TW201742922A - 經標記之核苷酸組合物及用於核酸定序之方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種基於發光壽命及/或強度對分子進行定序之方法。在一些態樣中，核酸定序方法涉及測定在核酸定序反應期間併入之一系列經發光標記之核苷酸之發光壽命及視情況發光強度。在一些態樣中，本發明提供包含經發光標記之核苷酸之組合物。

Description

經標記之核苷酸組合物及用於核酸定序之方法

本申請案一般係關於用於進行生物學及/或化學樣品之快速的大規模並行定量分析之方法、組合物及裝置；及製造該等裝置之方法。

生物樣品之檢測及分析可使用生物學分析(「生物分析」)。生物分析習知地涉及較大的昂貴實驗室設備，其需要經培訓之研究科學家操作該設備且進行生物分析。此外，生物分析習知地係以大量進行，因此大量特定類型的樣品為偵測及定量所必需的。 藉由用發射特定波長之光之發光標記物標記樣品來進行一些生物分析。用光源照明標記物以使得發光，且用光偵測器偵測發光光源以對標記物發射之發光光源之量進行定量。使用發光標記物之生物分析習知地涉及昂貴的雷射光源以照亮樣品及複雜的發光偵測光學裝置及電子裝置以自照亮的樣品採集發光。

在其他態樣中，本發明提供一種經發光標記之核苷酸，其包含一或多種經由核酸連接至一或多種聚磷酸核苷之發光標記，其中該核酸包含保護元件。在一些實施例中，保護元件涉及核酸之一或多個特徵及/或修飾，其當一或多種聚磷酸核苷之聚磷酸核苷在聚合酶之活性位點中或附近時，保護聚合酶免受一或多種發光標記損傷作用。 在一些實施例中，核酸為單股的。在一些實施例中，核酸為雙股的。在一些實施例中，根據本發明之雙股核酸包含：第一寡核苷酸股，其包含連接在沿著第一寡核苷酸股之任一側面上具有一或多種核苷酸之內部位置處之一或多種發光標記；及第二寡核苷酸股，其包含一或多種聚磷酸核苷，其中該第二寡核苷酸股緩冷配對至第一寡核苷酸股。 在一些實施例中，本發明之經發光標記之核苷酸包含兩種或多於兩種經由包含多個胸苷核苷酸之連接子連接至核酸之聚磷酸核苷。在一些實施例中，連接子包含支鏈連接子，例如支鏈胸苷連接子。在一些實施例中，支鏈連接子包含支鏈胸苷連接子。舉例而言，在一些實施例中，各核苷聚磷酸包含Nu-T(T)_n T-R之胸苷連接子，其中Nu代表核苷聚磷酸，T代表胸苷核苷酸，n為1與30之間的值之整數，且R代表連接一或多種額外聚磷酸核苷之匯合點。在一些實施例中，匯合點進一步直接連接至核酸之寡核苷酸股。在一些實施例中，匯合點例如經由其他胸苷連接子及/或其他匯合點進一步間接連接至寡核苷酸股。 在一些實施例中，核酸之保護元件包含至少一種能量吸收修飾。在一些實施例中，至少一種能量吸收修飾包含三重態淬滅劑。在一些實施例中，至少一種能量吸收修飾包含樹枝狀修飾。在一些實施例中，至少一種能量吸收修飾包含單醣-TEG、雙醣、N-乙醯基單醣、TEMPO-TEG、水溶性維生素E (trolox)-TEG或甘油樹狀體。在一些實施例中，保護元件包含一或多種莖-環。在一些實施例中，一或多種莖-環為未標記的，例如一或多種莖-環並不包含連接在莖-環之環及/或莖處的發光標記。在一些實施例中，一或多種莖-環在一或多種發光標記與一或多種聚磷酸核苷之間的核酸上之位置中。在此類實施例中，一或多種未標記莖-環可提供立體阻擋層及/或提供聚合酶保護作用之吸收阻擋層。 在一些實施例中，一或多種發光標記可連接在至少一或多個莖-環之環處。然而，在一些實施例中，保護元件(例如一或多種未標記的莖-環)將一或多種發光標記與一或多種聚磷酸核苷分離。 在一些實施例中，經發光標記之核苷酸之核酸進一步包含緩冷配對至第一及第二寡核苷酸股中之至少一者的第三寡核苷酸股。在一些實施例中，核酸進一步包含緩冷配對至第一、第二及第三寡核苷酸股中之至少一者的第四寡核苷酸股。在一些實施例中，寡核苷酸股形成霍利迪連結體(Holliday junction)。 在一些態樣中，本發明提供測定模板核酸序列之方法。在一些實施例中，該等方法包括以下步驟：其包含使目標體積中之複合物曝露於多種類型經發光標記之核苷酸，該複合物包含模板核酸、引物及聚合酶。在一些實施例中，各類型的經發光標記之核苷酸包含一或多種經由核酸連接至一或多種聚磷酸核苷之發光標記。在一些實施例中，核酸包含保護元件。因此，在一些態樣中，本發明提供核酸定序方法，其利用本文所描述之經發光標記之核苷聚磷酸組合物中之任一者。 在一些實施例中，該等方法進一步包含將一系列一或多種激發能量脈衝引向目標體積附近之步驟。在一些實施例中，該等方法進一步包含在連續併入包含引物之核酸期間自經發光標記之核苷酸偵測多個發射光子之步驟。在一些實施例中，該等方法進一步包含藉由測定發射光子之時序及視情況頻率鑑別併入的核苷酸之序列之步驟。 在一些實施例中，反應混合物中之四種不同類型的核苷酸(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶/尿嘧啶)可各自用一或多種發光分子(例如一或多種發光標記)標記。在一些實施例中，各類型的核苷酸可連接至多於一種相同發光分子(例如連接至核苷酸之相同螢光染料中之兩者或多於兩者)。在一些實施例中，各發光分子可連接至多於一種核苷酸(例如相同核苷酸中之兩者或多於兩者)。在一些實施例中，多於一種核苷酸可連接(例如經由包含一或多種保護元件之核酸連接子)至多於一種發光分子。在一些實施例中，所有四個核苷酸用在相同光譜範圍(例如520-570 nm)內吸收及發射之發光分子標記。 在一些實施例中，一組四個核苷酸中之發光標記可選自包含芳族或雜芳族化合物之染料，且可為芘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚、苯并吲哚、噁唑、咔唑、噻唑、苯并噻唑、啡啶、啡噁嗪、卟啉、喹啉、乙錠、苯甲醯胺、花青、羰花青、水楊酸酯、鄰胺基苯甲酸酯、香豆素、螢光素、若丹明或其他類似化合物。例示性染料包括二苯并哌喃染料，諸如螢光素；或若丹明染料、萘染料、香豆素染料、吖啶染料、花青染料、苯并噁唑染料、芪染料、芘染料、酞菁染料、藻膽蛋白染料、方酸染料、BODIPY染料及其類似物。 在一些實施例中，一組四個核苷酸中之發光標記包含Alexa Fluor® 546、Cy®3B、Alexa Fluor® 555及Alexa Fluor® 555及FRET對Alexa Fluor® 555及Cy®3.5。在一些實施例中，一組四個核苷酸中之發光標記包含Alexa Fluor® 555、Cy®3.5、Alexa Fluor® 546及DyLight® 554-R1。在一些實施例中，一組四個核苷酸中之發光標記包含Alexa Fluor® 555、Cy®3.5、ATTO Rho6G及DyLight® 554-R1在一些實施例中，一組四個核苷酸中之發光標記包含Alexa Fluor® 555、Cy®3B、ATTO Rho6G及DyLight® 554-R1。在一些實施例中，一組四個核苷酸中之發光標記包含Alexa Fluor® 555、Cy®3B、ATTO 542及DyLight® 554-R1。在一些實施例中，一組四個核苷酸中之發光標記包含Alexa Fluor® 555、Cy®3B、ATTO 542及Alexa Fluor® 546。在一些實施例中，一組四個核苷酸中之發光標記包含Cy®3.5、Cy®3B、ATTO Rho6G及DyLight® 554-R1。 在某些實施例中，至少一種類型、至少兩種類型、至少三種類型或至少四種類型經發光標記之核苷酸包含選自由以下組成之群的發光染料：6-TAMRA、5/6-羧基若丹明6G、Alexa Fluor® 546、Alexa Fluor® 555、Alexa Fluor® 568、Alexa Fluor® 610、Alexa Fluor® 647、Aberrior Star 635、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO Rho6G、ATTO 542、ATTO 647N、ATTO Rho14、Chromis 630、Chromis 654A、Chromeo™ 642、CF™514、CF™532、CF™543、CF™546、CF™546、CF™555、CF™568、CF™633、CF™640R、CF™660C、CF™660R、CF™680R、Cy®3、Cy®3B、Cy®3.5、Cy®5、Cy®5.5、Dyomics-530、Dyomics-547P1、Dyomics-549P1、Dyomics-550、Dyomics-554、Dyomics-555、Dyomics-556、Dyomics-560、Dyomics-650、Dyomics-680、DyLight® 554-R1、DyLight® 530-R2、DyLight® 594、DyLight® 635-B2、DyLight® 650、DyLight® 655-B4、DyLight® 675-B2、DyLight® 675-B4、DyLight® 680、HiLyte™ Fluor 532、HiLyte™ Fluor 555、HiLyte™ Fluor 594、LightCycler® 640R、Seta™ 555、Seta™ 670、Seta™700、Seta™u 647及Seta™u 665或具有如本文所描述之(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。 在一些實施例中，至少一種類型、至少兩種類型、至少三種類型或至少四種類型之經發光標記之核苷酸各自包含選自由以下組成之群的發光染料：Alexa Fluor® 546、Alexa Fluor® 555、Cy®3B、Cy®3.5、DyLight® 554-R1、Alexa Fluor® 546、Atto Rho6G、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO Rho6G及ATTO 542。 在一些實施例中，第一類型之經發光標記之核苷酸包含Alexa Fluor® 546，第二類型之經發光標記之核苷酸包含Cy®3B，第三類型之經發光標記之核苷酸包含兩種Alexa Fluor® 555，且第四類型之經發光標記之核苷酸包含Alexa Fluor® 555及Cy®3.5。 在一些實施例中，第一類型之經發光標記之核苷酸包含Alexa Fluor® 555，第二類型之經發光標記之核苷酸包含Cy®3.5，第三類型之經發光標記之核苷酸包含Alexa Fluor® 546，且第四類型之經發光標記之核苷酸包含DyLight® 554-R1。 在一些實施例中，第一類型之經發光標記之核苷酸包含Alexa Fluor® 555，第二類型之經發光標記之核苷酸包含Cy®3.5，第三類型之經發光標記之核苷酸包含ATTO Rho6G，且第四類型之經發光標記之核苷酸包含DyLight® 554-R1。 在一些實施例中，第一類型之經發光標記之核苷酸包含Alexa Fluor® 555，第二類型之經發光標記之核苷酸包含Cy®3B，第三類型之經發光標記之核苷酸包含ATTO Rho6G，且第四類型之經發光標記之核苷酸包含DyLight® 554-R1。 在一些實施例中，第一類型之經發光標記之核苷酸包含Alexa Fluor® 555，第二類型之經發光標記之核苷酸包含Cy®3B，第三類型之經發光標記之核苷酸包含ATTO 542，且第四類型之經發光標記之核苷酸包含DyLight® 554-R1。 在一些實施例中，第一類型之經發光標記之核苷酸包含Alexa Fluor® 555，第二類型之經發光標記之核苷酸包含Cy®3B，第三類型之經發光標記之核苷酸包含ATTO 542，且第四類型之經發光標記之核苷酸包含Alexa Fluor® 546。 在一些實施例中，第一類型之經發光標記之核苷酸包含Cy®3.5，第二類型之經發光標記之核苷酸包含Cy®3B，第三類型之經發光標記之核苷酸包含ATTO Rho6G，且第四類型之經發光標記之核苷酸包含DyLight® 554-R1。 在一些實施例中，至少一種類型、至少兩種類型、至少三種類型或至少四種類型經發光標記之核苷酸包含選自由以下組成之群的發光染料：Alexa Fluor® 532、Alexa Fluor® 546、Alexa Fluor® 555、Alexa Fluor® 594、Alexa Fluor® 610、CF™532、CF™543、CF™555、CF™594、Cy®3、DyLight® 530-R2、DyLight® 554-R1、DyLight® 590-R2、DyLight® 594、DyLight® 610-B1或具有式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。 在一些實施例中，第一及第二類型之經發光標記之核苷酸包含選自由以下組成之群的發光染料：Alexa Fluor® 532、Alexa Fluor® 546、Alexa Fluor® 555、CF™532、CF™543、CF™555、Cy®3、DyLight® 530-R2、DyLight® 554-R1，且第三及第四類型之經發光標記之核苷酸包含選自由以下組成之群的發光染料：Alexa Fluor® 594、Alexa Fluor® 610、CF™594、DyLight® 590-R2、DyLight® 594、DyLight® 610-B1或具有式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。 在某些實施例中，至少一種類型、至少兩種類型、至少三種類型或至少四種類型經發光標記之核苷酸分子包含選自由以下組成之群的發光蛋白質：TagBFP、mTagBFP2、藍銅礦(Azurite)、EBFP2、mKalama1、天狼星(Sirius)、寶石藍(Sapphire)、T-寶石藍、ECFP、蔚藍(Cerulean)、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、單體Midoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、祖母綠(Emerald)、Superfolder GFP、單體Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、檸檬色(Citrine)、金星(Venus)、SYFP2、TagYFP、單體Kusabira-Orange、mKOK、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、iRFP、mKeima Red、LSS-mKate1、LSS-mKate2、mBeRFP、PA-GFP、PAmCherry1、PATagRFP、Kaede (綠色)、Kaede (紅色)、KikGR1 (綠色)、KikGR1 (紅色)、PS-CFP2、mEos2 (綠色)、mEos2 (紅色)、PSmOrange或Dronpa。 本申請案之態樣提供用於將激發能量遞送至待鑑別分子(例如經發光標記之核苷聚磷酸)及在激發之後偵測發射光子之方法。在某些實施例中，偵測包含記錄各偵測發光之發光與前一激發能量脈衝之間的持續時間。在某些實施例中，偵測包含記錄多個偵測的發光中之每一者的發光與前一激發能量脈衝之間的持續時間。在某些實施例中，遞送多個激發能量脈衝。待鑑別分子之發光標記物(例如一或多種發光標記)可藉由各脈衝或該等脈衝之一部分激發。在某些實施例中，多次發光藉由一或多種感測器偵測。待鑑別分子之發光標記物可在各激發或激發之一部分之後發光。產生發光之激發事件之部分係基於標記物之發光量子產率。在一些實施例中，提高發光標記之數目可提高量子產率(例如提高發光發射之數目)。另外，並非標記物發射之所有發光均將偵測到，例如一些發光將遠離感測器定向。在某些實施例中，基於發光標記物之發光特性選擇激發能量，該等標記物包括吸收光譜及在給定光譜範圍內激發之後標記物發射光子所處的波長。 在某些實施例中，基於待偵測之經發光標記之分子(例如經發光標記之核苷聚磷酸)之發光特性(例如發光壽命)選擇脈衝式激發能量之頻率。在一些實施例中，脈衝之間的間隙長於一或多種激發的經發光標記之分子之發光壽命。在一些實施例中，間隙比一或多種激發的經發光標記之分子之發光壽命長約兩倍與約十倍之間，在約十倍與約100倍之間，或在約100倍與約1000倍之間。在一些實施例中，間隙比一或多種激發的經發光標記之分子之發光壽命長約10倍。 在某些實施例中，基於監測之化學方法選擇脈衝式激發能量之頻率。對於定序反應，當併入經發光標記之核苷酸時遞送至目標體積之脈衝之數目將部分地確定偵測到之發射光子之數目。在一些實施例中，選擇頻率以在併入經發光標記之核苷酸期間允許足夠數目個待偵測光子，其中足夠數目為區別經發光標記之核苷酸與多種類型經發光標記之核苷酸所必要的光子之數目。在一些實施例中，基於發射光子之波長，經發光標記之核苷酸為突出的。在一些實施例中，基於發光發射壽命，例如脈衝激發與發射偵測之間的時間，經發光標記之核苷酸為突出的。在一些實施例中，基於發射光子之波長及發射壽命，經發光標記之核苷酸為突出的。在一些實施例中，基於發射信號之發光強度(例如基於時間段內發射頻率或發射事件總數)，經發光標記之核苷酸為突出的。在一些實施例中，基於發射信號之發光強度及發光壽命，經發光標記之核苷酸為突出的。在一些實施例中，基於發光強度及波長，經發光標記之核苷酸為突出的。在一些實施例中，基於發光強度、波長及發光壽命，經發光標記之核苷酸為突出的。 根據本申請案之另一態樣，提供一種對靶核酸進行定序之方法。在一些實施例中，對靶核酸進行定序之方法包含以下步驟：(i)提供包含(a)該靶核酸、(b)與該靶核酸互補之引物、(c)核酸聚合酶及(d)用於併入與該靶核酸互補之生長核酸股中之核苷酸的混合物，其中該等核苷酸包括不同類型的經發光標記之核苷酸，其中該等經發光標記之核苷酸在連續併入該生長核酸股中期間產生可偵測信號，不同類型的經發光標記之核苷酸之該等可偵測信號在時域(例如藉由測定可偵測信號之時序及/或頻率)方面可彼此區分；(ii)使(i)之該混合物在足以藉由該引物延伸產生該生長核酸股之條件下進行聚合反應；(iii)在連續併入該生長核酸股中期間自該等經發光標記之核苷酸量測該等可偵測信號；及(iv)在連續併入該生長核酸股中後自該等經發光標記之核苷酸測定該等量測到的可偵測信號之時序及/或頻率以鑑別該等經發光標記之核苷酸併入該生長核酸股中之時間順序，進而測定該靶核酸之序列。 在一些實施例中，靶核酸或核酸聚合酶連接至支撐物。在一些實施例中，在使(i)之混合物進行聚合反應之後鑑別併入之時間順序。在一些實施例中，可偵測信號為光學信號。在一些實施例中，光學信號為發光信號。在一些實施例中，測定量測到的可偵測信號之時序及/或頻率包含(i)在一或多個感測器處接收該等可偵測信號；及(ii)將響應於在該一或多個感測器處接受的該等可偵測信號產生的多個電荷載流子之電荷載流子基於產生該等電荷載流子所處的時間選擇性地引導至至少一個電荷載流子存儲區域中。 在一些實施例中，該等量測到的可偵測信號之時序及/或頻率包含衰變壽命之量測結果。在一些實施例中，量測到的可偵測信號之時序及/或頻率包含在偵測可偵測信號之一或多個感測器處出現可偵測信號時之量測結果。在一些實施例中，該方法進一步包含基於可偵測信號出現時間將可偵測信號產生之電荷載流子分離成與一或多個感測器相關的頻段。在一些實施例中，量測到的可偵測信號之時序及/或頻率為非光譜量測結果。

