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WO2025110738A1 - 반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물 및 이를 이용한 반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 진단방법 - Google Patents

반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물 및 이를 이용한 반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 진단방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2025110738A1
WO2025110738A1 PCT/KR2024/018465 KR2024018465W WO2025110738A1 WO 2025110738 A1 WO2025110738 A1 WO 2025110738A1 KR 2024018465 W KR2024018465 W KR 2024018465W WO 2025110738 A1 WO2025110738 A1 WO 2025110738A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pik3ca
primer
companion animal
represented
sequence number
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/KR2024/018465
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
홍재우
주안린
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Canicaticare Inc
Industry Academic Cooperation Foundation of Daegu Catholic University
Original Assignee
Canicaticare Inc
Industry Academic Cooperation Foundation of Daegu Catholic University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020240160246A external-priority patent/KR20250078789A/ko
Application filed by Canicaticare Inc, Industry Academic Cooperation Foundation of Daegu Catholic University filed Critical Canicaticare Inc
Publication of WO2025110738A1 publication Critical patent/WO2025110738A1/ko
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a composition for detecting a PIK3CA gene mutant tumor in a companion animal, comprising a primer set capable of amplifying a PIK3CA gene mutation in a companion animal, and a method for diagnosing a PIK3CA gene mutant tumor in a companion animal using the same.
  • the present invention detects a PIK3CA gene mutation in a companion animal, diagnoses a PIK3CA gene mutant tumor, and provides information necessary for treatment.
  • PI3CA Phosphatidylinositol 3-kinase
  • PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase
  • PI3K activates the signal transduction system of the tyrosine kinase receptor.
  • Activated tyrosine kinase is involved in the carcinogenesis process by activating the function of proteins that suppress cell survival and division and the function of proteins that promote metabolism and help cell growth.
  • PIK3CA gene mutations accelerate the rate of cancer progression and increase the frequency of metastasis, worsening the patient's prognosis. It is also known to belong to the signal transduction system downstream of the Human Epidermal Growth Factor (HER) family and to be involved in the resistance of HER family targeted therapeutics.
  • HER Human Epidermal Growth Factor
  • biomarkers which are indicators that can detect changes in the body using proteins, DNA, RNA (ribonucleic acid), metabolites, etc., can be utilized to objectively measure the normal or pathological state of a living organism, the degree of response to drugs, etc.
  • the inventors of the present invention have completed the present invention to detect PIK3CA gene mutations in companion animals, diagnose changes in the body of companion animals, and produce a primer set for detecting PIK3CA gene mutant tumors, thereby providing information necessary for the diagnosis of related diseases.
  • the present invention aims to provide a method for detecting a tumor in a companion animal very simply and quickly using a composition for detecting a PIK3CA gene mutant tumor in a companion animal, and for performing a clinical diagnosis quickly and easily with high reliability.
  • the present invention provides a primer set for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, comprising a forward primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 and a reverse primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOs: 4 to 8, and a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor comprising the same.
  • a method for diagnosing a companion animal PIK3CA gene mutant tumor and information necessary for treating a companion animal PIK3CA gene mutant tumor using the primer set are provided.
  • FIG. 1 shows the results of performing PCR (RP-qPCR) using a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, including a primer set, according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1(a) and FIG. 1(b) show the results of confirming PCR amplification and evaluating analytical sensitivity by setting the ratio of mutant DNA to 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, and 100% for template DNA of Accession Number: NC_051838.
  • FIG. 2 shows the results of performing PCR (RP-qPCR) using a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, including a primer set, according to one embodiment of the present invention.
  • RP-qPCR PCR
  • the ratio of mutant DNA was set to 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, and 100%, and the results of evaluating analytical sensitivity are shown.
  • This shows the results of confirming the agarose gel electrophoresis in the step of detecting a companion animal PIK3CA mutation by analyzing the gene amplification of RT-qPCR.
