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TW202227636A - 感染、活化及擴增免疫細胞之方法及組合物 - Google Patents

感染、活化及擴增免疫細胞之方法及組合物 Download PDF

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TW202227636A
TW202227636A TW110133096A TW110133096A TW202227636A TW 202227636 A TW202227636 A TW 202227636A TW 110133096 A TW110133096 A TW 110133096A TW 110133096 A TW110133096 A TW 110133096A TW 202227636 A TW202227636 A TW 202227636A
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TW110133096A
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磊 張
蘇尼爾 哈達
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美商賽特免疫治療公司
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Abstract

本發明提供用於有效地感染、活化及擴增免疫細胞、例如天然殺手(NK)細胞及γδ T細胞之方法及組合物。

Description

感染、活化及擴增免疫細胞之方法及組合物
NK細胞在腫瘤免疫療法中具有巨大潛力，此乃因其可直接且迅速地殺死腫瘤細胞。使用基因改造重新引導NK細胞(CAR-NK)之功能係克服表現於NK細胞上之多種抑制性受體且強化靶向療法之用途之有效策略。當前，臨床前研究及臨床研究展示，表現嵌合抗原受體(CAR)之NK細胞可發揮顯著抗腫瘤作用且其安全性高於CAR-T細胞療法。例如參見Wang等人，Int. Immunopharmacol. 2019; 74:105695。
然而，CAR-NK細胞療法仍面臨一些難題，例如原代NK細胞在活體外之擴增及活化、難以儲存及運輸NK細胞產品及低轉導效率。因此，仍需要有效地製備用於療法之NK細胞之組合物及方法。本發明滿足該等需要且亦提供相關優點。
在一態樣中，本文提供包括經修飾RD114貓類內源性逆轉錄病毒套膜醣蛋白(RD114TR)及經修飾狒狒套膜醣蛋白(BaEVTR)之假型γ逆轉錄病毒顆粒。在一些實施例中，RD114TR醣蛋白包括RD114醣蛋白之胞外結構域及跨膜結構域以及雙嗜性鼠類白血病病毒(MLV-A)醣蛋白之細胞質結構域或基本上由其組成或進一步由其組成。另外或替代地，BaEVTR醣蛋白包括狒狒套膜醣蛋白(BaEV)之胞外結構域及跨膜結構域以及MLV-A醣蛋白之細胞質結構域或基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，將RD114TR及BaEVTR作為膜蛋白納入顆粒套膜中。在一些實施例中，假型γ逆轉錄病毒顆粒係選自莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(friend murine embryonic stem cell virus，FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒之種類。
在另一態樣中，提供製備(包含(但不限於)感染、活化或擴增)天然殺手(NK)細胞之群體之方法。該方法包括將細胞群體與一或多種免疫細胞活化劑(例如NK細胞活化劑)一起培養或基本上由其組成或進一步由其組成，該細胞群體包括下列各項中之一或多者或基本上由其組成或進一步由其組成：NK細胞、能夠衍生NK細胞之祖細胞或能夠衍生NK細胞之幹細胞。在一些實施例中，使用相同或不同之一或多種免疫細胞活化劑(例如NK細胞活化劑)或其組合重複此培養步驟一次、兩次、三次或更多次。在一些實施例中，該細胞群體在細胞群體中耗乏表現CD3、CD4、CD8、T細胞受體(TCR) α鏈、TCR β鏈或αβTCR中之一或多者之細胞。
在一些實施例中，一或多種免疫細胞活化劑(例如NK細胞活化劑)係選自下列各項中之一或多者：人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)及/或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長；一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合NK細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖NK細胞；一或多種由此活化或增殖NK細胞之細胞介素；或一或多種由此活化或增殖NK細胞之化學部分。
在一態樣中，提供製備γδ T細胞群體之方法，該方法包括將包括下列各項中之一或多者之細胞群體與一或多種免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)一起培養或基本上由其組成或進一步由其組成：γδ T細胞、能夠衍生γδ T細胞之祖細胞或能夠衍生γδ T細胞之幹細胞。在一些實施例中，該細胞群體在細胞群體中耗乏表現T細胞受體(TCR) α鏈、TCR β鏈或αβTCR中之一或多者之細胞。在一些實施例中，使用相同或不同之一或多種免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)或其組合重複此培養步驟一次、兩次、三次或更多次。
在一些實施例中，一或多種免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)係選自以下中之一或多者：人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)及/或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長；一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合γδ T細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖γδ T細胞；一或多種由此活化或增殖γδ T細胞之細胞介素；或一或多種由此活化或增殖γδ T細胞之化學部分。
在可涉及本文之任何本發明態樣之一些實施例中，aAPC進一步表現以下各項中之一或多者：4-1BBL、膜結合(mb) IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL (可誘導T細胞共刺激配體、B7H2、B7RP1)、MICA (MHC I類多肽相關序列A)、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25結合之mb IL-2突變體、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之mb IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc; ALT-803)或調介CD122/CD132信號傳導之細胞表面標記物。在一實施例中，aAPC進一步表現mb IL-21及4-1BBL。
在可涉及本文之任何本發明態樣之一些實施例中，細胞介素係選自由以下組成之群：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、缺乏CD25結合之IL-2突變體、IL-7、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803可溶性)、IL-15、IL-18、IL-21、LEC、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)或MICA。在一些實施例中，將細胞群體與100-500 IU/ml IL-2、20 ng/ml IL-15或25 ng/mL IL-21中之任一者或任兩者或所有三者一起培養。在一些實施例中，將細胞群體與50 IU/ml IL-2及0.5 ng/ml IL-15中之任一者或兩者一起培養。在一些實施例中，將細胞群體與50 IU/ml IL-2一起培養。
如本文所揭示之任何方法之一些實施例進一步包括(例如)在一或多個如本文所揭示之培養步驟之前及/或之後將多核苷酸引入經培養細胞群體中以供表現。在一些實施例中，多核苷酸編碼CAR及/或另一治療性蛋白或多肽(例如抗體或其片段、酶、配體或受體)。
如本文所揭示之任何方法之一些實施例進一步包括將假型γ逆轉錄病毒顆粒引入經培養細胞群體中，由此將如本文所揭示之多核苷酸引入經培養細胞中。在一些實施例中，該顆粒包括RD114TR及BaEVTR作為套膜蛋白。在一些實施例中，假型γ逆轉錄病毒顆粒係選自莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒之種類。
如本文所揭示之任何方法之一些實施例進一步包括使用RetroNectin促進包括如本文所揭示多核苷酸之慢病毒或逆轉錄病毒載體(例如如本文所揭示之假型γ逆轉錄病毒顆粒)及擬引入多核苷酸之細胞的共定位。一實例係將RetroNectin塗覆於其中向細胞群體中引入如本文所揭示之多核苷酸之容器之內表面上。RetroNectin係增強慢病毒及逆轉錄病毒調介之基因轉導之63 kD重組人類纖連蛋白片段。其可購自TaKaRa www.takarabio.com/products/gene-function/t-cell-transduction-and-culture/retronectin-reagent，最後訪問時間為2020年9月4日。
另外，提供產生逆轉錄病毒顆粒(例如γ逆轉錄病毒顆粒)之方法。該方法包括以下步驟、基本上由其組成或進一步由其組成：(i)將表現載體基因體之載體引入適於將載體基因體包裝至第一逆轉錄病毒顆粒中之第一包裝細胞系中，(ii)將第一逆轉錄病毒顆粒轉導至適於複製第一逆轉錄病毒顆粒之第二包裝細胞系中；及(iii)分離所複製逆轉錄病毒顆粒。在一些實施例中，該方法進一步包括培養引入載體之第一包裝細胞系。在其他實施例中，該方法進一步包括自引入載體之第一包裝細胞系之培養物分離第一逆轉錄病毒顆粒。另外或替代地，該方法進一步包括培養經轉導第二包裝細胞系。因此，提供藉由該方法產生之逆轉錄病毒顆粒以及所產生逆轉錄病毒顆粒在產生經改造免疫細胞(例如經改造以表現嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞)中之用途。
在可涉及本文之任何本發明態樣之一些實施例中，在引入步驟之前將細胞群體培養至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天或至少約10天。另外或替代地，在引入步驟之前將細胞群體培養不超過7天、不超過8天、不超過9天、不超過10天、不超過11天、不超過12天、不超過13天、不超過14天、不超過15天、不超過3週或不超過1個月。在一實施例中，在引入步驟之前將細胞群體培養約5天至約10天。
在可涉及本文之任何本發明態樣之一些實施例中，細胞群體包括以下中之任一者或多者或基本上由其組成或進一步由其組成：NK細胞、γδ T細胞、幹細胞、造血幹細胞(HSC)、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、衍生自幹細胞、HSC或iPSC中之任一者或多者之NK細胞或衍生自幹細胞、HSC或iPSC中之任一者或多者之γδ T細胞。另外或替代地，細胞群體係分離自個體之臍帶血、個體之周邊血或個體之骨髓。
在一態樣中，提供抑制癌細胞之生長之方法。該方法包括使藉由如本文所揭示之方法製得之CAR表現細胞之群體與癌細胞接觸或基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，由CAR識別之抗原係表現於癌細胞上之TAA。接觸步驟可在活體內或活體外進行。
在另一態樣中，提供治療個體之癌症之方法。該方法包括投與藉由如本文所揭示之方法製得之CAR表現細胞之群體或基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，由CAR識別之抗原係由癌細胞表現之TAA。
在又一態樣中，提供表現抗原及以下細胞表面標記物中之一或多者之經改造aAPC：4-1BBL、膜結合(mb) IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25結合之mb IL-2突變體、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之mb IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc; ALT-803)或調介CD122/CD132信號傳導之細胞表面標記物。
在另一態樣中，提供藉由如本文所揭示之方法製得之NK細胞、γδ T細胞或其任一者或兩者之細胞群體。在一些實施例中，該細胞及/或細胞群體表現CAR及/或另一治療性蛋白或多肽(例如抗體或其片段、酶、配體或受體)。
在一態樣中，提供一種組合物，其包括如本文所揭示之細胞或其群體及載劑、視情況醫藥上可接受之載劑或基本上由其組成或進一步由其組成。
在另一態樣中，提供一種套組，其包括一或多種適用於如本文所揭示之方法中之藥劑及可選說明或基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，藥劑係選自下列各項中之一或多者：編碼CAR或另一治療性蛋白之多核苷酸、包括多核苷酸之載體、用於檢測細胞表型之抗體、用於分離或富集或純化免疫細胞之抗體、用於檢測多核苷酸、細胞介素及aAPC之引子。
在又一態樣中，提供用於產生假型γ逆轉錄病毒顆粒之病毒包裝系統以及產生假型γ逆轉錄病毒顆粒之方法。該系統包括以下各項或基本上由其組成或進一步由其組成：(a)表現載體基因體之質體；(b)包裝質體；及(c)一或多個表現RD114TR及BaEVTR之套膜質體，而該方法包括在適於包裝假型γ逆轉錄病毒顆粒之條件下將該系統引入包裝細胞系中或基本上由其組成或進一步由其組成。
前述一般說明及下列詳細說明係實例性及闡釋性且意欲進一步闡釋所主張之揭示內容。熟習此項技術者根據下列圖式簡單說明及本發明之實施方式易於明瞭其他目標、優點及新穎特徵。
相關申請案之交叉參考
本申請案在35 U.S.C. § 119(e)下主張2020年9月8日提出申請之美國臨時申請案第63/075,651號及2020年9月8日提出申請之第63/075,747號之優先權，每一申請案之內容以全文引用方式併入本申請案中。 定義
應理解，本文所用之章節或子章節標題僅出於組織性目的且不應解釋為限制及/或孤立所闡述標的物。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解相同之含義。儘管任何類似或等效於本文所闡述者之方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但目前所闡述者係較佳之方法、裝置及材料。本文所引用之所有技術及專利公開案之全部內容以引用方式併入本文中。本文中沒有什麼內容應解釋為承認本發明沒有資格早於根據先前發明之此類揭示內容。
除非另外指示，否則本發明實踐將採用熟習此項技術者所熟知之組織培養、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學及重組DNA之習用技術。例如參見Sambrook及Russell編輯，(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版；Ausubel等人編輯，(2007) Current Protocols in Molecular Biology系列；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)系列；MacPherson等人，(1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson等人，(1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow及Lane編輯，(1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique，第5版；Gait編輯，(1984) Oligonucleotide Synthesis，美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編輯，(1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編輯，(1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller及Calos編輯，(1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides編輯，(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer及Walker編輯，(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；Herzenberg等人編輯，(1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002))；Sohail (編輯) (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)。
所有指定數值(例如pH、溫度、時間、濃度及分子量，包含範圍)皆係在適當時變化(+或‑)增量0.1或1.0之近似值。應理解但並不總是明確陳述，所有指定數值之前皆具有術語「約」。亦應理解但並不總是明確陳述，本文所闡述之試劑僅係實例性且該等試劑之等效物為業內所已知。
在提及可量測值(例如量或濃度及諸如此類)時，本文所用之術語「約」意欲涵蓋20%、10%、5%、1%、0.5%或甚至0.1%之指定量變化。
除非上下文明確指示其他含義，否則說明書及申請專利範圍中所用之單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包含複數個指示物。舉例而言，術語「細胞」包含複數個細胞，包含其混合物。
如由熟習此項技術者所理解，出於任何及所有目的，本文所揭示之所有範圍皆亦涵蓋任何及所有可能之其子範圍及子範圍組合。另外，如由熟習此項技術者所理解，範圍包含每一個別成員。
如本文中所使用，術語「包括(comprising或comprises)」意指組合物及方法包含所列舉要素，但不排除其他要素。在使用「基本上由……組成」來定義組合物及方法時，其應意指出於所陳述目的排除對組合有任何本質意義之其他要素。因此，基本上由如本文所定義要素組成之組合物將不自分離及純化方法以及醫藥上可接受之載劑(例如磷酸鹽緩衝鹽水、防腐劑及諸如此類)排除痕量污染物。「由……組成」應意指排除其他成分及用於投與本發明組合物之實質性方法步驟或用以產生組合物或達成預期結果之製程步驟之超過痕量的要素。由該等過渡術語中之每一者定義之實施例皆在本發明範圍內。
「可選(optional)」或「視情況(optionally)」意指，隨後闡述之情況可能發生或可能不發生，從而該說明包含該情況發生之情形及該情況不發生之情形。
如本文中所使用，「及/或」係指且涵蓋所列示相關項目中之一或多者之任何及所有可能組合，且在以替代意義(「或」)詮釋時係指並無組合。
「實質上」或「基本上」意指幾乎全部或完全，例如95%或更大之某一既定量。在一些實施例中，「實質上」或「基本上」意指95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%。
在一些實施例中，組分名稱中之術語「第一」、「第二」、「第三」、「第四」或類似者用於區分及鑑別一種以上在其名稱中共有某一屬性之組分。舉例而言，「第一細胞系」及「第二細胞系」用於區分兩種細胞系。
本文關於核酸(例如DNA或RNA)所用之術語「經分離」係指分別存在於天然大分子來源中之分子與其他DNA或RNA得以分離。術語「經分離核酸」意欲包含呈非天然片段形式且並不以自然狀態發現之核酸片段。術語「經分離」在本文中亦用於係指多肽、蛋白質、病毒及/或宿主細胞與其他細胞蛋白得以分離且意欲涵蓋經純化多肽及重組多肽、蛋白質、病毒及/或宿主細胞。在其他實施例中，術語「經分離」意指意指與在自然界中通常與細胞、組織、多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、病毒、抗體或其片段相關聯之組分、細胞及其他組分分離。舉例而言，經分離細胞係與具有不同表型或基因型之組織或細胞分離之細胞。如熟習此項技術者所明瞭，未必「分離」非天然多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、病毒或抗體或其片段以區分其與其天然對應體。
在一些實施例中，術語「經改造」或「重組」係指具有至少一種通常未發現於天然蛋白質、多肽、多核苷酸、菌株、野生型菌株或所提及物種之親代宿主菌株之修飾。在一些實施例中，術語「經改造」或「重組」係指藉由人為干預來合成。如本文中所使用，術語「重組蛋白」係指藉由重組DNA技術產生之多肽，其中通常將編碼多肽之DNA插入適宜表現載體中，繼而使用該表現載體轉變宿主細胞以產生異源蛋白。
術語「多核苷酸」、「核酸」及「寡核苷酸」可互換使用且係指任何長度之聚合核苷酸形式(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)。多核苷酸可具有任何三維結構，且可實施任何已知或未知功能。下列各項係多核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段(例如探針、引子、EST或SAGE標籤)、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、具支鏈多核苷酸、質體、載體、任何序列之經分離DNA、任何序列之經分離RNA、核酸探針及引子。多核苷酸可包括經修飾核苷酸，例如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。若存在，則可在組裝多核苷酸之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。非核苷酸組分可中斷核苷酸序列。多核苷酸可在聚合後藉由(例如)與標記組分結合來進一步修飾。該術語亦係指雙鏈分子及單鏈分子。除非另外指定或需要，否則本發明之任何多核苷酸實施例涵蓋雙鏈形式及已知或預計構成雙鏈形式之兩種互補單鏈形式中之每一者。
多核苷酸係由以下4種核苷酸鹼基之特定序列構成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；且在多核苷酸係RNA時胸腺嘧啶由尿嘧啶(U)代替。因此，術語「多核苷酸序列」係多核苷酸分子之字母表示。此字母表示可輸入具有中央處理單元之電腦之資料庫中且用於生物資訊學應用(例如功能基因體學及同源性搜索)。
表達「多核苷酸擴增」包含諸如PCR、連接擴增(或連接酶鏈反應，LCR)及擴增方法等方法。該等方法已在業內已知且廣泛實踐。例如參見美國專利第4,683,195號及第4,683,202號以及Innis等人，1990 (關於PCR)；及Wu等人(1989) Genomics 4:560-569 (關於LCR)。一般而言，PCR程序闡述一種基因擴增方法，其包括：(i)使引子序列特異性雜交至DNA試樣(或庫)內之特定基因，(ii)隨後使用DNA聚合酶進行涉及多輪退火、延長及變性之擴增，及(iii)篩選PCR產物以獲得具有適當大小之帶。所用引子係具有足夠長度及適當序列之寡核苷酸以引發聚合，亦即，每一引子經特定設計以與擬擴增基因體基因座之每一鏈互補。
用於實施PCR之試劑及硬體市面有售。可用於擴增來自特定基因區域之序列較佳地與靶區域或其側接區域中之序列互補，且與其特異性雜交。可將藉由擴增生成之核酸序列直接定序。或者，可在序列分析之前選殖經擴增序列。以酶促方式擴增之基因體區段之直接選殖及序列分析之方法為業內所已知。
「基因」係指含有至少一個能夠在轉錄及轉譯之後編碼特定多肽或蛋白質之開放閱讀框(ORF)之多核苷酸。
術語「表現」係指產生基因產物，例如mRNA、肽、多肽或蛋白質。如本文中所使用，「表現」係指將多核苷酸轉錄成mRNA之過程及/或隨後將經轉錄mRNA轉譯成肽、多肽或蛋白質之過程。若多核苷酸源自基因體DNA，則表現可包含在真核細胞中剪接mRNA。
「基因產物」或替代地「基因表現產物」係指在轉錄及轉譯基因時生成之胺基酸(例如肽或多肽)。在一些實施例中，基因產物可係指在轉錄基因時生成之mRNA。
如針對多核苷酸所應用，術語「編碼」係指，若多核苷酸在呈其天然狀態時或在藉由熟習此項技術者熟知之方法操縱時可發生轉錄及/或轉譯以產生多肽及/或其片段之mRNA，則其可視為「編碼」該多肽。反義鏈係此一核酸之補體，且可自其推斷出編碼序列。
「在轉錄控制下」 (其在本文中亦用作「引導表現」)係業內充分理解之術語且指示，多核苷酸序列(通常DNA序列)之轉錄依賴於其操作性連接至有助於開始轉錄或促進轉錄之元件。「操作性連接」意指，多核苷酸係以容許其在細胞中發揮作用之方式進行配置。
本文所用之術語「調控序列」、「表現控制元件」或「啟動子」意指操作性連接至擬轉錄及/或複製之靶多核苷酸且有利於表現及/或複製靶多核苷酸之多核苷酸。啟動子係表現控制元件或調控序列之一實例。啟動子可位於基因或其他多核苷酸之5’端或上游以為經調控基因轉錄提供控制點。聚合酶II及III係啟動子之實例。
本文所用之術語「啟動子」係指任何調控編碼序列(例如基因)之表現之序列。啟動子可為(例如)組成型、誘導型、抑制型或組織特異型。「啟動子」係一種控制序列且係控制轉錄之開始及速率之多核苷酸序列區域。其可含有可結合調控蛋白及分子(例如RNA聚合酶及其他轉錄因子)之基因元件。啟動子之非限制性實例包含EF1α啟動子及CMV啟動子。EF1α序列為業內所已知(例如參見addgene.org/11154/sequences/、ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04617，各自最後一次訪問於2019年3月13日；以及Zheng及Baum (2014) Int’l. J. Med. Sci. 11(5):404-408)。CMV啟動子序列為業內所已知(例如參見snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=CMV_promoter，最後一次訪問於2019年3月13日；以及Zheng及Baum (2014) (見上文))。一實例為：EF1 α啟動子序列：SEQ ID NO: 148及視情況其等效物。
增強子係增加靶序列之表現之調控元件。「啟動子/增強子」係含有能夠提供啟動子功能及增強子功能之序列之多核苷酸。舉例而言，逆轉錄病毒之長末端重複含有啟動子功能及增強子功能。增強子/啟動子可為「內源性」或「外源性」或「異源性」。「內源性」增強子/啟動子係與基因體中之既定基因天然連接者。「外源性」或「異源性」增強子/啟動子係藉助基因操縱(亦即分子生物技術)與基因並置以便該基因之轉錄由所連接增強子/啟動子引導者。
「雜交」係指其中一或多個多核苷酸反應形成複合物之反應，該複合物係經由核苷酸殘基之鹼基之間的氫鍵來穩定。氫鍵結可藉由Watson Crick鹼基配對、Hoogstein結合或以任何其他序列特異性方式來發生。複合物可包括兩條鏈(形成雙螺旋結構)、三條或更多條鏈(形成多鏈複合物)、單一自雜交鏈或其任一組合。雜交反應可構成更廣泛過程中之一個步驟，例如PCR反應之開始，或核酶對多核苷酸之酶裂解。
可在具有不同「嚴格度」之條件下實施雜交反應。一般而言，低嚴格度雜交反應係在約40℃下於10 x SSC或具有等效離子強度/溫度之溶液中來實施。中等嚴格度雜交通常係在約50℃下於6 x SSC中來實施，且高嚴格度雜交反應通常係在約60℃下於1 x SSC中來實施。雜交反應亦可實施於熟習此項技術者熟知之「生理條件」下。生理條件之一非限制性實例係通常發現於細胞中之溫度、離子強度、pH及Mg 2+濃度。
在雜交以反向平行構形發生於兩個單鏈多核苷酸之間，則該反應稱為「退火」且將該等多核苷酸闡述為「互補」。雙鏈多核苷酸可與另一多核苷酸「互補」或「同源」，條件係可在第一多核苷酸之一條鏈與第二多核苷酸之間發生雜交。「互補性」或「同源性」 (一個多核苷酸與另一多核苷酸之互補程度)可根據相對鏈中預計根據公認鹼基配對規則彼此形成氫鍵結之鹼基比例來進行量化。
「同源性」或「一致性」或「類似性」係指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列類似性。可藉由比較各序列中之位置來確定同源性，該等序列可出於對比目的進行比對。在比較序列中之位置由相同鹼基或胺基酸佔據時，分子在該位置處同源。序列間之同源性程度隨序列所共有之匹配或同源位置之數量而變化。「非相關」或「非同源」序列與本發明之一個序列共有小於40%之一致性或替代地小於25%之一致性。
多核苷酸或多核苷酸區(或多肽或多肽區)與另一序列具有某一百分比(例如70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)之「序列一致性」意指，在所比較兩個序列經比對時，該百分比之鹼基(或胺基酸)相同。可使用業內已知之軟體程式(例如闡述於Ausubel等人編輯，(2007) Current Protocols in Molecular Biology中者)來進行此比對及測定同源性或序列一致性百分比。較佳地，使用預設參數進行比對。一種比對程式係使用預設參數之BLAST。特定而言，程式係BLASTN及BLASTP，其使用下列預設參數：遺傳密碼=標準；篩選=無；鏈=兩條；截止值= 60；預期= 10；矩陣= BLOSUM62；說明=50個序列；分類依據=高評分；資料庫=非冗餘，基因庫+ EMBL + DDBJ + PDB + 基因庫CDS轉譯+ SwissProtein + SPupdate + PIR。該等程式之細節可參見下列網際網路地址：www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。在另一實施例中，程式係以下各項中之任一者：可獲得於www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/處之Clustal Omega、可獲得於www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/處之Needle (EMBOSS)、可獲得於www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher/處之Stretcher (EMBOSS)、可獲得於www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/處之Water (EMBOSS)、可獲得於www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/處之Matcher (EMBOSS)、可獲得於www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/處之LALIGN。在其他實施例中，使用預設設置。
在一些實施例中，如本文所揭示之多核苷酸係RNA。在一些實施例中，如本文所揭示之多核苷酸係DNA。在一些實施例中，如本文所揭示之多核苷酸係DNA及RNA之雜合體。
在一些實施例中，參考核酸、多核苷酸或寡核苷酸之等效物編碼由參考編碼之相同序列。在一些實施例中，參考核酸、多核苷酸或寡核苷酸之等效物視情況在高嚴格度條件下雜交至參考、互補參考、反向參考及/或反向互補參考。
另外或替代地，等效核酸、多核苷酸或寡核苷酸係與參考核酸、多核苷酸或寡核苷酸具有至少70%或至少75%或至少80%序列一致性或替代地至少85%序列一致性或替代地至少90%序列一致性或替代地至少92%序列一致性或替代地至少95%序列一致性或替代地至少97%序列一致性或替代地至少98%序列一致性者，或替代地，等效核酸在高嚴格度條件下雜交至參考多核苷酸或其補體。在一態樣中，等效必定編碼視情況可經由本文所闡述之一或多種分析鑑別之功能蛋白。另外或替代地，多核苷酸等效物與參考或母體多核苷酸編碼具有相同或類似功能之蛋白質或多肽。
如針對經改造細胞(例如嵌合抗原受體細胞)之產生所應用，術語「轉導(transduce或transduction)」係指將外來核苷酸序列引入細胞中之過程。在一些實施例中，經由載體(例如病毒載體或非病毒載體)進行此轉導。
如本文中所使用，限制酶係在分子內之特定識別位點(稱為限制位點)處或其附近將DNA裂解成片段之酶。其用於在基因選殖及蛋白質產生實驗期間輔助將多核苷酸(例如基因)插入質體載體中。為達成最佳應用，修飾通常用於基因選殖之質體(例如編碼病毒載體基因體者)以包含富含限制酶識別序列之短聚連接體序列(稱為多選殖位點或MCS)。此在將基因片段插入質體載體中時提供了靈活性；基因內天然含有之限制位點影響了用於消解DNA之內核酸酶之選擇，此乃因在有意切割DNA末端的同時需要避免限制期望DNA。為將基因片段選殖至載體中，通常使用相同限制酶切割質體DNA及基因插入體，且然後藉助稱為DNA連接酶之酶黏合在一起。
術語「蛋白質」、「肽」及「多肽」可互換使用且在其最廣泛意義上係指之兩個或更多個亞單元胺基酸、胺基酸類似物或肽模擬物化合物。該等亞單元可藉由肽鍵連接。在另一實施例中，亞單元可藉由其他鍵(例如酯、醚等)連接。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸且並不限制可構成蛋白質或肽序列之最大胺基酸數量。如本文中所使用，術語「胺基酸」係指天然及/或非天然或合成胺基酸(包含甘胺酸以及D及L光學異構體)、胺基酸類似物及肽模擬物。
如本文中所使用，術語「抗體」共同地係指免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子，包含(舉例而言且但不限於) IgA、IgD、IgE、IgG及IgM、其組合及任何脊椎動物中在免疫反應期間產生之類似分子，該脊椎動物係(例如)哺乳動物(例如人類、山羊、兔及小鼠)以及非哺乳動物物種(例如鯊魚免疫球蛋白)。除非另外具體闡述，否則術語「抗體」包含完整免疫球蛋白及「抗體片段」或「抗原結合片段」，其特異性結合至所關注分子(或一組高度類似之所關注分子)且實質上不結合至其他分子(舉例而言，抗體及抗體片段對所關注分子之結合常數大於對生物試樣中之其他分子之結合常數至少10 3M -1、大於至少10 4M -1或大於至少10 5M -1)。術語「抗體」亦包含基因改造形式，例如嵌合抗體(例如鼠類或人類化非靈長類動物抗體)、異源偶聯抗體(例如雙特異性抗體)。亦參見Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.)；Owen等人，Kuby Immunology，第7版，W.H. Freeman & Co., 2013；Murphy, Janeway’s Immunobiology，第8版，Garland Science, 2014；Male等人，Immunology (Roitt)，第8版，Saunders, 2012；Parham, The Immune System，第4版，Garland Science, 2014。
如本文中所使用，術語「單株抗體」係指藉由單一B淋巴球純系或由已轉染單一抗體之輕鏈及重鏈基因之細胞產生之抗體。單株抗體係藉由熟習此項技術者已知之方法所產生，例如藉由融合骨髓瘤細胞與免疫脾細胞以製備雜合抗體形成細胞。單株抗體包含人類化單株抗體。
就抗體結構而言，免疫球蛋白具有由二硫鍵互連之重(H)鏈及輕(L)鏈。存在以下兩類輕鏈：拉姆達(λ)及卡帕(κ)。存在以下5個決定抗體分子之功能活性之主要重鏈種類(或同型)：IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。每一重鏈及輕鏈含有恆定區及可變區(該等區域亦稱為「結構域」)。重鏈可變區及輕鏈可變區之組合特異性結合抗原。輕鏈可變區及重鏈可變區含有間雜有三個超變區(亦稱為「互補決定區」或「CDR」)之「框架」區。已定義框架區及CDR之範圍(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991，其以引用方式併入本文中)。現在線維護Kabat資料庫。不同輕鏈或重鏈之框架區序列在物種內相對保守。抗體之框架區(亦即組成輕鏈及重鏈之組合框架區)主要採用β摺疊構形且CDR形成環，該等環連結β摺疊結構且在一些情形下形成該β摺疊結構之一部分。因此，框架區用以形成用於藉由鏈間、非共價相互作用使CDR定位於適當定向之架構。
CDR主要負責結合至抗原表位。每一鏈之CDR通常稱為CDR1、CDR2及CDR3 (自N-末端開始依序編號)，且亦通常根據特定CDR所位於之鏈來鑑別(重鏈區標記為CDRH，例如CDRH1、CDRH2及CDRH3；且輕鏈區標記為CDRL，例如CDRL1、CDRL2及CDRL3)。因此，CDRH3係來自發現其之抗體重鏈之可變結構域之CDR3，而CDRL1係來自發現其之抗體輕鏈之可變結構域之CDR1。舉例而言，TNT抗體具有針對TNT相關抗原所特有之V H區及V L區序列，且由此具有特定CDR序列。具有不同特異性(亦即針對不同抗原之不同結合位點)之抗體具有不同CDR。儘管CDR在抗體之間有所變化，但CDR內僅有限數量之胺基酸位置直接參與抗原結合。CDR內之該等位置稱為特異性決定殘基(SDR)。
如本文中所使用，可結晶片段(Fc)區係指抗體之尾部區，其在一些實施例中可用於穩定抗體且視情況與免疫細胞或血小板上之Fc受體相互作用(例如結合)或結合補體蛋白。在一些實施例中，可使用Fc突變體，例如在Fc或其等效物中於對應於人類IgG4 Fc區之位置的位置(例如對於SEQ ID NO: 81而言，相應位置係SEQ ID NO: 81之胺基酸(aa) 16、aa 17及aa 79)處包括人類IgG4 Fc區突變F234A、L235A及N297Q中之一者或兩者或所有三個。
多肽或其各自等效物可在羧基末端後接額外之50個胺基酸或替代地約40個胺基酸或替代地約30個胺基酸或替代地約20個胺基酸或替代地約10個胺基酸或替代地約5個胺基酸或替代地約4或3或2或1個胺基酸。
其等效物包括與CAR具有至少80%胺基酸一致性之多肽或由在高嚴格度條件下雜交至編碼CAR之多核苷酸之補體之多核苷酸編碼的多肽，其中高嚴格度條件包括約55℃至約68℃之培育溫度；約1× SSC至約0.1× SSC之緩衝液濃度；約55%至約75%之甲醯胺濃度；及約1× SSC、0.1× SSC或去離子水之洗滌溶液。
替代實施例包含具有來自其他抗體CDR之適當CDR之LC可變區之一或多個CDR (例如CDR1、CDR2、CDR3)。且包含其各自等效物。因此且作為一實例，來自LC可變區之CDR1及CDR2可與另一抗體LC可變區之CDR3進行組合，且在一些態樣中，可在羧基末端處包含額外之50胺基酸或替代地約40個胺基酸或替代地約30個胺基酸或替代地約20個胺基酸或替代地約10個胺基酸或替代地約5個胺基酸或替代地約4或3或2或1個胺基酸。在另一態樣中，EGFR CAR係WO 2016/164370中所揭示之CAR。
在一態樣中，術語抗體之「等效物」或「生物等效物」意指抗體選擇性結合其表位蛋白或其片段之能力，如藉由ELISA或其他適宜方法所量測。生物等效抗體包含(但不限於)彼等與參考抗體結合至相同表位之抗體、肽、抗體片段、抗體變體、抗體衍生物及抗體模擬物。
未經明確敘述即可推斷且除非另外期望，否則在本發明陳述多肽、蛋白質、多核苷酸或抗體時，該物質之等效物或生物等效物意欲屬本發明範圍內。如本文中所使用，在提及參考蛋白質、抗體、多肽或核酸時，術語「其生物等效物」意欲與「其等效物」同義，且欲指具有最小同源性而仍維持期望結構或功能性者。除非特定地引述於本文中，否則本文所提及之任何多核苷酸、多肽或蛋白質亦考慮包含其等效物。舉例而言，等效物意欲與參考蛋白質、多肽或核酸具有至少約70%同源性或一致性或至少80%同源性或一致性及替代地或至少約85%或替代地至少約90%或替代地至少約95%或替代地98%百分比之同源性或一致性，且展現實質上等效之生物活性。或者，在提及多核苷酸時，其等效物係在嚴格條件下雜交至參考多核苷酸或其補體之多核苷酸。
術語「抗體變體」意欲包含在除小鼠外之物種中產生之抗體。其亦包含含有針對抗體或片段之線性多肽序列之轉譯後修飾之抗體。其進一步涵蓋完全人類抗體。
術語「抗體衍生物」意欲涵蓋結合如上文所定義之表位且係本發明之天然單株抗體之修飾物或衍生物之分子。衍生物包含(但不限於)例如雙特異性抗體、多特異性抗體、異種特異性抗體、三特異性抗體、四特異性抗體、多特異性抗體、二價抗體、嵌合抗體、重組抗體及人類化抗體。
如本文中所使用，術語「特異性結合」意指抗體與抗原之間以至少10 −6M之結合親和力進行接觸。在某些態樣中，抗體以至少約10 −7M及較佳地10 −8M、10 −9M、10 −10M、10 −11M或10 −12M之親和力進行結合。
如本文中所使用，術語「抗原」係指可由特定體液或細胞免疫性之產物(例如抗體分子或T細胞受體)特異性結合之化合物、組合物或物質。抗原可為任何類型之分子，包含(例如)半抗原、簡單中間代謝物、糖(例如寡醣)、脂質及激素以及大分子(例如複合碳水化合物(例如、多醣)、磷脂及蛋白質)。常見抗原類別包含(但不限於)病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物及其他寄生蟲抗原、腫瘤抗原、涉及自體免疫疾病、過敏及移植物排斥之抗原、毒素及其他各種抗原。
在一些實施例中，結合部分(例如抗體、其抗原結合片段或CAR)之抗原可在本文中以以下形式來提供：「抗原」且隨後係結合部分(例如BCMA CAR)，或在抗原前具有「抗」且在抗原後具有結合部分(例如抗BCMA抗體)，或結合部分、隨後「關於」或「針對」且然後係抗原(例如關於CS1之抗體)。
如本文中所使用，術語腫瘤相關抗原(TAA)、癌症抗原、腫瘤抗原、癌症相關抗原及腫瘤相關抗原可在本文中互換使用且係指癌症或腫瘤細胞之抗原性物質。在一些實施例中，TAA呈現於一些腫瘤或癌症細胞上且亦視情況以較低含量呈現於一些正常細胞上。在一些實施例中，TAA僅呈現於腫瘤或癌症細胞上，但並不呈現於正常細胞上。在一些實施例中，TAA係選自G蛋白偶合受體C類家族5成員D (GPRC5D)、B細胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7 (CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生長因子受體(EGFRwt)、表皮生長因子受體變體III (EGFRVIII)、FLT3、CD70、間皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、ERBB2 (Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1 (CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、介白素13受體α 2 (IL13Ra2)、鳥苷醯基環化酶C (GUCY2C)、腫瘤相關醣蛋白-72 (TAG-72)、胸苷激酶1 (TK1)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神經節苷脂G2 (GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮細胞黏附分子前體(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、黏蛋白1 (Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin) B2、纖維母細胞活化蛋白α (FAP)、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、肝配蛋白A型受體2前體(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位切斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、天門冬醯胺內肽酶、HPV E6、E7、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、FCRL5或IGLL1。
如本文中所使用，病毒抗原係指表現於病毒中及/或由病毒基因體編碼之抗原。非限制性實例包含流行性感冒病毒之血球凝集素(HA)及神經胺酸酶(NA)以及COVID-19之刺突蛋白、S1、S2、核衣殼套膜蛋白。
如本文中所使用，術語「抗原結合結構域」係指可特異性結合至抗原靶之任何蛋白質或多肽結構域。
如本文中所使用，提及細胞之術語「自體」係指經分離並輸注回同一個體(接受者或宿主)之細胞。「同種異體」係指非自體細胞。
本文所用之術語「嵌合抗原受體」 (CAR)係指包括以下部分之融合蛋白：能夠結合至抗原之細胞外結構域、衍生自不同於衍生細胞外結構域之多肽的多肽之跨膜結構域及至少一個細胞內結構域。「嵌合抗原受體(CAR)」有時稱為「嵌合受體」、「T體」或「嵌合免疫受體(CIR)」。「能夠結合至抗原之細胞外結構域」意指任何可結合至某一抗原之寡肽或多肽。「細胞內結構域」或「細胞內信號傳導結構域」意指任何已知用作傳輸信號以激活或抑制細胞中之生物過程之結構域之寡肽或多肽。在某些實施例中，除主要信號傳導結構域外，細胞內結構域亦可包括一或多個共刺激信號傳導結構域或者基本上由其組成或進一步包括該等結構域。「跨膜結構域」意指任何已知跨越細胞膜且可用於連接細胞外結構域及信號傳導結構域之寡肽或多肽。嵌合抗原受體可視情況包括「鉸鏈結構域」，該鉸鏈結構域用作細胞外結構域與跨膜結構域之間之連接體。該等結構域之非限制性實例提供於本文中，例如：鉸鏈結構域：IgG1重鏈鉸鏈編碼序列：SEQ ID NO: 112。其他非限制性實例包含業內已知之IgG4鉸鏈區、IgD及CD8結構域。其他例示序列提供於序列表中，例如：跨膜結構域：CD28跨膜區編碼序列：SEQ ID NO: 113；細胞內結構域：4-1BB共刺激信號傳導區編碼序列：SEQ ID NO: 114；細胞內結構域：CD28共刺激信號傳導區編碼序列：SEQ ID NO: 115；及細胞內結構域：CD3 ζ信號傳導區編碼序列：SEQ ID NO: 116。
每一實例性結構域組分之其他實施例包含具有類似生物功能之其他蛋白質，該等蛋白質與由上文所揭示核酸序列編碼之蛋白質共有至少70%或替代地至少80%之胺基酸序列一致性、較佳地90%之序列一致性、更佳地至少95%之序列一致性。另外，該等結構域之非限制性實例提供於本文中。
如本文中所使用，術語「CD8 α鉸鏈結構域」係指與此名稱有關之特定蛋白質片段及任何具有類似生物功能之其他分子，該等其他分子與如本文所展示之CD8 α鉸鏈結構域序列共有至少70%或替代地至少80%之胺基酸序列一致性、較佳地90%之序列一致性、更佳地至少95%之序列一致性。人類、小鼠及其他物種之CD8 α鉸鏈結構域之實例性序列提供於Pinto, R.D.等人(2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177中。與CD8 α鉸鏈結構域有關之序列提供於Pinto, R.D.等人(2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177中。該等序列之非限制性實例包含：人類CD8 α鉸鏈結構域：SEQ ID NO: 117；小鼠CD8 α鉸鏈結構域：SEQ ID NO: 118；及貓CD8 α鉸鏈結構域：SEQ ID NO: 119。
如本文中所使用，術語「CD8 α跨膜結構域」係指與此名稱有關之特定蛋白質片段及任何具有類似生物功能之其他分子，該等其他分子與如本文所展示之CD8 α跨膜結構域序列共有至少70%或替代地至少80%之胺基酸序列一致性、較佳地90%之序列一致性、更佳地至少95%之序列一致性。與人類T細胞表面醣蛋白CD8 α鏈(基因庫登錄號：NP_001759.3)之胺基酸位置183至203或小鼠T細胞表面醣蛋白CD8 α鏈(基因庫登錄號：NP_001074579.1)之胺基酸位置197至217及大鼠T細胞表面醣蛋白CD8 α鏈(基因庫登錄號：NP_ 113726.1)之胺基酸位置190至210有關之片段序列提供了CD8 α跨膜結構域的其他實例性序列。與所列示登錄號中之每一者有關之序列提供如下：人類CD8 α跨膜結構域：SEQ ID NO: 120；小鼠CD8 α跨膜結構域：SEQ ID NO: 121；及大鼠CD8 α跨膜結構域：SEQ ID NO: 122。
如本文中所使用，術語「CD28跨膜結構域」係指與此名稱有關之特定蛋白質片段及任何具有類似生物功能之其他分子，該等分子與如本文所展示之CD28跨膜結構域序列共有至少70%或替代地至少80%之胺基酸序列一致性、至少90%之序列一致性或替代地至少95%之序列一致性。與基因庫登錄號：XM_006712862.2及XM_009444056.1有關之片段序列提供了CD28跨膜結構域之其他非限制性實例序列。與所列示登錄號中之每一者有關之序列提供於本文中。
如本文中所使用，術語「4-1BB共刺激信號傳導區」係指與此名稱有關之特定蛋白質片段及任何具有類似生物功能之其他分子，該等分子與如本文所展示之4-1BB共刺激信號傳導區序列共有至少70%或替代地至少80%之胺基酸序列一致性、較佳地90%之序列一致性、更佳地至少95%之序列一致性。4-1BB共刺激信號傳導區之非限制性實例序列提供於美國公開案20130266551A1中，例如所提供之下述實例性序列：4-1BB共刺激信號傳導區：SEQ ID NO: 123。
如本文中所使用，術語「CD28共刺激信號傳導區」係指與此名稱有關之特定蛋白質片段及任何具有類似生物功能之其他分子，該等分子與本文所展示之CD28共刺激信號傳導區序列共有至少70%或替代地至少80%之胺基酸序列一致性、較佳地90%之序列一致性、更佳地至少95%之序列一致性。CD28共刺激信號傳導結構域之實例性序列提供於以下文獻中：美國專利第5,686,281號；Geiger, T.L.等人，Blood 98: 2364-2371 (2001)；Hombach, A.等人，J Immunol 167: 6123-6131 (2001)；Maher, J.等人，Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002)；Haynes, N.M.等人，J Immunol 169: 5780-5786 (2002)；Haynes, N.M.等人，Blood 100: 3155-3163 (2002)。非限制性實例包含下述CD28序列之殘基114-220：SEQ ID NO: 124及其等效物。
如本文中所使用，術語「ICOS共刺激信號傳導區」係指與此名稱有關之特定蛋白質片段及任何具有類似生物功能之其他分子，該等分子與如本文所展示之ICOS共刺激信號傳導區序列共有至少70%或替代地至少80%之胺基酸序列一致性、較佳地90%之序列一致性、更佳地至少95%之序列一致性。ICOS共刺激信號傳導區之非限制性實例序列提供於美國公開案2015/0017141A1中，實例性多核苷酸序列提供如下：ICOS共刺激信號傳導區編碼序列：SEQ ID NO: 125。
如本文中所使用，術語「OX40共刺激信號傳導區」係指與此名稱有關之特定蛋白質片段及任何具有類似生物功能之其他分子，該等分子與如本文所展示之OX40共刺激信號傳導區序列共有至少70%或替代地至少80%之胺基酸序列一致性或替代地90%之序列一致性或替代地至少95%之序列一致性。OX40共刺激信號傳導區之非限制性實例序列揭示於美國公開案2012/20148552A1中，且包含下文所提供之實例性序列：OX40共刺激信號傳導區編碼序列：ID NO: 126及其等效物。
可使用其他共刺激信號傳導區，例如CD27、CD40、CD40L及/或TLR之彼等。例如參見揭示於美國公開案20160340406A1中者。
如本文中所使用，術語「CD3 ζ信號傳導結構域」係指與此名稱有關之特定蛋白質片段及任何具有類似生物功能之其他分子，該等分子與如本文所展示之CD3 ζ信號傳導結構域序列共有至少70%或替代地至少80%之胺基酸序列一致性、較佳地90%之序列一致性、更佳地至少95%之序列一致性。CD3 ζ信號傳導結構域之非限制性實例序列提供於美國公開案20130266551A1中，例如SEQ ID NO: 3。
本文所用之信號肽(有時稱為信號序列、靶向信號、定位信號、定位序列、轉運肽、前導序列或前導肽)係指存在於大部分前往分泌路徑之新合成蛋白質之N-末端處之短肽(通常長16-30個胺基酸)。在一實施例中，信號肽係分泌信號。
分泌信號意指容許蛋白質自細胞溶質輸出至分泌路徑中之分泌信號肽。蛋白質可展現不同程度之成功分泌且通常某些信號肽在與特定蛋白質配對時可引起較低或較高之程度。在真核生物中，信號肽係由真核細胞之細胞溶質中之信號識別顆粒(SRP)識別之疏水性胺基酸串。在自mRNA-核糖體複合物產生信號肽之後，SRP結合肽且停止蛋白質轉譯。SRP然後將mRNA/核糖體複合物輸送至粗糙內質網中，在此將蛋白質轉譯至內質網之官腔中。信號肽然後自蛋白質裂解以在內質網中產生可溶性或具膜標籤(若跨膜區亦存在)之蛋白質。該等物質為業內所已知且可自供應商(例如Oxford Genetics)購得。
如本文中所使用，可裂解肽亦稱為可裂解連接體，其意指可(例如)由酶裂解之肽。一種包括該可裂解肽之經轉譯多肽可產生兩種最終產物，由此容許表現來自一個開放閱讀框之一個以上多肽。可裂解肽之一實例係自裂解肽，例如2A自裂解肽。2A自裂解肽係一類18-22 aa長之肽，其可誘導裂解細胞中之重組蛋白。在一些實施例中，2A自裂解肽係選自P2A、T2A、E2A、F2A及BmCPV2A。例如參見Wang Y等人，2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Sci Rep. 2015;5:16273 (公開於Nov 5, 2015)。
如本文中所使用，術語「T2A」及「2A肽」可互換使用且係指任何2A肽或其片段、任何2A樣肽或其片段或人工肽，該人工肽包括含有共有多肽基序D-V/I-E-X-N-P-G-P (SEQ ID NO: 177)之相對短肽序列(端視源病毒長約20個胺基酸)中之必需胺基酸，其中X係指任何通常視為自裂解之胺基酸。
「可檢測標記」、「標記」、「可檢測標記物」或「標記物」可互換使用且包含(但不限於)放射性同位素、螢光染料、化學發光化合物、染料及蛋白質(包含酶)。可檢測標記亦可附接至本文所闡述之多核苷酸、多肽、抗體或組合物。
