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TW201726140A - 治療癌症之新型生物標記及方法 - Google Patents

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TW201726140A
TW201726140A TW105130060A TW105130060A TW201726140A TW 201726140 A TW201726140 A TW 201726140A TW 105130060 A TW105130060 A TW 105130060A TW 105130060 A TW105130060 A TW 105130060A TW 201726140 A TW201726140 A TW 201726140A
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cancer
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沃德拉斯 艾瓦羅 艾維瓦
法蘭西斯可 亨柏頭 庫札雷鬼
凱文 哈德森
羅伯特 肯尼斯 麥可文
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瑞典商阿斯特捷利康公司
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Abstract

描述了用於治療與PI3K通路相關聯的病理狀況例如癌症之生物標記，以及使用PI3K通路的上游組分之抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑之方法。具體而言，描述了在癌症治療中用於患者選擇之生物標記，以及治療處理方法、診斷套組和檢測方法，其中具有PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA基因和/或AKT基因)之突變、以及野生型MAP3K1基因和MAP2K4基因的癌症會更可能有利地響應於用PI3K通路的上游組分的抑制劑進行的治療。

Description

治療癌症之新型生物標記及方法 【優先權要求】
本申請要求保護2015年9月17日提交的美國臨時申請案號62/219,698之權益，將該文獻藉由引用以其全文結合在此。
乳癌係世界上最普遍的癌症之一，每年診斷出超過1,300,000個病例並且每年死亡超過450,000例。治療乳癌最大的挑戰之一係它的異質性。大規模DNA定序的出現提供了乳癌的突變景觀，並且這種大規模DNA定序與拷貝數變異和基因表現數據的組合已經導致將乳癌分為十個綜合簇(柯帝士C(Curtis C)等人，《自然》(Nature)，2012，486，346-352和道森S-J(Dawson S-J)等人，EMBO J，2013，32，617-628)。已知PI3K/AKT/mTOR傳訊通路係癌細胞增殖、存活、代謝和凋亡的關鍵介導者(弗魯曼(Fruman)和隆美爾(Rommel)，《自然綜述》(Nature Reviews)2014，13，140-156)，以及對10個綜合簇的分析已經顯示磷酸肌醇-3-激酶、催化性α多肽(PIK3CA)，編碼PI3K的α同種型(PI3Kα)的基因在幾個雌激素受體陽性(ER+)簇中頻繁突變。總的說來，PIK3CA在45%的管腔A型乳癌病例中發生突變(癌症基因組阿特拉斯網路(Cancer Genome Atlas Network)，《自然》(Nature)，2012，490，61-70)。該等研究連同涉及該PIK3CA基因在腫瘤發生中的多種其他研究(概述於WO 2014/114928中)已經導致 相當大的研究努力以發現用於治療癌症的PI3K-α抑制劑。然而，癌症患者的反應率通常很低，並且迄今為止靶向PI3K-α抑制的抗癌劑尚未被批准。
作為PI3K的主要效應物，AKT由於生長因子受體傳訊而常常被發現於乳癌中。AKT藉由由PI3K活性產生的磷脂PIP3和PIP2啟動。膜結合的PDK1藉由PIP3直接啟動並且磷酸化位於啟動環上的Thr308上的AKT。例如，在HER2-陽性乳癌中，PI3K通路被啟動導致AKT的高活性，如藉由Thr308和Thr473的磷酸化(由MTORC2介導)所測量的。在ER+乳癌中，啟動型PIK3CA突變係普遍存在的，並且這超過了啟動生長因子以維持高水平PIP3和PIP2的需求，因此，通路活性藉由AKT介導。雖然不是所有的PI3K啟動的傳訊效應都歸因於AKT傳訊，但是這種激酶仍然是在該通路中的主要節點，並且一直是藥物發現和開發中的巨大努力的焦點。AKT同種型AKT1、AKT2和AKT3的抑制劑已經被開發並且目前正在乳癌的臨床試驗中。已經在ER+管腔型乳癌中鑒定了AKT1的啟動型突變。在超過80%的突變病例中，受影響密碼子係Glu17，其頻繁突變為賴胺酸(E17K突變)。在ER+管腔型乳癌中，此突變的發生率約為3%。認為這種或其他的啟動型突變會賦予AKT抑制劑敏感性，並且該假說目前正在臨床中進行測試。
最近乳癌患者的基因組研究也已經開始揭示促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在癌症中促進細胞存活或凋亡的可能作用，特別是藉由在MAP3K1和MAP2K4(JNK細胞死亡通路的兩個上游MAPK)中的失活型突變(範T(Pham T)等人，《基因和癌症》(Genes & Cancer)，2013，4，419-426)。在管腔A型乳癌中發現MAP3K1(13%-20%)和MAP2K4(約8%)中的突變，並且在11.56%的PIK3CA突變體中的臨床樣品中已經報導了PIK3CA和MAP3K1的同時突變(癌症基因組阿特拉斯網路(Cancer Genome Atlas Network)，《自然》(Nature)，2012，490，61-70和艾理斯M(Ellis M)等人，2012，《自然》(Nature)，486，353-360)。
該PIK3CA和MAP3K1/MAP2K4基因的同時突變作用於促進患者對PI3K通路的上游組分的抑制劑的反應(如果發生的話)的機制仍然是未知的。此外，對於該AKT和MAP3K1/MAP2K4基因的同時突變在此類患者的反應中的作用(如果有的話)瞭解甚少。因此，仍然需要瞭解PI3K通路(例如PIK3CA和AKT基因)的上游組分的基因突變與MAP3K1/MAP2K4基因突變之間的相互作用及其在腫瘤發生中的作用，以及任何這種相互作用在使用PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的患者治療中的相關性。
這篇說明書描述了用於治療與PI3K通路相關的病理狀況(例如癌症)的生物標記，以及使用PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑(例如PI3K抑制劑(例如PI3K-α抑制劑)或AKT抑制劑)之方法。具體而言，該說明書提供了在癌症治療中用於患者選擇的生物標記，以及治療處理之方法、診斷套組(kit)和檢測方法。
本文描述了鑒定和表徵編碼PI3K通路的上游組分的基因(例如該PIK3CA基因或AKT基因)的狀態、編碼MAP3K1或MAP2K4的基因的狀態與用PI3K通路的上游組分的抑制劑治療的易感性之間的關係。因此，這提供了用於選擇患者(尤其是癌症患者)用PI3K通路的上游組分的抑制劑進行治療和/或避免更不可能與該治療發生治療反應的患者治療而由 此避免不必要的治療以及可能與該無效治療有關的任何副作用的機會、方法以及工具。
本說明書部分涉及患者選擇工具和方法(包括個人化藥物)。該選擇係基於要處理的癌細胞是否具有PI3K通路的野生型或突變型上游組分(例如野生型或突變型PIK3CA基因或野生型或突變型AKT基因)以及野生型或突變型MAP3K1或MAP2K4基因。因此，PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA或AKT)的基因狀態和MAP3K1或MAP2K4基因狀態可以用作對用PI3K通路的上游組分的抑制劑治療具有易感性的生物標記。具體而言，該說明書描述了突變陽性PIK3CA基因或AKT基因和突變陽性MAP3K1或MAP2K4基因與作為結果的對用PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑(例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑)治療的敏感性的降低之間的聯繫。可替代地，該說明書描述了突變陽性PIK3CA基因或AKT基因和野生型MAP3K1和MAP2K4基因與作為結果的對用PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑(例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑)治療的敏感性的增加之間的聯繫。
在一個方面中，描述了一種治療患有癌症的患者之方法，該方法包括：(a)在代表該癌症且先前從該患者分離的樣品中，確定PI3K通路的上游組分的基因狀態是野生型還是突變型；(b)確定該樣品中的MAP3K1基因是野生型還是突變型；(c)確定該樣品中的MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且(d)向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑，如果：(i)PI3K通路的上游組分的基因狀態被確定為係突變型；(ii)該MAP3K1基因被確定為是野生型；並且(iii)該MAP2K4基因被確定為是野生型。
在另一方面，描述了一種治療患有癌症的患者之方法，該方法包括：(a)確定該患者的癌細胞中的AKT基因是野生型還是突變型；(b)確定該患者的癌細胞中的MAP3K1基因是野生型還是突變型；(c)確定該患者的癌細胞中的MAP2K4基因是野生型還是突變型；(d)向該患者給予有效量的AKT抑制劑，如果該等癌細胞具有：(i)突變型AKT基因；(ii)野生型MAP3K1基因；和(iii)野生型MAP2K4基因。
在另一方面，描述了PI3K通路的上游組分的抑制劑用於治療癌症之用途，其中該等癌細胞具有在PI3K通路的上游組分中的突變、野生型MAP3K1基因和野生型MAP2K4基因。
在另一方面，描述了一種用於取消選擇患有癌症的患者進行治療之方法，該方法包括：鑒定患有對用PI3K通路的上游組分的抑制劑的治療具有潛在易感性的癌症的候選患者；並且確定先前從該候選患者分離的代表該癌症的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；其中，如果該等癌細胞具有突變型MAP3K1或MAP2K4基因，則取消選擇該患者用PI3K通路的上游組分的抑制劑進行治療。
在另一方面，描述了一種治療患者體內的癌症之方法，該患者的PI3K通路的上游組分以及MAP3K1和MAP2K4的癌細胞基因狀態已經被確定，該方法包括：如果該等癌細胞具有在PI3K通路的上游組分中的突變、野生型MAP3K1基因和野生型MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑。
明確需要將針對以下患者富集或用於選擇該等患者的生物標記：該等患者的癌症將對用PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的治療起反應。鑒定不太可能對試劑反應的 患者的患者選擇生物標記在癌症的治療中也很重要，因為該等患者選擇生物標記會減少對此類試劑的潛在副作用無反應的癌症的患者之不必要治療，並且允許選擇最有可能受益於治療效果的患者進行治療。
【詳細說明】
生物標記可以描述為“作為正常生物過程、致病過程或對治療性干預的藥理學響應的指示劑客觀地經測量且評估的特性”。生物標記為與一種特定病狀或疾病有關的任何可鑒別且可測量的指示劑，其中在生物標記的存在或含量與該病狀或疾病的一些方面(包括該病狀或疾病的存在、它的含量或變化含量、它的類型、它的階段、它的易感性或對用於治療該病狀或疾病的藥物的反應)之間存在相關性。相關性可以為定性的、定量的或定性且定量的。典型地，生物標記為化合物、化合物片段或化合物組。該等化合物可以為在生物體中發現或藉由生物體產生的任何化合物，包括蛋白質(和肽)、核酸以及其他化合物。
生物標記可以具有預測能力，並且因此可以用於預測或檢 測特定病狀或疾病的存在、含量、類型或階段(包括特定微生物或毒素的存在或含量)、對特定病狀或疾病的易感性(包括遺傳易感性)或對特定治療(包括藥物治療)的響應。據認為在藥物發現和發展的未來，生物標記將藉由改良研究與發展程序的效率而發揮日益重要的作用。生物標記可以用作診斷劑、疾病進展監測劑、治療監測劑以及臨床結果預測劑。舉例來說，不同生物標記研究項目試圖鑒別出特定癌症和特定心血管疾病以及免疫疾病的標記。據相信新的經驗證的生物標記的發展將使醫療和藥物發展成本顯著降低，並且使多種疾病和病狀的治療顯著改善。
為了最佳設計臨床試驗並且為了從該等試驗獲得最多資訊，生物標記可以為需要的。標記在替代品和癌細胞或其中可檢測到標記的其他患者樣品中可以是可測量的。該等標記理想地也將與功效相關並且由此可以最終用於患者選擇。
因此，本發明的這一方面的根本技術問題為鑒別對用PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的治療的患者分類之方法。該技術問題藉由提供在此的申請專利範圍和/或說明書中所表徵的方面來解決。
如本文實例詳述的，發現具有MAP3K1或MAP2K4基因突變的細胞通常對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的生長抑制不太敏感。生長抑制會由於細胞增殖的抑制和/或增加的細胞死亡而發生。
該說明書提供了確定細胞對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的敏感性之方法。該等方法包括確定PI3K通路的上游組分的基因(例如PI3K-α基因或AKT基因)的狀態 以及在所述細胞中MAP3K1和MAP2K4基因的狀態。如果該等細胞具有在上游組分上的突變(例如突變的PIK3CA基因或AKT基因)並且該等細胞具有突變的MAP3K1或MAP2K4基因，那麼該等細胞被鑒定可能對PI3K通路的上游組分的抑制劑不敏感。因此，那些具有在上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)中的突變和突變的MAP3K1或MAP2K4基因的患者被預測對PI3K通路的上游組分的抑制劑(例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑)的治療特別不敏感。如果該等細胞具有在上游組分中的突變(例如突變的PIK3CA基因或AKT基因)並且該等細胞具有野生型MAP3K1和MAP2K4基因，那麼該等細胞被鑒定可能對PI3K通路的上游組分的抑制劑敏感。因此，那些具有在PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)中的突變以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因的患者被預測對PI3K通路的上游組分的抑制劑(例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑)的治療特別敏感。