  • FIG. 3 shows the results of performing PCR (RP-qPCR) using a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, including a primer set, according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3(a) and FIG. 3(b) show the results of performing PCR amplification using a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, including a primer set including at least one selected from the group consisting of the forward primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 2 and the reverse primer represented by SEQ ID NO: 4, for template DNA of Accession Number: NC_006616.
  • FIG. 3(c) and FIG. 3(d) show the results of analyzing the gene amplification of RT-qPCR using the melting curve analysis method in the step of detecting a companion animal PIK3CA mutation by analyzing the gene amplification of the RT-qPCR.
  • FIG. 4 shows the results of performing PCR (RP-qPCR) using a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, including a primer set, according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4(a) and FIG. 4(b) show the results of confirming PCR amplification and evaluating analytical sensitivity by setting the ratio of mutant DNA to 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, and 100% for template DNA of Accession Number: NC_051838.
  • FIG. 5 shows the results of performing PCR (RP-qPCR) using a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, including a primer set, according to one embodiment of the present invention.
  • RP-qPCR PCR
  • the ratio of mutant DNA was set to 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, and 100%, and the results of evaluating analytical sensitivity and confirming PCR amplification are shown. This is the result of confirming by agarose gel electrophoresis in the step of detecting a companion animal PIK3CA mutation by analyzing gene amplification of RT-qPCR.
  • composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor including a primer set including at least one primer selected from the group consisting of a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NOs: 5 to 8.
  • FIG. 6 shows the results of performing PCR (RP-qPCR) using a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, including a primer set, according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 6(a) and FIG. 6(b) show the results of performing PCR amplification using a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, including a primer set including at least one primer selected from the group consisting of a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and reverse primers represented by SEQ ID NOs: 5 to 8, for template DNA of Accession Number: NC_006616.
  • FIG. 6(c) and FIG. 6(d) show the results of analyzing the gene amplification of RT-qPCR using the melting curve analysis method in the step of detecting a companion animal PIK3CA mutation by analyzing the gene amplification of the RT-qPCR.
  • the expressions “have,” “may have,” “include,” or “may include” indicate the presence of a given feature (e.g., a component such as a number, function, operation, or part), and do not exclude the presence of additional features.
  • the expressions “A or B,” “at least one of A and/or B,” or “one or more of A or/and B” can include all possible combinations of the listed items.
  • “A or B,” “at least one of A and B,” or “at least one of A or B” can all refer to (1) including at least one A, (2) including at least one B, or (3) including both at least one A and at least one B.
  • the present invention relates to a primer set for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, comprising a forward primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 and a reverse primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOs: 4 to 8.
  • the term 'primer' used in the present invention refers to a short nucleic acid sequence having a short free 3-terminal hydroxyl group, which can form base pairs with a complementary template and functions as a starting point for template strand copying.
  • the 'template' refers to a 'template nucleic acid' and refers to a nucleic acid used as a template for amplification in a PCR reaction.
  • the 'template' may include all that exist in nature, are naturally produced, or are synthetic.
  • the 'template' in the present invention may refer to the PIK3CA gene of a companion animal.
  • the above primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization reaction (DNA polymerase, reverse transcriptase, etc.) and four different nucleoside triphosphates in an appropriate buffer solution and temperature.
  • the primer is also called an initiator, and can be formed in various forms such as DNA, RNA, PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), or a mixture thereof, and can be used for gene amplification.
  • the above primers can be prepared by chemical synthesis, for example, using the phosphoramidite method, the phosphodiester method, the diethylphosphoramidite method, etc.
  • the primer base sequence can be modified by means known in the art.
  • the primers are typically single-stranded oligonucleotides (e.g., oligodeoxyribonucleotides).
  • the length of the primers varies depending on the intended use, ranging from 10 to 50 consecutive nucleotides, preferably from 15 to 35 nucleotides. Shorter primer molecules generally require lower temperatures to form sufficiently stable hybridization complexes with the template.
