TW201843179A

TW201843179A - 用於治療或預防認知障礙之人類化抗體、用於製備其之方法及用於使用其來治療或預防認知障礙之藥劑

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Publication number: TW201843179A
Application number: TW107106444A
Authority: TW
Inventors: 江口廣志; 村上隆; 並木直子; 田野倉章; 金妮 E 貝克; 貝帝爾蘇菲帕曼堤爾; 安琪拉瑪莉賈伯隆斯基; 丹尼爾史帝芬馬拉夏克; 卡爾米茲科斯奇; 戈帕蘭拉許納森
Original assignee: 日商帝人製藥股份有限公司; 美商默沙東藥廠
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2018-12-16
Also published as: US20200223916A1; AR110875A1; CA3052538A1; MA47608A; SG11201907548PA; PE20191614A1; JP2018139530A; MX2019009945A; CL2024000339A1; CN110382528A; US10894829B2; US11739143B2; WO2018154392A1; EA201991726A1; CO2019008786A2; BR112019016490A2; JP2020508666A; CN111320695B; GEP20227392B; IL267945B2

Abstract

本發明提供用於使用結合tau蛋白、在位置413處之絲胺酸處磷酸化之人類化抗體組合物之方法及所述人類化抗體組合物。

Description

用於治療或預防認知障礙之人類化抗體、用於製備其之方法及用於使用其來治療或預防認知障礙之藥劑

相關申請案之交叉參考本申請案主張2017年2月27日申請的日本申請案第2017-035594號之權益，其內容明確地以全文引用的方式併入本文中。

序列表本申請案含有序列表，所述序列表已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。在2018年2月25日創建之所述ASCII複本命名為063785-06-5002-WO-SeqLstg-_ST25.txt，且大小為319,488位元組。

本發明係關於一種用於治療性或預防性治療認知障礙之人類化抗體、一種生產所述人類化抗體之方法、一種使用所述抗體之針對認知障礙之治療性或預防性藥劑及用於使用本文所揭示之治療劑治療或預防認知障礙之方法。更特定言之，本發明係關於一種具有極佳改良認知功能效果之新穎人類化抗磷酸化tau抗體、一種生產所述人類化抗體之方法、一種含有所述人類化抗體之針對認知障礙之治療性或預防性藥劑及用於使用所述人類化抗磷酸化tau抗體之治療或預防認知障礙之方法。

認知病症或癡呆為一種歸因於一些後天性原因發展智慧退化、產生社會適應阻礙之病狀。認知障礙分類為神經退化性疾病、血管認知疾病、朊病毒疾病、傳染病、代謝/內分泌疾病、外傷及大腦手術疾病及有毒疾病（參見Toshifumi Kishimoto及Shigeki Takahashi（編）, 「《Seishinka步驟系列（STEP Series Seishinka）》」（日本文獻）, 第2版, Kaibashobo, 2008, 第103-104頁）。截至2010年，在日本存在約2.1百萬例癡呆患者，其中在高於65歲之老年人中發病率約8%至10%或甚至多於10%，且此已公認為全世界老齡化社會之嚴重問題（Takashi Asada, 「《週刊醫學雜誌（Igaku no Ayumi）》」（日本文獻）, 補充卷, 「《認知障礙（Cognitive disorders）》」, Ishiyaku Publishing, 2011, 第5-10頁）。關於認知障礙之潛在疾病之資料指示，大部分為神經退化性疾病，諸如阿茲海默症（Alzheimer's disease，AD）及額顳葉型葉退化（frontotemporal lobar degeneration，FTLD），其中約35%為AD，約15%為AD與腦血管疾病之組合，且5%為FTLD（同上）。與神經退化性疾病相關之認知障礙表徵為隱伏發作在至少六個月或更長時間內進行之記憶障礙及/或人格改變。神經退化性過程與認知功能缺損程度高度相關，且其中涉及之一致特徵為存在神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFT）（Alistair Burns等人（編）, 《癡呆（Dementia）》, 第3版, 2005, CRC Press, 第408-464頁）。

tau蛋白為一種由位於人類基因組中之染色體17（17q21）上之MAPT基因編碼的蛋白質。Tau蛋白為在中樞神經系統中豐富表現之微管結合蛋白中之一者。已發現tau為形成AD（最顯著神經退化性疾病中之一者）中之NFT之配對螺旋細絲及直細絲之主要組成蛋白質，且已在各種神經病理學病狀中證明其胞內累積。

基於MAPT基因中之突變與染色體17相關之伴隨帕金森氏症之額顳葉型癡呆（chromosome17-linked frontotemporal dementia with Parkinsonism，FTDP-17）中之tau累積之間的關係，Tau首先牽涉神經退化性疾病。已報導MAPT基因中之多於40種基因突變與FTDP-17關於（Tetsuaki Arai, 「《Shinkei Naika》」（日本文獻）, 第72卷, 《特定數目（special number）》,（增刊6）, 2010, 第46-51頁）。表明此等基因突變為更改tau同功異型物之比例或更改結構及改變突變tau與微管之間的相互作用，因此造成發展病變。然而，不同於家族性神經退化性疾病，在諸如AD之偶發性神經退化性疾病中罕見地觀測到MAPT中之突變。另外，神經退化性疾病中累積之tau表徵為經由磷酸化高度修飾。此外，在呈現輕度認知障礙（mild cognitive impairment，MCI）之患者中，在脊髓液中之磷酸化tau含量與垂體萎縮程度之間觀測到相關性，表明磷酸化tau作為患有tau蛋白病之患者中之神經退化的高度可信賴的生物標記（Wendy Noble等人, 《關於藥物發現之專家觀點（Expert Opinion on Drug Discovery）》, 2011, 第6卷, 第8期, 第797-810頁）。基於此等發現，已嘗試研發使用針對為涉及磷酸化之酶之激酶之抑制劑，且特定言之針對GSK-3β之抑制劑以用於抑制tau過高磷酸化的治療（同上）。然而，由於諸如GSK-3β之激酶不僅牽涉病理性病狀且亦牽涉正常生理學過程中之功能控制，所以存在對於可能副作用之擔憂。實際上，由GSK-3β磷酸化tau之位點中之一些與見於胎兒及正常人類大腦中之tau磷酸化位點一致（Burnes等人，見上文），表明此策略可能影響正常tau功能的可能性。

儘管咸信，胞外tau來源於由於細胞死亡而自退化神經細胞之洩漏物，但近期研究已表明，在過高胞內磷酸化之後，加工tau且接著主動分泌在細胞外。認為自細胞分泌之磷酸化tau在某些磷酸化位點處去磷酸化，且隨後作用於周圍細胞之蕈毒鹼受體M1及M3，因此引起各種效果，諸如促進胞內tau磷酸化及造成細胞死亡（Miguel Diaz-Hernandes等人, 《生物化學雜誌（Journal of Biological Chemistry）》, 2010, 第285卷, 第42期, 第32539-32548頁，及Venessa Plouffe等人, 《公共科學圖書館（PLoS ONE）》, 2012, 第7卷, 第36873頁）。根據旨在執行針對tau之特異性作用之嘗試，已報導關於使用tau蛋白作為靶標之針對tau蛋白病之免疫療法之實驗（參見Noble,見上文；Kishimoto, 見上文；Asada, 見上文；及Burns, 見上文）。

人類認知障礙中之主要症狀為記憶障礙及認知功能缺損，考慮到認知功能在中基於記憶之判斷、交流及行為中之作用，所述記憶障礙及認知功能缺損尤其重要。另一方面，當為伴隨帕金森氏症之染色體17-相關之額顳葉型癡呆（FTDP-17）及晚期阿茲海默症中發現之症狀時，運動功能不一定為認知障礙中呈現之主要症狀。因此，治療認知障礙考慮之主要問題為改良認知功能。然而，目前存在用於測試tau蛋白病相關之認知功能缺損、將允許鑑別用於治療認知障礙之治療性或預防性藥劑的適合動物模型。另外，不存在呈現針對認知障礙之特異性及優良效果的此類藥劑。

鑒於針對人類個體之認知障礙之治療性及預防性應用，需求一種不僅具有針對磷酸化tau之高結合親和性且亦呈現針對人體之降低抗原性的人類化抗磷酸化tau抗體。

相對於此背景，在tau蛋白中之可經受阿茲海默症中之異常磷酸化之大量磷酸化位點中，本發明者聚焦於位置413處之絲胺酸殘基（Ser413）之磷酸化位點，且成功生產對Ser413磷酸化tau具有特異性之多株兔抗體及單株小鼠抗體。本發明者亦向展示磷酸化tau蛋白異常表現之小鼠認知障礙模型中投與單株小鼠抗體，且確認觀測到認知功能改良（WO2013/180238A）。

在一些實施例中，本發明提供包含特異性結合至絲胺酸殘基413處磷酸化之Tau蛋白（pS413-Tau）之抗原結合部分的蛋白質，諸如抗體。在一些實施例中，本發明提供編碼所述蛋白質之核酸。在一些實施例中，本發明提供包含編碼所述蛋白質之此類核酸之細胞。在一些實施例中，本發明提供用於藉由向有需要之患者投與本文所揭示之蛋白質、核酸或細胞來治療tau蛋白病（例如阿茲海默症）的方法。

因此在一些態樣中，本發明提供一種人類化抗體或其片段或衍生物，其與至少在對應於SEQ ID NO: 1之Ser413之胺基酸殘基上磷酸化之tau蛋白或tau肽產生抗原-抗體反應。在一些情況下，人類化抗體或其片段或衍生物針對tau蛋白或tau肽具有1.86 × 10^- ⁸ M或更低之平衡解離常數。

在其他態樣中，人類化抗體或其片段或衍生物相比於非磷酸化tau蛋白（或tau肽，例如SEQ ID NO: 69），與磷酸化tau蛋白（或tau肽，例如SEQ ID NO: 8）具有經改良選擇親和性。

在一額外態樣中，當投與至血液中時，本文中所描述之人類化抗體或其片段或衍生物具有進入大腦之經改良能力。

在另一態樣中，人類化抗體或其片段或衍生物包括如下CDR：作為CDR-H1序列，與序列1M具有80%或更多同源性之胺基酸序列；作為CDR-H2序列，與序列2M或2H1具有84%或更多同源性之胺基酸序列；作為CDR-H3序列，與序列3M具有80%或更多同源性之胺基酸序列；作為CDR-L1序列，與序列4L1或4M具有87%或更多同源性之胺基酸序列；作為CDR-L2序列，與序列5M具有85%或更多同源性之胺基酸序列；及作為CDR-L3序列，與序列6M具有77%或更多同源性之胺基酸序列。

在一額外態樣中，人類化抗體或其片段或衍生物包括如下CDR：作為CDR-H1序列，序列1M之胺基酸序列；作為CDR-H2序列，序列2H1之胺基酸序列或與序列2H1不同之處在於位置15處之Ala經Asp取代之胺基酸序列；作為CDR-H3序列，序列3M之胺基酸序列；作為CDR-L1序列，序列4L1之胺基酸序列或與序列4L1不同之處在於位置5處之Ser經Asn取代之胺基酸序列；作為CDR-L2序列，序列5M之胺基酸序列；及作為CDR-L3序列，序列6M之胺基酸序列。

在另一態樣中，人類化抗體或其片段或衍生物具有如下CDR：（1）作為CDR-H1序列，1M之胺基酸序列；作為CDR-H2序列，2H1之胺基酸序列；作為CDR-H3序列，3M之胺基酸序列；作為CDR-L1序列，4L1之胺基酸序列；作為CDR-L2序列，5M之胺基酸序列；及作為CDR-L3序列，6M之胺基酸序列，或（2）作為CDR-H1序列，1M之胺基酸序列；作為CDR-H2序列，2H1之胺基酸序列；作為CDR-H3序列，3M之胺基酸序列；作為CDR-L1序列，4M之胺基酸序列；作為CDR-L2序列，5M之胺基酸序列；及作為CDR-L3序列，6M之胺基酸序列，或（3）作為CDR-H1序列，1M之胺基酸序列；作為CDR-H2序列，2M之胺基酸序列；作為CDR-H3序列，3M之胺基酸序列；作為CDR-L1序列，4M之胺基酸序列；作為CDR-L2序列，5M之胺基酸序列；及作為CDR-L3序列，6M之胺基酸序列。

在額外態樣中，人類化抗體或其片段或衍生物包括：作為重鏈可變區，與選自以下序列之序列具有90%或更多同源性之胺基酸序列：VH11、VH12、VH47、VH61、VH62、VH64及VH65；及作為輕鏈可變區，與選自以下序列之序列具有90%或更多同源性之胺基酸序列：VL15、VL36、VL46、VL47、VL48及VL50。

在另一態樣中，人類化抗體或其片段或衍生物包括：作為重鏈可變區，序列VH65之胺基酸序列或與序列VH65不同之處在於包括選自由以下組成之群之一或多個取代的胺基酸序列：位置28（Kabat編號：H28）處之Ala經Thr取代、位置30（Kabat編號：H30）處之Asn經Ser取代、位置49（Kabat編號：H49）處之Val經Gly取代、位置64（Kabat編號：H61）處之Ala經Asp取代及位置78（Kabat編號：H75）處之Gln經Lys取代；及作為輕鏈可變區，序列VL47之胺基酸序列或與序列VL47不同之處在於包括選自由以下組成之群之一或多個取代的胺基酸序列：位置17（Kabat編號：L17）處之Asp經Glu取代、位置28（Kabat編號：L27A）處之Ser經Asn取代、位置42（Kabat編號：L37）處之Gln經Leu取代、位置50（Kabat編號：L45）處之Gln經Arg取代及位置51（Kabat編號：L46）處之Arg經Leu取代。

在另一態樣中，人類化抗體或其片段或衍生物包括以下序列組合中之任一者：（a）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL15；（b）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL36；（c）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL46；（d）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL47；（e）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL48；（f）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL50；（g）作為重鏈可變區之序列VH12及作為輕鏈可變區之序列VL48；（h）作為重鏈可變區之序列VH47及作為輕鏈可變區之序列VL48；（i）作為重鏈可變區之序列VH61及作為輕鏈可變區之序列VL48；（j）作為重鏈可變區之序列VH62及作為輕鏈可變區之序列VL48；（k）作為重鏈可變區之序列VH64及作為輕鏈可變區之序列VL47；（l）作為重鏈可變區之序列VH64及序列VL48；及（m）作為重鏈可變區之序列VH65及序列VL47。

在一額外態樣中，本發明提供一種用於治療或預防癡呆之藥劑，包括如本文中所描述之人類化抗體或其片段或衍生物。

在另一態樣中，本發明提供用於治療或預防癡呆或tau蛋白病之方法及藥劑，所述癡呆或tau蛋白病包括阿茲海默症、皮質基底核退化症、進行性核上麻痹、皮克氏疾病（Pick's disease）、嗜銀粒性癡呆（嗜銀粒性疾病）、伴隨早老性癡呆之多發性系統tau蛋白病（multiple system tauopathy with presenile dementia，MSTD）、與染色體17相關之額顳葉型癡呆及帕金森氏症（frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17，FTDP-17）、伴隨神經原纖維纏結之癡呆、伴隨鈣化之擴散性神經原纖維纏結（diffuse neurofibrillary tangle with calcification，DNTC）、伴隨球狀膠質夾雜物之白質tau蛋白病（white matter tauopathy with globular glial inclusions，WMT-GGI）或伴隨tau病變之額顳葉型葉退化（frontotemporal lobar degeneration with tau pathology，FTLD-tau）。

在一額外態樣中，本發明提供醫藥組合物，包括如本文中所描述之人類化抗體或其片段或衍生物及醫藥學上可接受之載劑。

在另一態樣中，本發明提供抗pSer413 tau抗體，包括：a）重鏈可變域，包括含SEQ ID NO: 86之vhCDR1、含SEQ ID NO: 115之vhCDR2及含SEQ ID NO: 88之vhCDR3；及b）輕鏈可變域，包括選自由以下組成之群之一組vlCDR：i）包括SEQ ID NO: 102之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；ii）包括SEQ ID NO: 91之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；iii）包括SEQ ID NO: 92之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；iv）包括SEQ ID NO: 93之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；v）包括SEQ ID NO: 94之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；vi）包括SEQ ID NO: 95之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；vii）包括SEQ ID NO: 96之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；viii）包括SEQ ID NO: 97之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；ix）包括SEQ ID NO: 98之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；x）包括SEQ ID NO: 99之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；xi）包括SEQ ID NO: 100之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；及xii）包括SEQ ID NO: 101之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3。在一些情況下，抗體具有至少約40之結合至SEQ ID NO: 8之磷酸化肽之抗體與結合至SEQ ID NO: 69之非磷酸化肽之抗體的比率。

在額外態樣中，本發明提供抗pSer413 tau抗體，包括：a）選自SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 117之重鏈可變域；及b）選自以下之輕鏈可變域：SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113及SEQ ID NO: 114。在一些情況下，抗體具有至少約40之結合至SEQ ID NO: 8之磷酸化肽之抗體與結合至SEQ ID NO: 69之非磷酸化肽之抗體的比率。

在一額外態樣中，本發明之抗體包括選自以下之重鏈恆定域：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142及SEQ ID NO: 144。

在另一態樣中，本發明之抗體包含選自SEQ ID NO: 79及SEQ ID NO: 80之輕鏈恆定域。

在一額外態樣中，本發明之抗體包含選自SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 117之可變重鏈域。

在另一態樣中，本發明之抗體包含選自以下之可變輕鏈域：SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113及SEQ ID NO: 114。

在一額外態樣中，抗體包含選自以下對之重鏈及輕鏈：LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 144、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 145、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 146、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 147、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 148、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 149、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 150、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 151、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 152、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 153、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 154、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 155、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 156、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 157、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 158、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 159、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 160、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 161、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 144、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 145、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 146、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 147、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 148、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 149、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 150、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 151、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 152、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 153、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 154、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 155、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 156、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 157、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 158、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 159、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 160及LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 161。

在另一態樣中，本發明抗體具有包括SEQ ID NO: 184或由其組成之輕鏈，及包括SEQ ID NO: 144或由其組成之重鏈。

在一額外態樣中，本發明抗體具有包括SEQ ID NO: 184或由其組成之輕鏈，及包括SEQ ID NO: 152或由其組成之重鏈。

在另一態樣中，本發明提供核酸組合物，包括：a）第一核酸，編碼選自以下之輕鏈：SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184及SEQ ID NO: 185；及b）第二核酸，編碼選自以下之重鏈：SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160及SEQ ID NO: 161。

在一額外態樣中，本發明提供一種表現載體組合物，包括第一及第二核酸，其中第一核酸包含於第一表現載體中且第二核酸包含於第二表現載體中。

在另一態樣中，本發明提供一種表現載體組合物，其中第一核酸及第二核酸包含於單一表現載體中。

在一額外態樣中，本發明提供宿主細胞，包括表現載體組合物；及製備抗pSer413 tau抗體之方法，包括在表現所述抗體之條件下培養宿主細胞及回收所述抗體。

在另一態樣中，本發明提供治療個體之tau蛋白病之方法，包括投與本發明之抗體。

A.概述

本發明提供包含抗原結合部分之抗體，所述抗原結合部分特異性結合至在絲胺酸殘基413處磷酸化之Tau蛋白（pSer413-Tau）。亦提供編碼所述蛋白之核酸及包含此類核酸之細胞。在一些實施例中，所提供方法及組合物用於治療tau蛋白病（例如阿茲海默症）中。

已鑑別編碼tau之MAPT基因為由置於基因組上之13個外顯子組成，其可經由替代性剪接表現為多種不同蛋白質同功異型物（參見Arai，見上文）。tau蛋白包括：N端酸性域，視外顯子2與外顯子3之替代性剪接而定含有29個胺基酸之0-2個重複序列（N）（N0-N2）；中間域，富含脯胺酸；及C端微管結合域（由外顯子9至12編碼），含有有助於微管結合之3個（3R）或4個（4R）重複序列（R）。因此，視人類tau含有之29個胺基酸重複序列（N）及微管結合重複序列（R）之數目而定，其具有六種代表性同功異型物：3R0N（352個胺基酸）、3R1N（381個胺基酸）、3R2N（410個胺基酸）、4R0N（383個胺基酸）、4R1N（412個胺基酸）及4R2N（441個胺基酸）。在此等同功異型物中，僅3R0N在胚胎大腦中存在，儘管所有六種同功異型物均在成人大腦中存在，其中4R為最豐富的（Burns，見上文）。3R與4R同功異型物之間的差異係由是經由替代性剪接（3R）移除外顯子10還是存在外顯子10（4R）造成的結果。為了明確地鑑別此等tau同功異型物中之任一者中之胺基酸殘基之位置，最長同功異型物（亦即4R2N（定義於SEQ ID NO: 1中））之胺基酸數目（1至441）用作參考物。舉例而言，「Ser413」係指4R2N（定義於SEQ ID NO: 1中）中之第413胺基酸位置處之絲胺酸殘基，其對應於4R1N（定義於SEQ ID NO: 2中）中之第384處、4R0N（定義於SEQ ID NO: 3中）中之第355處、3R2N（定義於SEQ ID NO: 4中）中之第382處、3R1N（定義於SEQ ID NO: 5中）中之第353處及3R0N（定義於SEQ ID NO: 6中）中之第324處的絲胺酸。

Tau在對應於定義於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列之位置413處之絲胺酸殘基（Ser413，當磷酸化時，其在本文中被稱作「pSer413」）（且因此，在Ser413處磷酸化之tau蛋白為「pSer413 tau」或「pSer413-tau」）的位置處具有磷酸化胺基酸殘基，所述位置為AD中的特異性磷酸化的位點。如先前在WO 2013/180238中所展示，向發展認知功能缺損同時成熟化之轉殖基因小鼠中投與參與同PSer413-tau之特異性抗原-抗體反應之抗體，引起認知功能復原至與對照組幾乎相同的水準。有趣的是，投與類似濃度之針對在對應於定義於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列之Ser396之位置處具有磷酸化胺基酸殘基的tau蛋白質的單株抗體，不引起認知功能的足夠改良，所述單株抗體比以上抗體針對等效抗原具有更強的親和性。由於不存在對於包括對應於定義於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列之Ser413之位置處的胺基酸殘基的區關於tau的結構及功能的特定資訊，所以與此區結合的抗體具有此類強力改良認知功能效果為完全出人意料的結果。