具有突變的PIK3CA基因和野生型MAP3K1和MAP2K4基因的患者被預測對PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的治療敏感。具有突變的AKT基因和野生型MAP3K1和MAP2K4基因的患者被預測對AKT抑制劑的治療敏感。
如果在細胞生長測定中一種或多種抑制劑抑制細胞或細胞群數目的增加(藉由抑制細胞增殖和/或藉由增加細胞死亡)，那麼該細胞或細胞群對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑敏感。此處描述的方法可用於預測哪些細胞或細胞群藉由生長抑制更有可能對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑敏感。
在某種程度上，本揭露進一步基於可用於確定患者對PI3K通路的上游組分的抑制劑的可能響應性之方法，包括確定是否給予PI3K通 路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑。具體地，本發明的方法包括確定患者的一個或多個癌細胞中PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)以及MAP3K1和MAP2K4基因的基因狀態(例如野生型或突變型)。上游組分(例如突變型PIK3CA基因或AKT基因)的突變和突變的MAP3K1或MAP2K4基因的存在指示當癌細胞與PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑接觸時不太可能藉由生長抑制來響應。因此，上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)以及MAP3K1和MAP2K4基因的基因狀態(在癌細胞中)可用於選擇患者使用所述上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療。
此外，揭露了一種用於鑒定一名或多名患者可能對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑敏感之體外方法。還揭露了能夠檢測PIK3CA、AKT、MAP3K1和MAP2K4基因的突變狀態的寡核苷酸或多核苷酸引物或探針之用途。還揭露了用於檢測PIK3CA、AKT、MAP3K1和MAP2K4突變的套組的用途。
還揭露了用於確定患有癌症的患者對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的藥物治療是否有可能反應之體外方法，所述方法包括以下步驟：(i)獲得先前從所述患者收集的代表該癌症之樣品；(ii)確定在所述樣品中PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)是否包含突變；並且(iii)確定在所述樣品中MAP3K1或MAP2K4基因是否包含突變。MAP3K1或MAP2K4基因突變的不存在指示對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的治療具有增加的反應可能性。作為基因生物標記測試，包含野生型MAP3K1和MAP2K4基因的癌症鑒定將富集對PI3K通路的上游組分 的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑之反應。包含野生型MAP3K1和MAP2K4基因的個體癌症對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑具有更大的反應可能性。
第二種這樣的方法包括以下步驟：(i)獲得先前從所述患者收集的代表該癌症之樣品；(ii)確定在所述樣品中該PIK3CA基因是否包含突變；並且(iii)確定在所述樣品中MAP3K1或MAP2K4基因是否包含突變。PIK3CA基因的突變以及MAP3K1或MAP2K4基因突變的不存在指示對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的治療具有增加的反應可能性。作為基因生物標記測試，包含突變型PIK3CA基因和野生型MAP3K1和MAP2K4基因的癌症鑒定將富集對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的反應。包含突變型PIK3CA基因和野生型MAP3K1和MAP2K4基因的個體癌症對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑具有最大的反應可能性。
另一種這樣的方法包括以下步驟：(i)獲得先前從所述患者收集的代表該癌症之樣品；(ii)確定在所述樣品中該AKT基因是否包含突變；並且(iii)確定在所述樣品中MAP3K1或MAP2K4基因是否包含突變。AKT基因突變以及MAP3K1或MAP2K4基因突變的不存在指示對該AKT抑制劑的治療具有增加的反應可能性。作為基因生物標記測試，包含突變型AKT基因和野生型MAP3K1和MAP2K4基因的癌症鑒定將富集對該AKT抑制劑的反應。包含突變型AKT基因和野生型MAP3K1和MAP2K4基因的個體癌症對該AKT抑制劑具有最大的反應可能性。
“代表癌症”之樣品可以是所分離(例如來自生檢或來自 血液中發現的細胞)的包含真實癌細胞的樣品，或可以是已經進一步加工的樣品，例如來自包含癌細胞的樣品的PCR擴增核酸的樣品，或者可以是癌症衍生的核酸(例如在患者的血液或其他體液中發現的循環游離DNA)的樣品。
定義：“AKT抑制劑”係指能夠抑制任何AKT同種型的任何化合物或物質，也稱為蛋白激酶B。AKT抑制劑的實例包括MK-2206、ipatasertib(GDC-0068)、afuresertib(GSK-2110183)、4-胺基-N-[(1S)-1-(4-氯苯基)-3-羥基-丙基]-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲醯腔、以及在WO 2006/046023、WO 2006/046024和WO 2009/047563中描述的那些。
“對偶基因”係指遺傳基因座的特定形式，藉由它的特定核苷酸或胺基酸序列與其他形式相區分。
“擴增反應”為導致靶核酸優於非靶核酸進行特異性擴增的核酸反應。聚合酶鏈反應(PCR)為熟知擴增反應。
“癌症”在此用於指由於細胞轉化成贅生性表型所出現的贅生性生長。該細胞轉化通常涉及遺傳突變。
“基因”為包含關於RNA產物的經調節生物合成的所有資訊的DNA區段，包括啟動子、外顯子、內含子以及可以位於控制表現的5'或3'側接區域內(不在該基因的轉錄部分內)的其他序列元件。
“基因狀態”係指該基因為野生型或者不是(即突變型)。
“標記”係指能夠產生指示在分析樣品中存在靶多核苷酸的可檢測信號的組成物。適合標記包括放射性同位素、核苷酸發色團、酶、 底物、螢光分子、化學發光部分、磁性粒子、生物發光部分等。因此，標記為藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學手段可檢測的任何組成物。
“非同義變異”係指基因編碼序列中或與基因編碼序列重疊的變異(變化)，導致產生不同(經改變的)多肽序列。該等變異可能影響或可能不影響蛋白質功能並且包括誤義變異體(導致一個胺基酸取代另一個)、無義變異體(由於產生過早終止密碼子而產生截短多肽)以及插入/缺失變異體。
“同義變異”係指不影響所編碼多肽的序列的基因編碼序列中的變異(變化)。該等變異可以間接地(例如藉由改變基因表現)影響蛋白質功能，但在不存在相反證據的情況下，總體上假定為無害的。
“核酸”係指單股或雙股DNA和RNA分子，包括自然界中所發現的天然核酸和/或經修飾的具有經修飾的主鏈或鹼基的人工核酸，如本領域中已知。
“PI3K抑制劑”係指能夠抑制磷酸肌醇-3-激酶的任何一種同種型(例如PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG基因的基因產物)的任何化合物或物質。PI3K抑制劑包括PI3K-α、PI3K-β和PI3K-δ抑制劑。PI3K-β和PI3K-δ抑制劑的實例係(R)-8-(1-(3,5-二氟苯基胺基)乙基)-N,N-二甲基-2-嗎啉代-4-氧代-4H-色烯-6-甲醯胺和idelalisib。
“PI3K-α抑制劑”係指能夠抑制磷酸肌醇-3-激酶的α-同種型的任何化合物或物質。PI3K-α抑制劑的實例包括BYL719、GDC0032、1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-三級丁基-1,3,4-二唑-2-基)吡-2-基)-1-乙基 -1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮和在WO 2009/080705、WO 2010/029082、WO 2011/000905和WO 2014/114928中描述的那些。
“引物”係指能夠充當用於合成與待複製的核酸股互補的引物延伸產物的起始點的單股DNA寡核苷酸序列。引物的長度和序列必須使其能夠引發延伸產物的合成。典型引物在與靶序列實質上互補的序列長度中包含至少約7個核苷酸，但略微更長的引物為較佳的。通常，引物包含約15-26個核苷酸，但也可以採用更長或更短引物。
“多態位點”為基因座內導致在一個群體中發現至少兩種替代性序列的位置。
“多型態”係指在個體中在多態位點處所觀察到的序列變異。多型態包括核苷酸取代、插入、缺失以及微衛星，並且可以(但無需)引起基因表現或蛋白質功能方面可檢測的差異。在不存在對表現或蛋白質功能的影響證據的情況下，包括非同義變異體的常見多型態總體上視為包括在野生型基因序列的定義中。人類多型態和相關注釋的目錄包括驗證、觀察的頻率以及疾病關聯，由NCBI(dbSNP：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)維護。請注意，當用於基因序列的情形中時的術語“多型態(polymorphism)”不應與當用於化合物的固態形式(即化合物的結晶或非晶性質)的情形中的術語“多晶型現象(polymorphism)”混淆。熟習該項技術者將藉由其背景瞭解所需的含義。
“探針”係指具有與待檢測的對偶基因的靶序列完全互補的序列的單股序列特異性寡核苷酸。
“響應”係藉由根據實體腫瘤反應評估準則(Response Evaluation Criteria in Solid Tumours；RECIST)進行的測量來定義，涉及將患者主要分成兩個組：顯示部分響應或穩定疾病的組和顯示進行性疾病的跡象的組。
“存活”涵蓋患者的整體存活和無進展存活。“整體存活(OS)”定義為從給藥開始到由於任何原因死亡的時間。“無進展存活(PFS)”定義為從給藥開始到第一次出現進行性疾病或由於任何原因死亡的時間。
“PI3K通路的上游組分”係指在mTOR的上游(並且不包括mTOR)的PI3K通路的基因組分。PI3K通路的上游組分包括PI3K同種型(包括PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG基因)、AKT同種型(包括AKT1、AKT2和AKT3基因)、PTEN、PDK1、SGK、INPP4B、INPP5D、PIK3R1和PIK3R2，並且特別是PIK3CA和AKT(例如AKT1和AKT2)。PI3K通路的上游組分的抑制劑包括PI3K抑制劑(例如PI3K-α、PI3K-β和PI3K-δ抑制劑，例如PI3K-α抑制劑)和AKT抑制劑。
用於治療的選擇的方法
根據一個方面，本文提供了一種用於選擇治療以用於患有癌症的患者之方法，該方法包括：提供來自患者的代表癌症之樣品；確定在該患者的代表癌症之樣品中PI3K通路的上游組分的基因狀態是野生型還是突變型；確定該患者的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且基於以上來選擇患者用PI3K通路的上游組分的抑制劑進行治療。
根據另一個方面，本文提供了一種用於選擇治療以用於患 有癌症的患者之方法，該方法包括：提供來自患者的代表癌症之樣品；確定在該患者的代表癌症之樣品中PIK3CA基因或AKT基因是野生型還是突變型；確定該患者的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且基於以上來選擇患者用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療。
該方法可以包括或不包括實際患者樣品分離步驟。因此，根據一個方面，提供了一種用於選擇治療以用於患有癌症的患者之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症的樣品中，確定PI3K通路的上游組分的基因狀態是野生型還是突變型；確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且基於以上來選擇患者用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療。
在另一個方面中，提供了一種用於選擇治療以用於患有癌症的患者之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症的樣品中，確定PIK3CA基因或AKT基因是野生型還是突變型；確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且基於以上來選擇患者用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療。
在一個方面中，該方法包括確定PIK3CA基因之狀態。
在另一個方面中，如果癌細胞DNA具有突變型PIK3CA基因和野生型MAP3K1和MAP2K4基因，那麼該患者被選擇用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療。