  • the primers do not need to reflect the exact sequence of the template, but should be sufficiently complementary to the template for the primers to hybridize to be extended.
  • the primers may, if desired, contain a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means.
  • labels include enzymes (e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioisotopes (e.g., 32 P), fluorescent molecules, and chemical groups (e.g., biotin).
  • the term 'primer set' used in the present invention means a plurality of primers.
  • the primer set may further include a container for accommodating the primers.
  • the plurality of primers of the primer set may include a forward primer and a reverse primer, which mean general primers commonly used for amplifying a genetic sample including a genetic mutation to be detected. This is a matter that can be easily determined by a person having ordinary knowledge in the art related to such primer sets according to a genetic mutation to be detected and a gene including the mutation.
  • the primer set of the present invention is carefully designed to maximize the sensitivity and specificity of detecting PIK3CA gene mutations in companion animals by sufficiently considering the size of the primer, the Tm value, the GC content of the primer, prevention of formation of a complex (dimer) of the primer by self-complementary sequences in the primer, prohibition of repetition of the same base sequence three or more times, etc.
  • the term 'mutation' used in the present invention refers to a phenomenon in which a qualitative or quantitative change occurs in a gene due to an abnormality in the gene or chromosome, thereby causing a change in the genetic trait.
  • the mutation may be a mutation at the gene level, and preferably may be a point mutation or multiple mutation selected from substitution, insertion, and deletion.
  • the mutation may be a silent mutation, a neutral mutation, a missense mutation, a nonsense mutation, a frame shift mutation, etc., and is not limited in type.
  • the term 'PCR (polymerase chain reaction)' used in the present invention is a method of confirming whether a gene is amplified using a fluorescent substance, and is a gene amplification method that can amplify and detect genes simultaneously.
  • the PCR reaction can be performed through (i) an initial denaturation step; (ii) a step of repeating one cycle of denaturation, annealing, and extension several to several dozen times; and (iii) a final heat treatment step; or a thermal cycle program that appropriately modifies these steps.
  • the gene amplification may use one amplification method selected from the group consisting of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time reverse transcriptase polymerase reaction (Real time RT-PCR), quantitative polymerase chain reaction (qPCR), competitive reverse transcription polymerase chain reaction (Competitive RT-PCR), real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), inverse polymerase chain reaction (Inverse PCR), and long and accurate polymerase chain reaction (Long and Accurate PCR).
  • the gene amplification using the primer set may preferably use one amplification method selected from the group consisting of RT-PCR, RT-qPCR, and Real time PCR. More preferably, it may use RT-qPCR.
  • 'RT-qPCR' is a combined technology of 'RT-PCR' and 'qPCR', which allows quantification of gene expression and enables rapid and accurate detection.
  • PCR, RT-PCR, RT-qPCR or Real time PCR amplification results can be confirmed by agarose gel electrophoresis, etc.
  • the electrophoresis results can be analyzed by ethidium bromide staining.
  • the RT-qPCR amplification results can be analyzed using agarose gel electrophoresis or melting curve analysis.
  • the 'PIK3CA' of the present invention is a gene for phosphoinositide 3-kinase (PI3K), and the PI3K is a lipid kinase that catalyzes the reaction of phosphorylating phosphatidyl-inositol 4,5-bisphosphate (PIP 2 ), which is involved in cell signaling, into phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP 3 ).
  • PI3K is classified into classes I, II, and III based on structure, mechanism of action, and substrate specificity. Among them, class IB PI3K contains p110 ⁇ , which is activated by G protein-coupled receptors.
  • the cell signaling pathway through p110 ⁇ is overly activated in human cancer cells. And when the PI3K cell signaling pathway is abnormally regulated, the level of PIP 3 increases, activating the downstream enzyme Akt, which ultimately affects cancer, immune disorders, and cardiovascular disorders.