本申請案主張根據35 U.S.C. § 119(e)2016年11月23日提交之美國臨時專利申請案第62/426,144號及2016年5月20日提交之美國臨時專利申請案第62/339,790號之優先權，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。 本發明之態樣係關於用於將發光標記連接至聚磷酸核苷之核酸連接子。此類組合物宜用於涉及聚磷酸核苷作為反應物基質之用途的技術。舉例而言，某些DNA定序技術可涉及在合成定序反應中使用聚合酶，從而可基於可歸因於生長股中特定類型之標記核苷酸之併入的獨特信號獲得序列資訊。在一些實施例中，聚合酶活性可決定定序結果之穩固性。因此，通常需要保護聚合酶免受光誘導損傷以便保存恰當官能基及總活性，例如以便優化讀數參數，諸如讀取長度及準確度。因此，本文所描述之核酸連接子提供聚合酶保護官能基，其使可能另外由非常接近於聚合酶活性位點之經發光標記之核苷酸產生的光誘導之損傷消除或最小化。 在一些態樣中，本發明提供經發光標記之核苷酸，其包含經由核酸連接子連接至聚磷酸核苷之發光標記。在一些實施例中，聚磷酸核苷用作合成反應物中之聚合酶基質，且核酸連接子在經發光標記之核苷酸上賦予聚合酶保護特性。在一些實施例中，核酸連接子在發光標記與聚磷酸核苷之間提供分離距離以在涉及聚磷酸核苷之酶催化反應期間使標記與聚合酶或其他酶之間的相互作用之程度降至最低。然而，本發明人進一步識別及瞭解可提供保護作用之核酸連接子之額外特徵。在一些實施例中，核酸連接子包含位於發光標記與聚磷酸核苷之間的一或多種保護元件以在涉及聚磷酸核苷之酶催化反應期間進一步保護聚合酶或其他酶。舉例而言，在一些實施例中，核酸連接子包含一或多種結構基元(例如莖-環、霍利迪連結體)、多個雜交寡核苷酸股、在雜交區域內的一或多種交聯鹼基對(例如在兩個或多於兩個將發光標記連接至聚磷酸核苷之寡核苷酸股之間)及/或一或多種能量吸收修飾(例如三重態淬滅劑、支鏈聚合結構、支鏈樹枝狀結構)以提供進一步聚合酶保護作用。在一些實施例中，本文所描述之核酸連接子(及相關標記核苷酸)不連接至材料粒子(例如不連接至金屬、磁性、聚合或其他材料之粒子)。在一些實施例中，核酸連接子為線性分子。在一些實施例中，核酸連接子為環狀分子。在一些實施例中，核酸連接子為單股的(例如具有或不具有莖-環結構)。在一些實施例中，核酸連接子為雙股的(例如具有或不具有莖環結構)。在一些實施例中，雙股核酸連接子之兩個股為雜交的(歸因於互補序列)及非共價連接的。然而，在一些實施例中，一或多個共價鍵可引入(例如使用一或多種化學連接子)至雙股連接子之共價連接的兩個股。在一些實施例中，核酸連接子可包括如本文所描述之一或多種額外部分。在一些實施例中，核酸連接子包括i)在糖磷酸酯主鏈內或結束處之一或多種額外部分，ii)一或多種修飾(例如一或多種經修飾之鹼或糖)或i)及ii)之組合。然而，在一些實施例中，核酸連接子不包括i)、ii)或i)或ii)中之任一者。 在一些實施例中，核酸連接子包含一或多種結構基元，諸如莖環，其在發光標記與聚磷酸核苷之間提供立體阻擋層。莖環或髮夾環為當寡核苷酸股與相同股之另一部分摺疊及形成鹼基對時形成之寡核苷酸股上之核苷酸之未配對環。在一些實施例中，莖-環之未配對環包含三至十個核苷酸。因此，莖-環可藉由具有雜交形成莖之倒轉互補序列之寡核苷酸股之兩個區域形成，其中兩個區域由形成未配對環之三至十個核苷酸間隔開。在一些實施例中，莖可經設計以具有一或多個G/C核苷酸，其可藉由相比於A/T核苷酸形成之加成氫鍵結相互作用提供添加穩定性。在一些實施例中，莖包含緊鄰未配對環序列之G/C核苷酸。在一些實施例中，莖在靠近未配對環序列之前2、3、4或5個核苷酸內包含G/C核苷酸。在一些實施例中，一或多種發光標記連接至莖-環之未配對環，其中莖區域在一或多種發光標記與聚磷酸核苷之間提供硬度及距離。在一些實施例中，一或多種發光標記連接至莖-環之莖。在一些實施例中，核酸連接子之莖-環不包含發光標記。在一些實施例中，核酸連接子之莖-環在莖(例如「凸出部分」)內包含未配對區域。在一些實施例中，一或多種未標記結構基元，諸如莖-環包括於核酸連接子中(例如一或多種發光標記與一或多種聚磷酸核苷之間的核酸連接子上之位置中)。在此類實施例中，一或多種未標記結構基元可提供立體阻擋層及/或提供聚合酶保護作用之吸收阻擋層。 在一些實施例中，核酸連接子包含一或多種能量吸收修飾，諸如淬滅部分，以吸收或另外緩和對聚合酶之光誘導損傷。在一些實施例中，核酸連接子可包含提供聚合酶保護作用之額外特徵。舉例而言，在一些實施例中，可選擇核酸連接子上之發光標記之連接位置以提供聚合酶保護作用。在一些實施例中，發光標記連接在核酸連接子上之內部位點處以使得接近相對於末端連接標記之核酸連接子之更大程度保持標記。在此類實施例中，發光標記在其可用性方面相對受限以與空間中之聚合酶相互作用。 在一些實施例中，核酸連接子為雙股的。在一些實施例中，雙股核酸連接子包含連接至發光標記之第一寡核苷酸股及連接至聚磷酸核苷之第二寡核苷酸股。在一些實施例中，第二寡核苷酸股進一步包含靠近緩冷配對的第一寡核苷酸股之發光標記之一或多種能量吸收修飾。舉例而言，在一些實施例中，核酸連接子之一或多種能量吸收修飾相比於聚磷酸核苷更接近發光標記。因此，在此類實施例中，一或多種能量吸收修飾充當與發光分子發射之輻射及/或非輻射衰變相交的立體及/或吸收阻擋層。 如本文所使用，「核酸連接子」係指將發光標記連接至聚磷酸核苷之核酸。在一些實施例中，核酸連接子提供聚合酶保護作用。因此，在一些實施例中，核酸連接子替代地稱為「核酸保護分子」或更一般稱為「保護分子」。在一些實施例中，視情形而定，術語核酸及寡核苷酸可互換使用。因而，核酸連接子、寡核苷酸連接子、核酸保護分子及寡核苷酸保護分子可指相同或類似概念。 應理解，在核酸連接子(例如寡核苷酸二聚體)的情況下，連接於其上之「核苷酸」或「聚磷酸核苷」係指經配置以併入生長核酸股中(例如在定序反應期間)之一或多種核苷酸(例如磷酸核苷)。在一些實施例中，一或多種核苷酸包含一或多種單磷酸核苷或聚磷酸核苷(例如二或三磷酸核苷或具有超過三種5'磷酸酯之核苷等)。在一些實施例中，一或多種磷酸核苷(例如聚磷酸核苷)可經由末端磷酸酯連接至形成如本申請案中所描述之保護分子之部分寡核苷酸(例如未標記寡核苷酸股)。在一些實施例中，本申請案中描述之組合物或方法中之任一者，磷酸核苷(例如聚磷酸核苷)之磷酸酯部分(例如聚磷酸酯部分)包括一或多種磷酸酯或其變體。舉例而言，在一些實施例中，磷酸核苷(例如聚磷酸核苷)之磷酸酯部分(例如聚磷酸酯部分)可包括磷酸酯、硫酯、胺基磷酸酯、烷基膦酸酯鍵、其他適合之鍵或大於一種此類修飾或其兩者或多於兩者之組合。在一些實施例中，核酸連接子之標記及未標記股實質上彼此互補(例如在二聚結構域之長度內，其中二聚結構域內之股可具有例如至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%彼此互補)。 如本文所描述，本發明之態樣係關於具有聚合酶保護作用之組合物。應瞭解，醫師可藉由多種參數評估聚合酶保護作用。一般而言，可藉由在具有保護元件之組合物與不具有保護性元件之組合物之間進行比較性評定來評估保護元件之作用。舉例而言，在一些實施例中，相對於在除不具有一或多種保護元件但另外類似或相同之核酸連接子之外相同條件及相同試劑下進行的定序反應，聚合酶保護元件可將序列讀數長度提高例如10%-25%、25-50%、50-75%、75-100%或大於100%，例如約2倍、3倍、4倍、5倍或多於5倍。在一些實施例中，保護元件可提高序列準確度(例如相對於在如上文所描述之比較性條件下進行之定序反應，提高約5%、約10%、約15%或多於15%)。在一些實施例中，聚合酶之保護可藉由降低(例如降低約10%、20%、30%、40%、50%或多於50%)量測，其程度為在股合成期間聚合酶因光誘導損傷而失活，如在上文所描述之比較性條件下評估。 在一些實施例中，本發明提供基於彼等分子之一或多種發光特性來鑑別單分子之新型方法及組合物。在一些實施例中，基於其發光壽命、吸收光譜、發射光譜、發光量子產率、發光強度或其兩者或多於兩者之組合，鑑別分子(例如經發光標記之聚磷酸核苷)。鑑別可意謂分配分子之準確分子一致性，或可意謂將特定分子與一組可能的分子區別或區分開來。在一些實施例中，基於不同發光壽命、吸收光譜、發射光譜、發光量子產率、發光強度或其兩者或多於兩者之組合，多個單分子可彼此區別開來。在一些實施例中，藉由使分子曝露於一系列單獨的光脈衝及評估自分子發射之各光子之時序或其他特性，鑑別單分子(例如與其他分子區別開來)。在一些實施例中，彙總自單分子依次發射之多個光子之資訊且進行評估以鑑別分子。在一些實施例中，由自分子依次發射之多個光子測定分子之發光壽命，且發光壽命可用於鑑別分子。在一些實施例中，由自分子依次發射之多個光子測定分子之發光強度，且發光強度可用於鑑別分子。在一些實施例中，由自分子依次發射之多個光子測定分子之發光壽命及發光強度，且發光壽命及發光強度可用於鑑別分子。 本申請案之態樣適用於偵測及/或鑑別一或多種生物學或化學分子。在一些實施例中，可藉由在一或多個時間點測定一或多種試劑或產物之存在或不存在來評估化學或生物學反應物。 本申請案之態樣藉由使分子曝露於光及測定自分子發射之一或多種光子之一或多個特性來查詢分子。在某些實施例中，藉由使分子曝露於光脈衝及測定自分子發射之光子之一或多個特性詢問分子。在一些實施例中，使分子曝露於多個單獨的光脈衝事件且測定在單獨的光脈衝事件之後發射之單獨的光子之一或多個特性。在一些實施例中，響應於各光脈衝，分子不發射光子。然而，可藉由使分子曝露於一系列單獨的光脈衝及評估在光脈衝事件之子集之後發射的單獨的光子(例如在約10%脈衝事件之後發射光子或在約1%脈衝事件之後發射光子)評估多個發射光子。 本申請案之態樣適用於藉由測定在一或多個時間點一或多種反應物之試劑、中間物及/或產物之存在或不存在來監測化學或生物學反應物。在一些實施例中，隨時間推移反應進程可藉由使反應樣品曝露於一系列單獨的光脈衝及分析在各光脈衝之後偵測到的任何發射光子分析。 因此，在本申請案之一些態樣中，使反應樣品曝露於多個單獨的光脈衝且偵測且分析一系列發射光子。在一些實施例中，該系列發射光子提供關於在實驗時間內在反應樣品中存在且不改變的單分子之資訊。然而，在一些實施例中，該系列發射光子提供關於在不同時間存在於反應樣品中(例如當反應或方法進行時)之一系列不同分子的資訊。 在一些實施例中，本申請案之態樣可用於分析生物樣品，例如測定樣品中之一或多種核酸或多肽之序列及/或測定樣品中一或多種核酸或多肽變體(例如相關基因中之一或多種突變)之存在或不存在。在一些實施例中，可對患者樣品(例如人類患者樣品)進行測試以提供核酸序列資訊或出於診斷、預後及/或治療目的，測定一或多種相關核酸之存在或不存在。在一些實例中，診斷測試可包括對個體之生物樣品中之核酸分子進行定序，例如藉由對個體之生物樣品中之無細胞去氧核糖核酸(DNA)分子及/或表現產物(例如核糖核酸(RNA))進行定序。 在一些實施例中，使用發光壽命及/或強度分析(例如詢問及/或鑑別)之一或多種分子可為標記分子(例如已用一或多種發光標記物標記之分子)。在一些實施例中，生物分子之個別次單元可使用標記物鑑別。在一些實例中，發光標記物用於鑑別生物分子之個別次單元。一些實施例使用發光標記物(在本文中亦稱為「標記物」)，其可為外源性或內源性標記物。外源性標記物可為用作報導子之外部發光標記物及/或用於發光標記之標籤。外源性標記物之實例可包括但不限於螢光分子、螢光團、螢光染料、螢光染色劑、有機染料、螢光蛋白質、參與螢光共振能量轉移(FRET)之物質、酶及/或量子點。其他外源性標記物為此項技術中已知的。此類外源性標記物可共軛至特異性結合至特定靶標或組分之探針或官能基(例如分子、離子及/或配位體)。將外源性標籤或報導子連接至探針允許經由偵測外源性標籤或報導子之存在鑑別靶標。探針之實例可包括蛋白質、核酸(例如DNA、RNA)分子、脂質及抗體探針。外源性標記物及官能基之組合可形成用於偵測之任何適合的探針、標籤及/或標記，其包括分子探針、標記探針、雜交探針、抗體探針、蛋白質探針(例如生物素結合探針)、酶標記、螢光探針、螢光標籤及/或酶報導子。 雖然本發明參考發光標記物，可與本文所提供之裝置、系統及方法一起使用其他類型的標記物。此類標記物可為質量標籤、靜電標籤、電化學標記或其任何組合。 儘管可將外源性標記物添加至樣品中，內源性標記物可已為樣品之一部分。內源性標記物可包括存在的任何發光標記物，其可在激發能量存在下發光或「自體螢光」。內源性螢光團之自體螢光可在不需要引入外源性螢光團之情況下提供無標記及非侵入性標記。藉助於實例而非限制，此類內源性螢光團之實例可包括血紅蛋白、氧血紅素、脂質、膠原蛋白及彈性蛋白交聯、減少的菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、經氧化之黃素(FAD及FMN)、脂褐質、角蛋白及/或卟啉。 已識別到，需要用於進行單分子偵測及/或核酸定序之簡單較不複雜設備，本發明人構想使用發光標籤組(例如發光標記物、發光標記)標記不同分子來偵測單分子之技術。此類單分子可為具有標籤之核苷酸或胺基酸。可在鍵結至單分子時，在自單分子釋放後，或在鍵結至單分子及自單分子釋放後偵測到標籤。在一些實例中，標籤為發光標籤。所選組中之各發光標籤與各別分子相關。舉例而言，一組四個標籤可用於「標記」與不同核鹼基相連的該組之各DNA標籤中存在之核鹼基，例如第一標籤與腺嘌呤(A)相連，第二標籤與胞嘧啶(C)相連，第三標籤與鳥嘌呤(G)相連，且第四標籤與胸腺嘧啶(T)相連。此外，該組標籤中之發光標籤中之每一者具有不同特性，其可用於將該組之第一標籤與該組中之其他標籤區別開來。以此方式，各標籤為使用此等區別性特徵中之一或多者獨特地可鑑別的。藉助於實例而非限制，可用於將一個標籤與另一個區別開來之標籤之特徵可包括標籤響應於激發能量發射之光之發射能量及/或波長、由特定標籤吸收以使標籤處於激發態下之激發光之波長及/或標籤之發射壽命。定序 本申請案之一些態樣適用於對生物學聚合物，諸如核酸及蛋白質進行定序。在一些實施例中，本申請案中描述之方法、組合物及裝置可用於鑑別併入核酸或蛋白質中(例如藉由偵測一系列標記核苷酸或胺基酸單體之併入時程)之一系列核苷酸或胺基酸單體。在一些實施例中，本申請案中描述之方法、組合物及裝置可用於鑑別併入藉由聚合酶合成之模板依賴性核酸定序反應產物中之一系列核苷酸。 在某些實施例中，藉由天然存在之核酸聚合酶進行模板依賴性核酸定序產物。在一些實施例中，聚合酶為天然存在之聚合酶之突變體或經修飾之變體。在一些實施例中，模板依賴性核酸序列產物將包含與模板核酸股互補之一或多種核苷酸鏈段。在一個態樣中，本申請案提供一種藉由測定其互補核酸股之序列來測定模板(或靶)核酸股之序列的方法。 如本文所使用，術語「聚合酶」一般係指能夠催化聚合反應之任何酶(或聚合酶)。聚合酶之實例包括(但不限於)核酸聚合酶、轉錄酶或連接酶。聚合酶可為聚合反應酶。 針對單分子核酸延伸部分(例如用於核酸定序)之實施例可使用能夠合成與靶核酸分子互補之核酸之任何聚合酶。在一些實施例中，聚合酶可為DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶及/或其一或多種突變體或改變形式。 聚合酶之實例包括(但不限於)DNA聚合酶、RNA聚合酶、熱穩定聚合酶、野生型聚合酶、經修飾聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、噬菌體T4 DNA聚合酶φ29 (psi29)DNA聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tca聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、鉑Taq聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tth聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、克列諾(Klenow)片段、具有3'至5'外切核酸酶活性之聚合酶及其變體、經修飾之產物及衍生物。在一些實施例中，該聚合酶為單一次單元聚合酶。DNA聚合酶之非限制性實例及其特性詳細描述於DNA Replication第2版, Kornberg及Baker, W. H. Freeman, New York, N.Y. (1991)及其他位置中。 在靶核酸之核鹼基與互補dNTP之間鹼基配對後，聚合酶藉由在新合成的股之3'羥基末端與dNTP之α磷酸酯之間形成磷酸二酯鍵將dNTP併入新合成的核酸股中。在共軛至dNTP之發光標籤為螢光團之實例中，用激發信號表示其存在且在併入步驟期間或之後偵測到發射脈衝。對於共軛至dNTP之末端(γ)磷酸酯之偵測標記物，將dNTP併入新合成的股中使得β及γ磷酸酯及偵測標記釋放，其自由擴散於樣品槽中，導致自螢光團偵測之發射降低。 在一些實施例中，聚合酶為具有較高持續合成能力之聚合酶。然而，在一些實施例中，聚合酶為具有降低的持續合成能力之聚合酶。聚合酶持續合成能力一般係指聚合酶將dNTP連續併入核酸模板中而不釋放核酸模板之能力。在一些實施例中，聚合酶為具有較低5'-3'外切核酸酶活性及/或3'-5'核酸外切酶之聚合酶。在一些實施例中，相對於對應的野生型聚合酶，聚合酶經修飾(例如藉由胺基酸取代)以具有降低的5'-3'外切核酸酶活性及/或3'-5'活性。DNA聚合酶之其他非限制性實例包括9°Nm™ DNA聚合酶(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs))及克列諾外聚合酶之P680G突變體(Tuske等人(2000) JBC 275(31):23759-23768)。在一些實施例中，具有降低的持續合成能力之聚合酶提供對含有一或多種核苷酸重複序列之延伸部分(例如兩個或多於兩個相同類型依序鹼基)之模板進行定序之提高的準確度。在一些實施例中，聚合酶為相比於未經標記之核酸對標記核苷酸具有更高親和性之聚合酶。 在另一態樣中，本申請案提供藉由對多個核酸片段進行定序來定序靶核酸之方法，其中靶核酸包含片段。在某些實施例中，該方法包含組合多個片段序列以提供親代靶核酸之序列或部分序列。在一些實施例中，組合步驟藉由電腦硬體及軟體進行。本文所描述之方法可允許一組相關靶核酸，諸如待定序之整個染色體或基因組。 在定序期間，聚合酶可耦接(例如連接)至靶核酸分子之引發位置。引發位置可為與靶核酸分子之一部分互補之引物。作為替代方案，引發位置為提供於靶核酸分子之雙股鏈段內之間隙或切口。間隙或切口可具有0至至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或40個核苷酸。切口可在雙股序列之一個股中提供斷裂，其可為聚合酶提供引發位置，諸如股置換聚合酶。 