在另一個方面中，該方法包括確定AKT基因之狀態。
在另一個方面中，如果癌細胞DNA具有突變型AKT基因和野生型MAP3K1和MAP2K4基因，那麼該患者被選擇用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如AKT抑制劑進行治療。
在另一個方面，如果癌細胞DNA具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因以及突變型MAP3K1基因或突變型MAP2K4基因，那麼患者不被選擇用PI3K通路的上游組分的抑制劑進行治療。
根據另一個方面，提供了一種用於選擇患者用PI3K-α抑制劑進行治療之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症之樣品中，確定PIK3CA基因是野生型還是突變型；確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且基於以上來選擇患者用PI3K-α抑制劑進行治療。
根據另一個方面，提供了一種選擇患者用AKT抑制劑進行治療之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症的樣品中，確定PIK3CA基因是野生型還是突變型；確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且基於以上來選擇患者用AKT抑制劑進行治療。
根據另一個方面，提供了一種選擇患者用AKT抑制劑進行治療之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症的樣品中，確定AKT基因是野生型還是突變型；確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且基於以上來選擇患者用AKT抑制劑進行治療。
根據另一個方面，提供了一種選擇患者用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症之樣品中，確定該PIK3CA基因或AKT基因是野生型還是突變型；確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1基因是野生型還是突變型；並且基於以上來選擇患者用抑制劑進行治療。
在一個方面中，如果癌細胞DNA具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、和野生型MAP3K1基因，那麼該患者被選擇用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療。在其他方面，如果癌細胞DNA具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、和突變型MAP3K1基因，那麼不被選擇用PI3K-α抑制劑進行治療。
在另一個方面中，提供了一種選擇患者用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症的樣品中，確定該PIK3CA基因或AKT基因是野生型還是突變型；確定先前從該患者分離的樣品中的MAP2K4是野生型還是突變型；並且基於以上來選擇患者用抑制劑進行治療。
在一個方面中，如果癌細胞DNA具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、和野生型MAP2K4基因，那麼該患者被選擇用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療。在其他方面中，如果癌細胞DNA具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、和突變型MAP2K4基因，那麼患者不被選擇用PI3K-α抑制劑進行治療。
根據另一個方面，提供了一種預測患者對PI3K通路的上游 組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的反應性之方法，該方法包括：在該患者癌細胞中，確定該PIK3CA基因或AKT基因是野生型還是突變型；確定該患者的癌細胞中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且基於以上來預測患者對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的反應性。
根據另一個方面，提供了一種在受癌症影響的人類患者中，確定PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑的有效性的可能性之方法，該方法包括：在該患者癌細胞中，確定該PIK3CA基因或AKT基因是野生型還是突變型；確定該患者的癌細胞中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且基於以上來預測患者對PI3K通路的上游組分的一種或多種抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑之反應性。
根據另一個方面，提供了一種用於取消選擇患者用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療之方法，該方法包括：確定包含癌細胞的先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1基因和MAP2K4基因是野生型還是突變型，並且其中，如果癌細胞DNA具有突變型MAP3K1基因或突變型MAP2K4基因，則該患者不被選擇用該抑制劑進行治療。
治療方法
根據另一方面，提供了一種治療患者體內的癌症之方法，該患者的PI3K通路的上游組分以及MAP3K1和MAP2K4的癌細胞基因狀態 已經被確定，該方法包括：如果該等癌細胞具有PI3K通路的上游組分的突變基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑。
根據另一方面，提供了一種治療患者體內的癌症之方法，該患者的癌細胞的PIK3CA或AKT基因狀態以及MAP3K1和MAP2K4基因狀態已經被確定，該方法包括：如果該等癌細胞具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑，例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑。
在另一個方面中，提供了一種治療患者體內的癌症之方法，該患者的癌細胞的PIK3CA、MAP3K1和MAP2K4的基因狀態已經被確定，該方法包括：如果該等癌細胞具有突變型PIK3CA基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑，例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑。
在另一個方面中，本文明提供了一種治療患者體內的癌症之方法，該患者的癌細胞的AKT、MAP3K1和MAP2K4的基因狀態已經被確定，該方法包括：如果該等癌細胞具有突變型AKT基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如AKT抑制劑。
在另一方面中，提供了一種治療患有癌症的患者之方法，該方法包括：在該患者的癌細胞中，確定PIK3CA基因或AKT基因的突變型或野生型狀態；在該患者的癌細胞中，確定MAP3K1和MAP2K4基因的突變型或野生型狀態；並且，如果該等癌細胞具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、和野生型MAP3K1和MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的 PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑。
根據另外的一方面，提供了一種治療患有癌症的患者之方法，該方法包括：提供來自患者的代表癌症之樣品；確定在該患者的癌細胞中PI3K通路的上游組分的基因狀態是野生型還是突變型；確定該患者的癌細胞中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且，如果該等癌細胞具有在PI3K通路的上游組分中的突變、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑。
根據另外的一方面，提供了一種治療患有癌症的患者之方法，該方法包括：提供來自患者的代表癌症之樣品；確定該患者的癌細胞中的PIK3CA基因或AKT基因是野生型還是突變型；確定該患者的癌細胞中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且，如果該等癌細胞具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、和野生型MAP3K1和MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑。
在另外的一方面中，提供了一種治療患有癌症的患者之方法，該方法包括：提供來自患者的代表癌症之樣品；確定該患者的癌細胞中的PIK3CA基因是野生型還是突變型；確定該患者的癌細胞中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且，如果該等癌細胞具有突變型PIK3CA基因、和野生型MAP3K1和MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑。
在另外的一方面中，提供了一種治療患有癌症的患者之方法，該方法包括：提供包含來自患者的樣品的癌細胞；確定該患者的癌細 胞中的AKT基因是野生型還是突變型；確定該患者的癌細胞中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且，如果該等癌細胞具有突變型AKT基因、和野生型MAP3K1和MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑。
如在此所用，術語“有效”和“有效性”包括藥理學有效性和生理學安全性兩者。藥理學有效性係指在患者中產生所希望的生物作用的治療能力。生理學安全性係指由所給予治療在細胞、器官和/或生物體層面上造成的毒性程度或其他不良生理學作用(通常稱為副作用)。“更不有效”意指該治療產生治療學上顯著更低程度的藥理學有效性和/或治療學上更大程度的不良生理學作用。
篩選方法
根據另一個方面，提供了一種篩選患者以確立對用PI3K通路的上游組分的抑制劑進行治療的適宜性之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症的樣品中，確定PI3K通路的上游組分的基因狀態是野生型還是突變型；並且確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型。
根據另一個方面，提供了一種篩選患者以確立對用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療的適宜性之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症的樣品中，確定該PIK3CA基因或AKT基因是野生型還是突變型；並且確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型。
在另一個方面中，提供了一種篩選患者以確立對用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療的適宜性之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症的樣品中，確定該PIK3CA基因是野生型還是突變型；並且確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型。
在另一個方面中，提供了一種篩選患者以確立對用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑進行治療的適宜性之方法，該方法包括：在先前從該患者分離的代表該癌症的樣品中，確定該AKT基因是野生型還是突變型；並且確定先前從該患者分離的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型。
抑制劑及其用途
根據另一方面，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑用以治療癌症患者之用途，該癌症患者的癌細胞已經被鑒定為具有在PI3K通路的上游組分中的突變、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
根據另一方面，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑用以治療癌症患者之用途，該癌症患者的癌細胞已經被鑒定為具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
在另一方面中，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑用以治療癌症患者之用途，該癌症患者的癌細胞已經被鑒定為具有突變型PIK3CA基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4 基因。
在另一方面中，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑用以治療癌症患者之用途，該癌症患者的癌細胞已經被鑒定為具有突變型AKT基因以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
根據另一方面，提供了用於在具有癌細胞的癌症的治療中使用的、PI3K通路的上游組分的抑制劑，所述癌細胞被鑒定具有在PI3K通路的上游組分中的突變、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
根據另一方面，提供了用於在具有癌細胞的癌症的治療中使用的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑，所述癌細胞被鑒定具有突變型PIK3CA基因、或突變型AKT基因以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