  • the PIK3CA gene which encodes p110 ⁇ , is mutated and overexpressed in various primary cancers. Mutations in the PIK3CA gene lead to the activation of the PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase) protein, and PI3K activates the signal transduction system of the tyrosine kinase receptor.
  • PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase
  • Activated tyrosine kinase is involved in the carcinogenesis process by activating the function of proteins that suppress cell survival and division, interfere with metabolism promotion, and activate the function of proteins that help cell growth.
  • PIK3CA gene mutations accelerate the rate of cancer progression and increase the frequency of metastasis, worsening the prognosis of cancer development. It is also known to belong to the signaling system downstream of the Human Epidermal Growth Factor (HER) family and to be involved in resistance to targeted therapeutics of the HER family.
  • This PIK3CA gene mutation can cause a tumor, and the tumor can be a mammary tumor.
  • the mammary tumor can be at least one selected from the group consisting of fibroadenoma, adenocarcinoma, and spindle cell neoplasm.
  • the companion animal of the present invention may be at least one selected from the group consisting of a companion dog, a cat, a mouse, a rabbit, a horse, a sheep, a hamster, a hedgehog, a ferret, and a guinea pig.
  • the companion animal of the present invention may be a companion dog.
  • the primer set for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor detects at least one mutation selected from the group consisting of PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L, and PIK3CA_H1047Y.
  • the primer set of the present invention can amplify either one of PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L, or PIK3CA_H1047Y, or simultaneously amplify one or more mutations selected from the group consisting of PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L, and PIK3CA_H1047Y.
  • the 'PIK3CA gene mutant tumor detection primer set' of the present invention refers to a set composed of primer pairs that can specifically bind to at least one mutation site selected from the group consisting of PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L, and PIK3CA_H1047Y in the PIK3CA gene and induce an extension reaction.
  • Each of the primer pairs generates a PCR product for a PIK3CA gene mutation, but hardly generates one for a wild-type PIK3CA gene.
  • the primers represented by the above sequence numbers 1 to 8 are as follows:
  • cPIK3CA-E545-WT-fwd-1 5'- gatcctctctctgaaatcactg-3' (SEQ ID NO: 1)
  • cPIK3CA-E545K-fwd-1 5'- gatcctctctctgaaatcacta -3' (SEQ ID NO: 2)
  • cfPIK3CA-H1047-fwd-2 5'- catacattcgaaagaccctagc-3' (SEQ ID NO: 3)
  • cfPIK3CA-E545-rve-1 5'- aggttagtaccaatgcagcgt-3' (SEQ ID NO: 4)
  • cPIK3CA-H1047-WT-rve-2 5'- tgttgtccagccatgatg-3' (SEQ ID NO: 5)
  • cPIK3CA-H1047R-rve-2 5'- ttgttgtccagccaccatgag-3' (SEQ ID NO: 6)
  • cPIK3CA-H1047L-rve-2 5'- ttgttgtccagccaccatgaa-3' (SEQ ID NO: 7)
  • cPIK3CA-H1047Y-rve-2 5'- tgttgtccagccatgata-3' (SEQ ID NO: 8)
  • the 1 base at the 3' end of the forward primer of the above sequence number 2 may be used for mutation detection corresponding to a position with a high possibility of mutation in the target DNA sequence.
  • the 1 base at the 3' end of the reverse primer of the above sequence number 6 may be used for mutation detection corresponding to a position with a high possibility of mutation in the target DNA sequence.
  • the 1 base at the 3' end of the reverse primer of the above sequence number 7 may be used for mutation detection corresponding to a position with a high possibility of mutation in the target DNA sequence.
  • the 1 base at the 3' end of the reverse primer of the above sequence number 8 may be used for mutation detection corresponding to a position with a high possibility of mutation in the target DNA sequence.
