自分離的核糖體結合位點之轉譯產生比H多肽更高量之F多肽。在一些實施例中，F多肽(或其細胞質域缺失)與H多肽(或其細胞質域缺失)之比率為至少2：1、至少3：1、至少4：1、至少5：1、至少6：1、至少7：1，或至少8：1。
在一些實施例中，第一反式活化子可調節能夠結合並活化靶細胞(諸如T細胞或NK細胞)之活化元件的表現。可表現本文所揭示之任何活化元件。舉例而言，在此等實施例中，活化元件可包括：a.)能夠結合並活化CD3之膜結合多肽；及/或b.)能夠結合並活化CD28之膜結合多肽。在一些實施例中，能夠結合至且活化CD3之膜結合多肽可為抗CD3抗體。在其他實施例中，抗CD3抗體可為抗CD3scFvFc。在一些實施例中，能夠結合並活化CD28之膜結合多肽為CD80、CD86或其功能片段，諸如CD80之細胞外域。
在一些實施例中，第二反式活化子可調節可封裝RNA基因組之表現，該可封裝RNA基因組可包括編碼一或多種靶標多肽之RNA，作為非限制性實例包括本文揭示之工程化信號傳導多肽中之任一者及/或一或多種(例如，兩種或更多種)抑制性RNA分子。應注意，可預見反轉錄病毒封裝系統態樣及製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法態樣不限於製備用於轉導T細胞及/或NK細胞之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，而亦適用於可藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導之任何細胞類型。在一些說明性實施例中，可封裝RNA基因組經設計以表現一或多種靶標多肽，作為非限制性實例包括本文所揭示之工程化信號傳導多肽中之任一者及/或一或多種(例如兩種或更多種)與諸如gag及pol之反轉錄病毒組分相反定向(例如，在相反鏈上且在相反方向上編碼)之抑制性RNA分子。舉例而言，可封裝 RNA基因組包括5’至3’：5’長末端重複或其活性截斷片段；編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件之核酸序列；編碼第一靶標多肽及視情況存在之第二靶標多肽的核酸序列，靶標多肽為諸如但不限於呈相反定向之工程化信號傳導多肽，其可相對於5’長末端重複及順式作用RNA封裝元件以此相反方向驅動啟動子，該啟動子在一些實施例中僅出於方便起見稱為「第四」啟動子(且有時在本文中稱為在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子)，其在諸如T細胞及/或NK細胞之靶細胞中具有活性，但在說明性實例中，在封裝細胞中不具有活性，或在封裝細胞中僅具有誘導性或最小活性；及3’長末端重複或其活性截斷片段。在一些實施例中，可封裝RNA基因組可包括中樞聚嘌呤區域(cPPT)/中樞終止序列(CTS)元件。在一些實施例中，反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件可為HIV Psi。在一些實施例中，反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件可為Rev反應元件。在例示性實施例中，由與5’長末端重複相反定向之啟動子驅動之工程化信號傳導多肽為本文所揭示之一或多種工程化信號傳導多肽，且可視情況表現如本文及在WO2017/165245A2、WO2018/009923A1及WO2018/161064A1中更詳細揭示之一或多種抑制性RNA分子。
應理解，諸如第一啟動子、第二啟動子、第三啟動子、第四啟動子等之啟動子編號僅出於方便起見。除非明確地敍述其他啟動子，否則稱為「第四」啟動子之啟動子不應被視為暗示存在任何其他啟動子，諸如第一啟動子、第二啟動子或第三啟動子。應注意，該等啟動子中之每一者能夠驅動轉錄物以適當細胞類型表現，且此類轉錄物形成轉錄單元。
在一些實施例中，工程化信號傳導多肽可包括第一淋 巴增殖性元件。適合之淋巴增殖性元件揭示於本文中之其他部分中。作為非限制性實例，淋巴增殖性元件可表現為具有識別域之融合物，諸如eTag，如本文所揭示。在一些實施例中，可封裝RNA基因組可進一步包括編碼第二工程化多肽之核酸序列，包括編碼本文所提供之任何CAR實施例的嵌合抗原受體。舉例而言，第二工程化多肽可包括第一抗原特異性靶向區、第一跨膜域，及第一胞內活化域。抗原特異性靶向區、跨膜域及胞內活化域之實例揭示於本文其他處。在靶細胞為T細胞之一些實施例中，在靶細胞中具有活性之啟動子在T細胞中具有活性，如本文其他處所揭示。
在一些實施例中，工程化信號傳導多肽可包括CAR，且核酸序列可編碼本文所提供之任何CAR實施例。舉例而言，工程化多肽可包括第一抗原特異性靶向區、第一跨膜域及第一胞內活化域。抗原特異性靶向區、跨膜域及胞內活化域之實例揭示於本文其他處。在一些實施例中，可封裝RNA基因組可進一步包括編碼第二工程化多肽之核酸序列。在一些實施例中，第二工程化多肽可為淋巴增殖性元件。在其中靶細胞為T細胞或NK細胞之一些實施例中，在靶細胞中具有活性之啟動子在T細胞或NK細胞中具有活性，如本文其他處所揭示。
在一些實施例中，可封裝RNA基因組可進一步包括核糖開關，如在WO2017/165245A2、WO2018/009923A1及WO2018/161064A1中所論述。在一些實施例中，編碼工程化信號傳導多肽之核酸序列可以相對於由5’LTR及3’LTR建立之5’至3’定向來反向定向。在其他實施例中，可封裝RNA基因組可進一步包括核糖開關，且視情況該核糖開關可呈反向定向。在本文所揭示之實施例中之 任一者中，包括該等元件中之任一者的聚核苷酸可包括引子結合位點。在說明性實施例中，轉錄阻斷劑或polyA序列可置放於基因附近以防止或減少未經調節之轉錄。在本文所揭示之實施例中之任一者中，編碼Vpx之核酸序列可位於第二轉錄單元上或視情況存在之第三轉錄單元上，或位於可操作地連接至第一可誘導啟動子之額外轉錄單元上。
在本文中之另一態樣中提供一種包含非複製勝任型反轉錄病毒顆粒之可封裝RNA基因組之哺乳動物封裝細胞株，其中該可封裝RNA基因組包含：a. 5’長末端重複或其活化片段；b. 編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件之核酸序列；c. 聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多種核酸序列，其中一或多種核酸中之第一核酸序列編碼針對一或多種RNA靶標之一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子，且一或多種核酸中之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域；及d. 3’長末端重複或其活化片段。
以上態樣中之抑制性RNA分子可包括在本揭示之其它部分中所提供之抑制性RNA分子中之任一者，作為非限制性實例，shRNA或miRNA。
在哺乳動物封裝細胞株態樣之一些實施例中，(c)之聚核苷酸可與編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件(b)、5’長末端重複(a)及/或3’長末端重複(d)之核酸序列呈相反定向，例如相對於由5’ LTR及the 3’LTR建立之定向。
在哺乳動物封裝細胞株態樣之一些實施例中，可封裝RNA基因組之表現藉由在哺乳動物封裝細胞株中具有活性之誘導型啟動子驅動。
在說明性實施例中，在驅動上文緊接著提供之此等態樣中之可誘導RNA及CAR之表現的T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子，在封裝細胞株中不具有活性或僅具有最小活性或可誘導活性。在說明性實施例中，在T細胞及/或NK細胞中具有活性之此啟動子位於編碼一(例如兩種)或多種可誘導RNA及CAR及3’LTR之核酸之間的可封裝RNA基因組上。
在涉及編碼針對一或多種RNA靶向物之一或多種抑制性RNA分子之可封裝細胞或細胞株的態樣中之任一者中，至少一種抑制性RNA分子及在一些實施例中，所有抑制性RNA分子可包括彼此部分地或完全互補之5’鏈及3’鏈，其中該5’鏈及該3’鏈能夠形成18個至25個核苷酸RNA雙螺旋體。在一些實施例中，5’鏈長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸，且3’鏈長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，5’鏈及3’鏈長度可相同或不同。在一些實施例中，RNA雙螺旋可包括一或多個錯配。在替代實施例中，RNA雙螺旋不具有錯配。
在上文針對本文之編碼針對一或多種RNA靶向物之抑制性RNA分子的可封裝細胞或細胞株所提供的態樣中之任一者中，抑制性RNA分子可為miRNA或shRNA。在一些實施例中，抑制性分子可為miRNA之前體，諸如Pri-miRNA或Pre-miRNA，或shRNA之前體。在一些實施例中，一或多種抑制性RNA分子可為人工衍生之 miRNA或shRNA。在其他實施例中，抑制性RNA分子可為經處理成siRNA之dsRNA(經轉錄或人工引入)或siRNA本身。在一些實施例中，抑制性RNA分子可為miRNA或shRNA，其具有在自然界中未發現之序列，或具有在自然界中未發現之至少一個功能區段，或具有在自然界中未發現之功能區段的組合。在說明性實施例中，抑制性RNA分子中之至少一者或全部為miR-155。
在上文針對本文之編碼針對一或多種RNA靶向物之抑制性RNA分子的可封裝細胞或細胞株所提供的態樣中之任一者中，該一或多種抑制性RNA分子在一些實施例中可包含自5’至3’定向：5’臂、5’莖、環、與該5’莖部分或完全互補之3’莖，及3’臂。在一些實施例中，兩種或更多種抑制性RNA分子中之至少一者具有此排列。在其他實施例中，兩個或更多個抑制性RNA分子之全部均具有此排列。在一些實施例中，5’莖長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，3’莖長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，環長度可為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸。在一些實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自天然存在之miRNA。在一些實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自天然存在之miRNA，該miRNA選自以下組成之群：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在說明性實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自miR-155。在一些實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自小家鼠miR-155或智人miR-155。在一些實施例中，5’臂具有SEQ ID NO：256中所闡述之序列或為其功能變體，諸如與SEQ ID NO：256長度 相同，或為SEQ ID NO：256之長度的95%、90%、85%、80%、75%，或50%，或為100個核苷酸或更少、95個核苷酸或更少、90個核苷酸或更少、85個核苷酸或更少、80個核苷酸或更少、75個核苷酸或更少、70個核苷酸或更少、65個核苷酸或更少、60個核苷酸或更少、55個核苷酸或更少、50個核苷酸或更少、45個核苷酸或更少、40個核苷酸或更少、35個核苷酸或更少、30個核苷酸或更少，或25個核苷酸或更少；且與SEQ ID NO：256至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致之序列。在一些實施例中，3’臂具有SEQ ID NO：260中所闡述之序列或為其功能變體，例如與SEQ ID NO：260相同的長度，或為SEQ ID NO：206之長度的95%、90%、85%、80%、75%，或50%，或為100個核苷酸或更少、95個核苷酸或更少、90個核苷酸或更少、85個核苷酸或更少、80個核苷酸或更少、75個核苷酸或更少、70個核苷酸或更少、65個核苷酸或更少、60個核苷酸或更少、55個核苷酸或更少、50個核苷酸或更少、45個核苷酸或更少、40個核苷酸或更少、35個核苷酸或更少、30個核苷酸或更少，或25個核苷酸或更少；且與SEQ ID NO：260至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致之序列。在一些實施例中，3’臂包含小家鼠BIC之核苷酸221至283。
在另一態樣中，本文提供用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法，其包括：培養封裝細胞群以積聚第一反式活化子，其中該等封裝細胞包括由組成性啟動子表現之第一反式活化子，其中該第一反式活化子能夠結合第一配位體及第一可誘導啟動子，以在存在與不存在第一配位體之情況下影響可操作地連接至其上之核酸序列的表現，且其中第二反式活化子之表現由第一反式活化子 調節；在第一配位體之存在下培育包括積聚之第一反式活化子的封裝細胞群以積聚第二反式活化子，其中第二反式活化子能夠結合第二配位體及第二可誘導啟動子，以在存在與不存在第二配位體之情況下影響可操作地連接到其上之核酸序列的表現；且在第二配位體之存在下培育包括積聚之第二反式活化子的封裝細胞群，從而誘導涉及病毒封裝之反轉錄病毒多肽的表現，諸如gag多肽、pol多肽及/或假型化元件，及視情況存在之被認為抑制哺乳動物細胞增殖或存活之其他多肽，其將併入非複製勝任型重組反轉錄病毒中或併入其上，從而製得非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。在說明性實施例中，可封裝RNA基因組由可操作地連接至啟動子(出於方便起見有時稱作「第三」啟動子)之聚核苷酸編碼，其中該第三啟動子具有組成性活性或可由第一反式活化子或在說明性實施例中由第二反式活化子誘導，從而製得非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。假型化元件通常能夠結合靶細胞之細胞膜且促進靶細胞膜與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒膜之融合。假型化元件可為此項技術中已知的任何包膜蛋白質。在一些實施例中，包膜蛋白質可為水泡性口炎病毒包膜蛋白質(VSV-G)、貓內源性病毒(RD114)包膜蛋白質、腫瘤反轉錄病毒雙嗜性包膜蛋白質及/或腫瘤反轉錄嗜親性包膜蛋白質。熟習此項技術這將理解，多種不同反式活化子、配位體，及可誘導啟動子可用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法中。適合之反式活化子、配位體，及可誘導啟動子揭示於本文中其他處，包括上文中。熟練的業內人士將進一步理解，與本文提供之反轉錄病毒封裝系統態樣相關之上述教示亦適用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法，且反之亦然。
在一些實施例中，第一反式活化子可調節元件之表現 以控制含有共有序列之轉錄物的核輸出，諸如HIV Rev，且共有序列可為Rev反應元件(RRE)。在說明性實施例中，靶細胞通常為T細胞。在一些實施例中，HIV RRE及編碼HIV Rev之聚核苷酸區域可分別由HIV-2 RRE及編碼HIV-2 Rev之聚核苷酸區域替代。在一些實施例中，HIV RRE及編碼HIV Rev之聚核苷酸區域可分別由SIV RRE及編碼SIV Rev之聚核苷酸區域替代。在一些實施例中，HIV RRE及編碼HIV Rev之聚核苷酸區域可分別由RemRE及編碼β反轉錄病毒Rem之聚核苷酸區域替代。在一些實施例中，HIV RRE及編碼HIV Rev之聚核苷酸區域可分別由δ反轉錄病毒RexRRE及編碼δ反轉錄病毒Rex之聚核苷酸區域替代。在一些實施例中，不需要Rev類蛋白質且PRE可由諸如組成性轉運元件(CTE)之順式作用RNA元件替代。
在一些實施例中，假型化元件為病毒包膜蛋白質。假型化分析元件通常包括用於將病毒與靶細胞膜結合並促進病毒與靶細胞膜之膜融合的結合多肽及融合多肽。在一些實施例中，假型化元件可為貓內源性病毒(RD114)包膜蛋白質、腫瘤反轉錄病毒雙嗜性包膜蛋白質、腫瘤反轉錄嗜親性包膜蛋白質及/或水泡性口炎病毒包膜蛋白質(VSV-G)。在說明性實施例中，假型化元件包括結合多肽及衍生自不同蛋白質之融合多肽，如本文進一步詳細論述。舉例而言，在一說明性實施例中，尤其在靶細胞為T細胞及/或NK細胞時，結合多肽可為麻疹病毒H多肽之細胞質域缺失變體且融合多肽可為麻疹病毒F多肽之細胞質域缺失變體。在一些實施例中，融合多肽可包括表現為一個多肽之多個元件。在一些實施例中，結合多肽及融合多肽可轉譯自同一轉錄物且轉譯自不同核糖體結合位點，或可在轉譯後使用肽裂解信號或核糖體跳過序列來裂解多肽，如本文其他處所揭示，以 產生結合多肽及融合多肽。在一些實施例中，結合多肽及融合多肽自分離的核糖體結合位點之轉譯產生比結合多肽更高量之融合多肽。在一些實施例中，融合多肽與結合多肽之比率為至少2：1、至少3：1、至少4：1、至少5：1、至少6：1、至少7：1，或至少8：1。
在一些實施例中，第一反式活化子可調節能夠結合並活化諸如T細胞之靶細胞的活化元件的表現。在此等實施例中，活化元件可包括：a.)能夠結合並活化CD3之膜結合多肽；及/或b.)能夠結合並活化CD28之膜結合多肽。在一些實施例中，能夠結合並活化CD28之膜結合多肽為CD80、CD86或其功能片段。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括反轉錄病毒膜上之活化元件及核衣殼內之反轉錄病毒RNA，從而製得非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。
在一些實施例中，第二反式活化子可調節包括自5’至3’之RNA之表現：5’長末端重複或其活性截斷片段；編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件之核酸序列；編碼第一靶標多肽及視情況存在之第二靶標多肽(作為非限制性實例，一或兩種工程化信號傳導多肽)的核酸序列；在靶細胞中具有活性之啟動子；及3’長末端重複或其活性截斷片段。在一些實施例中，RNA可包括cPPT/CTS元件。在一些實施例中，RNA可包括引子結合位點。在一些實施例中，反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件可為HIV Psi。在一些實施例中，反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件可為Rev反應元件。在本文揭示之實施例中之任一者中，RNA上的反轉錄病毒組分(包括RRE及Psi)可位於任何位置，如熟習此項技術者將理解。在說明性實施例中，工程化信號傳導多肽為本文所揭示之工程化信號傳導多肽中之一或多者。
在一些實施例中，工程化信號傳導多肽可包括第一淋巴增殖性元件。適合之淋巴增殖性元件揭示於本文中之其他部分中。在一些說明性實施例中，淋巴增殖性元件為融合至識別域之IL-7受體突變體，諸如eTag。在一些實施例中，可封裝RNA基因組可進一步包括編碼第二工程化多肽之核酸序列，包括編碼本文所提供之任何CAR實施例的嵌合抗原受體。舉例而言，第二工程化多肽可包括第一抗原特異性靶向區、第一跨膜域，及第一胞內活化域。抗原特異性靶向區、跨膜域及胞內活化域之實例揭示於本文其他處。在靶細胞為T細胞之一些實施例中，在靶細胞中具有活性之啟動子在T細胞中具有活性，如本文其他處所揭示。
在一些實施例中，可封裝RNA基因組可進一步包括核糖開關，如在WO2017/165245A2、WO2018/009923A1及WO2018/161064A1中所論述。在一些實施例中，編碼工程化信號傳導多肽之核酸序列可呈反向定向。在其他實施例中，可封裝RNA基因組可進一步包括核糖開關，且視情況該核糖開關可呈反向定向。在本文所揭示之實施例中之任一者中，包括該等元件中之任一者的聚核苷酸可包括引子結合位點。在說明性實施例中，轉錄阻斷劑或polyA序列可置放於基因附近以防止或減少未經調節之轉錄。在本文所揭示之實施例中之任一者中，編碼Vpx之核酸序列可位於第二轉錄單元上或視情況存在之第三轉錄單元上，或位於可操作地連接至第一可誘導啟動子之額外轉錄單元上。
在用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之封裝系統或方法之一些實施例中，編碼之RNA可以包括內含子，其可例如轉錄自用於表現靶標多肽之相同啟動子。在某些說明性實施例 中，此類內含子可編碼1種、2種、3種，或4種miRNA。在用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之封裝系統或方法的此等及其他實施例中，可封裝RNA基因組大小為11,000KB或更小，且在一些實例中為10,000KB或更小。
在一些實施例中，第一反式活化子可影響一或多種非毒性多肽之表現。在一些實施例中，第二反式活化子可影響一或多種毒性多肽之表現。舉例而言，第一反式活化子可誘導除了將轉運至封裝細胞之細胞膜的多肽之外的反轉錄病毒蛋白質Rev及Vpx之表現，且第二反式活化子可誘導反轉錄病毒蛋白質GAG、POL、MV(Ed)-F△30以及MV(Ed)-H△18或MV(Ed)-H△24之表現以及慢病毒基因組之表現。在一些實施例中，第一反式活化子可影響一或多種毒性多肽之表現且/或第二反式活化子可影響一或多種非毒性多肽之表現。
在另一態樣中，本文提供哺乳動物封裝細胞，其包括：a)哺乳動物封裝細胞之基因組中之第一轉錄單元，其包括編碼第一反式活化子之核酸序列，其中該第一轉錄單元可操作地連接至組成性啟動子，且其中該反式活化子能夠結合第一可誘導啟動子且在存在與不存在第一配位體之情況下影響可操作地連接至其上之核酸序列之表現，且其中該第一反式活化子能夠結合該第一配位體；b)哺乳動物封裝細胞之基因組中之第二轉錄單元及視情況存在之第三轉錄單元，其包括編碼反轉錄病毒REV蛋白質之核酸序列及編碼第二反式活化子之核酸序列，該第二反式活化子能夠結合第二可誘導啟動子且在存在與不存在第二配位體之情況下影響可操作地連接至其上之核酸序列之表現，其中該第二反式活化子能夠結合該第二配位體，且其中 該第二轉錄單元及視情況存在之第三轉錄單元可操作地連接至該第一可誘導啟動子；c)哺乳動物封裝細胞之基因組中之第四轉錄單元及視情況存在之第五轉錄單元，其包括編碼反轉錄病毒gag多肽及反轉錄病毒pol多肽之核酸序列，以及能夠結合並促進靶細胞膜與反轉錄病毒膜之融合的結合多肽和融合多肽，其中該第四轉錄單元及視情況存在之第五轉錄單元可操作地連接至該第二可誘導啟動子；以及d)哺乳動物封裝細胞之基因組中之第六轉錄單元，其自5’至3’包括5’LTR或其活性截斷片段、編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件之核酸序列、cPPT/CTS元件、編碼工程化信號傳導多肽之核酸序列之反向互補、內含子、在靶細胞中具有活性之啟動子，以及3’LTR或其活性截斷片段，其中該第六轉錄單元可操作地連接至該第二可誘導啟動子。
在另一態樣中，本文提供用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法，其包括：1.)培養封裝細胞群以積聚第一反式活化子，其中該等封裝細胞包括：a)哺乳動物封裝細胞之基因組中之第一轉錄單元，其包括編碼第一反式活化子之核酸序列，其中該第一轉錄單元可操作地連接至組成性啟動子，且其中該反式活化子能夠結合第一可誘導啟動子且在存在與不存在第一配位體之情況下影響可操作地連接至其上之核酸序列之表現，且其中該第一反式活化子能夠結合該第一配位體；b)哺乳動物封裝細胞之基因組中之第二轉錄單元及視情況存在之第三轉錄單元，其包括編碼反轉錄病毒REV蛋白質之核酸序列及編碼第二反式活化子之核酸序列，該第二反式活化子能夠結合第二可誘導啟動子且在存在與不存在第二配位體之情況下影響可操作地連接至其上之核酸序列之表現，其中該第二反式活化子能夠結合該第二配位體，且其中該第二轉錄單元及視情況存在之第三轉錄 單元可操作地連接至該第一可誘導啟動子；c)哺乳動物封裝細胞之基因組中之第四轉錄單元及視情況存在之第五轉錄單元，其包括編碼反轉錄病毒gag多肽及反轉錄病毒pol多肽之核酸序列，以及能夠結合並促進反轉錄病毒膜與靶細胞膜之融合的結合多肽和融合多肽，其中該第四轉錄單元及視情況存在之第五轉錄單元可操作地連接至該第二可誘導型啟動子；以及d)哺乳動物封裝細胞之基因組中之第六轉錄單元，其自5’至3’包括5’LTR或其活性截斷片段、引子結合位點(PBS)、編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件之核酸序列、cPPT/CTS元件、編碼工程化信號傳導多肽之核酸序列之反向互補、內含子、在靶細胞中具有活性之靶細胞啟動子，以及3’LTR或其活性截斷片段，其中該第五轉錄單元可操作地連接至該第二可誘導啟動子；及2)在該第一配位體之存在下培育包括該第一反式活化子之封裝細胞群以積聚該第二反式活化子及反轉錄病毒REV蛋白質；及3)在該第二配位體之存在下培育包括該第二反式活化子及反轉錄病毒REV蛋白質的封裝細胞群，從而誘導反轉錄病毒gag多肽、反轉錄病毒pol多肽、結合多肽、融合多肽及反轉錄病毒RNA(自5’至3’包括5’LTR或其活化片段之反轉錄病毒RNA、PBS、反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件、編碼工程化信號傳導多肽之核酸序列的反向互補、靶細胞啟動子，以及3’LTR或其活性截斷片段)之表現，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒由封裝細胞形成並釋放，且其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包括反轉錄病毒膜上之結合多肽及/或融合多肽以及核衣殼內之反轉錄病毒RNA，從而製得非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。
在本文所提供之一態樣中，反轉錄病毒封裝系統可包括哺乳動物細胞，其包括：1.)第一反式活化子，其由組成性啟動子表 現且能夠結合第一配位體及第一可誘導啟動子來在存在與不存在第一配位體的情況下影響可操作地連接至其上之核酸序列的表現；2.)第二反式活化子，其能夠結合第二配位體及第二可誘導啟動子，且在存在與不存在第二配位體的情況下影響可操作地連接至其上之核酸序列的表現；及3.)反轉錄顆粒之可封裝RNA基因組，其中該第一反式活化子調節該第二反式活化子、HIV REV、IL7 GPI DAF及活化元件之表現，且其中該第二反式活化子調節gag多肽、pol多肽、反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件，及一或多種包膜多肽之表現。在說明性實施例中，第一反式活化子可為融合至p65活化域之FRB域及融合至ZFHD1 DNA結合域之一或多個FKBP域，第一配位體可為雷帕黴素，且第一可誘導啟動子可為一或多個ZFHD1結合位點。在說明性實施例中，第二反式活化子可為rtTA蛋白質，第二配位體可為四環素或多西環素，且第二可誘導啟動子可為TRE啟動子或雙向TRE啟動子。在說明性實施例中，反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件可為HIV Psi。在說明性實施例中，一或多種包膜蛋白質包括麻疹病毒之F多肽及H多肽的細胞質域缺失變體。在說明性實施例中，轉錄阻斷劑或polyA序列可置放於基因附近以防止或減少未經調節之轉錄。在一些實施例中，可使用具有核糖開關之雷帕黴素-多西環素可誘導慢病毒基因組(SEQ ID NO：83)。在一些實施例中，可使用雷帕黴素-多西環素可誘導GAG POL ENV(SEQ ID NO：84)。在一些實施例中，可使用雷帕黴素可誘導TET活化子(SEQ ID NO：85)。在一些實施例中，可使用雷帕黴素誘導子可誘導REV srcVpx(SEQ ID NO：86)。
本發明之一些態樣包括細胞或為細胞，在說明性實例中為用作封裝細胞以製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之哺乳 動物細胞，諸如用於轉導T細胞及/或NK細胞之慢病毒顆粒。可選擇廣泛多種細胞中之任一者來在體外產生病毒或病毒顆粒，諸如根據本發明之重定向重組反轉錄病毒顆粒。通常使用真核細胞，尤其哺乳動物細胞，包括人類細胞，猿類細胞，大類細胞，貓類細胞，馬類細胞及嚙齒動物細胞。在說明性實例中，細胞為人類細胞。在其他說明性實施例中，細胞無限地增殖，且因此永生。可有利地用於本發明之細胞的實例包括NIH 3T3細胞、COS細胞、Madin-Darby犬腎細胞、人類胚胎293T細胞及衍生自此類細胞之任何細胞，諸如gpnlslacZ φNX細胞，其衍生自293T細胞。可使用高度可轉染細胞，諸如人胚胎腎293T細胞。「高度可轉染」係指細胞之至少約50%、較佳地至少約70%、最佳地至少約80%可表現引入之DNA的基因。
適合之哺乳動物細胞包括原代細胞及永生化細胞株。適合之哺乳動物細胞株包括人類細胞株、非人類靈長類細胞株、嚙齒動物(例如小鼠、大鼠)細胞株，及類似者。適合之哺乳動物細胞株包括(但不限於)HeLa細胞(例如美國模式培養物保藏所(ATCC)第CCL-2號)、CHO細胞(例如ATCC第CRL9618號、第CCL61號、第CRL9096號)、293細胞(例如ATCC第CRL-1573號)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例如ATCC第CRL-1658號)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如ATCC第CCL1O號)、PC12細胞(ATCC第CRL1721號)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC第CRL1651號)、RAT1細胞、小鼠L細胞(ATCC第CCLI.3號)、人類胚胎腎(HEK)細胞(ATCC第CRL1573號)、HLHepG2細胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK細胞株(例如NKL、NK92及YTS)，及類似者。
在本文所揭示之實施例中之任一者中，製備非複製勝 任型重組反轉錄病毒顆粒之方法可包括使哺乳動物封裝細胞生長至50%、60%、70%、80%、90%或95%匯合或匯合，或生長至25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%之峰值細胞密度或峰值細胞密度，且接著分裂或稀釋細胞。在一些實施例中，可使用攪拌槽反應器來使細胞生長。在一些實施例中，可使用熟練的業內人士將理解之方法將細胞分裂至少約1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：12、1：15，或1：20。在一些實施例中，可將細胞稀釋至25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%之峰值細胞密度。在一些實施例中，在分裂或稀釋細胞之後，可在添加第一配位體之前使細胞生長持續1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、10小時，或16小時，或1天、2天、3天、4天、5天、6天，或7天。在一些實施例中，在存在第一配位體之情況下使細胞生長持續1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天，或28天，在說明性實施例中，該第一配位體可為雷帕黴素或雷帕類似物。在一些實施例中，可添加第二配位體且使細胞生長持續1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天，或28天，在說明性實施例中，該第二配位體可為四環素或多西環素。培養條件將取決於所用之細胞及配位體，且方法為此項技術中已知的。用於培養且誘導HEK293S細胞之條件的特定實例展示於實例2中。
如本文所揭示，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒為用於基因遞送之常用工具(Miller，Nature(1992)357：455-460)。非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒將未經排列之核酸序列遞送至廣泛範圍之嚙齒動物、靈長類動物及人類體細胞中之能力使得非複製勝任型重 組反轉錄病毒顆粒較適用於將基因轉移至細胞。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可衍生自α反轉錄病毒屬，β反轉錄病毒屬，γ反轉錄病毒屬，δ反轉錄病毒屬，ε反轉錄病毒屬，慢病毒屬或泡沫病毒屬。存在許多種適用於本文中所揭示之方法的反轉錄病毒。舉例而言，可使用鼠白血病病毒(MLV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、富士納肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾貝森鼠白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)(A-MLV)、禽骨髓細胞病變病毒-29(MC29)及禽紅細胞增生病毒(AEV)。反轉錄病毒之詳細清單可見於Coffin等人之(「Retroviruses」，1977，Cold Spring Harbor Laboratory Press版：J M Coffin,S M Hughes,H E Varmus，第758至763頁)。可在此項技術中找到關於一些反轉錄病毒之基因組結構的細節。舉例而言，可自NCBI Genbank(亦即Genome Accession第AF033819號)中找到關於HIV之細節。
在說明性實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可衍生自慢病毒屬。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可衍生HIV、SIV或FIV。在其他說明性實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可衍生自慢病毒屬中之人類免疫缺陷病毒(HIV)。慢病毒為複雜的反轉錄病毒，除常見的反轉錄病毒基因gag、pol及env外，亦含有具有調節或結構功能之其他基因。較高複雜性使得慢病毒能夠在潛伏感染過程中調節其生命週期。典型之慢病毒為人類免疫缺陷病毒(HIV)，AIDS之病原體。在體內，HIV可感染極少分裂之終末分化的細胞，諸如淋巴球及巨噬細胞。
在說明性實施例中，本文提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒含有Vpx多肽。Vpx多肽可在其基因組中整合Vpx編碼核酸後在封裝細胞系中表現，例如作為併入至反轉錄病毒膜中之細胞膜結合蛋白質(Durand等人，J.Virol.(2013)87：234-242)。可藉由病毒蛋白酶之處理順序構建反轉錄病毒膜結合Vpx，使得游離Vpx一旦併入病毒顆粒中即被釋放。具有此功能之Vpx融合物之此實例為Src-Flag-Vpx，其包括c-Src之前11個胺基酸的膜靶向域(MGSSKSKPKDP)(SEQ ID NO：227)，隨後為病毒蛋白酶裂解域KARVLAEA(SEQ ID NO：228)，隨後為Flag-tagged Vpx。
不受理論之限制，Vpx多肽藉由降解限制因子SAMHD1來刺激反轉錄過程之效率，而有助於休眠細胞之轉導。因此，認為在本文提供之方法中，其中Vpx存在於用以轉導T細胞及/或NK細胞之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中，Vpx在藉由含有Vpx之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導細胞之後經釋放至休眠T細胞或休眠NK細胞之細胞質中。Vpx接著降解SAMHD1，其使得游離dNTP增加，此進而刺激反轉錄病毒基因組之反轉錄。
在一些實施例中，本文提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含及/或含有Vpu多肽。Vpu多肽可在其基因組中整合Vpu編碼核酸後自質體或封裝細胞株表現為例如被併入反轉錄病毒膜中之病毒膜蛋白。由Vpu與針對人類中之表現最佳化之其序列密碼子形成的重組可經構築及表現，使得可將游離Vpu併入至病毒顆粒中。Vpu為發現於HIV-1及一些HIV-1相關之猿猴免疫缺陷病毒(SIV)分離物(諸如SIVcpz、SIVgsn及SIVmon)中但並非HIV-2或大多數SIV分離物中之輔助蛋白。Vpu蛋白參與CD4之下調及束縛蛋白之拮抗以 供顆粒釋放。更重要地，Vpu與病毒孔蛋白且特定而言來自流感病毒A(IAV)之病毒孔蛋白M2共用結構相似性，由此，Vpu經展示形成陽離子選擇性離子通道且在多種模型中滲透膜。已展示，IAV-M2有助於酸化顆粒且因此有利於自用於進入之內體途徑早期釋放，從而減少盡頭傳輸產物之量。
本文之實例4表明，藉由反轉錄病毒顆粒轉導休眠PBMC由反轉錄病毒顆粒中之Vpu之存在來加強。不受理論限制，Vpu多肽藉由加速慢病毒假型之酸化輔助休眠細胞之轉導，從而允許更多衣殼更快的到達胞質。酸化病毒內部導致削弱病毒結構蛋白之間的靜電相互作用，且因此有助於分解衣殼及核糖核酸蛋白(RNP)複合物。因此，咸信在本文提供之方法中(其中Vpu存在於用於轉導T細胞及/或NK細胞之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒膜中)，在藉由含有Vpu之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導細胞後，Vpu加速慢病毒顆粒在內體途徑中之酸化，且有利於將衣殼釋放至休眠T細胞及/或NK細胞之胞質中。因此，在一些實施例中，其中包括Vpu多肽，其包含或為Vpu之片段，該Vpu片段保留促進休眠PBMC(且在一些實施例中，休眠T細胞)之轉導的能力。該片段可包含與野生型Vpu具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之Vpu之片段。在一些實施例中，Vpu多肽包括保留促進慢病毒顆粒在內體途徑中之酸化之能力的Vpu片段。
反轉錄病毒基因組大小
在本文提供之方法及組合物中，重組反轉錄病毒基因組(在非限制性說明性實例中為慢病毒基因組)對可封裝至病毒顆粒中 之聚核苷酸之數量具有限制。在本文提供之一些實施例中，由聚核苷酸編碼區編碼之多肽可為保留功能活性之截斷或其它缺失，使得聚核苷酸編碼區由比野生型多肽之聚核苷酸編碼區更少之核苷酸編碼。在一些實施例中，由聚核苷酸編碼區編碼之多肽可為可由一個啟動子表現之融合多肽。在一些實施例中，融合多肽可具有裂解信號以由一個融合多肽及一個啟動子產生兩個或更多個功能性多肽。此外，在初始離體轉導之後不需要之一些功能不包括於反轉錄病毒基因組中，而經由封裝細胞膜存在於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上。此等不同策略在本文用於使封裝於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒內之功能性元件最大化。
在一些實施例中，待封裝之重組反轉錄病毒基因組可在範圍之低端為1,000個、2,000個、3,000個、4,000個、5,000個、6,000個、7,000個及8,000個核苷酸與範圍之高端為2,000個、3,000個、4,000個、5,000個、6,000個、7,000個、8,000個、9,000個、10,000個及11,000個核苷酸之間。待封裝之反轉錄病毒基因組包括編碼如本文所詳細揭示之第一及第二工程信號傳導多肽之一或多個聚核苷酸區。在一些實施例中，待封裝之反轉錄病毒基因組可少於5,000個、6,000個、7,000個、8,000個、9,000個、10,000個，或11,000個核苷酸。本文其他處所討論之可封裝之功能包括用於反轉錄病毒裝配及封裝所需之反轉錄病毒序列，諸如反轉錄病毒rev、gag及pol編碼區，以及5’LTR及3’LTR或其活性截斷片段，編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件之核酸序列及cPPT/CTS元件。此外，在說明性實施例中，本文中之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括以下中之任何一者或多者或全部(在一些實施例中以相對於由反轉錄病毒5’LTR及3’LTR建立之5'至3'定 向之相反定向(如作為非限制性實例展示於圖4C中))：編碼第一及第二工程信號傳導多肽之一或多個聚核苷酸區，其中之至少一者包括至少一個淋巴組織增殖元件；可包括嵌合抗原受體之第二工程化信號多肽；miRNA(控制元件)，諸如核糖開關，其通常調節第一及/或第二工程化信號傳導多肽表現；識別域、內含子、在靶細胞中具有活性之啟動子，諸如T細胞，2A裂解信號及/或IRES。
重組反轉錄病毒顆粒
重組反轉錄病毒顆粒揭示於本文提供之方法及組合物中，例如用以轉導T細胞及/或NK細胞以製備經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。重組反轉錄病毒顆粒自身為本發明之態樣。通常，包括於本文提供之態樣中的重組反轉錄病毒顆粒為非複製勝任型的，意謂重組反轉錄病毒顆粒在其離開封裝細胞時即無法複製。在說明性實施例中，重組反轉錄病毒顆粒為慢病毒顆粒。
在一些態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒以用於轉導細胞，通常淋巴球且在說明性實施例中T細胞及/或NK細胞。非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括本文其他處論述之假型化元件中之任一者。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括本文其他處論述之活化元件中之任一者。在一個態樣中，本文提供包括聚核苷酸之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，該聚核苷酸包括：A.可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼嵌合抗原受體(CAR)；及B.在其表面上之假型化元件及T細胞活化元件，其中該T細胞活化元件不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。在一些實施例中，T細胞活化元件可為本文其他處 論述之活化元件中之任一者。在說明性實施例中，T細胞活化元件可為抗CD3 scFvFc。在另一態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其包括聚核苷酸，該聚核苷酸包括可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包括嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽及包括淋巴增殖性元件之第二多肽。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可為嵌合淋巴增殖性元件。在說明性實施例中，淋巴增殖性元件不包含連接至IL-7受體α鏈或其片段之IL-7。在一些實施例中，淋巴增殖性元件不包含連接至IL-2/IL-15受體β鏈之IL-15。
在一些態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽及包含嵌合淋巴增殖性元件(例如組成性活性嵌合淋巴增殖性元件)之第二多肽。在說明性實施例中，嵌合淋巴增殖性元件不包含連接至其同源受體或連接至其同源受體之片段的細胞介素。
在一些態樣中，本文提供一種重組反轉錄病毒顆粒，其包括(i)假型化元件，其能夠結合T細胞及/或NK細胞並促進重組反轉錄病毒顆粒之膜融合；(ii)聚核苷酸，其具有可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼具有嵌合抗原受體(包括抗原特異性靶向區、跨膜域及胞內活化域)之第一工程化信號傳導多肽，以及包含至少一種淋巴組織增殖元件之第二工程化信號傳導多肽；其中該第一工程化信號傳導多肽及/或該第二工程化信號傳導多肽之表現由體內控制元件 調節；及(iii)在其表面上之活化元件，其中該活化元件能夠結合至T細胞及/或NK細胞，且不由重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。在一些實施例中，在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子在封裝細胞株中不具有活性，或僅以可誘導之方式在封裝細胞株中具有活性。在本文揭示之實施例中之任一者中，第一及第二工程化信號傳導多肽中之一者可具有嵌合抗原受體且另一工程化信號傳導多肽可具有至少一種淋巴增殖性元件。
貫穿本發明提供包括於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之各種元件及元件之組合，諸如假型化元件、活化元件及膜結合細胞介素，以及包括於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之基因組中之核酸序列，諸如但不限於編碼CAR之核酸；編碼淋巴增殖性元件之核酸；編碼控制元件(諸如核糖開關)之核酸；啟動子，尤其在T細胞中具有組成型活性或可誘導之啟動子；及編碼抑制性RNA分子之核酸。此外，本文提供之各種態樣(諸如製備重組反轉錄病毒顆粒之方法、執行過繼細胞治療之方法，以及轉導T細胞之方法)產生及/或包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。此類方法中產生及/或包括之非複製勝任型重組反轉錄病毒自身形成作為本發明之獨立態樣的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒組合物，該等組合物可呈分離形式。此類組合物可呈乾燥(例如凍乾)形式，或者可呈此項技術已知的適合之溶液或介質形式以用於儲存且使用反轉錄病毒顆粒。
因此，作為非限制性實例，在另一態樣中，本文提供一種在其基因組中具有聚核苷酸之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，該聚核苷酸具有可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，在一些情況下，該核酸序列包括編 碼針對一或多種RNA靶標之一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子之第一核酸序列及編碼嵌合抗原受體或CAR之第二核酸序列，如本文所描述。在其他實施例中，存在編碼本文先前所描述之不為抑制性RNA分子之至少一種淋巴增殖性元件的第三核酸序列。在某些實施例中，聚核苷酸包括如本文所提及之一或多個核糖開關，該等核糖開關可操作地連接至第一核酸序列、第二核酸序列及/或第三核酸序列(若存在)。在此構築體中，一或多種抑制性RNA、CAR及/或不為抑制性RNA之一或多種淋巴增殖性元件之表現由核糖開關控制。在一些實施例中，兩種至10種抑制性RNA分子由第一核酸序列編碼。在其他實施例中，兩種至六種抑制性RNA分子由第一核酸序列編碼。在說明性實施例中，4種抑制性RNA分子由第一核酸序列編碼。在一些實施例中，第一核酸序列編碼一或多種抑制性RNA分子且位於內含子內。在某些實施例中，內含子包括啟動子之全部或部分。啟動子可為Pol I、Pol II，或Pol III啟動子。在一些說明性實施例中，啟動子為Pol II啟動子。在一些實施例中，內含子鄰近在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子且位於該啟動子之下游。在一些實施例中，內含子為EF1-α內含子A。
本文之重組反轉錄病毒顆粒實施例包括其中反轉錄病毒顆粒包含基因組之彼等，該基因組包括編碼一或多種抑制性RNA分子之一或多種核酸。編碼可包括於反轉錄病毒顆粒之基因組中之抑制性RNA分子的此類核酸之各種替代實施例(包括此類核酸與編碼除抑制性RNA分子之外的CAR或淋巴增殖性元件之其他核酸的組合)包括於例如本文提供之抑制性RNA部分以及包括於組合此等實施例之各種其他段落中。此外，此類非複製勝任型重組反轉錄病毒之各種替 代物可藉由在本文中所揭示之封裝細胞株態樣內揭示之例示性核酸識別。熟練的業內人士將認識到，包括編碼一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子之基因組之重組反轉錄病毒顆粒之此部分的揭示內容可與本文其他部分所提供之編碼抑制性RNA分子之此類核酸的各種替代物組合。此外，熟練的業內人士將認識到，編碼一或多種抑制性RNA分子之此類核酸可與本文所提供之各種其他功能性核酸元件組合，如(例如)本文中側重於抑制性RNA分子及編碼此等分子之核酸之部分所揭示。此外，在本文其他部分中提供之特異性抑制性RNA分子之各種實施例可用於本發明之重組反轉錄病毒顆粒態樣中。
諸如慢病毒載體之重組反轉錄病毒載體的必需元素為是此項技術中已知的。此等元素包括於封裝細胞株部分中，及在實例部分中所提供之用於製備重組反轉錄病毒顆粒之細節中。舉例而言，慢病毒顆粒通常包括封裝元件REV、GAG及POL，其可經由一或多種封裝質粒遞送至封裝細胞株；假型分型元件，本文提供的各種實例，其可經由假型化質粒遞送至封裝細胞株；及基因組，其由經由轉移質粒遞送至宿主細胞之聚核苷酸產生。此聚核苷酸通常包括病毒LTR及psi封裝信號。5’LTR可為與異源啟動子融合之嵌合5’LTR，其包括不依賴於Tat反式活化之5’'LTR。轉移質粒可自失活，例如藉由移除3’LTR之U3區。在一些非限制性實施例中，對於包括反轉錄顆粒之本文提供之任何組合物或方法態樣及實施例，將包括(但不限於)Src-FLAG-Vpu之Vpu(諸如包含Vpu之多肽(本文中有時稱為「Vpu多肽」))封裝於反轉錄病毒顆粒內。在一些非限制性實施例中，將Vpx(諸如Src-FLAG-Vpx)封裝於反轉錄病毒顆粒內。不受理論限制，在轉導T細胞後，Vpx進入細胞之胞液且促進SAMHD1之降解，從而 使得可用於反向轉錄胞質dNTP庫增加。在一些非限制性實施例中，對於包括本文提供之反轉錄顆粒之任何組合物或方法態樣及實施例，將Vpu及Vpx封裝於反轉錄病毒顆粒內。
包括於本發明之各種態樣中之反轉錄病毒顆粒(例如慢病毒顆粒)在說明性實施例中為非複製型，尤其出於對於包括將用此類反轉錄病毒顆粒轉導之細胞引入個體之實施例的安全原因。當非複製勝任型反轉錄病毒顆粒用於轉導細胞時，反轉錄病毒顆粒並非由轉導之細胞產生。對反轉錄病毒基因組之修飾為此項技術中已知的，以確保包括該基因組之反轉錄病毒顆粒為非複製勝任型的。然而，應理解，在一些實施例中，針對本文所提供之態樣中之任一者，可使用複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。
熟練的業內人士將認識到，可使用不同類型之載體(諸如表現載體)將本文所論述之功能元件遞送至封裝細胞及/或至T細胞。本發明之說明性態樣利用反轉錄病毒載體，及(在一些特定說明性實施例中)慢病毒載體。其他適合之表現載體可用於實現本文之某些實施例。此類表現載體包括(但不限於)病毒載體(例如基於以下之病毒載體：痘苗病毒；脊髓灰質炎病毒；腺病毒(參見例如Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35：2543 2549,1994；Borras等人，Gene Ther 6：515 524,1999；Li及Davidson，PNAS 92：7700 7704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5：1088 1097,1999；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984 and WO 95/00655)；腺相關病毒(參見例如Ali等人，Hum Gene Ther 9：81 86,1998，Flannery等人，PNAS 94：6916 6921,1997；Bennett等人，Invest Opthalmol Vis Sci 38：2857 2863,1997；Jomary等人，Gene Ther 4：683 690,1997，Rolling等人， Hum Gene Ther 10：641 648,1999；Ali等人，Hum Mol Genet 5：591 594,1996；WO 93/09239中之Srivastava，Samulski等人，J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166：154-165；及Flotte等人，PNAS(1993)90：10613-10617)；SV40；單純疱疹病毒；或反轉錄病毒載體(例如，小鼠白血病病毒、脾壞死病毒及衍生自諸如羅斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺腫瘤病毒之反轉錄病毒的載體)，例如γ反轉錄病毒；或人類免疫缺陷病毒(參見例如Miyoshi等人，PNAS 94：10319 23,1997；Takahashi等人，J Virol 73：7812 7816,1999)；及類似者。
在說明性實施例中，反轉錄病毒顆粒為慢病毒顆粒。此類反轉錄病毒顆粒通常包括位於病毒包膜內之衣殼內的反轉錄病毒基因組。
在一些實施例中，利用含DNA之病毒顆粒代替重組反轉錄病毒顆粒。此類病毒顆粒可為腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、巨細胞病毒、痘病毒、牛痘病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒(VSV)，或辛德畢斯病毒(Sindbis virus)。熟練的業內人士將理解如何修改本文揭示之用於不同病毒及反轉錄病毒或反轉錄病毒顆粒之方法。在使用包括DNA基因組之病毒顆粒時，熟練的業內人士將理解，此等基因組中可包括功能單元以誘導將病毒顆粒之全部或部分DNA基因組整合至用此類病毒轉導之T細胞之基因組中。
在一些實施例中，HIV RRE及編碼HIV Rev之聚核苷酸區可由N端RGG盒RNA結合基元及編碼ICP27之聚核苷酸區替代。在一些實施例中，編碼HIV Rev之聚核苷酸區可由編碼腺病毒E1B 55-kDa及E4 Orf6之一或多個聚核苷酸區替代。
在一個態樣中，本發明提供容器(諸如商業容器或封裝)或包含其之套組，包含根據本文提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣中之任一者之經分離非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。此外，在另一態樣中，本文提供容器(諸如商業容器或封裝)或包含其之套組，包含根據本文提供之封裝細胞及/或封裝細胞株態樣中之任一者之經分離封裝細胞，在說明性實施例中，來自封裝細胞株之經分離封裝細胞。在一些實施例中，套組包括額外容器，該額外容器包括額外試劑，諸如用於本文提供之方法中之緩衝液或試劑。此外，在某些態樣中，本文提供任何態樣中之本文提供之任何非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在製造用於以基因方式修飾根據本文提供之任何態樣之T細胞或NK之套組中之用途。此外，在某些態樣中，本文提供任何態樣中之本文提供之任何封裝細胞及/或封裝細胞株在製造用於產生根據本文提供之任何態樣之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之用途。
在一個態樣中，本文提供含有非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之商用容器及使用來治療個體之腫瘤生長的說明書，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其基因組中包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列。在一些實施例中，一或多個核酸序列之一核酸序列可編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在一些實施例中，一或多個核酸序列之一核酸序列可編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個抑制性RNA分子。
含有重組反轉錄病毒顆粒之容器可為用於儲存重組反轉錄病毒顆粒之管、小瓶，孔盤，或其他容器。套組可包括兩個或更多個容器，其中第二或其他容器可包括例如用於轉導T細胞及/或NK細胞之溶液或介質，及/或第二或其他容器可包括pH調節藥用試劑。此等容器中之任一者可具有工業強度及等級。包括套組及編碼抑制性RNA分子之核酸之此類態樣中的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可為本文所提供之此類非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之實施例中的任一者，其包括本文所提供之抑制性RNA之實施例中的任一者。
在另一態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在製造用於以基因方式修飾T細胞及/或NK細胞之套組中之用途，其中套組之用途包括：使T細胞或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包括表面上之假型化元件及表面上之T細胞活化元件，其中該接觸有助於藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導T細胞或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞或NK細胞。在一些實施例中，T細胞或NK細胞可來自個體。在一些實施例中，T細胞活化元件可經膜結合。在一些實施例中，該接觸可執行範圍之低端為1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時或8小時與範圍之高端為4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、10小時、12小時、15小時、18小時、21小時及24小時之間，例如1小時與12小時之間。用於製造套組之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括本文其他處論述之態樣、實施例或子實施例中之任一者。
在另一態樣中，本文中提供一種用於治療或預防包含 非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒作為活性成分之癌症或腫瘤生長的醫藥組合物。在另一態樣中，本文中提供一種用於治療或預防包含非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之癌症或腫瘤生長的輸液組合物。醫藥組合物或輸液組合物之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括上文或本文中其他處所論述之態樣、實施例或子實施例中之任一者。
經基因方式修飾之T細胞及NK細胞
在本文之方法及組合物之實施例中，產生本身為本發明之單獨態樣的經基因方式修飾之淋巴球。此類經基因方式修飾之淋巴球可為經轉導之淋巴球。在一個態樣中，本文提供經基因方式修飾之T細胞或NK細胞，其中T細胞或NK細胞經經基因方式修飾以表現第一工程化信號傳導多肽。在一些實施例中，第一工程化信號傳導多肽可為淋巴增殖性元件或包括抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域之CAR。在一些實施例中，T細胞或NK細胞可進一步包括可為CAR或淋巴增殖性元件之第二工程化信號傳導多肽。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可為嵌合淋巴增殖性元件。在一些實施例中，T細胞或NK細胞可進一步包括表面上之假型化元件。在一些實施例中，T細胞或NK細胞可進一步包括表面上之活化元件。經基因方式修飾之T細胞或NK細胞之CAR、淋巴增殖性元件、假型化元件及活化元件可包括本文揭示之態樣、實施例或子實施例中之任一者。在說明性實施例中，活化元件可為抗CD3 scFvFc。
本文提供之一些態樣包括根據方法藉由轉導休眠T細胞及/或休眠NK細胞製成之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞，該方法包含使休眠T細胞及/或休眠NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病 毒顆粒離體接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件及在其表面上之膜結合T細胞活化元件，其中該接觸有助於藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，且其中該接觸執行範圍之低端為1小時、2小時、3小時、4小時或6小時與範圍之高端為4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、18小時、20小時或24小時之間，例如1小時與12小時之間。
在一些實施例中，經基因方式修飾之淋巴球為已經基因方式修飾以表現包含至少一種淋巴增殖性元件之第一工程化信號傳導多肽及/或包含嵌合抗原受體之第二工程化信號傳導多肽的淋巴球，諸如T細胞或NK細胞，該嵌合抗原受體包括抗原特異性靶向區(ASTR)，跨膜域及胞內活化域。在本文態樣中之任一者的一些實施例中，NK細胞為NKT細胞。NKT細胞為表現CD3且通常共表現αβ T細胞受體且亦表現通常與NK細胞相關之多種分子標記物(NK1.1或CD56)的子組。
本發明之經基因方式修飾之淋巴球具有已藉由重組DNA方法引入至淋巴球中的異源核酸序列。舉例而言，在用於轉導本文所提供之淋巴球的方法期間將說明性實施例中之異源序列插入至淋巴球中。異源核酸發現於淋巴球內，且在一些實施例中經整合或未整合至經基因方式修飾之淋巴球的基因組中。
在說明性實施例中，將異源核酸整合至經基因方式修飾之淋巴球的基因組中。在說明性實施例中，使用利用重組反轉錄病毒顆粒之本文所提供之用於轉導淋巴球的方法來產生此類淋巴球。此類重組反轉錄病毒顆粒可包括編碼嵌合抗原受體之聚核苷酸，該嵌合 抗原受體通常包括至少一個抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在本發明之其他部分中，本文提供非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒及在非複製勝任型反轉錄病毒顆粒之基因組中編碼之聚核苷酸的各種實施例，該非複製勝任型反轉錄病毒顆粒可用以產生本身形成本發明之另一態樣的經基因方式修飾之淋巴球。
本發明之經基因方式修飾之淋巴球可在體外分離。舉例而言，此類淋巴球可發現於如本文所提供之用於離體轉導之介質及其他溶液中。淋巴球可以未經基因方式修飾之形式存在於以本文所提供之方法自個體收集之血液中，接著在轉導方法期間經基因方式修飾。經基因方式修飾之淋巴球可在其經基因方式修飾之後在其經引入或再引入至個體之後發現於個體內部。經基因方式修飾之淋巴球可為休眠T細胞或休眠NK細胞，或經基因方式修飾之T細胞或NK細胞可以主動分裂，尤其在其表現在如本文所揭示之轉導之後經插入至T細胞或NK細胞中之核酸中所提供之功能元件中的一些之後。
在一個態樣中，本文提供經轉導及/或經基因方式修飾之T細胞或NK細胞，其包含重組聚核苷酸，該重組聚核苷酸在其基因組中包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，該等轉錄單元表現本發明之態樣及實施例中之任一者中提供之功能元件中之一或多者。舉例而言，一或多個轉錄元可表現CAR，其可包括本文所提供之CAR元件中之任一者，諸如ASTR(作為非限制性實例，為MBR-ASTR)、跨膜域及胞內信號傳導域，且可以進一步包括作為非限制性實例之調節域。此外，本文提供在經轉導及/或經基因方式修飾之T細胞或NK細胞內表現之一或多個功能元件、淋巴增殖性元件中之一或多者，例如組成性活性IL-7受體 突變體或不為抑制性RNA分子(例如miRNA或shRNA)之其他淋巴增殖性元件、識別域及/或消除域。
在一個態樣中，本文提供經基因方式修飾之T細胞或NK細胞，其包含：a. 針對一或多種RNA靶標之一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子；及b. 嵌合抗原受體(CAR)，其包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，及/或編碼針對一或多種RNA靶標之抑制性RNA分子及CAR的核酸，其中該一種(例如兩種)或更多種抑制性RNA分子及CAR或編碼其之核酸編碼由T細胞及/或NK細胞之基因修飾的核酸序列編碼或為T細胞及/或NK細胞之基因修飾的核酸序列。
經基因方式修飾之T細胞或NK細胞可為經基因方式修飾之T細胞群及/或NK細胞群，其包括針對一或多種RNA靶標之一種(例如兩種)或更多種抑制性RNA分子；及CAR。
在緊接以上T細胞或NK細胞包含一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子及CAR或編碼其之核酸的態樣之一些實施例中，針對可包括作為CAR之一部分或可與淋巴增殖性元件一起表現或用以控制淋巴增殖性元件的元件，可包括本文所提供之具體實施例中之任一者。
在緊接以上T細胞或NK細胞包含一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子及CAR或編碼其之核酸的態樣之一些實施例中，CAR為微環境限制性生物(MRB)-CAR及/或經基因方式修飾之T細胞或NK細胞可進一步包括不為抑制性RNA分子之至少一種淋巴 增殖性元件及/或編碼淋巴增殖性元件之核酸。在此類實施例中，淋巴增殖性元件由對T細胞及/或NK細胞之基因修飾之核酸序列編碼。在此類實施例中，可使用及/或編碼本文所揭示之淋巴增殖性元件中之任一者。舉例而言，至少一種淋巴增殖性元件可為組成性活性之IL-7受體。
在緊接以上T細胞或NK細胞包含一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子及CAR或編碼其之核酸的態樣之一些實施例中，該抑制性RNA分子為miRNA或shRNA之前體。在此態樣之一些實施例中，該一種(例如兩種)或更多種抑制性RNA分子為多順反子的。在此態樣之一些實施例中，該一種(例如兩種)或更多種抑制性RNA分子針對相同的或(在說明性實施例中)不同的RNA靶標。在此態樣之一些實施例中，該一種(例如兩種)或更多種抑制性RNA分子中之大部分或全部降低了內源性TCR之表現。