因此，本發明係針對人類化及最佳化抗pSer413 tau抗體，用作用於治療人類個體之諸如tau蛋白病之認知障礙的治療性或預防性藥劑。

根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體針對磷酸化tau呈現高結合親和性同時針對人體具有顯著降低的抗原性，且可有效地用作用於人類個體之認知障礙（諸如tau蛋白病）之治療性或預防性藥劑。另外，CDR內之胺基酸修飾相比於鼠類CDR降低去醯胺化，從而穩定性增加；參見實例8、9及10。 B.定義

如本文中所使用，以下術語中之每一者具有在此章節中與其相關之含義。

本文中使用冠詞「一（a及an）」係指所述冠詞之一個或多於一個（亦即指至少一個）文法賓語。藉助於實例，「一元件」意謂一個元件或多於一個元件。

如本文所使用，當涉及諸如量、時距及其類似者之可量測值時，術語「約」意欲包涵離指定值±20%或±10%、更佳±5%、甚至更佳±1%且再更佳±0.1%之偏差，因為所述偏差適於進行本發明方法。

本文中「去除」意謂降低或移除活性。因此舉例而言，「去除FcγR結合」意謂，相比於不含有特定變體之Fc區，Fc區胺基酸變體之起始結合低於50%，其中活性損失低於70-80-90-95-98%較佳，且一般而言，其中活性低於Biacore分析中之可偵測結合之水準。

如本文所使用，「ADCC」或「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」意謂細胞介導的反應，其中表現FcγR之非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上之結合的抗體，且隨後引起靶細胞之裂解。ADCC與針對FcγRIIIa之結合相關；針對FcγRIIIa之結合增加引起ADCC活性增加。如本文中所論述，本發明之許多實施例完全去除ADCC活性。

如本文所使用，「ADCP」或抗體依賴性細胞介導的吞噬作用意謂細胞介導的反應，其中表現FcγR之非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上之結合的抗體，且隨後引起靶細胞之吞噬作用。

本文中之「抗原結合域」或「ABD」意謂當作為多肽序列之部分存在時特異性結合靶抗原之一組六個互補決定區（CDR），如本文所論述。因此，「抗原結合域」結合靶抗原，如本文中所概述。如本領域中已知，此等CDR一般作為第一組可變重鏈CDR（vhCDR或V_H CDR或CDR-HC）及第二組可變輕鏈CDR（vlCDR或V_L CDR或CDR-LC）存在，各自包含三個CDR：重鏈為vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3；且輕鏈為vlCDR1、vlCDR2及vlCDR3。CDR分別在可變重鏈域及可變輕鏈域中存在，且一起形成Fv區。因此，在一些情況下，抗原結合域之六個CDR由可變重鏈及可變輕鏈提供。呈「Fab」形式，所述6個CDR組由兩個不同多肽序列、可變重鏈域（vh或V_H ；含有vhCDR1、vhCDR2及vhCDR3）及可變輕鏈域（vl或V_L ；含有vlCDR1、vlCDR2及vlCDR3）提供，其中vh域之C端連接至重鏈CH1域之N端，且vl域之C端連接至恆定輕鏈域之N端（且因此形成輕鏈）。呈scFv形式，vh及vl域一般經由使用如本文中概述之連接子來共價連接為單一多肽序列，其可為（自N端開始）vh-連接子-vl或vl-連接子-vh，其中前者一般為較佳的（視而定，所使用形式，包括視情況存在之各側上之域連接子）。如本領域中所理解，各CDR由可變重鏈及可變輕鏈域中之每一者中之構架區分開：對於輕鏈可變域，其為FR1-vlCDR1-FR2-vlCDR2-FR3-vlCDR3-FR4；且對於重鏈可變域，其為FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR4，其中構架區展示對於人類生殖系序列之高度一致性。本發明之抗原結合域包含Fab、Fv及scFv。

本文中之「修飾」意謂多肽序列中之胺基酸取代、插入及/或缺失或對於化學連接至蛋白質之部分的更改。舉例而言，修飾可為連接至蛋白質之經更改碳水化合物或PEG結構。本文中之「胺基酸修飾」意謂多肽序列中之胺基酸取代、插入及/或缺失。出於清楚起見，除非另外指出，否則胺基酸修飾始終係對於由DNA編碼之胺基酸，例如在DNA及RNA中具有密碼子之20個胺基酸。

本文中之「胺基酸取代」或「取代」意謂用不同胺基酸置換親本多肽序列中之特定位置處之胺基酸。特定言之，在一些實施例中，取代係對於特定位置處非天然存在之或生物體內或任何生物體中非天然存在之胺基酸。舉例而言，取代M252Y係指變異多肽，在此情況下，Fc變體，其中位置252處之甲硫胺酸經酪胺酸置換。出於清楚起見，已經工程改造以改變核酸編碼序列但未改變起始胺基酸（例如更換CGG（編碼精胺酸）為CGA（仍編碼精胺酸）以增加宿主生物體表現量）之蛋白質不為「胺基酸取代」；亦即儘管形成編碼相同蛋白質之新型基因，但若蛋白質在其開始之特定位置處具有相同胺基酸，則其不為胺基酸取代。

如本文所使用，「變異蛋白」或「蛋白質變體」或「變體」意謂藉助於至少一個胺基酸修飾而不同於親本蛋白質之蛋白質。蛋白質變體可指代蛋白質自身、包括蛋白質之組合物或編碼其之胺基序列。較佳地，蛋白質變體相比於親本蛋白質具有至少一個胺基酸修飾，例如相比於親本約一個至約七十個胺基酸修飾，且較佳約一個至約五個胺基酸修飾。如下文所描述，在一些實施例中，親本多肽，例如Fc親本多肽，為人類野生型序列，諸如來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc區。本文中之蛋白質變體序列將較佳地與親本蛋白質序列擁有至少約80%一致性，且最佳至少約90%一致性，更佳至少約95%-98%-99%一致性。變異蛋白可以指變異蛋白自身，包括蛋白質變體之組合物或編碼其之DNA序列。

因此，如本文所使用，「抗體變體」或「變異抗體」意謂藉助於至少一個胺基酸修飾而不同於親本抗體之抗體；如本文所使用，「IgG變體」或「變異」IgG意謂藉助於至少一個胺基酸修飾而不同於親本IgG（同樣，在許多情況下，不同於人類IgG序列）之抗體；及如本文所使用，「免疫球蛋白變體」或「變異免疫球蛋白」意謂藉助於至少一個胺基酸修飾而不同於親本免疫球蛋白序列之免疫球蛋白序列。如本文所使用，「Fc變體」或「變異Fc」意謂在Fc域中包括胺基酸修飾之蛋白質。本發明之Fc變體根據構成其之胺基酸修飾來定義。因此，舉例而言，M252Y或252Y為相對於親本Fc多肽具有在位置252處之酪胺酸取代之Fc變體，其中編號係根據EU索引。同樣，M252Y/S254T/T256E定義相對於親本Fc多肽具有取代M252Y、S254T及T256E之Fc變體。WT胺基酸之一致性可能為非特定的，在此情況下，前述變體被稱作252Y/254T/256E。應注意，所提供取代之次序為任意的，換言之，例如252Y/254T/256E為與254T/252Y/256E等相同的Fc變體。對於在本發明中關於抗體論述之所有位置，除非另外指出，否則胺基酸位置編號係根據可變域之Kabat編號，且係根據包含Fc域之恆定域之EU索引。EU索引或如Kabat或EU編號流程中之EU索引係指EU抗體之編號（Edelman等人, 1969, 《美國國家科學院院報（Proc Natl Acad Sci USA）》 63:78-85,在此以引用之方式完全併入）。修飾可為添加、缺失或取代。取代可包括天然存在之胺基酸，及在一些情況下，合成的胺基酸。

如本文中所使用，本文中之「蛋白質」意謂至少兩個共價連接之胺基酸，其包含蛋白質、多肽、寡肽及肽。肽基可包括天然存在之胺基酸及肽鍵。

如本文所使用，「Fab」或「Fab區」意謂包括VH、CH1、VL及CL免疫球蛋白域之多肽。Fab可以指分開之此區，或在全長抗體、抗體片段或Fab融合蛋白之上下文中，此區。

如本文所使用，「Fv」或「Fv片段」或「Fv區」意謂包括單一抗原結合域（antigen binding domain，ABD）之VL及VH域之多肽。如本領域中之彼等者應瞭解，此等一般由兩條鏈組成，或可經組合（一般與如本文所論述之連接子）形成scFv。

如本文所使用，「胺基酸」及「胺基酸一致性」意謂由DNA及RNA編碼之20種天然存在之胺基酸中之一者。

如本文所使用，「效應功能」意謂由抗體Fc區與Fc受體或配位體之相互作用造成之生物化學事件。效應功能包含（但不限於）ADCC、ADCP及CDC。

如本文所使用，「Fc伽馬受體」、「FcγR」或「Fc伽馬R」意謂結合IgG抗體Fc區且由FcγR基因編碼之蛋白質家族之任何成員。在人類中，此家族包含（但不限於）FcγRI（CD64），包含同功異型物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc；FcγRII（CD32），包含同功異型物FcγRIIa（包含異型H131及R131）、FcγRIIb（包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2）及FcγRIIc；及FcγRIII（CD16），包含同功異型物FcγRIIIa（包含異型V158及F158）及FcγRIIIb（包含異型FcγRIIb-NA1及FcγRIIb-NA2）（Jefferis等人, 2002, 《免疫學快報（Immunol Lett）》 82:57-65, 以引用之方式完全併入）；以及任何未發現的人類FcγR或FcγR同功異型物或異型。在一些情況下，如本文中所概述，降低或去除與FcγR受體中之一或多者之結合。舉例而言，降低與FcγRIIIa之結合降低ADCC，且在一些情況下，需要降低與FcγRIIIa及FcγRIIb之結合。

如本文所使用，「FcRn」或「新生Fc受體」意謂結合IgG抗體Fc區且至少部分由FcRn基因編碼之蛋白質。FcRn可以來自任何生物體，包含（但不限於）人類、小鼠、大鼠、兔及猴。如本領域中已知，功能性FcRn蛋白包括通常被稱作重鏈及輕鏈之兩條多肽。輕鏈為β-2-微球蛋白，且重鏈由FcRn基因編碼。除非另外指出，否則在本文中，FcRn或FcRn蛋白係指FcRn重鏈與β-2-微球蛋白之複合物。

如本文所使用，「親本多肽」意謂隨後經修飾產生變體之起始多肽。親本多肽可為天然存在之多肽、或天然存在之多肽之變體或經工程改造型式。親本多肽可以指多肽自身、包括親本多肽之組合物或編碼其之胺基酸序列。因此，如本文所使用，「親本免疫球蛋白」意謂經修飾產生變體之未經修飾免疫球蛋白多肽；及如本文所使用，「親本抗體」意謂經修飾產生變異抗體之未經修飾抗體。應注意，「親本抗體」包含已知商業、以重組方式生產之抗體，如下文所概述。

本文中之「重鏈恆定區」意謂抗體之CH1-鉸鏈-CH2-CH3部分，一般來自人類IgG1、IgG2或IgG4。

如本文所使用，「靶抗原」意謂特異性地由既定抗體之可變區結合之分子。在本發明之情況下，靶抗原為在Ser413位置處磷酸化（「pSer413-tau」）之tau蛋白。

如本文所使用，「靶細胞」意謂表現靶抗原之細胞。

如本文所使用，「可變區」意謂免疫球蛋白之區，所述區包括大體上由V.κ.、V.λ.及/或分別構成κ、λ及重鏈免疫球蛋白基因座之VH基因中之任一者編碼的一或多個Ig域。

本文中之「野生型或WT」意謂在自然界中發現之胺基酸序列或核苷酸序列，包含對偶基因變異。WT蛋白質具有未有意修飾之胺基酸序列或核苷酸序列。

本文中所使用之術語「tau蛋白」意謂具有SEQ ID NO: 1至6中定義之胺基酸序列之人類tau蛋白之六種同功異型物中之任一者，亦即4R2N（定義於SEQ ID NO: 1中）、4R1N（定義於SEQ ID NO: 2中）、4R0N（定義於SEQ ID NO: 3中）、3R2N（定義於SEQ ID NO: 4中）、3R1N（定義於SEQ ID NO: 5中）及3R0N（定義於SEQ ID NO: 6中），以及其基因變體。如上文先前技術章節中所闡述，多於40種突變已牽涉FTDP-17，所述FTDP-17為與認知障礙相關之家族性神經退化性疾病。然而，tau蛋白中之突變之位點不應限制於牽涉FTDP-17之彼等位點。引入至SEQ ID NO: 1至6之胺基酸序列中之胺基酸突變數目不應受限制，但可為1至50個、特定言之1至30個、更特定言之1至10個。然而，對應於定義於SEQ ID NO: 1之位置413處之絲胺酸殘基（Ser413）中之胺基酸序列之胺基酸殘基應較佳地為保守的。根據本發明之tau蛋白亦涵蓋根據BLAST方法（其中PBLAST之預設條件由NCBI提供），與定義於SEQ ID NO: 1中之人類tau蛋白之胺基酸序列具有80%或更多之相似性或一致性的蛋白質及其同功異型物。此類tau蛋白包含來源於非人類物種之tau，諸如黑猩猩、獼猴、馬、豬、狗、小鼠、兔及大鼠。出於改良靶標動物之認知功能之目的，有可能產生靶向來源於此類非人類動物之tau的治療性或預防性藥劑。

本文中所使用之術語「tau肽」意謂包含tau蛋白之胺基酸序列之一部分的肽。來源於tau蛋白之tau肽之胺基酸序列之位置及長度不應受限制，但應較佳地含有例如一連串至少三個連續胺基酸，特定言之至少五個連續胺基酸，更特定言之至少八個連續胺基酸，所述連續胺基酸來源於對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸編號410至421的胺基酸殘基，至少包含對應於Ser413的胺基酸。tau肽之長度亦不應受限制，但應較佳地具有四個或更多個，特定言之六個或更多個，更特定言之八個或更多個之胺基酸長度。

本文中所使用之術語「tau」意謂集合地tau蛋白或tau肽。

術語「抗pSer413 tau蛋白」意謂如本文中所描述、相比於結合在位置413處之絲胺酸處未磷酸化的tau蛋白而較佳地結合至在413位置處之絲胺酸處磷酸化的tau蛋白的抗體。Ser413處磷酸化之tau蛋白可為人類及/或鼠類的。

如本文中所使用，「位置」意謂蛋白質在序列中之位置。位置可依序進行編號，或根據所建立形式，例如抗體編號之EU索引來進行編號。

如本文中所使用，「殘基」意謂在蛋白質及其相關胺基酸身分中之位置。舉例而言，天冬醯胺297（亦被稱作Asn297或N297）為人抗體IgG1中之位置297處之殘基。

在本發明之上下文中，處於清楚起見，胺基酸殘基在tau蛋白或tau肽中之位置由胺基酸編號指示，所述胺基酸編號係基於定義於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列來鑑別。舉例而言，對應於SEQ ID NO: 1之Ser413之胺基酸殘基意謂SEQ ID NO: 1（4R2N）之位置413、SEQ ID NO: 2（4R1N）之位置384、SEQ ID NO: 3（4R0N）之位置355、SEQ ID NO: 4（3R2N）之位置382、SEQ ID NO: 5（3R1N）之位置353或SEQ ID NO: 6（3R0N）之位置324處的絲胺酸殘基。tau同功異型物之間的胺基酸殘基位置之對應性展示於下文表1中。表 1 ：人類tau蛋白之同功異型物

儘管表1展示對應於定義於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列之位置410至421之此等同功異型物之胺基酸殘基之位置，但其他區中的胺基酸殘基的位置的對應性可容易地基於例如圖1A及圖1B來識別。本領域中熟習此項技術者將能夠使用成對序列比對（諸如Needleman-Wunsch方法或Smith-Waterman方法）或多個序列比對（諸如ClustalW方法或PRRP方法）來測定同功異型物或同源物中之胺基酸之對應位置。作為對應位置之分析之一實例，圖1A及圖1B展示基於ClustalW，六種人類同功異型物（用一個字母代碼指示）之胺基酸序列之比對。此等圖指示，在六種同功異型物中，對應於定義於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列之Ser413之胺基酸殘基周圍之結構為保守的。

本發明之抗體一般為經分離或重組的。「經分離」在用於描述本文所揭示之各種多肽時，意謂已自表現多肽之細胞或細胞培養物鑑定及分離及/或回收之多肽。通常，經分離多肽將藉由至少一個純化步驟來製備。「經分離抗體」係指大體上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體。「重組」意謂使用重組核酸技術在外源宿主細胞中產生之抗體。

相對於蛋白質序列之「胺基酸序列一致性百分比（%）」定義為，在比對序列及引入間隙（視需要）以達成最大序列一致性百分比，且不考慮任何保守取代作為序列一致性之部分之後，與特異性（親本）序列中之胺基酸殘基相同的候選序列中的胺基酸殘基的百分比。出於判定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以本領域技術內之各種方式達成，例如使用公開可獲得之電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟體。本領域中熟習此項技術者可判定用於量測比對（包含用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法）之適當參數。一個特定程式為在美國公開案第20160244525號之段落[0279]至[0280]處概述之ALIGN-2程式，所述公開案以引用之方式併入本文中。對於核酸序列之另一近似比對藉由Smith及Waterman, 《應用數學之進展（Advances in Applied Mathematics ）》, 2:482-489 (1981)之局部同源性演算法來提供。此演算法可藉由使用由Dayhoff, 《蛋白質序列及結構之圖譜（Atlas of Protein Sequences and Structure ）》, M. O. Dayhoff編, 5增刊 3:353-358, 國家生物醫學研究基金會, 美國華盛頓特區開發及由Gribskov, 《核酸研究Nucl . Acids Res . 》 14(6):6745-6763 (1986)標準化之計分矩陣來應用於胺基酸序列。

測定序列之一致性百分比之此演算法之實施之實例藉由「BestFit」效用申請案中之《遺傳電腦小組（Genetics Computer Group）》（威斯康星州麥迪遜）來提供。對於此方法之預設參數描述於《威斯康星州序列分析套裝程式手冊（Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual）》第8版（1995）（獲自《遺傳電腦小組》，威斯康星州麥迪遜）中。在本發明之情況下建立一致性百分比之另一方法為使用愛丁堡大學版權所有、John F.Collins及Shane S.Sturrok研發且由IntelliGenetics, Inc.（加州山景城）發行之MPSRCH程式套裝。根據此套裝程式組，可採用Smith-Waterman演算法，其中對於計分表使用預設參數（例如，12之空隙開放罰分，一之空隙擴展罰分及六之空隙）。根據所產生資料，「匹配」值反映「序列一致性」。用於計算序列之間的一致性或相似性百分比之其他合適程式一般為本領域中已知，例如另一比對程式為與預設參數一起使用之BLAST。舉例而言，使用以下預設參數可使用BLASTN及BLASTP：基因密碼=標準物；過濾器=無；鏈=兩條；截止值=60；預期值=10；矩陣=BLOSUM62；描述=50個序列；排序法=HIGH SCORE；資料庫=非冗餘、GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR。可在位於http:// in front of blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi之網際網路位址處找到此等程式之詳情。

將本發明之胺基酸序列（「本發明序列」）與親本胺基酸序列之間的一致性程度計算為兩個序列之比對中之準確匹配數目，除以「本發明序列」之長度或親本序列之長度，無論哪個為最短的。結果以百分比一致性表示。

在一些實施例中，兩個或更多個胺基酸序列為至少50%、60%、70%、80%或90%一致。在一些實施例中，兩個或更多個胺基酸序列為至少95%、97%、98%、99%或甚至100%一致。

「特異性結合」或「特異性結合至」或「對」特定抗原或抗原決定基「具有特異性」意謂可量測地不同於非特異性相互作用之結合。特異性結合可例如藉由測定相比於對照分子之結合、分子之結合來量測，對照分子通常係不具有結合活性之具有類似結構的分子。舉例而言，可藉由與類似於靶標之對照分子之競爭來測定特異性結合。

如本文中所使用，術語「K_assoc 」或「K_a 」意指特定抗體-抗原相互作用之結合速率，然而如本文中所使用，術語「K_dis 」或「K_d 」意指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文中所使用，術語「K_D 」意指解離常數，其獲自K_d 與K_a 之比率（亦即K_d /K_a ）且以莫耳濃度（M）表示。抗體之K_D 值可使用本領域中充分確立之方法來測定。在一些實施例中，用於測定抗體之K_D 之方法為藉由使用表面電漿子共振，例如藉由使用生物感測器系統，諸如BIACORE®系統。在某些實施例中，用磷酸化Tau蛋白量測K_D 值。在一些實施例中，用磷酸化肽量測K_D 值。在一些實施例中，用固定抗原（例如磷酸化Tau蛋白或磷酸化肽）量測K_D 值。在其他實施例中，用固定抗體（例如親本小鼠抗體、嵌合抗體或人類化抗體變體）量測K_D 值。在又其他實施例中，用作為分析物之磷酸化Tau蛋白量測K_D 值。在另其他具體實例中，用作為分析物之磷酸化肽量測KD值。在某些實施例中，量測呈二價結合模式之KD值。在其他實施例中，量測呈單價結合模式之KD值。

「疾病」包含動物（包含人類）之健康狀態，其中動物不能維持體內平衡，且其中若不改善疾病，則動物健康繼續惡化。

相比之下，動物（包含人類）之「病症」包含其中動物能夠維持體內平衡之健康狀態，但其中動物之健康狀態不比其在病症不存在的情況下有利。留置未處理，病症並不一定造成動物之健康狀態進一步降低。

術語「治療（treatment/treating/treat」及其類似術語係指獲得所需的藥理學及/或生理學效果。所述效果就完全或部分預防疾病或其症狀或降低疾病或其症狀之可能性而言可為預防性的，及/或就部分或完成治癒疾病及/或可歸因於疾病之不良影響而言可為治療性的。如本文中所使用，「治療」涵蓋哺乳動物，特定言之人類之疾病之任何治療，且包含：（a）預防可能易患疾病但尚未診斷為患有其之個體發生所述疾病；（b）抑制疾病，亦即遏制其發展或進展；及（c）緩解疾病，亦即引起疾病消退及/或緩解一或多個疾病症狀。「治療」亦意欲涵蓋遞送藥劑以便獲得藥理學效果，甚至無疾病或病狀。舉例而言，「治療」涵蓋遞送可引起免疫反應或在不存在疾病之情況下，例如在疫苗之情況下賦予免疫性的組合物。