在另外的一方面中，提供了用於在具有癌細胞的癌症的治療中使用的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑，所述癌細胞被鑒定為具有突變型PIK3CA基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
在另外的一方面中，提供了用於在具有癌細胞的癌症的治療中使用的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑，所述癌細胞被鑒定為具有突變型AKT基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
在另外的一方面中，提供了用於在具有癌細胞的癌症的治療中使用的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑，所述癌細胞被鑒定為具有突變型PIK3CA基因、或突變型AKT基因以及 野生型MAP3K1基因。
在另外的一方面中，提供了用於在具有癌細胞的癌症的治療中使用的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑，所述癌細胞被鑒定為具有突變型PIK3CA基因、或突變型AKT基因以及野生型MAP2K4基因。
根據另一方面，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑用於製造藥物之用途，該藥物用於治療具有癌細胞的癌症，所述癌細胞被鑒定為具有在PI3K通路的上游組分中的突變、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
根據另一方面，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑用於製造藥物之用途，該藥物用於治療具有癌細胞的癌症，所述癌細胞被鑒定為具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
在另外的一方面中，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑用於製造藥物之用途，該藥物用於治療具有癌細胞的癌症，所述癌細胞被鑒定為具有突變型PIK3CA基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
在另外的一方面中，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑用於製造藥物之用途，該藥物用於治療具有癌細胞的癌症，所述癌細胞被鑒定為具有突變型AKT基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
在另外的一方面中，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑 例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑用於製造藥物之用途，該藥物用於治療具有癌細胞的癌症，所述癌細胞被鑒定為具有突變型PIK3CA基因、或突變型AKT基因以及野生型MAP3K1基因。
在另外的一方面中，提供了PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑用於製造藥物之用途，該藥物用於治療具有癌細胞的癌症，所述癌細胞被鑒定為具有突變型PIK3CA基因、或突變型AKT基因以及野生型MAP2K4基因。
在另外的一方面中，本發明涉及藥物組成物，該藥物組成物包括用於在具有癌細胞的癌症的預防和治療中使用的、PI3K通路的上游組分的抑制劑，所述癌細胞被鑒定為具有在PI3K通路的上游組分中的突變、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
在再另外的方面中，本發明涉及藥物組成物，該藥物組成物包括用於在具有癌細胞的癌症的預防和治療中使用的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑，所述癌細胞被鑒定為具有突變型PIK3CA基因或突變型AKT基因、以及野生型MAP3K1和MAP2K4基因。
該等藥物組成物可採取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、含有液體的膠囊、粉末、緩釋製劑、栓劑、氣霧劑、噴霧劑、懸浮液的形式或適用的任何其他形式。
給藥可以是例如局部(即在需要藥物組成物作用的地方直接施用該藥物組成物)、腸內或口服(即藥物組成物藉由消化道被給予)、或腸胃外(即藥物組成物藉由由除消化道以外的其他途徑給予，例如藉由注射)。
在一個方面中，根據常規程序將活性化合物或其鹽(PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑)和視情況另一種治療或預防劑配製為適於人類靜脈給藥的藥物組成物。通常，用於靜脈給藥的活性化合物係在無菌等滲水性緩衝液中的溶液。必要時，該等組成物還可以包括增溶劑。用於靜脈給藥的組成物視情況包括局部麻醉劑例如利多卡因來緩解注射部位的疼痛。通常，該等成分單獨地或混合在一起以單位劑型給予，例如，在氣密密封容器例如安瓿瓶中作為乾燥的凍乾粉末或無水濃縮物。在藉由輸注給予活性化合物時，可以將其用含無菌藥物級水或鹽水的輸液瓶分配。在藉由注射給予活性化合物時，可以提供無菌注射用水或鹽水的安瓿以便該等成分可在給予之前被混合。
用於口服遞送的組成物可處於例如片劑、錠劑、水性或油性懸浮液、顆粒劑、粉末、乳液、膠囊、糖漿或酏劑的形式。口服給予的組成物可包含一種或多種視情況試劑，例如，甜味劑如果糖、阿斯巴甜或糖精；調味劑如薄荷、冬青油或櫻桃；著色劑；以及防腐劑，以提供藥學上可口的製劑。也可以使用時間延遲材料如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。口服組成物可包括標準運載體，如甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂，糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。此類運載體在特定方面係藥物級。
根據本發明使用的組成物可以按照常規的方式使用一種或多種生理上可接受的載體或賦形劑配製。因此，該活性化合物和視情況另一種治療劑或預防劑及其生理學上可接受的鹽和溶劑化物可以配製為用於藉由吸入或吹入(藉由口或鼻)或口服、腸胃外或黏膜(例如頰、陰道、直腸、舌下)給藥來給予的藥物組成物。在一個方面中，使用局部或全身腸胃外給藥。
對於口服給藥，該等組成物可採取例如片劑或膠囊的形式，其係藉由常規方法用藥學上可接受的賦形劑來製備，該等賦形劑例如黏合劑(例如預膠化的玉米澱粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化矽)；崩散劑(例如馬鈴薯澱粉或羥基乙酸澱粉鈉)；或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。該等片劑可以藉由本領域熟知的方法來包衣。用於口服給藥的液體製劑可採取例如溶液、糖漿或懸浮液的形式，或者它們可以作為在使用前用水或其他合適的運載體配製的乾燥產品呈現。此類液體製劑可以藉由常規方法用藥學上可接受的添加劑製備，該等添加劑例如助懸劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水性運載體(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分餾的植物油)；以及防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。適當的話，該等製劑還可包含緩衝鹽、調味劑、著色劑和甜味劑。
在一些方面中，本文揭露的化合物或鹽可以作為藥物組成物給予，其中該藥物組成物包含在0.1-1mg、1-10mg、10-50mg、50-100mg、100-500mg、或500mg-5g之間的所述活性化合物或其鹽。
根據再另一方面，提供了一種套組，該套組包含處於合適的單位劑型的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑；一測試物，該測試物適合提供分析結果以確定患者係具有PI3K通路的野生型上游組分還是突變型上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)；一種測試物，該測試物適合提供分析結果以確定患者是具有野生型還是突變型的MAP3K1和MAP2K4基因；容器裝置，該容器裝置用於容納PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑、以及PI3K通路上游組 分、MAP3K1和MAP2K4測試物；以及視情況使用說明書。
根據再另一方面，提供了一種套組，該套組包含處於合適的單位劑型的PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑；一測試物，該測試物適合提供分析結果以確定患者是具有野生型還是突變型PIK3CA基因；一測試物，該測試物適合提供分析結果以確定患者是具有野生型還是突變型的MAP3K1和MAP2K4基因；容器裝置，該容器裝置用於容納PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑以及PIK3CA、MAP3K1和MAP2K4測試物；以及視情況使用說明書。
在又另一方面中，提供了一種套組，該套組包含處於適合的單位劑型中的AKT抑制劑；一測試物，該測試物適合提供分析結果以確定患者是具有野生型還是突變型AKT基因；一測試物，該測試物適合提供分析結果以確定患者是具有野生型還是突變型的MAP3K1和MAP2K4基因；容器裝置，該容器裝置用於容納該AKT抑制劑以及AKT、MAP3K1和MAP2K4測試物；以及視情況使用說明書。
基因狀態：野生型或者突變型
為了本說明書的目的，野生型的基因狀態意為指示基因的正常或恰當表現以及所編碼蛋白質的正常功能。相比之下，突變型狀態意為指示異常或不適當的基因表現，或蛋白質功能改變的表現，與癌症中PI3K通路的突變型上游組分(例如PIK3CA或AKT)以及MAP3K1和MAP2K4的已知作用(如在此所述)一致。任何數目的遺傳或表觀遺傳變化(包括(但不限於)突變、擴增、缺失、基因組重排或甲基化特徵變化)可以導致突 變型狀態。然而，如果該等變化仍然引起正常蛋白質或功能上等效變異體的恰當表現，那麼該基因狀態被視為野生型。典型地將不產生功能突變型基因狀態的變異體實例包括同義編碼變異體和常見多型態(同義或非同義)。如下文所討論，基因狀態可以藉由功能分析來評估，或者它可以從與參考序列的檢測偏差的性質推斷。
在某些方面，PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA或AKT基因)和/或MAP3K1和MAP2K4基因的野生型或突變型狀態係藉由在基因中非同義核酸變異的存在或不存在來確定。所觀察的非同義變異對應於未標注功能作用的已知常見多型態，不促成突變型基因狀態。
在PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)的基因和/或表示突變型狀態的MAP3K1/MAP2K4基因中的其他變異包括剪接位點變異，該等剪接位點變異在先質mRNA到mRNA的加工期間減少內含子/外顯子接合點的識別。這可以導致外顯子跳躍或在剪接mRNA中包括通常內含的序列(內含子滯留或採用隱含的剪接接合點)。這可以轉而導致產生相對於正常蛋白質具有插入和/或缺失的異常蛋白質。因此，在其他方面中，如果在內含子/外顯子接合點處存在改變剪接位點識別序列的變異體，那麼該基因具有突變型狀態。
在PI3K通路的上游組分的基因(例如該PIK3CA基因或AKT基因)和/或MAP3K1/MAP2K4基因中的非同義的蛋白質表現或活性耗減型突變和/或功能突變的喪失與本文描述的該等方面的使用係特別相關的，並且提供了本揭露的單獨方面。在另外的方面中，此類突變可以是移碼突變、剪接區突變、無義突變和/或誤義突變。
PIK3CA突變的表徵
WO 2014/114928描述了於阿斯利康進行的關於乳癌(基於COSMIC資料庫(韋爾科姆基金會桑格研究所(Welcome Trust Sanger Institute)，2011年9月)的調查，其中從覆蓋>5千種人類腫瘤的整個數據集鑒別出PIK3CA基因中>55種不同的突變。大部分突變以<1%頻率發生，3種以1%-3%頻率發生，但4種突變占總PIK3CA突變的約88%。該等突變為C端激酶結構域中的激酶結構域誤義突變H1047R(55%)和H1047L(5%)，以及螺旋結構域殘基E545K(18%)和E542K(11%)。雖然並不旨在為窮盡性的，但其他普遍的乳癌突變的更長清單涵蓋R38H、R38C、R88Q、N345K、C420R、E453Q、P539R、E542K、E545K、E545A、Q546K、Q546P、M1043I、M1043V、H1047R、H1047L、H1047Y。因此，診斷分析可以被構建成聚焦於檢測最常見突變，由此允許鑒別大部分PIK3CA突變。舉例來說，來自羅氏分子系統的Cobas(TM)PIK3CA突變測試經設計以檢測從福馬林固定的石蠟嵌埋的腫瘤樣品分離的DNA中PIK3CA基因的外顯子1、4、7、9以及20中的17種突變(E542K、E545A、E545G、E545K、E545D、Q546K、Q546R、Q546E、Q546L、N345K、C420R、R88Q、H1047L、H1047R、H1047Y、G1049R以及M1043I)。這一套組能夠拾取ER陽性乳癌中的約95%突變。突變分佈在其他腫瘤類型中不同並且診斷策略可以相應地調適。舉例來說，在子宮內膜癌中，相比於乳癌，擴散在整個PIK3CA基因編碼序列中的突變分佈更均勻並且蛋白質N端區域中的突變數目更多(由醫學博士道格拉斯A.萊文(Douglas A.Levine,M.D)傳達，TCGA第2次年度研討會，2012年11月28日)。
關於PIK3CA，參考序列可供用於基因(基因庫登錄號： NG_012113)、mRNA(基因庫登錄號：NM_006218)以及蛋白質(基因庫登錄號：NP_006209或Swiss-Prot登錄號：P42336)。具體的參考序列分別顯示在SEQ ID NO：5、10、15和20中。參考基因(基因組區域)序列包括上游序列的5000個鹼基的下游序列的2000個鹼基。PIK3CA內的突變眾所周知(COSMIC資料庫-韋爾科姆基金會桑格研究所)，並且熟習該項技術者將能夠基於與野生型比較DNA或蛋白質序列來確定PIK3CA基因狀態，即特定PIK3CA基因為野生型抑或突變型。