在緊接以上T細胞或NK細胞包含一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子及CAR或編碼其之核酸的態樣之一些實施例中，該RNA靶標為自選自由以下組成之群之基因轉錄的mRNA：PD-1、CTLA4、TCR α、TCR β、CD3 ζ、SOCS、SMAD2、miR-155靶標、IFN γ、cCBL、TRAIL2、PP2A，及ABCG1。在此態樣之一些實施例中，該一種(例如兩種)或更多種抑制性RNA分子中之至少一者為miR-155。
在緊接以上T細胞或NK細胞包含一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子及CAR或編碼其之核酸的態樣之一些實施例中，CAR之ASTR為MRB ASTR及/或CAR之ASTR結合至與腫瘤相關之抗原。此外，在以上態樣之一些實施例中，第一核酸序列可操作 地連接至核糖開關，該核糖開關例如能夠結合核苷類似物，且在說明性實施例中為抗病毒藥物，例如阿昔洛韋。
在本文揭示之方法及組合物中，工程化信號傳導多肽之表現由控制元件調節，且在一些實施例中，該控制元件為包含核糖開關之聚核苷酸。在某些實施例中，核糖開關能夠結合核苷類似物，且當核苷類似物存在時，表現工程化信號傳導多肽中之一者或兩者。
本文所揭示之經基因方式修飾之淋巴球亦可在其表面上具有多肽，該等多肽在本文所提供之轉導方法期間為非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之融合之殘留物。此類多肽可包括活化元件、假型化元件及/或包括細胞介素之一或多種融合多肽。
在一個態樣中，本文提供表現針對一或多種RNA靶標一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子及嵌合抗原受體或CAR的經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，如本文所揭示。在一些實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞進一步表現本文所揭示之不為抑制性RNA分子之至少一種淋巴增殖性元件。在某些實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞亦表現控制一或多種抑制性RNA分子、CAR及/或不為抑制性RNA分子之至少一種淋巴增殖性元件之表現的一或多種核糖開關。在一些實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞表現兩種至10種抑制性RNA分子。在其他實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞表現兩種至六種抑制性RNA分子。在說明性實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞表現四種抑制性RNA分子。
核酸
本發明提供編碼本發明之多肽的核酸。在一些實施例 中，核酸將為DNA，包括例如重組性表現載體。在一些實施例中，核酸將為RNA，例如體內合成的RNA。
在一些情況下，核酸提供例如在哺乳動物細胞中產生本發明之多肽。在其他情況下，個體核酸提供編碼本發明之多肽的核酸的擴增。
編碼本發明之多肽的核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件，例如啟動子及增強子等。
適合之啟動子及增強子元件為此項技術中已知的。為在細菌細胞中表現，適合之啟動子包括(但不限於)lacl、lacZ、T3、T7、gpt、λ P及trc。為在真核細胞中表現，適合之啟動子包括(但不限於)輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子及增強子元件；巨細胞病毒立即早期啟動子；單純疱疹病毒胸苷激酶啟動子；早期及晚期SV40啟動子；反轉錄病毒之長末端重複中存在之啟動子；小鼠金屬硫蛋白-I啟動子；及此項技術中已知的各種組織特異性啟動子。
適合之可逆啟動子(包括可逆誘導型啟動子)為此項技術中已知的。此類可逆啟動子可分離且衍生自許多生物體，例如真核生物及原核生物。對用於第二生物中之衍生自第一生物(例如第一原核生物及第二真核生物、第一真核生物及第二原核生物，等)的可逆啟動子之修飾為此項技術中已知的。此類可逆啟動子，及基於此類可逆啟動子但亦包含其他控制蛋白質之系統包括(但不限於)醇調節啟動子(例如醇去氫酶I(alcA)基因啟動子、對醇反式活化子蛋白質具有反應性之啟動子(AlcR)等)、四環素調節之啟動子(例如包括TetActivators、TetON、TetOFF等之啟動子系統)、類固醇調節之啟動子(例如大鼠糖皮質激素受體啟動子系統、人類雌性激素受體啟動子 系統、類視黃素啟動子系統、甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素啟動子系統、米非司酮啟動子系統等)、金屬調節之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子系統等)、相關病原調節之啟動子(例如水楊酸調節之啟動子、乙烯調節之啟動子、苯并噻二唑調節之啟動子等)、溫度調節在啟動子(例如熱休克可誘導啟動子(例如HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等))、光調節之啟動子、合成可誘導啟動子，及類似者。
在一些情況下，含有適合之啟動子的基因座或構築體或轉基因經由對可誘導系統之誘導來進行不可逆轉換。用於誘導不可逆轉換之適合之系統為此項技術中公知的，例如，不可逆轉換之誘導可利用Cre-lox介導之重組(參見例如Fuhrmann-Benzakein等人，PNAS(2000)28：e99，其揭示內容以引用之方式併入本文)。此項技術中已知的重組酶、內切核酸酶、連接酶、重組位點等之任何適合之組合可用於產生不可逆轉換之啟動子。本文其他處描述之用於執行位點特異性重組之方法、機制及要求用於產生不可逆轉換之啟動子且為此項技術中所熟知的，參見例如Grindley等人(2006)Annual Review of Biochemistry,567-605及Tropp(2012)Molecular Biology(Jones & Bartlett Publishers,Sudbury,MA)，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些情況下，啟動子為CD8細胞特異性啟動子、CD4細胞特異性啟動子、嗜中性粒細胞特異性啟動子或NK特異性啟動子。舉例而言，可使用CD4基因啟動子，參見例如Salmon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7739及Marodon等人(2003)Blood 101：3416。作為另一實例，可使用CD8基因啟動子。NK細胞特異性表現可藉由使用Neri(第46頁)啟動子來實現；參見例如Eckelhart等人 (2011)Blood 117：1565。
在一些實施例中，例如，為在酵母細胞中表現，適合之啟動子為組成性啟動子，諸如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子及類似者；或為可調節啟動子，諸如GALI啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PH05啟動子、CUP1啟動子、GAL7啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子及AOX1(例如用於畢赤酵母中)。對合適之載體及啟動子的選擇在熟習此項技術者之水準之內。
用於原核宿主細胞中之適合之啟動子包括(但不限於)噬菌體T7RNA聚合酶啟動子、trp啟動子、lac操縱子啟動子、雜合啟動子(例如lac/tac雜合啟動子、tac/trc雜合啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子)；trc啟動子；tac啟動子及類似者；araBAD啟動子；經體內調節之啟動子，諸如ssaG啟動子或相關啟動子(參見例如美國專利公開案第20040131637號)、pagC啟動子(Pulkkinen及Miller,J.Bacterial.,1991：173(1)：86-93；Alpuche-Aranda等人，PNAS,1992；89(21)：10079-83)、nirB啟動子(Harborne等人(1992)Mal.Micro.6：2805-2813)，及類似者(參見例如Dunstan等人(1999)Infect.Immun.67：5133-5141；McKelvie等人(2004)Vaccine 22：3243-3255；及Chatfield等人(1992)Biotechnol.10：888-892)；σ70啟動子，例如共有σ70啟動子(參見例如Genome Accession第AX798980號、第AX798961號及第AX798183號)；固定相啟動子，例如dps啟動子、spv啟動子及類似者；衍生自致病島SPI-2之啟動子(參見例如WO96/17951)；actA啟動子(參 見例如Shetron-Rama等人(2002)Infect.Immun.70：1087-1096)；rpsM啟動子(參見例如Valdivia及Falkow(1996).Mal.Microbial.22：367)；tet啟動子(參見例如Hillen,W.及Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.及Heinemann,U.(編)，Topics in Molecular and Structural Biology,Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan，London，UK，第10卷，第143至162頁)；SP6啟動子(參見例如Melton等人(1984)Nucl.Acids Res.12：7035)；及類似者。用於諸如大腸桿菌之原核生物之適合的強啟動子包括(但不限於)Trc、Tac、T5、T7及Pλ。用於細菌宿主細胞之操縱子之非限制性實例包括乳糖啟動子操縱子(當與乳糖接觸時，Laci抑制蛋白改變構象，從而防止Laci抑制蛋白與操縱子結合)、色胺酸啟動子操縱子(當與色胺酸複合時，TrpR抑制蛋白具有結合操縱子之構象；在不存在色胺酸之情況下，TrpR抑制蛋白具有不結合操縱子之構象)及tac啟動子操縱子(參見例如deBoer等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。
編碼本發明之多肽的核苷酸序列可存在於表現載體及/或選殖載體中。編碼兩個單獨多肽之核苷酸序列可在相同或不同之載體中選殖。表現載體可包括選擇性標記、複製源及提供載體之複製及/或維持之其他部件。適合之表現載體包括例如質粒、病毒載體，及類似者。
大量適合之載體及啟動子為熟習此項技術者已知；許多在商業上可用於產生個體重組構築體。借助於實例提供以下細菌載體：pBs、phagescript、PsiXl74、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,CA，USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540，及pRIT5(Pharmacia,Uppsala， Sweden)。借助於實例提供以下真核生物載體：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG，及pSVL(Pharmacia)。
表現載體通常具有位於啟動子序列附近之方便限制位點，以提供編碼異源蛋白質之核酸序列之插入。可存在在表現宿主中操作之可選擇標記。
如上所述，在一些實施例中，編碼本發明之多肽之核酸在一些實施例中將為RNA，例如體外合成之RNA。體外合成RNA之方法為此項技術中已知的；可使用任何已知的方法來合成包括編碼本發明之多肽之核苷酸序列的RNA。將RNA引入至宿主細胞中之方法為此項技術中已知的。參見例如Zhao等人(2010)Cancer Res.15：9053。將包括編碼本發明之多肽之核苷酸序列的RNA引入至宿主細胞中可在體外或離體或體內進行。舉例而言，可藉由包含編碼本發明之多肽之核苷酸序列的RNA對宿主細胞(例如，NK細胞、細胞毒性T淋巴球等)進行體外或離體電穿孔。
包括聚核苷酸、核酸序列及/或轉錄單元及/或包括其之載體的各種態樣及實施例進一步包括Kozak類型序列(本文中亦稱為Kozak相關序列)、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)及二重終止密碼子或三重終止密碼子中之一或多者，其中二重終止密碼子或三重終止密碼子之一或多個終止密碼子定義自一或多個轉錄單元之至少一者的讀取終止。在某些實施例中，聚核苷酸、核酸序列及/或轉錄單元及/或包括其之載體進一步包括在一或多個轉錄單元中之至少一者之起始密碼子上游之10個核苷內具有5’核苷酸的Kozak類型序列。Kozak測定699脊椎動物mRNA之Kozak共有序列 (GCC)GCCRCCATG(SEQ ID NO：530)，其中R為嘌呤(A或G)(Kozak.Nucleic Acids Res.1987年10月26日；15(20)：8125-48)。在一個實施例中，Kozak類型序列為或包括CCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO：515)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：516)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：517)或GCCGCCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO：532)(其中圓括號中之核苷酸表示視情況選用之核苷酸及指示該位置處之不同可能的核苷酸之由斜線隔開之核苷酸，例如視核酸是否為DNA或RNA而定)。在包括AU/TG起始密碼子之此等實施例中，可將A視為位置0。在某些說明性實施例中，-3及+4處之核苷酸相同，例如-3及+4可為G。在另一實施例中，Kozak類型序列包括ATG上游之第3位置中之A或G，其中ATG為起始密碼子。在另一實施例中，Kozak類型序列包括AUG上游之第3位置中之A或G，其中AUG為起始密碼子。在一說明性實施例中，Kozak類型序列為(GCC)GCCRCCATG(SEQ ID NO：530)，其中R為嘌呤(A或G)。在一說明性實施例中，Kozak類型序列為GCCGCCACCAUG(SEQ ID NO：518)。在另一實施例中，其可與包括Kozak類型序列之前述實施例及/或包括三重密碼子之以下實施例組合，聚核苷酸包括WPRE元件。WPRE表徵於技術(參見例如(Higashimoto等人，Gene Ther.2007；14：1298))中且例示於本文之實例11及實例12中。在一些實施例中，WPRE元件位於一或多個轉錄單元之終止密碼子之3’及聚核苷酸之3’LTR的5’處。在另一實施例中，其可與前述實施例(亦即，其中聚核苷酸包括Kozak類型序列之實施例及/或其中聚核苷酸包括WPRE之一實施例)中之一者或兩者組合，一或多個轉錄單元經二重終止密碼子或三重終止密碼子之一或多個終止密碼子終止，其中二重終止密碼子包括第一讀取框中之第一終止密碼 子及第二讀取框中之第二終止密碼子或具有第二終止密碼子之框中之第一終止密碼子，且其中三重終止密碼子包括第一讀取框中之第一終止密碼子、第二讀取框中之第二終止密碼子及第三讀取框中之第三終止密碼子或具有具有第二終止密碼子或第三終止密碼子之框中之第一終止密碼子。
本文之三重終止密碼子包括三個終止密碼子，一個在各讀取框中，在彼此之10個核苷酸內，且較佳具有重疊序列，或在相同讀取框中之三個終止密碼子，較佳在連續密碼子處。二重終止密碼子意謂兩個終止密碼子，各自在不同讀取框中，在彼此之10個核苷酸內，且較佳具有重疊序列，或在相同讀取框中之兩個終止密碼子，較佳在連續密碼子處。
在本文揭示之方法及組合物中之一些中，使用不利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法執行DNA至PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞中之引入及視情況DNA至宿主細胞基因組中之併入。舉例而言，可利用其他病毒載體，諸如來源於腺病毒、腺病毒相關病毒或1型單純疱疹病毒之彼等，作為非限制實例。
在一些實施例中，本文提供之方法可包括用非病毒載體轉染及/或轉導靶細胞。在利用非病毒載體轉染靶細胞的本文揭示之實施例中之一者中，可使用包括電穿孔、核轉染、脂質體調配物、脂質、樹狀體、陽離子聚合物(諸如聚(乙烯亞胺)(PEI)及聚(1-賴胺酸)(PLL))、奈米顆粒、細胞穿透肽、顯微注射及/或未整合慢病毒載體之方法將非病毒載體(包括裸DNA)引入至靶細胞(諸如PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞)中。在一些實施例中，可將DNA引入至具有脂質體及魚精蛋白的複合物中之靶細胞(諸如PBMC、B細胞、T細胞 及/或NK細胞)中。可用於本文提供之方法之實施例中的用於離體轉染及/或轉導T細胞及/或NK細胞之其他方法在此項技術中已知(參見例如Morgan及Boyerinas,Biomedicines.2016年4月20日；4(2).pii：E9，其以全文引用之方式併入本文中)。
在本文提供之方法的一些實施例中，可藉由將靶DNA共轉染、共核轉染或共電穿孔為在所關注基因之5’及3’末端含有轉座子ITR片段之質粒或將轉座酶載體系統共轉染、共核轉染或共電穿孔為DNA或mRNA或蛋白質或位點特異性絲胺酸重組酶(諸如將所關注基因整合至人類基因組中之假attP位點的phiC31)而使用基於轉座子之載體系統將DNA整合至基因組中，在此情況下，DNA載體可含有34bp至40bp attB位點，其為重組酶之識別序列(Bhaskar Thyagarajan 等人.Site-Specific Genomic Integration in Mammalian Cells Mediated by Phage φC31 Integrase,Mol Cell Biol.2001年6月；21(12)：3926-3934)且經重組酶共轉染。對於T細胞及/或NK細胞，可用於本文提供之某些方法中之基於轉座子之系統利用呈DNA、mRNA或蛋白質形式之Sleeping Beauty DNA載體系統(參見例如美國專利第6,489,458號及美國專利申請案第15/434,595號，其以全文引用之方式併入本文中)、PiggyBac DNA載體系統(參見例如Manuri等人，Hum Gene Ther.2010年4月；21(4)：427-37，其以全文引用之方式併入本文中)或Tol2轉座子系統(參見例如Tsukahara等人，Gene Ther.2015年2月；22(2)：209-215，其以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，基於轉座子之載體系統之轉座子及/或轉座酶在引入至T細胞及/或NK細胞中之前可經產生作為微環DNA載體(參見例如Hudecek等人，Recent Results Cancer Res.2016；209：37-50及Monjezi等人，Leukemia.2017年1 月；31(1)：186-194，其以全文引用之方式併入本文中)。亦可藉由添加與靶位點之整合5’及3’同源之50bp至1000bp同源臂使用CRISPR或TALEN介導之整合將CAR或淋巴增殖性元件整合至基因組中之所定義及特異性位點中(Jae Seong Lee等人.Scientific Reports 5，文章編號：8572(2015)，由CRISPR/Cas9及同源定向之DNA修復路徑介導之CHO細胞中之位點特異性整合)。CRISPR或TALEN提供特異性及基因靶向之裂解且構築體將經由同源介導末端接合整合(Yao X等人.Cell Res.2017年6月；27(6)：801-814.doi：10.1038/cr.2017.76.2017年5月19日電子版)。CRISPR或TALEN可經靶質粒轉染為DNA、mRNA或蛋白質。
封裝細胞
本發明提供封裝細胞及為封裝細胞株之哺乳動物細胞株，其產生以基因方式修飾靶標哺乳動物細胞及其之哺乳動物細胞株的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。在說明性實施例中，封裝細胞包含核酸序列，其編碼非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之可封裝RNA基因組、REV蛋白、gag多肽、pol多肽及假型化元件。
適合之哺乳動物細胞包括原代細胞及永生化細胞株。適合之哺乳動物細胞株包括人類細胞株、非人類靈長類細胞株、嚙齒動物(例如小鼠、大鼠)細胞株，及類似者。適合之哺乳動物細胞株包括(但不限於)HeLa細胞(例如，美國模式培養物保藏所(ATCC)第CCL-2號)、CHO細胞(例如ATCC第CRL9618號、第CCL61號、第CRL9096號)、HEK293細胞(例如，ATCC第CRL-1573號)、適應懸浮之HEK293細胞、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例如，ATCC第CRL-1658號)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如，ATCC第CCL1O號)、PC12細胞(ATCC 第CRL1721號)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC第CRL1651號)、RAT1細胞、小鼠L細胞(ATCC第CCLI.3號)、人類胚胎腎(HEK)細胞(ATCC第CRL1573號)、HLHepG2細胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK細胞株(例如，NKL、NK92及YTS)，及類似者。
在一些情況下，細胞並非永生化細胞株，而係自個體獲得之細胞或離體細胞(例如，原代細胞)。舉例而言，在一些情況下，細胞為自個體獲得之免疫細胞。作為另一實例，細胞為自個體獲得之幹細胞或祖細胞。在包括B細胞、T細胞或NK細胞之本文提供之實施例及態樣中之任一者中，細胞可為自體細胞或其可為異體細胞(在本文中亦稱為異源細胞)。在一些實施例中，異源細胞可為以基因方式工程化之異源細胞。異體細胞(諸如異源T細胞)及用於以基因方式工程化異體細胞之方法在此項技術中已知。在一些實施例中，異體細胞可為永生化細胞。在其中異體細胞為T細胞之一些實施例中，T細胞經基因方式工程化，使得其T細胞受體鏈中之至少一者不起作用或其至少部分缺失。在一些實施例中，異體細胞可經修飾，使得其缺失所有或部分B2微小球蛋白。在其中異體細胞用於本文之方法中之一些實施例中，淋巴增殖性元件及/或CLE可起作用以減少為實踐本發明所必需的細胞數且可有助於自個體之T細胞、B細胞或NK細胞之細胞製造。
活化免疫細胞之方法
本發明提供體外、體內或離體活化免疫細胞(在說明性實施例中，淋巴球)之方法。該方法通常涉及使免疫細胞(體外、體內或離體)與活化元件或與一或多種靶標抗原接觸，其中該免疫細胞經基因方式修飾以產生本發明之CAR(其在一些實施例中為 MRB-CAR)。在一或多種靶標抗原之存在下，CAR活化免疫細胞，由此產生經活化免疫細胞。免疫細胞包括例如細胞毒性T淋巴球、NK細胞、CD4+ T細胞、T調節(Treg)細胞，γδ T細胞、NK-T細胞、嗜中性粒細胞等。在其他實施例中，使T細胞與T細胞活化劑接觸，活化T細胞。此等方法提供於本文中且論述於本文之活化元件章節中。
將經基因方式修飾之免疫細胞(例如T淋巴球、NK細胞)與一或多種靶標抗原接觸可使由免疫細胞產生之細胞介素與在不存在一或多種靶標抗原時由免疫細胞所產生之細胞介素之量相比增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約75%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍，或大於10倍。產量可增加之細胞介素包括但不限於IL-2及IFN-γ。
將經基因方式修飾之免疫細胞(例如細胞毒性T淋巴球)與AAR接觸可使細胞毒性細胞之細胞毒性活性與在不存在一或多種靶標抗原時細胞毒性細胞之細胞毒性活性相比增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約75%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍，或大於10倍。
將經基因方式修飾之免疫細胞(例如細胞毒性T淋巴球)與一或多種靶標抗原接觸可使細胞毒性細胞之細胞毒性活性與在不存在一或多種靶標抗原時細胞毒性細胞之細胞毒性活性相比增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約75%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍，或大於10倍。
在其他實施例中，例如，取決於宿主免疫細胞，使經基因方式修飾之宿主細胞與抗原接觸可增加或減少細胞增殖、細胞存活、細胞死亡，及類似者。
抑制性RNA分子
在某些實施例中，本文提供的本發明之方法包括抑制在T細胞及/或NK細胞中表現之一或多種內源基因之表現。本文提供之方法說明製備重組反轉錄病毒顆粒之能力，該等重組反轉錄病毒顆粒表現一或多種(且在說明性實施例中，兩種或更多種)抑制性RNA分子，諸如可用於此類方法之miRNA或shRNA。事實上，本文提供之方法說明此類抑制性RNA分子可在包括例如Ef1a內含子之內含子內經編碼。此利用本方法教示以使可包括於可封裝反轉錄病毒基因組中之功能元件最大化，以克服先前教示之缺點，且使此類重組反轉錄病毒顆粒在過繼性T細胞療法中之有效性最大化。
在一些實施例中，抑制性RNA分子包括與彼此部分或完全互補之5’鏈及3’鏈(在一些實例中，有義鏈及反義鏈)，使得該兩個鏈能夠在細胞環境內形成18至25個核苷酸之RNA雙螺旋。5’鏈長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸，且3’鏈長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。5’鏈及3’鏈可為相同或不同之長度，且RNA雙螺旋可包括一或多個錯配。替代地，RNA雙螺旋不具有錯配。
包括於本文所提供之組合物及方法中之抑制性RNA分子在某些說明性實施例中不存在於及/或不天然表現在其插入其基因組之T細胞中。在一些實施例中，抑制性RNA分子為miRNA或shRNA。在一些實施例中，當在本文或優先權申請中提及編碼siRNA 的核酸，尤其在核酸為基因組之一部分的上下文中，將理解，此類核酸能夠在由DICER處理之細胞中形成諸如miRNA或shRNA之siRNA前體，以形成通常與RISK複合物相互作用或成為RISK複合物之一部分的雙鏈RNA。在一些實施例中，本發明之一實施例中之抑制性分子可為miRNA之前體(諸如Pri-miRNA或Pre-miRNA)，或shRNA之前體。在一些實施例中，miRNA或shRNA為人工衍生的(亦即人工miRNA或siRNA)。在其他實施例中，抑制性RNA分子為經處理成siRNA之dsRNA(經轉錄或人工引入)或siRNA本身。在一些實施例中，miRNA或shRNA具有在自然界中未發現之序列，或具有在自然界中未發現之至少一個功能區段，或具有在自然界中未發現之功能區段的組合。
在一些實施例中，抑制性RNA分子以一連串或多重排列方式置於第一核酸分子中，使得多個miRNA序列同時自單個多順反子miRNA轉錄物表現。在一些實施例中，抑制性RNA分子可利用非功能性連接子序列直接或間接地與彼此連接。在一些實施例中，連接子序列長度可在5個核苷酸與120個核苷酸之間，且在一些實施例中可在10個核苷酸與40個核苷酸之間，作為非限制性實例。在說明性實施例中，編碼一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA之第一核酸序列及編碼CAR(例如MRB-CAR)之第二核酸序列可操作地連接至具有組成型活性或可在T細胞或NK細胞中誘導之啟動子。因此，該等抑制性RNA分子(例如miRNA)以及CAR以多順反子之方式表現。另外，功能性序列可自同一轉錄物表現。舉例而言，本文所提供之並非抑制性RNA分子之淋巴增殖性元件中之任一者可自與CAR及一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子相同之轉錄物表達。
在一些實施例中，抑制性RNA分子為天然存在之 miRNA，諸如但不限於miR-155。替代地，可產生人造miRNA，其中能夠形成雜交/互補的莖結構且針對靶標RNA之序列置於包括用於微小RNA處理之微小RNA側翼序列及環之miRNA框架中，且可視情況衍生自與莖序列之間的側翼序列相同之天然存在的miRNA。因此，在一些實施例中，抑制性RNA分子自5’至3’定向包括：5’微小RNA側翼序列、5’莖、環、與該5’莖部分或完全互補之3’莖，及3’微小RNA側翼序列。在一些實施例中，5’莖(本文中亦稱為5’臂)長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，3’莖(本文中亦稱為3’臂)長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，環之長度為3至40、10至40、20至40或20至30個核苷酸，且在說明性實施例中，環之長度可為18、19、20、21或22個核苷酸。在一些實施例中，一個莖比另一莖長兩個核苷酸。較長莖可為5’莖或3’莖。
在一些實施例中，5’微小RNA側翼序列、3’微小RNA側翼序列或兩者均衍生自天然存在之miRNA，諸如但不限於miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在某些實施例中，5’微小RNA側翼序列、3’微小RNA側翼序列或兩者均衍生自miR-155，例如來自小家鼠或智人之miR-155。將合成的miRNA莖環插入至miR-155框架(亦即5’微小RNA側翼序列、3’微小RNA側翼序列及miRNA5’莖與3’莖之間的環)為此項技術中之一般技術者已知的(Chung，K.等人2006.Nucleic Acids Research.34(7)：e53；US 7,387,896)。SIBR(合成抑制性BIC衍生之RNA)序列(Chung等人.2006，同前文獻)例如具有由小家鼠BIC非編碼mRNA(Genbank ID AY096003.1)之核苷酸134至161(SEQ ID NO：256)組成之5’微小RNA 側翼序列及由小家鼠BIC非編碼mRNA(Genbank ID AY096003.1)之核苷酸223至283組成之3’微小RNA側翼序列。在一項研究中，SIBR序列經修飾(eSIBR)以增強miRNA之表現(Fowler，D.K.等人.2015.Nucleic acids Research 44(5)：e48)。在本發明之一些實施例中，miRNA可置於SIBR或eSIBR miR-155框架中。在本文之說明性實施例中，miRNA置於miR-155框架中，其包括由SEQ ID NO：256展示之miR-155之5’微小RNA側翼序列，由SEQ ID NO：260展示之3’微小RNA側翼序列(小家鼠BIC非編碼mRNA之核苷酸221至265)；及經修飾之miR-155環(SEQ ID NO：258)。因此，在一些實施例中，miR-155之5’微小RNA側翼序列為SEQ ID NO：256或其功能性變體，諸如與SEQ ID NO：256相同的長度，或為SEQ ID NO：256之長度的95%、90%、85%、80%、75%或50%或長度為100個核苷酸或更少、95個核苷酸或更少、90個核苷酸或更少、85個核苷酸或更少、80個核苷酸或更少、75個核苷酸或更少、70個核苷酸或更少、65個核苷酸或更少、60個核苷酸或更少、55個核苷酸或更少、50個核苷酸或更少、45個核苷酸或更少、40個核苷酸或更少、35個核苷酸或更少、30個核苷酸或更少，或25個核苷酸或更少；且與SEQ ID NO：256至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致的序列。在一些實施例中，miR-155之3’微小RNA側翼序列為SEQ ID NO：260或其功能性變體，例如與SEQ ID NO：260相同的長度，或為SEQ ID NO：260之長度的95%、90%、85%、80%、75%，或50%或長度為100個核苷酸或更少、95個核苷酸或更少、90個核苷酸或更少、85個核苷酸或更少、80個核苷酸或更少、75個核苷酸或更少、70個核苷酸或更少、65個核苷酸或更少、60個核苷酸或更少、55個核苷酸或更少、50個核苷酸或更少、45個核苷酸或更少、40 個核苷酸或更少、35個核苷酸或更少、30個核苷酸或更少，或25個核苷酸或更少；且與SEQ ID NO：260至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致的序列。然而，作用以在插入其中的miRNA之細胞內提供適當處理以形成能夠抑制其結合之靶標mRNA之表現的成熟miRNA之任何已知的微小RNA框架涵蓋於本發明中。
在一些實施例中，由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之聚核苷酸中的核酸序列編碼之抑制性RNA分子中的至少一者、至少兩者、至少三者，或至少四者具有呈5’至3’定向之以下排列：5’微小RNA側翼序列、5’莖、環、與該5’莖部分或完全互補之3’莖，及3’微小RNA側翼序列。在一些實施例中，所有抑制性RNA分子具有呈5’至3’定向之以下排列：5’微小RNA側翼序列、5’莖、環、與該5’莖部分或完全互補之3’莖，及3’微小RNA側翼序列。如本文所揭示，抑制性RNA分子可由一或多個連接子序列分隔開，其在一些實施例中沒有除在該等抑制性RNA分子之間作為間隔子之外的功能。
在一些實施例中，當包括兩個或更多個抑制性RNA分子(在一些實例中，包括1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個抑制性RNA分子)時，此等抑制性RNA分子針對相同或不同的RNA靶標(諸如自相關基因轉錄的mRNA)。在說明性實施例中，第一核酸序列中包括2個與10個之間、2個與8個之間、2個與6個之間、2個與5個之間、3個與5個之間或3個與6個之間的抑制性RNA分子。在一說明性實施例中，第一核酸序列中包括四個抑制性RNA分子。
在一些實施例中，RNA靶標為自由T細胞表現之基因轉錄之mRNA，該等mRNA諸如(但不限於)：PD-1(防止失活)； CTLA4(防止失活)；TCRa(安全地防止自體免疫)；TCRb(安全-防止自體免疫)；CD3Z(安全-防止自體免疫)；SOCS1(防止失活)；SMAD2(防止失活)；miR-155靶標(促進活化)；IFN γ(減少CRS)；cCBL(延長信號傳導)；TRAIL2(防止死亡)；PP2A(延長信號傳導)；ABCG1(藉由限制膽固醇之清除來增加膽固醇微含量)。在說明性實例中，在本文提供的方法中插入至T細胞至基因組中的miRNA針對靶標，使得T細胞之增殖經誘導且/或增強且/或凋亡經抑制。
在一些實施例中，RNA靶標包括編碼T細胞受體(TCR)複合物之組份的mRNA。此類組分可包括用於產生及/或形成T細胞受體複合物之組分及/或用於T細胞受體複合物之恰當功能之組分。因此，在一個實施例中，兩種或更多種抑制性RNA分子中之至少一者使得TCR複合物(在說明性實施例中，T細胞之一或多種內源性TCR複合物)之形成及/或功能降低。T細胞受體複合物包括TCRa、TCRb、CD3d、CD3e、CD3g及CD3z。已知此等組分具有複雜的相互依賴性，使得任何一個子單元之表現之降低將導致複合物的表現及功能降低。因此，在一個實施例中，RNA靶標為表現與經轉導T細胞內源性之TCRa、TCRb、CD3d、CD3e、CD3g及CD3z中之一或多者的mRNA。在某些實施例中，RNA靶標為自T細胞之內源性TCRα或TCRβ基因轉錄之mRNA，該T細胞之基因組包含編碼一或多個miRNA之第一核酸序列。在說明性實施例中，RNA靶標為自TCRα基因轉錄之mRNA。在某些實施例中，可將針對自具有相似預期效用之靶基因轉錄的mRNA的抑制性RNA分子組合。在其他實施例中，可將針對自具有互補效用之靶基因轉錄的靶標mRNA的抑制性RNA分子組合。在一些實施例中，兩種或更多種抑制性RNA分子針對自靶基因CD3Z、 PD1、SOCS1及/或IFN γ轉錄之mRNA。
在本文提供之一些實施例中，兩種或更多種抑制性RNA分子可在單個內含子中遞送，諸如但不限於EF1-αa內含子A。可用於攜帶本發明之miRNA的內含子序列包括在T細胞內處理之任何內含子。如本文所示，此類排列之一個優勢在於，此有助於以本文提供之方法使miRNA序列包括於用於將此類序列遞送至T細胞之反轉錄病毒基因組之大小內的能力最大化。當第一核酸序列之內含子包括用以以多順反子方式表現內含子、CAR序列及本文所提供之其他功能性序列之啟動子序列的全部或部分(諸如並非抑制性RNA分子之淋巴增殖性元件)時，此尤其為真。內含子之序列要求為此項技術中已知的。在一些實施例中，此類內含子處理可操作地連接至核糖開關，諸如本文所揭示之任何核糖開關。因此，核糖開關可提供用於控制第一核酸序列上之一或多個miRNA序列之表現的調節元件。因此，本文所提供之說明性實施例為針對內源性T細胞受體子單元之miRNA的組合，其中miRNA之表現由核糖開關調節，該核糖開關可為本文所論述之核糖開關中的任一者。
在一些實施例中，抑制性RNA分子可提供於可包括於相同或不同轉錄單元上之多個核酸序列上。舉例而言，第一核酸序列可編碼一或多種抑制性RNA分子，且自第一啟動子表現，且第二核酸序列可編碼一或多種抑制性RNA分子且自第二啟動子表現。在說明性實施例中，兩種或更多種抑制性RNA分子位於自單個啟動子表現之第一核酸序列上。用於表現此類miRNA之啟動子通常為在用以表現反轉錄病毒顆粒之封裝細胞中無活性的啟動子，該反轉錄病毒顆粒將其基因組中之miRNA遞送至靶標T細胞，但此類啟動子在T細胞內為組成 性活性或呈可誘導之方式的活性。啟動子可為Pol I、Pol II，或Pol III啟動子。在一些說明性實施例中，啟動子為Pol II啟動子。
特徵及商業生產方法
本發明提供多種方法及組合物，可用作科學實驗中之研究試劑及用於商業生產。此科學實驗可包括用於使用以基因方式修飾(例如轉導)本文提供之淋巴球的方法表徵淋巴球(諸如NK細胞，且在說明性實施例中，T細胞)之方法。此等方法例如可用於研究淋巴球之活化及藉由其活化使得此等細胞可轉導的詳述分子機制。此外，本文提供將用於例如作為研究工具以更好理解影響T細胞增殖及存活之因素的經基因方式修飾之淋巴球。此等經基因方式修飾之淋巴球(諸如NK細胞，且在說明性實施例中，T細胞)可此外用於商業生產，例如用於產生可經採集或測試或用於產生商業產物的某些因子，諸如生長因子及免疫調節劑。
淋巴球之科學實驗及/或特徵可包括用於分析或比較淋巴球之本文提供之態樣、實施例或子實施例中之任一者。在一些實施例中，可用包括聚核苷酸之本文提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，轉導T細胞及/或NK細胞可包括聚核苷酸，該等聚核苷酸包括編碼本發明之多肽的聚核苷酸，例如CAR、淋巴增殖性元件及/或活化元件。在一些實施例中，聚核苷酸可包括如本文其他處論述之抑制性RNA分子。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可為嵌合淋巴增殖性元件。
治療方法
本發明提供使用CAR之各種治療方法。本發明之CAR在存在與T淋巴球或NK細胞中時，可介導對靶細胞之細胞毒性。本發 明之CAR結合靶細胞上存在之抗原，從而藉由經基因方式修飾以產生CAR之T淋巴球或NK細胞介導靶細胞之殺傷。CAR之ASTR結合存在於靶細胞之表面上的抗原。
本發明提供殺傷或抑制靶細胞之生長之方法，該方法包括使經基因方式修飾以產生個體CAR之細胞毒性免疫效應細胞(例如，細胞毒性T細胞或NK細胞)接觸，使得T淋巴球或NK細胞識別存在於靶細胞之表面上之抗原，且介導對靶細胞之殺傷。
本發明提供治療患有疾病或病症之個體中之疾病或病症之方法，該方法包括：a.將包括編碼CAR之聚核苷酸序列的表現載體引入至自個體獲得之周邊血細胞中以產生經基因工程化之細胞毒性細胞；及b.向個體投予該經基因工程化之細胞毒性細胞。
在包括向個體(尤其患有或疑似患有癌症之個體)投予經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞的本文提供之方法中，該等方法可進一步包括將有效劑量之免疫核查點抑制劑遞送至個體。此核查點抑制劑遞送可在投予經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之前、之後或同時發生。免疫核查點抑制劑為已知的且各種化合物經批准且在臨床研究中。在提及一些免疫核查點抑制劑的情況下，核查點分子(其中之許多者為核查點抑制劑化合物之靶標)包括以下：
CD27. 此分子支持原生T細胞之抗原特異性擴展且對產生T細胞記憶而言為必不可少的。Celldex Therapeutics正在研究CDX-1127，其為激動抗CD27單純系抗體。
CD28. 此分子組成性地表現於幾乎所有人類CD4+ T細胞上及所有CD8 T細胞之約一半上。CD28為TGN1412『超激動劑』之靶標。
CD40. 此分子(發現於包括抗原呈現細胞之各種免疫系統細胞上)具有CD40L，另外稱為CD154，且作為其配位體瞬時表現於經活化CD4+ T細胞之表面上。抗CD40激動劑單純系抗體授權給Roche。
CD122. 已知此分子(其為介白素-2受體β子單元)增加CD8+效應T細胞之增殖。Nektar Therapeutics已研發NKTR-214，其為經CD122偏壓之免疫刺激性細胞介素。
CD137. 當此分子(亦稱為4-1BB)由CD137配位體結合時，結果為T-細胞增殖。Pieris Pharmaceuticals已研發對CD137及HER2具有雙特異性之工程化脂質運載蛋白。
OX40. 此分子(亦稱為CD134)具有作為其配位體之OX40L或CD252。如同CD27，OX40促進效應子及記憶T細胞之擴展，然而，其亦以抑止T調節細胞之分化及活性，且亦其調節細胞介素產量的能力而聞名。AstraZeneca具有三種靶向OX40之研發藥物：MEDI0562為人類化OX40激動劑、MEDI6469、鼠類OX4激動劑；及MEDI6383(OX40激動劑)。
GITR為糖皮質激素誘導之TNFR家族相關基因之縮寫，其促進T細胞擴展，包括Treg擴展。TG Therapeutics正在研究抗GITR抗體。
ICOS. 此分子為可誘導T細胞共刺激因子之縮寫，且亦稱為CD278，其表現於經活化T細胞上。Jounce Therapeutics正在研發ICOS激動劑。
A2AR. 在癌症療法中將腺苷A2A受體視為重要的核查點，此係因為引起A2a受體之活化的免疫微環境中之腺苷為負免疫 反饋環且腫瘤微環境具有相對較高濃度之腺苷。
B7-H3(亦稱為CD276)最初理解為共刺激分子但現今視為共抑制的。MacroGenics正在研究MGA271，其為靶向B7-H3之經Fc最佳化之單純系抗體。
B7-H4(亦稱為VTCN1)由腫瘤細胞及腫瘤相關巨噬細胞表現且在腫瘤逃逸中起作用。
BTLA. 此分子為B及T淋巴球弱化子之縮寫且亦稱為CD272，其具有作為其配位體之HVEM(疱疹病毒進入介體)。
CTLA-4為細胞介素T淋巴球相關蛋白4之縮寫且亦稱為CD152，其為Bristol-Myers Squibb的化合物伊匹單抗(Yervoy)的靶標。
IDO為吲哚胺2,3-加雙氧酶之縮寫，其為具有免疫抑制性特性之色胺酸分解酶。另一重要的分子為TDO，色胺酸2,3-加雙氧酶。IDO.Newlink Genetics及Incyte已識別IDO路徑抑制劑。
KIR為殺滅細胞免疫球蛋白樣受體之縮寫，其為自然殺滅細胞上之MHC類別I分子的受體。Bristol-Myers Squibb已研發麗瑞魯單抗(Lirilumab)，其為KIR之單純系抗體。
LAG3，其為淋巴球活化基因-3之縮小，起作用以藉由作用於Treg抑止免疫應答，且CD8+ T細胞具有直接影響。Bristol-Myers Squibb已研發稱為BMS-986016之抗LAG3單純系抗體。
PD-1為程式化死亡1(PD-1)受體之縮寫，其具有兩個配位體PD-L1及PD-L2。此核查點為Merck & Co.之黑素瘤藥物默沙東(Keytrud)之靶標。
TIM-3為T細胞免疫球蛋白域及白結構域3之縮寫，其 表現於經活化人類CD4+ T細胞上且調節Th1 and Th17細胞介素。
VISTA(蛋白質)為T細胞活化之V域Ig抑制因子之縮寫，VISTA起始表現於造血細胞上。
適用於治療之個體
各種個體適用於藉由本發明之方法及組合物治療。適合之個體包括患有疾病或病症、經診斷患有疾病或病症、處於患有疾病或病症之風險、曾患有疾病或病症且處於疾病或病症復發之風險、已藉由用於該疾病或病症之藥物治療且未能對此治療作出反應、或已藉由用於該疾病或病症的藥物治療但在對此治療之初步反應之後復發的任何個體，例如人或非人類動物。
適用於藉由免疫調節方法治療之個體包括具有自身免疫疾病之個體；為器官或組織移植接受者及類似者之個體；免疫缺陷之個體；及感染病原體之個體。
例示性實施例
此例示性實施例章節提供本文中提供之例示性態樣及實施例且貫穿此說明書進一步論述。出於簡潔及方便起見，所有所揭示態樣及實施例及所揭示態樣及實施例之所有可能的組合不列於此章節中。應理解，所提供之實施例為針對許多態樣之特定實施例，如此整個揭示內容所論述。意欲鑒於本文之完整揭示內容，以下所述或此完整揭示內容中之任何個別實施例可與以下所述或此完整揭示內容中之任何態樣組合，其中其為可添加至態樣之額外元素或因為其為針對已呈現於態樣中之元素的更窄元素。此組合在此詳細描述之其他章節中具體地論述。
在一個態樣中，本文提供包括聚核苷酸之非複製勝任 型重組反轉錄病毒顆粒，該聚核苷酸包括：A. 可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)；及B. 在其表面上之假型化元件及活化元件(例如，NK細胞活化元件，或在說明性實施例中，T細胞活化元件)，其中該活化元件不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。
在另一態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其包括聚核苷酸，該聚核苷酸包括可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包括嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽及包括淋巴增殖性元件之第二多肽。在此章節中及此揭示內容中，本文提供諸如(但不限於)淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、控制元件、CAR及其他元件的此等顆粒之各種實施例。
在另一態樣中，本文提供包含聚核苷酸之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，該聚核苷酸包括可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽及包含嵌合淋巴增殖性元件(例如組成性活性嵌合淋巴增殖性元件)之第二多肽。在說明性實施例中，嵌合淋巴增殖性元件不包含連接至其同源受體或連接至其同源受體之片段的細胞介素。在此章節中及此揭示內容中，本文提供諸如(但不限於)淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、控制元件、CAR及其他元件的此等顆粒之各種實施例
在另一態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉 錄病毒顆粒，其包含：A. 聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼嵌合抗原受體(CAR)；及B. 在其表面上之假型化元件及T細胞活化元件，其中該T細胞活化元件不由該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼，且其中該T細胞活化元件為抗CD3 scFvFc抗體。在此章節中及此揭示內容中，本文提供諸如(但不限於)淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、控制元件、CAR及其他元件的此等顆粒之各種
實施例
在另一態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其包含：A. 一或多個假型化元件，其能夠與T細胞及/或NK細胞結合且有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與其之膜融合；B. 聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(包含抗原特異性靶向區、跨膜域及胞內活化域)之第一工程化信號傳導多肽及包含至少一個淋巴增殖性元件之第二工程化信號傳導多肽；其中第一工程化信號傳導多肽及/或第二工程化信號傳導多肽之表現由控制元件來調節；及C. 在其表面上之活化元件，其中該活化元件能夠與T細胞及/或NK細胞結合且不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。在此章節中及此揭示內容中，本文提供諸如(但不限於)淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、控制元件、CAR及其他 元件的此等顆粒之各種實施例。
在一些態樣中，本文提供藉由用本文提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之任一者離體轉導休眠T細胞及/或休眠NK細胞製成之經基因方式修飾之淋巴球(諸如T細胞或NK細胞)，其中該接觸有助於藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件及在其表面上之膜結合T細胞活化元件。在此章節中及此揭示內容中，本文提供諸如(但不限於)接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、控制元件及其他元件的此細胞之各種實施例。
在另一態樣中，本文提供任何非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在製造用於以基因方式修飾T細胞及/或NK細胞之套組中之用途，其中套組之用途包括本文提供之方法態樣及實施例中之任一者的步驟。舉例而言，在另一態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在製造用於以基因方式修飾T細胞或NK細胞之套組中之用途，其中套組之用途包括：使T細胞或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包括在表面上之假型化元件及通常在表面上之T細胞活化元件，其中該接觸有助於藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導T細胞或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞或NK細胞。在一些實施例中，T細胞活化元件可經膜結合。在說明性實施例中，T細胞活化元件經由T細胞受體相關受體複合物活化T細胞。在一些實施例中，該接觸可執行範圍之低端為1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時或8小時與範圍之高端為4小時、5小時、6小時、 7小時、8小時、10小時、12小時、15小時、18小時、21小時及24小時之間，例如1小時與12小時之間或1小時與5小時之間。在此用途態樣及本文之其他用途態樣中，用於製造套組之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括本文提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣及實施例中之任一者。本文提供諸如(但不限於)其他接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、經轉染/經基因方式修飾之細胞百分比、控制元件及其他元件的此等方法之各種其他實施例。
在另一態樣中，本文提供轉導及/或以基因方式修飾之淋巴球，通常T細胞及/或NK細胞，且通常休眠T細胞及/或休眠NK細胞，其包括使淋巴球與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒通常包含在其表面上之假型化元件，其中該接觸(其可亦被視為在接觸條件下培育)有助於藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。該等假型化元件通常能夠結合休眠T細胞及/或NK細胞且通常有助於其自身之膜融合或與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之其他蛋白質結合。在方法之一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含活化元件，諸如經由T細胞受體相關複合物活化T細胞之T細胞活化元件。此活化元件可為抗CD3抗體，例如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。本文提供各種例示性及說明性接觸時間。本文提供諸如(但不限於)接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、經轉染/經基因方式修飾之細胞百分比、控制元件、Kozak型序列、WPRE元件、三重終止序列及其他元件的此等方法之各種其他實施例。
在另一態樣中，本文提供用於以基因方式修飾及/或轉 導淋巴球的方法，該方法包含使淋巴球與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件及在其表面上之膜結合T細胞活化元件，其中該接觸有助於藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導淋巴球，由此產生經基因方式修飾之淋巴球。在一些實施例中，膜結合T細胞活化元件為抗CD3抗體，例如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。本文提供諸如(但不限於)接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、經轉染/經基因方式修飾之細胞百分比、控制元件、Kozak類序列、WPRE、三重終止及其他元件的此等方法之各種其他實施例。
在另一態樣中，本文提供轉導個體之休眠淋巴球的方法，該方法包含使休眠T細胞及/或休眠NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件，該假型化元件能夠結合休眠T細胞及/或休眠NK細胞且有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與其之膜融合，其中該接觸有助於藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。在此態樣之說明性實施例中，至少10%、20%或25%之休眠T細胞及/或NK細胞或10%與70%之間、10%與50%之間或20%與50%之間的T細胞及/或NK細胞經轉導作為方法之結果。本文提供諸如(但不限於)接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、經轉染/經基因方式修飾之細胞百分比、控制元件及其他元件的此等方法之各種其他實施例。
在另一態樣中，本文提供用於轉導來自經分離學院之休眠T細胞及/或休眠NK細胞的方法，其包含： A. 自個體收集血液；B. 分離包含休眠T細胞及/或休眠NK細胞之周邊血液單核細胞(PBMC)；C. 使個體之休眠T細胞及/或休眠NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件，該假型化元件能夠結合休眠T細胞及/或休眠NK細胞且有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與其之膜結合，其中該接觸有助於藉由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導至少5%之休眠T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，由此轉導休眠T細胞及/或NK細胞。本文提供諸如(但不限於)接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、經轉染/經基因方式修飾之細胞百分比、控制元件及其他元件的此等方法之各種其他實施例。
通常，封裝細胞株用於產生本文其他處所論述之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。在一些實施例中，封裝細胞株可為懸浮細胞株。在說明性實施例中，封裝細胞株可在無血清介質中生長。在一些實施例中，淋巴球可來自個體。在說明性實施例中，淋巴球可來自個體之血液。本文提供諸如(但不限於)接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、經轉染/經基因方式修飾之細胞百分比、控制元件及其他元件的此等方法之各種其他實施例。
在另一態樣中，本文提供用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導淋巴球的方法，其包含：A. 用包含非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之組分的一組載體轉染封裝細胞，其中該封裝細胞在含懸浮液之無血清介質中生長； B. 自無血清介質採集該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒；及C. 使淋巴球與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸。本文提供諸如(但不限於)接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、經轉染/經基因方式修飾之細胞百分比、控制元件及其他元件的此等方法之各種實施例。
在另一態樣中，本文提供一種用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導淋巴球的方法，其包含：A. 將封裝細胞培養培養在無血清介質中之懸浮液中，其中該封裝細胞包含編碼該非複製勝任型反轉錄病毒顆粒之可封裝RNA基因組、REV蛋白質、gag多肽、pol多肽及假型化元件之核酸序列；B. 自無血清介質採集該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒；及C. 使該淋巴球與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中該接觸執行少於12小時，由此轉導該淋巴球。本文提供諸如(但不限於)其他接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、假型化元件、經轉染/經基因方式修飾之細胞百分比、控制元件及其他元件的此等方法之各種其他實施例。
用於以基因方式修飾及/或轉導PBMC、淋巴球、NK細胞及/或於說明性實施例中T細胞之方法或本文中方法態樣之相關方法、用途或產物的其他實施例提供於在此例示性實施例章節內外的本揭示內容之其他章節中，例如在題為「用於轉導及/或以基因方式修飾淋巴球之方法(METHODS FOR TRANSDUCING AND/OR GENETICALLY MODIFYING LYMPHOCYTES)」之章節中。舉例而言，除非與態樣不相容或已陳述於態樣中，否則用於以基因方式修飾及/或轉導之以上方法或方法態樣之相關用途或產物中之任一者的其 他實施例可包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒、淋巴組織增殖性元件、CAR、假型化元件、核糖開關、活化元件、膜結合細胞介素、miRNA、Kozak類序列、WPRE、三重終止密碼子及/或本文中所揭示之其他元件的實施例中之任一者。在某些說明性實施例中，反轉錄病毒顆粒為慢病毒顆粒。
除非不與態樣相容或已陳述於態樣中，在說明性實施例中，封裝細胞為永生化細胞，其包含編碼可封裝RNA基因組之穩定地整合至其中的DNA核酸。在一些實施例中，gag多肽及pol多肽自一或多個可誘導啟動子表現，其中該方法進一步包含：在培養期間，添加反式活化因子以誘導gag多肽及pol多肽自一或多個可誘導啟動子的表現。本文提供諸如(但不限於)接觸時間、淋巴增殖性元件、活化元件、控制元件及其他元件的此等方法之各種實施例。
除非不與態樣相容或已陳述於態樣中，在用於以基因方式修飾及/或轉導淋巴球(T淋巴球)，用於以基因方式修飾及擴展淋巴球(例如T淋巴球)或執行本文中之細胞療法或類似方法的之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，該接觸可實行範圍之低端在5秒、10秒、15秒、30秒或45秒或1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘或45分鐘或1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時或8小時之間，及範圍之高端在2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、18小時、24小時、36小時、48小時及72小時之間。舉例而言，在說明性實施例中，該接觸實行2小時與24小時之間、2小時與20小時之間、2小時與6小時之間、1小時與20小時之間、1小時與12小時之間、1小時與4小時之間、4小時與12小時之間或4小時與8小時之間。在一些實施例中，在添加待以基因方式修 飾及/或經轉導的細胞之後，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可經立即洗滌，使得接觸時間實施持續洗滌非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒所花費之時間長度。因此，通常，接觸包括至少初始接觸步驟，其中在轉導反應混合物中之懸浮液中使反轉錄病毒顆粒與細胞接觸。在一些實施例中，除非陳述，或另外在本文中所提供之最廣泛態樣中陳述，否則在方法、用以產生產物之方法或其用途中之任一者中，PBMC、NK細胞及在說明性實施例中T細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之接觸可執行持續1分鐘與12小時之間、5分鐘與12小時之間、10分鐘與12小時之間、15分鐘與12小時之間、30分鐘與12小時之間，或1小時與24小時之間，例如1小時與12小時之間或1小時與6小時之間。在一些實施例中，可執行接觸少於24小時，例如少於12小時、少於8小時、少於4小時、少於3小時、少於2小時、少於1小時、少於30分鐘、少於15分鐘、少於10分鐘、少於5分鐘、少於4分鐘、少於3分鐘、少於2分鐘或少於1分鐘。在說明性實施例中，執行接觸持續1分鐘與12小時之間、5分鐘與12小時之間、15分鐘與12小時之間、30分鐘與12小時之間、1小時與14小時之間、1小時與12小時之間、1小時與6小時之間、1小時與4小時之間或2小時與14小時之間。可在不預先活化之情況下執行此類方法。
除非與態樣不相容，或已陳述於態樣中，否則在用於以基因方式修飾及/或轉導淋巴球(例如T淋巴球)、用於以基因方式修飾及擴展淋巴球(例如T淋巴球)或用於執行本文中之細胞療法之方法態樣中之任一者或類似方法的說明性實施例中，設想以基因方式修飾及/或轉導之方法之時間範圍的其他實施例或本文中方法態樣之相關用途或產物提供於此例示性實施例章節內外之本揭示內容的其他章 節中，例如在題為「(用於轉導及/或以基因方式修飾淋巴球之方法)METHODS FOR TRANSDUCING AND/OR GENETICALLY MODIFYING LYMPHOCYTES」之章節中。
除非與態樣不相容，或已陳述於態樣中，否則在用於以基因方式修飾及/或轉導淋巴球(例如T淋巴球)、用於以基因方式修飾及擴展淋巴球(例如T淋巴球)或用於執行本文中之細胞療法之方法態樣中任一者或類似方法的說明性實施例中，細胞在接觸期間活化，且在接觸之前完全不活化或不活化持續超過15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時或8小時。在某些說明性實施例中，藉由不存在於反轉錄病毒顆粒表面上之元件的活化不需要以基因方式修飾及/或轉導細胞。因此，在接觸之前、期間或之後，除在反轉錄病毒顆粒上之外，不需要此類活化或刺激元件。
除非與態樣不相容，或已陳述於態樣中，否則在用於以基因方式修飾及/或轉導淋巴球(例如T淋巴球)、用於以基因方式修飾及擴展淋巴球或用於執行本文中之細胞療法的方法態樣中之任一者或類似方法的說明性實施例中，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含操作性地鏈接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽，且在說明性實施例中編碼包含嵌合淋巴組織增殖性元件之第二多肽，經基因方式修飾之T細胞或NK細胞能夠、適用於、擁有以下特性及或經修飾以供：在不存在所添加IL-2或不存在所添加細胞介素(諸如IL-2、IL-15或IL-7)且存在由CAR識別之抗原的情況下，在離體培養物中存活及/或增殖至少7天、14天、21天、28天、35天、42天或60天，或自轉導後第7天與 第14天、第21天、第28天、第35天、第42天或第60天之間。
除非不與態樣相容或已陳述於態樣中，在本文提供之方法、套組、用途或組合物(例如，聚核苷酸、封裝細胞或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒)中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含或進一步包含在其表面上之活化元件，其能夠活化T細胞及/或NK細胞。通常，諸如T細胞活化元件之活化元件不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。
除非不與態樣相容或已陳述於態樣中，在敍述T細胞及/或NK細胞或休眠T細胞及/或休眠NK細胞之本文提供之方法、套組、用途或組合物(例如，聚核苷酸、封裝細胞或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒)中，在某些說明性實施例中，該細胞為T細胞。