如本文中所使用，術語「哺乳動物」係指任何哺乳動物，包含（但不限於）嚙齒目之哺乳動物（諸如小鼠及倉鼠）及兔形目之哺乳動物（諸如兔）。在一些實施例中，哺乳動物來自食肉目，包含貓科動物（貓）及犬科動物（狗）。在一些實施例中，哺乳動物來自偶蹄目，包含牛科動物（牛）及豬科動物（豬）；或奇蹄目，包含馬科動物（馬）。最佳地，哺乳動物為靈長目、猴目（Ceboids /Simoids ）（猴）或類人猿目（人類及猿）。在一些實施例中，哺乳動物為人類。

如本文中所使用，術語「消退」以及源於其之字組不一定暗示100%或完全消退。實際上，存在不同程度之消退，本領域中一般技術者認可所述程度之消退具有潛在益處或治療效果。就此而言，所揭示之方法可在哺乳動物中提供任何量之tau蛋白病之任何消退水準。此外，由本發明方法獲得之消退可包含疾病（例如tau蛋白病）之一或多個病狀或症狀之消退。亦出於本文之目的，「消退」可涵蓋延緩疾病發作、延緩症狀發作及/或延緩其病狀發作。對於進展性疾病及病症而言，「消退」可涵蓋減緩疾病或病症之進展、減緩疾病或病症之症狀之進展及/或減緩其病狀之進展。

「有效量」或「治療有效量」之組合物包含足以為向其投與組合物之個體提供有益效果的組合物量。「有效量」之遞送媒介物包含足以有效地結合或遞送組合物之量。

「個人（individual）」或「宿主（host）」或「個體（subject）」或「患者（patient）」意謂需要診斷、治療或療法之任何哺乳動物個體，特定言之人類。其他個體可包含牛、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等。

如本文所使用，術語「與...組合」係指用於例如以下情況下：在投與第二療法之整個時程期間投與第一療法；與投與第二療法重疊一段時間投與第一療法，例如在投與第二療法之前開始投與第一療法且在結束投與第二療法之前結束投與第一療法；在投與第一療法之前開始投與第二療法且在結束投與第一療法之前結束投與第二療法；在開始投與第二療法之前開始投與第一療法且在結束投與第一療法之前結束投與第二療法；在開始投與第一療法之前開始投與第二療法且在結束投與第二療法之前結束投與第一療法。因此，「與…組合」亦可係指涉及投與兩個或更多個療法之方案。如本文所使用，「與...組合」亦係指投與兩個或更多個療法，所述兩個或更多個療法可藉由相同或不同途徑、在相同或不同調配物中及呈相同或不同劑型投與。

「編碼」包含諸如基因、cDNA或mRNA之聚核苷酸中之核苷酸之特異性序列在生物過程中充當合成其他聚合物及大分子之模板的固有特性，所述聚合物及大分子具有已確定之核苷酸序列（亦即，rRNA、tRNA及mRNA）或已確定之胺基酸序列及由其獲得之生物特性。因此，若例如對應於基因之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則所述基因編碼蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中之編碼鏈與用作基因或cDNA轉錄之模板之非編碼鏈兩者均可稱為編碼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。

術語「核酸」包含呈任何形式之具有多於一個核苷酸之RNA或DNA分子，包含單鏈、雙鏈、寡核苷酸或聚核苷酸。術語「核苷酸序列」包含呈單鏈核酸形式之寡核苷酸或聚核苷酸中之核苷酸之次序。

「核酸構築體」，其意謂已經構築成包括未在自然界中發現在一起之一或多個功能單元的核酸序列。實例包含環形、線性、雙鏈、染色體外的DNA分子（質體）、黏質體（含有來自λ噬菌體之COS序列之質體）、包含非天然核酸序列之病毒基因組，及其類似物。

如本文所使用，術語「可操作地連接」包含與第二聚核苷酸呈功能性關係之聚核苷酸所述第二聚核苷酸例如包括以下之單鏈或雙鏈核酸部分：在核酸部分內以使得兩個聚核苷酸中之至少一個能夠藉由另一者發揮其表徵之生理學效果的方式排列的兩個聚核苷酸。藉助於實例，可操作地連接於基因編碼區之啟動子能夠促進編碼區之轉錄。在指示可操作地連接時指定之次序不係重要的。舉例而言，片語「啟動子可操作地連接於核苷酸序列」及「核苷酸序列可操作地連接於啟動子」在本文中互換地使用且認為為等效的。在一些情況下，當編碼所需蛋白質之核酸進一步包含啟動子/調節序列時，啟動子/調節序列位於所需蛋白質編碼序列之5'端，以使得其驅動在細胞中表現所需蛋白質。

在本文中互換地使用之術語「寡核苷酸」、「聚核苷酸」及「核酸分子」係指任何長度之核苷酸（核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸）之聚合形式。因此，此術語包含（但不限於）包括嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、經化學或生物化學修飾、非天然或衍生之核苷酸鹼基的單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體或聚合物。聚核苷酸之主鏈可包括糖及磷酸酯基團（如通常可於RNA或DNA中發現），或經修飾或取代之糖或磷酸酯基團。

如應用於聚核苷酸之術語「重組」意謂，聚核苷酸為產生相異及/或不同於在自然界中發現之聚核苷酸之構築體之各種選殖、限制性酶切或接合步驟及其他步驟之組合的產物。所述術語分別包含原始聚核苷酸構築體及原始病毒構築體之子代的複製品。

如本文所使用，術語「啟動子」包含可操作地連接於待轉錄之核酸序列（諸如編碼所需分子之核酸序列）之DNA序列。啟動子一般位於待轉錄核酸序列上游，且提供由RNA聚合酶及其他轉錄因子特異性結合之位點。

「載體」能夠將基因序列轉移至靶細胞。通常，「載體構築體」、「表現載體」及「基因轉移載體」意謂能夠引導相關基因之表現且可將基因序列轉移至靶細胞之任何核酸構築體，所述將基因序列轉移至靶細胞可藉由基因組整合載體之全部或一部分或短暫或可遺傳的維持載體作為染色體外的元件來實現。因此，術語包含選殖及表現媒介以及整合載體。

如本文所使用，術語「調節元件」包含控制核酸序列之表現之一些態樣之核苷酸序列。調節元件之實例說明性地包含增強子、內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）、內含子、複製起點、聚腺苷酸化信號（polyadenylation signal，pA）、啟動子、增強子、轉錄終止序列及上游調節域，所述元件有助於核酸序列之複製、轉錄及/或轉錄後加工。在各情況下，調節元件亦可包含順式調節DNA元件以及轉位元件（transposable element，TE）。本領域中一般熟習此項技術者能夠僅利用常規實驗來在表現構築體中選擇及使用此等及其他調節元件。可使用基因重組方法或合成地使用熟知方法來產生表現構築體。

「控制元件」或「控制序列」為涉及有助於聚核苷酸之功能性調節之分子相互作用之核苷酸序列，所述分子相互作用包含聚核苷酸之複製、重複、轉錄、剪接、轉譯或降解。調節可影響方法之頻率、速度或特異性，且可在自然界中增強或抑制。本領域中已知之對照元件包含例如轉錄調節序列，諸如啟動子及增強子。啟動子為在某些條件下能夠結合RNA聚合酶且起始通常位於啟動子下游（在3'方向）之編碼區之轉錄的DNA區。

本文中所使用之語句胺基酸殘基經「磷酸化」意謂，磷酸酯基團為連接至胺基酸殘基側鏈之酯。可進行磷酸化之典型胺基酸殘基包含絲胺酸（Ser）、蘇胺酸（Thr）及酪胺酸（Tyr）。 VIII. 抗體

本發明係針對結合已在位置413處磷酸化之人類tau蛋白之抗體及抗原結合片段。

傳統抗體結構單元通常包括四聚體。各四聚體通常由相同的兩對多肽鏈組成，各對具有一條「輕」鏈（通常具有約25 kDa之分子量）及一條「重」鏈（通常具有約50-70 kDa之分子量）。將人類輕鏈分類為κ及λ輕鏈。本發明係針對一般基於IgG類別，具有包含（但不限於）IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之若干子類之抗體。一般而言，比IgG3更頻繁地使用IgG1、IgG2及IgG4。應注意，IgG1在356（D或E）及358（L或M）處具有不同的多態性異型。本文中描繪之序列使用356D/358L異型，而其他異型包括在本文中。亦即，包括在本文中之包括IgG1 Fc結構域之任何序列可具有置換356D/358L異型之356E/358M。

本領域中之彼等者應瞭解，CDR之準確編號及位置在不同編號系統中可能係不同的。然而，應理解，可變重鏈及/或可變輕鏈序列之揭示內容包含相關（固有）CDR之揭示內容。因此，各可變重鏈區之揭示內容為vhCDR（例如vhCDR1、vhCDR2及vhCDR3）之揭示內容，且各可變輕鏈區之揭示內容為vlCDR（例如vlCDR1、vlCDR2及vlCDR3）之揭示內容。

用於鑑別抗體之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之每一者之序列之方法包含：Kabat方法（Kabat等人, 《免疫學雜誌（The Journal of Immunology）》, 1991, 第147卷, 第5期, 第1709-1719頁）及Chothia方法（Al-Lazikani等人, 《分子生物學雜誌（Journal of Molecular Biology）》, 1997, 第273卷, 第4期, 第927-948頁）。此等方法係在本領域中熟習此項技術者之技術常識內，其概述例如可在Andrew C.R.博士Martin小組之網站（http://www.bioinf.org.uk/abs/）上獲得。

CDR編號之適用比較如下，參見Lafranc等人, 《比較免疫學發展（Dev. Comp. Immunol.）》 27(1):55-77 (2003)：表 1

在整個本說明書中，當涉及可變域中之殘基（大致輕鏈可變區之殘基1-107及重鏈可變區之殘基1-113）時一般使用Kabat編號系統，且對於諸如Fc區之恆定區使用EU編號系統（例如Kabat等人，見上文（1991））。

本發明提供多種不同CDR組。在此情況下，「全CDR組」包括三個可變輕鏈及三個可變重鏈CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2及vhCDR3。此等可分別為較大可變輕鏈或可變重鏈域之部分。另外，如在本文中更充分概述，當使用重鏈及輕鏈（例如當使用Fab時）時，可變重鏈及可變輕鏈域可在獨立多肽鏈上，或在scFv序列之情況下，在單一多肽鏈上。

CDR促進形成抗體之抗原結合，或更特定言之，抗原決定基結合位點。「抗原決定基」係指與稱為互補位之抗體分子之可變區中之特異性抗原結合位點相互作用之決定子。抗原決定基為諸如胺基酸或糖側鏈之分子分組且通常具有特定結構特徵以及荷質比特徵。單一抗原可具有多於一個的抗原決定基。

在本發明之情況下，抗原決定基不僅包括直接涉及結合本發明之抗體之胺基酸殘基且亦包括在Ser413處磷酸化之胺基酸殘基。

各鏈之羧基端部分界定主要負責效應功能之恆定區。Kabat等人收集重鏈及輕鏈之可變區之許多一級序列。基於序列之保守度，其將個別一級序列分類為CDR及構架且製作其清單（參見《相關免疫之序列（SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST）》, 第5版, NIH公開案, 第 91-3242號, E.A. Kabat等人，其以引用之方式完全併入）。

在免疫球蛋白之IgG子類中，重鏈存在若干免疫球蛋白域。本文中之「免疫球蛋白（Ig）域」意謂具有獨特三級結構之免疫球蛋白區。本發明中所關注的為重鏈域，包含恆定重鏈（CH）域及鉸鏈域。在IgG抗體之情況下，IgG同型各自具有三個CH區。因此，在IgG之情況下，「CH」域如下：「CH1」係指根據如Kabat中之EU索引的位置118-220。「CH2」係指根據如Kabat中之EU索引的位置237-340，且「CH3」係指根據如Kabat中之EU索引的位置341-447。

重鏈之另一類型之Ig域為鉸鏈區。本文中之「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「抗體鉸鏈區」或「免疫球蛋白鉸鏈區」意謂包括抗體之第一及第二恆定結構域之間的胺基酸的可撓性多肽。在結構上，IgG CH1結構域在EU位置220處結束，且IgG CH2結構域在殘基EU位置237處開始。因此，對於IgG，抗體鉸鏈在本文中界定為包含位置221（IgG1中之D221）至236（IgG1中之G236），其中編號係根據如Kabat中之EU索引。在一些實施例中，例如在Fc區之情況下，包括下部鉸鏈，其中「下部鉸鏈」一般係指位置226或230。如本文提及，亦可在鉸鏈區中製備π（pI）變體。

輕鏈一般包括兩個域：可變輕鏈域（含有輕鏈CDR，且與可變重鏈域一起形成Fv區）；及恆定輕鏈區（通常被稱作CL或Cκ）。

下文概述之對於額外取代之所關注之另一區為Fc區。

因此，本發明提供不同抗體域。如本文中所描述及本領域中已知，本發明之抗體包括重鏈及輕鏈內、亦可重疊之不同域。此等域包含（但不限於）Fc域、CH1域、CH2域、CH3域、鉸鏈域、重鏈恆定域（CH1-鉸鏈-Fc域或CH1-鉸鏈-CH2-CH3）、可變重鏈域、可變輕鏈域、輕鏈恆定域、Fab域及scFv域。

因此，「Fc域」包含-CH2-CH3域及視情況存在之鉸鏈域。重鏈包括可變重鏈域及恆定域，所述恆定域包含CH1-鉸鏈-Fc域，所述Fc域包括CH2-CH3。輕鏈包括可變輕鏈域及輕鏈恆定域。scFv包括可變重鏈域、scFv連接子及可變輕鏈域。本發明之一些實施例包括至少一個scFv域，當不為天然存在的時，其一般包含由scFv連接子連接在一起之可變重鏈域及可變輕鏈域。如本文中所概述，儘管scFv域一般自N端至C端取向為vh-scFv連接子-vl，但對於scFv域（或使用來自Fab之vh及vl序列構築之彼等域）中之任一者可逆轉此取向為vl-scFv連接子-vh。

如本文中所展示，存在可使用之多種適合scFv連接子，包含藉由重組技術產生之傳統肽鍵。連接肽可主要包含以下胺基酸殘基：Gly、Ser、Ala或Thr。連接肽之長度應適合於以使兩個分子相對於彼此採用正確構形使得其保持所需活性之方式連接所述兩個分子。在一個實施例中，連接子之長度為約1至50個胺基酸，較佳之長度約1至30個胺基酸。在一個實施例中，可使用長度為1至20個胺基酸之連接子，在一些實施例中，可使用約5至約10個胺基酸長度。適用連接子包含甘胺酸-絲胺酸聚合物，包含例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n及(GGGS)n，其中n為至少一之整數（及一般3至4）；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及其他可撓性連接子。或者，各種非蛋白質聚合物，包含（但不限於）聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物，可用作連接子，亦即可用作連接子。

其他連接子序列可包含任何長度之CL/CH1域但並非所有CL/CH1域之殘基之任何序列，例如CL/CH1域之首個5-12胺基酸殘基。連接子可來源於免疫球蛋白輕鏈，例如Cκ或Cλ。連接子可來源於任何同型之免疫球蛋白重鏈，包含例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε及Cμ。連接子序列亦可來源於其他蛋白質，諸如Ig樣蛋白質（例如TCR、FcR、KIR）、鉸鏈區衍生之序列及來自其他蛋白質之其他天然序列。

在一些實施例中，連接子為「域連接子」，用於將如本文中所概述之任何兩個域連接在一起。儘管可使用任何合適的連接子，但許多實施例利用甘胺酸-絲胺酸聚合物，包含例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n及(GGGS)n，其中正為至少一之整數（且一般為3至4至5）；以及允許重組連接具有足以允許各域保持其生物功能之長度及可撓性之兩個域的任何肽序列。 A.嵌合及人類化抗體

在一些實施例中，本文中之抗體可來源於來自不同物種之混合物，例如嵌合抗體及/或人類化抗體。一般而言，「嵌合抗體」及「人類化抗體」係指組合來自多於一種物種之區的抗體。舉例而言，「嵌合抗體」傳統上包括來自小鼠（或在一些情況下，大鼠）之可變區及來自人類之恆定區。「人類化抗體」一般係指已用人類抗體中發現之序列交換可變域構架區的非人類抗體。一般而言，在人類化抗體中，除CDR之外的整個抗體由人類來源之聚核苷酸編碼，或除在其CDR內之外，與此類抗體一致。將一些或全部由來源於非人類生物體之核酸編碼之CDR移植至人類抗體可變區之β摺疊構架中以形成抗體，其特異性由移植之CDR決定。此類抗體之形成描述於例如WO 92/11018；Jones, 1986, 《自然（Nature）》 321:522-525；Verhoeyen等人, 1988, 《科學（Science）》 239:1534-1536中，其所有均以全文引用的方式併入。常常需要使所選受體構架殘基「回復突變」成對應供體殘基以恢復初始移植構築體中損失之親和性（US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213，其所有均以全文引用的方式併入）。人類化抗體最佳亦應包括免疫球蛋白恆定區之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之免疫球蛋白恆定區，且因此應通常包含人類Fc區。人類化抗體亦可使用具有經工程改造之免疫系統的小鼠來產生。Roque等人, 2004, 《生物技術學刊（Biotechnol. Prog.）》 20:639-654，以引用的方式完全併入。使非人類抗體人類化及重塑之多種技術及方法為本領域中所熟知（參見Tsurushita及Vasquez, 2004, 《單株抗體之人類化，B細胞之分子生物學（Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells）》, 533-545, Elsevier Science（美國）及其中所引用之參考文獻，其所有均以全文引用的方式併入）。人類化方法包含（但不限於）描述於以下中之方法：Jones等人, 1986, 《自然》 321:522-525；Riechmann等人,1988; 《自然》 332:323-329；Verhoeyen等人, 1988, 《科學》, 239:1534-1536；Queen等人, 1989, 《美國國家科學院院報》 86:10029-33；He等人, 1998, 《免疫學雜誌（J. Immunol.）》 160: 1029-1035；Carter等人, 1992, 《美國國家科學院院報》 89:4285-9；Presta等人, 1997, 《癌症研究（Cancer Res.）》 57(20):4593-9；Gorman等人, 1991, 《美國國家科學院院報》 88:4181-4185；O'Connor等人, 1998, 《蛋白質工程改造（Protein Eng）》 11:321-8，其所有均以全文引用之方式併入。人類化或降低非人類抗體可變區免疫原性之其他方法可包括表面再塑方法，如例如Roguska等人, 1994, 《美國國家科學院院報》 91:969-973中所描述，其以全文引用之方式併入。

在某些實施例中，本發明之抗體包括來自特定生殖系重鏈免疫球蛋白基因之重鏈可變區及/或來自特定生殖系輕鏈免疫球蛋白基因之輕鏈可變區。舉例而言，此類抗體可包括含重鏈或輕鏈可變區之人類抗體或由其組成，所述重鏈或輕鏈可變區為特定生殖系序列之「產物」或「來源於」特定生殖系序列。為人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可藉由將人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列進行比較且選擇在序列上（亦即最大%一致性）最接近人類抗體序列之人類生殖系免疫球蛋白序列來如此識別。相比於生殖系序列，為特定人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」特定人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可含有胺基酸差異，其歸因於例如天然存在之體細胞突變或定點突變之有意引入。然而，人類化抗體通常在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少80%一致，且含有當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列（例如鼠類生殖系序列）相比時鑑別人類抗體為來源於人類序列的胺基酸殘基。在某些情況下，人類化抗體與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列在胺基酸序列上可為至少95%、96%、97%、98%或99%，或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，來源於特定人類生殖系序列之人類化抗體將顯示與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過10-20個胺基酸差異。在某些情況下，人類化抗體可顯示與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。

在一個實施例中，親本抗體如本領域中已知已為親和性成熟的。可採用基於結構之方法用於人類化及親和性成熟，如例如美國專利第7,657,380號中所描述。可採用基於選擇之方法以使抗體可變區人類化及/或親和性成熟，包含（但不限於）描述於以下中之方法：Wu等人, 1999, 《分子生物學雜誌（J. Mol. Biol.）》 294:151-162；Baca等人, 1997, 《生物化學雜誌（J. Biol. Chem.）》 272(16):10678-10684；Rosok等人, 1996, 《生物化學雜誌》 271(37): 22611-22618；Rader等人, 1998, 美國國家科學院院報》 95: 8910-8915；Krauss等人, 2003, 《蛋白質工程改造（Protein Engineering）》 16(10):753-759，其所有均以全文引用的方式併入。其他人類化方法可涉及移植僅部分CDR，包含（但不限於）描述於以下中之方法：Tan等人, 2002, 《免疫學雜誌（J. Immunol.）》 169:1119-1125；De Pascalis等人, 2002, 免疫學雜誌》 169:3076-3084，其所有均以全文引用的方式併入。

術語「抗體」以最廣義地使用，且包含例如完整免疫球蛋白或抗原結合部分。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解來產生。因此，術語抗體包含兩條重鏈與兩條輕鏈之傳統四聚抗體，以及抗原結合片段，諸如Fv、Fab及scFv。在一些情況下，本發明提供包含如本文中所概述之至少一個抗原結合域之雙特異性抗體。

根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體應較佳地呈現經改良血漿動力學。本文中之人類化抗體之血漿動力學之改良意謂，相比於對應於人類化抗體之非人類化抗體，表示人類化抗體在血漿中之動力學之參數經更改。表示血漿動力學之參數之實例包含：血漿半衰期、血漿中之平均滯留時間及血漿清除。經「更改」之此類參數意謂參數增加或減少。「對應」於人類化抗體之非人類化抗體意謂用作生產人類化抗體之基礎之非人類化抗體，例如小鼠抗體或嵌合抗體。

術語「嵌合抗體」係指一種含有一或多個來自一個抗體之區及一或多個來自一或多個其他抗體之區的抗體。「CDR移植抗體」為包括一或多個來源於特定物種或同型之抗體之CDR及相同或不同物種或同型之另一抗體之構架的抗體。 IX. 組合物

