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TW201829471A - 包含bdnf之融合蛋白質 - Google Patents

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TW201829471A
TW201829471A TW106145826A TW106145826A TW201829471A TW 201829471 A TW201829471 A TW 201829471A TW 106145826 A TW106145826 A TW 106145826A TW 106145826 A TW106145826 A TW 106145826A TW 201829471 A TW201829471 A TW 201829471A
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TW
Taiwan
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amino acid
acid sequence
fusion protein
sequence
antibody
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TW106145826A
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English (en)
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TWI791006B (zh
Inventor
薗田啟之
高橋健一
Original Assignee
日商Ｊｃｒ製藥股份有限公司
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Publication date
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Abstract

本發明係提供一種融合蛋白質，其係BDNF與抗人類運鐵蛋白受體抗體之融合蛋白質，並且該抗體係於重鏈之可變區中，(a)CDR1為包含序列編號66或序列編號67之胺基酸序列而成，(b)CDR2為包含序列編號13或序列編號14之胺基酸序列而成，且(c)CDR3為包含序列編號15或序列編號16之胺基酸序列而成者。

Description

包含BDNF之融合蛋白質
本發明係關於一種能夠通過血腦障壁之BDNF，更詳細而言，係關於一種新穎之抗人類運鐵蛋白受體抗體與BDNF之融合蛋白質、其製造法及其使用法。
除包含腦室周圍器官(松果體、腦下垂體、最後區等)在內之若干區域以外，向腦之大部分組織供給血液之微血管係與存在於肌肉等其他組織中之微血管不同，形成其內皮之內皮細胞彼此藉由牢固之細胞間接合而相密接。因此，妨礙物質自血液向腦之被動傳輸，儘管有例外，但除脂溶性較高之物質、或分子量較小(200～500道耳頓以下)且於生理pH值附近為電中性(electrical neutrality)之物質以外，均不易自微血管向腦轉移。此種對經由腦內之微血管內皮所進行之血液與腦組織液間之物質交換加以限制的機構係稱為血腦障壁(Blood-Brain Barrier，BBB)。又，血腦障壁不僅限制腦，亦限制包括腦及脊髓在內之中樞神經系統之組織液與血液間之物質交換。 由於存在血腦障壁，故而中樞神經系統之大部分細胞不會受到血中之激素、淋巴激活素等物質之濃度變化所影響，而保持其生物化學上之恆常性。 然而，血腦障壁之存在於藥劑開發方面引起問題。例如，已知腦源神經滋養因子(BDNF；Brain-derived neurotrophic factor)係神經滋養素家族之一，且其二聚物特異性地結合於存在於靶細胞表面上之高親和性BDNF受體(亦稱為TrkB；酪胺酸受體激酶B(Tyrosine receptor kinase B)、原肌凝蛋白受體激酶B(Tropomyosin receptor kinase B)、或原肌凝蛋白相關激酶B(Tropomyosin-related Kinase B))，而對於中樞及末梢神經系統之細胞分化、功能維持、突觸形成、及損傷時之再生及修復等發揮重要之作用(非專利文獻1及2)。根據上述情況，期待開發BDNF作為阿茲海默氏症、帕金森氏症、杭丁頓舞蹈症等神經退化性疾病；肌萎縮性側索硬化症等脊髓退化性疾病；此外糖尿病性神經障礙、腦缺血性疾病、Rett症候群等發達障礙；精神分裂症；抑鬱症等各種疾病之治療劑(非專利文獻3～8)。然而，高分子蛋白質通常極難通過血腦障壁，因此於將BDNF本身作為中樞神經系統之疾病治療藥或作用於中樞神經系統之疾病治療藥並藉由末梢投予使用時，存在較大障礙。 開發出各種用以使應於中樞神經系統中發揮作用之此種蛋白質等高分子物質通過血腦障壁之方法。例如，於神經生長因子之情形時，嘗試了如下方法：使內包其之脂質體與腦內微血管之內皮細胞之細胞膜融合，藉此使之通過血腦障壁，但尚未達到實用化程度(非專利文獻9)。於α-L-艾杜糖醛酸酶之情形時，進行了如下嘗試，即增加每次投予之酶之量以提高其血中濃度，藉此提高血腦障壁中之酶之被動傳輸，且使用Hurler症候群之動物模型，而顯示出藉由該方法會緩解中樞神經系統(CNS)之異常(非專利文獻10)。 又，亦進行了如下嘗試，即避開血腦障壁，將高分子物質直接投予至脊椎內或腦內。例如報告有：將人類α-L-艾杜糖醛酸酶投予至Hurler症候群(I型黏多糖症)患者之脊椎內之方法(專利文獻1)；將人酸性神經磷脂酶投予至尼-皮二氏病患者之腦室內之方法(專利文獻2)；將艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)投予至Hunter症候群之模型動物之腦室內之方法(專利文獻3)。根據此類方法，認為可使藥劑確實地作用於中樞神經系統，但另一方面存在侵入性極高之問題。 作為使高分子物質通過血腦障壁而到達至腦內之方法，報告有各種以具有與存在於腦內微血管之內皮細胞上之膜蛋白質之親和性的方式對高分子物質進行修飾之方法。作為存在於腦內微血管之內皮細胞上之膜蛋白質，可列舉：針對胰島素、運鐵蛋白、類胰島素生長因子(IGF-I、IGF-II)、LDL(low density lipoproteins，低密度脂蛋白)、瘦體素等化合物之受體。 例如報告有如下技術：將神經生長因子(NGF)以與胰島素之融合蛋白質之形式合成，經由與胰島素受體之結合而使該融合蛋白質通過血腦障壁(專利文獻4～6)。又，報告有如下技術：將神經生長因子(NGF)以與抗胰島素受體抗體之融合蛋白質之形式合成，經由與胰島素受體之結合而使該融合蛋白質通過血腦障壁(專利文獻4及7)。 報告有如下技術：將腦源神經滋養因子(BDNF)以與抗胰島素受體抗體之融合蛋白質之形式合成，使該融合蛋白質經由與胰島素受體之結合而通過血腦障壁(非專利文獻11)。報告有如下技術：將神經生長因子(NGF)以與運鐵蛋白之融合蛋白質之形式合成，經由與運鐵蛋白受體(TfR)之結合而使該融合蛋白質通過血腦障壁(專利文獻8)。又，報告有如下技術：將神經生長因子(NGF)以與抗運鐵蛋白受體抗體(抗TfR抗體)之融合蛋白質之形式合成，經由與TfR之結合而使該融合蛋白質通過血腦障壁(專利文獻4及9)。又，報告有如下技術：將加成有聚乙二醇(PEG)之腦源神經滋養因子(BDNF)以經由抗生蛋白鏈菌素-生物素連接子與小鼠抗大鼠運鐵蛋白受體抗體(抗TfR抗體)化學鍵結之偶聯物的形式合成，於大鼠中，使該偶聯物經由與TfR之結合通過血腦障壁(非專利文獻12)。 進而就使用抗TfR抗體之技術而言，報告有於藉由與抗TfR抗體結合而使藥劑通過血腦障壁之技術中，於使用抗生蛋白鏈菌素之情形時可使用單鏈抗體之情況(非專利文獻13)。又，報告有與人類TfR(hTfR)之解離常數相對較大之抗hTfR抗體(低親和性抗hTfR抗體)於使藥劑通過血腦障壁之技術中可較佳地應用(專利文獻10及11、非專利文獻14)。進而，報告有為了使藥劑通過血腦障壁，與hTfR之親和性pH值依存性地發生變化之抗TfR抗體可用作載體(專利文獻12、非專利文獻15)。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]日本專利特表2007-504166號公報 [專利文獻2]日本專利特表2009-525963號公報 [專利文獻3]日本專利特開2012-62312號公報 [專利文獻4]美國專利5154924號公報 [專利文獻5]日本專利特開2011-144178號公報 [專利文獻6]美國專利2004/0101904號公報 [專利文獻7]日本專利特表2006-511516號公報 [專利文獻8]日本專利特開H06-228199號公報 [專利文獻9]美國專利5977307號公報 [專利文獻10]WO2012/075037 [專利文獻11]WO2013/177062 [專利文獻12]WO2012/143379 [非專利文獻] [非專利文獻1]Moses V. Chao. Nature Reviews Neuroscience. 4. 299-309 (2003) [非專利文獻2]Tabakman R. Progress in Brain Research. 146. 387-401 (2004) [非專利文獻3]Bollen E. Behavioural Brain Research. 257C. 8-12 (2013) [非專利文獻4]Altar C. Anthony. Journal of Neurochemistry. 63. 1021-32 (1994) [非專利文獻5]Zuccato C. Progress in Neurobiology. 81. 294-330 (2007) [非專利文獻6]Dafang Wu. The Journal of the American Society for Experimental Neurotherapeutics. 2. 120-8 (2005) [非專利文獻7]David M. Katz. The Handbook of Experimental Pharmacology. 220. 481-95 (2014) [非專利文獻8]E. Castren. The Handbook of Experimental Pharmacology. 220.461-79 (2014) [非專利文獻9]Xie Y. J Control Release. 105. 106-19 (2005) [非專利文獻10]Ou L. Mol Genet Metab. 111. 116-22 (2014) [非專利文獻11]Ruben J.B. Biotechnology Bioengineering， 97. 1376-1386 (2007) [非專利文獻12]Dafang W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96. 254-259 (1999) [非專利文獻13]Li JY. Protein Engineering. 12. 787-96(1999) [非專利文獻14]Bien-Ly N. J Exp Med. 211. 233-44 (2014) [非專利文獻15]Sada H. PLoS ONE. 9. E96340 (2014)
[發明所欲解決之問題] 於上述背景下，本發明之目的在於提供一種投予至血中之BDNF可於腦內進行作用之能夠通過血腦障壁的新穎之抗TfR抗體與BDNF之融合蛋白質、其製造方法、使用方法、及藉由投予該融合蛋白質而預防及/或治療特定範圍之疾病的方法。 [解決問題之技術手段] 於面向上述目的之研究中，本發明者等人反覆進行努力研究，結果發現，藉由本說明書中詳述之抗體製作方法所獲得之識別hTfR之細胞外區域的抗人類運鐵蛋白受體抗體(抗hTfR抗體)中某特定者、尤其是重鏈之CDR1包含序列編號66或序列編號67之胺基酸序列而成者，進而，除此以外，重鏈之架構區3包含序列編號68之胺基酸序列而成者在投予至血中時，明顯高效率地通過血腦障壁，而且，亦發現使BDNF與該抗體融合而成者亦通過血腦障壁，從而完成本發明。即，本發明提供以下。 1.一種融合蛋白質，其係腦源神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)與抗人類運鐵蛋白受體抗體之融合蛋白質，並且該抗體係於重鏈之可變區中， (a)CDR1為包含序列編號66或序列編號67之胺基酸序列而成， (b)CDR2為包含序列編號13或序列編號14之胺基酸序列而成，且 (c)CDR3為包含序列編號15或序列編號16之胺基酸序列而成者。 2.如上述1之融合蛋白質，其中重鏈之架構區3為包含序列編號68之胺基酸序列而成者。 3.如上述1或2之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中， CDR2為代替序列編號13或序列編號14之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成，且 CDR3為代替序列編號15或序列編號16之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 4.如上述1或2之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中， CDR2為代替序列編號13或序列編號14之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成，且 CDR3為代替序列編號15或序列編號16之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 5.如上述1或2之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中，代替 (a)關於CDR1之序列編號66或序列編號67、 (b)關於CDR2之序列編號13或序列編號14、 (c)關於CDR3之序列編號15或序列編號16、及 (d)關於架構區3之序列編號68 中之至少1個胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號66或序列編號67之胺基酸序列之自N末端側起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且 關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。 6.如上述1或2之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中，代替 (a)關於CDR1之序列編號66或序列編號67、 (b)關於CDR2之序列編號13或序列編號14、 (c)關於CDR3之序列編號15或序列編號16、及 (d)關於架構區3之序列編號68 中之至少1個胺基酸序列而包含相當於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號66或序列編號67之胺基酸序列之自N末端側起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。 7.如上述2之融合蛋白質，其中該重鏈之可變區為包含序列編號69之胺基酸序列而成者。 8.如上述7之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中CDR1之序列編號66或序列編號67及架構區3之序列編號68之各胺基酸序列以外之部分，代替該部分而包含與該部分具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 9.如上述7之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中CDR1之序列編號66或序列編號67及架構區3之序列編號68之各胺基酸序列以外之部分，代替該部分而包含與該部分具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 10.如上述7之融合蛋白質，其係代替構成該重鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號67之胺基酸序列之自N末端起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。 11.如上述7之融合蛋白質，其係代替構成該重鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號67之胺基酸序列之自N末端起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。 12.如上述7之融合蛋白質，其中該重鏈之胺基酸序列為包含序列編號70或序列編號72之胺基酸序列而成者。 13.如上述12之融合蛋白質，其係代替該重鏈中CDR1之序列編號66或序列編號67及架構區3之序列編號68之各胺基酸序列以外之部分，而包含相對於該部分具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 14.如上述12之融合蛋白質，其係代替該重鏈中CDR1之序列編號66或序列編號67及架構區3之序列編號68之各胺基酸序列以外之部分，而包含相對於該部分具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 15.如上述12之融合蛋白質，其係代替構成該重鏈之胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號67之胺基酸序列之自N末端起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。 16.如上述12之融合蛋白質，其係代替構成該重鏈之胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號67之胺基酸序列之自N末端起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。 17.如上述1至16中任一項之融合蛋白質，其係於該抗體之輕鏈之可變區中， (a)CDR1為包含序列編號6或序列編號7之胺基酸序列而成， (b)CDR2為包含序列編號8或序列編號9之胺基酸序列、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser而成，且 (c)CDR3為包含序列編號10之胺基酸序列而成者。 18.如上述17之融合蛋白質，其係於該輕鏈之可變區中， (a)CDR1為代替序列編號6或序列編號7之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成， (b)CDR2為代替序列編號8或序列編號9之胺基酸序列、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成，且 (c)CDR3為代替序列編號10之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 19.如上述17之融合蛋白質，其係於該輕鏈之可變區中， (a)CDR1為代替序列編號6或序列編號7之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成， (b)CDR2為代替序列編號8或序列編號9之胺基酸序列、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成，且 (c)CDR3為代替序列編號10之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 20.如上述17之融合蛋白質，其係於該輕鏈之可變區中，代替 (a)關於CDR1之序列編號6或序列編號7、 (b)關於CDR2之序列編號8或序列編號9、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser、及 (c)關於CDR3之序列編號10 中之至少1個胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。 21.如上述17之融合蛋白質，其係於該輕鏈之可變區中，代替 (a)關於CDR1之序列編號6或序列編號7、 (b)關於CDR2之序列編號8或序列編號9、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser、及 (c)關於CDR3之序列編號10 中之至少1個胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。 22.如上述1至16中任一項之融合蛋白質，其中該抗體之輕鏈之可變區為包含序列編號17、序列編號18、序列編號19、序列編號20、序列編號21或序列編號22之胺基酸序列而成者。 23.如上述22之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 24.如上述22之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 25.如上述22之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。 26.如上述22之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。 27.如上述1至16中任一項之融合蛋白質，其中該抗體之輕鏈為包含序列編號23、序列編號25、序列編號27或序列編號29之胺基酸序列而成者。 28.如上述27之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 29.如上述27之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。 30.如上述27之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。 31.如上述27之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。 32.如上述1至31中任一項之融合蛋白質，其中該抗體為Fab抗體、F(ab')2 抗體、或F(ab')抗體。 33.如上述1至31中任一項之融合蛋白質，其中該抗體為選自由scFab、scF(ab')、scF(ab')2 及scFv所組成之群中之單鏈抗體。 34.如上述33之融合蛋白質，其係經由連接子序列將該抗體之輕鏈與重鏈結合者。 35.如上述34之融合蛋白質，其係於該輕鏈之C末端側經由連接子序列而結合有該重鏈者。 36.如上述34之融合蛋白質，其係於該重鏈之C末端側經由連接子序列而結合有該輕鏈者。 37.如上述34至36中任一項之融合蛋白質，其中該連接子序列為包含8～50個胺基酸殘基者。 38.如上述37之融合蛋白質，其中該連接子序列為選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號3、序列編號4、及序列編號5之各胺基酸序列、相當於由3個序列編號3之胺基酸序列接連而成者的胺基酸序列、及由10個以下之該等胺基酸序列接連而成之序列所組成之群中者。 39.如上述1至38中任一項之融合蛋白質，其中該BDNF為結合至該抗體之輕鏈或重鏈之C末端側或N末端側者。 40.如上述39之融合蛋白質，其中該BDNF為直接或經由連接子而結合至該抗體之輕鏈或重鏈之C末端側或N末端側者。 41.如上述40之融合蛋白質，其中該連接子為包含1～50個胺基酸殘基之肽。 42.如上述41之融合蛋白質，其中該連接子為包含選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列編號3、序列編號4、及序列編號5所組成之群中之胺基酸序列而成之肽。 43.如上述1至42中任一項之融合蛋白質，其中該BDNF為人類BDNF。 44.如上述43之融合蛋白質，其中該人類BDNF為包含序列編號51之胺基酸序列或與其實質上一致之胺基酸序列而成者，或者與序列編號51所表示之蛋白質具有同質之功能者。 45.如上述1至44中任一項之融合蛋白質，其係對於人類運鐵蛋白受體之細胞外區域及猴運鐵蛋白受體之細胞外區域兩者具有親和性者。 46.如上述45之融合蛋白質，其中該抗運鐵蛋白受體抗體為與人類運鐵蛋白受體之細胞外區域之解離常數為1×10-10 M以下，與猴運鐵蛋白受體之細胞外區域之解離常數為1×10-9 M以下者。 47.如上述43之融合蛋白質，其中 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 (a)該重鏈為於其C末端側經由包含胺基酸序列Gly-Ser之連接子與人類BDNF結合，藉此形成有序列編號52之胺基酸序列者，或者 (b)該重鏈為於其C末端側經由如下連接子與人類BDNF結合，藉此形成有序列編號54之胺基酸序列者，該連接子係包含繼胺基酸序列Gly-Ser之後連接5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)而成之共計27個胺基酸序列者。 48.如上述1至31中任一項之融合蛋白質，其中該抗體為抗原結合性片段。 49.如上述48之融合蛋白質，其係於該抗原結合性片段之N末端側直接或經由連接子而結合人類BDNF而成者。 50.如上述48或49之融合蛋白質，其中該抗原結合性片段為單鏈抗體。 51.如上述50之融合蛋白質，其係經由連接子序列將該抗體之輕鏈可變區與重鏈可變區結合而成者。 52.如上述51之融合蛋白質，其係於該輕鏈可變區之C末端側經由該連接子序列而結合該重鏈可變區而成者。 53.如上述51之融合蛋白質，其係於該重鏈可變區之C末端側經由該連接子序列而結合該輕鏈可變區而成者。 54.如上述51至53中任一項之融合蛋白質，其中該連接子序列為包含8～50個胺基酸殘基者。 55.如上述54之融合蛋白質，其中該連接子序列為選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號3、序列編號4、及序列編號5之各胺基酸序列、相當於由3個序列編號3之胺基酸序列接連而成者的胺基酸序列、及由10個以下之該等胺基酸序列接連而成之序列所組成之群中者。 56.如上述50至55中任一項之融合蛋白質，其中該抗體為包含具有序列編號69之胺基酸序列之重鏈可變區、與具有序列編號18之胺基酸序列之輕鏈可變區而成者。 57.如上述56之融合蛋白質，其係該抗體包含序列編號57之胺基酸序列，且於其N末端側直接或經由連接子而結合人類BDNF而成者。 58.如上述57之融合蛋白質，其係該抗體包含序列編號57之胺基酸序列，且於其N末端側經由連接子而結合人類BDNF前體而成、即包含序列編號59之胺基酸序列而成者。 59.如上述57之融合蛋白質，其係該抗體包含序列編號57之胺基酸序列，且於其N末端側經由連接子而結合人類BDNF而成、即包含序列編號60之胺基酸序列而成者。 60.如上述48或49之融合蛋白質，其中該抗原結合性片段為Fab、F(ab')2 、或F(ab')之任一者。 61.如上述60之融合蛋白質，其係於Fab、F(ab')2 、或F(ab')之任一者之輕鏈或重鏈之N末端側直接或經由連接子而結合人類BDNF而成者。 62.如上述61之融合蛋白質，其係該抗體之輕鏈包含序列編號23之胺基酸序列，且該抗體之重鏈為包含序列編號61之胺基酸序列之Fab重鏈，且於該重鏈之N末端側直接或經由連接子而結合人類BDNF而成者。 63.如上述62之融合蛋白質，其中該連接子為包含選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列編號3之胺基酸序列、序列編號4之胺基酸序列、及序列編號5之胺基酸序列所組成之群中之胺基酸序列而成之肽。 64.如上述62之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 於包含該Fab重鏈與在其N末端側直接或經由連接子結合之人類BDNF前體的部分形成有序列編號63之胺基酸序列者。 65.如上述62之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 於包含Fab重鏈與在其N末端側直接或經由連接子而結合之人類BDNF的部分形成有序列編號65之胺基酸序列者。 66.如上述48至62中任一項之融合蛋白質，其係將人類IgG Fc區域或其一部分導入至人類BDNF與該抗體之間而成者。 67.如上述66之融合蛋白質，其係於人類BDNF之C末端側直接或經由連接子序列而結合人類IgG Fc區域而成，且於該人類IgG Fc區域之C末端側直接或經由連接子序列而結合該抗體而成者。 68.如上述66或67之融合蛋白質，其中人類IgG Fc區域為包含序列編號75所示之胺基酸序列而成者。 69.如上述68之融合蛋白質，其係 該重鏈為於人類BDNF之C末端側直接或經由連接子序列而結合該人類IgG Fc區域而成，且於該人類IgG Fc區域之C末端側直接或經由連接子序列而結合有該重鏈者。 70.如上述69之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 該重鏈為於人類BDNF之C末端側經由連接子序列而結合人類IgG Fc區域而成，並於該人類IgG Fc區域之C末端側經由連接子序列而結合有該重鏈，藉此形成有序列編號74之胺基酸序列者。 71.如上述48至62中任一項之融合蛋白質，其係進而導入白蛋白親和性肽而成者。 72.如上述71之融合蛋白質，其係於該抗體之C末端側直接或經由連接子序列而結合白蛋白親和性肽而成者。 73.如上述71或72之融合蛋白質，其中白蛋白親和性肽為包含序列編號85所示之胺基酸序列而成者。 74.如上述73之融合蛋白質，其係 該重鏈為直接或經由連接子序列結合至人類BDNF之C末端側而成，且於該重鏈之C末端側直接或經由連接子序列而結合有白蛋白親和性肽者。 75.如上述74之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 該重鏈為直接或經由連接子序列結合至人類BDNF前體之C末端側而成，且於該重鏈之C末端側直接或經由連接子序列而結合有白蛋白親和性肽，藉此形成有序列編號87之胺基酸序列者。 76.如上述74之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 該重鏈為直接或經由連接子序列結合至人類BDNF之C末端側而成，且於該重鏈之C末端側直接或經由連接子序列而結合有白蛋白親和性肽，藉此形成有序列編號88之胺基酸序列者。 77.一種DNA片段，其編碼如上述1至76中任一項之融合蛋白質。 78.一種表現載體，其係組入如上述77之DNA片段而成。 79.一種哺乳動物細胞，其係利用上述78之表現載體進行轉形而獲得。 80.一種藥劑，其係用以預防及/治療藉由暴露於BDNF能夠得益之疾病或障礙之藥劑，其係包含如上述1至76中任一項之融合蛋白質作為有效成分而成。 81.如上述80之藥劑，其中該疾病或障礙為神經系統之疾病或障礙。 82.如上述81之藥劑，其中該神經系統之疾病或障礙為神經退化性疾病、抑鬱症、精神分裂症、癲癇、自閉症、Rett症候群、West症候群、新生兒痙攣、癡呆症所伴隨之行為異常、焦慮症、疼痛、希什斯普隆氏病或快速動眼睡眠行為障礙。 83.如上述82之藥劑，其中該神經退化性疾病為腦神經退化性疾病、脊髓退化性疾病、視網膜退化性疾病或末梢神經退化性疾病。 84.如上述83之藥劑，其中該腦神經退化性疾病為腦神經系統之神經退化性疾病、腦虛血性疾病、外傷性腦損傷、腦白質病或多發性硬化症。 85.如上述84之藥劑，其中該腦神經系統之神經退化性疾病為阿茲海默氏症、帕金森氏症、杭丁頓舞蹈症、路易體癡呆(Dementia with Lewy Bodies)、匹克病、多發性系統萎縮症、進行性上行性麻痹或唐氏症候群。 86.一種如上述1至76中任一項之融合蛋白質之用途，其係用於預防及/或治療藉由暴露於BDNF能夠得益之疾病或障礙。 87.一種如上述1至76中任一項之融合蛋白質之用途，其係用於製造藉由暴露於BDNF能夠得益之疾病或障礙之預防及/或治療用醫藥。 88.一種預防及/或治療藉由暴露於BDNF能夠得益之疾病或障礙之方法，其包括：將含有如上述1至76中任一項之融合蛋白質之治療上有效量的醫藥組合物投予至具有該疾病或障礙之患者之血中。 [發明之效果] 本發明係對於作為無法通過血腦障壁者之腦源神經滋養因子(BDNF)，將其製成與特定之抗hTfR抗體之融合蛋白質之形態，藉此能夠通過血腦障壁。因此，將BDNF以此種融合蛋白質之形態藉由靜脈注射等投予至血中，藉此可使之對中樞神經系統發揮作用。
本發明中，「抗體」一詞係主要指人類抗體、小鼠抗體、人源化抗體、人類抗體與其他哺乳動物之抗體之嵌合抗體、及小鼠抗體與其他哺乳動物之抗體之嵌合抗體中之任一種，只要為具有特異性地結合至特定抗原之性質者，則並不限定於其等，又，抗體之動物物種亦無特別限制。其中較佳為人源化抗體。 本發明中，「人類抗體」一詞係指整個蛋白質由源自人類之基因所編碼之抗體。其中，為了提昇基因之表現效率等，而對於原本之人類之基因在不會使原本之胺基酸序列產生變化之情況下施加有突變之基因所編碼的抗體亦包括在「人類抗體」中。又，將編碼人類抗體之2個以上基因加以組合，並將某人類抗體之一部分置換為其他人類抗體之一部分所製作之抗體亦為「人類抗體」。人類抗體具有免疫球蛋白輕鏈之3個互補決定區域(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3個互補決定區域(CDR)。免疫球蛋白輕鏈之3個CDR自處於N末端側者起依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。免疫球蛋白重鏈之3個CDR亦自處於N末端側者起依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。藉由將某人類抗體之CDR置換為其他人類抗體之CDR而改變了人類抗體之抗原特異性、親和性等之抗體亦包括在人類抗體中。 本發明中，藉由對原本之人類抗體之基因進行修飾，而對原本之抗體之胺基酸序列施加有置換、缺失、附加等突變所獲得之抗體亦包括在「人類抗體」中。於利用其他胺基酸置換原本之抗體之胺基酸序列中之胺基酸之情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～20個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個。於使原本之抗體之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～20個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個。又，施加有組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變所獲得之抗體亦為人類抗體。於附加胺基酸之情形時，於原本之抗體之胺基酸序列中或者N末端或C末端附加較佳為1～20個、更佳為1～5個、進而較佳為1～3個胺基酸。施加有將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變所獲得之抗體亦為人類抗體。施加有突變所獲得之抗體之胺基酸序列相對於原本之抗體之胺基酸序列較佳為顯示出80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性，進而更佳為顯示出98%以上之同源性。即，本發明中稱為「源自人類之基因」時，除源自人類之原本之基因以外，亦包括藉由對其加以修飾而獲得之基因。 本發明中，所謂「小鼠抗體」，係指其蛋白質整體由源自小鼠之基因所編碼之抗體。其中，為了提昇基因之表現效率等，而對於原本之小鼠之基因在不會使原本之胺基酸序列產生變化之情況下施加有突變之基因所編碼的抗體亦包括在「小鼠抗體」中。又，將編碼小鼠抗體之2個以上基因加以組合，並將某小鼠抗體之一部分置換為其他小鼠抗體之一部分所獲得之抗體亦包括在小鼠抗體中。小鼠抗體具有免疫球蛋白輕鏈之3個互補決定區域(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3個互補決定區域(CDR)。免疫球蛋白輕鏈之3個CDR自處於N末端側者起依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。免疫球蛋白重鏈之3個CDR自處於N末端側者起依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。例如，藉由將某小鼠抗體之CDR置換為其他小鼠抗體之CDR而改變了小鼠抗體之抗原特異性、親和性等之抗體亦包括在小鼠抗體中。 本發明中，藉由對原本之小鼠抗體之基因進行修飾，而對原本之抗體之胺基酸序列施加有置換、缺失、附加等突變所獲得之抗體亦包括在「小鼠抗體」中。於將原本之抗體之胺基酸序列中之胺基酸置換為其他胺基酸之情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～20個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個。於使原本之抗體之胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～20個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個。又，施加有組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變所獲得之抗體亦包括在「小鼠抗體」中。於附加胺基酸之情形時，於原本之抗體之胺基酸序列中或者N末端側或C末端側附加較佳為1～20個、更佳為1～5個、進而較佳為1～3個胺基酸。施加有將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變所獲得之抗體亦包括在「小鼠抗體」中。施加有突變之抗體之胺基酸序列較佳為相對於原本之抗體之胺基酸序列顯示出80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性，進而更佳為顯示出98%以上之同源性。即，本發明中稱為「源自小鼠之基因」時，除源自小鼠之原本之基因以外，亦包括藉由對其加以修飾而獲得之基因。 本發明中，「人源化抗體」一詞係指可變區之一部分(例如，尤其是CDR之全部或一部分)之胺基酸序列源自人類以外之哺乳動物，除此以外之區域源自人類之抗體。例如，作為人源化抗體，可列舉：藉由將構成人類抗體之免疫球蛋白輕鏈之3個互補決定區域(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3個互補決定區域(CDR)置換為其他哺乳動物之CDR而製作之抗體。關於成為移植至人類抗體之適當位置之CDR之來源的其他哺乳動物之生物物種，只要為人類以外之哺乳動物，則無特別限定，較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、或人類以外之靈長類，更佳為小鼠及大鼠，進而較佳為小鼠。 本發明中，「嵌合抗體」一詞係指由源自2個以上之不同物種之2個以上之不同抗體的片段連結而成之抗體。 所謂人類抗體與其他哺乳動物之抗體之嵌合抗體，係人類抗體之一部分被置換為人類以外之哺乳動物之抗體之一部分的抗體。