在一些情況下，定序引物可緩冷配對至靶核酸分子，其可或可不固定化於固體載體。固體載體可包含例如用於核酸定序之晶片上之樣品槽(例如奈米孔口、反應腔室)。在一些實施例中，定序引物可固定化於固體載體且靶核酸分子之雜交亦使靶核酸分子固定化於固體載體。在一些實施例中，聚合酶固定化於固體載體且使可溶性引物及靶核酸與聚合酶接觸。然而，在一些實施例中，包含聚合酶、靶核酸及引物之複合物在溶液中形成且使複合物固定化於固體載體(例如經由聚合酶、引物及/或靶核酸之固定化)。在一些實施例中，樣品槽(例如奈米孔口、反應腔室)中之組分中無一者固定化於固體載體。舉例而言，在一些實施例中，包含聚合酶、靶核酸及引物之複合物在溶液中形成且複合物不固定化於固體載體。 在適當的條件下，與緩冷配對引物/靶核酸接觸之聚合酶可將一或多種核苷酸添加或併入引物中，且核苷酸可以5'至3'模板依賴性方式添加至引物中。此類核苷酸併入引物上(例如經由聚合酶之作用)可一般稱作引物延伸反應。各核苷酸可與可偵測標籤相關聯，該標籤可在核酸延伸反應期間偵測及鑑別出(例如基於其發光壽命及/或其他特性)且用於測定併入延伸的引物及因此新合成的核酸分子之序列中之各核苷酸。經由新合成的核酸分子之序列互補性，亦可測定靶核酸分子之序列。在一些情況下，定序引物緩冷配對至靶核酸分子及核苷酸併入至定序引物可在類似反應條件(例如相同或類似反應溫度)下或在不同反應條件(例如不同反應溫度)下進行。在一些實施例中，藉由合成方法進行定序可包括靶核酸分子(例如靶核酸之複本)之群體之存在及/或擴增靶核酸以獲得靶核酸之群體之步驟。然而，在一些實施例中，藉由合成進行定序用於測定待評估之各反應物中之單分子之序列(且不需要核酸擴增以製備用於定序之靶模板)。在一些實施例中，根據本申請案之態樣，並行(例如在單一芯片上)進行多個單分子定序反應。舉例而言，在一些實施例中，多個單分子定序反應各自在單一芯片上單獨的反應腔室(例如奈米孔口、樣品槽)中進行。 實施例能夠以較高準確度及較長讀取長度對單一核酸分子進行定序，諸如準確度為至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、99.999%或99.9999%，及/或讀取長度大於或等於約10個鹼基對(bp)、50 bp、100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1000 bp、10,000 bp、20,000 bp、30,000 bp、40,000 bp、50,000 bp或100,000 bp。在一些實施例中，單分子定序中使用之靶核酸分子為添加或固定化於含有固定化或連接至固體載體(諸如樣品槽之底部或側壁)之定序反應物之至少一種額外組分(例如聚合酶，諸如DNA聚合酶、定序引物)之樣品槽(例如奈米孔口)的單股靶核酸(例如去氧核糖核酸(DNA)、DNA衍生物、核糖核酸(RNA)、RNA衍生物)模板。靶核酸分子或聚合酶可直接或經由連接子連接至樣品壁，諸如在樣品槽之底部或側壁。樣品槽(例如奈米孔口)亦可含有經由引物延伸反應核酸合成所需的任何其他試劑，諸如適合的緩衝劑、輔助因子、酶(例如聚合酶)及聚磷酸去氧核苷，諸如例如三磷酸去氧核苷，包括三磷酸去氧腺苷(dATP)、三磷酸去氧胞苷(dCTP)、三磷酸去氧鳥苷(dGTP)、三磷酸去氧尿苷(dUTP)及三磷酸去氧胸苷(dTTP)、包括諸如螢光團之發光標籤之dNTP。在一些實施例中，各類別dNTP(例如含有腺嘌呤之dNTP (例如dATP)、含有胞嘧啶之dNTP (例如dCTP)、含有鳥嘌呤之dNTP (例如dGTP)、含有尿嘧啶之dNTP (例如dUTP)及含有胸腺嘧啶之dNTP (例如dTTP))共軛至不同發光標籤以使得自標籤發射之光之偵測指示併入新合成的核酸中之dNTP之一致性。經由任何適合的裝置及/或方法，包括用於本文中其他處描述之偵測之此類裝置及方法，可偵測到自發光標籤發射的光且歸因於其適當的發光標籤(及因此相關dNTP)。發光標籤可在任何位置處共軛至dNTP以使得發光標籤之存在不抑制dNTP併入新合成的核酸股中或聚合酶之活性。在一些實施例中，發光標籤共軛至dNTP之末端磷酸酯(例如γ磷酸酯)。 在一些實施例中，單股靶核酸模板可與定序引物、dNTP、聚合酶及核酸合成所必需的其他試劑接觸。在一些實施例中，所有適當的dNTP可與單股靶核酸模板同時(例如所有dNTP同時存在)接觸以使得dNTP之併入可持續進行。在其他實施例中，dNTP可與單股靶核酸模板依次接觸，其中單股靶核酸模板與各適當的dNTP單獨接觸，其中洗滌步驟在單股靶核酸模板與不同dNTP接觸之間。對於待鑑別之單股靶核酸模板之各連續鹼基位置，可重複使單股靶核酸模板與各dNTP單獨接觸繼而洗滌之此類循環。 在一些實施例中，定序引物緩冷配對至單股靶核酸模板且聚合酶基於單股靶核酸模板連續地將dNTP(或其他聚磷酸去氧核苷)併入引物中。與各併入的dNTP相關的獨特發光標籤可在dNTP併入引物期間或之後用適當的激發光激發，且可隨後使用任何適合的裝置及/或方法(包括本文中其他處描述之用於偵測之裝置及方法)偵測其發射。特定光發射(例如具有特定發射壽命、強度、光譜及/或其組合)之偵測可歸因於併入的特定dNTP。獲自偵測到的發光標籤之採集之序列可隨後用於經由序列互補性測定單股靶核酸模板之序列。 儘管本發明參考dNTP，本文所提供之裝置、系統及方法可與各種類型的核苷酸，諸如核糖核苷酸及去氧核糖核苷酸(例如具有至少4、5、6、7、8、9或10個磷酸酯基團之聚磷酸去氧核苷)一起使用。此類核糖核苷酸及去氧核糖核苷酸可包括各種類型的標籤(或標記物)及連接子。在一些實施例中，本發明提供可有利地用於同在申請中之美國專利申請案第14/543,865號、第14/543,867號、第14/543,888號、第14/821,656號、第14/821,686號、第14/821,688號、第15/161,067號、第15/161,088號、第15/161,125號、第15/255,245號、第15/255,303號、第15/255,624號、第15/261,697號、第15/261,724號、第62/289,019號、第62/296,546號、第62/310,398號、第62/339,790號、第62/343,997號、第62/344,123號及第62/426,144號中所描述之技術中的方法及組合物，其中之每一者之內容以引用之方式併入本文中。核酸定序之實例 以下實例意謂說明本文所描述之一些方法、組合物及裝置。實例之所有態樣為非限制性的。圖1示意性地說明單分子核酸定序方法之設備。1-110為經配置以含有單一複合物之樣品槽(例如奈米孔口、反應腔室)，該複合物包含核酸聚合酶1-101、待定序靶核酸1-102及引物1-104。在本實例中，樣品槽1-110之底部區描繪為目標體積(例如激發區域) 1-120。 如本文中其他處所描述，目標體積為引導朝向激發能量之體積。在一些實施例中，體積為樣品槽體積及激發能量偶合至樣品槽之特性。目標體積可經配置以限制目標體積中受限制之分子或複合物之數目。在一些實施例中，目標體積經配置以限制單分子或複合物。在一些實施例中，目標體積經配置以限制單一聚合酶複合物。在圖1中，包含聚合酶1-101之複合物受限於目標體積1-120中。複合物可視需要藉由連接至樣品槽表面固定化。用於樣品槽表面處理及官能化之例示性方法進一步詳細論述於本申請案中之其他處。在本實例中，藉由包含適於連接子連接至聚合酶1-101之一或多種生物分子(例如、生物素)之連接子1-103使複合物固定化。 孔口之體積亦含有具有聚合酶複合物所必需的適合的溶劑、緩衝劑及其他添加劑之反應混合物以合成核酸股。反應混合物亦含有多種類型經發光標記之核苷酸。各類型核苷酸由符號*-A、@-T、$-G、#-C表示，其中A、T、G及C表示核苷酸鹼基，且符號*、@、$及#表示經由連接子-連接至各核苷酸之獨特發光標記。在圖1中，#-C核苷酸目前併入互補股1-102中。併入的核苷酸在目標體積1-120內。 圖1亦用箭頭指示遞送至目標體積附近之激發能量及朝向偵測器發射之發光之概念。箭頭為示意性的，且不意謂指示激發能量遞送或發光之特定方向。在一些實施例中，激發能量為來自光源之光脈衝。激發能量可行進通過一或多種裝置組件，諸如在光源與目標體積附近之間的波導或濾光器。發射能量亦可行進通過一或多種裝置組件，諸如在發光分子與偵測器之間的波導或濾光器。一些發光可發射在載體上，其未引導至偵測器(例如朝向樣品槽之側壁)且可不被偵測到。 圖2示意性地說明隨時間推移單一樣品槽(例如奈米孔口)中之定序方法。階段A至D描繪具有如圖1中之聚合酶複合物之樣品槽。階段A描繪在任何核苷酸添加至引物中之前的初始狀態。階段B描繪經發光標記之核苷酸(#-C)之併入事件。階段C描繪併入事件之間的時間段。在本實例中，核苷酸C已添加至引物中，且先前連接至經發光標記之核苷酸(#-C)之標記及連接子已裂解。階段D描繪經發光標記之核苷酸(*-A)之第二併入事件。在階段D之後的互補股由引物、C核苷酸及A核苷酸組成。 階段A及C均描繪併入事件之前或之間的時間段，其在本實例中指定持續約10毫秒。在階段A及C中，因為不存在併入的核苷酸，所以在目標體積中不存在經發光標記之核苷酸(圖2中未繪出)，但可偵測出背景發光或來自未併入之經發光標記之核苷酸之偽發光。階段B及D展示不同核苷酸(分別#-C及*-A)之併入事件。在本實例中，此等事件亦指定持續約10毫秒。 列標記「原始頻段資料」描繪在各階段期間產生之資料。在實例實驗通篇，將多個光脈衝遞送至目標體積附近。對於各脈衝，偵測器經配置以記錄偵測器接受之任何發射光子。當偵測器接受發射光子時，將其分離成多個時間頻段(在本實例中存在3個)中之一者。在一些實施例中，偵測器經配置有2與16之間的時間頻段。「原始頻段資料」記錄分別對應於最短、中間及最長頻段的1 (最短條柱)、2 (中等條柱)或3 (最長條柱)之值。各條柱指示發射光子之偵測。 因為對於階段A或C，目標體積中不存在經發光標記之核苷酸，所以未偵測到光子。對於階段B及D中之每一者，在併入事件期間偵測到多個光子發射事件(如本文所使用之發光事件或「發光」)。發光標記#具有比發光標記*更短的發光壽命。階段B資料因此描繪為記錄有低於頻段值更高之階段D之平均頻段值。 列標記「處理資料」描繪已經處理以指示有時相對於各脈衝之發射光子之數目(計數)之原始數據。因為各條柱對應於特定時間頻段之光子計數，所以描繪經處理資料之例示性曲線對應於包含比圖中描述之三個時間頻段更多的時間頻段之原始頻段資料。在本實例中，該資料僅經處理以測定發光壽命，但該資料亦可評估其他發光特性，諸如吸收或發射的光子之發光強度或波長。例示性經處理資料接近目標體積中發光標記之發光壽命之指數衰變曲線特徵。因為發光標記#具有比發光標記*更短的發光壽命，階段B之經處理資料在更長持續時間具有更少計數，而階段D之經處理資料在更長持續時間具有相對更多的計數。 圖2之實例實驗將鑑別添加至互補股中作為CA之前兩個核苷酸。對於DNA，緊接在緩冷配對至引物之區域之後的靶股之序列將因此鑑別為GT。在本實例中，單獨基於發光壽命，核苷酸C及A可與多種C、G、T及A區別開來。在一些實施例中，諸如吸收或發射的光子之發光強度或波長之其他特性可為區別一或多種特定核苷酸所必要的。 在核苷酸併入後發射之信號可儲存於記憶體中且在稍候的時間處理以測定靶核酸模板之序列。此可包括將信號與參考信號進行比較以測定隨時間變化併入的核苷酸之一致性。替代地或另外，可實時採集及處理(例如在核苷酸併入後)在核苷酸併入後發射之信號以實時測定靶核酸模板之序列。 如本文所使用，術語「核酸」一般係指包含一或多種核酸次單元之分子。核酸可包括一或多種選自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)或其變體之次單元。在一些實例中，核酸為去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其衍生物。核酸可為單股或雙股的。核酸可為環狀的。 如本文所使用，術語「核苷酸」一般係指核酸次單元，其可包括A、C、G、T或U或其變體或類似物。核苷酸包括可併入生長核酸股中之任何次單元。此類次單元可為對一或多種互補A、C、G、T或U具有特異性或與嘌呤(例如A或G或其變體或類似物)或嘧啶(例如C、T或U或其變體或類似物)互補的A、C、G、T或U或任何其他次單元。次單元可獲得待分解之單獨的核酸鹼基或鹼基組(例如AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或其尿嘧啶對應物)。 核苷酸一般包括核苷及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多於10個磷酸酯(PO₃ )基團。核苷酸包括核鹼基、五碳糖(核糖或去氧核糖)及一或多種磷酸酯基團。核糖核苷酸為核苷酸，其中該糖為核糖。去氧核糖核苷酸為核苷酸，其中該糖為去氧核糖。核苷酸可為單磷酸核苷或聚磷酸核苷。核苷酸可為聚磷酸去氧核苷，諸如例如三磷酸去氧核苷，其可選自三磷酸去氧腺苷(dATP)、三磷酸去氧胞苷(dCTP)、三磷酸去氧鳥苷(dGTP)、三磷酸去氧尿苷(dUTP)及三磷酸去氧胸苷(dTTP)、包括諸如發光標籤或標記物(例如螢光團)之可偵測標籤之dNTP。 聚磷酸核苷可具有『n』個磷酸酯基團，其中『n』為大於或等於2、3、4、5、6、7、8、9或10之數目。聚磷酸核苷之實例包括二磷酸核苷及三磷酸核苷。核苷酸可為末端磷酸酯標記之核苷，諸如末端磷酸酯標記之聚磷酸核苷。此類標記可為發光(例如螢光或化學發光)標記、螢光標記、著色標記、顯色標記、質量標籤、靜電標記或電化學標記。標記(或標記物)可經由連接子耦接至末端磷酸酯。連接子可包括例如至少一個或多個羥基、硫氫基、胺基或鹵烷基，其可適於在天然或經修飾之核苷酸之末端磷酸酯處形成例如磷酸酯、硫酯、胺基磷酸酯或烷基膦酸酯鍵。連接子可為可裂解的以便自末端磷酸酯分離標記，諸如藉助於聚合反應酶。核苷酸及連接子之實例提供於美國專利第7,041,812號中，其全部以引用之方式併入本文中。 核苷酸(例如聚磷酸核苷酸)可包含甲基化核鹼基。舉例而言，甲基化核苷酸可為包含連接至核鹼基(例如直接連接至核鹼基之環，連接至核鹼基之環之取代基)之一或多個甲基之核苷酸。例示性甲基化核鹼基包括1-甲基胸腺嘧啶、1-甲基尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6,N6-二甲基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、N2-甲基鳥嘌呤及N2,N2-二甲基鳥嘌呤。 如本文所使用，術語「引物」一般係指核酸分子(例如寡核苷酸)，其可包括包含A、C、G、T及/或U或其變體或類似物之序列。引物可為包含DNA、RNA、PNA或其變體或類似物之合成寡核苷酸。引物可經設計以使得其核苷酸序列與靶股互補，或引物可包含無規核苷酸序列。在一些實施例中，引物可包含尾部(例如聚A尾部、索引銜接子、分子條碼等)。在一些實施例中，引物可包含5至15個鹼基，10至20個鹼基，15至25個鹼基，20至30個鹼基，25至35個鹼基，30至40個鹼基，35至45個鹼基，40至50個鹼基，45至55個鹼基，50至60個鹼基，55至65個鹼基，60至70個鹼基，65至75個鹼基，70至80個鹼基，75至85個鹼基，80至90個鹼基，85至95個鹼基，90至100個鹼基，95至105個鹼基，100至150個鹼基，125至175個鹼基，150至200個鹼基，或大於200個鹼基。發光特性 如本文所描述，發光分子為吸收一或多個光子且可隨後在一或多個持續時間之後發射一或多個光子的分子。藉由若干參數描述分子之發光，該等參數包括(但不限於)發光壽命、吸收光譜、發射光譜、發光量子產率及發光強度。術語吸收及激發在本申請案通篇可互換使用。典型的發光分子可吸收多種波長處之光或藉由多種波長處之光進行激發。在某些波長處或在某些光譜範圍內之激發可藉由發光發射事件弛豫，而在某些其他波長或光譜範圍處之激發可不藉由發光發射事件弛豫。在一些實施例中，發光分子僅適當地在單一波長處或在單一光譜範圍內激發發光。在一些實施例中，發光分子適當地在兩個或多於兩個波長處或在兩個或多於兩個光譜範圍內激發發光。在一些實施例中，藉由量測激發光子或吸收光譜之波長鑑別分子。 來自發光發射事件之發射光子將在可能的波長之光譜範圍內之波長處發射。典型地，相比於激發光子之波長，發射光子具有更長波長(例如具有更小能量或紅移)。在某些實施例中，藉由量測發射光子之波長鑑別分子。在某些實施例中，藉由量測多個發射光子之波長鑑別分子。在某些實施例中，藉由量測發射光譜鑑別分子。 發光壽命係指激發事件與發射事件之間的持續時間。在一些實施例中，發光壽命表示為指數衰變之等式中之常數。在一些實施例中，其中存在遞送激發能量之一或多個脈衝事件，持續時間為該脈衝與後續發射事件之間的時間。 分子之「發光壽命測定」可使用任何適合的方法(例如藉由使用適合的技術量測壽命或藉由測定發射之時間依賴性特徵)進行。在一些實施例中，測定分子之發光壽命包含相對於一或多種分子(例如定序反應物中之不同經發光標記之核苷酸)測定壽命。在一些實施例中，測定分子之發光壽命包含相對於參照測定壽命。在一些實施例中，測定分子之發光壽命包含量測壽命(例如螢光壽命)。在一些實施例中，測定分子之發光壽命包含測定指示壽命之一或多種時間特徵。在一些實施例中，分子之發光壽命可基於相對於激發脈衝橫跨一或多個時間閘控窗存在之多個發射事件之分佈(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或多於100個發射事件)而測定。舉例而言，基於相對於激發脈衝量測之光子出現時間之分佈，單分子之發光壽命可區別於具有不同發光壽命之多個分子。 應瞭解，單分子之發光壽命指示在單分子達到激發態之後發射之光子之時序，且單分子因指示光子時序之資訊可為突出的。一些實施例可包括藉由量測與分子發射之光子相關的時間，基於分子之發光壽命，區別分子與多個分子。時間分佈可提供可自分佈測定之發光壽命之指示。在一些實施例中，基於時間分佈，諸如藉由將時間分佈與對應於已知分子之參考分佈進行比較，單分子可區別於多種分子。在一些實施例中，發光壽命之值由時間分佈測定。 發光量子產率係指在產生發射事件之給定波長處或給定光譜範圍內激發事件之分數且典型地低於1。在一些實施例中，本文所描述之分子之發光量子產率在0與約0.001之間，在約0.001與約0.01之間，在約0.01與約0.1之間，在約0.1與約0.5之間，在約0.5與0.9之間，或在約0.9與1之間。在一些實施例中，藉由測定或估算發光量子產率鑑別分子。 如本文針對單分子所使用，發光強度係指每單位時間藉由遞送脈衝激發能量激發之分子所發射的發射光子之數目。在一些實施例中，發光強度係指每單位時間藉由遞送脈衝激發能量激發之分子所發射之發射光子之偵測到的數目且藉由特定感測器或感測器組偵測。 在不同條件下，給定分子之發光壽命、發光量子產率及發光強度可各自變化。在一些實施例中，單分子將具有與分子集合不同之觀測到的發光壽命、發光量子產率或發光強度。在一些實施例中，受限於樣品槽(例如奈米孔口)中之分子將具有與未受限於樣品槽中之分子不同的觀測到的發光壽命、發光量子產率或發光強度。