本發明提供以「抗原-抗體反應」結合至在Ser413處磷酸化（pSer413）之人類tau蛋白之多種不同抗原結合域（一般併入至抗體中）。

藉由抗體針對磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽之親和性，亦即平衡解離常數（K_D ），來量測「抗原-抗體反應」。在某些實施例中，用磷酸化Tau蛋白量測K_D 值。在一些實施例中，用磷酸化Tau肽量測K_D 值。在一個實施例中，磷酸化Tau肽僅在一個殘基處磷酸化（例如SEQ ID NO: 75）。在另一實施例中，磷酸化肽在多個殘基處磷酸化（例如SEQ ID NO: 76或SEQ ID NO: 78）。在一些實施例中，用固定抗原（例如磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽）量測K_D 值，在此情況下，親和性量測包含亦即呈二價結合模式之親合力分量。在其他實施例中，用固定抗體（例如小鼠親本抗體、嵌合抗體或人類化抗體變體）量測K_D 值，在此情況下，親和性量測並不包含亦即呈單價結合模式之親合力分量。在又其他實施例中，用固定抗體及用作為分析物之磷酸化Tau蛋白量測K_D 值。在另其他具體實例中，用固定抗體及用作為分析物之磷酸化肽量測K_D 值。在某些實施例中，量測呈二價結合模式之K_D 值。在其他實施例中，量測呈單價結合模式之K_D 值。

因此，在某些實施例中，K_D 值為5 × 10^- ⁸ M或更低；在一些實施例中，K_D 值為5 × 10^- ⁹ M或更低；在其他實施例中，K_D 值為5 × 10^- ¹⁰ M或更低；在又其他實施例中，K_D 值為1.86 × 10^- ⁸ M或更低；在另其他具體實例中，K_D 值為2 × 10^- ⁹ M或更低；在其他實施例中，K_D 值為2×10^- ¹⁰ M或更低。在一特定實施例中，本文所揭示之抗體以5 × 10^- ⁸ M或更低之K_D 結合至磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽，用固定抗體及磷酸化tau蛋白或磷酸化tau肽作為分析物所量測。在另一特定實施例中，本文所揭示之抗體以5 × 10^- ⁹ M或更低之K_D 結合至磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽，用固定磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽及抗體作為分析物所量測。在又一特定實施例中，本文所揭示之抗體以2 × 10^- ⁹ M或更低之K_D 結合至磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽，用固定磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽及抗體作為分析物所量測。在又一特定實施例中，本文所揭示之抗體以5 × 10^- ¹⁰ M或更低之K_D 結合至磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽，用固定磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽及抗體作為分析物所量測。在另一特定實施例中，本文所揭示之抗體以2 × 10^- ¹⁰ M或更低之K_D 結合至磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽，用固定磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽及抗體作為分析物所量測。

另外，如本文中所概述，本發明之抗體較佳地優於不在位置處413含有磷酸酯之蛋白質或肽而結合至在位置S413處磷酸化的tau肽或蛋白質。

根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體為可引起與根據本發明之磷酸化tau蛋白或磷酸化tau肽之抗原-抗體反應的抗體。

可與根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體引起抗原-抗體反應之磷酸化tau蛋白及tau肽為在特異性地在神經退化性疾病（諸如AD）中磷酸化之胺基酸殘基處磷酸化的彼等。特定言之，此類tau蛋白及tau肽至少在定義於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列之位置413處之絲胺酸殘基（Ser413）處磷酸化，以及可在對應於胺基酸編號410至421之胺基酸殘基中之一或多者處磷酸化，亦即對應於定義於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列之位置412處的絲胺酸殘基（Ser412）、位置414處的蘇胺酸殘基（Thr414）及位置416處的絲胺酸殘基（Ser416）的胺基酸殘基中的一或多者。典型的此類磷酸化肽包含（但不限於）：pSer412/pSer413(Cys-)，其具有定義於SEQ ID NO: 7中之胺基酸序列；pSer413(Cys-)，其具有定義於SEQ ID NO: 8中之胺基酸序列；及pSer409/pSer412/pSer413(Cys-)，其具有定義於SEQ ID NO: 9中之胺基酸序列。

根據本發明之磷酸化tau肽可用於生產根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體中，或用作用於研究反應性之抗原。

根據本發明之磷酸化tau肽可由本領域中熟習此項技術者藉由使用適當合成方法或基因工程改造方法來產生。用於經由合成來生產磷酸化肽之方法之實例包含Boc方法（Wakamiya T., 《化學快報（Chemistry Letters）》, 第22卷, 第1401頁, 1993）、Fmoc方法（Perich, J. W., 《國際肽及蛋白質研究雜誌（International Journal of Peptide and Protein Research）》, 第40卷, 第134-140頁, 1992），及JP3587390B以及WO2013/180238，但本領域中熟習此項技術者可視需要採用任何其他方法。用於經由基因工程改造來生產磷酸化肽之方法之實例包含以下之方法：其中製備具有編碼待生產之肽或其前體之核酸序列之遺傳物質（DNA或RNA），且之後視情況存在之諸如引入至表現載體中及添加啟動子序列、引入至用於表現之適合宿主中之步驟，或經受無細胞蛋白質合成系統。在此情況下，藉由藉助於酶（諸如激酶）在宿主中引起磷酸化反應，或藉由自宿主回收靶肽且接著使用酶（諸如激酶）引起磷酸化反應，肽可在所需位點處磷酸化，所述酶可為宿主固有的或經由基因工程改造引起表現。在後者情況下，可藉由活體外使靶肽經受已知在tau之磷酸化反應中起作用之酶來引起磷酸化反應，所述酶諸如肝糖合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）或細胞週期素依賴性蛋白激酶5（cyclin-dependent protein kinase 5，CDK5）。自根據以上方法在宿主中或活體外磷酸化之肽當中，可藉由例如經由抗體-抗原反應選擇特異性地結合至上文提及之抗磷酸化tau抗體之一者來回收在所需胺基酸殘基處磷酸化的肽。

根據本發明之磷酸化tau肽可在其N端序列及/或C端序列處經具有適合於所需目的之其他功能之物質修飾。舉例而言，根據本發明之磷酸化tau肽可在其N端及/或C端處添加例如甲硫胺酸殘基、乙醯基或焦麩胺酸，或在其N端及/或C端處經例如螢光材料修飾。或者，根據本發明之磷酸化tau肽之N端及/或C端可經例如肽或蛋白質修飾。可用於此類修飾之肽之實例包含適合標籤序列（通常組胺酸標籤或旗標標籤）；具有可由T細胞受體（T-cell receptor，TCR）或主要組織相容複合體（major histocompatibility complex，MHC）識別之胺基酸序列的肽；來源於具有來源於此類蛋白質之序列之病毒或細菌或肽的蛋白質。另外，根據本發明之磷酸化tau肽包含具有除N端及C端殘基以外之胺基酸殘基經任何其他化合物或肽修飾之至少一個的一者。本領域中熟習此項技術者應能夠使用任何已知方法來對磷酸化tau肽進行此類修飾，所述方法諸如描述於Hermanson等人, 「生物結合技術（Bioconjugate Techniques）」, (美國), Academic Press, 1996中之方法。

本領域中熟習此項技術者應能夠藉由在固相或液相系統中選擇適當結合分析來進行抗原-抗體反應之量測。此類分析之實例包含（但不限於）：酶聯免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、酶免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）、表面電漿子共振（surface plasmon resonance，SPR）、螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）及發光共振能量轉移（luminescence resonance energy transfer，LRET）。可藉由例如用例如酶、螢光材料、發光材料或放射性同位素標記抗體及/或抗原，及使用適合於量測所使用標記之物理及/或化學特性特徵之方法偵測抗原-抗體反應，來進行抗原-抗體結合親和性之量測。

根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體應較佳地針對磷酸化tau蛋白或tau肽具有優於其針對非磷酸化tau蛋白或tau肽之結合親和性的經改良選擇結合親和性。在此上下文中，抗體針對磷酸化tau蛋白或tau肽之選擇結合親和性之改良意謂，抗體針對磷酸化tau蛋白或tau肽之結合親和性與其針對對應非磷酸化tau蛋白或tau肽之結合親和性的比率增加。可藉由例如使用在其上磷酸化tau蛋白或tau肽已經固定之盤及在其上對應非磷酸化tau蛋白或tau肽已經固定之盤，藉助於例如ELISA（例如呈發射波長之吸光度OD值）量測抗體針對此等蛋白質或肽中之每一者的結合親和性，且針對磷酸化tau蛋白或tau肽獲得的結合親和性（例如吸光度OD值）值除以針對對應非磷酸化tau蛋白或tau肽獲得的值，來分析此類選擇結合親和性。對於ELISA之特定條件可為描述於以下實例章節中之彼等條件。

根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體應較佳地具有至少約40或更多，特定言之至少約50或更多，更特定言之至少約60或更多之針對磷酸化tau蛋白或tau肽的選擇結合親和性與針對非磷酸化tau蛋白或tau肽的結合親和性的比率，其限制條件為選擇結合親和性係根據下文實施例2中所描述的方法獲得。在一個實施例中，藉由比較抗pSer413 tau抗體針對諸如SEQ ID NO: 8之磷酸化肽的結合親和性與針對SEQ ID NO: 69之非磷酸化肽的結合親和性來計算比率。

當投與至血液中時，根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體應較佳地呈現進入大腦之經改良能力。當投與至血液中時，在此上下文中，抗體進入大腦之能力之改良意謂，當將抗體投與至人類或任何其他哺乳動物（例如小鼠或大鼠）之血液中時，大腦中之抗體濃度與血漿中之抗體濃度的比率增加。可例如藉由經由血液將抗體投與至動物（例如小鼠或大鼠），及在預定時間（例如一週）之後，收集血液且製備大腦勻漿，使用已知方法（例如使用抗-人類多株抗體之夾心ELISA）量測所獲得血漿樣本及所獲得大腦勻漿樣本中之每一者之抗體濃度，且大腦中之抗體濃度除以血漿中之抗體濃度，來分析抗體進入大腦的能力。對於ELISA之特定條件可為描述於以下實例章節中之彼等條件。已知抗體進入大腦之濃度一般為約血漿中之濃度的0.1%至0.3%。

根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體應較佳地具有0.30%或更多，特定言之0.35%或更多，更特定言之0.40%或更多，甚至更特定言之0.45%或更多之大腦中之抗體濃度與血漿中之抗體濃度的比率，其限制條件為所述比率係根據以下實例章節的「[7]實例7：腦內電子遷移之分析（[7] Example 7: Analysis of intracerebral migration）」中所描述的方法獲得。 A.本發明之抗原結合域

本發明提供如本文中所描述之較佳地優於結合至不在Ser413處磷酸化之tau蛋白而結合至人類pSer413 tau蛋白的抗原結合域。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 91之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 92之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 93之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 94之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 95之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 96之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 97之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 98之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 99之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 100之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 101之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

在一個實施例中，本發明提供抗原結合域，包括具有SEQ ID NO: 102之vlCDR1、具有SEQ ID NO: 82之vlCDR2、具有SEQ ID NO: 83之vlCDR3、具有SEQ ID NO: 86之vhCDR1、具有SEQ ID NO: 115之vhCDR2及具有SEQ ID NO: 88之vhCDR3。

本發明提供針對人類pSer413 tau蛋白之抗原結合域。如實例中所展示，提供可以任何組合而組合之多種人類化可變重鏈域及可變輕鏈域，且可以任何組合添加至人類IgG恆定域。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46（SEQ ID NO: 84）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合，形成結合pSer413 tau之Fv域。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46（SEQ ID NO: 84）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL47（SEQ ID NO: 104）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL47（SEQ ID NO: 104）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_G34A（SEQ ID NO: 105）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_G34A（SEQ ID NO: 105）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_G34S（SEQ ID NO: 106）與可變重鏈域Ta1505-VH11（（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_G34S（SEQ ID NO: 106）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_G34T（SEQ ID NO: 107）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_G34T（SEQ ID NO: 107）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33Q（SEQ ID NO: 108）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33Q（SEQ ID NO: 108）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33Q_G34A（SEQ ID NO: 109）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33Q_G34A（SEQ ID NO: 109）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33D（SEQ ID NO: 110）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33D（SEQ ID NO: 110）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33S（SEQ ID NO: 111）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33S（SEQ ID NO: 111）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33T（SEQ ID NO: 112）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_N33T（SEQ ID NO: 112）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_S28N（SEQ ID NO: 113）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_S28N（SEQ ID NO: 113）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_G34A_S28N（SEQ ID NO: 114）與可變重鏈域Ta1505-VH11（SEQ ID NO: 116）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

在一個實施例中，可變輕鏈域Ta1505-VL46_G34A_S28N（SEQ ID NO: 114）與可變重鏈域Ta1505-VH65（SEQ ID NO: 117）組合。在此實施例中，人類重鏈恆定域選自SEQ ID NO: 118、119、120、121、122、123、124、125及126以及人類輕鏈κ恆定域SEQ ID NO: 52。

根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體應亦較佳地具有具如下文特定提及之特定胺基酸序列之重鏈可變區及輕鏈可變區。

作為重鏈可變區，本發明之抗體應較佳地包含與選自以下之序列具有80%或更多，特定言之85%或更多，更特定言之90%或更多，甚至更特定言之95%或更多，再甚至更特定言之100%一致性的胺基酸序列：序列VH11（定義於SEQ ID NO: 18中）、序列VH12（定義於SEQ ID NO: 20中）、序列VH47（定義於SEQ ID NO: 22中）、序列VH61（定義於SEQ ID NO: 24中）、序列VH62（定義於SEQ ID NO: 26中）、序列VH64（定義於SEQ ID NO: 28中）及序列VH65（定義於SEQ ID NO: 30中）。在一個實施例中，作為重鏈可變區，本發明之抗體可包含序列VH65之胺基酸序列、或來源於經選自由以下組成之群之一或多個取代之序列VH65的胺基酸序列：位置28（Kabat編號：H28）處之Ala經Thr取代；位置30（Kabat編號：H30）處之Asn經Ser取代；位置49（Kabat編號：H49）處之Val經Gly取代；位置64（Kabat編號：H61）處之Ala經Asp取代；及位置78（Kabat編號：H75）處之Gln經Lys取代。

作為輕鏈可變區，本發明之抗體應較佳地包含與選自以下之序列具有80%或更多，特定言之85%或更多，更特定言之90%或更多，甚至更特定言之95%或更多，再甚至更特定言之100%一致性的胺基酸序列：序列VL15（定義於SEQ ID NO: 32 中）、序列VL36（定義於SEQ ID NO: 34中）、序列VL46（定義於SEQ ID NO: 36中）、序列VL47（定義於SEQ ID NO: 38中）序列VL48（定義於SEQ ID NO: 40中）及序列VL50（定義於SEQ ID NO: 42中）。在一個實施例中，作為輕鏈可變區，本發明之抗體可包含序列VL47之胺基酸序列、或來源於經選自由以下組成之群之一或多個取代之序列VL47的胺基酸序列：位置17（Kabat編號：L17）處之Asp經Glu取代；位置28（Kabat編號：L27A）處之Ser經Asn取代；位置42（Kabat編號：L37）處之Gln經Leu取代；位置50（Kabat編號：L45）處之Gln經Arg取代；及位置51（Kabat編號：L46）處之Arg經Leu取代。

在另一實施例中，根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體可包含選自以下之任何組合：（1）作為重鏈可變區之序列VH11（SEQ ID NO: 116）及作為輕鏈可變區之序列VL15（SEQ ID NO: 32）；（2）作為重鏈可變區之序列VH11（SEQ ID NO: 116）及作為輕鏈可變區之序列VL36（SEQ ID NO: 34）；（3）作為重鏈可變區之序列VH11（SEQ ID NO: 116）及作為輕鏈可變區之序列VL46（SEQ ID NO: 36）；（4）作為重鏈可變區之序列VH11（SEQ ID NO: 116）及作為輕鏈可變區之序列VL47（SEQ ID NO: 38）；（5）作為重鏈可變區之序列VH11（SEQ ID NO: 116）及作為輕鏈可變區之序列VL48（SEQ ID NO: 40）；（6）作為重鏈可變區之序列VH11（SEQ ID NO: 116）及作為輕鏈可變區之序列VL50（SEQ ID NO: 42）；（7）作為重鏈可變區之序列VH12（SEQ ID NO: 20）及作為輕鏈可變區之序列VL48（SEQ ID NO: 40）；（8）作為重鏈可變區之序列VH47（SEQ ID NO: 22）及作為輕鏈可變區之序列VL48（SEQ ID NO: 40）；（9）作為重鏈可變區之序列VH61（SEQ ID NO: 24）及作為輕鏈可變區之序列VL48（SEQ ID NO: 40）；（10）作為重鏈可變區之序列VH62（SEQ ID NO: 26）及作為輕鏈可變區之序列VL48（SEQ ID NO: 40）；（11）作為重鏈可變區之序列VH64（SEQ ID NO: 28）及作為輕鏈可變區之序列VL47（SEQ ID NO: 38）；（12）作為重鏈可變區之序列VH64（SEQ ID NO: 28）及作為輕鏈可變區之序列VL48（SEQ ID NO: 40）；（13）作為重鏈可變區之序列VH65（SEQ ID NO: 117）及作為輕鏈可變區之序列VL47（SEQ ID NO: 37）；

藉由自上文提及之彼等選擇重鏈及輕鏈之CDR及/或可變區的胺基酸序列，及將其與視需要人類抗體之重鏈及輕鏈之構架區及/或恆定區的胺基酸序列組合，本領域中熟習此項技術者將能夠設計根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體。人類抗體之重鏈及輕鏈之構架區及/或恆定區的胺基酸序列可選自例如人類IgG、IgA、IgM、IgE及IgD次型或其變體之彼等。 B.特異性抗pSer413 tau抗體

本發明提供包括如下一對序列重鏈及輕鏈之多種特異性抗體： mAb-aPT1：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 144 mAb-aPT2：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 145 mAb-aPT3：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 146 mAb-aPT4：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 147 mAb-aPT5：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 148 mAb-aPT6：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 149 mAb-aPT7：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 150 mAb-aPT8：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 151 mAb-aPT9：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 152 mAb-aPT10：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 153 mAb-aPT11：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 154 mAb-aPT12：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 155 mAb-aPT13：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 156 mAb-aPT14：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 157 mAb-aPT15：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 158 mAb-aPT16：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 159 mAb-aPT17：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 160 mAb-aPT18：LC SEQ ID NO: 184及HC SEQ ID NO: 161 mAb-aPT19：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 144 mAb-aPT20：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 145 mAb-aPT21：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 146 mAb-aPT22：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 147 mAb-aPT23：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 148 mAb-aPT24：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 149 mAb-aPT25：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 150 mAb-aPT26：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 151 mAb-aPT27：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 152 mAb-aPT28：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 153 mAb-aPT29：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 154 mAb-aPT30：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 155 mAb-aPT31：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 156 mAb-aPT32：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 157 mAb-aPT33：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 158 mAb-aPT34：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 159 mAb-aPT35：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 160 mAb-aPT36：LC SEQ ID NO: 185及HC SEQ ID NO: 161 C.競爭結合之抗體

除結合至在位置413處磷酸化（pSer413）之人類tau蛋白之抗原結合域及含有其之抗體以外，本發明提供與本文中引述之抗體競爭結合的抗體。

造成與根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體競爭性結合至pSer413 tau之人類化抗體亦包括於本發明之範疇中。本文中所使用之術語「競爭性結合」意謂，當與抗原一起存在兩種或更多種單株抗體時，抗體中之一者針對抗原之結合受其他抗體針對抗原之結合抑制。可通常藉由例如向恆定量（濃度）之單株抗體添加變化量（濃度）之另一單株抗體，及測定後一種單株抗體在何種量（濃度）下結合以恆定量存在之前一種單株抗體之量減少，來量測競爭性結合。其抑制程度可以IC50或Ki之單位表示。造成與根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體競爭性結合之人類化抗體意謂，當使用在10 nM下之根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體量測抗原-抗體結合時，抗體具有1 μM或更低，特定言之100 nM或更低，更特定言之10 nM或更低的IC50。

可如本領域中已知來進行競爭性結合研究，一般使用SPR/Biacore®或Octet®結合分析以及ELISA及基於細胞之分析。

在一些實施例中，競爭性結合抗體之可變重鏈域及可變輕鏈域與本文中概述之可變區中之至少一者具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性，且在恆定域中，與圖13中概述之人類IgG序列具有至少99%或100%一致性。 D.胺基酸取代

除本文中概述之序列以外，本發明提供相比於親本開始序列可具有一或多個胺基酸取代之抗原結合域及含有其之抗體。

因此舉例而言，對於本文中列舉之所有可變重鏈及輕鏈域，可進一步製備變體。如本文中所概述，在一些實施例中，6個CDR組可具有0、1、2、3、4或5個胺基酸修飾（經具有特定用途之胺基酸取代）。在此等實施例中，一般而言單一CDR具有不超過1或2個胺基酸取代，且經突變序列保持結合至pSer413 tau蛋白。然而，當對於本文中概述之序列之CDR製備胺基酸變體時，所得CDR並非PCT/JP13/65090中概述及SEQ ID NO: 81、82及83（可變輕鏈CDR）與SEQ ID NO: 86、87及88（可變重鏈CDR）中展示之鼠類CDR。

在一些情況下，在可變重鏈及/或輕鏈域之構架區上可進行改變。在此實施例中，構架區（例如排除CDR）中之較佳變體與人類生殖系序列保持至少約80%、85%、90%或95%一致性。因此，舉例而言，可將如本文中所描述之一致CDR與來自人類生殖系序列之不同構架序列組合，只要構架區與人類生殖系序列保持至少80%、85%、90%或95%一致性即可。

在一些實施例中，對於本文中概述之人類化輕鏈，最接近人類輕鏈生殖系為與本文中之序列具有81%一致性之IGKV2-30。因此，可製備輕鏈構架區中之額外變體，只要與IGKV2-30之一致性為至少80%、85%、90%或95%一致性即可。

對於本文中之人類化重鏈，重鏈之最接近人類生殖系為與本文中之序列具有85%一致性之IGHV3-73。因此，可製備輕鏈構架區中之額外變體，只要與IGHV3-73之一致性為至少80%、85%、90%或95%一致性即可。

或者，CDR可具有胺基酸修飾（例如CDR組中之1、2、3、4或5個胺基酸修飾（亦即CDR可經所改變之CDR之任何組合修飾，只要6個CDR組之改變總數目小於6個胺基酸修飾即可；例如可在vlCDR1中存在一個改變，在vhCDR2中存在兩個改變，在vhCDR3中不存在改變等）），以及具有構架區改變，只要構架區與人類生殖系序列保持至少80%、85%或90%一致性即可，且所得CDR並非PCT/JP13/65090中概述及SEQ ID NO: 81、82及83（可變輕鏈CDR）與SEQ ID NO: 86、87及88（可變重鏈CDR）中展示之鼠類CDR。