  • the present invention relates to a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, comprising at least one primer set selected from the group consisting of: a) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 1 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 4; b) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 2 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 4; c) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 5; d) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 6; e) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 7; and f) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 7; and f
  • the present invention relates to a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, comprising at least one primer set selected from the group consisting of a) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 1 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 4; and b) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 2 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 4, wherein the primer set detects a PIK3CA_E545K mutation.
  • the present invention relates to a composition for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, comprising at least one primer set selected from the group consisting of: c) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 5; d) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 6; e) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 7; and f) a primer set comprising a forward primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 8, wherein the primer set detects at least one mutation selected from the group consisting of PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L, and PIK3CA_H1047Y.
  • any one of PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L, and PIK3CA_H1047Y can be amplified, or at least one mutation selected from the group consisting of PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L, and PIK3CA_H1047Y can be amplified simultaneously.
  • the present invention relates to a method for diagnosing a PIK3CA gene mutant tumor in a companion animal, comprising the steps of: performing RT-qPCR on a PIK3CA gene in a companion animal using a primer set for detecting a PIK3CA gene mutant tumor in a companion animal, the primer set comprising a forward primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 and a reverse primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOs: 4 to 8; and detecting a PIK3CA mutation in the companion animal by analyzing the gene amplification of the RT-qPCR.
  • the above companion animal PIK3CA gene mutant tumor may be a mammary tumor.
  • the mammary tumor may be at least one selected from the group consisting of fibroadenoma, adenocarcinoma, and spindle cell neoplasm.
  • the step of performing RT-qPCR on the PIK3CA gene of a companion animal using a primer set for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor comprising a forward primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOS: 1 to 3 and a reverse primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOS: 4 to 8, means a process of amplifying the target DNA by using a target DNA as a template and repeating the processes of denaturation, annealing, and extension reactions using a primer specific for the target DNA.
  • the target DNA can be used using the canine PIK3CA gene information registered in the NCBI genebank of [Table 1] below as a template.
  • the primer set comprising a forward primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOS: 1 to 3 and a reverse primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOS: 4 to 8
  • specific PCR conditions include initial denaturation through heat treatment at 90 to 95°C for 1 to 20 minutes, a denaturation step at 90 to 95°C for 10 seconds to 2 minutes; an annealing step at 58 to 70°C for 10 seconds to 2 minutes; and a synthesis step at 70 to 75°C for 10 seconds to 2 minutes, repeating the above-described conditions 10 to 40 times in total, so that PCR amplification can be performed.
  • initial denaturation is performed at 95°C for 3 minutes, followed by a denaturation step at 95°C for 10 seconds; An annealing step of 10 seconds at 66°C and a synthesis step of 30 seconds at 72°C can be performed.
  • the analysis can be performed by analyzing the size of the PCR amplification product using a method known in the art.
  • the size of the amplification product can be confirmed by comparison with a target size marker by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or the PIK3CA mutation can be detected by melting curve analysis.
  • the above melting curve analysis method means specifically detecting companion animal PIK3CA gene mutation by confirming the temperature at which double-stranded DNA dissociates into single-stranded DNA.
  • the melting curve analysis method was used to analyze the gene amplification of the RT-qPCR.
  • the ratio of PIK3CA mutant DNA to the target PIK3CA wild-type (WT) DNA was set to 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, and 100%, and as a result of evaluating the analytical sensitivity of the primer kit of the present invention, the mutation was detected from the mutation ratio of 0.001% (see FIGS. 1 and 4).
  • the mutation was detected from the mutation ratio of 0.01%. More preferably, it can be confirmed that the mutation was detected from the mutation ratio of 1% (see FIGS. 1 to 2 and FIGS. 4 to 5).
  • FIGS. 1 to 2 and FIGS. 4 to 5 previous research results have reported that mutations can be discovered as a result of base sequence analysis only when the concentration of mutant DNA is 10% or higher.
  • the present invention can detect mutations even at a mutant DNA ratio of 0.001%, which is much lower than 10%, showing that the sensitivity of the kit of the present invention is very high.