在一些實施例中，連接至另一分子之發光標記或發光分子將具有與未連接至另一分子之發光標記或發光分子不同的發光壽命、發光量子產率或發光強度。在一些實施例中，與大分子複合物(例如蛋白質複合物(例如核酸聚合酶))相互作用之分子將具有與不與大分子複合物相互作用之分子不同的發光壽命、發光量子產率或發光強度。 在某些實施例中，本申請案中描述之發光分子在持續時間之後吸收一個光子且發射一個光子。在一些實施例中，可藉由量測持續時間測定或估算分子之發光壽命。在一些實施例中，可藉由量測多個脈衝事件及發射事件之多個持續時間來測定或估算分子之發光壽命。在一些實施例中，可藉由量測持續時間，在多種類型分子之發光壽命中區分分子之發光壽命。在一些實施例中，可藉由量測多個脈衝事件及發射事件之多個持續時間，在多種類型分子之發光壽命中區分分子之發光壽命。在某些實施例中，藉由測定或估算分子之發光壽命，在多種類型分子中鑑別或區分分子。在某些實施例中，藉由在多種類型分子之多個發光壽命中區分分子之發光壽命，在多種類型分子中鑑別或區分分子。 在某些實施例中，發光發射事件為螢光。在某些實施例中，發光發射事件為磷光。如本文所使用，術語發光涵蓋包括螢光及磷光兩者之所有發光事件。 在一個態樣中，本申請案提供一種測定單一發光分子之發光壽命之方法，其包含：在目標體積中提供發光分子；將多個激發能量脈衝遞送至目標體積附近；及偵測來自發光分子之多次發光。在一些實施例中，該方法進一步包含評估各對脈衝與發光之間的多個持續時間之分佈。在一些實施例中，該方法進一步包含使單一發光分子固定化於目標體積中。 在另一態樣中，本申請案提供一種測定多個分子之發光壽命之方法，其包含：在目標體積中提供多個發光分子；將多個激發能量脈衝遞送至目標體積附近；及偵測來自發光分子之多次發光。在一些實施例中，該方法進一步包含評估各對脈衝與發光之間的多個持續時間之分佈。在一些實施例中，該方法進一步包含使發光分子固定化於目標體積中。在一些實施例中，多個由以下組成：在2與約10個分子之間，在約10與約100個分子之間，或在約100與約1000個分子之間。在一些實施例中，多個由以下組成：在約1000與約10⁶ 個分子之間，在約10⁶ 與約10⁹ 個分子之間，在約10⁹ 與約10¹² 個分子之間，在約10¹² 與約10¹⁵ 個分子之間，或在約10¹⁵ 與約10¹⁸ 個分子之間。在一些實施例中，多個之所有分子為相同類型的分子。 圖3展示具有不同發光壽命(最長至最短，頂部至底部)之四個發光分子之例示性衰變曲線3-1。幅值可指來自包含多種分子之樣品之發光強度，其在基於發光壽命之初始激發之後隨時間推移以指數方式降低。幅值可替代地指在例如單分子之多個激發能量脈衝後的持續時間之後偵測到的發射之數目或計數。對於具有不同發光壽命(最短至最長，頂部至底部)之四個發光分子，標準化累積分佈函數3-2對應於3-1。CDF可表示在基於發光壽命之初始激發之後隨時間推移達到零(例如已發光的所有激發分子之累積機率)之發光幅值之標準化機率。CDF可替代地表示在單一脈衝之後或在多個激發能量脈衝中之每一者之後特定持續時間發射發光之單分子之標準化機率。 在一個態樣中，本申請案提供一種測定單一發光分子之發光強度之方法，其包含：在目標體積中提供發光分子；將多個激發能量脈衝遞送至目標體積附近；及偵測來自發光分子之多次發光。在一些實施例中，該方法進一步包含測定每單位時間多個偵測到的發光之數目。在一些實施例中，該方法進一步包含使單一發光分子固定化於目標體積中。 在另一態樣中，本申請案提供一種測定多個分子之發光強度之方法，其包含：在目標體積中提供多個發光分子；將多個激發能量脈衝遞送至目標體積附近；及偵測來自發光分子之多次發光。在一些實施例中，該方法進一步包含測定每單位時間多個偵測到的發光之數目。在一些實施例中，該方法進一步包含使發光分子固定化於目標體積中。在一些實施例中，多個由以下組成：在2與約10個分子之間，在約10與約100個分子之間，或在約100與約1000個分子之間。在一些實施例中，多個由以下組成：在約1000與約10⁶ 個分子之間，在約10⁶ 與約10⁹ 個分子之間，在約10⁹ 與約10¹² 個分子之間，在約10¹² 與約10¹⁵ 個分子之間，或在約10¹⁵ 與約10¹⁸ 個分子之間。在一些實施例中，多個之所有分子為相同類型的分子。激發能量 在本文所描述之方法之一個態樣中，一或多種激發能量用於激發待鑑別或區別(例如在定序反應期間)之分子之發光標記。在一些實施例中，激發能量在可見光譜中。在一些實施例中，激發能量在紫外線光譜中。在一些實施例中，激發能量在紅外線光譜中。在一些實施例中，一種激發能量用於激發經發光標記之分子。在一些實施例中，兩種激發能量用於激發經發光標記之分子。在一些實施例中，三種或大於三種激發能量用於激發經發光標記之分子。在一些實施例中，各經發光標記之分子僅藉由遞送的激發能量中之一者激發。在一些實施例中，經發光標記之分子藉由遞送的激發能量中之兩者或多於兩者激發。在某些實施例中，激發能量可為單色或受限於光譜範圍。在一些實施例中，光譜範圍具有約0.1 nm與約1 nm之間，約1 nm與約2 nm之間，或約2 nm與約5 nm之間的範圍。在一些實施例中，光譜範圍具有約5 nm與約10 nm之間，約10 nm與約50 nm之間，或約50 nm與約100 nm之間的範圍。 在某些實施例中，激發能量遞送為光脈衝。在某些實施例中，激發能量遞送為多個光脈衝。在某些實施例中，兩種或多於兩種激發能量用於激發經發光標記之分子。在一些實施例中，各激發能量同時遞送(例如在各脈衝中)。在一些實施例中，各激發能量在不同時間遞送(例如在各能量之單獨脈衝中)。不同激發能量可在足以允許偵測來自靶分子之發光之任何圖案中遞送。在一些實施例中，兩個激發能量在各脈衝中遞送。在一些實施例中，第一激發能量及第二激發能量在交替脈衝中遞送。在一些實施例中，第一激發能量在一系列依序脈衝中遞送，且第二激發能量在後續系列依序脈衝或此類系列之交替圖案中遞送。 在某些實施例中，基於經發光標記之分子之發光特性，選擇光脈衝之頻率。在某些實施例中，基於多種經發光標記之核苷酸之發光特性，選擇光脈衝之頻率。在某些實施例中，基於多種經發光標記之核苷酸之發光壽命，選擇光脈衝之頻率。在一些實施例中，選擇頻率以使得脈衝之間的間隙長於一或多種經發光標記之核苷酸之發光壽命。在一些實施例中，基於多種經發光標記之核苷酸之最長發光壽命，選擇頻率。舉例而言，若四種經發光標記之核苷酸之發光壽命為0.25、0.5、1.0及1.5 ns，則可選擇光脈衝之頻率以使得脈衝之間的間隙超過1.5 ns。在一些實施例中，間隙比一或多種激發的經發光標記之分子之發光壽命長約兩倍與約十倍之間，在約十倍與約100倍之間，或在約100倍與約1000倍之間。在一些實施例中，間隙比一或多種激發的經發光標記之分子之發光壽命長約10倍。在一些實施例中，間隙在約0.01 ns與約0.1 ns之間，在約1 ns與約5 ns之間，在約5 ns與約15 ns之間，在約15 ns與約25 ns之間，或在約25 ns與約50 ns之間。在一些實施例中，選擇間隙以使得該脈衝激發之分子將以發光方式衰變或激發態將藉由另一機制弛豫之機率為50%、75%、90%、95%或99%。 在某些實施例中，其中存在多種激發能量，各激發能量之脈衝之頻率相同。在某些實施例中，其中存在多種激發能量，各激發能量之脈衝之頻率不同。舉例而言，若紅色雷射用於激發壽命為0.2及0.5 ns之發光分子且綠色雷射用於激發壽命為5 ns及7 ns之發光分子，則在各紅色雷射脈衝之後的間隙可比各綠色雷射脈衝(例如20 ns)之後的間隙短(例如5 ns)。 在某些實施例中，基於監測之化學方法選擇脈衝式激發能量之頻率。對於定序反應，可選擇頻率以使得遞送足以允許偵測足夠數目個待偵測發射光子之多個脈衝。在偵測到的光子之情況下，足夠數目係指自多種經發光標記之核苷酸鑑別或區別經發光標記之核苷酸所必要的多種光子。舉例而言，DNA聚合酶可平均每20毫秒併有額外核苷酸一次。經發光標記之核苷酸與複合物相互作用之時間可為約10毫秒，且發光標記物裂解時與下一經發光標記之核苷酸開始相互作用之間的時間可為約10毫秒。可隨後選擇脈衝激發能量之頻率以歷經10毫秒遞送足夠脈衝，從而使得在併入經發光標記之核苷酸時的10毫秒期間偵測到足夠數目個發射光子。舉例而言，在100 MHz之頻率下，在10毫秒(併入事件之大致長度)內將存在1百萬脈衝。若此等脈衝之0.1%產生偵測到的光子，則將存在1,000個可分析之發光資料點以測定併入之經發光標記之核苷酸之一致性。上述值中之任一者為非限制性的。在一些實施例中，併入事件可進行1 ms與20 ms之間，20 ms與100 ms之間，或100 ms與500 ms之間。在一些實施例中，其中在單獨定時之脈衝中遞送多種激發能量，經發光標記之核苷酸可僅藉由該等脈衝之一部分激發。在一些實施例中，選擇多種激發能量脈衝之頻率及圖案以使得脈衝之數目足以激發多種經發光標記之核苷酸中之任一者以允許偵測足夠數目個發射光子。 在一些實施例中，脈衝頻率在約1 MHz與約10 MHz之間。在一些實施例中，脈衝頻率在約10 MHz與約100 MHz之間。在一些實施例中，脈衝頻率在約100 MHz與約1 GHz之間。在一些實施例中，脈衝頻率在約50 MHz與約200 MHz之間。在一些實施例中，脈衝頻率為約100 MHz。在一些實施例中，頻率為隨機的。 在某些實施例中，激發能量在約500 nm與約700 nm之間。在一些實施例中，激發能量在約500 nm與約600 nm之間，或約600 nm與約700 nm之間。在一些實施例中，激發能量在約500 nm與約550 nm之間，在約550 nm與約600 nm之間，在約600 nm與約650 nm之間，或在約650 nm與約700 nm之間。 在某些實施例中，本文所描述之方法包含遞送兩種激發能量。在一些實施例中，兩種激發能量間隔約5 nm與約20 nm之間，約20 nm與約40 nm之間，約40 nm與約60 nm之間，約60 nm與約80 nm之間，約80 nm與約100 nm之間，約100 nm與約150 nm之間，約150 nm與約200 nm之間，約200 nm與約400 nm之間，或至少約400 nm之間。在一些實施例中，兩種激發能量間隔約20 nm與約80 nm之間，或約80 nm與約160 nm之間。 當激發能量提及為在特定範圍內時，激發能量可包含單一波長以使得波長在範圍端點之間或範圍端點處，或激發能量可包含具有最大強度之波長之光譜以使得最大強度在範圍端點之間或範圍端點處。 在某些實施例中，第一激發能量在450 nm至500 nm範圍內，且第二激發能量在500 nm至550 nm，550 nm至600 nm，600 nm至650 nm，或650 nm至700 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在500 nm至550 nm範圍內，且第二激發能量在450 nm至500 nm，550 nm至600 nm，600 nm至650 nm，或650 nm至700 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在550 nm至600 nm範圍內，且第二激發能量在450 nm至500 nm，500 nm至550 nm，600 nm至650 nm，或650 nm至700 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在600 nm至650 nm範圍內，且第二激發能量在450 nm至500 nm，500 nm至550 nm，550 nm至600 nm，或650 nm至700 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在650 nm至700 nm範圍內，且第二激發能量在450 nm至500 nm，500 nm至550 nm，550 nm至600 nm，或600 nm至650 nm範圍內。 在某些實施例中，第一激發能量在450 nm至500 nm範圍內，且第二激發能量在500 nm至550 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在450 nm至500 nm範圍內，且第二激發能量在550 nm至600 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在450 nm至500 nm範圍內，且第二激發能量在600 nm至670 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在500 nm至550 nm範圍內，且第二激發能量在550 nm至600 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在500 nm至550 nm範圍內，且第二激發能量在600 nm至670 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在550 nm至600 nm範圍內，且第二激發能量在600 nm至670 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在470 nm至510 nm範圍內，且第二激發能量在510 nm至550 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在470 nm至510 nm範圍內，且第二激發能量在550 nm至580 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在470 nm至510 nm範圍內，且第二激發能量在580 nm至620 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在470 nm至510 nm範圍內，且第二激發能量在620 nm至670 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在510 nm至550 nm範圍內，且第二激發能量在550 nm至580 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在510 nm至550 nm範圍內，且第二激發能量在580 nm至620 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在510 nm至550 nm範圍內，且第二激發能量在620 nm至670 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在550 nm至580 nm範圍內，且第二激發能量在580 nm至620 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在550 nm至580 nm範圍內，且第二激發能量在620 nm至670 nm範圍內。在某些實施例中，第一激發能量在580 nm至620 nm範圍內，且第二激發能量在620 nm至670 nm範圍內。 用於將激發能量脈衝遞送至目標體積之激發能量來源及裝置之某些實施例描述在本文中其他處。經發光標記之核苷酸 在一個態樣中，本文所描述之方法及組合物包含一或多種經發光標記之核苷酸(例如經由包含一或多種保護元件之核酸連接子連接至一或多種標記物之一或多種聚磷酸核苷)。在某些實施例中，一或多種核苷酸包含去氧核糖核苷。在一些實施例中，所有核苷酸包含去氧核糖核苷。在某些實施例中，一或多種核苷酸包含核糖核苷。在一些實施例中，所有核苷酸包含核糖核苷。在一些實施例中，一或多種核苷酸包含經修飾之核糖或核糖模擬物(例如鎖定核酸)。在一些實施例中，一或多種核苷酸包含天然存在之鹼基(例如胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。在一些實施例中，一或多種核苷酸包含胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之衍生物或類似物。 在某些實施例中，一種方法包含使聚合酶複合物曝露於多種經發光標記之核苷酸之步驟。在某些實施例中，組合物或裝置包含反應混合物，其包含多種經發光標記之核苷酸。在一些實施例中，多種核苷酸包含四種類型核苷酸。在一些實施例中，四種類型核苷酸各自包含胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤及胸腺嘧啶中之一者。在一些實施例中，四種類型核苷酸各自包含胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤及尿嘧啶中之一者。 在某些實施例中，反應混合物中各類型經發光標記之核苷酸之濃度在約50 nM與約200 nM，約200 nM與約500 nM，約500 nM與約1 µM，約1 µM與約50 µM，或約50 µM與250 µM之間。在一些實施例中，反應混合物中各類型經發光標記之核苷酸之濃度在約250 nM與約2 µM之間。在一些實施例中，反應混合物中各類型經發光標記之核苷酸之濃度為約1 µM。 在某些實施例中，反應混合物含有用於定序反應之額外試劑。在一些實施例中，反應混合物包含緩衝液。在一些實施例中，緩衝液包含3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)。在一些實施例中，緩衝液以約1 mM之間及約100 mM之間的濃度存在。在一些實施例中，MOPS之濃度為約50 mM。在一些實施例中，反應混合物包含一或多種鹽。在一些實施例中，鹽包含乙酸鉀。在一些實施例中，乙酸鉀之濃度為約140 mM。在一些實施例中，鹽以約1 mM與約200 mM之間的濃度存在。在一些實施例中，反應混合物包含鎂鹽(例如乙酸鎂)。在一些實施例中，乙酸鎂之濃度為約20 mM。在一些實施例中，鎂鹽以約1 mM與約50 mM之間的濃度存在。在一些實施例中，反應混合物包含還原劑。在一些實施例中，還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)。在一些實施例中，還原劑以約1 mM與約50 mM之間的濃度存在。在一些實施例中，DTT之濃度為約5 mM。在一些實施例中，反應混合物包含一或多種光穩定劑。在一些實施例中，反應混合物包含抗氧化劑、氧氣清除劑或三重態淬滅劑。在一些實施例中，光穩定劑包含原兒茶酸(PCA)。在一些實施例中，光穩定劑包含4-硝基苯甲基醇(NBA)。在一些實施例中，光穩定劑以約0.1 mM與約20 mM之間的濃度存在。在一些實施例中，PCA之濃度為約3 mM。在一些實施例中，NBA之濃度為約3 mM。具有光穩定劑(例如PCA)之混合物亦可包含酶以再生光穩定劑(例如原兒茶酸二加氧酶 (PCD))。在一些實施例中，PCD之濃度為約0.3 mM。 本申請案涵蓋用於區分多種核苷酸中之核苷酸的不同方法。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之兩者或多於兩者具有相同發光壽命或大體上相同發光壽命(例如無法藉由方法或裝置區別之壽命)。 