一般而言，抗pSer413 tau抗體之間的比較之一致性百分比為至少75%、至少80%、至少90%，其中至少約95%、96%、97%、98%或99%一致性百分比較佳。一致性百分比可能為針對完全胺基酸序列，例如整個重鏈或輕鏈或針對鏈之一部分的一致性。舉例而言，包括在本發明之抗pSer413 tau抗體定義內的為針對整個可變區（例如其中與可變區之一致性為95或98%一致）或針對整個恆定區共用一致性的彼等。 X. 本發明之核酸

亦提供編碼本發明之抗pSer413 tau抗體之核酸組合物以及含有核酸之表現載體與用核酸及/或表現載體組合物轉化之宿主細胞。如本領域中之彼等者應瞭解，本文中描繪之蛋白質序列可由任何數目的可能核酸序列編碼，此係歸因於基因密碼之簡併。

因此，本發明進一步提供編碼抗原結合域及含有其之抗體之核酸組合物。如本領域中之彼等者應瞭解，在抗原結合域之情況下，核酸組合物一般包含編碼可變重鏈域之第一核酸及編碼可變輕鏈域之第二核酸。在scFv之情況下，可製備編碼可變重鏈及可變輕鏈域、由蛋白質連接子分開的單一核酸。在傳統抗體之情況下，核酸組合物一般包含編碼重鏈之第一核酸及編碼輕鏈之第二核酸，所述核酸組合物在於細胞中表現後，將自發地組裝為兩條重鏈與兩條輕鏈之「傳統」四聚形式。

如本領域中已知，可將編碼本發明組分之核酸併入至如本領域中已知之表現載體中，且視宿主細胞而定，用於產生本發明之雜二聚抗體。如本領域中之彼等者應瞭解，可將此等兩種核酸併入至單一表現載體中或兩個不同表現載體中。一般而言，核酸可操作地連接於任何數目的調節元件（啟動子、複製起點、選擇性標記、核糖體結合位點、誘導子等）。表現載體可為染色體外或整合載體。

接著，將本發明之核酸及/或表現載體轉化至任何數目的如本領域中熟知之不同宿主細胞類型中，所述宿主細胞包含哺乳動物、細菌、酵母菌、昆蟲及/或真菌細胞，其中哺乳動物細胞（例如CHO細胞）可用於多個實施例中。

藉由培養包括如本領域中所熟知之表現載體之宿主細胞來製備本發明之抗體。一旦產生，則進行傳統抗體純化步驟。 XI. 生物及生物化學分析

可以若干方式分析本發明之抗pSer413 tau抗體之功效。作為初始物質，可使用本領域中已知之技術，諸如ELISA技術（參見例如實例2(1)）、Octet、Biacore或FACS，其中將與磷酸化肽（例如SEQ ID NO: 8）的結合與如本文中概述之非磷酸化肽（例如SEQ ID NO: 69）的結合相比較，來測試抗體與在位置S413處磷酸化之人類tau蛋白或肽的結合。

在一些實施例中，藉由Biacore分析來量測本文所揭示之抗體之結合功效。在某些實施例中，用磷酸化Tau蛋白量測K_D 值。在一些實施例中，用磷酸化Tau肽量測K_D 值。在一個實施例中，磷酸化Tau肽僅在一個殘基處磷酸化（例如SEQ ID NO: 75）。在另一實施例中，磷酸化肽在多個殘基處磷酸化（例如SEQ ID NO: 76或SEQ ID NO: 78）。在一些實施例中，用固定抗原（例如磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽）量測K_D 值，在此情況下，親和性量測包含亦即呈二價結合模式之親合力分量。在其他實施例中，用固定抗體（例如小鼠親本抗體、嵌合抗體或人類化抗體變體）量測K_D 值，在此情況下，親和性量測並不包含亦即呈單價結合模式之親合力分量。在又其他實施例中，用固定抗體及用作為分析物之磷酸化Tau蛋白量測K_D 值。在另其他具體實例中，用固定抗體及用作為分析物之磷酸化肽量測K_D 值。在某些實施例中，量測呈二價結合模式之K_D 值。在其他實施例中，量測呈單價結合模式之K_D 值。

另外，亦可在人類AD大腦勻漿中，以及使用微流體室中的人類iPSC神經元，在AD衍生之tau接種HEC293 Tau P301L聚集分析中之中和研究及/或在AD衍生之tau接種及擴散模型中，分析本發明之抗pSer413 tau抗體之結合親和性。

另外，本發明之抗pSer413 tau抗體亦可用於AD患者大腦樣本之免疫組織化學分析中

另外，可分析本發明之抗pSer413 tau抗體在包含阿茲海默症（AD）之認知障礙之動物模型中的功效。用於關於針對本發明之認知障礙之治療性或預防性藥劑研究的動物包含用於認知障礙的動物模型，特定言之tau蛋白病的動物模型。用於tau蛋白病之動物模型為在大腦中表現正常類型或突變tau之動物，且特定言之呈現認知功能缺損之動物模型。可藉由基因工程改造，一種典型的轉殖基因小鼠（Tg小鼠）實例，來製備在大腦中表現正常類型或突變tau之此類動物。表現突變tau之動物模型（諸如Tg小鼠）適用作家族性遺傳tau蛋白病之模型，但對於針對構成人類中之大部分案例之偶發性tau蛋白病的治療性藥劑或預防性藥劑效果的檢查，較佳地在表現正常類型tau的Tg小鼠中呈現的效果。最適用作表現正常類型tau之Tg小鼠為在本發明之生產實例中製備之小鼠，但亦可使用由Kambe等人（《疾病神經生物學（Neurobiology of Disease）》, 第42卷, 第404-414頁, 2011）及Kimura等人（《歐洲分子生物學學會雜誌（The EMBO J.）》第26卷. 第5143-5152頁, 2007）報導的Tg小鼠，其兩者均以全文引用之方式併入本文中，且特定言之以用於產生及使用轉殖基因小鼠。然而，儘管在Kambe等人及Kimura等人之小鼠中看到認知功能缺損，但其分別在14個月齡及20個月齡之後出現，且因此經常在老齡期發作，且老齡化效果亦可為促進因素，而長期育種之效果及勞力亦係問題。

檢查針對根據本發明之認知障礙之治療性藥劑或預防性藥劑在動物模型中之效果的較佳方法為測試認知功能的方法，諸如記憶學習測試。此類方法可為莫氏水迷宮測試（Morris water maze test），逐步-通過學習測試或新物體識別測試，但較佳地其為行為量測測試（諸如空心領域測試）之組合，以便考慮行為量及動物焦慮之條件。

作為用於檢查針對根據本發明之認知障礙之治療性藥劑或預防性藥劑之效果之方法，有可能使用使用檢查在向認知病症投與認知障礙動物模型期間大腦組織中之tau蛋白或磷酸化tau之含量的方法。在AD及其他神經退化性疾病中，tau蛋白之表現量或異常磷酸化tau增加與病變相關（Khalid Iqbal等人, 《當前阿茲海默症研究（Curr. Alzheimer Res.）》, 第7卷, 第654-664頁, 2010）。亦熟知，降低一些病理性模型動物中之tau表現及異常磷酸化tau含量引起認知功能及運動功能之改良（K. Santa Cruz等人, 《科學》, 30, 第9卷, 第476-481頁, 2005；Sylvie Le Corre等人, 《美國國家科學院院報》, 第103卷, 第9673-9678頁, 2006）。作為檢查tau蛋白或磷酸化tau之改變之方法，可藉由如實例中所描述之諸如西方墨點法（Western blotting）使用大腦組織勻漿的方法來實現此，但本領域中熟習此項技術者可選擇其他適當方法，諸如ELISA（Xiyun Chai等人, 《生物化學雜誌》, 第286卷, 第34457-34467頁, 2011）或免疫組織化學方法（David J. Irwin等人, 《大腦（BRAIN）》, 第135卷, 第807-818頁, 2012）。 XII. 調配物

藉由將具有所需純度之抗體與視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合（如一般在《雷明頓醫藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）》第16版, Osol, A.編 [1980]中概述），製備儲存用、呈凍乾調配物或水溶液形式之根據本發明使用的抗體調配物。

可調配呈醫藥組合物形式之針對根據本發明之認知障礙的治療性或預防性藥劑，所述醫藥組合物除根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體以外含有醫藥學上可接受之載劑及/或其他賦形劑。可使用例如費城科學大學「《雷明頓：藥學之科學及實踐（Remington: The Science and Practice of Pharmacy）》第20版」, Lippincott Williams & Wilkins, 2000中所描述之方法，來進行使用醫藥學上可接受之載劑及/或其他賦形劑的調配物。可提供呈液體調配物形式或呈其凍乾調配物形式之此類治療性或預防性藥劑，所述液體調配物藉由將成分溶解、懸浮或乳化至無菌水性介質或油性介質中來製備。用於製備此類調配物之介質或溶劑可為水性介質，其實例包含注射用蒸餾水及生理鹽水溶液，其可視情況與添加滲透壓調節劑（例如D-葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇及氯化鈉）一起使用，及/或與適合溶解助劑組合，所述溶解助劑諸如醇（例如乙醇）、多元醇（例如丙二醇或聚乙二醇）或非離子型界面活性劑（例如聚山梨醇酯80或聚氧乙烯氫化蓖麻油50）。亦可用油性介質或溶劑來製備此類調配物，所述油性介質或溶劑之實例包含芝麻油及大豆油，其可視情況與諸如苯甲酸苯甲酯及苯甲醇的溶解助劑一起組合使用。可通常使用諸如以下之適當添加劑來製備此類液體藥物：緩衝劑（例如磷酸鹽緩衝劑及乙酸鹽緩衝劑）、舒緩劑（例如氯化苯甲烴銨及鹽酸普魯卡因）、穩定劑（例如人類血清白蛋白及聚乙二醇）、防腐劑（例如抗壞血酸、異抗壞血酸及其鹽）、著色劑（例如葉綠素β-胡蘿蔔素銅、紅色2號及藍色1號）、消毒劑（例如對羥基苯甲酸酯、苯酚、氯化苯索銨及氯化苯甲烴銨）、增稠劑（例如羥丙基纖維素、羧甲基纖維素及其鹽）、穩定劑（例如人類血清白蛋白甘露醇及山梨醇）及氣味校正劑（例如薄荷醇及橘芳香）。不同治療性或預防性藥劑形式包含固體調配物，諸如散劑、片劑、粒劑、膠囊、丸劑、栓劑及錠劑。對於待呈口服形式投與之固體調配物，可使用添加劑，諸如賦形劑（例如結晶纖維素、乳糖及澱粉）、潤滑劑（例如硬脂酸鎂及滑石）、黏合劑（羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙二醇及其類似物）及崩解劑（例如澱粉及羧甲基纖維素鈣）。視需要，可使用添加劑，諸如消毒劑（例如苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯）、抗氧化劑、著色劑、甜味劑及其類似物。主要出於賦予黏膜吸附或滯留特性之目的，其他替代形式包含用於施加至黏膜上之治療性藥劑或預防性藥劑，此類調配物通常含有添加劑，諸如壓敏黏合劑、壓敏增強劑、黏度調節劑、增稠劑及其類似物（例如黏蛋白、瓊脂、明膠、果膠、角叉菜膠、海藻酸鈉、刺槐豆膠、三仙膠、黃蓍膠、阿拉伯膠、殼聚糖、普魯蘭、蠟狀澱粉、硫糖鋁、纖維素及其衍生物（諸如羥丙基甲基纖維素）、聚丙三醇脂肪酸酯、丙烯酸-(甲基)丙烯酸烷基酯共聚物、或其鹽及聚丙三醇脂肪酸酯）。然而，待向身體投與之治療性藥劑或預防性藥劑之形式、溶劑及添加劑不限於此等，且可由本領域中熟習此項技術者進行適當選擇。

除根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體以外，針對根據本發明之認知障礙之治療性或預防性藥劑可含有具有治療或預防認知障礙效果之其他已知藥物，且特定言之具有抑制認知障礙進展效果之藥物。或者，可將含有根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體、針對根據本發明之認知障礙之治療性或預防性藥劑，與待呈套組形式製備、含有具有治療或預防認知障礙效果之已知藥物的另一治療性或預防性藥劑組合，且特定言之具有抑制認知障礙進展效果的藥物。具有抑制認知障礙進展效果之成分包含（但不限於）多奈哌齊（Donepezil）、加蘭他敏（Galantamine）、美金剛（Memantine）及雷斯替明（Rivastigmine）。具有抑制認知障礙進展效果之成分的劑量及含有具有抑制認知障礙進展效果之成分之治療性或預防性藥劑的劑量，可在正常療法使用劑量之範疇內，但可視條件而增加或減少。

儘管本發明者在WO2013/180238A（專利文獻4）中指示實驗結果，其表明即使當藉由腹膜內投與周邊地投與時，抗體藉由經由血腦屏障作用於大腦而呈現藥物效果，但亦有可能製備有效地向大腦組織供應根據本發明之人類化抗磷酸化tau抗體的調配物，所述調配物包含於根據本發明之針對認知障礙之治療性或預防性藥劑中。根據本發明之針對認知障礙之治療性或預防性藥劑亦涵蓋此類調配物。已知用於經由血腦屏障有效地向大腦組織供應抗體或肽之方法，諸如添加靶向物質之方法或包封於脂質體或奈米粒子中之方法。待用於靶向之物質包含藉由與具有與特異性受體或轉運體結合特性之抗體、或肽、蛋白質或其他化合物結合而經受總體或部分電荷特徵改變的彼等物質。具有與特異性受體或膜蛋白結合特性之肽、蛋白質或其他化合物之實例包含：結合至受體配位體或膜蛋白之配位體及其類似物；及結合至受體配位體或膜蛋白之抗體、促效劑化合物/拮抗劑化合物/別構調節劑及其類似化合物。作為具有結合至特異性受體或轉運體特性之肽、蛋白質或其他化合物之靶標之受體配位體或膜蛋白的實例包含：運鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）、胰島素受體（insulin receptor，IR）、類胰島素生長因子受體（insulin-like growth factor receptor，IGFR）、LDL受體相關蛋白（LDL receptor-related protein，LRP）及白喉毒素受體（HB-EGF），其中對於此等物質無特定限制（Angela R. Jones等人, 《醫藥研究（Pharm. Res.）》, 2007, 第24卷, 第9期, 第1759-1771頁）。可將用於靶向之物質化學添加至待用於根據本發明之針對認知障礙之治療性或預防性藥劑中之抗體，方法為可由本領域中熟習此項技術者參考已知方法適當進行的方法，所述已知方法諸如描述於例如Hermanson等人, 《生物結合技術》, USA, Academic Press, 1996中。亦可將用於靶向之物質結合至包封抗體或肽之脂質體或奈米粒子（Sonu Bhaskar等人, 《粒子及纖維毒理學（Particle and Fibre Toxicology）》, 2010, 7:3）。另外，當用於靶向之物質為肽或蛋白質時，可由本領域中熟習此項技術者使用基因工程改造技術，藉由利用肽化學合成生產融合肽，或藉由將包括編碼肽或蛋白質之胺基酸序列之核苷酸序列的核酸與包括編碼待使用之抗體或肽之胺基酸序列之核苷酸序列的核酸組合，來生產呈適當融合蛋白的所述用於靶向之物質。

出於改良症狀之目的，可向有需要之患者經口或非經腸投與根據本發明之治療性或預防性藥劑。對於經口投與，可選擇諸如以下之劑型：粒劑、散劑、片劑、膠囊、液體藥物、糖漿、乳液、懸浮劑或酏劑。對於非經腸投藥，可製備經鼻藥劑，及可選擇液體藥物、懸浮液或固體調配物。可以注射劑製備為非經腸投藥之不同形式，所選注射為皮下注射、靜脈內注射、輸注、肌肉內注射、腦室內注射或腹膜內注射。除經鼻藥劑以外，用於非經腸投藥之其他調配物包含栓劑、舌下藥劑、經皮藥劑及經黏膜投與藥劑。另外，可能藉由添加或包衣至血管支架或血管內閉孔器上之模式來進行血管內局部投與。

根據本發明之治療或預防用藥劑之劑量將視患者年齡、性別、體重及症狀、治療效果、投與方法、治療時間或醫學組合物中之活性成分之類型而變化，但其通常可在0.1 mg至1 g範圍內投與，且對於成人而言，較佳在0.5 mg至200 mg活性化合物/投與範圍內。然而，由於劑量將視各種條件而變化，所以比上文提及之劑量低之劑量可能為足夠的，或可能需要超過此等範圍之劑量。根據本發明之治療或預防用藥劑可在短投與時間內呈現效果。 XIII. 抗體之投與

一旦進行，本發明之抗體可用於治療諸如tau蛋白病之認知障礙。如本文所論述，已在各種神經病理學病狀中證實tau蛋白之胞內累積。由此類tau胞內累積引起之疾病統稱為「tau蛋白病」（參見Arai，見上文，以全文引用之方式併入本文中且關於其中概述之病症）。tau蛋白病包含神經退化性疾病，諸如阿茲海默症（AD）、皮質基底核退化症（CBD）或皮質基底核症候群（CBS）、進行性核上麻痹、皮克病、嗜銀粒性癡呆（嗜銀粒性疾病）、伴隨癡呆之多發性系統tau蛋白病（MSTD）、伴隨帕金森氏症之染色體17相關之額顳葉型癡呆（FTDP-17）、神經原纖維纏結癡呆、伴隨鈣化之擴散性神經原纖維纏結、伴隨球狀膠質夾雜物之白質tau蛋白病（WMT-GGI）、伴隨tau陽性夾雜物之額顳葉型葉退化（FTLD-tau）。tau蛋白病亦包含非神經退化性疾病，包含：感染性疾病，諸如埃科諾莫氏腦炎後遺症（Economo's encephalitis sequela）及亞急性硬化性全腦炎；及外傷誘導之病狀，諸如博克氏腦病（boxer's encephalopathy）。

認知障礙定義為一種涉及一旦發展或患得則心智功能下降之病況的心智缺損類型（「《新精神病學（New Psychiatry）》（南科多基礎先進叢書（Nankodo's Essential Well-Advanced Series））」（日本書籍）, Kunitoshi Kamijima及Shin-ichi Niwa編, Nankodo Co., Ltd., 2008, 第69-70頁），但在廣義上認為為呈現心智缺損及/或記憶障礙之疾病。在諸如AD之神經退化性疾病之診斷中，無論是否藉由例如經由死亡後之組織學分析來分析關於是否存在神經原纖維纏結（NFT）來測定「神經退化性」病狀，但醫師藉由使用各種手段來診斷認知障礙尤其為神經退化性疾病，所述手段例如：經由詢問之神經心理學檢查，諸如修正用長穀川癡呆量表（Hasegawa's dementia scale for revised，HDS-R）及微型精神狀態檢查（mini-mental state examination，MMSE）；經由觀測之神經心理學檢查，諸如臨床癡呆評級（clinical dementia rating，CDR）或功能性評定分級（functional assessment staging，FAST）；基於例如tau及磷酸化tau之含量之增加或腦脊髓液中之Aβ之含量增加的生物化學檢查；及基於經由例如頭部CT、頭部MRI、SPECT或PET獲得之資訊的影像檢測。基於神經退化性疾病之診斷索引中之至少一者，向患者投與根據本發明之針對認知障礙之治療性或預防性藥劑，所述患者已經醫師診斷為患有認知障礙，且相比於投與前之狀態患者之病狀具有改良效果，經由投與控制病狀之進展或將病狀維持在投與前之狀態，或使病狀恢復至投與前之狀態。

根據本發明之針對認知障礙之治療性或預防性藥劑亦可具有改良人類或非人類動物之認知功能、或抑制認知功能降低或維持認知功能的效果。此類非人類動物之實例應較佳地為表現與人類tau具有高同源性之tau之彼等非人類動物，且包含（但不限於）：黑猩猩、獼猴、馬、豬、狗、小鼠、兔、大鼠及貓。 XIV. 實例 A.實例1：抗體之產生。 1.小鼠抗體（親本抗體）

小鼠抗體Ta1505用作嵌合抗體及人類化抗體之親本抗體。小鼠抗體Ta1505之詳情描述於國際公開案第WO2013/180238A號之實例中。小鼠抗體Ta1505之輕鏈（L鏈）之胺基酸序列定義於SEQ ID NO: 44中，且編碼其之核苷酸序列定義於SEQ ID NO: 45中。小鼠抗體Ta1505之重鏈（H鏈）之胺基酸序列定義於SEQ ID NO: 46中，且編碼其之核苷酸序列定義於SEQ ID NO: 47中。 2.嵌合抗體

藉由將小鼠抗體Ta1505之輕鏈（L鏈）及重鏈（H鏈）之可變區分別與人類免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G1（κ）之L鏈及H鏈之恆定區組合來產生嵌合抗體。嵌合抗體之輕鏈（L鏈）之胺基酸序列定義於SEQ ID NO: 48中，且編碼其之核苷酸序列定義於SEQ ID NO: 49中。嵌合抗體之重鏈（H鏈）之胺基酸序列定義於SEQ ID NO: 50中，且編碼其之核苷酸序列定義於SEQ ID NO: 51中。在整個說明書中，此嵌合抗體被稱作「嵌合抗體」或「嵌合抗體Ta1505」。 3.人類化抗體 a. VL及VH之設計

具有高同源性之一級序列選自人類生殖系，且藉由移植互補決定區（complementarity determining region，CDR）以設計各種人類化抗體來進行人類化。

詳言之，具有高同源性之人類構架選自資料庫；將小鼠抗體Ta1505之CDR區插入至構架中之每一者中；且進行胺基酸取代以例如降低免疫原性同時維持活性。從而設計各種輕鏈可變區（VL）及重鏈可變區（VH）之胺基酸序列。VL之胺基酸序列之SEQ ID編號及編碼其之基因之核苷酸序列之SEQ ID編號展示於表2A中，且VH之胺基酸序列之SEQ ID編號及編碼其之基因之核苷酸序列之SEQ ID編號展示於表2B中。VL及VH之胺基酸序列之比對分別展示於圖2A及圖2B中。表2A：輕鏈可變區（VL）表2B：重鏈可變區（VH） b.基於免疫原性分值，VL及VH之組合之選擇

任意組合藉由上文所描述之步驟設計之VL及VH，且藉由活體外分析軟體Epibase（Lonza）來計算各組合之免疫原性分值（DRB1分值）。待用於後續實驗中之VL與VH之組合選自展示低免疫原性、其中免疫原性分值等於或低於預定值（DRB1分值：1500）之組合。VL與VH之所選擇組合展示於表3A中，且此等組合之免疫原性分值（DRB1分值）展示於表3B中。表3A：VL與VH之所選擇組合表3B：免疫原性分值（DRB1分值） c.人類化抗體之表現培養及純化