抗體包含以下所說明之Fc區域、Fab區域及鉸鏈部。作為此種嵌合抗體之具體例，可列舉：Fc區域源自人類抗體，另一方面Fab區域源自其他哺乳動物之抗體之嵌合抗體。鉸鏈部係源自人類抗體或其他哺乳動物之抗體之任一者。可列舉相反地Fc區域源自其他哺乳動物，另一方面Fab區域源自人類抗體之嵌合抗體。鉸鏈部係源自人類抗體或其他哺乳動物之抗體之任一者。 又，抗體亦可謂由可變區與恆定區構成。作為嵌合抗體之其他具體例，亦可列舉：重鏈之恆定區(CH )與輕鏈之恆定區(CL )源自人類抗體，另一方面重鏈之可變區(VH )及輕鏈之可變區(VL )源自其他哺乳動物之抗體者；相反地重鏈之恆定區(CH )與輕鏈之恆定區(CL )源自其他哺乳動物之抗體，另一方面重鏈之可變區(VH )及輕鏈之可變區(VL )源自人類抗體者。此處，其他哺乳動物之生物物種只要為人類以外之哺乳動物，則無特別限定，較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、或人類以外之靈長類，例如為小鼠。 所謂小鼠抗體與其他哺乳動物之抗體之嵌合抗體，係小鼠抗體之一部分被置換為小鼠以外之哺乳動物之抗體之一部分的抗體。作為此種嵌合抗體之具體例，可列舉：Fc區域源自小鼠抗體，另一方面Fab區域源自其他哺乳動物之抗體之嵌合抗體；或相反地Fc區域源自其他哺乳動物，另一方面Fab區域源自小鼠抗體之嵌合抗體。此處，其他哺乳動物之生物物種較佳為人類。 人類抗體與小鼠抗體之嵌合抗體尤其是指「人類/小鼠嵌合抗體」。關於人類/小鼠嵌合抗體，可列舉：Fc區域源自人類抗體，另一方面Fab區域源自小鼠抗體之嵌合抗體；或相反地Fc區域源自小鼠抗體，另一方面Fab區域源自人類抗體之嵌合抗體。鉸鏈部係源自人類抗體或小鼠抗體之任一者。作為人類/小鼠嵌合抗體之其他具體例，亦可列舉：重鏈之恆定區(CH )與輕鏈之恆定區(CL )源自人類抗體，另一方面重鏈之可變區(VH )及輕鏈之可變區(VL )源自小鼠抗體者；相反地重鏈之恆定區(CH )與輕鏈之恆定區(CL )源自小鼠抗體，另一方面重鏈之可變區(VH )及輕鏈之可變區(VL )源自人類抗體者。 抗體原本具有如下基本結構，該基本結構包含2條免疫球蛋白輕鏈與2條免疫球蛋白重鏈之共計4條多肽鏈。其中，本發明中，稱為「抗體」時，除具有該基本結構者以外，亦包含 (1)包含1條免疫球蛋白輕鏈與1條免疫球蛋白重鏈之共計2條多肽鏈者；或如以下所詳述般， (2)作為於免疫球蛋白輕鏈之C末端側結合連接子序列，並且進而於其C末端側結合免疫球蛋白重鏈而成者之單鏈抗體，及 (3)作為於免疫球蛋白重鏈之C末端側結合連接子序列，並且進而於其C末端側結合免疫球蛋白輕鏈而成者之單鏈抗體。又， (4)原本意義上之抗體之基本結構中缺失有Fc區域者即包含Fab區域者及包含Fab區域與鉸鏈部之全部或一部分者(包含Fab、F(ab')及F(ab')2 )亦包含於本發明中之「抗體」中。 此處，所謂Fab，係指包含可變區與CL 區域(輕鏈之恆定區)之輕鏈、與包含可變區與CH 1區域(重鏈之恆定區之部分1)之重鏈以存在於各自中之半胱胺酸殘基彼此藉由雙硫鍵結合而成之分子。於Fab中，重鏈除可變區與CH 1區域(重鏈之恆定區之部分1)以外，亦可進而含有鉸鏈部之一部分，但該情形時之鉸鏈部係欠缺存在於鉸鏈部中且將抗體之重鏈彼此結合之半胱胺酸殘基者。於Fab中，輕鏈與重鏈係藉由雙硫鍵而結合，該雙硫鍵係形成於存在於輕鏈之恆定區(CL 區域)之半胱胺酸殘基、與存在於重鏈之CH 1區域或鉸鏈部之半胱胺酸殘基之間。於本說明書中將形成Fab之重鏈稱為「Fab重鏈」。Fab係欠缺存在於鉸鏈部中且將抗體之重鏈彼此結合之半胱胺酸殘基，且包含1條輕鏈與1條重鏈。F(ab')中，其重鏈除可變區與CH 1區域以外，亦含有包含將重鏈彼此結合之半胱胺酸殘基之鉸鏈部之全部或一部分。F(ab')2 係指2個F(ab')以存在各自鉸鏈部中之半胱胺酸殘基彼此藉由雙硫鍵結合而成之分子。於本說明書中將形成F(ab')或F(ab')2 之重鏈稱為「Fab'重鏈」。又，作為複數個抗體直接或經由連接子結合而成者之二聚物、三聚物等聚合物亦為抗體。進而，並不限於該等，包含免疫球蛋白分子之一部分，且具有特異性地結合至抗原之性質者均包含於本發明中所謂「抗體」中。即，於本發明中稱為免疫球蛋白輕鏈時，包含源自免疫球蛋白輕鏈，且具有其可變區之全部或一部分之胺基酸序列者。又，稱為免疫球蛋白重鏈時，包含源自免疫球蛋白重鏈，且具有其可變區之全部或一部分之胺基酸序列者。因此，只要具有可變區之全部或一部分之胺基酸序列，則例如缺失有Fc區域者亦為免疫球蛋白重鏈。 又，此處所謂Fc或Fc區域，係指抗體分子中之含有如下片段之區域，該片段包含CH 2區域(重鏈之恆定區之部分2)、及CH 3區域(重鏈之恆定區之部分3)。Fc或Fc區域除CH 2區域與CH 3區域以外，亦可包含鉸鏈部之一部分。 進而，本發明中稱為「抗體」時， (5)亦包含使構成上述(4)所示之Fab、F(ab')或F(ab')2 之輕鏈與重鏈經由連接子序列結合而分別製成單鏈抗體所獲得之scFab、scF(ab')、及scF(ab')2 。此處，於scFab、scF(ab')、及scF(ab')2 時，亦可為於輕鏈之C末端側結合連接子序列，並且進而於其C末端側結合重鏈而成者，又，亦可為於重鏈之C末端側結合連接子序列，並且進而於其C末端側結合輕鏈而成者。進而，使輕鏈之可變區與重鏈之可變區經由連接子序列結合而製成單鏈抗體所獲得之scFv亦包含於本發明之抗體中。scFv時，亦可為於輕鏈之可變區之C末端側結合連接子序列，並且進而於其C末端側結合重鏈之可變區而成者，又，亦可為於重鏈之可變區之C末端側結合連接子序列，並且進而於其C末端側結合輕鏈之可變區而成者。 進而，本說明書中所謂「抗體」，亦包含作為除全長抗體、上述(1)～(3)所示者以外，亦包括上述(4)及(5)之概念的全長抗體之一部分缺損之抗原結合性片段(抗體片段)之任一形態。 「抗原結合性片段」一詞係指保持有與抗原之特異性結合活性之至少一部分的抗體之片段。作為結合性片段之例，例如除上述(4)及(5)所示者以外，亦包含使可變區(Fv)、重鏈可變區(VH )及輕鏈可變區(VL )經由適當連接子連結而成之單鏈抗體(scFv)；作為包含重鏈可變區(VH )與輕鏈可變區(VL )之多肽之二聚物之雙鏈抗體；作為於scFv之重鏈(H鏈)結合有恆定區之一部分(CH 3)者之二聚物之微型抗體；其他低分子化抗體等。但是，只要具有與抗原之結合能力，則並不限定於該等分子。又，關於該等結合性片段，不僅包含抗體蛋白質之全長分子經適當酶處理者，亦包含使用經基因工程修飾之抗體基因而於適當宿主細胞中產生之蛋白質。 本發明中，稱為「單鏈抗體」時，係指於包含免疫球蛋白輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列的C末端側結合連接子序列，進而於其C末端側結合包含免疫球蛋白重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列而成，且可特異性地結合至特定抗原之蛋白質。例如，單鏈抗體包括上述(2)、(3)及(5)所示者。又，於包含免疫球蛋白重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列的C末端側結合連接子序列，進而於其C末端側結合包含免疫球蛋白輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列而成，且可特異性地結合至特定抗原之蛋白質亦為本發明中之「單鏈抗體」。於在免疫球蛋白重鏈之C末端側經由連接子序列結合有免疫球蛋白輕鏈之單鏈抗體時，通常免疫球蛋白重鏈缺失有Fc區域。免疫球蛋白輕鏈之可變區具有3個與抗體之抗原特異性相關之互補決定區域(CDR)。同樣地，免疫球蛋白重鏈之可變區亦具有3個CDR。該等CDR係決定抗體之抗原特異性之主要區域。因此，單鏈抗體較佳為包含免疫球蛋白重鏈之全部3個CDR、與免疫球蛋白輕鏈之全部3個CDR。但是，只要維持抗體之抗原特異性親和性，則亦可設為缺失有1個或複數個CDR之單鏈抗體。 單鏈抗體中，配置於免疫球蛋白之輕鏈與重鏈之間之連接子序列係由較佳為2～50個、更佳為8～50個、進而較佳為10～30個、進而更佳為12～18個或15～25個、例如15個或25個胺基酸殘基所構成之肽鏈。此種連接子序列只要藉由其兩鏈連結而成之抗hTfR抗體保持對於hTfR之親和性，則並不限定於其胺基酸序列，較佳為僅由甘胺酸構成者或由甘胺酸與絲胺酸構成者。例如可列舉包含如下序列者：胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列編號5)、或相當於該等胺基酸序列2～10個或2～5個接連而成者之序列。例如，於在包含免疫球蛋白重鏈之可變區之全區域之胺基酸序列的C末端側經由連接子序列結合免疫球蛋白輕鏈之可變區的情形時，較佳為包含相當於3個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成者的共計15個胺基酸之連接子序列。 本發明中，關於「人類運鐵蛋白受體」或「hTfR」一詞，係指具有序列編號1之胺基酸序列之膜蛋白質。於本發明之一實施態樣中，應與BDNF融合之抗hTfR抗體係特異性地結合至序列編號1之胺基酸序列中自從N末端數第89位之半胱胺酸殘基直至C末端之苯丙胺酸的部分(hTfR之細胞外區域)者，但並不限定於此。又，本發明中關於「猴運鐵蛋白受體」或「猴TfR」一詞，係具有尤其是源自食蟹猴(Macaca fascicularis)之序列編號2之胺基酸序列之膜蛋白質。本發明之抗hTfR抗體於上述一實施態樣中係亦結合至序列編號2之胺基酸序列中自從N末端數第89位之半胱胺酸殘基直至C末端之苯丙胺酸的部分(猴TfR之細胞外區域)者，但並不限定於此。 作為對於hTfR之抗體之製作方法，通常為如下方法：使用導入有組入有hTfR基因之表現載體之細胞而製作重組人類運鐵蛋白受體(rhTfR)，使用該rhTfR免疫小鼠等動物而獲得抗體。自免疫後之動物提取對於hTfR之抗體產生細胞，使其與骨髓瘤細胞融合，藉此可製作具有抗hTfR抗體產生能力之融合瘤細胞。 又，藉由體外免疫法用rhTfR對自小鼠等動物獲得之免疫系細胞進行免疫，亦可取得產生對於hTfR之抗體之細胞。於使用體外免疫法之情形時，該免疫系細胞所源自之動物物種並無特別限定，較佳為小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、貓、馬、及包括人類在內之靈長類，更佳為小鼠、大鼠及人類，進而較佳為小鼠及人類。作為小鼠之免疫系細胞，例如可使用自小鼠之脾臟製備之脾細胞。作為人類之免疫系細胞，可使用自人類之末梢血、骨髓、脾臟等製備之細胞。於藉由體外免疫法免疫了人類之免疫系細胞之情形時，可獲得對於hTfR之人類抗體。 於藉由體外免疫法免疫了免疫系細胞後，使細胞與骨髓瘤細胞融合，藉此可製作具有抗體產生能力之融合瘤細胞。又，亦可自免疫後之細胞提取mRNA而合成cDNA，以該cDNA作為模板，藉由PCR反應擴增包含編碼免疫球蛋白之輕鏈及重鏈之基因之DNA片段，使用該等而人工重組抗體基因。 關於藉由上述方法直接獲得之融合瘤細胞，亦包含產生將hTfR以外之蛋白質識別作抗原之抗體之細胞。又，產生抗hTfR抗體之融合瘤細胞未必全部產生對於hTfR顯示出高親和性之抗hTfR抗體。 同樣地，關於經人工重組之抗體基因，亦包含編碼將hTfR以外之蛋白質識別作抗原之抗體之基因。又，編碼抗hTfR抗體之基因未必全部具備編碼對於hTfR顯示出高親和性之抗hTfR抗體等所需之特性。 因此，需要如下步驟：自上述中直接獲得之融合瘤細胞中選擇產生具有所需特性(對於hTfR之高親和性等)之抗體之融合瘤細胞。又，於經人工重組之抗體基因時，需要如下步驟：自該抗體基因中選擇編碼具有所需特性(對於hTfR之高親和性等)之抗體之基因。作為選擇產生對於hTfR顯示出高親和性之抗體(高親和性抗體)之融合瘤細胞、或編碼高親和性抗體之基因之方法，有效的是以下所詳述之方法。再者，所謂對於hTfR顯示出高親和性之抗體，係藉由實施例7所記載之方法測定之與hTfR之解離常數(KD )較佳為1×10-8 M以下者，更佳為1×10-9 M以下者，進而較佳為1×10-10 M以下者，進而更佳為1×10-11 M以下者。例如作為較佳者，可列舉：解離常數為1×10-13 M～1×10-9 M者、解離常數為1×10-13 M～1×10-10 M者。 例如於選擇產生對於抗hTfR抗體顯示出高親和性之抗體之融合瘤細胞的情形時，可使用如下方法：將重組hTfR添加至培養盤中並將之保持在其中後，添加融合瘤細胞之培養上清液，繼而將未與重組hTfR結合之抗體自培養盤去除，對培養盤中所保持之抗體之量進行測定。根據該方法，添加至培養盤中之融合瘤細胞之培養上清液所包含之抗體對於hTfR的親和性越高，培養盤中所保持之抗體之量變得越多。因此，對培養盤中所保持之抗體之量進行測定，可選擇與保持有更多抗體之培養盤對應之融合瘤細胞作為產生對於hTfR具有相對較高之親和性之抗hTfR抗體的細胞株。自以上述方式選擇出之細胞株提取mRNA而合成cDNA，以該cDNA作為模板，使用PCR法擴增包含編碼抗hTfR抗體之基因之DNA片段，藉此亦可將編碼高親和性抗體之基因單離。 於自上述經人工重組之抗體基因中選擇編碼具有高親和性之抗hTfR抗體的基因之情形時，暫時將經人工重組之抗體基因組入至表現載體中，將該表現載體導入至宿主細胞。此時，作為用作宿主細胞之細胞，只要為可藉由導入組入有經人工重組之抗體基因之表現載體而使抗體基因表現之細胞，則不論原核細胞、真核細胞均無特別限定，較佳為源自人類、小鼠、中國倉鼠等哺乳動物之細胞，尤佳為源自中國倉鼠卵巢之CHO細胞、或源自小鼠骨髓瘤之NS/0細胞。又，關於用以組入編碼抗體基因之基因並使之表現之表現載體，只要為於導入至哺乳動物細胞內時使該基因表現者，則可無特別限定地使用。組入至表現載體中之該基因係配置於在哺乳動物細胞內可調節基因之轉錄之頻度的DNA序列(基因表現控制部位)之下游。作為本發明中可使用之基因表現控制部位，例如可列舉：源自巨細胞病毒之啟動子、SV40初期啟動子、人類延伸因子-1α(EF-1α)啟動子、泛激素C啟動子等。 導入有此種表現載體之哺乳動物細胞變得表現組入至表現載體中之上述經人工重組之抗體。於自以上述方式獲得之表現經人工重組之抗體之細胞中選擇產生對於抗hTfR抗體具有高親和性之抗體之細胞的情形時，可使用如下方法：將重組hTfR添加至培養盤中並將之保持在其中後，使重組hTfR與細胞之培養上清液接觸，繼而，將未與重組hTfR結合之抗體自培養盤去除，對培養盤中所保持之抗體之量進行測定。根據該方法，細胞之培養上清液中所包含之抗體之對於hTfR之親和性越高，培養盤中所保持之抗體之量變得越多。因此，可對培養盤中所保持之抗體之量進行測定，而選擇與保持有更多抗體之培養盤對應之細胞作為產生對於hTfR具有相對較高之親和性之抗hTfR抗體的細胞株，進而可選擇編碼對於hTfR具有高親和性之抗hTfR抗體之基因。藉由使用PCR法擴增包含編碼抗hTfR抗體之基因之DNA片段，可自以上述方式選擇出之細胞株單離編碼高親和性抗體之基因。 自上述經人工重組之抗體基因中選擇編碼具有高親和性之抗hTfR抗體之基因時，亦可藉由如下方式進行：將經人工重組之抗體基因組入至表現載體中，將該表現載體導入至大腸桿菌，使用培養該大腸桿菌而獲得之培養上清液或使大腸桿菌溶解而獲得之包含抗體之溶液，利用與選擇上述融合瘤細胞之情形相同之方法而選擇具有所需基因之大腸桿菌。所選擇出之大腸桿菌株係表現編碼對於hTfR具有相對較高之親和性之抗hTfR抗體的基因者。可自該細胞株中選擇編碼對於hTfR具有相對較高之親和性之抗hTfR抗體之基因。於使抗體分泌至大腸桿菌之培養上清液中之情形時，只要以於N末端側結合分泌訊號序列之方式將抗體基因組入至表現載體即可。 作為選擇編碼具有高親和性之抗hTfR抗體之基因之其他方法，有如下方法：使上述經人工重組之抗體基因所編碼之抗體保持在噬菌體粒子上並使之表現。此時，抗體基因係以編碼單鏈抗體之基因之形式重組。將抗體保持在噬菌體粒子上之方法係記載於國際公開公報(WO1997/09436、WO1995/11317)等中，且眾所周知。自保持經人工重組之抗體基因所編碼之抗體之噬菌體中選擇保持對於抗hTfR抗體具有高親和性之抗體之噬菌體的情形時，可使用如下方法：將重組hTfR添加至培養盤中並將其加以保持後，使之與噬菌體接觸，繼而自培養盤將未與重組hTfR結合之噬菌體去除，對培養盤中所保持之噬菌體之量進行測定。根據該方法，噬菌體粒子上所保持之抗體之對於hTfR之親和性越高，培養盤中所保持之噬菌體之量變得越多。因此，可對培養盤中所保持之噬菌體之量進行測定，而選擇與保持有更多噬菌體之培養盤對應之噬菌體粒子作為產生對於hTfR具有相對較高之親和性之抗hTfR抗體的噬菌體粒子，進而可選擇編碼對於hTfR具有高親和性之抗hTfR抗體之基因。藉由使用PCR法擴增包含編碼抗hTfR抗體之基因之DNA片段，可自以上述方式選擇出之噬菌體粒子單離編碼高親和性抗體之基因。 可使用利用酶免疫測定法(EIA，ELISA)之直接及間接夾心分析、流式細胞儀、表面電漿子共振法(以下稱為「SPR法」)、生物膜層干涉法(以下稱為「BLI法」)、或免疫沈澱分析等眾所周知之結合分析，而選擇產生對於hTfR具有高親和性之抗體之融合瘤細胞。可自該高親和性抗體產生細胞製備cDNA，以其作為模板，藉由PCR法等擴增包含編碼抗hTfR抗體之輕鏈、抗hTfR抗體之重鏈、或作為抗hTfR抗體之單鏈抗體之全部或其一部分之基因的DNA片段並進行單離。同樣地，亦可藉由PCR法等擴增包含編碼抗hTfR抗體之輕鏈之可變區之全部或其一部分之基因的DNA片段、包含編碼抗hTfR抗體之重鏈之可變區之全部或其一部分之基因的DNA片段並進行單離。 將該編碼具有高親和性之抗hTfR抗體之輕鏈及重鏈之基因之全部或其一部分組入至表現載體，使用該表現載體將哺乳動物細胞等宿主細胞進行轉形，對所獲得之轉形細胞進行培養，藉此可產生具有高親和性之抗hTfR抗體。亦可自編碼所單離之抗hTfR抗體之基因之鹼基序列轉譯抗hTfR抗體之胺基酸序列，而人工合成編碼該胺基酸序列之DNA片段。於人工合成DNA片段之情形時，亦可藉由選擇適當之密碼子而增加宿主細胞中之抗hTfR抗體之表現量。 為了對於原本之抗hTfR抗體對胺基酸序列施加置換、缺失、附加等突變，亦可於編碼單離出之DNA片段所包含之抗hTfR抗體之基因施加適當突變。編碼施加有突變之抗hTfR抗體之基因較佳為與原本之基因具有80%以上之同源性者，更佳為具有90%以上之同源性者，但同源性並無特別限制。藉由對胺基酸序列施加突變，亦可改變與抗hTfR抗體結合之糖鏈之數量、糖鏈之種類以增加生物體內之抗hTfR抗體之穩定性。 於對編碼抗hTfR抗體之輕鏈之可變區之全部或其一部分的基因施加突變之情形時，施加有突變之基因較佳為與原本之基因具有80%以上之同源性者，更佳為具有90%以上之同源性者，同源性並無特別限制。於利用其他胺基酸置換輕鏈之可變區之胺基酸序列之胺基酸之情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個，進而更佳為1～2個。於使輕鏈之可變區之胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個，進而更佳為1～2個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變。於輕鏈之可變區附加胺基酸之情形時，於輕鏈之可變區之胺基酸序列中或者N末端或C末端附加較佳為1～10個、更佳為1～5個、進而較佳為1～3個、進而更佳為1～2個胺基酸。亦可施加將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變。施加有突變之輕鏈之可變區之胺基酸序列較佳為與原本之輕鏈之可變區之胺基酸序列具有80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性。尤其是於利用其他胺基酸置換CDR之胺基酸序列之胺基酸之情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～5個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，進而更佳為1個。於使CDR之胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～5個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，進而更佳為1個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變。於附加胺基酸之情形時，於該胺基酸序列中或者N末端或C末端附加較佳為1～5個、更佳為1～3個、進而較佳為1～2個、進而更佳為1個胺基酸。亦可施加將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變。施加有突變之各CDR之胺基酸序列較佳為與原本之各CDR之胺基酸序列具有80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性。 於對編碼抗hTfR抗體之重鏈之可變區之全部或其一部分之基因施加突變之情形時，施加有突變之基因較佳為與原本之基因具有80%以上之同源性者，更佳為具有90%以上之同源性者，同源性並無特別限制。於利用其他胺基酸置換重鏈之可變區之胺基酸序列之胺基酸的情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個，進而更佳為1～2個。於使重鏈之可變區之胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個，進而更佳為1～2個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變。於重鏈之可變區附加胺基酸之情形時，於重鏈之可變區之胺基酸序列中或者N末端或C末端附加較佳為1～10個、更佳為1～5個、進而較佳為1～3個、進而更佳為1～2個胺基酸。亦可施加將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變。施加有突變之重鏈之可變區之胺基酸序列較佳為與原本之重鏈之可變區之胺基酸序列具有80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性。尤其是於利用其他胺基酸置換CDR之胺基酸序列之胺基酸之情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～5個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，進而更佳為1個。於使CDR之胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～5個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，進而更佳為1個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變。於附加胺基酸之情形時，於該胺基酸序列中或者N末端或C末端附加較佳為1～5個、更佳為1～3個、進而較佳為1～2個、進而更佳為1個胺基酸。亦可施加將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變。施加有突變之各CDR之胺基酸序列較佳為與原本之各CDR之胺基酸序列具有80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性。 亦可組合上述對於抗hTfR抗體之輕鏈之可變區之突變、與上述對於抗hTfR抗體之重鏈之可變區之突變，而對於抗hTfR抗體之輕鏈與重鏈之可變區兩者施加突變。 作為上述抗hTfR抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸序列中之胺基酸的利用其他胺基酸之置換，例如可列舉：芳香族胺基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族胺基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性胺基酸(Gln、Asn)、鹼性胺基酸(Lys、Arg、His)、酸性胺基酸(Glu、Asp)、具有羥基之胺基酸(Ser、Thr)等分類為相同群組之胺基酸間的置換。關於利用此種類似胺基酸之置換，預測不會給蛋白質之表型帶來變化(即，為保守性胺基酸置換)。 再者，於對抗hTfR抗體施加突變而於C末端或N末端附加有胺基酸之情形時，該所附加之胺基酸於使抗hTfR抗體與BDNF融合時位於抗hTfR抗體與BDNF之間，於此情形時，該所附加之胺基酸構成連接子之一部分。針對於抗hTfR抗體與BDNF之融合蛋白質中配置於抗hTfR抗體與BDNF之間之連接子序列，於以下進行詳述。 對藉由上述方法等選擇出之產生對於hTfR具有相對較高之親和性之抗hTfR抗體的細胞進行培養而獲得之抗hTfR抗體、及使編碼具有高親和性之抗hTfR抗體之基因表現而獲得之抗hTfR抗體亦可藉由對其胺基酸序列導入置換、缺失、附加等突變，而修飾為具有所需特性之抗體。對於抗hTfR抗體之胺基酸序列之突變導入係藉由如下方式進行，即對與其胺基酸序列對應之基因施加突變。 抗hTfR抗體可藉由對其抗體之可變區之胺基酸序列施加置換、缺失、附加等突變，而適當調整抗體對於hTfR之親和性。例如，於抗體與抗原之親和性較高，且於水性液中之解離常數明顯較低之情形時，將抗體投予至生物體內時，抗體未與抗原解離，其結果為，有可能產生功能上之異常。於此種情形時，藉由對抗體之可變區導入突變，而將解離常數階段性地調整為原本之抗體之2～5倍、5～10倍、10～100倍等，而可獲得符合目標之最佳抗體。相反地，亦可藉由該突變之導入，而將解離常數階段性地調整為原本之抗體之1/2～1/5倍、1/5～1/10倍、1/10～1/100倍等。 對抗hTfR抗體之胺基酸序列導入置換、缺失、附加等突變時，例如藉由如下方式進行：以編碼抗hTfR抗體之基因為模板，藉由PCR等方法對基因之鹼基序列之特定部位導入突變，或隨機地導入突變。 以調整抗體與hTfR之親和性為目的之對抗hTfR抗體之胺基酸序列的突變之導入例如可藉由如下方式實現：將編碼作為單鏈抗體之抗hTfR抗體之基因組入至噬菌粒中，使用該噬菌粒而製作使單鏈抗體於衣殼表面上表現出之噬菌體，使突變原等進行作用，藉此於編碼單鏈抗體之基因上導入突變並且使噬菌體增生，藉由上述方法，自所增生之噬菌體中選擇表現具有所需解離常數之單鏈抗體之噬菌體，或者於一定條件下使用抗原管柱進行純化。 由上述融合瘤細胞產生之抗體係藉由實施例7所記載之方法所測定之與hTfR的解離常數(KD )較佳為1×10-8 M以下者，更佳為1×10-9 M以下者，進而較佳為1×10-10 M以下者，進而更佳為1×10-11 M以下者。例如作為較佳者，可列舉：解離常數為1×10-13 M～1×10-9 M者、解離常數為1×10-13 M～1×10-10 M者。即便抗體為單鏈抗體亦相同。暫時獲得之抗體可以對編碼該抗體之基因導入突變等而具有所需特性之方式適當進行修飾。 自以上述方式獲得之抗hTfR抗體中選擇具有對於猴TfR之親和性之抗體，藉此可獲得對於人類及猴之TfR均具有親和性之抗體。具有對於猴TfR之親和性之抗體例如可藉由使用利用基因重組技術所製作之重組猴TfR之ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯免疫吸附測定)法等進行選擇。於該ELISA法中，將重組猴TfR添加至培養盤中並將之保持在其中後，使之與抗hTfR抗體接觸，繼而將未與重組猴TfR結合之抗體自培養盤去除，測定培養盤中所保持之抗體之量。對於重組猴TfR之親和性越高，培養盤中所保持之抗體之量變得越多，因此可選擇與保持有更多抗體之培養盤對應之抗體作為對猴TfR具有親和性之抗體。再者，此處所謂「猴」，較佳為除人類外之分類為類人猿類者，更佳為分類為猴科(Cercopithecidae)者，進而較佳為分類為獼猴屬(Macaca)者，例如為食蟹猴或恆河獼猴，尤其是食蟹猴適合用於評價。 對於人類及猴之hTfR均具有親和性之抗體具有如下有利之效果：可使用猴來觀察投予了該抗體與BDNF之融合蛋白質時之於生物體內之動態。例如，於將本發明之抗hTfR抗體與BDNF之融合蛋白質進行醫藥開發之情形時，可用猴來實施該醫藥之藥物動力學試驗，因此可顯著地促進該醫藥之開發。 本發明中，關於對於hTfR具有相對較高之親和性且對於猴TfR亦具有親和性之抗體，尤其是藉由實施例7所記載之方法進行測定時，與人類及猴之TfR之解離常數為如下者： (a)與hTfR之解離常數：較佳為1×10-10 M以下，更佳為2.5×10-11 M以下，進而較佳為5×10-12 M以下，進而更佳為1×10-12 M以下， (b)與猴TfR之解離常數：較佳為1×10-9 M以下，更佳為5×10-10 M以下，進而較佳為1×10-10 M以下，例如為7.5×10-11 M以下。 例如，可列舉與hTfR及猴TfR之解離常數分別為1×10-10 M以下與1×10-9 M以下、1×10-11 M以下與5×10-10 M以下、5×10-12 M以下與1×10-10 M以下、5×10-12 M以下與7.5×10-11 M以下、1×10-12 M以下與1×10-10 M以下、1×10-12 M以下與7.5×10-11 M以下者。此處，與人類TfR之解離常數並無特別明確之下限，例如可設為5×10-13 M、1×10-13 M等。又，與猴TfR之解離常數亦無特別明確之下限，例如可設為1×10-11 M、1×10-12 M等。即便抗體為單鏈抗體亦相同。 關於藉由上述選擇產生高親和性抗體之細胞之方法而獲得之對於hTfR具有相對較高之親和性的抗體，於為人類以外之動物之抗體之情形，可設為人源化抗體。所謂人源化抗體，係指藉由一邊維持對於抗原之特異性，一邊使用人類以外之動物之抗體之可變區的一部分(例如，尤其是CDR之全部或一部分)之胺基酸序列，利用該序列置換人類抗體之適當區域(該序列向人類抗體之移植)而獲得之抗體。例如作為人源化抗體，可列舉：構成人類抗體之免疫球蛋白輕鏈之3個互補決定區域(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3個互補決定區域(CDR)經其他哺乳動物之CDR置換之抗體。關於組入至人類抗體中之CDR所源自之生物物種，只要為人類以外之哺乳動物，則無特別限定，較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、人類以外之靈長類，更佳為小鼠及大鼠，進而較佳為小鼠。但是，亦可設為人類抗體之一部分經其他人類抗體之一部分置換之抗體。 人源化抗體之製作方法於該技術領域中眾所周知，最常用的是基於Winter等人所發明之用非人類哺乳動物之抗體之CDR置換處於人類抗體之可變區之互補決定區域(CDR)的胺基酸序列之方法(Verhoeyen M. Science. 239. 1534-1536 (1988))者。此處，亦眾所周知有如下情形，即為了再現施體抗體所具有之原本活性，需要不僅藉由非人類哺乳動物之抗體之CDR，亦藉由與CDR之結構保持或同抗原之結合相關之CDR外之區域的胺基酸序列而置換成為受體之人類抗體之相應部位(Queen C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86. 10029-10033 (1989))。此處，CDR外之區域亦稱為架構區(FR)。 抗體之重鏈與輕鏈之可變區均包含4個架構區1～4(FR1～4)。FR1係於其N末端側與CDR1鄰接之區域，且於構成重鏈及輕鏈之各肽中，包含自其N末端直至與CDR1之N末端鄰接之胺基酸之胺基酸序列。FR2於構成重鏈及輕鏈之各肽中，包含CDR1與CDR2之間之胺基酸序列。FR3於構成重鏈及輕鏈之各肽中，包含CDR2與CDR3之間之胺基酸序列。FR4包含自與CDR3之C末端鄰接之胺基酸直至可變區之C末端之胺基酸序列。但是，並不限於此，於本發明中，於上述各FR區域中，亦可將除其N末端側之1～5個胺基酸及/或C末端側之1～5個胺基酸以外之區域設為架構區。 人源化抗體之製作包括如下作業：代替人類抗體之可變區CDR(及視情形之其周邊之FR)，移植非人類哺乳動物之抗體之CDR(及視情形之其周邊之FR)。於該作業中，原本之人類抗體之可變區之架構區可自包含生殖細胞系列抗體基因序列之公共DNA資料庫等獲得。例如，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖細胞系列DNA序列及胺基酸序列可自「VBase」人類生殖細胞系序列資料庫(於網際網路中能夠於www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase中獲取)中選擇。此外，亦可自公表之文獻、例如「Kabat EA. Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與人群服務部，NIH Publication No. 91-3242 (1991)」、「Tomlinson IM. J. Mol. Biol. 227. 776-98 (1992)」、「Cox JPL. Eur. J Immunol. 24：827-836 (1994)」等所記載之DNA序列及胺基酸序列中進行選擇。 如上所述，於人源化抗體中，移植至原本之人類抗體之可變區之非人類哺乳動物的抗體之區域一般包含CDR其本身、或者CDR與其周邊之FR。但是，與CDR一併移植來之FR亦與CDR之結構保持或同抗原之結合相關，而認為實質上具有決定抗體之互補性之功能，因此於本發明中「CDR」一詞於製作人源化抗體之情形時，係指自非人類哺乳動物之抗體移植至人源化抗體之區域、或可移植之區域。即，於CDR中，即便為一般視為FR之區域，只要其為與CDR之結構保持或同抗原之結合相關，而認為實質上具有決定抗體之互補性之功能者，則於本發明中亦包含於CDR中。 本發明中之抗hTfR抗體於將其藉由靜脈注射等投予至生物體內之情形時，可高效率地結合至存在於腦內之微血管之內皮細胞上之hTfR。又，已與hTfR結合之抗體係藉由內噬作用、胞吞轉送作用等機制通過血腦障壁而摻入至腦內。因此，藉由預先使BDNF與本發明之抗hTfR抗體結合，可使BDNF高效率地通過血腦障壁而到達至腦內。又，本發明之抗hTfR抗體可在通過血腦障壁後，到達至大腦之腦實質、海馬區之神經細胞、小腦之浦金埃氏細胞等、或者至少該等中之任一者。並且，亦預計會到達至大腦紋狀體之神經細胞及中腦黑質之神經細胞。因此，可藉由使BDNF與本發明之抗hTfR抗體結合而到達至該等組織或細胞。 於使通常而言由於無法通過血腦障壁，故而於靜脈內投予時於腦內無法發揮功能之BDNF自血中到達至腦內以於腦內發揮功能的方面上，使用抗hTfR抗體與BDNF之融合蛋白質可成為有效之方法。尤其是本發明之抗hTfR抗體與BDNF之融合蛋白質在通過血腦障壁後，到達至大腦之腦實質、海馬區之神經細胞、小腦之浦金埃氏細胞(Purkinje cell)等、或者至少該等中之任一者。並且，亦預計會到達至大腦紋狀體(striatum)之神經細胞及中腦黑質之神經細胞。因此，可藉由利用靜脈內投予將BDNF以與本發明之抗hTfR抗體分子結合之形態等進行血中投予，而於該等腦組織或細胞中發揮或強化BDNF之功能。 本說明書中，BDNF係於1982年由Barde等人發現，且係於1990年由Jones等人選殖之公知蛋白質(EMBO J, (1982) 1: 549-553, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 8060-8064)，作為一例，表示序列編號51之人類成熟BDNF之胺基酸序列，但亦可為包含實質上與其同源之胺基酸序列之蛋白質，或者源自其他溫血動物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、雞、兔、狗、豬、羊、牛、猴等)之BDNF。 又，於本說明書中，所謂BDNF，不僅為表示人類成熟BDNF之特定胺基酸序列(序列編號51)所表示之「蛋白質」或「(多)肽」，只要具有與該等同質之功能，則亦包含其同族體(同源物(homolog)或剪切突變體)、突變體、衍生物及胺基酸修飾體等。 此處，所謂「同質之功能」，意指例如自生理學或藥理學之方面來看，該性質在定性上相同，功能之程度(例如，約0.1～約10倍、較佳為0.5～2倍)，或蛋白質之分子量等定量要素亦可不同。又，將具有天然BDNF所具有之功能、例如(1)對於BDNF受體(TrkB)之結合親和性、(2)BDNF受體之磷酸化活性、(3)對於神經細胞之增生促進作用、(4)對於神經細胞之存活維持作用、(5)對於神經細胞之神經突起伸展作用，或者(6)可由特異性地識別包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質之抗體識別的蛋白質視為與BDNF「具有同質之功能之蛋白質」。 關於上述之BDNF之功能，可使用如下述「(2)BDNF之功能之評價方法」之項所記載之公知的各種評價方法、或本說明書之實施例23以後所記載之方法進行調查。 此處作為同源物，可例示與人類蛋白質對應之小鼠或大鼠等其他生物物種之蛋白質，該等除Maisonpierre等(Genomics(1991)10：558-568)所報告者以外，亦可自UniProt所揭示之蛋白質之胺基酸序列(P21237-1、P23363-1、P25429-1、Q7YRB4-1、P14082-1、Q5IS78-1、Q95106-1)等推斷性地鑑定。又，關於突變體，包含天然存在之對偶基因突變體、天然不存在之突變體、及具有藉由人為性之缺失、置換、附加或插入而經修飾之胺基酸序列的突變體。再者，作為上述突變體，可列舉與無突變之蛋白質或(多)肽至少70%、較佳為80%、更佳為90%、進而更佳為95%、進而再佳為97%、尤佳為98%、最佳為99%相同者。又，關於胺基酸修飾體，包含天然存在之胺基酸修飾體、天然不存在之胺基酸修飾體，具體而言，可列舉胺基酸之磷酸化體。 進而，於本說明書中，所謂「BDNF」，亦可為可與BDNF發揮同質之功能之上述BDNF之前驅物(前原體)或自該前驅物切斷訊號序列所獲得之前體，且不僅為表示人類BDNF前驅物之特定胺基酸序列(UniProt ID No.P23560-1)所示之「蛋白質」或「(多)肽」，只要與該等具有同質之功能，則包含其同族體(同源物或剪切突變體)、突變體、衍生物、前體及胺基酸修飾體等。作為人類BDNF之前體(BDNF前體)，可列舉序列編號56之胺基酸序列。 此處，所謂與BDNF前驅物同質之功能，意指BDNF前驅物所具有之功能、例如可生成BDNF之前體(BDNF前體)或成熟BDNF，所謂與BDNF前體同質之功能，意指BDNF前體所具有之功能、例如對於p75受體之結合親和性。 此處，作為人類BDNF前驅物之剪切突變體，可列舉UniProt所揭示之蛋白質之胺基酸序列(P23560-2、P23560-3、P23560-4、P23560-5)等。又，編碼該等人類BDNF前驅物蛋白質之基因亦公知，例如可列舉：http://www.ncbi.nlm.nih.gov所揭示之基因之鹼基序列(NM_001143805.1、NM_001143806.1、NM_001143807.1、NM_001143808.1、NM_001143809.1、NM_001143810.1、NM_001143811.1、NM_001143812.1、NM_001143813.1、NM_001143814.1、NM_001143816.1、NM_001709.4、NM_170731.4、NM_170732.4、NM_170733.3、NM_170734.3、NM_170735.5)等。 