在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之每一者吸收不同光譜範圍內之激發能量。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之兩者吸收相同光譜範圍內之激發能量。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之三者吸收相同光譜範圍內之激發能量。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之四者或多於四者吸收相同光譜範圍內之激發能量。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之兩者吸收不同光譜範圍內之激發能量。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之三者吸收不同光譜範圍內之激發能量。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之四者或多於四者吸收不同光譜範圍內之激發能量。 在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之每一者發射不同光譜範圍內之光子。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之兩者發射相同光譜範圍內之光子。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之三者發射相同光譜範圍內之光子。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之四者或多於四者發射相同光譜範圍內之光子。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之兩者發射不同光譜範圍內之光子。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之三者發射不同光譜範圍內之光子。在某些實施例中，經發光標記之核苷酸中之四者或多於四者發射不同光譜範圍內之光子。 在某些實施例中，四種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命。在某些實施例中，兩種或多於兩種經發光標記之核苷酸具有不同發光壽命且吸收及/或發射第一光譜範圍內之光子，且一或多種經發光標記之核苷酸吸收及/或發射第二光譜範圍內之光子。在一些實施例中，三種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命且發射第一光譜範圍內之發光，且第四經發光標記之核苷酸吸收及/或發射第二光譜範圍內之光子。在一些實施例中，兩種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命且發射第一光譜範圍內之發光，且第三及第四經發光標記之核苷酸各自具有不同發光壽命且發射第二光譜範圍內之發光。 在某些實施例中，四種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光強度。在某些實施例中，兩種或多於兩種經發光標記之核苷酸具有不同發光強度且發射第一光譜範圍內之發光，且一或多種經發光標記之核苷酸吸收及/或發射第二光譜範圍內之光子。在一些實施例中，三種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光強度且發射第一光譜範圍內之發光，且第四經發光標記之核苷酸吸收及/或發射第二光譜範圍內之光子。在一些實施例中，兩種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光強度且發射第一光譜範圍內之發光，且第三及第四經發光標記之核苷酸各自具有不同發光強度且發射第二光譜範圍內之發光。 在某些實施例中，四種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命或發光強度。在某些實施例中，兩種或多於兩種經發光標記之核苷酸具有不同發光壽命或發光強度且發射第一光譜範圍內之發光，且一或多種經發光標記之核苷酸吸收及/或發射第二光譜範圍內之光子。在一些實施例中，三種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命或發光強度且發射第一光譜範圍內之發光，且第四經發光標記之核苷酸吸收及/或發射第二光譜範圍內之光子。在一些實施例中，兩種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命或發光強度且發射第一光譜範圍內之發光，且第三及第四經發光標記之核苷酸各自具有不同發光壽命或發光強度且發射第二光譜範圍內之發光。 在某些實施例中，兩種或多於兩種經發光標記之核苷酸具有不同發光壽命且吸收第一光譜範圍內之激發能量，且一或多種經發光標記之核苷酸吸收第二光譜範圍內之激發能量。在一些實施例中，三種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命且吸收第一光譜範圍內之激發能量，且第四經發光標記之核苷酸吸收第二光譜範圍內之激發能量。在一些實施例中，兩種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命且吸收第一光譜範圍內之激發能量，且第三及第四經發光標記之核苷酸各自具有不同發光壽命且吸收第二光譜範圍內之激發能量。 在某些實施例中，兩種或多於兩種經發光標記之核苷酸具有不同發光壽命或發光強度且吸收第一光譜範圍內之激發能量，且一或多種經發光標記之核苷酸吸收第二光譜範圍內之激發能量。在一些實施例中，三種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命或發光強度且吸收第一光譜範圍內之激發能量，且第四經發光標記之核苷酸吸收第二光譜範圍內之激發能量。在一些實施例中，兩種經發光標記之核苷酸中之每一者具有不同發光壽命或發光強度且吸收第一光譜範圍內之激發能量，且第三及第四經發光標記之核苷酸各自具有不同發光壽命或發光強度且吸收第二光譜範圍內之激發能量。 在定序期間，核苷酸鑑別方法可隨著序列中之各種鹼基對變化。在某些實施例中，兩種類型核苷酸可經標記以吸收第一激發能量，且基於不同發光強度，區別彼等兩種類型核苷酸(例如A、G)，而兩種額外類型核苷酸(例如C、T)可經標記以吸收第二激發能量，且基於不同發光壽命，區別彼等兩種額外類型核苷酸。對於此類實施例，在定序期間，可僅基於發光強度測定序列之某些鏈段(例如僅併有A及G之鏈段)，而可僅基於發光壽命測定序列之其他鏈段(例如僅併有C及T之鏈段)。在一些實施例中，基於發光壽命區分2與4種之間的經發光標記之核苷酸。在一些實施例中，基於發光強度區分2與4種之間的經發光標記之核苷酸。在一些實施例中，基於發光壽命及發光強度區分2與4種之間的經發光標記之核苷酸。 圖4展示例示性經發光標記之核苷酸之發光壽命4-1及相同例示性核苷酸之發光強度4-2。舉例而言，第四列展示連接至螢光團Alexa Fluor® 555 (AF555)之六磷酸去氧胸苷(dT6P)核苷酸之資料。此經發光標記之核苷酸具有大約0.25 ns之壽命且呈現大約20000計數/秒之發光強度。一般而言，在併入條件下(例如在單分子複合物中，在奈米孔口中)，相對於其他更典型的條件，諸如4-1及4-2之彼等者，對於核苷酸，任何經發光標記之核苷酸之觀測到的發光壽命及發光強度可不同。發光偵測 在本文所描述之方法之一個態樣中，藉由一或多種感測器偵測一個發射光子(發光)或多個發射光子。對於多種經發光標記之分子或核苷酸，分子中之每一者可發射單一光譜範圍內之光子，或分子之一部分可發射第一光譜範圍內之光子且分子之另一部分可發射第二光譜範圍內之光子。在某些實施例中，藉由單一感測器偵測發射光子。在某些實施例中，藉由多個感測器偵測發射光子。在一些實施例中，第一光譜範圍內發射之光子藉由第一感測器偵測，且第二光譜範圍內發射之光子藉由第二感測器偵測。在一些實施例中，多個光譜範圍中之每一者內發射之光子藉由不同感測器偵測。 在某些實施例中，各感測器經配置以基於激發能量與發射光子之間的持續時間為發射的光子指定時間頻段。在一些實施例中，在較短持續時間之後發射之光子將指定為較早時間頻段，且在較長持續時間之後發射之光子將指定為較晚時間頻段。 在一些實施例中，將多個激發能量脈衝遞送至目標體積附近且偵測到可包括光子發射事件之多個光子。在一些實施例中，多種發光(例如光子發射事件)對應於經發光標記之核苷酸併入核酸產物中。在一些實施例中，經發光標記之核苷酸之併入持續約1 ms與約5 ms之間，約5 ms與約20 ms之間，約20 ms與約100 ms之間，或約100 ms與約500 ms之間。在一些實施例中，在經發光標記之核苷酸之併入期間偵測到約10與約100之間，約100與約1000，約1000與約10000，或約10000與約100000之間的發光。 在某些實施例中，若未併入經發光標記之核苷酸，則未偵測到發光。在一些實施例中，存在發光背景。在一些實施例中，當未併入經發光標記之核苷酸時，偵測到偽發光。在激發能量脈衝期間，若一或多種經發光標記之核苷酸在目標體積中(例如擴散至目標體積中，或與聚合酶相互作用，但未併入)，則可發生此類偽發光，但未藉由定序反應併入。在一些實施例中，自目標體積中但未併入之經發光標記之核苷酸偵測到的多次發光少於來自經發光標記之核苷酸之多次發光(例如十倍、100倍、1000倍、10000倍)。 在一些實施例中，對於對應於經發光標記之核苷酸之併入之各多種偵測到的發光，基於脈衝與發射光子之間的持續時間，指定發光之時間頻段。針對併入事件之此多個在本文中稱為「峰值」。在一些實施例中，峰值係指高於基線(例如雜訊臨限值)之一系列信號(例如量測結果)，其中該等信號對應於經發光標記之核苷酸在激發區域內時發生之多個發射事件。在一些實施例中，峰值與前一及/或後一峰值間隔代表基線之信號之時間間隔。在一些實施例中，藉由基於多種持續時間測定發光壽命來分析峰值。在一些實施例中，藉由基於每單位時間偵測到的發光之數目測定發光強度來分析峰值。在一些實施例中，藉由測定偵測到的發光之光譜範圍來分析峰值。在一些實施例中，分析峰值資料將允許指定併入之經發光標記之核苷酸之一致性，或允許自多種經發光標記之核苷酸區分一或多種經發光標記之核苷酸。指定或區分可依賴於發光壽命、發光強度、發射光子之光譜範圍或其任何組合中之任一者。 圖5描繪例示性模板核酸之定序。用以下4種經發光標記之核苷酸運行定序實驗：連接至Alexa Fluor® 647 (A-AF647)之去氧腺苷、連接至Alex Fluor 555 (T-AF555)之去氧胸苷、連接至DyLight® 554-R1 (G-D554R1)之去氧胍及連接至DyLight® 530-R2 (C-D530R2)之去氧胞苷。核苷酸A-AF647藉由紅色光譜範圍內之激發能量激發，且T、G及C核苷酸藉由綠色光譜範圍內之激發來激發。歷經約200 s定序反應偵測到之光子之數目展示於強度跡線5-1中。各峰值對應於偵測到的發光之峰值且用圓點標記。各峰值可對應於經發光標記之核苷酸之併入且包含數千次偵測到的發光。可利用不同著色跡線來表示不同激發脈衝。舉例而言，紫色跡線可用於綠色激發脈衝，且藍色跡線可用於紅色激發脈衝。藍色跡線峰值可歸因於核苷酸A-AF647之併入(本實例中具有紅色發光分子之唯一核苷酸)。 圖5展示一種還原原始數據以使用相對於壽命曲線5-2之強度區分相同顏色峰值(例如T、G與C之間的紫色跡線中之峰值)的方法。各圓圈代表紫色跡線之峰值。已分析各峰值以基於脈衝與各偵測到的光子之發射之間的持續時間測定經發光標記之核苷酸之發光壽命。另外，已分析各峰值以基於每秒偵測到的光子之數目測定經發光標記之核苷酸之發光強度。併入事件聚集在對應於三種經發光標記之核苷酸中之每一者之三組中。曲線底部中之深色集群(虛線下曲線區域)歸因於具有最長發光壽命及最低發光強度之C-D530R2。曲線底部中之淺色集群(虛線下曲線區域)歸因於具有中等壽命及強度之G-D554R1。且曲線上部中之淺色集群(虛線上曲線區域)歸因於具有最短壽命及最高強度之T-AF555。圖5展示自資料測定之序列與模板核酸之已知序列之間的比對5-3。垂直條柱指示以實驗方式測定之鹼基與靶序列之間的匹配。短劃線指示經測定序列中未指定核苷酸之模板序列中之位置或不對應於模板序列中之任何位置之經測定序列中之額外位置。 圖6描繪模板核酸定序之第二實例。用以下4種經發光標記之核苷酸運行定序實驗：連接至Alexa Fluor® 647 (A-AF647)之去氧腺苷、連接至Alex Fluor 555 (T-AF555)之去氧胸苷、連接至Alexa Fluor® 647 (G-AF647)之去氧胍及連接至Alexa Fluor® 546 (C-AF546)之去氧胞苷。核苷酸A-AF647及G-AF647藉由紅色光譜範圍內之激發能量激發，且T及C核苷酸藉由綠色光譜範圍內之激發來激發。在此實驗中，A及G具有相同發光標記物且未辨別。圖6展示強度跡線6-1中歷經約300定序反應偵測到之光子之數目。各峰值對應於偵測到的發光之峰值且用圓點標記。各峰值可對應於經發光標記之核苷酸之併入且包含數千次偵測到的發光。跡線展示綠色激發脈衝之偵測到的發光(對應於鹼基T及C)。 圖6展示一種還原原始數據以使用相對於壽命曲線6-2之強度區分T及C之方法。各圓圈代表強度跡線6-1之峰值。已分析各峰值以基於脈衝與各偵測到的光子之發射之間的持續時間測定經發光標記之核苷酸之發光壽命。另外，已分析各峰值以基於每秒偵測到的光子之數目測定經發光標記之核苷酸之發光強度。併入事件聚集在對應於兩種經發光標記之核苷酸中之每一者之兩組中。曲線右部中之深色集群(虛線右側曲線區域)歸因於具有最長發光壽命及最低發光強度之C-AF546。曲線右部中之淺色集群(虛線右側曲線區域)歸因於具有最短壽命及最高強度之T-AF555。圖6展示自資料測定之序列與模板核酸之已知序列之間的比對6-3。垂直條柱指示以實驗方式測定之鹼基與靶序列之間的匹配。短劃線指示經測定序列中未指定核苷酸之模板序列中之位置或不對應於模板序列中之任何位置之經測定序列中之額外位置。發光標記 術語發光標籤、發光標記及發光標記物通篇可互換使用且係關於包含一或多種發光分子之分子。在某些實施例中，併入之分子為例如未連接不同發光標記之發光分子。典型的核苷酸及胺基酸不發光，或在激發及發射能量之適合的範圍內不發光。在某些實施例中，併入之分子包含發光標記。在某些實施例中，併入之分子為經發光標記之核苷酸。在某些實施例中，併入之分子為經發光標記之胺基酸或經發光標記之tRNA。在一些實施例中，經發光標記之核苷酸包含核苷酸及發光標記。在一些實施例中，經發光標記之核苷酸包含核苷酸、發光標記及連接子。在一些實施例中，發光標記為螢光團。 在某些實施例中，發光標記及視情況連接子保持連接至併入之分子。在某些實施例中，發光標記及視情況連接子在併入過程期間或之後自分子裂解。 在某些實施例中，發光標記為花青染料或其模擬物。在一些實施例中，花青染料具有下式：， 或其鹽、立體異構體或互變異構體，其中： A¹ 及A² 接合形成視情況經取代之芳族或非芳族單環或多環雜環； B¹ 及B² 接合形成視情況經取代之芳族或非芳族單環或多環雜環； R¹ 及R² 中之每一者獨立地為氫、視情況經取代之烷基；及 L¹ 及L² 中之每一者獨立地為氫、視情況經取代之烷基，或L¹ 及L² 接合形成視情況經取代之芳族或非芳族單環或多環碳環。 在某些實施例中，發光標記為若丹明染料或其模擬物。在一些實施例中，若丹明染料具有下式：， 或其鹽、立體異構體或互變異構體，其中： A¹ 及A² 中之每一者獨立地為氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之芳族或非芳族雜環基、視情況經取代之芳族或非芳族碳環基或視情況經取代之羰基，或A¹ 及A² 接合形成視情況經取代之芳族或非芳族單環或多環雜環； B¹ 及B² 中之每一者獨立地為氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之芳族或非芳族雜環基、視情況經取代之芳族或非芳族碳環基或視情況經取代之羰基，或B¹ 及B² 接合形成視情況經取代之芳族或非芳族單環或多環雜環； R² 及R³ 中之每一者獨立地為氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之醯基；及 R⁴ 為氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之視情況經取代之芳族或非芳族雜環基、視情況經取代之芳族或非芳族碳環基或視情況經取代之羰基。 在一些實施例中，R⁴ 為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，R⁴ 為視情況經取代之苯基，其中至少一個取代基為視情況經取代之羰基。在一些實施例中，R⁴ 為視情況經取代之苯基，其中至少一個取代基為視情況經取代之磺醯基。 典型地，發光標記包含芳族或雜芳族化合物且可為芘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚、苯并吲哚、噁唑、咔唑、噻唑、苯并噻唑、啡啶、啡噁嗪、卟啉、喹啉、乙錠、苯甲醯胺、花青、羰花青、水楊酸鹽、鄰胺基苯甲酸鹽、香豆素、螢光素、若丹明或其他類似化合物。例示性染料包括二苯并哌喃染料，諸如螢光素或若丹明染料，包括5-羧基螢光素(FAM)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基螢光素(JOE)、四氯螢光素(TET)、6-羧基若丹明(R6G)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)。例示性染料亦包括在α或β位置中具有胺基之萘胺染料。舉例而言，萘胺基化合物包括1-二甲基胺基萘基-5-磺酸酯、1-苯胺基-8-萘磺酸酯及2-p-甲苯烷基-6-萘磺酸酯、5-(2'-胺基乙基)胺基萘-1-磺酸(EDANS)。其他例示性染料包括香豆素，諸如3-苯基-7-異氰酸酯基香豆素；吖啶，諸如9-異硫氰基香豆素及吖啶橙；N-(p-(2-苯并噁唑基)苯基)順丁烯二醯亞胺；花青，諸如吲哚二羰菁3 (Cy®3)、(2Z)-2-[(E)-3-[3-(5-羧基戊基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基苯并[e]吲哚-3-鎓-2-基]亞丙-2-烯基]-3-乙基-1,1-二甲基-8-(三氧烷基硫烷基)苯并[e]吲哚-6-磺酸酯(Cy®3.5)、2-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-16,16,18,18-四甲基-6,7,7a,8a,9,10,16,18-八氫苯并[2'',3'']氮茚[8'',7'':5',6']吡喃并[3',2':3,4]吡啶并[1,2-a]吲哚-5-鎓-14-磺酸酯(Cy®3B)、吲哚二羰菁5 (Cy®5)、吲哚二羰菁5.5 (Cy®5.5)、3-(-羧基-戊基)-3'-乙基-5,5'-二甲基噁羰花青(CyA)；1H,5H,11H,15H-二苯并哌喃并[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']二喹嗪-18-鎓、9-[2(或4)-[[[6-[2,5-二側氧基-1-吡咯啶基)氧基]-6-側氧基己基]胺基]磺醯基]-4(或2)-磺基苯基]-2,3,6,7,12,13,16,17-八氫-內鹽(TR或Texas Red®)；BODIPY®染料；苯并噁唑；芪；芘；及其類似物。 