  • the detection of PIK3CA_E545K mutation was confirmed using the composition for detecting companion animal PIK3CA gene mutant tumor, and one Melt Peak was confirmed (see Figs. 1 and 3), and the section where the fluorescence sensitivity rapidly decreased occurred within the range of 81 to 84°C, and when the Melt Curve was confirmed, it could be confirmed to have a single specific melting temperature (see Figs. 1 and 3). It could be confirmed that the specificity of PIK3CA_E545K mutation was very excellent using the composition for detecting companion animal PIK3CA gene mutant tumor.
  • the composition for detecting companion animal PIK3CA gene mutant tumors was used to confirm the detection of PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L or PIK3CA_H1047Y mutations, one Melt Peak was confirmed (see FIGS. 4 and 6), and the section where the fluorescence sensitivity rapidly decreased occurred within the range of 81 to 84°C, and when the Melt Curve was confirmed, it could be confirmed that it had a single specific melting temperature (see FIGS. 4 and 6). It could be confirmed that the composition for detecting companion animal PIK3CA gene mutant tumors has very excellent specificity for PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L or PIK3CA_H1047Y mutations.
  • the present invention relates to a method for providing information necessary for treating a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, comprising: isolating a PIK3CA gene from a cancer sample or a sample suspected of having a cancer mutation; performing RT-qPCR using a primer set for detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, the primer set including the separated PIK3CA gene as a template and a forward primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOS: 1 to 3 and a reverse primer selected from the group consisting of primers represented by SEQ ID NOS: 4 to 8; and identifying a specific region of the PIK3CA gene in a product amplified by the RT-qPCR.
  • sample' used in the present invention refers to a genetic sample containing a genetic mutation site to be detected. Specifically, it may be any biologically derived sample capable of genetic analysis, including nuclei and/or mitochondria, cells, tissues, organs, body fluids, etc., or endogenous genes or exogenous genes extracted therefrom.
  • the cancer sample or the suspected cancer mutation occurrence sample may be collected from a blood sample of a companion animal.
  • the companion animal may be a companion dog.
  • the PIK3CA gene can be isolated from the sample according to a conventional method known in the art.
  • the RT-qPCR refers to a process of amplifying target DNA by using target DNA as a template and repeating the processes of denaturation, annealing, and extension reactions using primers specific for the target DNA.
  • the specific region of the PIK3CA gene means detecting at least one mutation selected from the group consisting of PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L, and PIK3CA_H1047Y.
  • the present invention relates to a kit for use in detecting a companion animal PIK3CA gene mutant tumor, the kit comprising one or more primers selected from the group consisting of base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8.
  • RT-qPCR performed using one or more primers selected from the group consisting of the base sequences of the above sequence numbers 1 to 8 can reliably and rapidly identify companion animal PIK3CA gene mutations, thereby rapidly diagnosing companion animal PIK3CA gene mutant tumors and rapidly providing information necessary for treating companion animal PIK3CA gene mutant tumors.
  • the term 'kit' used in the present invention may include DNA polymerase, dNTPs, buffer, etc. to perform PCR amplification reaction.
  • the kit may further include a user guide describing optimal reaction performance conditions.
  • the guide is a printed matter explaining how to use the kit, for example, a method for preparing reverse transcription buffer and PCR buffer, suggested reaction conditions, etc.
  • the guide includes a description in the form of a pamphlet or leaflet, a label attached to the kit, and on the surface of a package containing the kit.
  • the guide includes information disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
  • the kit may take the form of a bottle, a tub, a sachet, an envelope, a tube, an ampoule, etc., which may be formed partly or wholly from plastic, glass, paper, foil, wax, etc.
  • the container may be equipped with a completely or partially detachable stopper, which may initially be part of the container or may be attached to the container by mechanical, adhesive, or other means.
  • the container may also be fitted with a stopper, the contents of which may be accessed by means of a syringe needle.