如本文中所使用，術語「標記」或可檢測標記意指直接或間接偶聯至擬檢測組合物以生成「經標記」組合物之直接或間接可檢測之化合物或組合物，例如N-末端組胺酸標籤(N-His)、磁活性同位素(例如 115Sn、 117Sn及 119Sn)、非放射性同位素(例如 13C及 15N)、多核苷酸或蛋白質(例如抗體)。該術語亦包含偶聯至將在表現插入序列時提供信號之多核苷酸之序列，例如綠色螢光蛋白(GFP)及諸如此類。標記可為自身可檢測(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記情形下，標記可催化受質化合物或組合物發生可檢測之化學變化。標記可適用於小規模檢測或更適用於高通量篩選。因此，適宜標記包含(但不限於)磁活性同位素、非放射性同位素、放射性同位素、螢光染料、化學發光化合物、染料及蛋白質(包含酶)。標記可經簡單檢測或其可經量化。簡單檢測之反應通常包括僅證實存在之反應，而經量化之反應通常包括具有可量化(例如可以數值形式報告)值(例如強度、極化及/或其他性質)之反應。在發光或螢光分析中，可直接使用與實際上參與結合之分析組分締合之發光體或螢光團或間接使用與另一組分(例如報告基因或指示劑)締合之發光體或螢光團來生成可檢測反應。產生信號之發光標記之實例包含(但不限於)生物發光及化學發光。可檢測發光反應通常包括發光信號之變化或出現。用於以發光方式標記分析組分之適宜方法及發光體為業內所已知且闡述於(例如) Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (第6版)中。發光探針之實例包含(但不限於)水母素及螢光素酶。
如本文中所使用，術語「免疫偶聯物」包括與第二藥劑(例如細胞毒性劑、可檢測劑、放射性試劑、靶向劑、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、合成抗體、半合成抗體或多特異性抗體)締合或連接之抗體或抗體衍生物。
適宜螢光標記之實例包含(但不限於)螢光素、羅丹明(rhodamine)、四甲基羅丹明、伊紅(eosin)、赤蘚紅(erythrosin)、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀綠(Malacite green)、均二苯乙烯、螢光黃(Lucifer Yellow)、Cascade Blue™及德克薩斯紅(Texas Red)。其他適宜光學染料闡述於Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (第6版)中。
在另一態樣中，螢光標記經官能化以有利於共價附接至存在於細胞或組織之表面中或其上之細胞組分(例如細胞表面標記物)。適宜官能基包含(但不限於)異硫氰酸酯基團、胺基、鹵基乙醯基、馬來醯亞胺、琥珀醯亞胺基酯及磺醯基鹵化物，其皆可用於使螢光標記附接至第二分子。螢光標記之官能基之選擇取決於附接至連接體、試劑、標記物或第二標記劑之位點。
如本文中所使用，純化標記或標記物係指可用於純化標記之偶聯分子或組分之標記，例如表位標籤(包含(但不限於) Myc標籤、人類流行性感冒血球凝集素(HA)標籤、FLAG標籤)、親和標籤(包含(但不限於)麩胱甘肽-S轉移酶(GST)、聚組胺酸(His)標籤、鈣調蛋白結合蛋白(CBP)或麥芽糖結合蛋白(MBP))或螢光標籤。
如本文中所使用，調介CD122/CD132信號傳導之細胞表面標記物係指表現於細胞(例如免疫細胞)上且能夠活化IL2路徑(例如CD122信號傳導路徑及/或CD132信號傳導路徑)之蛋白質或多肽或另一部分。CD122亦稱為介白素-2受體亞單元β，而CD132亦稱為介白素-2受體亞單元γ。介白素2受體(其參與T細胞調介之免疫反應)針對結合介白素2之能力以3種形式存在。低親和力形式係α亞單元之單體(亦稱為CD25)且並不參與信號轉導。中間親和力形式由γ/β亞單元異源二聚體組成，而高親和力形式由α/β/γ亞單元異源三聚體組成。受體之中間親和力形式及高親和力形式皆參與來自介白素2之促有絲分裂信號之受體調介之內吞作用及轉導。該等蛋白質亦形成三種IL-15受體亞單元中之一者，而CD132與其他配體特異性受體配對以引導淋巴球對細胞介素(包含IL4、IL7、IL9及IL21)具有反應。活化受體可增加CD8+效應T細胞之增殖。例如參見Noguch等人，Science. 262 (5141): 1877-80。因此， 調介CD122/CD132信號傳導之細胞表面標記物之非限制性實例包含IL2受體、IL4受體、IL7受體、IL9受體、IL15受體、IL21受體、膜結合性IL2、膜結合性IL4、膜結合性IL7、膜結合性IL9、膜結合性IL15或膜結合性IL21。可使用其他重組蛋白，例如融合至任何跨膜結構域及CD122、CD132、IL2受體、IL4受體、IL7受體、IL9受體、IL15受體或IL21受體之胞質結構域之任何細胞外結構域。
如本文中所使用，介白素(IL)係指最早由白血細胞(白血球)表現之細胞介素。免疫系統之功能主要取決於介白素。大部分介白素係由輔助性CD4 T淋巴球以及經由單核球、巨噬球及內皮細胞合成。其促進了T及B淋巴球以及造血細胞之發育及分化。如本文中所使用，介白素可為自細胞分泌出之可溶性細胞介素及/或表現於細胞表面上之膜結合(mb)細胞介素。熟習此項技術者可轉化細胞介素之可溶性形式及膜結合形式，例如改造細胞介素之跨膜結構域及/或信號肽。
介白素-2 (IL-2)係一種介白素，其係免疫系統中之一類細胞介素信號傳導分子。其係調控負責免疫性之白血細胞(白血球，通常係淋巴球)之活性之15.5-16 kDa蛋白質。在一些實施例中，L-2係人類IL-2。在一些實施例中，IL-2源於其他物種，例如具有XP_517425.1之NCBI參考序列之黑猩猩IL-2。此蛋白質或潛在基因之非限制性實例性序列可參見以下基因卡ID：GC04M122451、HGNC (6001)、NCBI Entrez Gene (3558)、Ensembl (ENSG00000109471)、OMIM® (147680)、UniProtKB/Swiss-Prot (P60568)及Open Targets atform(ENSG00000109471)，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
因此，在一些實施例中，IL-2包括MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO: 178)或基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，IL-2包括SEQ ID NO: 178之胺基酸(aa) 21至aa 153或基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，本文所用之IL-2係野生型IL-2或其等效物。在一些實施例中，本文所用之IL-2係藉由宿主細胞(例如HEK 293細胞或CHO細胞或大腸桿菌(E. coli)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))在活體外產生之重組IL-2。例如參見由Sigma-Aldrich (SRP3085、SRP6170、I7908、I2644、H7041或I17002)及STEMCELL TMTechnologies (78036)出售之人類IL-2。在其他實施例中，IL-2等效物刺激NK細胞之增殖或活化其細胞毒性功能或二者兼有，此顯著類似於野生型IL-2。熟習此項技術者可利用用於評估NK細胞之增殖及細胞毒性功能之分析，例如離體培養及細胞計數(例如參見Choi等人，J Immunother Cancer. 2019 Jul 5;7(1):168)、 51鉻釋放分析(例如參見Dong等人，Cancer Discov. 2019 Oct;9(10):1422-1437. doi: 10.1158/2159-8290. CD-18-1259. Epub 2019 Jul 24)、基於比色量測之細胞毒性分析(例如參見Chava等人，J Vis Exp. 2020 Feb 22;(156):10.3791/60714)或基於流式細胞術之細胞毒性分析(例如參見Kim等人，Front Immunol. 2020 Aug 14;11:1851)。在一些實施例中，IL-2等效物包括野生型IL-2之片段(例如SEQ ID NO: 179之aa 22至aa 153)或基本上由其組成或進一步由其組成。另外或替代地，IL-2等效物包括野生型IL-2或其片段之變體或基本上由其組成或進一步由其組成，該變異係(例如)在N-末端處添加額外甲硫胺酸或具有一或多個下列突變：對應於SEQ ID NO: 178之aa 38之胺基酸殘基視情況突變成甲硫胺酸、對應於SEQ ID NO: 178之aa 39之胺基酸殘基視情況突變成絲胺酸、對應於SEQ ID NO: 178之aa 58之胺基酸殘基視情況突變成丙胺酸或離胺酸、對應於SEQ ID NO: 178之aa 62之胺基酸殘基視情況突變成離胺酸或異白胺酸或丙胺酸或麩醯胺酸、對應於SEQ ID NO: 178之aa 65之胺基酸殘基視情況突變成天門冬醯胺酸或麩胺酸或丙胺酸或精胺酸、對應於SEQ ID NO: 178之aa 82之胺基酸殘基視情況突變成白胺酸或丙胺酸、對應於SEQ ID NO: 178之aa 88之胺基酸殘基視情況突變成纈胺酸、對應於SEQ ID NO: 178之aa 145之胺基酸殘基視情況突變成絲胺酸或丙胺酸或其任何組合。非限制性實例包含由PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 179)組成之阿地介白素(Aldesleukin)、由MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO: 180)組成之替西介白素(Teceleukin)、Neoleukin 2/15 (例如參見Silva等人，Nature. 2019 Jan;565(7738):186-191)以及揭示於US9206243B2或US8012465B2中者。另外或替代地，IL-2等效物包括IL-2衍生物(例如藉由醣基化、乙醯化或磷酸化修飾)或基本上由其組成或進一步由其組成。
介白素-15 (IL-15)係結構類似於介白素-2 (IL-2)之細胞介素。如同IL-2，IL-15結合至由IL-2/IL-15受體β鏈(CD122)及公共γ鏈(γ-C, CD132)構成之複合物且經由該複合物傳導信號。IL-15係在藉由病毒感染後藉由單核吞噬細胞(及一些其他細胞)所分泌。此細胞介素誘導天然殺手細胞之增殖。在一些實施例中，IL-15係人類IL-15。此蛋白質或潛在基因之非限制性實例性序列可參見以下基因卡ID：GC04P141636、HGNC: 5977、NCBI Entrez Gene: 3600、Ensembl: ENSG00000164136、OMIM®: 600554或UniProtKB/Swiss-Prot: P40933，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，IL-15係人類IL-15同種型1。因此，在一些實施例中，IL-15包括MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS  (SEQ ID NO: 181)或基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，IL-15包括SEQ ID NO: 181之胺基酸(aa) 30至aa 162或基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，IL-15係人類IL-15同種型2。因此，在一些實施例中，IL-15包括MVLGTIDLCSCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS  (SEQ ID NO: 182)或基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，IL-15源於其他物種，例如具有UniProtKB參考ID：P48092之恆河猴IL-15。
在一些實施例中，本文所用之IL-15係野生型IL-15或其等效物。在一些實施例中，本文所用之IL-15係由宿主細胞(例如HEK 293細胞或大腸桿菌)在活體外產生之重組IL-15。例如參見藉由Sigma-Aldrich (SRP6293或SRP3077)及STEMCELL TMTechnologies (78031)出售之人類IL-15。在其他實施例中，IL-15等效物刺激NK細胞之增殖或活化其細胞毒性功能或二者兼有，此顯著類似於野生型IL-15。熟習此項技術者可利用用於評估NK細胞之增殖及細胞毒性功能之分析，且闡述於本文中。IL-15等效物之非限制性實例包含揭示於US20190263877A1、US10450359B2及US10537615B2中者。另外或替代地，IL-15等效物包括IL-15衍生物(例如藉由醣基化、乙醯化或磷酸化修飾)或基本上由其組成或進一步由其組成。
介白素-21 (IL-21) (在本文中亦稱為IL-21多肽)係對免疫系統細胞(包含可破壞病毒性感染或癌性細胞之天然殺手(NK)細胞及細胞毒性T細胞)具有強效調控效應之細胞介素。此細胞介素誘導其靶細胞中之細胞分裂/增殖。在一些實施例中，IL-21係人類IL-21。此蛋白質或潛在基因之非限制性實例性序列可參見以下基因卡ID：GC04M122612、HGNC: 6005、NCBI Entrez Gene: 59067、Ensembl: ENSG00000138684、OMIM ®: 605384及UniProtKB/Swiss-Prot: Q9HBE4，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
在其他實施例中，IL-21等效物刺激免疫細胞(例如NK細胞)之增殖或維持其生存力或二者兼有，此顯著類似於野生型IL-21。熟習此項技術者可利用用於評估細胞增殖及生存力之分析，例如離體培養及細胞計數或活/死細胞染色(例如四唑鎓還原分析、刃天青還原分析、蛋白酶生存力標記物分析、ATP分析或活細胞實時分析)。例如參見Choi等人，J Immunother Cancer. 2019 Jul 5;7(1):168；及Riss等人，Cell Viability Assays. 2013年5月1日；Markossian等人編輯，Assay Guidance Manual. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company及the National Center for Advancing Translational Sciences, 2004；可在2021年5月14日訪問之www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/。
CD122係介白素-2之受體且亦稱為介白素2受體亞單元β。此β亞單元參與受體介導之內吞作用且轉導IL2之促有絲分裂信號。其很可能與IL15RA締合，後者參與IL15之嗜中性球吞噬作用刺激。此蛋白質或潛在基因或用於檢測該蛋白質之適宜抗體之非限制性實例性序列可參見以下基因卡ID：GC22M037125、HGNC: 6009、NCBI Entrez Gene: 3560、Ensembl: ENSG00000100385、OMIM®: 146710或UniProtKB/Swiss-Prot: P14784，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
如本文中所使用，所關注序列中「對應於」參考序列中之鑑別位置之胺基酸(aa)或核苷酸(nt)殘基位置係指，在所關注序列與參考序列之間進行序列比對時該殘基位置與所鑑別位置對齊。可利用各種程式實施該等序列比對，例如Clustal Omega及BLAST。
在一些實施例中，術語「載體」意指保留感染及轉導非分裂及/或緩慢分裂性細胞且整合至靶細胞基因體中之能力之重組載體。
「質體」係與染色體DNA分離之染色體外DNA分子，其能夠獨立於染色體DNA進行複製。在許多情形下，其為圓形及雙鏈。質體提供了用於微生物群體內之水平基因轉移之機制且通常在既定環境狀態下提供選擇性優點。質體可攜載抵抗競爭性環境生態區位中之天然抗生素之基因，或替代地所產生蛋白質可在類似情況下用作毒素。可購得用於該等用途之許多質體。將擬複製基因插入含有使細胞抵抗特定抗生素之基因及多選殖位點(MCS或聚連接體)之質體之拷貝中，該多選殖位點係含有若干容許容易地在此位置處插入DNA片段之常用限制位點之較短區域。質體之另一主要用途係製備大量蛋白質。在此情形下，研究者生長含有具有所關注基因之質體之細菌。正如細菌產生蛋白質以賦予其抗生素抗性一樣，其亦可經誘導以自插入基因產生大量蛋白質。此係大量產生基因或其然後代碼之蛋白質之便宜及容易之方式。
「病毒載體」定義為以重組方式產生之病毒或病毒顆粒，其包括擬在活體內 、離體或在活體外遞送至宿主細胞中之多核苷酸。如熟習此項技術者所已知，存在6類病毒。DNA病毒構成I類及II類。RNA病毒及逆轉錄病毒構成剩餘種類。III類病毒具有雙鏈RNA基因體。IV類病毒具有正單鏈RNA基因體，本身用作mRNA V類病毒之該基因體具有用作mRNA合成模板之負單鏈RNA基因體。VI類病毒具有正單鏈RNA基因體，但在複製以及mRNA合成中皆具有DNA中間體。逆轉錄病毒攜載呈RNA形式之其基因資訊；然而，在病毒感染細胞後，RNA被逆轉錄成整合至經感染細胞之基因體DNA中之DNA形式。整合DNA形式稱為前病毒。病毒載體之實例包含逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、α病毒載體及諸如此類。α病毒載體(例如基於塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)之載體及基於辛得比斯病毒(Sindbis virus)之載體)亦已研發用於基因療法及免疫療法中。參見Schlesinger及Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439及Ying等人(1999) Nat. Med. 5(7):823-827。
在若干實施例中，載體係衍生自或基於野生型病毒。在其他實施例中，載體係衍生自或基於野生型腺病毒、腺相關病毒或逆轉錄病毒(例如γ逆轉錄病毒及/或慢病毒)。逆轉錄病毒之實例包含(但不限於)莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)或弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、馬類感染性貧血病毒(EIAV)、猿類免疫缺陷病毒(SIV)及貓類免疫缺陷病毒(FIV)。病毒載體可包括衍生自兩種或更多種不同病毒之組分，且亦可包括合成組分。可操縱載體組分以獲得期望特性，例如靶細胞特異性。
本發明之重組載體可衍生自靈長類動物及非靈長類動物。靈長類動物慢病毒之實例包含人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類獲取免疫缺陷症候群之致病因子(AIDS)及猿類免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒基團包含原型「慢發病毒」維斯那-梅迪病毒(visna/maedi virus) (VMV)以及相關山羊類關節炎-腦炎病毒(CAEV)、馬類感染性貧血病毒(EIAV)及最近闡述之貓類免疫缺陷病毒(FIV)及牛類免疫缺陷病毒(BIV)。先前技術之重組慢病毒載體為業內所已知，例如參見美國專利第6,924,123號、第7,056,699號、第7,419,829號及第7,442,551號，該等專利以引用方式併入本文中。在一些實施例中，慢病毒載體係自我不活化性慢病毒載體。在其他實施例中，慢病毒載體具有缺乏TATA盒之U3區。另外或替代地，慢病毒載體具有缺乏一或多個轉錄因子結合位點之U3區。
逆轉錄病毒(例如γ逆轉錄病毒及/或慢病毒)包括(a)套膜，其包括脂質及醣蛋白；(b)載體基因體，其係遞送至靶細胞中之RNA (通常係在5’端處包括帽且在側接有LTR之3’端處包括聚A尾部之二聚體RNA)；(c)衣殼；及(d)蛋白質，例如蛋白酶。美國專利第6,924,123號揭示，某些逆轉錄病毒序列有利於整合至靶細胞基因體中。此專利教示，每一逆轉錄病毒基因體包括稱為gag、pol及env之基因，該等基因編碼病毒體蛋白質及酶。該等基因在兩端側接有稱為長末端重複(LTR)之區域。LTR負責前病毒整合及轉錄。其亦用作增強子-啟動子序列。換言之，LTR可控制病毒基因之表現。逆轉錄病毒RNA藉助位於病毒基因體之5'端處之psi序列發生衣殼化。LTR自身係可分成三個元件(其稱為U3、R及U5)之相同序列。U3係衍生自RNA之3'端之獨特序列。R係衍生自重複於RNA之兩端之序列，且U5係衍生自RNA之5'端之獨特序列。三個元件之大小可在不同逆轉錄病毒中變化較大。對於病毒基因體而言，聚(A)加成(終止)位點位於右手側LTR中之R與U5之間之邊界處。U3含有前病毒之大部分轉錄控制元件，該等轉錄控制元件包含啟動子及多個對細胞及(在一些情形下)病毒轉錄活化蛋白具有反應之增強子序列。
就結構基因gag、pol及env自身而言，gag編碼病毒之內部結構蛋白。Gag蛋白以蛋白水解方式被處理成成熟蛋白MA (基質)、CA (衣殼)及NC (核衣殼)。pol基因編碼逆轉錄酶(RT)，該逆轉錄酶含有調介基因體複製之DNA聚合酶、相關RNase H及整合酶(IN)。在一些實施例中，該等結構基因中之一或多者係由產生病毒載體之包裝細胞(在本文中亦稱為宿主細胞)提供，而非提供於載體基因體本身中。
為產生病毒載體顆粒，將載體RNA基因體自編碼其之DNA構築體表現於宿主細胞中。藉由表現於宿主細胞中之其他核酸序列(「包裝系統」，其通常包含gag/pol及env基因中之任一者或兩者)反式提供未由載體基因體編碼之顆粒組分。產生病毒載體顆粒所需之序列組可藉由瞬時轉染引入宿主細胞中，或其可整合至宿主細胞基因體中，或其可以混合方式提供。所涉及技術為熟習此項技術者所已知。
γ逆轉錄病毒係逆轉錄病毒科之一個屬且可用於本文之揭示內容中。實例性物種係莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒。γ逆轉錄病毒係直徑介於80-100 nm之間之球形、包膜病毒體。其含有核衣殼、逆轉錄酶、整合酶、衣殼、蛋白酶、套膜及表面單元。核衣殼係病毒顆粒內之核酸蛋白組裝體，且係病毒體之子結構。逆轉錄酶係負責在病毒體複製週期期間將RNA轉變成DNA之酶。整合酶與逆轉錄酶一起用於將RNA轉化成DNA。γ逆轉錄病毒之基因體係大約8.3 kb大小之單鏈RNA (+)基因體。其具有5’帽與3’聚A尾部，且其在5’及3’端含有兩個長末端重複區。該等長末端重複區具有U5、R及U3區以及聚嘌呤區(在3’端)及引子結合位點(在5’端)。典型γ逆轉錄病毒基因體含有gag基因、pol基因及env基因，該等基因於基因療法載體中均可省去。衣殼係病毒顆粒之環繞基因體之蛋白質殼體，其主要功能係保護基因體且將其遞送至宿主細胞中。病毒套膜係環繞病毒衣殼之膜，其係經宿主細胞衍生之脂質雙層。作為基因療法之潛在載體， γ逆轉錄病毒作為慢病毒載體相對於HIV具有一些優點。具體而言，γ逆轉錄包裝系統無需納入與gag、pol或輔助基因之編碼序列重疊之任何序列。例如參見Tobias Maetzig等人，Viruses. 2011 Jun;3(6):677-713. Epub 2011 Jun 3。
如本文中所使用，假型化係產生病毒或病毒載體與外來病毒套膜蛋白之組合之過程。此會產生假型病毒顆粒(亦稱為假病毒)。使用此方法，可使用外來病毒套膜蛋白改變宿主向性或增加或降低病毒顆粒之穩定性。假型顆粒並不攜載用以產生其他病毒套膜蛋白之遺傳物質，從而表型變化不能傳遞至子代病毒顆粒。在一些情形下，不能產生病毒套膜蛋白導致假病毒無法複製。以此方式，可在較低風險環境中研究危險病毒之性質。假型化使得可控制套膜蛋白之表現。常用蛋白質係來自水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)之醣蛋白G (VSV-G)，其調介經由LDL受體之進入。納入假病毒中之套膜蛋白使得病毒易於進入具有相應宿主受體之不同細胞類型中。
逆轉錄病毒使用特定受體來結合及進入細胞；含有RD114之逆轉錄病毒及含有BaEV套膜之逆轉錄病毒皆使用中性胺基酸(aa)轉運蛋白(ASCT2)。RD114 假型病毒載體僅使用鈉依賴性中性胺基酸轉運蛋白(ASCT2)作為其進入受體，而BaEV使用兩種受體 (ASCT1及ASCT2)來進入細胞。IL-15-NK細胞及IL-21-NK細胞中之ASCT1及ASCT2 mRNA皆多於新分離NK且此可能係BaEV係用於NK轉導之較佳逆轉錄病毒假型的原因(Colmartino等人，Front Immunol. 2019 Dec 16;10:2873)。在本文中，申請者研發表現BaEV及RD114套膜之逆轉錄病毒生產細胞系，該細胞系可產生在每一病毒體上具有兩種套膜之病毒，從而有利於藉由訪問靶細胞上之兩種受體來增加轉導效率。
如本文所揭示，使用γ逆轉錄病毒之兩種外來重組套膜蛋白，其係經修飾RD114貓類內源性逆轉錄病毒套膜醣蛋白(RD114TR)及經修飾狒狒套膜醣蛋白(BaEVTR)。人類一級淋巴球之轉導效率取決於用於包被逆轉錄病毒載體之套膜蛋白類型，且活化NK細胞高度表現受體中性胺基酸轉運蛋白A (SLC1A4，其在本文中亦稱為ASCT-1)及中性胺基酸轉運蛋白B(0) (SLC1A5，其在本文中亦稱為ASCT-2)，該等受體係用於進入靶之狒狒套膜醣蛋白(BaEV-TR)。ASCT-2受體係用於進入細胞之貓類內源性逆轉錄病毒套膜醣蛋白(RD114TR)。
本文所用之術語「進入受體」意指在病毒(例如逆轉錄病毒)與細胞之間藉由結合至病毒(例如病毒之套膜醣蛋白)來引起膜融合之受體。在一些實施例中，逆轉錄病毒進入受體ASCT1、ASCT2及Pit1表現於人類造血系統之細胞上。在其他實施例中，ASCT1、ASCT2或Pit1中之任一者或任兩者或任三者表現於經活化及增殖之NK及T細胞上，此大大改良了包括相應套膜醣蛋白之病毒之轉導效率。
丙胺酸/絲胺酸/半胱胺酸/蘇胺酸轉運蛋白1 (ASCT1)亦稱為溶質載體家族1成員4 (SLC1A4)或中性胺基酸轉運蛋白A。在一些實施例中，ASCT1係人類ASCT1。此蛋白質或潛在基因之非限制性實例性序列可參見基因卡ID：GC02P064988、HGNC: 10942、NCBI Entrez Gene: 6509、Ensembl: ENSG00000115902、OMIM®: 600229或UniProtKB/Swiss-Prot: P43007，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
2型鈉依賴性中性胺基酸轉運蛋白(ASCT2)亦稱為溶質載體家族1成員5 (SLC1A5)或中性胺基酸轉運蛋白B(0)。其係RD114/猿類D型逆轉錄病毒受體、狒狒M7病毒受體及RD114病毒受體。在一些實施例中，ASCT2係人類ASCT2。此蛋白質或潛在基因之非限制性實例性序列可參見基因卡ID：GC19M051483、HGNC: 10943、NCBI Entrez Gene: 6510、Ensembl: ENSG00000105281、OMIM®: 109190或UniProtKB/Swiss-Prot: Q15758，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
磷酸轉運蛋白1 (Pit1或PiT-1或PiT1)亦稱為溶質載體家族20成員1 (SLC20A1)或鈉依賴性磷酸轉運蛋白1或長臂猿白血病病毒受體1或白血病病毒受體1同系物。其係使得人類細胞易於由長臂猿白血病病毒、猿類肉瘤相關病毒、貓類白血病病毒子組B及10A1鼠類白血病病毒感染之逆轉錄病毒受體。在一些實施例中，Pit1係人類Pit1。此蛋白質或潛在基因之非限制性實例性序列可參見基因卡ID：GC02P118061、HGNC: 10946、NCBI Entrez Gene: 6574、Ensembl: ENSG00000144136、OMIM®: 137570或UniProtKB/Swiss-Prot: Q8WUM9，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
術語「4-1BBL」、「腫瘤壞死因子超家族成員9」、「TNFSF9」或「4-1BBL多肽」係發現於APC (抗原呈現細胞)上且結合至4-1BB (亦稱為CD137)之2型跨膜醣蛋白受體。4-1BB/4-1BBL複合物屬TNFR:TNF超家族且表現於活化T淋巴球上。在一些實施例中，4-1BBL係人類4-1BBL。此蛋白質或潛在基因之非限制性實例性序列可參見基因卡ID：GC19P006531、HGNC: 11939、NCBI Entrez Gene: 8744、Ensembl: ENSG00000125657、OMIM®: 606182或UniProtKB/Swiss-Prot: P41273，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
CD56 (亦稱為神經細胞黏附分子1 (NCAM))係細胞黏附蛋白及免疫球蛋白超家族成員，其參與發育及分化期間之細胞-細胞相互作用以及細胞-基質相互作用。其已用作NK細胞標記物。例如參見Freud等人，Immunity. 2017 Nov 21;47(5):820-833。此蛋白質或潛在基因或用於檢測蛋白質之適宜抗體之非限制性實例性序列可參見基因卡ID：GC11P112961、HGNC: 7656、NCBI Entrez Gene: 4684、Ensembl: ENSG00000149294、OMIM®: 116930或UniProtKB/Swiss-Prot: P13591，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。在人類中，可區分兩種主要NK細胞子組且其特徵在於黏附分子CD56及低親和力Fc受體CD16 (FcγRIIIa)之不同表現。其通常稱為CD56 bright及CD56 dimNK細胞。CD56 dimNK細胞在周邊血中佔主導地位，而CD56 brightNK細胞構成二級淋巴樣組織(例如淋巴結)及若干器官組織(例如肝、子宮及腎)中之NK細胞之大部分。
本文所提及之蛋白質或潛在基因或用於檢測蛋白質之適宜抗體之非限制性實例性序列可參見公開可用的資料庫，例如可獲得於www.genecards.org/處之基因卡或可獲得於www.uniprot.org/uniprot處之UniProtKB。
在一些實施例中，RD114TR包括RD114醣蛋白之胞外結構域及跨膜結構域及雙嗜性鼠類白血病病毒(MLV-A)醣蛋白之細胞質結構域或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。例如參見Sandrin等人，Blood (2002) 100 (3): 823-832。在一些其他實施例中，RD114TR包括MKLPTGMVILCSLIIVRAGFDDPRKAIALVQKQHGKPCECSGGQVSEAPPNSIQQVTCPGKTAYLMTNQKWKCRVTPKISPSGGELQNCPCNTFQDSMHSSCYTEYRQCRRINKTYYTATLLKIRSGSLNEVQILQNPNQLLQSPCRGSINQPVCWSATAPIHISDGGGPLDTKRVWTVQKRLEQIHKAMTPELQYHPLALPKVRDDLSLDARTFDILNTTFRLLQMSNFSLAQDCWLCLKLGTPTPLAIPTPSLTYSLADSLANASCQIIPPLLVQPMQFSNSSCLSSPFINDTEQIDLGAVTFTNCTSVANVSSPLCALNGSVFLCGNNMAYTYLPQNWTRLCVQASLLPDIDINPGDEPVPIPAIDHYIHRPKRAVQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSHQLISDVQVLSGTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYANKSGIVRNKIRTLQEELQKRRESLATNPLWTGLQGFLPYLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVFNRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPLEYEP (SEQ ID NO: 172)或其等效物或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，BaEVTR包括狒狒套膜醣蛋白(BaEV)之胞外結構域及跨膜結構域及MLV-A醣蛋白之細胞質結構域或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。例如參見Girard-Gagnepain, Blood (2014) 124 (8): 1221-1231。在其他實施例中，BaEVTR包括MGFTTKIIFLYNLVLVYAGFDDPRKAIELVQKRYGRPCDCSGGQVSEPPSDRVSQVTCSGKTAYLMPDQRWKCKSIPKDTSPSGPLQECPCNSYQSSVHSSCYTSYQQCRSGNKTYYTATLLKTQTGGTSDVQVLGSTNKLIQSPCNGIKGQSICWSTTAPIHVSDGGGPLDTTRIKSVQRKLEEIHKALYPELQYHPLAIPKVRDNLMVDAQTLNILNATYNLLLMSN TSLVDDCWLCLKLGPPTPLAIPNFLLSYVTRSSDNISCLIIPPLLVQPMQFSNSSCLFSPSYNSTEEIDLGHVAFSNCTSITNVTGPICAVNGSVFLCGNNMAYTYLPTNWTGLCVLATLLPDIDIIPGDEPVPIPAIDHFIYRPKRAIQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSNQLISDVQILSSTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYVNKSGIVRDKIKTLQEELERRRKDLASNPLWTGLQGLLPYLLPFLGPLLTLLLLLTIGPCIFNRLVQ FVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPLEYEP (SEQ ID NO: 173)或其等效物或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，野生型MLV-A包括MAARSTLSKPPQDKINPWKPLIVMGVLLGVGMAESPHQVFNVTWRVTNLMTGRTANATSLLGTVQDAFPKLYFDLCDLVGEEWDPSDQEPYVGYGCKYPAGRQRTRTFDFYVCPGHTVKSGCGGPGEGYCGKWGCETTGQAYWKPTSSWDLISLKRGNTPWDTGCSKVACGPCYDLSKVSNSFQGATRGGRCNPLVLEFTDAGKKANWDGPKSWGLRLYRTGTDPITMFSLTRQVLNVGPRVPIGPNPVLPDQRLPSSPIEIVPAPQPPSPLNTSYPPSTTSTPSTSPTSPSVPQPPPGTGDRLLALVKGAYQALNLTNPDKTQECWLCLVSGPPYYEGVAVVGTYTNHSTAPANCTATSQHKLTLSEVTGQGLCMGAVPKTHQALCNTTQSAGSGSYYLAAPAGTMWACSTGLTPCLSTTVLNLTTDYCVLVELWPRVIYHSPDYMYGQLEQRTKYKREPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGIGTGTTALIKTQQFEQLHAAIQTDLNEVEKSITNLEKSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYADHTGLVRDSMAKLRERLNQRQKLFETGQGWFEGLFNRSPWFTTLISTIMGPLIVLLLILLFGPCILNRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPLEYEP (SEQ ID NO: 174)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，野生型MLV-A之信號肽包括MAARSTLSKPPQDKINPWKPLIVMGVLLGVGMA (SEQ ID NO: 174之胺基酸(aa) 1至aa 33)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型MLV-A之胞外結構域結構域包括SEQ ID NO: 174之aa 1至aa 599或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型MLV-A之跨膜區包括LISTIMGPLIVLLLILLFGPCIL (SEQ ID NO: 174之aa 600至aa 622)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型MLV-A之細胞質結構域包括NRLVQFVKDRISVVQAL (SEQ ID NO: 174之aa 623至aa 639)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，MLV-A之細胞質結構域野生型包括NRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPLEYEP (SEQ ID NO: 174之aa 623至aa 655)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，在提及蛋白質時，BaEV意指狒狒內源性病毒之套膜醣蛋白。此蛋白質之非限制性實例性序列可參見UniProtKB - P10269或NCBI參考序列：YP_009109691.1，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，野生型BaEV包括MGFTTKIIFLYNLVLVYAGFDDPRKAIELVQKRYGRPCDCSGGQVSEPPSDRVSQVTCSGKTAYLMPDQRWKCKSIPKDTSPSGPLQECPCNSYQSSVHSSCYTSYQQCRSGNKTYYTATLLKTQTGGTSDVQVLGSTNKLIQSPCNGIKGQSICWSTTAPIHVSDGGGPLDTTRIKSVQRKLEEIHKALYPELQYHPLAIPKVRDNLMVDAQTLNILNATYNLLLMSNTSLVDDCWLCLKLGPPTPLAIPNFLLSYVTRSSDNISCLIIPPLLVQPMQFSNSSCLFSPSYNSTEEIDLGHVAFSNCTSITNVTGPICAVNGSVFLCGNNMAYTYLPTNWTGLCVLATLLPDIDIIPGDEPVPIPAIDHFIYRPKRAIQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSNQLISDVQILSSTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYVNKSGIVRDKIKTLQEELERRRKDLASNPLWTGLQGLLPYLLPFLGPLLTLLLLLTIGPCIFNRLTAFINDKLNIIHAMVLTQQYQVLRTDEEAQD (SEQ ID NO: 175)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，野生型BaEV之信號肽包括MGFTTKIIFLYNLVLVYA (SEQ ID NO: 175之胺基酸(aa) 1至aa 18)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型BaEV之胞外結構域結構域包括SEQ ID NO: 175之aa 1至aa 506或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型BaEV之跨膜區包括YLLPFLGPLLTLLLLLTIGPCIF (SEQ ID NO: 175之aa 507至aa 529)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型BaEV之細胞質結構域包括NRLTAFINDKLNIIHAM (SEQ ID NO: 175之aa 530至aa 546)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型BaEV之細胞質結構域包括NRLTAFINDKLNIIHAMVLTQQYQVLRTDEEAQD (SEQ ID NO: 175之aa 530至aa 563)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，在提及蛋白質時，RD114意指RD114逆轉錄病毒之套膜醣蛋白。此蛋白質之非限制性實例性序列可參見基因庫：CAA61093.1、CBI參考序列：YP_001497149.1或基因庫：BAM17308.1，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，野生型RD114包括MKLPTGMVILCSLIIVRAGFDDPRKAIALVQKQHGKPCECSGGQVSEAPPNSIQQVTCPGKTAYLMTNQKWKCRVTPKISPSGGELQNCPCNTFQDSMHSSCYTEYRQCRRINKTYYTATLLKIRSGSLNEVQILQNPNQLLQSPCRGSINQPVCWSATAPIHISDGGGPLDTKRVWTVQKRLEQIHKAMTPELQYHPLALPKVRDDLSLDARTFDILNTTFRLLQMSNFSLAQDCWLCLKLGTPTPLAIPTPSLTYSLADSLANASCQIIPPLLVQPMQFSNSSCLSSPFINDTEQIDLGAVTFTNCTSVANVSSPLCALNGSVFLCGNNMAYTYLPQNWTRLCVQASLLPDIDINPGDEPVPIPAIDHYIHRPKRAVQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSHQLISDVQVLSGTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYANKSGIVRNKIRTLQEELQKRRESLATNPLWTGLQGFLPYLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVFSRLMAFINDRLNVVHAMVLAQQYQALKAEEEAQD (SEQ ID NO: 176)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，野生型RD114之信號肽包括MKLPTGMVILCSLIIVRA (SEQ ID NO: 176之胺基酸(aa) 1至aa 18)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型RD114之胞外結構域結構域包括SEQ ID NO: 176之aa 1至aa 504或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型RD114之胞外結構域結構域包括SEQ ID NO: 176之aa 1至aa 507或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型RD114之跨膜區包括FLPYLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVF (SEQ ID NO: 176之aa 505至aa 530)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型RD114之跨膜區包括YLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVF (SEQ ID NO: 176之aa 508至aa 530)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型RD114之細胞質結構域包括SRLMAFINDRLNVVHAM (SEQ ID NO: 176之aa 531至aa 547)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型RD114之細胞質結構域包括SRLMAFINDRLNVVHAMVLAQQYQALKAEEEAQD (SEQ ID NO: 176之aa 531至aa 564)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，在提及蛋白質時，GALV意指長臂猿白血病病毒套膜醣蛋白之套膜醣蛋白。此蛋白質之非限制性實例性序列可參見UniProtKB - P21415 (ENV_GALV)，其全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，野生型GALV包括MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKWDQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLLSTIAGPLLLLLLLLILGPCIINKLVQFINDRISAVKILVLRQKYQALENEGNL (SEQ ID NO: 183)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型GALV包括SEQ ID NO: 183之aa 42至aa 685或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，GALV之信號肽野生型包括SEQ ID NO: 183之aa 1至aa 41或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型GALV之胞外結構域包括SEQ ID NO: 183之aa 1至aa 489或SEQ ID NO: 183之aa 42至aa 489或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型GALV之跨膜區包括SEQ ID NO: 183之aa 490至aa 670或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，野生型GALV之細胞質結構域包括SEQ ID NO: 183之aa 671至aa 685或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。
如本文中所使用，感染複數(MOI)係指在感染期間添加至每一細胞中之病毒顆粒數。
RetroNectin試劑係增強慢病毒及逆轉錄病毒調介之基因轉導之效率之63 kD重組人類纖連蛋白片段(亦稱為rFN-CH-296)。此對於造血細胞及其他難以轉染之細胞類型尤其重要。據信，轉導增強係源於病毒顆粒及靶細胞之共定位。此係藉由使病毒顆粒直接結合至肝素結合結構域中之序列且使靶細胞整聯蛋白與rFN-CH-296中之兩個其他結構域相互作用來達成。RetroNectin可高度有效地用於表現整聯蛋白中之整聯蛋白α4β1 (VLA-4)及/或整聯蛋白α5β1 (VLA-5)之細胞。VLA-4表現細胞包含T細胞、B細胞、單核球、NK細胞、嗜酸性球、骨髓單核球細胞及淋巴樣祖細胞。胸腺細胞、活化T細胞及肥大細胞表現VLA-5。
在基因轉移係由慢病毒載體調介之態樣中，載體構築體係指包括慢病毒基因體或其部分及治療基因之多核苷酸。如本文中所使用，「慢病毒調介之基因轉移」或「慢病毒轉導」涵蓋相同含義，且係指藉助進入細胞且將其基因體整合至宿主細胞基因體中之病毒將基因或核酸序列穩定轉移至宿主細胞中之過程。病毒可經由其正常感染機制進入宿主細胞或經修飾以便其結合至不同宿主細胞表面受體或配體以進入細胞。逆轉錄病毒攜載呈RNA形式之其基因資訊；然而，一旦病毒感染細胞，RNA即逆轉錄成DNA形式且整合至經感染細胞之基因體DNA中。經整合DNA形式稱為前病毒。如本文中所使用，慢病毒載體係指能夠經由病毒或病毒樣進入機制將外源核酸引入細胞中之病毒顆粒。「慢病毒載體」係業內熟知之一類逆轉錄病毒載體，其在轉導非分裂細胞方面與其他逆轉錄病毒載體相比具有某些優點。參見Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelberg。
本發明之慢病毒載體係基於或衍生自致癌逆轉錄病毒(含有MLV之逆轉錄病毒之子組)及慢病毒(含有HIV之逆轉錄病毒之子組)。實例包含ASLV、SNV及RSV，其皆分成用於慢病毒載體顆粒產生系統之包裝組分及載體組分。本發明之慢病毒載體顆粒可基於特定逆轉錄病毒之基因或其他(例如藉由特定選擇包裝細胞系統)改變形式。
本文所用之術語「腺相關病毒」或「AAV」係指與此名稱有關且屬小病毒科(Parvoviridae)科之依賴性小病毒屬之病毒種類之成員。已知此病毒之多種血清型適用於基因遞送；所有已知血清型皆可感染來自各種組織類型之細胞。至少11種依序編號之AAV血清型為業內所已知。可用於本文所揭示之方法中之非限制性實例性血清型包含11種血清型中之任一者，例如AAV2、AAV8、AAV9或變異或合成血清型(例如AAV-DJ及AAV PHP.B)。AAV顆粒包括三種主要病毒蛋白：VP1、VP2及VP3、替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一實施例中，AAV係指血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV PHP.B或AAV rh74。該等載體市面有售或已闡述於專利或技術文獻中。
本發明之載體顆粒係「基於」特定逆轉錄病毒意指，載體係衍生自該特定逆轉錄病毒。載體顆粒之基因體包括來自該逆轉錄病毒之組分作為骨架。載體顆粒含有與RNA基因體相容之必需載體組分，包含逆轉錄及整合系統。通常，該等組分包含衍生自特定逆轉錄病毒之gag蛋白及pol蛋白。因此，載體顆粒之大部分結構組分通常衍生自該逆轉錄病毒，但其可已經基因改變或以其他方式改變以提供期望有用性質。然而，某些結構組分及尤其env蛋白可源自不同病毒。可藉由使用載體顆粒產生系統中之不同env基因賦予載體顆粒不同特異性來改變所感染或轉導之載體宿主範圍及細胞類型。
如本文中所使用，細胞可為原核或真核細胞。在其他實施例中，細胞係免疫細胞。
如本文中所使用，「免疫細胞」包含(例如)可衍生自骨髓中所產生造血幹細胞(HSC)之白血細胞(白血球，例如顆粒球(嗜中性球、嗜酸性球及嗜鹼性球)、單核球及淋巴球(T細胞、B細胞、天然殺手(NK)細胞及NKT細胞))、淋巴球(T細胞、B細胞、天然殺手(NK)細胞及NKT細胞)及骨髓樣衍生的細胞(嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、單核球、巨噬球、樹突狀細胞)。在一些實施例中，免疫細胞係衍生自下列各項中之一或多者：祖細胞、胚胎幹細胞、胚胎幹細胞衍生的細胞、胚胎生殖細胞、胚胎生殖細胞衍生的細胞、幹細胞、幹細胞衍生的細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)或永生化細胞。在一些實施例中，HSC係衍生自個體臍帶血、個體周邊血或個體骨髓。
「宿主細胞」不僅係指特定受試細胞，但係指此一細胞之子代或潛在子代。由於突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，因此，此子代實際上可能與母細胞不同但卻仍包含於本文所用術語之範圍內。
「包裝細胞」係指藉由使用異源核苷酸序列穩定或瞬時轉染或轉導而具有包括病毒輔助構體之核酸分子之宿主細胞，其中該構築體能夠穩定或瞬時表現可經反式提供以用於產生病毒顆粒之包裝功能體(例如複製及衣殼化所需之蛋白質)。病毒輔助功能體之表現可為組成型或誘導型，例如在輔助功能體處於可誘導啟動子之控制下時。
細胞之「富集群體」意指具有某些指定特性之實質上均質之細胞群體。細胞之指定特性之相同度大於70%或替代地大於75%或替代地大於80%或替代地大於85%或替代地大於90%或替代地大於95%或替代地大於98%。
術語「繁殖」意指生長細胞或細胞群體。術語「生長」亦係指細胞在支持培養基、營養物、生長因子、支持細胞或獲得期望數量之細胞或細胞類型所需之任何化學或生物化合物存在下之增殖。
術語「培養」係指細胞或生物體在各種培養基上或其中之活體外繁殖。應理解，培養生長之細胞之後代可能與親代細胞不完全相同(亦即在形態上、在基因上或在表型上)。
未修飾細胞有時稱為「源細胞」或「源幹細胞」。細胞可為原核或真核細胞，且包含(但不限於)細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞及哺乳動物細胞(例如貓類、犬類、馬類、鼠類、大鼠、猿類、牛類、豬類及人類之細胞)。
在一實施例中，「不成熟細胞」係指未擁有期望(成熟)表型或基因型之細胞。舉例而言，在一實施例中，成熟細胞係經代替之細胞。可對不成熟細胞實施將細胞之表型或基因型變化、引發(變化)或改變成「成熟細胞」之技術，包含物理、生物或化學製程。「成熟細胞」係指擁有期望表型或基因型之細胞。
如本文中所使用，術語「NK細胞」 (亦稱為天然殺手細胞)係指源於骨髓中且在先天性免疫系統中發揮關鍵作用之一類淋巴球。NK細胞針對病毒感染細胞、腫瘤細胞或其他受應細胞提供快速免疫反應，甚至在細胞表面上不存在抗體及主要組織相容性複合物下。NK細胞可自市售來源分離或獲得。商業NK細胞系之非限制性實例包含細胞系NK-92 (ATCC® CRL-2407™)、NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)。其他實例包含(但不限於) NK細胞系HANK1、KHYG-1、NKL、NK-YS、NOI-90及YT。該等市售細胞系之非限制性實例性來源包含美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)或ATCC (www.atcc.org/)及德國微生物及細胞培養物保藏所(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (www.dsmz.de/)。
如本文中所使用，細胞(例如NK細胞、NKT細胞、細胞毒性T細胞或γδ T細胞)之功效包括細胞之細胞毒性(例如在殺死靶細胞方面)及/或細胞之細胞介素釋放(例如IFN-γ，在本文中亦稱為IFNγ或IFN-伽馬)。
天然抗原呈現細胞(APC)係指藉由處理及呈現抗原以用於由某些淋巴球(例如T細胞、經典APC (包含樹突狀細胞)、巨噬球、朗格漢斯細胞(Langerhans cell)及B細胞)識別來調介細胞免疫反應之免疫細胞。如本文中所使用，人工抗原呈現細胞(aAPC)係該等APC之合成形式且藉由將特定免疫細胞(例如T細胞及/或NK細胞)刺激信號附著至各種宏觀及微觀生物相容表面及/或細胞上來製得。此可潛在地減小成本，且同時可控制生成大量用於療法之功能性病原體特異性免疫細胞。