對於藉由上文所描述之步驟選擇之VL與VH之各組合，製備編碼VL及VH之胺基酸序列之基因。將VL基因框內融合至人類免疫球蛋白κ L-鏈恆定區（CL）基因（其胺基酸序列及核苷酸序列分別定義於SEQ ID NO: 52及SEQ ID NO: 53中），且將VH基因框內融合至人類免疫球蛋白γ-1 H-鏈恆定區（CH）基因（其胺基酸序列及核苷酸序列分別定義於SEQ ID NO: 54及SEQ ID NO: 55中），使得在各結合位點處不應存在突變或缺陷。將將VL基因及VH基因之5'端分別框內融合至來源於人類免疫球蛋白κ L-鏈基因（其胺基酸序列及核苷酸序列分別定義於SEQ ID NO: 56及SEQ ID NO: 57中）之信號序列及來源於人類免疫球蛋白γ-1 H-鏈基因（其胺基酸序列及核苷酸序列分別定義於SEQ ID NO: 58及SEQ ID NO: 59中）之信號序列，使得在各結合位點處不應存在突變或缺陷。

將分別編碼藉由上文所描述之步驟設計之信號序列融合L鏈及H鏈之核酸構築體各自併入至用於動物細胞表現的表現載體中，且接著使用ExpiCHO（由Thermo Fisher Scientific K.K.製造）根據表現抗體的標準方案培養。藉由離心澄清各培養物，且將所得培養上清液應用於蛋白A親和管柱以純化人類化抗體。使用pH為2.8至3.5之酸性溶液溶離之級分進行快速中和，濃縮，且應用於凝膠過濾管柱，以移除聚集物。緩衝液改變為磷酸鹽緩衝鹽水（phosphate buffered saline，PBS），以收集主要級分，所述主要級分用溶劑稀釋為適當濃度且接著在隨後測試中使用。

在下文描述中，可使用其VL與VH之代碼名稱之組合來對由上文所描述之步驟產生的各人類化抗體進行縮寫。舉例而言，使用L15作為VL且H11作為VH產生之人類化抗體被稱作L15H11。

在下文測試中，在無另外規定之情況下，3% BSA/PBS用作用於調整抗體濃度之溶劑。 B.實例2：抗原肽結合親和性之ELISA分析 1.針對抗原肽之結合親和性之ELISA分析

藉由酶聯免疫吸附分析（enzyme - linked immunosorbent assay，ELISA），分析具有展示於表3A中之VL與VH之組合之一些人類化抗體針對抗原肽的結合親和性。

將非磷酸化tau肽PD17（Ser413）及Ser413磷酸化之磷酸化tau肽PD17P（pSer413）各自用冷PBS稀釋至1 μg/mL，且將所得溶液各自以50微升/孔施配至盤，且使其在4℃下靜置隔夜。移除溶液，且接著以270微升/孔施配阻斷緩衝液（3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）-PBS），且使盤在4℃下靜置隔夜。在移除溶液之後，以逐步方式稀釋抗體溶液，其中接著以50微升/孔向盤中添加3% BSA-PBS，使其在室溫下反應90分鐘。非磷酸化tau肽PD17（Ser413）及磷酸化tau肽PD17P（pSer413）之胺基酸序列分別定義於SEQ ID NO: 60及SEQ ID NO: 8中。

用含有0.05%吐溫20之Tris緩衝鹽水+吐溫20（TBS-T）洗滌各孔。以50微升/孔向盤中添加用稀釋緩衝液（3% BSA-PBS）稀釋2000倍之山羊抗-人類IgG-鹼性磷酸酶標記（由Sigma-Aldrich Co. LLC.製造），使其在室溫下反應60分鐘。在用TBS-T洗滌之後，以100微升/孔向盤中添加顯色溶液（1 mg/mL對硝基苯磷酸（p-nitrophenylphosphate，pNPP）溶液），以顯色40分鐘。量測405 nm波長下之吸光度（光密度（optical density，OD）值）。

藉由測定各抗體之OD值與0.25 nM嵌合抗體之OD值之比率，及在以下三點量表上對所得比率進行評級來評價反應性： +：足夠反應性（0.6 ≤ OD比）， ±：極弱反應性（0.15 ＜ OD比＜ 0.6），及 -：無反應性（OD比≤ 0.15）。

表4A展示抗體與磷酸化tau肽PD17P之反應性之評估結果。表4B展示抗體與非磷酸化tau肽PD17之反應性之評估結果。相比於嵌合抗體，所有人類化抗體均呈現與磷酸化tau肽PD17P之較高反應性，但與非磷酸化tau肽PD17之較低反應性。此等結果表明，人類化抗體具有與磷酸化tau肽之選擇性反應性。表4A：與磷酸化肽PD17P之反應性之ELISA分析表4B：與非磷酸化肽PD17之反應性之ELISA分析 2.針對磷酸化tau肽之選擇結合親和性之ELISA分析

藉由酶聯免疫吸附分析（ELISA），使用嵌合抗體Ta1505作為參考抗體，分析具有展示於表3A中之VL與VH之組合之一些人類化抗體的抗Tau人類化抗體針對磷酸化tau肽的選擇結合親和性。

以50微升/孔將含有1 μg/mL非磷酸化肽PD17或磷酸化肽PD17P之溶液施配至盤，且使其在4℃下靜置隔夜。在移除溶液之後，以270微升/孔施配阻斷緩衝液（3%牛血清白蛋白（BSA）-PBS），且使盤在4℃下靜置隔夜，從而產生其中非磷酸化肽PD17或磷酸化肽PD17P固定在各孔上的盤。

藉由4倍連續稀釋，自0.6 μg/mL（4 nM）之初始濃度開始來製備各抗體的一系列五個濃度。以50微升/孔向盤之孔中添加各溶液，使其在室溫下反應一小時。在洗滌處理之後，將山羊抗-人類IgG-鹼性磷酸酶標記（由Sigma-Aldrich Co. LLC.製造）稀釋2000倍，且接著以50微升/孔向各孔中添加，進一步允許反應一小時。

在洗滌處理之後，以100微升/孔向各孔中添加1 mg/mL對硝基苯磷酸（pNPP），允許反應20分鐘。在405 nm波長下量測吸光度（OD）。

用SoftMax Pro軟體6.5版本（Molecular Devices Corporation）來分析在各製備抗體之個別濃度下之吸光度OD之資料，以測定以下歸為展示於下之四參數邏輯回歸曲線的數值A至D：（方程式I）其中 x表示抗體之濃度，及 y表示吸光度（OD值）。

將在1 nM濃度下之非磷酸化肽PD17之吸光度OD值輸入表達式，以計算對應於OD值之各抗體之濃度x。由於PD17之濃度為1 nM，所以基於各肽針對PD17之結合親和性之針對磷酸化tau肽PD17P之結合親和性的比例因數由1/x來計算，且用作針對磷酸化tau肽的選擇結合親和性的指標。

結果展示於圖3之曲線中。嵌合抗體Ta1505針對磷酸化tau肽PD17P之結合親和性強達其針對非磷酸化肽PD17的30倍。相比之下，人類化抗體之選擇結合親和性呈現高選擇性，其中比例因數為40至210倍。結果表明，人類化抗體針對磷酸化肽具有特異性結合親和性。 3.使用磷酸化tau肽、針對Ser413磷酸化位點之選擇結合親和性之ELISA分析

藉助於ELISA使用各種磷酸化肽，各自分析具有展示於表3A中之VL與VH之組合之人類化抗體的其在蛋白質的主要磷酸化位點中選擇性結合至Ser413磷酸化位點的能力。

如表5中所展示，使用十二種磷酸化肽。除了12號肽具有包含Ser413位點但不磷酸化（PD17）之抗原決定基以外，名稱為「抗原決定基」之行指示4R2N型tau蛋白之磷酸化位點（例如，1號肽中之「pS46」指示Ser46之位點為磷酸化抗原決定基，且多個抗原決定基之描述指示一個肽具有兩個或三個磷酸化位點）。表5：用於分析針對tau蛋白Ser413磷酸化位點之特異性結合之肽

將展示於表5中之十二種肽（亦即肽編號1至12）或此等肽與牛血清白蛋白（BSA）或匙孔螺血氰蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）之結合物，各自用冷卻至4℃之PBS稀釋至1 µg/mL，且以50微升/孔將所得溶液施配至盤，且使其在4℃下靜置隔夜。移除溶液，且接著以270微升/孔施配阻斷緩衝液（3% BSA-PBS），且使盤在4℃下靜置隔夜。在移除溶液之後，用3% BSA-PBS將純化抗體稀釋至150 ng/mL，且接著以50微升/孔向盤中添加，使其在室溫下反應90分鐘。用含有0.05%吐溫20之Tris緩衝鹽水（TBS-T）洗滌各孔。以50微升/孔向盤中添加用稀釋緩衝液（3% BSA-PBS）稀釋2000倍之山羊抗-人類IgG（H+L）-鹼性磷酸酶標記（Sigma-Aldrich Co. LLC.製造），使其在室溫下反應60分鐘。在用TBS-T洗滌之後，以100微升/孔向盤中添加顯色溶液（1 mg/mL pNPP溶液）以顯色40分鐘。在405 nm量測波長及550 nm參考波長下量測吸光度（OD值）。

在以下三點量表上評價反應性： +：足夠反應性（1.0 ≤ OD值）， ±：極弱反應性（0.5 ≤ OD值＜ 1.0），及 -：無反應性（OD值＜ 0.5）。

結果展示於表6中。所有人類化抗體均展示對僅9號肽（pSer412/pSer413：PRHLSNV(pS)(pS)TGSIDMVD）、10號肽（pSer413：PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD及11號肽（pSer409/pSer412/pSer413：PRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVD）之強力結合親和性，但並不結合至其對應於tau蛋白之Ser413之位點不磷酸化的其他肽。結合之模式及強度大體上與嵌合體（嵌合抗體Ta1505）之彼等相同。此等結果指示，人類化抗體具有特異性針對具有磷酸化Ser413位點之tau蛋白的結合親和性。表6：與各種磷酸化tau肽之反應性之ELISA分析之結果 C.實例3：針對抗原蛋白質之結合親和性之ELISA分析

藉由ELISA，分析具有展示於表3A中之VL與VH之組合之一些人類化抗體針對抗原蛋白質的結合親和性。

為了製備磷酸化tau蛋白pTau，使用桿狀病毒系統，在昆蟲細胞中表現tau蛋白4R2N。另外，為了製備過磷酸化tau蛋白hpTau，製造能夠同時表現tau蛋白與GSK3β之重組桿狀病毒。

在重組桿狀病毒之製造中，使用pFastBac1及pFastBac Dual載體。對於磷酸化tau蛋白pTau，將編碼具有His標記C端之tau蛋白4R2N之cDNA插入至pFastBac1中。對於過磷酸化tau蛋白hpTau，將編碼具有His標記C端之tau蛋白4R2N的cDNA及編碼GSK3β的cDNA插入至pFastBac Dual中。His標記tau蛋白4R2N之胺基酸序列及核苷酸序列分別定義於SEQ ID NO: 70及71中。GSK3β之胺基酸序列及核苷酸序列分別定義於SEQ ID NO: 72及73中。

藉由脂質體轉染，將所得載體各自引入至細胞株Sf9中，且培養細胞以製備重組桿狀病毒。接著，將所得重組桿狀病毒用於感染細胞株Sf9或Tn5，從而表現磷酸化tau蛋白（pTau）及過磷酸化tau蛋白（hpTau）。

採集表現所需蛋白質之細胞，且使其經受音波處理及離心，獲得細胞裂解物，所述細胞裂解物接著應用於Ni-NTA管柱，以純化tau蛋白。藉由雙金雞納酸（bicinchoninic acid，BCA）分析使用牛血清白蛋白（BSA）作為標準樣本來測定純化tau蛋白之濃度。

用冷卻PBS將所得過磷酸化tau蛋白（hpTau）及磷酸化tau蛋白（pTau）稀釋至1 µg/mL，且以50微升/孔將稀釋溶液施配至盤，且使其在4℃下靜置隔夜。在移除溶液之後，接著以270微升/孔施配阻斷緩衝液（3% BSA-PBS），且使盤在4℃下靜置隔夜。在移除緩衝溶液之後，以50微升/孔向盤中添加經由3% BSA-PBS連續稀釋製備之一系列抗體溶液，使其在室溫下反應90分鐘。

接著，用含有0.05%吐溫20之Tris緩衝鹽水（TBS-T）洗滌孔。以50微升/孔向盤中添加用稀釋緩衝液（3% BSA-PBS）稀釋2000倍之山羊抗-人類IgG-鹼性磷酸酶標記（由Sigma-Aldrich Co. LLC.製造），使其在室溫下反應60分鐘。在用TBS-T洗滌之後，以100微升/孔向盤中添加顯色溶液（1 mg/mL pNPP溶液）以顯色40分鐘。在405 nm波長下量測吸光度（OD值）。

表7A展示與過磷酸化tau蛋白hpTau之人類化抗體之所評價反應性之結果。表7B展示與磷酸化tau蛋白pTau之人類化抗體之所評價反應性之結果。結果表明，相比於嵌合抗體，所有人類化抗體均具有與過磷酸化tau蛋白hpTau及磷酸化tau蛋白pTau兩者之高反應性。表7A：與過磷酸化tau蛋白hpTau之反應性之ELISA分析之結果表7B：與磷酸化tau蛋白pTau之反應性之ELISA分析之結果 D.實例4：藉由SPR，結合親和性之分析

藉由表面電漿子共振（surface plasmon resonance，SPR）使用嵌合抗體Ta1505作為參考抗體，使具有展示於表3A中之VL與VH之組合之一些人類化抗體經受結合親和性分析。

將過磷酸化tau蛋白4R2N（hpTau：參見實例3）用作抗原蛋白質，及將由大腸桿菌（Escherichia coli ）產生之非磷酸化tau蛋白（Tau：His標記非磷酸化tau蛋白4R0N，ATGen Co. Ltd.，目錄號：ATGP0795）用作陰性對照。所使用抗原肽為單磷酸化tau肽（1×P），其中僅Ser413磷酸化；及三磷酸化tau肽（3×P），其中除Ser413以外，Ser409及Ser412進一步經磷酸化。此等肽之胺基酸序列展示於表8中。所使用陰性對照肽為非磷酸化tau肽（無P），其胺基酸序列亦展示於表8中。His標記非磷酸化tau蛋白質4R0N之胺基酸序列定義於SEQ ID NO: 74中。單磷酸化tau肽1×P、三磷酸化tau肽3×P及非磷酸化tau肽無P之胺基酸序列分別定義於SEQ ID NO: 75、76及77中。表8：SPR中使用之抗原肽

利用SPR系統Biacore T200（GE Healthcare Japan）根據附著於系統之評估使用手冊，來量測過磷酸化tau蛋白4R2N（hpTau）、非磷酸化tau蛋白4R0N、單磷酸化tau肽1×P、三磷酸化tau肽3×P及非磷酸化tau肽無P與各抗體的結合親和性。

藉由包含以下之方法來量測結合親和性：製備NTA感測器晶片（包含已固定氮基三乙酸（NTA）之羧甲基聚葡萄糖層，編碼號BR-1005-32）；藉由共價鍵，經由胺偶合反應使用胺偶合套組（GE Healthcare Japan，編碼號BR-1006-33），將與His標籤融合之上文所提及之各肽及展示於表8中之各抗原肽固定在感測器晶片上；及量測抗體針對固定蛋白質及肽的結合動力學。

使用HBS-N緩衝液（編碼號BR-1003-69）作為固定反應溶液，且使氯化鎳溶液與NTA感測器晶片反應以將Ni與NTA結合，來將His標記hpTau或Tau蛋白各自固定在感測器晶片上。隨後，利用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽（1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，EDC）與N-羥基丁二醯亞胺（NHS）之混合溶液來活化感測器晶片。將濃度利用4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）緩衝液（0.01 M HEPES，150 mM KCl，2 mM DTT，1 mM EDTA，pH 7.2）調整至100至500 ng/mL之各His標記蛋白質之溶液，塗覆於感測器晶片，從而經由與Ni-NTA之共價鍵將蛋白質固定在感測器晶片上。用乙醇胺阻斷殘餘活性NHS，且用EDTA溶液移除Ni離子（Ni親和性胺偶合：參見國際公開案第WO2005/022156號）。藉由用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺（EDC）鹽酸鹽與N-羥基丁二醯亞胺（NHS）之混合溶液活化NTA感測器晶片，且接著將用10 mM乙酸鈉緩衝液（pH：4至4.5）稀釋至1至10 µM之抗原肽溶液塗覆於感測器晶片，從而肽共價結合至感測器晶片，來將抗原肽（1×P、3×P及無P）各自固定在感測器晶片上。用乙醇胺阻斷殘餘活性NHS。因此，產生分別固定有上文提及之蛋白質及肽之感測器晶片。

在37℃下將CAPS緩衝液（pH 10.5）塗覆於此等感測器晶片，以使感測器晶片之蛋白質-或肽-固定表面穩定。對於一反應，在介於0.2至1 nM（所評估結合解離常數[KD]之周圍）範圍內之濃度下，將用HEPES緩衝液（pH 7.2）製備之作為特異性結合反應溶液之各抗體之溶液塗覆於感測器晶片表面150秒（相同評估中一致），且量測結合動力學。使用Biacore分析軟體（Biacore T200評估軟體，3.0版本）分析所得資料。

藉由自抗原蛋白質4R2N（hpTau）針對感測器晶片之結合動力學減去作為陰性對照之非磷酸化蛋白質4R0N針對感測器晶片之結合動力學，來校正各抗體的結合動力學。藉由自抗原肽1×P及3×P中之每一者之結合動力學減去作為陰性對照之非磷酸化肽無P針對感測器晶片之結合動力學，來校正各抗原肽的結合動力學。在進行量測之樣本濃度範圍內，未觀測到各抗體針對非磷酸化tau蛋白4R0N或非磷酸化肽無P的結合。

表9A展示人類化抗體針對磷酸化tau蛋白4R2N（hpTau）之結合活性。表9B展示人類化抗體針對單磷酸化tau肽1×P及三磷酸化tau肽3×P之結合活性的結果。結果表明，各人類化抗體呈現針對過磷酸化tau蛋白hpTau、單磷酸化tau肽1×P及三磷酸化tau肽3×P全部之高結合活性。表9A：人類化抗體針對磷酸化tau蛋白（hpTau）（1:1結合模型）之結合活性表9B：人類化抗體針對磷酸化肽（1×P、3×P）（1:1結合模型）之結合活性 E.實例5：AD患者大腦勻漿中之pSer413-Tau之結合親和性分析

在具有展示於表3A中之VL與VH之組合之人類化抗體中，使用小鼠抗體Ta1505及嵌合抗體作為參考抗體，評價在液相中L15H11、L46H11及L47H65針對來源於阿茲海默症（AD）患者臨床樣本之Ser413磷酸化tau蛋白（pSer413-Tau）的結合親和性。

使用N-羥基丁二醯亞胺-LC-生物素（NHS-LC-生物素）（Thermo Fisher Scientific K.K.）對人類化抗體、小鼠抗體及嵌合抗體各自進行生物素標記，隨後用PBS進行透析。

向0.8 mL TBS-I（Tris緩衝鹽水，蛋白酶抑制劑混合物，磷酸酶抑制劑混合物）中添加來自Braak階段V/VI下之AD患者大腦之冷凍海馬組織（160 mg），且在冰水中進行音波處理。在4℃下以3000×g離心音波處理溶液10分鐘，且採集上清液，且在4℃下以100000×g進一步超速離心15分鐘，獲得大腦勻漿。將Innotest pTau（pT181）套組（Fijirebio Inc.）用作Ser413磷酸化tau蛋白（pSer413-Tau）之ELISA系統，但用以上產生之生物素標記抗體替換包括於套組中之生物素標記抗體（標記為CONJ1）。

將以上產生之各生物素標記抗體製備為在0.1 nM濃度下之溶液，且與大腦勻漿之1000倍稀釋液一起，添加至HT7抗體固定MT盤（包括於套組中）。混合所得樣本，且在4℃下培育隔夜。在第二天，洗滌盤，且向盤中添加HRP標記抗生蛋白鏈菌素（作為CONJ2包括於套組中），隨後培育一小時。在洗滌之後，添加色彩試劑TMB，隨後在遮光下於室溫下培育30分鐘。接著，用反應終止溶液（作為停止溶液包括於套組中）來使反應停止，且量測在450 nm波長下之吸光度。

結果展示於圖4中。如圖4之曲線中所展示，人類化抗體L15H11、L46H11及L47H65所有均呈現針對來源於AD患者臨床樣本之Ser413磷酸化tau蛋白（pSer413-Tau）之高結合親和性。 F.實例6：血液中之動力學之測試

測試五個初始人類化抗體變體在正常小鼠中，與可商購的抗體賀癌平（Herceptin）（Genentech，加州南舊金山）及嵌合Ta1505抗體相比之藥物動力學。各人類化抗體變體之輕鏈及重鏈概述於下文表 10 中。表10.一些初始人類化抗體變體之輕鏈及重鏈

以10 mg/kg之劑量向11-週齡雄性C57BL/6J小鼠（Charles River Laboratories Japan, Inc.）中腹膜內注射抗體。自給藥1、3、8、24及72小時後採集之血液獲得血漿。樣本大小為2隻動物/抗體。

具有抗-人類IgG多株抗體之夾心ELISA用於測定血漿抗體濃度。藉由用小鼠血漿對各抗體之連續稀釋來繪製校準曲線。

以1,000之因子稀釋血漿，且量測抗體濃度。

將山羊抗-人類IgG（Fc）多株抗體之1 μg/mL PBS溶液吸入至96孔盤（MaxSorp（NUNC））中，且使其在4℃下靜置隔夜。接著，用3% BSA/PBS來實現阻斷，以製備具有固定山羊抗-人類IgG（Fc）多株抗體之盤。使用小鼠血漿來連續稀釋抗體，且獲得標準物質。用3% BSA/PBS稀釋血漿及標準物質，且以50微升/孔吸入至具有固定山羊抗-人類IgG（Fc）多株抗體之盤中。使混合物在室溫下反應1.5小時，且接著用TBS-T（TBS，0.05%吐溫20）洗滌盤。接著，以50微升/孔吸取藉由以2000之因子用3% BSA/PBS稀釋鹼性磷酸酶標記抗-人類IgG（H+L）多株抗體（Southern Biotech，目錄號2087-04）來製備之溶液，且使反應在室溫下進行1小時。接下來，用TBS-T洗滌盤，以100微升/孔添加著色試劑，且在室溫下培育盤1小時。其後，使用盤讀取器來量測在405 nm及550 nm下之吸光度。