除非不與態樣相容或已陳述於態樣中，通常，本文提供之方法、套組、用途或組合物(例如，聚核苷酸、封裝細胞或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒)中之任一者中的重組反轉錄病毒顆粒為非複製勝任型的，亦即不可複製。在說明性實施例中，反轉錄病毒為慢病毒，諸如複製或複製缺陷型HIV慢病毒。在說明性實施例中，反轉錄病毒為慢病毒，諸如非複製勝任型或複製缺陷型HIV慢病毒顆粒。因此，在文提供之方法、套組、用途或組合物(例如，聚核苷酸、封裝細胞或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒)中之任一者中的說明性實施例中，若未敍述或另外敍述，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒為慢病毒顆粒及/或經基因方式修飾之細胞為經基因方式修飾之T細胞。
除非不與態樣相容或已陳述於態樣中，在本文提供之態樣中之任一者的說明性實施例中，淋巴球可為T細胞及/或NK細 胞。在另外的實施例中，T細胞及/或NK細胞可為休眠T細胞及/或休眠NK細胞。
除非不與態樣相容或已陳述於態樣中，在用於轉導、以基因方式修飾及擴展淋巴球或用於執行本文之適應性細胞療法或類似療法的方法態樣中之任一者之說明性實施例中，10%與75%之間、或10%與70%之間、或10%與60%之間、或10%與50%之間、或10%與25%之間、或20%與75%之間、或20%與50%之間，或至少10%、20%或25%之休眠T細胞經轉導或0%與75%之間的NK細胞經轉導。在其他態樣中，5%與80%之間、或10%與80%之間、或10%與70%之間、或10%與60%之間、或10%與50%之間、或10%與25%之間、或10%與20%之間、或20%與50%之間的休眠NK細胞經轉導。
除非不與態樣相容或已陳述於態樣中，在用於以基因方式修飾及擴展淋巴球或用於執行本文之適應性細胞療法的或類似療法或本文提供之任何組合物的方法態樣中之任一者的說明性實施例中，該第二工程化信號傳導多肽之表現由控制元件來調節。
除非不與態樣相容或已陳述於態樣中，在包括經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒本文之方法、用途、製程產物或組合物中之任一者中，此經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽及/或包含T細胞淋巴增殖性元件之二多肽。在一些實施例中，CAR及/或淋巴增殖性元件之表現受控制元件或針對每一者之不同控制元件控制。在一些實施例中，CAR及/或淋 巴增殖性元件可表現於相同多肽上，且在說明性實施例中，CAR及/或淋巴增殖性元件表現為獨立的多肽。在一些實施例中，CAR為MRB CAR。在一些實施例中，嵌合淋巴增殖性元件為組成性活性的，例如組成性活性嵌合細胞介素受體。在此實施例中，組成性活性嵌合細胞介素受體可受控制元件控制。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文包括聚核苷酸之態樣中之任一者中，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽及/或包含T細胞淋巴增殖性元件之第二多肽，該聚核苷酸可進一步包含Kozak相關序列、WPRE元件及多重終止序列(諸如雙重終止密碼子或三重終止密碼子)中之一或多者，其中雙重終止密碼子或三重終止密碼子中之一或多個終止密碼子限定自該一或多個轉錄單元中之至少一者中讀取的終止。在某些實施例中，聚核苷酸包含選自以下之Kozak類型序列：CCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO：515)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：516)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：517)或GCCGCCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO：532)。在某些實施例中，相對於第一核酸序列之起始密碼子的-3及+4核苷酸皆包含G。在可與包含Kozak類型序列之前述實施例及/或包括三重終止密碼子之以下實施例組合的另一實施例中，聚核苷酸包含WPRE元件。在一些實施例中，WPRE元件位於一或多個轉錄單元之終止密碼子之3’及聚核苷酸之3’LTR的5’處。在可與前述實施例(亦即，其中聚核苷酸包含Kozak類型序列之實施例及/或其中聚核苷酸包含WPRE之一實施例)中之任一者或兩者組合之另一實施例中，一或多個轉錄單元經雙重終 止密碼子或三重終止密碼子中之一或多個終止密碼子終止。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文中提供之包括淋巴增殖性元件之方法、用途及組合物中之任一者的說明性實施例中，該淋巴增殖性元件可為嵌合淋巴增殖性元件。在本文中之包括嵌合淋巴增殖性元件之實施例中之任一者中，該嵌合淋巴增殖性元件可為嵌合細胞介素受體。在本文中之包括嵌合淋巴增殖性元件之實施例中之任一者中，該嵌合淋巴增殖性元件可為連接至IL-7受體α之IL-7，或不連接至IL-7受體α之IL-7。在一些實施例中，嵌合細胞介素受體包含連接至IL-7受體α之IL-7，或其保留促進T細胞及/或NK細胞之增殖之能力的片段，且其中該嵌合細胞介素受體為組成性活性。在一些實施例中，嵌合細胞介素受體包含共價連接至能夠結合IL-7之IL-7受體之功能性胞外片段、IL-7受體跨膜域及IL-7受體信號傳導域的IL-7。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文中之包括嵌合淋巴增殖性元件之態樣或實施例中之任一者中，該嵌合淋巴增殖性元件可不為嵌合細胞介素受體。在本文中提供之包括淋巴增殖性元件之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，嵌合淋巴增殖性元件可為嵌合細胞介素受體。在本文中提供之包括嵌合細胞介素受體之方法及組合物中之任一者之說明性實施例中，該嵌合細胞介素受體包含IL-7受體之胞內信號傳導域、IL-12受體之胞內信號傳導域、IL-15/IL-2受體之胞內信號傳導域(諸如IL-15/IL-2β受體)、IL-21受體之胞內信號傳導域、IL-23受體之胞內信號傳導域、IL-27受體之胞內信號傳導域、轉化生長因子β(TGFβ)誘餌受體之胞內信號傳導域或CD28。在一些實施例中，嵌合細胞介素受體包含與IL-7 受體融合之IL-7。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文中提供之包括淋巴增殖性元件之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，該淋巴增殖性元件可包含T細胞存活基元。T細胞存活基元可包含IL-7受體、IL-15受體或CD28之全部或功能性片段。在其他實施例中，淋巴增殖性元件可包括細胞介素或細胞介素受體多肽，或其包含信號傳導域之片段。舉例而言，淋巴增殖性元件可包含介白素多肽且該淋巴增殖性元件可進一步包含經由連接子共價連接之其同源介白素受體多肽之部分。通常，同源介白素受體之此部分包括能夠結合介白素細胞介素之胞外域及跨膜域之功能性部分。在一些實施例中，胞內域為同源介白素受體之胞內部分。在一些實施例中，胞內域為不同介白素受體之胞內部分，其能夠促進淋巴球增殖且視情況在不存在將淋巴球暴露至外源性細胞介素(諸如IL-15、IL-7，且在說明性實施例中，IL-2)且視情況在不存在針對由淋巴球表現之CAR之ASTR的靶標之情況下，或在某些說明性實施例中，在存在由CAR識別之抗原的情況下在培養期間在培養物中離體或活體外存活6天、7天、14天、21天或35天或更長時間，其中方法包含使用於其表面上具有假型化元件及視情況選用之分離或經融合活化域的反轉錄病毒顆粒以基因方式修飾及/或轉導且通常不需要進行預活化，。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在一些實施例中，淋巴增殖性元件為經由連接子共價連接至其全長同源介白素受體多肽之介白素多肽。替代地，淋巴增殖性元件可為IL-7受體之胞內信號傳導域、IL-12受體之胞內信號傳導域、IL-23受體之胞內信號傳導域、IL-27受體之胞內信號傳導域、IL-15受體之胞內信 號傳導域、IL-21受體之胞內信號傳導域，或轉化生長因子β(TGFβ)誘餌受體之胞內信號傳導域。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在一些說明性實施例中，淋巴增殖性元件為組成性活性。此外，淋巴增殖性元件可包括突變IL-7受體或其片段，其可進一步包括組成性活性突變IL-7受體或其組成性活性片段。在一些實施例中，淋巴增殖性元件或嵌合細胞介素受體包含IL7 InsPPCL突變體。除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在包括淋巴增殖性元件之態樣中之任一者中，該淋巴增殖性元件可為本文中之淋巴增殖性元件部分中列舉之任一CLE。舉例而言，在說明性實施例中，CLE包含來自特別稱為尤其值得注意之基因基因及/或相對於本文中之實例的最優構築體(Top Constructs)的域。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文所揭示之包括淋巴增殖性元件之態樣及實施例中之任一者中，諸如方法、用途、組合物及過程態樣之產物，在說明性實施例中，經基因方式修飾之PBMC、淋巴球或經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞能夠在不存在將該等細胞暴露至細胞介素(諸如IL-15、IL-7，且在說明性實施例中，IL-2)及視情況針對由細胞表現之CAR之ASTR的靶標的情況下，或在某些說明性實施例中，在存在由CAR識別之抗原的情況下(特別對於其中方法包含使用於其表面上具有假型化元件及視情況選用之分離或經融合活化域的反轉錄病毒顆粒以基因方式修飾及/或轉導且通常不需要進行預活化的實施例)在培養期間在培養物中離體或活體外存活及/或增殖/擴展至少6天、7天、14天、21天或35天或更長時間。在本文中揭示之包括CAR及淋巴增殖性元件之實施例 的任一者中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞可能夠植入小鼠體內而不暴露至由該CAR識別之靶標。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文提供之包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，該等非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包含在其表面上之活化元件。在說明性實施例中，活化元件經由T細胞受體相關之複合物活化T細胞。在一些情況下，活化元件可僅活化T細胞。在其他情況下，活化元件需要經由TCR受體複合物之活化以進一步活化T細胞。因此，在一些實施例中，活化元件包含：A. 能夠與CD3結合之膜結合多肽；及/或B. 能夠與CD28結合之膜結合多肽。
此外，能夠與CD3結合之膜結合多肽為能夠與融合至異源GPI錨定連接序列之CD3結合之多肽，且能夠與CD28結合之膜結合多肽可為能夠與融合至異源GPI錨定連接序列之CD28結合之多肽。在一些實施例中，能夠與CD28結合之膜結合多肽為CD80、CD86或能夠誘導對Akt(諸如CD80之胞外域)之經CD28介導之活化的其功能性片段。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文提供之為非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒或包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，活化元件可為能夠結合CD3之膜結合多肽，諸如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。在本文提供之包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒及抗CD3之方法及組合物中之任一者的說明性實施例，抗CD3可為與異源GPI錨定連接序列融合之抗CD3 scFvFc。在本文提供之包括非複 製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，能夠結合CD3的膜結合多肽可為與CD14 GPI錨定連接序列結合之抗CD3 scFv，且能夠結合CD28之膜結合多肽可為與CD16B GPI錨定連接序列結合之CD80或其胞外域。在本文提供之包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可在其表面上包含結合CD14 GPI錨定連接序列之抗CD3 scFv，或結合CD16B GPI錨定連接序列之CD80或其胞外域，及IL-7之融合多肽或其活化片段，及，及包含GPI錨定連接序列之DAF。在本文提供之包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，IL-7或其活化片段，及DAF融合體、抗CD3 scFv及CD80及其胞外域各包含DAF信號序列。
除非另外陳述，或在廣泛態樣中已陳述，否則在本文提供之包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，該等非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可在其表面上包含膜結合細胞介素。膜結合細胞介素可為IL-7、IL-15或其活化片段。在其他實施例中，膜結合細胞介素為IL-7之之融合多肽或其活化片段及DAF。舉例而言，融合多肽可包含DAF信號序列(SEQ ID NO：286之核苷酸1至34)，無其信號序列(SEQ ID NO：286之核苷酸35至186)之IL-7及包括其GPI錨定連接序列(SEQ ID NO：286之核苷酸187至532)之DAF片段。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文提供之方法及組合物態樣中之任一者之說明性實施例中，假型化元件可包含一或多種異源包膜蛋白質。在其他實例中，假型化元件 可包括由T細胞識別之一或多種病毒多肽。一或多個假型化元件可包含麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽及/或其片段。該一或多個假型化元件可為麻疹病毒F多肽及/或麻疹病毒H多肽之細胞質域缺失變體。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文提供之包括控制元件之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，該控制元件為可調節淋巴增殖性元件之控制元件，其中淋巴增殖性元件在促進T細胞及/或NK細胞之增殖中在不存在化合物之情況下無活性或具有較低活性，且其中該化合物為結合淋巴增殖性元件且誘導淋巴增殖性元件之活性的分子伴侶。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文提供之包括控制元件之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，控制元件可為包含核糖開關之聚核苷酸。核糖開關可能夠結合核苷類似物且結合控制元件之化合物為核苷類似物。核苷類似物可為抗病毒劑。抗病毒劑可為阿昔洛韋或噴昔洛韋。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文提供之包括工程化信號傳導多肽(其包括ASTR)之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，該等工程化信號重疊多肽中之一者或兩者之ASTR可結合腫瘤相關之抗原。在一些說明性實施例中，第二工程化多肽之抗原特異性靶向區為微環境受限之抗原特異性靶向區(MRB-ASTR)。在一些實施例中，微環境可為活體內微環境，諸如腫瘤、組織、非腫瘤組織、正常組織或已經歷pH短暫變化之組織。舉例而言，通常經歷pH短暫變化之組織包括厭氧條件下之肌肉組織或經歷鍛煉之肌肉組織或已發炎組織或正經歷發炎之組織。在包括靶標哺乳動物細胞之一些實施例中，靶標哺乳動物細胞可為腫瘤細胞或 非腫瘤細胞或正常細胞。
除非與一個態樣不相容或在一個態樣中已陳述，否則在本文提供之包括一或多個非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可編碼經生物驗證之單株抗體之識別域。在一些實施例中，識別域在與嵌合抗原受體相同之轉錄物上表現，且其中藉由核糖體跳躍及/或裂解信號將識別域與嵌合抗原受體分離。核糖體跳躍及/或裂解信號可為2A-1。識別域可包括由識別EGFR之抗體識別之多肽或其抗原決定基。識別域可為由EGFR抗體識別且在經轉導之T細胞及/或NK細胞之表面上表現為本文提供之另一控制機制的EGFR突變體。在相關實施例中，識別域可包括由識別EGFR之抗體識別之多肽或其抗原決定基。
除非與態樣、方法、用途、過程產物中之任一者不相容或在一個態樣中已陳述，否則該方法可進一步包括自個體收集血液。該方法可進一步包括在離體接觸個體之休眠T細胞及/或休眠NK細胞之後，將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞再引入該個體。在某些實施例中，接觸之休眠T細胞及/或休眠NK細胞來自個體之血液，且其中經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之擴增在個體體內發生。在某些實施例中，在收集血液與再引入經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之間的步驟在不超過24小時、18小時、12小時、8小時、6小時或4小時內進行。其他時間提供於本文中。在某些實施例中，個體在進行接觸之7天內、在接觸期間，及/或在將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞再引入至個體後之7天內並不暴露於淋巴消耗劑。
在一個態樣中，本文提供一種轉導及/或以基因方式修 飾個體之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)，在說明性實施例中休眠淋巴球(休眠T細胞及/或NK細胞)之方法，該方法包含使個體之休眠T細胞及/或休眠NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件及在其表面上之能夠結合休眠T細胞及/或休眠NK細胞且有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與其融合之膜結合抗CD3 scFvFc抗體，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
在一個態樣中，本文提供一種轉導及/或以基因方式修飾來自分離血液之休眠T細胞及/或休眠NK細胞之方法，該方法包含：自個體收集血液；分離包含休眠T細胞及/或休眠NK細胞之周邊血單核細胞(PBMC)；以及使個體之休眠T細胞及/或休眠NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸有效時間，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件及在其表面上之膜結合抗CD3 scFvFc抗體，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，由此轉導休眠T細胞及/或NK細胞。
在本文中之轉導及/或以基因方式修飾包括膜結合抗CD3 scFvFc抗體之T淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)的態樣中，假型化元件在某些實施例中為疱疹性口腔病毒包膜蛋白質(VSV-G)。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒進一步包含能夠與CD28結合之膜結合多肽，其可包括例如CD80、CD86之胞外域，或其保留與CD28結合之能力的功能性片段。在一些實施例中，抗CD3 scFvFc抗體與異源性GPI錨定連接序列融合。在一些實施例中，抗CD3 scFvFc抗體不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。
在本文中之轉導及/或以基因方式修飾包括膜結合抗CD3 scFvFc抗體之T淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)的態樣中，重組反轉錄病毒顆粒可進一步包括聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼嵌合抗原受體。在一些實施例中，能夠與CD3結合之膜結合多肽不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。在一些實施例中，抗CD3 scFvFc抗體不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。
在另一態樣中，本文提供一種轉導及/或以基因方式修飾個體之休眠淋巴球之方法，該方法包含使個體之休眠T細胞及/或休眠NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件及在其表面上之能夠與CD3結合之膜結合多肽，而非在其表面上之能夠與CD28結合且活化CD28之膜結合多肽，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
在另一態樣中，本文提供一種轉導及/或以基因方式修飾來自分離血液之休眠T細胞及/或休眠NK細胞之方法，該方法包含：自個體收集血液；分離包含休眠T細胞及/或休眠NK細胞之周邊血單核細胞(PBMC)；以及使個體之休眠T細胞及/或休眠NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸有效時間，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件及在其表面上 之能夠與CD3結合之膜結合多肽，而非在其表面上之能夠與CD28結合且活化CD28之膜結合多肽，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，由此轉導休眠T細胞及/或NK細胞。
在本文中之轉導及/或以基因方式修飾休眠T淋巴球之態樣中，該休眠T淋巴球包括在其表面上之假型化元件及在其表面上之能夠與CD3結合之膜結合多肽，而非在其表面上之能夠與CD28結合且活化CD28之膜結合多肽，假型化元件可為例如疱疹性口腔病毒包膜蛋白質(VSV-G)。在說明性實施例中，能夠與CD3結合之膜結合多肽為抗CD3 scFvFc抗體，其在一些實施例中與異源性GPI錨定連接序列融合。在此態樣之一些實施例中，接觸執行至少2小時、或2小時與24小時之間，或2小時與6小時之間。在一些實施例中，可偵測標記由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之基因組編碼，且在轉導之後在T細胞及/或NK細胞中偵測到。在一些實施例中，能夠與CD3結合之膜結合多肽不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。在一些實施例中，可偵測標記由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之基因組編碼，且在轉導之後在T細胞及/或NK細胞中偵測到。
在另一態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其包含：一或多個假型化元件；聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼嵌合抗原受體；及在其表面上之假型化元件以及在其表面上之活化元件，其中該活化元件能夠與T細胞及/或NK細胞結合且不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼，且其中該活化元件為抗CD3 scFvFc抗體。
在另一態樣中，本文提供一種非複製勝任型重組反轉 錄病毒顆粒，其包含：一或多個假型化元件，其能夠與T細胞及/或NK細胞結合且有助於與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒至其上之膜融合；聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼嵌合抗原受體；及在其表面上之假型化元件以及在其表面上之活化元件，其中該活化元件能夠與T細胞及/或NK細胞結合且不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼，且其中該活化元件為能夠在其表面上與CD3結合之膜結合多肽，但不為能夠在其表面上與CD28結合且活化CD28之膜結合多肽。
在本文中之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之一些實施例中，該重組反轉錄病毒顆粒進一步包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼嵌合抗原受體。在此等態樣中之一些實施例中，能夠與CD3結合之膜結合多肽不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。在此等態樣中之一些實施例中，抗CD3 scFvFc抗體不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。
在本文中之態樣及實施例中之任一者中，諸如包括多肽或編碼其之核酸的彼等包括例如存在於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上之活化元件，該活化元件可進一步包括例如具有能夠與CD28或在說明性實施例中與CD3結合之多肽的融合多肽、可在不存在二聚劑之情況下有活性之二聚基元。在一些實施例中，活化元件可為抗CD3單鏈抗體且二聚基元可選自由以下組成之群：CD69、 CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324，以及其保留二聚能力之突變體及/或活性片段。
在本文中之態樣及實施例中之任一者中，諸如包括多肽或編碼其之核酸的彼等包括例如存在於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上之活化元件，該活化元件可進一步包括例如具有能夠與CD28或在說明性實施例中與CD3結合之多肽的融合多肽、可在不存在二聚劑之情況下有活性之二聚基元。在一些實施例中，活化元件可為抗CD3單鏈抗體且二聚基元可選自由以下組成之群：FKBP及雷帕黴素或其類似物、GyrB及香豆黴素或其類似物、DHFR及甲胺蝶呤或其類似物，或DmrB及AP20187或其類似物，以及保留二聚能力之所述二聚蛋白質的突變體及/或活性片段。
在本文中之態樣及實施例中之任一者中，諸如包括多肽或編碼其之核酸的彼等包括例如存在於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上之活化元件，該活化元件可進一步包括抗CD3-scFvFc-GPI部分(UCHT1)及視情況之VSV-G。
在以上態樣之一個實施例中，該聚核苷酸進一步包含Kozak類型序列、WPRE元件及雙重終止密碼子或三重終止密碼子中之一或多者，其中雙重終止密碼子或三重終止密碼子中之一或多個終止密碼子限定自一或多個轉錄單元中之至少一者中讀取的終止。在某些實施例中，聚核苷酸包含選自以下之Kozak類型序列：CCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO：515)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：516)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：517)或GCCGCCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO：532)。在某些實施例中，相對於第一核酸序列之起始密碼子的-3及+4核苷酸皆包含G。在可與包含 Kozak類型序列之前述實施例及/或包括三重終止密碼子之以下實施例組合的另一實施例中，聚核苷酸包含WPRE元件。在一些實施例中，WPRE元件位於一或多個轉錄單元之終止密碼子之3’及聚核苷酸之3’LTR的5’處。在可與前述實施例(亦即，其中聚核苷酸包含Kozak類型序列之實施例及/或其中聚核苷酸包含WPRE之實施例)中之任一者或兩者組合之另一實施例中，一或多個轉錄單元經雙重終止密碼子或三重終止密碼子中之一或多個終止密碼子終止。
在本文提供之包括ASTR之態樣中之任一者的一些實施例中，ASTR可為抗tag ASTR。此方法可進一步包括例如與靶分子(諸如靶細胞上之靶蛋白)結合之經tag結合之抗體。
在本文提供之包括B細胞、T細胞或NK細胞之實施例及態樣中之任一者中，細胞可為同種異體細胞，或其可不為同種異體細胞。
在本文所揭示之態樣及實施例中之任一者中，將DNA轉導成PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞及視情況將DNA併入宿主細胞基因組中可使用不利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法來執行。舉例而言，可利用其他病毒載體，諸如來源於腺病毒、腺病毒相關病毒或1型單純疱疹病毒之彼等，作為非限制實例。在其他實施例中，此等態樣及實施例可包括用非病毒載體轉染及/或轉導靶細胞。在本文所揭示之利用非病毒載體轉染靶細胞之此等實施例中之任一者中，可使用包括以下之方法將包括裸DNA之非病毒載體引入至靶細胞(諸如PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞)中：電穿孔、核轉染、脂質體製劑、脂質、樹枝狀聚合物、諸如聚(乙烯亞胺)(PEI)和聚(1-離胺酸)(PLL)之陽離子聚合物、奈米顆粒、細胞穿透肽、顯微注射 及/或非整合慢病毒載體。在本文提供之方法及組合物之一些實施例中，可使用基於轉座子之載體系統藉由共轉染、共核轉染或共電穿孔靶DNA將DNA整合至基因組中，該靶DNA作為在感興趣基因及轉座酶載體系統之5’及3’末端含有轉座子ITR片段的質粒。此等方法中使用之轉座酶或其他酶(例如CRISPR或TALEN)可與靶質粒共轉染為DNA、mRNA或蛋白質。
在另一態樣中，本文一種提供非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，每一者包含：A.在其表面上之假型化元件，該假型化元件能夠與T細胞及/或NK細胞結合且有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與其之膜融合的，其中該假型化元件包含麻疹病毒F多肽及/或麻疹病毒H多肽之細胞質域缺失變體；B.聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(其包含抗原特異性靶向區、跨膜域及胞內活化域)之第一工程化信號傳導多肽及包含組成性活性IL-7受體突變體之第二工程化信號傳導多肽；其中IL-7受體突變體之表現由結合核苷類似抗病毒藥物之核糖開關調節；及C.能夠與CD3結合之多肽及能夠與CD28結合之多肽，其中該等多肽在非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上表現；能夠與T細胞及/或NK細胞結合；且不由非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之聚核苷酸編碼。在此態樣之說明性實施例中，核苷類似抗病毒藥物與核糖開關之結合增加IL-7受體突變體之表現。
在一個態樣中，本文提供一種以基因方式修飾且擴增 個體之淋巴球的方法，該方法包含：A.使個體之休眠T細胞及/或NK細胞離體在不需要進行預先離體刺激之情況下與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包括：i.在其表面上之假型化元件，該假型化元件能夠與T細胞及/或NK細胞結合且有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與其之膜融合；及ii.聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子之一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼由控制元件調節之第一工程化信號傳導多肽，其中該第一工程化信號傳導多肽包含至少一個淋巴增殖性元件，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞中之至少一些，由此產生能經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；B.將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中；及C.使經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞活體內暴露於結合控制元件之化合物，以影響第一工程化信號傳導多肽之表現且活體內促進及/或強化淋巴球之擴展、移植及/或持久性，由此以基因方式修飾及擴展個體之淋巴球。在說明性實施例中，在無需活體外刺激之情況下進行轉導。
在以上態樣及用於以基因方式修飾及擴增淋巴球或用於執行本文之細胞治療的方法態樣中之任一者中，若在最廣泛之態樣中未敍述，則在某些實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼包含第一嵌合抗原受體之第二工程化信號傳導多肽之轉錄單元，該第一嵌合抗 原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在另一態樣中，本文提供用於對個體執行過繼性細胞療法之方法，該方法包含：A.自個體收集血液；B.使來自個體之血液的休眠T細胞及/或NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含i.在其表面上之假型化元件，該假型化元件能夠與T細胞及/或NK細胞結合且有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒至其上之膜融合；及ii.聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含至少一個淋巴增殖性元件(其表現由控制元件調節)的第一工程化信號傳導多肽，及包含包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域之嵌合抗原受體的第二工程化信號傳導多肽，其中該接觸產生變為經基因方式修飾之休眠T細胞及/或NK細胞中之至少一些；及C.將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞再引入至個體中，其中經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之擴增、移植及/或持久性出現於個體體內，且其中在收集血液與再引入經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之間的方法在不超過24小時內進行，從而對個體執行過繼性細胞療法。
本文之另一態樣提供用於對個體執行過繼性細胞療法之方法，該方法包含： A.自個體收集血液；B.分離包含休眠T細胞及/或休眠NK細胞之周邊血單核細胞(PBMC)；C.使個體之休眠T細胞及/或休眠NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之能夠結合休眠T細胞及/或NK細胞且有助於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒至其上之膜融合的假型化元件，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；及D.在自個體收集血液之24小時內，將經基因方式修飾之細胞再引入至個體中，從而在個體中執行過繼性細胞療法。
在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則該方法可進一步包含將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞在體內暴露於結合控制元件之化合物，以影響第一工程化信號傳導多肽及視情況存在之第二工程化信號傳導多肽之表現，且促進體內淋巴球之擴增、移植及/或持久性。
在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞在經引入或再引入至個體之前離體經歷8次、7次、6次、5次、4次、3次或更少之細胞分裂。
在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本 文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則經基因發生修飾之T細胞及/或NK細胞在體內之擴增、移植及/或持久性取決於結合控制元件之化合物之存在或不存在，且在說明性實施例中取決於結合控制元件之化合物之存在。
在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則個體在執行接觸之7天、14天或21天內或在接觸期間，及/或在將經修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中之後7天、14天或21天內未暴露於淋巴消耗劑。在其他實施例中，個體在接觸期間未暴露於淋巴消耗劑。
在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則用於接觸步驟之T細胞及/或NK細胞條件可為針對用於以基因方式修飾及/或轉導之方法(包括彼等不包括明確活體內步驟之方法)而提供於此例示性實施例章節及本文中之其他章節中之其他段落中的條件中之任一者，例如接觸時間。
在用於以基因方式修飾及擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則該方法進一步包括在接觸之後自T細胞及/或NK細胞分離非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之步驟。在包括引入或再引入之方法中，分離係在引入之前執行。在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療 法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則該暴露步驟包括在接觸之前或期間，及/或在已將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中之後向個體投予一定劑量之化合物。
在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則該方法包含在使T細胞及/或NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之前自個體收集包含T細胞及/或NK細胞之血液，且其中該引入為再引入。舉例而言，自個體抽取20ml與250ml之間的血液。
在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則在自個體收集血液之時間與將經修飾之T細胞及/或NK細胞再引入至個體中之時間之間不超過8小時、12小時、24小時或48小時。
在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則在自個體收集血液之時間與將經修飾之T細胞及/或NK細胞再引入至個體中之時間之間的範圍為在低端為4小時或8小時與高端為12小時、24小時、36小時或48小時之間。
在本文提供之包括向個體(尤其在個體患有或疑似患有癌症時)投予經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞的態樣及實施例中，方法可進一步包括向個體遞送有效量之免疫檢查點抑制劑。
在用於以基因方式修飾且擴增淋巴球或用於執行本文之過繼性細胞療法或類似方法之方法態樣中之任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則在收集血液之後且在再引入血液之前的所有步驟都在一個封閉之系統中進行，在該系統中一人在整個處理過程中監控該封閉系統。在另一實施例中，在收集血液之後及在再引入血液之前，在與個體保持在同一房間中之封閉系統中進行。
在本文中提供之包括一或多個轉錄單元或一或多個工程化信號傳導多肽之方法及組合物中的任一者的說明性實施例中，若在最廣泛態樣中未明確地敍述，則該等轉錄單元中之一者或該等工程化信號傳導多肽中之一者可編碼或包含或進一步包含抗原特異性靶向區(ASTR)及將該ASTR連接至淋巴增殖性元件的跨膜域。此工程化信號傳導多肽之ASTR能夠與第一腫瘤抗原結合，且在存在時，第二工程化信號傳導多肽之ASTR能夠與第二腫瘤抗原結合。在說明性實施例中，第一工程化信號傳導多肽及/或第二工程化信號傳導多肽進一步包含共刺激域。此外，第一工程化信號傳導多肽及/或第二工程化信號傳導多肽進一步包含柄。此外，第一工程化信號傳導多肽進一步包含胞內活化域。第一工程化信號傳導多肽及/或第二工程化信號傳導多肽上之胞內活化域可來源於CD3 ζ。在本文中提供之包括淋巴增殖性元件之方法及組合物中的任一者的說明性實施例中，該淋巴增殖性元件可包含MPL或可為MPL或其變體及/或片段，包括包括MPL之胞內域的至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，具有或不具有MPL之跨膜域及/或胞外域；及/或與MPL之胞內域具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%序列一致性，具有或不具有MPL之跨膜域及/或胞外域的變體及/或片段，其中該變體及/或片段保留促進PBMC(在一些實施例中T細胞)之細胞增殖的能力。
在本文中提供之包括淋巴增殖性元件之方法或組合物中的任一者中，方法或組合物可進一步包括刺激STAT5路徑或抑制SOCS路徑之抑制性RNA分子(諸如miRNA或shRNA)，或淋巴增殖性元件可由該抑制性RNA分子替換。舉例而言，抑制性RNA分子可結合編碼選自由以下組成之群之蛋白質的核酸：ABCG1、SOCS、TGFbR2、SMAD2、cCBL及PD1。在本文提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒或轉導細胞中之任一者或包括其之方法的說明性實施例中，此類非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒或轉導細胞可編碼兩種或更多種抑制性RNA分子，諸如內含子中之miRNA或shRNA，在一些實施例中為1種、2種、3種或4種抑制性RNA分子，其結合編碼以下目標內源性T細胞表現之基因中之一或多者的核酸：PD-1、CTLA4、TCR α、TCR β、CD3 ζ、SOCS、SMAD2、miR-155、IFN γ、cCBL、TRAIL2、PP2A或ABCG1。舉例而言，在一個實施例中，靶向以下中之任一者之miRNA的組合可包括在非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒或轉導細胞之基因組中：TCR α、CD3 ζ、IFN γ，及PD-1；且在另一實施例中為SOCS 1、IFN γ、TCR α及CD3 ζ。
在本文提供之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒、哺乳動物細胞及/或封裝細胞可包含Vpu多肽。Vpu多肽可為例如融合多肽，且在一些實例中，尤其在封裝細胞中，為膜結合Vpu多肽。在本文提供之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆 粒、哺乳動物細胞及/或封裝細胞可包含Vpu多肽及Vpx多肽兩者。
在本文提供之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒、哺乳動物細胞及/或封裝細胞可包含Vpx多肽。Vpx多肽可為例如融合多肽，且在一些實例中，尤其在封裝細胞中，為膜結合Vpx多肽。
在本文所提供之方法或組合物中之任一者中，一或多個假型化元件可包括疱疹性口腔病毒包膜蛋白質(VSV-G)、貓類內源性病毒(RD114)包膜蛋白、致癌反轉錄病毒雙嗜性包膜蛋白或致癌反轉錄病毒親嗜性包膜蛋白或其功能性片段。
在一個態樣中，本文提供經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，其中該T細胞及/或NK細胞已經基因方式修飾以表現包含淋巴增殖性元件之第一工程化信號傳導多肽及包含CAR之第二工程化信號傳導多肽，該CAR包括抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在另一態樣中，本文提供經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，其包含：在該T細胞或NK細胞之表面上之假型化元件及在該T細胞或NK細胞之表面上之活化元件，其中該T細胞或NK細胞已經基因方式修飾以表現包含淋巴增殖性元件之第一工程化信號傳導多肽及包含嵌合抗原受體之第二工程化信號傳導多肽，該嵌合抗原受體包括抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在另一態樣中，本文提供經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，其包含：A.第一工程化信號傳導多肽，其包含至少一個淋巴增殖性元件；及 B.第二工程化信號傳導多肽，其包含嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在一些實施例中，在不存在使細胞暴露於細胞介素(諸如IL-15、IL-7且在說明性實施例中，IL-2)及視情況選用之針對由細胞表現之CAR之ASTR之靶標的情況下，或在某些說明性實施例中在存在由CAR識別之抗原的情況下(特定而言其中以基因方式修飾之T細胞或NK細胞藉由使用於其表面上具有假型化元件及視情況選用之分離或經融合活化域的反轉錄病毒顆粒以基因方式修飾及/或轉細胞且通常不需要進行預活化而形成)，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞能夠在培養期間在培養物中於離體或活體外存活及/或增殖及/或擴展6天、7天、14天、21天或35天、42天或更久時間。在一些實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞包含嵌合細胞介素受體。在一些實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞不包含嵌合細胞介素受體。
在本文提供之包括哺乳動物封裝細胞之方法(包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒封裝系統態樣，或用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法)中之任一者中，例如，可封裝RNA基因組由可操作地連接至啟動子之聚核苷酸編碼，其中該啟動子具有組成性活性或可由第一反式活化子或第二反式活化子誘導。可封裝RNA基因組可由可操作地連接至啟動子之聚核苷酸編碼，其中該啟動子可由第二反式活化子誘導。本文中用於驅動第一及/或第二工程化信號傳導多肽之表現之啟動子通常在靶細胞(例如淋巴球、PBL、T細胞及/或NK細胞)中具有活性，但在說明性實施例中，在封裝細胞系中不具有活性。第二反式活化子可調節能夠結合並活化靶細胞之活化元 件的表現。在本文提供之包括哺乳動物封裝細胞之方法(包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒封裝系統態樣，或用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(例如，一些實施例中之可封裝RNA基因組)之方法)中之任一者中，可封裝RNA基因組之表現可由第二反式活化子調節。
此外，可封裝RNA基因組自5’至3’包含：1.)5’長末端重複或其活化片段；2.)核酸序列，其編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件；3.)編碼第一靶標多肽之核酸序列及/或編碼一或多種(例如兩種或更多種)抑制性RNA分子之核酸序列；4.)在靶細胞中具有活性之啟動子；及5.)3’長末端重複或其活化片段。
在一些實施例中，編碼第一靶標多肽之核酸序列與編碼用於封裝及組裝之反轉錄病毒組分的RNA及5’LTR呈相反定向。
在本文提供之包括哺乳動物封裝細胞之方法(包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒封裝系統態樣，或用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法)中之任一者中，例如第一靶標多肽包含第一工程信號傳導多肽且其中該第一工程化信號傳導多肽包含至少一個淋巴增殖性元件。可封裝RNA基因組可進一步包含編碼第二靶標多肽之核酸序列。第二靶標多肽可包含包括嵌合抗原受體之第二工程化信號傳導多肽，該嵌合抗原受體包含：1.)第一抗原特異性靶向區；2.)第一跨膜域；及3.)第一胞內活化域。
在本文提供之包括哺乳動物封裝細胞之方法(包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒封裝系統態樣，或用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(例如哺乳動物細胞)之方法)中之任一者中，例如封裝細胞可包括例如在第二轉錄單元或視情況存在之第三轉錄單元上或在可操作地連接至第一可誘導啟動子之其他轉錄單元上編碼Vpu多肽的核酸序列。在本文提供之包括哺乳動物封裝細胞之方法(包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒封裝系統態樣，或用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(例如哺乳動物細胞)之方法)中之任一者中，例如，封裝細胞可包括例如在第二轉錄單元或視情況存在之第三轉錄單元上或在可操作地連接至第一可誘導啟動子之其他轉錄單元上編碼Vpx多肽及Vpu多肽兩者的核酸序列。可為封裝細胞之哺乳動物細胞可為293細胞。
在本文提供之包括哺乳動物封裝細胞之方法(包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒封裝系統態樣，或用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(例如哺乳動物細胞)之方法)中之任一者中，例如封裝細胞可包括例如在第二轉錄單元或視情況存在之第三轉錄單元上或在可操作地連接至第一可誘導啟動子之其他轉錄單元上編碼Vpx的核酸序列。可為封裝細胞之哺乳動物細胞可為293細胞。
在本文提供之包括哺乳動物封裝細胞之方法(包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒封裝系統態樣，或用於製備非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法)中之任一者中，第一配位體可為雷帕黴素，且第二配位體可為四環素或阿黴素，或第一配體可為四環素或阿黴素且第二配體可為雷帕黴素。
在一些態樣中，本文提供已藉由本文提供之非複製勝 任型重組反轉錄病毒顆粒中之任一者轉導之細胞。該細胞可為例如淋巴球，諸如T細胞或NK細胞。在說明性實施例中，該細胞為人類細胞。
在一個態樣中，本文提供用於擴增個體中經修飾之T細胞及/或NK細胞的方法，該方法包含：A.使自該個體獲得之經分離休眠T細胞及/或休眠NK細胞與本文所揭示之實施例中之任一者的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸；B.將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中；及C.向該個體提供有效量之阿昔洛韋、阿昔洛韋前藥、噴昔洛韋或噴昔洛韋前藥，其中該經修飾之T細胞及/或NK細胞在投予阿昔洛韋、阿昔洛韋前藥、噴昔洛韋或噴昔洛韋前藥後在該個體中增殖，從而擴增個體中之經修飾之T細胞及/或NK細胞。
在另一態樣中，本文提供用於停止個體中經修飾之T細胞及/或NK細胞之擴增、移植及/或持久性的方法，該方法包含：A.使自該個體獲得之經分離靜息T細胞及/或NK細胞與本文所揭示之實施例中之任一者的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸；B.將經修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中；C.向該個體投予有效量之阿昔洛韋、阿昔洛韋前藥、噴昔洛韋或噴昔洛韋前藥以擴增個體中經修飾之T細胞及/或NK細胞，其中該經修飾之T細胞及/或NK細胞在投予阿昔洛韋、阿昔洛韋前藥、噴昔洛韋、噴昔洛韋前藥後在該個體中增殖，從而擴增個體中之經修飾PBL；及D.停止投予阿昔洛韋、阿昔洛韋前藥、噴昔洛韋或噴昔洛韋前 藥，其中該經修飾之T細胞及/或NK細胞在停止投予阿昔洛韋、阿昔洛韋前藥、噴昔洛韋或噴昔洛韋前藥後在該個體中停止增殖，從而控制個體中之經修飾之T細胞及/或NK細胞之擴增、移植及/或持久性。
在另一態樣中，本文中提供一種治療個體中之癌症之方法，該方法包含：A.使自該個體獲得之經分離靜息T細胞及/或NK細胞與根據本文所揭示之實施例中之任一者之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸；B.將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中；及C.向該個體投予有效量之阿昔洛韋、阿昔洛韋前藥、噴昔洛韋或噴昔洛韋前藥以擴展個體中之經修飾T細胞及/或NK細胞，其中該經修飾T細胞及/或NK細胞在投予阿昔洛韋、阿昔洛韋前藥、噴昔洛韋、噴昔洛韋前藥後在該個體中增殖，且其中該經修飾T細胞及/或NK細胞中之嵌合抗原受體結合個體中之癌細胞，從而治療個體中之癌症。
在另一態樣中，本文中提供一種經轉導T細胞及/或NK細胞，其包含重組聚核苷酸，該重組聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼由控制元件調節之第一工程化信號傳導多肽，其中該第一工程化信號傳導多肽包含組成性活性IL-7受體突變體，且其中該控制元件能夠活體內與化合物結合，及/或經設計及/或經組態與化合物結合。
在另一態樣中，本文中提供一種反轉錄病毒封裝系 統，其包含：哺乳動物細胞，其包含：A.第一反式活化子，其由組成性啟動子表現且能夠結合第一配位體及第一可誘導啟動子以供在第一配位體之存在對比缺失下影響可操作地連接至其之核酸序列之表現；B.第二反式活化子，其能夠結合第二配位體及第二可誘導啟動子，且在第二配位體之存在對比缺失下影響可操作地連接至其之核酸序列之表現；及C.針對反轉錄病毒顆粒之可封裝RNA基因組，其中該第一反式活化子調節該第二反式活化子及反轉錄病毒REV蛋白質之表現，其中該第二反式活化子調節gag多肽、pol多肽及能夠與靶細胞結合且有助於與其膜融合之一或多個假型化元件之表現，且其中反轉錄病毒蛋白質衍生自反轉錄病毒。此態樣之實施例可包括針對其他態樣中之所述實施例在本文中提供之實施例中之任一者。
在另一態樣中，本文提供一種用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法，其包含：A.培養封裝細胞之群體以積聚第一反式活化子，其中封裝細胞包含由第一組成性啟動子表現之第一反式活化子，其中第一反式活化子能夠結合第一配位體及第一可誘導啟動子以供在第一配位體之存在下對比於缺失下影響可操作地連接至其之核酸序列之表現，且其中由第一反式活化子調節第二反式活化子及反轉錄病毒REV蛋白質之表現；B.在第一配位體之存在下培育包含經積聚第一反式活化子之 封裝細胞之群體以積聚第二反式活化子及反轉錄病毒REV蛋白質，其中第二反式活化子能夠結合第二配位體及第二可誘導啟動子以供在第二配位體之存在下對比於缺失下影響可操作地連接至其之核酸序列之表現；及C.在第二配位體之存在下培育包含經積聚第二反式活化子及反轉錄病毒REV蛋白質之封裝細胞之群體，從而誘導gag多肽、pol多肽及一或多個假型化元件之表現，從而製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中可封裝RNA基因組係由可操作地連接至第三啟動子之聚核苷酸編碼，其中該第三啟動子係組成性活性的或可由第一反式活化子或第二反式活化子誘導，且其中一或多個假型化元件能夠與靶標細胞結合及/或有助於膜與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒融合。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法的一些實施例中，哺乳動物細胞進一步包含能夠與靶細胞(通常為淋巴球，諸如NK細胞或在說明性實施例中為T細胞)結合且活化靶細胞之活化元件，且第一反式活化子調節活化元件之表現。活化元件在非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之表面上且其中該活化元件可包括：能夠與CD3結合之膜結合多肽；及/或能夠與CD28結合之膜結合多肽。能夠與CD3結合之膜結合多肽為能夠與融合至異源GPI錨定連接序列之CD3結合之多肽，且能夠與CD28結合之膜結合多肽為能夠與融合至異源GPI錨定連接序列之CD28結合之多肽。能夠與CD28結合之膜結合多肽在一些實施例中包含CD80、CD86或能夠誘導經CD28介導之Akt之活化的其功能性片段 (諸如CD80之胞外域)。在其他實施例中，能夠結合CD3之膜結合多肽為與CD14 GPI錨定連接序列結合之抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc，且其中能夠與CD28結合之膜結合多肽為CD80，或與CD16B GPI錨定連接序列結合之其胞外片段。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，哺乳動物細胞進一步包含膜結合細胞介素，且第一反式活化子調節膜結合細胞介素之表現。膜結合細胞介素可為例如IL-7、IL-15或其活化片段。實施例中之膜結合細胞介素可為IL-7或其活化片段及DAF之融合多肽。舉例而言，融合多肽可包含DAF信號序列及不具有其信號序列之IL-7，接著為DAF之殘基36至525。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，哺乳動物細胞包含與其膜相關聯之：活化元件，其包含與CD14 GPI錨定連接序列結合之抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc，或與CD16B GPI錨定連接序列結合之CD80或其胞外片段；及膜結合細胞介素，其包含IL-7或其活化片段及包含GPI錨定連接序列之DAF之融合多肽，且其中第一反式活化子調節活化元件及膜結合細胞介素中之每一者之表現。在一些實施例中，IL-7或其活化片段及DAF融合、抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc及CD80或其胞外片段各自包含DAF信號序列。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，哺乳動物細胞進一步包含Vpu多肽。在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施 例中，哺乳動物細胞進一步包含Vpu多肽及Vpx多肽。在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，哺乳動物細胞進一步包含Vpx多肽。在此等或其他實施例中，一或多個假型化元件包含由T細胞識別之一或多個病毒多肽。一或多個假型化元件可包含麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽及/或其片段。在某些說明性實施例中，一或多個假型化元件為麻疹病毒F多肽及/或麻疹病毒H多肽之細胞質域缺失變體。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，可封裝RNA基因組由可操作地連接至第三啟動子之聚核苷酸編碼，其中該第三啟動子係組成性活性的或可由第一反式活化子或第二反式活化子誘導。在說明性實施例中，可封裝RNA基因組由可操作地連接至第三啟動子之聚核苷酸編碼，其中該第三啟動子可由第二反式活化子誘導。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，可封裝RNA基因組進一步自5’至3’包含：a)5’長末端重複或其活化片段；b)核酸序列，其編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件；c)核酸序列，其編碼第一靶標多肽及視情況選用之第二靶標多肽；d)第四啟動子，其可操作地連接至第一靶標多肽及視情況選用之第二靶標多肽，其中該第四啟動子在靶細胞中具有活性但在封裝細胞株中為無活性的；及 e)3’長末端重複或其活化片段。
在包括緊接著上文構築體之本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，第三啟動子促進與由第四啟動子促進之轉錄及表現相反的方向上之轉錄或表現。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，可封裝RNA基因組編碼在本發明中揭示之任何實施例之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中第一靶標多肽及第二靶標多肽分別為第一工程化信號傳導多肽及第二工程化信號傳導多肽。在一些實施中，例如，可封裝RNA基因組進一步包含可操作地連接至核酸之控制元件，該核酸編碼第一工程化信號傳導多肽或第二工程化信號傳導多肽。控制元件在說明性實施例中為核糖開關。核糖開關在說明性實施例中能夠結合化合物且結合控制元件之化合物為核苷類似物，且該核苷類似物可為抗病毒藥物，例如阿昔洛韋或噴昔洛韋。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，可封裝RNA基因組進一步包含內含子，該內含子包含編碼抑制性RNA分子(諸如miRNA或shRNA)之聚核苷酸。內含子可鄰近於第四啟動子或在第四啟動子之下游。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，靶標細胞可為T細胞及/或NK細胞。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非 複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，一或多個假型化元件包含疱疹口腔炎病毒包膜蛋白(VSV-G)、貓類內源性病毒(RD114)包膜蛋白、致癌反轉錄病毒雙嗜性包膜蛋白或致癌反轉錄病毒親嗜性包膜蛋白或其功能性片段。
在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，可封裝RNA基因組大小為11,000KB或更小，或10,000KB或更小。在本文所提供之反轉錄病毒封裝系統及用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之方法的一些實施例中，第一靶標多肽包含第一工程化信號傳導多肽且其中該第一工程化信號傳導多肽包含至少一個淋巴增殖性元件，且第二靶標多肽包含包括CAR之第二工程化信號傳導多肽。
在包括控制元件之本文所提供之該等方法及組合物中之任一者的說明性實施例中可為包含核糖開關之聚核苷酸。核糖開關可能夠結合核苷類似物且結合控制元件之化合物為核苷類似物。核苷類似物可為抗病毒劑。抗病毒劑可為阿昔洛韋或噴昔洛韋。核糖開關可較佳地經由噴昔洛韋結合阿昔洛韋或較佳地經由阿昔洛韋結合噴昔洛韋。核糖開關可在高於37℃、37.5℃、38℃、38.5℃或39℃(例如，高於39℃)之溫度下減少與核苷類似物抗病毒藥物之結合。核糖開關可在長度為35、40、45及50個核苷酸之範圍之低端與長度為60、65、70、75、80、85、90、95及100個核苷酸之範圍之高端之間，例如在長度為45與80個核苷酸之間。在包括核糖開關之本文所提供之該等方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，由核糖開關調節之聚核苷酸靶標聚核苷酸可包括編碼miRNA、shRNA及/或多肽之區域。 聚核苷酸靶標聚核苷酸可編碼淋巴增殖性元件。聚核苷酸靶標聚核苷酸可哥操作地連接至啟動子。聚核苷酸靶標聚核苷酸可包括編碼多肽之區域，且該多肽可包括嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區、跨膜域及胞內活化域。在包括核糖開關之本文所提供之該等方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，功能切換域可調節內部核糖體進入位元點、病毒基因構築體中之pre-mRNA剪接供體可及性、轉譯、轉錄終止、轉錄降解、miRNA表現或shRNA表現，從而調節聚核苷酸靶標聚核苷酸之表現。核糖開關可包括核糖核酸酶。在本文所提供之包括核糖開關之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，經分離聚核苷酸可為分子選殖載體或表現載體。在本文所提供之包括核糖開關之方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，可將經分離聚核苷酸整合至反轉錄病毒基因組中或至哺乳動物染色體或其片段中。在本文中之包含核糖開關之態樣及實施例中之任一者的說明性實施例中，核糖開關調節前mRNA剪接。舉例而言，核糖開關可包含通常在本文中之聚核苷酸及/或轉錄單元上之兩個外顯子之間的分支點序列。因此，核苷類似抗病毒化合物或藥物與核糖開關之結合調節外顯子剪接。此類實施例可包括聚核苷酸，該聚核苷酸包含第一外顯子、第二外顯子及在第一外顯子與第二外顯子之間的核糖開關，其中該核糖開關包含分支點序列，且其中核苷類似抗病毒化合物或藥物(例如阿昔洛韋)與核糖開關之結合調節第一及第二外顯子之外顯子剪接。在本文中之包含核糖開關之態樣及實施例中之任一者的說明性實施例中，核糖公開可藉由調節前mRNA反式剪接來控制基因表現。在此類實施例中，核糖開關位於反式剪接內含子內。舉例而言，一個態樣可包括聚核苷酸，該聚核苷酸包含第一外顯子、第二外顯子 及在第一外顯子與第二外顯子之間的核糖開關，其中該核糖開關包含分支點序列，且其中阿昔洛韋與核糖開關之結合調節第一及第二外顯子之外顯子剪接。