對於核苷酸定序，經發光標記之核苷酸之某些組合為較佳的。在一些實施例中，經發光標記之核苷酸中之至少一者包含花青染料或其模擬物。在一些實施例中，至少一種經發光標記之核苷酸包含若丹明染料或其模擬物。在一些實施例中，至少兩種經發光標記之核苷酸各自包含花青染料或其模擬物。在一些實施例中，至少兩種經發光標記之核苷酸各自包含若丹明染料或其模擬物。在一些實施例中，至少三種經發光標記之核苷酸各自包含花青染料或其模擬物。在一些實施例中，至少三種經發光標記之核苷酸各自包含若丹明染料或其模擬物。在一些實施例中，至少四種經發光標記之核苷酸各自包含花青染料或其模擬物。在一些實施例中，至少四種經發光標記之核苷酸各自包含若丹明染料或其模擬物。在一些實施例中，三種經發光標記之核苷酸包含花青染料或其模擬物，且第四經發光標記之核苷酸包含若丹明染料或其模擬物。在一些實施例中，兩種經發光標記之核苷酸包含花青染料或其模擬物，且第三及視情況第四經發光標記之核苷酸包含若丹明染料或其模擬物。在一些實施例中，三種經發光標記之核苷酸包含若丹明染料或其模擬物，且第三及視情況第四經發光標記之核苷酸包含花青染料或其模擬物。 在一些實施例中，至少一種經標記之核苷酸連接至兩種或多於兩種染料(例如相同染料之兩個或多於兩個複本及/或兩種或多於兩種不同染料)。 在一些實施例中，至少兩種經發光標記之核苷酸吸收第一激發能量，其中經發光標記之核苷酸中之至少一者包含花青染料或其模擬物，且經發光標記之核苷酸中之至少一者包含若丹明染料或其模擬物。在一些實施例中，至少兩種經發光標記之核苷酸吸收第二激發能量，其中經發光標記之核苷酸中之至少一者包含花青染料或其模擬物，且經發光標記之核苷酸中之至少一者包含若丹明染料或其模擬物。在一些實施例中，至少兩種經發光標記之核苷酸吸收第一激發能量，其中經發光標記之核苷酸中之至少一者包含花青染料或其模擬物，且經發光標記之核苷酸中之至少一者包含若丹明染料或其模擬物，且至少兩種額外經發光標記之核苷酸吸收第二激發能量，其中經發光標記之核苷酸中之至少一者包含花青染料或其模擬物，且經發光標記之核苷酸中之至少一者包含若丹明染料或其模擬物。 在一些實施例中，至少兩種經發光標記之核苷酸吸收第一激發能量，其中經發光標記之核苷酸中之至少一者具有小於約1 ns之發光壽命，且經發光標記之核苷酸中之至少一者具有超過1 ns之發光壽命。在一些實施例中，至少兩種經發光標記之核苷酸吸收第二激發能量，其中經發光標記之核苷酸中之至少一者具有小於約1 ns之發光壽命，且經發光標記之核苷酸中之至少一者具有超過1 ns之發光壽命。在一些實施例中，至少兩種經發光標記之核苷酸吸收第一激發能量，其中經發光標記之核苷酸中之至少一者具有小於約1 ns之發光壽命，且經發光標記之核苷酸中之至少一者具有超過1 ns之發光壽命，且至少額外兩種經發光標記之核苷酸吸收第二激發能量，其中經發光標記之核苷酸中之至少一者具有小於約1 ns之發光壽命，且經發光標記之核苷酸中之至少一者具有超過1 ns之發光壽命。 在某些實施例中，發光標記為選自表1之染料。表1中列出之染料為非限制性的，且本申請案之發光標記可包括表1中未列出之染料。在某些實施例中，一或多種經發光標記之核苷酸之發光標記選自表1。在某些實施例中，四種或更多種經發光標記之核苷酸之發光標記選自 表1. 表 1. 例示性螢光團 . 染料亦可基於最大吸收率或發射發光之波長進行分類。表2提供根據最大吸收率之大致波長分成行的例示性螢光團。表2中列出之染料為非限制性的，且本申請案之發光標記可包括表2中未列出之染料。準確的最大吸收率或發射波長可不對應於指定的光譜範圍。在某些實施例中，一或多種經發光標記之核苷酸之發光標記選自表2中列出之「紅色」組。在某些實施例中，一或多種經發光標記之核苷酸之發光標記選自表2中列出之「綠色」組。在某些實施例中，一或多種經發光標記之核苷酸之發光標記選自表2中列出之「黃色/橙色」組。在某些實施例中，選擇四種核苷酸之發光標記以使得所有選自表2中列出之「紅色」、「黃色/橙色」或「綠色」組中之一者。在某些實施例中，選擇四種核苷酸之發光標記以使得三種選自表2中列出之「紅色」、「黃色/橙色」及「綠色」組之第一組，且第四組選自表2中列出之「紅色」、「黃色/橙色」及「綠色」組之第二組。在某些實施例中，選擇四種核苷酸之發光標記以使得兩種選自表2中列出之第一「紅色」、「黃色/橙色」及「綠色」組，且第三及第四選自表2中列出之「紅色」、「黃色/橙色」及「綠色」組之第二組。在某些實施例中，選擇四種核苷酸之發光標記以使得兩種選自表2中列出之第一「紅色」、「黃色/橙色」及「綠色」組，且第三選自表2中列出之「紅色」、「黃色/橙色」及「綠色」組之第二組，且第四選自表2中列出之「紅色」、「黃色/橙色」及「綠色」組之第三組。 表 2. 例示性螢光團光譜範圍 . 在某些實施例中，發光標記可為具有下式之(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106) (呈NHS酯形式)：(染料101)，(染料102)，(染料103)，(染料104)，(染料105)，(染料106)， 或其模擬物。在一些實施例中，各磺酸酯或羧酸酯獨立地視情況為質子化的。在一些實施例中，上述染料藉由在指定連接點處形成醯胺鍵而連接至連接子或核苷酸。 在某些實施例中，發光標記可包含第一及第二發色團。在一些實施例中，第一發色團之激發態能夠經由能量傳遞至第二發色團弛豫。在一些實施例中，能量傳遞為福斯特共振能量轉移(Förster resonance energy transfer；FRET)。此類FRET對可適用於提供具有使標記易於自多個發光標記中區分之特性之發光標記。在某些實施例中，FRET對可吸收第一光譜範圍內之激發能量且發射第二光譜範圍內之發光。 對於一組經發光標記之分子(例如經發光標記之核苷酸)，經發光標記之FRET對之特性可允許選擇多個可區別的分子(例如核苷酸)。在一些實施例中，FRET對之第二發色團具有與多個其他經發光標記之分子不同之發光壽命。在一些實施例中，FRET對之第二發色團具有與多個其他經發光標記之分子不同之發光強度。在一些實施例中，FRET對之第二發色團具有與多個其他經發光標記之分子不同之發光壽命及發光強度。在一些實施例中，FRET對之第二發色團發射與多個其他經發光標記之分子不同之光譜範圍內之光子。在一些實施例中，FRET對之第一發色團具有與多個經發光標記之分子不同之發光壽命。在某些實施例中，FRET對可吸收與多個其他經發光標記之分子不同之光譜範圍內之激發能量。在某些實施例中，FRET對可吸收與多個其他經發光標記之分子中之一或多者相同光譜範圍內之激發能量。 在一些實施例中，兩種或多於兩種核苷酸可連接至發光標記，其中核苷酸連接至發光標記上之不同位置。非限制性實例可包括含有兩個與核苷酸模擬物上之反應性部分相容之獨立反應性化學部分(例如疊氮基、乙炔基、羧基、胺基)之發光分子。在此類實施例中，發光標記可經由獨立鍵連接至兩個核苷酸分子。在一些實施例中，發光標記可包含兩種或多於兩種核苷酸之兩種或多於兩種獨立接點。 在一些實施例中，兩種或多於兩種核苷酸可經由連接子(例如具有兩個或多於兩個反應性位點之分支鏈連接子或連接子，其上可連接核苷酸及/或染料)連接至發光染料。因此，在一些實施例中，兩種或多於兩種核苷酸(例如具有相同類型)可連接至兩種或多於兩種染料(例如具有相同類型)。 在一些實施例中，發光標記可包含具有發光特性之蛋白質。在一些實施例中，一或多種核苷酸連接至發光蛋白質。在一些實施例中，一或多種核苷酸經由蛋白質之不同位點之接點連接至發光蛋白質。在某些實施例中，選擇四種核苷酸之發光標記以使得一種核苷酸用螢光蛋白質標記，而其餘三種核苷酸用螢光染料(例如表1及2中之非限制性實例)標記。在某些實施例中，選擇四種核苷酸之發光標記以使得兩種核苷酸用螢光蛋白質標記，而其餘兩種核苷酸用螢光染料(例如表1及2中之非限制性實例)標記。在某些實施例中，選擇四種核苷酸之發光標記以使得三種核苷酸用螢光蛋白質標記，而其餘核苷酸用螢光染料(例如表1及2中之非限制性實例)標記。在一些實施例中，選擇四種核苷酸之發光標記以使得所有四種核苷酸用螢光蛋白質標記。 根據本申請案之一些態樣，發光標記(例如染料，例如螢光團)可損傷曝露於激發光之定序反應中之聚合酶。在一些態樣中，當發光分子保持非常接近於聚合酶時，此損傷在經發光標記之核苷酸之併入期間發生。損傷反應之非限制性實例包括在聚合酶與發光分子之間形成共價鍵及輻射或非輻射衰變自發光分子發射至酶。此可減少聚合酶之有效性且縮短定序運行長度。 在一些實施例中，藉由相對較長連接子或連接子構造連接核苷酸及發光標記以在標記核苷酸之併入期間保持發光標記遠離聚合酶。術語「連接子構造」在本文中用於指將發光分子連接至核苷酸且不涵蓋發光分子或核苷酸之整個結構。 在一些實施例中，單一連接子將發光分子連接至核苷酸。在一些實施例中，連接子含有一或多個分叉點以使得兩種或多於兩種(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或多於10種)核苷酸連接至各發光分子，兩種或多於兩種(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或多於10種)發光分子連接至各核苷酸，或兩種或多於兩種(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或多於10種)核苷酸連接至兩種或多於兩種(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或多於10種)發光分子。 在一些實施例中，連接子構造測定發光標記與核苷酸之間的距離。在一些實施例中，距離為約1 nm或2 nm至約20 nm。舉例而言，超過2 nm，超過5 nm，5-10 nm，超過10 nm，10-15 nm，超過15 nm，15-20 nm，超過20 nm。然而，發光標記與核苷酸之間的距離不能過長，因為當核苷酸保持在酶之活性位點內時，發光標記需要在待激發照射體積內。因此，在一些實施例中，總體連接子長度小於30 nm，小於25 nm，約20 nm，或小於20 nm。 在一些實施例中，保護分子包括在連接子構造內。保護分子可保護聚合酶免受可能在酶與發光標記之間發生之損傷反應。保護分子之非限制性實例包括核酸(例如去氧核糖核酸、核糖核酸)，例如包含一或多種保護元件之核酸。在一些實施例中，保護分子為寡核苷酸(例如DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或其變體)。 在一些實施例中，保護分子連接至一或多種發光分子及一或多種核苷酸分子。如本文所使用，核苷酸在此情形下係指可併入生長核酸中之聚磷酸核苷，例如在定序反應之情形下。在一些實施例中，發光分子不靠近核苷酸。舉例而言，一或多種發光分子可連接在保護分子之第一側面上且一或多種核苷酸可連接至保護分子之第二側面，其中保護分子之第一及第二側面彼此遠離。在一些實施例中，其在保護分子之大約相對側面上。 保護分子連接至發光標記之位置與保護分子連接至核苷酸之位置之間的距離可為經由空間之線性量測結果或橫跨保護分子表面之非線性量測結果。保護分子上發光標記與核苷酸連接點之間的距離可藉由建立保護分子之三維結構模型來量測。在一些實施例中，此距離可為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 nm或大於20 nm。替代地，保護分子上發光標記及核苷酸之相對位置可藉由處理保護分子之結構作為二次表面(例如橢球、橢圓形圓柱)描述。在一些實施例中，發光標記及核苷酸相隔之距離為環繞代表保護分子之橢球形形狀之距離的至少八分之一。在一些實施例中，發光標記及核苷酸相隔之距離為環繞代表保護分子之橢球形形狀之距離的至少四分之一。在一些實施例中，發光標記及核苷酸相隔之距離為環繞代表保護分子之橢球形形狀之距離的至少三分之一。在一些實施例中，發光標記及核苷酸相隔之距離為環繞代表保護分子之橢球形形狀之距離的一半。 在一些實施例中，在保護分子包含核酸(例如具有一或多種保護元件之核酸連接子)之情況下，可基於發光標記與核苷酸之間產生之核酸內鹼基之數目量測核酸上發光標記(例如一或多種發光標記)與核苷酸(例如一或多種聚磷酸核苷)連接點之間的距離。在一些實施例中，將標記之連接點與聚磷酸核苷之連接點分離之連接子(例如單股連接子中之核苷酸或雙股連接子中之鹼基對的數目)中之核酸次單元之數目可為10-100 (例如10-25、25-50、50-75、75-100)或多於100。舉例而言，在一些實施例中，核酸連接子為雙股的。在此類實施例中，發光標記及核苷酸之連接點之間的距離可藉由雙股核酸內產生之鹼基對之數目量測(例如核酸連接子之第一及第二寡核苷酸股之核鹼基之間的鹼基配對)。在一些實施例中，核酸連接子(例如線性核酸連接子)上發光標記及核苷酸連接點相隔至少5個鹼基對，5與10個之間的鹼基對，至少10個鹼基對，10與15個之間的鹼基對，至少15個鹼基對，15與20個之間的鹼基對，至少20個鹼基對，20與25個之間的鹼基對，至少25個鹼基對，25與30個之間的鹼基對，至少30個鹼基對，30與35個之間的鹼基對，至少35個鹼基對，35與40個之間的鹼基對，至少40個鹼基對，40與45個之間的鹼基對，至少45個鹼基對，45與50個之間的鹼基對，至少50個鹼基對，50與75個之間的鹼基對，至少75個鹼基對，75與100個之間的鹼基對，或多於100個。在一些實施例中，預期包括一或多種結構基元保護元件(例如莖-環)可使得更大數目的鹼基及/或鹼基對在發光標記與核苷酸之間產生。因此，在一些實施例中，核酸連接子上發光標記及核苷酸連接點間隔至少50個鹼基對，50與60個之間的鹼基對，至少60個鹼基對，60與70個之間的鹼基對，至少70個鹼基對，70與80個之間的鹼基對，至少80個鹼基對，80與90個之間的鹼基對，至少90個鹼基對，90與100個之間的鹼基對，至少100個鹼基對，100與150個之間的鹼基對，至少150個鹼基對，150與200個之間的鹼基對，至少200個鹼基對，或多於200個。在一些實施例中，雙股核酸連接子(或單股核酸連接子中之核苷酸)中之鹼基對之數目小於500，小於450，小於400，小於350，小於300，或小於250。 保護分子，諸如包含一或多種保護元件之核酸連接子可適用於提供防止發光標記接近聚合酶之立體阻擋層。保護分子可適用於吸收或保護聚合酶免受發光分子發射之輻射及非輻射衰變。保護分子可適用於在發光標記與聚合酶之間提供立體阻擋層及衰變阻擋層兩者。 當核苷酸保持在酶之活性位點內時，保護分子之尺寸應使得發光標記不能或不大可能直接接觸聚合酶。當核苷酸保持在酶之活性位點內時，保護分子之尺寸亦應使得連接發光標記在待激發之照射體積內。應考慮將發光標記連接至保護分子之所選連接子及將核苷酸連接至保護分子之所選連接子來選擇保護分子之尺寸。保護分子及連接子用於連接發光標記且核苷酸(例如聚磷酸核苷)包含連接子構造，其中當核苷酸保持在酶之活性位點內時，連接子構造之尺寸應使得發光標記不能直接接觸聚合酶。 保護分子(及/或包含保護分子之連接子構造)較佳為水可溶的。在一些實施例中，保護分子(及/或包含保護分子之連接子構造)較佳具有淨負電荷。 圖7進一步說明定序實驗之非限制性實例及獨特發光特性如何可用於區別多個經發光標記之核苷酸7-1。連接至各鹼基(胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤)之發光標記具有允許各標記核苷酸區別於多種標記核苷酸之發光特性(例如發光壽命、發光強度及/或發射波長)。包括多種相同類型核苷酸用以加快定序反應中之併入速率。 利用經發光標記之核苷酸7-1之定序實驗可在例示性反應容器7-2中進行。反應在波導上之腔室中進行，該波導用作激發能量管道，藉由自波導消散波將激發能量遞送至反應腔室底部中之樣品。孔口阻擋自波導輻射至本體樣品之光及環境光及/或感測器之雜散光以及為反應腔室提供製造路徑。反應腔室為將樣品置放在底部及波導之消散波之較高激發之區域內之蝕刻結構。選擇性表面化學物用於提供具有不同組成之反應腔室之底部及側壁，以使得樣品可選擇性地定位於反應腔室底部。 在一些實施例中，可使用選擇性表面官能化及/或表面鈍化之不同技術獲得選擇性表面化學物，例如如例示性反應容器7-2中一般所描繪。舉例而言，反應容器7-2可包含金屬堆疊，其中側壁表面處金屬之曝露部分包含金屬氧化物。在一些實施例中，金屬氧化物表面可鈍化以使得其為惰性的或針對官能化試劑及/或樣品為反應性最低。如所示，在一些實施例中，「氧化物」層可指由其曝露表面上之二氧化矽構成之透明層。在一些實施例中，氧化物或二氧化矽表面可選擇性地官能化以將樣品限制在反應容器7-2之底部表面處或附近。 在每例示性工作流7-3之定序反應期間，特定核苷酸之併入可區別於四種經發光標記之核苷酸。在實驗時程通篇，存在兩個不同時間段：脈衝時間段及偵測時間段。在脈衝時間段期間，持續20皮秒，未採集到發射光。在脈衝時間段為偵測時間段之後，持續10奈秒，其中四個時間頻段捕獲歷經偵測時間段(i)存在之發射事件。脈衝及偵測時間段包含一個循環。發射事件為歷經1百萬循環(ii)之時程持續分組及累積。橫跨時間頻段之發射事件之總體分佈代表發光壽命且可用於使特定資料組匹配已知壽命分佈(iii)。在一些實施例中，發射事件(例如發光壽命)之分佈不使一個經發光標記之鹼基區別於多個其他標記分子。除了發射事件之分佈之外，發射事件(例如發光強度)之數量可用於自多個其他分子鑑別單分子。 圖8A為由非蛋白質(例如核酸)保護分子(101)間隔開的發光分子及核苷酸之非限制性實例。非蛋白質保護分子之非限制性實例可包括核酸分子，例如去氧核糖核酸、核糖核酸及其組合。在一些實施例中，核酸保護分子包含一或多種保護元件(例如位於一或多種核苷酸之連接位點與一或多種標記物之間)。如所示，發光分子及核苷酸直接連接至非蛋白質保護分子(例如共價連接)。在一些實施例中，發光分子及核苷酸直接連接至非蛋白質保護分子之連續部分。舉例而言，在一些實施例中，非蛋白質保護分子為核酸分子，且發光分子及/或核苷酸直接鍵結至核酸分子之核苷酸。在一些實施例中，發光分子及/或核苷酸經由為非蛋白質保護分子之非連續部分之連接子連接至非蛋白質保護分子。舉例而言，在一些實施例中，非蛋白質保護分子為核酸分子，且發光分子及/或核苷酸經由連接子連接至核酸。 在一些實施例中，發光分子及核苷酸可經由反應性部分連接至非蛋白質(例如核酸)保護分子，如圖8B中所描繪。在本實例中，發光分子上之反應性部分(550)經由非蛋白質保護分子上之對應的反應性部分(500)共價連接至非蛋白質保護分子。核苷酸上之反應性部分(551)經由非蛋白質保護分子上之對應的反應性部分(501)共價連接至非蛋白質保護分子(101)。