清楚的是，揭露的針對PIK3CA的基因和mRNA參考序列各自是代表性序列，並且出於本揭露的目的，將僅用於比較目的的較佳的蛋白質參考序列顯示在SEQ ID NO.20中。在正常個體中，每種基因存在兩個拷貝(母本和父本拷貝)，該等拷貝將可能具有一些序列差異，此外在一群體內將存在基因序列的許多對偶基因變異體。視為野生型的其他序列包括具有以下的序列：核酸序列的一種或多種同義變化(該等變化不改變所編碼的蛋白質序列)、改變蛋白質序列但不影響蛋白質功能的非同義常見多型態(例如生殖系多型態)以及內含子非剪接位點序列變化。
AKT突變的表徵
AKT1誤義點突變已經在包括乳癌的人類癌症中被鑒定(參見下面的參考文獻1-3)。除了E17K外，人類癌症中最常見的AKT1突變、幾種其他突變(L52R、C77F和Q79K)已經顯示為功能性轉化(參見下文參考文獻4、5)。鑒於AKT1和AKT2蛋白之間的高序列同源性(Ensembl資料庫-EMB1-EBI/韋爾科姆基金會桑格研究所(Welcome Trust Sanger Institute))，認為AKT2中的相應突變也在轉化。
關於AKT1，參考序列可供用於基因(基因庫登錄號：NG_012188)、mRNA(基因庫登錄號：NM_005163)以及蛋白質(基因庫登錄號：NP_005154或Swiss-Prot登錄號：P31749)。具體的參考序列分別顯示在SEQ ID NO：1、6、11和16中。關於AKT2，參考序列可供用於基因(基因庫登錄號：NG_012038)、mRNA(基因庫登錄號：NM_001626)以及蛋白質(基因庫登錄號：NP_001617或Swiss-Prot登錄號：P31751)。具體的參考序列分別顯示在SEQ ID NO：2、7、12和17中。AKT1和AKT2內的突變以相對低的頻率發生(COSMIC資料庫-韋爾科姆基金會桑格研究所)，並且熟習該項技術者將能夠基於與野生型比較DNA或蛋白質序列來確定AKT1和AKT2基因狀態，即具體的AKT1或AKT2基因是野生型還是突變型。
清楚的是，揭露的針對AKT1和AKT2的基因、mRNA序列和蛋白質參考序列各自是代表性序列，並且出於本揭露的目的，將僅用於比較目的的較佳的蛋白質參考序列顯示在SEQ ID NO.16(針對AKT)和SEQ ID NO.17(針對AKT2)中。在正常個體中，每種基因存在兩個拷貝(母本和父本拷貝)，該等拷貝將可能具有一些序列差異，此外在一群體內將存在基因序列的許多對偶基因變異體。視為野生型的其他序列包括具有以下的序列：核酸序列的一種或多種同義變化(該等變化不改變所編碼的蛋白質序列)、改變蛋白質序列但不影響蛋白質功能的非同義常見多型態(例如生殖系多型態)以及內含子非剪接位點序列變化。
1.弗拉特利，E.(Flatlcy,E.)等人，微乳頭乳癌中的PIK3CA-AKT通路突變(PIK3CA-AKT pathway mutations in micropapillary breast carcinoma).《人類病理學》(Human Pathology)(2013)44，1320-1327。
2.斯蒂姆-黑爾，K.(Stemke-Hale,K.)等人，乳癌中 PIK3CA、PTEN和AKT突變的綜合基因組學和蛋白質組學分析(An integrative genomic and proteomic analysis of PIK3CA,PTEN and AKT mutations in breast cancer).《癌症研究》(Cancer Research)(2008)68，6084-6091。
3.特羅克塞爾，M.L.(Troxell,M.L.)等人，乳房乳頭狀瘤中PIK3CA/AKT通路突變的高發病率(High prevalence of PIK3CA/AKT pathway mutations in papillary neoplasms of the breast).《現代病理學》(Modern Pathology)(2010)23，27-37)。
4.藝，K.(Yi,K.)等人，人類乳癌中發現的非熱點AKT1突變體的功能分析鑒定出新穎的驅動突變：對個性化醫學的影響(Functional analysis of non-hotspot AKT1 mutants found in human breast cancers identifies novel driver mutations：implications for personalized medicine)，《腫瘤靶向》(Oncotarget)(2012)4，29-34。
5.開普敦，J.D.(Carpten,J.D.)等人，癌症中的AKT1的普列克底物蛋白同源結構域的轉化突變(A transforming mutation in the pleckstrin homology domain of AKT1 in cancer).《自然》(Nature)(2007)448，439-444。
MAP3K1和/或MAP2K4突變的表徵
文獻中的幾個報導(參見下面的參考文獻1-4)鑒定了MAP3K1和MAP2K4基因中的頻繁突變。突變被分佈在每個基因的編碼序列上，其在任何功能結構域中沒有明顯的富集。這種模式指示該基因作為腫 瘤抑制基因的功能，其中所謂的‘喪失功能’突變(剪接、無義和移碼突變)消除功能蛋白質的表現。對於MAP3K1，在19%的情況中，突變導致編碼序列中的非同義變化(彭(Pham)等人，《基因和癌症》(Genes and Cancer)2014，4：410-426)，但大多數情況下突變係移碼缺失或插入(59%的突變)。實例係移碼突變例如R273fs*27.I761fs*35和無義突變例如S431*和S1344*。因此，診斷測定可以被構建成聚焦於喪失功能突變的檢測上，由此允許鑒別MAP3K1和MAP2K4突變。對於MAP3K1和MAP2K4，參考序列可供用於基因、mRNA和蛋白質(表1)。具體的參考序列的SEQ ID NO.如下文表1所示。
MAP3K1和MAP2K4內的突變係眾所周知的(COSMIC資料庫-韋爾科姆基金會桑格研究所)，並且熟習該項技術者將能夠基於與野生型比較DNA或蛋白質序列來確定基因狀態，即具體的MAP3K1或MAP2K4基因是野生型還是突變型。
清楚的是，揭露的針對MAP3K1和該MAP2K4的基因和mRNA以及蛋白質參考序列各自是代表性序列，並且出於本揭露的目的，將僅用於比較目的的較佳的蛋白質參考序列顯示在SEQ ID NO.19(針對MAP3K1)和在SEQ ID NO.18(針對MAP2K4)中。在正常個體中，每種 基因存在兩個拷貝(母本和父本拷貝)，該等拷貝將可能具有一些序列差異，此外在一群體內將存在基因序列的許多對偶基因變異體。視為野生型的其他序列包括具有以下的序列：核酸序列的一種或多種同義變化(該等變化不改變所編碼的蛋白質序列)、改變蛋白質序列但不影響蛋白質功能的非同義常見多型態(例如生殖系多型態)以及內含子非剪接位點序列變化。
1.癌症基因組阿特拉斯網路，人類乳房腫瘤的綜合分子圖譜(Comprehensive molecular portraits of human breast tumours).《自然》(Nature)(2012)490，61-70。
2.斯蒂芬,P.J.(Stephens,P.J.)等人，癌基因的景觀和乳癌中的突變過程(The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer).《自然》(Nature)(2012)486，400-404。
3.艾理斯，M.J.(Ellis,M.J.)等人，全基因組分析說明乳癌對芳香酶抑制的響應(Whole-genome analysis informs breast cancer response to aromatase inhibition)《自然》(Nature)(2012)486，353-60。
4.柯帝士，C(Curtis，C.)等人，2000個乳房腫瘤的基因組和轉錄組結構揭示新型亞組(The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups).《自然》(Nature)(2012)486，346-352。
確定治療有效的可能性之方法
根據另一方面，提供了在受癌症影響的人類患者中，使用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑治療的有效 的可能性之方法，該方法包括：相對於野生型基因，檢測所述患者的PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)中至少一種非同義核酸變異的存在或不存在；相對於野生型基因，檢測所述患者的MAP3K1基因和MAP2K4基因中至少一種非同義核酸變異的存在或不存在；其中在PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)中至少一個非同義核酸變異的存在，以及在MAP3K1基因和MAP2K4基因兩者中至少一個非同義核酸變異的不存在，指示用PI3K通路的上游組分的抑制劑(例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑)的治療可能是有效的。
根據另一方面，提供了評估個體對使用PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑治療的易感性之方法，該方法包括：(i)確定來自個體的癌細胞DNA中PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)的非同義突變狀態；(ii)確定來自個體的癌細胞DNA中MAP3K1基因和MAP2K4基因的非同義突變狀態；並且(iii)藉由參考在癌細胞中PI3K通路的上游組分(例如PIK3CA基因或AKT基因)以及MAP3K1基因和MAP2K4基因的非同義突變狀態，確定個體對用PI3K通路的上游組分的抑制劑(例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑)的治療的可能易感性。
存在熟習該項技術者可獲得的以確定PIK3CA的基因狀態的許多技術。基因狀態可以藉由測定核酸序列來確定。這可以經由對全長基因進行直接定序或分析該基因內的特異性位點，例如一般突變位點。
用於確定PIK3CA基因為野生型抑或突變型的替代性手段為評估轉錄基因的功能。這一PIK3CA基因的功能突變產生脂質激酶活性增加的蛋白質，引起細胞中該路徑的下游傳訊增加，包括(但不限於)Akt和S6激酶的啟動。當PIK3CA變異體在細胞中表現時，用於評估它們功能狀態的分析包括(但不限於)：(i)具有PIK3CA基因三磷酸磷脂醯肌醇(PI(3,4,5)P3)的激酶活性的產物的增加的產生；(ii)磷酸化Akt或S6激酶的增加的含量；(iii)用PIK3CA變異體轉染的NTH-3T3細胞的增加的聚集和集落形成；(池上T(Ikenoue T)等人的《癌症研究》(Cancer Res.)，2005，65，4562-4567)。
用於分析相關的DNA樣品的可替代方法涉及大規模平行定序(也稱為下一代定序，或NGS)。大規模平行定序方法可用於確定該等基因的基因型，並且例如，但不限於，億明達公司(Illumina)、離子激流公司(Ion Torrent)、西格諾公司(Sequenom)和牛津奈米孔平臺(Oxford Nanopore platforms)。
樣品
用於測試基因狀態的患者樣品可以是從個體獲得或可獲得的任何包含癌組織或癌細胞的樣品，或者是包含癌症核酸例如可能在血液/血漿或其他體液中發現的循環游離DNA(cfDNA)的樣品。測試樣品宜為從個體獲得的血液樣品、口腔抹片、生檢體或其他體液或組織。特定實例 包括：循環癌細胞、血漿或血清中的循環DNA、從卵巢癌患者的腹水液分離的細胞、具有癌症的患者肺內的肺痰、來自乳癌患者的細針抽出物、尿液、外周血液、細胞刮片、毛囊、點式生檢或面頰樣品。
應瞭解，測試樣品同樣可以為對應於測試樣品中的序列的核酸序列，換句話說，樣品核酸中的所有或一部分區域可以在分析之前先使用任何便利技術(例如聚合酶鏈反應(PCR))擴增。核酸可以為基因組DNA或者分級的或全細胞RNA。在特定方面中，RNA為全細胞RNA且直接用作使用隨機引物或poly A引物來標記第一股cDNA的模板。可以根據標準方法從測試樣品提取該樣品中的核酸或蛋白質(參見格林(Green)和薩姆布魯克(Sambrook)編，《分子選殖實驗指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual),(2012，第4版，第1-3卷，ISBN 9781936113422)，紐約州冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.))。
本發明的診斷方法可以使用先前從個體或患者獲取的樣品進行。該等樣品可以藉由冷凍或固定以及嵌埋於福馬林-石蠟或其他介質中來保存。可替代地，可以獲得且使用包含新鮮癌細胞的樣品。
本說明書揭露的方法可以使用來自任何適合的癌症的細胞來應用。本文描述了適合的用於治療的癌症。
突變的流行率
在臨床腫瘤中廣泛發現PIK3CA突變，但每一基因突變的流行率隨腫瘤組織類型顯著不同。舉例來說，PIK3CA突變在乳癌中相對常 見，但在腎臟腫瘤中相對罕見(表2)。
表2：臨床樣品中PIK3CA突變的流行率。PIK3CA資訊來源為COSMIC資料庫(v62版)。本揭露的患者選擇方法可以尤其有用於存在PIK3CA突變的高發生率的疾病(組織)區段(例如乳房、泌尿道、子宮內膜、大腸、子宮頸等)。
臨床腫瘤中發現在AKT1和AKT2中的突變廣泛存在，突變的流行率隨腫瘤組織類型而變化(表3和4)。
表3.在臨床癌症組群中AKT1突變的流行率。本揭露的患者選擇方法可以尤其有用於存在AKT1突變的高發生率的疾病(組織)區段中。
表4.在臨床癌症組群中AKT2突變的流行率。本揭露的患者選擇方法可以尤其有用於存在AKT2突變的高發生率的疾病(組織)區段中。
在包括乳癌、胃癌和子宮癌的許多癌症類型中發現MAP3K1的突變(表5)。雖然所有乳癌研究中的流行率總共為6%左右，但在特定類型的乳癌中可能更高。例如，在管腔A型、HER2陽性/ER+癌症中發現在乳癌中所見的75%的變化，其中，MAP3K1突變的流行率可以是在11%和16%之間。
表5：臨床樣品中MAP3K1突變的流行率。MAP3K1資訊來源係cBioPortal資料庫。本揭露的患者選擇方法可以尤其有用於存在MAP3K1突變的高發生率的疾病(組織)區段。
在包括乳癌、結腸癌、胰腺癌和胃癌的許多癌症類型中發現MAP2K4的突變(表6)。雖然所有乳癌研究中的流行率總共為3%左右，但在特定類型的乳癌中可能更高。例如，在管腔A型HER2-陰性/ER+癌症中發現在乳癌中所見的75%的變化，其中，MAP2K4突變的流行率可以是在8%和10%之間。