在任一非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之說明性實施例中，該反轉錄病毒顆粒為慢病毒顆粒。在該方法之其他說明性實施例中，能夠與CD3結合之多肽及能夠與CD28結合之多肽各自與異源性GPI錨定連接序列融合。在一些情況下，能夠與CD3結合之多肽可為抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv，且能夠與CD28結合之多肽可為CD80。抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv及CD80可各自進一步與DAF信號序列融合。在另一說明性實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上進一步包含融合多肽，該融合多肽包含共價連接至DAF之細胞介素。在一些情況下，細胞介素可為IL-7或IL-15，且融合多肽可包含DAF信號序列、不具有其信號序列之IL-7及包含GPI錨定連接序列之DAF之片段。
在本文中之任一非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣之另一說明性實施例中，核糖開關進一步以藉由核糖開關與核苷類似抗病毒藥物之結合調節之方式來控制嵌合抗原受體之表現，該核苷類似抗病毒藥物在一些情況下為阿昔洛韋及/或噴昔洛韋。在另一實施例中，組成性活性IL-7可經miRNA或shRNA或編碼miRNA或shRNA之核酸替換，且可存在IL-7。miRNA或shRNA可由內含子內之核酸編碼。
本文中提供之另一態樣為一種用於製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之方法，其包含：A.培養封裝細胞之群體以積聚第一反式活化子，其中封裝細胞 包含由組成性啟動子表現之第一反式活化子，其中第一反式活化子能夠結合第一配位體及第一可誘導啟動子以供在第一配位體之存在下對比於缺失下影響可操作地連接至其之核酸序列之表現，且其中由第一反式活化子調節第二反式活化子及反轉錄病毒REV蛋白質之表現；B.在第一配位體之存在下培育包含經積聚第一反式活化子之封裝細胞之群體以積聚第二反式活化子及反轉錄病毒REV蛋白質及通常在其表面上之活化元件，該活化元件包含能夠與CD3結合之多肽及包含能夠與CD28結合之多肽，其中第二反式活化子能夠結合第二配位體及第二可誘導啟動子以供在第二配位體之存在下對比於缺失下影響可操作地連接至其之核酸序列之表現；及C.在第二配位體之存在下培育包含經積聚第二反式活化子及反轉錄病毒REV蛋白質之封裝細胞之群體，從而誘導gag多肽、pol多肽及能夠與T細胞且/或NK細胞結合且有助於與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒膜融合之假型化元件之表現，其中該假型化元件包含麻疹病毒F多肽及/或麻疹病毒H多肽之細胞質域缺失變體，其中可封裝RNA基因組係由可操作地連接至第三啟動子之聚核苷酸編碼，且其中該啟動子可由第二反式活化子誘導，其中可封裝RNA基因組自5’至3’包含：i. 5’長末端重複或其活化片段；ii.核酸序列，其編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件；iii.核酸序列，其編碼由裂解信號隔開之包含嵌合抗原受體之第一工程化信號傳導多肽及包含組成性活性IL-7受體突變體之第二工程化信號傳導多肽； iv.第四啟動子，其在T細胞及/或NK細胞中具有活性；及v.3’長末端重複或其活化片段，從而製造非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。
在該方法之一說明性實施例中，可封裝RNA基因組進一步包含結合核苷類似物抗病毒藥物之核糖開關，其中使核糖開關結合至核苷類似物抗病毒藥物增加IL-7受體突變體之表現。在一些實施例中，核糖開關進一步以藉由結合核糖開關與核苷類似物抗病毒藥物之結合調節之方式來控制嵌合抗原受體之表現。在另一說明性實施例中，核苷類似物抗病毒藥物為阿昔洛韋及/或噴昔洛韋。在另一說明性實施例中，可封裝RNA基因組進一步包含識別域，其中該識別域包含由識別EGFR或其抗原決定基之抗體識別之多肽。在另一說明性實施例中，第一配位體為雷帕黴素，且第二配位體為四環素或阿黴素；或第一配位體為四環素或阿黴素，且第二配位體為雷帕黴素。在另一說明性實施例中，封裝細胞進一步包含在第二或視情況選用之第三轉錄單元上或可操作地連接至第一可誘導啟動子之其他轉錄單元上編碼Vpu之核酸序列。在另一說明性實施例中，封裝細胞進一步包含在第二或視情況選用之第三轉錄單元上或可操作地連接至第一可誘導啟動子之其他轉錄單元上編碼Vpu多肽及Vpx多肽之核酸序列。在另一說明性實施例中，封裝細胞進一步包含在第二或視情況選用之第三轉錄單元上或可操作地連接至第一可誘導啟動子之其他轉錄單元上編碼Vpx之核酸序列。在另一說明性實施例中，能夠與CD3結合之多肽及能夠與CD28結合之多肽各自與異源性GPI錨定連接序列融合。在一些情況下，能夠與CD3結合之多肽可為抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv，且能夠與CD28結合之多肽可為CD80。抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv及CD80可各自進一步與DAF信號序列融合。在另一說明性實施例中，亦包括包含共價連接至DAF之細胞介素之融合多肽的表現。在一些情況下，細胞介素可為IL-7或IL-15，且融合多肽可包含DAF信號序列、不具有其信號序列之IL-7及包含GPI錨定連接序列之DAF之片段。在另一說明性實施例中，核糖開關進一步以藉由核糖開關與核苷類似物抗病毒藥物之結合調節之方式來控制嵌合抗原受體之表現，該核苷類似物抗病毒藥物在一些情況下為阿昔洛韋及/或噴昔洛韋。在另一實施例中，組成性活性IL-7可經miRNA或shRNA或編碼miRNA或shRNA之核酸替換，且可存在IL-7。miRNA或shRNA可由內含子內之核酸編碼。在一說明性實施例中，反轉錄病毒顆粒為慢病毒顆粒。
本文中之另一態樣中提供一種以基因方式修飾之淋巴球，其包含：A.第一工程化信號傳導多肽，其包含組成性活性IL-7受體突變體；及B.第二工程化信號傳導多肽，其包含嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在以上經基因方式修飾之淋巴球之說明性實施例中，經基因方式修飾之淋巴球為T細胞及/或NK細胞。在某些實施例中，淋巴球為T細胞。在另一說明性實施例中，該第一工程化信號傳導多肽及/或該第二工程化信號傳導多肽之表現係由結合核苷類似物抗病毒藥物之核糖開關調節，其中核苷類似物抗病毒藥物與核糖開關之結合增加IL-7受體突變體之表現。在另一實施例中，經基因方式修飾之淋巴球表現至少一種(例如，兩種)抑制性RNA分子，諸如miRNA或shRNA。抑制性RNA分子可進一步由內含子內之核酸編碼。
本文中之另一態樣提供一種以基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，其包含：a.第一工程化信號傳導多肽，其包含至少一個淋巴增殖性元件；及b.第二工程化信號傳導多肽，其包含嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞態樣之說明性實施例中，淋巴增殖性元件係組成性活性的，且在一些情況下為組成性活性突變的IL-7受體或其片段。在另一說明性實施例中，第一工程化信號傳導多肽及/或第二工程化信號傳導多肽之表現係由控制元件調節。在一些情況下，控制元件為包含核糖開關之聚核苷酸。在一些情況下，核糖開關能夠結合核苷類似物且當核苷類似物存在時，表現第一工程化信號傳導多肽及/或第二工程化信號傳導多肽。在其他說明性實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞在其表面上具有活化元件、假型化元件及/或膜結合細胞介素。在一些情況下，活化元件包含能夠與CD3結合之膜結合多肽；及/或能夠與CD28結合之膜結合多肽。在某些實施例中，活化元件包含與異源性GPI錨定連接序列融合之抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc及/或與異源性GPI錨定連接序列融合之CD80。在一說明性實施例中，假型化元件包含麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽，及/或麻疹病毒F多肽及/或麻疹病毒H多肽之細胞質域缺失變體。在其他實施例中，膜結合細胞介素為包含IL-7或融合至DAF或包含GPI錨定連接序列之其片段之融合多肽。
在一個態樣中，本文中提供一種用於以基因方式修飾及擴展個體之淋巴球的方法，其包含： A.使個體之休眠T細胞及/或NK細胞活體外在通常不需要進行預先活體外刺激之情況下與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，該等非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含：i.在其表面上之假型化元件，該假型化元件能夠與T細胞及/或NK細胞結合且有助於與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒膜融合；及ii.聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元：編碼由控制元件調節之第一工程化信號傳導多肽，其中該第一工程化信號傳導多肽包含至少一個淋巴增殖性元件；且視情況編碼由控制元件視情況調節之第二工程化信號傳導多肽，其中第二工程化信號傳導多肽包含胞內活化域及視情況選用之CAR之其他組分，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞中之至少一些，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；B.將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中；及將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞活體內暴露於充當控制元件之化合物以影響第一工程化信號傳導多肽之表現且活體內促進淋巴球之擴展、移植及/或持久性，從而以基因方式修飾及擴展個體之淋巴球。
在說明性實施例中，在無需活體外刺激之情況下進行轉導。在說明性實施例中，化合物為分子伴侶，諸如小分子伴侶。在說明性實施例中，分子伴侶與淋巴增殖性元件之結合增加淋巴增殖性元件之增殖活性。可在收集血液之前、在接觸期間及/或在將T細胞及 /或NK細胞引入至個體中之後將分子伴侶投予至個體。將藉由化合物係控制元件之此態樣瞭解，此化合物通常能夠與淋巴增殖性元件及/或CAR之組分結合，且在執行該方法期間與此淋巴增殖性元件或CAR組分結合。與包括用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉染T細胞及/或NK細胞的本文所提供之方法相關之其他實施例及教示應用於此態樣，亦包括分子伴侶實施例。
在另一態樣中，本文中提供一種用於結合靶標抗原之嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包含：a)受微環境限制之抗原特異性靶向區，其與正常生理環境下相比，在異常條件下展現與靶標抗原之結合之增加，其中抗原特異性靶向區與靶標結合；b)跨膜域；及c)胞內活化域。
在包括受微環境限制之抗原特異性靶向區(ASTR)之本文所提供之該等方法及組合物中之任一者的說明性實施例中，與正常條件下相比，ASTR在異常條件下之分析中對靶標抗原可增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之結合親和力。異常條件可為低氧、酸性pH、較高濃度之乳酸、較高濃度之透明質酸、較高濃度之白蛋白、較高濃度之腺苷、較高濃度之R-2-羥基戊二酸、較高濃度之PAD酶、較高壓力、較高氧化反應及較低養分可用性。如相比於在7.4之pH下，受微環境限制之ASTR在6.7之pH下可展現抗原結合之增加。受微環境限制之ASTR可展現在與對應生理條件相關之腫瘤環境及/或活體內腫瘤環境分析條件中之抗原結合之增加。靶標可為4-1BB、ST4、腺癌抗原、α-胎蛋 白、AXL、BAFF、B-淋巴瘤細胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶-9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD 152、CD 19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受體)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNT0888、CTLA-4、DRS、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纖連蛋白外域-B、葉酸受體1、GD2、GD3神經節苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人類分散因子受體激酶、IGF-1受體、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、類胰島素生長因子I受體、整合素nSP1、整合素nvP3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、黏蛋白CanAg、N葡萄糖代神經胺酸、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂醯絲胺酸、前列腺癌細胞、RANKL、RON、ROR1、ROR2 SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGF β 2、TGF-P、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2及波形蛋白。ASTR可為抗體、抗原、配位體、配位體之受體結合域、受體、受體之配位體結合域或親和體。ASTR可為全長抗體、單鏈抗體、Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段以及二價單鏈抗體或雙功能抗體。ASTR可包括來自抗體之重鏈及輕鏈。抗體可為單鏈可變片段。在一些實施例中，重鏈及輕鏈可由連接子隔開，其中該連接子長度在6與100個胺基酸之間。在一些實施例中，重鏈可定位於嵌合抗原受體上之輕鏈之N端，且在一些實施例中輕鏈可定位於嵌合抗原受體上之重鏈之N端。
在包括多肽顯示庫之本文所提供之該等方法中之任一者的說明性實施例中，多肽顯示庫可為噬菌體顯示庫或酵母顯示庫。多肽顯示庫可為抗體顯示庫。抗體顯示庫可為人類或人類化抗體顯示庫。抗體顯示庫可為原生庫。該等方法可包括用所收集噬菌體感 染細菌細胞以產生精製噬菌體顯示庫，且重複接觸、培育及收集1至1000個循環，使用由前述循環產生之精製噬菌體顯示庫。
在另一態樣中本文中提供一種經轉導T細胞及/或NK細胞，其包含重組聚核苷酸，該重組聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼由控制元件調節之第一工程化信號傳導多肽，其中該第一工程化信號傳導多肽包含組成性活性IL-7受體突變體，且其中控制元件能夠活體外或活體內與化合物結合，或經組態以活體內結合化合物。
在另一態樣中本文中提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其包含重組聚核苷酸，該重組聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子之一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼由控制元件(其可為活體內控制元件)調節之第一工程化信號傳導多肽，其中該第一工程化信號傳導多肽包含組成性IL-7受體突變體，且其中控制元件能夠活體內與化合物結合，或經組態以活體內結合化合物。
在另一態樣中本文中提供一種轉導T細胞及/或NK細胞之方法，該方法包含：使T細胞及/或NK細胞與包含重組聚核苷酸之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，該重組聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子之一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼由控制元件調節之第一工程化信號傳導多肽，其中該第一工程化信號傳導多肽包含組成性IL-7受體突變體，且其中活體內控制元件能夠在轉導條件下活體內或活體外與化合物結合，從而轉導T細胞及/或NK細胞。
在前述段落提供之經轉導T細胞及/或NK細胞態樣、非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒態樣、及方法態樣之說明性實施例中，重組聚核苷酸進一步包含編碼包含第一嵌合抗原受體之第二工程化信號傳導多肽之轉錄單元，該第一嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在其他說明性實施例中，淋巴增殖性元件包含經突變IL-7受體或其片段。在其他說明性實施例中，控制元件為包含核糖開關之聚核苷酸。在一些情況下，核糖開關能夠結合核苷類似物且結合控制元件之化合物為核苷類似物。在一些情況下，核苷類似物為抗病毒劑，諸如阿昔洛韋或噴昔洛韋。在某些實施例中，抗病毒劑為阿昔洛韋。在其他說明性實施例中，組成性活性IL-7受體突變體與EGFR或其抗原決定基融合。在其他說明性實施例中，組成性活性IL-7受體突變體包含eTag。在其他說明性實施例中，組成性活性IL-7受體突變體包含PPCL插入。在其他說明性實施例中，組成性活性IL-7受體突變體包含等效於野生型人類IL-8受體中之位置243之位置處之PPCL插入。在其他說明性實施例中，經轉導T細胞及/或NK細胞為經轉導T細胞。
在一個態樣中，本文中提供一種在其基因組中包含聚核苷酸之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中：a.一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，及b.該一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及 胞內活化域。
在本文中之另一態樣中提供一種包含非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之可封裝RNA基因組之哺乳動物封裝細胞株，其中該可封裝RNA基因組包含：a. 5’長末端重複或其活化片段；b. 核酸序列，其編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件；c. 聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中一或多個核酸之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域；及d. 3’長末端重複或其活化片段。
在哺乳動物封裝細胞株態樣之一些實施例中，(c)之聚核苷酸可在與編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件(b)、5’長末端重複(a)及/或3’長末端重複(d)之核酸序列呈相反定向。
在哺乳動物封裝細胞株態樣之一些實施例中，可封裝RNA基因組之表現藉由在哺乳動物封裝細胞株中具有活性之可誘導啟動子驅動。
在哺乳動物封裝細胞株態樣之一些實施例中，反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件可包含中央聚嘌呤段(cPPT)/中央終止序列、HIV Psi或其組合。
本文中之另一態樣提供一種反轉錄病毒載體，其包含針對非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之可封裝RNA基因組，其中該 可封裝RNA基因組包含：a. 5’長末端重複或其活化片段；b. 核酸序列，其編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件；c. 聚核苷酸，其包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中一或多個核酸之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域；及d. 3’長末端重複或其活化片段。
在反轉錄病毒載體態樣之一些實施例中，(c)之聚核苷酸可在與編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件之核酸序列(b)、5’長末端重複(a)及/或3’長末端重複(d)相反之定向中。
在反轉錄病毒載體態樣之一些實施例中，可封裝RNA基因組之表現係由在哺乳動物封裝細胞株中具有活性之可誘導啟動子驅動。
在反轉錄病毒載體態樣之一些實施例中，反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件可包含中央聚嘌呤段(cPPT)/中央終止序列、HIV Psi或其組合。反轉錄病毒載體可視情況包括抗生素抗性基因及/或可偵測標記。
在另一態樣中，本文提供一種用於以基因方式修飾或轉導個體之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或其群之方法，該方法包含使個體之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或其群活體外與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，該非複製勝任型重組反轉錄病毒 顆粒在其基因組中包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中該一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且該一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒基因修飾及/或轉導淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)中之至少一些，從而產生經基因方式修飾及/或轉導之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)。
在緊接著上文提供之方法之一些實施例中，將經基因方式修飾及/或轉導之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或其群引入至個體中。在一些實施例中，經基因方式修飾及/或轉導之淋巴球(例如，T細胞及/或NK細胞)或其群體在被引入或再次引入至個體中之前活體外經歷4次或更少細胞分裂。在一些實施例中，淋巴球為與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸1小時與12小時之間的休眠T細胞及/或休眠NK細胞。在一些實施例中，自個體收集血液之時間與將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞再引入至個體中之時間之間不超過8小時。在一些實施例中，在收集血液之後及再引入血液之前的所有步驟均在封閉系統中執行，在整個處理期間人監測該封閉系統。
在另一態樣中，本文中提供一種經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，其包含：a.針對一或多個RNA靶標一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子；及 b.嵌合抗原受體(CAR)，其包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，其中該一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子及CAR係由T細胞及/或NK細胞之基因修飾之核酸序列編碼。
在經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞態樣之一些實施例中，經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞亦包含不為抑制性RNA分子之至少一個淋巴增殖性元件，其中該淋巴增殖性元件係由T細胞及/或NK細胞之基因修飾之核酸編碼。在一些實施例中，抑制性RNA分子、CAR及/或至少一個淋巴增殖性元件以多順反子物質表現。在說明性實施例中，抑制性RNA分子由單個多順反子轉錄物表現。
在另一態樣中本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒以供在用於以基因方式修飾個體之淋巴球之方法中使用，以供治療腫瘤生長，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其基因組中包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，且第二核酸序列編碼淋巴增殖性元件，其中該方法包含活體外接觸個體之T細胞及/或NK細胞，且該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞中之至少一些，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，CAR為MRB-CAR。在本文中所提供之包括MRB-CAR之態樣中之任一者中，MRB-CAR可在一個pH值下比在不同pH值下具有減少的與其同源抗原的結合。在一些實施例中，MRB-CAR可在高於7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5之pH 下比在低於6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0之pH下具有減少的與其同源抗原之結合。在其他實施例中，MRB-CAR可在較高pH下比在較低pH下具有減少的結合。舉例而言，MRB-CAR可在低於6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0之pH下比在高於7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5之pH下具有減少的與其同源抗原之結合。在其他實施例中，在腫瘤之pH中相較於在血液之pH中，MRB-CAR呈現出經增加之結合。在一些實施例中，藥劑用於方法中，該方法進一步包括將經基因方式工程化之T細胞及/或NK細胞引入至個體中。在一些實施例中，藥劑可為碳酸氫鈉、三-羥甲基胺基甲烷、碳酸氫鈉與碳酸鈉之等莫耳高滲溶液或質子泵抑制劑，諸如艾美拉唑(esomeprazole)、艾美拉唑及萘普生(naproxen)、蘭索拉唑(lansoprazole)、奧美拉唑(omeprazole)及雷貝拉唑(rabeprazole)。
在另一態樣中本文提供一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒以供在用於以基因方式修飾個體之T細胞及/或NK細胞之方法中使用，以供治療腫瘤生長，其中該方法包含：a)使個體之T細胞及/或NK細胞活體外與在其基因組中包含聚核苷酸之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞中之至少一些，從而產生經基因 方式修飾之T細胞及/或NK細胞；及b)將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中，從而以基因方式修飾個體之T細胞及/或NK細胞。
在緊接著上文提供之態樣中，在一些實施例中，T細胞及/或NK細胞之群體在接觸步驟中接觸，且在引入步驟中引入至個體中。
在另一態樣中本文提供非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在製造用於以基因方式修飾個體之T細胞及/或NK細胞之套組中之用途，其中該套組之用途包含：A.使個體之T細胞及/或NK細胞活體外與在其基因組中包含聚核苷酸之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼針對一或多個靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞中之至少一些，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；及B.將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中，從而以基因方式修飾個體之T細胞及/或NK細胞。
在另一態樣中本文提供非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在製造用於以基因方式修飾個體之T細胞及/或NK細胞之藥劑中之用途，其中該藥劑之用途包含： A)使個體之T細胞及/或NK細胞活體外與在其基因組中包含聚核苷酸之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼針對一或多個靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，其中該接觸有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導休眠T細胞及/或NK細胞中之至少一些，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；及B)將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至個體中，從而以基因方式修飾個體之T細胞及/或NK細胞。
在另一態樣中本文提供一種含有非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒及用以以治療個體中之腫瘤生長之其使用說明書的商用容器，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其基因組中包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在一些實施例中，在商用容器之態樣中，該說明書指導使用者活體外接觸個體之T細胞及/或NK細胞，以有助於利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導個體之至少一個休眠T細胞及/或 NK細胞，從而產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，其中一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，該聚核苷酸可進一步包括第三核酸序列，該第三核酸序列編碼不為抑制性RNA分子之至少一個淋巴增殖性元件。在一些實施例中，淋巴增殖性元件可為細胞介素或細胞介素受體多肽，或其包含信號傳導域之片段。在一些實施例中，淋巴增殖性元件為組成性活性。在某些實施例中，淋巴增殖性元件可為IL-7受體或其片段。在說明性實施例中，淋巴增殖性元件可為組成性活性IL-7受體或其組成性活性片段。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，其中一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，抑制性RNA分子在一些實施例中可包括與彼此部分或完全互補之5’鏈及3’鏈，其中該5’鏈及該3’鏈能夠形成18至25個核苷酸RNA雙螺旋。在一些實施例中，5’鏈長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸，且3’鏈長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，5’鏈及3’鏈長度可相同或不同。在一些實施例中，RNA雙螺旋可包括一或多個錯配。在替代實施例中，RNA雙螺旋不具有錯配。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，一或多個核酸序列之第一核酸序列可編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，抑制性RNA分子可為miRNA或shRNA。在一些實施例中，抑制性分子可為miRNA之前體，諸如Pri-miRNA或前miRNA，或shRNA之前體。在一些實施例中，抑制性分子可為人工衍生之miRNA或ShRNA。在其他實施例中，抑制性RNA分子可為經處理成siRNA之dsRNA(經轉錄或人工引入)或siRNA本身。在一些實施例中，抑制性RNA分子可為miRNA或shRNA，其具有在自然界中未發現之序列，或具有在自然界中未發現之至少一個功能性區段，或具有在自然界中未發現之功能性區段之組合。在說明性實施例中，抑制性RNA分子中之至少一者或全部為miR-155。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，一或多個核酸序列之第一核酸序列可編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，在一些實施例中，抑制性RNA分子可自5’至3’定向包含：5’臂、5’莖、環、與該5’莖部分或完全互補之3’莖，及3’臂。在一些實施例中，兩個或更多個抑制性RNA分子中之至少一者具有此排列。在其他實施例中，兩個或更多個抑制性RNA分子之全部均具有此排列。在一些實施例中，5’莖長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，3’莖長度可為18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，環長度可為3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸。在一些實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自天然存在之miRNA。在一些實施例中，5’臂、3’臂或兩者均衍生自天然存在之miRNA，該天然存在之miRNA係選自以下組成之群：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在說明性實施例中，5’臂、3’臂或兩者係衍生自miR-155。在一些實施例中，5’臂、3’臂或兩者係衍生自小家鼠(Mus musculus)miR-155或智人(Homo sapiens)miR-155。在一些實施例中，5’臂具有闡述於SEQ ID NO：256中之序列或為其功能性變體，諸如長度與SEQ ID NO：256相同，或SEQ ID NO：256長度之95%、90%、85%、80%、75%或50%或為100個核苷酸或更少、95個核苷酸或更少、90個核苷酸或更少、85個核苷酸或更少、80個核苷酸或更少、75個核苷酸或更少、70個核苷酸或更少、65個核苷酸或更少、60個核苷酸或更少、55個核苷酸或更少、50個核苷酸或更少、45個核苷酸或更少、40個核苷酸或更少、35個核苷酸或更少、30個核苷酸或更少或25個核苷酸或更少的序列；且至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%與SEQ ID NO：256一致。在一些實施例中，3’臂具有闡述於SEQ ID NO：260中之序列或為其功能性變體，諸如長度與SEQ ID NO：260相同，或SEQ ID NO：260長度之95%、90%、85%、80%、75%或50%或為100個核苷酸或更少、95個核苷酸或更少、90個核苷酸或更少、85個核苷酸或更少、80個核苷酸或更少、75個核苷酸或更少、70個核苷酸或更少、65個核苷酸或更少、60個核苷酸或更少、55個核苷酸或更少、50個核苷酸或更少、45個核苷酸或更少、40個核苷酸或更少、35個核苷酸或更少、30個核苷酸或更少或25個核苷 酸或更少的序列；且至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%與SEQ ID NO：260一致。在一些實施例中，3’臂包含小家鼠BIC之核苷酸221至283。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，一或多個核酸序列之第一核酸序列可編碼針對一或多個RNA靶標之兩個或更多個抑制性RNA分子，在一些實施例中，兩個或更多個抑制性RNA分子可連續地定位於第一核酸序列中。在一些實施例中，抑制性RNA分子可利用非功能性連接子序列直接地或間接地與彼此鄰接。在一些實施例中，連接子序列長度可在5個與120個核苷酸之間，或長度在10個與40個核苷酸之間。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，一或多個核酸序列之第一核酸序列可編碼針對一或多個RNA靶標之兩個或更多個抑制性RNA分子，在一些實施例中，第一核酸序列編碼兩個至四個抑制性RNA分子。在說明性實施例中，第一核酸序列中包括2個與10個之間、2個與8個之間、2個與6個之間、2個與5個之間、2個與4個之間、3個與5個之間或3個與6個之間的抑制性RNA分子。在一說明性實施例中，第一核酸序列中包括四個抑制性RNA分子。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，一或多個核酸序列之第一核酸序列可編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，該一 或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子可在內含子中。在一些實施例中，內含子在啟動子中。在說明性實施例中，內含子為EF-1α內含子A。在一些實施例中，內含子鄰近啟動子且在啟動子之下游，在說明性實施例中，該內含子在用於產生非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之封裝細胞中為無活性的。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，其中一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼針對一或多個RNA靶標之兩個或更多個抑制性RNA分子，在一些實施例中，該兩個或更多個抑制性RNA分子可針對不同靶標。在一替代實施例中，兩個或更多個抑制性RNA分子針對同一靶標。在一些實施例中，RNA靶標為自由T細胞表現之基因轉錄之mRNA，該等mRNA諸如(但不限於)：PD-1(防止失活)；CTLA4(防止失活)；TCRa(安全地防止自體免疫)；TCRb(安全-防止自體免疫)；CD3Z(安全-防止自體免疫)；SOCS1(防止失活)；SMAD2(防止失活)；miR-155靶標(促進活化)；IFN γ(減少CRS)；cCBL(延-長信號傳導)；TRAIL2(防止死亡)；PP2A(延長信號傳導)；ABCG1(藉由限制膽固醇之清除來增加膽固醇微含量)。在一些實施例中，RNA靶標為自編碼T細胞受體(TCR)複合物之組分之基因轉錄之mRNA。在一些實施例中，兩個或更多個抑制性RNA分子中之至少一者可減少T細胞受體(在說明性實施例中，T細胞之一或多個內源性T細胞受體)之表現。在某些實施例中，RNA靶標可為自T細胞之內源性TCRα或TCRβ基因轉錄之mRNA，該T細胞之基因組包含編碼一或多個miRNA之第一核酸序列。在說明性實施例中，RNA靶標為自TCRα基因轉錄之mRNA。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，一或多個核酸序列之第一核酸序列可編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，在一些實施例中，CAR為受微環境限制之生物(MRB)-CAR。在其他實施例中，CAR之ASTR與腫瘤相關之抗原結合。在其他實施例中，CAR之ASTR為微環境受限之生物(MRB)-ASTR。
在本文提供之包括聚核苷酸(包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個核酸序列)之態樣中之任一者中，一或多個核酸序列之第一核酸序列可編碼針對一或多個RNA靶標之一或多個(例如，兩個或更多個)抑制性RNA分子，且一或多個核酸序列之第二核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，且在一些情況下，編碼至少一個淋巴增殖性元件之一或多個核酸序列之第三核酸序列不為抑制性RNA分子，在一些實施例中，第一核酸序列、第二核酸序列及第三核酸序列中之任一者或全部可操作地連接至核糖開關。在一些實施例中，核糖開關能夠結合核苷類似物。在一些實施例中，核苷類似物為抗病毒藥物。
在本文提供之包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之態樣中之任一者中，在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件，該假型化元件能夠與T細胞及/或NK細胞結合且有助於與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒膜 融合。在一些實施例中，假型化元件可為麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽、VSV-G多肽，或保留與休眠T細胞及/或休眠NK細胞結合之能力的任何其片段。在說明性實施例中，假型化元件為VSV-G。
在本文提供之包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之態樣中之任一者中，在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之活化元件，該活化元件包含能夠與CD3結合之膜結合多肽，及/或能夠與CD28結合之膜結合多肽。在一些實施例中，能夠與CD3結合之膜結合多肽與異源性GPI錨定連接序列融合，及/或能夠與CD28結合之膜結合多肽與異源性GPI錨定連接序列融合。在一些實施例中，能夠與CD3結合之膜結合多肽為抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。在說明性實施例中，能夠與CD3結合之膜結合多肽為抗CD3 scFvFc。在說明性實施例中，能夠與CD28結合之膜結合多肽為CD80，或與CD16B GPI錨定連接序列結合之其胞外細胞域。
在本文提供之包括非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之態樣中之任一者中，在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含核酸，該核酸編碼由經生物驗證之單株抗體識別之域。
在下文提供之包括促進PBMC(例如B細胞、T細胞及/或NK細胞)之細胞增殖的嵌合多肽之態樣中，嵌合多肽可在本文中稱為嵌合淋巴增殖性元件(CLE)。在下文中提供之包括編碼CLE及CAR之核酸序列的實施例在本文中稱為CLE CAR聚核苷酸實施例。
在本文中提供之包括淋巴增殖性元件之態樣及實施例中的任一者的實施例及子實施例(包括在本節上述段落中之彼等)中，淋巴增殖性元件可為本文中提供之嵌合淋巴增殖性元件中之任一 者，包括在本節之下文中。在本文中之包括CAR之態樣及實施例中的任一者的其他實施例及子實施例中，淋巴增殖性元件在說明性實施例中為由本文所提供之CLE CAR聚核苷酸(及相關多肽)實施例中之核酸編碼的嵌合淋巴增殖性元件中之任一者，例如在本節之下文中所闡述。
除非與態樣不相容，或已陳述於態樣中，否則在某些說明性實施例中，本文中所提供之包括淋巴組織增殖性元件(LE)或編碼淋巴組織增殖性元件之核酸的任何態樣或其他實施例可陳述：淋巴組織增殖性元件滿足、適用於滿足、擁有以下特性、擁有以下能力或擁有用於識別本文中所提供之LE的所識別測試中之任一者的特性，或藉由具有編碼LE之基因組的反轉錄病毒顆粒(例如，慢病毒顆粒)經基因方式修飾及/或經轉導之細胞能夠提供、適用於、擁有以下特性及/或經修飾以實現以下測試中之任一者或多者的結果：a)相較於在相同條件下之對照構築體，當與編碼包含CD3 ζ胞內活化域但無共刺激域之抗CD19 CAR之核酸一起轉導時，在不存在外源性添加之細胞介素的情況下，在活體外培養之第7天與第21天、第28天、第35天及/或第42天之間改良用包含編碼淋巴組織增殖性元件之核酸的反轉錄病毒顆粒轉導的經預活化PBMC之擴展；及/或b)當與編碼包含CD3 ζ胞內活化域但無共刺激域之抗CD19 CAR的核酸一起轉導時，在不存在外源性添加之細胞介素的情況下，在活體外培養之第7天與第21天、第28天、第35天及/或第42天之間，將用包含編碼淋巴組織增殖性元件之核酸的反轉錄病毒顆粒轉導的經預活化PBMC擴展至少2倍、3倍、4倍、6倍、7倍 或8倍，或在3倍與25倍之間、5倍與25倍之間、5倍與20倍之間、5倍與15倍之間、7倍與15倍之間或7倍與12倍之間。
在一些實施例中，使用統計測試展示根據上一段落中之要素a)來改良擴展。統計測試可使用例如等於或小於0.10、0.05或0.01之p值的截止值。舉例而言，統計測試可為T測試。對照構築體可為本文中所提供之淋巴組織增殖性元件的對照構築體，或不包含LE之對照構築體，或在說明性實施例中，對照構築體與包含淋巴組織增殖性元件之核酸構築體相同，但不具有淋巴組織增殖性元件或淋巴組織增殖性元件之胞內域。
在一個態樣中，本文提供包含一或多種核酸序列的經分離之聚核苷酸，其中：該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中包含以下之嵌合多肽，a)來自細胞介素受體或激素受體之胞外域及跨膜域，其中胞外域及跨膜域中之至少一者包含i.在細胞介素受體之組成性活性突變體上發現之突變，且其中胞外序列不結合細胞介素受體之配位體，或ii.來自LMP1之胞外域及跨膜域；及b)第一胞內域，其選自具有在表8至11中識別之所選多肽之第一胞內域的基因的胞內域，其中該嵌合多肽促進B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖。
在緊接著上文段落中之態樣的一個實施例中，第一核酸序列進一步編碼第二胞內域，其中該第二胞內域可在第一胞內域之上游(亦即5’)處，或在說明性實施例中第二胞內域在第一胞內域之下 游處。在此實施例之子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含所選擇多肽之第一胞內域及第二胞內域組合。因此，為了清楚起見，在非限制例示性實施例中，所選擇的多肽為M008-S212-S075。在此實施例中，嵌合多肽之第一胞內域包含或係TNFRSF8轉錄變體1(NM_001243_4)(S212)且第二多肽包含或係FCGR2C(NM_201563_5)(S075)。
在此態樣之一個實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之跨膜域、第一胞內域及第二胞內域。在此態樣之一個實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域。因此，為了清楚起見，在非限制例示性實施例中，所選擇的多肽為M008-S212-S075。在此實施例中，嵌合多肽之胞外域及跨膜域包含或係Myc LMP1(NC_007605_1)(M008)，嵌合多肽之第一胞內域包含或係TNFRSF8轉錄變體1(NM_001243_4)(S212)，且嵌合多肽之第二胞內域包含或係FCGR2C(NM_201563_5)(S075)。在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域視情況包含識別域或消除域，或不包含識別域或消除域。在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域以外包含所選擇多肽之識別或消除域，或另一清除標籤。在上述段落中提供之態樣的另一實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含所選擇多肽之第一胞內域及在表8至11中之任何候選多肽之第二胞內域中識別之任何基因的任何胞內域。
在此態樣之另一實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異 性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在此態樣之一子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合為所選擇多肽之第一胞內域及第二胞內域組合，且所選擇多肽經識別在表8至11中。在此實施例之另一子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，且所選擇多肽識別在表8至11中。在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域視情況包含識別或消除域，且其中該識別或消除域為所選擇多肽之胞外域之識別或消除域，或其他識別或消除域，且其中所選擇多肽經識別在表8至11中。
在另一態樣中，本文提供包含一或多種核酸序列之經分離聚核苷酸，其中：該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中包含以下之嵌合多肽，a)來自細胞介素受體或激素之胞外域及跨膜域，其中胞外域及跨膜域中之至少一者包含i.在細胞介素受體之組成性活性突變體上發現之突變，且其中胞外序列不結合細胞介素受體之配位體，或ii.來自LMP1之胞外域及跨膜域；及b)第一胞內域，其選自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8、TNFRSF9、IL31RA或MyD88之胞內域，其中該嵌合多肽促進PBMC，在說明性實施例中B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖。
在緊接著上文段落中之態樣的一個實施例中，第一核酸序列進一步編碼第二胞內域，其中該第二胞內域可在第一胞內域之 上游(亦即5’)處，或在說明性實施例中第二胞內域在第一胞內域之下游處。在此實施例之一子實施例中，第二胞內域來自在實例11之任一表中識別為在第35天對比第7天產生高於0、1或2之富集之所選擇多肽中的第二胞內域之基因，其中該第一胞內域來自所選擇多肽之第一胞內域之基因。在此子實施例或實施例之另一子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合為來自在實例11之任一表中識別為在第35天對比第7天產生高於0、1或2之富集之所選擇多肽的第一胞內域及第二胞內域。在此段落中之實施例或子實施例之另一實施例中，第一胞內域來自表8至11中所選擇多肽之所選擇第一胞內域之第一基因且第二胞內域來自所選擇多肽之所選擇第二胞內域之第二基因。在此段落中之實施例或子實施例之另一實施例中，第一胞內域來自表8至11中之所選擇多肽且第二胞內域來自標8至11中之所選擇多肽。
在其中第一核酸序列進一步編碼第二胞內域的緊接著上文實施例之另一子實施例中，第二胞內域選自在實例11中之任一表中識別為針對相應的第一胞內域在第35天對比第7天產生高於0、1或2之富集的第二胞內域。在此等實施例之子實施例中，第一胞內域選自CD27、CD40或CD79B之胞內域。在此實施例之其他子實施例中，第一胞內域選自在實例11之任一表中識別為在第35天對比第7天產生高於0、1或2之富集的CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8、TNFRSF9、IL31RA或MyD88之胞內域。在此段落中之實施例或子實施例之另一實施例中，第一胞內域來自表8至11中所選擇之嵌合多肽之第一基因且第二胞內域來自表8至11中所選擇之嵌合多肽之第二基因。在此段落中之實施例或子實施例之另一實施例中，第一胞內域來自表8至11 中所選擇嵌合多肽之第一基因且第二胞內域來自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18之胞內域。在此段落中之實施例或子實施例之另一實施例中，第一胞內域來自在表8至11中識別之所選擇多肽且第二胞內域來自在表8至11中識別之所選擇多肽。在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域視情況包含清除標籤，或不包含清除標籤，且其中所選擇多肽識別在表8至11中。在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域包含所選擇多肽之識別或消除域，或其他識別或消除域，且其中所選擇多肽識別在表8至11中。
在此態樣之另一實施例中，第一胞內域選擇CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8或TNFRSF9之胞內域，聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在此態樣之一子實施例中，第一胞內域來自所選擇多肽之第一胞內域之基因且第二胞內域來自所選擇多肽之第二胞內域之基因，且所選擇多肽經識別在表8至11中。在此態樣之一子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合為所選擇多肽之第一胞內域及第二胞內域組合，且所選擇多肽經識別在表8至11中。在此實施例之一子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，且所選擇多肽經識別在表8至11中。在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外及 跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域視情況包含識別或消除域，且其中該識別或消除域為所選擇多肽之胞外域之識別或消除域，或其他識別或消除域，且其中所選擇多肽經識別在表8至11中。
在另一態樣中，本文提供包含一或多種核酸序列之經分離聚核苷酸，其中：該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中包含以下之嵌合多肽，(a)來自細胞介素受體或激素之胞外域及跨膜域，其中胞外域及跨膜域中之至少一者包含i.在細胞介素受體之組成性活性突變體上發現之突變，且其中胞外序列不結合細胞介素受體之配位體，或ii.來自LMP1之胞外域及跨膜域；及(b)第一胞內域，其選自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18之胞內域，其中該嵌合多肽促進PBMC，且在說明性實施例中B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖。
在實例11中，在緊接著上述態樣中所述的胞內域識別為值得注意的第二胞內域。然而，應瞭解在一些實施例中，識別為值得注意的第二胞內域之胞內域為此等實施例之嵌合多肽之第一胞內域。
在另一態樣中，本文提供包含一或多種核酸序列之經分離聚核苷酸，其中： 該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中包含以下之嵌合多肽，a)來自細胞介素受體或激素之胞外域及跨膜域，其中胞外域及跨膜域中之至少一者包含i.在細胞介素受體之組成性活性突變體上發現之突變，且其中胞外序列不結合細胞介素受體之配位體，或ii.來自LMP1之胞外域及跨膜域；及b)第一胞內域，其選自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8、TNFRSF9、IL31RA或MyD88之胞內域，其中該嵌合多肽促進PBMC，且在說明性實施例中B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖，且其中胞外域及跨膜域選自IL7RA Ins PPCL、LMP1、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHR E260C I270C、IL27RA F523C及MPL S505N之胞外域及跨膜域。
在上述關於編碼嵌合多肽之聚核苷酸的態樣中之任一者的某些實施例中，其中該嵌合多肽促進PBMC，且在說明性實施例中B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖，胞外域及跨膜域選自CSF3R T640N及MPL S505N。在說明性實施例中，胞外域及跨膜域來自CSF3R T640N且在某些實施例中，分離之聚核苷酸不包含CAR。在某些子實施例中，胞外域及跨膜域為表7中所提供之CSF3R T640N，但識別域及消除域為可選的。在某些實施例中，第一胞內域及第二胞內域來自本文中之包括所述胞內域及胞外域及所述第一胞內域之實例11及表中所提供之多肽中的任一者。在其他子實施例中，胞外域及 胞內域來自MPL S505N，且在某些實施例中，表7中提供之MPL S505N之除識別域及消除域以外的胞外域及跨膜域為可選的。
在另一態樣中，本文提供包含一或多種核酸序列之經分離聚核苷酸，其中：該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中包含以下之嵌合多肽，a)來自I型跨膜蛋白之跨膜域；及b)第一胞內域，其選自具有在表12至17中識別之所選擇多肽之第一胞內域的基因的胞內域，其中該嵌合多肽促進B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖及或存活。
如附加實例12中所示，此類嵌合多肽能夠在培養期間在PBMC、T細胞、B細胞或NK細胞不暴露於細胞介素(諸如IL-15、IL-7，且在說明性實施例中，IL-2)以及視情況於不存在由細胞表現之CAR之ASTR之靶標的情況下，活體內或活體外或離體促進PBMC之細胞存活及/或增殖6天、7天、14天、21天或35天、42天或更久時間。
在緊接著上文段落中之態樣的一個實施例及在下文本節中之此態樣的任何實施例中，第一胞內域為具有表12至17中之第一胞內域的基因之胞內域，且在其他說明性實施例中，第一50、25或10構築體中之一者列於表12至17中，且在其他說明性實施例中，第一50、25或10構築體中之一者列於表12至17中之六個表中的兩者、三者、四者或五者中，或全部表中。在一個實施例中，第一胞內域為在表18中識別之胞內域。表18識別在第7天與第21天或第35天之間促進PBMC之增殖的構築體，其中第二胞內域不存在於該構築體中。在此 實施例之一些實施例中，嵌合多肽包含跨膜域及胞內域之組合，具有或不具有包含表18之二聚基元的胞外域。
在緊接著上文段落中之態樣的一個實施例及在下文本節中之此態樣的任何實施例中，第一核酸序列進一步編碼胞外域，且在說明性實施例中，該胞外域包含二聚基元。在其中CLE之胞外域包含二聚基元之任何態樣或實施例中，二聚基元可選自由以下組成之群：含白胺酸拉鏈基元之多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324，以及其保留二聚能力之突變體及/或活性片段。在其中CLE之胞外域包含二聚基元之態樣或實施例中之任一者中，二聚基元可需要二聚劑，且二聚基元及相關二聚劑可選自由以下組成之群：FKBP及雷帕黴素或其類似物、GyrB及香豆黴素或其類似物、DHFR及甲胺喋呤或其類似物或DmrB及AP20187或其類似物，以及保留二聚能力之所述二聚蛋白之突變體及/或活性片段。
在其中CLE之胞外域包含二聚基元之任何態樣或實施例之說明性實施例中，胞外域可包含白胺酸拉鏈基元。在一些實施例中，白胺酸拉鏈基元來自jun多肽，例如c-jun。在某些實施例中，c-Jun多肽為ECD-11之c-jun多肽區。
在此態樣之一個實施例中，第一核酸序列進一步編碼第二胞內域，其中該第二胞內域可在第一胞內域之上游(亦即5')處，或在說明性實施例中第二胞內域在第一胞內域之下游處。在此實施例之子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含所選擇多肽之第一胞內域及在表12至17中之任何候選多肽之第二胞內域中識別的任何基因的任何胞內域，且在表12至17中之說明性實施例中，及在其他實 施例中，第一50、25或10構築體之一者列於表12至17中，且在其他說明性實施例中，第一50、25或10構築體之一者列於表12至17中之表的兩者、三者、四者或五者，或全部表中。在此實施例之子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含所選擇多肽之第一胞內域及第二胞內域。
在此態樣之一個實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之跨膜域、第一胞內域及第二胞內域。在此態樣之一個實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，其中該胞外域視情況包含識別域或消除域。
在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除胞外域及跨膜域視情況包含識別域或消除域或不包含識別域或消除域以外。在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除胞外域及跨膜域包含所選擇多肽之識別域或消除域，或另一識別域或消除域以外。
在此態樣之另一實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在此態樣之子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合為所選擇多肽之第一胞內域及第二胞內域組合，且所選擇多肽識別在表12至17中，且在其他實施例中，第一50、25或10構築體中之一者列於表12至17中，且在其他實施例中，第一50、25或10構築體中之一者列於表12至17中之表中的兩者、三者、四者或五者，或全部表中。在此實施例之另一實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，且 所選擇多肽識別在表12至17中，或在說明性實施例中，第一50、25或10構築體中之一者列於表12至17中，在其他實施例中，第一50、25或10構築體中之一者列於表12至17中之表的兩者、三者、四者或五者，或全部表中。在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域視情況包含識別域或消除域，且其中該識別域或消除域為所選擇多肽之胞外域之識別域或消除域，或另一識別域或消除域，且其中所選擇多肽識別在表12至17中。
在另一態樣中，本文提供包含一或多種核酸序列之經分離聚核苷酸，其中：該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中包含以下之嵌合多肽，a)來自I型跨膜蛋白之跨膜域；及b)第一胞內域，其選自LEPR、MYD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA之胞內域，其中該嵌合多肽促進PBMC，且在說明實施例中，B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖。
在緊接著上文段落中之態樣的一個實施例及在下文本節中之此態樣的任何實施例中，第一核酸序列進一步編碼胞外域，且在說明性實施例中，該胞外域包含二聚基元。在此態樣之說明性實施例中，胞外域包含白胺酸拉鏈。在一些實施例中，白胺酸拉鏈來自jun多肽，例如c-jun。在某些實施例中，c-jun多肽為ECD-11之c-jun多肽區。
在其中第一胞內域選自LEPR、MYD88、IFNAR2、 MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA之胞內域的此態樣之另一實施例中，第一核酸序列進一步編碼第二胞內域，其中第二胞內域可在第一胞內域之上游(即5’)處，或在說明性實施例中，第二胞內域在第一胞內域之下游處。在此實施例之一子實施例中，第二胞內域來自在實例12之任一表中識別為在第21天對比第7天產生高於0、1或2之富集的所選擇多肽中的第二胞內域之基因，其中該第一胞內域來自所選擇多肽之第一胞內域之基因。在此子實施例或實施例之另一子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合為來自在實例12之任一表中識別為在第21天對比第7天產生高於0、1或2之富集之所選擇多肽的第一胞內域及第二胞內域。在此段落中之實施例或子實施例之另一實施例中，第一胞內域來自表12至17中所選擇多肽之所選擇第一胞內域之第一基因且第二胞內域來自所選擇多肽之所選擇第二胞內域之第二基因。在此段落中之實施例或子實施例之另一實施例中，第一胞內域來自表12至17中所選擇多肽且第二胞內域來自所選擇多肽。在此態樣之另一實施例或本文中之任何實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在此態樣之一個實施例或緊接著前述段落中之包含第二胞內域的實施例及子實施例的一個子實施例或其他子實施例中，第一胞內域為LEPR、MYD88、IFNAR2及MPL之胞內域。在另一實施例中，第一胞內域為LEPR、IFNAR2及MPL之胞內域。在另一實施例中，第一胞內域不是MyD88。在另一實施例中，第一胞內域不是MyD88且第二胞內域不是CD40。在此段落中之此實施例的子實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序 列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在本發明之此態樣之一個實施例中，MPL為第一胞內域且第二胞內域來自在表12至17中識別之所選擇多肽中之第二胞內域的基因。在此實施例之一其他子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含來自在表12至17中識別之所選擇嵌合多肽的第一胞內域及第二胞內域。在此等實施例之一些子實施例中，第一胞內域及第二胞內域之定向是相反的以使得第二域之羧基端殘基與第一域或與第二域與第一域之間的間隔區結合。