在一些實施例中，反應性部分500及/或反應性部分501直接連接至非蛋白質保護分子之連續部分。在一些實施例中，反應性部分500及/或反應性部分501經由為非蛋白質保護分子之非連續部分之連接子連接至非蛋白質保護分子。 在一些實施例中，一或多種發光標記及/或一或多種聚磷酸核苷可使用此項技術中已知之化學偶合技術連接至核酸連接子(例如非蛋白質保護分子)。舉例而言，在一些實施例中，點擊化學技術(例如銅催化、應變促進、無銅單擊化學方法等)可用於將一或多種發光標記及一或多種聚磷酸核苷連接至核酸。因此，在一些實施例中，圖8B中描繪之反應性部分對501/551及500/550可包括反應性胺、疊氮化合物、炔烴、硝酮、烯烴(例如環烯烴)、四嗪、四唑及適於點擊反應及類似偶合技術之其他反應性部分。 在一些實施例中，非蛋白質保護分子為寡核苷酸(例如DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或其變體)。在一些實施例中，寡核苷酸為單股的。在一些實施例中，發光標記直接地或間接地連接至單股寡核苷酸之一端(例如5'端或3'端)，且一或多種核苷酸直接地或間接地連接至單股寡核苷酸之另一端(例如3'端或5'端)。舉例而言，單股寡核苷酸可包含連接至寡核苷酸之5'端之發光標記及連接至寡核苷酸之3'端之一或多種核苷酸(例如相同類型)。替代地，在一些實施例中，單股寡核苷酸可包含連接至寡核苷酸之3'端之發光標記及連接至寡核苷酸之5'端之一或多種核苷酸(例如相同類型)。 在一些實施例中，寡核苷酸為雙股的(例如寡核苷酸包含兩種緩冷配對互補寡核苷酸股)。在一些實施例中，發光標記直接地或間接地連接至雙股寡核苷酸之一端，且一或多種核苷酸直接地或間接地連接至雙股核苷酸之另一端。在一些實施例中，發光標記直接地或間接地連接至雙股寡核苷酸之一個股，且一或多種核苷酸(例如相同類型)直接地或間接地連接至雙股核苷酸之另一股。舉例而言，雙股寡核苷酸可包含連接至寡核苷酸之一個股之5'端之發光標記及連接至另一股之5'端之一或多種核苷酸(例如相同類型)。替代地，在一些實施例中，雙股寡核苷酸可包含連接至寡核苷酸之一個股之3'端之發光標記及連接至另一股之3'端之一或多種核苷酸(例如相同類型)。 在一些實施例中，一或多種發光標記及/或一或多種核苷酸(例如相同類型)可連接在單股或雙股寡核苷酸上之一或多個不同位置處，包括在寡核苷酸之一或多個末端及/或內部位置處。 例示性實施例描繪在圖8C中，其中經發光標記之核苷酸包含寡核苷酸保護分子。如所示，當核苷酸鍵結至聚合酶時，寡核苷酸提供發光標記(例如一或多種染料)與聚合酶之間的距離。因此，在一些實施例中，寡核苷酸可適用於充當防止或限制發光標記與聚合酶之間的相互作用程度之立體阻擋層。另外，寡核苷酸可吸收發光分子發射之輻射及/或非輻射衰變。此類功能可有利地保護聚合酶免受降解或功能缺失。 圖8C中所示之非限制性實例描繪包含連接至一個股之一端(例如5'端)之發光標記及連接至同一股之另一端(例如3'端)之核苷酸之雙股寡核苷酸保護分子。在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含連接至第一股之發光標記及連接至第二股之一或多種核苷酸，如圖8D中所描繪。如所示，核酸815 (例如雙股寡核苷酸)包含15個鹼基對。核酸815包含經由連接子815-2連接至核酸之第一寡核苷酸股之發光標記815-1及經由連接子815-4連接至核酸之第二寡核苷酸股之核苷酸815-3 (例如聚磷酸核苷描繪為六磷酸核苷)。將核苷酸815-3連接至核酸815之連接子815-4之化學結構展示於圖9-2中，但可根據本文中其他處描述之連接子分子設計任何適合的連接子。 圖8D進一步描繪核酸820及822，各自包含具有20個鹼基對之雙股寡核苷酸。如所示，核酸820包含外部發光標記820-1。在一些實施例中，「外部」發光標記係指連接至寡核苷酸股之末端(例如5'或3'端)之發光標記。在一些實施例中，外部發光標記連接在寡核苷酸股上5'-大部分或3'-大部分鹼基處。然而，在一些實施例中，寡核苷酸股可包含額外鹼基作為懸垂區域，其中額外鹼基不與核酸之相對股鹼基配對。在此類實施例中，可認為外部發光標記連接在形成與相對股鹼基配對之5'-大部分或3'大部分之寡核苷酸股上之鹼基處。核酸822包含內部發光標記822-1。在一些實施例中，「內部」發光標記係指連接在沿著寡核苷酸股在任一側面上具有一或多種鹼基配對核苷酸之寡核苷酸股內之位置處之發光標記。因此，若沿著股之連接位點上游之至少一個核苷酸及下游之至少一個核苷酸與相對股鹼基配對，則據稱發光標記可為內部發光標記。在一些實施例中，內部發光標記經由無鹼基位點或核鹼基連接至寡核苷酸股。在一些實施例中，內部發光標記整合於寡核苷酸主鏈內。 應瞭解，寡核苷酸保護分子可具有任何長度，如圖8D中之例示性構築體之改變長度所示(例如15個鹼基對核酸815、20個鹼基對核酸820、30個鹼基對核酸830及45個鹼基對核酸845)。舉例而言，由15個鹼基對及25個鹼基對組成之例示性寡核苷酸分別展示於圖8E及圖8F中以及定序實驗之例示性結果。在一些實施例中，寡核苷酸可具有約10或大於10，約20或大於20，約30或大於30，約40或大於40，約50或大於50，約60或大於60，約70或大於70，約80或大於80，約90或大於90，約100或大於100，約125或大於125，約150或大於150，約175或大於175，約200或大於200，約250或大於250，約300或大於300，約350或大於350，約400或大於400，約450或大於450，約500或大於500之長度。在一些實施例中，寡核苷酸具有小於20，小於30，小於40，小於50，小於60，小於70，小於80，小於90，小於100，小於125，小於150，小於175，小於200，小於250，小於300，小於350，小於400，小於450，小於500，或小於600個鹼基之長度。在一些實施例中，寡核苷酸連接子足夠長以保護聚合酶免於連接至寡核苷酸連接子之標記之發射，而亦足夠短以允許在定序反應期間激發且偵測標記。 應瞭解，發光標記及/或一或多種核苷酸可連接在寡核苷酸中之任何位置處。在一些實施例中，發光標記及/或一或多種核苷酸連接在5'或3'端處或大約在5'或3'端處。在一些實施例中，發光標記連接在寡核苷酸之內部位置處以使得發光標記非常接近於寡核苷酸之較大部分。舉例而言，圖8G描繪包含內部染料之例示性寡核苷酸及包含外部染料之例示性寡核苷酸以及在定序實驗中利用任一者之例示性結果。在一些實施例中，內部發光標記(例如內部染料)一般係指當相比於外部發光標記(例如外部染料)時緊密接近之寡核苷酸之較大部分包圍之發光標記。在一些實施例中，包圍發光標記之寡核苷酸之較大部分提供用於吸收發光標記發射之輻射及/或非輻射衰變之更大阻擋層。 可使用此項技術中已知之任何方法產生包含寡核苷酸保護分子之經發光標記之核苷酸。舉例而言，圖8H描繪一種非限制性途徑，其中發光標記及核苷酸連接在寡核苷酸之同一股之相對端處。在此實施例中，發光標記及核苷酸使用反應性基團化學方法連接至第一股，且第二互補股隨後緩冷配對至第一股。如上文所指示，在一些實施例中，發光標記及一或多種核苷酸可連接至寡核苷酸保護分子之不同股(例如在3'及/或5'端處)。圖8I描繪例示性方法，其中包含發光標記之第一股緩冷配對至包含核苷酸之第二互補股。 如本文所描述，保護分子可包含發光標記(例如具有一或多種染料之標記)。在一些實施例中，保護分子可包含一或多種適用於吸收發光標記發射之輻射及/或非輻射衰變之部分(例如能量吸收部分)。舉例而言，圖8J描繪將多種染料連接至例示性寡核苷酸保護分子之股之非限制性方法，其中反應性基團化學方法用於將兩種染料共價連接至寡核苷酸上之連接子。如所示，連接子包含三重態淬滅劑，其可吸收由激發成高度反應性狀態之發光標記產生之任何潛在有害的作用。在圖8J中所示之實例中，展示能量吸收部分共價連接至同一股作為發光標記(例如染料分子)。在一些實施例中，能量吸收部分可靠近發光標記，但連接至緩冷配對至具有如下文所描述之發光標記之股之互補股。 除了提供聚合酶保護作用之化學部分之外，寡核苷酸結構基元涵蓋於本文中。在一些實施例中，一或多種未標記結構基元(例如能夠形成穩定莖-環或其他結構之寡核苷酸序列)位於發光標記與聚磷酸核苷(例如未標記莖結構存在於標記之位置與聚磷酸核苷之位置之間)之間的核酸連接子上。舉例而言，圖8K描繪包含三個莖環結構之寡核苷酸保護分子。在一些實施例中，寡核苷酸保護分子可包含一或多個莖環結構(例如2、3、4、5、6、7、8、9或大於9個)且可為單股的。在一些實施例中，寡核苷酸保護分子可包含一或多個莖環結構(例如2、3、4、5、6、7、8、9或大於9個)且可為雙股的。舉例而言，圖8L描繪包含莖環結構之例示性雙股寡核苷酸保護分子。在一些實施例中，莖環提供之發光標記與一或多種核苷酸之間的區域中之增加的結構提供較大區域，其中寡核苷酸可空間上阻礙發光標記與聚合酶之間的相互作用。 在一些實施例中，寡核苷酸保護分子包含一個莖環(例如髮夾結構)。在一些實施例中，寡核苷酸保護分子包含兩個莖環。在一些實施例中，寡核苷酸保護分子包含三個莖環。在一些實施例中，寡核苷酸保護分子包含四個莖環。在一些實施例中，寡核苷酸保護分子包含5、6、7、8、9或10或多於10個莖環。 本文所描述之寡核苷酸保護分子涵蓋額外核酸結構基元。在一些實施例中，寡核苷酸保護分子包含三個或多於三個核酸股(例如3、4、5、6、7或8或多於8個核酸股)。在一些實施例中，寡核苷酸保護分子包含四個核酸股。舉例而言，寡核苷酸保護分子可包含霍利迪連結體，如圖8M中所描繪。在一些實施例中，一或多種結構基元(例如莖環、霍利迪連結體)可提高寡核苷酸保護分子之硬度以使發光標記與聚合酶之間的平均距離最大化。在一些實施例中，相關平均距離係指當連接至標記之聚磷酸核苷在聚合酶活性位點(例如在併入生長股中期間)中時發光標記與聚合酶之間的距離。 在一些實施例中，額外結構基元(例如基於寡核苷酸保護分子之序列賦予之物理特性及/或基於寡核苷酸保護分子之一或多個部分之一或多種化學修飾)可包括於單股或雙股寡核苷酸保護分子中，例如以提高硬度或提供特定3維構造。在一些實施例中，一或多個緩冷配對區域(例如兩種寡核苷酸之莖結構或雜交互補區域)可經穩定化(例如藉由共價修飾)。 在一些實施例中，寡核苷酸保護分子上之一或多個位置可經修飾以包括一或多種能量吸收部分。在一些實施例中，一或多種能量吸收部分可添加至連接標記之同一核酸股中(參見作為非限制性實例之圖8J)。在一些實施例中，一或多種能量吸收部分可添加至與在雙股寡核苷酸保護分子(例如一或多種能量吸收部分可包括在連接至一或多種核苷酸之互補股上)之情況下標記之股之不同股中，例如如下文更詳細地描述。 因此，在一些實施例中，經發光標記之核苷酸可以圖8N中描繪之通用形式8-100提供。如所示，發光標記結構域(星形形狀、點線)經由二聚結構域非共價連接至核苷酸結構域(圓圈形狀、點線)。在一些實施例中，二聚結構域係指在發光標記結構域與核苷酸結構域之間提供非共價鍵之區域。舉例而言，在一些實施例中，通用結構8-100為互補寡核苷酸二聚體，其包含：包含發光標記結構域之標記寡核苷酸股8-110及包含核苷酸結構域之未標記寡核苷酸股8-120。應理解，在寡核苷酸保護分子(例如寡核苷酸二聚體)之情況下，核苷酸結構域係指經配置以併入生長核酸股(例如在定序反應期間)中之一或多種核苷酸(例如磷酸核苷)。在一些實施例中，一或多種核苷酸包含一或多種單磷酸核苷或聚磷酸核苷(例如二或三磷酸核苷或具有超過三種5'磷酸酯之核苷等)。在一些實施例中，一或多種磷酸核苷(例如聚磷酸核苷)可經由末端磷酸酯連接至形成如本申請案中所描述之保護分子之部分寡核苷酸(例如未標記寡核苷酸股)。在一些實施例中，本申請案中描述之組合物或方法中之任一者，磷酸核苷(例如聚磷酸核苷)之磷酸酯部分(例如聚磷酸酯部分)包括一或多種磷酸酯或其變體。舉例而言，在一些實施例中，磷酸核苷(例如聚磷酸核苷)之磷酸酯部分(例如聚磷酸酯部分)可包括磷酸酯、硫酯、胺基磷酸酯、烷基膦酸酯鍵、其他適合之鍵或大於一種此類修飾或其兩者或多於兩者之組合。在一些實施例中，標記及未標記股實質上彼此互補(例如在二聚結構域之長度內，其中二聚結構域內之股可具有例如至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%彼此互補)。在此類實施例中，標記及未標記股可經緩冷配對以形成雙股構築體，其中緩冷配對部分構成二聚結構域，且兩個股之緩冷配對產生經發光標記之核苷酸8-100。在一些實施例中，二聚結構域含有5至100個鹼基對，例如10至50個鹼基對，15至45個鹼基對，或其他範圍內之鹼基對，例如基於以下非限制性尺寸中之任一者之組合。在一些實施例中，二聚結構域含有至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少100、至少250個鹼基對。在一些實施例中，二聚結構域含有不超過500、不超過300、不超過200、不超過150、不超過100、不超過75、不超過70、不超過65、不超過60、不超過55、不超過50、不超過45、不超過40、不超過35、不超過30、不超過25、不超過20、不超過15、不超過10個鹼基對。在一些實施例中，二聚結構域含有15個鹼基對。在一些實施例中，二聚結構域含有30個鹼基對。在一些實施例中，二聚結構域含有45個鹼基對。 在一些實施例中，發光標記結構域及核苷酸結構域可有利地藉由二聚結構域間隔開。舉例而言，在一些實施例中，在通用形式8-100係指雙股寡核苷酸構築體之情況下，發光標記結構域及核苷酸結構域描繪在緩冷配對之寡核苷酸二聚體之相反末端處。因此，在一些實施例中，發光標記結構域及核苷酸結構域各自分別連接在標記及未標記股之3'端處或附近(例如連接在3'-大部分核苷酸處，連接在位於寡核苷酸序列中之3'-大部分核苷酸之1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或45%內之核苷酸處)。在一些實施例中，發光標記結構域及核苷酸結構域各自連接在5'端處或附近(例如連接在5'-大部分核苷酸處，連接在位於寡核苷酸序列中之5'-大部分核苷酸之1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或45%內之核苷酸處)。 如圖8N中所示，標記股8-110包含發光標記結構域(星形形狀、點線)。在一些實施例中，發光標記結構域係指具有一或多種發光分子之標記股之區域。舉例而言，在一些實施例中，標記股8-111之發光標記結構域由一種發光分子(星形形狀、實線)組成。在一些實施例中，標記股8-112之發光標記結構域由兩種發光分子組成。如結構8-112中所描繪，具有多於一種發光分子之發光標記結構域可類似分支鏈結構。應瞭解，醫師可基於所需特性(例如發光特性，諸如壽命、強度、量子產率等)確定待包括在單一標記股上之發光分子之數目。連接至發光標記結構域之發光分子之數目之非限制性實例包括2-10 (例如2、3、4、5、6、7、8、9、10)、10-15、15-20或其他適合之數目。發光分子可連接在線性、分支鏈、線性及分支鏈之組合或其他構造中。因此，通用標記股8-113展示具有：具有第一發光分子之發光標記結構域及兩個額外分支鏈發光標記部分(點線)，各發光標記部分具有一或多種發光分子。 在一些實施例中，未標記股之核苷酸結構域可以類似方式設計。舉例而言，如圖8N中所示，在一些實施例中，未標記股8-120包含核苷酸結構域(圓圈形狀、點線)。在一些實施例中，核苷酸結構域係指具有一或多種核苷酸(例如一或多種聚磷酸核苷)之未標記股之區域。在一些實施例中，未標記股8-121之核苷酸結構域由一個核苷酸(圓圈形狀、實線)組成。在一些實施例中，未標記股8-122之核苷酸結構域由兩種核苷酸組成。如結構8-122中所描繪，具有多於一種核苷酸之核苷酸結構域可類似分支鏈結構。應瞭解，醫師可基於所需特性(例如核酸定序反應中之特性，諸如反應動力學、讀取長度、接近聚合酶等)確定待包括於單一未標記股上之核苷酸結構域中之核苷酸之數目。連接至核苷酸結構域之核苷酸之數目之非限制性實例包括2-10 (例如2、3、4、5、6、7、8、9、10)、10-15、15-20或其他適合之數目。核苷酸可連接在線性、分支鏈、線性及分支鏈之組合或其他構造中。因此，通用未標記股8-123展示具有：具有第一核苷酸之核苷酸結構域及兩個額外分支鏈核苷酸部分(點線)，各核苷酸部分具有一或多種核苷酸。分支鏈核苷酸之非限制性實例展示於圖8O中，其描繪經由分支鏈胸苷寡核苷酸連接子在核苷酸結構域中具有多於一種核苷酸(Nu)之各種未標記股組態。儘管藉助於實例在連接子中描繪胸苷，但在一些實施例中，可使用替代寡核苷酸連接子(例如胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷或其任何組合)。在一些實施例中，未標記股可包含可適用於例如核酸定序反應中之額外修飾。 如圖8N中所描繪，包含核苷酸結構域之未標記股8-131可進一步包含能量吸收修飾(正方形形狀、實線)。在一些實施例中，能量吸收修飾係指保護核酸定序反應完整性(例如避免對標記激發態產生之反應性物質之聚合酶之損傷作用)之任何化學部分。舉例而言，在一些實施例中，能量吸收修飾藉由以下中之任一者保護定序反應之完整性：吸收、淬滅或以其他方式緩解反應性物質(例如反應性氧物質、自由基或任何三重態分子)之作用；在發光標記結構域與核苷酸結構域之間提供立體阻擋層；當相比於在能量吸收修飾不存在下進行之反應時，提高定序反應中之讀取長度；當相比於在能量吸收修飾不存在下進行之反應時，提高定序反應之讀取準確度；或其任何組合。 如所示，在一些實施例中，能量吸收修飾在與核苷酸結構域相對之未標記股之末端處或附近。如自通用寡核苷酸二聚體8-100應瞭解，未標記股8-131中之能量吸收修飾可有利地定位成鄰近於緩冷配對構築體中之發光標記結構域。因此，在一些實施例中，在發光標記結構域及核苷酸結構域連接在其各別股之3'端處或附近之情況下，能量吸收修飾連接在未標記股之5'端處或附近(例如連接在5'-大部分核苷酸處，連接在位於寡核苷酸序列中之5'-大部分核苷酸之1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或45%內之核苷酸處)。在一些實施例中，在發光標記結構域及核苷酸結構域連接在其各別股之5'端處或附近之情況下，能量吸收修飾連接在未標記股之3'端處或附近(例如連接在3'-大部分核苷酸處，連接在位於寡核苷酸序列中之3'-大部分核苷酸之1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或45%內之核苷酸處)。在一些實施例中，未標記股可包含多於一種能量吸收修飾。在一些實施例中，能量吸收修飾可包括在不為互補二聚結構域之部分之寡核苷酸突出端(例如3'或5'突出端)內。突出端可具有任何適合的長度，例如長度為1至10 (例如約5)或10至20個核苷酸(或其他適合之長度)。 舉例而言，在一些實施例中，未標記股8-132包含兩種能量吸收修飾。如結構8-132中所描繪，具有多於一種能量吸收修飾之未標記股可類似分支鏈結構。