表6：臨床樣品中MAP2K4突變的流行率。MAP2K4資訊來源係cBioPortal資料庫。本揭露的患者選擇方法可以尤其有用於存在MAP2K4突變的高發生率的疾病(組織)區段。
如熟習該項技術者將顯而易知，隨著新的且更全面的數據從如TCGA(癌症基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas))和ICGC(國際癌症基因組聯盟(International Cancer Genome Consortium))的人類癌症基因組分析協會(Human Cancer Genome profiling consortia)出現，這一頻率數據持續地得到改進與更新。因此，具有PIK3CA或AKT依賴性和MAP3K1和/或MAP2K4依賴性的另外的腫瘤類型可以被鑒定，並且適合用PI3K通路的上游組分的抑制劑(例如PI3K-α抑制劑或AKT抑制劑)進行治療，如本文所述的。
相關適應症
在表明癌症治療的情況下，應瞭解，這可能是指預防轉移以及治療轉移(即癌症擴散)。因此，本文揭露的方法能夠用於治療不具有轉移的患者而終止轉移發生，或延長轉移發生前的時間段，以及針對已具有轉移的患者來治療轉移本身。此外，癌症治療可能指治療一種或多種確定的原發性腫瘤和一種或多種發展中的原發性腫瘤。
因此，在一個方面中，癌症治療涉及預防轉移。
在另一個方面中，癌症治療涉及治療轉移。
在另一個方面中，癌症治療涉及治療一種或多種確定的原發性腫瘤或一種或多種發展中的原發性腫瘤。
在此，癌症的治療可以是指預防癌症本身。
在一方面中，癌症被提及時，它可以指的是對PI3K通路的上游組分的抑制敏感的腫瘤，該等上游組分參與導致腫瘤細胞的增殖、存活、侵襲和遷移能力的信號轉導步驟。
在一個方面中，癌症係在PI3K通路的上游組分例如PIK3CA或AKT基因中攜帶突變的癌症。
在一個方面中，癌症係基於突變、擴增或其他畸變顯示PIK3CA依賴性或AKT依賴性的癌症。
在一個方面中，該癌症選自乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、頭頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、子宮頸癌、外陰癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、膀胱癌、腦癌、結腸直腸癌、膽囊癌、膽管癌、皮膚癌、胰腺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、腎癌、肝癌、外陰癌、陰莖癌和其他PI3-激酶依賴性癌症。
在一個方面中，該癌症係乳癌。
在一個方面中，該癌症係雌激素受體陽性乳癌。
在一個方面中，該癌症係雌激素受體陽性的管腔乳癌。
在一個方面中，該癌症係雌激素受體陽性的管腔A型乳癌。
在一個方面中，該癌症處於轉移性狀態。
在一個方面中，該癌症處於非-轉移性狀態。
檢測核酸的方法
在本發明的上下文中，可以採用PI3K通路的突變型上游組分(例如PIK3CA或AKT)以及突變型MAP3K1或MAP2K4核酸的檢測來預測對藥物治療的反應。因為該等基因中的突變發生在DNA層面，所以本發明方法可以基於檢測基因組DNA的突變或變化，以及轉錄物和蛋白質本身。所希望的可以是藉由分析轉錄物和/或多肽來確認基因組DNA突變，以便確保所檢測的突變實際上在該受試者中表現。
熟習該項技術者將清楚，存在可以用於檢測基因中一個或多個位置處變異體核苷酸的存在或不存在的大量分析程序。一般來說，等位基因變異的檢測需要突變辨別技術、視情況擴增反應(如基於聚合酶鏈反應的擴增反應)以及視情況信號產生系統。在本領域中可獲得多種突變檢測技術並且該等突變檢測技術可以與信號產生系統組合使用，在本領域中可獲得許多信號產生系統。檢測對偶基因變異的許多方法由以下文獻進行了綜述：諾勞(Nollau)等人，《臨床化學》(Clin.Chem.)，1997,43,1114-1120；安德森SM.(Anderson SM.)《分子診斷學專家評論》(Expert Rev Mol Diagn.)，2011,11,635-642；邁耶森M.(Meyerson M.)等人，《自然綜述．遺傳學》(Nat Rev Genet.)，2010,11,685-696綜述；以及綜述於標準教科書中，例如《突變檢測的實驗室方案》(“Laboratory Protocols for Mutation Detection”)，由U.蘭德葛籣(U.Landegren)編，牛津大學出版社(Oxford University Press)，1996和《PCR》(“PCR”)，第2版，由牛頓(Newton)和格雷安(Graham)編，拜爾斯科學出版社有限公司(BIOS Scientific Publishers Limited)，1997。
如上所指出，測定具有癌症的患者中存在或不存在PIK3CA基因的特定變化或多種變化可以按多種方式進行。此類測試通常使用從生物樣品收集的DNA或RNA進行，該等生物樣品例如組織生檢體、尿液、大便、痰、血液、細胞、組織刮片、乳房抽出物或其他細胞物質，並且可以藉由多種方法進行，該等方法包括(但不限於)PCR、與對偶基因特異性探針雜交、酶突變檢測、錯配的化學裂解、質譜或DNA定序，包括微定序。
適合的突變檢測技術包括擴增阻礙突變系統(ARMSTM)、擴增阻礙突變系統線性延伸(ALEXTM)、競爭性寡核苷酸引發系統(COPS)、塔克曼(Taqman)、分子信標(Molecular Beacons)、限制性片段長度多型態(RFLP)以及基於限制位點的PCR以及螢光共振能量轉移(FRET)技術。
技術人員會意識到與上述那些相似的技術可用於檢測AKT和/或MAP3K1或MAP2K4基因中的突變。在特定方面中，用於測定生物標記基因內的核苷酸所用的方法係選自：對偶基因特異性擴增(對偶基因特異性PCR)(如擴增阻礙突變系統(ARMS))、定序、對偶基因辨別分析、雜交、限制性片段長度多型態(RFLP)或寡核苷酸連接分析(OLA)。
在特定方面中，與對偶基因特異性探針雜交可以藉由以下來進行：(1)溶液中結合到具有經標記樣品的固相(例如玻璃、矽、尼龍膜)的對偶基因特異性寡核苷酸，例如，如同在許多DNA晶片應用中；或(2)溶液中的經結合樣品(通常為經選殖DNA或PCR擴增的DNA)和經標 記寡核苷酸(或者對偶基因特異性或者較短以便允許藉由雜交來定序)。診斷測試可以涉及一組變化，通常在固體支撐物上，這使得能夠同時測定一種以上變化。該等雜交探針在本領域中為熟知的(參見例如格林和薩姆布魯克編，《分子選殖實驗指南》，(2012，第4版，第1-3卷，ISBN 9781936113422)，紐約州冷泉港的冷泉港實驗室出版社)並且可以跨越兩個或更多個變化位點。
因此，在一個方面中，檢測到至少一種突變的存在或不存在使包含假定突變位點的PIK3CA或AKT核酸和/或MAP3K1和MAP2K4核酸與至少一個核酸探針接觸。探針優先在選擇性雜交條件下與包括變化位點且在該變化位點處包含互補核苷酸鹼基的核酸序列雜交。雜交可以使用熟習該項技術者已知的標記用可檢測標記來檢測。該等標記包括(但不限於)放射性、螢光、染料以及酶標記。
在另一個方面中，檢測到至少一種突變的存在或不存在使包含假定突變位點的PIK3CA或AKT核酸和/或MAP3K1和MAP2K4核酸與至少一個核酸引物接觸。引物較佳的是在選擇性雜交條件下與包括變化位點且在該變化位點處包含互補核苷酸鹼基的核酸序列雜交。
用作特異性擴增的引物的寡核苷酸可以攜帶與分子中間(因此擴增取決於差異性雜交；參見例如吉布斯(Gibbs)等人，1989.《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)，17，2437-248)或在一個引物的3'遠端處的所關注的突變互補的核苷酸鹼基，其中在恰當的條件下，可以防止錯配或減少聚合酶延伸(參見例如普羅森納(Prossner)，1993，《蒂布技術》(Tibtech)，11 238)。
在又另一個方面中，檢測至少一種突變的存在或不存在包 括對至少一種核酸序列進行定序且比較所獲得的序列與已知野生型核酸序列。
可替代地，至少一種突變的存在或不存在包括質譜測定至少一種核酸序列。
在一個方面中，檢測至少一種核酸變化的存在或不存在包括進行聚合酶鏈反應(PCR)。使包含假設變化的靶核酸序列擴增且測定經擴增的核酸的核苷酸序列。測定經擴增的核酸的核苷酸序列包括對至少一個核酸區段進行定序。可替代地，擴增產物可以使用能夠根據它們的大小分離擴增產物的任何方法來分析，包括自動化和手動凝膠電泳等。
基因組核酸中的突變有利地藉由基於擴增核酸片段中的活動位移的技術來檢測。舉例來說，陳(Chen)等人，《分析生物化學》(Anal Biochem)1996,239,61-9中描述藉由競爭性活動位移分析來檢測單鹼基突變。此外，基於馬塞利諾(Marcelino)等人，《生物技術》(BioTechniques)1999,26,1134-1148的技術的分析可商購。
在特定實例中，可以使用毛細管異雙螺旋分析以基於毛細管系統中雙螺旋核酸的活動位移來檢測突變的存在作為存在錯配的結果。
從樣品產生用於分析的核酸一般需要核酸擴增。許多擴增方法依賴於酶鏈反應(如聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應或自持續序列複製)或來自已進行選殖的所有或一部分載體。較佳的是，根據本發明的擴增為指數擴增，如藉由例如聚合酶鏈反應所展現。
許多靶標和信號擴增方法已描述於文獻中，例如該等方法的總體綜述描述於蘭德葛籣U.(Landegren,U.)等人，《科學》，1988 242, 229-237和路易士R.(Lewis,R.)，《基因工程新聞》(Genetic Engineering News)1990,10,54-55中。該等擴增方法可以用於本發明的方法中，並且包括聚合酶鏈反應(PCR)、原位PCR、連接酶擴增反應(LAR)、連接酶雜交、Qβ噬菌體複製酶、基於轉錄的擴增系統(TAS)、基因組擴增與轉錄物定序(GAWTS)、基於核酸序列的擴增(NASBA)以及原位雜交。適用於不同擴增技術的引物可以根據本領域中已知的方法製備。
聚合酶鏈反應(PCR)為核酸擴增方法，尤其描述於美國專利案第4,683,195號和第4,683,202號中。PCR由DNA聚合酶產生的引物延伸反應的重複週期組成。靶DNA係熱變性的且使兩個寡核苷酸雜交，這兩個寡核苷酸囊括待擴增的DNA相對股上的靶序列。該等寡核苷酸變成引物用於DNA聚合酶。藉由引物延伸複製DNA來製造兩個股的第二拷貝。藉由重複熱變性、引物雜交以及延伸的週期，靶DNA可以在約二到四小時內擴增一百萬倍或更多。PCR為分子生物學工具，它必須與檢測技術結合用於測定擴增結果。PCR的優點為它藉由將靶DNA的量在約4小時內擴增一百萬到十億倍來增加敏感性。PCR可以用於在診斷背景中擴增任何已知核酸(莫(Mok)等人，《婦科腫瘤學》(Gynaecologic Oncology)，1994，52：247-252)。
如擴增阻礙突變系統(ARMSTM)的對偶基因特異性擴增技術(牛頓等人，《核酸研究》，1989，17，2503-2516)也可以用於檢測單鹼基突變。在恰當的PCR擴增條件下，位於引物的3'末端的單鹼基錯配對完全匹配的對偶基因的優先擴增來說已足夠(牛頓等人，1989，前述)，允許辨別密切相關的物質。使用上述引物的擴增系統的基礎係具有錯配3'-殘基的寡核苷酸在恰當的條件下將不充當PCR引物。這一擴增系統允許在瓊脂糖凝膠電泳之後僅藉由檢查反應混合物來進行基因分型。
擴增產物的分析可以使用能夠根據它們的大小分離擴增產物的任何方法來進行，包括自動化和手動凝膠電泳、質譜等。
核酸分離、擴增以及分析方法對熟習該項技術者來說為常規的並且方案的實例可以見於例如格林和薩姆布魯克(Green & Sambrook)編，《分子選殖實驗指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，(2012，第4版，第1-3卷，ISBN 9781936113422)，紐約州冷泉港的冷泉港實驗室出版社)。PCR擴增中所用方法的尤其有用的方案來源係《PCR(基礎：從背景到實驗台)》(PCR(Basics：From Background to Bench))，M.J.麥克弗森(M.J.McPherson)，S.G.梅爾樂(S.G.Mailer)，R.貝農(R.Beynon)，C.豪(C.Howe)，斯普林格出版社(Springer Verlag)；第1版(2000年10月15日)，ISBN：0387916008。
本說明書還描述了預測和診斷套組，該等套組包括用於擴增PIK3CA基因或AKT基因和/或MAP3K1基因和MAP2K4基因中的靶核酸的簡並引物；以及說明書，包括擴增方案和結果分析。該套組也可以可替代地包括用於進行擴增以及擴增產物的分析的緩衝劑、酶以及容器。該套組也可以為包括其他工具(如DNA微陣列或其他支撐物)的篩選或診斷套組的組件。較佳的是，該套組還提供一個或多個對照模板，如從正常組織樣品分離的核酸；和/或一系列代表參考基因中的不同變化的樣品。
在一個方面中，該套組提供兩個或更多個引物對，每一對均能夠擴增參考(PIK3CA或AKT，和/或MAP3K1和MAP2K4)基因的不同區域(每一區域具有可能變化位點)，由此提供用於分析生物樣品在一個反應或若干平行反應中的若干基因變化的表現的套組。
套組中的引物可以經標記(例如螢光標記)以促進檢測擴 增產物以及隨後分析核酸的變化。該套組還可以允許在一個分析中檢測一種以上變化。組合套組將因此包括能夠擴增參考基因的不同區段的引物。該等引物可以例如使用不同的螢光標記進行差示性標記，以便在該等變化之間進行區分。
還揭露了檢測PIK3CA或AKT和/或MAP3K1和MAP2K4突變的套組的用途，所述套組包括但不限於目前市售的PIK3CA突變檢測套組和AKT突變檢測套組。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的PIK3CA的突變體形式處於基因中的所有位置處。
對於所有以上方面，使用如乳癌的腫瘤作為實例，所測定/鑒別的PIK3CA的特定突變體形式為在R38、R88、N345、C420、E453、P539、E542K、E545K、Q546、M1043、M1043以及H1047R位置處者。
對於所有以上方面，使用如乳癌的腫瘤作為實例，所測定/鑒別的PIK3CA的特定突變體形式為在E542、E545以及H1047位置處者。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的AKT的突變體形式處於基因中的所有位置處。