術語「幹細胞」係指處於未分化或部分分化狀態且能夠自我更新及/或生成經分化子代之細胞。自我更新定義為幹細胞能夠增殖且產生更多該等幹細胞，且同時維持其發育潛力(亦即全能、多潛能、多能等)。術語「體幹細胞」在本文中用於係指衍生自非胚胎組織(包含胎兒、幼年及成人組織)之任何幹細胞。已自眾多種成人組織(包含血液、骨髓、腦、嗅上皮、皮膚、胰臟、骨骼肌及心肌)分離出天然體幹細胞。實例性天然體幹細胞包含(但不限於)間質幹細胞(MSC)及神經或神經元幹細胞(NSC)。在一些實施例中，幹細胞祖細胞可為胚胎幹細胞或誘導性多潛能幹細胞(iPSC)。如本文中所使用，「胚胎幹細胞」係指衍生自形成於受精之後但在懷孕結束之前之組織之幹細胞，該組織包含在懷孕期間(通常但未必在大約懷孕10-12週之前)之任何時間獲取之胚胎前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織。最通常地，胚胎幹細胞係衍生自早期胚胎或胚泡之多潛能細胞。胚胎幹細胞可自適宜組織(包含(但不限於)人類組織)或自所確立胚胎細胞系直接獲得。「胚胎樣幹細胞」係指共有胚胎幹細胞之一或多種(但未必所有)特性之細胞。
「分化」闡述非特殊細胞獲得特殊細胞(例如心臟細胞、肝細胞或肌肉細胞)之特徵之過程。「定向分化」係指操縱幹細胞培養條件以誘導分化成特定細胞類型。「去分化」定義恢復至細胞譜系內之較小定向性位置之細胞。如本文中所使用，術語「分化或經分化」定義呈現於細胞譜系內之較大定向性(「經分化」)位置上之細胞。如本文中所使用，「分化成中胚層(或外胚層或內胚層)譜系之細胞」定義分別隸屬於特定中胚層、外胚層或內胚層譜系之細胞。分化成中胚層譜系或產生特定中胚層細胞之細胞之實例包含(但不限於)脂肪原性細胞、平滑筋原性細胞、軟骨原性細胞、心原性細胞、皮原性細胞、造血細胞、血管形成細胞、肌原性細胞、腎原性細胞、生殖器原性細胞、骨原性細胞、心包原性細胞或基質細胞。
如本文中所使用，術語「分化或經分化」定義呈現於細胞譜系內之較大定向性(「經分化」)位置上之細胞。「去分化」定義恢復至細胞譜系內之較小定向性位置之細胞。誘導性多潛能幹細胞係去分化細胞之實例。
在一些實施例中，衍生自第二細胞之第一細胞係指自第二細胞分化之第一細胞。另外或替代地，衍生自第二細胞之第一細胞係指自第二細胞改造之第一細胞。
如本文中所使用，細胞之「譜系」定義細胞之遺傳性，亦即其前輩及子代。細胞譜系將細胞置於發育及分化之遺傳方案內。
「多譜系幹細胞」或「多能幹細胞」係指繁殖本身及至少兩種來自不同發育譜系之進一步分化之子代細胞之幹細胞。該等譜系可來自相同胚層(亦即中胚層、外胚層或內胚層)或來自不同胚層。來自多譜系幹細胞分化之具有不同發育譜系之兩種子代細胞之一實例係肌原性細胞及脂肪原性細胞(皆源自中胚層，但產生不同組織)。另一實例係神經原性細胞(外胚層來源)及脂肪原性細胞(中胚層來源)。
「前體」或「祖細胞」欲指能夠分化成特定類型之細胞的細胞。祖細胞可為幹細胞。祖細胞亦可比幹細胞更具特異性。祖細胞可為單能或多能的。與成熟幹細胞相比，祖細胞可處於細胞分化之後期中。祖細胞之一實例包含(但不限於)祖神經細胞。
如本文中所使用，「多潛能細胞」定義可產生至少兩種不同(在基因型上及/或在表型上)之進一步分化之子代細胞之較小分化性細胞。在另一態樣中，「多潛能細胞」包含誘導性多潛能幹細胞(iPSC)，後者係來自非多潛能細胞(通常係成熟體細胞)之人工衍生性幹細胞，該非多潛能細胞在過去已藉由誘導表現一或多種幹細胞特異性基因來產生。該等幹細胞特異性基因包含(但不限於)八聚體轉錄因子家族，亦即Oct-3/4； Sox基因家族，亦即Sox1、Sox2、Sox3、Sox 15及Sox 18；Klf基因家族，亦即Klf1、Klf2、Klf4及Klf5； Myc基因家族，亦即c-myc及L-myc； Nanog基因家族，亦即OCT4、NANOG及REX1；或LIN28。iPSC之實例闡述於以下文獻中：Takahashi等人(2007) Cell advance online publication，2007年11月20日；Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663-76；Okita等人(2007) Nature 448:260-262；Yu等人(2007) Science advance online publication，2007年11月20日；及Nakagawa等人(2007) Nat. Biotechnol. Advance online publication，2007年11月30日。
「類胚胎體或EB」係在培養期間所形成促進後續分化之三維(3D)胚胎幹細胞聚集體。在以懸浮培養方式生長時，EB細胞形成由內臟內胚層之外層環繞之小細胞聚集體。在生長及分化時，EB發育成充滿液體之空腔及外胚層樣細胞內層之囊狀類胚胎體。
「誘導性多潛能細胞」意指自成熟細胞再程式化成不成熟表型之胚胎樣細胞。業內已知各種方法，例如「A simple new way to induce pluripotency: Acid.」 Nature，2014年1月29日(且可獲得於sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445處，最後一次訪問於2014年2月5日)及美國專利申請案公開案第2010/0041054號。人類iPSC亦表現幹細胞標記物且能夠生成所有三種胚層之特徵性細胞 。
「孤雌生殖幹細胞」係指源自孤雌生殖卵活化之幹細胞。產生孤雌生殖幹細胞之方法為業內所已知。例如參見Cibelli等人(2002) Science 295(5556):819及Vrana等人(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(增刊)11911-6。
如本文中所使用，術語「多潛能基因或標記物」意指與不成熟或未分化表型相關之經表現基因或蛋白質，例如Oct ¾、Sox2、Nanog、c-Myc及LIN-28。用以業內已知鑑別該等物種之方法且用以鑑別該等物種之系統可購自(例如) EMD Millipore (MILLIPLEX® Map套組)。
術語「表型」闡述可量測且僅表現於群體內之個體子組中之個體特性或特性。在本發明之一態樣中，個體表型包含單細胞、實質上均質之細胞群體、分化細胞群體或包括細胞群體之組織之表型。
在一些實施例中，細胞群體意指一種以上在表型及/或基因型上相同(純系)或不相同之細胞之集合體。群體可為純化、高度純化、實質上均質或異質的，如本文所闡述。
術語有效時段(或時間)及有效條件係指使藥劑或組合物達成其預期結果(例如將細胞分化或去分化成預定細胞類型)之所需或較佳時間段或其他可控條件(例如用於活體外方法之溫度、濕度)。
「實質上均質」闡述其中高於約50%或替代地高於約60%或替代地高於70%或替代地高於75%或替代地高於80%或替代地高於85%或替代地高於90%或替代地高於95%之細胞屬相同或類似表型之細胞群體。可藉由預選細胞表面標記物或其他標記物來測定表型。
如本文中所使用，術語「耗乏」係指實質上缺乏。舉例而言，耗乏CD3+細胞之細胞群體係指包括小於約0.1%、小於約0.2%、小於約0.3%、小於約0.4%、小於約0.5%、小於約0.6%、小於約0.7%、小於約0.8%、小於約0.9%、小於約1.0%、小於約1.1%、小於約1.2%、小於約1.3%、小於約1.4%、小於約1.5%、小於約1.6%、小於約1.7%、小於約1.8%、小於約1.9%或小於約2.0%之CD3+細胞之細胞群體。
術語「可接受」、「有效」或「足以」在用於闡述本文所揭示之任何組分、範圍、劑型等選擇之時欲指，該組分、範圍、劑型等適用於所揭示目的。
如本文中所使用，術語「治療(treating、treatment)」及諸如此類在本文中用於意指獲得期望藥理學及/或生理學效應。在一些實施例中，效應可為防治性(關於完全或部分預防病症或其體徵或症狀)，及/或可為治療性(關於部分或完全治癒病症及/或可歸因於病症之不良效應)。「治療」之實例包含(但不限於)：預防病症發生於可易患病症但尚未診斷為患有該病症之個體中；抑制病症，亦即阻止其發生；及/或減輕或改善病症症狀。在一態樣中，治療係阻止發生疾病或病症(例如癌症)之症狀。在一些實施例中，其係指(1)預防症狀或疾病發生於易患疾病或尚未顯示其症狀之個體中；(2)抑制疾病或阻止其發生；或(3)改善疾病或疾病症狀或使其消退。如業內所理解，「治療」係獲得有益或期望結果(包含臨床結果)之方式。出於本發明技術之目的，有益或期望結果可包含以下各項中之一或多者(但不限於此)：緩解或改善一或多種症狀、減弱病狀(包含疾病)之程度、穩定(亦即不惡化)病狀(包含疾病)之狀態、延遲或減緩病狀(包含疾病)之進展、改善或緩解病狀(包含疾病)狀態及緩解(不論部分抑或完全)，不論該等結果可檢測抑或不可檢測。在疾病係癌症時，下列臨床終點係治療之非限制性實例：腫瘤負荷減小、腫瘤生長減緩、整體存活期較長、腫瘤進展時間較長、轉移抑制或腫瘤轉移減少。在一態樣中，治療不包含防治。在一態樣中，治療不包含防治。
如本文中所使用，治療性蛋白或多肽係指適用於治療之蛋白質及/或多肽，包含(但不限於)抗體或其片段、酶、配體或受體。該治療性蛋白或多肽可由醫師或熟習此項技術者基於擬治療疾病來進行選擇。舉例而言，為治療癌症，可使用免疫檢查點受體或其配體之抗體，例如抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體。
在一實施例中，本文所用之術語「疾病」或「病症」係指癌症、經診斷患有癌症之狀態、懷疑患有癌症之狀態或處於患有癌症之高風險下之狀態。
如本文中所使用，「癌症」係特徵在於在個體中存在顯示異常不受控複製之細胞之疾病狀態，且在一些態樣中該術語可與術語「腫瘤」互換使用。術語「癌症或腫瘤抗原」係指已知與癌細胞或腫瘤細胞或組織締合相關且表現於其表面上之抗原，且術語「癌症或腫瘤靶向抗體」係指靶向此一抗原之抗體。
「實體腫瘤」係通常不含囊腫或液體區域之異常組織塊。實體腫瘤可為良性或惡性、轉移性或非轉移性。不同類型之實體腫瘤係針對形成其之細胞類型來命名。實體腫瘤之實例包含肉瘤、癌及淋巴瘤。
「組合物」欲指活性劑及另一惰性(例如可檢測試劑或標記)或活性化合物或成分(例如佐劑 、稀釋劑、黏合劑、穩定劑、緩衝劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑或諸如此類且包含醫藥上可接受之載劑)之組合。
載劑亦包含以下醫藥賦形劑及添加劑：蛋白質、肽、胺基酸、脂質及碳水化合物(例如糖，包含單醣、二醣、三醣、四醣及寡醣；衍生糖，例如醛醣醇、醛醣酸、酯化糖及諸如此類；及多醣或糖聚合物)，其可單獨或組合存在且單獨或組合地佔1-99.99重量或體積%。實例性蛋白質賦形劑包含血清白蛋白(例如人類血清白蛋白(HSA))、重組人類白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白及諸如此類。亦可實施緩衝能力之代表性胺基酸/抗體組分包含丙胺酸、精胺酸、甘胺酸、精胺酸、甜菜鹼、組胺酸、麩胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、離胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、阿斯巴甜(aspartame)及諸如此類。碳水化合物賦形劑亦意欲屬此技術之範圍內，其實例包含(但不限於)單醣，例如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖及諸如此類；二醣，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二醣及諸如此類；多醣，例如棉子糖、蜜三糖、麥芽糊精、右旋糖酐、澱粉及諸如此類；及醛醣醇，例如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(山梨醇)及肌醇。
「醫藥組合物」意欲包含活性多肽、多核苷酸或抗體與惰性或活性載劑(例如固體載體)之組合，該載劑使得該組合物適用於活體外、活體內或離體之診斷或治療性應用。
如本文中所使用，術語「醫藥上可接受之載劑」涵蓋任一標準醫藥載劑，例如磷酸鹽緩衝之鹽水溶液、水及乳液(例如油/水或水/油型乳液)及各種類型之潤濕劑。組合物亦可包含穩定劑及防腐劑。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見Martin (1975) Remington’s Pharm. Sci.，第15版(Mack Publ. Co., Easton)。術語醫藥上可接受之載劑(或介質) (其可與術語生物相容性載劑或介質互換使用)係指如下試劑、細胞、化合物、材料、組合物及/或劑型：其不僅與擬治療性投與之細胞及其他藥劑相容，且亦在合理醫學判斷範圍內適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏性反應或其他併發症，並與合理益處/風險比相稱。適用於本發明中之醫藥上可接受之載劑包含液體、半固體(例如凝膠)及固體材料(例如細胞架構及基質、管狀體、片材及如業內已知且更詳細闡述於本文中之其他此類材料)。該等半固體及固體材料可經設計以防止降解於身體內(非生物可降解)或其可經設計以降解於身體內(生物可降解、生物可蝕)。生物可降解材料可進一步為生物可再吸收或生物可吸收的，亦即，其可溶解及吸收至體液(水溶性植入體係一實例)，或在身體中降解且最終消除(藉由轉化成其他材料或經由天然路徑分解且消除)。
「醫藥上可接受之載劑」係指可用於本文所揭示之組合物中之任何稀釋劑、賦形劑或載劑。醫藥上可接受之載劑包含離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(例如人類血清白蛋白)、緩衝物質(例如磷酸鹽)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠狀二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯基吡咯啶酮、基於纖維素的物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇及羊毛脂。適宜醫藥載劑闡述於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company中，該文獻係此領域中之標準參考文獻。其可根據預期投與形式(亦即口服錠劑、膠囊、酏劑、糖漿及諸如此類)進行選擇，且應與習用醫藥實踐一致。
用於本發明之組合物可包裝成劑量單位形式以便於投與且達成劑量均勻性。術語「單位劑量」或「劑型」係指適用於個體中之物理離散單位，每一單位含有預定量之組合物，該預定量經計算以產生與投與(亦即適當途徑及方案)有關之期望反應。擬投與量(根據治療數量及單位劑量)取決於期望之結果及/或保護。組合物之精確量亦取決於從業人員之判斷且對於每一個體而言係獨特的。影響劑量之因素包含個體之身體及臨床狀態、投與途徑、預期治療目標(緩解症狀對固化)以及特定組合物之功效、穩定性及毒性。在調配後，以與劑量調配物相容之方式且以治療或防治有效量來投與溶液。調配物易於以各種劑型來投與，例如本文所闡述之可注射溶液之類型。
如本文中所使用，術語「接觸」意指兩種或更多種分子之間之直接或間接結合或相互作用。直接相互作用之特定實例係結合。間接相互作用之特定實例係其中一種實體作用於中間分子且該中間分子繼而作用於第二提及實體。本文所用之接觸包含於溶液中、固相中、活體外、離體、細胞中及活體內。活體內接觸可稱為投與(administering或administration)。
細胞或載體或其他藥劑及含有其之組合物之「投與」或「遞送」可以一個劑量連續或間歇性地實施於整個治療過程中。測定最有效投與方式及劑量之方法為熟習此項技術者所已知，且將隨用於療法之組合物、療法目的、所治療靶細胞及所治療個體而變化。可使用由治療醫師或(在動物情形下)由治療獸醫選擇之劑量值及圖案來實施單一或多個投與。適宜劑量調配物及藥劑投與方法為業內所已知。亦可確定投與途徑，且確定最有效投與途徑之方法為熟習此項技術者所已知並將隨用於治療之組合物、治療目的、所治療個體之健康狀況或疾病階段及靶細胞或組織而變化。投與途徑之非限制性實例包含經口投與、腹膜腔內投與、輸注、經鼻投與、吸入、注射及局部施加。
術語投與應包含(但不限於)經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、腦室內(ICV)、鞘內、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)來投與或局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)，且可單獨或一起調配成含有適用於每一投與途徑之醫藥上可接受之習用無毒載劑、佐劑、賦形劑及媒劑之適宜劑量單位調配物。本發明並不受限於投與途徑、調配物或投藥時間表。
「投與」可以一個劑量連續或間歇性地實施於整個治療過程中。測定最有效投與方式及劑量之方法為熟習此項技術者所已知，且將隨用於療法之組合物、療法目的、所治療靶細胞及所治療個體而變化。可使用由治療醫師選擇之劑量值及圖案來實施單一或多個投與。適宜劑量調配物及藥劑投與方法為業內所已知。亦可確定投與途徑，且確定最有效投與途徑之方法為熟習此項技術者所已知並將隨用於治療之組合物、治療目的、所治療個體之健康狀況或疾病階段及靶細胞或組織而變化。
可藉由任何適宜投與途徑將本發明藥劑投與療法中。亦應瞭解，最佳途徑將隨接受者之狀況及年齡以及所治療疾病而變化。
「個體(subject)」、「個體(individual)」或「患者」在本文中可互換使用，且係指脊椎動物、較佳地哺乳動物、更佳地人類。哺乳動物包含(但不限於)鼠類、大鼠、兔、猿類、牛類、羊類、豬類、犬類、貓類、農場動物、運動動物、寵物、馬類及靈長類動物、尤其人類。除可用於人類治療外，本發明亦可用於伴侶哺乳動物、境外動物及家養動物(包含哺乳動物、齧齒類動物)之獸醫學治療。在一實施例中，哺乳動物包含馬、狗及貓。在本發明之另一實施例中，人類係胎兒、嬰兒、青春期前個體、青少年、兒科患者或成人。在一態樣中，個體係症狀前哺乳動物或人類。在另一態樣中，個體具有最少臨床疾病症狀。個體可為男性或女性、成人、嬰兒或兒科個體。在另一態樣中，個體係成人。在一些情況下，成人係成人人類，例如年齡大於18歲之成人人類。
與術語「治療」相關之術語「患有」係指，患者或個體已診斷有或易患症候群癌症或病毒感染。患者亦可稱為「處於患有疾病之風險下」，此乃因其攜載一或多種基因突變。此患者尚未發生特徵性疾病病況。
「有效量」係足以實現有益或期望結果之量。有效量可以一或多次投與、施加或劑量來投與。該遞送取決於諸多變量，包含擬使用個別劑量單位之時間段、治療劑之生物可用性、投與途徑等。然而，應理解，本發明治療劑用於任何特定個體之具體劑量值取決於各種因素，包含所採用具體化合物之活性、個體之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食、投與時間、排泄速率、藥物組合及所治療特定病症之嚴重程度以及投與形式。通常可逐步增加治療劑量以最佳化安全性及效能。通常，來自活體外及/或活體內測試之劑量-效應關係首先可用於指導用於患者投與之適當劑量。一般而言，化合物之期望投與量可有效達成與所發現活體外有效濃度相稱之血清含量。該等參數之測定在業內已眾所周知。該等考慮以及有效調配物及投與程序在業內已眾所周知且闡述於標準教科書中。
藥物或藥劑之「治療有效量」係指藥物或藥劑足以獲得藥理學反應(例如被動免疫性)之量；或替代地係藥物或藥劑在投與患有指定病症或疾病之患者時足以具有預期效應(例如治療、緩解、改善、緩解或消除患者中之指定病症或疾病之一或多種表現)之量。治療效應不必藉由投與一個劑量而出現，且可僅在投與一系列劑量後出現。因此，治療有效量可以一或多次投與來投與。
本文所用之「單獨療法」包含(但不限於)手術切除術、化學療法、冷凍療法、輻射療法、免疫療法及靶向療法。用於減小細胞增殖之藥劑為業內已知且已廣泛使用。僅在分裂時殺死癌細胞之化學療法藥物稱為細胞週期特異性。該等藥物包含作用於S期之藥劑，包含拓撲異構酶抑制劑及抗代謝物。
拓撲異構酶抑制劑係干擾拓撲異構酶(拓撲異構酶I及II)之作用之藥物。在化學治療之過程期間，拓撲異構酶控制複製所需之DNA結構操縱，且由此係細胞週期特異性。拓撲異構酶I抑制劑之實例包含上文所列示之喜樹鹼(camptothecan)類似物、伊立替康(irinotecan)及托泊替康(topotecan)。拓撲異構酶II抑制劑之實例包含安吖啶(amsacrine)、依託泊苷(etoposide)、磷酸依託泊苷(etoposide phosphate)及替尼泊苷(teniposide)。
抗代謝物通常係通常干擾染色體複製所涉及過程之正常代謝受質之類似物。其在週期中於極其特定之時期攻擊細胞。抗代謝物包含葉酸拮抗劑，例如胺甲喋呤(methotrexate)；嘧啶拮抗劑，例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷(foxuridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、卡培他濱(capecitabine)及吉西他濱(gemcitabine)；嘌呤拮抗劑，例如6-巰基嘌呤及6-硫基鳥嘌呤；腺苷去胺酶抑制劑，例如克拉屈濱(cladribine)、氟達拉濱(fludarabine)、奈拉濱(nelarabine)及噴司他汀(pentostatin)；及諸如此類。
植物鹼係衍生自某些類型之植物。長春花生物鹼係自長春花屬植物(長春花(Catharanthus rosea))製得。紫杉烷(taxane)係自太平洋紫杉樹(Pacific Yew tree) (紫杉)之樹皮製得。長春花生物鹼及紫杉烷亦稱為抗微管劑。鬼臼毒素(podophyllotoxin)係衍生自鬼臼(May apple)植物。喜樹鹼類似物係衍生自亞洲「快樂樹」 (喜樹(Camptotheca acuminata))。鬼臼毒素及喜樹鹼類似物亦歸類為拓撲異構酶抑制劑。植物鹼通常為細胞週期特異性。
該等藥劑之實例包含長春花生物鹼，例如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)及長春瑞濱(vinorelbine)；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西他賽(docetaxel)；鬼臼毒素，例如依託泊苷及替尼泊苷；及喜樹鹼類似物，例如伊立替康及托泊替康。
冷凍療法包含(但不限於)涉及降低溫度之療法，例如低體溫療法。
輻射療法包含(但不限於)暴露於輻射(例如離子化輻射、UV輻射)，如業內所已知。實例性劑量包含(但不限於)在至少約2 Gy至不超過約10 Gy範圍內之離子化輻射劑量及/或在至少約5 J/m2至不超過約50 J/m2範圍內(通常為約10 J/m2)之紫外輻射劑量。
片語「一線」或「二線」或「三線」係指患者所接受治療之順序。一線療法方案係首先給予之治療，而二線或三線療法分別係在一線療法之後或在二線療法之後給予。國家癌症研究院(National Cancer Institute)將一線療法定義為疾病或病狀之「第一治療」。在癌症患者中，主要治療可為手術、化學療法、輻射療法或該等療法之組合。一線療法亦由熟習此項技術者稱為「主要療法及主要治療」。參見國家癌症研究院網站www.cancer.gov (最後訪問於2008年5月1日)。通常，向患者給予後續化學療法方案，此乃因患者並不針對一線療法展示陽性臨床或亞臨床反應或一線療法已停止。 實施本發明之方式
觀察到如本文所揭示之組合物及/或方法之若干優點且例示於圖式以及實驗方法中。該等優點包含(但不限於)基因向免疫細胞(例如NK細胞)之有效遞送、遞送基因之穩定性、細胞之成功擴增及經轉導細胞之高生存力，由此促進及改良經轉導免疫細胞(例如表現CAR之免疫細胞)之研發及製造。
在一些實施例中，由如本文所揭示方法製得之細胞群體中之至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%之細胞表現CAR及/或另一治療性蛋白或多肽。可使用各種方法來評價該表現，例如螢光活化細胞分選(FACS)或另一利用特異性識別及結合CAR及/或治療性蛋白或多肽之抗體或其抗原結合片段之免疫染色方法。
在一些實施例中，由如本文所揭示方法製得之細胞群體(例如)在細胞培養物中表現CAR及/或另一治療性蛋白或多肽至少約3天、至少約5天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天、至少約21天、至少約22天、至少約23天、至少約24天、至少約25天、至少約26天、至少約27天、至少約28天、至少約29天、至少約30天、至少約1個月、至少約40天、至少約50天、至少約60天、至少約70天、至少約80天、至少約90天、至少約100天、至少約120天、至少約150天、至少約180天或更久。在一些實施例中，由如本文所揭示方法製得之細胞群體中之至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%的細胞(例如)在細胞培養物中表現CAR及/或另一治療性蛋白或多肽至少約3天、至少約5天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天、至少約21天、至少約22天、至少約23天、至少約24天、至少約25天、至少約26天、至少約27天、至少約28天、至少約29天、至少約30天、至少約1個月、至少約40天、至少約50天、至少約60天、至少約70天、至少約80天、至少約90天、至少約100天、至少約120天、至少約150天、至少約180天或更久。
在一些實施例中，如本文所揭示之方法生成多於1 × 10 9個細胞、多於2 × 10 9個細胞、多於3 × 10 9個細胞、多於4 × 10 9個細胞、多於5 × 10 9個細胞、多於6 × 10 9個細胞、多於7 × 10 9個細胞、多於8 × 10 9個細胞、多於9 × 10 9個細胞、多於1 × 10 10個細胞、多於2 × 10 10個細胞、多於3 × 10 10個細胞、多於4 × 10 10個細胞、多於5 × 10 10個細胞、多於6 × 10 10個細胞、多於7 × 10 10個細胞、多於8 × 10 10個細胞、多於9 × 10 10個細胞、多於1 × 10 11個細胞、多於2 × 10 11個細胞、多於3 × 10 11個細胞、多於4 × 10 11個細胞、多於5 × 10 11個細胞、多於6 × 10 11個細胞、多於7 × 10 11個細胞、多於8 × 10 11個細胞、多於9 × 10 11個細胞、多於1 × 10 12個細胞、多於2 × 10 12個細胞、多於3 × 10 12個細胞、多於4 × 10 12個細胞、多於5 × 10 12個細胞、多於6 × 10 12個細胞、多於7 × 10 12個細胞、多於8 × 10 12個細胞、多於9 × 10 12個細胞或多於1 × 10 13個細胞、1 × 10 8個細胞或其當量。另外或替代地，如本文所揭示之方法生成最多5 × 10 10個細胞、最多6 × 10 10個細胞、最多7 × 10 10個細胞、最多8 × 10 10個細胞、最多9 × 10 10個細胞、最多1 × 10 11個細胞、最多2 × 10 11個細胞、最多3 × 10 11個細胞、最多4 × 10 11個細胞、最多5 × 10 11個細胞、最多6 × 10 11個細胞、最多7 × 10 11個細胞、最多8 × 10 11個細胞、最多9 × 10 11個細胞、最多1 × 10 12個細胞、最多2 × 10 12個細胞、最多3 × 10 12個細胞、最多4 × 10 12個細胞、最多5 × 10 12個細胞、最多6 × 10 12個細胞、最多7 × 10 12個細胞、最多8 × 10 12個細胞、最多9 × 10 12個細胞或最多1 × 10 13個細胞、1 × 10 8個細胞或其等效物。在一些實施例中，如本文所揭示之方法生成約5 × 10 10個細胞、約6 × 10 10個細胞、約7 × 10 10個細胞、約8 × 10 10個細胞、約9 × 10 10個細胞、約1 × 10 11個細胞、約2 × 10 11個細胞、約3 × 10 11個細胞、約4 × 10 11個細胞、約5 × 10 11個細胞或約6 × 10 11個細胞、1 × 10 8個細胞或其當量。可由熟習此項技術者經由將所生成細胞數及初始細胞數除以或乘以相同正數來計算該當量。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞群體之生存力可為至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%。可利用測試細胞生存力之多種方法，例如MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化鎓)分析或APT量測分析。 假型 γ 逆轉錄病毒顆粒
在一態樣中，提供假型γ逆轉錄病毒顆粒。在一些實施例中，γ逆轉錄病毒顆粒包括經修飾RD114貓類內源性逆轉錄病毒套膜醣蛋白(RD114TR)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。另外或替代地， γ逆轉錄病毒顆粒包括經修飾狒狒套膜醣蛋白(BaEVTR)或基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，RD114TR醣蛋白包括RD114醣蛋白之胞外結構域及跨膜結構域及雙嗜性鼠類白血病病毒(MLV-A)醣蛋白之細胞質結構域或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，BaEVTR醣蛋白包括狒狒套膜醣蛋白(BaEV)之胞外結構域及跨膜結構域及MLV-A醣蛋白之細胞質結構域或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，將RD114TR及BaEVTR作為膜蛋白納入顆粒套膜中。
在一些實施例中，如本文所揭示之假型γ逆轉錄病毒顆粒進一步包括囊封於套膜中之載體基因體。在其他實施例中，載體基因體包括下列側接有兩個長末端重複(LTR)者中之一或多者或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：(A)編碼嵌合抗原受體(CAR)及/或另一治療性蛋白或多肽之多核苷酸；(B) (A)之反向補體；或(C)包括一或多個識別位點之多核苷酸。在一些實施例中，治療性蛋白或多肽係選自抗體或其片段、酶、配體或受體。在一些實施例中，識別位點由適於將所關注序列 (例如(A)及(B)中之任一者或兩者)插入多核苷酸中之限制酶識別及裂解。
在一些實施例中，載體基因體進一步包括下列各項中之一或多者：5’ LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’ LTR。
在一些實施例中，如本文所揭示之假型γ逆轉錄病毒顆粒進一步包括逆轉錄酶或整合酶中之任一者或兩者。
在一些實施例中，假型γ逆轉錄病毒顆粒係基於或衍生自或係選自下列物種中之任一者：莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)或貓類白血病病毒。 人工抗原呈現細胞 (aAPC)
在另一態樣中，本文提供人工抗原呈現細胞(aAPC)。在一些實施例中，aAPC表現如本文所揭示之一或多種腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原或二者。在其他實施例中，aAPC表現下列各項中之一或多者：4-1BBL、膜結合(mb) IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25結合之mb IL-2突變體、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之mb IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc; ALT-803)或調介CD122/CD132信號傳導之細胞表面標記物。在一實施例中，aAPC進一步表現mb IL-21及4-1BBL。在一些實施例中，如本文所揭示之aAPC表現活化及/或刺激免疫細胞(例如NK細胞或γδ T細胞)之生長之腫瘤相關抗原(TAA)及/或病毒抗原。
在一些實施例中，aAPC係經改造K562細胞。
在一些實施例中，aAPC缺乏細胞增殖及/或缺乏長期存活。可由熟習此項技術者(例如)經由培養活細胞並計數來評估細胞增殖及長期存活。在一些實施例中，如本文所揭示之aAPC並不實質上存活超過約5天、約7天、約10天、約14天、約15天、約21天或約30天。
在一些實施例中，輻照aAPC以抑制細胞增殖及/或減小長期存活。在其他實施例中，在50 Gy或更高、60 Gy或更高、70 Gy或更高、75 Gy或更高、80 Gy或更高、90 Gy或更高、100 Gy或更高、110 Gy或更高、120 Gy或更高、130 Gy或更高、140 Gy或更高、150 Gy或更高、160 Gy或更高、170 Gy或更高、180 Gy或更高、190 Gy或更高、200 Gy或更高、210 Gy或更高、220 Gy或更高、230 Gy或更高、240 Gy或更高、250 Gy或更高及/或300 Gy或更高下輻照aAPC。另外或替代地，在1000 Gy或更低、900 Gy或更低、800 Gy或更低、700 Gy或更低、600 Gy或更低、500 Gy或更低、400 Gy或更低、350 Gy或更低、300 Gy或更低、250 Gy或更低、240 Gy或更低、230 Gy或更低、220 Gy或更低、210 Gy或更低、200 Gy或更低、190 Gy或更低、180 Gy或更低、170 Gy或更低、160 Gy或更低、150 Gy或更低、140 Gy或更低、130 Gy或更低、120 Gy或更低、110 Gy或更低、100 Gy或更低、90 Gy或更低、80 Gy或更低、70 Gy或更低或60 Gy或更低下輻照aAPC。在一些實施例中，在約50 Gy至約300 Gy (包含(但不限於)約50 Gy至約100 Gy、約50 Gy至約150 Gy、約50 Gy至約200 Gy 、約50 Gy至約250 Gy、約100 Gy至約150 Gy、約100 Gy至約200 Gy、約100 Gy至約150 Gy、約150 Gy至約200 Gy、約150 Gy至約250 Gy、約200 Gy至約250 Gy)下輻照aAPC。在其他實施例中，在約50 Gy、約100 Gy、約150 Gy或約200 Gy下輻照aAPC。在一些實施例中，在一起培養aAPC與免疫細胞(例如NK細胞、NKT細胞及/或γδ T細胞中之一或多者)或其細胞群體之前實施輻照。 NK 感染及擴增
在另一態樣中，提供製備天然殺手(NK)細胞之群體之方法。該方法包括將包括下列各項中之一或多者之細胞群體與免疫細胞活化劑(例如NK細胞活化劑)一起培養或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：NK細胞、能夠衍生NK細胞之祖細胞或能夠衍生NK細胞之幹細胞。在一些實施例中，該細胞群體在細胞群體中耗乏表現CD3、CD4、CD8、T細胞受體(TCR) α鏈、TCR β鏈或αβTCR中之一或多者之細胞。
在與本文之任何揭示內容相關之一些實施例中，一或多種免疫細胞活化劑(例如NK細胞活化劑)係選自下列各項中之一或多者：人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)及/或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長；一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合NK細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖NK細胞；一或多種由此活化或增殖NK細胞之細胞介素；及/或一或多種由此活化或增殖NK細胞之化學部分，其視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)。
在一些實施例中，刺激受體係下列各項中之一或多者：CD2、NKp46、CD16、NKG2D、DNAM-1 (CD226)、2B4 (天然殺手細胞受體2B4、CD244)、NTB-A (SLAM家族成員6，SLAMF6)及/或NKp46。例如參見Zamai L, Del Zotto G, Buccella F等人。Understanding the Synergy of NKp46 and Co活化性 Signals in Various NK Cell Subpopulations: Paving the Way for More Successful NK-Cell-Based Immunotherapy. Cells. 2020;9(3):753.公開於2020 Mar 19. doi:10.3390/cells9030753。
在一些實施例中，aAPC係如本文所揭示之aAPC。在一些實施例中，將aAPC與細胞群體以以下細胞數比(aAPC之細胞數:細胞群體之細胞數及/或aAPC之細胞數:細胞群體中免疫細胞(例如NK細胞、NKT細胞及/或γδ T細胞中之一或多者)之細胞數)一起培養：約100:1或更大、約50:1或更大、約20:1或更大、約10:1或更大、約9:1或更大、約9:1或更大、約8:1或更大、約7:1或更大、約6:1或更大、約5:1或更大、約4:1或更大、約3:1或更大、約2:1或更大、約1:1或更大、約1:2或更大、約1:3或更大、約1:4或更大、約1:5或更大、約1:6或更大、約1:7或更大、約1:8或更大、約1:9或更大、約1:10或更大、約1:20或更大、約1:50或更大或約1:100或更大。另外或替代地，將aAPC與細胞群體以以下細胞數比(aAPC之細胞數:細胞群體之細胞數及/或aAPC之細胞數:細胞群體中免疫細胞(例如NK細胞、NKT細胞及/或γδ T細胞中之一或多者)之細胞數)一起培養：約100:1或更小、約50:1或更小、約20:1或更小、約10:1或更小、約9:1或更小、約9:1或更小、約8:1或更小、約7:1或更小、約6:1或更小、約5:1或更小、約4:1或更小、約3:1或更小、約2:1或更小、約1:1或更小、約1:2或更小、約1:3或更小、約1:4或更小、約1:5或更小、約1:6或更小、約1:7或更小、約1:8或更小、約1:9或更小、約1:10或更小、約1:20或更小、約1:50或更小或約1:100或更小。在一些實施例中，將aAPC與細胞群體以約10:1至約1:10、約5:1至約1:5、約3:1至約1:3、約2:1至約1:2之細胞數比(aAPC之細胞數:細胞群體之細胞數及/或aAPC之細胞數:細胞群體中免疫細胞(例如NK細胞、NKT細胞及/或γδ T細胞中之一或多者)之細胞數)一起培養。在一些實施例中，將aAPC與細胞群體以約10:1、約5:1、約3:1、約2:1、約1:1、約1:2、約1:3、約1:5或約1:10之細胞數比(aAPC之細胞數:細胞群體之細胞數及/或aAPC之細胞數:細胞群體中免疫細胞(例如NK細胞、NKT細胞及/或γδ T細胞中之一或多者)之細胞數)一起培養。
在一些實施例中，細胞介素係選自由以下組成之群：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、之IL-2突變體、IL-7、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803可溶性)、IL-15、IL-18、IL-21、LEC、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)或MICA。
在一些實施例中，細胞介素包括IL-2或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，將細胞群體與約1 IU/mL至約1000 IU/ml IL2一起培養。在一些實施例中，將細胞群體與約1 IU/mL或更多、約2 IU/mL或更多、約3 IU/mL或更多、約5 IU/mL或更多、約10 IU/mL或更多、約20 IU/mL或更多、約30 IU/mL或更多、約40 IU/mL或更多、約50 IU/mL或更多、約60 IU/mL或更多、約70 IU/mL或更多、約80 IU/mL或更多、約90 IU/mL或更多、約100 IU/mL或更多、約110 IU/mL或更多、約120 IU/mL或更多、約130 IU/mL或更多、約140 IU/mL或更多、約150 IU/mL或更多、約160 IU/mL或更多、約170 IU/mL或更多、約180 IU/mL或更多、約190 IU/mL或更多、約200 IU/mL或更多、約250 IU/mL或更多、約300 IU/mL或更多、約400 IU/mL或更多、約500 IU/mL或更多、約600 IU/mL或更多、約700 IU/mL或更多、約800 IU/mL或更多、約900 IU/mL或更多或約1000 IU/mL或更多 IL2一起培養。另外或替代地，將細胞群體與約2000 IU/mL或更少、約1500 IU/mL或更少、約1000 IU/mL或更少、約900 IU/mL或更少、約800 IU/mL或更少、約700 IU/mL或更少、約600 IU/mL或更少、約500 IU/mL或更少、約400 IU/mL或更少、約300 IU/mL或更少、約250 IU/mL或更少、約200 IU/mL或更少、約100 IU/mL或更少、約90 IU/mL或更少、約80 IU/mL或更少、約70 IU/mL或更少、約60 IU/mL或更少、約50 IU/mL或更少、約40 IU/mL或更少、約30 IU/mL或更少、約20 IU/mL或更少、約10 IU/mL或更少、約5 IU/mL或更少IL2一起培養。在一些實施例中，細胞介素包括IL-2。在其他實施例中，將細胞群體與約1 IU/mL至約1000 IU/ml IL2 (包含(但不限於)約10 IU/ml至約100 IU/ml、約100 IU/ml至200 IU/ml、約200 IU/ml至約300 IU/ml、約300 IU/ml至約400 IU/ml、約400至約500 IU/ml、約100 IU/ml至約500 IU/ml IL2)一起培養。在一些實施例中，將細胞群體與約10 IU/mL、約20 IU/mL、約30 IU/mL、約40 IU/mL、約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約110 IU/mL、約120 IU/mL、約130 IU/mL、約140 IU/mL、約150 IU/mL、約160 IU/mL、約170 IU/mL、約180 IU/mL、約190 IU/mL、約200 IU/mL、約250 IU/mL、約300 IU/mL、約400 IU/mL、約500 IU/mL、約600 IU/mL、約700 IU/mL、約800 IU/mL、約900 IU/mL或約1000 IU/mL IL2一起培養。
在一些實施例中，細胞介素包括IL-15或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，將細胞群體與約0.1 ng/mL至約500 ng/mL IL15 (包含落入其中之任何範圍及/或數值)一起培養。在一些實施例中，將細胞群體與約1 ng/mL至約100 ng/ml IL15 (包含(但不限於)約1 ng/ml至約10 ng/ml、約10 ng/ml至約20 ng/ml、約20 ng/ml至約30 ng/ml、約30 ng/ml至約40 ng/ml、約40 ng/ml至約50 ng/ml IL 15)一起培養。在一些實施例中，將細胞群體與約1 ng/mL、約5 ng/ml、約10 ng/ml、約20 ng/ml、約30 ng/ml、約40 ng/ml、約50 ng/ml、約60 ng/ml、約70 ng/ml、約80 ng/ml、約90 ng/ml或約100 ng/ml IL15一起培養。
在一些實施例中，細胞介素包括IL-21或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，將細胞群體與約0.1 ng/mL至約500 ng/mL IL21 (包含落入其中之任何範圍及/或數值)一起培養。在一些實施例中，將細胞群體與約1 ng/mL至約100 ng/ml IL21 (包含(但不限於)約1 ng/ml至約10 ng/ml、約10 ng/ml至約20 ng/ml、約20 ng/ml至約30 ng/ml、約30 ng/ml至約40 ng/ml、約40 ng/ml至約50 ng/ml IL21)一起培養。在一些實施例中，將細胞群體與約1 ng/mL、約5 ng/ml、約10 ng/ml、約15 ng/ml、約20 ng/ml、約25 ng/ml、約30 ng/ml、約35 ng/ml、約40 ng/ml、約45 ng/ml、約50 ng/ml、約55 ng/ml、約60 ng/ml、約65 ng/ml、約70 ng/ml、約75 ng/ml、約80 ng/ml、約90 ng/ml或約100 ng/ml IL 21一起培養。
在一些實施例中，將細胞群體與一種以上細胞介素(例如如本文所揭示之細胞介素之組合)一起培養。在一些實施例中，將細胞群體與100-500 IU/ml IL-2、20 ng/ml IL-15或25 ng/mL IL-21中之任一者或任兩者或所有三者一起培養。在其他實施例中，將細胞群體與50 IU/ml IL-2及0.5 ng/ml IL-15中之任一者或兩者一起培養。
在一些實施例中，亦可使用化學部分作為免疫細胞活化劑(例如NK活化劑)，舉例而言，已證實，使用ADAM17抑制劑進行處理會藉由防止CD16受體脫落來增大NK細胞ADCC，且使用菸鹼醯胺處理NK細胞會增強其L-選擇素(其已知對於細胞輸送而言必不可少)表現。例如參見Peled等人，Blood (2017) 130 (增刊1): 657及Childs RW, Carlsten M. Nat Rev Drug Discov. 2015;14(7):487-498。其他實例係mTOR抑制劑、PI3K抑制劑及/或STING活化環狀二核苷酸(CDN)。
在一些實施例中，如本文所揭示之方法進一步包括將編碼CAR及/或另一治療性蛋白或多肽之多核苷酸引入經培養細胞群體中以供表現。在一些實施例中，CAR特異性識別且結合腫瘤相關抗原(TAA)及/或病毒抗原。在其他實施例中，由CAR識別及結合之腫瘤相關抗原(TAA)及/或病毒抗原係由aAPC表現者。在一些實施例中，治療性蛋白或多肽係選自 抗體或其片段、酶、配體或受體。
在一些實施例中，如本文所揭示之方法進一步包括在引入步驟之前及/或之後將細胞群體與免疫細胞活化劑(例如NK細胞活化劑)一起培養。在其他實施例中，使用相同或不同之免疫細胞活化劑(例如NK細胞活化劑)或其組合重複培養步驟一次、兩次、三次或更多次。
在一些實施例中，在引入步驟之前及之後將活化劑與細胞群體一起培養。在其他實施例中，在引入步驟之前及之後與細胞群體一起培養之兩種活化劑係相同的。在一些實施例中，在引入步驟之前及之後與細胞群體一起培養之兩種活化劑彼此不同。
一些方法實施例包括將假型γ逆轉錄病毒顆粒引入經培養細胞群體中，由此將編碼CAR及/或如本文所揭示之另一治療性蛋白或多肽之多核苷酸引入經培養細胞群體中。在一些實施例中，假型γ逆轉錄病毒顆粒揭示於本文中。在一些實施例中，假型γ逆轉錄病毒顆粒包括編碼CAR及/或如本文所揭示之另一治療性蛋白或多肽之多核苷酸及/或其反向補體。在其他實施例中，編碼多核苷酸及/或其反向補體側接有兩個長末端重複(LTR)。另外或替代地，假型γ逆轉錄病毒顆粒包括如本文所揭示之RD114TR及/或BaEVTR。在一些實施例中，假型γ逆轉錄病毒顆粒包括載體基因體，該載體基因體包括5’ LTR、5’帽、編碼多核苷酸或其反向補體、3’聚-A尾部及3’ LTR或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，如本文所揭示之組分自5’至3’位於載體基因體中。在一些實施例中，假型γ逆轉錄病毒顆粒進一步包括逆轉錄酶及整合酶中之任一者或兩者。在一些實施例中，假型γ逆轉錄病毒顆粒係基於及/或衍生自及/或係選自以下任何物種：莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒。
在一些實施例中，以約0.01至約100 (包含落入其中之任何範圍及/或數值)之感染複數(MOI)將假型γ逆轉錄病毒顆粒引入經培養細胞群體中。在一些實施例中，將以約0.1至約10、約0.2至約5、約1至約10或約1至約5之MOI將假型γ逆轉錄病毒顆粒引入經培養細胞群體中。在一些實施例中，以約0.1、約0.2、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10之MOI將假型γ逆轉錄病毒顆粒引入經培養細胞群體中。
在一些實施例中，在引入步驟之前將細胞群體培養至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天或至少約10天。另外或替代地，在引入步驟之前將細胞群體培養不超過7天、不超過8天、不超過9天、不超過10天、不超過11天、不超過12天、不超過13天、不超過14天、不超過15天、不超過3週或不超過1個月。在一些實施例中，在引入步驟之前將細胞群體培養約1天至約180天(包含落入其中之任何範圍及/或數值)。在一些實施例中，在引入步驟之前將細胞群體培養約5天至約10天，例如約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天。
在一些實施例中，經由在RetroNectin存在下轉導包括編碼多核苷酸或其反向補體之病毒載體將編碼多核苷酸引入細胞群體中。在一些實施例中，將RetroNectin塗覆於轉導細胞群體之容器之內表面上。在其他實施例中，容器係適於培養細胞之袋。在其他實施例中，容器係適於培養細胞之板。在另一實施例中，容器係適於培養細胞之燒瓶。在一些實施例中，細胞群體表現整聯蛋白α4β1 (VLA-4)及整聯蛋白α5β1 (VLA-5)中之任一者或兩者。
在一些實施例中，細胞群體係分離自個體之生物試樣(例如血樣)。在一些實施例中，細胞群體係分離自以下各項中之一或多者：個體之臍帶血、個體之周邊血或個體之骨髓。在一些實施例中，細胞群體包括以下各項或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：祖細胞、胚胎幹細胞、胚胎幹細胞衍生的細胞、胚胎生殖細胞、胚胎生殖細胞衍生的細胞、幹細胞、幹細胞衍生的細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)或永生化細胞。
在一些實施例中，如本文所揭示之方法進一步包括富集細胞群體中表現CD56、CD25、CD122、CD212、CD215、CD218、CD360、TGF-βR或IL-10R中之任一者或多者之細胞。在一些實施例中，如本文所揭示之方法進一步包括富集、衍生及/或生成CD56 dim細胞。在其他實施例中，CD56 dim細胞以低密度表現CD56表面抗原且具有特殊細胞毒性功能。另外或替代地，如本文所揭示之方法進一步包括富集、衍生及/或生成CD56 bright細胞。在其他實施例中，CD56 bright細胞以高密度表現CD56表面抗原且具有特殊細胞介素分泌。例如參見Jacobs等人，Eur J Immunol. 2001 Oct;31(10):3121-7。在一些實施例中，細胞群體包括周邊血NK細胞及/或臍帶血NK細胞或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，周邊血NK細胞及/或臍帶血NK細胞表現NCR、CD56、DNAM-1、CD16、IL-2R、CXCR4、KIRS、CD8、CD57、黏附分子、NKG2D、NKG2C及/或NKG2A中之任一者或多者。在其他實施例中，周邊血NK細胞及/或臍帶血NK細胞之表現含量係不同的。在一些實施例中，如本文所揭示之方法進一步包括富集細胞群體中表現NCR、CD56、DNAM-1、CD16、IL-2R、CXCR4、KIRS、CD8、CD57、黏附分子、NKG2D、NKG2C及/或NKG2A中之任一者或多者之細胞。在一些實施例中，如本文所揭示之方法進一步包括富集細胞群體中之周邊血NK細胞及/或臍帶血NK細胞。
在一些實施例中，任何步驟及/或實施例及/或態樣之細胞群體可包括天然殺手(NK)細胞或其實質上經純化組合物或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，任何步驟及/或實施例及/或態樣之細胞群體(例如經耗乏細胞群體)可包括下列各項中之一或多者或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：NK細胞、祖細胞、HSC、iPSC或其各自之實質上經純化群體。
在一些實施例中，NK細胞可包括衍生自下列各項中之一或多者之細胞或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：祖細胞、胚胎幹細胞、胚胎幹細胞衍生的細胞、胚胎生殖細胞、胚胎生殖細胞衍生的細胞、幹細胞、幹細胞衍生的細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)或永生化細胞。
在一些實施例中，祖細胞、HSC或iPSC中之一或多者能夠衍生NK細胞。
在一些實施例中，任何步驟及/或實施例及/或態樣之細胞群體實質上不含T細胞。在一些實施例中，任何步驟及/或實施例及/或態樣之細胞群體實質上不含T調控細胞。
如本文所揭示之方法之一些實施例可進一步包括分離、富集及/或純化細胞群體。在一些實施例中，任何步驟及/或實施例及/或態樣之細胞群體經分離、富集或純化。
在一些實施例中，在培養步驟中將細胞群體及aAPC在選自以下之細胞培養基中一起培養：StemSpan (Stemcell #09960)、NK MACS®培養基(Miltenyi research 30-114-429；GMP: 170-076-356)、TexMACS (170-076-306 GMP培養基)、Cellgenix無血清幹細胞生長培養基(SCGM, #20806-0500)或ImmunoCult™-XF培養基(來自Stemcell technologies)。
如本文所揭示之方法之一些實施例進一步包括以下步驟中之任一者或兩者：調配如本文所揭示之細胞群體(例如表現CAR組合物者)；及/或冷凍保存如本文所揭示之細胞群體(例如表現CAR組合物者)。
如本文所揭示之方法之一些實施例進一步包括以下步驟中之任一者或兩者：在一或多個步驟之前或之後洗滌細胞群體，及/或在一或多個步驟之前或期間或之後檢測下列各項中之一或多者：(i)細胞群體之生存力；(ii)細胞群體之無菌性；(iii)細胞群體中之支原體；(iv)細胞群體之人類白血球抗原(HLA)類型；(v)細胞群體之細胞數；(vi)細胞群體之細胞表型；(vii)細胞群體或包括細胞群體之組合物中之HHV6或HHV7或二者；(viii)細胞群體或包括細胞群體之組合物中之人類免疫缺陷病毒(HIV) 1型及2型、人類嗜T淋巴球病毒(HTLV) I型及II型、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、CMV、茲卡(Zika)、西尼羅(West Nile)或蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)中之一或多者；(ix) aAPC之細胞表型；(x)包括細胞群體之組合物中之IL-15含量；(xi)細胞群體中之CAR表現；(xii)細胞群體或包括細胞群體之組合物中之內毒素；(xiii)殘餘腫瘤負荷及/或包括細胞群體之組合物之aAPC污染；(xiv)細胞群體之功效；(xv)細胞群體之IFN-γ、IL-15及TNF-α釋放；(xvi)細胞群體之細胞毒性活性；(xvii)細胞群體之去顆粒；及(xviii)監測或測定培養物中之下列各項中之一或多者：細胞聚集、葡萄糖或乳酸鹽。在其他實施例中，表型檢測包括檢測下列各項中之一或多者之細胞表現及/或表現含量：CD3、CD56、抗原(例如CD19)、CD45、HLA、NKp46、NKG2D、NKG2A、NCR、DNAM-1、CD16、IL-2R、CXCR4、KIRS、CD8、CD57、黏附分子、NKG2C、CD107a、CAR或由細胞群體(例如aAPC及/或免疫細胞)表現之細胞表面標記物。 γδ T 細胞感染及擴增