應瞭解，未標記股可包含任何數目之能量吸收修飾，其可例如視給定能量吸收修飾之特性或發光標記結構域中之發光分子之特性及/或數目而變化。能量吸收修飾(例如連接至任一個或兩個股)之數目之非限制性實例包括2-10 (例如2、3、4、5、6、7、8、9、10)、10-15、15-20或其他適合之數目。能量吸收修飾可連接在線性、分支鏈、線性及分支鏈之組合或其他構造中。因此，通用未標記股8-133展示具有第一能量吸收修飾及兩個額外分支鏈能量吸收結構域(點線)，各能量吸收結構域具有一或多種能量吸收修飾。 在一些實施例中，可根據圖8P-8Q中所描繪之非限制性結構對未標記股作出一或多種能量吸收修飾。在一些實施例中，可根據下文描繪之非限制性結構對未標記股作出一或多種能量吸收修飾。在此等實例中，一或多種能量吸收修飾展示連接至寡核苷酸股(例如未標記寡核苷酸股)之5'端。 在一些實施例中，核酸連接子包含一或多種能量吸收修飾。在一些實施例中，一或多種能量吸收修飾包含多種淬滅部分(例如三重態淬滅劑)。淬滅部分可包含可檢測地淬滅本文所描述之一或多種發光標記之發射之任何染料分子。可基於一或多種發光標記之染料分子之特定類型選擇適合的淬滅部分。舉例而言，在一些實施例中，適當的淬滅部分具有展現與發光標記之發射譜帶至少一些光譜重疊之吸收譜帶。在一些實施例中，此重疊可在與淬滅部分之最大吸收波長相比更低或甚至更高波長發射最大值下存在之供體之發射之情況下發生，限制條件為存在足夠的光譜重疊。在一些實施例中，能量傳遞亦可經由供體發射轉移至受體之更高電子狀態進行。在一些實施例中，適當的淬滅部分能夠自可能損傷聚合酶之一或多種發光標記吸收特定能階發射。在此類實施例中，可選擇淬滅部分以優先(例如選擇性地)吸收發射光譜之一部分，其包括潛在地損傷聚合酶，而不會吸收偵測為信號(例如在定序反應期間)之發射光譜之部分的發射能階。 適用作淬滅部分之廣泛多種化學反應染料及螢光團為此項技術中已知的(參見例如MOLECULAR PROBES HANDBOOK,第六版, Richard P. Haugland編 (1996),尤其第1-3章；MOLECULAR PROBES HANDBOOK, 第七版, Richard P. Haugland編；BIOPROBES 26 (1997年10月)；BIOPROBES 27 (1998年2月)；BIOPROBES 28 (1998年5月)；BIOPROBES 29 (1998年11月)；BIOPROBES 30 (1999年1月)；BIOPROBES 31 (1999年5月): BIOPROBES 32 (1999年12月)；及BIOPROBES 33 (2000年2月)；全部以引用之方式併入本文中)。溶液中或共軛至寡核苷酸時之候選染料之光譜特性為吾人所知或易於使用光譜螢光計來量測。 在一些實施例中，淬滅部分為芘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-胺基-7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑(NBD)、花青、羰花青、卡波帝(carbostyryl)、卟啉、水楊酸鹽、鄰胺基苯甲酸鹽、薁、苝、吡啶、喹啉、香豆素(包括羥基香豆素及胺基香豆素及其氟化及磺化衍生物(如Gee等人(1998)之美國專利第5,830,912號及Wang等人(1997)之美國專利第5,696,157號中所描述，其以引用之方式併入本文中)、聚氮雜陰丹(polyazaindacene) (例如Haugland等人(1988)之美國專利第4,774,339號；Kang等人(1993)之美國專利第5,187,288號；Haugland等人(1993)之美國專利第5,248,782號；Kang等人(1993)之美國專利第5,274,113號；Kang等人(1995)之第5,433,896號；Wu等人(1999)之美國專利第6,005,113號，全部以引用之方式併入本文中)、二苯并哌喃、噁嗪或苯并噁嗪、卡巴嗪(Corey (1989)之美國專利第4,810,636號，以引用之方式併入)或芴酮或苯芴酮(Babb等人(1989)之美國專利第4,812,409號，以引用之方式併入)。 在一些實施例中，淬滅部分為非螢光染料。舉例而言，在一些實施例中，淬滅部分可選自偶氮染料(諸如DABCYL或DABSYL染料及其結構類似物)；三芳基甲烷染料，諸如孔雀綠或酚紅；經4',5z-二醚取代之螢光素(美國專利第4,318,846號(1982))或不對稱花青染料淬滅劑(PCT國際申請案WO 99 37,717 (1999))。 在一些實施例中，核酸連接子包含具有兩種或多於兩種(例如三種)淬滅部分之未標記股。舉例而言，在一些實施例中，未標記股包含下文描繪之經參水溶性維生素E修飾之股。然而，可使用其他類似結構且併入核酸連接子中(例如在發光標記與聚磷酸核苷之間的位置處)。在一些實施例中，包含三種淬滅部分之未標記股為經參四甲基哌啶氧化物(tempo)修飾之股：在一些實施例中，核酸連接子包含一或多種並不充當發色團之能量吸收修飾。在此類實施例中，一或多種能量吸收修飾可藉由在發光標記與聚磷酸核苷之間提供立體阻擋層起作用，該等阻擋層阻止發光標記與聚合酶相互作用。在一些實施例中，核酸連接子包含充當立體阻擋層之分支鏈聚合結構。在一些實施例中，分支鏈聚合結構包含兩種或多於兩種基於聚醚之結構。舉例而言，在一些實施例中，分支鏈聚合結構包含基於聚乙二醇(PEG)之結構，如描繪未標記股之末端修飾之以下結構中所示。然而，應瞭解，可使用其他類似分支結構且併入核酸連接子中(例如在發光標記與聚磷酸核苷之間的位置處)。在一些實施例中，核酸連接子包含充當立體阻擋層之樹枝狀結構。舉例而言，在一些實施例中，核酸連接子包含具有聚酯-16-羥基雙-MPA樹枝狀修飾之未標記股，如描繪末端經修飾之未標記股之以下結構中所示。應瞭解，預想任何數目之分支適用於此等及類似實施例，因為可根據特定標記核苷酸構造使分支數目最佳化。舉例而言，在一些實施例中，具有多種發光標記之核酸連接子可能需要更大數目之分支以提供相對於具有單一發光標記之類似連接子更大的立體阻擋層。在一些實施例中，末端經修飾之未標記股為聚酯-8-羥基雙-MPA樹枝狀經修飾之股：如上文中所描述，在一些實施例中，能量吸收修飾為保護定序反應完整性之未標記股之修飾。根據本發明中所提供之技術，核酸定序反應可使用多種類型經發光標記之核苷酸進行，其中核苷酸之發光特性為某些類型核苷酸獨有的。因此，在一些實施例中，此等獨特發光特性中之一或多者之偵測允許鑑別特定類型的核苷酸。因而，在一些實施例中，對一或多種經發光標記之核苷酸作出之任何能量吸收修飾不應干擾基於各別獨特發光特性偵測特定類型核苷酸之能力。舉例而言，各種染料(Chromis530N、Dylight554R1及Cy3B)各自連接至標記股，且各標記股緩冷配對至具有6-單糖-突出端能量吸收修飾或6-甘油樹狀體突出端能量吸收修飾之未標記股，且量測各寡核苷酸二聚體之發光強度及壽命值。如表3中所呈現之結果中所示，發光特性之任何改變歸因於大約橫跨染料分子按比例調整之能量吸收修飾。因此，經發光標記之寡核苷酸二聚體保留將允許各自在混合物中之鑑別之獨特發光特性。 表3.能量吸收修飾對經標記之寡核苷酸之作用。 因此，發光標記可直接例如藉由一鍵連接至分子，或可經由連接子或連接子構造連接。在某些實施例中，連接子包含一或多種磷酸酯。在一些實施例中，核苷酸藉由包含一或多種磷酸酯之連接子連接至發光標記。描述為具有一或多種磷酸酯之連接子係指包含存在於連接子結構內之一或多種磷酸酯(不直接連接至核苷酸之一或多種磷酸酯)的連接子。在一些實施例中，核苷酸藉由包含三種或多於三種磷酸酯之連接子連接至發光標記。在一些實施例中，核苷酸藉由包含四個或多於四種磷酸酯之連接子連接至發光標記。 在某些實施例中，連接子包含脂族鏈。在一些實施例中，連接子包含-(CH₂ )_n -，其中n為1至20 (包括端點)之整數。在一些實施例中，n為1至10 (包括端點)之整數。在某些實施例中，連接子包含雜脂族鏈。在一些實施例中，連接子包含聚乙二醇部分。在一些實施例中，連接子包含聚丙二醇部分。在一些實施例中，連接子包含-(CH₂ CH₂ O)_n -，其中n為1至20 (包括端點)之整數。在一些實施例中，連接子包含-(CH₂ CH₂ O)_n -，其中n為1至10 (包括端點)之整數。在某些實施例中，連接子包含-(CH₂ CH₂ O)₄ -。在某些實施例中，連接子包含一或多種伸芳基。在一些實施例中，連接子包含一或多種伸苯基(例如對位取代伸苯基)。在某些實施例中，連接子包含對掌性中心。在一些實施例中，連接子包含脯胺酸或其衍生物。在一些實施例中，連接子包含脯胺酸六聚體或其衍生物。在一些實施例中，連接子包含香豆素或其衍生物。在一些實施例中，連接子包含萘或其衍生物。在一些實施例中，連接子包含蒽或其衍生物。在一些實施例中，連接子包含聚苯基醯胺或其衍生物。在一些實施例中，連接子包含苯并二氫吡喃或其衍生物。在一些實施例中，連接子包含4-胺基炔丙基-L-苯丙胺酸或其衍生物。在某些實施例中，連接子包含多肽。 在一些實施例中，連接子包含寡核苷酸。在一些實施例中，連接子包含兩個緩冷配對寡核苷酸。在一些實施例中，一或多種寡核苷酸包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或鎖定核糖核苷酸。 在某些實施例中，連接子包含光穩定劑。在一些實施例中，連接子具有下式：， 其中P^S 為光穩定劑，位置標記d連接至發光標記，且位置標記b連接至核苷酸。在一些實施例中，位置標記d藉由如本文所描述之連接子連接至發光標記。在一些實施例中，位置標記b藉由如本文所描述之連接子連接至核苷酸。 在某些實施例中，連接子包含一或多種磷酸酯、脂族鏈、雜脂族鏈及一或多種醯胺(例如-C(=O)NH-)。在某些實施例中，包含一或多種磷酸酯及脂族鏈之連接子可經由圖9中描繪之例示性反應流程9-1合成。在某些實施例中，連接子含有一或多種官能化反應性部分(例如乙炔基、疊氮基)。 等效物及範疇 本申請案之各種態樣可單獨、組合或以前文中所描述之實施例中未具體論述的多種配置使用，且因此不限於應用至前文描述中所闡述或圖式中所說明之組件之細節及配置。舉例而言，一個實施例中所描述之態樣可以任何方式與其他實施例中所描述之態樣組合。 此外，本發明可體現為一種方法，已提供其至少一個實例。作為方法之部分的所執行之動作可以任何適合的方式排序。因此，可建構如下實施例：其中動作以不同於所說明之次序的次序執行，亦即，可包括同時執行一些動作，即使此等動作在說明性實施例中被展示為連續動作。 在申請專利範圍中使用諸如「第一」、「第二」、「第三」等序數術語修飾請求項要素本身不意味著一個請求項要素相對於另一請求項要素的任何優先權、優先性或次序或執行方法動作之時間次序，而是僅用作標籤以區分具有某一名稱之一個請求項要素與具有相同名稱(但使用序數術語)之另一要素，以區分該等請求項要素。 此外，本文所使用之措詞及術語出於描述之目的且不應視為限制性。本文中對「包括」、「包含」或「具有」、「含有」、「涉及」及其變化的使用意謂涵蓋在其之後所列舉的項目及其等效物以及額外項目。

1-101‧‧‧核酸聚合酶
1-102‧‧‧待定序靶核酸/互補股
1-103‧‧‧連接子
1-104‧‧‧引物
1-110‧‧‧樣品槽
1-120‧‧‧目標體積
3-1‧‧‧例示性衰變曲線
3-2‧‧‧標準化累積分佈函數
4-1‧‧‧經發光標記之核苷酸之發光壽命
4-2‧‧‧核苷酸之發光強度
5-1‧‧‧強度跡線
5-2‧‧‧壽命曲線
5-3‧‧‧自資料測定之序列與模板核酸之已知序列之間的比對
6-1‧‧‧強度跡線
6-2‧‧‧壽命曲線
6-3‧‧‧自資料測定之序列與模板核酸之已知序列之間的比對
7-1‧‧‧經發光標記之核苷酸
7-2‧‧‧例示性反應容器
7-3‧‧‧例示性工作流
101‧‧‧非蛋白質保護分子
500‧‧‧反應性部分
501‧‧‧反應性部分
550‧‧‧反應性部分
551‧‧‧反應性部分
815‧‧‧核酸
815-1‧‧‧第一寡核苷酸股之發光標記
815-2‧‧‧連接子
815-3‧‧‧第二寡核苷酸股之核苷酸
815-4‧‧‧連接子
820‧‧‧核酸
820-1‧‧‧外部發光標記
822‧‧‧核酸
822-1‧‧‧內部發光標記
830‧‧‧核酸
845‧‧‧核酸
8-100‧‧‧通用形式/通用結構/經發光標記之核苷酸
8-110‧‧‧包含發光標記結構域之標記寡核苷酸股/標記股
8-111‧‧‧標記股
8-112‧‧‧標記股
8-113‧‧‧通用標記股
8-120‧‧‧包含核苷酸結構域之未標記寡核苷酸股/未標記股
8-121‧‧‧未標記股
8-122‧‧‧未標記股
8-123‧‧‧通用未標記股
8-131‧‧‧包含核苷酸結構域之未標記股/未標記股
8-132‧‧‧未標記股
8-133‧‧‧通用未標記股
9-1‧‧‧例示性反應流程

熟習此項技術者將理解，本文所描述之圖僅用於說明性目的。應理解，在一些情況下，可放大或增大展示本發明之各種態樣以便於本發明之理解。在該等圖中，在各種圖通篇，相同參考標號一般係指相同特徵、功能上類似及/或結構上類似的元素。圖式未必為按比例的，實際上重點在於說明教示內容之原理。圖式不意欲以任何方式限制本教示內容之範疇。 本發明之特徵及優點將自下文結合圖式所闡述之[實施方式]而變得更顯而易見。 當參考圖式描述實施例時，可使用方向參考(「之上」、「之下」、「頂部」、「底部」、「左側」、「右側」、「水平」、「垂直」等)。此類參考僅預期為讀者在正常方向觀看圖式之輔助。此等方向參考不意欲描述實施裝置之較佳或唯一方向。裝置可實施於其他定向中。 如自具體實施方式顯而易見，在本申請案通篇，圖(例如圖1-9)中描繪及出於說明的目的進一步描述之實例描述非限制性實施例，且在一些情況下可出於更清楚說明的目的簡化某些方法或省略特徵或步驟。 圖1展示含有用於核酸定序之各種組分之樣品槽之非限制性示意圖。 圖2展示用於四個階段之核酸定序之非限制性例示性實驗；(A)在併入經發光標記之核苷酸之前；(B)第一併入事件；(C)第一及第二併入事件之間的時間段；及(D)第二併入事件；以及在階段(A)-(D)期間原始及經處理數據之對應實例。 圖3描繪具有不同發光壽命及針對衰變機率標準化的累積分佈函數之四種發光分子之非限制性信號與發射時間。 圖4展示例示性經發光標記之核苷酸之發光壽命之非限制性圖表及發光強度之圖表。 圖5描繪四個經發光標記之核苷酸之非限制性定序實驗：(A)自綠色及紅色脈衝偵測到的發光之跡線；(B)基於各核苷酸併入之發光壽命及強度，來自綠色脈衝之資料減少；及(C)具有模板序列之以實驗方式測定之序列之比對。 圖6描繪四個經發光標記之核苷酸之非限制性定序實驗：(A)自綠色脈衝偵測到的發光之跡線；(B)基於各核苷酸併入之發光壽命及強度，來自綠色脈衝之資料減少；及(C)具有模板序列之以實驗方式測定之序列之比對。 圖7描繪非限制性定序實驗，其中經發光標記之核苷酸之發光特性用於鑑別併入定序反應物中之鹼基。 圖8A及圖8B描繪藉由核酸保護分子分離之發光分子及核苷酸之非限制性實例。 圖8C描繪包含對接在聚合酶活性位點中之核酸保護分子之非限制性經發光標記之核苷酸。如所示，經由5'-胺-染料連接子將染料分子連接至核酸，且核苷酸包含經由疊氮基-丙醇連接子連接至核酸之六磷酸核苷。 圖8D描繪核酸保護分子之非限制性實例。 圖8E描繪用包含15鹼基對核酸保護分子之經發光標記之六磷酸去氧胸苷進行之定序反應之非限制性實例。 圖8F描繪用各自包含25鹼基對核酸保護分子之Cy3標記腺苷及AlexaFluor-546標記胞苷進行之定序反應之非限制性實例。 圖8G描繪在20鹼基對核酸保護分子上使用內部發光標記或外部發光標記獲得之強度跡線之非限制性比較。 圖8H描繪具有連接在相同寡核苷酸股之相對端處之發光標記及核苷酸之核酸保護分子之非限制性實例。 圖8I描繪具有連接至不同寡核苷酸股之發光標記及核苷酸之核酸保護分子之非限制性實例。 圖8J描繪將多種染料連接至核酸保護分子股之非限制性方法。 圖8K描繪包含三個莖環及連接在寡核苷酸股主鏈內之兩個Cy3.5染料之非限制性單股核酸保護分子。 圖8L描繪包含可在染料與聚磷酸核苷之間提供距離及/或本體結構以保護聚合酶不與染料接觸之莖環結構之非限制性雙股寡核苷酸保護分子。 圖8M描繪形成霍利迪連結體之核酸保護分子之非限制性實例。 圖8N描繪包含雙股核酸保護分子之經發光標記之聚磷酸核苷之非限制性組態。 圖8O描繪經由支鏈胸苷寡核苷酸連接子具有核苷酸結構域中之多於一種核苷酸(Nu)之非限制性未標記之股組態。 圖8P-8Q描繪具有多種能量吸收修飾(修飾之非限制性實例展示連接至寡核苷酸股之5'端)之非限制性寡核苷酸結構。 圖9描繪用於核苷酸連接子合成及例示性結構之非限制性反應流程。

Claims (16)

1. 一種經發光標記之核苷酸，其包含經由核酸連接至一或多種聚磷酸核苷之一或多種發光標記，其中該核酸包含保護元件。
2. 如請求項1之經發光標記之核苷酸，其中該核酸為單股的。
3. 如請求項1之經發光標記之核苷酸，其中該核酸為雙股的。
4. 如請求項3之經發光標記之核苷酸，其中該核酸包含： 第一寡核苷酸股，其包含連接在沿著該第一寡核苷酸股之任一側面上具有一或多種核苷酸之內部位置處之該一或多種發光標記；及 第二寡核苷酸股，其包含該一或多種聚磷酸核苷，其中該第二寡核苷酸股係經緩冷配對至該第一寡核苷酸股。
5. 如前述請求項中任一項之經發光標記之核苷酸，其中兩種或多於兩種聚磷酸核苷經由包含多個胸苷核苷酸之連接子連接至核酸。
6. 如請求項5之經發光標記之核苷酸，其中該連接子包含分支鏈連接子。
7. 如前述請求項中任一項之經發光標記之核苷酸，其中該保護元件包含至少一種能量吸收修飾。
8. 如請求項7之經發光標記之核苷酸，其中該至少一種能量吸收修飾包含三重態淬滅劑。
9. 如請求項7之經發光標記之核苷酸，其中該至少一種能量吸收修飾包含樹枝狀修飾。
10. 如請求項7之經發光標記之核苷酸，其中該至少一種能量吸收修飾包含單醣-TEG、雙醣、N-乙醯基單醣、TEMPO-TEG、水溶性維生素E-TEG或甘油樹狀體。
11. 如前述請求項中任一項之經發光標記之核苷酸，其中該保護元件包含一或多種未標記莖-環。
12. 如請求項11之經發光標記之核苷酸，其中該一或多種發光標記中之至少一者藉由該一或多種未標記莖-環連接在與該一或多種聚磷酸核苷分離之莖-環之環處。
13. 如請求項4至12中任一項之經發光標記之核苷酸，其進一步包含係經緩冷配對至第一及第二寡核苷酸股中之至少一者之第三寡核苷酸股。
14. 如請求項13之經發光標記之核苷酸，其進一步包含係經緩冷配對至第一、第二及第三寡核苷酸股中之至少一者之第四寡核苷酸股。
15. 如請求項13之經發光標記之核苷酸，其中該等寡核苷酸股形成霍利迪連結體(Holliday junction)。
16. 一種測定模板核酸序列之方法，其包含： (i)使目標體積中之複合物曝露於多種類型經發光標記之核苷酸，該複合物包含該模板核酸、引物及聚合酶，其中各類型的經發光標記之核苷酸包含如請求項1之經發光標記之核苷酸； (ii)將一系列一或多種激發能量脈衝引向該目標體積附近； (iii)在連續併入包含該引物之核酸期間自經發光標記之核苷酸偵測多個發射光子；及 (iv)藉由測定該等發射光子之時序及視情況頻率鑑別併入的核苷酸之序列。