在本發明之此態樣之一個實施例中，LEPR為第一胞內域且第二胞內域來自在表12至17中識別之所選擇多肽中之第二胞內域的基因。在此實施例之其他子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含來自在表12至17中識別之所選擇嵌合多肽的第一胞內域及第二胞內域。在此等實施例之一些子實施例中，第一胞內域及第二胞內域之定向是相反的，以使得第二域之羧基端殘基與第一域或第二域與第一域之間的間隔區結合。
在本發明之此態樣之一個實施例中，IFNAR2為第一胞內域且第二胞內域來自在表12至17中識別之所選擇多肽中之第二胞內域的基因。在此實施例之其他子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含來自在表12至17中識別之所選擇嵌合多肽的第一胞內域及第二胞內域。在此等實施例之一些子實施例中，第一胞內域及第二胞內域之定向是相反的，以使得第二域之羧基末端殘基與第一域或第二域與第一域之間的間隔區結合。
在本發明之此態樣的一個實施例中，MyD88為第一胞 內域，且第二胞內域來自在表12至17中識別之經選擇多肽中之第二胞內域之基因。在此實施例之另一子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含第一胞內域及來自在表12至17中識別之經選擇嵌合多肽的第二胞內域。在此等實施例之一些子實施例中，第一胞內域及第二胞內域之定向是相反的，以使得第二域之羧基端殘基與第一域或第二域與第一域之間的間隔區結合。
在上文其中第一胞內域選自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL之胞內域的經分離聚核苷酸態樣之一些實施例中，跨膜域選自CD40、CD8B、CRLF2、CSF2RA、GCGR2C、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IL10RB、IL18R1、IL18RAP、IL3RA及PRLR之跨膜域。在一些說明性實施例中，跨膜域為CD40或ICOS之跨膜域。在一些子實施例中，第一胞內域來自LEPR、MYD88、IFNAR2及MPL。舉例而言，在一些實施例中，跨膜域為來自CD40之跨膜域且第一胞內域為來自MPL之胞內域。
在上文其中第一胞內域選自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL之胞內域的經分離聚核苷酸態樣之一些實施例中，第二胞內域來自CD40、CD79B或CD27。在一些子實施例中，第一胞內域來自LEPR、MYD88、IFNAR2及MPL。舉例而言，在一些實施例中，第一胞內域為MPL且第二胞內域為CD40。在此段落中之所有實施例中，第一胞內域及第二胞內域在多肽上之順序可相反。
在另一態樣中，本文提供包含一或多種核酸序列之經分離聚核苷酸，其中：該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中 包含以下之嵌合多肽，a)來自I型跨膜蛋白之跨膜域；及b)第一胞內域，其選自具有在表12至17中識別之所選擇多肽之第一胞內域的基因的胞內域，其中該嵌合多肽促進B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖其中該嵌合多肽促進PBMC，且在說明實施例中，B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖。在一些實施例中，NK細胞為NKT細胞。
在緊接著上文段落中之態樣的一個實施例及在下文本節中之此態樣的任何實施例中，第一核酸序列進一步編碼胞外域，且在說明性實施例中，該胞外域包含二聚基元。在其中CLE之胞外域包含二聚基元之任何態樣或實施例中，二聚基元可選自由以下組成之群：含白胺酸拉鏈基元之多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324，以及其保留二聚能力之突變體及/或活性片段。在本文中之CLE之胞外域包含二聚基元的任何態樣或實施例中，二聚基元可需要二聚劑，且二聚基元及相關二聚劑可選自由以下組成之群：FKBP及雷帕黴素或其類似物、GyrB及香豆黴素或其類似物、DHFR及甲胺蝶呤或其類似物，或DmrB及AP20187或其類似物，以及保留二聚能力之所述二聚蛋白質的突變體及/或活性片段。
在本文中之CLE之胞外域包含二聚基元的任何態樣或實施例的說明性實施例中，胞外域可包含白胺酸拉鏈基元。在一些實施例中，白胺酸拉鏈基元來自jun多肽，例如c-jun。在某些實施例中，c-jun多肽為ECD-11之c-jun多肽區。
在此態樣之一個實施例中，第一核酸序列進一步編碼第二胞內域，其中該第二胞內域可在第一胞內域之上游(亦即5’)處，或在說明性實施例中第二胞內域在第一胞內域之下游處。在此實施例之子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含所選擇多肽之第一胞內域及在表12至17中之任何候選多肽之第二胞內域中識別的任何基因的任何胞內域。在此實施例之子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合包含所選擇多肽之第一胞內域及第二胞內域。
在此態樣之一個實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之跨膜域、第一胞內域及第二胞內域。在此態樣之一個實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，其中該胞外域視情況包含識別域或消除域。
在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域視情況包含識別域或消除域，或不包含識別域或消除域。在一相關子實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域視情況包含所選擇多肽之識別域或消除域，或另一識別域或消除域。
在此態樣之另一實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在此態樣之子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合為所選擇多肽之第一胞內域及第二胞內域組合，且所選擇多肽識別在表12至17中。在此實施例之另一實施例中，嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，且所選擇多肽識別在表12至17中。在一相關子實施例中， 嵌合多肽包含所選擇多肽之胞外域及跨膜域、第一胞內域及第二胞內域，除了胞外域及跨膜域視情況包含識別域或消除域，且其中該識別域或消除域為所選擇多肽之胞外域之識別域或消除域，或另一識別域或消除域，且其中所選擇多肽識別在表12至17中。
在另一態樣中，本文提供包含一或多種核酸序列之經分離聚核苷酸，其中：該一或多種核酸序列之第一核酸序列編碼在胺基至羧基定向中包含以下之嵌合多肽，a)來自I型跨膜蛋白之跨膜域；及b)第一胞內域，其選自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL之胞內域，其中該嵌合多肽促進PBMC，且在說明實施例中，B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖。
在緊接著上文段落中之態樣的一個實施例及在下文本節中之此態樣的任何實施例中，第一核酸序列進一步編碼胞外域，且在說明性實施例中，該胞外域包含二聚基元。在此態樣之說明性實施例中，胞外域包含白胺酸拉鏈。在一些實施例中，白胺酸拉鏈來自jun多肽，例如c-jun。在某些實施例中，c-jun多肽為ECD-11之c-jun多肽區。
在其中第一胞內域選自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL之胞內域的此態樣之另一實施例中，第一核酸序列進一步編碼第二胞內域，其中第二胞內域可在第一胞內域之上游(即5’)處，或在說明性實施例中，第二胞內域在第一胞內域之下游處。在此實施例之一子實施例中，第二胞內域來自 在實例12之任一表中識別為在第21天對比第7天產生高於0、1或2之富集的所選擇多肽中的第二胞內域之基因，其中該第一胞內域來自所選擇多肽之第一胞內域之基因。在此子實施例或實施例之另一子實施例中，第一胞內域及第二胞內域組合為來自在實例12之任一表中識別為在第21天對比第7天產生高於0、1或2之富集之所選擇多肽的第一胞內域及第二胞內域。在此段落中之實施例或子實施例之另一實施例中，第一胞內域來自表12至17中所選擇多肽之所選擇第一胞內域之第一基因且第二胞內域來自所選擇多肽之所選擇第二胞內域之第二基因。在此段落中之實施例或子實施例之另一實施例中，第一胞內域來自表12至17中所選擇多肽且第二胞內域來自所選擇多肽。在此態樣之另一實施例或本文中之任何實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。
在本文中包括嵌合多肽之方法或經分離聚核苷酸實施例中之任一者的某些實施例中，其中該嵌合多肽促進PBMC，且在說明性實施例中，B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖，第一及/或第二胞內域(在說明性實施例中第一胞內域)為來自LEPR、MYD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA之胞內域。在一些實施例中，第一胞內域來自MPL。在例示性子實施例中，嵌合多肽包含胞外域，該胞外域包含本文中所提供之二聚基元。
在本文中包括嵌合多肽之方法或經分離聚核苷酸實施例中之任一者的某些實施例中，跨膜域來自CD40、ICOS、FCGR2C、PRLR、IL3RA或IL6ST，其中該嵌合多肽促進PBMC之細胞增殖，且在說明性實施例中，促進B細胞、T細胞及/或NK細胞之細 胞增殖。在一些說明性實施例中，跨膜域來自CD40或ICOS。在例示性子實施例中，嵌合多肽包含胞外域，該胞外域包含本文中所提供之二聚基元。
在本文中包括嵌合多肽之方法或經分離聚核苷酸實施例中之任一者的某些實施例中，第一及/或第二胞內域(在說明性實施例中，第二胞內域)為來自CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27之胞內域，其中該嵌合多肽促進PBMC之細胞增殖，且在說明性實施例中，促進B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖。在一些說明性實施例中，第二胞內域來自CD40、CD79B或CD27。在例示性子實施例中，嵌合多肽包含胞外域，該胞外域包含本文中所提供之二聚基元。
在本文中包括嵌合多肽之方法或經分離聚核苷酸實施例中之任一者的某些實施例中，第一及/或第二胞內域為表12至17中之嵌合多肽中之任一者的胞內域(P3或P4元件)，其中該嵌合多肽促進PBMC之細胞增殖，且在說明性實施例中，促進B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖。在一些實施例中，嵌合多肽包含表12至17中之嵌合多肽中之任一者的任何P2、P3及P4組合。
在其中跨膜域為I型跨膜蛋白之態樣及實施例中的任一者的實施例中，跨膜域可為I型細胞介素受體、激素受體、T細胞受體或TNF家族受體。在其中嵌合多肽包含跨膜域且其中跨膜域包含二聚基元之態樣及實施例中的任一者的實施例中，跨膜域可為I型細胞介素受體、激素受體、T細胞受體或TNF家族受體。在此段落中之此等實施例中之任一者的說明性實施例中，第一胞內域選自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL之胞 內域。
在係關於包含編碼嵌合多肽之核酸序列之聚核苷酸的態樣及實施例中的任一者的實施例中，該嵌合多肽包含胞外域，該胞外域可包含胞外域之羧基端的20個胺基酸內(且在說明性實施例中，在胞外域之羧基端處)的1、2、3或4個胺基酸間隔子以使得間隔子將胞外域及跨膜域間隔開。在一些實施例中，1、2、3或4個胺基酸間隔子包含丙胺酸殘基，且在一些情況下，僅丙胺酸殘基。在包含該間隔子之實施例的說明性子實施例中，胞外域包含二聚基元，例如白胺酸拉鏈基元。
應理解，本文所提供之包含促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽之態樣及實施例的第一胞內域及第二胞內域可包括所述基因之突變體及/或片段，其限制條件為該嵌合多肽保留其促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的能力。此等突變體及/或片段通常保留信號傳導活性以使得嵌合多肽保留其促進存活及增殖活性。應理解，第一胞內域及第二胞內域可為相反的以便用於本文中所提供之包含促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽的任一態樣及實施例中。因此，在此等實施例應瞭解，第一胞內域為第二胞內域且反之亦然。
在本文提供之包含聚核苷酸之態樣及實施例中的任一者中，該聚核苷酸包括編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽的核酸序列，該核酸序列可進一步編碼識別域或消除域。在一些實施例中，識別域或消除域為生物學批准之單株抗體之識別域。在一些實施例中，識別域或消除域包含由識別EGFR之抗體識別的多肽，或其抗原決定基。在一些實施例中，識別域或消 除域包含由識別MYC之抗體識別的多肽，或其抗原決定基。
在本文提供之包含聚核苷酸之態樣及實施例中的任一者中，該聚核苷酸包括編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽的核酸序列，該核酸序列及/或第二核酸序列可操作地連接至在B細胞、T細胞及/或NK細胞中具有活性之第一啟動子。在一些說明性實施例中，第一啟動子在T細胞及/或NK細胞中為活性的。
在本文提供之具有編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽的核酸序列之經分離聚核苷酸態樣及實施例中的任一者的實施例中，針對包含第二胞內域之聚核苷酸實施例，連接子可存在於跨膜域與第一胞內域之間及/或在第一胞內域與第二胞內域之間。在一些實施例中，針對包含胞外域之實施例，在1與4個丙胺酸之間的連接子存在於胞外域與跨膜域之間。
在本文提供之包含編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽的第一核酸序列及編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列之經分離聚核苷酸或載體態樣及實施例中的任一者的實施例中，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域，該第一核酸序列及第二核酸序列可藉由核糖體跳躍序列間隔開。在一些實施例中，核糖體跳躍序列為F2A、E2A、P2A或T2A。
在本文提供之編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽的經分離聚核苷酸態樣及實施例中的任一者的實施例中，該聚核苷酸進一步包含Kozak類型序列、WPRE元件及雙重終止密碼子或三重終止密碼子中之一或多者，其中雙重終 止密碼子或三重終止密碼子中之一或多個終止密碼子限定自一或多個轉錄單元中之至少一者中讀取的終止。在某些實施例中，聚核苷酸進一步包含選自以下之Kozak類型序列：CCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO：515)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：516)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO：517)或GCCGCCGCCAT/UG。在某些實施例中，相對於第一核酸序列之起始密碼子的-3及+4核苷酸皆包含G。在可與包含Kozak類型序列之前述實施例及/或包括三重終止密碼子之以下實施例組合的另一實施例中，聚核苷酸包含WPRE元件。在一些實施例中，WPRE元件位於一或多個轉錄單元之終止密碼子之3’及聚核苷酸之3’LTR的5’處。在可與前述實施例(亦即，其中聚核苷酸包含Kozak類型序列之實施例及/或其中聚核苷酸包含WPRE之一實施例)中之任一者或兩者組合之另一實施例中，一或多個轉錄單元經雙重終止密碼子或三重終止密碼子中之一或多個終止密碼子終止。
在一個態樣中，本文提供包含以下之核酸載體本文提供之編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽的經分離聚核苷酸態樣及實施例中的任一者的實施例，a.複製源；b.抗生素抗性基因；及/或c.一或多種病毒及/或反轉錄病毒序列，其選自反轉錄病毒長端重複序列(LTR)或其活性片段、反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件，及/或反轉錄病毒中心多嘌呤段/中心終止序列(CTS)元件。
在此態樣之某些實施例中，載體為質體。在其他實施 例中，載體為非複製勝任型病毒載體，例如非複製勝任型反轉錄病毒載體或顆粒。在此等實施例中，非複製勝任型反轉錄載體或顆粒顆包含5’反轉錄病毒LTR或其活性片段、反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件，及3’反轉錄病毒LTR或其活性片段，其中5’反轉錄病毒LTR及3’反轉錄病毒LTR側接經分離之聚核苷酸。在一些實施例中，該經分離之聚核苷酸與編碼反轉錄病毒順式作用RNA封裝元件、5’長端重複序列及/或3’長端重複序列的核酸序列呈相反定向。
在一些態樣中，本文提供包含反轉錄病毒基因組且進一步包含包膜及衣殼之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，該反轉錄病毒基因組包含本文中之包含經分離聚核苷酸之態樣及實施例中的任一者，該經分離聚核苷酸包含編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽的第一核酸序列。反轉錄病毒顆粒可額外包含本揭示案中所闡述之反轉錄病毒元件中的任一者。在一個實施例中，反轉錄病毒基因組進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在一些實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可藉由核糖體跳躍序列間隔開。在一些實施例中，核糖體跳躍序列為F2A、E2A、P2A或T2A。在此等實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的轉錄單元上。
在另一實施例中，本文提供一種哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞(例如人類細胞)為包含經分離聚核苷酸之B細胞、T細胞或NK細胞，根據本文中之包含經分離聚核苷酸之態樣及實施例中的任一者，該經分離聚核苷酸視情況可整合至該細胞之基因組中，該經分離聚核苷酸包含編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之 細胞增殖的嵌合多肽的第一核酸序列。在一個實施例中，哺乳動物細胞中之經分離聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在一些實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可藉由核糖體跳躍序列間隔開。在一些實施例中，核糖體跳躍序列為F2A、E2A、P2A或T2A。在此等實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的轉錄單元上。在一些實施例中，細胞為T細胞或NK細胞，且在某些說明性實施例中，細胞為人類T細胞。
在另一態樣中，本文提供根據本文中之包含經分離聚核苷酸之態樣及實施例中的任一者的包含經分離聚核苷酸之封裝元件，該經分離聚核苷酸可整合至細胞之基因組中，包含編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖的嵌合多肽的第一核酸序列。在一些實施例中，該細胞中之經分離聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。在一些實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可藉由核糖體跳躍序列間隔開。在一些實施例中，核糖體跳躍序列為F2A、E2A、P2A或T2A。在此等實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的轉錄單元上。在一些實施例中，細胞為本文提供用於產生反轉錄病毒顆粒之細胞。
在一個態樣中，本文提供一種促進PBMC(例如，B細胞、T細胞及/或NK細胞)之細胞增殖的方法，該方法包含用編碼淋巴增殖性元件(且在說明性實施例中，根據本文所提供之實施例中的任一者的嵌合多肽)之載體轉導及/或以基因方式修飾細胞，其中該嵌合多肽促進PBMC增殖。該方法可包括培養細胞至少7天、14天、21天、 28天、35天、42天或60天。通常地，此培養例如在一些實施例中在用可誘導IL-2之介質轉導之後在存在IL-2之情況下進行。
在一個態樣中，本文提供一種轉染、轉導及/或以基因方式修飾B細胞、T細胞及/或NK細胞(在一些非限制性實施例中，可為同種異體細胞、自體細胞或非同種異體細胞)之方法，該方法包含使該細胞與根據本文中之包含經分離聚核苷酸之態樣及實施例中的任一者的經分離聚核苷酸接觸，該經分離聚核苷酸包含編碼促進PBMC、B細胞、T細胞及/或NK細胞之細胞增殖之嵌合多肽的第一核酸序列(CLE態樣及實施例)。在此方法態樣中之一些實施例中，該細胞為T細胞且經分離聚核苷酸進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之第二核酸序列，該嵌合抗原受體包含抗原特異性靶向區(ASTR)、跨膜域及胞內活化域。換言之，用於轉染、轉導及/或以基因方式修飾B細胞、T細胞及/或NK細胞之方法可包括使該細胞與根據本文中之CLE或CLE CAR實施例中的任一者的經分離聚核苷酸接觸。在一些實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可藉由核糖體跳躍序列間隔開。在一些實施例中，核糖體跳躍序列為F2A、E2A、P2A或T2A。在此等實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的轉錄單元上。在一些實施例中，細胞為T細胞或NK細胞，且在某些說明性實施例中，細胞為人類T細胞。該接觸在用於轉染、轉導及/或以基因方式修飾細胞之有效條件下進行。在一些實施例中，在接觸時之經分離聚核苷酸在根據本文中所提供之載體態樣及實施例中的任一者的載體內。在一些實施例中，經分離聚核苷酸在接觸時在非複製型反轉錄病毒顆粒中。
在本文態樣中之任一者的一些實施例中，NK細胞為 NKT細胞。
以下非限制性實例僅藉助於說明例示性實施例而提供，且絕不限制本發明之範疇及精神。此外，應理解，本文所揭示或主張之任何發明涵蓋本文所描述之任何一或多個特徵之所有變體、組合及排列。任何一或多個特徵可明確地自權利要求排除，即使未在本文中明確地闡述特定排除。亦應理解，除非一般熟習此項技術者將理解，否則根據本文揭示之特定方法或本領域中已知之其他方法，用於方法中之試劑之揭示內容意欲與(及為其提供支援)涉及試劑之用途之方法同義。另外，除非一般熟習此項技術者將理解，否則說明書及/或權利要求揭示一種方法，本文所揭示之試劑中之任何一或多者可用於該方法。
實例
實例1.將反轉錄病毒封裝及轉導系統工程化為靶向休眠T細胞以供選擇T細胞整合及由PBMC表現。
儘管利用瞬態轉染產生高效價慢病毒載體係可能的，但此方法帶有產生非複製勝任型重組反轉錄病毒(RCR)之風險且對於臨床應用不可擴展。在此，藉由將編碼可誘導啟動子之多個構築體及其調節劑同步引入至HEK293懸浮適應性細胞(HEK293S)中以穩定地產生病毒組分、CAR基因及其調節組分來產生穩定的反轉錄病毒封裝細胞株。兩個不同的可誘導系統可用於暫時控制基因之表現。一個系統係基於兩種轉錄因子之雷帕黴素-或雷帕黴素類似物誘導之二聚合。一個轉錄因子由與ZFHD1 DNA結合域融合之FKPB蛋白質之三個複本組成且其他轉錄因子由與p65活化域融合之FRB蛋白質組成。雷帕黴素或雷帕黴素類似物將轉錄因子二聚合以形成ZFHD1/p65 AD 且可在12xZFHD1結合位點處活化基因轉錄。
如圖3A至圖3E中所展示之一系列載體係藉由側接轉座子序列產生以用於整合至HEK293S基因組中。一旦整合至細胞之基因組中，此等序列充當調節組分及lox位點及/或FRT位點(在此被稱為著陸點)以供隨後使用Cre及/或flp重組酶進行整合。初始5個構築體含有編碼嘌呤黴素抗性、GFP、RFP及經由N端PLss(牛促乳素信號肽)靶向細胞膜且經由衍生自血小板之生長因子受體(PDGFR)C端跨膜錨定域錨定至細胞膜之胞外MYC標記的聚核苷酸序列。初始5個構築體亦可包括組成性最小CMV啟動子及最小IL-2啟動子、經雷帕黴素調節之基於ZFHD1之啟動子、四環素回應性元件(TRE)啟動子或雙向TRE(BiTRE)啟動子。圖3A中之構築體含有編碼與NFκB p65活化子域(p65 AD)融合之FRB域及與組成性表現之三個FKBP重複融合之ZFHD1 DNA結合域的聚核苷酸序列。圖3A中之構築體亦包括在雷帕黴素可誘導之ZFHD1/p65 AD啟動子下之HIV1 REV及HSV VP65域SrcFlagVpx。圖3B中之構築體包括編碼在ZFHD1/p65 AD啟動子之控制下之rtTA序列的聚核苷酸。圖3C中之構築體包括編碼側接有loxP位點之嘌呤黴素抗性基因及側接有lox2272位點之胞外MYC標記的聚核苷酸。此等可選標記之兩者均在BiTRE啟動子之控制下，該BiTRE啟動子側接有FRT位點。圖3D中之構築體包括編碼在TRE啟動子之控制下側接有loxP位點之GFP的聚核苷酸。圖3D中之構築體亦包括在TRE啟動子與GFP之5’loxP位點之間的單個FRT位點。圖3E中之構築體包括編碼在ZFHD1/p65 AD啟動子之控制下側接有loxP位點之RFP的聚核苷酸。圖3E中之構築體亦包括在ZFHD1/p65 AD啟動子與RFP之5’ loxP位點之間的單個FRT位點。圖3C至圖3E中之構築體充當其他聚核 苷酸序列之著陸點以插入至封裝細胞株之基因組中。待插入之聚核苷酸序列可側接有lox位點且使用Cre重組酶及loxP位點插入至基因組中。此導致編碼嘌呤黴素抗性、胞外MYC標記、GFP及RFP之基因組區之插入及同步移除。替代地，聚核苷酸序列可側接有FRT位點，且使用flp重組酶及FRT位點來插入至基因組中，接著使用Cre重組酶移除編碼嘌呤黴素抗性、胞外MYC標記、GFP及RFP之聚核苷酸序列。
為用整合至基因組中之著陸點產生封裝細胞株，用等莫耳濃度之5種質體(圖3A至圖3E)加5μg之經活體外轉錄之piggybac轉座酶mRNA或5μg之具有用於在PEI之存在下以2：1或3：1之PEI比DNA(w/w)之比率表現piggybac轉座酶之啟動子的質體或2μg至5μg piggybac轉座酶蛋白使用陽離子肽混合物來共轉染HEK293S細胞。在100nm雷帕黴素及1μg/mL多西環素之存在下用----嘌呤黴素選擇經轉染細胞2至5天，接著螢光活化之細胞分選以收集表現GFP及RFP之細胞。經分選細胞在不存在嘌呤黴素、雷帕黴素及多西環素下生長5天，且移除表現GFP及RFP之細胞，亦用myc珠粒移除myc陽性細胞。接著篩檢來自經陰性分選之細胞的個別純系以供利用雷帕黴素及多西環素以及所選殖之單個細胞誘導GFP及RFP。採集來自純系之DNA且經定序以用於整合分析。對在存在雷帕黴素及多西環素下具有GFP及RFP之強有力誘導表現，在不存在雷帕黴素及多西環素下具有受限背景表現呈陽性的純系進行擴展並進行堆積。
接著用含有三順反子聚核苷酸之構築體轉染具有來自整合至基因組中之圖3A至圖3E之構築體之HEK293S細胞，該三順反子聚核苷酸編碼DAF信號序列/抗CD3 scFvFc(UCHT1)/CD14 GPI錨定連接位點(SEQ ID NO：287)、能夠結合CD28/CD16B GPI錨定連接 位點(SEQ ID NO：286)之DAF信號序列/CD80胞外域及DAF信號序列/IL-7/DAF(SEQ ID NO：286)及側接用於整合至HEK293S基因組中之聚核苷酸區之轉座子序列(圖4)。在轉染之後，細胞在不存在雷帕黴素及多西環素下擴展2天且選擇係組成性紅色之純系。接著用用於表現Cre重組酶之構築體瞬時轉染陽性純系以移除剩餘基因組DNA及RFP編碼區。同時轉染含有具有BiTRE啟動子之聚核苷酸、及在一個方向上編碼gag多肽及pol多肽之聚核苷酸區以及在另一方向上編碼麻疹病毒F蛋白質及H蛋白質的聚核苷酸區的另一構築體(圖4B)。Cre重組酶將構築體整合至基因組中以產生展示於圖4B中之經整合序列。針對在多西環素及雷帕黴素之存在下之蛋白表現評估所得純系且藉由用於基因組整合之深度定序進行分析。保留剩餘TRE回應性GFP位點以用於慢病毒基因組插入。
實例2.慢病毒載體及反轉錄病毒封裝之產生。
用用於表現Flp重組酶之構築體(圖4C)及含有聚核苷酸序列之構築體轉染實例1中產生之反轉錄病毒封裝穩定細胞株，該聚核苷酸序列編碼CAR及在CD3Z啟動子(其在HEK293S細胞中無活性)之控制下之淋巴增殖性元件IL7Rα-insPPCL，其中CAR及IL7Rα-insPPCL由編碼T2A核糖體跳躍序列之聚核苷酸序列隔開，且IL7Rα-insPPCL具有阿昔洛韋核糖開關控制之核糖核酸酶。含CAR之構築體進一步包括cPPT/CTS及RRE序列以及編碼HIV-1 Psi之聚核苷酸序列。待被整合至基因組中之含CAR之構築體上之整個聚核苷酸序列側接有FRT位點。含CAR之構築體之成功整合造成因此藉由用用於表現Cre重組酶之構築體瞬時轉染而移除之GFP之組成性表現。反轉錄病毒基因組中之含CAR構築體可相對於由5’長末端重複及3’長末 端重複所建立之5’至3’方向而處於反向定向中。HEK293S株在無血清介質中生長。在經攪拌槽反應器中生長至峰值細胞密度之後，將細胞稀釋至70%峰值細胞密度且用100nM雷帕黴素處理2天以誘導早期基因REV、Vpx及aCD3 scFv CD16B GPI、aCD28 scFv CD16B GPI及IL-7 SD GPI DAF之表現，接著在介質中添加1μg/mL多西環素以誘導如Gag Pol、MV(Ed)-F△30、MV(Ed)-H△18及包括治療性靶標之慢病毒基因組的結構化元件之表現。病毒產量之水準係由封裝序列之qPCR及p24 ELISA來檢查。藉由細胞之深度過濾及使用TFF盒之濃縮/滲濾，接著快速冷凍以供裝入小瓶來採集病毒。
實例3.藉由用VSV-G假型化且在其表面上表現抗CD3 scFvFc之反轉錄病毒顆粒轉導新鮮經分離及未經刺激之人類T細胞之效率。
重組慢病毒顆粒係藉由用編碼gag/pol及rev之單獨的慢病毒封裝質體及編碼VSV-G之假型化質體瞬時轉染293T細胞(Lenti-XTM 293T，Clontech)來產生。用封裝質體共轉染編碼GFP、抗CD19嵌合抗原受體及在此稱為F1-0-03(圖5)之eTAG的第三代慢病毒表現載體(在3’LTR中含有缺失導致自身失活)。細胞藉由在FreestyleTM 293表現介質(ThermoFisher Scientific)中連續生長來適應懸浮培養。以1×106個細胞/毫升(30mL)在125mL Erlenmeyer燒瓶中接種懸浮液中之細胞，並立即使用溶解於弱酸中之聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences)轉染。
對於30mL細胞將質體DNA稀釋於1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM介質中。為獲得用VSV-G假型化之慢病毒顆粒，所使用之總DNA(1μg/mL之培養體積)為具有以下莫耳比之4種質體之混合 物：2×基因組質體(F1-0-03)、1×含Rev之質體、1×含VSV-G之質體及1×含gag/pol之質體。為獲得用VSV-G假型化且在其表面上表現抗CD3-scFvFc-GPI之慢病毒顆粒，所使用之總DNA(1μg/mL之培養體積)為具有以下莫耳比之5種質體之混合物：2×基因組質體(F1-0-03)、1×含Rev之質體、1×含VSV-G之質體、1×含抗CD3-scFvFc-GPI之質體及1×含gag/pol之質體。為獲得用VSV-G假型化且在其表面上表現抗CD3-scFvFc-GPI及CD80-GPI之慢病毒顆粒，所使用之總DNA(1μg/mL之培養體積)為具有以下莫耳比之6種質體之混合物：2×基因組質體(F1-0-03)、1×含Rev之質體、1×含VSV-G之質體、1×含抗CD3-scFvFc之質體、1×含CD80之質體及1×含gag/pol之質體。單獨地，在1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM中稀釋PEI至2μg/mL(培養體積，與DNA之比為2：1比率)。在5分鐘室溫培育之後，將兩種溶液澈底地混合在一起，且在室溫下培育20分鐘。將最終體積(3ml)添加至細胞。接著伴隨呈125rpm及具有8% CO2之旋轉在37℃下培育細胞72小時。含有抗CD3-scFvFc-GPI之質體包括衍生自OKT3或UCHT1之scFv及GPI錨定連接序列。UCHT1scFvFc-GPI載體編碼包括人類Ig κ信號肽(NCBI GI第CAA45494.1號之胺基酸1至胺基酸22)之肽(SEQ ID NO：278)，該人類Ig κ信號肽與UCHT1 scFv(NCBI GI第CAH69219.1號之胺基酸21至胺基酸264)融合，與具有位置115處之A取代為T的人類IgG1 Fc(NCBI GI第AEV43323.1號之胺基酸1至胺基酸231)融合，該人類IgG1 Fc與人類DAF GPI錨定連接序列(NCBI GI第NP_000565號之胺基酸345至胺基酸381)融合。OKT3scFvFc-GPI載體編碼包括人類Ig κ信號肽(NCBI GI第CAA45494.1號之胺基酸1至胺基酸22)之肽(SEQ ID NO：279)，該人類Ig κ信號肽與OKT3 scFv(SEQ ID NO：285)融合， 該OKT3 scFv與人類IgG1 Fc(NCBI GI第AEV43323.1號之胺基酸1至胺基酸231)融合，該人類IgG1 Fc與人類DAF GPI錨定連接序列(NCBI GI第NP_000565號之胺基酸345至胺基酸381)融合。CD80-GPI載體編碼包括人類CD80信號肽及與人類CD16b GPI錨定連接序列(NCBI GI第NP_000561號之胺基酸196至胺基酸233)融合之胞外域(NCBI GI第NP_005182號之胺基酸1至胺基酸242)之肽(SEQ ID NO：280)。
在72小時後，採集上清液且藉由以1,200g離心10分鐘來澄清。將經澄清上清液倒入新試管中。在4℃下，藉由以3,300g隔夜離心來沈澱慢病毒顆粒。捨棄上清液，且將慢病毒顆粒丸粒再懸浮於1：100之初始體積之X-VivoTM 15介質(Lonza)中。利用連續稀釋及在轉導72小時後之293T及Jurkat細胞中利用流式細胞術分析GFP表現來滴定慢病毒顆粒。
將周邊血單核細胞(PBMC)首先自供體12F及供體12M之ACD(酸性檸檬酸鹽)試管中之新鮮血液或自供體13F之血塊黃層分離，利用San Diego Blood Bank,CA收集並分配。根據製造商之說明書，執行基於SepMateTM 50(StemcellTM)之Ficoll-Paque PLUS®(GE Healthcare Life Sciences)上之PBMC的梯度密度分離。根據各SepMateTM試管將稀釋於PBS-2%HIFCS(熱滅活胎牛血清)中之30mL之血液或血塊黃層分層。在室溫下以1,200g離心20分鐘之後，收集PBMC層，經彙集且用45mL之PBS-2%HIFCS洗滌三次，並在室溫下以400g離心10分鐘。接著在室溫下在10mL之RBC裂解緩衝液(Alfa Aesar)中培育丸粒10分鐘，且用45mL之PBS-2%HIFCS洗滌額外兩次，並在室溫下以400g離心10分鐘。在以下轉導及培養介質中執行最 終洗滌：供體13F之X-VivoTM 15或供體12F及供體12M之RPMI-1640+10%HIFCS。不採取額外步驟以移除單核細胞。在分離之後，新鮮及未經刺激PBMC經再懸浮在各別介質中達到1×106/mL之最終濃度，且用先前揭示之慢病毒顆粒轉導該等PBMC(兩個重複或三個重複)。使傳導在37℃、5% CO2下在供體13F之X-VivoTM 15介質中或在供體12F及供體12M之RPMI-1640+10%HIFCS中進行14小時傳導通常在1毫升/孔之12孔盤形式中在MOI 1下進行。對於動力學實驗，0.5×106PBMC/mL係在7mL最終溶液、在MOI 1下，伴隨呈125rpm及具有8% CO2之旋轉，在37℃下在125mL振盪燒瓶中培育2小時至20小時來轉導。在與慢病毒一起培育所選擇時間後，用供體13F之X-VivoTM 15介質或供體12F及供體12M之PBS+2%HIFCS洗滌三次，且最終在37℃，5% CO2下在供體13F之X-VivoTM 15介質或供體12F及供體12M之RPMI-1640+10%HIFCS中在1×106/mL之細胞密度下培育。在轉導後第3天開始，並且從此開始每隔2-3天，將介質體積加倍且用IL-2補充至最終濃度100U/mL。在轉導後之不同天(第3天至第17天)收集樣本，以利用GFP表現水準評估所產生之各類型之慢病毒之轉導效率。
在轉導後之不同天，對於具有或不具有呈1μg/ml之OKT3抗體(Biolegend)下用VSV-G假型化之慢病毒顆粒，VSV-G假型化且在其表面上顯現抗CD3 scFvFc-GPI之慢病毒顆粒，或用VSV-G假型化且在其表面上顯現抗CD3 scFvFc-GPI及CD80-GPI之慢病毒顆粒，收集100μL之細胞且利用流式細胞術對於CD3+細胞群體中之GFP之表現進行分析。
圖6A及圖6B分別展示在用所指示慢病毒顆粒轉導自供體12M之新鮮經分離及未經刺激PBMC 14小時後第3天、第6天、第 9天、第13天及第17天的總CD3+群體中之CD3+GFP+細胞之百分比(%)之直方圖及CD3+GFP+群體之每孔絕對細胞數量之直方圖。各棒表示重複之平均值+/-SD。圖6A及圖6B展示，用VSV-G假型化慢病毒顆粒且在慢病毒顆粒之表面上顯現抗CD3-scFvFc有效地轉導新鮮經分離及未經刺激之PBMC。衍生自OKT3或UCHT1之抗CD3 scFv’s在呈scFvFc-GPI之形式時係有效的。
圖7A及圖7B分別展示在用所指示慢病毒顆粒轉導自供體13F之新鮮經分離及未經刺激PBMC 14小時後第3天及第6天的總CD3+群體中之CD3+GFP+細胞之百分比(%)之直方圖及CD3+GFP+群體之每孔絕對細胞數量之直方圖。請注意，「A」為使用經VSV-G假型化之慢病毒顆粒之結果(三個重複實驗)；「B」為在向轉導介質添加OKT3 Ab(1μg/mL)之情況下使用經VSV-G假型化之慢病毒顆粒之結果(兩個重複實驗)；「C」為使用在其表面上顯現經GPI錨定之UCHT1scFvFc之經VSV-G假型化之慢病毒顆粒之結果(三個重複實驗)；及「D」為使用在其表面上顯現經GPI錨定之UCHT1scFvFc及經GPI錨定之CD80之經VSV-G假型化之慢病毒顆粒之結果(兩個重複實驗)。各棒表示兩個重複或三個重複之平均值+/-SD，如圖7A所指示。圖7A及圖7B展示，當執行轉導14小時時，用VSV-G假型化慢病毒且在其表面上顯現抗CD3-scFvFc-GPI及CD80-GPI亦有效地轉導新鮮經分離及未經刺激之PBM。
圖8A及圖8B分別展示在用所指示慢病毒顆粒轉導自供體12M之新鮮經分離及未經刺激PBMC持續暴露之所指示時間(2小時至20小時)(亦即，細胞與慢病毒顆粒在轉導反應混合物中之接觸)後第3天、第6天及第9天的總CD3+群體中之CD3+GFP+細胞之百分比 (%)之直方圖及CD3+GFP+群體之每孔絕對細胞數量之直方圖。轉導係在如所指示之盤或振盪器燒瓶中執行。各棒表示用VSV-G(「[VSV-G]」)假型化之慢病毒顆粒之兩個重複之平均值+/-SD；其他實驗不具有重複。圖8A及圖8B展示，可用用VSV-G假型化及在其表面上顯現抗CD3 scFvFc及CD80之慢病毒顆粒在少至2小時內有效地轉導新鮮經分離及未經刺激之PMBC。
值得注意的係，隨後的試驗使用僅使用Rev、VSV-G、gag/pol及F1-0-03(而非編碼抗CD3或CD80之載體)在存在可溶性抗CD3抗體(100ng/ml)下轉導新鮮分離之休眠PBMC 2.5小時所產生的慢病毒顆粒來進行。轉導使用3種不同的可溶性抗CD3抗體純系來實現。針對CD3抗體純系HIT3A、OKT3及UCHT1，在第6天藉由CD3+GFP+細胞量測之轉導效率分別為4.31%、3.27%及0.52%。在不存在可溶性抗體下之背景轉導效率為0.06%。
實例4.藉由含有VSV-G假型化元件及膜結合活化元件且視情況含有Vpu蛋白之反轉錄病毒顆粒對新鮮經分離且未經刺激之人類T細胞的轉導效率。
藉由用編碼gag/pol及rev之單獨的慢病毒封裝質體及編碼VSV-G之假型化質體瞬時轉染293T細胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)來產生重組慢病毒顆粒。編碼GFP、抗CD19嵌合抗原受體及在本文中稱為F1-0-03之eTAG(圖5)的第三代慢病毒表現載體用封裝質體共轉染。細胞藉由在FreestyleTM 293表現介質(ThermoFisher Scientific)中連續生長來適應懸浮培養。以1×106個細胞/毫升(30mL)在125mL Erlenmeyer瓶中接種懸浮液中之細胞，並立即使用溶解於弱酸中之聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences)轉染該等細胞。
對於30mL細胞將質體DNA稀釋於1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM介質中。為獲得用VSV-G假型化之慢病毒顆粒[VSV-G]，所使用之總DNA(1μg/mL之培養物體積)為具有以下莫耳比之4種質體的混合物：2×基因組質體(F1-0-03)、1×含Rev之質體、1×含VSV-G之質體及1×含gag/pol之質體。為獲得用VSV-G假型化且在其表面上顯現抗CD3-scFvFc-GPI之慢病毒顆粒[VSV-G+UCHT1]，所使用之總DNA(1μg/mL之培養物體積)為具有以下莫耳比之5種質體的混合物：2×基因組質體(F1-0-03)、1×含Rev之質體、1×含VSV-G之質體、1×含抗CD3-scFvFc-GPI之質體及1×含gag/pol之質體。為獲得用VSV-G假型化、顯現抗CD3-scFvFc-GPI且含有輔助蛋白Vpu之慢病毒顆粒[VSV-G+UCHT1+VpuCH]，所使用之總DNA(1μg/mL之培養物體積)為具有以下莫耳比之6種質體的混合物：2×基因組質體(F1-0-03)、1×含Rev之質體、1×含VSV-G之質體、1×含抗CD3-scFvFc-GPI之質體、1×含Vpu-CH之質體及1×含gag/pol之質體。單獨地，將PEI在1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM中稀釋至2μg/mL(培養體積，與DNA之比為2：1比率)。在5分鐘室溫培育之後，將兩種溶液澈底地混合在一起，且在室溫下培育20分鐘。將最終體積(3ml)添加至細胞中。接著伴隨在125rpm下及具有8% CO2之旋轉在37℃下培育細胞72小時。含抗CD3-scFvFc-GPI之質體包括來源於UCHT1之scFv及來源於DAF(CD55)之GPI錨定連接序列。UCHT1scFvFc-GPI載體編碼包括與人類Ig κ信號肽(NCBI GI No.CAA45494.1之胺基酸1至22)之肽(SEQ ID NO：278)，該人類Ig κ信號肽與UCHT1 scFv(NCBI GI No.CAH69219.1之胺基酸21至264)融合、與人類IgG1 Fc(NCBI GI No.AEV43323.1之胺基酸1至231)、與人類DAF GPI錨定連接序列(NCBI GI No.NP_000565之胺基酸345至381)融合。含Vpu-CH之質體編碼包括來自HIV-1 M CH167-CC分離體(胺基酸1-84，GeneBank：AGF30946.1)之Vpu序列的肽(MFDFIARVDYRVGVVALVVALIIAIIVWSIVYIEYRKLLKQRKIDWLIKRIRERAEDSGNESDGEIEELSTMVDMEHLRLLDDL*)。
在72小時之後，採集上清液並且藉由以1,200g離心10分鐘來澄清。將經澄清上清液倒入新試管中。在4℃下，藉由以3,300g隔夜離心來沈澱慢病毒顆粒。捨棄上清液，且將慢病毒顆粒集結粒再懸浮於1：100之初始體積之X-VivoTM 15介質(Lonza)中。藉由連續稀釋及在轉導72小時後之293T及Jurkat細胞中藉由流式細胞術分析GFP表現來滴定慢病毒顆粒。
將周邊血單核細胞(PBMC)自血塊黃層分離，利用San Diego Blood Bank,CA收集並分配。根據製造商之說明書，執行基於SepMateTM 50(StemcellTM)之Ficoll-Paque PLUS®(GE Healthcare Life Sciences)上之PBMC的梯度密度分離。根據各SepMateTM試管將稀釋於X-VivoTM 15介質中之30mL之血塊黃層分層。在室溫下以1,200g離心20分鐘之後，收集PBMC層，經彙集且用45mL之X-VivoTM 15介質洗滌三次，並在室溫下以400g離心10min。接著在室溫下在10mL之RBC裂解緩衝液(Alfa Aesar)中培育丸粒10分鐘，且用45mL之X-VivoTM 15介質洗滌額外兩次，並在室溫下以400g離心10min。不採取額外步驟以移除單核細胞。在分離之後，將新鮮及未經刺激之PBMC再懸浮於X-VivoTM 15中達到1×106/mL之最終濃度，且用先前揭示之慢病毒顆粒轉導該等PBMC(兩個重複)。使傳導在37℃、5% CO2下在X-VivoTM 15介質中進行3天。傳導通常在1毫升/孔之12孔盤形式中在針對[VSV-g] 之MOI 10下及在針對[VSV-G+UCHT1]及[VSV-G+UCHT1+Vpu-CH]之MOI 1下進行(兩個重複)。在轉導3天之後，收集樣本並藉由FACS分析CD3+群體中之絕對細胞計數及GFP表現量。
圖9A及9B分別展示在用所指示慢病毒顆粒轉導新鮮經分離且未經刺激之PBMC後3天的總CD3+群體中之CD3+GFP+細胞之百分比(%)之直方圖(圖9A)及活CD3+群體之每孔絕對細胞計數之直方圖(圖9B)。各條柱表示兩個重複之平均值+/- SD。圖9A展示，相較於單獨的[VSV-G]，將抗CD3-scFvFc-GPI部分(UCHT1)添加至經VSV-G假型化慢病毒顆粒產生對新鮮經分離且未經刺激之PBMC的更高轉導效率。圖9A亦展示，Vpu-CH之添加可進一步改良經雙假型化載體[VSV-G+UCHT1]之轉導效率。圖9B展示，相較於僅VSV-G，UCHT1部分以每微升絕對細胞計數增強細胞刺激。相較於僅VSV-G，Vpu及UCHT1之添加以絕對細胞計數類似地增強細胞刺激。
實例5.藉由4小時暴露於用VSV-G假型化且在其表面上表現抗CD3 scFvFc之反轉錄病毒顆粒轉導未經刺激之人類PBMC由抗病毒藥物來抑制。
在此實例中，藉由4小時短暫暴露於用VSV-G假型化且不在其表面上單獨或與CD80-GPI組合顯現UCHT1scFvFc-GPI之反轉錄病毒顆粒而來有效地轉導未經刺激之人類PBMC。將抗病毒藥物達普利寧(反轉錄酶抑制劑)與度魯特韋(整合酶抑制劑)之組合的存在添加至一個樣本，以抑制轉導。
在FreestyleTM 293表現介質(Thermo Fisher Scientific)中適應懸浮培養之293T細胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)中產生重組慢病毒顆粒。使用具有基因組質體及編碼gag/pol、rev之單獨的封裝質 體以及編碼如實例3中所描述之VSV-G之假型化質體的PEI瞬時轉染細胞。對於某些樣本，轉染反應混合物亦包括單獨編碼UCHT1scFvFc-GPI之質體或連同編碼如實例3中進一步所描述之CD80-GPI之另一質體一起。基因組質體為編碼GFP、抗CD19嵌合抗原受體及本文中稱為F1-0-03之eTAG(圖5)的第三代慢病毒表現載體。F1-0-03不包括淋巴組織增殖性元件。
在不具有用以移除單核細胞之任何額外步驟的情況下，由如實例3中所描述之血塊黃層來製備PBMC。在分離之後，將含1×106個未經刺激之PBMC之1ml之X-Vivo15接種至96個深孔盤之各孔中。在1之MOI下添加病毒顆粒且在37℃及5% CO2下培育盤4小時。在4小時轉導之後，在各孔中之細胞再懸浮於1ml X-Vivo15中之前在DPBS+2% HSA中將細胞洗滌3次，且在37℃及5% CO2下培育。對於經抗病毒藥物處理之樣本，在轉導及後續培育期間，將達普利甯及度魯特韋添加至10μM之最終濃度。任何時候均不向樣本添加外源性細胞介素。在第6天收集樣本，以測定基於GFP表現之轉導效率，如使用基於前向及側向散射的淋巴球門藉由FAC分析所測定。
圖10A及圖10B展示轉導未經刺激之PBMC後第6天的GFP+細胞之百分比(%)的直方圖(圖10A)及每孔GFP+細胞之絕對數目的直方圖(圖10B)。此等直方圖展示，可藉由4小時暴露於編碼F1-0-03且不單獨顯現UCHT1scFvFc-GPI或與CD80-GPI組合顯現的經VSV-G假型化之慢病毒顆粒來轉導未經刺激之人類PBMC。此外，如針對顯現UCHT1scFvFc-GPI的經VSV-G假型化之慢病毒顆粒所展示，藉由抑制反轉錄及整合之藥物組合的存在來顯著地降低藉由此等慢病毒顆粒對PBMC的轉導效率。此實例展示，在短暫4小時暴露於此等反轉 錄病毒顆粒之後，此等PBMC之基因修飾及轉基因表現不為假轉導，而為轉導之結果，其中病毒轉基因RNA經反轉錄、整合至PBMC之基因組中且表現。
實例6.未經刺激之PBMC與用源自VSV-G、BaEV或MuLV的包膜假型化且視情況於其表面上表現抗CD3 scFvFc之反轉錄病毒顆粒一起培育4小時的轉導效率。
在此實例中，將用各種不同包膜蛋白假型化之慢病毒顆粒與未經刺激之人類PBMC一起培育4小時，並評估轉導效率。
在FreestyleTM 293表現介質(Thermo Fisher Scientific)中適應懸浮培養之293T細胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)中產生重組慢病毒顆粒。使用具有基因組質體及編碼gag/pol、rev之單獨的封裝質體及假型化質體的PEI瞬時轉染細胞。對於某些樣本，轉導反應混合物亦包括編碼UCHT1scFvFc-GPI之質體。對於此實例中之樣本所使用之基因組質體為本文中之其他實例中所描述的F1-3-219或F1-3-451。對於此實例中之樣本所使用的假型化質體編碼來自以下之之包膜蛋白：VSV-G(SEQ ID NO：548)、BaEVwt(SEQ ID NO：535)、MuLV(SEQ ID NO：538)(有時稱為MLV)、其中在甲硫胺酸殘基546(SEQ ID NO：536)或纈氨酸殘基547(SEQ ID NO：537)之前藉由截斷BaEVwt移除融合抑制性R肽之BaEV包膜的修飾，或其中來自UCHT1之抗CD3 scFv融合至MuLV包膜之胺基末端的U-MuLV(SEQ ID NO：539)。
在不同的日子執行使用編碼F1-3-219及F1-3-451之慢病毒顆粒的實驗，且使用來自不同供體之PBMC，但遵循相同方案。在第0天，在不具有用以移除單核細胞之任何額外步驟的情況下，由如實例3中所描述之血塊黃層來製備PBMC。在分離之後，將含1×106 個未經刺激之PBMC之1ml之X-Vivo15接種至96個深孔盤之各孔中。除非另外指示，否則在1之MOI下添加病毒顆粒且在37℃及5% CO2下培育盤4小時。在4小時轉導之後，在各孔中之細胞再懸浮於1ml X-Vivo15中之前在DPBS+2% HSA中將細胞洗滌3次，且在37℃及5% CO2下培育。任何時候均不向樣本添加外源性細胞介素。在第3天或第6天收集樣本，以測定基於GFP表現之轉導效率，如使用基於前向及側向散射的淋巴球門藉由FAC分析所測定。
對於測試VSV-G及狒狒包膜蛋白之第一次轉導，在第6天量測編碼F1-3-219之慢病毒顆粒的轉導效率。圖11A展示FLAG+%且圖11B展示如所指示假型化之慢病毒的每微升FLAG+細胞數目。相較於未經轉導之細胞，包括具有VSV-G或狒狒包膜蛋白之彼等的慢病毒顆粒中之每一者能夠促進轉導。相對於在實例5中，在此實例中藉由經VSV-G假型化之慢病毒顆粒之較高轉導速率有可能為由F1-3-219編碼之嵌合淋巴組織增殖性元件的結果。用VSV-G假型化且表現UCHT1scFvFc-GPI之病毒顆粒及用BaEV△R(HA)假型化之病毒顆粒在此實驗中展示最高轉導效率。
對於測試VSV-G及狒狒包膜蛋白之第一次轉導，在第6天量測編碼F1-3-451之慢病毒顆粒的轉導效率。圖12A展示CD3+ FLAG+ %且圖12B展示如所指示假型化之慢病毒的活CD3+ FLAG+細胞%。相較於未經轉導之細胞，包括具有VSV-G或鼠類白血病病毒包膜蛋白之彼等的慢病毒顆粒中之每一者能夠促進轉導。用MuLV假型化且不將UCHT1ScFv顯現為單獨的包膜蛋白及UCHT1scFvFv-GPI[MuLV+U]或顯現為包膜融合蛋白[U-MuLV]之病毒顆粒在此實驗中展示最高轉導效率。
實例7.藉由暴露4小時或少於1分鐘的未經刺激之PBMC之反轉錄病毒轉導的時間過程。
在此實驗中，重組慢病毒顆粒與未經刺激之PBMC一起培育持續4小時與少於1分鐘之間的時間，且檢查其在不存在任何外源性細胞介素之情況下轉導PBMC且促進其活體外存活及/或增殖的能力。
方法
在FreestyleTM 293表現介質(Thermo Fisher Scientific)中適應懸浮培養之293T細胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)中產生重組慢病毒顆粒。使用具有基因組質體及編碼gag/pol、rev之單獨的封裝質體以及編碼如實例3中所描述之VSV-G之假型化質體的PEI瞬時轉染細胞。對於某些樣本，轉導反應混合物亦包括編碼如實例3中進一步所描述之UCHT1scFvFc-GPI的質體。在此實例中使用2種基因組質體。第一種質體包括Kozak序列、CD8a信號肽、FLAG標記及抗CD19：CD8：CD3z CAR，隨後三重終止序列(F1-3-253)。第二種質體包括Kozak序列、CD8a信號肽、FLAG標記及抗CD19：CD8：CD3z CAR、T2A及CLE DL3A-4(E013-T041-S186-S051)，隨後三重終止序列(F1-3-451)。
在第0天，根據製造商之說明書用Ficoll-Paque PREMIUM®(GE Healthcare Life Sciences)及SepMateTM-50(StemcellTM Technologies)使PBMC自來自2個供體之血塊黃層(San Diego Blood Bank)以密度梯度濃度富集。不採取額外步驟以移除單核細胞。在分離之後，將PBMC稀釋至每1ml之X-Vivo15(LONZA)1×106個PBMC，且將1ml接種至96個深孔盤之各孔中。亦留下來自各供體之細胞以用 於藉由FACS之表現型分析。轉導前不添加抗CD3、抗CD28、IL-2、IL-7或其他外源性細胞介素以活化或以其他方式刺激淋巴球。在1之MOI下將慢病毒顆粒直接地添加至未經刺激之PBMC。在以DPBS+2% HSA洗滌轉導混合物之細胞3次之前，在37℃及5% CO2下培育轉導物4小時、2小時、30分鐘、15分鐘、7.5分鐘、5分鐘、2.5分鐘或完全不培育。接著，使各孔中之細胞再懸浮於1ml X-Vivo15中且在37℃及5% CO2下培育。對於經抗病毒藥物治療之樣本，在轉導期間，將達普利甯或度魯特韋添加至10μM之最終濃度，且在37℃及5% CO2下培育轉導反應物4小時。在三次洗滌之後，在回收介質中以相同濃度補充藥物。任何時候均不向樣本添加外源性細胞介素。在第6天收集樣本，且使用基於前向及側向散射之淋巴球門藉由FACS分析來測定基於FLAG表現之轉導效率。
結果
在此實例中，發現少於1分鐘之培育時段與4小時的培育時段一樣有效地促進重組慢病毒顆粒對未刺激之PBMC的轉導。圖13展示，在藉由不同重組慢病毒顆粒轉導來自1個供體之未經刺激之PBMC所指示時段後第6天的CD3+FLAG+絕對細胞計數(每微升)。重組慢病毒顆粒中之每一者轉導PBMC之能力在所有培育時段內類似。此對表現抗CD3scFvFc-GPI之慢病毒顆粒而言尤其明顯，且相較於其非抗CD3scFvFc-GPI表現對應物具有更高轉導效率。對於所檢查之所有培育時間，經轉導PBMC之總數目在藉由[F1-3-451GU]轉導之彼等樣本中比在由指示在F1-3-451中編碼之DL3A CLE促進此等細胞之存活及/或增殖的[F1-3-253GU]轉導之彼等樣本更大。對如圖13中所展示藉由達普利寧(反轉錄酶)及度魯特韋(整合酶抑制劑)之轉導的抑 制證實，對此等PBMC之基因修飾及轉基因表現不為假轉導，而為其中病毒轉基因RNA經反轉錄、整合至PBMC之基因組中且表現之轉導的結果。使用PBMC自第二供體觀察到類似結果。
實例8. IL-7受體淋巴組織增殖性元件之構築。
藉由重疊寡核苷酸合成(DNA2.0,Newark,California)來合成來自T細胞淋巴母細胞白血病(243 InsPPCL(SEQ ID NO：82)；246 InsKCH(SEQ ID NO：101)；241 InsFSCGP(SEQ ID NO：102)；244 InsCHL(SEQ ID NO：103)；及244 InsPPVCSVT(SEQ ID NO：104)；全部均來自Shochat等人2011,J.Exp.Med.卷208 No.5 901-908)之一系列組成性活性IL7受體(IL7R)跨膜突變體。將經合成組成性活性IL7R跨膜突變體立即插入至在2A核糖體跳躍序列後面之組成性表現慢病毒載體主鏈中，接著為抗CD19 CD3ζ表現卡匣，該表現卡匣包括CD8A柄(SEQ ID NO：79)及前導肽(SEQ ID NO：74)。HEK293封裝細胞用IL7R跨膜突變體慢病毒載體及慢病毒封裝構築體來轉染，進行生長，並使用本領域中已知之方法採集病毒上清液。經CD3/CD28刺激之T細胞用病毒上清液來轉導且在IL2缺陷型AIM V、CTS OpTmizer T細胞擴展SFM或X-VIVO 15介質中生長4週，每週一次補充來自相同供體之冷凍PBMC。所得經擴展之表現IL7R變體之經轉導T細胞利用FACS分選來選殖且藉由定序RT-PCR產物來鑑別IL7R構築體之序列。選擇243 InsPPCL變體(PPCL)(SEQ ID NO：82)以供進一步進化以產生條件性活性CAR。
實例9.測試IL-7受體淋巴組織增殖性/存活元件在PBMC中之活性。
為測試IL-7Rα變體之其介導T細胞之細胞介素非依賴 性存活的能力，用酸性檸檬酸鹽(ACD)作為抗凝劑將三十毫升人類血液抽取至採血管中。遵循製造商之說明書藉由Ficoll-PacqueTM(General Electric)使用密度梯度濃度來處理全血，從而獲得周邊血單核細胞(PBMC)。將PBMC之等分試樣與X-VivoTM 15介質(Lonza)一起無菌地轉移至12孔組織培養盤之孔，至含50萬存活細胞/毫升之1mL最終體積中的最終濃度。亦將重組人類介白素-2(IL-2)(Novoprotein)添加至濃度為100IU/ml之一些樣本。在50ng/ml之濃度下添加活化抗CD3 Ab(OKT3，Novoprotein)，以活化PBMC以供病毒轉導。在37℃及5%二氧化碳下，在標準增濕組織培養培育箱中培育盤隔夜。在隔夜培育之後，以5重感染(MOI)將含有所要測試構築體(圖14A)之慢病毒顆粒製備物添加至個別孔。在37℃及5%二氧化碳下，在標準增濕組織培養培育箱中培育盤隔夜。在隔夜培育之後，收集12孔盤之孔中之每一者的內容物且離心以獲得丸粒。用D-PBS+2%人類血清蛋白(HSA)洗滌樣本一次，再懸浮於X-Vivo15TM介質中，且轉移至G-Rex® 6孔透氣細胞培養器件(Wilson Wolf)之孔。添加額外X-VivoTM 15介質以使各孔之最終體積達30ml。。將構築體中之每一者之匹配對照樣本轉移至G-Rex® 6-孔透氣細胞培養器件(Wilson Wolf)之孔且添加額外介質以用針對一些對照樣本之100IU/ml IL-2使最終體積達至30ml。在37℃及5%二氧化碳下，在標準增濕組織培養培育箱中培育G-Rex®器件7天。在每2至3天培養期間，將新鮮IL-2添加至含有IL-2之對照樣本。不補充不具有IL-2之經匹配測試樣本。在第7天移除樣本以追蹤擴展(Countess,Thermo Fisher)期間之細胞數目及存活力。
圖14A提供所測試IL7Rα構築體之示意圖。將此等構築體插入至重組慢病毒顆粒基因組中。非複製勝任型重組反轉錄病毒 顆粒用於轉導PBMC。圖14A展示由信號序列(SS)、胞外域(ECD)、跨膜(TM)及胞內域(ICD)構成之野生型IL7Rα(SEQ ID NO：229)的示意圖。「1」指示纖網蛋白III型域之位點；「2」指示WSXWS基元之位點；「3」指示Box 1位點；「4」指示蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點之位點，且「5」指示Box 2位點。
變體「A」為在位置243處具有InsPPCL(Shochat等人2011,J.Exp.Med.卷208 No.5 901-908)但不具有S185C突變之IL-7Rα，其在具有GFP多肽、GSG鏈接子及融合至其N末端之P2A核糖體跳躍序列的轉錄物上表現。變體「B」為具有GFP多肽、GSG鏈接子及融合至其N末端之P2A核糖體跳躍序列以及信號序列與胞外域之間的Myc標記的IL-7Rα InsPPCL。除其胞內域在位置292處經截斷以外，變體「C」與變體「B」類似。除其胞內域在位置292處經截斷以外，變體「D」與變體「A」類似。變體「E」為在其N末端處經截斷以使得不存在信號序列及大部分胞外域(殘基1至228)之IL-7Rα InsPPCL變體；變體「E」亦以根據胺基末端之次序具有GFP多肽、GSG鏈接子、P2A核糖體跳躍序列及融合至N末端之eTag。對胺基酸殘基進行編號係基於IL7Rα(NCBI GI No.002176.2)。在存在或不存在IL-2之情況下，針對存活力使用Trypan Blue排除法來測試含有變體中之每一者的T細胞。
如圖14B中所展示，PBMC需要IL-2以供活體外存活。如圖14B中所說明，在轉導後的第7天，未經轉染之PBMC在存在IL-2之情況下具有約80%存活力，且在不存在IL-2之情況下具有0%存活力。在轉導後的第7天，在不存在IL-2之情況下，具有IL-7Rα InsPPCL(圖14A中之IL-7Rα變體A及B)之全長型式的PBMC具有超過 20%存活力，從而指示組成性活性IL-7Rα InsPPCL受體之表現在此等細胞中具有存活活性。此外，相較於野生型IL-7受體，在轉導後的第7天，表現具有經截斷胞內域(ICD)之IL-7Rα InsPPCL變體(圖14A中之IL-7Rα變體C及D)的T細胞具有增加的存活力。最終，N末端IL-7受體突變體(圖14A中之IL-7Rα變體E)如圖14B中所展示在此等細胞中具有存活活性。因此，此實例說明，當在PBMC中表現時，某些IL-7受體突變體具有存活活性。
實例10.對來自重複嵌合庫篩檢之淋巴組織增殖性元件及整體嵌合構築體之胞內信號傳導域的分析。
此實例確認，當在不存在外源性添加之細胞介素(諸如IL-2)的情況下在轉導後第7天與至少第21天之間培養時，來自絕大多數候選增殖及/或存活基因之胞內域在促進PBMC之增殖及/或存活方面有效，該等增殖及/或存活基因經報道在某些條件下促進淋巴或骨髓增殖及/或存活。此外，在第21天和以後的時間點，識別出令人驚訝地促進尤其值得注意的擴展的胞內域及對應基因
材料及方法
資料準備
用於此分析之資料為8個重複庫之集合中之構築體的子集，4個庫各自根據本文中實例12之庫3.1A(「饋入」有PBMC)(3.1.1a至3.1.4a)及庫3.1B(未「饋入」有PBMC)(3.1.1b至3.1.4b)來製備。針對全部8個庫分析第7天與第21天之間的差異富集，且如下分析額外時間點經：庫3.1.1a-第28天及第35天；庫3.1.1b-第35天；庫3.1.4a-第28天、第35天及第42天；以及庫3.1.4b-第28天。與對於相同胞外域及跨膜域而言無胞內域(鏈接子及終止)相比較，在各時間點處對具有一個(僅受 測第一胞內域)或兩個胞內域(受測胞內域加庫中之任何第二胞內域)之受測胞內域的所有構築體進行分析。
功能/分析
對含有特定胞內域部分之構築體相比於含有任何其他胞內域部分之構築體的差異富集進行Mann-Whitney-Wilcoxon測試，其中差異富集經定義為具有胞內域之構築體與其具有相同胞外域及跨膜域且無胞內域的對應部分之富集(在第21天之標準化計數與第7天之標準化計數之間的log2轉變比率，各自增加假計數1)之間的差異。P值可經調節以用於測試之各集合(當考慮每庫測試之一個集合時)的假發現率(Benjamini-Hochberg)，且將假發現率設定為0.1(Sober等人Sci Rep.2016年12月8日；6：38439；及Biostatistics.2017年4月1日；18(2)：275-294)。
結果
吾等試圖確認，經報道在某些條件下促進淋巴或骨髓細胞之細胞增殖及/或存活之各種候選基因的胞內信號傳導域可提供包括於本文中所提供之組合物及方法中之淋巴組織增殖性元件的有效胞內信號傳導域。因此，構築嵌合淋巴增殖性元件，其將第一胞內信號傳導域與各種胞外域及跨膜域(且於大多數情況中，第二胞內域)組合。此等嵌合淋巴增殖性元件(CLE)構築體自胺基至羧基末端包括如關於編碼此等CLE之核酸構築體而圖解性地展示於圖15中之胞外域(P1)、跨膜域(P2)及二者中之一者或兩者、第一胞內信號傳導域(P3)及第二胞內信號傳導域(P4)。測試來自以下基因(具有圓括號中所提供之部分的標識符及表7中所提供之部分的序列)之第一胞內信號傳導域(P3)：CRLF2(S054)、CSF2RB(S057)、CSF2RA(S058及S059)、 CSF3R(S062)、CSF3R(S063)、CSF3R(S064)、EPOR(S069及S072)、GHR(S077)、IFNAR1(S081)、IFNAR2(S082及S083)、IFNGR1(S084)、IFNGR2(S085)、IFNLR1(S086)、IL1R1(S098及S099)、IL1RAP(S100及S101)、IL1RL1(S102)、IL1RL2(S103)、IL2RA(S104)、IL2RB(S105)、IL2RG(S106)、IL3RA(S109)、IL5R(S115)、IL6R(S116)、IL6ST(S117)、IL7RA(S120)、IL7RA(S121)、IL9R(S126)、IL10RA(S129)、IL10RB(S130)、IL11RA(S135)、IL12RB1(S136)、IL12RB1(S137)、IL12RB2(S138)、IL13RA1(S141)、IL13RA2(S142)、IL15RA(S143)、IL17RB(S145)、IL17RC(S147)、IL17RD(S148)、IL18R1(S154)、IL18RAP(S155)、IL20RA(S156)、IL20RB(S157)、IL21R(S158)、IL22RA1(S161)、IL23R(S165)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170及S171)、LEPR(S174、S175、S176及S177)、LIFR(S180)、LMP1(S183)、MPL(S186)、MyD88(S189、S190、S191、S192、S193、S194、S195、S196、S197、及S198)、OSMR(S199)、PRLR(S202)、IL17RA(S144)、IL17RC(S146)、IL17RE(S149)及IFNLR1(S087)。此外，在篩檢中包括連接子作為P3部分(X001)，以產生缺少第一細胞內信號域之淋巴增殖性元件。