用標準物質來繪製校準曲線，且將所述校準曲線用於計算血漿抗體濃度。結果展示於圖5A中。

相比於在注射直至3天後保持高且穩定之賀癌平及嵌合抗體之含量，所測試初始人類化變體（變體2、5、6、9及10）展示在投與後8小時血漿濃度快速降低。與嵌合抗體相比，此等初始人類化抗體呈現較短半衰期及較差PK特徵曲線，此可能可歸於此等變體之高π值。需要進一步改良以達到嵌合抗體之PK。

在具有展示於表3A中之VL與VH之組合之人類化抗體中，使L15H11、L46H11及L47H65經受血液中之動力學之測試。所使用參考抗體為AD治療之臨床試驗研究中使用之嵌合抗體Ta1505及已知人類化抗體，所述已知人類化抗體藉由重組表現基於專利資訊或資料庫資訊中揭示之胺基酸序列資訊來產生。特定言之，國際免疫遺傳學資訊系統資料庫（註冊商標）（IMGT）（http://www.imgt.org）供索拉珠單抗（Solanezumab）（抗Aβ抗體，Eli Lilly and Company）參考；WO2014/200921 A1中揭示之VH2Vk3之胺基酸序列用於IPN007（抗TauN端抗體，Bristol-Myers Squibb iPierian）；及WO2015/091656A1中揭示之VH32VL21之胺基酸序列用於MAb3221（抗Tau pS422抗體，Roche Diagnostics K.K.）。

在各自10 mg/kg濃度下，向11-週齡雄性C57BL/6J小鼠（Charles River Laboratories Japan, Inc.）腹膜內投與各抗體。在投與後1、3、8及24小時，且隨後在第3及第7天抽取血液，以收集血漿。重複三次測試各抗體（N=3）。

藉由夾心ELISA使用抗-人類多株抗體來量測血漿中之抗體之濃度。特定言之，向96孔盤（Max Sorp（NUNC））中添加含有1 µg/mL山羊抗-人類IgG（Fc）多株抗體（Southern Biotech）之PBS溶液，以在4℃下固定隔夜，隨後用3% BSA-PBS阻斷，從而產生山羊抗-人類IgG（Fc）多株抗體固定之盤。

分別地，藉由用取自未投與抗體之小鼠之血漿連續稀釋各抗體來製備一系列已知濃度的標準抗體樣本，且進行量測以用於製備校準曲線。

將待量測之血漿樣本及標準樣本各自稀釋10000倍，且以50微升/孔添加至山羊抗-人類IgG（Fc）多株抗體固定之盤，以在室溫下反應一小時30分鐘，且接著用TBS-T（Tris緩衝鹽水，0.05%吐溫20）洗滌盤。隨後，以50微升/孔向盤中添加用3% BSA-PBS稀釋2000倍之鹼性磷酸酶標記抗-人類IgG（H+L）多株抗體（Southern Biotech）之溶液，使其在室溫下反應一小時。在用TBS-T洗滌之後，以100微升/孔向盤中添加顯色溶液（1 mg/mL pNPP溶液），隨後在室溫下培育一小時。接著，用盤讀取器量測在405 nm量測波長及550 nm參考波長下之吸光度。基於標準樣本之量測結果製備校準曲線，且使用校準曲線來計算各血漿樣本中之抗體濃度。

圖5B為展示血漿中之抗體之濃度隨著時間推移改變的曲線。如自曲線顯而易見，人類化抗體L15H11（LC SEQ ID NO: 32，HC SEQ ID NO: 18）、L46H11（LC SEQ ID NO: 36，HC SEQ ID NO: 18）及L47H65（LC SEQ ID NO: 38，HC SEQ ID NO: 30）（所有均使用人類IgG1（SEQ ID NO: 135）與人類κ（SEQ ID NO: 79）展示與嵌合抗體Ta1505大體上相同的血液中的動力學。血液中之此等人類化抗體L15H11、L46H11及L47H65之動力學與已知人類化抗體IPN007及MAb3221之彼等動力學相當，且顯著地優於已知人類化抗體索拉珠單抗之彼等動力學。 G.實例7：腦內電子遷移之分析

進行分析具有經改良血漿藥物動力學之人類化變體之大腦濃度的研究。

在注射抗體1週後，自用親本小鼠抗體、嵌合抗體或人類化抗體變體（L15H11、L36H11、L46H11、L48H12、L48H47、L48H64、L47H65或L48H11）注射之小鼠採集血液。接下來，用3-麻醉混合物使動物麻醉，剖腹且經由腹主動脈放血。接著，採集大腦組織。將此採集大腦組織分成左半球及右半球，在乾冰/乙醇上冷凍，且儲存在-80℃下。對各冷凍半球進行稱重，且轉移至2 mL管。接著，添加0.8 mL TBS-I（Tris緩衝鹽水，蛋白酶抑制劑混合物及磷酸酶抑制劑混合物），且在冰水中音波處理混合物。在3000×g及4℃下離心音波處理混合物10分鐘，且採集上清液。在100,000×g及4℃下進一步離心上清液15分鐘，獲得大腦勻漿。

將山羊抗-人類IgG（Fc）多株抗體之10 μg/mL PBS溶液吸入至96孔盤（MaxSorp（NUNC））中，且使其在4℃下靜置隔夜。接著，用3% BSA/PBS來實現阻斷，以製備具有固定山羊抗-人類IgG（Fc）多株抗體之盤。使用獲自未注射有抗體之小鼠之大腦勻漿來連續稀釋抗體，且獲得標準物質。

以10之因子稀釋大腦勻漿及標準物質，且以50微升/孔吸入至具有固定山羊抗-人類IgG（Fc）多株抗體之盤中。使混合物在室溫下反應2小時，且接著用TBS-T（TBS，0.025%吐溫20）洗滌盤。接著，以50微升/孔吸取藉由以2000之因子用3% BSA/PBS稀釋鹼性磷酸酶標記抗-人類IgG（H+L）多株抗體（Sigma，目錄號SAB3701337-1MG）來製備之溶液，且使反應在室溫下進行1小時。接下來，用TBS-T洗滌盤，以100微升/孔添加著色試劑pNPP（Sigma，目錄號P7998），且在室溫下培育盤1小時。其後，使用盤讀取器來量測在405 nm及550 nm下之吸光度。

用標準物質繪製校準曲線，且使用所述校準曲線來計算大腦勻漿中之抗體濃度。測定抗體濃度/大腦體重（完全大腦體積），且計算與血漿濃度之比率。

圖 6A 表明，具有良好藥物動力學之人類化抗體變體（例如，根據圖5B之L15H11、L46H11及L47H65）在大腦中具有經改良濃度。

使用AD治療之臨床試驗研究中使用之嵌合抗體Ta1505及已知人類化抗體索拉珠單抗、IPN007及MAb3221作為參考抗體，分析人類化抗體L15H11、L46H11及L47H65中之每一者的腦內電子遷移。

在實例6中，在投與各抗體一週之後，自小鼠抽取血液，所述小鼠接著在利用三個類型之混合麻醉劑之麻醉下經受開腹術。在死於自腹部腔靜脈放血之後，採集大腦組織。將所採集大腦組織分成右半球及左半球，將其冷凍在乾冰乙醇中且儲存在80℃下。對各冷凍半球進行稱重，且轉移至2 mL管，向所述管中添加0.8 mL TBS-I（Tris緩衝鹽水，蛋白酶抑制劑混合物及磷酸酶抑制劑混合物）。接著，在冰水中音波處理各半球。在4℃下以3000×g離心音波處理溶液10分鐘，且採集上清液，且在4℃下以100000×g進一步超速離心15分鐘，獲得大腦勻漿。

藉由抗原ELISA使用抗-人類多株抗體來量測大腦勻漿中之抗體含量。特定言之，向96孔盤（Max Sorp（NUNC））中添加含有10 µg/mL山羊抗-人類IgG Fc之PBS溶液，以在4℃下固定隔夜，隨後用3% BSA-PBS阻斷，從而產生固定之盤。

分別地，藉由用取自未投與抗體之小鼠之大腦勻漿連續稀釋各抗體來製備一系列已知濃度之抗體標準樣本，且進行量測，以用於製備校準曲線。

用0.1%脫脂奶-3% BSA-PBS對待量測之大腦勻漿及標準樣本各自稀釋10倍，且以50微升/孔添加至PD17(P)-固定之盤，以在室溫下反應2小時。接著，用TBS-T（TBS，0.05%吐溫20）洗滌盤。隨後，以50微升/孔向盤中添加用0.1%脫脂奶-3% BSA-PBS稀釋2000倍之鹼性磷酸酶標記抗-人類IgG（H+L）多株抗體（Sigma-Aldrich Co. LLC.，目錄號SAB3701337，1 mg）之溶液，使其在室溫下反應一小時。在用TBS-T洗滌盤之後，以100微升/孔添加pNPP（Sigma-Aldrich Co. LLC.，目錄號P7998，100 mL）作為顯色受質，隨後在室溫下培育一小時。接著，用盤讀取器量測在405 nm量測波長及550 nm參考波長下之吸光度。基於標準樣本之量測結果製備校準曲線，且使用校準曲線測定各大腦勻漿樣本中之抗體含量，且評估為大腦中之抗體含量。

另外，使用在開腹術之前以與實例6中相同之方式採集之血液來測定血漿中之抗體含量，且計算大腦中之抗體含量與血漿中之抗體含量的比率。

圖6B為展示大腦中之各抗體之含量與血漿中之對應抗體之含量的比率的曲線。相比於嵌合抗體Ta1505及已知人類化抗體IPN007、MAb3221及索拉珠單抗之彼等比率，人類化抗體L15H11、L46H11及L47H65之大腦中之抗體濃度與血漿中之抗體濃度的比率較高。結果指示，此等人類化抗體具有至大腦之高電子遷移。H.實例 8 ：選擇性人類化抗體之進一步發展

將其他突變引入至VL46之CDR1序列，以移除去醯胺熱點及/或將CDR序列恢復至親本小鼠序列。表 11 概述引入至VL46 CDR1之突變。表 11 . VL46 CDR1 中引入之突變

另外，以新產生之人類化抗體變體測試包含IgG1及具有S228P突變之IgG4之不同IgG同型。表 12 概述新產生之人類化抗體變體與親本小鼠抗體及嵌合抗體一起之輕鏈及重鏈。表 12 . 特定抗體 之輕鏈及重鏈 I.實例9：新產生之人類化抗體變體之Biacore^TM 結合分析

使用Biacore^TM T200及4000生物感測器（GE Healthcare，伊利諾斯州芝加哥）來量測新產生之人類化抗體變體之結合親和性。除非下文另外指出，否則以下操作緩衝液用於固定、樣本稀釋及資料採集：10 mM HEPES（GE Healthcare，BR100671），150 mM NaCl（GE Healthcare，BR100671），0.05% v/v界面活性劑P20（GE Healthcare，BR100671），2 mM DTT（Sigma，10708984001，密蘇里州聖路易斯）及1 mM EDTA（GE Healthcare，28995043）。

固定之蛋白質係指固定在晶片上之重組人類磷酸化Tau蛋白質；固定之1×P肽係指固定在晶片上之磷酸化肽（TSPRHLSNVS(pS)TGSIDMVDSPC，SEQ ID NO: 75）。此等兩種方法均具有親和性量測之親合力分量。4×P肽分析物具有晶片上捕獲之抗體及溶液中之4×磷酸化肽（GAEIVYK(pS)PVVSGDT(pS)PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD(pS)PQLATLADEVSASLAKQGL，SEQ ID NO: 78）。

使用S感測器晶片NTA系列（GE Healthcare，BR100034）來量測結合至固定、磷酸化Tau蛋白之抗體。用於固定之操作緩衝液為10 mM HEPES，150 mM NaCl₂ ，0.05% v/v界面活性劑P20，pH 7.4（GE Healthcare，BR100671），且流動速率為10微升/分鐘。注射350 mM EDTA 1分鐘以清潔晶片，隨後注射0.5 mM NiCl₂ （GE Healthcare，NTA試劑套組）2分鐘以製備捕獲his標記蛋白質之晶片。根據製造商說明書使用胺偶合套組（GE Healthcare，BR100633）來活化晶片，接著注射300 nM磷酸化Tau蛋白（80AWB）直至已固定所需量之蛋白質為止。用來自胺偶合套組之乙醇胺阻斷晶片。各實驗使用多個固定磷酸化Tau蛋白含量。最低含量在54個共振單位（resonance unit，RU）至452 RU至間變化，且最高含量在463 RU至1020 RU間變化。為了量測結合至固定磷酸化Tau蛋白之Ta1505抗體之親和性，製備5員、3倍稀釋系列之各抗體，產生0.37 nM至30 nM之濃度。以45微升/分鐘之流動速率注射各濃度及若干緩衝液空白3分鐘。監測抗體之解離15分鐘，接著利用30秒至1分鐘之100 mM CAPS（Sigma，C6070）、1 M KCl（Sigma，P9541）、1 mM EDTA、2 mM DTT、pH 10.5之注射液，來再生表面。

使用S感測器晶片CM3系列（GE Healthcare，BR100536）來量測結合至固定、磷酸化Tau肽的抗體。使用胺偶合套組來活化晶片，接著注射pH 5.0含30 μg/mL磷酸化Tau肽（SEQ ID NO: 75）之10 mM乙酸鈉，直至已固定51 RU為止。用乙醇胺阻斷晶片。類似地使用非磷酸化Tau肽（TSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPC，SEQ ID NO: 77）來製備陰性對照參考表面。為了量測結合至固定磷酸化Tau肽之Ta1505抗體之親和性，製備5員、3倍稀釋系列之各抗體，產生0.37 nM至30 nM之濃度。以45微升/分鐘之流動速率注射各濃度及若干緩衝液空白3分鐘。監測抗體之解離15分鐘。用30秒之100 mM鹽酸（Fisher Scientific，SA56-1，馬薩諸塞州沃爾瑟姆）之注射液來再生表面。

使用S感測器晶片CM5系列（GE Healthcare，29149603）來量測結合至固定抗體之磷酸化Tau肽。使用胺偶合套組來活化晶片，接著注射pH 5.0含1至3 μg/ml抗體之10 mM乙酸鈉（Ge Healthcare，BR100351），直至已固定280至9100 RU抗體為止。用乙醇胺阻斷晶片。為了量測結合至固定Ta1505抗體之磷酸化Tau肽（SEQ ID NO: 78）之親和性，製備6員、2.5倍稀釋系列之肽，產生5.1 nM至500 nM之濃度。以30至50微升/分鐘注射樣本及若干緩衝液空白3分鐘，且監測解離15分鐘。用30秒之未調整pH 4.5或用鹽酸將pH調整至3.5之20 mM乙酸鈉之注射液來再生表面。

使用Biacore^TM T200評估軟體2.0版本或Biacore^TM 4000評估軟體1.1版本（GE Healthcare）來對資料進行處理及擬合。藉由自陰性對照流槽減去反應且自緩衝注射液減去反應或兩個緩衝注射液之平均反應來「雙參考」資料。接著，用「1:1結合」模型來對資料進行擬合，以測定結合速率常數k_a （M^- ¹ s^- ¹ ，其中「M」等於莫耳且「s」等於秒）及解離速率常數k_d （s^- ¹ ）。使用此等速率常數來計算平衡解離常數K_D （M）= k_d /k_a 。表 13 概述與親本小鼠抗體及嵌合抗體之彼等相比，新產生之人類化抗體變體之K_D 值。表 13 . 抗體針對磷酸化 Tau 蛋白或肽之 K_D （ nM ）值 J.實例10：親本小鼠抗體、嵌合抗體及一些人類化抗體變體之ELISA結合分析

藉由ELISA，分析親本小鼠抗體、嵌合抗體及新產生之人類化抗體變體針對磷酸化肽（PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD，SEQ ID NO: 79）及對應非磷酸化肽（PRHLSNVSTGSIDMVD，SEQ ID NO: 80）的結合。

向ELISA盤之各孔中添加五十微升含1 μg/ml磷酸化或非磷酸化肽之PBS，且在4℃下培育盤隔夜。在第二天，洗滌盤3次，且在4℃下用200 μL超阻斷（superblock）阻斷隔夜。在第三天，洗滌盤3次。接著，向盤之各孔中添加開始於10 μg/mL之50 μL呈1:3連續稀釋之含抗體之ELISA緩衝液，在室溫下培育1小時，接著洗滌3次。添加五十微升山羊抗小鼠HRP（Southern Biotech，1030-05）之1:3000稀釋液，以量測親本小鼠抗體。添加五十微升山羊抗-人類HRP（Jackson Immunologics，109-036-098）之1:3000稀釋液，以量測嵌合抗體及人類化抗體。在室溫下培育ELISA盤45分鐘，洗滌3次，接著在室溫下用ABTS顯影5分鐘。其後，使用盤讀取器來量測405 nm下之吸光度。

圖 8A 及圖 8B 展示藉由融合瘤或重組方法產生之親本抗體結合至磷酸化肽（圖 8A ）但不結合至非磷酸化肽（圖 8B ）。類似地，嵌合抗體（具有IgG1或IgG4主鏈）結合至磷酸化肽（圖 8C ）但不結合至非磷酸化肽（圖 8D ）。

圖 9A 至圖 9C 表明，大部分新產生之人類化抗體變體以與嵌合IgG4抗體相當之親和性結合至磷酸化肽，而若干變體失去針對磷酸化肽之結合親和性。特定言之，在圖 9B 中，模擬胺基酸N33至D之完全去醯胺之huVL46/VH11_N33D_IgG4變體已極大地降低與磷酸化肽之結合，表明完全去醯胺抗體將大大失去其針對磷酸化Tau蛋白的結合親和性。因此，減少人類化抗體變體中N33處之去醯胺為必要的。K.實例11：阿茲海默症患者大腦勻漿中之新產生之人類化抗體變體之抗原結合分析

在液相中，評價親本小鼠抗體、嵌合抗體及所選擇人類化抗體變體之其針對來源於阿茲海默症（AD）患者臨床樣本之Ser413磷酸化Tau蛋白（pSer413-Tau）的結合效能。

如圖 10A 至圖 10E 中所描述，藉由在分別用增加濃度之對照人類IgG（Sigma，目錄號I2511）及所選擇抗體變體培育AD大腦樣本之後，使用小鼠生物素標記Ta1505 IgG2a抗體所偵測之總體及游離抗原結合之間的差異，來測定pSer413-Tau上的抗體佔有率。

用相同小鼠生物素標記Ta1505 IgG2a抗體之偵測允許直接比較抗體變體之間的結合效能。使用N-羥基丁二醯亞胺-LC-生物素（NHS-LC-生物素）（Thermo Fisher Scientific K.K.）來對小鼠Ta1505 IgG2a抗體進行生物素標記，隨後用PBS進行透析。

向含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物（Thermo Fisher Scientific，目錄號1861281）之1 mL TBS-I（Tris緩衝鹽水，目錄號BP2471-1，Thermo Fisher Scientific）中，添加來自AD患者大腦之冷凍前額皮層組織（100 mg），且使用Qiagen Tissue Lyzer II在冰水上將所述冷凍前額皮層組織裂解。在Beckman Coulter Optima Max-XP超離心機中於4℃下以27,000g（TLA-55 rotor）離心均質化樣本20分鐘，且採集上清液，且在Beckman Coulter Optima Max-XP超離心機中於4℃下以150,000×g（TLA-55 rotor）進一步離心20分鐘，獲得稱為P2級分的離心塊。藉由音波處理，將P2級分再懸浮於均質化緩衝液TBS-I中。使用Pierce™BCA蛋白質分析套組（Thermo Fisher Scientific，目錄號23225）根據製造商說明書來測定P2級分之蛋白質濃度。將蛋白濃度調整至4 µg/mL。

將INNOTEST^® pTau（pT181）套組（Fijirebio Inc.，目錄號81581）用作Ser413磷酸化Tau蛋白（pSer413-Tau）之ELISA系統，但用以上製造之生物素標記小鼠Ta1505 IgG2a抗體替換包括於套組中的生物素標記抗體（標記為CONJ1）。

在樣本稀釋緩衝液（由INNOTEST^® 套組提供）中，自儲備液將親本小鼠抗體、嵌合抗體、人類化抗體變體或對照人類IgG稀釋至200 nM。接著，將抗體溶液進行連續稀釋，且與先前以1/1000稀釋之AD大腦P2級分一起在分析盤中在室溫下培育4小時。接著，向固定HT7抗體之MT盤（包括於套組中）中添加抗體-抗原混合物以及經稀釋生物素標記抗體小鼠Ta1505 IgG2a（1/10於CONJ DIL 1中，由INNOTEST^® 套組提供）。混合所得樣本，且在4℃下培育隔夜。在第二天，洗滌盤，且向盤中添加HRP標記抗生蛋白鏈菌素（作為CONJ2包括於套組中），隨後培育一小時。在洗滌之後，添加色彩試劑TMB，隨後在遮光下於室溫下培育30分鐘。接著，用反應終止溶液（作為停止溶液包括於套組中）來使反應停止，且量測在450 nm波長下之吸光度。

圖 10A 至圖 10E 中所說明之濃度反應曲線之非線性分析，允許測定AD大腦勻漿中Tau pSer413 50%佔有率所需之各抗體的濃度，以及各抗體最大佔有率含量的百分比。圖 10A 至圖 10E 表明親本小鼠抗體、嵌合抗體及所選擇人類化抗體變體在AD患者大腦勻漿中相當的結合特徵，包含pSer413 Tau抗原之活體外佔有量及最大結合。 L.實例12：新產生之人類化抗體變體之穩定性及純度分析

藉由經由nano-DSF量測解鏈溫度（Tm1）及聚集溫度（Tagg）來測定各種抗體之穩定性。藉由SEC及非還原性毛細管SDS（NR-cSDS）來量測各抗體之純度。

Tm 及 Tagg 之測定 ：藉由nano-DSF使用由PR.ThermControl 2.0.4版本軟體控制之Prometheus NT.48差示掃描螢光計（Nanotemper Technologies）來測定Tm及Tagg。激勵功率為40%，且以1℃/min之速率使溫度自20℃增加至95℃。自動地量測Tm及Tagg。藉由在20 mM乙酸鈉pH 5.5緩衝液中稀釋至1 mg/mL來製備樣本，且藉由毛細作用抽吸至Prometheus玻璃毛細管（PR-L002）中。