作為BDNF前驅物之同源物及其剪切突變體，可例示與人類蛋白質對應之小鼠或大鼠等其他生物物種之蛋白質及其剪切突變體，該等可自http://www.ncbi.nlm.nih.gov所揭示之基因之鹼基序列(NM_001048139.1、NM_001048141.1、NM_001048142.1、NM_001285416.1、NM_001285417.1、NM_001285418.1、NM_001285419.1、NM_001285420.1、NM_001285421.1、NM_001285422.1、NM_007540.4等小鼠BDNF基因之鹼基序列，NM_001270630.1、NM_001270631.1、NM_001270632.1、NM_001270633.1、NM_001270634.1、NM_001270635.1、NM_001270636.1、NM_001270637.1、NM_001270638.1、NM_012513.4等大鼠BDNF基因之鹼基序列)等推斷性地鑑定。 又，關於BDNF前驅物之突變體，包含天然存在之對偶基因突變體、天然不存在之突變體、及具有藉由人為性之缺失、置換、附加或插入而經修飾之胺基酸序列的突變體。再者，作為上述突變體，可列舉與無突變之蛋白質或(多)肽至少70%、較佳為80%、更佳為90%、進而較佳為95%、進而更佳為97%、尤佳為98%、最佳為99%相同者。又，關於胺基酸修飾體，包含天然存在之胺基酸修飾體、天然不存在之胺基酸修飾體，具體而言，可列舉胺基酸之磷酸化體。 作為序列編號51之胺基酸序列或與其實質上一致之胺基酸序列，可列舉以下之(A)～(E)： (A)序列編號51之胺基酸序列， (B)序列編號51之胺基酸序列中有1個或複數個胺基酸經缺失、附加、插入或置換，且與包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質具有同質之功能或者可由特異性地識別包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質之抗體識別之胺基酸序列， (C)與序列編號51之胺基酸序列具有至少80%以上之同源性，且與包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質具有同質之功能或者可由特異性地識別包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質之抗體識別之胺基酸序列， (D)由具有序列編號50之鹼基序列之DNA編碼之胺基酸序列，或者 (E)由與對於具有序列編號50之鹼基序列之DNA具有互補性之DNA在嚴格條件下進行雜交之DNA所編碼，且與包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質具有同質之功能或者可由特異性地識別包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質之抗體識別之胺基酸序列。 具體而言，可列舉：包含序列編號51之胺基酸序列之人類蛋白質之其他哺乳動物中之異種同源物的胺基酸序列、或者包含序列編號51之胺基酸序列之人類蛋白質或其異種同源物之剪切突變體、對偶基因突變體或多態性突變體中之胺基酸序列。 此處所謂「同源性」，意指於使用該技術領域中公知之數學演算法並使2個胺基酸序列對準之情形時，最佳比對(較佳為該演算法係可為了最佳比對而考慮向一序列或兩序列導入間隙者)中之同源胺基酸及類似胺基酸殘基相對於重疊之全部胺基酸殘基的比例(%)。所謂「類似胺基酸」，意指物理化學性質上相類似之胺基酸，例如可列舉：芳香族胺基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族胺基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性胺基酸(Gln、Asn)、鹼性胺基酸(Lys、Arg、His)、酸性胺基酸(Glu、Asp)、具有羥基之胺基酸(Ser、Thr)等分類為相同群組之胺基酸。關於利用此種類似胺基酸之置換，預測不會給蛋白質之表型帶來變化(即，為保守性胺基酸置換)。 關於本說明書中之胺基酸序列之同源性，可使用同源性計算演算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment SearchTool)，於以下之條件(期待值＝10；容許間隙；矩陣＝BLOSUM62；過濾＝OFF)下進行計算。作為用以確定胺基酸序列之同源性之其他演算法，例如可列舉：Karlin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)所記載之演算法[該演算法係組入至NBLAST及XBLAST程式(version 2.0)中(Altschul等人，Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]；Needleman等人，J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)所記載之演算法[該演算法係組入至GCG軟體包中之GAP程式中]；Myers及Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)所記載之演算法[該演算法係組入至作為CGC序列比對軟體包之一部分之ALIGN程式(version 2.0)中]；Pearson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)所記載之演算法[該演算法係組入至GCG軟體包中之FASTA程式中]等，該等亦同樣地可較佳地使用。 所謂上述(E)中之嚴格條件，例如可列舉：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, 6.3.1-6.3.6, 1999所記載之條件，例如於6×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)/45℃下雜交，繼而於0.2×SSC/0.1% SDS/50～65℃下洗淨一次以上等，若為業者，則可適當選擇提供與其同等之嚴格度之雜交條件。 更佳為，作為「與序列編號51之胺基酸序列實質上同源之胺基酸序列」，可列舉：與序列編號51之胺基酸序列具有約70%以上、較佳為約80%以上、更佳為約90%以上、進而較佳為約95%以上、進而更佳為約97%以上、尤佳為約98%以上、最佳為約99%以上之同源性之胺基酸序列。 本發明中之蛋白質：作為BDNF，例如亦含有包含 (i)序列編號51之胺基酸序列中缺失有1～30個、較佳為1～20個、更佳為1～10個、進而較佳為1～數(6、5、4、3或2)個胺基酸之胺基酸序列， (ii)於序列編號51之胺基酸序列中附加有1～30個、較佳為1～20個、更佳為1～10個、進而較佳為1～數(6、5、4、3或2)個胺基酸之胺基酸序列， (iii)於序列編號51之胺基酸序列中插入有1～30個、較佳為1～20個、更佳為1～10個、進而較佳為1～數(6、5、4、3或2)個胺基酸之胺基酸序列， (iv)序列編號51之胺基酸序列中之1～30個、較佳為1～20個、更佳為1～10個、進而較佳為1～數(6、5、4、3或2)個胺基酸經其他胺基酸置換之胺基酸序列， 或者 (v)組合有該等之胺基酸序列之蛋白質等所謂突變體。 於如上述般胺基酸序列經插入、缺失、附加或置換之情形時，關於其插入、缺失、附加或置換之位置，只要施加有此種變更之蛋白質與包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質具有同質之功能，或者可由特異性地識別包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質之抗體所識別，則無特別限定。例如除包含序列編號51之胺基酸序列之成熟BDNF以外，於其N末端附加有甲硫胺酸而成之Met-BDNF等亦只要與包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質具有同質之功能，則作為BDNF可用於本發明之融合蛋白質。 此處作為人為地進行胺基酸之缺失、附加、插入或置換之情形時之方法，例如可列舉如下方法：對於編碼序列編號51之胺基酸序列之DNA實施慣用之定點突變，其後藉由常規方法使該DNA表現。此處作為定點突變法，例如可列舉：應用琥珀型無竟義突變體(amber mutant)之方法((帶)缺口雙鏈體(gapped duplex)法，Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984))、基於使用突變導入用引子之PCR之方法等。 作為BDNF之較佳例，例如可列舉：包含序列編號51之胺基酸序列之人類蛋白質、或者其對偶基因突變體或多態性突變體等。 「編碼BDNF之基因」係表示具有編碼上述(A)～(E)所示之序列編號51之胺基酸序列或與其實質上一致之胺基酸序列之鹼基序列的基因。具體而言，可列舉具有以下(F)～(J)之鹼基序列之基因： (F)編碼序列編號51之胺基酸序列之鹼基序列， (G)編碼於序列編號51之胺基酸序列中有1個或複數個胺基酸經缺失、附加、插入或置換，且與包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質具有同質之功能或者可由特異性地識別包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質之抗體所識別之胺基酸序列的鹼基序列， (H)編碼與序列編號51之胺基酸序列具有至少80%以上之同源性，且與包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質具有同質之功能或者可由特異性地識別包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質之抗體所識別之胺基酸序列的鹼基序列， (I)編碼由具有序列編號50之鹼基序列之DNA所編碼之胺基酸序列的鹼基序列，或者 (J)編碼由與對於具有序列編號50之鹼基序列之DNA具有互補性之DNA在嚴格條件下進行雜交之DNA所編碼，且與包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質具有同質之功能或者可由特異性地識別包含序列編號51之胺基酸序列之蛋白質之抗體所識別之胺基酸序列。 再者，此處所謂基因，亦可為cDNA或基因組DNA等DNA，或者mRNA等RNA之任一者，又，係一併包含單鏈之核酸序列及雙鏈之核酸序列之概念。又，本說明書中，序列編號2、序列編號24、序列編號26、序列編號28、序列編號30、序列編號38、序列編號40、序列編號50、序列編號53、序列編號55、序列編號58、序列編號64等所示之核酸序列係為了方便起見而以DNA序列之形式記載，但於表示mRNA等RNA序列之情形時，將胸腺嘧啶(T)替換為尿嘧啶(U)。 又，作為本發明所使用之BDNF，亦可為經聚乙二醇(PEG)等具有蛋白質穩定作用之分子等修飾之衍生物等(Drug Delivery System (1998); 13: 173-178)。 作為本發明中之抗hTfR抗體與人類BDNF之融合蛋白質之一例，可列舉：於構成抗hTfR抗體之「重鏈」之C末端側經由連接子序列而融合有人類BDNF之類型者。作為此種融合蛋白質，可例示： (1)如下融合蛋白質，即人源化抗hTfR抗體之輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 人源化抗hTfR抗體之重鏈為於其C末端側經由包含胺基酸序列Gly-Ser之連接子而與人類BDNF結合，藉此包含序列編號52之胺基酸序列而成者；及 (2)如下融合蛋白質，即人源化抗hTfR抗體之輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且人源化抗hTfR抗體之重鏈為於其C末端側經由包含繼胺基酸序列Gly-Ser之後連接5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)而成之共計27個胺基酸序列的連接子而與人類BDNF結合，藉此包含序列編號54之胺基酸序列而成者。 上述(1)及(2)所記載之融合蛋白質係 (1)如下融合蛋白質，即包含具有序列編號23之胺基酸序列之人源化抗hTfR抗體之輕鏈、與於具有序列編號70之胺基酸序列之人源化抗hTfR抗體之重鏈之C末端側，經由包含胺基酸序列Gly-Ser之連接子而結合有具有序列編號51之胺基酸序列之人類BDNF者；及 (2)如下融合蛋白質，即包含具有序列編號23之胺基酸序列之人源化抗hTfR抗體之輕鏈、與於具有序列編號70之胺基酸序列之人源化抗hTfR抗體之重鏈之C末端側，經由包含繼胺基酸序列Gly-Ser之後連接5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)而成之共計27個胺基酸的連接子而結合有具有序列編號51之胺基酸序列之人類BDNF者。 再者，於上述(1)及(2)中，可將人源化抗hTfR抗體之重鏈置換為自具有序列編號70之胺基酸序列者至具有序列編號72之胺基酸序列者。具有序列編號70與72之胺基酸序列者分別為IgG1型與IgG4型之抗體。作為編碼具有序列編號70之胺基酸序列者之鹼基序列，可例示序列編號71所示者，作為編碼具有序列編號72之胺基酸序列者之鹼基序列，可例示序列編號76所示者。 此種融合蛋白質例如可藉由利用組入有具有編碼序列編號52之胺基酸序列之鹼基序列(序列編號53)之DNA片段的表現載體、與組入有具有編碼具有序列編號23之胺基酸序列之抗hTfR抗體輕鏈之鹼基序列(序列編號24)的DNA片段之表現載體使哺乳動物細胞等宿主細胞轉形，對該宿主細胞進行培養而製造。或者，可藉由利用組入有具有編碼序列編號54之胺基酸序列之鹼基序列(序列編號55)之DNA片段的表現載體、與組入有具有編碼具有序列編號23之胺基酸序列之抗hTfR抗體輕鏈之鹼基序列(序列編號24)的DNA片段之表現載體使哺乳動物細胞等宿主細胞轉形，對該宿主細胞進行培養而製造。 作為結合人類BDNF之抗hTfR抗體之一個較佳態樣，可列舉該抗體之抗原結合性片段，具體而言，單鏈抗體、Fab、F(ab')及F(ab')2 等。 作為抗hTfR抗體為單鏈抗體之情形時本發明中之人源化抗hTfR抗體與人類BDNF之融合蛋白質的具體態樣之一例，可例示：於人類BDNF之C末端側經由包含繼胺基酸序列Gly-Ser之後連接5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)而成之共計27個胺基酸的第1連接子序列，而結合有單鏈抗體者，即包含序列編號59或60之胺基酸序列者。此處，該單鏈抗體係於具有序列編號69之胺基酸序列之重鏈之可變區的C末端，經由包含3個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成之共計15個胺基酸之第2連接子序列，而結合有具有序列編號18之胺基酸序列之輕鏈之可變區者，且係具有序列編號57之胺基酸序列者。因此，作為於抗hTfR抗體為單鏈抗體之情形時本發明之人源化抗hTfR抗體與人類BDNF之融合蛋白質的具體態様之一例，可例示：於包含具有序列編號69之胺基酸序列之重鏈可變區與具有序列編號18之胺基酸序列之輕鏈可變區的單鏈抗體之N末端側，直接或經由連接子而結合有人類BDNF者，即融合蛋白質。 關於抗hTfR抗體為單鏈抗體之此種融合蛋白質，例如可藉由利用組入有具有編碼序列編號59之胺基酸序列之鹼基序列(序列編號58)之DNA片段的表現載體使哺乳動物細胞等宿主細胞轉形，對該宿主細胞進行培養而製造。 作為抗hTfR抗體為單鏈抗體之情形時本發明中之人源化抗hTfR抗體與人類BDNF之融合蛋白質的其他具體態樣之一例，可列舉：於具有序列編號61所記載之胺基酸序列之人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈的C末端側，經由包含於序列編號3所示之胺基酸序列6次接連之胺基酸序列後接著胺基酸序列Gly-Gly的32個胺基酸之連接子，而結合有具有序列編號23所記載之胺基酸序列之抗hTfR抗體輕鏈者，即於具有序列編號90所記載之胺基酸序列之單鏈抗體結合有人類BDNF者。人類BDNF可結合至該單鏈抗體之C末端側或N末端側之任一側，較佳為N末端側。又，人類BDNF可直接或經由連接子結合至該單鏈抗體。 再者，於本發明中在1個肽鏈中包含複數個連接子序列之情形時，為了方便起見，各連接子序列自N末端側開始依序稱為第1連接子序列、第2連接子序列。 作為抗hTfR抗體為Fab之情形時本發明之人源化抗hTfR抗體與人類BDNF之融合蛋白質的具體態樣之一例，可列舉：於人類BDNF之C末端側，經由包含由5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成之共計25個胺基酸之連接子序列，而融合有包含抗hTfR抗體重鏈之可變區與CH 1區域之區域者。此時除CH 1區域外，亦可包含鉸鏈部之一部分，該鉸鏈部不包含形成重鏈間之二硫鍵之半胱胺酸殘基。序列編號63及65所示者係其較佳之一例。序列編號63所示者包含序列編號56所示之人類BDNF前體之胺基酸序列，序列編號65所示者包含序列編號51所示之人類成熟BDNF之胺基酸序列。 序列編號63及65中之抗hTfR抗體Fab重鏈之胺基酸序列係相當於序列編號70所示之人源化抗hTfR抗體之重鏈之胺基酸序列的自N末端至第1～226位之部分，包含序列編號61之胺基酸序列。再者，序列編號61之自N末端至第1～118位之部分相當於可變區(序列編號69)，第119～216位之部分相當於CH 1區域，第217～226位之部分相當於鉸鏈部。作為於抗hTfR抗體為Fab之情形時本發明中之人源化抗hTfR抗體與人類BDNF之融合蛋白質的具體態樣之一例，可列舉：於人源化抗hTfR抗體之Fab、F(ab')2 或F(ab')之任一者之重鏈之N末端側，直接或經由連接子而結合有人類BDNF者作為融合蛋白質較佳之一態樣。 作為抗hTfR抗體為Fab之情形時本發明中之人源化抗hTfR抗體與人類BDNF之融合蛋白質的具體態樣之一例，可列舉如下融合蛋白質，其係輕鏈包含序列編號23之胺基酸序列，且重鏈為包含序列編號61之胺基酸序列之Fab重鏈，於該重鏈之N末端側直接或經由連接子結合人類BDNF而成者。更具體而言，可列舉如下融合蛋白質： (1)輕鏈包含序列編號23之胺基酸序列，且包含Fab重鏈與在其N末端側直接或經由連接子結合之人類BDNF前體的部分包含序列編號63之胺基酸序列者；及， (2)輕鏈包含序列編號23之胺基酸序列，且包含Fab重鏈與在其N末端側直接或經由連接子結合之人類BDNF的部分包含序列編號65之胺基酸序列者。 抗hTfR抗體為Fab之此種融合蛋白質例如亦可藉由如下方式進行製造：利用組入有具有編碼序列編號63之胺基酸序列之鹼基序列(序列編號62)之DNA片段的表現載體、與組入有具有編碼具有序列編號23之胺基酸序列之抗hTfR抗體輕鏈之鹼基序列(序列編號24)之DNA片段的表現載體使哺乳動物細胞等宿主細胞轉形，對該宿主細胞進行培養。 抗hTfR抗體為Fab之此種融合蛋白質例如亦可藉由如下方式進行製造：利用組入有具有編碼序列編號65之胺基酸序列之鹼基序列(序列編號64)之DNA片段的表現載體、與組入有具有編碼具有序列編號23之胺基酸序列之抗hTfR抗體輕鏈之鹼基序列(序列編號24)之DNA片段的表現載體使哺乳動物細胞等宿主細胞轉形，對該宿主細胞進行培養。 再者，於對人類BDNF(hBDNF)施加突變而於C末端或N末端附加有胺基酸之情形時，該附加之胺基酸於使hBDNF與抗hTfR抗體融合時位於hBDNF與抗hTfR抗體之間，於該情形時，該附加之胺基酸構成連接子之一部分。 作為使抗hTfR抗體與BDNF結合之方法，有經由非肽連接子或肽連接子而結合之方法。作為非肽連接子，可使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖類、葡聚糖、聚乙烯醚、生物降解性高分子、脂質聚合物、甲殼素類、及玻尿酸、或者該等之衍生物、或組合有該等者。肽連接子係由肽鍵結之1～50個胺基酸所構成之肽鏈或其衍生物，且係其N末端與C末端分別與抗hTfR抗體或BDNF之任一者形成共價鍵，藉此使抗hTfR抗體與BDNF結合者。 使用PEG作為非肽連接子而使本發明之抗hTfR抗體與BDNF結合所得者尤其是指抗hTfR抗體-PEG-BDNF。抗hTfR抗體-PEG-BDNF可藉由使抗hTfR抗體與PEG結合而製作抗hTfR抗體-PEG，繼而使抗hTfR抗體-PEG與BDNF結合而製造。或者，抗hTfR抗體-PEG-BDNF亦可藉由使BDNF與PEG結合而製作BDNF-PEG，繼而使BDNF-PEG與抗hTfR抗體結合而製造。於使PEG與抗hTfR抗體及BDNF結合時，可使用經碳酸酯、羰基咪唑、羧酸之活性酯、吖內酯、環狀醯亞胺硫酮、異氰酸酯、異硫氰酸酯、醯亞胺酯、或醛等官能基修飾之PEG。該等導入至PEG中之官能基主要與抗hTfR抗體及BDNF分子內之胺基進行反應，藉此PEG與hTfR抗體及BDNF進行共價鍵結。此時所使用之PEG之分子量及形狀並無特別限定，其平均分子量(MW)較佳為MW＝500～60000，更佳為MW＝500～20000。例如，平均分子量為約300、約500、約1000、約2000、約4000、約10000、約20000等之PEG可適宜地用作非肽連接子。 例如，抗hTfR抗體-PEG可藉由將抗hTfR抗體與醛基改性PEG(ALD-PEG-ALD)以該改性PEG相對於該抗體之莫耳比成為11、12.5、15、110、120等之方式進行混合，於其中添加NaCNBH3 等還原劑並進行反應而獲得。繼而，使抗hTfR抗體-PEG於NaCNBH3 等還原劑之存在下與BDNF進行反應，藉此可獲得抗hTfR抗體-PEG-BDNF。亦可相反地首先使BDNF與ALD-PEG-ALD結合而製作BDNF-PEG，繼而使BDNF-PEG與抗hTfR抗體結合，藉此獲得抗hTfR抗體-PEG-BDNF。 BDNF由於其二聚物結合至存在於靶細胞表面上之高親和性BDNF受體，故而認為以二聚物發揮作用，但與抗hTfR抗體結合之BDNF可為1分子，亦可為2分子。例如，可使BDNF與使1分子之BDNF結合至抗hTfR抗體而成之融合蛋白質進行反應而製成二聚物，亦可設為2分子之BDNF結合至抗hTfR抗體而成之融合蛋白質。又，該結合亦可如下述般將抗hTfR抗體與編碼BDNF之DNA組入至表現載體而獲得，亦可藉由在分別製造抗hTfR抗體與BDNF後使該等進行化學結合而製作。具體而言，抗hTfR抗體與BDNF可藉由於抗hTfR抗體之重鏈或輕鏈之C末端側或N末端側經由連接子序列或直接利用肽鍵分別結合BDNF之N末端或C末端而一體化。作為BDNF與抗hTfR抗體之融合蛋白質之一個較佳態樣，可列舉：於抗hTfR抗體之重鏈或輕鏈之N末端側經由連接子序列或直接地結合BDNF之C末端而成之融合蛋白質。 如上述般，作為使人類BDNF結合之抗hTfR抗體之1個較佳態樣，可列舉該抗體之抗原結合性片段，具體而言，單鏈抗體、Fab、F(ab')及F(ab')2 。因此，作為BDNF與抗hTfR抗體之融合蛋白質之1個較佳態樣，可例示如以下融合蛋白質。 (1)該融合蛋白質係BDNF與抗hTfR抗體之融合蛋白質，且係如下者，即該抗hTfR抗體為抗原結合性片段，於該抗原結合性片段之N末端側直接或經由連接子而結合有人類BDNF者。 (2)該融合蛋白質係BDNF與抗hTfR抗體之融合蛋白質，且係如下者，即該抗hTfR抗體為單鏈抗體，於該單鏈抗體之N末端側直接或經由連接子而結合有人類BDNF。 (3)該融合蛋白質係BDNF與抗hTfR抗體之融合蛋白質，且係如下者，即該抗hTfR抗體為Fab、F(ab')2 、或F(ab')之任一者，於該等Fab、F(ab')2 、或F(ab')之重鏈或輕鏈之N末端側直接或經由連接子而結合有人類BDNF。 此處，於上述(3)之情形時，人類BDNF可尤佳地與抗hTfR抗體之Fab、F(ab')2 、或F(ab')之任一者之重鏈之N末端側結合。因此，更具體而言，可例示如以下融合蛋白質。 (4)該融合蛋白質係BDNF與抗hTfR抗體之融合蛋白質，且係如下者，即該抗hTfR抗體為Fab、F(ab')2 、或F(ab')之任一者，於該等Fab、F(ab')2 、或F(ab')之重鏈之N末端側直接或經由連接子而結合有人類BDNF。 於融合蛋白質中之抗hTfR抗體為Fab之形態之情形時，亦可製作於其中進而導入有另外之IgG之Fc區域之形態的新穎融合蛋白質。藉此，與原本之融合蛋白質相比，可提高於血中等生物體內之穩定性。作為包含Fc區域之此種融合蛋白質，例如可列舉：於人類BDNF之C末端側直接或經由連接子序列而結合人類IgG Fc區域，繼而於其C末端側直接或經由連接子序列而結合該抗hTfR抗體之Fab重鏈而成者。 人類BDNF與人類IgG Fc區域之間之連接子序列較佳為由1～50個胺基酸所構成。此處，胺基酸之個數係適當調整為1～17個、1～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、27個等。此種連接子序列其胺基酸序列並無限定，較佳為由甘胺酸與絲胺酸所構成者。例如可列舉：包含甘胺酸或絲胺酸之任一個胺基酸者，包含胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列編號5)、或者該等胺基酸序列1～10個或2～5個連結而成之包含50個以下之胺基酸之序列、包含2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或25個胺基酸之序列等者。例如，包含由5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成之共計25個胺基酸序列者可適宜地用作連接子序列。關於人類IgG Fc區域與Fab重鏈之間之連接子序列亦相同。 再者，於製作包含人類IgG Fc區域之融合蛋白質之情形時，人類IgG Fc區域可結合至原本之抗hTfR抗體之重鏈與輕鏈之任一者。又，原本之抗體亦可為包含Fab、F(ab')2 、F(ab')、及單鏈抗體之任一種抗原結合性片段。 所導入之人類IgG Fc區域之IgG之類型並無特別限定，可為IgG1～IgG5之任一種。又，所導入之人類IgG Fc區域可為Fc區域之整體，亦可為其一部分。作為該人類IgG Fc區域之較佳一實施形態，可列舉作為人類IgG1之Fc之全區域之具有序列編號75所示之胺基酸序列者。Fc區域較佳為將BDNF、Fc區域及Fab重鏈以自N末端側開始依序存在之方式導入。例如，作為導入有Fc區域之融合蛋白質，可列舉：於BDNF之C末端側經由連接子序列結合有Fc區域之整體，於其C末端側經由連接子序列結合有抗hTfR抗體之重鏈Fab的包含序列編號74所示之胺基酸序列而成者作為一例。 抗hTfR抗體與hBDNF之融合蛋白質(抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質)亦可以具有對於白蛋白之親和性之方式進行修飾。該修飾例如可藉由於抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質中導入對於白蛋白具有親和性之物質(例如，對於白蛋白具有親和性之化合物、肽及蛋白質等)而進行。實施了該修飾之抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質(修飾融合蛋白質)係與白蛋白結合並於血中循環。白蛋白具有使與其結合之蛋白質穩定之功能。因此，修飾融合蛋白質於投予至生物體內時，於血中之半衰期變長，因此可強化其藥效。以具有對於白蛋白之親和性之方式進行修飾係於如下情形時更具效果，即抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質中之抗hTfR抗體為欠缺有助於抗體之穩定性之Fc區域者之情形、例如為Fab之情形。 又，於抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質投予至生物體內時，以具有對於白蛋白之親和性之方式進行修飾即便於如顯示出免疫原性之情形時亦具效果。藉由使修飾融合蛋白質與白蛋白結合，而阻礙抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質中之顯示出免疫原性之部位於免疫細胞呈現，因此降低免疫原性。 於抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質中導入具有對於白蛋白之親和性之物質之情形時，供導入該物質之部分可為抗hTfR抗體之輕鏈、抗hTfR抗體之重鏈、hBDNF、及連接子部分之任一者，亦可導入至該等2個以上之部分。 作為對於白蛋白具有親和性之肽或蛋白質，例如可使用具有序列編號85所示之胺基酸序列之對源自鏈球菌菌株(Streptococcus strain)G418之蛋白質的白蛋白結合區域(Alm T. Biotechnol J. 5. 605-17(2010))以顯示出鹼耐性之方式進行修飾而成之肽，但並不限定於此。作為使對於白蛋白具有親和性之肽或蛋白質(白蛋白親和性肽)與抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質結合之方法，有經由非肽連接子或肽連接子而結合之方法。作為非肽連接子，可使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖類、葡聚糖、聚乙烯醚、生物降解性高分子、脂質聚合物、甲殼素類、及玻尿酸、或者該等之衍生物、或組合有該等者。肽連接子係由肽鍵結之1～50個胺基酸所構成之肽鏈或其衍生物，且係其N末端與C末端分別與白蛋白親和性肽或融合蛋白質之任一者形成共價鍵，藉此使白蛋白親和性肽與融合蛋白質結合者。 使用PEG作為非肽連接子而使白蛋白親和性肽與抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質結合所得者尤其是指白蛋白親和性肽-PEG-融合蛋白質。白蛋白親和性肽-PEG-融合蛋白質可藉由使白蛋白親和性肽與PEG結合而製作白蛋白親和性肽-PEG，繼而使白蛋白親和性肽-PEG與抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質結合而製造。或者，白蛋白親和性肽-PEG-融合蛋白質亦可藉由使抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質與PEG結合而製作抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質-PEG，繼而使白蛋白親和性肽與抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質-PEG結合而製造。於使PEG與白蛋白親和性肽及抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質結合時，可使用經碳酸酯、羰基咪唑、羧酸之活性酯、吖內酯、環狀醯亞胺硫酮、異氰酸酯、異硫氰酸酯、醯亞胺酯、或醛等官能基修飾之PEG。該等導入至PEG之官能基主要與白蛋白親和性肽及抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質分子內之胺基進行反應，藉此PEG與白蛋白親和性肽及抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質進行共價鍵結。此時所使用之PEG之分子量及形狀並無特別限定，其平均分子量(MW)較佳為MW＝500～60000，更佳為MW＝500～20000。例如，平均分子量為約300、約500、約1000、約2000、約4000、約10000、約20000等之PEG可適宜地用作非肽連接子。 例如，白蛋白親和性肽-PEG可藉由將白蛋白親和性肽與醛基改性PEG(ALD-PEG-ALD)以該改性PEG相對於該白蛋白親和性肽之莫耳比成為11、12.5、15、110、120等之方式進行混合，於其中添加NaCNBH3 等還原劑並進行反應而獲得。繼而，使白蛋白親和性肽-PEG於NaCNBH3 等還原劑之存在下與抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質進行反應，藉此可獲得白蛋白親和性肽-PEG-融合蛋白質。亦可相反地首先使抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質與ALD-PEG-ALD結合而製作抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質-PEG，繼而使白蛋白親和性肽與抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質-PEG結合，藉此獲得白蛋白親和性肽-PEG-融合蛋白質。 亦可使抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質與白蛋白親和性肽融合。該融合蛋白質(抗hTfR抗體-hBDNF-白蛋白親和性肽)可藉由如下方式獲得：將於編碼抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質之重鏈或輕鏈之cDNA之3'末端側或5'末端側直接或經由編碼連接子序列之DNA片段將編碼白蛋白親和性肽之cDNA配置於讀碼框內(in-frame)而成的DNA片段組入至哺乳動物細胞用表現載體中，對導入有該表現載體之哺乳動物細胞進行培養。於使編碼白蛋白親和性肽之DNA片段與重鏈(或重鏈與hBDNF之融合蛋白質)結合之情形時，將組入有編碼構成抗hTfR抗體之輕鏈與hBDNF之融合蛋白質輕鏈(或輕鏈)之cDNA片段的哺乳動物細胞用表現載體亦一併導入至相同宿主細胞中，又，於使編碼白蛋白親和性肽之DNA片段與輕鏈(或輕鏈與hBDNF之融合蛋白質)結合之情形時，將組入有編碼抗hTfR抗體之重鏈與hBDNF之融合蛋白質(或重鏈)之cDNA片段的哺乳動物細胞用表現載體亦一併導入至同一宿主細胞中。即，白蛋白親和性肽可結合至抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質之重鏈(包含重鏈與hBDNF之融合蛋白質)或輕鏈(包含輕鏈與hBDNF之融合蛋白質)之N末端側或C末端側之任一者，但於使hBDNF結合至抗hTfR抗體之重鏈之N末端側之情形時，較佳為結合至抗hTfR抗體之C末端側，尤佳為結合至重鏈之C末端側。例如，作為導入有白蛋白親和性肽之融合蛋白質，可列舉：於人類BDNF之C末端側直接或經由連接子序列而結合有抗體之重鏈，且於該重鏈之C末端側直接或經由連接子序列而結合有白蛋白親和性肽者作為一例。 於使抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質與白蛋白親和性肽融合之情形時，可直接或經由連接子序列而融合。此處，連接子序列較佳為由1～50個胺基酸所構成。此處，胺基酸之個數係適當調整為1～17個、1～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、27個等。此種連接子序列並不限定於該胺基酸序列，較佳為由甘胺酸與絲胺酸所構成者。例如可列舉：包含甘胺酸或絲胺酸之任一個胺基酸者，包含胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列編號5)、或該等胺基酸序列1～10個或2～5個連結而成之包含50個以下之胺基酸之序列、包含2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或25個胺基酸之序列等者。例如，包含3個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成之共計15個胺基酸序列者可適宜地用作連接子序列。 作為導入有白蛋白親和性肽之抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質之一例，有如下融合蛋白質，其係於具有序列編號56所示之胺基酸序列之hBDNF前體之C末端側，經由包含序列編號3所示之胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反覆5次之共計25個胺基酸之連接子序列而融合有具有與序列編號61所示之胺基酸序列之第1號至第216號對應之胺基酸序列(序列編號84)的人源化抗hTfR抗體3NFab重鏈，進而於其C末端側，經由包含序列編號3所示之胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反覆3次之共計15個胺基酸之連接子序列而融合有序列編號85所示之白蛋白結合區域(ABD)者。 關於導入有白蛋白親和性肽之抗hTfR抗體-hBDNF融合蛋白質與白蛋白之結合親和性，於藉由實施例7所記載之生物膜層干涉法進行測定時，較佳為1×10-7 M以下，更佳為5×10-7 M以下，進而較佳為1×10-8 M以下，進而更佳為1×10-9 M以下。 Fab抗體亦可藉由導入Fc區域或白蛋白親和性肽以外之方法而於血中穩定。例如，Fab抗體可藉由對Fab抗體本身、或Fab抗體與其他蛋白質之融合體進行PEG修飾而穩定。該方法一般於蛋白質醫藥之領域中實施，而經PEG化之紅血球生成素、干擾素等作為醫藥品得到實用化。又，Fab抗體亦可藉由對其導入突變而穩定化。例如，可藉由將輕鏈之自N末端側起第4位之甲硫胺酸置換為白胺酸而使Fab抗體穩定。但是，突變之導入並不限定於此，亦可對重鏈導入突變。又，Fab抗體之穩定方法並不限定於該等者，可應用眾所周知之全部方法。 於構成抗hTfR抗體之「輕鏈」之N末端側結合有BDNF之類型之融合蛋白質係抗人類運鐵蛋白受體抗體含有包含輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列、與包含重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列者，且係BDNF結合至輕鏈之N末端側者。此處，抗hTfR抗體之輕鏈與BDNF可直接結合，亦可經由連接子結合。 於構成抗hTfR抗體之「重鏈」之N末端側結合有BDNF之類型之融合蛋白質係抗人類運鐵蛋白受體抗體含有包含輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列、與包含重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列者，且係BDNF結合至重鏈之N末端側者。此處，抗hTfR抗體之重鏈與BDNF可直接結合，亦可經由連接子結合。 於構成抗hTfR抗體之「輕鏈」之C末端側結合有BDNF之類型之融合蛋白質係抗人類運鐵蛋白受體抗體含有包含輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列、與包含重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列者，且係BDNF結合至輕鏈之C末端側者。此處，抗hTfR抗體之輕鏈與BDNF可直接結合，亦可經由連接子結合。 於構成抗hTfR抗體之「重鏈」之C末端側結合有BDNF之類型之融合蛋白質係抗人類運鐵蛋白受體抗體含有包含輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列、與包含重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列者，且係BDNF結合至重鏈之C末端側者。