在3.1庫中，「第二」胞內域(P4)意欲作為調節域，儘管若干此等P4胞內域來自亦經報道在某些條件下促進淋巴或骨髓細胞之增殖及/或存活的基因，且因而可在淋巴組織增殖性元件上不存在「第一」胞內信號傳導域(P3)的情況下提供有效增殖及/或存活信號。測試來自以下基因(具有圓括號中所提供之部分的標識符及表7中所提供之部分的序列)之第二胞內信號傳導域(P4)：CD3D(S037)、CD3E(S038)、CD3G(S039)、CD27(S047)、突變δ Lck CD28(S048)、 CD28(S049)、CD40(S050及S051)、CD79A(S052)、CD79B(S053)、FCER1G(S074)、FCGR2C(S075)、FCGRA2(S076)、ICOS(S080)、TNFRSF4(S211)、TNFRSF8(S212)、TNFRSF9(S213)、TNFRSF14(S214)及TNFRSF18(S215及S216)。另外，終止密碼子包括於P4域中之一些候選淋巴組織增殖性元件中，以產生僅具有單個胞內域之構築體。
如實例12中針對庫3.1所論述，含有包括亮胺酸拉鏈基元之c-Jun之變體的胞外域與eTAG及含有0個、1個、2個、3個或4個丙胺酸(分別為E006、E007、E008、E009及E010)之鏈接子一起使用。測試來自以下基因(具有圓括號中所提供之部分的標識符及表7中所提供之部分的序列)之跨膜域或組合柄及TM域：CD2(T001)、CD3D(T002)、CD3E(T003)、CD3G(T004)、CD3Z(T005)、CD4(T006)、CD8A(T007)、CD8B(T008)、CD27(T009)、CD28(T010)、CD40(T011)、CD79A(T012)、CD79B(T013)、CRLF2(T014及T015)、CSF2RA(T016)、CSF2RB(T017及T018)、CSF3R(T019及T020)、EPOR(T021及T022)、FCER1G(T023)、FCGR2C(T024)、FCGRA2(T025)、GHR(T026及T027)、ICOS(T028)、IFNAR1(T029)、IFNAR2(T030)、IFNGR1(T031)、IFNGR2(T032)、IFNLR1(T033)、IL1R1(T034)、IL1RAP(T035)、IL1RL1(T036)、IL1RL2(T037)、IL2RA(T038)、IL2RB(T039)、IL2RG(T040)、IL3RA(T041)、IL4R(T042)、IL5RA(T043)、IL6R(T044)、IL6ST(T045)、IL7RA(T046及T047)、IL9R(T048)、IL10RA(T049)、IL10RB(T050)、IL11RA(T051)、IL12RB1(T052)、IL12RB2(T053)、IL13RA1(T054)、IL13RA2(T055)、IL15RA(T056)、IL17RA(T057)、IL17RB(T058)、IL17RC(T059)、IL17RD(T060)、IL17RE(T061)、IL18R1(T062)、IL18RAP(T063)、IL20RA(T064)、IL20RB(T065)、 IL21R(T066)、IL22RA1(T067)、IL23R(T068)、IL27RA(T069)、IL27RA(T070)、IL31RA(T071)、LEPR(T072)、LIFR(T073)、MPL(T074)、MPL(T075)、OSMR(T076)、PRLR(T077)、TNFRSF4(T078)、TNFRSF8(T079)、TNFRSF9(T080)、TNFRSF14(T081)及TNFRSF18(T082)。
除上文所論述及此實例中進一步分析之庫3.1的重複以外，已執行總共二十個庫篩檢，確認各種候選胞內域可在不存在培養介質之任何外源性T細胞生長刺激劑(例如，外源性IL-2)的情況下有效促進T細胞活體外擴展。在與實例11及實例12中所提供之彼等類似且使用來自不同供體之PBMC的各種條件下，構築體包括一個或兩個胞內域以及跨膜域以及如表7中所提供之胞外域。對於在所測試構築體中不包括CAR之庫，一般在第21天與第7天觀察到較少擴展，且編碼CAR及CLE兩者之許多構築體的轉導在第21天與第7天之間提供超出由僅包括CAR之構築體所提供之富集的富集。此等一般觀察確認，所測試淋巴組織增殖性元件增強抗CD19 CAR在存在PBMC的情況下提供之初級增殖及/或擴展信號，PBMC中之至少一些據信表現CD-19。
為確認在某些條件下驅動骨髓或淋巴球之增殖及/或存活之許多不同胞內域可充當本文中所提供之淋巴組織增殖性元件中之第一胞內信號傳導域，以在培養期間在不存在任何外源性添加之細胞介素或外源性添加之促淋巴球有絲分裂劑(例如，抗CD3或抗CD28)的情況下促進經轉導PBMC之擴展，根據實例12針對庫3.1所提供之方法對胞內P3及P4域執行八個庫篩檢，其中4個根據3.1A的重複庫(「饋入」有PBMC)及4個根據3.1B的重複庫(未「饋入」有PBMC)。 在轉導後在不存在外源性細胞介素或其他T細胞刺激劑的情況下培養細胞達21天，並分析結果。藉由量測富集來測定第21天及稍後時間點之擴展，該富集為第21天或更晚之標準化計數(每百萬計數)與針對彼構築體的第7天之標準化計數之間的比。相較於第7天，在第21天、第28天、35天及42天針對庫重複內之各可用時間點分析細胞之擴展。相較於第7天，就測試時間點處所獲得之擴展水準而言對構築體進行排序。
表25提供，在至少一個時間點之此等八個重複庫篩檢中之任一者中，相對於第7天，在時間點處之擴展方面排序在前100個構築體的構築體。細胞擴展定量顯示，每一胞外域(P1部分)及跨膜域(P2部分)以及所有第二胞內域(P4部分)於此等八個庫篩檢中之至少一者中的至少一個前100個構築體中表示。在此等篩檢之49個基因中測試的79個第一胞內信號傳導域(P3部分)中，僅6個胞內信號傳導域部分未存在於八個重複庫篩檢中之任一者中的前100個構築體中，且在前100個構築體中發現來自基因中之兩者的不同胞內域片段。因此，來自僅3個所測試基因之胞內信號傳導域未表示於前100個構築體中。未在前100個部分中發現不具有胞內信號傳導域之構築體(亦即，其中P3為鏈接子(X001)且P4為終止密碼子(X002)之構築體)。事實上，不具有胞內信號傳導域之構築體中無一者經排序在八個重複庫篩檢中之任一者中的前350(最前排序為庫3.1.1b中之353)中，從而驗證此等淋巴組織增殖性元件(亦即，驅動子)篩檢在識別有效淋巴組織增殖性元件構築體，且尤其在在此等條件下離體或活體外促進此等培養物之擴展的胞內信號傳導域中之效果。
此等資料支援，來自經報道在某些條件下在淋巴或骨 髓細胞(包括在此等八個庫篩檢中成功測試之此等細胞)中促進細胞增殖或存活之基因的相對較大數目之胞內域可在本文中所提供之方法及組合物中用作淋巴組織增殖性元件之第一信號傳導胞內域。未識別為在此等篩檢中之任一者中提供前100個富集的五個基因(六個胞內域P3部分)為IL4R(部分S110及S113)、IL17RA(部分S144)、IL17RC(部分S146)、IL17RE(部分S149)及IFNLR1(部分S087)。無論是在基因構築體中，抑或在用於偵測之方法中，此等P3部分有可能存在未在重複中之任一者的前100中被識別出來的技術問題。因此，不可根據此資料得出此等胞內活化域不能形成有效胞內第一信號傳導分子的結論。亦值得注意，IL17RC部分S146未發現於此等庫3.1重複中之任何前100個庫中，但在前100個清單中發現IL17RC胞內域部分S147。
不受理論限制，所有胞外域(P1)及所有跨膜域(P2)均存在於來自至少一個庫篩檢的至少一個前100個構築體中的結果與胞外域及跨膜域在定向此等淋巴組織增殖性元件構築體中之一個或兩個胞內信號域中起支援作用的假設一致。由於在篩檢中測試之ECD已知形成二聚體，且跨膜域已知作為可將胞內信號傳導域定向於活性構象中之跨膜多肽，因此預期在篩檢中測試之所有ECD和TM在與有效的胞內信號域配對時至少在一些時候為有效的。
咸信，在如此實例中所分析之彼等的複雜淋巴組織增殖性元件篩檢中，如單獨在本文中之實例11及實例12中更詳細地例示，最有效胞內域及完整嵌合構築體將在八個篩檢之外的至少一個篩檢中展示為各庫中之構築體之以下所識別編號之外的前100個命中者：3.1.1a 73,556；3.1.1b 93,768；3.1.2a 91,572；3.1.2b 115,860；3.1.3a 91,918；3.1.3b 99,772；3.1.4a 31,177；3.1.4b 66,873。然而，許多有 效胞內域並不在所有或甚至大多數篩檢中展示為前100個命中者。不受理論限制，咸信，存在有助於淋巴增殖性元件在給定實驗中是否相對有效的許多因素，在給定的實驗中培養物由用編碼候選淋巴增殖性元件的慢病毒之大型複雜混合物轉導的PBMC產生，此等慢病毒相互競爭以供擴展，且在各「饋入」實驗及各「未饋入」實驗中自不同供體個體獲得經轉導PBMC。
含有以下基因之部分存在於在P4處含有X002之構築體上的P3處及庫3.1重複(表25)中之至少一者的前100個構築體中：CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL5RA、IL6R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA2、IL15RA、IL17RD、IL21R、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、MyD88或OSMR。以下部分存在於在P4處含有X002之構築體上的P3處及庫3.1重複(表25)中之至少一者的前100個構築體中：S057、S058、S059、S064、S069、S072、S084、S085、S099、S100、S101、S102、S104、S106、S115、S116、S126、S130、S135、S137、S138、S142、S143、S148、S158、S165、S168、S169、S170、S171、S174、S175、S176、S177、S186、S190、S191、S192、S193、S197、S198或S199。
含有以下基因之部分存在於在P3處含有X001之構築體上的P4處及庫3.1重複(表25)中之至少一者的前100個構築體中：CD40、CD79B、FCGR2C或FCGRA2。以下部分存在於在P3處含有X001之構築體上的P4處及庫3.1重複(表25)中之至少一者的前100個構築體中：S037、S039、S050、S051、S052、S080、S212或S213。
接下來，對來自8個庫3.1重複庫篩檢實驗之資料進行 統計分析，從而識別出尤其有效之胞內P3及P4域。相對於第7天之細胞計數(亦即，假定相等細胞計數之DNA條形碼計數)，分析在第21天及稍後開始之時間點，如上文針對前100庫分析所論述。
吾等使用統計分析來識別獨立於其胞內配偶體之尤其有效的胞內域(亦即，P3部分及P4部分)。差異富集值經計算為含有所關注胞內部分的構築體之富集與具有相同胞外部分及跨膜部分但不具有胞內域的構築體之富集之間的差，其中富集經表現為以2為底，在特定時間點之標準化計數值(每百萬計數)增加假計數1與於第7天之標準化計數值(每百萬計數)增加假計數1之間的比例之對數。藉由對各第一胞內域(P3)相比於所有其他可能之P3部分進行Mann-Whitney-Wilcoxon測試來做統計分析。此測試針對含有特定P3部分之構築體及資料集中之所有其他構築體計算排序之和，且執行卡方測試以測定排序分佈是否顯著不同。應用Benjamini-Hochberg校正以獲得經調節以用於各個別庫之假發現率的p值。首先對與P4部分無關之所有構築體進行此分析。當若干部分表示相同基因之變體時，亦使用由基因分組之部分單獨進行分析。隨後僅對於在P4處具有終止密碼子(X002部分)之構築體進行相同分析。
對於8個庫3.1重複，表1提供使用統計分析的最有效第一胞內信號傳導域(P3)基因及部分之標識符之。當僅以P4處之終止進行分析時，表1中之天數編號之後的星號指示P3基因或部分對所指示水準為顯著的，且當對於所給P3以任何P4進行分析時，在天數編號之後的井字號指示P3基因或部分對所指示P水準為顯著的。在天數編號之後不存在星號或井字指示所指示天數的顯著性及顯著水準係針對以所給P3之所有P4部分的分析及針對所給P3之P4處之終止的分析兩 者的P3部分或基因獲得。以下基因由第一胞內信號傳導域部分來表示，該等第一胞內信號傳導域部分經識別在藉由此統計分析(P<0.1)展示為最有效之構築體中，其中部分數字在圓括號中，或由藉由基因分析之基因展示為最有效：CSF2RB(S057)、CSF3R(S062、S063及S064)、IFNAR1(S081)、IFNGR1(S084)、IL2RB(S105)、IL2RG(S106)、IL6ST(S117)、IL10RA(S129)、IL12RB2(S138)、IL17RC(僅基因分析)、IL17RE(S149)、IL18R1(僅基因分析)、IL22RA1(S161)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170)、MPL(S186)、MyD88(S190、S191、S192、S194、S196、S197、S198)、OSMR(S199)及PRLR(S202)。值得注意，IL17RE(S149)係藉由此統計分析來識別，但並未展示於此等庫之任何前100個清單上(參見表25)。咸信，此庫之此部分的較低表示產生假陽性統計結果。
以下第一胞內域基因由第一胞內信號傳導域部分來表示，該等第一胞內信號傳導域部分藉由至少2個庫之此統計分析(P<0.1)最有效，其中部分數字在圓括號中：CSF2RB(S057)、CSF3R(S062、S063及S064)、IL2RB(S105)、IL2RG(S106)、IL6ST(S117)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170)、MPL(S186)及MyD88(S190、S191、S192、S194、S196、S197、S198)。
以下第一胞內域基因由第一胞內信號傳導域部分來表示，該等第一胞內信號傳導域部分即使在P之統計截止值小於0.05時藉由至少2個庫之此統計分析最有效：CSF2RB(S057)、CSF3R(S062、S063及S064)、IL2RB(S105)、IL6ST(S117)、IL27RA(S168及S169)、IL31RA(S170)、MPL(S186)及MyD88(S190、S191、S192、S194、S196、S197、S198)。最終，以下第一胞內域基因藉由至少2個庫之此統計分 析最有效，即使在P之統計截止值小於0.05時，其中該等庫不為來自相同重複之經饋入/未經饋入之對。CSF3R、IL6ST、IL27RA、MPL及MyD88。
對P4域之分析
除使用任何P3域或不使用P3域(部分P3處之鏈接子(X001))分析受測P4域以外，如上文針對P3域所指示來進行對P4域之統計分析。對於8個庫3.1重複，表2提供使用統計分析的最有效第二胞內信號傳導域(P4)基因及部分的標識符之。當僅以P3處之鏈接子進行分析時，在表2中之天數編號之後的星號指示P4基因或部分對所指示水準為顯著的，且當對於所給P4以任何P3進行分析時，在天數編號之後的井字號指示P4基因或部分對所指示P水準為顯著的。在天數編 號之後不存在星號或井字指示所指示天數的顯著性及顯著水準係針對以所給P4之所有P3部分的分析及對所給P4之P3處鏈接子的分析兩者之P4部分或基因獲得。在圓括號中具有部分數字之以下基因由第二胞內信號傳導域部分來表示，該等第二胞內信號傳導域部分經識別在藉由此統計分析(P<0.1)展示為最有效之構築體中：CD27(S047)、CD40(S050及S051)、CD79B(S053)、TNFRSF4(S211)、TNFRSF8(S212)、TNFRSF9(S213)及TNFRSF18(S215)。以下基因由第二胞內信號傳導域部分來表示，該等第二胞內信號傳導域部分在藉由至少2個庫之此統計學分析最有效：CD40(S050及S051)及TNFRSF8(S212)。在圓括號中具有部分數字之以下基因由第二胞內信號傳導域部分來表示，該等第二胞內信號傳導域部分經識別在藉由此統計學分析(P<0.05)展示為最有效之構築體中：CD27(S047)、CD40(S050及S051)、TNFRSF4(S211)、TNFRSF8(S212)、TNFRSF9(S213)及TNFRSF18(S215)。值得注意，統計學上最顯著之第二胞內信號傳導域中的所有均源自TNF受體家族成員。
進行進一步分析以識別出對各第一胞內信號傳導域最有效之第二胞內信號傳導域(P4)配偶體。為進行此分析，將具有兩個胞內域之構築體與其具有僅一個胞內域之等效物(相同胞外域、跨膜域及第一胞內域)進行比較。差異富集經計算為兩個構築體之間的富集值之間的差，其中富集經表現為以2為底，在所關注時間點之標準化計數(每百萬計數)與第7天之標準化計數(每百萬計數)(各自增加假計數1)之間的比例之對數。針對胞外部分、跨膜部分及第一胞內部 分之各代表組合組合，對具有特定第二胞內域相比於其他第二胞內域之構築體的差異表現值進行Mann-Whitney-Wilcoxon測試，以識別出與排序分佈顯著變化相關聯之部分。針對各測試集使用Benjamini-Hochberg方法來調整P值，且將假發現率設定為0.1或0.05。
對於8個庫3.1重複及庫3.0(實例12)，表3提供使用此統計分析的對第一胞內信號傳導域(P3)部分及對應基因最有效的第二胞內信號傳導域(P4)配偶體之標識符。具有首先來自P3部分之基因及其次來自P4部分之基因的以下對基因由第一及第二胞內信號傳導域部分來表示，該等第一及第二胞內信號傳導域部分經識別在藉由此統計分析(P<0.1)最有效之相同構築體上：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSF2RA及TNFRSF8；CSF2RA及CD27；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL1RAP及CD79A；IL3RA及CD40；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL13RA2及TNFRSF14；IL18RAP及CD3G；IL27RA及FCGRA2；LEPR及CD3G；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD3G；MyD88及CD79B；以及MyD88及CD3D。具有首先來自P3部分之基因及其次來自P4部分之基因的以下對基因由第一及第二胞內信號傳導域部分來表示，該等第一及第二胞內信號傳導域部分經識別在嚴格統計水準下(P<0.05)最有效之相同構築體上：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL27RA及FCGRA2；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD3G；以及MyD88及CD79B。首先具有P3部分及其次P4部分之以下對基因經識別在藉由此統計分析(P<0.1)最有效之相同構築體上：S058 及S211；S058及S049；S059及S212；S059及S047；S064及S053；S083及S214；S101及S052；S109及S050；S129及S053；S135及S076；S142及S214；S155及S039；S169及S076；S177及S039；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186及S039；S192及S053；S194及S037；以及S195及S053。首先具有P3部分及其次P4部分之以下基因對經識別在藉由此統計分析(P<0.05)最有效之相同構築體上：S058及S211；S058及S049；S064及S053；S083及S214；S129及S053；S135及S076；S169及S076；S180及S216；S186及S050；S186及S051；S186及S053；S186及S211；S186及S039；以及S195及S053。
因此，來自所列P4基因之胞內信號傳導域似乎在對由所列P3配偶體基因之胞內信號傳導域提供之增殖信號進行共刺激時特別有效。
此實例確認，絕大多數所測試第一胞內域在離體培養時在不存在外源性細胞介素的情況下在轉導後第7天與第21天之間驅動經轉導PBMC之擴展方面有效。此外，各種胞內域以及第一及第二胞內域組合經識別在此等條件下驅動擴展達21天及更晚時間點方面 特別有效。
實例11.候選嵌合多肽淋巴組織增殖性元件之識別。
在此實例中，候選(推定)嵌合淋巴增殖性元件之兩個嵌合多肽庫(庫1及庫2)經組裝至來自胞外-跨膜阻斷序列庫、胞內阻斷序列庫及根據圖16至圖17中所提供之編碼嵌合多肽之構築體的條形碼庫的病毒載體中。庫轉導之PBMC的增殖隨時間進行：以一週間隔自PBMC提取基因組DNA且擴增條形碼區以用於DNA定序以估計在此等混合的含有測試候選嵌合淋巴增殖性元件中之每一者之PBMC培養物中的細胞數目。因此，篩檢測試候選嵌合淋巴增殖性元件在不存在IL-2或任何其他外源性細胞介素之情況下促進PBMC細胞增殖的能力。
此研究中製備且分析兩個庫：在庫1(其用於識別為庫1A、1.1A及1.1B之篩檢中)之構築體在候選嵌合多肽之5’末端處側接有CAR，而庫2(其用於識別為庫2B及2.1B之篩檢中)之構築體不包括CAR(圖16及圖17)。圖16提供含有聚核苷酸序列之非限制性例示性轉基因表現卡匣之示意圖，該聚核苷酸序列編碼由慢病毒載體主鏈中之EF-1α啟動子及Kozak類型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO：519))驅動的庫1之CAR及候選嵌合淋巴增殖性元件(CLE)。CAR經FLAG標記且含有針對CD19之ASTR、CD8之莖及跨膜部分，及來自CD3z之胞內活化域。庫1之各候選淋巴增殖性元件包括3個模塊：1個胞外/跨膜模塊(P1-2)及2個胞內模塊(P3及P4)。P1-2模塊亦編碼識別及/或消除域(TAG)。三重終止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO：520))自DNA條形碼(P5)中分離P4。WPRE(GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATT CTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO：521))存在於最後一個終止密碼子(開始於最後一個終止密碼子之最後一個核苷酸之後的4bp)與3’LTR(其開始於WPRE之最後一個核苷酸之後的83個核苷酸)之間。
庫1之CAR及P1-2藉由編碼T2A核糖體跳躍序列之聚核苷酸序列間隔開。
圖17提供含有聚核苷酸序列之非限制性例示性轉基因表現卡匣之示意圖，該聚核苷酸序列編碼由慢病毒載體主鏈中之EF-1α啟動子及Kozak類型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO：519))驅動的庫2之候選CLE。庫2之各候選淋巴增殖性元件包括3個模塊：一個胞外/跨膜模塊(P1-2)及2個胞內模塊(P3及P4)。P1-2模塊亦編碼識別及/或消除域(TAG)。三重終止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO：520))自DNA條形碼(P5)中分離P4。WPRE(GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO：521))存在於最後一個終止密碼子(開始於最後一個終止密碼子之最後一個核苷酸之後的4bp)與3’LTR(其開始於WPRE之最後一個核苷酸之後的83個核苷酸)之間。
兩個庫之經組裝候選嵌合多肽部分遵循具有3個位置(1個胞外/跨膜模塊(P1-2)及2個胞內模塊(P3及P4)，其中之一者可為提 前終止信號)之完全相同的設計。包括由各域中之每一者之間的核酸序列編碼之GGS連接子作為構築體組件產物。編碼Myc或eTAG(SEQ ID NO：284)識別及/或消除域(在表7中稱為「eTAG」或「Myc Tag」)之完整或變體形式的核酸經插入各截斷細胞介素受體(或選擇LMP1構築體)之胞外域的5’作為P1-2模塊之部分，以使得所編碼之候選嵌合多肽在具有胞外域之框中包括識別及/或消除域。信號序列插入在庫1中之編碼CAR序列之5’端處及在庫2之編碼識別及/或消除域序列之5’端處。亦為增強型Kozak類型序列之Kozak類型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO：519))插入在ATG起始密碼子之前的10個核苷酸內，該起始密碼子在庫1中之信號序列編碼序列的5’端處及在庫2中之編碼識別及/或消除域序列(或選擇LMP1構築體)之5’端處。第4個模塊含有由~10,000×~10,000個子條形碼之隨機PCR組件產生的隨機條形碼(~1億個組合)。庫1構築體之CAR之寫碼序列編碼信號序列、FLAG標籤、抗CD19 ASTR scFv、CD8a莖、CD8a跨膜域及CD3ζ胞內活化域。CAR(僅庫1)及CLE(庫1及庫2)之表現由EF1α啟動子驅動。在庫1之構築體中，T2A位點位於CAR與嵌合多肽編碼序列之間。在庫1及2中，三重終止密碼子存在於P4之3’末端處。
病毒載體之合成
庫組件之個別部分經設計且合成為具有相容性IIs型酶(AarI)突出端及在各部分之5’及3’末端上編碼甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸序列之連接體的DNA嵌段。隨後將此等部分各別選殖至通用質體載體中。各部分之組件完成為一個管組件，其中將0.04pmol的部分、0.04pmol條形碼混合物及0.04pmol質體載體主鏈添加至10ul反應物中，接著添加1單位AarI酶、10單位T4 DNA連接酶及1X連接酶緩衝液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、10mM DTT)以獲得最佳連接酶活性。使用如下之熱循環進行分解及連接循環：在37℃下2min及16℃下5min；在50℃下培育5min以最終分解；在80℃下培育10min以使AarI失活，以及最終保持在4℃下的55個循環。隨後組裝之載體藉由習知的乙醇沈澱來純化。將得到的純化載體電穿孔(Electro Micropulser，Bio-rad)至Top10電感受態細胞(Thermo Fisher Scientific)中且直接回收在含有康微素抗生素之液體培養物中以用於選擇及擴增。在37℃下培育培養物10至12小時並且隨後收集，且使用ZymoPURE-EndoZeroTM質體Gigaprep套組純化質體。
慢病毒顆粒生產
重組慢病毒顆粒係藉由用編碼gag/pol及rev之單獨的慢病毒封裝質體及編碼VSV-G之假型化質體瞬時轉染293T細胞(Lenti-XTM 293T，Clontech)來產生。編碼具有或不具有共表現嵌合抗原受體之候選嵌合多肽的合成病毒載體用封裝質體共轉染。細胞藉由在FreestyleTM 293表現介質(ThermoFisher Scientific)中連續生長來適應懸浮培養。以1×106個細胞/毫升(200mL)在1L Erlenmeyer燒瓶中接種懸浮液中之細胞，並立即使用溶解於弱酸中之聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences)轉染。
對於200mL細胞將質體DNA稀釋於10ml GibcoTM Opti-MEMTM介質中。為獲得用VSV-G假型化之慢病毒顆粒，所使用之總DNA(1μg/mL之培養體積)為具有以下莫耳比之4種質體之混合物：2×組合病毒載體、1×含Rev之質體、1×含VSV-G之質體及1×含gag/pol之質體。單獨地，將PEI在10ml GibcoTM Opti-MEMTM中稀釋至2μg/mL(培養體積，與DNA之比為2：1比率)。在5分鐘室溫培育之 後，將兩種溶液澈底地混合在一起，且在室溫下培育20分鐘。將最終體積(20ml)添加至細胞中。接著伴隨在125rpm下及具有8% CO2之旋轉在37℃下培育細胞48小時。
在48小時後，採集上清液且藉由以1,000g離心10分鐘來澄清。隨後使病毒上清液經由低蛋白結合之Millex-HV 0.45μm PVDF過濾器(Millipore，目錄編號SLHVR25LS)來過濾。將澄清上清液倒入新試管中，使1體積之Lenti-X PEG(Takara，4×)與3體積之澄清上清液混合，並且在4℃下培育隔夜。隨後藉由以1,500g且在4℃下離心90分鐘來沈澱慢病毒顆粒。捨棄上清液，且將慢病毒顆粒丸粒再懸浮於1：100之初始體積之不具有IL-2之完全PBMC生長介質中。使用來自Takara(#632200)之p24檢定ELISA套組來滴定慢病毒顆粒。
PBMC之轉導及培養
將來自健康供體之全部人類血液(101ml)收集至200ml含有CDP抗凝劑(Nanger；S-200)之血袋中。遵循製造商之說明書及套組CS900.2(BioSafe；1008)使用Sepax 2 S-100器件(Biosafe；14000)使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)之密度梯度離心來處理血液，以獲得周邊血單核細胞(PBMC)。活PBMC之產量為7.3×107個細胞。將1.5×107個PBMC各自添加至兩個G-Rex 100M細胞培養器件(Wilson Wolf，81100S)中以在最終體積30ml之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴展SFM(根據製造商之說明書的補充有26ml OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增補充液(Thermo Fisher，A10484-02)、25ml CTSTM免疫細胞SR(Thermo Fisher，A2596101)及10ml CTSTM GlutaMAXTM-I補充液(Thermo Fisher，A1286001)之OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增基礎介質1L(Thermo Fisher，A10221))中達到最終濃度0.5×106個活細胞/ 毫升。亦將濃度為100IU/ml之重組人類介白素-2(IL-2)(Novoprotein)以及濃度為50ng/ml之活化抗CD3 Ab(OKT3，Novoprotein)一起添加以活化PBMC用於病毒轉導。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育隔夜。在隔夜培育之後，在5重感染(MOI)下將含有所要測試編碼嵌合多肽之構築體(庫1或庫2)之慢病毒顆粒製劑添加至個別G-Rex器件中。將G-Rex器件(庫1及庫2)在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育隔夜。在隔夜培育之後，添加額外的完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM以使各G-Rex器件之最終體積達到500ml。在此或以下細胞培養步驟中不添加額外的IL-2或其他外源性細胞介素。自PBMC分離後，將G-Rex®器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育7天。在第7天，藉由離心自用庫1或庫2轉導之兩個G-Rex器件中收集細胞並將該等細胞再懸浮於新鮮的不具有TL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中。將1.25×107個庫1細胞及2.54×107之庫2細胞置放在含有500ml不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM的新G-Rex 100M器件上。將一小瓶解凍的第0天冷凍供體匹配之PBMC(1.46×107個PBMC)添加至含有用庫1轉導之細胞的G-Rex器件中以提供對CD19 ASTR之CD19+ B細胞活化。在此等篩檢中，用庫數目之後的A指定饋入有PBMC之細胞，例如使用用庫1轉導且饋入有PBMC之細胞進行之篩檢在本文稱為庫1A。庫2不接受第0天PBMC。在此等篩檢中，用庫數目之後的B指定未饋入有PBMC之細胞，例如使用用庫2轉導且未饋入有PBMC之細胞進行之篩檢在本文稱為庫2B。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育隔夜。在第14天，藉由離心自兩個G-Rex器件(庫1A及庫2B)中收集細胞並將該等細胞再懸浮於新鮮的 不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中。將此等細胞各自置放在含有30ml不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM的6孔G-rex盤(Wilson-Wolf；80240M)之個別孔中。將一小瓶解凍的第0天冷凍供體匹配之PBMC添加至含有庫1A細胞之孔中以提供對CD19 ASTR之CD19+ B細胞活化。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育隔夜。在第21天，自6孔G-rex盤之各孔收集細胞，並且重複在第14天進行之處理。在轉導後之不同天(第7天、第21天、第28天及/或第35天)收集樣本(1×105至~4-5×106個細胞)，且根據套組方案使用GenEluteTM哺乳動物基因組DNA微量製劑純化基因組DNA。在一些情況下，使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)之密度梯度離心來純化樣本以在基因組DNA提取之前移除死亡細胞。使用Illumina HiSeq對純化的基因組DNA進行測序，產生配對末端150bp讀數。通常，從每個索引的fastq文檔中提取一千萬個讀數的子集，並使用barcode_reader進行分析處理，該barcode_reader為一個自定義的R腳本，用於基於恆定區域之存在提取條形碼序列。亦將純化的基因組DNA在PacBio定序系統上測序以獲得更長讀取長度以將條形碼與構築體相關聯。重複此等篩檢且將該等庫指定為1.1A、1.1B及2.1B，其中A及B指示如上文所論述之細胞是否饋入有PBMC。
資料分析
一旦獲得所有時間點之HiSeq資料後，就基於條形碼ID合併條形碼計數表。使用下式將計數標準化為『每百萬計數』：1×106 *原始計數/總和(樣本中所有條形碼之原始計數)，其稱為流行率值。捨棄具有每時間點0.33cpm或更少之平均流行率的條形碼。藉由SMRT測序(Pacific Biosciences)在選擇時間點獲得之全長構築體-條形 碼關聯性用於識別感興趣之組件。過濾掉不具有3個部分之非勝任型構築體或具有超過一個構築細胞之模糊構築體。各組件之富集值以(最終時間點之標準化計數+1)/(最初時間點之標準化計數+1)計算。候選嵌合多肽基因經識別為富集度高於各庫特異性閾值的構築體。
結果
嵌合多肽候選物經指示具有3個測試域，其包括一胞外及跨膜域(P1-2)、第一胞內域(P3)及第二胞內域(P4)(圖16及圖17)。此外，構築體包括DNA條形碼以幫助使用下一代定序來分析且識別構築體。另外，如表7中所示之最多構築體包括在具有胞外域及跨膜域之框中編碼識別及/或消除域之核酸序列。然而，編碼LMP1之胞外或跨膜片段之彼等構築體的識別及/或消除域在含有此類識別及/或消除域之彼等構築體之細胞內。庫1構築體編碼嵌合多肽候選物之上游的CAR。基於20個不同的胞外-跨膜域、106個可能的P3域及107個可能的P4域設計總共226,840個可能的概念化組合，其中一個為終止密碼子。在病毒載體組裝、慢病毒顆粒產生、PBMC之轉導及培養7天後，並非所有概念化構築體均偵測到。對於庫1A，在轉導PBMC及培養7天之後，存在57,815個構築體。對於庫2B，在轉導PBMC及培養7天之後，存在69,578個構築體。關於分析之候選物的詳細資訊以及詳細結果提供在表8至12中。關於各候選部分之詳細資訊提供在表7中。表8至12之標題如下：BlockSequence為在各構築體中使用之來自表7的P1-P2、P3及P4域的密碼；Norm_D7為在第7天之標準化計數；Enrich_DXX為在第XX天對比第7天之富集度，其中XX為表中指示之當天，例如Enrich_D21為第21天對比第7天之富集度且Enrich_D35為 第35天對比第7天之富集度。構築體之資料緊接著該構築體之右行展示。兩個構築體之資料展示於各列中。舉例而言，在表8中識別之第一候選物為M008-S212-S075。對於此候選物，胞外及跨膜域(P1-2)為M008，第一胞內域(P3)為S212，且第二胞內域(P4)為S075。關於此等模塊之身分標識之詳細資訊(例如M008)發現於表7中。表7揭示M008為LMP1且該構築體包括Myc標籤。候選域之胺基酸序列提供於表7中。為清楚說明，表7中之GenBank標識符提供編碼多肽域之核酸序列。在一些情況下，核酸序列經修飾以輔助選殖，或用於密碼子最佳化，但編碼與GenBank序列相同之多肽。在一些情況下，如由表7中提供之胺基酸序列顯而易見，使用由GenBank序列編碼之多肽的部分。
候選胞外及跨膜域選自已知的突變受體，諸如已經報導在至少一些細胞類型中表現時為組成性活性的細胞介素或激素受體。配位體結合域不包括在候選胞外及跨膜域中。此類受體突變體中之突變發生在跨膜區或近膜區中。例示性候選胞外及跨膜域包括IL7RA Ins PPCL、LMP1、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHR E260C I270C、IL27RA F523C及MPL S505N。候選胞外及跨膜域包括野生型病毒蛋白LMP1，其為一種已知在靶向脂質筏時或在與CD40融合時活化與配位體無關之細胞信號傳導的多重跨膜蛋白(Kaykas等人.EMBO J.20：2641(2001))。
選擇佔據候選嵌合多肽之第一及第二胞內域之潛在多肽的身分標識為一致的。此等候選胞內域為已知在至少一些細胞類型中促進增殖、存活(抗細胞凋亡)及/或提供共刺激信號之基因的胞內信號傳導域，該共刺激信號增強分化狀態、增殖潛能或對細胞死亡之 抗性。已知候選嵌合多肽之胞內域中之一些可活化JAK1/JAK2信號傳導及STAT5。來自表7中所列出之基因中之一些的胞內域包括在庫中。來自此等基因之例示性胞內域提供在表8至12之P3及P4位置。關於此等P3及P4域之詳細資訊提供在表7中。
對於包括編碼嵌合多肽及CAR之構築體的庫1A，當在不存在IL-2下培養時識別到在第7天與表上指示之最後一天之間促進PBMC增殖至最大程度(及亦可能存活)的172個最優候選嵌合多肽(參見表8，其中富集度以Log2(表中所指示之最後一天的標準化計數+1)-log2(第7天之標準化計數+1)計算)。值得注意的係，實例11及實例12之此篩檢實驗或全部篩檢實驗為競爭性實驗。因此，陰性結果並不意味構築體在不存在諸如IL-2之生長因子下不促進T細胞之增殖。其僅意味相對於所測試之其他構築體，其在增殖方面表現優於其他構築體。
對於庫1A，對於在P1-2位置測試之每個胞外及跨膜突變體域，一些嵌合多肽構築體在第7天與表上所指示之最後一天之間促進細胞增殖。當將自相同位置P1-2突變體推導之所有構築體的全部結果組合時，所有測試之胞外及跨膜域在第7天與表上所指示之最後一天之間產生大於1之細胞富集度(即促進細胞增殖)。存在於促進細胞增殖之構築體中的胞外及/或跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表8中。在稱為庫1.1A之重複篩檢中存在於促進細胞增殖之構築體中的胞外及/或跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表10中。在稱為庫1.1B(其包括用庫1轉導未饋入PBMC之細胞)之重複篩檢中存在於促進細胞增殖之構築體中的胞外及/或跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表11中。
對於庫1A，已知具有信號傳導活性的來自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8及TNFRSF9之胞內域或其突變體(若此類突變體存在於表8中提供之構築體中)在發現處於候選嵌合多肽之第一胞內域位置(P3)時在第7天與表上所指示之最後一天之間促進PBMC增殖，此時以組合方式考慮具有來自彼基因之第一細胞內域(P3)之所有構築體的資料。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，當將一個基因之所有構築體之結果組合時，使得對於庫1A，在表中指示之最後一天存在的此結構域計數比第7天多至少3倍。存在於促進最高程度之細胞增殖之構築體中的第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表8中。在稱為庫1.1A之重複篩檢中存在於促進最高程度之細胞增殖之構築體中的第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表10中。在稱為庫1.1B(其包括用庫1轉導未饋入PBMC之細胞)之重複篩檢中存在於促進細胞增殖之構築體中的第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表11中。
對於庫1A，已知具有信號傳導活性的來自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18之胞內域或其突變體(若此類突變體存在於該等表中)在發現處於候選嵌合多肽之第二胞內域位置(P4)時在第7天與表上所指示之最後一天之間促進PBMC增殖，此時以組合方式考慮具有來自彼基因之第二細胞內域(P4)之所有構築體的資料。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，當將一個基因之所有構築體之結果組合時，使得對於庫1A，在第35天存在的此結構域計數比第7天多 至少2.9倍。存在於促進最高程度之細胞增殖之構築體中的第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表8中。在稱為庫1.1A之重複篩檢中存在於促進細胞增殖之構築體中的第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表10中。在稱為庫1.1B(其包括用庫1轉導未饋入PBMC之細胞)之重複篩檢中存在於促進細胞增殖之構築體中的第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表11中。
特定言之，對於庫1A，在具有MPL S505N(MPL原癌基因，具有絲胺酸505突變成天冬醯胺之血小板生成素受體)作為P1-P2模塊之5,996個構築體中，165個為陽性的，其定義為對於庫1A具有富集度大於二之構築體。在具有CD3D(CD3d分子)作為P3模塊之436個構築體中，24個為陽性的。在具有CD3E(CD3e分子)作為P3模塊之528個構築體中，17個為陽性的。在具有CD8A(CD8a分子)作為P3模塊之261個構築體中，14個為陽性的。在具有CD40(CD40分子)作為P3模塊之1,022個構築體中，50個為陽性的。在具有IL3RA(介白素3受體次單元α)作為P3模塊之568個構築體中，26個為陽性的。在具有CD79B(CD79b分子)作為P3模塊之556個構築體中，27個為陽性的。在具有IFNAR1(干擾素α及β受體次單元1)作為P3模塊之131個構築體中，7個為陽性的。在具有IL13RA2(介白素13受體次單元α2)作為P3模塊之519個構築體中，33個為陽性的。在具有IL2RA(介白素2受體子單元α)作為P3模塊之571個構築體中，28個為陽性的。在具有CD27(CD27分子)作為P3模塊之618個構築體中，30個為陽性的。在具有TNFRSF8(TNF受體超家族成員8)作為P3模塊之573個構築體中，15個為陽性的。在具有TNFRSF9(TNF受體超家族成員9)作為P3模塊之573個構築體中，25個為陽性的。在具有IL13RA2(介白素13受體次單 元α2)作為P4模塊之360個構築體中，25個為陽性的。在具有IL2RA(介白素2受體次單元α)作為P4模塊之490個構築體中，28個為陽性的。在具有IL15RA(介白素15受體次單元α)作為P4模塊之489個構築體中，22個為陽性的。在具有CD8A(CD8a分子)作為P4模塊之590個構築體中，25個為陽性的。在具有IL13RA1(介白素13受體次單元α1)作為P4模塊之619個構築體中，25個為陽性的。在具有CD3G(CD3g分子)作為P4模塊之637個構築體中，30個為陽性的。在具有CD3D(CD3d分子)作為P4模塊之618個構築體中，37個為陽性的。在具有CD27(CD27分子)作為P4模塊之673個構築體中，29個為陽性的。在具有CD79B(CD79b分子)作為P4模塊之654個構築體中，33個為陽性的。在具有TNFRSF9(TNF受體超家族成員9)作為P4模塊之728個構築體中，30個為陽性的。在具有CD40(CD40分子)作為P4模塊之1,169個構築體中，53個為陽性的。在具有TNFRSF18(TNF受體超家族成員18)作為P4模塊之1,324個構築體中，54個為陽性的。在具有CD8B作為P4模塊之1,739個構築體中，73個為陽性的。在具有CRLF2作為P4模塊之286個構築體中，8個為陽性的。在具有FCGR2C作為P4模塊之725個構築體中，29個為陽性的。在具有ICOS作為P4模塊之602個構築體中，24個為陽性的。
出於重複篩檢之目的，具有尤其值得注意之富集度的構築體為對於重複庫之兩個庫具有大於2之log2((最後一天之標準化計數資料+1)/(第7天之標準化計數資料+1))值的彼等構築體。在表20及表21中列出符合庫1及庫2之此截止值的構築體。對於庫1A及1.1A，構築體M001-S116-S044、M024-S192-S045、M001-S047-S102、M048-S195-S043、M012-S216-S211及M030-S170-S194在兩次篩檢中 具有尤其值得注意的富集度。
關於在對庫1A及庫1.1A兩者之篩檢中的具有尤其值得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表20中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個ITAM基元。具有來自IL6R、MYD88、CD27、TNFRSF18或IL31RA之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD8B、IL1RL1、CD8A、TNFRSF4或MYD88之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫1A及1.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表20)。具有來自細胞介素受體IL6R、CD27、TNFRSF18或IL31RA之結構域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自細胞介素受體IL1RL1或TNFRSF4之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫1A及1.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表20)。
在包括編碼嵌合多肽且不編碼CAR之構築體的庫2B中，當在不存在IL-2下培養時識別到在第7天與表上指示之最後一天之間促進PBMC增殖的167個最優候選物(參見表9，其中富集度以Log2(表上所指示之最後一天的標準化計數+1)-log2(第7天之標準化計數+1)計算)。值得注意的係，一般富集度小於針對庫1A構築體(包括CAR)發現之彼富集度。
對於庫2B，在P1-2位置中之CSF3R T640N在第7天與表上所指示之最後一天之間促進細胞增殖比其他所測試之胞外及跨膜(P1-2)域更佳，當將來自胞外及跨膜域之所有構築體的所有結果組合時，產生大於2.5之富集因子。存在於促進最高程度之細胞增殖之構築體中的胞外及/跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表9 中。存在於在稱為庫2.1B之重複篩檢中促進最高程度之細胞增殖之構築體中的胞外及/或跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表12中。
對於庫2B，已知具有信號傳導活性的來自CD8A、CD40、IFNAR1、IL31RA及MyD88之胞內域或其突變體(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)在發現處於候選嵌合多肽之第一胞內域位置(P3)時在第7天與表上所指示之最後一天之間促進PBMC增殖，此時以組合方式考慮具有來自彼基因之第一細胞內域(P3)之所有構築體的資料。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，當將一個基因之所有構築體之結果組合時，使得對於庫2B，在第28天存在的此結構域計數比第7天多至少2倍。存在於促進最大程度之細胞增殖之構築體中的第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表9中。存在於在稱為庫2.1B之重複篩檢中促進最高程度之細胞增殖之構築體中的第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表12中。
對於庫2B，已知具有信號傳導活性的來自CD27之胞內域或其突變體(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)在發現處於嵌合多肽候選物之第二胞內域位置(P4)時在第7天與表上所指示之最後一天之間促進PBMC增殖，此時以組合方式考慮具有來自彼基因之第二細胞內域(P4)之所有構築體的資料。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，當將一個基因之所有構築體之結果組合時，使得對於庫2B，在第28天存在的此結構域計數比第7天多至少11倍。存在於促進最大程度之細胞增殖之構築體中的第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表9中。存在於在 稱為庫2.1B之重複篩檢中促進最大程度之細胞增殖之構築體中的第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表12中。
特定言之，對於庫2B，在具有CSF3R T640N(具有蘇胺酸640突變成天冬醯胺之群落刺激因子3受體)作為庫2B之P1/P2模塊的6,909個構築體中，59個為陽性的，其定義為對於庫2B具有大於二之富集度的構築體。在具有IFNAR1(干擾素α及β受體次單元1)作為庫2B之P3模塊的184個構築體中，3個為陽性的。在具有CD40(CD40分子)作為庫2B之P3模塊的1,258個構築體中，17個為陽性的。在具有CD27(CD27分子)作為庫2B之P4模塊的851個構築體中，11個為陽性的。在具有CD8A作為庫2B之P3模塊的418個構築體中，10個為陽性的。在具有IL31RA作為庫2B之P3模塊的1,385個構築體中，12個為陽性的。在具有MyD88作為庫2B之P3模塊的5,757個構築體中，56個為陽性的。
對於庫2B及2.1B，構築體M007-S049-S051、M007-S050-S039、M012-S050-S043、M012-S161-S213、M030-S142-S049、M001-S145-S130、M018-S085-S039、M018-S075-S053、M012-S135-S074及M007-S214-S077在兩個篩檢中具有尤其值得注意的富集度。出於重複篩檢之目的，具有尤其值得注意的富集度之構築體為具有log2((在最後一天之標準化計數資料+1)/(在第7天之標準化計數資料+1))值大於2之彼等構築體。
關於在對庫2B及庫2.1B兩者之篩檢中的具有尤其值得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表21中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個 ITAM基元。具有來自CD28、CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD40、CD3G、CD8A、TNFRSF9、CD28、IL10RB、CD79B、FCER1G或GHR之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫2B及2.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表21)。具有來自細胞介素受體CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、IL11RA或TNFRSF14之結構域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自細胞介素受體TNFRSF9、IL10RB、GHR或CD40之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫2B及2.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表21)。具有含有FCGR2C之ITAM基元之結構域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有含有CD3G、CD79B或FCER1G之ITAM基元之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫2B及2.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表21)。
實例12.候選嵌合多肽淋巴增殖性元件之識別。
在此實例中，候選(推定)嵌合淋巴增殖性元件之兩個嵌合多肽庫(庫3及庫4)經組裝至來自胞外-跨膜阻斷序列庫、胞內阻斷序列庫及根據圖15及圖18中所提供之編碼嵌合多肽之構築體的條形碼庫的病毒載體中。庫轉導之PBMC的增殖隨時間進行：以一週間隔自PBMC提取基因組DNA且擴增條形碼區以用於DNA定序以估計在此等混合的含有測試候選嵌合多肽中之每一者之PBMC培養物中的細胞數目。因此，篩檢測試候選嵌合多肽在不存在外源性添加之IL-2或任何其他外源性細胞介素下促進PBMC細胞增殖的能力。
在此研究中製備且分析兩個庫：庫3(其用於識別為庫3A、3B、3.1A及3.1B之篩檢中)在嵌合多肽之5’末端處側接有CAR， 而庫4(其用於識別為庫4B及4.1B之篩檢中)不包括CAR。圖15提供含有聚核苷酸序列之非限制性例示性轉基因表現卡匣之示意圖，該聚核苷酸序列編碼由慢病毒載體主鏈中之EF-1α啟動子及Kozak類型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO：519))驅動的庫3之CAR及候選CLE。CAR經FLAG標記且含有針對CD19之ASTR、CD8之莖及跨膜部分，及來自CD3z之胞內活化域。庫3之各候選淋巴增殖性元件包括4個模塊：胞外模塊(P1)、跨膜模塊(P2)及2個胞內模塊(P3及P4)。P1模塊亦編碼Myc識別及/或消除域。三重終止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO：520))自DNA條形碼(P5)中分離P4。WPRE(GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO：521))存在於最後一個終止密碼子(開始於最後一個終止密碼子之最後一個核苷酸之後的4bp)與3’LTR(其開始於WPRE之最後一個核苷酸之後的83個核苷酸)之間。
庫3之CAR及P1藉由編碼T2A核糖體跳躍序列之聚核苷酸序列間隔開。
圖18提供含有聚核苷酸序列之非限制性例示性轉基因表現卡匣之示意圖，該聚核苷酸序列編碼由慢病毒載體主鏈中之EF-1α啟動子及Kozak類型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO：519))驅動的庫4之候選CLE。庫4之各候選淋巴增殖性元件包括4個模塊：胞外模塊(P1)、跨膜模塊(P2)及2個胞內模塊(P3及P4)。P1模塊亦編碼Myc識別及/或消除域。三重終止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO：520))自 DNA條形碼(P5)中分離P4。WPRE(GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO：521))存在於最後一個終止密碼子(開始於最後一個終止密碼子之最後一個核苷酸之後的4bp)與3’LTR(其開始於WPRE之最後一個核苷酸之後的83個核苷酸)之間。
兩個庫之經組裝候選嵌合多肽部分遵循具有4個位置(1個胞外模塊(P1)、1個跨膜模塊(P2)及2個胞內模塊(P3及P4)，其中之一者可為提前終止信號)之完全相同的設計(圖15及圖18)。編碼Myc標籤或eTAG識別及/或消除域(在表7中稱為「eTAG」或「Myc Tag」)之完整或變體形式的核酸經插入在庫3中之編碼CAR序列之5’端處及在庫4中之P1中之c-Jun結構域的5’端處。信號序列插入在庫3中之編碼CAR序列之5’端處及在庫4之編碼識別及/或消除域序列的5’端處。除P1及P2結構域如本實施例稍後更詳細闡述之外，庫的通用設計及構建(包括條形碼)如本文實例11中所揭示。此外，清除域在如表7中所指示之一些構築體上，且在存在時為eTag變體或Myc標籤。
病毒載體之合成及慢病毒生產
如實例11中所揭示合成載體並且產生各庫之慢病毒顆粒。
PBMC之轉導及培養
對於庫3A，將來自健康供體之全部人類血液(89.1ml)收集至200ml含有CDP抗凝劑(Nanger；S-200)之血袋中。遵循製造商 之說明書及套組CS900.2(BioSafe；1008)使用Sepax 2 S-100器件(Biosafe；14000)使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)之密度梯度離心來處理血液，以獲得周邊血單核細胞(PBMC)。活PBMC之產量為8.4×107個細胞。將十小瓶每瓶5×106個PBMC之細胞冷凍以稍後用於饋入含有CD19-CAR之庫3A樣本的CD19+ B細胞。將3×107個PBMC添加至一個G-Rex 100M細胞培養器件(Wilson Wolf，81100S)中以在最終體積60ml之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴展SFM(根據製造商之說明書的補充有26ml OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增補充液(Thermo Fisher，A10484-02)、25ml CTSTM免疫細胞SR(Thermo Fisher，A2596101)及10ml CTSTM GlutaMAXTM-I補充液(Thermo Fisher，A1286001)之OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增基礎介質1L(Thermo Fisher，A10221))中達到最終濃度0.5×106個活細胞/毫升。亦將濃度為100IU/ml之重組人類介白素-2(IL-2)(Novoprotein)以及濃度為50ng/ml之活化抗CD3 Ab(OKT3，Novoprotein)一起添加以活化PBMC用於病毒轉導。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育隔夜。在隔夜培育之後，在5重感染(MOI)下將含有所要測試編碼嵌合多肽之構築體(庫3)之慢病毒顆粒製劑添加至G-Rex器件中。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育隔夜。在隔夜培育之後，添加額外的完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM以使最終體積達到500ml。在此或以下細胞培養步驟中不添加額外的IL-2或其他外源性細胞介素。自PBMC分離後，將G-Rex®器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育7天。在第7天，藉由離心自用庫3轉導之G-Rex器件中收集細胞並將該等細胞再懸浮於新鮮的不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中。將 5×107個庫3細胞置放在含有500ml不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM的新G-Rex 100M器件上且標記為庫3A。將1.1×108個庫3細胞置放在含有500ml不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM的新G-Rex 100M器件上且標記為庫3B。在此等篩檢中，用庫數目之後的A指定未饋入有PBMC之細胞，例如使用用庫3轉導且饋入有PBMC之細胞進行之篩檢在本文稱為庫3A。將一小瓶解凍的第0天冷凍供體匹配之PBMC(2×107個PBMC)添加至含有用庫3A轉導之細胞的G-Rex器件中以提供對CD19 ASTR之CD19+ B細胞活化。庫3B不接受第0天PBMC。在此等篩檢中，用庫數目之後的B指定未饋入有PBMC之細胞。舉例而言，使用用庫3轉導且未饋入有PBMC之細胞進行之篩檢在本文中稱為庫3B。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育。在第14天，藉由離心自兩個G-Rex器件(庫3A、庫3B)中收集細胞並將該等細胞再懸浮於新鮮的不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中。將此等細胞各自置放在含有30ml不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM的6孔G-Rex盤(Wilson-Wolf；80240M)之個別孔中。將一小瓶解凍的第0天冷凍供體匹配之PBMC(5×106個PBMC)添加至含有庫3A G-Rex中以提供對CD19 ASTR之CD19+ B細胞活化。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育。在第21天、第28天、第35天及第42天重複此過程，除了在第21天將兩小瓶冷凍第0天PBMC添加至庫3A，在第28天、第35天及第42天添加一瓶。庫3B在過去21天不培養。重複此等篩檢，除了P1部分上之Myc標籤用eTag替換(如表7、15及16中所展示)並且指定為庫3.1A及3.1B，其中該A及B指示如上文所論述之細胞是否饋入有PBMC。
製備庫3A之細胞以在第49天藉由流式細胞術(400g，5分鐘)分析。藉由離心收集細胞並且根據製造商之說明在Ficoll(Ficoll-Paque Premium(GE,cat# 17-5442-02))上分層。將1.7 x 106個細胞再懸浮於450μl FACs染色緩衝液(554656，BD)中。將再懸浮之細胞等分至9個eppendorf管中，每個管含有50μl或1.8×105個細胞。將2.5μl人類Fc嵌段(564220，BD)添加至各管中並且在室溫下培育10分鐘。將以下抗體配方添加至50μl樣本中以染色CD3、CD4、CD8、CD56、CD19、FLAG Tag(CAR+)：2.5μl抗CD3-BV421抗體(純系OKT3,317344，Biolegend)、2.5μl抗CD8-BV510抗體(純系RPA-T8(301048，Biolegend))、2.5μl抗CD4-PE-Cy7抗體(純系OKT4(317412，Biolegend))、2.5μl抗CD56-BV785(362550，Biolegend)及0.5μl PE抗FLAG Tag(抗DYKDDDDK，Clone L5,637310，Biolegend)用於5種顏色染色樣本。添加2.5μl BB515 CD19抗體(純系HIB19、564456、BD)及0.5ul PE抗FLAG Tag抗體用於2種顏色染色樣本。亦使用上述抗體及體積製備單染色CD3、CD4、CD8、CD56或FLAG Tag之樣本。添加2.5μl BV421 IgG(小鼠IgG2a，400259，Biolegend)、2.5μl PE/CY5 IgG(小鼠IgG2b，400317，Biolegend)、2.5μl BV510 IgG(小鼠IgG1，400171，Biolegend)、2.5μl BV785 IgG(小鼠IgG1，400169，Biolegend)及10μl PE IgG(小鼠IgG1，555749，BD)用於IgG對照染色樣本。不添加抗體以用於未染色對照。將樣本在冰上培育30分鐘。將該等樣本離心(400g，5分鐘)並且移除上清液。用0.5ml FACS染色緩衝液洗滌該等樣本兩次。將經染色之細胞集結粒再懸浮於125μl FACS染色緩衝液中且隨後藉由添加125ul BD固定緩衝液(554655 BD)來固定。在4℃下用固定緩衝液培育該等樣本15分鐘。用500μl FACS染色緩衝液洗滌該等樣本兩次並且用0.4ml FACS染色緩衝液再懸浮。在Novocyte流式細胞測儀(ACEA Biosciences)進行樣本之FAC分析並且基於正向散射及側向散射使用淋巴球門分析。