在又一態樣中，提供製備γδ T細胞之群體之方法。該方法包括將包括下列各項中之一或多者之細胞群體與一或多種免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)一起培養或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：γδ T細胞、能夠衍生γδ T細胞之祖細胞或能夠衍生γδ T細胞之幹細胞。在一些實施例中，該細胞群體在細胞群體中耗乏表現以下各項中之一或多者之細胞：T細胞受體(TCR) α鏈、TCR β鏈或αβTCR。
在一些實施例中，一或多種免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)係選自下列中之一或多者：人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)及/或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長；一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合γδ T細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖γδ T細胞；一或多種由此活化或增殖γδ T細胞之細胞介素；或一或多種由此活化或增殖γδ T細胞之化學部分，其視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)。
如本文所揭示之方法之一些實施例中進一步包括將編碼CAR及/或另一治療性蛋白或多肽之多核苷酸引入經培養細胞群體中以供表現。在一些實施例中，治療性蛋白或多肽係選自抗體或其片段、酶、配體或受體。在一些實施例中，CAR特異性識別且結合腫瘤相關抗原(TAA)及/或病毒抗原。在其他實施例中，由CAR識別及結合之腫瘤相關抗原(TAA)及/或病毒抗原係表現於aAPC上者。
如本文所揭示之方法之一些實施例進一步包括在引入步驟之後將細胞群體與免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)或其組合一起培養。在一些實施例中，使用相同或不同之活化劑重複培養步驟一次、兩次、三次或更多次。
在一些實施例中，任何步驟及/或實施例及/或態樣之細胞群體可包括下列各項中之一或多者或替代地基本上由其組成或進一步由其組成： γδ T細胞或其實質上經純化組合物。在一些實施例中，任何步驟及/或實施例及/或態樣之細胞群體(例如如本文所揭示之經耗乏細胞群體)可包括下列各項中之一或多者或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：γδ T細胞、HSC、iPSC或其各自之實質上經純化群體。
在一些實施例中，祖細胞、HSC或iPSC中之一或多者能夠衍生 γδ T細胞。在一些實施例中，γδ T細胞包括衍生自下列各項中之一或多者之細胞或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：祖細胞、胚胎幹細胞、胚胎幹細胞衍生的細胞、胚胎生殖細胞、胚胎生殖細胞衍生的細胞、幹細胞、幹細胞衍生的細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)或永生化細胞。在一些實施例中，細胞群體實質上不含表現TCR α鏈或TCR β鏈之細胞。 抗原及嵌合抗原受體 (CAR)
在如本文所揭示之任何態樣之一些實施例中，腫瘤相關抗原係選自下列各項或其各自之片段中之一或多者：G蛋白偶合受體C類家族5成員D (GPRC5D)、B細胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7 (CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生長因子受體(EGFRwt)、表皮生長因子受體變體III (EGFRVIII)、FLT3、CD70、間皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、ERBB2 (Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1 (CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、介白素13受體α 2 (IL13Ra2)、鳥苷醯基環化酶C (GUCY2C)、腫瘤相關醣蛋白-72 (TAG-72)、胸苷激酶1 (TK1)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神經節苷脂G2 (GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮細胞黏附分子前體(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、黏蛋白1 (Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、纖維母細胞活化蛋白 α (FAP)、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、肝配蛋白A型受體2前體(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位切斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、天門冬醯胺內肽酶、HPV E6、E7、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、FCRL5或IGLL1。
在如本文所揭示之任何態樣之一些實施例中，如本文所揭示之CAR包括以下部分或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：(1)特異性識別且結合抗原之抗體之抗原結合結構域；(2)鉸鏈結構域；(3)跨膜結構域；及(4)包括信號傳導結構域之細胞內結構域。在一些實施例中，CAR進一步包括信號肽。
在如本文所揭示之任何態樣之一些實施例中，CAR之抗原結合結構域特異性識別且結合下列各項中之一或多者：G蛋白偶合受體C類家族5成員D (GPRC5D)、B細胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7 (CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生長因子受體(EGFRwt)、表皮生長因子受體變體III (EGFRVIII)、FLT3、CD70、間皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、ERBB2 (Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1 (CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、介白素13受體α 2 (IL13Ra2)、鳥苷醯基環化酶C (GUCY2C)、腫瘤相關醣蛋白-72 (TAG-72)、胸苷激酶1 (TK1)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神經節苷脂G2 (GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮細胞黏附分子前體(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、黏蛋白1 (Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、纖維母細胞活化蛋白 α (FAP)、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、肝配蛋白A型受體2前體(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位切斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、天門冬醯胺內肽酶、HPV E6、E7、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、FCRL5或IGLL1。
在如本文所揭示之任何態樣之一些實施例中，CAR之抗原結合結構域包括特異性識別且結合下列各項中之一或多者之抗體的6個CDR：G蛋白偶合受體C類家族5成員D (GPRC5D)、B細胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7 (CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生長因子受體(EGFRwt)、表皮生長因子受體變體III (EGFRVIII)、FLT3、CD70、間皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、ERBB2 (Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1 (CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、介白素13受體α 2 (IL13Ra2)、鳥苷醯基環化酶C (GUCY2C)、腫瘤相關醣蛋白-72 (TAG-72)、胸苷激酶1 (TK1)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神經節苷脂G2 (GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮細胞黏附分子前體(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、黏蛋白1 (Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、纖維母細胞活化蛋白 α (FAP)、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、肝配蛋白A型受體2前體(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位切斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、天門冬醯胺內肽酶、HPV E6、E7、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、FCRL5或IGLL1。
在如本文所揭示之任何態樣之一些實施例中，CAR之抗原結合結構域包括選自以下之抗體或其各自之片段之6個CDR：抗EGFRwt及抗EGFRVIII抗體、抗FLT3抗體、抗BCMA抗體及/或抗CS1抗體。
在一些實施例中，鉸鏈結構域包括CD8 α鉸鏈結構域。
在一些實施例中，跨膜結構域包括CD8α跨膜結構域。
在一些實施例中，細胞內結構域進一步包括(1)一或兩個或更多個共刺激信號傳導區或(2)包括JAK-STAT活化結構域之IL2Rβ或其片段或(1)及(2)。在其他實施例中，共刺激信號傳導區包括CD28共刺激信號傳導區或4-1BB共刺激信號傳導區或二者。
在一些實施例中，信號傳導結構域包括CD3 ζ信號傳導結構域或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，所引入多核苷酸進一步表現細胞介素及/或抗體中之一或多者，或其中該方法進一步包括將表現細胞介素及/或抗體中之一或多者之另一多核苷酸引入經耗乏細胞群體中。
在其他實施例中，由多核苷酸表現之細胞介素係選自下列各項中之一或多者：B7.1(可溶性或膜結合性)、CCL19(可溶性或膜結合性)、CCL21(可溶性或膜結合性)、CD40L(可溶性或膜結合性)、CD137L(可溶性或膜結合性)、GITRL(可溶性或膜結合性)、GM-CSF(可溶性或膜結合性)、IL-12(可溶性或膜結合性)、IL-2(可溶性或膜結合性)、低毒性IL-2(可溶性或膜結合性)、缺乏cd25結合之IL-2類似物(可溶性或膜結合性)、IL-15-N72D超激動劑以及IL-15RαSushi-Fc融合蛋白(可溶性或膜結合性)、IL-15 (可溶性或膜結合性)、IL-18 (可溶性或膜結合性)、IL-21 (可溶性或膜結合性)、LEC (可溶性或膜結合性)、OX40L (可溶性或膜結合性)、IL-7 (可溶性或膜結合性)、ICOSL (B7H2、B7RP1，可溶性或膜結合性)或MICA (可溶性或膜結合性)。
另外或替代地，由多核苷酸表現之抗體係單特異性抗體或雙特異性抗體或多特異性抗體。另外或替代地，由多核苷酸表現之抗體係免疫細胞活化劑，例如NK細胞活化劑。
在一些實施例中，所製得表現CAR之細胞群體適於抑制癌細胞生長且其中抗原係由癌細胞表現之腫瘤相關抗原(TAA)。 編碼多核苷酸及載體
在一些實施例中，編碼CAR及/或治療性蛋白或多肽之多核苷酸(其在本文中亦稱為編碼多核苷酸)進一步編碼信號肽。另外或替代地，編碼CAR及/或治療性蛋白或多肽之多核苷酸進一步包括自殺基因。在其他實施例中，自殺基因產物係選自以下中之一或多者：HSV-TK (單純疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶去胺酶、硝基還原酶、羧基酯酶、細胞色素P450或PNP (嘌呤核苷磷酸化酶)、截短EGFR或可誘導半胱天冬酶(caspase) (「iCasp」)。在一些實施例中，編碼多核苷酸進一步包括引導表現自殺基因之調控序列。在其他實施例中，調控序列係可誘導的。
在一些實施例中，編碼多核苷酸進一步包括引導表現CAR或治療性蛋白或多肽之調控序列。在其他實施例中，引導表現CAR或治療性蛋白之調控序列係誘導型或組成型活性的。
在一些實施例中，經由載體將編碼多核苷酸引入細胞群體中。在其他實施例中，載體係病毒載體或非病毒載體。在一些實施例中，非病毒載體係質體。在一些實施例中，病毒載體係選自逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或疱疹病毒載體。在另一實施例中，病毒主鏈含有用於將編碼多核苷酸整合至靶細胞之基因體中之必需核酸或序列。在一些實施例中，整合靶細胞之基因體中所需之必需核酸在5’及3’端包含載體整合所需之最小LTR區域。
本發明亦提供包括如本文所揭示之多核苷酸(例如編碼多核苷酸)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成之載體，其視情況插入病毒主鏈中。在一些實施例中，載體經選擇以用於表現於原核或真核細胞中。在一些實施例中，載體包括如本文所闡述編碼經修飾蛋白質之多核苷酸或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，載體包括如本文所闡述允許多核苷酸複製之多核苷酸或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，載體進一步包括操作性連接至多核苷酸且引導多核苷酸複製之調控序列。在又一實施例中，調控序列包括以下各項中之一或多者或替代地基本上由其組成或進一步由其組成：啟動子、內含子、增強子、聚腺苷酸化信號、終止子、沉默子、TATA盒或旱獺肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus，WHP)轉錄後調控元件(WPRE)。
在一些實施例中，經由如本文所揭示之假型γ逆轉錄病毒顆粒將編碼序列引入靶細胞中。 包裝系統
本發明亦提供一種病毒包裝系統，其包括：如本文所闡述之載體，視情況其中主鏈係衍生自病毒；包裝質體；及套膜質體。包裝質體含有編碼核苷、基質蛋白、衣殼及將載體基因體包裝至病毒顆粒中所需之其他組分之多核苷酸。包裝質體闡述於專利文獻中，例如美國專利第7,262,049號、第6,995,258號、第7,252,991號及第5,710,037號，其以引用方式併入本文中。
該系統亦可含有編碼由套膜質體提供之假型套膜蛋白之質體。假型病毒載體由具有衍生自其他包膜病毒之醣蛋白或替代地含有功能部分之載體顆粒組成。例如參見美國專利第7,262,049號，其以引用方式併入本文中。在一些實施例中，套膜質體編碼視情況不會導致病毒顆粒非特異性結合至細胞或細胞群體之套膜蛋白。病毒顆粒之特異性可由插入顆粒套膜中之蛋白質或多肽(例如抗體結合結構域)賦予。適宜套膜蛋白之實例包含(但不限於)含有VSVG或RD114結構域者。在一些實施例中，本文所用之套膜蛋白包含(但不限於) RD114TR及/或BaEVTR。
本發明亦提供適宜包裝細胞系。在一態樣中，包裝細胞系係HEK-293細胞系。其他適宜細胞系為業內所已知，如美國專利第7,070,994號、第6,995,919號、第6,475,786號、第6,372,502號、第6,365,150號及第5,591,624號 (各自以引用方式併入本文中)內之專利文獻中所闡述。在一些實施例中，包裝細胞系係選自或係衍生自以下各項中之一或多者：293Vec-Galv、293Vec-Ampho、293Vec-RD114或293Vec-BaEV。例如參見Ghani等人，Gene Ther. 2007 Dec;14(24):1705-11；Dakiw Piaceski A等人，Eur Cell Mater. 2018 Feb 14;35:73-86；Ghani等人，Hum Gene Ther. 2009 Sep;20(9):966-74；美國專利公開案第US20060270042號；及美國專利第8034335號。
本發明進一步提供產生如本文所揭示之病毒顆粒之方法，其包括在適於包裝病毒載體之條件下使用如上文所闡述之病毒系統轉導包裝細胞系或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。該等條件為業內所已知且簡述於本文中。可使用熟習此項技術者已知之方法(例如離心)自細胞上清液來分離病毒顆粒。該等經分離顆粒進一步提供於本發明中。
本發明進一步提供藉由此方法產生之經分離病毒顆粒。病毒顆粒包括如本文所揭示之多核苷酸或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。
本發明亦提供製備包括如本文所揭示之多核苷酸(例如如本文所揭示之編碼多核苷酸)之病毒顆粒(例如γ逆轉錄病毒顆粒)之方法，其係藉由在有利於將載體包裝至套膜顆粒中之條件下使用載體、套膜質體及包裝質體轉導如本文所闡述之包裝細胞系來達成。在一些實施例中，病毒顆粒係假型病毒顆粒。在其他實施例中，該等顆粒係分離自細胞上清液且偶聯至抗體以供細胞特異性靶向。
亦提供產生逆轉錄病毒顆粒(例如γ逆轉錄病毒顆粒)之方法。該方法包括以下步驟、基本上由其組成或進一步由其組成：(i)將表現載體基因體之載體引入適於將載體基因體包裝至第一逆轉錄病毒顆粒中之第一包裝細胞系中，(ii)將第一逆轉錄病毒顆粒轉導至適於複製第一逆轉錄病毒顆粒之第二包裝細胞系中；及(iii)分離所複製逆轉錄病毒顆粒。
在一些實施例中，載體係非病毒載體。在其他實施例中，載體係質體。
在一些實施例中，該方法進一步包括培養引入載體之第一包裝細胞系。在其他實施例中，該方法進一步包括自引入載體之第一包裝細胞系之培養物(例如自上清液)分離第一逆轉錄病毒顆粒。
在一些實施例中，該方法進一步包括培養經轉導第二包裝細胞系。
在一些實施例中，使用以下兩個步驟來產生載體： 步驟1：質體(其表現逆轉錄病毒載體基因體)轉染293Vec-GALV細胞以產生逆轉錄病毒載體。所產生該逆轉錄病毒載體經包括GALV之脂質膜包膜。另外，因293Vec-GALV細胞在此步驟中瞬時轉染，故所產生逆轉錄病毒載體亦稱為瞬時載體且測試於 圖 10中。 步驟2：所產生逆轉錄病毒載體轉導293Vec-BaEV細胞以複製逆轉錄病毒載體。所複製逆轉錄病毒載體與親代載體具有相同載體基因體，但經包括BaEV之脂質膜包膜。另外，因293Vec-BaEV細胞在此步驟中穩定轉導，故此處之所複製逆轉錄病毒載體亦稱為穩定載體且測試於 圖 10中。
令人吃驚地，T細胞(使用RQR8編碼之逆轉錄病毒載體基因體轉導)使用穩定載體以高於瞬時載體之含量表現RQR8。另外，所生成之該等穩定病毒生產細胞(亦稱為生產者)較為穩定且及與所關注轉基因整合。在一些實施例中，由轉基因編碼之蛋白質產物無毒。因此，不期望受限於理論，正如親代包裝細胞系一般，生產細胞可在活體外連續培養與其處於對數生長期中時一樣多之世代。在一些實施例中，生產者可保持活體外培養不超過30代。
在一些實施例中，將細胞培養至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天或至少約10天。另外或替代地，將細胞培養不超過7天、不超過8天、不超過9天、不超過10天、不超過11天、不超過12天、不超過13天、不超過14天、不超過15天、不超過3週或不超過1個月。在一些實施例中，將細胞培養約1天至約180天(包含落入其中之任何範圍及/或數值)。在一些實施例中，將細胞培養約5天至約10天，例如約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天。
在一些實施例中，第一包裝細胞系及第二包裝細胞系表現包裝逆轉錄病毒顆粒所需之組分。在其他實施例中，包裝逆轉錄病毒顆粒所需之組分係選自以下中之一或多者：逆轉錄病毒gag、逆轉錄病毒pol、逆轉錄病毒env、其各自之片段或其任何組合。
在一些實施例中，第二包裝細胞系在細胞膜中包括逆轉錄病毒套膜蛋白，但在細胞膜中不包括逆轉錄病毒套膜蛋白之進入受體。
另外，提供經轉導第二包裝細胞系、其細胞或其細胞群體。在一些實施例中，細胞穩定產生逆轉錄病毒顆粒。
在一些實施例中，逆轉錄病毒套膜蛋白係BaEV且其進入受體係ASCT1或ASCT2。在一些實施例中，逆轉錄病毒套膜蛋白係RD114，且其進入受體係ASCT2。在一些實施例中，逆轉錄病毒套膜蛋白係GALV且其進入受體係Pit1。
在一些實施例中，第一包裝細胞系包括第一逆轉錄病毒顆粒之逆轉錄病毒套膜蛋白之進入受體。在其他實施例中，第一包裝細胞系確實包括第一逆轉錄病毒顆粒之逆轉錄病毒套膜蛋白之進入受體。
在一些實施例中，以約0.01至約100 (包含落入其中之任何範圍及/或數值)之感染複數(MOI)將載體引入第一包裝細胞系中。在一些實施例中，以約0.1至約10、約0.2至約5、約1至約10或約1至約5之MOI將載體引入第一包裝細胞系中。在一些實施例中，以約0.1、約0.2、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10之MOI將載體引入第一包裝細胞系中。
在一些實施例中，以約0.01至約100 (包含落入其中之任何範圍及/或數值)之感染複數(MOI)將第一逆轉錄病毒顆粒引入(例如轉導至)第二包裝細胞系中。在一些實施例中，以約0.1至約10、約0.2至約5、約1至約10或約1至約5之MOI將第一逆轉錄病毒顆粒引入(例如轉導至)第二包裝細胞系中。在一些實施例中，以約0.1、約0.2、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10之MOI將第一逆轉錄病毒顆粒引入(例如轉導至)第二包裝細胞系中。
因此，提供藉由如本文所揭示之方法產生之逆轉錄病毒顆粒。
在另一態樣中，提供產生經改造免疫細胞(例如表現CAR之免疫細胞)之方法。該方法包括將使用如本文所揭示之方法產生之逆轉錄病毒顆粒引入(例如轉導至)免疫細胞或其前體細胞中或基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，病毒載體顆粒之基因資訊(其在本文中亦稱為載體基因體或病毒基因體)係RNA，其在5’及3’端上包括載體整合所需之最小LTR區域及如本文所揭示位於兩個LTR區域之間之多核苷酸或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，在兩個LTR區域之間進一步包括將載體RNA包裝至顆粒中所需之衣殼化信號(psi區域)。在一些實施例中，在psi區域之後係Rev反應性元件(RRE)及中心聚嘌呤區序列(cPPT)，該等結構藉由將全長載體轉錄物傳輸出細胞核以用於有效包裝至載體顆粒中來增強載體產生。
在一些實施例中，將所列示基因元件轉錄成全長RNA分子，該分子被包裝至載體顆粒中且含有將整合至經轉導細胞中之所有基因資訊。
在一些實施例中，全長RNA轉錄物包裝於載體顆粒之衣殼內部，該載體顆粒含有自包裝質體生成之核衣殼、衣殼及基質蛋白。在一些實施例中，自包裝質體生成之逆轉錄酶聚合酶亦位於具有RNA轉錄物之衣殼內。在一些實施例中，衣殼包封且保護全長RNA轉錄物。
在一些實施例中，在轉染之前24小時，將包裝細胞系之細胞(例如HEK-293T細胞)以75%鋪滿度平鋪於完整DMEM培養基中。在平鋪細胞後至少24小時，製備轉染混合物。將3毫升無血清培養基與150 µl脂轉染試劑在室溫下一起培育20分鐘。然後以某一比率(包裝質體:病毒載體質體:套膜質體)將質體添加至培養基/脂轉染試劑混合物中不培育30分鐘。在該最終培育期中，然後將培養基/脂轉染試劑/DNA混合物添加至HEK-293T細胞中並過夜以發生轉染。第二天，去除轉染培養基且添加新鮮完整DMEM。72小時後，可收集細胞培養上清液並藉由在20,000 rpm下超離心1.5小時來予以濃縮。
在載體顆粒自包裝細胞萌芽且釋放至上清液中後，可藉由特異性識別或結合顆粒之抗體及/或藉由在如本文所定義之顆粒套膜上偶聯抗體來分離及/或純化此載體顆粒。
因此，在一態樣中，本文提供用於產生假型γ逆轉錄病毒顆粒之病毒包裝系統，其包括：(a)表現載體基因體之質體；(b)包裝質體；及(c)一或多種表現RD114TR及BaEVTR之套膜質體。在一些實施例中，包裝系統進一步包括包裝細胞系。在其他實施例中，包裝細胞系係293T細胞系。
在一些實施例中，載體基因體包括下列側接有兩個長末端重複(LTR)者中之一或多者：(A)編碼嵌合抗原受體(CAR)及/或另一治療性蛋白或多肽之多核苷酸；(B) (A)之反向補體；或(C)包括一或多個由適於將編碼序列或其反向補體插入多核苷酸中之限制酶識別之識別位點之多核苷酸。在一些實施例中，治療性蛋白或多肽係選自抗體或其片段、酶、配體或受體。在一些實施例中，載體基因體進一步包括下列各項中之一或多者：5’ LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’ LTR。在其他實施例中，編碼多肽位於5’帽與3’聚-A尾部之間。
在一些實施例中，假型γ逆轉錄病毒顆粒係基於及/或衍生自及/或係選自以下任何物種：莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒。
在另一態樣中，提供產生假型γ逆轉錄病毒顆粒之方法。該方法包括在適於包裝假型γ逆轉錄病毒顆粒之條件下使用如本文所揭示之包裝系統轉導包裝細胞系或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在其他實施例中，包裝細胞系係293T細胞系。
在一些實施例中，以約5:5:1、5:4:1、5:3:1、5:2:1、5:1:1、4:5:1、3:5:1、2:5:1、1:5:1；4:4:1、4:3:1、4:2:1、4:1:1、3:4:1、2:4:1、1:4:1；3:3:1、3:2:1、3:1:1、2:3:1、1:3:1；2:2:1、2:1:1、1:2:1；1.5:1.5:1、1.5:1:1、1:1.5:1或1:1:1之比率使用(a)、(b)及(c)之質體(亦即病毒載體質體:包裝質體:套膜質體)來轉導細胞系。在其他實施例中，包裝系統包括至少兩種套膜質體，一種表現RD114TR且另一種表現BaEVTR。在其他實施例中，以3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2或1:3之比率來轉導RD114TR表現質體及BaEVTR表現質體。在一些實施例中，以以下比率使用(a)之質體、(b)之質體、RD114TR表現質體及BaEVTR表現質體來轉導細胞系：3:3:1:1、2:2:1:1、1.5:1.5:1:1、1:1:1:1、5:5:1:1、5:4:1:1、5:3:1:1、5:2:1:1、5:1:1:1、4:5:1:1、3:5:1:1、2:5:1:1、1:5:1:1、4:4:1:1、4:3:1:1、4:2:1:1、4:1:1:1、3:4:1:1、2:4:1:1、1:4:1:1；3:3:1:1、3:2:1:1、3:1:1:1、2:3:1:1、1:3:1:1、2:2:1:1、2:1:1:1、1:2:1:1、1.5:1.5:1:1、1.5:1:1:1、1:1.5:1:1或1:1:1:1、2.5:2.5:1:1:1、2.5:2:1:1、2.5:1.5:1:1、2.5:1:1:1、2.5:0.5:1:1、2:2.5:1:1、1.5:2.5:1:1、1:2.5:1:1、0.5:2.5:1:1、2:2:1:1、2:1.5:1:1、2:1:1:1、2:0.5:1:1、1.5:2:1:1、1:2:1:1、0.5:2:1:1、1.5:1.5:1:1、1.5:1:1:1、1.5:0.5:1:1、1:1.5:1:1、0.5:1.5:1:1、1:1:1:1、1:0.5:1:1、0.5:1:1:1、0.75:0.75:1:1、0.75:0.5:1:1、0.5:0.75:1:1或0.5:0.5:1:1。 細胞及細胞群體
在一態樣中，提供如本文所揭示之細胞群體及/或其子代。在一些實施例中，細胞群體係純系的。在一些實施例中，細胞群體經分離及/或富集及/或改造。
在一態樣中，提供藉由如本文所揭示之方法產生或製備之免疫細胞(例如NK細胞及/或γδ T細胞)或其群體。進一步提供包括細胞或其群體及載劑、視情況醫藥上可接受之載劑之組合物。在一些實施例中，免疫細胞或其群體經分離及/或富集及/或改造。
另外或替代地，如本文所揭示之細胞係衍生或分化自幹細胞。在一些實施例中，所衍生及/或分化細胞及/或其細胞群體包括免疫細胞或基本上由其組成或進一步由其組成。在一些情況下，免疫細胞係選自B細胞、T細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NKT)細胞、樹突狀細胞、骨髓樣譜系細胞及/或嗜中性球。在一些實施例中，T細胞不表現CD3，亦即係CD3- T細胞。在一些實施例中，T細胞不表現CD4，亦即係CD4- T細胞。在一些實施例中，T細胞不表現CD8，亦即係CD8- T細胞。在一些實施例中，T細胞不表現以下各項中之任一者或多者：T細胞受體(TCR) α鏈、TCR β鏈或αβTCR。在一些實施例中，T細胞表現TCR γ鏈。另外或替代地， T細胞表現TCR δ鏈。在一些實施例中，T細胞係γδ T細胞。在一些情況下，免疫細胞之經分離細胞或經富集群體包括單核球、巨噬球及/或小神經膠質細胞或基本上由其組成或進一步由其組成。
在一些實施例中，細胞群體實質上包括視情況衍生自幹細胞(例如HSC及/或誘導性多潛能幹細胞(iPSC))之免疫細胞。在一些實施例中，細胞群體實質上包括視情況衍生成免疫細胞之幹細胞(例如HSC及/或iPSC)。
在一些實施例中，細胞群體實質上均質，舉例而言，群體中之至少約60%或至少約70%或至少約80%或至少約85%或至少約90%或至少約91%或至少約92%或至少約93%或至少約94%或至少約95%或至少約96%或至少約97%或至少約98%或至少約99%之細胞係相同的。
在另一態樣中，提供藉由如本文所揭示之方法產生或製備之NK細胞或其群體。進一步提供包括細胞或其群體及載劑、視情況醫藥上可接受之載劑之組合物。
在另一態樣中，提供藉由如本文所揭示之方法產生或製備之γδ T細胞或其群體。進一步提供包括細胞或其群體及載劑、視情況醫藥上可接受之載劑之組合物。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物包括小於約0.1%、小於約0.2%、小於約0.3%、小於約0.4%、小於約0.5%、小於約0.6%、小於約0.7%、小於約0.8%、小於約0.9%、小於約1.0%、小於約1.1%、小於約1.2%、小於約1.3%、小於約1.4%、小於約1.5%、小於約1.6%、小於約1.7%、小於約1.8%、小於約1.9%或小於約2.0%之aAPC。
另外或替代地，如本文所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物具有不小於30%、不小於40%、不小於50%、不小於55%、不小於60%、不小於65%、不小於70%、不小於75%、不小於80%、不小於85%、不小於90%或不小於95%之存活率。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物係無菌的。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物包括小於臨限致熱劑量(TPD)之內毒素，該臨限致熱劑量以統計學方式評價在測試個體(例如兔，例如參見Wachtel及Tsuji, 1976；Dabbah,等人，1980)中誘導發熱所需之內毒素活性程度。該TPD可基於投與途徑來測定。在一實施例中，TPD係5 EU Kg −1h −1內毒素，例如用於靜脈內或肌內投與。在一實施例中，TPD係0.2 EU Kg −1h −1內毒素，例如用於鞘內投與。
在一些實施例中，所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物針對以下各項中之一或多者為陰性：支原體、外來病毒或HHV (例如HHV6及/或HHV7)。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞群體及/或組合物在總細胞中包括大於約25%、大於約30%、大於40%、大於約45%、大於約50%、大於約55%、大於約60%、大於約65%、大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%或大於約95%之表現CAR之細胞。在其他實施例中，如本文所揭示之細胞群體及/或組合物在總細胞中包括約25%、約30%、40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之表現CAR之細胞。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞群體及/或組合物在總細胞中包括大於約25%、大於約30%、大於40%、大於約45%、大於約50%、大於約55%、大於約60%、大於約65%、大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%或大於約99%之表現CD56之細胞。在其他實施例中，如本文所揭示之細胞群體及/或組合物在總細胞中包括約25%、約30%、40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%之表現CD56之細胞。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞群體及/或組合物在總細胞中包括小於約0.1%、小於約0.2%、小於約0.3%、小於約0.4%、小於約0.5%、小於約0.6% 、小於約0.7% 、小於約0.8% 、小於約0.9% 、小於約1.0% 、小於約1.1% 、小於約1.2% 、小於約1.3% 、小於約1.4% 、小於約1.5% 、小於約1.6% 、小於約1.7% 、小於約1.8% 、小於約1.9%或小於約2.0%之表現CD3之細胞。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物包括小於約2、小於約3、小於約4、小於約5、小於約6、小於約7、小於約8、小於約9或小於約10個多核苷酸拷貝/細胞。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物在不存在IL-2及/或IL-21下缺乏增殖。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物具有強效能力(亦即功效)，例如為並非藉由如本文所揭示之任何培養步驟及/或引入步驟製得之免疫細胞的1倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍或更高倍數。該等功效可量測為IFNγ及/或其他促發炎細胞介素之分泌及/或CD107 (例如CD107a)之表現。例如參見Orange等人，J Exp Med. 1995 Oct 1;182(4):1045-56；及McElroy等人，J Immunol Methods. 2007 Dec 1;328(1-2):45-52。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物表現一或多種抗原(例如CD19、NKp46或NKG2D)。
在其他實施例中，該等細胞、細胞群體及/或組合物可用於治療及/或預防有需要之個體之癌症或測試新療法。
在一些實施例中，如本文所揭示之細胞及/或其群體及/或組合物(例如投與有需要之個體者)包括大於1 × 10 6個細胞/公斤擬治療個體體重(包含(但不限於)大於2 × 10 6個細胞/公斤、大於3 × 10 6個細胞/公斤、大於4 × 10 6個細胞/公斤、大於5 × 10 6個細胞/公斤、大於6 × 10 6個細胞/公斤、大於7 × 10 6個細胞/公斤、大於8 × 10 6個細胞/公斤、大於9 × 10 6個細胞/公斤、大於1 × 10 7個細胞/公斤、大於2 × 10 7個細胞/公斤、大於3 × 10 7個細胞/公斤、大於4 × 10 7個細胞/公斤、大於5 × 10 7個細胞/公斤、大於6 × 10 7個細胞/公斤、大於7 × 10 7個細胞/公斤、大於8 × 10 7個細胞/公斤、大於9 × 10 7個細胞/公斤或大於1 × 10 8個細胞/公斤)或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。 治療方法
在一態樣中，提供抑制癌細胞生長之方法。該方法包括使(例如)有效量之藉由如本文所揭示之方法製得之CAR表現細胞的體與癌細胞接觸或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，由CAR識別之抗原係由癌細胞表現之腫瘤相關抗原(TAA)。在一些實施例中，接觸係在活體內或在活體外。
在另一實施例中，提供治療個體之癌症之方法。該方法包括將(例如)有效量之藉由如本文所揭示之方法製得之CAR表現性免疫細胞的群體投與個體或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，由CAR識別之抗原係由癌細胞表現之TAA。在一些實施例中，投與係一線療法、二線療法、三線療法或四線療法。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，細胞群體包括NK細胞或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。另外或替代地，細胞群體包括小於或等於約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%或約2.0%之CD3+細胞。
在一些實施例中，向個體投與小於1 × 10 2、2 × 10 2、3 × 10 2、4 × 10 2、5 × 10 2、6 × 10 2、7 × 10 2、8 × 10 2、9 × 10 2、1 × 10 3、2 × 10 3、3 × 10 3、4 × 10 3、5 × 10 3、6 × 10 3、7 × 10 3、8 × 10 3、9 × 10 3、1 × 10 4個T細胞/公斤體重。
在一些實施例中，癌細胞係選自以下器官之癌細胞：循環系統，例如心臟(肉瘤[血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤]、黏液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤及脂肪瘤)、縱膈及胸膜及其他胸內器官、血管腫瘤及腫瘤相關血管組織；呼吸道，例如鼻腔及中耳、副鼻竇、喉、氣管、支氣管及肺，例如小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、支氣管原癌(鱗狀細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌)、肺泡(支氣管)癌、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨錯構瘤、間皮瘤；胃腸道系統，例如食道(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胃、胰臟(導管腺癌、胰島素瘤、升糖素瘤、胃泌素瘤、類癌腫瘤、胰腺瘤)、小腸(腺癌、淋巴瘤、類癌腫瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)、大腸(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤)；出現於任何部位之胃腸道基質腫瘤及神經內分泌腫瘤；泌尿生殖道，例如腎(腺癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilm's tumor) [腎母細胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱及/或尿道(鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睪丸(精原細胞瘤、胚胎癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、間質性細胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、類腺瘤腫瘤、脂肪瘤)；肝，例如肝細胞瘤(肝細胞癌)、膽管癌、肝母細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞腺瘤、血管瘤、胰臟內分泌腫瘤(例如嗜鉻細胞瘤、胰島素瘤、血管活性腸肽腫瘤、胰島細胞腫瘤及升糖素瘤)；骨，例如成骨肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞腫瘤、脊索瘤、骨軟骨瘤(骨軟骨性外生骨疣)、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨樣骨瘤及巨細胞腫瘤；神經系統，例如中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、顱骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃色瘤、變形性骨炎)、腦膜癌(腦膜瘤、腦脊膜肉瘤、神經膠質過多)、腦癌(星形細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、生殖細胞瘤[松果體瘤]、多形性神經膠母細胞瘤、少突神經膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜母細胞瘤、先天性腫瘤)、脊髓神經纖維瘤、腦膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)；生殖系統，例如婦科，子宮(子宮內膜癌)、子宮頸(子宮頸癌、腫瘤前期子宮頸發育不良)、卵巢(卵巢癌[漿液囊腺癌、黏液囊腺癌、未分類癌]、粒層泡膜細胞腫瘤、塞托利-雷丁氏細胞腫瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)、外陰(鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤)、胎盤、陰道(透明細胞癌、鱗狀細胞癌、葡萄形肉瘤(胚胎型橫紋肌肉瘤)、輸卵管(癌)及與女性生殖器官有關之其他部位；陰莖、前列腺、睪丸及與男性生殖器官有關之其他部位；血液學系統，例如血液(骨髓樣白血病[急性及慢性]、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球性白血病、骨髓增殖性疾病、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群)、何傑金氏疾病(Hodgkin's disease)、非何傑金氏淋巴瘤[惡性淋巴瘤]；口腔，例如唇、舌、齒齦、口底、上顎及其他口腔部分、腮腺及其他唾液腺部分、扁桃體、口咽、鼻咽、梨狀隱窩、下嚥及唇、口腔及咽中之其他部位；皮膚，惡性黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤、結構不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤及瘢痕瘤；腎上腺：神經母細胞瘤；及其他組織，包括結締組織及軟組織、腹膜後腔及腹膜、眼睛、眼內黑色素瘤及附屬結構、乳房、頭或/及頸、肛門區、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺腺及其他內分泌腺及相關結構、淋巴結繼發性及未特指惡性贅瘤、呼吸及消化系統繼發性惡性贅瘤及其他部位之繼發性惡性贅瘤。
在一些實施例中，癌細胞係實體腫瘤細胞。在其他實施例中，癌細胞並非實體腫瘤細胞。在其他實施例中，癌細胞係白血病癌細胞。在一些實施例中，癌細胞係原發性癌細胞或轉移性癌細胞。在一些實施例中，癌細胞係來自癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
其他有效療法可視需要與本發明組合及/或添加該等療法。如本文所揭示之方法之一些實施例進一步包括使細胞與單獨療法接觸或投與單獨療法。在一些實施例中，單獨療法包括手術切除術、化學療法、輻射療法、免疫療法及靶向療法或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，單獨療法係一線療法、二線療法、三線療法或四線療法。
在一些實施例中，遞送「有效量」，亦即其係足以實現有益或期望結果之量。有效量可以一或多次投與、施加或劑量來投與。該遞送取決於諸多變量，包含擬使用個別劑量單位之時間段、治療劑之生物可用性、投與途徑等。然而，應理解，本發明治療劑用於任何特定個體之具體劑量值取決於各種因素，包含所採用具體化合物之活性、個體之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食、投與時間、排泄速率、藥物組合及所治療特定病症之嚴重程度以及投與形式。通常可逐步增加治療劑量以最佳化安全性及效能。通常，來自活體外及/或活體內測試之劑量-效應關係首先可用於指導用於患者投與之適當劑量。一般而言，基因或蛋白質之期望投與量可有效達成與所發現活體外有效濃度相稱之血清含量。該等參數之測定在業內已眾所周知。該等考慮以及有效調配物及投與程序在業內已眾所周知且闡述於標準教科書中。與此定義一致，如本文中所使用，術語「治療有效量」係足以提供治療益處之量。
術語投與應包含(但不限於)經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、腦室內(ICV)、鞘內、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)、經顱內來局部或全身性投與或局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)，且可單獨或一起調配成含有適用於每一投與途徑之醫藥上可接受之習用無毒載劑、佐劑、賦形劑及媒劑之適宜劑量單位調配物。本發明並不受限於投與途徑、調配物或投藥時間表。在一些實施例中，投與係局部實施，例如投與骨髓或腦中。在一些實施例中，全身性實施投與。在一些實施例中，投與係(例如)經約1小時、約1.5小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約12小時或約1天之輸注。
進一步提供一種套組，其包括一或多種適用於如本文所揭示之方法中之藥劑及可選說明或替代地基本上由其組成或進一步由其組成。在一些實施例中，藥劑係選自下列各項中之一或多者：編碼CAR或另一治療性蛋白之多核苷酸、包括多核苷酸之載體、用於檢測細胞表型之抗體、用於分離或富集或純化免疫細胞之抗體、用於檢測如本文所揭示之多核苷酸、細胞介素及aAPC之引子。
下列實例意欲闡釋本文所揭示之實施例，且並不加以限制。 實驗方法 1 號實驗 ： γ 逆轉錄病毒載體 (PCIR) 調介之基因轉移用以遞送人類原代 NK 細胞中之嵌合抗原受體且測試其功能之獨特用途
缺乏將基因遞送至人類原代NK細胞中之有效方法、轉基因不穩定及經轉導CAR-NK細胞之生存力較低係成功CAR-NK研發及製造之主要障礙。靜脈至靜脈時間較為關鍵，此乃因患者中之不期望等待時間與較差預後相關且並非所有合格患者皆可接受療法(因較差T細胞功能、準備時間及/或復發時間)。當前可用之療法具有可變之功效及/或毒性。簡言之，患者中之受損T細胞可影響產物功效。該可變性可引起不可預測之治療結果。另外，並不罕見之3-4級細胞介素釋放會引起症候群及神經毒性。鑒於物流複雜、規模低效及可用性有限，生產成本較高。製造失敗由此包含(但不限於)不能在個別化療法中產生庫存且可能因患者起始材料有限而難以再治療。
為解決該等問題，本文提供γ逆轉錄病毒載體(PCIR)調介之基因轉移用於遞送人類原代NK細胞中之嵌合抗原受體(CAR)且測試其功能之獨特用途。
已證實，慢病毒及逆轉錄病毒載體調介之基因遞送係用於基因改造之安全方式。然而，在許多報導及甚至申請者之第一手實驗中，習用慢病毒載體調介之轉導對於NK細胞而言較為低效，此乃因CAR-NK擴增期間之轉基因表現顯著減小。例如參見 圖 5A 及 5C。因此，申請者所實施之許多嘗試旨在尋找克服慢病毒載體之低效性之替代基因遞送方法。
首先，測試莫洛尼鼠類白血病病毒衍生的SFG γ逆轉錄病毒載體針對周邊血(PB)衍生的人類原代NK細胞之基因遞送。
如 圖 1中所展示，用於本發明中之原代人類NK細胞係衍生自周邊血(PB)，且使用MACSxpress人類全血NK細胞分離套組(Miltenyi Biotec, 0.130-098-185)分離。經由使用CD56及CD3抗體將細胞染色來測定純度( 圖 2A)，且將NK細胞定義為CD56+/CD3-群體。將NK細胞與NK MACS培養基(130-114-429)在50 IU/ml人類IL-2及經輻照K562-mb21-41BBL飼養細胞(比率為1:1)存在下一起培養。使用PEQ-PEM3(-E)包裝所有γ逆轉錄病毒質體(PCIR)並使用BaEVTR或RD114TR質體包膜(以1.5:1.5:1比率)，且經由lipofectamine 3000試劑(Invitrogen™ L3000075)或PEI MAX 40K (Polysciences, Inc，目錄號：24765)瞬時轉染至293T細胞(ATCC CRL-3216)中。與由RD114TR識別之ASCT-2相比，BaEVTR質體在實踐中有益於將較大插入體遞送至表現兩種病毒進入受體ASCT-1及ASCT-2之活化NK細胞中。使用經retronectin試劑(TakaRa, T100A/B)塗覆之非組織培養板，申請者藉由將上述逆轉錄病毒顆粒感染至活化NK細胞中(培養7天)來直接實施滴定測定且使用MOI 3來生成CAR-NK。顯而易見，在分離並培養5天之後，原代NK細胞進入顯著增殖狀態，由此使用第6-10天時之活化NK細胞進行基因遞送( 圖 2B)。
然後在感染後第3天評價轉導效率。實施富集、擴增、功能及其他治療性應用。
實驗結果展示，在感染之後存在具有顯著較高存活率(介於73.51% - 82.81%之間)之NK細胞(可藉由排除低正向散射(FSC)及高側向散射(SSC)事件來獲得大致活細胞門) ( 圖 3B)，三個供體中之EGFR CAR基因(Fab-AF647陽性)轉導效率介於65.11% - 72.75%之間( 圖 3C)，且在感染後第8天三個供體中之高增殖狀態產率25、34及45倍於初始感染NK數量( 圖 3D)。此廣泛最佳化使得能夠以50% - 80%效率在原代人類NK細胞中持續轉導CAR構築體；將CAR NK細胞自10至20百萬在8天內25 ~ 45倍離體擴增至數百百萬；且達成CAR fll保留與NK細胞離體擴增。
測試更長培養。例如參見 圖 7。如本文所揭示之此廣泛最佳化使得能夠在17-24天內自數十百萬個NK細胞擴增至數十十億個NK細胞，且提供在解凍時具有極佳生存力之真正現成之冷凍產品。商業製造成本至少為約$2000/劑量且每批次具有大於500個劑量。
基於使用相同遞送策略直接感染相同增殖狀態之活化NK細胞之逆轉錄病毒滴定提供於 圖 4中。
另外，在分選後第10天，對於PCIL-EGFR-CAR-NK及PCIL-GFP空載體對照而言，GFP陽性細胞自約100%顯著減小至39% ( 圖 5A 及 5C)。然而，流動分析證實，在分選後第10天、第14天及第25天，PCIR-EGFR-CAR-NK具有高度穩定之轉導基因表現( 圖 5B 及 5C)。
另外觀察到，空載體截短CD19 (EV-Tcd19)及EGFR轉基因之轉導速率分別為平均85% (CD19-PE陽性)及79.6% (山羊抗小鼠Fab-AF647陽性) ( 圖 6A)。另外，與具有最低活細胞指數之空載體模擬轉導組及未轉導NK組相比，經改造EGFR-CAR-NK具有動態實時殺死性( 圖 6B)。
其次，申請者最佳化所擴增原代NK細胞之逆轉錄病毒轉導之時間點。因γ-逆轉錄病毒能夠有效地感染分裂細胞，故申請者確定了生長曲線及原代NK細胞進入顯著增殖狀態以供基因遞送時之時間點。
第三，若干研究已明確展示，人類原代淋巴球之轉導效率取決於用於包被逆轉錄病毒載體之套膜蛋白之類型，且經活化NK細胞高度表現受體ASCT-1及ASCT-2 (其係用於進入靶之狒狒套膜醣蛋白(BaEV-TR))。ASCT-2受體係用於進入細胞之貓類內源性逆轉錄病毒套膜醣蛋白(RD114TR)，由此測試BaEVTR及RD114TR。BaEVTR質體在實踐中用於較大插入體遞送，例如串聯CAR、雙重CAR及BiTE CAR。
接下來，已證實，RetroNectin試劑可藉由輔助共定位靶細胞及病毒體來增強逆轉錄病毒調介之基因轉導。具體而言，病毒顆粒經由與H結構域相互作用來結合RetroNectin試劑，且靶細胞主要經由細胞表面整聯蛋白受體VLA-5及VLA-4分別與纖連蛋白C結構域及CS-1位點之相互作用來進行結合。藉由促進鄰近性，RetroNectin試劑可增強針對表現整聯蛋白受體VLA-4及/或VLA-5之靶細胞之逆轉錄病毒調介之基因轉移。
另外，申請者確定了基於使用相同遞送策略直接感染相同增殖狀態之活化NK細胞之逆轉錄病毒滴定，其旨在避免高估或低估自基於不同細胞類型之間接量測方法所計算之滴定。