此處，抗hTfR抗體之重鏈與BDNF可直接結合，亦可經由連接子結合。 此種抗hTfR抗體與BDNF之融合蛋白質可藉由如下方式獲得：將於編碼抗hTfR抗體之重鏈或輕鏈之cDNA之3'末端側或5'末端側直接或經由編碼連接子序列之DNA片段於讀碼框內(in-frame)配置編碼BDNF之cDNA(序列編號50)而成之DNA片段組入至哺乳動物細胞用表現載體，對導入有該表現載體之哺乳動物細胞進行培養。於使編碼BDNF之DNA片段與重鏈結合之情形時，將組入有編碼構成抗hTfR抗體之輕鏈之cDNA片段之哺乳動物細胞用表現載體亦一併導入至相同宿主細胞中，又，於使編碼BDNF之DNA片段與輕鏈結合之情形時，將組入有編碼抗hTfR抗體之重鏈之cDNA片段之哺乳動物細胞用表現載體亦一併導入至相同宿主細胞中。 此處，關於哺乳動物細胞，將組入有編碼於抗hTfR抗體之重鏈(或輕鏈)之C末端直接或經由連接子序列結合BDNF而成之融合蛋白質的cDNA片段之哺乳動物細胞用表現載體、與組入有編碼抗hTfR抗體之輕鏈(或重鏈)之cDNA片段之哺乳動物細胞用表現載體一併導入至同一宿主細胞中，藉此可製作包含於抗hTfR抗體之重鏈(或輕鏈)之C末端側結合有BDNF之融合蛋白質、與抗hTfR抗體之重鏈(或輕鏈)之融合蛋白質。 又，將組入有編碼於抗hTfR抗體之重鏈(或輕鏈)之N末端直接或經由連接子序列結合BDNF而成之融合蛋白質的cDNA片段之哺乳動物細胞用表現載體、與組入有編碼抗hTfR抗體之輕鏈(或重鏈)之cDNA片段之哺乳動物細胞用表現載體一併導入至同一宿主細胞中，藉此亦可製作包含於抗hTfR抗體之重鏈(或輕鏈)之N末端側結合BDNF而成之融合蛋白質、與抗hTfR抗體之輕鏈(重鏈)之融合蛋白質。 於抗hTfR抗體為單鏈抗體之情形時，使抗hTfR抗體與BDNF結合而成之融合蛋白質可藉由如下方式獲得：將於編碼BDNF之cDNA之5'末端或3'末端直接或經由編碼連接子序列之DNA片段連結有編碼單鏈抗hTfR抗體之cDNA的DNA片段組入至哺乳動物細胞、酵母等真核細胞或大腸桿菌等原核細胞用表現載體中，使該表現載體於導入有該表現載體之該等相應之細胞中進行表現。 於抗hTfR抗體為Fab之情形時，使抗hTfR抗體與BDNF結合而成之融合蛋白質可藉由如下方式獲得：將組入有於編碼BDNF之cDNA之5'末端或3'末端直接或經由編碼連接子序列之DNA片段連結有編碼該Fab之重鏈與輕鏈之任一者之cDNA片段而成之DNA片段的表現載體(哺乳動物細胞、酵母等真核細胞或大腸桿菌等原核細胞用)、與組入有編碼該Fab重鏈與輕鏈之另一者之cDNA片段之表現載體導入至同一宿主細胞中，使該等於細胞中表現。 於抗hTfR抗體與BDNF之間配置連接子序列之情形時，連接子序列較佳為由1～50個胺基酸所構成。此處，胺基酸之個數係適當調整為1～17個、1～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、27個等。此種連接子序列只要藉由其連結之抗hTfR抗體保持與hTfR之親和性，且所連結之BDNF於生理條件下可發揮其生理活性，則其胺基酸序列並無限定，較佳為由甘胺酸與絲胺酸所構成者。例如可列舉：包含甘胺酸或絲胺酸之任一個胺基酸者，包含胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列編號5)、或者該等胺基酸序列1～10個或2～5個連結而成之包含50個以下之胺基酸之序列、包含2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或25個胺基酸之序列等者。例如，包含由5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成之共計25個胺基酸序列者可適宜地用作連接子序列。 於抗hTfR抗體與BDNF之融合蛋白質中，抗hTfR抗體為單鏈抗體之情形時，包含免疫球蛋白輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列、與包含免疫球蛋白重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列一般經由連接子序列結合。此時，只要抗hTfR抗體之對於hTfR之親和性得到保持，則亦可為於包含免疫球蛋白輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列的C末端側結合有連接子序列，進而於其C末端側結合有包含免疫球蛋白重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列者，又，亦可為於包含免疫球蛋白重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列的C末端側結合有連接子序列，進而於其C末端側結合有包含免疫球蛋白輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列者。 配置於免疫球蛋白之輕鏈與重鏈之間之連接子序列係由較佳為2～50個、更佳為8～50個、進而較佳為10～30個、進而更佳為12～18個或15～25個、例如15個或25個胺基酸所構成。此種連接子序列只要藉由其兩鏈連結而成之抗hTfR抗體保持與hTfR之親和性，且結合至該抗體之BDNF於生理條件下可發揮其生理活性，則胺基酸序列並無限定，較佳為僅由甘胺酸或由甘胺酸與絲胺酸所構成者。例如可列舉：包含胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列編號5)、或者該等胺基酸序列2～10個或2～5個接連而成之序列者。例如，於包含免疫球蛋白重鏈之可變區之全區域之胺基酸序列的C末端側經由連接子序列結合免疫球蛋白輕鏈之可變區之情形時，包含3個序列編號3所示之胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成之共計15個胺基酸者作為連接子序列較佳。 作為抗hTfR抗體與BDNF之融合蛋白質之具體態樣之一例，可列舉：於抗hTfR抗體重鏈之C末端經由作為連接子序列之胺基酸序列Gly-Ser融合人類BDNF而成之具有序列編號52之胺基酸序列者。使用將組入有編碼該融合蛋白質之具有序列編號53之鹼基序列之DNA片段的表現載體、與組入有編碼具有序列編號23之胺基酸序列之抗hTfR抗體輕鏈之具有序列編號24之鹼基序列的DNA片段之表現載體一併導入而轉形之宿主細胞，藉此可製作抗hTfR抗體與人類BDNF之融合蛋白質。 於抗hTfR抗體為人類以外之動物之抗體之情形時，將其投予至人類時，會引起對於該抗體之抗原抗體反應，而產生欠佳之副作用之可能性較高。人類以外之動物之抗體可藉由製成人源化抗體而減少此種抗原性，而可抑制投予至人類時因抗原抗體反應而產生副作用之情況。又，報告有根據使用猴之實驗，人源化抗體與小鼠抗體相比，於血中更為穩定，而認為可相應地長時間維持治療效果。其原因在於，因抗原抗體反應而產生副作用之情況亦可藉由使用人類抗體作為抗hTfR抗體得到抑制。 以下，對抗hTfR抗體為人源化抗體或人類抗體之情形進一步詳細地進行說明。人類抗體之輕鏈有λ鏈與κ鏈。構成抗hTfR抗體之輕鏈可為λ鏈與κ鏈之任一者。又，人類之重鏈有γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈及ε鏈，分別與IgG、IgM、IgA、IgD及IgE對應。構成抗hTfR抗體之重鏈可為γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈及ε鏈之任一者，較佳為γ鏈。進而，人類之重鏈之γ鏈有γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈，分別與IgG1、IgG2、IgG3及IgG4對應。於構成抗hTfR抗體之重鏈為γ鏈之情形時，該γ鏈可為γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈之任一者，較佳為γ1鏈或γ4鏈。於抗hTfR抗體為人源化抗體或人類抗體，且為IgG之情形時，人類抗體之輕鏈可為λ鏈與κ鏈之任一者，人類抗體之重鏈可為γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈之任一者，較佳為γ1鏈或γ4鏈。例如作為較佳之抗hTfR抗體之一態樣，可列舉：輕鏈為λ鏈且重鏈為γ1鏈之抗hTfR抗體。 於抗hTfR抗體為人源化抗體或人類抗體之情形時，抗hTfR抗體與BDNF可藉由於抗hTfR抗體之重鏈或輕鏈之N末端(或C末端)經由連接子序列或直接地分別藉由肽鍵而結合BDNF之C末端(或N末端)。於使BDNF結合至抗hTfR抗體之重鏈之N末端側(或C末端側)之情形時，於抗hTfR抗體之γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈或ε鏈之N末端(或C末端)經由連接子序列或直接利用肽鍵而分別結合BDNF之C末端(或N末端)。於抗hTfR抗體之輕鏈之N末端側(或C末端側)結合BDNF之情形時，於抗hTfR抗體之λ鏈與κ鏈之N末端(或C末端)經由連接子序列或直接利用肽鍵而分別結合BDNF之C末端(或N末端)。但是，於抗hTfR抗體為缺失有Fc區域者即包含Fab區域者或包含Fab區域與鉸鏈部之全部或一部分者(Fab、F(ab')及F(ab')2 )的情形時，BDNF可於構成Fab、F(ab')2 及F(ab')之重鏈或輕鏈之N末端(或C末端)經由連接子序列或直接利用肽鍵分別結合其C末端或N末端。 於抗hTfR抗體(為人源化抗體或人類抗體)之「輕鏈」之C末端側或N末端側結合有BDNF之類型之融合蛋白質係抗hTfR抗體含有包含輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列、與包含重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列者，且係BDNF結合至該輕鏈之C末端側或N末端側者。此處，抗hTfR抗體之輕鏈與BDNF可直接結合，亦可經由連接子結合。 於抗hTfR抗體(為人源化抗體或人類抗體)之「重鏈」之C末端側或N末端側結合有BDNF之類型之融合蛋白質係抗人類運鐵蛋白受體抗體含有包含輕鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列、與包含重鏈之可變區之全部或一部分之胺基酸序列者，且係BDNF結合至該重鏈之C末端側或N末端側者。此處，抗hTfR抗體之重鏈與BDNF可直接結合，亦可經由連接子結合。 於抗hTfR抗體與BDNF之間配置連接子序列之情形時，連接子序列係由較佳為1～50個、更佳為10～40個、進而較佳為20～34個、例如27個胺基酸所構成。構成連接子序列之胺基酸之個數係適當調整為1～17個、1～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、27個等。此種連接子序列只要藉由其連結之抗hTfR抗體保持對於hTfR之親和性，且所連結之BDNF於生理條件下可發揮其生理活性，則胺基酸序列並無限定，較佳為由甘胺酸與絲胺酸所構成者。例如可列舉：包含甘胺酸或絲胺酸之任一個胺基酸者，包含胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列編號5)、或者該等胺基酸序列1～10個或2～5個接連而成之包含50個以下之胺基酸的序列、包含2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或25個胺基酸之序列等者。例如，包含由5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成之共計25個胺基酸序列者可適宜地用作連接子序列。 抗hTfR抗體之對於hTfR之特異性親和性主要取決於抗hTfR抗體的重鏈及輕鏈之CDR之胺基酸序列。該等CDR之胺基酸序列只要為抗hTfR抗體除hTfR以外亦具有對於猴hTfR之特異性親和性者，則無特別限制。 於本發明中，抗hTfR抗體為人源化抗體或人類抗體之情形時，對於hTfR具有相對較高之親和性且對於猴TfR亦具有親和性之抗體係尤其是藉由實施例7所記載之方法進行測定時，與人類及猴之TfR之解離常數為如下者： (a)與hTfR之解離常數：較佳為1×10-10 M以下，更佳為2.5×10-11 M以下，進而較佳為5×10-12 M以下，進而更佳為1×10-12 M以下 (b)與猴TfR之解離常數：較佳為1×10-9 M以下，更佳為5×10-10 M以下，進而較佳為1×10-10 M以下，例如為7.5×10-11 M以下。 例如可列舉：與hTfR及猴TfR之解離常數分別為1×10-10 M以下與1×10-9 M以下、1×10-11 M以下與5×10-10 M以下、5×10-12 M以下與1×10-10 M以下、5×10-12 M以下與7.5×10-11 M以下、1×10-12 M以下與1×10-10 M以下、1×10-12 M以下與7.5×10-11 M以下者。此處，與人類TfR之解離常數並無特別明確之下限，例如可設為5×10-13 M、1×10-13 M等。又，與猴TfR之解離常數亦無特別明確之下限，例如可設為5×10-11 M、1×10-11 M、1×10-12 M等。即便抗體為單鏈抗體亦相同。 作為應與BDNF融合且對於hTfR具有親和性之抗體的較佳實施形態，可列舉：抗體之重鏈之CDR具有以下所示之胺基酸序列者。即： CDR1為包含序列編號66或序列編號67之胺基酸序列而成，CDR2為包含序列編號13或序列編號14之胺基酸序列而成，且CDR3為包含序列編號15或序列編號16之胺基酸序列而成者。 作為對於hTfR具有親和性之抗體之更具體之實施形態，可列舉抗體之重鏈之CDR具有以下所示之胺基酸序列者。即： CDR1為包含序列編號66之胺基酸序列而成，CDR2為包含序列編號13之胺基酸序列而成，及CDR3為包含序列編號15所記載之胺基酸序列而成者。 於上述之較佳實施形態中，可列舉：於作為抗體之重鏈之架構區3之胺基酸序列較佳者中具有序列編號68的胺基酸序列者。 作為對於hTfR具有親和性之抗體之較佳輕鏈與重鏈之組合，可例示CDR具有以下所示之胺基酸序列者。即： 如下輕鏈與如下重鏈之組合，該輕鏈係CDR1為包含序列編號6或序列編號7之胺基酸序列而成，CDR2為包含序列編號8或序列編號9之胺基酸序列、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser而成，及CDR3為包含序列編號10之胺基酸序列而成者，該重鏈係CDR1為包含序列編號66或序列編號67之胺基酸序列而成，CDR2為包含序列編號13或序列編號14之胺基酸序列而成，及CDR3為包含序列編號15或序列編號16之胺基酸序列而成者。 作為對於hTfR具有親和性之抗體之輕鏈與重鏈之組合的具體態樣，可例示CDR具有以下所示之胺基酸序列者。即： 如下輕鏈與如下重鏈之組合，該輕鏈係CDR1為包含序列編號6之胺基酸序列而成，CDR2為包含序列編號8之胺基酸序列而成，及CDR3為包含序列編號10之胺基酸序列而成者，該重鏈係CDR1為包含序列編號66之胺基酸序列而成，CDR2為包含序列編號13之胺基酸序列而成，及CDR3為包含序列編號15之胺基酸序列而成者。 作為對於hTfR具有親和性之人源化抗體之較佳實施形態，可例示具有以下所示之胺基酸序列者。即： 如下抗hTfR抗體，其輕鏈之可變區為包含選自由序列編號17、序列編號18、序列編號19、序列編號20、序列編號21、及序列編號22所示之胺基酸序列所組成之群中之胺基酸序列而成，重鏈之可變區為包含序列編號69所示之胺基酸序列而成者。 序列編號17、序列編號18、序列編號19、序列編號20、序列編號21、及序列編號22所示之輕鏈可變區之胺基酸序列係分別CDR1包含序列編號6或7，CDR2包含序列編號8或序列編號9，及CDR3包含序列編號10之胺基酸序列者。其中，於序列編號17～22之胺基酸序列中，CDR之胺基酸序列並不限定於該等，包含該等CDR之胺基酸序列之區域、包含該等CDR之胺基酸序列之任意接連之3個以上胺基酸的胺基酸序列亦可設為CDR。 序列編號69所示之重鏈可變區之胺基酸序列係分別CDR1包含序列編號66或序列編號67，CDR2包含序列編號13或序列編號14，及CDR3包含序列編號15或序列編號16之胺基酸序列者。但是，於序列編號69之胺基酸序列中，CDR之胺基酸序列並不限定於該等，包含該等CDR之胺基酸序列之區域、包含該等CDR之胺基酸序列之任意接連之3個以上胺基酸的胺基酸序列亦可設為CDR。 作為對於hTfR具有親和性之人源化抗體之更具體實施形態之例，可列舉： (1a)輕鏈之可變區包含序列編號18之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列編號69之胺基酸序列者、 (1b)輕鏈之可變區包含序列編號20之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列編號69之胺基酸序列者、 (1c)輕鏈之可變區包含序列編號21之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列編號69之胺基酸序列者、及 (1d)輕鏈之可變區包含序列編號22之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列編號69之胺基酸序列者。 作為對於hTfR具有親和性之人源化抗體之更具體實施形態之例，可列舉： (2a)輕鏈包含序列編號23之胺基酸序列且重鏈包含序列編號70或72之胺基酸序列者、 (2b)輕鏈包含序列編號25之胺基酸序列且重鏈包含序列編號70或72之胺基酸序列者、 (2c)輕鏈包含序列編號27之胺基酸序列且重鏈包含序列編號70或72之胺基酸序列者、 (2d)輕鏈包含序列編號29之胺基酸序列且重鏈包含序列編號70或72之胺基酸序列者。 作為對於hTfR具有親和性之作為Fab之人源化抗體之更具體實施形態的例，可列舉： (3a)輕鏈包含序列編號23之胺基酸序列且Fab重鏈包含序列編號61之胺基酸序列者、 (3b)輕鏈包含序列編號25之胺基酸序列且Fab重鏈包含序列編號61之胺基酸序列者、 (3c)輕鏈包含序列編號27之胺基酸序列且Fab重鏈包含序列編號61之胺基酸序列者、 (3d)輕鏈包含序列編號29之胺基酸序列且Fab重鏈包含序列編號61之胺基酸序列者。 於抗hTfR抗體為Fab之情形時，作為將其他Fc區域導入至融合蛋白質中所得者之具體實施形態之例，可列舉： (4a)輕鏈包含序列編號23之胺基酸序列且導入有Fc區域之Fab重鏈包含序列編號81之胺基酸序列者、 (4b)輕鏈包含序列編號25之胺基酸序列且導入有Fc區域之Fab重鏈包含序列編號81之胺基酸序列者、 (4c)輕鏈包含序列編號27之胺基酸序列且導入有Fc區域之Fab重鏈包含序列編號81之胺基酸序列者、 (4d)輕鏈包含序列編號29之胺基酸序列且導入有Fc區域之Fab重鏈包含序列編號81之胺基酸序列者。 再者，序列編號81所示之胺基酸序列係，於人源化抗hTfR抗體3N之Fab重鏈之胺基酸序列(胺基酸序列61)之N末端側，經由包含由5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成之共計25個胺基酸序列之連接子序列，而結合有具有序列編號75所示之胺基酸序列之人類IgG Fc區域者。 上述(4a)～(4d)中，例如，於人類BDNF之C末端側直接或經由連接子序列結合有人類IgG Fc區域，進而於該人類IgG Fc區域之C末端側直接或經由連接子序列而結合有抗人類運鐵蛋白受體抗體。 作為人類IgG Fc區域之較佳一實施形態，可列舉具有序列編號75之胺基酸序列者。又，作為導入有人類IgG Fc區域之融合蛋白質，可列舉：於BDNF之C末端側經由連接子序列結合有Fc區域，於其C末端側經由連接子序列結合有抗hTfR抗體之重鏈Fab的具有序列編號74之胺基酸序列者作為一例。 於抗hTfR抗體為Fab之情形時，作為將白蛋白親和性肽導入至融合蛋白質中所得者之具體實施形態之例，可列舉： 白蛋白親和性肽為具有序列編號85所示之胺基酸序列之白蛋白結合區域，且 (5a)輕鏈包含序列編號23之胺基酸序列，且導入有白蛋白親和性肽之Fab重鏈包含序列編號89之胺基酸序列者， (5b)輕鏈包含序列編號25之胺基酸序列，且導入有白蛋白親和性肽之Fab重鏈包含序列編號89之胺基酸序列者， (5c)輕鏈包含序列編號27之胺基酸序列，且導入有白蛋白親和性肽之Fab重鏈包含序列編號89之胺基酸序列者， (5d)輕鏈包含序列編號29之胺基酸序列，且導入有白蛋白親和性肽之Fab重鏈包含序列編號89之胺基酸序列者。 再者，序列編號89所示之胺基酸序列係於人源化抗hTfR抗體3N之Fab重鏈之胺基酸序列(胺基酸序列61)的C末端側，經由包含3個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)接連而成之共計15個胺基酸序列的連接子序列，而結合有具有序列編號85所示之胺基酸序列之白蛋白親和性肽者。 於上述(5a)～(5d)中，例如於人類BDNF之C末端側直接或經由連接子序列結合有抗人類運鐵蛋白受體抗體，進而於該抗人類運鐵蛋白受體抗體之C末端側直接或經由連接子序列結合有白蛋白親和性肽。 作為白蛋白親和性肽之較佳一實施形態，可列舉具有序列編號85之胺基酸序列者。又，作為導入有白蛋白親和性肽之融合蛋白質，可列舉：於人類BDNF前體或人類BDNF之C末端側直接或經由連接子序列結合有Fab重鏈，於其C末端側直接或經由連接子序列結合有白蛋白親和性肽的具有序列編號87或序列編號88之胺基酸序列者作為一例。 將對於hTfR具有親和性之人源化抗體之較佳實施形態如上述般例示。關於該等抗hTfR抗體之輕鏈及重鏈，以將抗hTfR抗體與hTfR之親和性調整為所需者等為目的，可對其可變區之胺基酸序列適當施加置換、缺失、附加等突變。又，以將hBDNF之功能等調整為所需者為目的，亦可對hBDNF適當施加置換、缺失、附加等突變。 於利用其他胺基酸置換輕鏈之可變區之胺基酸序列之胺基酸的情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個，進而更佳為1～2個。於使輕鏈之可變區之胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個，進而更佳為1～2個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變。 於在輕鏈之可變區附加胺基酸之情形時，於輕鏈之可變區之胺基酸序列中或者N末端側或C末端側附加較佳為1～10個、更佳為1～5個、進而較佳為1～3個、進而更佳為1～2個胺基酸。亦可施加將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變。施加有突變之輕鏈之可變區之胺基酸序列較佳為與原本之輕鏈之可變區之胺基酸序列具有80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性。 尤其是於利用其他胺基酸置換輕鏈之各CDR或各架構區之各胺基酸序列中之胺基酸的情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～5個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，進而更佳為1個。於使各CDR或各架構區之各胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～5個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，進而更佳為1個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變。 於在輕鏈之各CDR或各架構區之各胺基酸序列中附加胺基酸之情形時，於該胺基酸序列中或者N末端側或C末端側附加較佳為1～5個、更佳為1～3個、進而較佳為1～2個、進而更佳為1個胺基酸。亦可施加將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變。施加有突變之各CDR或各架構區之各胺基酸序列較佳為與原本之各CDR之胺基酸序列具有80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性。 於將作為重鏈之可變區之序列編號69所示之胺基酸序列的胺基酸置換為其他胺基酸之情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個，進而更佳為1～2個。於使重鏈之可變區之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個，進而更佳為1～2個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變。 於在作為重鏈之可變區之序列編號69所示之胺基酸序列中附加胺基酸之情形時，於重鏈之可變區之胺基酸序列中或者N末端側或C末端側附加較佳為1～10個、更佳為1～5個、進而較佳為1～3個、進而更佳為1～2個胺基酸。亦可施加將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變。施加有突變之重鏈之可變區之胺基酸序列較佳為與原本之重鏈之可變區之胺基酸序列具有80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性。 尤其是於將序列編號69所示之胺基酸序列中之各CDR或各架構區之各胺基酸序列中的胺基酸置換為其他胺基酸之情形時，所置換之胺基酸之個數較佳為1～5個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，進而更佳為1個。於使各CDR之各胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，所缺失之胺基酸之個數較佳為1～5個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，進而更佳為1個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之突變。 於在序列編號69所示之胺基酸序列中之各CDR或各架構區之各胺基酸序列中附加胺基酸的情形時，於該胺基酸序列中或者N末端側或C末端側附加較佳為1～5個、更佳為1～3個、進而較佳為1～2個、進而更佳為1個胺基酸。亦可施加將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合之突變。施加有突變之各CDR之各胺基酸序列較佳為與原本之各CDR之胺基酸序列具有80%以上之同源性，更佳為顯示出90%以上之同源性，進而較佳為顯示出95%以上之同源性。 再者，於如上述般對作為抗hTfR抗體之重鏈之可變區之序列編號69所示的胺基酸序列施加置換、缺失、附加等突變的情形時，原本之CDR1之自N末端側起第5位的胺基酸即甲硫胺酸、與架構區3之自N末端側起第17位之胺基酸即白胺酸係保存在與突變前相同之位置上。又，重鏈之CDR1及架構區3之胺基酸序列較佳為保存。 亦可將上述對於抗hTfR抗體之輕鏈之可變區之突變、與上述對於抗hTfR抗體之重鏈之可變區之突變組合，而對於抗hTfR抗體之輕鏈與重鏈之可變區兩者施加突變。 作為上述抗hTfR抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸序列中之胺基酸向其他胺基酸之置換，例如可列舉：芳香族胺基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族胺基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性胺基酸(Gln、Asn)、鹼性胺基酸(Lys、Arg、His)、酸性胺基酸(Glu、Asp)、具有羥基之胺基酸(Ser、Thr)等分類為相同群組之胺基酸間的置換。關於利用此種類似胺基酸之置換，預測不會給蛋白質之表型帶來變化(即，為保守性胺基酸置換)。但是，本發明者首先發現，確認到與本案發明具有同種效果之抗體編號3(於本案申請時點未公開)之hTfR之架構區3之胺基酸序列即序列編號83其第17位為Trp，相對於此，本案發明中之抗hTfR抗體編號3N之重鏈之架構區3係具有序列編號68之胺基酸序列，且其自N末端側起第17位被置換為Leu者。又，CDR1之胺基酸序列係序列編號12之第5位之Thr如序列編號66所示般被置換為Met者。Trp與Leu並非上述類似關係，並且Thr與Met亦並非上述類似關係。然而，如下述般，包含該置換之抗體編號3N即便出乎預料，效果亦與抗體編號3同種，而且表現出進一步優異之效果。 再者，於對抗hTfR抗體或hBDNF施加突變而於C末端或N末端附加有胺基酸之情形時，該所附加之胺基酸於使抗hTfR抗體與BDNF融合時位於抗hTfR抗體與BDNF之間，於該情形時，該所附加之胺基酸構成連接子之一部分。 (1)融合蛋白質之製造方法 本發明之融合蛋白質可藉由下述實施例所記載之方法或本領域中眾所周知之方法進行製造。 例如，分別構建具有編碼於以本說明書之實施例16及17所記載之方式取得之抗人類運鐵蛋白抗體的重鏈之N末端直接或經由連接子(例如，包含序列編號3反覆5次之25個胺基酸者)融合有BDNF之C末端者即融合蛋白質的DNA之表現用載體、與具有編碼該抗體之輕鏈之DNA之動植物細胞表現用載體，一併導入至適當之宿主細胞中，藉此可獲得產生本發明之融合蛋白質之細胞或基因轉殖動植物。或者，分別構建具有編碼於所取得之抗人類運鐵蛋白抗體之輕鏈之N末端直接或經由連接子(例如，包含序列編號3反覆5次之25個胺基酸者)融合有BDNF之C末端者即融合蛋白質的DNA之表現用載體、與具有編碼該抗體之重鏈之DNA之表現用載體，一併導入至適當之宿主細胞中，藉此可獲得產生本發明之融合蛋白質之細胞或基因轉殖動植物。 以上述方式構建之融合蛋白質基因可藉由公知之方法表現並取得。為了使融合蛋白質之表現量最大化，融合蛋白質基因之鹼基序列亦可匹配融合蛋白質之表現所使用之細胞或動物物種的密碼子使用頻度而最佳化。於哺乳類細胞之情形時，可藉由常用之有用之啟動子、所表現之抗體基因、使poly-A訊號功能性地結合至其3'側下流而成之DNA或包含其之載體進行表現。例如作為啟動子/促進子，可列舉：人類巨細胞病毒前期啟動子/促進子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。 又，作為其他本發明中所使用之抗體表現可使用之啟動子/促進子，只要使用反轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴病毒40(SV40)等病毒啟動子/促進子或延長因子1α(hEF1α)等源自哺乳類細胞之啟動子/促進子即可。 例如於使用SV40啟動子/促進子之情形時，若依據Mulligan等人之方法(Mulligan, R.C. et al., Nature (1979) 277,108-114)，則可容易地實施，又，於使用hEF1α啟動子/促進子之情形時，若依據Mizushima等人之方法(Mizushima,S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res.(1990)18, 5322)，則可容易地實施。 於大腸桿菌之情形時，可功能性地結合常用之有用之啟動子、用以抗體分泌之訊號序列、應表現之抗體基因而進行表現。例如作為啟動子，可列舉：lacZ啟動子、araB啟動子。於使用lacZ啟動子之情形時，只要依據Ward等人之方法(Ward, E.S. et al., Nature (1989) 341, 544-546；Ward, E.S. et al., FASEB J.(1992) 6, 2422-2427)即可，於使用araB啟動子之情形時，只要依據Better等人之方法(Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043)即可。 作為用以抗體分泌之訊號序列，於產生於大腸桿菌之周質空間(Periplasmic space)之情形時，只要使用pelB訊號序列(Lei, S.P. et al., J.Bacteriol.(1987) 169, 4379-4383)即可。(例如，參照國際公開第96/30394號)。 作為複製起源，可使用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳突病毒(BPV)等者，進而，為了於宿主細胞系中擴增基因拷貝數，表現載體可包含胺基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標記物。 於使用真核細胞之情形時，存在使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞之產生系。作為動物細胞，已知有(1)哺乳類細胞，例如CHO、HEK293、COS、骨髓瘤、BHK(幼侖鼠腎(baby hamster kidney))、HeLa、Vero等；(2)兩栖類細胞，例如非洲爪蟾卵母細胞；或(3)昆蟲細胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作為植物細胞，已知有源自菸草(Nicotiana tabacum)之細胞，只要對其進行愈傷組織培養即可。作為真菌細胞，已知有酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)屬，例如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、絲狀菌，例如麯黴屬(Aspergillus)屬，例如黑麴菌(Aspergillus niger)等。 於使用原核細胞之情形時，存在使用細菌細胞之產生系。作為細菌細胞，已知有大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。 藉由轉形將設為目標之抗體基因導入至該等細胞中，將經轉形之細胞於活體外(in vitro)進行培養，藉此獲得抗體。培養係依據公知之方法進行。例如，可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作為培養液，亦可併用胎牛血清(FCS)等血清補液。又，將導入有抗體基因之細胞移植至動物之腹腔等中，藉此亦可於活體內(in vivo)產生抗體。 作為活體內(in vivo)之產生系，可列舉：使用動物之產生系或使用植物之產生系。於使用動物之情形時，存在使用哺乳類動物、昆蟲之產生系等。 作為哺乳類動物，可使用山羊、豬、羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。又，作為昆蟲，可使用蠶。於使用植物之情形時，例如可使用菸草。 將融合蛋白質基因導入至該等動物或植物中，使融合蛋白質於動物或植物之體內產生並進行回收。例如，將融合蛋白質基因插入至編碼如山羊β-酪蛋白之固有地產生於乳汁中之蛋白質的基因之途中，以融合基因的形式進行製備。將包含插入有抗體基因之融合基因之DNA片段注入至山羊之胚胎，將該胚胎導入至雌性之山羊。從自受容有胚胎之山羊出生之基因轉殖山羊或其後代所產生的乳汁獲得所需之融合蛋白質。為了使自基因轉殖山羊產生之包含所需融合蛋白質之乳汁量增加，亦可適當將激素用於基因轉殖山羊(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994)12, 699-702)。 又，於使用蠶之情形時，使插入有目標融合蛋白質基因之桿狀病毒感染蠶，自該蠶之體液獲得所需之抗體(Maeda, S. et al., Nature (1985)315, 592-594)。進而，於使用菸草之情形時，將目標融合蛋白質基因插入至植物表現用載體、例如pMON 530中，將該載體導入至如農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之細菌。使該細菌感染菸草、例如菸草(Nicotiana tabacum)，自本菸草之葉獲得所需之融合蛋白質(Julian, K.-C.Ma et al., Eur.J.Immunol.(1994) 24, 131-138)。 如上述般產生、表現出之融合蛋白質可自細胞內外、宿主細胞進行分離並進行純化直至均一。本發明中所使用之融合蛋白質之分離、純化可藉由親和層析進行。作為親和層析所使用之管柱，例如可列舉：蛋白A管柱、蛋白G管柱、蛋白L管柱。作為蛋白A管柱所使用之載體，例如可列舉：Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，只要使用通常之蛋白質所使用之分離、純化方法即可，並無任何限定。視需要，將上述親和層析以外之層析法、過濾、超過濾、鹽析、透析等組合，藉此亦可將本發明所使用之抗體進行分離、純化。作為層析法，例如可列舉離子交換層析法、疏水性層析法、凝膠過濾等。該等層析法可應用於HPLC(High performance liquid chromatography，高效液相層析法)。又，亦可使用逆相HPLC(reverse phase HPLC)。 BDNF係其同型二聚物特異性地結合至存在於靶細胞表面上之BDNF受體(TrkB)，而對於中樞及末梢神經系統之細胞之分化、功能維持、突觸形成、及損傷時之再生及修復等發揮重要之作用(非專利文獻1、非專利文獻2)。根據此種作用，BDNF係作為可廣泛地應用於中樞及末梢神經具有障礙之疾病之治療之蛋白質受到關注。 又，於杭丁頓舞蹈症、帕金森氏症、阿茲海默氏症等各種神經系統之疾病中有BDNF之表現降低或量之降低的報告(Nuerosci. Lett.(1999) 270: 45-48)，已知若使用滲透壓泵等將BDNF持續地注入至該等疾病模型動物之腦內或脊椎內，則顯示出抑制紋狀體之神經細胞死亡、改善運動障礙、改善記憶能力等效果(J. Nuerosci.(2004) 24: 7727-7739, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89: 11347-11351, Nat. Med.(2009)15: 331-337)。 進而，亦已知BDNF具有牙齒之相關細胞或血管內皮細胞之增生、分化促進、飲食調節、糖代謝等各種作用(Tissue Eng. (2005) 11: 1618-629，肥胖研究(2009)15: 97-99)。 根據該情況，而期待開發BDNF作為阿茲海默氏症、帕金森氏症、杭丁頓舞蹈症等神經退化性疾病，肌萎縮性側索硬化症等脊髓退化性疾病，此外糖尿病性神經障礙，腦缺血性疾病，Rett症候群等發達障礙，精神分裂症，抑鬱症等各種疾病之治療劑(非專利文獻3、非專利文獻4、非專利文獻5、非專利文獻6、非專利文獻7、非專利文獻8、WO91/03568)。 BDNF無法通過血腦障壁(BBB；Blood-Brain Barrier)，但本發明之融合蛋白質(hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質)能夠通過BBB，因此已末梢投予之本發明之融合蛋白質轉移至腦內，BDNF可發揮原本所具有之效果。此種BDNF之功能可利用如以下之方法進行確認。 (2)BDNF之功能之評價方法 BDNF之功能可藉由調查對於BDNF受體(TrkB)之結合親和性(Eur J Neurosci (1994)6: 1389-1405)、以BDNF受體之磷酸化為指標之BDNF受體之活化(Biochim Biophys Acta (2015)1852: 862-872)、伴隨著BDNF受體之活化之細胞內鈣增加等細胞內訊號傳遞增強活性(Nature Reviews Neuroscience (2009)10: 850-860)、對於TrkB表現神經細胞之增生促進作用(岐阜藥科大學紀要(2006) 55: 53-54)、存活維持作用(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry (2015)60: 11-17)、神經突起伸展作用(J Biol Chem (2007)282: 34525-34534)等而於活體外進行評價。作為在活體外使用之細胞，可為使TrkB內在性地表現之細胞，亦可為使TrkB外來性地強制表現出之細胞。例如可使用對BAF細胞、CHO細胞、PC-12細胞等導入TrkB基因並使之強制表現出之細胞，或者海馬區或紋狀體等初代培養神經細胞。 又，BDNF之功能可藉由調查對於帕金森氏症、杭丁頓舞蹈症、阿茲海默氏症等疾病模型動物之治療效果(Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1994)91: 8920-8924)而於活體內進行評價。例如，本發明之融合蛋白質(TfR抗體-BDNF融合蛋白質)於活體內(in vivo)之BDNF生物活性可藉由使用如實施例2～5所記載之方法，對帕金森氏症模型動物中之運動功能障礙改善作用、紋狀體多巴胺量恢復效果、紋狀體多巴胺神經再生效果等進行調查而評價。作為帕金森氏症模型，可應用進行過已知會特異性地破壞多巴胺神經之MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶)處理的小鼠及猴。 (3)融合蛋白質之用途 再者，於某疾病模型動物、例如帕金森氏症模型動物中將本發明之融合蛋白質(hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質)自末梢進行投予，藉此該疾病或障礙得到改善之情況係表示如下情況：本發明之融合蛋白質到達至需要部位(例如腦內)至BDNF可發揮原本所具有之效果的程度，該情況係意指本發明之融合蛋白質並不限於該疾病，可廣泛地用以治療藉由對於BDNF之暴露可得益之疾病及障礙。 本發明藉由投予含有本發明之融合蛋白質之治療有效量作為有效成分之醫藥組合物，而可用以治療藉由BDNF之暴露可得益之疾病或障礙。因此，本發明又提供一種含有本發明之融合蛋白質作為有效成分而成之藉由BDNF之暴露可得益之疾病或障礙之預防及/或治療劑。此處「治療」一詞係如下含義，即不僅包括完全治癒，亦包括症狀之改善。 作為藉由對於本發明之融合蛋白質之暴露可得益之疾病或障礙，不僅包含由BDNF之表現或量降低引起之疾病或障礙，亦包含藉由BDNF發揮作用而能夠治療之疾病或障礙，例如可列舉：神經系統之疾病或障礙(神經退化性疾病、抑鬱症、精神分裂症、癲癇、自閉症、Rett症候群、West症候群、新生兒痙攣、癡呆症所伴隨之行為異常(例如，徘徊、攻擊行為等)、焦慮症、疼痛、希什斯普隆氏病、快速動眼睡眠行為障礙等)及其他之疾病或障礙。作為神經退化性疾病，可列舉：以下之腦神經退化性疾病、脊髓退化性疾病、視網膜退化性疾病、末梢神經退化性疾病等。 作為腦神經退化性疾病，例如可列舉：腦神經系統之神經退化性疾病(阿茲海默氏症、帕金森氏症、杭丁頓舞蹈症、路易體癡呆、匹克病、多發性系統萎縮症、進行性上行性麻痹、唐氏症候群等)、腦缺血性疾病(腦卒中、腦梗塞、短暫性腦缺血發作、蛛網膜下腔出血、缺血性腦症、腦梗塞(腔隙性梗塞、動脈粥樣化血栓性腦梗塞、心源性腦梗塞症、出血性腦梗塞、其他梗塞)等)、外傷性腦損傷、腦白質病、及多發性硬化症等。 作為脊髓退化性疾病，例如可列舉：肌萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髓損傷、由各種原因引起之脊髓障礙、脊髓性進行性肌肉萎縮症、及脊髓小腦變性症等。作為視網膜退化性疾病，例如可列舉：老年性黃斑變性症(AMD)、糖尿病性視網膜症、視網膜色素變性症、高血壓性視網膜症、及青光眼等。 作為末梢神經退化性疾病，例如可列舉：糖尿病性神經障礙、末梢神經損傷、外傷性末梢神經障礙、中毒、由其他毒性物質引起之末梢神經障礙、由癌症化學治療法引起之末梢神經障礙、吉蘭-巴雷綜合征、由缺乏維生素等引起之末梢神經障礙、澱粉樣蛋白末梢神經障礙、缺血性末梢神經障礙、伴隨著惡性腫瘤之末梢神經障礙、尿毒症性末梢神經障礙、由物理原因引起之末梢神經障礙、Charcot-Marie-Tooth病、酒精性末梢神經障礙、自律神經異常(未察覺低血糖、胃輕癱、神經源性下痢及便秘、勃起功能障礙、直立性低血壓、心律不整、心衰竭、無痛性心肌梗塞、汗分泌異常、神經源性膀胱等)、膀胱功能障礙(例如，無抑制膀胱、反射性膀胱、自律性膀胱、感覺麻痹性膀胱、運動麻痹性膀胱等)等。 作為其他之疾病或障礙，例如可列舉：牙周病、糖尿病、糖尿病性心肌病、糖尿病性病足、炎症性腸病(例如，潰瘍性結腸炎、克隆氏病等)、聽覺障礙、骨疾病(例如，骨質疏鬆症等)、關節病(例如，夏科氏(Charcot)關節病、變形性關節病、風濕等)等。 本發明之融合蛋白質可用作投予至血中而應於中樞神經系統(CNS)中發揮藥效之藥劑。該藥劑大致藉由利用靜脈滴注等之靜脈注射、皮下注射、肌肉注射而投予至患者，但投予路徑並無特別限定。 (4)投予形態、投予量、投予方法 本發明之融合蛋白質可作為藥劑並以冷凍乾燥品、或水性液劑等形態供給於醫療機構。於水性液劑之情形時，可將預先使藥劑溶解於含有穩定劑、緩衝劑、等張劑之溶液中所得者以封入至小瓶或注射器中之製劑的形式進行供給。封入至注射器中之製劑一般稱為預裝藥品之注射器製劑。藉由製成預裝藥品之注射器製劑，可使由患者本身投予藥劑變得簡單。 於以水性液劑之形式供給之情形時，與水性液劑所含有之抗hTfR抗體結合之BDNF之濃度係應根據用法用量而適當調整者，例如為0.01～5 mg/mL。又，水性液劑所含有之穩定劑只要為藥劑學上可容許者，則無特別限定，可較佳地使用非離子性界面活性劑。作為此種非離子性界面活性劑，可將聚山梨糖醇酯、泊洛沙姆等單獨或組合該等使用。作為聚山梨糖醇酯，尤佳為聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80，作為泊洛沙姆，尤佳為泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)。又，水性液劑所含有之非離子性界面活性劑之濃度較佳為0.01～1 mg/mL，更佳為0.01～0.5 mg/mL，進而較佳為0.1～0.5 mg/mL。作為穩定劑，亦可使用組胺酸、精胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸等胺基酸。用作穩定劑之情形時之水性液劑所含有之胺基酸之濃度較佳為0.1～40 mg/mL，更佳為0.2～5 mg/mL，進而較佳為0.5～4 mg/mL。水性液劑所含有之緩衝劑只要為藥劑學上可容許者，則無特別限定，較佳為磷酸鹽緩衝劑，尤佳為磷酸鈉緩衝劑。於使用磷酸鈉緩衝劑作為緩衝劑之情形時之磷酸鈉之濃度較佳為0.01～0.04 M。又，經緩衝劑調整之水性液劑之pH值較佳為5.5～7.2。水性液劑所含有之等張劑只要為藥劑學上可容許者，則無特別限定，可較佳地將氯化鈉、甘露醇單獨或組合而用作等張劑。 含有本發明之融合蛋白質之上述醫藥之投予量亦根據投予對象、對象疾病、症狀、投予途徑等不同，例如，於用以治療、預防神經退化性疾病之情形時，投予量係設為：以有效量、例如治療有效量計作為腦內之BDNF之濃度為至少約0.001 ng/g以上，較佳為大於0.01、0.1、1、10或100 ng/g腦。又，較佳為維持於投予1次後經過數天(1、2、3、4、5、6、7天)、2週、進而1個月，BDNF之腦內量亦上升之狀態，作為腦內維持濃度，例如維持大於約1 ng/g腦、約10 ng/g腦、約100 ng/g腦、或約100 ng/g腦之狀態。 例如，投予量並不限定於該等，於幾個實施形態中，作為1次投予量，可於0.0001～1,000 mg/kg體重之範圍內進行選擇。或者，亦可每個患者於0.001～100,000 mg之範圍內進行選擇。通常以約0.01～1000 mg、約0.1～100 mg、約1～100 mg、約0.05～500 mg、約0.5～50 mg、或約5 mg～50 mg之投予量例如利用靜脈內投予進行投予。於症狀特別嚴重之情形時，亦可視其症狀而增量。 本發明之組合物、例如本發明之融合蛋白質亦可單獨使用，或者於無損本發明之效果之範圍內，視需要與其他醫藥品或其他治療法一併使用，以同一製劑或不同之組合物之形式投予至患者。例如作為於阿茲海默型癡呆症中與本發明之醫藥組合物併用之醫藥，可列舉阿茲海默氏症治療藥、例如鹽酸多奈哌齊、利凡斯的明、氫溴酸加蘭他敏等乙醯膽鹼酯酶抑制藥，或鹽酸美金剛胺。又，亦可列舉：現在處於臨床開發階段之Solanezumab(N Engl J Med.(2014) 370: 311-21)或Gantenerumab(Arch Neurol.(2012) 69: 198-207)等抗Aβ抗體，或Verubecestat(AAIC 2013, Boston: Abs 01-06-05, Jul 2013)或AZD-3293(AAIC 2014, Copenhargen: AbsP1-363, Jul 2014)等β澱粉樣蛋白產生抑制劑等。作為於阿茲海默型癡呆症中與本發明之醫藥組合物併用之治療法，可列舉腦活性型恢復療法等。作為於帕金森氏症中與本發明之醫藥組合物併用之醫藥，可列舉：帕金森氏症治療藥、例如左旋多巴等多巴胺補充療法藥；他利克索、普拉克索、溴麥角環肽等多巴胺受體促效劑；MAO-B抑制劑或COMT抑制劑等多巴胺分解酶抑制藥；金剛烷胺或Nouriast等多巴胺游離促進藥。作為於帕金森氏症中與本發明之醫藥組合物併用之治療法，可列舉：丘腦刺激術、蒼白球刺激術、丘腦下核刺激術等。作為於杭丁頓舞蹈症中與本發明之醫藥組合物併用之醫藥，可列舉杭丁頓舞蹈症治療藥、例如丁苯那嗪(Tetrabenazine)等單胺小胞轉運體2抑制藥。作為於腦缺血性疾病中與本發明之醫藥組合物併用之醫藥，可列舉Radicut等腦保護藥。作為於腦缺血性疾病中與本發明之醫藥組合物併用之治療法，可列舉血栓溶解療法、恢復療法等。 投予本發明之醫藥組合物之時點並無特別限定，可為適當其他醫藥之投予或治療之前後或同時。 [實施例] 以下，參照實施例而進一步詳細地說明本發明，但本發明並非意圖限定於實施例。再者，實施例1～15-3係關於參考例(抗體編號3)者。 [實施例1]hTfR表現用載體之構建 以人類脾臟快速選殖(Quick Clone)cDNA(Clontech公司)作為模板，使用引子hTfR5'(序列編號41)及引子hTfR3'(序列編號42)，藉由PCR擴增編碼人類運鐵蛋白受體(hTfR)之基因片段。利用MluI與NotI消化經擴增之編碼hTfR之基因片段，插入至pCI-neo載體(Promega公司)之MluI與NotI間。將所獲得之載體命名為pCI-neo(hTfR)。繼而，利用MluI與NotI消化該載體，切出編碼hTfR之基因片段，組入至國際公開公報(WO2012/063799)所記載之表現載體即pE-mIRES-GS-puro之MluI與NotI之間，藉此構建作為hTfR表現用載體之pE-mIRES-GS-puro(hTfR)。 [實施例2]重組hTfR之製作 藉由電穿孔法將pE-mIRES-GS-puro(hTfR)導入至CHO-K1細胞中之後，使用包含甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)及嘌呤黴素之CD OptiCHOTM 培養基(Invitrogen公司)進行細胞之選擇培養，而獲得重組hTfR表現細胞。對該重組hTfR表現細胞進行培養而製備重組hTfR。 [實施例3]使用重組hTfR之小鼠之免疫 使用實施例2中所製備之重組hTfR作為抗原而免疫小鼠。免疫係將抗原靜脈內投予或腹腔內投予至小鼠而進行。 [實施例4]融合瘤之製作 在最後投予細胞之日之約1週後摘取小鼠之脾臟並均質化，將脾細胞分離。使用聚乙二醇法使所獲得之脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞株(P3.X63.Ag8.653)進行細胞融合。細胞融合結束後，使細胞懸浮於包含(1X)HAT混合鹽(Life Technologies公司)及10%超低IgG胎牛血清(Life Technologies公司)之RPMI1640培養基中，將細胞懸浮液以200 μL/每孔之方式分注至20片96孔培養盤中。於二氧化碳培養器(37℃，5%CO2 )中將細胞培養10天後，於顯微鏡下觀察各孔，選擇存在單一菌落之孔。 於各孔之細胞已大致融合之時點回收培養上清液，將其作為融合瘤之培養上清液而供於以下之篩選。 [實施例5]高親和性抗體產生細胞株之篩選 利用50 mM碳酸鈉緩衝液(pH值9.5～9.6)稀釋重組hTfR溶液(Sino Biologics公司)而調整為5 μg/mL之濃度，將其作為固相溶液。於Nunc MaxiSorpTM 平底(flat-bottom)96孔培養盤(基材：聚苯乙烯，Nunc公司製造)之各孔中各添加50 μL之固相溶液後，將培養盤於室溫下靜置1小時，使重組hTfR吸附於培養盤而進行固定。去除固相溶液，利用250 μL之洗淨液(PBS(Phosphate buffer saline，磷酸鹽緩衝液)-T：含有0.05% Tween20之PBS)將各孔洗淨3次後，於各孔中各添加200 μL之阻斷液(含有1% BSA(bovine serum albumin，牛血清血蛋白)之PBS)，將培養盤於室溫下靜置1小時。 去除阻斷液，利用250 μL之PBS-T將各孔洗淨3次後，於各孔中各添加50 μL之融合瘤之培養上清液，將培養盤於室溫下靜置1小時，使培養上清液所含有之小鼠抗hTfR抗體結合至重組hTfR。此時，作為對照組，設置向孔中添加有50 μL之不會產生小鼠抗hTfR抗體之融合瘤之培養上清液者。又，設置於添加有各培養上清液之孔之旁邊之孔中添加有50 μL之融合瘤之培養用培養基者，將其作為空白對照孔。測定係於n＝2下實施。繼而，去除溶液，利用250 μL之PBS-T將各孔洗淨3次。 於上述之各孔中添加100 μL之HRP標記山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體溶液(Promega公司)，將培養盤於室溫下靜置1分鐘。繼而，去除溶液，利用250 μL之PBS-T將各孔洗淨3次。繼而，於各孔中添加50 μL之顯色用受質液TMB辣根過氧化酶穩定底物(Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase)(Promega公司)，於室溫下靜置10～20分鐘。繼而，於各孔中添加100 μL之反應終止液(2 N硫酸)後，使用讀盤儀對各孔之450 nm下之吸光度進行測定。取各培養上清液及對照組之2個孔之平均值，將自該等平均值分別減去各培養上清液及對照組每個設置之2個空白對照孔之平均值所得者設為測定值。 選擇與添加至顯示出較高測定值之孔中之培養上清液對應之14種融合瘤細胞作為產生對於hTfR顯示出高親和性之抗體(高親和性抗hTfR抗體)之細胞株(高親和性抗體產生細胞株)。該等14種細胞株編號為純系1株～純系14株。自該等細胞株選擇純系3株，並用於以下之實驗。又，將純系3株所產生之抗hTfR抗體設為抗hTfR抗體編號3。 [實施例6]高親和性抗hTfR抗體之可變區之胺基酸序列之分析 由在實施例5中選擇出之純系3株製備cDNA，以該cDNA作為模板，擴增編碼抗體之輕鏈及重鏈之基因。將經擴增之基因之鹼基序列進行轉譯，而確定關於該細胞株所產生之抗hTfR抗體編號3之抗體的輕鏈及重鏈之可變區之胺基酸序列。 抗hTfR抗體編號3係於輕鏈之可變區包含序列編號48所記載之胺基酸序列，且於重鏈之可變區包含序列編號49所記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係CDR1包含序列編號6或7所記載之胺基酸序列，CDR2包含序列編號8或9所記載之胺基酸序列，及CDR3包含序列編號10所記載之胺基酸序列而成，其重鏈之可變區係CDR1包含序列編號11或12所記載之胺基酸序列，CDR2包含序列編號13或14所記載之胺基酸序列，及CDR3包含序列編號15或16所記載之胺基酸序列而成者。但是，CDR並不限於上述之胺基酸序列，認為亦可將包含該等胺基酸序列之區域、包含含有該等胺基酸序列之一部分的連續3個以上胺基酸的胺基酸序列作為CDR。 將抗hTfR抗體編號3之輕鏈之可變區之CDR1～3與重鏈的可變區之CDR1～3所包含之胺基酸序列之序列編號彙總示於表1中。但是，表1係例示各CDR之胺基酸序列者，各CDR之胺基酸序列並不限於表1所記載之胺基酸序列，認為亦可將包含該等胺基酸序列之區域、包含含有該等胺基酸序列之一部分的連續3個以上胺基酸的胺基酸序列作為CDR。 [表1] [實施例7]抗hTfR抗體對於人類TfR及猴TfR之親和性之測定 抗hTfR抗體對於人類TfR及猴TfR之親和性之測定係使用應用生物膜層干涉法(BioLayer Interferometry：BLI)之生物體分子相互作用分析系統即OctetRED96(ForteBio公司，a division of Pall Corporation)實施。關於生物膜層干涉法之基本原理，簡單地進行說明。將特定波長之光投射至固定在感測器晶片表面之生物體分子之層(layer)，由生物體分子之層與成為內部之參照之層的兩個表面反射光，而產生光之干涉波。測定試樣中之分子結合至感測器晶片表面之生物體分子，藉此感測器前端之層之厚度增加，干涉波產生波長位移。對該波長位移之變化進行測定，藉此可即時進行結合至固定在感測器晶片表面之生物體分子之分子數之定量及動力學分析。測定係大致依據OctetRED96所隨附之操作指南實施。作為人類TfR，使用如下重組人類TfR(r人類TfR：Sino Biological公司)，其係在於N末端附加有組胺酸標籤之序列編號1所示之胺基酸序列中具有自從N末端側起第89位之半胱胺酸殘基直至C末端之苯丙胺酸的hTfR之細胞外區域之胺基酸序列。作為猴TfR，使用如下重組猴TfR(r猴TfR：Sino Biological公司)，其係在於N末端附加有組胺酸標籤之序列編號2所示之胺基酸序列中具有自從N末端側起第89位之半胱胺酸殘基直至C末端之苯丙胺酸的食蟹猴之TfR之細胞外區域之胺基酸序列。 將實施例5中選擇出之純系3株以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式利用包含(1X)HAT混合鹽(Life Technologies公司)及10%超低IgG胎牛血清(Life Technologies公司)之RPMI1640培養基進行稀釋，於1 L之三角燒瓶中加入200 mL之細胞懸浮液，於37℃下在包含5%CO2 與95%空氣之濕潤環境下以約70 rpm之攪拌速度培養6～7天。對培養液進行離心操作後，利用0.22 μm過濾器(Millipore公司)進行過濾，回收培養上清液。於預先經包含150 mM NaCl之管柱體積3倍體積之20 mM三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值8.0)平衡化之蛋白G管柱(管柱體積：1 mL，GE healthcare公司)中注入所回收之培養上清液。繼而，藉由管柱體積5倍體積之上述緩衝液將管柱洗淨後，利用包含150 mM NaCl之管柱體積4倍體積之50 mM甘胺酸緩衝液(pH值2.8)使所吸附之抗體溶出，採取溶出份。對溶出份添加1 M三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值8.0)而調整至pH值7.0。將其作為抗hTfR抗體編號3之純化品而用於以下之實驗。 利用HBS-P+(150 mM NaCl、50 μM EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，四乙酸乙二胺)及包含0.05% Surfactant P20之10 mM HEPES(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，羥乙基哌嗪乙磺酸))將抗hTfR抗體編號3之純化品進行2階段稀釋，而製備0.78125～50 nM(0.117～7.5 μg/mL)之7階段濃度之抗體溶液。將該抗體溶液設為樣品溶液。利用HBS-P+分別稀釋r人類TfR與r猴TfR，而製備25 μg/mL之溶液，並分別設為r人類TfR-ECD(Histag)溶液及r猴TfR-ECD(Histag)溶液。 將進行上述2階段稀釋所製備之樣品溶液以200 μL/每孔之方式添加至96孔培養盤(黑色)(greiner bioone公司)中。又，將上述所製備之r人類TfR-ECD(Histag)溶液及r猴TfR-ECD(Histag)溶液以200 μL/孔之形式分別添加至特定之孔中。將HBS-P+以200 μL/每孔之方式添加至基線、解離用及洗淨用之孔中。將10 mM甘胺酸鹽酸鹽(Glycine-HCl)(pH值1.7)以200 μL/每孔之方式添加至再生用之孔中。將0.5 mM NiCl2 溶液以200 μL/每孔之方式添加至活化用之孔中。將該培養盤與生物感測器(Biosensor/Ni-NTA：ForteBio公司，a division of Pall Corporation)設置在OctetRED96之特定位置上。 使OctetRED96於下述表2所示之條件下作動而取得資料後，使用OctetRED96自帶之分析軟體，將結合反應曲線擬合為1：1結合模型或2：1結合模型，而測定抗hTfR抗體對於r人類TfR及r猴TfR之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)，算出解離常數(KD )。再者，測定係於25～30℃之溫度下實施。 [表2] 於表3中表示抗hTfR抗體編號3對於人類TfR及猴TfR之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)之測定結果、及解離常數(KD )。 [表3] 抗hTfR抗體對於人類TfR之親和性之測定之結果為，抗hTfR抗體編號3之與人類TfR之解離常數為1×10-12 M以下，與猴TfR之解離常數亦為1×10-12 M以下。該等結果表示，抗hTfR抗體編號3為不僅對於人類TfR具有高親和性，對於猴TfR亦具有高親和性之抗體。 [實施例7-2]抗hTfR抗體之使用小鼠之腦轉移評價 繼而，關於抗hTfR抗體編號3，使用將編碼小鼠運鐵蛋白受體之細胞外區域之基因置換為編碼人類運鐵蛋白受體基因之細胞外區域的基因所獲得之hTfR基因敲入小鼠(hTfR-KI小鼠)，對各抗體通過BBB而轉移至腦內之情況進行評價。hTfR-KI小鼠大致藉由下述方法製作。又，作為抗hTfR抗體編號3，使用實施例7中所製備之純化品。 化學合成於編碼細胞內區域為小鼠TfR之胺基酸序列且細胞外區域為人類TfR之胺基酸序列之嵌合hTfR的cDNA之3'側配置有由loxP序列夾住之新黴素耐性基因之具有序列編號45所示之鹼基序列的DNA片段。藉由常規方法，將該DNA片段組入至具有序列編號46所示之鹼基序列作為5'連接臂序列且具有序列編號47所示之鹼基序列作為3'連接臂序列的打靶載體(targeting vector)中，藉由電穿孔法將其導入至小鼠ES細胞中。將基因導入後之小鼠ES細胞於新黴素存在下進行選擇培養，選擇出藉由同源重組將打靶載體組入至染色體中而成之小鼠ES細胞。將所獲得之基因重組小鼠ES細胞注入至ICR小鼠之8細胞期胚胎(宿主胚胎)，移植至藉由與進行過輸精管結紮之小鼠交配而獲得之假妊娠小鼠(受體小鼠)中。對於所獲得之產子(嵌合小鼠)進行毛色判定，篩選出ES細胞以高效率有助於生物體之形成之個體，即白色毛占整體毛之比率較高之個體。使該嵌合小鼠個體與ICR小鼠交配而獲得F1小鼠。篩選白色之F1小鼠，對自尾巴之組織提取之DNA進行分析，將染色體上小鼠運鐵蛋白受體基因被置換為嵌合hTfR之小鼠設為hTfR-KI小鼠。 使用螢光標記套組(Fluorescein Labeling Kit)-NH2 (同仁化學研究所)，依據隨附之操作指南，藉由螢光素異硫氰酸酯(FITC)對抗hTfR抗體編號3之純化品進行螢光標記。製備包含該經FITC螢光標記之抗體之PBS溶液。將該抗體溶液以所投予之抗hTfR抗體之用量成為3 mg/kg之方式靜脈注射至1隻hTfR-KI小鼠(雄性，10～12週齡)中。又，作為對照組，將以相同方式製備之包含經FITC螢光標記之小鼠IgG1(西格瑪公司)之PBS溶液以3 mg/kg之用量靜脈注射至1隻hTfR-KI小鼠(雄性，10～12週齡)中。於靜脈注射約8小時後利用生理鹽水進行全身灌注，採取腦(包含大腦與小腦之部分)。測定所摘取之腦之重量(濕重量)後，添加包含蛋白酶抑制劑混合液(Protease Inhibitor Cocktail)(西格瑪公司)之T-PER(Thermo Fisher Scientific公司)而將腦組織勻漿化。將勻漿進行離心而回收上清液，利用以下之方法測定上清液中所包含之經FITC螢光標記之抗體之量。首先，於高結合力培養盤(High Bind Plate)(Meso Scale Diagnostics公司)之各孔中各添加10 μL之抗FITC抗體(Bethyl公司)，靜置1小時而使抗FITC抗體固定在培養盤中。繼而，於各孔中各添加150 μL之含有SuperBlock阻斷緩衝液之PBS(SuperBlock blocking buffer in PBS)(Thermo Fisher Scientific公司)，進行1小時振盪而將培養盤阻斷。繼而，於各孔中各添加25 μL之腦組織勻漿之上清液，進行1小時振盪。繼而，於各孔中各添加25 μL之SULFO-TAG抗小鼠抗體(Goat)(Meso Scale Diagnostics公司)，進行1小時振盪。繼而，於各孔中各添加150 μL之Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000 reader測定來自各孔之發光量。根據濃度已知之經FITC螢光標記之抗hTfR抗體之標準試樣的測定值製作校準曲線，於其中插補各檢體之測定值，藉此算出腦之每克重(濕重量)所包含之抗體之量(腦組織中之抗hTfR抗體之濃度)。將其結果示於表4。 與對照組相比，抗hTfR抗體編號3於腦組織中之濃度為約27.8倍。該結果顯示，抗hTfR抗體編號3具有積極地通過BBB而轉移至腦內之性質。 [表4] [實施例8]抗hTfR抗體之使用猴之藥物動力學分析 將抗hTfR抗體編號3以5.0 mg/kg之用量單次靜脈內投予至雄性食蟹猴，於投予8小時後利用生理鹽水實施全身灌注。又，作為陰性對照，將未投予抗hTfR抗體之1隻個體同樣地進行全身灌注。灌注後，摘取包含髓質之腦組織。使用該腦組織，進行以下之抗hTfR抗體之濃度測定及免疫組織化學染色。作為抗hTfR抗體編號3，使用實施例7所記載之抗體之純化品。 腦組織中之抗hTfR抗體之濃度測定大致藉由以下程序進行。對於所採取之組織，將腦組織分為大腦、小腦、海馬區及髓質後，分別利用包含蛋白酶抑制劑混合液(Protease Inhibitor Cocktail)(Sigma-Aldrich公司)之RIPA緩衝液(和光純藥工業股份有限公司)進行勻漿化並進行離心而回收上清液。於高結合力培養盤(High Bind Plate)(Meso Scale Diagnostics公司)之各孔中各添加10 μL之標記山羊抗小鼠(Affinipure Goat Anti mouse)IgG Fcγ pAb(Jackson ImmunoResearch公司)，靜置1小時而固定於培養盤中。繼而，於各孔中各添加150 μL之含有SuperBlock阻斷緩衝液之PBS(SuperBlock blocking buffer in PBS)(Thermo Fisher Scientific公司)，進行1小時振盪而將培養盤阻斷。繼而，於各孔中各添加25 μL之腦組織勻漿之上清液，進行1小時振盪。繼而，於各孔中各添加25 μL之標記山羊抗小鼠(Affinipure Goat Anti mouse)IgG Fab-Biotin(Jackson ImmunoResearch公司)，進行1小時振盪。繼而，於各孔中各添加25 μL之SULFO-Tag-抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)(Meso Scale Diagnostics公司)，進行0.5小時振盪。於各孔中各添加150 μL之Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000 reader(Meso Scale Diagnostics公司)測定來自各孔之發光量。根據濃度已知之抗hTfR抗體之標準試樣的測定值製作校準曲線，於其中插補各檢體之測定值，藉此算出各腦組織之每克重(濕重量)所包含之抗體之量(腦組織中之抗hTfR抗體之濃度)。 將腦組織中之抗hTfR抗體之濃度測定之結果示於表5。於大腦、小腦、海馬區及頸脊髓全部中，發現了抗hTfR抗體編號3之儲積。該等結果顯示，抗hTfR抗體編號3具有通過血腦障壁而於腦組織中儲積之性質，藉由使應於腦組織內發揮功能之藥劑與該等抗體結合，而可使該藥劑高效率地儲積於腦組織中。 [表5] 腦組織中之抗hTfR抗體之免疫組織化學染色大致藉由以下之程序進行。使用Tissue-Tek冷凍3DM(Sakura-finetek股份有限公司)，將所採取之組織急速冷凍至-80℃，而製作組織之冷凍片。將該冷凍片薄切至4 μm後，貼附至MAS COAT載玻片(松浪硝子股份有限公司)。使4%多聚甲醛(和光純藥工業股份有限公司)與組織薄片於4℃下反應5分鐘，將組織薄片固定在載玻片上。繼而，使包含0.3%過氧化氫水之甲醇溶液(和光純藥工業股份有限公司)與組織薄片反應30分鐘，而使內源性過氧化酶失去活性。繼而，使載玻片與含有SuperBlock阻斷緩衝液之PBS(SuperBlock blocking buffer in PBS)於室溫下反應30分鐘而進行阻斷。繼而，使小鼠IgG-重鏈及輕鏈抗體(Bethyl Laboratories公司)與組織薄片於室溫下反應1小時。利用DAB受質(3,3'-二胺基聯苯胺，Vector Laboratories公司)使組織薄片顯色，利用邁爾氏蘇木精(Mayer's Hematoxylin)(Merck公司)進行對比染色，於脫水、透明後封片，利用光學顯微鏡觀察。 圖1中表示大腦皮質之抗hTfR抗體之免疫組織化學染色之結果。於投予了抗hTfR抗體編號3之猴之大腦皮質中，確認到血管之特異性染色(圖1b)。進而，於腦血管外之腦實質區域亦廣泛地確認到特異性染色。另一方面顯示，於作為對照組設置之未投予抗hTfR抗體之猴之大腦皮質中未發現染色，且背景之染色幾乎不存在(圖1a)。 圖2中表示海馬區之抗hTfR抗體之免疫組織化學染色之結果。於投予了抗hTfR抗體編號3之猴之大腦皮質中，確認到血管之特異性染色(圖2b)。進而，於神經細胞中亦確認到特異性染色，又，於腦血管外之腦實質區域亦廣泛地確認到特異性染色。另一方面顯示，於作為對照組設置之未投予抗hTfR抗體之猴之海馬區中未發現染色，且背景之染色幾乎不存在(圖2a)。 圖3中表示小腦之抗hTfR抗體之免疫組織化學染色之結果。於投予了抗hTfR抗體編號3之猴之大腦皮質中，確認到血管之特異性染色(圖3b)。進而，於浦金埃氏細胞中亦確認到特異性染色。另一方面顯示，於作為對照組設置之未投予抗hTfR抗體之猴之小腦中未發現染色，且背景之染色幾乎不存在(圖3a)。 根據以上之大腦、海馬區及小腦之免疫組織化學染色之結果可知，抗hTfR抗體編號3可結合至存在於腦血管內皮表面之hTfR，且結合至hTfR後，通過血腦障壁而轉移至腦實質內，進而於海馬區中自腦實質內摻入至神經細胞中，於小腦中摻入至浦金埃氏細胞中。 [實施例9]人源化抗hTfR抗體之製作 嘗試抗hTfR抗體編號3之輕鏈及重鏈之可變區所包含之胺基酸序列的人源化。然後，獲得具有序列編號17～序列編號22所示之胺基酸序列之經人源化之輕鏈之可變區、與具有序列編號31～序列編號36所示之胺基酸序列之經人源化之重鏈之可變區(人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈之可變區之胺基酸序列1～6、及人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區之胺基酸序列1～6)。 [實施例10]編碼人源化抗hTfR抗體之基因之構建 關於上述之抗hTfR抗體編號3，人工地合成如下DNA片段，其包含分別編碼包含人源化抗hTfR抗體之輕鏈及重鏈之可變區之輕鏈及重鏈之全長的基因。此時，於編碼輕鏈之全長之基因之5'側自5'端依序導入MluI序列與編碼前導肽之序列，於3'側導入NotI序列。又，於編碼重鏈之全長之基因之5'側自5'端依序導入MluI序列與編碼前導肽之序列，於3'側導入NotI序列。再者，此處所導入之前導肽係以於使人源化抗體之輕鏈及重鏈於作為宿主細胞之哺乳動物細胞表現出時將輕鏈及重鏈分泌至細胞外的方式作為分泌訊號發揮功能者。 關於抗hTfR抗體編號3之輕鏈，合成DNA片段(序列編號24)，其編碼可變區具有序列編號18所示之胺基酸序列之序列編號23所示之胺基酸序列的輕鏈(以下，人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈)之全長。關於抗hTfR抗體編號3之重鏈，合成DNA片段(序列編號38)，其編碼可變區具有序列編號32所示之胺基酸序列之序列編號37所示之胺基酸序列的重鏈(以下，人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈)之全長。序列編號38所示之DNA片段所編碼之人源化抗hTfR抗體之重鏈為IgG1。 關於抗hTfR抗體編號3之輕鏈，亦合成DNA片段(序列編號26)、DNA片段(序列編號28)、及DNA片段(序列編號30)，該DNA片段(序列編號26)係編碼可變區具有序列編號20所示之胺基酸序列之序列編號25所示之胺基酸序列的輕鏈(以下，人源化抗hTfR抗體編號3-2之輕鏈)之全長，該DNA片段(序列編號28)係編碼可變區具有序列編號21所示之胺基酸序列之序列編號27所示之胺基酸序列的輕鏈(以下，人源化抗hTfR抗體編號3-3之輕鏈)之全長，該DNA片段(序列編號30)係編碼可變區具有序列編號22所示之胺基酸序列之序列編號29所示之胺基酸序列的輕鏈(以下，人源化抗hTfR抗體編號3-4之輕鏈)之全長。 進而，關於抗hTfR抗體編號3之重鏈，合成DNA片段(序列編號40)，其編碼可變區具有序列編號32所示之胺基酸序列之序列編號39所示之胺基酸序列的重鏈(以下，人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈IgG4)之全長。該序列編號40所示之DNA片段所編碼之人源化抗hTfR抗體之重鏈為IgG4。 [實施例11]人源化抗hTfR抗體表現載體之構建 利用KpnI與NcoI消化pEF/myc/nuc載體(Invitrogen公司)，切出包含EF-1α啟動子及其第一內含子之區域，利用T4 DNA聚合酶對其進行平滑末端化處理。利用BglII及EcoRI消化pCI-neo(Invitrogen公司)，切除包含CMV之促進子/啟動子及內含子之區域後，利用T4 DNA聚合酶進行平滑末端化處理。於其中插入上述包含EF-1α啟動子及其第一內含子之區域，而構建pE-neo載體。利用SfiI及BstXI消化pE-neo載體，將包含新黴素耐性基因之約1 kbp之區域切除。以pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen公司)為模板，使用引子Hyg-Sfi5'(序列編號43)及引子Hyg-BstX3'(序列編號44)，藉由PCR反應擴增潮黴素基因。利用SfiI及BstXI消化經擴增之潮黴素基因，插入至上述切除了新黴素耐性基因之pE-neo載體中，而構建pE-hygr載體。 分別利用MluI與NotI消化pE-hygr載體及pE-neo載體，利用MluI與NotI消化實施例10中所合成之編碼人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈之DNA片段(序列編號24)與編碼人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之DNA片段(序列編號38)，分別插入至pE-hygr載體與pE-neo載體之MluI-NotI間。將所獲得之載體分別製成人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC3)、人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈表現用載體之pE-neo(HC3)而用於以下之實驗。 進而，關於抗hTfR抗體編號3之輕鏈，利用MluI與NotI消化實施例10中所合成之編碼人源化抗hTfR抗體編號3-2之輕鏈之DNA片段(序列編號26)、編碼人源化抗hTfR抗體編號3-3之輕鏈之DNA片段(序列編號28)、及編碼人源化抗hTfR抗體編號3-4之輕鏈之DNA片段(序列編號30)，插入至pE-hygr載體之MluI-NotI間，分別構建人源化抗hTfR抗體編號3-2之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC3-2)、人源化抗hTfR抗體編號3-3之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC3-3)、及人源化抗hTfR抗體編號3-4之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC3-4)。 進而同樣地，關於抗hTfR抗體編號3之重鏈，利用MluI與NotI消化實施例10中所合成之編碼人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈IgG4之DNA片段(序列編號40)，插入至pE-neo載體之MluI-NotI間，而構建人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈IgG4表現用載體之pE-neo(HC3-IgG4)。 [實施例12]人源化抗hTfR抗體表現用細胞之構建 藉由下述方法，並使用基因脈衝儀(GenePulser)(Bio-Rad公司)，利用實施例11中所構建之輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3)將CHO細胞(CHO-K1：自美國菌種中心(American Type Culture Collection)獲取)轉形。細胞之轉形大致藉由以下之方法進行。將5×105 個CHO-K1細胞接種至添加有CD OptiCHOTM 培養基(Life Technologies公司)之3.5 cm培養皿中，於37℃、5%CO2 之條件下培養一夜。將培養基更換為Opti-MEMTM I培養基(Life Technologies公司)，使細胞以成為5×106 細胞/mL之密度之方式懸浮。採取細胞懸浮液100 μL，於其中各添加5 μL之經Opti-MEMTM I培養基稀釋為100 μg/mL之pE-hygr(LC3)及pE-neo(HC3)質體DNA溶液。