對於庫4B，將來自健康供體之全部人類血液(70ml)收集至200ml含有CDP抗凝劑(Nanger；S-200)之血袋中。遵循製造商之說明書及套組CS900.2(BioSafe；1008)使用Sepax 2 S-100器件(Biosafe；14000)使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)之密度梯度離心來處理血液，以獲得周邊血單核細胞(PBMC)。活PBMC之產量為4.9×107個細胞。將4.9×107個PBMC添加至一個G-Rex 100M細胞培養器件(Wilson Wolf，81100S)中以在最終體積98ml之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中達到最終濃度0.5×106個活細胞/毫升。亦將濃度為100IU/ml之重組人類介白素-2(IL-2)(Novoprotein)以及濃度為50ng/ml之活化抗CD3 Ab(OKT3，Novoprotein)一起添加以活化PBMC用於病毒轉導。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育隔夜。在隔夜培育之後，在5重感染(MOI)下將含有所要測試編碼嵌合多肽之構築體(庫4)之慢病毒顆粒製劑添加至G-Rex器件中。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育隔夜。在隔夜培育之後，添加額外的完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM以使最終體積達到500ml。在此或以下細胞培養步驟中不添加額外的IL-2。自PBMC分離後，將G-Rex®器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育7天。在第7天，藉由離心自用庫4轉導之G-Rex器件中收集細胞並將該等細胞再懸浮於新鮮的不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中。將1.63×108個庫4細胞置放在含有500ml不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM的 新G-Rex 100M器件上且標記為庫4。庫4不接受第0天PBMC。因此，在此等篩檢中，用庫數目之後的B指定庫，例如使用用庫4轉導且未饋入有PBMC之細胞進行之篩檢在本文稱為庫4B。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育。在第14天，藉由離心自G-Rex器件(庫4)中收集細胞並將該等細胞再懸浮於新鮮的不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中。將此等細胞各自置放在含有30ml不具有IL-2之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM的6孔G-rex盤(Wilson-Wolf；80240M)之個別孔中。將G-Rex器件在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培育。庫4樣本在過去21天培養。重複此等篩檢，除了P1部分上之Myc標籤用eTag替換(如表7及17中所展示)並且指定為庫4.1B，其中該B指示如上文所論述之細胞未饋入有PBMC。
在轉導後之不同天(第7天及第21天)收集樣本(7×104至~4-8×106個細胞)，且根據套組方案使用GenEluteTM哺乳動物基因組DNA微量製劑純化基因組DNA。在一些情況下，使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)之密度梯度離心來純化樣本以在基因組DNA提取之前移除死亡細胞。使用Illumina HiSeq對純化的基因組DNA進行測序，產生配對末端150bp讀數。通常，從每個索引的fastq文檔中提取一千萬個讀數的子集，並使用barcode_reader進行分析處理，該barcode_reader為一個自定義的R腳本，用於基於恆定區域之存在提取條形碼序列。亦將純化的基因組DNA在PacBio定序系統上測序以將條形碼與構築體相關聯。
資料分析
除時間點不同以外，如實例11中所揭示進行資料分 析。
Results
在此實驗中，嵌合多肽候選物經設計具有4個測試域，其包括胞外域(P1)、跨膜域(P2)、第一胞內域(P3)及第二胞內域(P4)(圖15及圖18)。如實例11中所解釋，構築體包括DNA條形碼以幫助使用下一代定序來分析且識別構築體。另外，所有構築體包括在具有胞外域之框中編碼識別及/或消除域之核酸序列。庫3而非庫4中之構築體編碼嵌合多肽候選物上游之CAR，其在結構上與庫1(實例11)中所使用之CAR一致。
用於庫3及庫4之胞外域為包括已知為二聚基元之白胺酸拉鏈基元(NM_002228_3)的c-Jun變體(參見例如Chinenov及Kerppola,Oncogene.2001年4月30日；20(19)：2438-52)。具有0與4個丙胺酸殘基之間的間隔區包括在c-Jun胞外域與跨膜域之間的候選嵌合多肽。不受理論限制，咸信丙胺酸間隔區可藉由改變連接之跨膜域及/或胞內域之方向來影響經由跨膜域與白胺酸胞外區連接之胞內域的信號傳導。
候選跨膜域選自已知的野生型及突變體I型受體之單跨膜域，諸如已經報導在至少一些細胞類型中表現時為組成性活性的細胞介素、激素、共刺激或活化受體。選自庫3及庫4的此類受體突變體中之突變發生在跨膜區中。庫3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B之例示性跨膜域可識別在表13至18中。表13至18之標題如下：BlockSequence為各構築體中使用之來自表7的P1、P2、P3及P4域的密碼；Norm_D7為在第7天之標準化計數；Enrich_DXX為第XX天對比第7天之富集度，其中XX為表中所指示之天數，例如Enrich_D21為第 21天對比第7天之富集度且Enrich_D35為第35天對比第7天之富集度。構築體之資料緊接著該構築體之右行展示。兩個構築體之資料展示於各列中。舉例而言，在表13中識別之第一構築體為E013-T047-S158-S080，其闡述為P1-P2-P3-P4。在彼構築體中，跨膜域(P2)為T047，其為IL7RA Ins PPCL(介白素7受體)之跨膜域，如表7中所提供，以及此結構域之胺基酸序列包括在此構築體中。實例11中包括之相同的第一胞內域(P3)及第二胞內域(P4)包括在此實例中之庫中，但P3部分中之一者為間隔區(參見下文)。
基於Jun白胺酸拉鏈胞外域及將其與82個不同的跨膜域、81個潛在的P3域間隔開的0-4個蘇胺酸間隔區(其中之一者為23個胺基酸間隔區)、及21個潛在的P4域(其中一個為終止密碼子)設計總共5個可能的概念化組合。在病毒載體組裝、慢病毒顆粒產生、PBMC之轉導及培養7天後，並非所有概念化構築體均偵測到。對於庫3A及庫3B，在轉導PBMC及培養7天之後，存在68,951個構築體。對於庫4B，在轉導PBMC及培養7天之後，存在50,652個構築體。可自表7及表13至18中確定關於分析之候選物的詳細資訊。構築體之寫碼系統與實例11所解釋之相同，如前述段落中所闡述。
對於庫3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B，在第7天與表上指示之最後一天之間識別到促進PBMC細胞增殖之構築體。在CLE之特定模塊中之某些多肽在庫3A、3B及4中的最優命中者之間。此等CLE促進增殖至最大程度。舉例而言，在P2位置含有CD40或ICOS；在P3位置含有MPL、MyD88、LEPR或IFNAR2；及/或在P4位置含有CD40、CD79B或CD27之例示性構築體為3個庫3A、3B及4B中之至少2個中的前5個最常見的嵌合多肽(參見表13、14及17)。顯然， MPL為對於所有3個庫而言在P3大間隔處之最常見嵌合多肽。注意來自P3(MP、MyD88、LEPR及IFNAR2)之最優命中者不包括在此等構築體之P4位置中。
在包括編碼嵌合多肽及CAR之構築體以及補充有(庫3A)或不具有(庫3B)新鮮未轉導PBMC之轉導PBMC的庫3A及庫3B中，當在不存在IL-2下培養時分別識別到在第7天與表上指示之最後一天之間促進PBMC增殖的126個及127個最優候選物(參見表13及14)。表13及14之最優候選物清單藉由將基於初始中期資料分析之在第21天的前100個最流行候選物與基於初始中期資料分析在第21天與第7天之間的前100個最富集之候選構築體組合來產生。初始中期資料藉由解碼經編碼庫之部分來產生，以使得對於庫3A已解碼前100個構築體中之66個及前1000個構築體中之538個；且對於庫3B已解碼前100個構築體中之77個，及前1000個構築體中之464個。
對於庫3A，當以組合方式考慮具有來自彼基因之跨膜域之所有構築體的資料時(資料未示出)，來自CD40、CD8B、CRLF2、CSF2RA、FCGR2C、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IL10RB、IL18R1、IL18RAP、IL3RA、LEPR及PRLR之跨膜域(P2)或其突變體已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)、在第7天與第21天之間促進PBMC之增殖。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，當將一個基因之所有構築體之結果組合時，使得對於庫3A，以第21天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為至少2。對於庫3B，來自CD40、ICOS、CSF2RA、IL18R1、IL3RA及TNFRSF14之跨膜域在以此方式分析時為表現最佳 的。對於第35天及第21天之庫3A及3B，存在於促進細胞增殖之構築體中之跨膜域或其部分及/或突變體之實例分別提供於表13及14中。存在於稱為庫3.1A及3.1B之重複篩檢中之促進細胞增殖之構築體中的跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表15及16中。
對於庫3A，當在第7天與第21天之間在本文之候選嵌合多肽元件之第一胞內域位置(P3)處發現促進PBMC增殖時，當以組合方式考慮具有來自彼基因之第一細胞內域之所有構築體的資料時(資料未示出)，來自IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL之第一胞內域(P3)或其突變體已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，當將一個基因之所有構築體之結果組合時，使得對於庫3A，以第21天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為至少2。對於庫3B，已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性的來自IL21R、MPL及IL2RB之第一胞內域或其突變體(若此類突變體存在於該等表中)在以此方式分析時為表現最佳的。對於第35天及第21天之庫3A及3B，存在於促進最大程度之細胞增殖之構築體中的第一胞內域或其部分及/或突變體之實例分別提供於表13及14中。存在於稱為庫3.1A及3.1B之重複篩檢中之促進細胞增殖之構築體中的第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表15及16中。
對於庫3A，當在第7天與第21天之間在本文之候選嵌合多肽元件之第二胞內域位置(P4)處發現促進PBMC增殖時，當以組合方式考慮具有來自彼基因之第二細胞內域之所有構築體的資料時(資料未示出)，來自CD27、CD3G、CD40及CD79B之第二胞內域(P4) 或其突變體已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性(若此類突變體存在於該等表中)。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，當將一個基因之所有構築體之結果組合時，使得對於庫3A，以第21天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為至少2。對於庫3B，已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性的來自CD40之第二胞內域或其突變體(若此類突變體存在於該等表中)在以此方式分析時為表現最佳的。對於第35天及第21天之庫3A及3B，存在於促進最大程度之細胞增殖之構築體中的第二胞內域或其部分及/或突變體之實例分別提供於表13及14中。存在於稱為庫3.1A及3.1B之重複篩檢中之促進最大程度之細胞增殖之構築體中的第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表15及16中。
關於特定基因，在具有CD8B(CD8b分子)作為P2部分之798個構築體中，111個陽性的，其定義為對於第21天之庫3A或3B具有富集度大於二(log2)之構築體。在具有CD40(CD40分子)作為P2部分之1,032個構築體中，159個陽性的。在具有CRLF2(細胞介素受體類似因子2)作為P2部分之1,339個構築體中，175個陽性的。在具有CSF2RA(群落刺激因子2受體α次單元)作為P2部分之593個構築體中，108個陽性的。在具有FCGR2C(IgG受體IIc之Fc片段(基因/假基因))作為P2部分之714個構築體中，88個陽性的。在具有ICOS(可誘導T細胞共刺激劑)作為P2部分之788個構築體中，108個陽性的。在具有IFNAR1(干擾素α及β受體次單元1)作為P2模塊之882個構築體中，106個為陽性的。在具有IFNGR1(干擾素γ受體1)作為P2模塊之806個構築體中，104個為陽性的。在具有IL3RA(介白素3受體次單元α)作為P2 模塊之938個構築體中，132個為陽性的。在具有IL10RB(介白素10受體次單元α)作為P2模塊之746個構築體中，99個為陽性的。在具有IL18R1(介白素18受體1)作為P2模塊之814個構築體中，131個為陽性的。在具有IL18RAP(介白素18受體輔助蛋白)作為P2模塊之552個構築體中，83個為陽性的。在具有LEPR(瘦素受體)作為P2模塊之1,390個構築體中，184個為陽性的。在具有PRLR(催乳素受體)作為P2模塊之795個構築體中，123個為陽性的。
在具有IL1RAP(介白素1受體輔助蛋白)作為P3部分之1,259個構築體中，158個陽性的，其定義為對於第21天之庫3A或3B具有富集度大於二之構築體。在具有IL17RD(介白素17受體D)作為P3部分之200個構築體中，31個陽性的。在具有IL17RE(介白素17受體E)作為P3模塊之11個構築體中，3個為陽性的。在具有IL23R(介白素23受體)作為P3模塊之538個構築體中，86個為陽性的。在具有MPL(MPL原癌基因，血小板生成素受體)作為P3模塊之1,531個構築體中，509個為陽性的。
在具有CD3G(CD3g分子)作為P4部分之3,124個構築體中，458個陽性的，其定義為對於第21天之庫3A或3B具有富集度大於二之構築體。在具有CD27(CD27分子)作為P4部分之3,293個構築體中，443個陽性的。在具有CD40(CD40分子)作為P4模塊之5,163個構築體中，724個為陽性的。在具有CD79B(CD79b分子)作為P4模塊之4,486個構築體中，663個為陽性的。值得注意的係，對於任何構築體而言，由於此係一種競爭性測定法，「陰性」意謂構築體在促進增殖方面不參與競爭，而非構築體不能夠促進增殖。
出於重複篩檢之目的，具有尤其值得注意之富集度的 構築體為在重複之兩個篩檢中具有大於2之log2((最後一天之標準化計數資料+1)/(第7天之標準化計數資料+1))值的彼等構築體，如表21至24中針對庫3及4個重複庫所列出。對於庫3A及3.1A，構築體E008/E013-T041-S186-S050、E006/E011-T077-S186-S211、E007/E012-T021-S186-S051、E009/E014-T041-S186-S053、E007/E012-T073-S186-S053、E006/E011-T017-S186-S051、E006/E011-T031-S186-S211、E006/E011-T011-S186-S050、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T001-S186-S050、E006/E011-T041-S186-S051、E008/E013-T028-S186-S076、E009/E014-T029-S199-S053、E009/E014-T062-S186-S216、E007/E012-T006-S058-S051、E009/E014-T076-S186-S211及E007/E012-T001-S186-S047在兩個篩檢中均具有尤其值得注意的富集度，其中藉由此處之斜杠間隔開之P1部分包括如表7、13及15中所示之庫3A及3.1A的不同標籤。
關於在對庫3A及庫3.1A兩者之篩檢中的具有尤其值得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表22中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個ITAM基元。具有來自MPL、OSMR或CSF2RA之胞內域之構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD40、TNFRSF4、CD79B、CD27、FCGR2A或TNFRSF18之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3A及3.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表22)。具有來自細胞介素受體MPL、OSMR或CSF2RA之結構域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自細胞介素受體CD40、TNFRSF4、CD27或 TNFRSF18之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3A及3.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表22)。具有含有MPL或OSMR之ITAM基元之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3A及3.1A兩者中展示尤其值得注意的富集度(表22)。
對於庫3B及3.1B，構築體E007/E012-T017-S186-S051、E007/E012-T073-S186-S053、E008/E013-T028-S186-S047、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T082-S176-S214、E006/E011-T046-S186-S052、E008/E013-T029-S186-S052、E009/E014-T011-S186-S053、E008/E013-T032-S186-S039、E007/E012-T034-S186-S051、E007/E012-T041-S192-S213、E006/E011-T014-S069-S213、E006/E011-T022-S186-S053、E006/E011-T023-S115-S075、E006/E011-T029-S106-S213、E006/E011-T032-S155-S080、E006/E011-T041-S186-S216、E006/E011-T057-S135-S080、E006/E011-T072-S191-X002、E006/E011-T077-S186-S216、E006/E011-T080-S141-S080、E007/E012-T001-X001-S214、E007/E012-T007-S059-S211、E007/E012-T016-S186-S052、E007/E012-T031-S186-S053、E007/E012-T044-S102-S052、E007/E012-T044-S142-X002、E007/E012-T055-S069-S053、E007/E012-T063-S176-S216、E007/E012-T065-S157-S075、E008/E013-T008-S085-X002、E008/E013-T011-S085-S048、E008/E013-T021-S109-X002、E008/E013-T021-S168-S211、E008/E013-T032-S064-S214、E008/E013-T037-S170-S215、E008/E013-T038-S176-S048、E008/E013-T039-S137-S216、 E008/E013-T041-S141-S053、E008/E013-T045-S177-S048、E008/E013-T048-S109-S074、E008/E013-T073-S199-S075、E009/E014-T001-S157-S074、E009/E014-T005-S196-S049、E009/E014-T011-S130-X002、E009/E014-T013-S155-X002、E009/E014-T017-S186-S076、E009/E014-T021-S142-S080、E009/E014-T023-S082-S076、E009/E014-T038-S196-S037、E009/E014-T055-S186-S052、E009/E014-T060-S175-S053、E009/E014-T070-S085-S212、E008/E013-T026-S054-S213、E009/E014-T007-S120-S053、E007/E012-T045-S186-S211、E008/E013-T073-S186-X002、E008/E013-T074-S186-X002、E007/E012-T055-S186-S053、E008/E013-T036-S186-S053、E007/E012-T017-S058-S053、E008/E013-T030-S189-S080、E006/E011-T029-S081-S047、E009/E014-T044-S194-S050、E006/E011-T028-S121-X002、E008/E013-T028-S186-S053、E009/E014-T078-S142-S213、E009/E014-T041-S186-S051、E008/E013-T006-S186-S050、E006/E011-T028-S186-S075、E006/E011-T040-S120-S038、E007/E012-T044-S115-S211、E009/E014-T039-S176-S075、E007/E012-T028-S186-S050、E008/E013-T031-S202-S050、E007/E012-T072-S192-S053、E006/E011-T065-X001-S051、E007/E012-T030-S062-X002、E007/E012-T073-S186-X002、E009/E014-T056-S186-S053、E008/E013-T046-S137-X002、E006/E011-T016-S136-S076、E007/E012-T032-S142-S037、E007/E012-T065-S120-S215、E009/E014-T077-S186-S047、E009/E014-T001-S126-S051、 E006/E011-T030-S121-S039、E008/E013-T006-S176-S213、E009/E014-T032-S130-S215、E008/E013-T041-S186-S039、E009/E014-T021-S186-S047、E008/E013-T026-S137-S214、E007/E012-T029-S116-S075、E008/E013-T026-S106-S049及E007/E012-T032-S168-S075在兩個篩檢中均具有尤其值得注意的富集度，其中藉由此處之斜杠間隔開之P1部分包括如表7、14及16中所示之庫3B及3.1B的不同標籤。出於重複篩檢之目的，具有尤其值得注意的富集度之構築體為具有log2((在最後一天之標準化計數資料+1)/(在第7天之標準化計數資料+1))值大於2之彼等構築體。
關於在對庫3B及庫3.1B兩者之篩檢中的具有尤其值得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表23中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個ITAM基元。具有來自MPL、LEPR、MYD88、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD40、CD79B、CD27、TNFRSF14、CD79A、CD3G、TNFRSF9、FCGR2C、ICOS、TNFRSF18、TNFRSF4、CD28、FCER1G、FCGR2A、CD3D、TNFRSF8或CD3E之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3B及3.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表23)。具有來自細胞介素受體MPL、LEPR、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、 IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA之域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自細胞介素受體CD40、CD27、TNFRSF14、TNFRSF9、TNFRSF18、TNFRSF4或TNFRSF8之域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3B及3.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表23)。具有含有CD79B、CD79A、CD3G、FCGR2C、FCER1G、FCGR2A、CD3D或CD3E之ITAM基元之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫3B及3.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表23)。
FACs分析顯示第49天庫3A擴增細胞主要為CD3+、CD8+、CD56+及FLAG-Tag+。下文緊接之表格展示對指定標記及標記組合染色呈陽性的淋巴球百分比。此資料展示自此庫篩檢中識別之驅動程式主要為擴增CD3+T細胞組分。
對於在包括編碼嵌合多肽而無CAR之構築體以及未補充有新鮮未轉導PBMC之轉導PBMC的庫4B，當在不存在IL-2下培養時識別到在第7天與表上指示之最後一天之間促進最大程度之PBMC增殖的154個最優候選物(參見表17)。
對於庫4B，當在第7天與表上指示之最後一天之間在本文之候選嵌合多肽元件之跨膜域位置(P2)處發現促進PBMC之細胞增殖時，當以組合方式考慮具有來自彼基因之跨膜域之所有構築體的資料時，來自CD40、CD8B、CSF2RA、IL18R1及IL3RA之跨膜域(P2)或其突變體已知在某些細胞類型中促進組成性信號傳導活性(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，使得當針對一個基因將所有構築體之結果組合時，對於庫4B，以表上指示之最後一天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為至少2。存在於庫4B中促進細胞增殖之構築體中的跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表17中。存在於在稱為庫4.1B之重複篩檢中促進細胞增殖之構築體中的跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表18中。
對於庫4B，當在第7天與表上指示之最後一天之間在本文之候選嵌合多肽元件之第一胞內域位置(P3)處發現促進PBMC之細胞增殖時，當以組合方式考慮具有來自彼基因之第一細胞內域之所有構築體的資料時，來自CRLF2、CSF2RA、IFNGR2、IL4R、MPL 及OSMR之第一胞內域(P3)或其突變體已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，當將一個基因之所有構築體之結果組合時，使得對於庫4B，以表上指示之最後一天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為大於0。存在於庫4B中促進細胞增殖之構築體中的第一胞內域域或其部分及/或突變體之實例提供於表17中。存在於在稱為庫4.1B之重複篩檢中促進細胞增殖之構築體中的第一胞內域域或其部分及/或突變體之實例提供於表18中。
對於庫4，當在第7天與表上指示之最後一天之間在本文之候選嵌合多肽元件之第二胞內域位置(P4)處發現促進PBMC之增殖時，當以組合方式考慮具有來自彼基因之第二細胞內域之所有構築體的資料時，來自CD27、CD40及CD79B之第二胞內域(P4)或其突變體已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，當將一個基因之所有構築體之結果組合時，使得對於庫4B，在最後一天存在的此結構域計數比第7天多。存在於庫4B中促進細胞增殖之構築體中的第二胞內域域或其部分及/或突變體之實例提供於表17中。存在於在稱為庫4.1B之重複篩檢中促進細胞增殖之構築體中的第二胞內域域或其部分及/或突變體之實例提供於表18中。
對於庫4B及4.1B，構築體E007/E012-T078-S154-S047、E008/E013-T062-S186-X002、E008/E013-T055-S186-S050、E009/E014-T057-S186-S050、 E007/E012-T077-S054-S053、E007/E012-T034-S135-S211、E009/E014-T071-X001-S216、E009/E014-T011-S141-S037、E008/E013-T041-S186-S037、E006/E011-T038-S106-S039、E006/E011-T011-S121-X002、E007/E012-T007-S085-S215、E006/E011-T041-S186-S050、E007/E012-T008-S064-S051、E006/E011-T041-S186-S047、E008/E013-T045-S186-S051、E008/E013-T003-S104-S216、E006/E011-T019-S186-S053、E008/E013-T071-S064-S080、E006/E011-T021-S054-X002、E006/E011-T003-S135-X002、E009/E014-T020-S199-S213、E008/E013-T027-S121-S211、E009/E014-T032-S195-X002、E009/E014-T050-S171-X002、E008/E013-T069-S083-X002、E008/E013-T026-S116-S038、E009/E014-T072-S195-X002、E007/E012-T047-S058-S211、E008/E013-T046-S142-S080、E006/E011-T065-S186-S076、E006/E011-T062-S069-X002、E007/E012-T047-S098-X002、E009/E014-T069-S099-S048、E008/E013-T039-S141-S050、E006/E011-T052-S130-S052、E008/E013-T041-S186-X002、E007/E012-T019-S120-X002、E008/E013-T045-S186-S053、E006/E011-T003-S170-S039、E007/E012-T047-S058-S051、E007/E012-T069-S109-X002、E009/E014-T019-S130-S075及E006/E011-T047-S054-S053在兩個篩檢中均具有尤其值得注意的富集度，其中藉由此處之斜杠間隔開之P1部分包括如表7、17及18中所示之庫34B及4.1B的不同標籤。出於重複篩檢之目的，具有尤其值得注意的富集度之構築體為具有log2((在最後一天之標準化計數資料+1)/(在第7天之標準化計數資料+1))值大 於2之彼等構築體。
關於在對庫4B及庫4.1B兩者之篩檢中的具有尤其值得注意的富集度之構築體中之第一及第二胞內域的其他資訊提供於表24中，包括第一及第二胞內域來源之基因，第一及/或第二胞內域是否為細胞介素受體，且第一及/或第二胞內域是否具有至少一個ITAM基元。具有來自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、MYD88、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD27、CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF18、CD3D、CD3G、CD27、ICOS、TNFRSF9、CD3E、FCGR2A、CD28、CD79A或FCGR2C之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫4B及4.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表24)。具有來自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA之胞內域的構築體存在於第一胞內域(P3)時，且具有來自CD27、CD40、TNFRSF4、TNFRSF18或TNFRSF9之胞內域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫4B及4.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表24)。具有含有CD79B、CD3D、CD3G、CD3E、FCGR2A、CD79A或FCGR2C之ITAM基元之結構域的構築體存在於第二胞內域(P4)時，在庫4B及4.1B兩者中展示尤其值得注意的富集度(表24)。
對於庫4B，在具有CD8B(CD8b分子)作為P2部分之572個構築體中，21個為陽性的，其定義為對於庫4B具有富集度大於二之構築體。在具有CD40(CD40分子)作為P2模塊之897個構築體中， 50個為陽性的。在具有CSF2RA(群落刺激因子2受體α次單元)作為P2模塊之551個構築體中，25個為陽性的。在具有IL3RA(介白素3受體次單元α)作為P2模塊之732個構築體中，47個為陽性的。在具有IL18R1(介白素18受體1)作為P2模塊之738個構築體中，44個為陽性的。在具有MPL(MPL原癌基因，血小板生成素受體)作為P3模塊之1,683個構築體中，305個為陽性的。
在第21天對庫3A之初始中期分析中，前100個命中者中之66個及前1000個命中者中之538個已經解碼。進一步解碼提供深度解碼及對庫3A之前100個命中者中之99個及前1000個命中者中之992個的識別且在第35天收集資料並且在第21天更新分析。在第21天對庫3B之初始分析中，前100個命中者中之77個及前1000個命中者中之464個已經在初始中期分析中解碼。進一步解碼提供深度解碼及對庫3B之前100個命中者中之100個及前1000個命中者中之708個的識別。庫3A及3B之最優構築體以及庫3A之第35天資料及庫3B之第21天資料分別展示與表13及14中。
在包括編碼嵌合多肽及CAR之構築體以及補充有(庫3A)或不具有(庫3B)新鮮未轉導PBMC之轉導PBMC的庫3A及庫3B中，當在不存在IL-2(亦即，在初始轉導之後的培養期間，不將IL-2不添加到培養介質中)下培養時識別到在第7天與表上指示之最後一天之間促進最大程度之PBMC增殖的針對第35天的庫3A之124個最優候選者，並且識別到針對第21天的庫3B之131個最優候選者(分別參見表13及14)。表13(第35天之庫3A)及表14(第21天之庫3B)之最優候選清單係藉由在深度解碼之後將在第21天(庫3B)或第21或35天(庫3A)之前100個最流行候選者與第21天與第7天之間(庫3B)或第21天與第7天之 間或第35天與第7天之間(庫3A)的前100個最富集候選構築體組合來產生。
自使用深度解碼結果之最優命中者表中來看，CLE之特定模塊中之某些多肽係在庫3A及庫3B中之至少一者及第21天及第35天(庫3A)或第21天(庫3B)之時間點中之至少一者的最優命中者之中。舉例而言，含有以下之例示性構築體係在前5個最常見嵌合多肽之中(參見表13及14)：在P2位置中，CD40(特定言之例如具有密碼T011之跨膜域)、ICOS(特定言之例如具有密碼T028之跨膜域)、FCGR2C(特定言之例如具有密碼T024之跨膜域)、PRLR(特定言之例如具有密碼T077之跨膜域)、IL3RA(特定言之例如具有密碼T041之跨膜域)、IL6ST(特定言之例如具有密碼T045之跨膜域)；在P2位置中，IL18R1(特定言之例如具有密碼T062之跨膜域)；在P3位置中，MPL(特定言之例如具有密碼S186之胞內域)、IL18R1(特定言之例如具有密碼S154之胞內域)、IL13RA2(特定言之例如具有密碼S142之胞內域)、IL10RB(特定言之例如具有密碼S130之胞內域)、LEPR(特定言之例如具有密碼S176之胞內域)、IFNAR2(特定言之例如具有密碼S083之胞內域)、IL23R(特定言之例如具有密碼S165之胞內域)、MyD88(特定言之例如具有密碼S194之胞內域，及CSF2RA(特定言之例如具有密碼S058之胞內域)；及/或在P4位置中，CD40(特定言之例如具有密碼S050或S051之胞內域)、CD79B(特定言之例如具有密碼S053之胞內域)、TNFRSF4(特定言之例如具有密碼S211之胞內域)、TNFRSF9(特定言之例如具有密碼S213之胞內域)、TNFRSF14(特定言之例如具有密碼S214之胞內域)、FCGRA2(特定言之例如具有密碼S076之胞內域)、CD3G(特定言之例如具有密碼S039之胞內域)或CD27(特定言之例如 具有密碼S047之胞內域)。顯然，MPL為對於兩個庫3A及3B而言在P3大間隔處之最常見嵌合多肽。注意來自P3之最優命中者不包括在庫3A或3B中之此等構築體之P4位置中。
以下額外觀測結果值得注意：P2_CD40、P2_ICOS、P3_MPL、P4_CD40及P4_CD79B在表13及14中之每一者中顯示為最優命中者中之最常見部分。P4_CD27在表13及14中顯示為最常見部分。CSF2RB在前123個最富集中出現4次且在P2處重複最多，但突變V449E並不出現在此等最優命中者中(表13)。因此，在本文之一些實施例中，嵌合多肽包含在表13及14中所示之任何構築體中識別的跨膜域，除CSF2RB之跨膜域突變V449E以外。八個MyD88變體在庫3A前123個中的P3位置處出現至少一次(表13)。在庫中測試之CD40之兩個變體在庫3A之前123個清單中的P4位置處出現至少一次(表13)。在P3處之MPL與在P4處之CD40之組合展示在庫3A之前123個構築體清單中之26個構築體中(表13)。
為對基因進行基因分析，對於庫3A，已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性的來自CD4、CD8B、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6ST、IL7RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL22RA1、IL31RA、LEPR、PRLR及TNFRSF8之跨膜域(P2)或其突變體(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)在第7天與表示所指示之最後一天之間促進PBMC之增殖，此時以組合方式考慮具有來自彼基因之跨膜域之所有構築體的資料時(表13)。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的 序列計數的富集，使得當針對一個基因將所有構築體之結果組合時，對於庫3A，以表上指示之最後一天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為至少2。對於庫3B(表14)，已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性的來自CD40、ICOS及IL18R1之跨膜域或其突變體(若此類突變體存在於該等表中)在以此方式分析時為表現最佳的。對於庫3A及3B，存在於促進最大程度之細胞增殖之構築體中的跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表13及14中。存在於稱為庫3.1A及3.1B之重複篩檢中之促進細胞增殖之構築體中的跨膜域或其部分及/或突變體之實例提供於表15及16中。
對於庫3A，已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性的來自CSF2RA、IFNAR1、IL1RAP、IL4R、IL6ST、IL11RA、IL12RB2、IL17RA、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL21R、IL23R、MPL及MyD88之第一胞內域(P3)或其突變體(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)在發現處於本文之候選嵌合多肽元件之第一胞內域位置(P3)時在第7天與表上指示之最後一天之間促進PBMC之細胞增殖，此時以組合方式考慮具有來自彼基因之第一細胞內域之所有構築體的資料。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，使得當針對一個基因將所有構築體之結果組合時，對於庫3A，以表上指示之最後一天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為至少2。對於庫3B，已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性的來自CSF2RB、IL4R及MPL之第一胞內域或其突變體(若此類突變體存在於該等表中)在以此方式分析時為表現最佳的。對於庫3A及3B，存在於促進最大程度 之細胞增殖之構築體中的第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表13及14中。存在於稱為庫3.1A及3.1B之重複篩檢中之促進細胞增殖之構築體中的第一胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表15及16中。
對於庫3A，已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性的來自CD3D、CD3G、CD27、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4及TNFRSF8之第二胞內域(P4)或其突變體(若此類突變體存在於該等表中所提供之構築體中)在發現處於本文之候選嵌合多肽元件之第二胞內域位置(P4)時在第7天與第21或第7天與表上指示之最後一天之間促進PBMC之增殖，此時以組合方式考慮具有來自彼基因之第二細胞內域之所有構築體的資料。此結論基於混合培養之PBMC細胞群體中之構築體的序列計數的富集，使得當針對一個基因將所有構築體之結果組合時，對於庫3A，以表上指示之最後一天之標準化計數加一與第7天之標準化計數加一之間的比率的以2為底之對數計算的富集度為至少2。對於庫3B，已知在某些細胞類型中促進信號傳導活性的來自CD40之第二胞內域或其突變體(若此類突變體存在於該等表中)儘管未獲得2倍log2富集度，但在以此方式分析時為表現最佳的。對於庫3A及3B，存在於促進最大程度之細胞增殖之構築體中的第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表13及14中。存在於稱為庫3.1A及3.1B之重複篩檢中之促進細胞增殖之構築體中的第二胞內域或其部分及/或突變體之實例提供於表15及16中。
實例13.個別淋巴增殖性元件之特徵化
在此實例中，在實例11及實例12中描述之庫篩檢中識 別的選擇嵌合淋巴增殖性元件(CLE)經單獨地評估。為進一步分析在庫2B篩檢中識別之CLE，活化之PBMC用編碼單獨的CLE之慢病毒顆粒隔夜轉導並且在不存在外源性細胞介素下培養。為進一步分析在庫3A篩檢中識別之CLE，活化之PBMC用編碼在5’末端側接有抗CD19CAR之CLE的慢病毒顆粒隔夜轉導，並且在存在每7天將供體匹配之CD19+ B細胞添加至培養物中，但不存在外源性細胞介素的情況下培養。將細胞培養至多35天以評估CLE促進PBMC增殖之能力。此實例進一步提供表徵任何個別推定的淋巴增殖性元件的方法並且進一步證實若干高度活躍CLE之身分。
重組反轉錄病毒顆粒係在293T細胞(Lenti-XTM 293T，Clontech)中產生，其適應在FreestyleTM 293表現介質(ThermoFisher Scientific)無血清化學成分界定之介質中懸浮培養。如實例4中所解釋，使用具有基因組質體及3種編碼gag/pol、rev之慢病毒封裝質體及編碼之假型化質體的PEI轉染該等細胞。在實例11及實例12中描述之庫篩檢中識別的所選擇CLE係自其部分(P1-2、P3及P4或P1、P2、P3及P4)各別再生的並且經插入至與其首先經識別之庫相同的轉基因表現卡匣中。所選擇CLE中之每一者的模塊部分展示於圖19及20中並且基因名稱及胺基酸序列展示於表7中。圖17及15分別展示庫2及庫3之卡匣。用含有經由庫篩檢識別之構築體的慢病毒顆粒轉導之細胞被稱為「DL」緊接著庫編號。舉例而言，用含有來自庫2之構築體之慢病毒顆粒轉導的細胞稱為DL2。因此，具有前綴「DL2」及「DL3」之CLE係分別在圖17及圖15中所示之卡匣中構建的。類似地，「DC1-5」及「DC1-6」包含插入至如圖16中所示之庫1所使用的轉基因表現卡匣中的CLE。DC1-5之嵌合淋巴增殖性元件自胺基端至 羧基端編碼：人類IL-7(SEQ ID NO：511)、可撓性連接子(SEQ ID NO：53)及為不具有其信號肽之全長IL-7Rα的人類IL-7Rα(SEQ ID NO：229)之殘基21-458。DC1-6之CLE自胺基端至羧基端編碼：IL-7(SEQ ID NO：511)、可撓性連接子(SEQ ID NO：53)、IL-7Rα(CD127)(SEQ ID NO：513)之胞外及跨膜部分，及IL-2Rβ(CD122)(SEQ ID NO：514)之胞內域。先前已描述嵌合蛋白IL-7-IL-7Rα及IL-7-IL-7Rα-IL-2Rβ(Hunter等人.Molecular Immunology 56(2013)：1-11)。IL-7「DC2-5」及「DC2-6」包含插入至如圖17中所示之庫2所使用的轉基因表現卡匣中的CLE。DC2-5及DC2-6中之CLE分別為與DC1-5及DC1-6相同的CLE。包括未經轉導之PBMC(NT)、用編碼eTag而非CLE(F1-0-01)之載體轉導之PBMC及用編碼抗CD19 CAR及eTag而非CLE(F1-3-23)之載體轉導之PBMC作為陰性對照。
此實例中使用之來自庫2B之構築體為DL2-1(M024-S190-S047)、DL2-2(M025-S050-S197)、DL2-3(M036-S170-S047)、DL2-4(M012-S045-S048)、DL2-5(M049-S194-S064)、DL2-6(M025-S190-S050)及DL2-7(M025-S190-S051)。
此實例中使用之來自庫3A之構築體為DL3A-1(E013-T047-S158-S080)、DL3A-2(E011-T024-S194-S039)、DL3A-3(E014-T040-S135-S076)、DL3A-4(E013-T041-S186-S051)、DL3A-5(E013-T064-S058-S212)、DL3A-6(E013-T028-S186-S051)、DL3A-7(E014-T015-S186-S051)、DL3A-8(E011-T016-S186-S050)、DL3A-9(E011-T073-S186-S050)及DL3A-10(E013-T011-S186-S211)。
在第0天，根據製造商之說明書，藉由用Ficoll-Paque PLUS®(GE Healthcare Life Sciences)密度梯度離心接著裂解紅細胞來自血塊黃層(San Diego Blood Bank)富集PBMC。將1.5×106個PBMC在補充有100IU/ml(IL-2)及50ng/ml抗CD3抗體(317326，Biolegend)之3ml完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中接種在G-Rex 6孔盤(Wilson Wolf，80240M)之各孔中以活化PBMC用於病毒轉導。在37℃及5% CO2下轉導隔夜之後，在MOI為5下將上文所描述之編碼構築體之慢病毒顆粒直接添加至經活化PBMC中並且在37℃及5% CO2下培育隔夜。第二天，用完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM使各孔中之介質體積達到30ml並且將盤放回培養箱中。在此或以下細胞培養步驟中不添加IL-2、IL-7或其他外源性細胞介素。在第7天收集各孔之細胞以測定細胞數目、存活百分比及經轉導細胞百分比，其藉由FACS分析定義為FLAG-Tag+或E-Tag+細胞之百分比。隨後將該等細胞離心，再懸浮於新鮮的完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中，並且將各樣本之0.5×106個細胞在30ml完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中再接種至G-Rex 6孔盤之孔中。先前將含有0.5×106個CD19+ B細胞之冷藏第0天供體匹配之PBMC(如在第0天由FACS測定)添加至「DL3A-」培養物中以提供對CD19 ASTR之CD19+ B細胞活化。在第35天採集細胞之前，在第14天、第20天及第28天重複此過程。
結果
將用編碼CLE之慢病毒顆粒轉導之PBMC在不存在外源性細胞介素下培養35天。增殖表示為倍數擴增，其藉由細胞總數除以該時間點接種之細胞數來計算。用圖19中所示之各單獨選擇的CLE轉導之PBMC比陰性對照增殖更多，該陰性對照包括未經轉導PBMC 及用編碼eTag而非CLE之載體轉導的PBMC(圖19)。此外，以下CLE在第14天、第21天、第28天及第35天呈現大於23之倍數擴增，而對於此等時間點，陰性對照之倍數擴增幾乎為0：DL2-7、DC2-6、DL2-6、DL2-2、DL2-1及DC2-5。用編碼抗CD19 CAR及不同CLE(圖20中所示)之構築體轉導並且在存在每7天添加新鮮的供體匹配之PBMC，但不存在外源性細胞介素之情況下培養的PBMC比陰性對照增殖更多，該陰性對照包括未經轉導PBMC及用編碼抗CD19 CAR及eTag而非CLE之載體轉導的PBMC。圖20中所示之所有CLE在第35天呈現大於23的倍數擴增，而陰性對照之倍數擴增在第35天幾乎為0。用含有編碼DL3A-1(E013-T047-S158-S080)、DL3A-2(E011-T024-S194-S039)、DL3A-3(E014-T040-S135-S076)及DL3A-5(E013-T064-S058-S212)之聚核苷酸的慢病毒顆粒轉導的PBMC之增殖與陰性對照相當並且未展示於圖20中。未分析此等CLE在用其基因組編碼此等CLE的反轉錄病毒顆粒轉導之細胞中的表現，以確認其確實被表現。
實例14.促進PBMC之存活及/或擴展的CLE之表現。
在此實例中，當在不存在外源性添加之細胞介素的情況下活體外培養21天時，針對其促進PBMC之轉導及後續存活及/或增殖的能力，單獨地評定暴露於未經刺激之人類PBMC持續4小時之14個獨特重組慢病毒顆粒。此實例中之反轉錄病毒顆粒用VSV-G假型化，在其表面上表現抗CD3scFvFc-GPI，且含有編碼抗CD19 CAR及14個獨特CLE中之1個的轉基因表現卡匣。將匹配PBMC之供體添加至培養物，以提供CD19 CAR之CD19+ B細胞活化。在此實例中之任何點處均不向樣本添加外源性細胞介素。
方法
在FreestyleTM 293表現介質(Thermo Fisher Scientific)無血清化學定義介質中適應懸浮培養之293T細胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)中產生重組慢病毒顆粒。使用具有基因組質體及編碼gag/pol、rev之單獨的封裝質體、編碼VSV-G之假型化質體及編碼如實例4中所描述之UCHT1scFvFc-GPI之質體的PEI瞬時轉染細胞。基因組質體包括Kozak序列、CD8a信號肽、FLAG標記及抗CD19：CD8：CD3z CAR、T2A及CLE，且隨後三重終止序列，如圖15中所展示。抗CD19 CAR缺失共刺激域。13個不同CLE經識別為在庫3.1.1A中在第35天較高富集或較高遍及，且經識別來自庫3A之1個CLE由其以下部分(P1、P2、P3及P4)單獨地再產生：DL3.1A-1(E006-T074-S194-S211)、DL3.1A-2(E010-T073-S186-S211)、DL3.1A-3(E009-T049-S106-S037)、DL3.1A-4(E009-T073-S190-S215)、DL3.1A-5(E009-T009-S165-S052)、DL3.1A-6(E009-T066-S168-S053)、DL3.1A-7(E010-T024-S197-S214)、DL3.1A-8(E009-T072-S186-S039)、DL3.1A-9(E009-T038-S105-S050)、DL3.1A-10(E006-T057-S105-S039)、DL3.1A-11(E006-T077-S069-S050)、DL3.1A-12(E009-T071-S186-S211)、DL3.1A-13(E009-T032-S105-S048)及DL3A-4(E013-T041-S186-S051)。包括Kozak序列、CD8a信號肽、FLAG 標記、抗CD19：CD8：CD3z CAR、T2A及三重終止序列但缺失CLE(F1-3-253)的另一基因組質體包括為對照。編碼其中CLE為DL3A-4但不於其表面上表現UCHT1scFvFc-GPI之基因組載體的慢病毒顆粒亦在此實驗中用作對照。
在第0天，根據製造商之說明書，藉由用Eicoll-Paque PREMIUM®(GE Healthcare Life Sciences)密度梯度離心接著裂解紅細胞來自白細胞減少系統(LRS-WBC)(San Diego Blood Bank)富集PBMC。。不採取額外步驟以移除單核細胞。將來自各供體之部分細胞以每瓶2×107個PBMC冷凍，以供稍後用於饋入CD19-CAR表現細胞。來自各供體之細胞亦留下以用於藉由FAC之表現型分析。剩餘PBMC在完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴展SFM中經稀釋至1.0×106個存活細胞/毫升，且將5ml添加至每各樣本之50ml圓錐形試管。轉導前不添加抗CD3、抗CD28、IL-2、IL-7或其他外源性細胞介素以活化或以其他方式刺激淋巴球。在1之MOI下將慢病毒顆粒直接添加至圓錐形試管中之未經刺激之PBMC且在37℃及5% CO2下培育4小時。隨後在再懸浮於30ml完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴展SFM中之前在DPBS+2% HSA中將細胞洗滌3次且轉移至G-Rex® 6孔透氣細胞培養器件(Wilson Wolf)之孔。在第7天收集來自各孔之細胞以測定細胞數目、存活力百分比及經轉導細胞百分比，該經轉導細胞百分比經定義為藉由使用淋巴球門的FACS分析的FLAG-Tag+細胞之百分比。將來自各轉導之一半細胞接種至G-Rex® 6孔盤之孔中。以1個經轉導細胞與1個第0天經供體匹配之CD19+ B細胞的比例將預先冷藏之第0天經供體匹配的PBMC添加至各樣本(在第0天藉由FAC來測定CD19+ B細胞於PBMC中之百分比)。隨後將完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴展SFM添加至各孔以使體積達30ml，且在37℃及5% CO2下培育經轉導細胞。在第14天，用新鮮介質代替15ml之廢介質，且以相同1：1比例添加額外第0天PBMC。在第14天及第21天再次測定細胞，以測定細胞數目、存活力百分比及由FACS之表面標記物的表現。
結果
此實例中之慢病毒顆粒用VSV-G假型化，在其表面上表現抗CD3scFvFc-GPI，且含有編碼抗CD19 CAR及14個獨特CLE中之1個的轉基因表現卡匣。在洗滌細胞3×之前，將慢病毒暴露於未經刺激且推測上休眠之PBMC持續4小時，並在不存在任何外源性添加之細胞介素的情況下培養。在第7天對PBMC之分析確認，包括CLE且表現抗CD3scFvFc-GPI之慢病毒顆粒中之每一者在轉導PBMC方面有效。此外，在第7天、第14天及第21天對CART細胞之總數目的分析展示，相較於編碼抗CD19 CAR但不編碼CLE(F1-3-253)之對照構築體，用編碼抗CD19 CAR及CLE之構築體轉導的PBMC能夠較佳地促進CAR+細胞之活體外存活及/或擴展。下表(表5)展示用第7天、第14天和第21天的F1-3-253轉導的CAR+細胞總數標準化的所指示構築體轉導的CAR+細胞總數。下表亦展示針對第7天與第14天之間及第7天與第21天之間的各構築體轉導的CAR+細胞數目之增加百分比。
表5.細胞計數分析。
如由展示於表5中之資料所支援，相較於未經轉導之對照細胞或用不具有CLE之慢病毒顆粒轉導的對照細胞，用抗CD19 CAR及所測試CLE轉導PBMC在第7天、第14天及第21天之經提供經改良擴展及/或存活。
針對其促進經轉導PBMC之存活及增殖之能力的在此實例中尤其值得注意之CLE為DL3.1A-2(E010-T073-S186-S211)、DL3.1A-7(E010-T024-S197-S214)、DL3.1A-8(E009-T072-S186-S039)、DL3.1A-12(E009-T071-S186-S211)及DL3A-4(E013-T041-S186-S051)。
實例15.周邊血單核細胞(PBMC)分離、轉導及擴展。
以下實例說明在活體內擴展之前用於離體處理PBMC之封閉系統的用途。作為一實例，用酸性檸檬酸鹽葡萄糖溶液(ACD)作為抗凝劑自個體抽取30ml至200ml之人類血液至血液收集袋中。替代地，將血液抽取至採血管、注射器或等效物中且轉移至空血液收集袋或IV袋中。根據製造商之說明書，在Sepax 2細胞處理系統(BioSafe) 上使用純細胞套組(目錄號# CS-900.2，Omniamed)處理全部血液。將周邊血單核細胞(PBMC)收集至培養袋中，或替代地注射器中。無菌地等份採集以用於細胞計數以測定存活細胞之數目。在具有呈至多200ml最終體積之10IU/ml至300IU/ml IL-2(目錄號# 202-IL-010，R&D Systems)的X-VIVO 15(目錄號# 08-879H，Lonza)或CTS OpTmizer細胞擴展SFM(目錄號# A1048501，Thermo Fisher Scientific)介質中將呈0.1×106至1.0×106個存活細胞/毫升之最終濃度的PBMC轉移至G-Rex100MCS透氣細胞培養系統器件(Wilson Wolf)。除IL-2以外，可將CTS免疫細胞SR(目錄號# A2596101，Thermo Fisher Scientific)添加至介質。根據製造商之說明書，封閉G-Rex透氣細胞培養系統器件可預塗佈有纖維連接蛋白(Retronectin)(目錄號# CH-296，Takara)或類似衍生自纖連蛋白之等效物。
將自周邊血液分離之PBMC裝載至PALL PBMC過濾器上，經由過濾器用10ml AIM V(Thermo Fisher Scientific)或X-VIVO 15介質洗滌一次，接著在37℃下以5毫升/小時用10ml至60ml慢病毒原液(如實例2中所製備)灌注。接著再次用含有重組人類DNase(Pulmozyme，Genentech)之AIM V、CTS OpTmizerT細胞擴展SFM或X-VIVO 15介質洗滌PBMC，接著用無DNase之林格氏乳酸鹽(Lactated Ringers)(目錄號# L7500，Braun)洗滌。接著經由過濾器將PBMC反灌注至注射器中。接著經由靜脈內輸注將細胞(細胞之靶標水準為5×105至1×106個細胞/公斤)再輸注至個體中。
視反轉錄病毒基因組內含有之核糖開關而定，將各別核苷類似物抗病毒藥物或核苷類似物抗病毒前藥(阿昔洛韋、伐昔洛韋、噴昔洛韋及泛昔洛韋)給予個體。可經口每天三次將任何治療有 效劑量(諸如500mg核苷類似物抗病毒藥物或前藥)給予個體。用核苷類似物抗病毒藥物或前藥治療較佳地在再輸注之前(諸如2小時前)開始，且亦可在再輸注之時或再輸注一些時間後開始。治療可繼續至少1、2、3、4、5、7、10、14、21、28、30、60、90、120天或5、6、9、12、24、36或48個月或更長。治療可包括每天一次、兩次、三次或四次投予核苷類似物抗病毒藥物或前藥。在再輸注及治療開始後，經由使用qPCR以定量病毒基因組之量在再輸注後第2天、第5天、第7天、第11天、第13天、第18天、第28天及第56天血液計數來測定經感染細胞之數目。經歷發熱或細胞介素釋放綜合症之個體可使核苷類似物抗病毒藥物或前藥之劑量或頻率減少或停止。若經感染T細胞未能在第18天擴增10,000至100,000倍，則可增加核苷類似物抗病毒藥物或前藥之劑量或頻率。可經由FDG PET成像及連續CT掃描來量測個體之臨床反應。可在經延長緩解期後或在過量T細胞傳播超出總周邊T細胞計量之30%之情形下減少或停止核苷類似物抗病毒藥物或前藥的口服劑量。
實例16.對本文提供之各種說明性方法(包括經基因方式修飾之淋巴球之活體內擴增)的概念性證明。
此實例提供用於離體轉導PBMC(包括T細胞)並且活體內擴增此等經轉導PBMC(包括T細胞)之例示性方法。此類方法包括用表現某些說明性嵌合淋巴增殖性元件之說明性重組慢病毒顆粒進行之說明性4小時轉導方法。此外，此類方法提供用於用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導PBMC(其在說明性實施例中通常為T細胞)4小時之額外例示性方法，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒係藉由在無血清化學成分界定之介質中之懸浮液中用編碼非複製 勝任型重組反轉錄病毒顆粒之各種組分之載體轉染封裝細胞來產生的。
材料及方法
重組反轉錄病毒顆粒係在293T細胞(Lenti-XTM 293T，Clontech)中產生，其適應在FreestyleTM 293表現介質(ThermoFisher Scientific)無血清化學成分界定之介質中懸浮培養。如實例4中所解釋使用具有3種基因組質體(詳述於下文)及3種編碼gag/pol、rev之單獨的封裝質體及編碼VSV-G之假型化質體中之1種的PEI瞬時轉染細胞。為產生亦顯示膜結合活化元件之慢病毒顆粒，如實例4中所描述共轉染編碼能夠與CD3(UCHT1scFvFc-GPI)結合之膜結合多肽之第四封裝質體。基因組質體為在3’LTR中含有導致自身失活之缺失的第三代慢病毒表現載體，其中該質體編碼以下：(1)抗ROR2 MRB-CAR：T2A：eTag(F1-1-27)：該基因組質體與圖5中所示之彼基因組質體一致，不同之處在於編碼抗CD19 CAR之序列經具有識別人類ROR2、CD8莖及跨膜序列(SEQ ID NO：75)、CD137(SEQ ID NO：1)及CD3z(SEQ ID NO：13)之scFv的MRB-ASTR替代。編碼此構築體之重組慢病毒顆粒稱為F1-1-27(2)Flag-抗ROR2 MRB-CAR：T2A：CLE(F1-1-228及F1-1-228U)：該基因組質體與圖5中所示之彼基因組質體一致，不同之處在於編碼抗CD19之序列經與上述(1)中所描述之抗ROR2 MRB-CAR共價連接之Flag標籤替代，並且GMCSFR ss：eTag經CLE替代。該CLE為包含胞外二聚模塊(P1)、跨膜模塊(P2)及2個胞內模塊(P3及P4)之I型跨膜蛋白質。在位置P1-P2-P3-P4中之基因為MycTag 2A Jun-IL13RA-MPL-CD40。此等模塊之密碼為 E013-T041-S186-S051(參見表7)。該CLE首先在庫3A、3B及4B中識別並且在庫3A中之第7天與第35天之間為第6個最富集之CLE。編碼此構築體之重組反轉錄病毒顆粒稱為F1-1-228並且編碼此構築體並且顯示UCHT1scFvFc-GPI之重組反轉錄病毒顆粒稱為F1-1-228U；或(3)Flag-抗CD19 CAR：T2A：CLE(F1-3-219及F1-3-219U)：該基因組質體與圖5中所示之抗人類CD19 CAR一致，不同之處在於Flag標籤插入在CD8ss與CAR之間，並且編碼GMCSFRss：eTag之序列經CLE替代。該CLE為I型跨膜蛋白質，其包含經由可撓性連接子共價連接至其同源介白素受體之胞外及跨膜模塊域並且共價連接至不同細胞介素受體之胞內域的介白素多肽。特定言之，自胺基端至羧基端，該質體編碼：IL-7(SEQ ID NO：511)、可撓性連接子(SEQ ID NO：53)、IL-7Rα(CD127)(SEQ ID NO：513)之胞外及跨膜部分，及IL-2Rβ(CD122)(SEQ ID NO：514)之胞內域。編碼此構築體之重組反轉錄病毒顆粒稱為F1-3-219並且編碼此構築體並且顯示UCHT1scFvFc-GPI之重組反轉錄病毒顆粒稱為F1-3-219U。
PBMC分離，在離體刺激之後對PBMC之隔夜轉導，接著對經工程化淋巴球之15天離體擴增