如本文所揭示之發現展示，組合使用RD114-TR或BaEV-TR假型γ逆轉錄病毒顆粒與RetroNectin係用以將治療基因遞送至人類原代NK細胞中之成功策略，且具有較高轉導效率、持續轉基因表現及較大細胞生存力及擴增速率。
在一些實施例中，自健康新生兒之臍帶血收集NK細胞。如所揭示來選擇最佳NK細胞候選者。然後使用飼養細胞(例如如本文所揭示之aAPC)擴增NK細胞。經擴增NK細胞發生轉導以表現CAR及/或其他組分(例如自殺開關、抗體及細胞介素)。持續離體擴增亦由外源IL-2驅動。然後收穫最終細胞產物，冷凍保存，並以高生存力解凍以用於現成投與患者。
在一些實施例中，該等方法容許選擇最佳臍帶血產物以供NK細胞擴增。與如本文所揭示之aAPC一起共培養可達成大規模NK細胞擴增。產生方法顯著減小所需逆轉錄病毒之量且使NK細胞擴增時間減少20%。達成表現CAR之高轉導效率。 2 號實驗 ： 細胞療法 ： 製程研發研究
測試支持NK生長及/或擴增之培養基及/或添加劑，包含(但不限於) StemSpan (Stemcell #09960)、NK MACS®培養基(Miltenyi research 30-114-429；GMP: 170-076-356)、TexMACS (170-076-306 GMP培養基)及Cellgenix無血清幹細胞生長培養基(SCGM, #20806-0500)。
比較細胞介素添加劑以最佳化產率，例如比較下列各項中之一或多者：100-500 U/ml IL-2、20 ng/ml IL-15、25 ng/mL IL-21或其任何組合。
實施NK細胞富集。測試下列市售套組且加以比較：Stemcell NKdepletion EasySep NK分離套組(17955RF)、RosetteSep NK富集混合劑(#15065)以及Miltenyi NK分離套組(130-092-657)及CD56 +NK細胞分離套組(130-092-660)。
測試將CD3+細胞減少至＜0.3% (亦即小於0.3%之經耗乏細胞群體)之各種CD3耗乏套組。彼等套組包含(例如) Miltenti 130-096-535。
生成經K562改造之細胞(例如表現膜結合IL-15 (sushi結構域)及/或IL-21者)。根據當前良好製造實踐來研發經改造細胞之原始細胞庫(MCB)及/或工作細胞庫(WCB)。
另外，完成K562 MCB及WCB庫之釋放測試，包含(但不限於)測試下列各項中之一或多者：無菌性、內毒素、支原體、外來病毒測試(活體外及活體內)、基於PCR之病毒測試、同功酶分析、核型分析、S +L -等。另外，測定K562標記物共表現(例如CD64/FcγRI、CD86/B7-2、CD137L/4-1BBL、截短CD19及膜結合IL-21)在4週培養時間中及在輻照(21天培養)之後之穩定性。測試K562細胞輻照以確保輻照劑係合格/有效的。在以50、100、150 Gy輻照進行輻照後第1-14天時，在平鋪之後測試生長及/或生存力之動力學。
使用經輻照K562細胞在各種NK: K562比率(例如1:2、1:1、1:3、1:5比率)下測試臍帶血衍生的NK細胞之擴增。
使用經RetroNectin塗覆之AFC袋與經RetroNectin塗覆之板比較轉導效率。
然後例如經由比較G-Rex、Xuri、Bioflow及Xcellerex生物反應器系統來放大製程。
自1 × 10 8個CD56+細胞開始生成多於1 × 10 11個CD56+細胞。首先使用較少培養物實施測試以定義生長及擴增參數且證實功能性。不期望受限於理論，細胞因高度擴增而損失功效，由此細胞擴增與功能之間之平衡係放大之主要考慮。
所用測試抗體/試劑包含(但不限於)：抗CD56亮紫(Brilliant Violet) 605 (BioLegend, San Diego, CA)、抗CD3 APC-H7、顆粒酶B-PE-CF594、CCR4-BV421、CXCR3-PerCP Cy5.5、NKp46-BV711 (BD Biosciences, San Jose CA)、CD57-PerCP (Bioss Woburn MA)、抗CD16亮紫 650及抗CD19 PE (Miltenyi Biotec Inc.)、CD44-BV785、CXCR4-BV605、2B4-PE、NKG2D-PE、DNAM-FITC、TbetBV711、CD16-BV650、CX3CR1-PE-Cy7、CD62L-PE-Cy7、CXCR1-PE、CCR7-FITC、PD-1-BV421、NKp30-生物素(來自Biolegend)、NKp44-PerCP-eflour 710、脫中胚蛋白-efluor-660、KLRG-1-PE (eBiosciences San Diego CA)、DAP12-PE、CD158-FITC (R&D Minneapolis MN)、DAP10-FITC (Antibodies-Online Atlanta GA) 、NKG2A-PE-Cy7 (Beckman Coulter Irving, TX)。 表 1例示測試
製程步驟 測試
1. 供體合格性 評審用於病原體篩選之CoA。重複生存力、細胞數、無菌性、表型、myco、HLA、HHV 6、HHV 7
2. ficoll後 生存力、細胞數、無菌性、表型
3. CD56富集後 生存力、細胞數、無菌性、表型
4. CD3耗乏後 生存力、細胞數、無菌性、表型
5. 在K562上進行第1擴增後 生存力、細胞數、無菌性、表型、K562表型、支原體
6. 在RRV轉導後 生存力、細胞數、無菌性、表型、支原體
7 a, b 擴增後 生存力、細胞數、無菌性、表型、支原體、IL-15、CAR
8. 收穫後 生存力、細胞數、無菌性、表型、K562表型、支原體、IL-15、CAR
9. 調配/釋放後 生存力、細胞數、無菌性、表型、支原體、產物釋放測試、IL-15、CAR
10. 穩定性測試 外觀、生存力、細胞 #、無菌性、支原體、CAR
11. 臨床材料 現場評審容器完整性及患者屬性
如上文所陳述，實施K562測試，包含(但不限於)產生純系K562-基因修飾細胞之庫(若細胞並非純系的，則再選殖)；測試庫之生存力、無菌性、支原體、內毒素、HLA及/或基因修飾之表面標記物(例如mb IL-15、mb IL-21、CD64、CD86、CD137L等)；研發K562-基因修飾細胞之分析證書；確保輻照劑經校準且劑量投與經驗證及測試100 Gy、200 Gy現在細胞輻照且測試14天內之增殖/存活。 表 2例示表型分析
製程步驟 測試
1. 供體合格性 CD3、CD56、CD19、CD45、HLA
2. ficoll後 CD3、CD56、CD19、CD45
3. CD56富集後 CD3、CD56、CD19、CD45、NKp46、NKG2D
4. CD3耗乏後 CD3、CD56、CD19、CD45
5. 在K562上進行第1擴增後 CD3、CD56、CD45、K562標記物
6. 在RRV轉導後 CD56
7 a, b 擴增後 CD56、K562標記物、NKp46、NKG2D、CAR
8. 收穫後 CD56、K562標記物、NKp46、NKG2D、CAR
9. 調配/釋放後 CD3、CD56、CAR
10. 穩定性測試 CD56
11. 臨床材料 現場評審容器完整性及患者屬性
實施同種異體產物之供體合格性篩選及測試，包含(但不限於)測試下列各項中之一或多者：人類免疫缺陷病毒(HIV) 1型及2型；人類嗜T淋巴球病毒(HTLV) I型及II型；B型肝炎病毒(HBV)；C型肝炎病毒(HCV)；CMV、茲卡、西尼羅；蒼白密螺旋體；HHV6/ HHV7。
臍帶血含有大約5 × 10 8個總有核細胞(TNC)，其中之30%係NK細胞。因此，每一臍帶血單元(60 mL)含有約1~2 × 10 8個NK細胞。 表 3例示表徵
測試 方法
生存力、細胞計數 7-AAD染色、流式細胞術
無菌性 Gram, 21CFR610.12
內毒素 鱟阿米巴樣細胞溶解物(Limulus amebocyte lysate)，Endosafe
支原體 MycoAlert快速檢測套組
HHV 測試 測試HHV6、HHV7
殘餘腫瘤負荷 流式細胞術
細胞數 流式細胞術
CAR 表現 CAR+細胞%，流式細胞術
純度、表型 CD56+細胞%，流式細胞術
轉基因拷貝數 Taqman PCR
功效 針對靶抗原 +細胞之細胞毒性
屬性 供體及最終產物之HLA匹配(低解析度I類)
表 4例示製程中測試
測試 方法 建議規格
生存力、細胞計數 7-AAD染色、流式細胞術 ⩾70%存活
無菌性 Gram, 21CFR610.12 在第7天為陰性(自動化測試)
內毒素 鱟阿米巴樣細胞溶解物，Endosafe ＜5 EU Kg −1 h −1
支原體 MycoAlert快速檢測套組 陰性
殘餘腫瘤負荷 流式細胞術、PCR ＜ 0.3% K562細胞，K562細胞DNA
細胞數 流式細胞術 1ee7個細胞/ kg
CAR 表現 CAR+細胞%，流式細胞術 ＞ 50% CAR +細胞
純度，表型 CD56+細胞%，流式細胞術 ＞ 95% CD56 +細胞，＜ 0.3% CD3 +
轉基因拷貝數 Taqman PCR ＜ 4個拷貝/細胞
功效 針對靶抗原 +細胞之細胞毒性 IFN-γ分泌增加＞ 10倍或CD107分析
屬性 供體及最終產物之HLA匹配(低解析度I類) 證實失配
僅資訊 流式細胞術 CD19、NKp46、NKG2D、細胞聚集、葡萄糖、乳酸鹽
表 5例示釋放測試 ：NK-FLT3-CAR
測試 方法 建議規格
外觀 目測檢查 渾濁液體懸浮液
生存力 台盼藍(Trypan blue)排除、7-AAD染色 ⩾70%存活
無菌性 21CFR610.12 (14天測試) 在第14天為陰性(好氧性及厭氧性)
內毒素 鱟阿米巴樣細胞溶解物，Endosafe ＜5 EU Kg −1 h −1
支原體 培養方法USP/EU 陰性
外來病毒 PCR 陰性
HHV 測試 測試HHV6、HHV7 陰性
殘餘腫瘤負荷 流式細胞術 ＜0.3% K562細胞
細胞數 流式細胞術 1 × 10 7個細胞/ kg
CAR 表現 CAR+細胞%，流式細胞術 ＞ 50% FLT3 +細胞
純度、表型 CD56+細胞%，流式細胞術 ＞ 95% CD56 +細胞，＜ 0.3% CD3+
轉基因拷貝數 PCR ≤ 4個拷貝/細胞
功效 針對靶抗原 +細胞之細胞毒性 IFN-γ分泌增加≥10倍或CD107分析
RCR S+/ L-分析 不存在複製勝任性逆轉錄病毒EOP細胞
轉變 測試+/- IL-2或IL-21之生長 確保在不存在細胞介素下之增殖
屬性 供體及最終產物之HLA匹配(低解析度I類) 證實失配
測試NK純度。不期望受限於理論，至關重要的是應減少來自NK產物之T細胞，此乃因患者在接受 ≥0.5 × 10 5個T細胞/kg體重時發生≥ II級急性移植物抗宿主病( GvHD)，且在T細胞污染為0.03 × 10 5個T細胞/kg體重時NK細胞劑量充分耐受，由此定義≤ 0.3% CD3+細胞之接受準則。例如參見Stern M, Passweg JR, Meyer-Monard S等人，Preemptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective Phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant 2013;48:433-438。
實施功效分析。利用CAR-NK細胞使用用於IFN-γ、IL-15及TNF-α之ELISA及/或用於細胞毒性活性之分析(例如殺死分析、去顆粒分析(例如用於CD107a去顆粒分析之FACS)及用於細胞內細胞介素IFN-γ及/或TNF-α之FACS)來測試CAR+及CAR-靶細胞。 3 號實驗 ： 用於生成具有大尺寸轉基因之載體之穩定逆轉錄病毒生產者 -293VEC-BaE
在293Vec-GalV及293Vec-BaEV包裝細胞上評估逆轉錄病毒進入受體表現，且使用兩種細胞系Jurkat T及HT1080進行滴定。
在逆轉錄病毒中，狒狒內源性病毒(BaEV)及貓類內源性逆轉錄病毒(RD114)使用公共細胞表面受體ASCT2 (鈉依賴性中性胺基酸轉運蛋白)進入細胞。除ASCT2外，BaEV亦使用ASCT1作為細胞進入受體。長臂猿白血病病毒(GALV)使用鈉依賴性磷酸轉運蛋白(Pit1)作為其進入受體。參見 圖 8A。在兩種包裝細胞系293Vec-GalV及293Vec-BaEV以及兩種滴定細胞系Jurkat T及HT1080上實施針對ASCT1、ASCT2及Pit1之免疫染色。參見 圖 8B中所展示之結果。可使用兩種細胞系Jurkat T及HT1080來滴定三種逆轉錄病毒套膜蛋白BaEV、RD114及GALV (因其進入受體之普遍表現)。對於293基包裝細胞系293Vec GALV及293Vec BaEV而言，僅GALV假型逆轉錄病毒可使用進入受體Pit1將其感染。
用於生成穩定逆轉錄病毒生產者-293VEC-BaEV之轉導策略之工作流程提供於本文中。
使用基於莫洛尼鼠類白血病病毒(Mo-MuLV)之逆轉錄病毒載體(PCIR)作為靶轉基因遞送媒劑。使用BaEV假型化293Vec-BaEV包裝細胞系來產生媒劑以感染臍帶血衍生的NK細胞。
使用以下兩種包裝細胞系進行此產生：293Vec-GALV (用以產生瞬時長臂猿白血病病毒(GALV)假型上清液)及293Vec-BaEV (用以生成最終載體)。兩種細胞系皆係由BioVec Pharma供應。
首先，藉由使用試劑PEI MAX 40K (Polysciences, Inc，目錄號：24765)瞬時轉染包裝細胞系293Vec-GALV來生成GALV假型逆轉錄病毒上清液。簡言之，在轉染前一天，將0.6百萬個293Vec-GALV接種於6孔板之孔上之3 ml完整DMEM培養基(含有10%熱滅活胎牛血清)。在轉染當天，293Vec-GALV應80%鋪滿。將總共2.5 μg含有靶轉基因之單一Mo-MuLV基逆轉錄病毒載體稀釋於150 μl Opti-MEM™減血清培養基中。同時，亦將總共10 μg/10μl之PEI MAX 40K稀釋於150 μl Opti-MEM™減血清培養基中。質體/DNA與PEI MAX 40K之比率為1:4。然後將經稀釋DNA添加至PEI 40K中，混合孔，並在室溫下於通風櫥中培育12分鐘。在培育之後，將300 μl DNA-PEI MAX 40K複合物輕輕逐滴添加至3 ml培養物中之細胞中。
然後使用此上清液轉導BaEV假型化包裝細胞系293Vec-BaEV以生成批量生產者。對於高效價純系生成而言，可藉由限制性稀釋進一步單細胞選殖此293Vec- BaEV批量生產者並篩選藉由滴定自每一純系生成之上清液所選擇之高效價純系。
然後，可自高效價穩定逆轉錄病毒生產者-293VEC-BaEV連續產生上清液。
自用於具有大尺寸轉基因之載體之穩定逆轉錄病毒生產者-293VEC-BaEV觀察到原始上清液之改良效價。參見 圖 10。
「多個靶組合為一」係由申請者研發之獨特治療策略。使用BaEV假型化293Vec-BaEV包裝細胞系來產生媒劑。用於具有較大轉基因插入體(＞11 kb)之質體之代表性逆轉錄病毒係由293Vec-BaEV包裝細胞瞬時及穩定地產生。將總共3.5百萬個293Vec-BaEV包裝細胞接種於100 mm組織培養盤中，並在37℃下培育48-72 h。板應達到90-100%鋪滿。然後收集原始上清液並在1500 g下旋轉5 min。在Jurkat T細胞上滴定上述上清液。將一系列病毒上清液加載於經RetroNectin預塗覆性非組織培養液處理之24孔板上並使用包括10%熱滅活胎牛血清之完整DMEM培養基達到500 μl。將板在32℃、2000g下旋轉2小時，且添加0.1百萬個Jurkat T細胞，並在1000g下旋轉5 min。將板在37℃下培育48h，然後實施流式細胞術分析以根據下式測定效價(轉導單位/ml)：轉導單位(TU)/mL = [(靶細胞數) × (陽性細胞%)]。在此實例中，藉由針對人類CD34抗體(QBEnd/10) (別藻藍蛋白) (Novus Biologicals, LLC, #FAB7227A)之流式抗體檢測報告基因RQR8。B). 與暫時產生之病毒(TU=2.2E5)相比，來自用於具有大尺寸轉基因之載體之穩定逆轉錄病毒產生者-293VEC-BaEV (TU=7.2E5)之原始上清液具有改良效價。 等效內容
應理解，儘管已聯合上述實施例闡述了本發明，但前述闡述及實例意欲進行闡釋且並不限制本發明範圍。熟習本發明所屬技術者應明瞭本發明範圍內之其他態樣、優點及修改。
應理解，儘管本發明已藉由具體實施例及可選特徵具體揭示，但熟習此項技術者可採取對本文中所揭示之實施例之修改、改良及變化，且該等修改、改良及變化視為在本發明範圍內。本文所提供之材料、方法及實例代表特定實施例，係實例性，且並不意欲限制本發明範圍。
本發明範圍已經在本文中廣泛地且一般性地予以闡述。在一般揭示內容內之更窄種及亞屬組群中之每一者亦形成本發明之一部分。此包含一般闡述，條件或消極限制係將任何標的物自該類屬中去除，而不管所除去材料是否在本文中具體敘述。
另外，倘若本發明之特徵或態樣藉助馬庫西群(Markush group)來闡述時，則熟習此項技術者將認識到，由此本發明亦可藉助馬庫西群之任一個別成員或成員之亞群來闡述。
本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻之全部內容皆以引用方式明確併入本文中，其併入程度如同每一者個別地以引用方式併入一般。倘若出現衝突，則以本說明書(包含定義)為準。 部分序列表
IgG1鉸鏈結構域：LEPKSCDKTHTCPPCPDPKGT (SEQ ID NO: 1)
CD28跨膜及細胞質結構域：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 2)
CD3 ζ信號傳導結構域：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 3)
IL 2信號肽：MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 4),
IgG1信號肽：MGWSSIILFLVATATGVH (SEQ ID NO: 5)
抗NKG2D抗原結合結構域之CDR： CDRL1:SGSSSNIGNNAVN (SEQ ID NO: 6) CDRL2: YDDLLPS (SEQ ID NO: 7) CDRL3: AAWDDSLNGPV (SEQ ID NO: 8) CDRH1: GFTFSSY (SEQ ID NO: 9) CDRH2: RYDGSN (SEQ ID NO: 10) CDRH3: DRGLGDGTYFDY (SEQ ID NO: 11)
抗NKG2D輕鏈可變區： QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 12)
抗NKG2D重鏈可變區： QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 13)
肽連接體：GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 14)
人類IgG4 Fc區：ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 81)
具有F234A、L235A及N297Q突變(亦即分別係SEQ ID NO: 81之aa 16、aa 17及aa 79處之突變)之人類IgG4 Fc區等效物ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 82)
人類肌肉醛縮酶(HMA)肽連接體：PSGQAGAAASESLFVSNHAY (SEQ ID NO: 83)
可檢測標記物：YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 84)
T2A肽：HVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 85)
編碼信號肽之核苷酸序列：ATGGGGTGGTCAAGCATTATTCTGTTTCTGGTCGCTACCGCTACAGGCGTCCAT (SEQ ID NO: 86)
編碼信號肽之核苷酸序列： ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT (SEQ ID NO: 87)
編碼連接肽之核苷酸序列：GGTGGGGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGAGGTGGCAGT (SEQ ID NO: 88)
編碼跨膜及細胞質結構域之核苷酸序列：TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 89)
編碼信號傳導結構域之核苷酸序列：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 90)或其等效物；
編碼可裂解肽之核苷酸序列：CACGTGGGTTCTGGAGAAGGACGCGGTTCCTTGTTGACGTGTGGCGATGTAGAGGAAAATCCGGGTCCA (SEQ ID NO: 91)
編碼連接體之核苷酸序列：CCGAGCGGCCAGGCGGGCGCGGCGGCATCGGAGTCCCTGTTTGTGTCAAATCACGCCTAC (SEQ ID NO: 92)
編碼鉸鏈結構域之核苷酸序列：CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCGGATCCCAAAGGTACC (SEQ ID NO: 109)
肽連接體：(甘胺酸-絲胺酸)n，其中n係1至6之整數，(SEQ ID NO: 110)
6× His標籤：His His His His His His (SEQ ID NO: 111)
鉸鏈結構域：IgG1重鏈鉸鏈編碼序列： CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG (SEQ ID NO: 112)
CD28跨膜區編碼序列： TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG (SEQ ID NO: 113)
4-1BB共刺激信號傳導區編碼序列： AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (SEQ ID NO: 114)
CD28共刺激信號傳導區編碼序列： AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 115)
CD3 ζ信號傳導區編碼序列： AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA (SEQ ID NO: 116)
人類CD8 α鉸鏈結構域：PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY (SEQ ID NO: 117)。
小鼠CD8 α鉸鏈結構域：KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY (SEQ ID NO: 118)。
貓CD8 α鉸鏈結構域：PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY (SEQ ID NO: 119)。
人類CD8 α跨膜結構域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 120)。
小鼠CD8 α跨膜結構域：IWAPLAGICVALLLSLIITLI (SEQ ID NO: 121)。
大鼠CD8 α跨膜結構域：IWAPLAGICAVLLLSLVITLI (SEQ ID NO: 122)。
4-1BB共刺激信號傳導區：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 123)
CD28序列：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 124)
ICOS共刺激信號傳導區編碼序列： acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta (SEQ ID NO: 125)
OX40共刺激信號傳導區編碼序列： AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC (SEQ ID NO: 126)
連接體：GGGGS (SEQ ID NO: 134)。
連接體：(GGGGS)n，其中n可為整數1 (SEQ ID NO: 134)或2 (SEQ ID NO: 135)或3 (SEQ ID NO: 14)或4 (SEQ ID NO: 136)或5 (SEQ ID NO: 137)或6 (SEQ ID NO: 138)或7 (SEQ ID NO: 139)或8 (SEQ ID NO: 140)或9 (SEQ ID NO: 141)或10 (SEQ ID NO: 142)或11(SEQ ID NO: 143)或12(SEQ ID NO: 144)或13 (SEQ ID NO: 145)或14 (SEQ ID NO: 146)或15(SEQ ID NO: 147)或更大。
EF1 α啟動子序列： AAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC (SEQ ID NO: 148)
SEQ ID NO: 71之反向序列：AVGTIVDQSAK (SEQ ID NO: 151)
IgG1重鏈信號肽DNA ATGGAATTTGGGCTGCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGATGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 168)
蛋白質 MEFGLRWVFLVAILKDVQC (SEQ ID NO: 169)
IgG1 FcDNA GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCC (SEQ ID NO: 170)
由IgG1 FcDNA編碼之蛋白質 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA (SEQ ID NO: 171) 本發明之例示實施例
實施例1.   一種假型γ逆轉錄病毒顆粒，其包括經修飾RD114貓類內源性逆轉錄病毒套膜醣蛋白(RD114TR)及經修飾狒狒套膜醣蛋白(BaEVTR)，其中： a.該RD114TR醣蛋白包括RD114醣蛋白之胞外結構域及跨膜結構域以及雙嗜性鼠類白血病病毒(MLV-A)醣蛋白之細胞質結構域；且 b.其中該BaEVTR醣蛋白包括狒狒套膜醣蛋白(BaEV)之胞外結構域及跨膜結構域以及MLV-A醣蛋白之細胞質結構域。
實施例2.   如實施例1之假型γ逆轉錄病毒顆粒，其中該RD114TR及該BaEVTR作為膜蛋白納入該γ逆轉錄病毒顆粒之套膜中。
實施例3.   如實施例1或2之假型γ逆轉錄病毒顆粒，其進一步包括囊封於該套膜中之載體基因體，其中該載體基因體包括下列側接有兩個長末端重複(LTR)者中之一或多者： (A)    編碼嵌合抗原受體(CAR)或另一治療性蛋白或多肽之多核苷酸，該治療性蛋白或多肽視情況選自抗體或其片段、酶、配體或受體， (B)    (A)之反向補體，或 (C)    包括一或多個識別位點之多核苷酸，該等識別位點視情況由適於將CAR編碼序列或其反向補體插入該多核苷酸中之限制酶識別及裂解。
實施例4.   如實施例1至3中任一項之假型γ逆轉錄病毒顆粒，其中該載體基因體進一步包括下列各項中之一或多者：5’ LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’ LTR。
實施例5.   如實施例1至4中任一項之假型γ逆轉錄病毒顆粒，其進一步包括逆轉錄酶或整合酶中之任一者或兩者。
實施例6.   如實施例1至5中任一項之假型γ逆轉錄病毒顆粒，其係選自下列物種中之任一者：莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(friend murine embryonic stem cell virus，FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒。
實施例7.   一種製備天然殺手(NK)細胞之群體之方法，其包括將包括下列各項中之一或多者之細胞群體與免疫細胞活化劑(例如NK細胞活化劑)一起培養：NK細胞、能夠衍生NK細胞之祖細胞或能夠衍生NK細胞之幹細胞，其中該細胞群體在細胞群體中耗乏表現以下各項中之一或多者之細胞：CD3、CD4、CD8、T細胞受體(TCR) α鏈、TCR β鏈或αβTCR，且其中該免疫細胞活化劑係選自下列(i)至(iv)中之一或多者： (i)     人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長， (ii)    一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合NK細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖NK細胞，視情況其中該抗體係選自以下中之一或多者：抗CD2抗體、抗CD16抗體、抗NKG2D抗體、抗DNAM-1抗體、抗2B4抗體、抗NTB-A抗體或抗NKp46 (天然細胞毒性受體1 (NCR1))抗體， (iii)   一或多種由此活化或增殖NK細胞之細胞介素，或 (iv)   一或多種由此活化或增殖NK細胞之化學部分，其視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)。
實施例8.   如實施例7之方法，其進一步包括將編碼CAR或另一視情況選自抗體或其片段、酶、配體或受體之治療性蛋白或多肽之多核苷酸引入經培養細胞群體中以供表現，其中該CAR特異性識別且結合該腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原。
實施例9.   如實施例8之方法，其進一步包括在實施例8之該引入步驟之後將該細胞群體與免疫細胞活化劑一起培養，其中該免疫細胞活化劑係選自下列(i)至(iv)中之一或多者： (i)     人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長， (ii)    一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合NK細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖NK細胞， (iii)   一或多種由此活化或增殖NK細胞之細胞介素，或 (iv)   一或多種由此活化或增殖NK細胞之化學部分，其視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)， 視情況其中使用相同或不同之免疫細胞活化劑或其組合重複該培養步驟一次、兩次、三次或更多次。
實施例10. 如實施例7至9中任一項之方法，其中該等aAPC進一步表現以下各項中之一或多者：4-1BBL、膜結合(mb) IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25結合之mb IL-2突變體、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之mb IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc; ALT-803)或調介CD122/CD132信號傳導之細胞表面標記物。
實施例11. 如實施例7至10中任一項之方法，其中該等aAPC進一步表現mb IL-21及4-1BBL。
實施例12. 如實施例7至11中任一項之方法，其中該等aAPC係經改造K562細胞。
實施例13. 如實施例7至12中任一項之方法，其中輻照該等aAPC，由此缺乏細胞增殖或缺乏長期存活。
實施例14. 如實施例13之方法，其中在50 Gy、100 Gy、150 Gy或200 Gy下輻照該等aAPC。
實施例15. 如實施例7至14中任一項之方法，其中以約10:1、約5:1、約3:1、約2:1、約1:1、約1:2、約1:3、約1:5或約1:10之細胞數比將該aAPC與該細胞群體一起培養。
實施例16. 如實施例7至15中任一項之方法，其中該等細胞介素係選自由以下組成之群：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、缺乏CD25結合之IL-2突變體、IL-7、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803可溶性)、IL-15、IL-18、IL-21、LEC、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)或MICA。
實施例17. 如實施例16之方法，其中將該細胞群體與100-500 IU/ml IL-2、20 ng/ml IL-15或25 ng/mL IL-21中之任一者或任兩者或所有三者一起培養。
實施例18. 如實施例16之方法，其中將該細胞群體與50 IU/ml IL-2及0.5 ng/ml IL-15中之任一者或兩者一起培養。
實施例19. 如實施例16之方法，其中將該細胞群體與50 IU/ml IL-2一起培養。
實施例20. 如實施例9至19中任一項之方法，其中在該引入步驟之前及之後與該細胞群體一起培養之該活化劑係相同的。
實施例21. 如實施例9至19中任一項之方法，其中在該引入步驟之前及之後與該細胞群體一起培養之該活化劑彼此不同。
實施例22. 如實施例8至21中任一項之方法，其包括將假型γ逆轉錄病毒顆粒引入該經培養細胞群體中，由此將該CAR編碼多核苷酸引入該經培養細胞中，其中該顆粒包括側接有兩個長末端重複(LTR)之該CAR編碼多核苷酸或其反向補體、RD114TR及BaEVTR。
實施例23. 如實施例22之方法，其中該假型γ逆轉錄病毒顆粒包括載體基因體，該載體基因體包括5’ LTR、5’帽、t該CAR編碼多核苷酸或其反向補體、3’聚-A尾部及3’ LTR。
實施例24. 如實施例22或23之方法，其中該假型γ逆轉錄病毒顆粒進一步包括逆轉錄酶及整合酶中之任一者或兩者。
實施例25. 如實施例22至24中任一項之方法，其中該假型γ逆轉錄病毒顆粒係選自以下任何物種：莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒。
實施例26. 如實施例22至25中任一項之方法，其中以約0.1、約0.2、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10之感染複數(MOI)將該假型γ逆轉錄病毒顆粒引入該經培養細胞群體中。
實施例27. 如實施例8至26中任一項之方法，其中將該細胞群體在該引入步驟之前培養至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天或至少約10天。
實施例28. 如實施例8至27中任一項之方法，其中將該細胞群體在該引入步驟之前培養不超過7天、不超過8天、不超過9天、不超過10天、不超過11天、不超過12天、不超過13天、不超過14天、不超過15天、不超過3週或不超過1個月。
實施例29. 如實施例8至27中任一項之方法，其中將該細胞群體在該引入步驟之前培養約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天。
實施例30. 如實施例8至29中任一項之方法，其中經由在RetroNectin存在下轉導包括該CAR編碼多核苷酸或其反向補體之病毒載體來將該CAR編碼多核苷酸引入該細胞群體中。
實施例31. 如實施例30之方法，其中將該RetroNectin塗覆於轉導該細胞群體之容器之內表面上。
實施例32. 如實施例30或31之方法，其中該細胞群體表現整聯蛋白α4β1 (VLA-4)及整聯蛋白α5β1 (VLA-5)中之任一者或兩者。
實施例33. 如實施例7至32中任一項之方法，其中該細胞群體係分離自個體之血樣。
實施例34. 如實施例7至33中任一項之方法，其中該細胞群體係分離自以下各項中之一或多者：個體之臍帶血、個體之周邊血或個體之骨髓。
實施例35. 如實施例7至34中任一項之方法，其中該細胞群體包括祖細胞、胚胎幹細胞、胚胎幹細胞衍生的細胞、胚胎生殖細胞、胚胎生殖細胞衍生的細胞、幹細胞、幹細胞衍生的細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)或永生化細胞。
實施例36. 如實施例7至35中任一項之方法，其進一步包括富集該細胞群體中表現以下各項中之任一者或多者之細胞：CD56、CD25、CD122、CD212、CD215、CD218、CD360、TGF-βR或IL-10R，且視情況進一步包括富集CD56 dim細胞及CD56 bright細胞中之任一者或兩者。
實施例37. 如實施例7至36中任一項之方法，其中任何細胞群體包括天然殺手(NK)細胞或其實質上經純化組合物。
實施例38. 如實施例7至37中任一項之方法，其中該經耗乏細胞群體包括下列各項中之一或多者：NK細胞、祖細胞、HSC、iPSC或其各自之實質上經純化群體。
實施例39. 如實施例37或38之方法，其中該等NK細胞包括衍生自下列各項中之一或多者之細胞：祖細胞、胚胎幹細胞、胚胎幹細胞衍生的細胞、胚胎生殖細胞、胚胎生殖細胞衍生的細胞、幹細胞、幹細胞衍生的細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)或永生化細胞。
實施例40. 如實施例38之方法，其中該等祖細胞、HSC或iPSC中之一或多者能夠衍生NK細胞。
實施例41. 如實施例7至40中任一項之方法，其中任何細胞群體實質上不含T細胞。
實施例42. 如實施例7至41中任一項之方法，其中任何細胞群體實質上不含T調控細胞。
實施例43. 如實施例7至42中任一項之方法，其中任何細胞群體係經分離、富集或純化的。
實施例44. 如實施例7至43中任一項之方法，其中在該培養步驟中將該細胞群體及該等aAPC在選自以下之細胞培養基中一起培養：StemSpan (Stemcell #09960)、NK MACS®培養基(Miltenyi research 30-114-429；GMP: 170-076-356)、TexMACS (170-076-306 GMP培養基)、Cellgenix無血清幹細胞生長培養基(SCGM, #20806-0500)或ImmunoCult™-XF培養基(來自Stemcell technologies)。
實施例45. 如實施例7至44中任一項之方法，其進一步包括以下步驟中之任一者或兩者： 將該CAR表現群體調配成組合物；及 冷凍保存該CAR表現群體。
實施例46. 如實施例7至45中任一項之方法，其自1 × 10 8個細胞生成大於1 × 10 11個細胞。
實施例47. 如實施例7至46中任一項之方法，其進一步包括以下步驟中之任一者或兩者： 在一或多個步驟之前或之後洗滌該細胞群體，及 在一或多個步驟之前或期間或之後檢測下列各項中之一或多者： (i)     該細胞群體之生存力； (ii)    該細胞群體之無菌性； (iii)   該細胞群體中之支原體； (iv)   該細胞群體之人類白血球抗原(HLA)類型； (v)    該細胞群體之細胞數； (vi)   該細胞群體之細胞表型； (vii)  該細胞群體或包括該細胞群體之組合物中之HHV6或HHV7或二者； (viii) 該細胞群體或包括該細胞群體之組合物中之以下各項中之一或多者：人類免疫缺陷病毒(HIV) 1型及2型、人類嗜T淋巴球病毒(HTLV) I型及II型、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、CMV、茲卡(Zika)、西尼羅(West Nile)或蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)； (ix)   該等aAPC之細胞表型； (x)    包括該細胞群體之組合物中之IL-15含量； (xi)   該細胞群體中之CAR表現； (xii)  該細胞群體或包括該細胞群體之組合物中之內毒素； (xiii) 包括該細胞群體之組合物之殘餘腫瘤負荷及/或aAPC污染； (xiv) 該細胞群體之子代； (xv)  由該細胞群體釋放之IFN-γ、IL-15及TNF-α； (xvi) 該細胞群體之細胞毒性活性； (xvii) 該細胞群體之去顆粒；及 (xviii)    監測或測定培養物之下列各項中之一或多者：細胞聚集、葡萄糖或乳酸鹽。
實施例48. 如實施例47之方法，其中該表型檢測包括檢測下列各項中之一或多者之細胞表現或表現含量：CD3、CD56、抗原(例如CD19)、CD45、HLA、NKp46、NKG2D、NKG2A、NCRs、DNAM-1、CD16、IL-2R、CXCR4、KIRS、CD8、CD57、黏附分子、NKG2C、CD107a、CAR或由該細胞群體表現之細胞表面標記物。
實施例49. 如實施例48之方法，其中該表型檢測包括檢測該細胞群體對CD56之細胞表現含量。
實施例50. 如實施例8至49中任一項之方法，其中該CAR之抗原結合結構域特異性識別且結合下列各項中之一或多者： G蛋白偶合受體C類家族5成員D (GPRC5D)、B細胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7 (CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生長因子受體(EGFRwt)、表皮生長因子受體變體III (EGFRVIII)、FLT3、CD70、間皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、ERBB2 (Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1 (CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、介白素13受體α 2 (IL13Ra2)、鳥苷醯基環化酶C (GUCY2C)、腫瘤相關醣蛋白-72 (TAG-72)、胸苷激酶1 (TK1)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神經節苷脂G2 (GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮細胞黏附分子前體(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT組、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、黏蛋白 1 (Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin) B2、纖維母細胞活化蛋白 α (FAP)、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、肝配蛋白A型受體2前體(EphA2)、岩藻糖基 GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白 17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原 1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位切斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、天門冬醯胺內肽酶、HPV E6、E7、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、FCRL5或IGLL1。
實施例51. 如實施例8至50中任一項之方法，其中該抗原係選自下列各項或其各自之片段中之一或多者： G蛋白偶合受體C類家族5成員D (GPRC5D)、B細胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7 (CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生長因子受體(EGFRwt)、表皮生長因子受體變體III (EGFRVIII)、FLT3、CD70、間皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、ERBB2 (Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1 (CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、介白素13受體α 2 (IL13Ra2)、鳥苷醯基環化酶C (GUCY2C)、腫瘤相關醣蛋白-72 (TAG-72)、胸苷激酶1 (TK1)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神經節苷脂G2 (GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮細胞黏附分子前體(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT組、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、黏蛋白 1 (Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin) B2、纖維母細胞活化蛋白 α (FAP)、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、肝配蛋白A型受體2前體(EphA2)、岩藻糖基 GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白 17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原 1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位切斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、天門冬醯胺內肽酶、HPV E6、E7、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、FCRL5或IGLL1。
實施例52. 如實施例8至51中任一項之方法，其中該CAR包括(1)特異性識別且結合抗原之抗體之抗原結合結構域；(2)鉸鏈結構域；(3)跨膜結構域；及(4)細胞內結構域，其包括信號傳導結構域。
實施例53. 如實施例8至52中任一項之方法，其中該CAR包括(1)特異性識別且結合抗原之抗體之抗原結合結構域；(2)鉸鏈結構域；(3)跨膜結構域；及(4)細胞內結構域，其包括信號傳導結構域及共刺激結構域。
實施例54. 如實施例8至53中任一項之方法，其中該CAR進一步包括信號肽。
實施例55. 如實施例53或54之方法，其中該鉸鏈結構域包括CD8 α鉸鏈結構域。
實施例56. 如實施例53至55中任一項之方法，其中該跨膜結構域包括CD8α跨膜結構域。
實施例57. 如實施例53至56中任一項之方法，其中該細胞內結構域進一步包括(1)一或兩個或更多個共刺激信號傳導區。
實施例58. 如實施例57之方法，其中該共刺激信號傳導區包括CD28共刺激信號傳導區或4-1BB共刺激信號傳導區或二者。
實施例59. 如實施例53至58中任一項之方法，其中該信號傳導結構域包括CD3 ζ信號傳導結構域。
實施例60. 如實施例8至59中任一項之方法，其中該所引入多核苷酸進一步表現細胞介素及抗體中之一或多者，或其中該方法進一步包括將表現細胞介素及抗體中之一或多者之另一多核苷酸引入經耗乏細胞群體中。
實施例61. 如實施例60之方法，其中由該多核苷酸表現之該細胞介素係選自下列各項中之一或多者：B7.1(可溶性或膜結合性)、CCL19(可溶性或膜結合性)、CCL21(可溶性或膜結合性)、CD40L(可溶性或膜結合性)、CD137L(可溶性或膜結合性)、GITRL(可溶性或膜結合性)、GM-CSF(可溶性或膜結合性)、IL-12(可溶性或膜結合性)、IL-2(可溶性或膜結合性)、低毒性IL-2(可溶性或膜結合性)、缺乏cd25結合之IL-2類似物(可溶性或膜結合性)、IL-15-N72D超激動劑以及IL-15RαSushi-Fc融合蛋白(可溶性或膜結合性)、IL-15 (可溶性或膜結合性)、IL-18 (可溶性或膜結合性)、IL-21 (可溶性或膜結合性)、LEC (可溶性或膜結合性)、OX40L (可溶性或膜結合性)、IL-7 (可溶性或膜結合性)、ICOSL (B7H2、B7RP1，可溶性或膜結合性)或MICA (可溶性或膜結合性)。
實施例62. 如實施例60或61之方法，其中由該多核苷酸表現之該抗體係單特異性抗體或雙特異性抗體或多特異性抗體。
實施例63. 如實施例60至62中任一項之方法，其中由該多核苷酸表現之該抗體係免疫細胞活化劑。
實施例64. 如實施例8至63中任一項之方法，其中該多核苷酸進一步編碼信號肽。
實施例65. 如實施例8至64中任一項之方法，其中該多核苷酸進一步包括自殺基因。
實施例66. 如實施例65之方法，其中該自殺基因產物係選自以下中之一或多者：HSV-TK (單純疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶去胺酶、硝基還原酶、羧基酯酶、細胞色素P450或PNP (嘌呤核苷磷酸化酶)、截短EGFR或可誘導半胱天冬酶(caspase) (「iCasp」)。
實施例67. 如實施例65或66之方法，其中該多核苷酸進一步包括引導表現該自殺基因之調控序列且其中該調控序列係可誘導的。
實施例68. 如實施例8至67中任一項之方法，其中該多核苷酸進一步包括引導表現該CAR或該治療性蛋白之調控序列。
實施例69. 如實施例68之方法，其中引導表現該CAR或該治療性蛋白之該調控序列係誘導型或組成型活性。
實施例70. 如實施例8至69中任一項之方法，其中經由載體將該多核苷酸引入該細胞群體中。
實施例71. 如實施例70之方法，其中該載體係病毒載體或非病毒載體。
實施例72. 如實施例71之方法，其中該非病毒載體係質體。
實施例73. 如實施例71之方法，其中該病毒載體係選自逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或疱疹病毒載體。
實施例74. 如實施例8至73中任一項之方法，其中該所製備表現CAR之細胞群體適於抑制癌細胞生長且其中該抗原係由該癌細胞表現之腫瘤相關抗原(TAA)。
實施例75. 一種抑制癌細胞生長之方法，其包括使藉由如實施例8至74中任一項之方法製得之CAR表現細胞群體與該癌細胞接觸，其中由該CAR識別之該抗原係由該癌細胞表現之TAA。
實施例76. 一種治療個體之癌症之方法，其包括向該個體投與藉由如實施例8至74中任一項之方法製得之CAR表現性免疫細胞之群體，其中由該CAR識別之該抗原係由該癌症之細胞表現之TAA。
實施例77. 如實施例76之方法，其中該細胞群體包括NK細胞及小於或等於0.3%之CD3+細胞。
實施例78. 如實施例76或77之方法，其中向該個體投與小於3 × 10 3個T細胞/公斤體重。
實施例79. 如實施例74至78中任一項之方法，其中該癌細胞係選自以下器官之癌細胞：循環系統，例如心臟(肉瘤[血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤]、黏液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤及脂肪瘤)、縱膈及胸膜及其他胸內器官、血管腫瘤及腫瘤相關血管組織；呼吸道，例如鼻腔及中耳、副鼻竇、喉、氣管、支氣管及肺，例如小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、支氣管原癌(鱗狀細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌)、肺泡(支氣管)癌、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨錯構瘤、間皮瘤；胃腸道系統，例如食道(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胃、胰臟(導管腺癌、胰島素瘤、升糖素瘤、胃泌素瘤、類癌腫瘤、胰腺瘤)、小腸(腺癌、淋巴瘤、類癌腫瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)、大腸(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤)；出現於任何部位之胃腸道基質腫瘤及神經內分泌腫瘤；泌尿生殖道，例如腎(腺癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilm's tumor) [腎母細胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱及/或尿道(鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睪丸(精原細胞瘤、胚胎癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、間質性細胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、類腺瘤腫瘤、脂肪瘤)；肝，例如肝細胞瘤(肝細胞癌)、膽管癌、肝母細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞腺瘤、血管瘤、胰臟內分泌腫瘤(例如嗜鉻細胞瘤、胰島素瘤、血管活性腸肽腫瘤、胰島細胞腫瘤及升糖素瘤)；骨，例如成骨肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞腫瘤、脊索瘤、骨軟骨瘤(骨軟骨性外生骨疣)、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨樣骨瘤及巨細胞腫瘤；神經系統，例如中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、顱骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃色瘤、變形性骨炎)、腦膜癌(腦膜瘤、腦脊膜肉瘤、神經膠質過多)、腦癌(星形細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、生殖細胞瘤[松果體瘤]、多形性神經膠母細胞瘤、少突神經膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜母細胞瘤、先天性腫瘤)、脊髓神經纖維瘤、腦膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)；生殖系統，例如婦科，子宮(子宮內膜癌)、子宮頸(子宮頸癌、腫瘤前期子宮頸發育不良)、卵巢(卵巢癌[漿液囊腺癌、黏液囊腺癌、未分類癌]、粒層泡膜細胞腫瘤、塞托利-雷丁氏細胞腫瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)、外陰(鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤)、胎盤、陰道(透明細胞癌、鱗狀細胞癌、葡萄形肉瘤(胚胎型橫紋肌肉瘤)、輸卵管(癌)及與女性生殖器官有關之其他部位；陰莖、前列腺、睪丸及與男性生殖器官有關之其他部位；血液學系統，例如血液(骨髓樣白血病[急性及慢性]、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球性白血病、骨髓增殖性疾病、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群)、何傑金氏疾病(Hodgkin's disease)、非何傑金氏淋巴瘤[惡性淋巴瘤]；口腔，例如唇、舌、齒齦、口底、上顎及其他口腔部分、腮腺及其他唾液腺部分、扁桃體、口咽、鼻咽、梨狀隱窩、下嚥及唇、口腔及咽中之其他部位；皮膚，惡性黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤、結構不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤及瘢痕瘤；腎上腺：神經母細胞瘤；及其他組織，包括結締組織及軟組織、腹膜後腔及腹膜、眼睛、眼內黑色素瘤及附屬結構、乳房、頭或/及頸、肛門區、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺腺及其他內分泌腺及相關結構、淋巴結繼發性及未特指惡性贅瘤、呼吸及消化系統繼發性惡性贅瘤及其他部位之繼發性惡性贅瘤。