  • the detection of the above companion animal PIK3CA gene mutation tumor may be used to assess the prognosis of cancer or predict the risk of developing cancer mutations.
  • the detection of the above companion animal PIK3CA gene mutation tumor may provide information necessary for targeted treatment of cancer.
  • Table 1 shows the PIK3CA gene information of dogs registered in NCBI genebank to be used as a template for gene amplification in the present invention.
  • the SnapGene program was used to design eight primers by checking the primer size, Tm value, GC content of the primer, and whether there is a self-complementary sequence within the primer.
  • the base sequences of the designed primers are shown in [Table 2].
  • PCR of template DNA was performed using the primers prepared in Example 1 above.
  • Each 10 uL reaction contained 5 uL of master mix, 1 uL of primers (final concentration of 0.1 uM each), 2 uL of nuclease-free water, and 1 uL of template DNA (0.1 ng/ul).
  • PCR runs were analyzed with Bio-Rad CFX Maestro software version 2.3. In all analyses, automatic thresholding was set to determine the threshold cycle (Ct). PCR conditions are as shown in [Table 3].
  • the primer that can target PIK3CA gene mutation can selectively detect only DNA containing mutation without detecting normal DNA. Therefore, the primer can specifically detect PIK3CA gene mutation causing tumor and can be usefully utilized in the diagnosis of PIK3CA gene mutant tumor in companion animals.
  • cPIK3CA-E545-WT-fwd-1 5'- gatcctctctctgaaatcactg-3' (SEQ ID NO: 1)
  • cPIK3CA-E545K-fwd-1 5'- gatcctctctctgaaatcacta -3' (SEQ ID NO: 2)
  • cfPIK3CA-H1047-fwd-2 5'- catacattcgaaagaccctagc-3' (SEQ ID NO: 3)
  • cfPIK3CA-E545-rve-1 5'- aggttagtaccaatgcagcgt-3' (SEQ ID NO: 4)
  • cPIK3CA-H1047-WT-rve-2 5'- tgttgtccagccatgatg-3' (SEQ ID NO: 5)
  • cPIK3CA-H1047R-rve-2 5'- ttgttgtccagccaccatgag-3' (SEQ ID NO: 6)
  • cPIK3CA-H1047L-rve-2 5'- ttgttgtccagccaccatgaa-3' (SEQ ID NO: 7)
  • cPIK3CA-H1047Y-rve-2 5'- tgttgtccagccatgata-3' (SEQ ID NO: 8)

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.

Description

반려동물의 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물 및 이를 이용한 반려동물의 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 진단방법
본 발명은 반려동물의 PIK3CA 유전자 돌연변이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 반려동물의 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물 및 이를 이용한 반려동물의 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 반려동물의 PIK3CA 유전자 돌연변이를 검출하여 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양을 진단하고 치료에 필요한 정보를 제공한다.
인간을 비롯한 동물의 암의 발생에 암유전자(oncogene) 및 종양억제유전자(tumor suppressor gene)의 돌연변이가 관여한다는 사실이 알려지면서 여러 암유전자 및 종양억제유전자의 돌연변이를 검출하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 이러한 돌연변이 검출은 암의 발생 및 약물의 예후판단에 관여하여 암 또는 종양의 예방, 진단 또는 치료에 필요한 정보를 제공한다.
PIK3CA 유전자의 돌연변이는 PI3K(Phosphatidylinositol 3-kinase) 단백질의 활성화를 가져오고 PI3K는 타이로신 키나아제 수용체의 신호전달 체계를 활성화한다. 활성화된 타이로신 키나아제는 세포의 생존과 분열을 억제하는 단백질의 기능과 대사촉진을 방해하며 세포 성장을 돕는 단백질의 기능을 활성화시킴으로써 발암과정에 관여한다. PIK3CA 유전자 돌연변이는 암 진행 속도를 빠르게 하고 전이 빈도를 증가시켜 환자의 예후를 악화시킨다. 또한 인간 표피성장인자류(Human Epidermal Growth Factor, HER family)의 하류부분(downstream)의 신호전달 체계에 속하여 HER 패밀리의 표적 치료제들의 내성에 관여하는 것으로 알려져 있다.