對於所有以上方面，使用如乳癌的腫瘤作為實例，所測定/鑒別的AKT的特定突變體形式為在E17K、L52R、C77F以及Q79K位置處者。
對於所有以上方面，使用如乳癌的腫瘤作為實例，所測定/鑒別的AKT的特定突變體形式為在E17K位置處者。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP3K1的突變體形式處於基因中的所有位置處。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP3K1的突變體形式係以導致過早翻譯終止的突變為特徵的那些形式。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP3K1的突變體形式係以導致喪失功能的突變為特徵的那些形式。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP3K1的突變體形式係以導致編碼序列的非同義變化的突變為特徵的那些形式。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP3K1的突變體形式係處於R273fs*27.I761fs*35，S431*和S1344*位置處者。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP2K4的突變體形式處於基因中的所有位置處。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP2K4的突變形式係以導致過早翻譯終止的突變為特徵的那些形式。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP2K4的突變形式係以導致喪失功能的突變為特徵的那些形式。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP2K4的突變形式係以導致編碼序列的非同義變化的突變為特徵的那些形式。
對於所有以上方面，所測定/鑒別的MAP2K4的突變體形式處於R273fs*27.I761fs*35，S431*以及S1344*位置處者。
貫穿本說明書，提及了PI3K通路的上游組分的基因狀態。為了避免疑問，當描述涵蓋PI3K通路的上游組分的任何特定方面時，提供了以下另外的方面，該等另外的方面涵蓋PI3K基因(包括PIK3CA、 PIK3CB、PIK3CD和PIK3CD基因)的狀態、AKT的同種型(包括AKT1、AKT2和AKT3基因)的狀態、PTEN基因的狀態、PDK1基因的狀態、SGK基因的狀態、INPP4B基因的狀態、INPP5D基因的狀態、PIK3R1基因的狀態和PIK3R2基因的狀態。特定的另外的方面係本文描述的任何方面，其中僅涵蓋PIK3CA基因的狀態。另外特定的另一個方面係本文描述的任何方面，其中僅涵蓋AKT基因的狀態。
類似地，並且為了避免疑問，當描述涵蓋MAP3K1和MAP2K4基因兩者的任何特定方面時，提供了涵蓋僅MAP3K1基因的狀態的另外的方面以及涵蓋僅MAP2K4基因的狀態的另一方面。
此外，並且為了避免疑問，當本說明書中提及AKT基因時，則另外的方面係選自AKT1和AKT2的基因。再另一方面，該基因僅是AKT1基因。在又另一方面中，該基因僅是AKT2基因。
另外，貫穿本說明書，提及了PI3K通路的上游組分的抑制劑。為了避免疑問，當描述涵蓋PI3K通路的上游組分的抑制劑的任何特定方面時，提供了涵蓋PI3K同種型的抑制劑(包括PI3K-α、PI3K-β和PI3K-δ抑制劑)的另外的方面以及涵蓋AKT的同種型的抑制劑(包括AKT1、AKT2、AKT1/2和AKT3抑制劑)的另外的方面。
在再另一方面中，當提及PI3K通路的上游組分的抑制劑時，所述抑制劑選自PI3K-α抑制劑和AKT抑制劑。
類似地，當描述涵蓋來自PI3K-α抑制劑和AKT抑制劑的抑制劑的選擇的任何特定方面時，提供了其中所述抑制劑僅是PI3K-α抑制劑的另外的方面以及其中所述抑制劑僅是AKT抑制劑的另外的方面。
此外，也為避免疑問，無論何時本說明書提及PI3K-α抑制劑，則提供其中所述抑制劑係1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-三級丁基-1,3,4-二唑-2-基)吡-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮(化合物A)的另一方面。
此外，並且為了避免疑問，當本說明書中提及AKT抑制劑時，則另一方面係選自AKT1和AKT2的AKT同種型的抑制劑。在另一方面中，抑制劑係AKT1/2同種型的雙重抑制劑。在再另一方面中，抑制劑僅是同種型AKT1的抑制劑。在另一方面中，抑制劑僅是同種型AKT2的抑制劑。
此外，也為避免疑問，無論何時本說明書提及AKT抑制劑，則提供其中所述抑制劑係4-胺基-N-[(1S)-1-(4-氯苯基)-3-羥基-丙基]-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲醯胺(化合物B)的另一方面。
圖1示出了乳癌細胞系中PIK3CA、MAP3K1和MAP2K4基因之突變狀態。
圖2A示出了在PIK3CA突變型乳癌細胞系中，在siRNA靶向MAP3K1 mRNA之後基礎pAKT(T308)水平的誘導。圖2B示出了當與親本(P.)MCF7細胞比較時，在突變細胞系(CR1.4和CR2.5)中，在MAP3K1基因破壞後基礎pAKT(T308)水平的以及對化合物A(PI3Kα和PI3Kδ抑制劑)處理的部分抗性的誘導。
圖3示出了在親本MCF7細胞(左圖)和MAK3K1-缺陷型MCF7 CR2.5細胞(右圖)中使用遞增水平的化合物A化合物B(AKT抑制劑)和GDC-0068(AKT抑制劑)的治療對MAP3K1、pJNK、pPRAS40、pS6 RP(S235/236)和黏著斑蛋白(Vinculin)之影響。
圖4示出了在用500nM化合物A和化合物B治療以後的親本MCF10A-H1047R(A)、MCF7(C)和MAP3K1突變型MCF10A-H1047R CR2.3(B)和MCF7 CR1.4細胞的增殖時間歷程。
圖5示出了在使用化合物A、化合物B和mTOR抑制劑(AZD2014)的情況下，親本細胞系與MAP3K1-缺陷型細胞系的增殖的IC50之比較。
圖6示出了在使用500nM化合物A、化合物B和DMSO治療60和66個小時之後親本細胞系與MAP3K1-缺陷型細胞系之匯合百分比。
圖7A示出了MAP3K1在體積上的耗減(左圖)和在3D-基質膠腺泡結構上的細胞凋亡(右圖)之影響。MCF7親本(灰色)和MCF7 CR2.5(黑色)腺泡和MCF10A-H1047R親本(灰色)和MCF10A-H1047R CR2.9(黑色)腺泡使用DMSO(-)或化合物B(+)處理15天。圖7B示出了在2μM化合物B不存在(灰色)或存在(黑色)的情況下，MCF7親本與MCF7 CR2.5腺泡的外層細胞的pS6強度均值的量化。
圖8示出了MCF7親本與MCF7 CR2.5異種移植移植物在兩個時間點(25天和45天)的腫瘤體積。
實驗方案中所用的縮寫：
實例1：已知細胞系突變的PIK3CA-MAP3K1雙突變體譜的分析。
為了測試MAP3K1功能喪失對PIK3CA突變體背景中腫瘤細胞對PI3K通路抑制劑的敏感性的影響，對鑒定的臨床樣品中的突變和存在於可獲得於公共區域中的細胞系中的那些突變進行了全面調查。該等細胞系都沒有與所需的PIK3CA-MAP3K1雙突變體譜匹配的基因譜。發現含有PIK3CA和MAP3K1突變的僅有細胞系還包含其他基因中的缺失，這將潛在地混淆結果並產生不想要的離位效應的可能性(圖1)。
實例2：含有PIK3CA和MAP3K1突變兩者的細胞系的產生以及MAP3K1表現喪失對PI3K通路的上游組分的抑制劑的活性的影響的分析。
在不存在可用的細胞系的情況下，藉由兩種方法產生再現PIK3CA突變和MAP3K1失活的細胞系模型，所述方法包括：第一，藉由siRNA轉染暫態敲低MAP3K1的表現(圖2A)；以及第二，藉由使用精確的基因編輯技術在MAP3K1基因中永久地誘導插入或缺失(圖2B)。
獨立於該途徑，在PIK3CA突變細胞系的背景下MAP3K1失活導致pAKT(T308)水平的提高。
方法1：藉由siRNA轉染來暫態敲低MAP3K1的表現
MCF7細胞來源於人乳癌。它們的特徵在於表現雌激素受體(ER)並且缺乏EGFR家族的生長因子受體HER2的表現。由於該等原因，這種細胞系被認為是ER+/HER2-管腔型乳癌的可接受的模型。第二細胞 系，T47D具有類似的特徵。此外，MCF7和T47D細胞在PIK3CA基因中攜帶“熱點”突變，並且在用PI3Kα同種型選擇性化合物處理後對通路抑制和存活力兩者均最敏感。MCF7攜帶突變c.1633G>A(p.E545K)，並且T47D攜帶突變c.3140A>G(p.H1047R)。
藉由西方印漬術監測全長蛋白的表現來測試可商購的siRNA雙股體的若干來源(西格瑪(Sigma)、Dharmacon和凱傑(QIAGEN))的MAP3K1的有效敲低。在選擇最佳表現的siRNA雙股體後，在有或沒有先前siRNA介導的MAP3K1敲低的情況下，用PI3Kα選擇性抑制劑化合物A處理細胞。由於siRNA敲低效應的暫態性質，細胞活力測定係不可行的。
RNA干擾(RNAi)和質粒轉染的方案。
使用Lipofectamine RNAiMax(英傑公司(Invitrogen))和FuGENE HD(羅氏公司(Roche))暫態轉染細胞。ON-TARGETplus MAP3K1 siRNA和購自Dharmacon的亂序陰性對照被轉染至終濃度為40nM。使用10ug DNA與15ul Fugene HD混合並且培養24和48小時進行質粒的轉染。
在MCF7、T47D細胞中測量磷酸化AKT(T308)的方案。
低傳代MCF7和T47D細胞從AZ細胞庫保藏中心(AZ Cell Bank Collection)獲得並如先前描述的進行培養(阿維娃-巴爾德拉斯(Avivar-Valderas)等人，MCB，31(17)：3616-29，2011)。野生型和MCF10A-PI3KαH1047R由地平線探索公司(Horizon Discovery)提供。
培養後，將細胞裂解，並且將蛋白藉由免疫印漬術(IB)進行分析(阿維娃-巴爾德拉斯(Avivar Valderas)等人，MCB，31(17)：3616-29，2011)。使用針對MAP3K1(聖克魯什(Santa Cruz))磷酸AKT (Thr308)(細胞傳訊技術公司(Cell Signaling Technology))和黏著斑蛋白(西格瑪)的抗體進行膜印漬。用山葵過氧化物酶(HRP)綴合的二級抗體和化學發光測定法檢測結合的抗體(阿維娃-巴爾德拉斯等人，MCB，31(17)：3616-29，2011)。
方法2：在MAP3K1基因中產生插入或缺失
為了進一步測試MAP3K1失活的效果並模擬在人乳房腫瘤中發現的突變，瑞典阿斯利康公司(AstraZeneca Sweden)使用精確的基因編輯技術在MAP3K1基因中產生插入或缺失以使其表現失活。在用期望的構建體轉染MCF7和MCF10A-PI3KαH1047R後，藉由細胞分選選擇單獨的細胞並且使其作為殖株生長。MCF7突變體殖株係MCF7-CR1和MCF7-CR2。在MCF10A-PI3KαH1047R細胞中產生的突變體殖株係MCF10A-H1047R-CR1和MCF10A-H1047R-CR2。
用於產生和驗證MAP3K1突變體殖株的方案。
使用先前描述的程序設計gRNA(多娜(Doudna)等人，《科學》(Science)346，(6213)：1258096，2014；冉(Ran)等人，《細胞》(Cell)154，1380-9，2013；蔡(Tsai)等人，《自然生物科技期刊》(Nature Biotechnology)，32，569-576，2014)。將靶向MAP3K1座位的gRNA亞選殖到gRNA-Cas9-GFP編碼載體中，並且隨後確認序列。使用FuGENE HD(羅氏公司)暫態轉染細胞並且用綠色螢光(GFP)分選。藉由有限稀釋來選擇單殖株培養物。
將基因組DNA藉由使用凱傑套組從擴增的殖株中分離。用以擴增靶向區的PCR反應係藉由使用融合閃速(Fusion Flash)DNA聚合酶 (富酶泰斯公司(Fermentas))進行。將10μL PCR產物直接變性(95℃，10分鐘)、雜交(-0.1℃/1秒)，並且用CelI酶(重組公司(recombinetic))處理。將消化產物使用10%丙烯醯胺凝膠電泳進行分析。
突變基因組DNA的桑格(Sanger)定序：用於CelI測定的相同的PCR產物係拓撲異構酶(Topo)-選殖的(生命科技公司(Life Technologies))，並且將每個樣品中至少5個單獨的殖株的質粒DNA進行分離並使用M13反向引物進行定序。
實例2A
使用藉由siRNA轉染產生的細胞系，藉由監測PI3Kα下游的傳訊讀出的抑制水平來檢查MAP3K1表現喪失對化合物A的藥理活性的影響。該通路的主要讀出係蘇胺酸308處的AKT的磷酸化。這種磷酸化由PDK1進行，其本身被PI3K產生的PIP3(磷脂醯肌醇3,4,5-三磷酸)啟動。另外的通路讀出係在Thr246處的PRAS40(富含脯胺酸的AKT1底物)的磷酸化。這種磷酸化允許mTORC1複合物的活化和p70S6K的活化，造成核糖體蛋白S6的磷酸化增強。在MCF7和T47D細胞中監測化合物A對PI3Kα的選擇性抑制的影響，其已經顯示依賴於用於通路活化和存活的這種同種型(弗裡奇等人，MCT，10：1158/1535-7163，2014)。已經顯示由於啟動型熱點E545K突變MCF7細胞具有PI3K通路的高基礎水平的活性。
用250nM化合物A處理24小時導致先前用使MAP3K1mRNA失活的對照siRNA雙股體轉染的對照細胞中Thr308上的AKT磷酸化顯著降低(圖2A)。相反，MAP3K1的siRNA敲低導致pAKT-Thr308信號的更高的基礎水平(約10倍(MCF7)和2.3倍(T47D)的增加)(圖2A)。
實例2B
還使用藉由採用精確的基因編輯技術(MCF7殖株CR1.4和CR2.5)產生的所選擇的MAP3K1缺陷型細胞系來評估通路活性。如在使用MAP3K1的siRNA敲低之前所觀察到的，該基因的失活導致MAP3K1 mRNA和蛋白質的表現喪失。如前所述，MAP3K1的喪失造成Thr308上pAKT的基礎水平增加。此外，使用化合物A對PI3K傳訊的抑制基於其藉由西方印漬術評估的對Thr308上的pAKT的影響係較不明顯的(圖2B)。
實例3：增殖測定以確定MAP3K1缺陷型對比親本細胞系的生長速率以及對化合物A和化合物B的敏感性。
根據實例2中描述的方案和方法，我們使用PIK3CA突變細胞系比較了MAP3K1缺失對化合物A與化合物B以及Genentech AKT抑制劑GDC-0068的敏感性的影響。