藉由 SEC ，純度之測定 ：在UPLC H類系統上進行SEC。所使用管柱為來自Waters（馬薩諸塞州米爾福德）之ACQUITY UPLC蛋白質BEH SEC管柱（部件號186005225，1.7 µm，200A，4.6 mm × 150 mm）。管柱溫度為25℃，且使用0.5 mL/min之系統流動速率注射在1 mg/mL下之10 µL樣本。移動相為100 mM磷酸鈉，200 mM氯化鈉及0.02%疊氮化鈉，pH 7.0。在214及280 nm兩者下定量資料，且使用Empower 3軟體進行分析。以10 µg注射來自Waters（馬薩諸塞州米爾福德）之BEH200 SEC蛋白質標準混合物（部件號186006518），且量測USP解析度、理論盤及加尾。

藉由 NR - cSDS ， 純度之測定 ：為了藉由NR-cSDS評定純度，在96孔盤中，將在1 mg/mL下之5 µL各樣本與含有50 mM碘乙醯胺之35 µL上樣緩衝液（HT蛋白質表現樣本緩衝液（Perkin Elmer））混合。在70℃下培育盤20分鐘，且向各孔中添加75 µL水。在LabChip GXII系統（Perkin Elmer）上使用HT蛋白質表現晶片（Perkin Elmer）來分析各樣本。藉由量測隨著時間推移之樣本之螢光來採集電泳圖，且使用LabChip GX軟體4.1.1619.0 SP1版本（Perkin Elmer）來進行整合。

表 14 概述所測試抗體之穩定性及純度。表 14 . 各種抗體之穩定性及純度

相比於親本小鼠抗體或嵌合抗體，所有新產生人類化抗體變體均維持或改良穩定性及純度。一些初始人類化變體huVL47/VH65 _IgG1突出為具有降低的穩定性，如藉由Tm1/Tagg所量測。M.實例13：新產生之人類化抗體變體之去醯胺分析

測定各種抗體之輕鏈CDR1中之胺基酸N33之去醯胺含量測試脅迫條件，諸如50℃或pH 10培育。進行4℃培育作為對照。

4 ℃ 及 50 ℃ 培育：將在20 mM乙酸鈉pH 5.5中調配之在2 mg/ml下之樣本保持在溫度控制穩定性腔室中於50℃下一週。對於4℃對照，將樣本保持在4℃下，以用於比較目的。

pH 10 培育：使用0.5 M NaOH將在20 mM乙酸鈉pH 5.5中調配之在2 mg/mL下之樣本調整至pH 10，且保持在溫度控制穩定性腔室中於25℃下一週。之後，接著使用Zeba旋轉去鹽管柱（7K MWCO，Thermo Fisher，2mL，89890），將樣本交換至20 mM乙酸鈉pH 5.5緩衝液中。

藉由肽定位 ， 去醯胺分析 ：對於藉由質譜分析之肽定位，用30 µL 8 M胍/1 M 鹽酸Tris溶液（15:1）使100 µg各樣本變性，在60℃下用2 µL 1 M DTT還原30分鐘，且在暗處用5 µL 1 M碘乙醯胺烷基化45分鐘。在消化之前，使用7千道爾頓分子量截止ZEBA盒，將樣本緩衝交換至50 mM碳酸氫銨中。將樣本分成不同管，且在37℃下用2 µg胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶平行消化2小時。藉由向各樣本中添加3 µL 5 M鹽酸鹽來淬滅消化。在維持於40℃下之肽BEH-C18-1×50 mm Waters UPLC管柱（部件號186005592）上注射2 µL樣本。使用2%至36%乙腈/0.1%甲酸、50 min內之線性梯度，在Dionex/QE plus MS中獲取資料。使用用於資料庫檢索之PEAKS DB（Bioinformatics Solutions Inc.）以及PepFinder（Thermo Fisher Scientific）來分析樣本，且人工校驗評定變化百分比。表 15 概述所測試抗體之輕鏈CDR1中之胺基酸N33之去醯胺百分比。表 15 . 在各種條件下 ，輕鏈 CDR1 中之 N33 之去醯胺百分比

相比於親本小鼠抗體及初始人類化變體（VL46/VH11）IgG1或IgG4抗體，新產生之人類化抗體變體呈現輕鏈CDR1中之N33之去醯胺含量顯著減少。

可當結合隨附圖式閱讀時的以下詳細描述來最佳理解本發明。圖式中所包含為以下諸圖：圖 1A 及圖 1B 集合地展示使用ClustalW製備之Tau蛋白之各種人類同功異型物的比對。圖 2A 展示根據Kabat編號系統，根據本發明之一些實施例之若干抗pS413-Tau結合蛋白之輕鏈可變區序列突顯CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列之比對。圖 2B 展示根據Kabat編號系統，根據本發明之一些實施例之若干抗pS413-Tau結合蛋白之重鏈可變區序列突顯CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列之比對。圖 3 說明根據本發明之一些實施例，相對於非磷酸化肽PD17，若干抗pS413-Tau抗體針對磷酸化肽PD17P之選擇結合親和性。圖 4 說明根據本發明之一些實施例之若干抗pS413-Tau抗體針對來自阿茲海默氏症患者之大腦勻漿中之磷酸化Tau的結合親和性。圖 5A 及圖 5B 展示人類化抗體變體在小鼠血漿中隨著時間推移之藥物動力學。圖 5A 表明來自小鼠血漿之呈現快速消除的五個初始人類化抗體變體2、5、6、9及10。圖 5B 表明呈現與嵌合抗體相當之藥物動力學曲線之三個稍後發展人類化抗體變體L15H11、L46H11及L47H65。圖 6A 及圖 6B 展示不同人類化抗體變體具有不同腦內電子遷移。圖 6A 展示大腦勻漿中之各種人類化抗體之濃度。圖 6B 展示大腦中之代表性人類化抗體之含量與血漿中之對應抗體之含量的比率。圖 7A 及圖 7B 展示代表性人類化抗體變體之輕鏈可變區（圖 7A ）及重鏈可變區（圖 7B ）之胺基酸序列與親本小鼠抗體之胺基酸序列的比對。圖 8A 至圖 8D 表明親本小鼠抗體（圖 8A 及圖 8B ）及嵌合抗體（圖 8C 及 8D ）結合至磷酸化肽（圖 8A 及 8C ）但不結合至非磷酸化對應物（圖 8B 及 8D ）。圖 9A 至圖 9C 展示代表性人類化抗體變體結合至pS413肽。圖 10A 至圖 10E 展示親本小鼠抗體（圖 10A ）、嵌合抗體（圖 10B ）及所選擇人類化抗體變體（圖 10C 至圖 10E ）針對來自阿茲海默症患者之大腦勻漿中之S413磷酸化Tau蛋白之相當的結合特徵。圖 11A 至圖 11E 展示本發明之抗pSer413 tau蛋白人類化抗體中之一些之可變重鏈及可變輕鏈區。圖 12A 至圖 12C 展示用於抗pSer413 tau抗體之可變重鏈與可變輕鏈之組合之多種不同人類IgG恆定域。「Human_IgG1 _ 」為人類野生型IgG1之恆定域（CH1-鉸鏈-CH2-CH3）。「Human_IgG1_L234A_L235A」為具有兩個胺基酸取代L234A及L235A（有時稱為「LALA」突變）之人類野生型IgG1之恆定域（CH1-鉸鏈-CH2-CH3），所述兩個胺基酸取代降低/去除效應功能。「Human_IgG1_ _L234A_L235A_D265S」為具有三個胺基酸取代L234A、L235A及D265S之人類野生型IgG1之恆定域（CH1-鉸鏈-CH2-CH3），所述三個胺基酸取代降低/去除效應功能。「Human_IgG1_YTE_ 」或「人類IgG1_YTE（M252Y_S254T_T256E）」為具有三個胺基酸取代M252Y、S254T、T256E之人類野生型IgG1之恆定域（CH1-鉸鏈-CH2-CH3），所述三個胺基酸取代增加抗體在血清中的半衰期。「Human_IgG1_N297A_ 」為具有胺基酸取代N297A之人類野生型IgG1之恆定域（CH1-鉸鏈-CH2-CH3），所述胺基酸取代消除糖基化位點且降低/去除效應功能。「Human_IgG1_N297Q_ 」為具有胺基酸取代N297Q之人類野生型IgG1之恆定域（CH1-鉸鏈-CH2-CH3），所述胺基酸取代消除糖基化位點且降低/去除效應功能。「_Human_IgG2」為人類野生型IgG2之恆定域（CH1-鉸鏈-CH2-CH3）。「_Human_IgG4」為人類野生型IgG4之恆定域（CH1-鉸鏈-CH2-CH3）。「Human_IgG4_S228P_」為具有防止臂切換之胺基酸取代S228P之人類野生型IgG4之恆定域（CH1-鉸鏈-CH2-CH3）圖 13A 至圖 13E 展示結合圖 12 之主鏈之H11及H65可變區之全長重鏈。「斜線」（「/」）指示可變域與恆定域之接合點，且對CDR加底線。圖 14A 至圖 14D 展示具有人類κ或λ輕鏈恆定域之12個不同可變輕鏈域之全長輕鏈。「斜線」（「/」）指示可變域與恆定域之接合點，且對CDR加底線。圖 15 描述本發明之重鏈與輕鏈之可能組合之表格。方框中之「A」指示使用重鏈恆定域「Human_IgG1 _ 」。方框中之「B」指示使用重鏈恆定域「Human_IgG1_L234A_L235A」。方框中之「C」指示使用重鏈恆定域「Human_IgG1_ _L234A_L235A_D265S」。方框中之「D」意謂使用重鏈恆定域「Human_IgG1_YTE_ 」。方框中之「E」意謂使用重鏈恆定域「Human_IgG1_N297A_ 」。方框中之「F」意謂使用重鏈恆定域「Human_IgG1_N297Q_ 」。方框中之「G」意謂使用重鏈恆定域「_Human_IgG2」。方框中之「H」意謂使用重鏈恆定域「_Human_IgG4」。方框中之「I」意謂使用重鏈恆定域「Human_IgG4_S228P_」。方框中之「J」意謂使用具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代之人類IgG1恆定域。

Claims

一種人類化抗體或其片段或衍生物，其與至少在對應於SEQ ID NO: 1之Ser413之胺基酸殘基上磷酸化之tau蛋白或tau肽產生抗原-抗體反應。
如申請專利範圍第1項所述的人類化抗體或其片段或衍生物，其針對tau蛋白或tau肽具有1.86 × 10^- ⁸ M或更低之平衡解離常數。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的人類化抗體或其片段或衍生物，其相比於非磷酸化之tau蛋白或tau肽，與磷酸化之tau蛋白或tau肽具有經改良選擇親和性。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的人類化抗體或其片段或衍生物，當投與至血液中時其具有進入大腦之經改良能力。
如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的人類化抗體或其片段或衍生物，包括：作為可變重鏈互補決定區（vhCDR）vhCDR1序列，與序列1M具有80%或更多同源性之胺基酸序列；作為vhCDR2序列，與序列2M或2H1具有84%或更多同源性之胺基酸序列；作為vhCDR3序列，與序列3M具有80%或更多同源性之胺基酸序列；作為vlCDR1序列，與序列4L1或4M具有87%或更多同源性之胺基酸序列；作為vlCDR2序列，與序列5M具有85%或更多同源性之胺基酸序列；以及作為vlCDR3序列，與序列6M具有77%或更多同源性之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的人類化抗體或其片段或衍生物，包括：作為vhCDR1序列，序列1M之胺基酸序列；作為vhCDR2序列，序列2H1之胺基酸序列或與序列2H1之不同之處在於位置15處之Ala經Asp取代之胺基酸序列；作為vhCDR3序列，序列3M之胺基酸序列；作為vlCDR1序列，序列4L1之胺基酸序列或與序列4L1之不同之處在於位置5處之Ser經Asn取代之胺基酸序列；作為vlCDR2序列，序列5M之胺基酸序列；以及作為vlCDR3序列，序列6M之胺基酸序列。
如申請專利範圍第5項或第6項之人類化抗體或其片段或衍生物，包括：（a）作為vhCDR1序列，1M之胺基酸序列；作為vhCDR2序列，2H1之胺基酸序列；作為vhCDR3序列，3M之胺基酸序列；作為vlCDR1序列，4L1之胺基酸序列；作為vlCDR2序列，5M之胺基酸序列；及作為vlCDR3序列，6M之胺基酸序列，或（b）作為vhCDR1序列，1M之胺基酸序列；作為vhCDR2序列，2H1之胺基酸序列；作為vhCDR3序列，3M之胺基酸序列；作為vlCDR1序列，4M之胺基酸序列；作為vlCDR2序列，5M之胺基酸序列；及作為vlCDR3序列，6M之胺基酸序列，或（c）作為vhCDR1序列，1M之胺基酸序列；作為vhCDR2序列，2M之胺基酸序列；作為vhCDR3序列，3M之胺基酸序列；作為vlCDR1序列，4M之胺基酸序列；作為vlCDR2序列，5M之胺基酸序列；及作為vlCDR3序列，6M之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的人類化抗體或其片段或衍生物，包括：作為重鏈可變區，與選自以下序列之序列具有90%或更多同源性之胺基酸序列：VH11、VH12、VH47、VH61、VH62、VH64及VH65；及作為輕鏈可變區，與選自以下序列之序列具有90%或更多同源性之胺基酸序列：VL15、VL36、VL46、VL47、VL48及VL50。
如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的人類化抗體或其片段或衍生物，包括：作為重鏈可變區，序列VH65之胺基酸序列或與序列VH65之不同之處在於包括選自由以下組成之群的一或多個取代的胺基酸序列：位置28（Kabat編號：H28）處之Ala經Thr取代，位置30（Kabat編號：H30）處之Asn經Ser取代，位置49（Kabat編號：H49）處之Val經Gly取代，位置64（Kabat編號：H61）處之Ala經Asp取代，及位置78（Kabat編號：H75）處之Gln經Lys取代；及作為輕鏈可變區，序列VL47之胺基酸序列或與序列VL47之不同之處在於包括選自由以下組成之群之一或多個取代的胺基酸序列：位置17（Kabat編號：L17）處之Asp經Glu取代，位置28（Kabat編號：L27A）處之Ser經Asn取代，位置42（Kabat編號：L37）處之Gln經Leu取代，位置50（Kabat編號：L45）處之Gln經Arg取代，及位置51（Kabat編號：L46）處之Arg經Leu取代。
如申請專利範圍第8項或第9項之人類化抗體或其片段或衍生物，包括以下序列組合中之任一者：（a）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL15；（b）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL36；（c）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL46；（d）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL47；（e）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL48；（f）作為重鏈可變區之序列VH11及作為輕鏈可變區之序列VL50；（g）作為重鏈可變區之序列VH12及作為輕鏈可變區之序列VL48；（h）作為重鏈可變區之序列VH47及作為輕鏈可變區之序列VL48；（i）作為重鏈可變區之序列VH61及作為輕鏈可變區之序列VL48；（j）作為重鏈可變區之序列VH62及作為輕鏈可變區之序列VL48；（k）作為重鏈可變區之序列VH64及作為輕鏈可變區之序列VL47；（l）作為重鏈可變區之序列VH64及序列VL48；（m）作為重鏈可變區之序列VH65及序列VL47。
一種用於治療或預防癡呆之藥劑，包括如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的人類化抗體或其片段或衍生物。
如申請專利範圍第11項所述的用於治療或預防癡呆之藥劑，其中所述癡呆為tau蛋白病。
如申請專利範圍第11項所述的用於治療或預防癡呆之藥劑，其中所述tau蛋白病為阿茲海默症（Alzheimer's disease）、皮質基底核退化症、進行性核上麻痹、皮克氏疾病（Pick's disease）、嗜銀粒性癡呆（嗜銀粒性疾病）、伴隨早老性癡呆之多發性系統tau蛋白病（multiple system tauopathy with presenile dementia，MSTD）、額顳葉型癡呆及與染色體17（FTDP-17）相關之帕金森氏症（parkinsonism）、伴隨神經原纖維纏結之癡呆、伴隨鈣化之擴散性神經原纖維纏結（diffuse neurofibrillary tangle with calcification，DNTC）、伴隨球狀膠質夾雜物之白質tau蛋白病（white matter tauopathy with globular glial inclusions，WMT-GGI）或伴隨tau病變之額顳葉型葉退化（frontotemporal lobar degeneration with tau pathology，FTLD-tau）。
一種醫藥組合物，包括如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的人類化抗體或其片段或衍生物及醫藥學上可接受之載劑。
一種核酸分子，編碼如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的人類化抗體或其片段或衍生物之蛋白質。
一種載體或質體，包括如申請專利範圍第15項所述的核酸分子。
一種宿主細胞，用如申請專利範圍第15項所述的核酸分子或如申請專利範圍第16項所述的載體或質體轉化。
如申請專利範圍第17項所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞為細菌細胞或選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞及植物細胞之真核細胞。
一種用於生產如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的人類化抗體或其片段或衍生物之方法，包括在適合於生產所述人類化抗體或其片段或衍生物之條件下培養如申請專利範圍第17項或第18項所述的宿主細胞。
如申請專利範圍第19項所述的方法，進一步包括自所述宿主細胞分離所述人類化抗體或其片段或衍生物。
一種抗pSer413 tau抗體，包括： a）重鏈可變域，包括含SEQ ID NO: 86之vhCDR1、含SEQ ID NO: 115之vhCDR2及含SEQ ID NO: 88之vhCDR3；及 b）輕鏈可變域，包括選自由以下組成之群之一組vlCDR： i）包括SEQ ID NO: 102之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； ii）包括SEQ ID NO: 91之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； iii）包括SEQ ID NO: 92之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； iv）包括SEQ ID NO: 93之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； v）包括SEQ ID NO: 94之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； vi）包括SEQ ID NO: 95之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； vii）包括SEQ ID NO: 96之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； viii）包括SEQ ID NO: 97之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； ix）包括SEQ ID NO: 98之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； x）包括SEQ ID NO: 99之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； xi）包括SEQ ID NO: 100之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；及 xii）包括SEQ ID NO: 101之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3。
一種抗pSer413 tau抗體，包括： a）重鏈可變域，包括含SEQ ID NO: 86之vhCDR1、含SEQ ID NO: 115之vhCDR2及含SEQ ID NO:88之vhCDR3；及 b）輕鏈可變域，包括選自由以下組成之群之一組vlCDR： i）包括SEQ ID NO: 102之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； ii）包括SEQ ID NO: 91之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； iii）包括SEQ ID NO: 92之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； iv）包括SEQ ID NO: 93之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； v）包括SEQ ID NO: 94之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； vi）包括SEQ ID NO: 95之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； vii）包括SEQ ID NO: 96之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； viii）包括SEQ ID NO: 97之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； ix）包括SEQ ID NO: 98之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； x）包括SEQ ID NO: 99之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3； xi）包括SEQ ID NO: 100之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；及 xii）包括SEQ ID NO: 101之vlCDR1、包括SEQ ID NO: 82之vlCDR2及包括SEQ ID NO: 83之vlCDR3；其中所述抗體針對SEQ ID NO: 8之磷酸化肽之結合親和性與所述抗體針對SEQ ID NO: 69之非磷酸化肽之結合親和性的比率為至少約40。
一種抗pSer413 tau抗體，包括： a）重鏈可變域，選自SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 116；及 b）輕鏈可變域，選自SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113及SEQ ID NO: 114。
一種抗pSer413 tau抗體，包括： a）重鏈可變域，選自SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 116；及 b）輕鏈可變域，選自SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113及SEQ ID NO: 114；其中所述抗體針對SEQ ID NO: 8之磷酸化肽之結合親和性與所述抗體針對SEQ ID NO: 69之非磷酸化肽之結合親和性的比率為至少約40。
如申請專利範圍第21項至第24項中任一項所述的抗體，其中所述抗體包括選自以下之重鏈恆定域：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142及SEQ ID NO: 143。
如申請專利範圍第21項至第24項中任一項所述的抗pSer413 tau抗體，其中所述抗體包括選自SEQ ID NO: 79及SEQ ID NO: 80之輕鏈恆定域。
如申請專利範圍第21項至第22項中任一項所述的抗pSer413 tau抗體，其中所述可變重鏈域選自SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 117。
如申請專利範圍第21項至第22項中任一項所述的抗pSer413 tau抗體，其中所述可變輕鏈域選自SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113及SEQ ID NO: 114。
如申請專利範圍第21項至第28項中任一項所述的抗pSer413 tau抗體，其中所述重鏈及所述輕鏈選自以下對：LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 144、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 145、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 146、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 147、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 148、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 149、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 150、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 151、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 152、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 153、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 154、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 155、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 156、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 157、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 158、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 159、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 160、LC SEQ ID NO: 184與HC SEQ ID NO: 161、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 144、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 145、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 146、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 147、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 148、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 149、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 150、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 151、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 152、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 153、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 154、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 155、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 156、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 157、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 158、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 159、LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 160及LC SEQ ID NO: 185與HC SEQ ID NO: 161。
如申請專利範圍第21項至第29項中任一項所述的抗pSer413 tau抗體，其中所述抗體之所述輕鏈具有SEQ ID NO: 184及所述抗體之所述重鏈具有SEQ ID NO: 144。
如申請專利範圍第21項至第29項中任一項所述的抗pSer413 tau抗體，其中所述抗體之所述輕鏈具有SEQ ID NO: 184及所述重鏈具有SEQ ID NO: 152。
一種核酸組合物，包括： a）第一核酸，編碼選自以下之輕鏈：SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184及SEQ ID NO: 185；及 b）第二核酸，編碼選自以下之重鏈：SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160及SEQ ID NO: 161。
一種如申請專利範圍第32項所述的表現載體組合物，其中所述第一核酸包含於第一表現載體中且所述第二核酸包含於第二表現載體中。
一種如申請專利範圍第33項所述的表現載體組合物，其中所述第一核酸及所述第二核酸包含於表現載體中。
一種宿主細胞，包括如申請專利範圍第33項或第34項所述的表現載體組合物。
一種製備抗PSer413 tau抗體之方法，包括在表現所述抗體之條件下培養如申請專利範圍第35項所述的宿主細胞及回收所述抗體。
一種治療個體之tau蛋白病之方法，包括投與如申請專利範圍第21項至第31項中任一項所述的抗pSer413 tau抗體。