實施例80. 如實施例74至79中任一項之方法，其中該癌細胞係實體腫瘤細胞。
實施例81. 如實施例74至79中任一項之方法，其中該癌細胞並非實體腫瘤之細胞，視情況其中該癌細胞係白血病癌細胞。
實施例82. 如實施例74至81中任一項之方法，其中該癌細胞係原發性癌細胞或轉移性癌細胞。
實施例83. 如實施例74至82中任一項之方法，其中該癌細胞係來自癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
實施例84. 如實施例75及79至83中任一項之方法，其中該接觸係在活體內或在活體外進行。
實施例85. 如實施例74至84中任一項之方法，其進一步包括使該細胞與單獨療法接觸或投與單獨療法。
實施例86. 如實施例85之方法，其中該單獨療法包括手術切除術、化學療法、輻射療法、免疫療法及靶向療法。
實施例87. 如實施例85或86之方法，其中該單獨療法係一線療法、二線療法、三線療法或四線療法。
實施例88. 一種NK細胞或其群體，其係藉由如實施例7至74中任一項之方法所產生或製備。
實施例89. 一種組合物，其包括如實施例88之細胞或其群體及載劑、視情況醫藥上可接受之載劑。
實施例90. 如實施例88之細胞或其群體或如實施例89之組合物，其包括小於0.5%之aAPC。
實施例91. 如實施例88或90之細胞或其群體或如實施例89或90之組合物，其包括小於0.1%或小於0.2%或小於0.3%、小於0.4%或小於0.5%之aAPC。
實施例92. 如實施例88及90至91中任一項之細胞或其群體或如實施例89至91中任一項之組合物，其具有下列性質中之一或多者： (A)    不小於70%之存活率； (B)    無菌； (C)    含有小於5 EU Kg −1h −1之內毒素； (D)    對於以下中之一或多者為陰性：支原體、外來病毒或HHV (HHV6或HHV7)； (E)    包括大於1 × 10 6個細胞/公斤擬治療個體體重； (F)    在總細胞中包括大於40%之表現CAR之細胞； (G)    在總細胞中包括大於95%之表現CD56之細胞； (H)    在總細胞中包括小於0.3%之表現CD3之細胞； (I)     包括小於4個多核苷酸拷貝/細胞； (J)     在不存在IL-2或IL-21下無增殖； (K)    具有功效，例如在IFNγ分泌或CD107分析中具有10倍以上之增加；及 (L)    表現一或多種抗原(例如CD19、NKp46或NKG2D)。
實施例93. 如實施例92之細胞或其群體或如實施例92之組合物，其具有下列性質中之一或兩者： (E’)   包括大於1 × 10 7個細胞/公斤擬治療個體體重；或 (F’)   在總細胞中包括大於50%之表現CAR之細胞。
實施例94. 一種經改造aAPC，其表現抗原及以下細胞表面標記物中之一或多者：4-1BBL、膜結合(mb) IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25結合之mb IL-2突變體、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之mb IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc; ALT-803)或調介CD122/CD132信號傳導之細胞表面標記物。
實施例95. 如實施例94之aAPC，其中該等aAPC係經改造K562細胞。
實施例96. 如實施例94或95之aAPC，其中輻照該等aAPC，由此缺乏細胞增殖或長期存活或缺乏二者。
實施例97. 如實施例96之aAPC，其中在50 Gy、100 Gy、150 Gy或200 Gy下輻照該等aAPC。
實施例98. 如實施例94至97中任一項之aAPC，其中該等aAPC並不實質上存活14天以上。
實施例99. 一種套組，其包括一或多種適用於如實施例7至87中任一項之方法之藥劑及可選說明。
實施例100.     如實施例99之套組，其中該等藥劑係選自下列各項中之一或多者：編碼CAR或另一治療性蛋白之多核苷酸、包括多核苷酸之載體、用於檢測細胞表型之抗體、用於分離或富集或純化免疫細胞之抗體、用於檢測多核苷酸之引子、細胞介素及aAPC。
實施例101.     一種製備γδ T細胞之群體之方法，其包括將包括下列各項中之一或多者之細胞群體與免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)一起培養：γδ T細胞、能夠衍生γδ T細胞之祖細胞或能夠衍生γδ T細胞之幹細胞，其中該細胞群體在細胞群體中耗乏表現以下各項中之一或多者之細胞：T細胞受體(TCR) α鏈、TCR β鏈或αβTCR，且其中該活化劑係選自下列(i)至(iv)中之一或多者： (i)     人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長， (ii)    一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合γδ T細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖γδ T細胞， (iii)   一或多種細胞介素，由此活化或增殖γδ T細胞，或 (iv)   一或多種化學部分，由此活化或增殖γδ T細胞，該等化學部分視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)。
實施例102.     如實施例101之方法，其進一步包括將編碼CAR或另一視情況選自抗體或其片段、酶、配體或受體之治療性蛋白之多核苷酸引入經培養細胞群體中以供表現，其中該CAR特異性識別且結合該腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原。
實施例103.     如實施例102之方法，其進一步包括在實施例102之引入步驟之後將該細胞群體與免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)一起培養，其中該活化劑係選自下列(i)至(iv)中之一或多者： (i)     人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長， (ii)    一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合γδ T細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖γδ T細胞， (iii)   一或多種細胞介素，由此活化或增殖γδ T細胞，或 (iv)   一或多種化學部分，由此活化或增殖γδ T細胞，該等化學部分視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)； 視情況其中使用相同或不同之活化劑重複培養步驟一次、兩次、三次或更多次。
實施例104.     如實施例101至103中任一項之方法，其中該細胞群體包括下列各項中之一或多者：γδ T細胞或其實質上經純化組合物。
實施例105.     如實施例101至104中任一項之方法，其中該經耗乏細胞群體包括下列各項中之一或多者：γδ T細胞、HSC、iPSC或其各自之實質上經純化群體。
實施例106.     如實施例105之方法，其中該等祖細胞、HSC或iPSC中之一或多者能夠衍生γδ T細胞。
實施例107.     如實施例101或106之方法，其中該等γδ T細胞包括衍生自下列各項中之一或多者之細胞：祖細胞、胚胎幹細胞、胚胎幹細胞衍生的細胞、胚胎生殖細胞、胚胎生殖細胞衍生的細胞、幹細胞、幹細胞衍生的細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)或永生化細胞。
實施例108.     如實施例101至107中任一項之方法，其中該細胞群體實質上不含表現TCR α鏈或TCR β鏈之細胞。
實施例109.     一種用於產生假型γ逆轉錄病毒顆粒之病毒包裝系統，其包括：(a)表現載體基因體之質體；(b)包裝質體；及(c)一或多種表現RD114TR及BaEVTR之套膜質體。
實施例110.     如實施例109之病毒包裝系統，其中該載體基因體包括下列側接有兩個長末端重複(LTR)者中之一或多者： (A)    編碼嵌合抗原受體(CAR)或另一治療性蛋白之多核苷酸，該治療性蛋白視情況選自抗體或其片段、酶、配體或受體， (B)    (A)之反向補體，或 (C)    包括一或多個識別位點之多核苷酸，該等識別位點由適於將CAR編碼序列或其反向補體插入該多核苷酸中之限制酶識別。
實施例111.     如實施例109至110中任一項之病毒包裝系統，其中該載體基因體進一步包括下列各項中之一或多者：5’ LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’ LTR。
實施例112.     如實施例109至111中任一項之病毒包裝系統，其中該假型γ逆轉錄病毒顆粒係選自以下任何物種：莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒。
實施例113.     如實施例109至112中任一項之病毒包裝系統，其進一步包括包裝細胞系。
實施例114.     如實施例113之病毒包裝系統，其中該包裝細胞系係293T細胞系。
實施例115.     一種產生假型γ逆轉錄病毒顆粒之方法，其包括在適於包裝該假型γ逆轉錄病毒顆粒之條件下使用如實施例109至112中任一項之系統來轉導包裝細胞系。
實施例116.     如實施例115之方法，其中該包裝細胞系係293T細胞系。
實施例117.     如實施例115或116之方法，其中該細胞系係以1.5:1.5:1之比率使用(a)、(b)及(c)之質體來轉導。
實施例118.     如實施例115至116中任一項之方法，其中該包裝系統包括至少兩種套膜質體，一種表現RD114TR且另一種表現BaEVTR。
實施例119.     如實施例118之方法，其中該細胞系係以1.5:1.5:1:1之比率使用(a)之質體、(b)之質體、RD114TR表現質體及BaEVTR表現質體來轉導。
圖 1提供向人類原代NK細胞之基於γ逆轉錄載體(PCIR)之治療基因遞送之圖解。
圖 2A 至 2B提供生長曲線及原代NK細胞進入顯著增殖狀態以供基因遞送時之時間點之確定。將經擴增原代NK細胞之逆轉錄病毒轉導之時間點最佳化。確定生長曲線以及原代NK細胞進入顯著增殖狀態以供基因遞送時之時間點。用於本發明中之原代人類NK細胞係衍生自周邊血(PB)，且使用MACSxpress人類全血NK細胞分離套組(Miltenyi Biotec, 130-098-185)分離。經由使用CD56及CD3抗體將細胞染色來測定純度，且將NK細胞定義為CD56+/CD3-群體( 圖 2A)。將NK細胞與NK MACS培養基(130-114-429)在50 IU/ml人類IL-2及經輻照K562-mb21-41BBL飼養細胞(比率為1:1)存在下一起培養。顯而易見，在分離並培養5天之後，原代NK細胞進入顯著增殖狀態，由此使用第6-10天時之活化NK細胞進行基因遞送( 圖 2B)。
圖 3A 至 3D展示使用RetroNectin達成之RD114TR及BaEVTR假型γ逆轉錄病毒顆粒(PCIR)之效能，該RetroNectin容許在NK細胞中以高生存力及高產率進行較大程度之基因轉移。在本發明中使用RetroNectin結合病毒(RBV)感染策略且細節闡釋於 圖 3A中。在感染之後存在具有顯著較高存活率(介於73.51% - 82.81%之間)之NK細胞(可藉由排除低正向散射(FSC)及高側向散射(SSC)事件來獲得大致活細胞門) ( 圖 3B)，三個供體中之EGFR CAR基因(Fab-AF647陽性)轉導效率介於65.11% - 72.75%之間( 圖 3C)，且在感染後第8天三個供體中之高增殖狀態產率25、34及45倍於初始感染NK數量( 圖 3D)。
圖 4提供基於使用相同遞送策略直接感染相同增殖狀態之活化NK細胞之逆轉錄病毒滴定之確定。在本發明中，為研發針對人類原代NK細胞之基於γ逆轉錄載體(PCIR)之治療基因遞送，滴定測定方法係基於在第7天對相同增殖狀態之活化NK細胞採用完全相同之感染策略。在 圖 3A 至 3D中所顯示之此PCIR-EGFR-CAR-NK遞送分析中，所用空載體係PCIR-EV-EGFP。將在轉染後48-及72小時收穫之所彙集原始病毒上清液之連續稀釋液添加至經RetroNectin塗覆之板中且程序與 圖 1 及圖 3A相同。使用ALEXA FLUOR ®647 AffiniPure山羊抗小鼠IgG (F(ab') 2片段特異性，Jackson ImmunoResearch_115-605-006)檢測CAR之小鼠來單鏈可變片段(ScFv)。使用下式計算轉導單位/mL：TU/mL = (轉導細胞數×螢光百分比×稀釋因子) / (轉導體積(以mL表示))。為獲得更準確之效價，獲取多個稀釋液之平均值。在此研究中使用MOI 3 (參見 圖 3A 至 3D)。
圖 5A 至 5C展示，經γ逆轉錄載體改造之CAR-NK勝過經慢病毒載體改造之CAR-NK，其中在長期培養中具有高度穩定之轉導基因表現。基於分選GFP陽性群體來富集經慢病毒改造之PCIL-EGFR-CAR-NK及EV-GFP對照，且經逆轉錄病毒改造之PCIR-EGFR-CAR-NK係基於山羊抗小鼠Fab-AF647陽性細胞之分選。在分選後第10天使用流式細胞術及螢光顯微術成像來評估PCIL-EGFR-CAR-NK轉導速率及表現，且PCIL-EGFR-CAR-NK及PCIL-GFP空載體對照中之GFP陽性細胞自約100%顯著降至39% ( 圖 5A 及 5C)。然而，流動分析證實，在分選後第10天、第14天及第25天，PCIR-EGFR-CAR-NK具有高度穩定之轉導基因表現( 圖 5B 及 5C)。
圖 6A 及 6B展示使用實時細胞分析(RTCA)獲得之經γ逆轉錄載體PCIR/BaEVTR改造之EGFR-CAR-NK細胞之高度轉導效率及細胞毒性之效能。NovoCyte 3005流式細胞術分析證實了來自4個供體之經γ逆轉錄載體PCIR/BaEVTR改造之EGFR-CAR-NK之高轉導效率。攜載截短CD19之空載體(EV-Tcd19)及EGFR轉基因之轉導速率分別為平均85% (CD19-PE陽性)及79.6% (山羊抗小鼠Fab-AF647陽性) ( 圖 6A)。使用xCELLigence RTCA MP Bundle (ACEA Biosciences，目錄號：00380601040)實施免疫細胞殺死分析。該等繪圖展示兩個供體之使用5,000個細胞/孔之LN229且添加500個細胞/孔之效應物(1:10 E:T)之實驗的阻抗數據。與具有最低活細胞指數之空載體模擬轉導組及未轉導NK組相比，經改造EGFR-CAR-NK具有動態實時殺死性( 圖 6B)。
圖 7展示17-24天之NK細胞擴增。
圖 8A 至 8C提供293Vec-GalV及293Vec-BaEV包裝細胞以及用於滴定之兩種細胞系Jurkat T及HT1080之逆轉錄病毒進入受體表現。如 圖 8A中所展示，在逆轉錄病毒中，狒狒內源性病毒(BaEV)及貓類內源性逆轉錄病毒(RD114)使用公共細胞表面受體ASCT2 (鈉依賴性中性胺基酸轉運蛋白)進入細胞。除ASCT2外，狒狒內源性病毒(BaEV)亦使用ASCT1作為細胞進入受體。長臂猿白血病病毒(GALV)使用鈉依賴性磷酸轉運蛋白(Pit1)作為其進入受體。 圖 8B提供兩種包裝細胞系293Vec-GalV及293Vec-BaEV以及滴定細胞系Jurkat T及HT1080上之ASCT1、ASCT2及Pit1之免疫染色。直方圖代表以下各項之平均螢光強度(MFI)：經兔IgG同型對照(Invitrogen，目錄號：02-6102)及相應二級抗體與Alexa Fluor 647偶聯之山羊抗兔IgG (A-21245；Invitrogen)染色之細胞、經抗ASCT1 (LifeSpan BioSciences, LS-C179222)及相應二級抗體染色之細胞、經抗ASCT2 (Cell Signaling Technology, 8057S)及相應二級抗體染色之細胞及經抗Pit1 (ThermoFisher, PA5-98650)染色之細胞。 圖 8C展示，可使用兩種細胞系(Jurkat T及HT1080)來滴定三種逆轉錄病毒套膜蛋白(BaEV、RD114及GALV)，因該等逆轉錄病毒套膜蛋白之相應進入受體具有廣泛性表現。對於293基包裝細胞系293Vec GALV及293Vec BaEV而言，僅GALV假型逆轉錄病毒可使用進入受體Pit1將其感染。針對各細胞類型，在 圖 8C中繪製三根條：左側條代表ASCT1之表現，中間條代表ASCT2之表現，且右側條代表Pit1之表現。
圖 9圖解說明用於生成穩定逆轉錄病毒生產者-293Vec-BaEV之轉導策略之工作流程。使用基於莫洛尼鼠類白血病病毒(Mo-MuLV)之逆轉錄病毒載體(PCIR)作為靶轉基因遞送媒劑。使用BaEV假型化293Vec-BaEV包裝細胞系來產生媒劑以感染臍帶血衍生的NK細胞。使用以下兩種包裝細胞系進行此產生：293Vec-GALV (用以產生瞬時長臂猿白血病病毒(GALV)假型上清液)及293Vec-BaEV (用以生成最終載體)。兩種細胞系皆係由BioVec Pharma供應。然後使用此上清液轉導BaEV假型化包裝細胞系293Vec-BaEV以生成批量生產者。對於高效價純系生成而言，可藉由限制性稀釋及使用藉由滴定自每一純系生成之上清液所選擇之高效價純系來進一步分選或單細胞選殖此293Vec- BaEV批量生產者。然後，可自高效價穩定逆轉錄病毒生產者-293Vec-BaEV連續產生上清液。
圖 10A 及 10B展示來自穩定逆轉錄病毒生產者-293Vec-BaEV之原始上清液之改良效價，該293Vec-BaEV產生具有大尺寸轉基因之載體。「多個靶組合為一」係由申請者研發之獨特治療策略。使用BaEV假型化293Vec-BaEV包裝細胞系來產生媒劑。 圖 10A展示，具有大轉基因插入體(＞11 kb)之代表性逆轉錄病毒可由293Vec-BaEV包裝細胞瞬時地及穩定地產生。將總共3.5百萬個293Vec-BaEV包裝細胞接種於100 mm組織培養盤中，並在37℃下培育48-72 h。在細胞達到90-100%鋪滿時，收集原始上清液並在1500 g下旋轉5 min。在Jurkat T細胞上滴定上述上清液。將一系列病毒上清液加載於經RetroNectin預塗覆性非組織培養液處理之24孔板上並使用包括10%熱滅活胎牛血清之完整DMEM培養基達到500 μl。將板在32℃、2000g下旋轉2小時，且添加0.1百萬個Jurkat T細胞，並在1000g下旋轉5 min。將板在37℃下培育48h，然後實施流動分析以根據下式測定效價(轉導單位/ml)：轉導單位(TU)/mL = [(靶細胞數) × (陽性細胞%)]。在此實例中，藉由針對人類CD34抗體(QBEnd/10) (別藻藍蛋白) (Novus Biologicals, LLC, #FAB7227A)之流式抗體檢測報告基因RQR8之表現。如 圖 10B中所展示，與瞬時產生之病毒(TU=2.2E5)相比，來自用於具有大尺寸轉基因之載體之穩定逆轉錄病毒生產者-293Vec-BaEV (TU=7.2E5)之原始上清液具有改良效價。 

          <![CDATA[<110> 美商賽特免疫治療公司(CYTOIMMUNE THERAPEUTICS, INC.)]]>
          <![CDATA[<120> 感染、活化及擴增免疫細胞之方法及組合物]]>
          <![CDATA[<130> 113086-9311]]>
          <![CDATA[<140> TW 110133096]]>
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          <![CDATA[<151> 2020-09-08]]>
          <![CDATA[<150> 63/075,651]]>
          <![CDATA[<151> 2020-09-08]]>
          <![CDATA[<160> 183   ]]>
          <![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 
          1               5                   10                  15      
          Asp Pro Lys Gly Thr 
                      20      
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 68]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 
                  35                  40                  45              
          Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 
              50                  55                  60                  
          Ala Tyr Arg Ser 
          65              
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 112]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Thr Asn Ser 
                      20  
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His 
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 13]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Arg Tyr Asp Gly Ser Asn 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 110]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          000
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          000
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
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          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
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          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
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          <![CDATA[<400> 20]]>
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          <![CDATA[<400> 21]]>
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          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
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          <![CDATA[<400> 23]]>
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          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
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          <![CDATA[<400> 25]]>
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          <![CDATA[<400> 26]]>
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          <![CDATA[<400> 27]]>
          000
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          <![CDATA[<400> 28]]>
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          <![CDATA[<400> 29]]>
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          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
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          <![CDATA[<400> 31]]>
          000
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          <![CDATA[<400> 32]]>
          000
          <![CDATA[<210> 33]]>
          <![CDATA[<400> 33]]>
          000
          <![CDATA[<210> 34]]>
          <![CDATA[<400> 34]]>
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          <![CDATA[<400> 35]]>
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          <![CDATA[<400> 36]]>
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          <![CDATA[<400> 37]]>
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          <![CDATA[<400> 38]]>
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          <![CDATA[<400> 39]]>
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          <![CDATA[<400> 40]]>
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          <![CDATA[<400> 43]]>
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          <![CDATA[<400> 44]]>
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          <![CDATA[<400> 45]]>
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          <![CDATA[<400> 61]]>
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          <![CDATA[<210> 81]]>
          <![CDATA[<211> 229]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 81]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 
          1               5                   10                  15      
          Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly Lys 
          225                 
          <![CDATA[<210> 82]]>
          <![CDATA[<211> 229]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 82]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly Lys 
          225                 
          <![CDATA[<210> 83]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 83]]>
          Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser 
          1               5                   10                  15      
          Asn His Ala Tyr 
                      20  
          <![CDATA[<210> 84]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 84]]>
          Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 
          1               5                   
          <![CDATA[<210> 85]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 85]]>
          His Val Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 
                      20              
          <![CDATA[<210> 86]]>
          <![CDATA[<211> 54]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 86]]>
          atggggtggt caagcattat tctgtttctg gtcgctaccg ctacaggcgt ccat             54
          <![CDATA[<210> 87]]>
          <![CDATA[<211> 60]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 87]]>
          atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt       60
          <![CDATA[<210> 88]]>
          <![CDATA[<211> 45]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 88]]>
          ggtgggggcg gctctggtgg cggtggcagc ggcggaggtg gcagt                       45
          <![CDATA[<210> 89]]>
          <![CDATA[<211> 204]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之說明：跨膜結構域及細胞質結構域]]>
          <![CDATA[<400> 89]]>
          ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg       60
          gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg      120
          aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca      180
          cgcgacttcg cagcctatcg ctcc                                             204
          <![CDATA[<210> 90]]>
          <![CDATA[<211> 336]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之說明：信號傳導結構域]]>
          <![CDATA[<400> 90]]>
          agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc       60
          tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc      120
          cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat      180
          gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc      240
          cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc      300
          tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc                                336
          <![CDATA[<210> 91]]>
          <![CDATA[<211> 69]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之說明：可裂解序列]]>
          <![CDATA[<400> 91]]>
          cacgtgggtt ctggagaagg acgcggttcc ttgttgacgt gtggcgatgt agaggaaaat       60
          ccgggtcca                                                               69
          <![CDATA[<210> 92]]>
          <![CDATA[<211> 60]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 92]]>
          ccgagcggcc aggcgggcgc ggcggcatcg gagtccctgt ttgtgtcaaa tcacgcctac       60
          <![CDATA[<210> 93]]>
          <![CDATA[<400> 93]]>
          000
          <![CDATA[<210> 94]]>
          <![CDATA[<400> 94]]>
          000
          <![CDATA[<210> 95]]>
          <![CDATA[<400> 95]]>
          000
          <![CDATA[<210> 96]]>
          <![CDATA[<400> 96]]>
          000
          <![CDATA[<210> 97]]>
          <![CDATA[<400> 97]]>
          000
          <![CDATA[<210> 98]]>
          <![CDATA[<400> 98]]>
          000
          <![CDATA[<210> 99]]>
          <![CDATA[<400> 99]]>
          000
          <![CDATA[<210> 100]]>
          <![CDATA[<400> 100]]>
          000
          <![CDATA[<210> 101]]>
          <![CDATA[<400> 101]]>
          000
          <![CDATA[<210> 102]]>
          <![CDATA[<400> 102]]>
          000
          <![CDATA[<210> 103]]>
          <![CDATA[<400> 103]]>
          000
          <![CDATA[<210> 104]]>
          <![CDATA[<400> 104]]>
          000
          <![CDATA[<210> 105]]>
          <![CDATA[<400> 105]]>
          000
          <![CDATA[<210> 106]]>
          <![CDATA[<400> 106]]>
          000
          <![CDATA[<210> 107]]>
          <![CDATA[<400> 107]]>
          000
          <![CDATA[<210> 108]]>
          <![CDATA[<400> 108]]>
          000
          <![CDATA[<210> 109]]>
          <![CDATA[<211> 63]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之說明：鉸鏈結構域序列]]>
          <![CDATA[<400> 109]]>
          ctcgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccgga tcccaaaggt       60
          acc                                                                     63
          <![CDATA[<210> 110]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(12) ]]>
          <![CDATA[<223> 此序列可涵蓋1-6個「Gly Ser」重複單元]]>
          <![CDATA[<400> 110]]>
          Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210> 111]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成6xHis標籤]]>
          <![CDATA[<400> 111]]>
          His His His His His His 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 112]]>
          <![CDATA[<211> 48]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 112]]>
          ctcgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccg                    48
          <![CDATA[<210> 113]]>
          <![CDATA[<211> 81]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 113]]>
          ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg       60
          gcctttatta ttttctgggt g                                                 81
          <![CDATA[<210> 114]]>
          <![CDATA[<211> 126]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 114]]>
          aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa       60
          actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt      120
          gaactg                                                                 126
          <![CDATA[<210> 115]]>
          <![CDATA[<211> 123]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 115]]>
          aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc       60
          gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc      120
          tcc                                                                    123
          <![CDATA[<210> 116]]>
          <![CDATA[<211> 339]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 116]]>
          agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc       60
          tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc      120
          cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat      180
          gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc      240
          cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc      300
          tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa                             339
          <![CDATA[<210> 117]]>
          <![CDATA[<211> 51]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 117]]>
          Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 
          1               5                   10                  15      
          Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 
                      20                  25                  30          
          Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 
                  35                  40                  45              
          Asp Ile Tyr 
              50      
          <![CDATA[<210> 118]]>
          <![CDATA[<211> 49]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 小鼠屬]]>
          <![CDATA[<400> 118]]>
          Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro 
          1               5                   10                  15      
          Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg 
                      20                  25                  30          
          Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr 
          <![CDATA[<210> 119]]>
          <![CDATA[<211> 51]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 貓屬]]>
          <![CDATA[<400> 119]]>
          Pro Val Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Gln Ala 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ile Thr Thr Ser Gln Arg Val Ser Leu Arg Pro Gly Thr Cys Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Ser Ala Gly Ser Thr Val Glu Ala Ser Gly Leu Asp Leu Ser Cys 
                  35                  40                  45              
          Asp Ile Tyr 
              50      
          <![CDATA[<210> 120]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 120]]>
          Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Val Ile Thr 
                      20      
          <![CDATA[<210> 121]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 小鼠屬]]>
          <![CDATA[<400> 121]]>
          Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ile Thr Leu Ile 
                      20      
          <![CDATA[<210> 122]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 大鼠屬]]>
          <![CDATA[<400> 122]]>
          Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Ala Val Leu Leu Leu Ser Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Ile Thr Leu Ile 
                      20      
          <![CDATA[<210> 123]]>
          <![CDATA[<211> 42]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 123]]>
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
          1               5                   10                  15      
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      20                  25                  30          
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 
                  35                  40          
          <![CDATA[<210> 124]]>
          <![CDATA[<211> 220]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 124]]>
          Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 
                  35                  40                  45              
          Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 
              50                  55                  60                  
          Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 
                      100                 105                 110         
          Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 