如先前描述的，在完全生長培養基中培養並用化合物A、化合物B和GDC-0068處理對照MCF7(親本)和MAP3K1缺陷型(CR2.5)細胞系。培養過夜後，製備細胞裂解物，並藉由使用針對PI3K通路中磷酸化蛋白具有特異性的抗體的西方印漬術進行分析(圖3)。
MAP3K1和pJNK對照印漬分別顯示蛋白質表現藉由基因編輯有效地被破壞並且其反映在通路的功能性失活中。pPRAS40抗體用作AKT活性的讀出，並且顯示MCF7 CR2.5細胞系具有pPRAS40的更高的基礎水平，並且此外該細胞系對化合物A、化合物B和GDC-0058抑制具有抗性。pS6 RP抗體用作PI3Kα活性的遠端讀出，並且顯示儘管化合物A、化合物B 和GDC-0068可以有效地抑制親本MCF7細胞中的pS6 RP活性，但是MAP3K1缺陷型細胞(CR2.5)對所有處理具有抗性(圖3)。
該數據表明MAP3K1和PIK3CA的同時突變促進對PI3Kα通路抑制劑的抗性，並且這不是特異針對AZ抑制劑(化合物A和化合物B)，但為一般抗性現象，正如用Genentech GDC-0068 AKT抑制劑也觀察到的。
實例4：增殖測定以確定MAP3K1缺陷型對比親本細胞系的生長速率以及對化合物A和化合物B的敏感性。
使用經證實在MAP3K1中具有有害突變並且沒有MAP3K1蛋白表現的殖株，表徵單層中的生長，並且使用Incucyte技術測量常規生長培養基中單層培養物上的細胞增殖。
使用IncuCyte技術的增殖測定的方案。
將MCF7和MCF10A細胞以2000個細胞/孔的密度分別鋪在含有10%FBS的RPMI培養基或含有5%HS(馬血清)的DMEM/F12培養基中的96孔板中。37℃培養16小時後，將多個濃度的化合物A、化合物B(30μM-117nM)或AZD2014(15μM-66nM)加入測定板中。然後將板放置在IncuCyte中，並安排為每6小時掃描一次，持續3天。將匯合數據的相對百分比針對對照DMSO處理的細胞進行歸一化，並使用PRISM(Graphpad)擬合為非線性回歸曲線。
殖株MCF7-CR1.4、MCF7-CR1.8和MCF7-CR2.5比親本MCF7細胞增殖快兩倍。類似地，殖株H1047R-CR2.3和H1047R-CR2.7比親本MCF10AH1047R細胞的增殖更快(增殖曲線未顯示)。
測試上游PI3K通路抑制劑化合物A(PI3Kα選擇性，參見WO 2014/114928)和化合物B(AKT1/2變構抑制劑，參見WO 2009/047563)和mTORC1/2複合物的下游通路抑制劑(AZD2014，參見WO 2008/023161)對H1047R-CR2.3和MCF7-CR1.4的增殖的影響(圖4、5和6)。儘管500nM化合物B能夠抑制MCF10A-H1047R親本細胞和MCF7親本細胞的增殖，但它對衍生的MAP3K1突變細胞系的生長沒有影響(圖4和圖6)。相對於MCF10A-H1047R親本細胞，用於殖株H1047R-CR2.3的增殖的最大效應的一半所需的化合物B的濃度(IC50)增加了10倍(圖5)。在MCF7細胞中，對增殖進行類似的觀察。儘管500nM化合物B能夠減少親本MCF7細胞的生長，但是化合物B對MCF7-CR1.4的增殖沒有影響(圖4C-D和圖6B)。在這種情況下，增殖的IC50增加3倍(圖5)。
我們還測試了化合物A對兩組細胞系的增殖的影響。我們發現與親本系MCF10A-H1047R系相比，化合物A對殖株H1047R-CR2.3的增殖具有更高的IC50(圖4A-B和圖5)。與親本MCF7細胞相比，在MCF7-CR1.4中觀察到類似的影響(圖4C-D和圖5)。
相比之下，當比較親本和MAP3K1突變細胞系時，未觀察到mTORC1/2抑制劑AZD2014的IC50的顯著變化(圖5)。AZD2014在減少親本和突變背景中的增殖同樣有效。
總之，該等數據表明在PIK3CA突變背景下的MAP3K1基因失活減少了化合物A和化合物B(PI3K通路的上游組分的兩種抑制劑)對癌細胞的增殖的抑制。相比之下，下游組分mTORC1/2的抑制劑對增殖的抑制不受MAP3K1失活的影響。
實例5：在3D生長培養中MAP3K1啟動或耗減對PI3K通路抑制劑的影響的分析。
已知當以三維形式(3D)培養時，培養中生長的癌細胞對抑制劑顯示出非常不同的敏感性。上皮細胞在細胞外基質(ECM)的影響下形成有序的極化腺體結構。附著到ECM上是控制正常上皮細胞增殖、分化和存活所需的。3D基質膠藉由向上皮細胞提供適當的整合錨定來部分地概括體內人腫瘤背景。這對於可能確定細胞命運決定和藥物敏感性的受體和存活蛋白的表現係必需的。最後，乳腺發育期間，在3D培養中的管腔形成和導管伸長的研究均支持在管腔間隙中失巢凋亡的關鍵作用(狄步思(Debnath)等人，《自然癌症綜述》(Nature Reviews Cancer)，5：675-688,2005)。由於已報導MAP3K1藉由JNK通路的活化在應激反應(包括失巢凋亡)中被啟動，3D生長培養應顯示MAP3K1失活或耗減對細胞生長和存活的更明顯的影響及其對於對PI3K通路的抑制劑的敏感性的影響。
3D基質膠培養的方案
對於3D培養，將細胞接種在可商購的生長因子減少的基質膠(Mgel)(BD生物科學(BD Biosciences)，聖地牙哥(San Diego)，CA)中，並且生長(阿維多娃-巴爾德拉斯等人，MCB，31(17)：3616-29，2011)。在IF分析的固定之前，每3天用500nM化合物B處理腺泡，直到終點(第15天)。將3D-基質膠MCF10A腺泡結構在第15天固定，並處理以進行尺寸測量和IF顯微鏡分析(阿維多娃-巴爾德拉斯等人，MCB，31(17)：3616-29，2011)。
為了進行失巢凋亡測定，收集細胞(阿維多娃-巴爾德拉斯等人，MCB，31(17)：3616-29，2011)。在定量之後，將5.105/ml細胞在 指定時間用適當的生長培養基保存在超低附著板(康寧公司(Corning))中和/或用化合物B處理。
在形態發生的15天后，藉由基因編輯(MCF7 CR2.)的MAP3K1抑制基本上不增加腺泡數目，然而當與對照(親本MCF7)腺泡相比時，其顯著增加腺泡體積(圖7A，左圖)。這可以藉由細胞增殖的增加或/和細胞死亡的減少(ECM-剝奪的細胞中的失巢凋亡)來解釋。為了測試後者，進行用半胱天冬酶3(caspase-3)(失巢凋亡讀出)染色和共焦赤道截面以分析管腔形成(發生失巢凋亡的主隔室)。
此外，化合物B處理顯著降低了對照培養(MCF7親本)中的腺泡體積，而該作用在MAP3K1缺陷型腺泡中部分恢復(圖7A，左圖)。因此，儘管化合物B在MCF10A-H1047R對照腺泡中誘導陽性切割半胱天冬酶3事件的數量顯著增加，但是這種增加在MAP3K1缺陷型MCF10A-H1047R腺泡中不顯著(圖7A，右圖)。
該等數據表明MAP3K1耗減減少細胞死亡，並且減弱由PI3K通路的上游抑制劑介導的細胞凋亡的誘導。
為了確認先前表明MAP3K1抑制降低對化合物B的敏感性的2D體外數據(圖3)，我們用PI3Kα通路標記pS6RP染色3D-腺泡。ECM貼壁細胞(位於外邊緣)對於親代腺泡中的pS6 RP係陽性的。如預測的，MCF7-CR2.5中pS6 RP陽性細胞的數量更多(圖7B，灰色條)。最後，儘管化合物B處理極大的降低親本腺泡中陽性pS6 RP細胞的數量，但是這種效應在MCF7 CR2.5腺泡中被恢復(圖7B，黑色條)。
實例6：體內異種移植物分析以比較MAP3K1缺陷型與親本對照細胞系的生長速率。
我們使用3D MCF7和MCF10A-H1047R培養物測定來模擬早期致癌事件。使用這種途徑，我們已觀察到MAP3K1耗減促進腫瘤生長體積並防止化合物B誘導的細胞凋亡。雖然該等代表了比2D體外測定更具生理性的方法，但是我們已經使用體內測定對此進行了驗證。圖8示出了在植入後25天和45天MCF7親本與MCF7 CR2.5的腫瘤體積的差異。然而在第45天差異不顯著在第25天，MAP3K1缺陷型細胞具有比親本更大的腫瘤，並且表明CR2.5殖株比親本對照細胞更有效地並且更快地生長。
方法3：體內研究。
親本MCF7和突變體MAP3K1 MCF7 C2.5細胞在如先前描述的完全生長培養基中生長。一旦達到80%匯合率，將培養物用胰酶消化，計數並如先前描述的進行植入(凱文哈德森(Kevin Hudson)等人，MCT，10.1158/1535-7163.MCT-15-0687)。總之，將5x106個細胞皮下植入含有0.50mg/21d雌激素顆粒植入物的SCID小鼠的側腹中。一旦可見則每週兩次測量腫瘤，並且每週稱量動物體重兩次，除非觀察到體重減輕。當腫瘤達到約1.6cm3時或當腫瘤/動物病症指示時實驗結束。
本文描述的實例闡述了PI3K通路的上游組分的基因狀態與MAP3K1/MAP2K4基因的狀態之間的聯繫。具體而言，顯示MAP3K1或MAP2K4基因中的突變導致PI3K通路的上游組分的抑制劑例如PI3K-α抑制劑和AKT抑制劑的作用的降低。相比之下，在用PI3K通路的下游組分例如mTOR的抑制劑的情況下沒有觀察到效果。因此，對於正在考慮用PI3K通路的上游組分的抑制劑治療的患者來說，確定其MAP3K1和MAP2K4基因的基 因狀態係有利的。優先選擇具有野生型MAP3K1和MAP2K4基因的患者進行治療。
#基因組區
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#轉錄物
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Claims (15)

  1. 一種治療患有癌症的患者之方法，該方法包括：(a)在代表該癌症且先前從該患者分離的樣品中，確定PI3K通路的上游組分的基因狀態是野生型還是突變型；(b)確定該樣品中的MAP3K1基因是野生型還是突變型；(c)確定該樣品中的MAP2K4基因是野生型還是突變型；並且(d)向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分之抑制劑，如果：(i)該PI3K通路的上游組分的基因狀態被確定為係突變型；(ii)該MAP3K1基因被確定為是野生型；並且(iii)該MAP2K4基因確定為是野生型。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該PI3K通路的上游組分選自PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、AKT1、AKT2、AKT3、PTEN、PDK1、SGK、INPP4B、INPP5D、PIK3R1和PIK3R2。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該PI3K通路的上游組分係AKT1、AKT2、和/或AKT3。
  4. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之方法，其中該癌症係乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、頭頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、子宮頸癌、外陰癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、膀胱癌、腦癌、結腸直腸癌、膽囊癌、膽管癌、皮膚癌、胰腺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、腎癌、肝癌、外陰癌、陰莖癌或其他PI3-激酶依賴性癌症。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該癌症係乳癌。
  6. 如申請專利範圍第1-5項中任一項所述之方法，其中該抑制劑係4-胺基-N-[(1S)-1-(4-氯苯基)-3-羥基-丙基]-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲醯胺。
  7. 一種治療患有癌症的患者之方法，該方法包括：(a)確定該患者的癌細胞中的AKT基因是野生型還是突變型；(b)確定該患者的癌細胞中的MAP3K1基因是野生型還是突變型；(c)確定該患者的癌細胞中的MAP2K4基因是野生型還是突變型；(d)向該患者給予有效量的AKT抑制劑，如果該等癌細胞具有：(i)突變型AKT基因；(ii)野生型MAP3K1基因；和(iii)野生型MAP2K4基因。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該抑制劑係4-胺基-N-[(1S)-1-(4-氯苯基)-3-羥基-丙基]-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲醯胺。
  9. PI3K通路的上游組分的抑制劑用於治療癌症之用途，其中該等癌細胞具有在PI3K通路的上游組分中的突變、野生型MAP3K1基因和野生型MAP2K4基因。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該PI3K通路的上游組分係AKT1、AKT2、和/或AKT3。
  11. 如申請專利範圍第9-10項中任一項所述之方法，其中該抑制劑係4-胺基-N-[(1S)-1-(4-氯苯基)-3-羥基-丙基]-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲醯胺。
  12. 一種用於取消選擇患有癌症的患者進行治療之方法，該方法包括：鑒定患有對用PI3K通路的上游組分的抑制劑的治療具有潛在易感性的癌症之候選患者；並且確定先前從該候選患者分離的代表該癌症的樣品中的MAP3K1和MAP2K4基因是野生型還是突變型； 其中，如果該等癌細胞具有突變型MAP3K1或MAP2K4基因，則取消選擇該患者用PI3K通路的上游組分的抑制劑進行治療。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該PI3K通路的上游組分係AKT1、AKT2、和/或AKT3。
  14. 一種治療患者體內的癌症之方法，該患者的PI3K通路的上游組分以及MAP3K1和MAP2K4的癌細胞基因狀態已經被確定，該方法包括：如果該等癌細胞具有在PI3K通路的上游組分中的突變、野生型MAP3K1基因和野生型MAP2K4基因，則向該患者給予有效量的PI3K通路的上游組分的抑制劑。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該PI3K通路的上游組分係AKT1、AKT2、和/或AKT3。
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