在第0天，根據製造商的說明使用CS-900.2套組(BioSafe；1008)在Sepax 2 S-100器件(Biosafe；14000)上藉由密度梯度離心使用Ficoll-PacqueTM(General Electric)自知情同意的健康志願者之ACD周邊血中分離PBMC。將3.0×107個活PBMC接種在1L G-Rex(Wilson-Wolf)上並且使用補充有100IU/ml IL-2(Novoprotein，GMP-CD66)、10ng/ml IL-7(Novoprotein，GMP-CD47)及50ng/ml抗 CD3抗體(OKT3，Novoprotein)之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM使體積達到60ml以活化該等PBMC(其包括T細胞及NK細胞)用於病毒轉導。在37℃及5% CO2下培育隔夜之後，在MOI為5(440ul)下將編碼抗ROR2 MRB-CAR、F1-1-27之慢病毒顆粒直接添加至經活化PBMC中並且在37℃及5% CO2下培育隔夜。在隔夜培育之後，藉由使用補充有NAC(Sigma)之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM使G-Rex中之介質總體積達到100ml來饋入細胞以使最終濃度增加10mM以及100IU/ml重組人類IL-2及10ng/ml重組人類IL-7。在每48小時添加100IU/ml重組人類IL-2及10ng/ml重組人類IL-7溶液下在37℃及5% CO2下將G-Rex器件在標準濕潤組織培養箱中培育。在採集之前，細胞在第15天時擴增。將此等經轉導細胞在冷凍介質(70% RPMI 1640、20%熱失活FBS、10% DMSO)中洗滌並且以5.0×107個細胞/毫升的1ml等分試樣冷藏保存以稍後使用。在用於下文實例中之實驗A組之前兩天，將8小瓶(4.0×108)此等冷藏保存之經F1-1-27轉導之PBMC解凍並且在含有377ml補充有100IU/ml之IL-2(Novoprotein)、10ng/ml IL-7(Novoprotein)及充足的NAC之完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(根據製造商之說明書補充有26ml OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增補充液(Thermo Fisher，A10484-02)、25ml CTSTM免疫細胞SR(Thermo Fisher，A2596101)及10ml CTSTM GlutaMAXTM-I補充液(Thermo Fisher，A1286001)之OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增基礎介質1L(Thermo Fisher，A10221))的G-Rex100M中靜置2天以使最終濃度增加10mM。
在無需事先離體刺激並且無需離體細胞擴增下之PBMC分離及休眠淋巴球之有利快速轉導
將知情同意之2個健康志願者之全部人類血液收集至含有1.5ml檸檬酸葡萄糖溶液A抗凝劑之多個100mm Vacutainer管(Becton Dickenson；364606)中(ACD周邊血)。對於各志願者，將來自Vacutainer管之血液彙集(185.2ml用於B組，182.5ml用於C組)並且分配至2個標準500ml血液收集袋中經由轉導進行PBMC富集之以下步驟在封閉系統中執行。
在Sepax 2 S-100器件(Biosafe；14000)上使用CS-900.2套組(BioSafe；1008)使用用Ficoll-PaqueTM(General Electric)之密度梯度離心對來自各志願者之2個血袋中的血液依次處理，根據製造商之說明書使用2次洗滌循環，以每次運行獲得45ml經分離PBMC。用於Sepax 2處理中之洗滌溶液為標準生理鹽水(Chenixin Pharm)+2%人類血清白蛋白(HSA)(Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical)。最終的細胞再懸浮溶液為45ml完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(補充有26ml OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增補充液(Thermo Fisher，A10484-02)、25ml CTSTM免疫細胞SR(Thermo Fisher，A2596101)及10ml CTSTM GlutaMAXTM-I補充液(Thermo Fisher，A1286001)之OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增基礎介質1L(Thermo Fisher，A10221-03))。Sepax 2機器上之每一處理步驟大約為1小時及12分鐘。自2個處理輪次獲得之經富集PBMC分別彙集用於B組及C組，並且對該等細胞計數。
將5.5×107個新鮮富集之活PBMC接種至用於B組之4個標準血液收集袋中的每一個中，並且使用完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM使體積達到55ml以使得細胞密度為1.0×106/ml。將1.12×108個新鮮富集之活PBMC接種至用於C組之2個標準血液收集 袋中的每一個中，並且使用完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM使體積達到110ml以使得細胞密度為1.0×106/ml。不添加抗CD3、抗CD28、IL-2、IL-7或其他外源性細胞介素以在轉導之前離體活化或以其他方式刺激淋巴球。如下在MOI為1下將慢病毒顆粒直接添加至血液收集袋中之未刺激PBMC中：將0.779ml之F1-1-228添加至一袋B組PBMC中並且將3.11ml之F1-1-228U添加至另一袋B組PBMC中；將0.362ml之F1-3-219添加至一袋C組PBMC中並且將3.52ml之F1-3-219U添加至另一袋C組PBMC中。溫和地按摩轉導反應混合物以混合內容物，隨後在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中在血液收集袋中培育四(4)小時。隨後將來自各袋之PBMC轉譯至50ml Conical管中(從而在此概念驗證試驗中自封閉系統移除細胞)並在再懸浮於5ml DPBS+2% HAS中之前在DPBS+2% HAS中洗滌3次並計數。下表展示該過程中之每一步驟之持續時間及經歷的總時間。在此等PBMC用於此實例中之試驗中之前不對其進行其他處理。
藉由上述方法轉導PBMC的體外轉導效率及細胞介素非依賴性存活/增殖
將誘導T細胞及NK細胞且如緊接下文所揭示與反轉錄病毒接觸4小時之2.0 x 106個PBMC一式兩份或一式三份接種至各 樣本之6孔組織培養盤之各孔中。將該等盤離心並且將各樣本再懸浮於2ml完全OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM中。不添加細胞介素。在37℃及5% CO2下在標準濕潤組織培養箱中培養該等盤6天。在第3天將各孔之細胞懸浮液的一半(1ml)移除並且在第6天移除剩餘細胞以測定細胞數目、存活百分比及轉導細胞百分比，其藉由FACS分析定義為FLAG-Tag+細胞之百分比。將第6天之總細胞計數加倍以解釋在第3天移除細胞之一半。
藉由上述方法轉導致效應PBMC的體內增殖/存活及靶向殺死腫瘤
選擇使用NSG或NOD Scid Gamma小鼠之異種移植模型來探測用F1-1-27、F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-219U轉導之人類PBMC在體內存活、增殖及殺死同源抗原表現腫瘤的能力。NSG為缺乏成熟T細胞、NK細胞及B細胞之小鼠品種且為迄今為止描述之最免疫缺乏的小鼠品系之一。通常對免疫系統之此等細胞組分進行移除以致使人類PBMC能夠在宿主物先天性、體液性或適應性免疫反應之情況下移植。由於不存在小鼠細胞外共同γ鏈，所以通常僅在人類中進行輻射或淋巴耗盡化學療法之後才能實現穩定細胞介素之濃度，此使得經接受性轉移之人類細胞能夠接受此類細胞介素。同時，此等動物亦可用於移植腫瘤異種移植靶標以檢測CAR殺死靶向表現腫瘤之功效。儘管異種反應性T細胞受體抗原在效應細胞產物中之存在最終會引起移植物抗宿主病，但此等模型能夠對動物藥理學及急性耐受性進行短期評估。
表現內源性人類CD19之Raji細胞(ATCC,Manassas,VA)及經轉染以穩定表現人類ROR2(CHO-ROR2)之CHO細胞(ATCC, Manassas,VA)用於提供抗原來刺激CAR效應細胞並且產生一致的目標腫瘤以測定CAR效應細胞殺死同源抗原表現腫瘤之功效。Raji細胞及轉基因CHO變體在與Matrigel人造基底組合皮下投予至NSG小鼠中之後快速生長並伴有散播性惡性腫瘤。
根據中國科學院生化與細胞所實驗動物管理委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准之方案處理小鼠。皮下(sc)腫瘤異種移植物在雌性NOD-PrkdcscidIl2rgtm1/Begen(B-NSG)小鼠(Beijing Biocytogen Co.Ltd.)之後腹側建立。簡言之，培養之Raji細胞及培養之CHO-ROR2細胞單獨地在DPBS(Thermo Fisher)中洗滌，計數，再懸浮於冷DPBS中並且與濃度為0.5×106個細胞/200微升的適當體積之Matrigel ECM(Corning；最終濃度5mg/mL)在冰上混合。在注射之前使用標準批准之麻醉及脫毛(Nair)來製備動物以供注射。分別將Raji及CHO-ROR2細胞之200μl的含細胞懸浮液之ECM皮下注射至9週齡或10週齡小鼠之後側面。
在腫瘤接種後5天，如下藉由尾部靜脈注射來靜脈內(IV)給藥攜帶有平均77mm3體積之CHO-ROR2腫瘤的小鼠：A組中之NSG小鼠接受含用F1-1-27慢病毒顆粒轉導之1×107個PBMC的200μl DPBS(n=4)，或僅200μl DPBS(n=2)；B組中之NSG小鼠接受含用F1-1-228慢病毒顆粒轉導之0.85×107個PBMC的200μl DPBS(n=2)、含用F1-1-228U慢病毒顆粒轉導之0.85×107個PBMC的200μl DPBS(n=2)或僅200μl DPBS(n=2)。類似地，在腫瘤接種後5天，藉由尾部靜脈注射僅200μl DPBS(n=4)或用含F1-3-219慢病毒顆粒之200μl DPBS(n=3)或含F1-3-219U慢病毒顆粒之200μl DPBS(n=3)轉導之1×107個PBMC來靜脈內(IV)給藥攜帶有Raji腫瘤之C組中之小鼠(平均 76mm3體積)。應注意，使用在離體活化之前且不進行離體細胞擴增之情況下對休眠淋巴球之有利快速轉導的方案來轉導具有F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-219U之PBMC用於給藥此等小鼠。自全部人類血液收集至用經轉導之PBMC IV給藥小鼠所經歷的總時間對於F1-1-228及F1-1-228U為14.5小時，且對於F1-3-219及F1-3-219U為11.5小時。
使用測徑規一週2次量測腫瘤並且使用以下等式計算腫瘤體積：(最長直徑×最短直徑2)/2。在第7天、第14天及第21天自各小鼠收集大約100μl血液以供FACS及qPCR分析。當小鼠被安樂死時，亦收集血液、脾臟及腫瘤，其與來自腫瘤負荷之屍檢指標一致。
流式細胞術
對於自體外培養物收穫之細胞-將細胞離心並再懸浮於0.5ml FACS染色緩衝液(554656，BD)中。將2.5μl人類Fc嵌段(BD，564220)添加至各樣本中並且在室溫下培育10分鐘。在冰上用0.5μl抗FLAG Tag PE((抗DYKDDDDK)637310，Biolegend))及0.5μl Live/Dead Fixable Green Dead細胞染色劑(L34970，Thermo Fisher)對細胞染色30min。將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，固定在FACS緩衝液及BD Cytofix(554655，BD)之1：1混合物中，用Novocyte(ACEA)處理，並且使用基於正向及側向散射以及活死染色之活閥門用NovoExpress軟體(ACEA)分析所得資料。量測經轉導之淋巴球作為FLAG Tag+細胞。
對於自血液獲得之細胞-新鮮收集之血液中之紅血球使用裂解緩衝液(555899，BD)來裂解並且將剩餘細胞再懸浮於100μl之FACS染色緩衝液中。將2.5μl人類Fc嵌段(BD，564220)添加至各樣本中並且在室溫下培育10分鐘。在冰上用生物素化之西妥昔單抗對 細胞染色30min經染色之細胞用FACS緩衝液洗滌並且用5μl抗人類CD45-PE-Cy7及0.5μl抗小鼠CD45-FITC進一步染色。將0.4μl SA-PE添加至來自此等組之經用F1-1-27、F1-1-228、F1-1-228U及PBS對照轉導之細胞給藥的小鼠的樣本中。將1μl抗FLAG Tag PE((抗DYKDDDDK)637310，Biolegend)添加至來自此組之經用F1-3-219及F1-3-219U以及PBS對照轉導之細胞給藥的小鼠的樣本中。在冰上培育細胞30min，在FACS緩衝液中洗滌兩次，並且再懸浮於具有1μl 7-AAD(420404，Biolegend)之100μl FACS染色緩衝液中。新鮮染色之樣本用Novocyte(ACEA)處理，並且使用基於正向及側向散射之活閥門、基於7-AAD、人類CD45+之活閥門用NovoExpress軟體(ACEA)分析所得資料並且檢測FLAG或eTag之表現。
qPCR
藉由生物分析qPCR來評估自血液樣本分離之基因組DNA(gDNA)的經轉導淋巴球之存在。使用QIAamp DNA Blood Mini套組(Qiagen 51106)自50μl血液樣本分離基因組DNA並且使用QIAamp DNA Micro套組(56304)進一步清洗該DNA。使用對於慢病毒之5’LTR具有特異性之引子及探針組對分離之基因組DNA進行TaqMan測定(Thermo Fisher)以檢測經轉導之細胞。
結果
在此實驗中使用經VSV-G假型化並且編碼CAR及淋巴增殖性元件之慢病毒顆粒。慢病毒顆粒F1-1-228及F1-1-228U將MRB-CAR編碼為包括MycTag及2A Jun二聚域、IL13RA跨膜域以及MPL及CD40胞內域之ROR2及CLE，且慢病毒顆粒F1-2-219及F1-3-219U將CAR編碼為CD19及CLE，該CD19及CLE編碼共價連接至 IL-7Rα(CD127)(SEQ ID NO：513)之胞外部分及跨膜部分及IL-2R(CD122)之胞內域的IL7。慢病毒顆粒F1-1-228U及F1-3-219U亦在其表面上呈現UCHT1scFvFc-GPI。藉由用Ficoll-PaqueTM密度梯度離心自人類血液分離PBMC。在細胞離體活化之前，將新鮮PBMC在標準血袋中用慢病毒顆粒轉導。在4小時轉導之後，將細胞洗滌並且用於以下實驗中。熟練之技術人員將理解，自血液收集至洗滌細胞之整個過程可在封閉系統中進行。作為對照，將PBMC活化隔夜，用編碼CAR而不編碼淋巴增殖性元件或UCHT1scFvFc-GPI(F1-1-27)之慢病毒顆粒轉導，並且離體培養15天(F1-1-27)。
將經轉導之PBMC在不存在細胞介素下體外培養。圖21展示在第6天之轉導效率。UCHT1scFvFc-GPI增加F1-1-228及F1-3-219之轉導效率。休眠PBMC在暴露於F1-1-228U或F1-3-219U 4小時時之轉導效率分別為34%及73%。圖22展示在第3天與第6天之間的此等培養物中之活細胞總數。用F1-1-228U或F1-3-219U轉導之休眠PBMC在不存在外源性細胞介素下在第3天與第6天之間存活且甚至增殖，而用F1-1-228或F1-3-219轉導之PBMC卻未存活且甚至增殖。此等結果證實，呈現活化元件並且編碼淋巴增殖性元件之慢病毒顆粒可在4小時內轉導休眠PBMC，並且此等經轉導之PBMC在不存在外源性細胞介素下培養6天時可體外增殖且存活。
攜帶ROR2或CD19腫瘤之免疫缺乏小鼠經靜脈內給予分別表現CAR至ROR2或CD19之1×107個PBMC。隨著時間檢測經轉導PBMC在體內存活且增殖之能力。圖23A至圖23C展示作為經轉導細胞之讀數的藉由qPCR自給藥表現CAR之PBMC的小鼠之血液分離的每微克基因組DNA之慢病毒複本。圖23A展示對於F1-1-27之每微克 基因組DNA之慢病毒複本，其不編碼淋巴增殖性元件，自第7天之平均數884降低至低於第21天之定量下限(LLOQ)。圖23B展示對於F1-1-228U之慢病毒複本低於第7天及第14天之LLOQ，但第21天增加大於LLOQ並且在第25天增加至平均數1,939。圖23C展示當小鼠被安樂死時，對於F1-3-219U之慢病毒複本自低於第7天之LLOQ增加至第14天之20,430。在對照樣本F1-1-228及F1-3-219中之慢病毒複本仍低於LLOQ。圖24展示在小鼠被安樂死時(最後時間點展示於圖23中)如藉由對CAR構築體之eTag或FLAG-Tag的FACS分析所測定的每200ul血液之經轉導細胞數目。每200ul來自用F1-1-228U(5,857)及F1-3-219U(121,324)轉導之細胞給藥的小鼠的血液中偵測到顯著數目之CAR+細胞。
對經基因方式修飾以表現淋巴組織增殖性元件及抗CD19 CAR或抗ROR2 CAR之PMBC的抗腫瘤活性進行分析。如上文所提供產生攜帶CHO-ROR2腫瘤或CD-19表現腫瘤之小鼠。用F1-1-228U或F1-3-219U轉導之淋巴球殺死在體內表現其目標抗原之腫瘤(圖25A及圖25B)。在兩種情況下，淋巴球以延遲方式減小腫瘤體積。不受理論限制，但此延遲與注射細胞擴增之需求一致，其花費如qPCR所觀測之時間。後來的時間點不能在此實驗中研究，此係由於攜帶ROR2腫瘤之小鼠達到了對於腫瘤負荷之安樂死指標，並且攜帶Raji腫瘤之小鼠產生了由小鼠中大量經轉導及擴增之淋巴球引起之移植物抗宿主病。
此等資料一起展示，呈現活化元件並且編碼淋巴增殖性元件之反轉錄病毒顆粒可在4小時內轉導休眠PBMC，並且此等轉導之PMBC可體內增殖並存活。在此實驗中測試之兩種淋巴增殖性元 件MycTag 2A Jun-IL13Ra-MPL-CD40及IL-7-IL-7Rα-IL-2Rβ呈現促進體內存活且增殖之能力。此外，以此方式轉導之表現MRB-CAR(F1-1-228U)或傳統CAR(F1-3-219U)的此等淋巴球能夠體內識別並且殺死腫瘤細胞。
實例17.插入至EF-1α啟動子內含子中之miRNA的功能性。
設計四個單獨gBlocks®基因片段，各自含有包括miR-155 5’側接序列或「5’臂」(SEQ ID NO：256)及miR-155 3’側接序列或「3’臂」(SEQ ID NO：260)的miR-155構架。對於各gBlock®，靶向CD3zeta mRNA轉錄物之唯一miRNA片段係用於替換miR-155莖-環前體。各gBlock®含有經設計以有助於將全部四個gBlocks®作為單鏈組裝至EF-1α啟動子內含子中的40bp重疊序列。使用用於執行Gibson®組裝ultra之商用套組(NEBuilder，New England Biolabs，Inc.)來組裝gBlocks®。
含有miRNA(在序列SEQ ID NO：255中)之合成EF-1α啟動子及內含子A為驅動慢病毒載體主鏈中所含有之GFP及eTag之表現的轉殖基因表現卡閘之部分(具有由西妥昔單抗識別之GFP且例示性eTag之慢病毒載體主鏈在此稱為F1-0-02；圖26A及圖26B)。在表26中指示之SEQ ID NO：255中之各gBlock®及其各別組分之核苷酸位置為圖26B中之各「特徵」之位置。將四個miRNA適當組裝至慢病毒載體主鏈中係藉由對經修飾之EF-1α啟動子及內含子區進行全面定序來確認。
在其基因組中含有編碼針對CD3ζ之四個miRNA之核酸的非複製勝任型慢病毒顆粒係藉由瞬時共轉染以下四個質體至懸浮HEK293細胞中來產生：含有編碼經修飾以包括靶向CD3zeta mRNA轉錄物之四個miRNA之F1-0-02之核酸的質體、編碼VSV-G之 質體、編碼REV之質體以及編碼GAG-POL之質體。在48小時後採集慢病毒顆粒上清液且經PEG沈澱24小時。離心上清液，且將成丸粒慢病毒顆粒再懸浮於不具有IL-2之完全PBMC生長介質中。利用Jurkat細胞之48小時轉導來計算慢病毒顆粒效價。
對於轉導，在第0天融解PBMC且與100U/mL之hrIL-2一起培育24小時。在第1天，經由經CD3/CD28結合之珠粒活化PBMC。在第2天，在10MOI下用含有具有編碼miRNA之核酸序列之基因組的慢病毒顆粒轉導經活化PBMC。擴展細胞直至第11天，其中每兩天添加新鮮hrIL-2。在第7天、第9天及第11天，採集1百萬個細胞以供FACS分析。
針對CD3 Epsilon表面表現，使用經PE結合之OKT-3抗體(Biolegend)染色細胞。表現水準係利用GFP陽性群體(經轉導細胞)中之PE之平均螢光強度(MF)來測定。在衍生自F1-0-02之反轉錄慢病毒顆粒與衍生自F1-0-02之反轉錄慢病毒顆粒之間比較經轉導細胞之表現水準，其中將編碼連續定位之CD3z miRNA核酸序列插入至EF-1α啟動子及內含子A中。
結果展示於圖27中。此資料展示，靶向由EF-1α啟動子內含子A內之核酸序列編碼之CD3zeta的連續miRNA在基因敲除CD3複合物之表現時有效。
實例18.插入至EF-1α啟動子內含子中之連續抑制性RNA的位置依賴性。
選殖
四個表現miRNA之慢病毒載體構築體經設計以測試在包含連續之4個miRNA前體的結構中之個別miRNA前體之處理。表 27展示個別構築體之名稱及各構築體中之miR-TCRα之位置。。
各miRNA含有用於實例17中之miR-155構架，例如miR-155 5'臂(SEQ ID NQ：256)、miR-155 3'臂(SEQ ID NO：260)、環(SEQ ID NO：258)及如表28中所展示之莖序列之特異性次序。類型II組裝方法係用於達成將四個miRNA片段組裝至慢病毒載體構築體(F1-0-02；提供於實例17中且展示於圖26A及圖26B中)之EF-1α內含子內之其合適位置中。
，其中：
SEQ ID NO：267=TCRα miRNA莖1；ATATGTACTTGGCTGGACAGC
SEQ ID NO：268=TCRα miRNA莖2；GCTGTCCACAAGTACATAT
SEQ ID NO：269=鏈接子1；CACATTGGTGCCGGATGAAGCTCTTATGTTGCCGGTCAT
SEQ ID NO：270=mir-155莖1；CTGTTAATGCTAATCGTGATA
SEQ ID NO：271=mir-155莖2；TATCACGATTATTAACAG
SEQ ID NO：272=鏈接子2；GTTGCCGGAGTCTTGGCAGCGAGAGATCACTATCAACTAA
SEQ ID NO：273=PD-1 miRNA莖1；TACCAGTTTAGCACGAAGCTC
SEQ ID NO：274=PD-1 miRNA莖2；GAGCTTCGCTAAACTGGTA
SEQ ID NO：275=鏈接子3； GTGTTAATTGTCCATGTAGCGAGGCATCCTTATGGCGTGG
SEQ ID NO：276=CTLA-4miRNA莖1；TGCCGCTGAAATCCAAGGCAA
SEQ ID NO：277=CTLA-4 miRNA莖2；TTGCCTTGTTTCAGCGGCA
慢病毒顆粒產生
四個構築體及對照F1-0-02(其不包括編碼miRNA之核酸序列)係用於在293T細胞之30mL懸浮培養物中產生慢病毒顆粒。採集慢病毒顆粒且利用PEG沈澱濃縮。功能性慢病毒顆粒效價係藉由在多次稀釋(1：1000、1：10000、1：100000)下轉導Jurkat細胞，在37℃下培育慢病毒顆粒及細胞2天，用FACS緩衝液洗滌細胞2×及利用流式細胞術分析GFP來獲得。關於慢病毒顆粒產生之其他細節係提供於本文實例17中。
轉導
對於轉導，融解PBMC且在含有100U/mL hrIL-2之完全介質中回收隔夜。經由暴露於經CD3/CD28結合之珠粒24小時來活化1×105PBMC。在MOI 10下用四個miRNA構築體中之每一者或用對照反轉錄病毒顆粒F1-0-02在兩個重複孔中轉導細胞。每3天用100U/mL hrIL-2供應細胞且擴展該等細胞直至第10天。
FACS
集細胞以供FACS分析，該FACS分析確認用非複製勝任型慢病毒載體轉導之細胞。結果展示，在實驗中將大約等量之含有miRNA之病毒遞送至各孔。
細胞-對-ct miRNA RT-qPCR及分析
RT-qPCR分析經設計以偵測表現及將miRNA前體加工為經成熟加工之miR。藉由首先將所有miR-TCRa ct值歸一化為RNU48內部對照以產生△Ct值來進行分析。接著，自未經轉導之對照之△Ct減去各經轉導樣本之△Ct值以產生△△Ct。此值表示各經轉導樣本相對於未經轉導之對照中之經加工miR-TCRa miRNA的量。
如圖28中所展示，RT-qPCR分析成功地偵測到用含有miR-TCRα之非複製勝任型慢病毒顆粒轉導之樣本中之經加工miR-TCRα。此外，結果清晰地指示，在所測試之四個位置中之任一者處之miRNA TCRα加工中無顯著影響。
實例19.miRNA表現增加了表現CAR之經轉導細胞的活體內存活及/或增殖。
此實例使用小鼠異種移植模型證實，靶向cCBL或CD3z之miRNA增加了表現CAR之經轉導PBMC的活體內增殖及/或存活。
方法
庫製備
108個gBlocks®基因片段用於產生各自含有處於連續位置1(P1)、2(P2)、3(P3)及4(P4)的4個miRNA前驅物的構築體之庫。各gBlock®對P1、P2、P3或P4具有特異性且含有包括如實例17中所描述之5’臂及3’臂的miR-155構架，其中靶向對應於1個至27個不同基因之mRNA轉錄物的獨特miRNA構架用於替換miR-155莖-環前驅物。為清楚起見，miRNA片段之序列對於每各位置P1至P4有所不同，即使在靶向對應於相同基因之mRNA轉錄物的miRNA片段當中。各位置的gBlocks®含有獨特的40bp重疊序列，且II型裝配方法用於以其規定次 序組裝四個gBlocks®之組合進，以產生庫。藉由此等方法，531,441個獨特的構築體(P1處之27 miRNA×P2處之27 miRNA×P3處之27 miRNA×P4處之27 miRNA)之總分集為可能的。
將miRNA構築體之庫經單獨選殖至F1-1-315及F1-2-314之EF-1 α內含子A中，以分別產生庫315及庫314。除EF-1 α啟動子以外，F1-1-315亦包括CD8a信號肽、抗ROR2：CD28：CD3z CAR、T2A及eTag。類似地，除EF-1 α啟動子以外，F1-2-314包括CD8a信號肽、抗Axl：CD8：CD3z CAR、T2A及eTag。圖26A及圖26B展示驅動GFP而非CAR之表現的具有EF-1 α啟動子(包括具有4個miRNA前驅物之內含子A)的類似慢病毒載體。
cCBL及CD3z在此實例中靶向的27個轉錄物當中。針對cCBL之4個miRNA序列為：P1之SEQ ID NO：540；P2之SEQ ID NO：541；P3之SEQ ID NO：542；及P4之SEQ ID NO：543。針對CD3z之4個miRNA序列為：P1之SEQ ID NO：544；P2之SEQ ID NO：545；P3之SEQ ID NO：546；及P4之SEQ ID NO：547。
注意，由於其特定序列(針對CD3z之miRNA)經設計，因此其將僅靶向編碼內源性CD3z之RNA且將不靶向編碼CAR轉基因內之CD3z域的RNA。此藉由將miRNA設計為靶向未存在於CAR轉基因中的內源性CD3z之3’UTR內的序列來實現。替代地，可將miRNA靶向至編碼內源性CD3z及CAR轉基因兩者之CD3z胞內域的mRNA序列，其限制條件為對CAR轉基因之密碼子利用充分不同於內源性CD3z之彼密碼子利用，使得靶向內源性CD3z而非CAR轉基因mRNA以供裂解。
慢病毒顆粒產生
庫315及庫314單獨用於在293T細胞之30ml懸浮培養物中產生慢病毒顆粒。採集慢病毒顆粒且利用PEG沈澱濃縮。關於慢病毒顆粒產生之其他細節係提供於本文實例17中。
轉導
在第0天，使PBMC自ACD周邊血液分離，且用補充有100IU/ml IL-2(Novoprotein,GMP-CD66)、10ng/ml IL-7(Novoprotein,GMP-CD47)及50ng/ml抗CD3抗體(Novoprotein,GMP-A018)的完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴展SFM將5.0×107個存活PBMC以100ml接種至兩個1L G-Rex器件中的每一者中，以活化包括T細胞及NK細胞之PBMC以用於病毒轉導。在5之MOI下將慢病毒顆粒直接添加至庫315之1 G-Rex及庫314之其他G-Rex中之經活化PBMC中，且培育隔夜。在37℃及5% CO2下，將G-Rex器件在標準增濕組織培育箱中培育，其中每48小時添加100IU/ml重組人類IL-2及10ng/ml重組人類IL-7溶液，且使培養物擴展直至第12天，在該時間細胞主要為T細胞。關於PBMC分離、轉導及離體擴展之其他細節提供於本文中之實例16中。
腫瘤培育及經轉導細胞之投予。
使用NOD Scid Gamma(NSG)小鼠之異種移植模型經選擇以探測用庫315或庫314之慢病毒顆粒轉導之人類PBMC活體內存活及/或增殖的能力，其中腫瘤表現或未表現由在此等慢病毒顆粒之基因組中編碼之CAR識別的抗原。根據中國科學院生化與細胞所實驗動物管理委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)所批准方案來處理小鼠。將皮下(sc)腫瘤異種移植建立於12週大之雌性 NOD-PrkdcscidIl2rgtm1/Begen(B-NSG)小鼠(Beijing Biocytogen Co.Ltd.)的脅腹中。簡言之，將經轉染以穩定表現人類ROR2(CHO-ROR2)或人類AXL(CHO-AXL)之所培養CHO細胞、所培養CHO細胞在DPBS(Thermo Fisher)中單獨地洗滌、計數、再懸浮於冷DPBS中，且以冰上0.47×106個細胞/200微升之濃度與適當體積之Matrigel ECM(Corning；最終濃度5mg/mL)混合。準備動物以使用標準批准之麻醉注射，其中在注射前去除毛髮(Nair)。將200μl的ECM中之任一種細胞懸浮液分別皮下注射至CHO細胞(n=2)、CHO-ROR2細胞(n=1)及CHO-AXL細胞(n=1)之後側面中。
在腫瘤接種後5天，藉由尾靜脈注射使攜帶CHO腫瘤之1隻小鼠及攜帶CHO-ROR2腫瘤之1隻小鼠靜脈(IV)給藥含有用來自庫315之慢病毒顆粒轉導之1×107個PBMC的200μl DPBS。在腫瘤接種後5天，藉由尾靜脈注射使攜帶CHO腫瘤之1隻小鼠及攜帶CHO-Axl腫瘤之1隻小鼠靜脈(IV)給藥含有藉由來自庫314之慢病毒顆粒轉導之1×107個PBMC的200μl DPBS。
腫瘤採集及DNA測序
在給藥有經轉導PBMC後第20天，切除腫瘤。自一半各腫瘤提取DNA，且來自各腫瘤之4ug在PCR反應中用作模板持續25個週期，以擴增EF-1α內含子。將擴增子選殖至測序載體中，轉化為細菌且劃線至盤上。選擇18個總菌落(每隻小鼠約5個)，且製備DNA且使用Sanger測序進行分析以測定存在於腫瘤中之miRNA構築體之樣本的序列。
結果
小鼠異種移植模型用於測定靶向cCBL或CD3z之 miRNA是否增加表現CAR之經轉導PBMC的活體內增殖及/或存活，其中異種移植為具有或不具有CAR之靶向抗原之表現的腫瘤。對於此分析，產生由針對cCBL、內源性CD3z或25種其他靶標的miRNA構成的miRNA構築體之庫。所分析miRNA構築體含有4個單獨的miRNA的4個位置，如圖26B以及實例17及實例18中所展示。藉由對EF-1α內含子測序來分析腫瘤DNA，以識別出在注射經轉導PBMC後20天存在哪些miRNA構築體，且因此哪些miRNA構築體增加了增殖及/或存活。
4個連續miRNA之531,441個不同組合係有可能的。在所測序18個EF-1α內含子中，13個含有miRNA構築體，其中構築體中之所有4個miRNA係針對一個靶標，儘管該靶標在構築體當中不同。值得注意地，2個EF-1α內含子含有具有針對cCBL(SEQ ID NO：540至543)之所有4個miRNA的miRNA構築體，且1個EF-1α內含子含有具有針對CD3z(SEQ ID NO：544至547)之所有4個miRNA的miRNA構築體。針對cCBL之4個連續miRNA經發現在來自接受用庫315轉導之PBMC之小鼠的CHO-ROR2腫瘤中，以及來自接受用庫314轉導之PBMC之小鼠的CHO腫瘤中。針對CD3z之4個連續miRNA經發現在來自接受用庫315轉導之PBMC之小鼠的CHO腫瘤中。此表明，cCBL及CD3z中之每一者的基因敲除促進T細胞在腫瘤微環境中之存活及/或增殖。此外，此資料表明存在劑量效應，使得針對cCBL和CD3z之miRNA的4個物種產生比1、2或3種物種更大的編碼此等基因之轉錄物之基因敲除，且此經增加基因敲除賦予了存活和/或增殖優勢。
所揭示之實施例、實例及實驗不意欲限制本發明之範疇或表示以下實驗為執行之全部或唯一的實驗。已努力確保關於所使用之數字(例如，量、溫度等)之準確度，但應計入一些實驗性誤差及 偏差。應理解，可在不改變實驗意欲說明之基本態樣之情況下對如所描述之方法進行變化。
熟習此項技術者可在本發明之範疇及精神下設計許多修改及其他實施例。實際上，可在不改變本發明之基本態樣之情況下由熟習的技術者對所描述之材料、方法、圖式、實驗、實例及實施例進行變化。所揭示實施例中之任一者可結合其他所揭示之實施例來使用。
在一些情況下，參考特定實施例描述一些概念。然而，一般熟習此項技術者瞭解，可在不背離如以下申請專利範圍所闡述之發明內容之範疇之情況下進行各種修改及改變。因此，說明書及圖式應視為呈說明性意義而非限制性意義，且所有此等修改意欲包括在本發明之範疇內。
表16.庫3.1B最優構築體。
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<150> PCT/US2018/020818
<151> 2018-03-03
<150> US 62/560,176
<151> 2017-09-18
<150> US 62/564,253
<151> 2017-09-27
<150> US 62/564,991
<151> 2017-09-28
<150> US 62/728,056
<151> 2018-09-06
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<220>
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<220>
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<222> (2)..(3)
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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<222> (12)..(12)
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<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
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<211> 12
<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩ滖莩 宎唗蹈
<400> 533
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<211> 13
<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩ 笭皺砦躇徨赽
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<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩ敳敳毀滖？瓷馮婦臚昒粥啞
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<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩ敳敳毀滖？瓷馮婦臚昒粥啞汛RㄗHAㄘ
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<211> 546
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩ敳敳毀滖？瓷馮婦臚昒粥啞汛RㄗHAMㄘ
<400> 537
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<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩMuLV婦臚粥啞
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<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩ蕨CD3 scFV赻UCHT1磁祫MuLV婦臚粥啞
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<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩP1？眳cCBL miRNA
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<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
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<400> 541
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<211> 204
<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
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<211> 200
<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩP4？眳cCBL miRNA
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<211> 223
<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩP1？眳CD3Z miRNA
<400> 544
<210> 545
<211> 204
<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩP2？眳CD3Z miRNA
<400> 545
<210> 546
<211> 204
<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩP3？眳CD3Z miRNA
<400> 546
<210> 547
<211> 200
<212> DNA
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩP4？眳CD3Z miRNA
<400> 547
<210> 548
<211> 511
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<220>
<223> 磁傖ㄩVSV-G婦臚粥啞
<400> 548

Claims (48)

  1. 一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在製備用於以基因方式修飾個體之T細胞或NK細胞之套組中的用途，其中該套組之用途包含：使該T細胞或該NK細胞離體與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含在其表面上之假型化元件，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中，該一或多個轉錄單元編碼包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一多肽，或包含LE之第一多肽及包含嵌合抗原受體(CAR)之第二多肽，且其中該接觸執行持續15分鐘與18小時之間以有助於該T細胞或該NK細胞與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜融合，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：CD2、CD4、CD8A、CD8B、CD40、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、FCGR2A、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR或PRLR，由此產生經基因方式修飾之T細胞或經基因方式修飾之NK細胞。
  2. 一種經基因方式修飾之T細胞或NK細胞，其根據包含使該T 細胞或NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸的方法藉由以基因方式修飾T細胞或NK細胞而製成，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含假型化元件，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一個或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一多肽，或包含LE之第一多肽及包含嵌合抗原受體(CAR)之第二多肽，且其中該接觸執行持續15分鐘與18小時之間以有助於該T細胞或該NK細胞與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜融合，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：CD2、CD4、CD8A、CD8B、CD40、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、FCGR2A、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR或PRLR，由此產生該經基因方式修飾之T細胞或該經基因方式修飾之NK細胞。
  3. 一種用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞之方法，包含使該T細胞或該NK細胞離體與在其表面上包含假型化元件的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操 作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一多肽，或包含LE之第一多肽及包含嵌合抗原受體(CAR)之第二多肽，且其中該接觸執行持續15分鐘與18小時之間以有助於該T細胞或該NK細胞藉由該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒進行膜融合，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：CD2、CD4、CD8A、CD8B、CD40、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、FCGR2A、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR及PRLR，由此產生經基因方式修飾之T細胞或NK細胞。
  4. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該LE能夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2。
  5. 一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在製造用於以基因方式修飾個體之T細胞或NK細胞之套組中的用途，其中該套組之該用途包含：使該T細胞或該NK細胞離體與該非複製勝任型重組反轉 錄病毒顆粒接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含假型化元件，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽、包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一多肽或包含LE之第一多肽及包含CAR之第二多肽，其中該一或多個轉錄單元進一步包含Kozak相關序列、WPRE元件及三重終止序列中之一或多者，其中該LE能夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2，且其中該接觸執行持續15分鐘與18小時之間以有助於該T細胞或該NK細胞與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜融合，由此產生經基因方式修飾之T細胞或經基因方式修飾之NK細胞。
  6. 一種經基因方式修飾之T細胞或NK細胞，其根據包含使該T細胞或NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸的方法藉由以基因方式修飾T細胞或NK細胞而製成，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含假型化元件，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽、包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一多肽或包含LE之第一多肽及包含CAR之第二多肽，其中該一或多個轉錄單元進一步包含Kozak相關序列、WPRE元件及三重終止序列中之一或多者，其中該LE能 夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2，且其中該接觸執行持續15分鐘與18小時之間以有助於該T細胞或該NK細胞與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜融合，由此產生該經基因方式修飾之T細胞或該經基因方式修飾之NK細胞。
  7. 一種用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞之方法，其包含使該T細胞或該NK細胞離體與在其表面上包含假型化元件的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽、包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一多肽或包含LE之第一多肽及包含CAR之第二多肽，其中該一或多個轉錄單元進一步包含Kozak相關序列、WPRE元件及三重終止序列中之一或多者，其中該LE能夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2，且其中該接觸執行持續15分鐘與18小時之間以有助於該T細胞或該NK細胞藉由該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒進行膜融合，由此產生經基因方式修飾之T細胞或NK細胞。
  8. 如請求項5之用途、如請求項6之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或如請求項7之用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：BTLA、CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD8A、CD8B、CD27、突變δ Lck CD28、CD28、CD40、CD79A、CD79B、 CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、DAP10/CD28、DAP12、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、FCGRA2、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14、TNFRSF18或ZAP70。
  9. 如請求項5之用途、如請求項6之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或如請求項7之用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：CD2、CD4、CD8A、CD8B、CD40、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、FCGR2A、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR及PRLR。
  10. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方 法，其中該用途或該方法在無需進行預先離體刺激之情況下執行。
  11. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該T細胞為休眠T細胞或該NK細胞為休眠NK細胞。
  12. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含膜結合T細胞活化元件。
  13. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該一或多個轉錄單元編碼包含該LE之該第一多肽及包含該CAR之該第二多肽，且其中該經基因方式修飾之細胞為經基因方式修飾之T細胞。
  14. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該用途或該方法進一步包含：在使該T細胞或NK細胞離體與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸之前，收集包含來自個體之該T細胞或NK細胞的血液；及將該經基因方式修飾之T細胞或NK細胞引入至該個體中，其中該經基因方式修飾之T細胞或NK細胞在該接觸之後且在被引入至該個體中之前不離體擴展。
  15. 一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該非複製勝任型 重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含假型化元件及膜結合T細胞活化元件，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一多肽及包含嵌合抗原受體(CAR)之第二多肽，且其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：CD2、CD4、CD8A、CD8B、CD40、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、FCGR2A、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR及PRLR，且其中該LE能夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2。
  16. 一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含假型化元件及膜結合T細胞活化元件，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含淋巴組織增殖性元件之第一多肽及包含嵌合抗原受體(CAR)之第二多肽，其中該LE能夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2，且其中該一 或多個轉錄單元進一步包含Kozak相關序列、WPRE元件及三重終止序列中之一或多者。
  17. 如請求項12、請求項15或請求項16中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該活化元件包含抗CD3。
  18. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒為慢病毒顆粒。
  19. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該LE為包含各自來自不同基因的兩個或更多個胞內信號傳導域的嵌合LE。
  20. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該LE為包含胞內信號傳導域、跨膜域及胞外域的嵌合LE。
  21. 如請求項20之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法、經分離多肽、經分離聚核苷酸或非複製勝任重組反轉錄病毒顆粒，其中該嵌合LE之該胞外域包含二聚基元。
  22. 如請求項20之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法、經分離 多肽、經分離聚核苷酸或非複製勝任重組反轉錄病毒顆粒，其中該嵌合LE之該胞外域不結合細胞介素受體之配偶體。
  23. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法、經分離多肽、經分離聚核苷酸或非複製勝任重組反轉錄病毒顆粒，其中該LE為組成性活性的。
  24. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法、經分離多肽、經分離聚核苷酸或非複製勝任重組反轉錄病毒顆粒，其中該LE擁有以下特性a)在相同條件下，相較於與包含該LE之該核酸構築體相同但不具有該LE之對照構築體，在不存在外源性添加之細胞介素的情況下，在活體外培養之第7天與第21天、第28天、第35天及/或第42天之間，當與編碼包含CD3 ζ胞內活化域但不無共刺激域之抗CD19 CAR的核酸一起轉導時，改良用包含編碼該LE之核酸的反轉錄病毒顆粒轉導的經預活化PBMC之擴展；及/或b)當與編碼包含CD3 ζ胞內活化域但無共刺激域之抗CD19 CAR的核酸一起轉導時，在不存在外源性添加之細胞介素的情況下，在活體外培養之第7天與第21天、第28天、第35天及/或第42天之間，將用編碼該LE之核酸構築體轉導的經預活化PBMC擴展至少2倍、3倍、4倍、6倍、7倍或8倍，或在3倍與25倍之間、5倍與25倍之間、5倍與20倍之間、5 倍與15倍之間、7倍與15倍之間或7倍與12倍之間。
  25. 如請求項24之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法、經分離多肽、經分離聚核苷酸或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該LE根據要素a)能夠改良擴展，且其中該改良使用統計方法及等於或小於0.1之截止值p值來測定。
  26. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法、經分離多肽、經分離聚核苷酸或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：CSF2RB、CSF3R、IFNGR1、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL10RA、IL17RE、IL18R1、IL22RA1、IL31RA、MPL、MyD88、OSMR或PRLR。
  27. 如前述請求項中任一項之用途、以基因方式經修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞、經分離多肽、經分離聚核苷酸的方法或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：CSF2RB、CSF3R、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL31RA、MPL及MyD88。
  28. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法、經分離多肽、經分離聚核苷酸或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IFNGR2及FCGR2C。
  29. 如前述請求項中任一項之用途、經基因方式修飾之T細胞或NK細胞、用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法、經分離多肽、經分離聚核苷酸或非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該LE包含分別選自以下組合的第一胞內信號傳導域及第二胞內信號傳導域：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSF2RA及TNFRSF8；CSF2RA及CD27；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL1RAP及CD79A；IL3RA及CD40；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL13RA2及TNFRSF14；IL18RAP及CD3G；IL27RA及FCGRA2；LEPR及CD3G；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD79A；MPL及CD3G；MyD88及CD79B；或MyD88及CD3D。
  30. 一種經分離多肽，其包含膜相關基元以及分別選自以下組合的第一胞內信號傳導域及第二胞內信號傳導域：CSF2RA及TNFRSF4；CSF2RA及CD28；CSF2RA及TNFRSF8；CSF2RA及CD27；CSFR3及CD79B；IFNAR2及TNFRSF14；IL1RAP及CD79A；IL3RA及CD40；IL10RA及CD79B；IL11RA及FCGRA2；IL13RA2及TNFRSF14；IL18RAP及CD3G；IL27RA及FCGRA2；LEPR及CD3G；LIFR及TNFRSF18；MPL及CD40；MPL及CD79B；MPL及TNFRSF4；MPL及CD79A；MPL及CD3G；MyD88及CD79B；或MyD88及CD3D。
  31. 如請求項30之經分離多肽，其中該膜相關基元為鄰近該第一胞內信號傳導域之跨膜域。
  32. 如請求項31之經分離多肽，其進一步包含胞外域。
  33. 如請求項30至32中任一項之經分離多肽，其中該經分離多肽能夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2。
  34. 如請求項33之經分離多肽，其中該經分離多肽為組成性活性的。
  35. 一種經分離聚核苷酸，其編碼如請求項30至34中任一項之經分離多肽。
  36. 如請求項35之經分離聚核苷酸，其進一步包含在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子。
  37. 一種經分離非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其包含如請求項36之經分離聚核苷酸。
  38. 如請求項37之經分離非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，其中該反轉錄病毒顆粒進一步編碼嵌合抗原受體。
  39. 一種非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在製造用於以基因方式修飾個體之T細胞或NK細胞之套組中的用途，其中該套組之該用途包含：使該T細胞或該NK細胞離體與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含假型化元件，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽、包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一多肽或包含LE之第一多肽及包含CAR之第二多肽，其中該LE能夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2，且其中該 接觸執行少於15分鐘以有助於該T細胞或該NK細胞與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜融合，由此產生經基因方式修飾之T細胞或經基因方式修飾之NK細胞。
  40. 一種經基因方式修飾之T細胞或NK細胞，其根據包含使該T細胞或NK細胞離體與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸的方法藉由以基因方式修飾T細胞或NK細胞而製成，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含假型化元件，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽、包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一多肽或包含LE之第一多肽及包含CAR之第二多肽，其中該LE能夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2，且其中該接觸執行少於15分鐘以有助於該T細胞或NK細胞與該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之膜融合，由此產生該經基因方式修飾之T細胞或該經基因方式修飾之NK細胞。
  41. 一種用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞之方法，其包含使該T細胞或該NK細胞離體與在其表面上包含假型化元件之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含可操作性地連接至在T細胞及/或NK細胞中具有活性之啟動子的一或多個轉錄單元，其中該一或多個轉錄單元編碼包含嵌合抗原受體(CAR)之第一多肽、包含淋巴組織增殖性元件(LE)之第一 多肽或包含LE之第一多肽及包含CAR之第二多肽，其中該LE能夠在培養期間促進T細胞之細胞存活及/或細胞增殖且無需添加IL-2，且其中該接觸執行少於15分鐘以有助於該T細胞或該NK細胞藉由該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒進行膜融合，由此產生經基因方式修飾之T細胞或NK細胞。
  42. 如請求項39之用途、如請求項40之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞，或如請求項41之用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：BTLA、CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD8A、CD8B、CD27、突變δ Lck CD28、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、DAP10/CD28、DAP12、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、FCGRA2、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14、TNFRSF18或ZAP70。
  43. 如請求項39之用途、如請求項40之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或如請求項41之用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該LE包含來自以下之胞內信號 傳導域：CD2、CD4、CD8A、CD8B、CD40、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、FCGR2A、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR及PRLR。
  44. 如請求項39之用途、如請求項40之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或如請求項41之用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該LE包含來自以下之胞內信號傳導域：CSF2RB、CSF3R、IFNGR1、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL10RA、IL17RE、IL18R1、IL22RA1、IL31RA、MPL、MyD88、OSMR或PRLR。
  45. 如請求項39之用途、如請求項40之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或如請求項41之用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該用途或該方法在無需預先離體刺激之情況下執行。
  46. 如請求項39之用途、如請求項40之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或如請求項41之用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該T細胞為休眠T細胞或該NK細胞為休眠NK細胞。
  47. 如請求項39之用途、如請求項40之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或如請求項41之用於以基因方式修飾及/或轉導T 細胞或NK細胞的方法，其中該非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒在其表面上包含膜結合T細胞活化元件。
  48. 如請求項39之用途、如請求項40之經基因方式修飾之T細胞或NK細胞或如請求項41之用於以基因方式修飾及/或轉導T細胞或NK細胞的方法，其中該一或多個轉錄單元編碼包含該LE之該第一多肽及包含該CAR之該第二多肽，且其中該經基因方式修飾之細胞為經基因方式修飾之T細胞。
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