                  115                 120                 125             
          Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 
                          165                 170                 175     
          Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 
                      180                 185                 190         
          Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 
                  195                 200                 205             
          Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 
              210                 215                 220 
          <![CDATA[<210> 125]]>
          <![CDATA[<211> 105]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 125]]>
          acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga       60
          gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta                      105
          <![CDATA[<210> 126]]>
          <![CDATA[<211> 108]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 126]]>
          agggaccaga ggctgccccc cgatgcccac aagccccctg ggggaggcag tttccggacc       60
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          Ala Val Gly Thr Ile Val Asp Gln Ser Ala Lys 
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          <![CDATA[<400> 155]]>
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          <![CDATA[<210> 156]]>
          <![CDATA[<400> 156]]>
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          <![CDATA[<400> 158]]>
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          <![CDATA[<400> 162]]>
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          <![CDATA[<400> 163]]>
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          <![CDATA[<210> 164]]>
          <![CDATA[<400> 164]]>
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          <![CDATA[<400> 165]]>
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          <![CDATA[<210> 166]]>
          <![CDATA[<400> 166]]>
          000
          <![CDATA[<210> 167]]>
          <![CDATA[<400> 167]]>
          000
          <![CDATA[<210> 168]]>
          <![CDATA[<211> 57]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 168]]>
          atggaatttg ggctgcgctg ggttttcctt gttgctattt taaaagatgt ccagtgt          57
          <![CDATA[<210> 169]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之說明：肽序列]]>
          <![CDATA[<400> 169]]>
          Met Glu Phe Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Cys 
          <![CDATA[<210> 170]]>
          <![CDATA[<211> 903]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 170]]>
          gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg       60
          gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg      120
          acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc      180
          aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag      240
          tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat      300
          ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc      360
          atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg      420
          gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc      480
          gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct      540
          cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc      600
          aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac      660
          tacacacaga agagcctctc cctgtctccg gagctgcaac tggaggagag ctgtgcggag      720
          gcgcaggacg gggagctgga cgggctgtgg acgaccatca ccatcttcat cacactcttc      780
          ctgttaagcg tgtgctacag tgccaccgtc accttcttca aggtgaagtg gatcttctcc      840
          tcggtggtgg acctgaagca gaccatcatc cccgactaca ggaacatgat cggacagggg      900
          gcc                                                                    903
          <![CDATA[<210> 171]]>
          <![CDATA[<211> 301]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 171]]>
          Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 
              50                  55                  60                  
          Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 
                          85                  90                  95      
          Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 
                      100                 105                 110         
          Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 
                  115                 120                 125             
          Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 
                          165                 170                 175     
          Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 
                  195                 200                 205             
          Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 
              210                 215                 220                 
          Ser Leu Ser Leu Ser Pro Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe 
                          245                 250                 255     
          Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe 
                      260                 265                 270         
          Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr 
                  275                 280                 285             
          Ile Ile Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala 
              290                 295                 300     
          <![CDATA[<210> 172]]>
          <![CDATA[<211> 563]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 172]]>
          Met Lys Leu Pro Thr Gly Met Val Ile Leu Cys Ser Leu Ile Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Ala Leu Val Gln Lys 
                      20                  25                  30          
          Gln His Gly Lys Pro Cys Glu Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Ala 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Asn Ser Ile Gln Gln Val Thr Cys Pro Gly Lys Thr Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Leu Met Thr Asn Gln Lys Trp Lys Cys Arg Val Thr Pro Lys Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ser Gly Gly Glu Leu Gln Asn Cys Pro Cys Asn Thr Phe Gln Asp 
                          85                  90                  95      
          Ser Met His Ser Ser Cys Tyr Thr Glu Tyr Arg Gln Cys Arg Arg Ile 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Leu Asn Glu Val Gln Ile Leu Gln Asn Pro Asn Gln Leu Leu Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Cys Arg Gly Ser Ile Asn Gln Pro Val Cys Trp Ser Ala Thr Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ile His Ile Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Lys Arg Val 
                          165                 170                 175     
          Trp Thr Val Gln Lys Arg Leu Glu Gln Ile His Lys Ala Met Thr Pro 
                      180                 185                 190         
          Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Leu Pro Lys Val Arg Asp Asp Leu 
                  195                 200                 205             
          Ser Leu Asp Ala Arg Thr Phe Asp Ile Leu Asn Thr Thr Phe Arg Leu 
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Met Ser Asn Phe Ser Leu Ala Gln Asp Cys Trp Leu Cys Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Leu Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Thr Pro Ser Leu Thr 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Leu Ala Asp Ser Leu Ala Asn Ala Ser Cys Gln Ile Ile Pro 
                      260                 265                 270         
          Pro Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Ser 
                  275                 280                 285             
          Ser Pro Phe Ile Asn Asp Thr Glu Gln Ile Asp Leu Gly Ala Val Thr 
              290                 295                 300                 
          Phe Thr Asn Cys Thr Ser Val Ala Asn Val Ser Ser Pro Leu Cys Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr 
                          325                 330                 335     
          Leu Pro Gln Asn Trp Thr Arg Leu Cys Val Gln Ala Ser Leu Leu Pro 
                      340                 345                 350         
          Asp Ile Asp Ile Asn Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile 
                  355                 360                 365             
          Asp His Tyr Ile His Arg Pro Lys Arg Ala Val Gln Phe Ile Pro Leu 
              370                 375                 380                 
          Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser His Gln Leu Ile 
                          405                 410                 415     
          Ser Asp Val Gln Val Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln 
                      420                 425                 430         
          Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp 
                  435                 440                 445             
          Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys 
              450                 455                 460                 
          Cys Cys Phe Tyr Ala Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asn Lys Ile Arg 
          465                 470                 475                 480 
          Thr Leu Gln Glu Glu Leu Gln Lys Arg Arg Glu Ser Leu Ala Thr Asn 
                          485                 490                 495     
          Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Phe Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Leu 
                      500                 505                 510         
          Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ile Leu Thr Ile Gly Pro Cys 
                  515                 520                 525             
          Val Phe Asn Arg Leu Val Gln Phe Val Lys Asp Arg Ile Ser Val Val 
              530                 535                 540                 
          Gln Ala Leu Val Leu Thr Gln Gln Tyr His Gln Leu Lys Pro Leu Glu 
          545                 550                 555                 560 
          Tyr Glu Pro 
          <![CDATA[<210> 173]]>
          <![CDATA[<211> 562]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 173]]>
          Met Gly Phe Thr Thr Lys Ile Ile Phe Leu Tyr Asn Leu Val Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys 
                      20                  25                  30          
          Arg Tyr Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro 
                  35                  40                  45              
          Pro Ser Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Leu Met Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Pro Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Val His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ser Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Cys Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ile His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile 
                          165                 170                 175     
          Lys Ser Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro 
                      180                 185                 190         
          Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu 
                  195                 200                 205             
          Met Val Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu 
              210                 215                 220                 
          Leu Leu Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Leu Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser 
                          245                 250                 255     
          Tyr Val Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro 
                      260                 265                 270         
          Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser 
                  275                 280                 285             
          Pro Ser Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe 
              290                 295                 300                 
          Ser Asn Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu 
                          325                 330                 335     
          Pro Thr Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp 
                      340                 345                 350         
          Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp 
                  355                 360                 365             
          His Phe Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu 
              370                 375                 380                 
          Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser 
                          405                 410                 415     
          Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val 
                      420                 425                 430         
          Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu 
                  435                 440                 445             
          Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys 
              450                 455                 460                 
          Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro 
                          485                 490                 495     
          Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu 
                      500                 505                 510         
          Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile 
                  515                 520                 525             
          Phe Asn Arg Leu Val Gln Phe Val Lys Asp Arg Ile Ser Val Val Gln 
              530                 535                 540                 
          Ala Leu Val Leu Thr Gln Gln Tyr His Gln Leu Lys Pro Leu Glu Tyr 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Pro 
          <![CDATA[<210> 174]]>
          <![CDATA[<211> 655]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 鼠類白血病病毒]]>
          <![CDATA[<400> 174]]>
          Met Ala Ala Arg Ser Thr Leu Ser Lys Pro Pro Gln Asp Lys Ile Asn 
          1               5                   10                  15      
          Pro Trp Lys Pro Leu Ile Val Met Gly Val Leu Leu Gly Val Gly Met 
                      20                  25                  30          
          Ala Glu Ser Pro His Gln Val Phe Asn Val Thr Trp Arg Val Thr Asn 
                  35                  40                  45              
          Leu Met Thr Gly Arg Thr Ala Asn Ala Thr Ser Leu Leu Gly Thr Val 
              50                  55                  60                  
          Gln Asp Ala Phe Pro Lys Leu Tyr Phe Asp Leu Cys Asp Leu Val Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Glu Trp Asp Pro Ser Asp Gln Glu Pro Tyr Val Gly Tyr Gly Cys 
                          85                  90                  95      
          Lys Tyr Pro Ala Gly Arg Gln Arg Thr Arg Thr Phe Asp Phe Tyr Val 
                      100                 105                 110         
          Cys Pro Gly His Thr Val Lys Ser Gly Cys Gly Gly Pro Gly Glu Gly 
                  115                 120                 125             
          Tyr Cys Gly Lys Trp Gly Cys Glu Thr Thr Gly Gln Ala Tyr Trp Lys 
              130                 135                 140                 
          Pro Thr Ser Ser Trp Asp Leu Ile Ser Leu Lys Arg Gly Asn Thr Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asp Thr Gly Cys Ser Lys Val Ala Cys Gly Pro Cys Tyr Asp Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Lys Val Ser Asn Ser Phe Gln Gly Ala Thr Arg Gly Gly Arg Cys 
                      180                 185                 190         
          Asn Pro Leu Val Leu Glu Phe Thr Asp Ala Gly Lys Lys Ala Asn Trp 
                  195                 200                 205             
          Asp Gly Pro Lys Ser Trp Gly Leu Arg Leu Tyr Arg Thr Gly Thr Asp 
              210                 215                 220                 
          Pro Ile Thr Met Phe Ser Leu Thr Arg Gln Val Leu Asn Val Gly Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Val Pro Ile Gly Pro Asn Pro Val Leu Pro Asp Gln Arg Leu Pro 
                          245                 250                 255     
          Ser Ser Pro Ile Glu Ile Val Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ser Pro Leu 
                      260                 265                 270         
          Asn Thr Ser Tyr Pro Pro Ser Thr Thr Ser Thr Pro Ser Thr Ser Pro 
                  275                 280                 285             
          Thr Ser Pro Ser Val Pro Gln Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Arg Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Ala Leu Val Lys Gly Ala Tyr Gln Ala Leu Asn Leu Thr Asn Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Lys Thr Gln Glu Cys Trp Leu Cys Leu Val Ser Gly Pro Pro Tyr 
                          325                 330                 335     
          Tyr Glu Gly Val Ala Val Val Gly Thr Tyr Thr Asn His Ser Thr Ala 
                      340                 345                 350         
          Pro Ala Asn Cys Thr Ala Thr Ser Gln His Lys Leu Thr Leu Ser Glu 
                  355                 360                 365             
          Val Thr Gly Gln Gly Leu Cys Met Gly Ala Val Pro Lys Thr His Gln 
              370                 375                 380                 
          Ala Leu Cys Asn Thr Thr Gln Ser Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Ala Pro Ala Gly Thr Met Trp Ala Cys Ser Thr Gly Leu Thr Pro 
                          405                 410                 415     
          Cys Leu Ser Thr Thr Val Leu Asn Leu Thr Thr Asp Tyr Cys Val Leu 
                      420                 425                 430         
          Val Glu Leu Trp Pro Arg Val Ile Tyr His Ser Pro Asp Tyr Met Tyr 
                  435                 440                 445             
          Gly Gln Leu Glu Gln Arg Thr Lys Tyr Lys Arg Glu Pro Val Ser Leu 
              450                 455                 460                 
          Thr Leu Ala Leu Leu Leu Gly Gly Leu Thr Met Gly Gly Ile Ala Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Ile Gly Thr Gly Thr Thr Ala Leu Ile Lys Thr Gln Gln Phe Glu 
                          485                 490                 495     
          Gln Leu His Ala Ala Ile Gln Thr Asp Leu Asn Glu Val Glu Lys Ser 
                      500                 505                 510         
          Ile Thr Asn Leu Glu Lys Ser Leu Thr Ser Leu Ser Glu Val Val Leu 
                  515                 520                 525             
          Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Phe Leu Lys Glu Gly Gly Leu 
              530                 535                 540                 
          Cys Ala Ala Leu Lys Glu Glu Cys Cys Phe Tyr Ala Asp His Thr Gly 
          545                 550                 555                 560 
          Leu Val Arg Asp Ser Met Ala Lys Leu Arg Glu Arg Leu Asn Gln Arg 
                          565                 570                 575     
          Gln Lys Leu Phe Glu Thr Gly Gln Gly Trp Phe Glu Gly Leu Phe Asn 
                      580                 585                 590         
          Arg Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Ile Ser Thr Ile Met Gly Pro Leu 
                  595                 600                 605             
          Ile Val Leu Leu Leu Ile Leu Leu Phe Gly Pro Cys Ile Leu Asn Arg 
              610                 615                 620                 
          Leu Val Gln Phe Val Lys Asp Arg Ile Ser Val Val Gln Ala Leu Val 
          625                 630                 635                 640 
          Leu Thr Gln Gln Tyr His Gln Leu Lys Pro Leu Glu Tyr Glu Pro 
                          645                 650                 655 
          <![CDATA[<210> 175]]>
          <![CDATA[<211> 563]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 狒狒內源性病毒]]>
          <![CDATA[<400> 175]]>
          Met Gly Phe Thr Thr Lys Ile Ile Phe Leu Tyr Asn Leu Val Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys 
                      20                  25                  30          
          Arg Tyr Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro 
                  35                  40                  45              
          Pro Ser Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Leu Met Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Pro Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Val His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ser Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Cys Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ile His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile 
                          165                 170                 175     
          Lys Ser Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro 
                      180                 185                 190         
          Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu 
                  195                 200                 205             
          Met Val Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu 
              210                 215                 220                 
          Leu Leu Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Leu Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser 
                          245                 250                 255     
          Tyr Val Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro 
                      260                 265                 270         
          Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser 
                  275                 280                 285             
          Pro Ser Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe 
              290                 295                 300                 
          Ser Asn Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu 
                          325                 330                 335     
          Pro Thr Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp 
                      340                 345                 350         
          Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp 
                  355                 360                 365             
          His Phe Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu 
              370                 375                 380                 
          Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser 
                          405                 410                 415     
          Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val 
                      420                 425                 430         
          Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu 
                  435                 440                 445             
          Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys 
              450                 455                 460                 
          Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro 
                          485                 490                 495     
          Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu 
                      500                 505                 510         
          Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile 
                  515                 520                 525             
          Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His 
              530                 535                 540                 
          Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu 
          545                 550                 555                 560 
          Ala Gln Asp 