使用基因脈衝儀(GenePulser)(Bio-Rad公司)而實施電穿孔法，將質體導入至細胞中。將細胞於37℃、5%CO2 之條件下培養一夜後，於添加有0.5 mg/mL之潮黴素及0.8 mg/mL之G418之CD OptiCHOTM 培養基中進行選擇培養。 繼而，藉由限制稀釋法，以每孔接種1個以下之細胞之方式，將於選擇培養中選擇出之細胞接種至96孔培養盤上，以各細胞形成單純系菌落之方式培養約10天。採取形成有單純系菌落之孔之培養上清液，利用ELISA法調查培養上清液中之人源化抗體含量，選擇出人源化抗體高表現細胞株。 此時之ELISA法大致藉由以下之方法實施。於96孔微量滴定盤(Nunc公司)之各孔中各添加100 μL之利用0.05 M碳酸氫鹽緩衝液(pH值9.6)將山羊抗人類IgG多株抗體溶液稀釋至4 μg/mL所得者，於室溫下至少靜置1小時而使抗體吸附於培養盤。繼而，利用PBS-T將各孔洗淨3次後，於各孔中各添加200 μL之Starting Block(PBS)阻斷緩衝液(Blocking Buffer)(Thermo Fisher Scientific公司)，將培養盤於室溫下靜置30分鐘。利用PBS-T將各孔洗淨3次後，於各孔中各添加100 μL之經於PBS中添加有0.5%BSA及0.05%Tween20者(PBS-BT)稀釋為適當濃度所獲得之培養上清液或人類IgG標準品，將培養盤於室溫下至少靜置1小時。利用PBS-T將培養盤洗淨3次後，於各孔中各添加100 μL之經PBS-BT稀釋之HRP標記抗人類IgG多株抗體溶液，將培養盤於室溫下至少靜置1小時。利用PBS-T將各孔洗淨3次後，於各孔中各添加100 μL之包含磷酸-檸檬酸緩衝液(pH值5.0)之0.4 mg/mL鄰苯二胺，於室溫下靜置8～20分鐘。繼而，於各孔中各添加100 μL之1 mol/L硫酸而使反應終止，使用96孔讀盤儀，測定各孔之490 nm下之吸光度。將與顯示出較高測定值之孔對應之細胞設為人源化抗hTfR抗體編號1之高表現細胞株。將其設為抗體編號3表現株。 進而同樣地，使用實施例11中所構建之輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3-2)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3)而使CHO細胞轉形，從而獲得人源化抗hTfR抗體編號3-2之高表現細胞株。將其設為抗體編號3-2表現株。 進而同樣地，使用實施例11中所構建之輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3-3)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3)而使CHO細胞轉形，從而獲得人源化抗hTfR抗體編號3-3之高表現細胞株。將其設為抗體編號3-3表現株。 進而同樣地，使用實施例11中所構建之輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3-4)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3)而使CHO細胞轉形，從而獲得人源化抗hTfR抗體編號3-4之高表現細胞株。將其設為抗體編號3-4表現株。 進而同樣地，使用實施例11中所構建之輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3-IgG4)而使CHO細胞轉形，從而獲得人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)之高表現細胞株。將其設為抗體編號3(IgG4)表現株。 進而同樣地，使用實施例11中所構建之輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3-2)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3-IgG4)而使CHO細胞轉形，從而獲得人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之高表現細胞株。將其設為抗體編號3-2(IgG4)表現株。 [實施例13]人源化抗hTfR抗體之純化 將實施例12中所獲得之抗體編號3表現株、抗體編號3-2表現株、抗體編號3-3表現株及抗體編號3-4表現株分別以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式利用CD OptiCHOTM 培養基進行稀釋，於1 L之三角燒瓶中添加200 mL之細胞懸浮液，於37℃下且於包含5%CO2 與95%空氣之濕潤環境以約70 rpm之攪拌速度培養6～7天。藉由離心操作回收培養上清液，利用0.22 μm過濾器(Millipore公司)進行過濾，而製成培養上清液。於所回收之培養上清液中添加包含150 mM NaCl之5倍體積之20 mM三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值8.0)，注入預先經包含150 mM NaCl之管柱體積3倍體積之20 mM三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值8.0)平衡化之蛋白A管柱(管柱體積：1 mL，Bio-Rad公司)中。繼而，藉由管柱體積5倍體積之上述緩衝液將管柱洗淨後，利用包含150 mM NaCl之管柱體積之4倍體積之50 mM甘胺酸緩衝液(pH值2.8)使所吸附之人源化抗體溶出，採取溶出份。於溶出份中添加1 M三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值8.0)而進行中和，將其設為抗體之純化品。 此處，自抗體編號3表現株之培養上清液純化所獲得之抗體係設為人源化抗hTfR抗體編號3。自抗體編號3-2表現株之培養上清液純化所獲得之抗體係設為人源化抗hTfR抗體編號3-2。自抗體編號3-3表現株之培養上清液純化所獲得之抗體係設為人源化抗hTfR抗體編號3-3。又，自抗體編號3-4表現株之培養上清液純化所獲得之抗體係設為人源化抗hTfR抗體編號3-4。 又，關於實施例12中所獲得之抗體編號3(IgG4)表現株、及抗體編號3-2(IgG4)表現株，亦與上述同樣地進行培養，自其培養上清液分別獲得經純化之人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。該等2種抗體係用於使用實施例15所記載之猴之藥物動力學分析。 [實施例14]人源化抗hTfR抗體之對於人類TfR及猴TfR之親和性之測定 利用實施例7所記載之方法測定實施例13中所獲得之人源化抗hTfR抗體對於人類TfR及猴TfR之親和性。於表6中表示人源化抗hTfR抗體編號3～3-4(表中，分別與No.3～3-4對應)之對於人類TfR之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)之測定結果、及解離常數(KD )。 [表6] 於表7中表示人源化抗hTfR抗體編號3～3-4(表中，分別與抗體編號3～3-4對應)之對於猴TfR之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)之測定結果、及解離常數(KD )。 [表7] 人源化抗hTfR抗體編號3～3-4之對於人類TfR之親和性之測定的結果為，若為人源化抗hTfR抗體編號3及3-4抗體，則與人類TfR之解離常數未達1×10-12 M(表6)。又，人源化抗hTfR抗體編號3-2及3-3之與人類TfR之解離常數分別為2.39×10-11 M與2.09×10-11 M。另一方面，與該等抗體對應之人源化前之抗hTfR抗體(抗體編號3)之與人類TfR的解離常數未達1×10-12 M(表3)。該等結果顯示，抗hTfR抗體之對於人類TfR之較高親和性在將抗體人源化之前後得以維持。 繼而，自人源化抗hTfR抗體之對於猴TfR之親和性之測定結果來看，關於人源化抗hTfR抗體編號3～3-4，觀察到人源化前之與該等抗體對應之抗hTfR抗體編號3之與猴TfR的解離常數未達1×10-12 M者於人源化後，對於猴TfR之親和性降低至2.60×10-10 M～1.91×10-9 M(表3、表7)。若為人源化抗hTfR抗體編號3，則觀察到對於猴TfR之親和性之降低，但該等結果顯示，抗hTfR抗體之對於猴TfR之較高親和性於將抗體人源化之前後不會喪失而大致得以維持。 [實施例15]人源化抗hTfR抗體之使用猴之藥物動力學分析 使用人源化抗hTfR抗體編號3、人源化抗hTfR抗體編號3-2、人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之4種抗體，進行使用猴之藥物動力學分析。再者，人源化抗hTfR抗體編號3係重鏈為IgG1，人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)係將人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈直接作為可變區而設為IgG4者。又，人源化抗hTfR抗體編號3-2係重鏈為IgG1，且人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)係將人源化抗hTfR抗體編號3-2之重鏈直接作為可變區而設為IgG4者。將該等4種抗體分別以5.0 mg/kg之用量分別單次靜脈內投予至雄性食蟹猴中，於投予前及投予後2分鐘、30分鐘、2小時、4小時及8小時後採取末梢血，於採血後實施全身灌注。又，作為陰性對照，將關於HER2蛋白之人源化抗體即曲妥珠單抗(赫賽汀(Herceptin)TM ，中外製藥)以相同方式投予至一隻個體，於投予前及投予後2分鐘、30分鐘、2小時、4小時及8小時後採取末梢血，於採血後實施全身灌注。灌注後，摘取包含髓質之腦組織、脊髓組織及其他組織(包含肝臟、心臟、脾臟及骨髓)。使用該腦組織、脊髓組織及其他組織，進行以下之人源化抗hTfR抗體之濃度測定及免疫組織化學染色。 組織中及末梢血中之人源化抗hTfR抗體之濃度測定大致藉由以下之程序進行。再者，將關於腦所採取之組織分為大腦皮質、小腦、海馬區及髓質後，進行人源化抗hTfR抗體之濃度測定。分別利用包含蛋白酶抑制劑混合液(Protease Inhibitor Cocktail)(Sigma-Aldrich公司)之RIPA緩衝液(和光純藥工業股份有限公司)將所採取之組織勻漿化，並進行離心而回收上清液。將關於末梢血之血清進行分離。將抗人類Kappa輕鏈山羊IgG生物素(免疫生物研究所股份有限公司)、Sulfo-tag抗人類IgG(H＋L)抗體(Bethyl公司)及腦組織勻漿添加至利用含有SuperBlock阻斷緩衝液之PBS(SuperBlock blocking buffer in PBS)(Thermo Fisher Scientific公司)實施過阻斷之抗生蛋白鏈菌素培養盤(Meso Scale Diagnostics公司)中，進行1小時振盪而固定於培養盤中。繼而，於各孔中各添加150 μL之Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000 reader測定來自各孔之發光量。根據濃度已知之抗hTfR抗體之標準試樣的測定值製作校準曲線，於其中插補各檢體之測定值，藉此算出各組織中及末梢血中所包含之抗體之量。濃度之測定各樣品每個反覆進行3次。 將腦組織及脊髓組織中之人源化抗hTfR抗體之濃度測定之結果示於表8中。 [表8] 發現人源化抗hTfR抗體編號3、人源化抗hTfR抗體編號3-2、人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之抗體均於大腦皮質、小腦、海馬區、髓質及脊髓中儲積(表8)。關於上述抗體之量，若為人源化抗hTfR抗體編號3，則與陰性對照之曲妥珠單抗(赫賽汀(Herceptin)TM )相比，於大腦皮質中為約82倍，於小腦中為約68倍，於海馬區中為約92倍，於髓質中為約54倍，於脊髓中為約3.1倍，若為人源化抗hTfR抗體編號3-2，則與陰性對照之曲妥珠單抗相比，於大腦皮質中為約128倍，於小腦中為約80倍，於海馬區中為約136倍，於髓質中為約63倍，於脊髓中為約3.1倍，若為人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，則與陰性對照之曲妥珠單抗相比，於大腦皮質中為約79倍，於小腦中為約66倍，於海馬區中為約106倍，於髓質中為約54倍，於脊髓中為約3.1倍，若為人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)，則與陰性對照之曲妥珠單抗相比，於大腦皮質中為約93倍，於小腦中為約63倍，於海馬區中為約117倍，於髓質中為約66倍，於脊髓中為約3.2倍(表9)。該等結果顯示，該等4種人源化抗hTfR抗體具有通過血腦障壁而於腦組織中儲積之性質，可藉由使應於腦組織內發揮功能之藥劑與該等抗體結合而使該藥劑高效率地於腦組織中儲積。 [表9] 繼而，將肝臟、心臟、脾臟及骨髓之各組織中之人源化抗hTfR抗體之濃度測定的結果示於圖4。於肝臓、及脾臟中，發現4種人源化抗hTfR抗體及陰性對照之曲妥珠單抗均儲積，關於上述人源化抗hTfR抗體及曲妥珠單抗之量，係人源化抗hTfR抗體與曲妥珠單抗同等。於心臟中，人源化抗hTfR抗體與陰性對照之曲妥珠單抗相比，有儲積量較多之傾向，但該人源化抗hTfR抗體之量止於陰性對照之1.5倍～2.8倍左右。於骨髓中，人源化抗hTfR抗體與陰性對照之曲妥珠單抗相比，有儲積量明顯較多之傾向，該人源化抗hTfR抗體之量為陰性對照之3.5～16倍。關於人源化抗hTfR抗體向骨髓之儲積，認為其原因在於：於作為造血器官之骨髓中TfR之表現量較多，藉由與TfR結合而更多之人源化抗hTfR抗體較陰性對照儲積。該等資料顯示，該等4種人源化抗hTfR抗體具有特異性地於作為中樞神經系統之大腦、小腦、海馬區及髓質中儲積之性質，可藉由使應於腦組織內發揮功能之藥劑與該等抗體結合而使該藥劑高效率地於腦組織中儲積。 繼而，將人源化抗hTfR抗體之血中動態之測定結果示於表9-2。4種人源化抗hTfR抗體係與陰性對照之曲妥珠單抗同樣地，即便於投予後8小時，血中濃度亦顯示出60 μg/mL以上之高值，而表示於血中穩定(表9-2)。 [表9-2] 腦組織中之人源化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色係藉由實施例8所記載之方法進行。但是，此時，使用人類IgG-重鏈及輕鏈抗體(Bethyl Laboratories公司)代替小鼠IgG-重鏈及輕鏈抗體(Bethyl Laboratories公司)。 圖5中表示大腦皮質之人源化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色的結果。於投予了人源化抗hTfR抗體編號3、人源化抗hTfR抗體編號3-2、人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之猴之大腦皮質中，確認到血管及神經細胞之特異性染色(分別為圖5b～e)。尤其是於投予了人源化抗hTfR抗體編號3-2之猴之大腦皮質(圖5c)中，於腦血管外之腦實質區域亦廣泛地確認到特異性染色。再者，於作為對照組設置之投予了赫賽汀(Herceptin)之猴之大腦皮質中未發現染色，顯示於圖5b～e中觀察到之組織染色為對於人源化抗hTfR抗體具有特異性者(圖5a)。 圖6中表示海馬區之人源化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色之結果。於投予了人源化抗hTfR抗體編號3、人源化抗hTfR抗體編號3-2、人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之猴之海馬區中確認到血管及神經細胞之特異性染色(分別為圖6b～e)。再者，於作為對照組設置之投予了赫賽汀(Herceptin)之猴之海馬區中未發現染色，顯示於圖6b～e中觀察到之組織染色為對於人源化抗hTfR抗體具有特異性者(圖6a)。 圖7中表示小腦之人源化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色之結果。於投予了人源化抗hTfR抗體編號3、人源化抗hTfR抗體編號3-2、人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之猴之小腦中確認到血管及浦金埃氏細胞之特異性染色(分別為圖7b～e)。再者，於作為對照組設置之投予了赫賽汀(Herceptin)之猴之小腦中未發現染色，顯示於圖7b～e中觀察到之組織染色為對於人源化抗hTfR抗體具有特異性者(圖7a)。 圖8中表示髓質之人源化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色之結果。於投予了人源化抗hTfR抗體編號3、人源化抗hTfR抗體編號3-2、人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之猴之髓質中確認到血管及神經細胞之特異性染色(分別為圖8b～e)。再者，於作為對照組設置之投予了赫賽汀(Herceptin)之猴之髓質中未發現染色，顯示於圖8b～e中觀察到之組織染色為對於人源化抗hTfR抗體具有特異性者(圖8a)。 根據上述實施例8之大腦及小腦之免疫組織化學染色之結果顯示，作為人源化前之小鼠抗體之抗hTfR抗體編號3可結合至存在於腦血管內皮表面之hTfR，且結合至hTfR後，通過血腦障壁而轉移至腦實質內，進而於海馬區自腦實質內摻入至神經細胞中，於小腦中摻入至浦金埃氏細胞中。 根據實施例15之大腦、海馬區、小腦及髓質之免疫組織化學染色之結果可知，將供於實驗之抗hTfR抗體編號3人源化所獲得之4種人源化抗hTfR抗體係結合至存在於腦血管內皮表面之hTfR，且結合至hTfR後，通過血腦障壁而轉移至腦實質內，進而於大腦皮質中摻入至神經細胞中，於海馬區中自腦實質內摻入至神經細胞中，於小腦中摻入至浦金埃氏細胞中，於髓質中摻入至神經細胞中。 [實施例15-2]hBDNF-人源化抗hTfR抗體融合蛋白質(hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質)表現用細胞之製作 人工合成包含編碼如下融合蛋白質之基因之具有序列編號78所示之鹼基序列的DNA片段，該融合蛋白質係於具有序列編號56所示之胺基酸序列之hBDNF之前體之C末端側，經由包含接著Gly-Ser後序列編號3所示之胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反覆5次之共計27個胺基酸之連接子序列，融合具有序列編號77所示之胺基酸序列之人源化抗hTfR抗體Fab重鏈所得。此處，序列編號77所示之胺基酸序列係相當於序列編號37所示之胺基酸序列之自N末端側至第1～226位。此處自N末端側至第1～118位之胺基酸序列相當於序列編號32(人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區之胺基酸序列2)，第119～216位之胺基酸序列相當於CH1區域，第217～226位之胺基酸序列相當於鉸鏈部。 該DNA片段編碼具有序列編號79所示之胺基酸序列之hBDNF之前體與人源化抗hTfR抗體Fab重鏈的融合蛋白質。具有序列編號79所示之胺基酸序列之融合蛋白質係於表現後經加工(processing)，而成為具有序列編號80所示之胺基酸序列之hBDNF與人源化抗hTfR抗體Fab重鏈的融合蛋白質。於序列編號79所示之胺基酸序列中，自N末端側至第1～110位之胺基酸序列係將hBDNF自前體向成熟型加工時被去除之部分。利用MluI與NotI消化該DNA片段，組入至pE-neo載體之MluI與NotI之間，而構建pE-neo(BDNF-Fab HC-1)。 藉由實施例12所記載之方法，利用pE-neo(BDNF-Fab HC-1)與實施例11中所構建之pE-hygr(LC3)將CHO細胞(CHO-K1：自美國菌種中心(American Type Culture Collection)獲取)轉形，而獲得表現hBDNF與人源化抗hTfR抗體之融合蛋白質之細胞株。將該細胞株設為hBDNF-抗hTfR抗體(3)1表現株。將該細胞株所表現之hBDNF與人源化抗hTfR抗體之融合蛋白質設為hBDNF-抗hTfR抗體(3)1。 [實施例15-3]hBDNF-抗hTfR抗體(3)1之製作 使用實施例15-2中所獲得之hBDNF-抗hTfR抗體(3)1表現株，利用實施例13所記載之方法，獲得hBDNF-抗hTfR抗體(3)1之純化品。 [實施例16]對於人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之突變 製作於序列編號37所示之人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區中將CDR1設為序列編號12所示者時置換該CDR1之1個胺基酸序列，並且置換架構區3之1個胺基酸序列之人源化抗體的重鏈。該新穎之抗體之重鏈係CDR1包含序列編號66(或者包含其之序列編號67)之胺基酸序列，架構區3包含序列編號68之胺基酸序列者，因此係置換了2個構成序列編號37所示之人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之胺基酸序列的胺基酸者。該新穎之抗體(人源化抗hTfR抗體編號3N)之重鏈係包含序列編號70之胺基酸序列，其可變區包含序列編號69所示之胺基酸序列而成。 於表10中表示人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈中之序列編號12之CDR1與人源化抗hTfR抗體編號3N的重鏈中之序列編號66之CDR1的比對。於該比對中，將自N末端側起第5位的胺基酸自蘇胺酸置換為甲硫胺酸。 於表11中表示人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈中之架構區3(序列編號83)與人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈中的架構區3(序列編號68)之胺基酸序列之比對。於該比對中，將自N末端側起第17位之胺基酸自色胺酸置換為白胺酸。 [表10] [表11] [實施例17]人源化抗hTfR抗體編號3N表現用細胞之構建 人工合成包含編碼包含序列編號70所示之胺基酸序列之抗體之重鏈之基因的DNA片段(序列編號71)。於該DNA片段之5'側自5'端開始依序導入MluI序列與編碼前導肽之序列，於3'側導入NotI序列。利用實施例11所記載之方法將以上述方式合成之DNA組入至pE-neo載體中，將所獲得之載體設為人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈表現用載體之pE-neo(HC3)N。使用該pE-neo(HC3)N與實施例11中所構建之輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3)，利用實施例12所記載之方法使CHO細胞轉形，而獲得人源化抗hTfR抗體編號3N表現株。 [實施例18]人源化抗hTfR抗體編號3N之純化 使用實施例17中所獲得之人源化抗hTfR抗體編號3N表現株，利用實施例13所記載之方法而獲得人源化抗hTfR抗體編號3N之純化品。再者，人源化抗hTfR抗體編號3N係於人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之胺基酸序列中置換了表10及表11所示之2個胺基酸而成者。另一方面，人源化抗hTfR抗體編號3N與人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈之胺基酸序列係同源。 [實施例19]人源化抗hTfR抗體編號3與人源化抗hTfR抗體編號3N之對於人類TfR及猴TfR之親和性的比較 利用實施例7所記載之方法，測定實施例13中所獲得之人源化抗hTfR抗體編號3與實施例17中所獲得之人源化抗hTfR抗體編號3N之對於人類TfR及人類TfR的親和性。於表12中表示各抗體之對於人類TfR之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)之測定結果、及解離常數(KD )。再者，表示人源化抗hTfR抗體編號3之對於人類TfR之親和性之測定值係與表6所示者不同，但為實驗誤差。 [表12] 利用實施例7所記載之方法，測定實施例13中所獲得之人源化抗hTfR抗體編號3與實施例17中所獲得之人源化抗hTfR抗體編號3N之對於人類TfR及猴TfR之親和性。於表13中表示各抗體之對於猴TfR之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)之測定結果、及解離常數(KD )。再者，表示人源化抗hTfR抗體編號3之對於猴TfR之親和性之測定值係與表7所示者不同，但為實驗誤差。 [表13] 若將人源化抗hTfR抗體編號3N及人源化抗hTfR抗體編號3之與猴TfR之KD 值進行比較，則前者為5.07×10-11 M，後者為1.32×10-9 M，人源化抗hTfR抗體編號3N之與猴TfR之KD 值與人源化抗hTfR抗體編號3之與猴TfR之KD 值進行比較，為約30分之1。另一方面，若將人源化抗hTfR抗體編號3N及人源化抗hTfR抗體編號3之與人類TfR之KD 值進行比較，則均未達1×10-12 M，所有抗體均對於人類TfR具有較高之親和性。又，所有抗體相較於對於猴TfR之親和性，對於人類TfR具有較高之親和性。 作為將人源化抗hTfR抗體作為藥劑進行開發時實施之非臨床試驗的一環，大多情況下實施使用猴之藥理試驗。此處，使用猴之藥理試驗之結果係用以判斷實施使用人類之臨床試驗之妥當性，因此於猴體內之行為較佳為與投予至人類時之行為更為近似者。如上述結果所示，人源化抗hTfR抗體編號3N由於對於猴TfR之親和性顯示出人源化抗hTfR抗體編號3之約30倍之高值，故而人源化抗hTfR抗體編號3N之於猴體內之行為可謂與投予至人類時之行為更為近似。因此，藉由使用人源化抗hTfR抗體編號3N，而於使用猴之試驗中可獲得更為反映出投予至人類時之行為之結果。因此，藉由使用猴之試驗，而作為實施使用人類之臨床試驗時之判斷材料可獲得更有益之結果。 [實施例20]人源化抗hTfR抗體編號3與人源化抗hTfR抗體編號3N向使用猴之腦組織之轉移性的比較 將實施例13中所獲得之人源化抗hTfR抗體編號3與實施例17中所獲得之人源化抗hTfR抗體編號3N分別以5.0 mg/kg之用量分別單次靜脈內投予至雄性食蟹猴，於投予8小時後實施全身灌注。灌注後，摘取包含髓質之腦組織及脊髓組織。關於腦組織，於摘取後分為大腦皮質、小腦、海馬區及髓質。 各組織所包含之人源化抗hTfR抗體之濃度測定係依據實施例15所記載之測定法進行。 將腦組織中之抗hTfR抗體之濃度測定之結果示於表14中。若將人源化抗hTfR抗體編號3N與人源化抗hTfR抗體編號3之於大腦、小腦、海馬區中之濃度進行比較，則人源化抗hTfR抗體編號3N之濃度顯示出較人源化抗hTfR抗體編號3高之值，即於大腦中為約1.42倍，於小腦中為約1.56倍，於海馬區中為約1.29倍。於髓質中兩者之濃度大致同等。於頸脊髓中人源化抗hTfR抗體編號3N之濃度亦顯示出較人源化抗hTfR抗體編號3高之值，即為約1.47倍。該等結果顯示，人源化抗hTfR抗體編號3N具有與人源化抗hTfR抗體編號3相比，更高效率地通過血腦障壁而於大腦、小腦、海馬區等腦組織中儲積之性質。即，顯示人源化抗hTfR抗體編號3N具有如下性質：可藉由使應於腦組織內發揮功能之藥劑與該等抗體結合而使該藥劑高效率地於腦組織中儲積。 [表14] [實施例20-2]hFc-人源化抗hTfR抗體表現用細胞之製作 人工合成包含編碼導入有包含序列編號81所示之胺基酸序列之人類IgG Fc區域之人源化抗hTfR抗體3N的Fab重鏈之胺基酸序列之基因之DNA片段(序列編號82)。於該DNA片段之5'側自5'端依序導入MluI序列與編碼前導肽之序列，於3'側導入NotI序列。利用實施例11所記載之方法將以上述方式合成之DNA組入至pE-neo載體中，將所獲得之載體設為pE-neo(Fc-Fab HC(3N))。使用該pE-neo(Fc-Fab HC(3N))與實施例11中所構建之輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3)，利用實施例12所記載之方法使CHO細胞轉形，而獲得Fc-Fab(3N)表現株。 [實施例20-3]hFc-人源化抗hTfR抗體之製作 使用Fc-Fab(3N)表現株，利用實施例13所記載之方法獲得Fc-Fab(3N)之純化品。 [實施例20-4]hFc-人源化抗hTfR抗體之對於人類TfR及猴TfR之親和性之比較 利用實施例7所記載之方法，測定實施例20-3中所獲得之Fc-Fab(3N)之純化品之對於人類TfR及猴TfR的親和性。將結果示於表14-2中。該結果顯示，Fc-Fab(3N)具有如下性質，即可藉由使應於腦組織內發揮功能之藥劑與該等抗體結合而使該藥劑高效率地於腦組織中儲積。 [表14-2] [實施例20-5]hFc-人源化抗hTfR抗體之向使用猴之腦組織之轉移性之測定 將實施例20-3中所獲得之Fc-Fab(3N)以5.0 mg/kg之用量單次靜脈內投予至雄性食蟹猴，於投予8小時後實施全身灌注。灌注後，摘取包含髓質之腦組織及脊髓組織。關於腦組織，於摘取後分為大腦皮質、小腦、海馬區及髓質。 各組織所包含之人源化抗hTfR抗體之濃度測定係依據實施例15所記載之測定法進行。 將腦組織中之抗hTfR抗體之濃度測定之結果示於表14-3。Fc-Fab(3N)之於大腦、小腦、海馬區中之濃度分別為0.80 μg/g濕重量、0.80 μg/g濕重量、及1.05 μg/g。又，於髓質及頸部脊髓中之濃度分別為0.67 μg/g濕重量及0.68 μg/g濕重量。該等結果顯示，即便於作為Fab之人源化抗hTfR抗體之N末端側結合有Fc區域之情形時，抗hTfR抗體亦可通過BBB。因此，於Fab結合BDNF而成之結合體於投予至生物體內時不穩定之情形時，藉由於Fab之N末端側結合Fc區域，可一邊維持通過BBB之特性，一邊使該結合體於生物體內穩定、例如增加該結合體之血中半衰期。 [表14-3] [實施例21]hBDNF-人源化抗hTfR抗體融合蛋白質(hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質)表現用細胞之製作 (1)人工合成包含編碼如下融合蛋白質之基因之具有序列編號62所示之鹼基序列的DNA片段，該融合蛋白質係於具有序列編號56所示之胺基酸序列之hBDNF之前體的C末端側，經由包含序列編號3所示之胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反覆5次之共計25個胺基酸之連接子序列，而融合具有序列編號61所示之胺基酸序列之人源化抗hTfR抗體3NFab重鏈所得。此處，序列編號61所示之胺基酸序列係相當於序列編號70所示之人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈之胺基酸序列的自N末端側至第1～226位。此處，自N末端側至第1～118位之胺基酸序列相當於序列編號69(人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈之可變區之胺基酸序列)，第119～216位之胺基酸序列相當於CH 1區域，第217～226位之胺基酸序列相當於鉸鏈部。 該DNA片段編碼具有序列編號63所示之胺基酸序列之hBDNF之前體與人源化抗hTfR抗體3NFab重鏈的融合蛋白質。具有序列編號63所示之胺基酸序列之融合蛋白質係於表現後經加工，而成為具有序列編號65所示之胺基酸序列之hBDNF與人源化抗hTfR抗體Fab重鏈之融合蛋白質。於序列編號63所示之胺基酸序列中，自N末端側至第1～110位之胺基酸序列係將hBDNF自前體向成熟型加工時被去除之部分。利用MluI與NotI消化該DNA片段，組入至pE-neo載體之MluI與NotI之間，而構建pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))。 (2)又，人工合成包含編碼如下融合蛋白質之基因之具有序列編號73所示之鹼基序列的DNA片段，該融合蛋白質係於具有序列編號56所示之胺基酸序列之hBDNF之前體的C末端側，經由包含序列編號3所示之胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反覆5次之共計25個胺基酸之連接子序列，自N末端側向C末端側依序融合序列編號75之Fc區域之序列、包含序列編號3所示之胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反覆5次之共計25個胺基酸之連接子序列、及具有序列編號61所示之胺基酸序列之人源化抗hTfR抗體3NFab重鏈所得。 該DNA片段編碼序列編號74所示之融合蛋白質。具有序列編號74所示之胺基酸序列之融合蛋白質係於表現後經加工，而hBDNF之前體部分成為hBDNF。於序列編號74所示之胺基酸序列中，自N末端側至第1～110位之胺基酸序列係將hBDNF自前體向成熟型加工時被去除之部分。利用MluI與NotI消化該DNA片段，組入至pE-neo載體之MluI與NotI之間，而構建pE-neo(BDNF-Fc-Fab HC(3N))。 藉由pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))與實施例11中所構建之pE-hygr(LC3)將CHO細胞(CHO-K1：自美國菌種中心(American Type Culture Collection)獲取)轉形，而獲得表現hBDNF與人源化抗hTfR抗體3N之融合蛋白質之細胞株。將該細胞株設為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1表現株。將該細胞株所表現之hBDNF與人源化抗hTfR抗體之融合蛋白質設為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1。又，藉由pE-neo(BDNF-Fc-Fab HC(3N))與實施例11中所構建之pE-hygr(LC3)將CHO細胞轉形，而獲得另外之表現hBDNF與人源化抗hTfR抗體3N之融合蛋白質之細胞株。將該細胞株設為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)2表現株。將該細胞株所表現之hBDNF與人源化抗hTfR抗體之融合蛋白質設為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)2。 [實施例21-2]白蛋白結合區域(ABD)附加型hBDNF-人源化抗hTfR抗體融合蛋白質之表現用細胞之製作 人工合成包含編碼如下融合蛋白質之基因之具有序列編號86所示之鹼基序列的DNA片段，該融合蛋白質係於具有序列編號56所示之胺基酸序列之hBDNF之前體的C末端側，經由包含序列編號3所示之胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反覆5次之共計25個胺基酸之連接子序列，融合具有與序列編號61所示之胺基酸序列之第1位至第216位對應之胺基酸序列(序列編號84)的人源化抗hTfR抗體3NFab重鏈，進而於其C末端側，經由包含序列編號3所示之胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反覆3次之共計15個胺基酸之連接子序列，融合序列編號85所示之ABD所得。此處，序列編號84所示之胺基酸序列係相當於序列編號70所示之人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈之胺基酸序列的自N末端側至第1～216位。此處，自N末端側至第1～118位之胺基酸序列相當於序列編號69(人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈之可變區之胺基酸序列)，第119～216位之胺基酸序列相當於CH 1區域。 該DNA片段編碼具有序列編號87所示之胺基酸序列之於hBDNF之前體與人源化抗hTfR抗體3NFab重鏈的融合蛋白質之C末端側附加有ABD的融合蛋白質。具有序列編號87所示之胺基酸序列之融合蛋白質係於表現後經加工，而成為於具有序列編號88所示之胺基酸序列之hBDNF與人源化抗hTfR抗體Fab重鏈之融合蛋白質的C末端側附加有ABD的融合蛋白質。於序列編號87所示之胺基酸序列中，自N末端側至第1～110位之胺基酸序列係將hBDNF自前體向成熟型加工時被去除之部分。利用MluI與NotI消化該DNA片段，組入至pE-neo載體之MluI與NotI之間，而構建pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))ABD。 藉由pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))ABD與實施例11中所構建之pE-hygr(LC3)將CHO細胞(CHO-K1：自美國菌種中心(American Type Culture Collection)獲取)轉形，而獲得表現於hBDNF與人源化抗hTfR抗體3N之融合蛋白質之C末端側附加有ABD之融合蛋白質的細胞株。將該細胞株設為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD表現株。將該細胞株所表現之於hBDNF與人源化抗hTfR抗體之融合蛋白質之C末端側附加有ABD之融合蛋白質設為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD。 [實施例22]hBDNF-人源化抗hTfR抗體融合蛋白質之製造 hBDNF-人源化抗hTfR抗體融合蛋白質係藉由以下之方法製造。將實施例21中所獲得之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1表現株以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式利用CD OptiCHOTM 培養基進行稀釋，於1 L之三角燒瓶中添加200 mL之細胞懸浮液，於37℃下且於包含5%CO2 與95%空氣之濕潤環境下以約70 rpm之攪拌速度培養6～7天。藉由離心操作而回收培養上清液，利用0.22 μm過濾器(Millipore公司)進行過濾，而製成培養上清液。於上述所回收之培養上清液中，添加管柱體積5倍體積之包含150 mL NaCl之20 mM三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值8.0)，注入預先經管柱體積3倍體積之包含150 mM NaCl之20 mM三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值8.0)平衡化之蛋白L管柱(管柱體積：1 mL，GE healthcare公司)中。繼而，供給管柱體積之5倍體積之上述緩衝液而將管柱洗淨後，利用包含150 mM NaCl之管柱體積之4倍體積之50 mM甘胺酸緩衝液(pH值2.8)使所吸附之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1溶出。於溶出後立即使用1 M三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值8.0)而將pH值調整至7.0。將其作為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之純化品而用於以下之試驗。 關於hBDNF-抗hTfR抗體(3N)2，可利用與hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1相同之方法而獲得純化品。 [實施例22-2]hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之製造 hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質係藉由以下之方法製造。將實施例21-2中所獲得之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD表現株以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式利用CD OptiCHOTM 培養基進行稀釋，於1 L之三角燒瓶中添加200 mL之細胞懸浮液，於37℃下且於包含5%CO2 與95%空氣之濕潤環境下以約70 rpm之攪拌速度培養6～7天。藉由離心操作而回收培養上清液，利用0.22 μm過濾器(Millipore公司)進行過濾，而製成培養上清液。 將所回收之培養上清液注入經管柱體積5倍體積之包含50 mM之NaCl之10 mM HEPES緩衝液(pH值7.0)平衡化的HR-S管柱(管柱體積：5mL，Bio Rad公司)中。繼而，供給管柱體積5倍體積之上述緩衝液而將管柱洗淨後，利用管柱體積15倍體積之包含1 M之NaCl之10 mM HEPES緩衝液(pH值8.2)使所吸附之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD溶出，回收包含hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之組分。將該步驟實施4次。 對上述溶出份添加4倍體積之10 mM HEPES緩衝液(pH值7.0)而進行稀釋。將該經稀釋之溶出份注入經管柱體積5倍體積之包含50 mM之NaCl之10 mM HEPES緩衝液(pH值7.0)平衡化的Nuvia cPrime管柱(管柱體積：5 mL，Bio Rad公司)中。供給管柱體積25倍體積之包含1 M NaCl之10 mM HEPES緩衝液(pH值8.2)而將管柱洗淨後，利用15倍體積之包含2 M之NaCl、0.4 M精胺酸之10 mM HEPES緩衝液(pH值8.5)使所吸附的hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD溶出，回收包含hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD的組分。將以上述方式回收者作為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之純化品而用於以下的實驗。 [實施例23]使用BDNF受體(TrkB)表現細胞之hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質之BDNF活性的評價 實施例16、實施例22及實施例22-2中所製造之hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質所具有的BDNF生物活性係，以將TrkB基因導入至源自中國倉鼠卵巢之細胞(CHO細胞)中所獲得之CHO-TrkB細胞中之Ca濃度變化設為指標的細胞內訊號傳遞增強活性的測定進行評價。 將CHO細胞於繼代用培養基(Nutrient Mixture F-12 Ham，10%胎牛血清)中進行培養。其後，更換為評價用培養基(Nutrient Mixture F-12 Ham，3%胎牛血清，10 mM Hepes(pH值7.4))，而製作細胞懸浮液。於細胞中導入表現水母發光蛋白及人類TrkB(GenBank Acc. No. NP_001018074.1)之病毒，以成為2×103 細胞/孔之方式接種至黑色384細胞培養用底部透明培養盤(bottom clear plate)中後，於CO2 培養箱(37℃、95%Air、5%CO2 )內靜置培養一夜。 將包含1 μM之Viviren(Promega)之HHBS液(1×Hanks' Balanced Salt Solution，20 mM HEPES(pH值7.4))以20 μL/well進行添加，於室溫下靜置4小時。利用包含0.1%之牛血清血蛋白之HHBS液，將BDNF及hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質(hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1及2、以及hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD)分別稀釋為目標濃度，添加後，利用FDSS7000(浜松光子)經時性地測定發光強度。將111 ng/mL之BDNF(＃450-02，Peprotech公司)所顯示之發光強度設為100%，自所獲得之發光強度計算相對之TrkB促效活性，自其用量反應曲線算出EC50而設為BDNF活性。於表15中表示hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質之評價結果。 [表15] [實施例24]使用大鼠初代培養神經細胞之hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質之TrkB受體訊號增強作用的評價 藉由以大鼠初代培養神經細胞中之Erk之磷酸化作用作為指標的細胞內訊號傳遞增強活性之測定，而評價實施例22及實施例22-2中所製造的hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質所具有之BDNF生物活性。初代培養神經細胞係自小鼠或大鼠胎兒之腦之各部位、例如紋狀體、皮質、或者海馬區等進行製備，或者購入所銷售之初代培養神經細胞而使用，但本次係自大鼠胎兒之紋狀體製備。 自胎生15-19天之新生大鼠腦採取紋狀體，浸漬於冰浴冷卻cHBSS液(1 mM丙酮酸、0.5% D(+)葡萄糖及10mM HEPES含有Hanks'平衡鹽溶液)中。將cHBSS液去除，添加包含0.1 mg/mL DNase I、5 mM MgCl2 及0.3 mg/mL木瓜酶之cHBSS液(酶反應液)而於37℃下培養1-5分鐘。將酶反應液去除，添加冰浴冷卻含10%FBS之NGPS液(包含0.5mM L-麩胺酸及青黴素・鏈黴素液(DS Pharma Biomedical)之培養基)，使酶反應終止。將含10%FBS之NGPS液去除，利用冰浴冷卻cHBSS液洗淨3次。繼而於冰浴冷卻cHBSS液中使神經細胞分散，添加至70 μm Streiner(Falcon 2350)中，進而追加cHBSS液而進行過濾。將過濾液進行離心(1000 rpm、4分鐘、室溫)而收集沈渣，使之於cHBSS液中再次懸浮，計數懸浮液中之細胞數。以成為1×106 細胞/mL之方式利用包含B-27TM (Serum-Free Supplement(50X)，Invitrogen)之NGPS液進行稀釋，接種至聚D-離胺酸培養盤後，於CO2 培養箱(37℃、95%Air、5%CO2 )內靜置培養1週。 自各孔去除培養液，利用NGPS液將細胞洗淨後，添加NGPS液而於CO2 培養箱(37℃、95%Air、5%CO2 )內靜置2小時。利用NGPS液將BDNF及hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質分別稀釋為目標濃度，添加後，於CO2 培養箱(37℃、95%Air、5%CO2 )內靜置30分鐘。反應後，將培養盤置於冰上，利用冰浴冷卻磷酸鹽緩衝鹽水洗淨。洗淨後，添加包含Halt蛋白酶與磷酸酶抑制劑混合液(Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail)(Thermo Fisher Scientific)之RIPA緩衝液(Pierce)，於冰上靜置10分鐘。使用細胞刮刀(Cell Scraper)刮取細胞，回收至管中，利用漩渦攪拌器攪拌後，於冰上靜置10分鐘。進行離心(13,500 rpm、10分鐘、4℃)而採取上清液，於-80℃下冷凍保存直至Erk磷酸化檢定(使用一部分進行蛋白質定量)。 蛋白質定量係使用Pierce BCA 蛋白質定量檢測套組(Thermo Fisher Scientific)進行。將上述採取樣品以蛋白質濃度成為檢測範圍內之方式利用蒸餾水進行稀釋，以10 μL/每孔之方式分注至96孔培養盤中。又，將蛋白質檢測溶液(Protein assay solution)(Reagent A：Reagent B＝50：1混合液)以200 μL/每孔之方式進行添加。於37℃下培養30分鐘後，使用讀盤儀測定吸光度(562 nm)，自由同時測定所獲得之牛血清白蛋白標準溶液之吸光度製作之校準曲線算出蛋白濃度。 Erk磷酸化檢定係使用Erk 1/2 ELISA Kit Simple Step(pT202/Y204＋Total)(Abcam)進行。利用包含Halt蛋白酶與磷酸酶抑制劑混合液(Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail)(Thermo)之RIPA緩衝液(Pierce)將上述採取樣品以成為0.5 mg/mL之方式進行稀釋，並以50 μL/每孔之方式分注至檢定套組所自帶之Simple Step Pre-Coated 96孔培養盤中。將抗體混合液(Antibody Cocktail)以50 μL/每孔之方式進行添加，一面進行攪拌一面於室溫下培養1小時。利用洗滌緩衝液(Wash Buffer)(350 μL/well)將孔內洗淨後，將TMB底物顯色劑以100 μL/每孔之方式進行添加，一面攪拌一面於室溫遮光下培養15分鐘。將Stop Solution(100 μL/well)以100 μL/每孔之方式進行添加而使反應終止，使用讀盤儀對吸光度進行測定(450 nm)。評價相對於藉由溶劑處理確認之磷酸化Erk量，基於BDNF或hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質之磷酸化Erk量之相對增加量，藉此評價hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質所具有之BDNF生物活性。於表15-2中表示Erk磷酸化活性之評價結果。 [表15-2] [實施例25]hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之對於人類TfR及猴TfR之親和性之測定 測定實施例22中所製造之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之對於人類TfR及猴TfR之親和性。測定係大致藉由下述方法進行。 利用HBS-P+(1%BSA)(150 mM NaCl、50 μM EDTA、0.05% Surfactant P20及包含1%BSA之10 mM HEPES)稀釋經生物素標記之兔抗人類BDNF多株抗體(抗人類BDNF抗體：PeproTech公司)，而製備15 μg/mL之溶液，將該溶液設為配體溶液1。利用HBS-P+(1%BSA)稀釋抗hTfR抗體融合BDNF(hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1)之純化品，將該溶液設為配體溶液2。又，作為對照物質，製備實施例15-3中所獲得之hBDNF-抗hTfR抗體(3)1之純化品經HBS-P+(1%BSA)稀釋所獲得之配體溶液3。利用HBS-P+(1%BSA)將r人類TfR與r猴TfR分別進行2階段稀釋，而製備0.78125～50 nM(0.585～3.74 μg/mL)之7階段濃度之溶液。將該TfR溶液設為樣品溶液。 將上述進行2階段稀釋而製備之樣品溶液以200 μL/每孔之方式添加至96孔培養盤(黑色)(greiner bioone公司)中。又，將上述所製備之配體溶液1、配體溶液2及配體溶液3分別以200 μL/每孔之方式添加至特定孔中。將HBS-P+(1%BSA)以200 μL/每孔之方式添加至基線、解離用及洗淨用之孔中。將該培養盤與生物感測器(Biosensor/SA：ForteBio公司，a division of Pall Corporation)設置在OctetRED96之特定位置上。 使OctetRED96於下述表15-3所示之條件下作動而將抗人類BDNF抗體固相至感測器。繼而，使OctetRED96於下述表15-4所示之條件下作動而取得資料後，使用OctetRED96所自帶之分析軟體，將結合反應曲線擬合為1：1結合模型或2：1結合模型，測定抗hTfR抗體融合BDNF對於r人類TfR及r猴TfR之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)，算出解離常數(KD )。再者，測定係於25～30℃之溫度下實施。 [表15-3] [表15-4] 表15-4 動力學分析時之OctetRED96之作動條件 於表16中表示hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之對於人類TfR及猴TfR之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)之測定結果、及解離常數(KD )。hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之與人類TfR之解離常數為7.42×10-12 M，與猴TfR之解離常數為7.94×10-10 M。該等結果顯示，hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1為對於人類TfR及猴TfR具有較高之親和性者。又，hBDNF-抗hTfR抗體(3)1之對於人類TfR及猴TfR之解離常數分別為2.51×10-10 M與3.94×10-8 M。即，可理解hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1與hBDNF-抗hTfR抗體(3)1相比，對於人類TfR及猴TfR具有極高之親和性。 [表16] [實施例25-2]hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之對於人類TfR、猴TfR及HAS之親和性之測定 hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD對於人類TfR、猴TfR及人類血清白蛋白(HSA)之親和性之測定係與實施例25同樣地，應用使用生物膜層干涉法(BioLayer Interferometry：BLI)之生物體分子相互作用分析系統即OctetRED96(ForteBio公司，a division of Pall Corporation)而實施。測定係大致依據OctetRED96所隨附之操作指南實施。於以下進行詳述。 利用HBS-P+(1%BSA)(150 mM NaCl、50 μM EDTA、0.05% Surfactant P20及包含1%BSA之10 mM HEPES)稀釋經生物素標記之兔抗人類BDNF多株抗體(抗人類BDNF抗體：PeproTech公司)，而製備25 μg/mL之溶液，將該溶液設為配體溶液1。利用HBS-P+稀釋hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之純化品，將該溶液設為配體溶液2。利用HBS-P+分別對r人類TfR與r猴TfR進行2階段稀釋，而製備0.78125～50 nM(0.0585～3.74 μg/mL)之7階段濃度之溶液。將該TfR溶液設為TfR樣品溶液。再者，r人類TfR與r猴TfR係使用實施例7所記載者。又，利用HBS-P+對HSA(人血清白蛋白製劑(KENKETU ALBUMIN25-NICHIYAKU，日本製藥股份有限公司)進行2階段稀釋，而製備3.13～200 nM(0.208～13.3 μg/mL)之7階段濃度之溶液。將該HSA溶液設為HSA樣品溶液。 將上述進行2階段稀釋而製備之TfR樣品溶液及HSA樣品溶液分別以200 μL/每孔之方式添加至96孔培養盤(黑色)(greiner bio-one公司)中。又，將上述製備之配體溶液1及配體溶液2分別以200 μL/每孔之方式添加至特定孔中。將HBS-P+以200 μL/每孔之方式添加至基線、解離用及洗淨用之孔中。將該培養盤、與生物感測器(Biosensor/SA：ForteBio公司，a division of Pall Corporation)設置在OctetRED96之特定位置。 使OctetRED96於實施例25所記載之表15-3所示之條件下作動而將抗人類BDNF抗體固相至感測器。繼而，使OctetRED96於表16-2所示之條件下作動而取得資料後，使用OctetRED96自帶之分析軟體，將結合反應曲線擬合為1：1結合模型，測定hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD對於r人類TfR、r猴TfR及HAS之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)，算出解離常數(KD )。再者，測定係於25～30℃之溫度下實施。 [表16-2] 表16-2 動力學分析時之OctetRED96之作動條件 表16-3中表示hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之對於人類TfR、猴TfR及HAS之締合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)之測定結果、及解離常數(KD )。 [表16-3] hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之與人類TfR及猴TfR之解離常數分別為5.66×10-11 M及6.26×10-10 M。該等結果顯示，即便於hBDNF與抗hTfR抗體之融合蛋白質之C末端側附加ABD，該融合蛋白質之對於人類TfR及猴TfR之高親和性亦得到維持。又，hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之與HAS之解離常數為1.35×10-8 M。該等結果顯示，hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD對於TfR(人類及猴)及ABD均具有高親和性。即，顯示將hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD投予至人類之血中時，如下情況均會達成，即經由ABD而與存在於血中之白蛋白結合，藉此血中半衰期上升；及經由TfR而通過BBB。進而顯示，藉由與白蛋白結合，亦可使hBDNF-抗hTfR抗體(3N)之免疫原性降低。 [實施例26]hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之使用小鼠之腦轉移評價 關於hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1，使用將編碼小鼠運鐵蛋白受體之細胞外區域之基因置換為編碼人類運鐵蛋白受體基因之細胞外區域的基因所獲得之hTfR基因敲入小鼠(hTfR-KI小鼠)，對hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1通過BBB而轉移至腦內之情況進行評價。hTfR-KI小鼠係大致藉由下述方法進行製作。又，作為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1，使用實施例22所記載之純化品。 化學合成於編碼細胞內區域為小鼠hTfR之胺基酸序列且細胞外區域為人類hTfR之胺基酸序列之嵌合hTfR之cDNA之3'側配置有由loxP序列夾住之新黴素耐性基因之具有序列編號45所示之鹼基序列的DNA片段。藉由常規方法，將該DNA片段組入至具有序列編號46所示之鹼基序列作為5'連接臂序列且具有序列編號47所示之鹼基序列作為3'連接臂序列的打靶載體(targeting vector)中，藉由電穿孔法將其導入至小鼠ES細胞中。將基因導入後之小鼠ES細胞於新黴素存在下進行選擇培養，選擇出藉由同源重組將打靶載體組入至染色體中而成之小鼠ES細胞。將所獲得之基因重組小鼠ES細胞注入至ICR小鼠之8細胞期胚胎(宿主胚胎)，移植至藉由與進行過輸精管結紮之小鼠交配而獲得之假妊娠小鼠(受體小鼠)中。對於所獲得之產子(嵌合小鼠)進行毛色判定，篩選出ES細胞以高效率有助於生物體之形成之個體，即白色毛占整體毛之比率較高之個體。使該嵌合小鼠個體與ICR小鼠交配而獲得F1小鼠。篩選白色之F1小鼠，對自尾巴之組織提取之DNA進行分析，將染色體上小鼠運鐵蛋白受體基因被置換為嵌合hTfR之小鼠設為hTfR-KI小鼠。 將hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1溶液以所投予之用量成為5 mg/kg之方式於各時點靜脈內投予至3隻hTfR-KI小鼠(雄性、21～28週齡)。於靜脈內投予後，在投予後0.17、1、3、8、24、48小時後採取末梢血，於採取後利用生理鹽水進行全身灌注，採取腦(包含大腦與小腦之部分)。測定所摘取之腦之重量(濕重量)後，添加包含蛋白酶抑制劑混合液(Protease Inhibitor Cocktail)之RIPA緩衝液(Nacalai Tesque)而將腦組織勻漿化。將勻漿進行離心而回收上清液，利用以下之方法測定上清液中所包含之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之量。 首先，於標準培養盤(Standard Plate)(Meso Scale Diagnostics公司)之各孔中各添加25 μL之兔抗人類IgG H＆L pre-adsorbed(Abcam公司)，靜置1小時而固定在培養盤。繼而，於各孔中各添加150 μL之SuperBlock(PBS)阻斷緩衝液，進行1小時振盪而將培養盤阻斷。繼而，利用含有Tween 20之三羥甲基胺基甲烷緩衝鹽水(Tris Buffered Saline with Tween 20)將各孔洗淨，於各孔中各添加50 μL之腦組織之勻漿之上清液，進行1小時振盪。繼而，於各孔中各添加50 μL之經Sulfo-tag標記之Anti-BDNF抗體[35928.11](ab10505)(Abcam公司)，進行1小時振盪。繼而，於各孔中各添加150 μL之Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，利用SectorTM Imager 6000 reader測定來自各孔之發光量。根據濃度已知之標準試樣之測定值製作校準曲線，於其中插補各檢體之測定值，藉此算出腦之每克重(濕重量)所包含之融合蛋白質之量。 將腦組織中之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之濃度測定之結果示於圖9。再者，hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1係形成二聚物而於生物體內發揮其功能，因此於圖9中，將換算為二聚物所獲得之值設為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之濃度(莫耳濃度)。以下，關於圖10、表17、及表18所示之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之濃度亦相同。hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1即便於投予後經過24小時，腦內濃度亦顯示出5.7 nM之高值。又，腦內濃度之半衰期為29小時。本結果顯示，hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1具有通過血腦障壁而於腦組織中儲積之性質，可藉由使應於腦組織內發揮功能之藥劑即BDNF與抗hTfR抗體(3N)1或其抗原結合性片段(抗體片段)結合，而使該藥劑高效率地於腦組織中儲積。 繼而，將hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之血中動態之測定結果示於表17。顯示hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1即便於投予後經過1小時，血中濃度亦顯示15 nM之高值，且於血中穩定(表17)。又，血中濃度之半衰期為0.4小時。該結果顯示，腦內濃度之半衰期明顯長於血中濃度之半衰期。又，關於Fc-Fab(3N)，亦藉由相同之試驗測定hTfR-KI小鼠中之血中動態，血中濃度之半衰期為5.3小時。該結果顯示，藉由導入人類IgG Fc區域而血中濃度之半衰期可明顯延長。 [表17] [實施例27]hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之使用食蟹猴之腦轉移評價 將hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1以5.0 mg/kg之用量分別單次靜脈內投予至雄性食蟹猴，於投予後0.083、0.5、1、3、24、72小時後採取末梢血，於採取後利用生理鹽水實施腦灌注。灌注後，摘取腦組織。 使用該腦組織，進行以下之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之濃度測定及免疫組織化學染色。又，作為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1，使用實施例22所記載之純化品。 腦組織中之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之濃度測定係大致藉由以下之程序進行。對於所採取之組織，將腦組織分為大腦皮質、小腦、海馬區及紋狀體等後，分別利用包含蛋白酶抑制劑混合液(Protease Inhibitor Cocktail)(Sigma-Aldrich公司)之RIPA緩衝液(Nacalai Tesque公司)進行勻漿化，並進行離心而回收上清液。將抗人類Kappa輕鏈山羊IgG生物素(股份有限公司免疫生物研究所)、Sulfotag抗BDNF抗體(Abcam公司)及腦組織勻漿添加至利用含有SuperBlock阻斷緩衝液之PBS(SuperBlock blocking buffer in PBS)(Thermo Fisher Scientific公司)實施過阻斷之抗生蛋白鏈菌素培養盤(Meso Scale Diagnostics公司)中，進行1小時靜置而固定在培養盤中。繼而，於各孔中各添加150 μL之Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000 reader(Meso Scale Diagnostics公司)測定來自各孔之發光量。根據濃度已知之標準試樣之測定值製作校準曲線，於其中插補各檢體之測定值，藉此算出各腦組織之每克重(濕重量)所包含之融合蛋白質之量(腦組織中濃度)。 將腦組織中之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之濃度測定之結果示於圖10。本結果顯示，hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1具有通過血腦障壁而於腦組織中儲積之性質，且顯示，可藉由使應於腦組織內發揮功能之藥劑即BDNF與抗hTfR抗體(3N)1或其抗原結合性片段(抗體片段)結合，而使該藥劑高效率地儲積至腦組織中。 繼而，將hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1之血中動態之測定結果示於表18。顯示hBDNF-抗hTfR抗體(3N)1即便於投予後經過1小時，血中濃度亦顯示30 nM之高值，且於血中穩定(表18)。 [表18] 腦組織中之hBDNF-人源化抗hTfR抗體融合蛋白質之免疫組織化學染色可藉由實施例15所記載之方法進行。 [實施例28]hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之使用小鼠之腦轉移評價 關於hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD，使用將編碼小鼠運鐵蛋白受體之細胞外區域之基因置換為編碼人類運鐵蛋白受體基因的細胞外區域之基因所獲得之hTfR基因敲入小鼠(hTfR-KI小鼠)，對hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD通過BBB而轉移至腦內之情況進行評價。hTfR-KI小鼠係大致藉由實施例7-2所記載之方法製作。又，作為hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD，使用實施例22-2所記載之純化品。 將hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD溶液以所投予之用量成為2.15 mg/kg之方式於各時點靜脈內投予至3隻hTfR-KI小鼠(雄性、19～21週齡)中。於靜脈內投予後，在投予後0.167、1、3、8、24、48、72小時後利用生理鹽水進行全身灌注，採取腦(包含大腦與小腦之部分)。測定所摘取之腦之重量(濕重量)後，添加包含蛋白酶抑制劑混合液(Protease Inhibitor Cocktail)之RIPA緩衝液(Nacalai Tesque)而將腦組織勻漿化。將勻漿進行離心而回收上清液，利用以下之方法測定上清液中所包含之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之量。 首先，於標準培養盤(Standard Plate)(Meso Scale Diagnostics公司)之各孔中各添加25 μL之兔抗人類IgG H＆L pre-adsorbed(Abcam公司)，於4℃下靜置一夜而固定在培養盤中。繼而，於各孔中各添加150 μL之SuperBlock(PBS)阻斷緩衝液，進行1小時振盪而將培養盤阻斷。繼而，利用三羥甲基胺基甲烷緩衝鹽水(Tris Buffered Saline with Tween 20)將各孔洗淨，於各孔中各添加50 μL之腦組織之勻漿之上清液，進行1小時振盪。繼而，於各孔中各添加50 μL之經Sulfo-tag標記之抗BDNF抗體[35928.11](ab10505)(Abcam公司)，進行1小時振盪。繼而，於各孔中各添加150 μL之Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，利用SectorTM Imager 6000 reader測定來自各孔之發光量。根據濃度已知之標準試樣之測定值製作校準曲線，於其中插補各檢體之測定值，藉此算出腦之每克重(濕重量)所包含之抗體之量。 將腦組織中之hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之濃度測定之結果示於圖11。hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之腦內濃度於投予8小時後顯示2.98 nM之Cmax ，於投予72小時後為0.7 nM。 本結果顯示，hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD具有通過血腦障壁而於腦組織中儲積之性質，且顯示，可藉由使應於腦組織內發揮功能之藥劑即BDNF與該等抗體結合，而使該藥劑高效率地儲積至腦組織中。 繼而，將hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之血中動態之測定結果示於表19。hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD之血中濃度於投予1小時後顯示179.8 nM，於3小時後亦顯示53.4 nM之高值，且於血中穩定(表19)。該結果顯示，藉由導入白蛋白親和性肽而血中之穩定性提高，且血中半衰期可明顯地延長。 [表19] [實施例29]使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)處理帕金森氏症模型小鼠之利用本發明之融合蛋白質之運動功能改善作用的研究 實施例22中所製造之hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質於活體內(in vivo)之BDNF生物活性例如可使用如以下所記載之方法，藉由經MPTP處理之hTfR-KI小鼠中之帕金森氏症症狀改善效果而進行評價。 (1)帕金森氏症模型小鼠之製作 使用實施例26所記載之hTfR-KI小鼠(均為8-15週齡)。對於檢疫、馴化已完成之小鼠，將生理鹽水或溶解於生理鹽水中之MPTP(25或30 mg/kg)以1天1次之方式進行5天腹腔內投予，或者將20 mg/kg於1天內每隔2小時進行4次腹腔內投予。 於最終投予之3天後，藉由Pole試驗評價動作緩慢症狀，或者藉由旋轉(Rota-rod)試驗評價協調運動能力之降低。 (2)Pole試驗 於垂直豎立之木製棒之上部5 cm附近將MPTP處理小鼠以頭部朝上之方式抓住。測定小鼠抓住棒後向下方改變方向為止之時間(Tturn)、及抓住後降至地面為止之時間(TLA)。此外，觀察小鼠之活動，以下述方式對其症狀進行評分。 0：熟練地使用四肢下降/正常之活動。 1：於棒之上部改變朝向時可見笨拙。 2：未完全跨過棒而採取橫向移動之行動。 3：掉落。 首先進行1次訓練後，每隔5分鐘進行1次，將試驗反覆進行3次。將3次之平均時間用於分群用資料。基於體重與Pole試驗之資料，藉由多變量完全隨機分配，而將MPTP處理小鼠分為3或4個群。 於生理鹽水處理小鼠(溶劑處理群)、MPTP處理小鼠(溶劑處理群、本發明之融合蛋白質處理群)之計4～5個群中，以1週進行1～2次之方式反覆進行4～8週靜脈內投予。於最終投予後1週後再次進行Pole試驗(與上述分群用資料採用時相同之操作說明)，而評價動作緩慢症狀之改善作用。藉由投予至靜脈內之本發明之融合蛋白質轉移至腦內而於腦內發揮BDNF活性，可改善帕金森氏症模型動物中之動作緩慢等運動功能之障礙。 如此，可確認投予至靜脈內之本發明之融合蛋白質轉移至疾病模型動物之腦內而可發揮BDNF活性。 (3)旋轉(Rota-rod)試驗 於Rota-rod裝置(MK-610A，室町機械)之旋轉軸上每1個區帶各載置1隻小鼠，靜置30秒鐘後，使小鼠適應軸以8 rpm旋轉1分鐘，其後，於以3分鐘旋轉數上升至25 rpm之條件下訓練。於訓練之1小時後進行以下之評價試驗。 於本試驗中，使小鼠適應以8 rpm旋轉之軸之運動30秒鐘後，於以5分鐘旋轉數上升至40 rpm之條件下測定小鼠自軸掉落之時間。間隔1小時反覆本試驗3次，將3次之平均時間用於分群用資料。基於體重與Rota-rod試驗之資料，藉由多變量完全隨機分配，而將MPTP處理小鼠分為3或4個群。 於生理鹽水處理小鼠(溶劑處理群)、MPTP處理小鼠(溶劑處理群、本發明之融合蛋白質處理群)之計4～5個群中，以1週進行1～2次之方式反覆進行4～8週靜脈內投予。於最終投予後1週後再次進行Rota-Rod試驗(與上述分群用資料採用時相同之操作說明)，而評價協調運動能力之改善作用。藉由投予至靜脈內之本發明之融合蛋白質轉移至腦內而於腦內發揮BDNF活性，可改善帕金森氏症模型動物中之協調運動能力等運動功能之障礙。 如此，可確認投予至靜脈內之本發明之融合蛋白質轉移至疾病模型動物之腦內而可發揮BDNF活性。 [實施例30]使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)處理帕金森氏症模型猴之利用本發明之融合蛋白質之運動功能改善效果的研究 實施例22中所製造之hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質於活體內(in vivo)之BDNF生物活性例如可使用如以下所記載之方法，藉由經MPTP處理之猴中之帕金森氏症樣症狀改善效果而進行評價。 於MPTP處理前之5天間，對於以正常行動為首進行過評價之雄性恆河獼猴(5～8歲)或食蟹猴(4～8歲)，將MPTP(0.2 mg/kg或其以上，且將2 mg/kg設為上限)於1週間進行最大連續5天且4週以上之靜脈內投予、或者肌肉內投予或皮下投予，確認UPDRS得分之降低或運動量之降低。或者，僅對於頸內動脈之單側，將MPTP(0.2 mg/kg或其以上，且將2 mg/kg設為上限)投予1次，或將投予間隔設為5～10天而投予2次，以UPDRS得分(J Neurosci Methods. 2000; 96: 71-76)、運動量、進而旋轉運動量為指標，而確認帕金森氏症樣症狀，使MPTP處理結束。 確認到於MPTP最終投予後1週以後帕金森氏症樣症狀穩定後，於1週間將hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質(0.03～10 mg/kg)進行1次或2次靜脈內或皮下投予，藉由UPDRS、運動量、或旋轉運動之評價而評價運動功能之改善度。藉由投予至靜脈內或皮下之hBDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質轉移至腦內而於腦內發揮BDNF活性，可改善帕金森氏症模型動物中之運動功能之障礙。 如此，可確認投予至靜脈內之本發明之融合蛋白質轉移至疾病模型動物(猴)之腦內而可發揮BDNF活性。 [產業上之可利用性] 本發明之hBDNF與抗hTfR抗體之融合蛋白質可有效率地通過血腦障壁，因此作為提供使hBDNF於中樞神經系統中發揮作用之改良方法者有用性較高。 [序列表非關鍵文字] 序列編號3：連接子例1之胺基酸序列 序列編號4：連接子例2之胺基酸序列 序列編號5：連接子例3之胺基酸序列 序列編號6：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR1之胺基酸序列1 序列編號7：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR1之胺基酸序列2 序列編號8：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR2之胺基酸序列1 序列編號9：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR2之胺基酸序列2 序列編號10：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR3之胺基酸序列 序列編號11：小鼠抗hTfR抗體編號3之重鏈CDR1之胺基酸序列1 序列編號12：小鼠抗hTfR抗體編號3之重鏈CDR1之胺基酸序列2 序列編號13：小鼠抗hTfR抗體編號3之重鏈CDR2之胺基酸序列1 序列編號14：小鼠抗hTfR抗體編號3之重鏈CDR2之胺基酸序列2 序列編號15：小鼠抗hTfR抗體編號3之重鏈CDR3之胺基酸序列1 序列編號16：小鼠抗hTfR抗體編號3之重鏈CDR3之胺基酸序列2 序列編號17：人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈之可變區之胺基酸序列1 序列編號18：人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈之可變區之胺基酸序列2 序列編號19：人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈之可變區之胺基酸序列3 序列編號20：人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈之可變區之胺基酸序列4 序列編號21：人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈之可變區之胺基酸序列5 序列編號22：人源化抗hTfR抗體編號3之輕鏈之可變區之胺基酸序列6 序列編號23：人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列2作為可變區之輕鏈之胺基酸序列 序列編號24：編碼人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列2作為可變區之輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號25：人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列4作為可變區之輕鏈之胺基酸序列 序列編號26：編碼人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列4作為可變區之輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號27：人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列5作為可變區之輕鏈之胺基酸序列 序列編號28：編碼人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列5作為可變區之輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號29：人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列6作為可變區之輕鏈之胺基酸序列 序列編號30：編碼人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列6作為可變區之輕鏈之胺基酸序列之鹼基序列、合成序列 序列編號31：人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區之胺基酸序列1 序列編號32：人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區之胺基酸序列2 序列編號33：人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區之胺基酸序列3 序列編號34：人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區之胺基酸序列4 序列編號35：人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區之胺基酸序列5 序列編號36：人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區之胺基酸序列6 序列編號37：人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列2作為可變區之重鏈之胺基酸序列 序列編號38：編碼人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列2作為可變區之重鏈之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號39：人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列2作為可變區之重鏈(IgG4)之胺基酸序列 序列編號40：編碼人源化抗hTfR抗體編號3之包含胺基酸序列2作為可變區之重鏈(IgG4)之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號41：引子hTfR5'、合成序列 序列編號42：引子hTfR3'、合成序列 序列編號43：引子Hyg-Sfi5'、合成序列 序列編號44：引子Hyg-BstX3'、合成序列 序列編號45：於編碼嵌合hTfR之cDNA之3'側配置有由loxP序列夾住之新黴素耐性基因之DNA的鹼基序列、合成序列 序列編號46：打靶載體之5'連接臂序列、合成序列 序列編號47：打靶載體之3'連接臂序列、合成序列 序列編號48：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈之可變區之胺基酸序列 序列編號49：小鼠抗hTfR抗體編號3之重鏈之可變區之胺基酸序列 序列編號52：人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈與hBDNF之融合蛋白質(1)之胺基酸序列 序列編號53：編碼人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈與hBDNF之融合蛋白質(1)之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號54：人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈與hBDNF之融合蛋白質(2)之胺基酸序列 序列編號55：編碼人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈與hBDNF之融合蛋白質(2)之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號57：單鏈人源化抗hTfR抗體編號3N之胺基酸序列 序列編號58：編碼hBDNF之前體與單鏈人源化抗hTfR抗體編號3N之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號59：hBDNF之前體與單鏈人源化抗hTfR抗體編號3N之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號60：hBDNF與單鏈人源化抗hTfR抗體編號3N之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號61：人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈之胺基酸序列 序列編號62：編碼hBDNF之前體與人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號63：hBDNF之前體與人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈之融合蛋白質的胺基酸序列 序列編號64：編碼hBDNF與人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號65：hBDNF與人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號66：人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈CDR1之胺基酸序列1 序列編號67：人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈CDR1之胺基酸序列2 序列編號68：人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈架構區3之胺基酸序列 序列編號69：人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈之可變區之胺基酸序列 序列編號70：人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈之胺基酸序列 序列編號71：編碼人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈之胺基酸序列之鹼基序列、合成序列 序列編號72：人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈(IgG4)之胺基酸序列 序列編號73：編碼導入有人類IgG Fc區域之hBDNF之前體與人源化抗hTfR抗體3N之Fab重鏈的融合蛋白質之胺基酸序列之鹼基序列、合成序列 序列編號74：導入有人類IgG Fc區域之hBDNF之前體與人源化抗hTfR抗體3N之Fab重鏈的融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號75：人類IgG之Fc區域之胺基酸序列之一例 序列編號76：編碼人源化抗hTfR抗體編號3N之重鏈(IgG4)之胺基酸序列之鹼基序列、合成序列 序列編號77：人源化抗hTfR抗體3之Fab重鏈之胺基酸序列 序列編號78：編碼hBDNF之前體與人源化抗hTfR抗體編號3之Fab重鏈之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號79：hBDNF之前體與人源化抗hTfR抗體編號3之Fab重鏈之融合蛋白質的胺基酸序列 序列編號80：hBDNF與人源化抗hTfR抗體編號3之Fab重鏈之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號81：導入有人類IgG Fc區域之人源化抗hTfR抗體3N之Fab重鏈之胺基酸序列 序列編號82：編碼導入有人類IgG Fc區域之人源化抗hTfR抗體3N之Fab重鏈之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號83：人源化抗hTfR抗體編號3之重鏈架構區3之胺基酸序列 序列編號84：人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈之胺基酸序列(2) 序列編號85：白蛋白結合區域之胺基酸序列 序列編號86：編碼hBDNF之前體、人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈、及ABD之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列、合成序列 序列編號87：hBDNF之前體、人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈、及ABD之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號88：hBDNF之前體、人源化抗hTfR抗體編號3N之Fab重鏈、及ABD之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號89：導入有白蛋白親和性肽之Fab重鏈之胺基酸序列 序列編號90：單鏈人源化抗hTfR抗體編號3N(2)之胺基酸序列
圖1係表示將抗hTfR抗體單次靜脈內投予後之食蟹猴之大腦皮質之關於抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果之圖式代用照片。(a)係不投予抗hTfR抗體，(b)係投予抗hTfR抗體編號3。各照片之右下之欄係表示50 μm之標準尺寸(gauge)。 圖2係表示將抗hTfR抗體單次靜脈內投予後之食蟹猴之海馬區之關於抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果之圖。(a)係不投予抗hTfR抗體，(b)係投予抗hTfR抗體編號3。各照片之右下之欄係表示50 μm之標準尺寸(gauge)。 圖3係表示將抗hTfR抗體單次靜脈內投予後之食蟹猴之小腦之關於抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果之圖式代用照片。(a)係不投予抗hTfR抗體，(b)係投予抗hTfR抗體編號3。各照片之右下之欄係表示50 μm之標準尺寸(gauge)。 圖4係表示單次靜脈內投予後之人源化抗hTfR抗體對於食蟹猴之腦以外之各種器官的儲積量之圖。縱軸係表示各器官之每單位濕重量之人源化抗hTfR抗體之量(μg/g濕重量)。白欄係自左依序分別投予人源化抗hTfR抗體編號3、人源化抗hTfR抗體編號3-2、人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)、及人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)，黑欄係表示投予了曲妥珠單抗(赫賽汀(Herceptin)TM )之猴之各器官中之儲積量。ND意指未測定。 圖5係表示單次靜脈內投予後之食蟹猴之大腦皮質之關於人源化抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果之圖式代用照片。(a)係投予赫賽汀(Herceptin)，(b)係投予人源化抗hTfR抗體編號3，(c)係投予人源化抗hTfR抗體編號3-2，(d)係投予人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，(e)係投予人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。各照片之右下之欄係表示20 μm之標準尺寸(gauge)。 圖6係表示單次靜脈內投予後之食蟹猴之海馬區之關於人源化抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果之圖。(a)係投予赫賽汀(Herceptin)，(b)係投予人源化抗hTfR抗體編號3，(c)係投予人源化抗hTfR抗體編號3-2，(d)係投予人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，(e)係投予人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。各照片之右下之欄係表示20 μm之標準尺寸(gauge)。 圖7係表示單次靜脈內投予後之食蟹猴之小腦之關於人源化抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果之圖。(a)係投予赫賽汀(Herceptin)，(b)係投予人源化抗hTfR抗體編號3，(c)係投予人源化抗hTfR抗體編號3-2，(d)係投予人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，(e)係投予人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。各照片之右下之欄係表示20 μm之標準尺寸(gauge)。 圖8係表示單次靜脈內投予後之食蟹猴之髓質之關於人源化抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果之圖。(a)係投予赫賽汀(Herceptin)，(b)係投予人源化抗hTfR抗體編號3，(c)係投予人源化抗hTfR抗體編號3-2，(d)係投予人源化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，(e)係投予人源化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。各照片之右下之欄係表示20 μm之標準尺寸(gauge)。 圖9係表示將BDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質單次靜脈內投予後之hTfR-KI小鼠之腦內濃度推移的圖式。橫軸係表示投予後之時間(小時)，縱軸係表示腦之每克重(濕重量)之BDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質之濃度(nM，二聚物換算)。 圖10係表示將BDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質單次靜脈內投予後之投予後3小時中之食蟹猴腦內之各部位中的BDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質之濃度(nM，二聚物換算)之圖式。 圖11係表示將BDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質(hBDNF-抗hTfR抗體(3N)ABD)單次靜脈內投予後之hTfR-KI小鼠之腦內濃度推移之圖式。橫軸係表示投予後之時間(小時)，縱軸係表示腦之每克重(濕重量)之BDNF-抗hTfR抗體融合蛋白質之濃度(nM，二聚物換算)。

Claims (88)

  1. 一種融合蛋白質，其係腦源神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)與抗人類運鐵蛋白受體抗體之融合蛋白質，並且該抗體係於重鏈之可變區中， (a)CDR1為包含序列編號66或序列編號67之胺基酸序列而成， (b)CDR2為包含序列編號13或序列編號14之胺基酸序列而成，且 (c)CDR3為包含序列編號15或序列編號16之胺基酸序列而成者。
  2. 如請求項1之融合蛋白質，其中重鏈之架構區3為包含序列編號68之胺基酸序列而成者。
  3. 如請求項1或2之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中， CDR2為代替序列編號13或序列編號14之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成，且 CDR3為代替序列編號15或序列編號16之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  4. 如請求項1或2之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中， CDR2為代替序列編號13或序列編號14之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成，且 CDR3為代替序列編號15或序列編號16之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  5. 如請求項1或2之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中，代替 (a)關於CDR1之序列編號66或序列編號67、 (b)關於CDR2之序列編號13或序列編號14、 (c)關於CDR3之序列編號15或序列編號16、及 (d)關於架構區3之序列編號68 中之至少1個胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號66或序列編號67之胺基酸序列之自N末端側起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且 關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。
  6. 如請求項1或2之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中，代替 (a)關於CDR1之序列編號66或序列編號67、 (b)關於CDR2之序列編號13或序列編號14、 (c)關於CDR3之序列編號15或序列編號16、及 (d)關於架構區3之序列編號68 中之至少1個胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號66或序列編號67之胺基酸序列之自N末端側起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。
  7. 如請求項1之融合蛋白質，其係如請求項2之融合蛋白質，其中該重鏈之可變區為包含序列編號69之胺基酸序列而成者。
  8. 如請求項7之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中CDR1之序列編號66或序列編號67及架構區3之序列編號68之各胺基酸序列以外之部分，代替該部分而包含與該部分具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  9. 如請求項7之融合蛋白質，其係於該重鏈之可變區中CDR1之序列編號66或序列編號67及架構區3之序列編號68之各胺基酸序列以外之部分，代替該部分而包含與該部分具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  10. 如請求項7之融合蛋白質，其係代替構成該重鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號67之胺基酸序列之自N末端起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。
  11. 如請求項7之融合蛋白質，其係代替構成該重鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號67之胺基酸序列之自N末端起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。
  12. 如請求項7之融合蛋白質，其中該重鏈之胺基酸序列為包含序列編號70或序列編號72之胺基酸序列而成者。
  13. 如請求項12之融合蛋白質，其係代替該重鏈中CDR1之序列編號66或序列編號67及架構區3之序列編號68之各胺基酸序列以外之部分，而包含相對於該部分具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  14. 如請求項12之融合蛋白質，其係代替該重鏈中CDR1之序列編號66或序列編號67及架構區3之序列編號68之各胺基酸序列以外之部分，而包含相對於該部分具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  15. 如請求項12之融合蛋白質，其係代替構成該重鏈之胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號67之胺基酸序列之自N末端起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。
  16. 如請求項12之融合蛋白質，其係代替構成該重鏈之胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者， 此處，關於CDR1，位於序列編號67之胺基酸序列之自N末端起第5位的甲硫胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置，且關於架構區3，位於序列編號68之自N末端側起第17位的白胺酸即便於經修飾後之胺基酸序列中亦處於相同位置。
  17. 如請求項1至16中任一項之融合蛋白質，其係於該抗體之輕鏈之可變區中， (a)CDR1為包含序列編號6或序列編號7之胺基酸序列而成， (b)CDR2為包含序列編號8或序列編號9之胺基酸序列、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser而成，且 (c)CDR3為包含序列編號10之胺基酸序列而成者。
  18. 如請求項17之融合蛋白質，其係於該輕鏈之可變區中， (a)CDR1為代替序列編號6或序列編號7之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成， (b)CDR2為代替序列編號8或序列編號9之胺基酸序列、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成，且 (c)CDR3為代替序列編號10之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  19. 如請求項17之融合蛋白質，其係於該輕鏈之可變區中， (a)CDR1為代替序列編號6或序列編號7之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成， (b)CDR2為代替序列編號8或序列編號9之胺基酸序列、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成，且 (c)CDR3為代替序列編號10之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  20. 如請求項17之融合蛋白質，其係於該輕鏈之可變區中，代替 (a)關於CDR1之序列編號6或序列編號7、 (b)關於CDR2之序列編號8或序列編號9、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser、及 (c)關於CDR3之序列編號10 中之至少1個胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。
  21. 如請求項17之融合蛋白質，其係於該輕鏈之可變區中，代替 (a)關於CDR1之序列編號6或序列編號7、 (b)關於CDR2之序列編號8或序列編號9、或者胺基酸序列Lys-Val-Ser、及 (c)關於CDR3之序列編號10 中之至少1個胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。
  22. 如請求項1至16中任一項之融合蛋白質，其中該抗體之輕鏈之可變區為包含序列編號17、序列編號18、序列編號19、序列編號20、序列編號21或序列編號22之胺基酸序列而成者。
  23. 如請求項22之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  24. 如請求項22之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  25. 如請求項22之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。
  26. 如請求項22之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之可變區之胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。
  27. 如請求項1至16中任一項之融合蛋白質，其中該抗體之輕鏈為包含序列編號23、序列編號25、序列編號27或序列編號29之胺基酸序列而成者。
  28. 如請求項27之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之胺基酸序列而包含相對於其具有80%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  29. 如請求項27之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之胺基酸序列而包含相對於其具有90%以上之同源性之胺基酸序列而成者。
  30. 如請求項27之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之胺基酸序列而包含相對於其有1～5個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。
  31. 如請求項27之融合蛋白質，其係代替該輕鏈之胺基酸序列而包含相對於其有1～3個胺基酸經置換、缺失或附加之修飾之胺基酸序列而成者。
  32. 如請求項1至31中任一項之融合蛋白質，其中該抗體為Fab抗體、F(ab')2 抗體、或F(ab')抗體。
  33. 如請求項1至31中任一項之融合蛋白質，其中該抗體為選自由scFab、scF(ab')、scF(ab')2 及scFv所組成之群中之單鏈抗體。
  34. 如請求項33之融合蛋白質，其係經由連接子序列將該抗體之輕鏈與重鏈結合者。
  35. 如請求項34之融合蛋白質，其係於該輕鏈之C末端側經由連接子序列而結合有該重鏈者。
  36. 如請求項34之融合蛋白質，其係於該重鏈之C末端側經由連接子序列而結合有該輕鏈者。
  37. 如請求項34至36中任一項之融合蛋白質，其中該連接子序列為包含8～50個胺基酸殘基者。
  38. 如請求項37之融合蛋白質，其中該連接子序列為選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號3、序列編號4、及序列編號5之各胺基酸序列、相當於由3個序列編號3之胺基酸序列接連而成者的胺基酸序列、及由10個以下之該等胺基酸序列接連而成之序列所組成之群中者。
  39. 如請求項1至38中任一項之融合蛋白質，其中該BDNF為結合至該抗體之輕鏈或重鏈之C末端側或N末端側者。
  40. 如請求項39之融合蛋白質，其中該BDNF為直接或經由連接子而結合至該抗體之輕鏈或重鏈之C末端側或N末端側者。
  41. 如請求項40之融合蛋白質，其中該連接子為包含1～50個胺基酸殘基之肽。
  42. 如請求項41之融合蛋白質，其中該連接子為包含選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列編號3、序列編號4、及序列編號5所組成之群中之胺基酸序列而成之肽。
  43. 如請求項1至42中任一項之融合蛋白質，其中該BDNF為人類BDNF。
  44. 如請求項43之融合蛋白質，其中該人類BDNF為包含序列編號51之胺基酸序列或與其實質上一致之胺基酸序列而成者，或者與序列編號51所表示之蛋白質具有同質之功能者。
  45. 如請求項1至44中任一項之融合蛋白質，其係對於人類運鐵蛋白受體之細胞外區域及猴運鐵蛋白受體之細胞外區域兩者具有親和性者。
  46. 如請求項45之融合蛋白質，其中該抗運鐵蛋白受體抗體係與人類運鐵蛋白受體之細胞外區域之解離常數為1×10-10 M以下，與猴運鐵蛋白受體之細胞外區域之解離常數為1×10-9 M以下者。
  47. 如請求項43之融合蛋白質，其中 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 (a)該重鏈為於其C末端側經由包含胺基酸序列Gly-Ser之連接子與人類BDNF結合，藉此形成有序列編號52之胺基酸序列，或者 (b)該重鏈為於其C末端側經由如下連接子與人類BDNF結合，藉此形成有序列編號54之胺基酸序列，該連接子係包含繼胺基酸序列Gly-Ser之後連接5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號3)而成之共計27個胺基酸序列者。
  48. 如請求項1至31中任一項之融合蛋白質，其中該抗體為抗原結合性片段。
  49. 如請求項48之融合蛋白質，其係於該抗原結合性片段之N末端側直接或經由連接子而結合人類BDNF而成者。
  50. 如請求項48或49之融合蛋白質，其中該抗原結合性片段為單鏈抗體。
  51. 如請求項50之融合蛋白質，其係經由連接子序列將該抗體之輕鏈可變區與重鏈可變區結合而成者。
  52. 如請求項51之融合蛋白質，其係於該輕鏈可變區之C末端側經由該連接子序列而結合該重鏈可變區而成者。
  53. 如請求項51之融合蛋白質，其係於該重鏈可變區之C末端側經由該連接子序列而結合該輕鏈可變區而成者。
  54. 如請求項51至53中任一項之融合蛋白質，其中該連接子序列為包含8～50個胺基酸殘基者。
  55. 如請求項54之融合蛋白質，其中該連接子序列為選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號3、序列編號4、及序列編號5之各胺基酸序列、相當於序列編號3之胺基酸序列3個連接而成者之胺基酸序列、及由10個以下之該等胺基酸序列接連而成之序列所組成之群中者。
  56. 如請求項50至55中任一項之融合蛋白質，其中該抗體為包含具有序列編號69之胺基酸序列之重鏈可變區、與具有序列編號18之胺基酸序列之輕鏈可變區而成者。
  57. 如請求項56之融合蛋白質，其係該抗體包含序列編號57之胺基酸序列，且於其N末端側直接或經由連接子而結合人類BDNF而成者。
  58. 如請求項57之融合蛋白質，其係該抗體包含序列編號57之胺基酸序列，且於其N末端側經由連接子而結合人類BDNF前體而成、即包含序列編號59之胺基酸序列而成者。
  59. 如請求項57之融合蛋白質，其係該抗體包含序列編號57之胺基酸序列，且於其N末端側經由連接子而結合人類BDNF而成、即包含序列編號60之胺基酸序列而成者。
  60. 如請求項48或49之融合蛋白質，其中該抗原結合性片段為Fab、F(ab')2 、或F(ab')之任一者。
  61. 如請求項60之融合蛋白質，其係於Fab、F(ab')2 、或F(ab')之任一者之輕鏈或重鏈之N末端側直接或經由連接子而結合人類BDNF而成者。
  62. 如請求項61之融合蛋白質，其係該抗體之輕鏈包含序列編號23之胺基酸序列，且該抗體之重鏈為包含序列編號61之胺基酸序列之Fab重鏈，於該重鏈之N末端側直接或經由連接子而結合人類BDNF而成者。
  63. 如請求項62之融合蛋白質，其中該連接子為包含選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列編號3之胺基酸序列、序列編號4之胺基酸序列、及序列編號5之胺基酸序列所組成之群中之胺基酸序列而成之肽。
  64. 如請求項62之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 於包含該Fab重鏈與在其N末端側直接或經由連接子而結合之人類BDNF前體的部分形成有序列編號63之胺基酸序列者。
  65. 如請求項62之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 於包含Fab重鏈與在其N末端側直接或經由連接子而結合之人類BDNF的部分形成有序列編號65之胺基酸序列者。
  66. 如請求項48至62中任一項之融合蛋白質，其係將人類IgG Fc區域或其一部分導入至人類BDNF與該抗體之間而成者。
  67. 如請求項66之融合蛋白質，其係於人類BDNF之C末端側直接或經由連接子序列而結合人類IgG Fc區域而成，且於該人類IgG Fc區域之C末端側直接或經由連接子序列而結合該抗體而成者。
  68. 如請求項66或67之融合蛋白質，其中人類IgG Fc區域為包含序列編號75所示之胺基酸序列而成者。
  69. 如請求項68之融合蛋白質，其係 該重鏈為於人類BDNF之C末端側直接或經由連接子序列而結合該人類IgG Fc區域而成，且於該人類IgG Fc區域之C末端側直接或經由連接子序列而結合有該重鏈者。
  70. 如請求項69之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 該重鏈為於人類BDNF之C末端側經由連接子序列而結合人類IgG Fc區域而成，且於該人類IgG Fc區域之C末端側經由連接子序列而結合有該重鏈，藉此形成有序列編號74之胺基酸序列者。
  71. 如請求項48至62中任一項之融合蛋白質，其係進而導入白蛋白親和性肽而成者。
  72. 如請求項71之融合蛋白質，其係於該抗體之C末端側直接或經由連接子序列而結合白蛋白親和性肽而成者。
  73. 如請求項71或72之融合蛋白質，其中白蛋白親和性肽為包含序列編號85所示之胺基酸序列而成者。
  74. 如請求項73之融合蛋白質，其係 該重鏈為直接或經由連接子序列結合至人類BDNF之C末端側而成，且於該重鏈之C末端側直接或經由連接子序列而結合有白蛋白親和性肽者。
  75. 如請求項74之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 該重鏈為直接或經由連接子序列結合至人類BDNF前體之C末端側而成，且於該重鏈之C末端側直接或經由連接子序列而結合有白蛋白親和性肽，藉此形成有序列編號87之胺基酸序列者。
  76. 如請求項74之融合蛋白質，其係 該輕鏈為包含序列編號23之胺基酸序列而成，且 該重鏈為直接或經由連接子序列結合至人類BDNF之C末端側而成，且於該重鏈之C末端側直接或經由連接子序列而結合有白蛋白親和性肽，藉此形成有序列編號88之胺基酸序列者。
  77. 一種DNA片段，其編碼如請求項1至76中任一項之融合蛋白質。
  78. 一種表現載體，其係組入如請求項77之DNA片段而成。
  79. 一種哺乳動物細胞，其係利用如請求項78之表現載體進行轉形而獲得。
  80. 一種藥劑，其係用以預防及/或治療藉由暴露於BDNF能夠得益之疾病或障礙之藥劑，且包含如請求項1至76中任一項之融合蛋白質作為有效成分而成。
  81. 如請求項80之藥劑，其中該疾病或障礙為神經系統之疾病或障礙。
  82. 如請求項81之藥劑，其中該神經系統之疾病或障礙為神經退化性疾病、抑鬱症、精神分裂症、癲癇、自閉症、Rett症候群、West症候群、新生兒痙攣、癡呆症所伴隨之行為異常、焦慮症、疼痛、希什斯普隆氏病或快速動眼睡眠行為障礙。
  83. 如請求項82之藥劑，其中該神經退化性疾病為腦神經退化性疾病、脊髓退化性疾病、視網膜退化性疾病或末梢神經退化性疾病。
  84. 如請求項83之藥劑，其中該腦神經退化性疾病為腦神經系統之神經退化性疾病、腦缺血性疾病、外傷性腦損傷、腦白質病或多發性硬化症。
  85. 如請求項84之藥劑，其中該腦神經系統之神經退化性疾病為阿茲海默氏症、帕金森氏症、杭丁頓舞蹈症、路易體癡呆、匹克病、多發性系統萎縮症、進行性上行性麻痹或唐氏症候群。
  86. 一種如請求項1至76中任一項之融合蛋白質之用途，其係用於預防及/或治療藉由暴露於BDNF能夠得益之疾病或障礙。
  87. 一種如請求項1至76中任一項之融合蛋白質之用途，其係用於製造藉由暴露於BDNF能夠得益之疾病或障礙之預防及/或治療用醫藥。
  88. 一種預防及/或治療藉由暴露於BDNF能夠得益之疾病或障礙之方法，其包括：將含有如請求項1至76中任一項之融合蛋白質之治療上有效量之醫藥組合物投予至具有該疾病或障礙的患者之血中。
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