          <![CDATA[<210> 176]]>
          <![CDATA[<211> 564]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之說明：RD114逆轉錄病毒序列]]>
          <![CDATA[<400> 176]]>
          Met Lys Leu Pro Thr Gly Met Val Ile Leu Cys Ser Leu Ile Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Ala Leu Val Gln Lys 
                      20                  25                  30          
          Gln His Gly Lys Pro Cys Glu Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Ala 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Asn Ser Ile Gln Gln Val Thr Cys Pro Gly Lys Thr Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Leu Met Thr Asn Gln Lys Trp Lys Cys Arg Val Thr Pro Lys Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ser Gly Gly Glu Leu Gln Asn Cys Pro Cys Asn Thr Phe Gln Asp 
                          85                  90                  95      
          Ser Met His Ser Ser Cys Tyr Thr Glu Tyr Arg Gln Cys Arg Arg Ile 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Leu Asn Glu Val Gln Ile Leu Gln Asn Pro Asn Gln Leu Leu Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Cys Arg Gly Ser Ile Asn Gln Pro Val Cys Trp Ser Ala Thr Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ile His Ile Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Lys Arg Val 
                          165                 170                 175     
          Trp Thr Val Gln Lys Arg Leu Glu Gln Ile His Lys Ala Met Thr Pro 
                      180                 185                 190         
          Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Leu Pro Lys Val Arg Asp Asp Leu 
                  195                 200                 205             
          Ser Leu Asp Ala Arg Thr Phe Asp Ile Leu Asn Thr Thr Phe Arg Leu 
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Met Ser Asn Phe Ser Leu Ala Gln Asp Cys Trp Leu Cys Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Leu Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Thr Pro Ser Leu Thr 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Leu Ala Asp Ser Leu Ala Asn Ala Ser Cys Gln Ile Ile Pro 
                      260                 265                 270         
          Pro Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Ser 
                  275                 280                 285             
          Ser Pro Phe Ile Asn Asp Thr Glu Gln Ile Asp Leu Gly Ala Val Thr 
              290                 295                 300                 
          Phe Thr Asn Cys Thr Ser Val Ala Asn Val Ser Ser Pro Leu Cys Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr 
                          325                 330                 335     
          Leu Pro Gln Asn Trp Thr Arg Leu Cys Val Gln Ala Ser Leu Leu Pro 
                      340                 345                 350         
          Asp Ile Asp Ile Asn Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile 
                  355                 360                 365             
          Asp His Tyr Ile His Arg Pro Lys Arg Ala Val Gln Phe Ile Pro Leu 
              370                 375                 380                 
          Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser His Gln Leu Ile 
                          405                 410                 415     
          Ser Asp Val Gln Val Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln 
                      420                 425                 430         
          Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp 
                  435                 440                 445             
          Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys 
              450                 455                 460                 
          Cys Cys Phe Tyr Ala Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asn Lys Ile Arg 
          465                 470                 475                 480 
          Thr Leu Gln Glu Glu Leu Gln Lys Arg Arg Glu Ser Leu Ala Thr Asn 
                          485                 490                 495     
          Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Phe Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Leu 
                      500                 505                 510         
          Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ile Leu Thr Ile Gly Pro Cys 
                  515                 520                 525             
          Val Phe Ser Arg Leu Met Ala Phe Ile Asn Asp Arg Leu Asn Val Val 
              530                 535                 540                 
          His Ala Met Val Leu Ala Gln Gln Tyr Gln Ala Leu Lys Ala Glu Glu 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Ala Gln Asp 
          <![CDATA[<210> 177]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223> Ile或Val]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223> 通常視為自裂解之任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 177]]>
          Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 178]]>
          <![CDATA[<211> 153]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 178]]>
          Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 
                  35                  40                  45              
          Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 
                          85                  90                  95      
          Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 
                      100                 105                 110         
          Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 
                  115                 120                 125             
          Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 
              130                 135                 140                 
          Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 
          145                 150             
          <![CDATA[<210> 179]]>
          <![CDATA[<211> 132]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 179]]>
          Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 
                      20                  25                  30          
          Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 
                          85                  90                  95      
          Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 
                      100                 105                 110         
          Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile 
                  115                 120                 125             
          Ser Thr Leu Thr 
              130         
          <![CDATA[<210> 180]]>
          <![CDATA[<211> 134]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之說明：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 180]]>
          Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 
                      100                 105                 110         
          Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser 
                  115                 120                 125             
          Ile Ile Ser Thr Leu Thr 
              130                 
          <![CDATA[<210> 181]]>
          <![CDATA[<211> 162]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 181]]>
          Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 
                      20                  25                  30          
          Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 
                  35                  40                  45              
          Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 
              50                  55                  60                  
          Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 
                          85                  90                  95      
          Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 
                  115                 120                 125             
          Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Ser 
          <![CDATA[<210> 182]]>
          <![CDATA[<211> 135]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 182]]>
          Met Val Leu Gly Thr Ile Asp Leu Cys Ser Cys Phe Ser Ala Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 
                      20                  25                  30          
          Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 
                  35                  40                  45              
          Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 
          65                  70                  75                  80  
          His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 
                  115                 120                 125             
          Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser 
              130                 135 
          <![CDATA[<210> 183]]>
          <![CDATA[<211> 685]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 長臂猿白血病病毒]]>
          <![CDATA[<400> 183]]>
          Met Val Leu Leu Pro Gly Ser Met Leu Leu Thr Ser Asn Leu His His 
          1               5                   10                  15      
          Leu Arg His Gln Met Ser Pro Gly Ser Trp Lys Arg Leu Ile Ile Leu 
                      20                  25                  30          
          Leu Ser Cys Val Phe Gly Gly Gly Gly Thr Ser Leu Gln Asn Lys Asn 
                  35                  40                  45              
          Pro His Gln Pro Met Thr Leu Thr Trp Gln Val Leu Ser Gln Thr Gly 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Val Trp Asp Thr Lys Ala Val Gln Pro Pro Trp Thr Trp Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Thr Leu Lys Pro Asp Val Cys Ala Leu Ala Ala Ser Leu Glu Ser 
                          85                  90                  95      
          Trp Asp Ile Pro Gly Thr Asp Val Ser Ser Ser Lys Arg Val Arg Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Asp Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Tyr Lys Gln Ile Thr Trp Gly Ala 
                  115                 120                 125             
          Ile Gly Cys Ser Tyr Pro Arg Ala Arg Thr Arg Met Ala Ser Ser Thr 
              130                 135                 140                 
          Phe Tyr Val Cys Pro Arg Asp Gly Arg Thr Leu Ser Glu Ala Arg Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Gly Gly Leu Glu Ser Leu Tyr Cys Lys Glu Trp Asp Cys Glu Thr 
                          165                 170                 175     
          Thr Gly Thr Gly Tyr Trp Leu Ser Lys Ser Ser Lys Asp Leu Ile Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Lys Trp Asp Gln Asn Ser Glu Trp Thr Gln Lys Phe Gln Gln Cys 
                  195                 200                 205             
          His Gln Thr Gly Trp Cys Asn Pro Leu Lys Ile Asp Phe Thr Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Gly Lys Leu Ser Lys Asp Trp Ile Thr Gly Lys Thr Trp Gly Leu Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Tyr Val Ser Gly His Pro Gly Val Gln Phe Thr Ile Arg Leu Lys 
                          245                 250                 255     
          Ile Thr Asn Met Pro Ala Val Ala Val Gly Pro Asp Leu Val Leu Val 
                      260                 265                 270         
          Glu Gln Gly Pro Pro Arg Thr Ser Leu Ala Leu Pro Pro Pro Leu Pro 
                  275                 280                 285             
          Pro Arg Glu Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Asp Ser Asn Ser Thr Ala 
              290                 295                 300                 
          Leu Ala Thr Ser Ala Gln Thr Pro Thr Val Arg Lys Thr Ile Val Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Asn Thr Pro Pro Pro Thr Thr Gly Asp Arg Leu Phe Asp Leu Val 
                          325                 330                 335     
          Gln Gly Ala Phe Leu Thr Leu Asn Ala Thr Asn Pro Gly Ala Thr Glu 
                      340                 345                 350         
          Ser Cys Trp Leu Cys Leu Ala Met Gly Pro Pro Tyr Tyr Glu Ala Ile 
                  355                 360                 365             
          Ala Ser Ser Gly Glu Val Ala Tyr Ser Thr Asp Leu Asp Arg Cys Arg 
              370                 375                 380                 
          Trp Gly Thr Gln Gly Lys Leu Thr Leu Thr Glu Val Ser Gly His Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Cys Ile Gly Lys Val Pro Phe Thr His Gln His Leu Cys Asn Gln 
                          405                 410                 415     
          Thr Leu Ser Ile Asn Ser Ser Gly Asp His Gln Tyr Leu Leu Pro Ser 
                      420                 425                 430         
          Asn His Ser Trp Trp Ala Cys Ser Thr Gly Leu Thr Pro Cys Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Thr Ser Val Phe Asn Gln Thr Arg Asp Phe Cys Ile Gln Val Gln Leu 
              450                 455                 460                 
          Ile Pro Arg Ile Tyr Tyr Tyr Pro Glu Glu Val Leu Leu Gln Ala Tyr 
          465                 470                 475                 480 
          Asp Asn Ser His Pro Arg Thr Lys Arg Glu Ala Val Ser Leu Thr Leu 
                          485                 490                 495     
          Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ile Gly Thr Gly Ser 
                      500                 505                 510         
          Thr Ala Leu Ile Lys Gly Pro Ile Asp Leu Gln Gln Gly Leu Thr Ser 
                  515                 520                 525             
          Leu Gln Ile Ala Ile Asp Ala Asp Leu Arg Ala Leu Gln Asp Ser Val 
              530                 535                 540                 
          Ser Lys Leu Glu Asp Ser Leu Thr Ser Leu Ser Glu Val Val Leu Gln 
          545                 550                 555                 560 
          Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Phe Leu Lys Glu Gly Gly Leu Cys 
                          565                 570                 575     
          Ala Ala Leu Lys Glu Glu Cys Cys Phe Tyr Ile Asp His Ser Gly Ala 
                      580                 585                 590         
          Val Arg Asp Ser Met Lys Lys Leu Lys Glu Lys Leu Asp Lys Arg Gln 
                  595                 600                 605             
          Leu Glu Arg Gln Lys Ser Gln Asn Trp Tyr Glu Gly Trp Phe Asn Asn 
              610                 615                 620                 
          Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Leu Ser Thr Ile Ala Gly Pro Leu Leu 
          625                 630                 635                 640 
          Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Gly Pro Cys Ile Ile Asn Lys Leu 
                          645                 650                 655     
          Val Gln Phe Ile Asn Asp Arg Ile Ser Ala Val Lys Ile Leu Val Leu 
                      660                 665                 670         
          Arg Gln Lys Tyr Gln Ala Leu Glu Asn Glu Gly Asn Leu 
                  675                 680                 685
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Claims (33)

  1. 一種假型γ逆轉錄病毒顆粒，其包括經修飾RD114貓類內源性逆轉錄病毒套膜醣蛋白(RD114TR)及經修飾狒狒套膜醣蛋白(BaEVTR)，其中： a.該RD114TR醣蛋白包括RD114醣蛋白之胞外結構域及跨膜結構域以及雙嗜性鼠類白血病病毒(MLV-A)醣蛋白之細胞質結構域；且 b.其中該BaEVTR醣蛋白包括狒狒套膜醣蛋白(BaEV)之胞外結構域及跨膜結構域以及MLV-A醣蛋白之細胞質結構域， 視情況其中該RD114TR及該BaEVTR作為膜蛋白納入該γ逆轉錄病毒顆粒之套膜中；且 另外視情況其中該假型γ逆轉錄病毒顆粒進一步包括囊封於該套膜中之載體基因體、可選逆轉錄酶及可選整合酶，其中該載體基因體包括下列側接有兩個長末端重複(LTR)者中之一或多者： (A)    編碼嵌合抗原受體(CAR)或另一治療性蛋白或多肽之多核苷酸，該治療性蛋白或多肽視情況選自抗體或其片段、酶、配體或受體， (B)    (A)之反向補體，或 (C)    包括一或多個識別位點之多核苷酸，該等識別位點視情況由適於將CAR編碼序列或其反向補體插入該多核苷酸中之限制酶識別及裂解。
  2. 如請求項1之假型γ逆轉錄病毒顆粒，其中該載體基因體進一步包括下列各項中之一或多者：5’ LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’ LTR。
  3. 如請求項1或2之假型γ逆轉錄病毒顆粒，其係選自下列物種中之任一者：莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(friend murine embryonic stem cell virus，FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒。
  4. 一種製備天然殺手(NK)細胞之群體之方法，其包括將包括下列各項中之一或多者之細胞群體與免疫細胞活化劑(例如NK細胞活化劑)一起培養：NK細胞、能夠衍生NK細胞之祖細胞或能夠衍生NK細胞之幹細胞，其中該細胞群體在細胞群體中耗乏表現以下各項中之一或多者之細胞：CD3、CD4、CD8、T細胞受體(TCR) α鏈、TCR β鏈或αβTCR，且其中該免疫細胞活化劑係選自下列(i)至(iv)中之一或多者： (i)     人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長， (ii)    一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合NK細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖NK細胞，視情況其中該抗體係選自以下中之一或多者：抗CD2抗體、抗CD16抗體、抗NKG2D抗體、抗DNAM-1抗體、抗2B4抗體、抗NTB-A抗體或抗NKp46 (天然細胞毒性受體1 (NCR1))抗體， (iii)   一或多種由此活化或增殖NK細胞之細胞介素，或 (iv)   一或多種由此活化或增殖NK細胞之化學部分，其視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)。
  5. 如請求項4之方法，其進一步包括下列步驟中之一或兩者： 將編碼CAR或另一視情況選自抗體或其片段、酶、配體或受體之治療性蛋白或多肽之多核苷酸引入該經培養細胞群體中以供表現，其中該CAR特異性識別且結合該腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原；或 如在請求項4之該引入步驟之後將該細胞群體與免疫細胞活化劑一起培養，其中該免疫細胞活化劑係選自下列(i)至(iv)中之一或多者： (i)     人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長， (ii)    一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合NK細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖NK細胞， (iii)   一或多種由此活化或增殖NK細胞之細胞介素，或 (iv)   一或多種由此活化或增殖NK細胞之化學部分，其視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)， 視情況其中使用相同或不同之免疫細胞活化劑或其組合重複該培養步驟一次、兩次、三次或更多次。
  6. 如請求項4或5之方法，其中該等aAPC進一步表現以下各項中之一或多者：4-1BBL、膜結合(mb) IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25結合之mb IL-2突變體、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之mb IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc; ALT-803)或調介CD122/CD132信號傳導之細胞表面標記物，視情況其中該等aAPC進一步表現mb IL-21及4-1BBL，視情況其中該等aAPC係經改造K562細胞，視情況其中輻照該等aAPC，由此缺乏細胞增殖或缺乏長期存活，另外視情況其中在50 Gy、100 Gy、150 Gy或200 Gy下輻照該等aAPC，且視情況其中以約10:1、約5:1、約3:1、約2:1、約1:1、約1:2、約1:3、約1:5或約1:10之細胞數比率將該aAPC與該細胞群體一起培養。
  7. 如請求項4或5之方法，其中該等細胞介素係選自由以下組成之群：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、缺乏CD25結合之IL-2突變體、IL-7、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803可溶性)、IL-15、IL-18、IL-21、LEC、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)或MICA，視情況其中將該細胞群體與100-500 IU/ml IL-2、20 ng/ml IL-15或25 ng/mL IL-21中之任一者或任兩者或所有三者一起培養，視情況其中將該細胞群體與50 IU/ml IL-2及0.5 ng/ml IL-15中之任一者或兩者一起培養，視情況其中將該細胞群體與50 IU/ml IL-2一起培養 。
  8. 如請求項5之方法，其中在該引入步驟之前及之後與該細胞群體一起培養之該活化劑係相同的，或其中在該引入步驟之前及之後與該細胞群體一起培養之該活化劑彼此不同。
  9. 如請求項5之方法，其包括將假型γ逆轉錄病毒顆粒引入該經培養細胞群體中，由此將該CAR編碼多核苷酸引入該經培養細胞中，其中該顆粒包括側接有兩個長末端重複(LTR)之該CAR編碼多核苷酸或其反向補體、RD114TR及BaEVTR，視情況其中該假型γ逆轉錄病毒顆粒包括載體基因體，該載體基因體包括5’ LTR、5’帽、該CAR編碼多核苷酸或其反向補體、3’聚-A尾部及3’ LTR，視情況其中該假型γ逆轉錄病毒顆粒進一步包括逆轉錄酶及整合酶中之任一者或兩者，視情況其中該假型γ逆轉錄病毒顆粒係選自以下任何物種：莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒，視情況其中以約0.1、約0.2、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10之感染複數(MOI)將該假型γ逆轉錄病毒顆粒引入該經培養細胞群體中。
  10. 如請求項5之方法，其中在該引入步驟之前將該細胞群體培養至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天或至少約10天，視情況其中在該引入步驟之前將該細胞群體培養不超過7天、不超過8天、不超過9天、不超過10天、不超過11天、不超過12天、不超過13天、不超過14天、不超過15天、不超過3週或不超過1個月，視情況其中在該引入步驟之前將該細胞群體培養約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天。
  11. 如請求項5之方法，其中經由在RetroNectin存在下轉導包括該CAR編碼多核苷酸或其反向補體之病毒載體來將該CAR編碼多核苷酸引入該細胞群體中，視情況其中將該RetroNectin塗覆於轉導該細胞群體之容器之內表面上，另外視情況其中該細胞群體表現整聯蛋白α4β1 (VLA-4)及整聯蛋白α5β1 (VLA-5)中之任一者或兩者。
  12. 如請求項4或5之方法，其進一步包括富集該細胞群體中表現CD56、CD25、CD122、CD212、CD215、CD218、CD360、TGF-βR或IL-10R中之任一者或多者之細胞，且視情況進一步包括富集CD56 dim細胞及CD56 bright細胞中之任一者或兩者。
  13. 如請求項4或5之方法，其中任何細胞群體包括天然殺手(NK)細胞或其實質上經純化組合物，視情況其中該經耗乏細胞群體包括下列各項中之一或多者：NK細胞、祖細胞、HSC、iPSC或其各自之實質上經純化群體，視情況其中該等NK細胞包括衍生自下列各項中之一或多者之細胞：祖細胞、胚胎幹細胞、胚胎幹細胞衍生的細胞、胚胎生殖細胞、胚胎生殖細胞衍生的細胞、幹細胞、幹細胞衍生的細胞、多潛能幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)或永生化細胞，另外視情況其中該等祖細胞、HSC或iPSC中之一或多者能夠衍生NK細胞，視情況其中任何細胞群體實質上不含T細胞，視情況其中任何細胞群體實質上不含T調控細胞，視情況其中任何細胞群體係經分離、富集或純化的。
  14. 如請求項4或5之方法，其進一步包括以下步驟中之任一者或兩者：將該CAR表現群體調配成組合物；或冷凍保存該CAR表現群體。
  15. 一種藉由如請求項5至14中任一項之方法製得之CAR表現細胞之群體之用途，其用以製造用於抑制癌細胞生長之藥劑，其中由該CAR識別之抗原係由該癌細胞表現之TAA。
  16. 一種抑制癌細胞生長之活體外方法，其包括使藉由如請求項5至14中任一項之方法製得之CAR表現細胞群體與該癌細胞接觸，其中由該CAR識別之抗原係由該癌細胞表現之TAA。
  17. 一種藉由如請求項5至14中任一項之方法製得之CAR表現性免疫細胞之群體之用途，其用以製造用於治療癌症之藥劑，其中由該CAR識別之抗原係由該癌症之細胞表現之TAA。
  18. 一種NK細胞或其群體，其係藉由如請求項4至14中任一項之方法所產生或製備。
  19. 如請求項18之細胞或其群體，其包括小於0.5%之aAPC、視情況小於0.1%或小於0.2%或小於0.3%、小於0.4%或小於0.5%之aAPC。
  20. 一種組合物，其包括如請求項18或19之細胞或其群體及載劑、視情況醫藥上可接受之載劑。
  21. 如請求項20之組合物，其包括小於0.5%之aAPC、視情況小於0.1%或小於0.2%或小於0.3%、小於0.4%或小於0.5%之aAPC。
  22. 一種經改造aAPC，其表現抗原及以下細胞表面標記物中之一或多者：4-1BBL、膜結合(mb) IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25結合之mb IL-2突變體、與IL-15RαSushi-Fc融合蛋白複合之mb IL-15-N72D超激動劑(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc; ALT-803)或調介CD122/CD132信號傳導之細胞表面標記物，視情況其中該等aAPC係經改造K562細胞，視情況其中輻照該等aAPC，由此缺乏細胞增殖或長期存活或缺乏二者，另外視情況其中在50 Gy、100 Gy、150 Gy或200 Gy下輻照該等aAPC，視情況其中該等aAPC實質上不會存活14天以上。
  23. 一種套組，其包括一或多種適用於如請求項4至14中任一項之方法中之藥劑及可選說明書，視情況其中該等藥劑係選自下列各項中之一或多者：編碼CAR或另一治療性蛋白之多核苷酸、包括多核苷酸之載體、用於檢測細胞表型之抗體、用於分離或富集或純化免疫細胞之抗體、用於檢測多核苷酸之引子、細胞介素及aAPC。
  24. 一種製備γδ T細胞之群體之方法，其包括將包括下列各項中之一或多者之細胞群體與免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)一起培養：γδ T細胞、能夠衍生γδ T細胞之祖細胞或能夠衍生γδ T細胞之幹細胞，其中該細胞群體在細胞群體中耗乏表現以下各項中之一或多者之細胞：T細胞受體(TCR) α鏈、TCR β鏈或αβTCR，且其中該活化劑係選自下列(i)至(iv)中之一或多者： (i)     人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長， (ii)    一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合γδ T細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖γδ T細胞， (iii)   一或多種細胞介素，由此活化或增殖γδ T細胞，或 一或多種化學部分，由此活化或增殖γδ T細胞，該等化學部分視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)。
  25. 如請求項24之方法，其進一步包括將編碼CAR或另一視情況選自抗體或其片段、酶、配體或受體之治療性蛋白之多核苷酸引入該經培養細胞群體中以供表現，其中該CAR特異性識別且結合該腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原。
  26. 如請求項25之方法，其進一步包括在請求項25之該引入步驟之後將該細胞群體與免疫細胞活化劑(例如γδ T細胞活化劑)一起培養，其中該活化劑係選自下列(i)至(iv)中之一或多者： (i)     人工抗原呈現細胞(aAPC)，其表現腫瘤相關抗原(TAA)或病毒抗原且視情況活化及/或刺激免疫細胞生長， (ii)    一或多種抗體或其抗原結合片段，其特異性識別且結合γδ T細胞、祖細胞或幹細胞中之一或多者上之刺激受體，由此活化或增殖γδ T細胞， (iii)   一或多種細胞介素，由此活化或增殖γδ T細胞，或 (iv)   一或多種化學部分，由此活化或增殖γδ T細胞，該等化學部分視情況選自mTOR抑制劑、PI3K抑制劑或STING活化環狀二核苷酸(CDN)； 視情況其中使用相同或不同之活化劑重複該培養步驟一次、兩次、三次或更多次。
  27. 一種用於產生假型γ逆轉錄病毒顆粒之病毒包裝系統，其包括：(a)表現載體基因體之質體；(b)包裝質體；及(c)一或多種表現RD114TR及BaEVTR之套膜質體，視情況其中該載體基因體包括下列側接有兩個長末端重複(LTR)者中之一或多者： (A)    編碼嵌合抗原受體(CAR)或另一治療性蛋白之多核苷酸，該治療性蛋白視情況選自抗體或其片段、酶、配體或受體， (B)    (A)之反向補體，或 (C)    包括一或多個識別位點之多核苷酸，該等識別位點由適於將CAR編碼序列或其反向補體插入該多核苷酸中之限制酶識別， 視情況其中該載體基因體進一步包括下列各項中之一或多者：5’ LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’ LTR， 視情況其中該假型γ逆轉錄顆粒係選自以下任何物種：莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、弗裡德鼠類胚胎幹細胞病毒(FMEV)、嗜異性MuLB相關病毒、貓類肉瘤病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)及貓類白血病病毒。
  28. 如請求項27之病毒包裝系統，其進一步包括包裝細胞系，視情況其中該包裝細胞系係293T細胞系。
  29. 一種產生假型γ逆轉錄病毒顆粒之方法，其包括在適於包裝該假型γ逆轉錄病毒顆粒之條件下使用如請求項27或28之系統轉導包裝細胞系，視情況其中該包裝細胞系係293T細胞系，視情況其中該細胞系係以1.5:1.5:1之比率使用(a)、(b)及(c)之質體來轉導，視情況其中該包裝系統包括至少兩種套膜質體，一種表現RD114TR且另一種表現BaEVTR，另外視情況其中該細胞系係以1.5:1.5:1:1之比率使用(a)之質體、(b)之質體、RD114TR表現質體及BaEVTR表現質體來轉導。
  30. 一種產生逆轉錄病毒顆粒之方法，其包括 (i)     將表現載體基因體之載體、視情況質體引入適於將該載體基因體包裝至第一逆轉錄病毒顆粒中之第一包裝細胞系中， (ii)    將該第一逆轉錄病毒顆粒轉導至適於複製該第一逆轉錄病毒顆粒之第二包裝細胞系中；及 (iii)   分離該經複製逆轉錄病毒顆粒。
  31. 如請求項30之方法，其中該第二包裝細胞系在細胞膜中包括逆轉錄病毒套膜蛋白，但在該細胞膜中不包括該逆轉錄病毒套膜蛋白之進入受體，視情況其中該逆轉錄病毒套膜蛋白係狒狒套膜醣蛋白(BaEV)且其進入受體係丙胺酸/絲胺酸/半胱胺酸/蘇胺酸轉運蛋白1 (ASCT1)或鈉依賴性中性胺基酸轉運蛋白2型(ASCT2)，視情況其中該逆轉錄病毒套膜蛋白係RD114逆轉錄病毒(RD114)之套膜醣蛋白，且其進入受體係ASCT2，視情況其中該逆轉錄病毒套膜蛋白係長臂猿白血病病毒套膜醣蛋白(GALV)且其進入受體係鈉依賴性磷酸轉運蛋白(Pit1)。
  32. 一種逆轉錄病毒顆粒，其係藉由如請求項30或31之方法所產生。
  33. 一種產生經改造免疫細胞之方法，其包括將如請求項32之逆轉錄病毒顆粒轉導至免疫細胞或其前體細胞中。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114891740B (zh) * 2022-03-25 2023-12-01 和携科技有限公司 一种高增殖能力和高细胞毒性nk细胞的培养方法及其应用
CN115028737A (zh) * 2022-05-26 2022-09-09 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司 一种nk细胞培养用滋养细胞
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CN119161426A (zh) * 2023-06-09 2024-12-20 深圳市先康达生命科学有限公司 用于转导nk细胞假型化慢病毒载体的包膜糖蛋白及其应用
GB202315834D0 (en) * 2023-10-16 2023-11-29 Centre Nat Rech Scient Oncolytic viruses and their uses

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2618864C2 (ru) * 2011-09-29 2017-05-11 Энститю Насьональ Де Ля Сантэ Э Дэ Ля Решерш Медикаль (Инсерм) ЛЕНТИВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ, ПСЕВДОТИПИРОВАННЫЕ МУТАНТНЫМИ BaEV ГЛИКОПРОТЕИНАМИ
EP3235828A1 (en) * 2016-04-21 2017-10-25 Genethon Stable pseudotyped lentiviral particles and uses thereof
CN118895313A (zh) * 2017-09-18 2024-11-05 埃克苏马生物技术公司 用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物

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