동물에서 종양과 같은 질병은 인간과 달리 정기검진 등 종양관련 질병에 대하여 적절한 바이오마커의 탐지검사 등 보조적 진단 또는 검출 수단이 없다. 동물의 경우 정기적인 건강검진이 이루어지지 않으며 질병의 징후가 발생되는 경우 뒤늦게 검진이 이루어지고 있어 질병의 예방이 어렵다. 또한, 동물은 일반 동물병원에서 조형검사, 조직검사와 같은 정밀검사를 일상적으로 수행할 수 없어 한계가 있다. 일반적으로 인간의 경우 단백질이나 DNA, RNA(리보핵산), 대사 물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표인 바이오마커를 활용하면 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 반려동물에서 PIK3CA 유전자 돌연변이를 검출하여 반려동물의 몸 안의 변화를 진단하고 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출을 위한 프라이머 세트를 제작하여 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하고자 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
국내등록특허 제10-1543215호
본 발명은 반려동물의 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 반려동물의 종양을 매우 간단하고 신속하게 검출하고, 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 임상진단을 할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 제공한다. 또한, 상기 프라이머 세트를 이용하여 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 진단 방법, 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 치료에 필요한 정보를 제공한다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 RT-qPCR을 수행하는 경우 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양을 높은 정확도와 민감도로 검출할 수 있고, 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 임상진단을 하고 종양 치료에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR(RP-qPCR)을 수행한 결과이다. 도 1(a) 및 도 1(b)는 Accession Number: NC_051838의 주형 DNA에 대하여, 돌연변이 DNA의 비율을 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, 100%로 정하여 PCR 증폭을 확인하고 분석적 감도를 평가한 결과를 나타낸다. 서열번호 1 내지 2로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR 증폭 실행한 결과이다. 도 1(c)와 도 1(d)는 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 멜팅커브 분석법을 이용하여 상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR(RP-qPCR)을 수행한 결과이다. Accession Number: NC_051838의 주형 DNA에 대하여, 돌연변이 DNA의 비율을 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, 100%로 정하여 PCR 증폭을 확인하고 분석적 감도를 평가한 결과를 나타낸다. RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 아가로스겔 전기영동법으로 확인한 결과이다. 서열번호 1 내지 2로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR 증폭 실행한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR(RP-qPCR)을 수행한 결과이다. 도 3(a) 및 도 3(b)는 Accession Number: NC_006616의 주형 DNA에 대하여, 서열번호 1 내지 2로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR 증폭 실행한 결과이다. 도 3(c)와 도 3(d)는 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 멜팅커브 분석법을 이용하여 상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR(RP-qPCR)을 수행한 결과이다. 도 4(a) 및 도 4(b)는 Accession Number: NC_051838의 주형 DNA에 대하여, 돌연변이 DNA의 비율을 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, 100%로 정하여 PCR 증폭을 확인하고 분석적 감도를 평가한 결과를 나타낸다. 서열번호 3로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5 내지 8로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR 증폭 실행한 결과이다. 도 4(c)와 도 4(d)는 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 멜팅커브 분석법을 이용하여 상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR(RP-qPCR)을 수행한 결과이다. Accession Number: NC_051838의 주형 DNA에 대하여, 돌연변이 DNA의 비율을 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, 100%로 정하여 PCR 증폭을 확인하고 분석적 감도를 평가한 결과를 나타낸다. RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 아가로스겔 전기영동법으로 확인한 결과이다. 서열번호 3로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5 내지 8로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR 증폭 실행한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR(RP-qPCR)을 수행한 결과이다. 도 6(a) 및 도 6(b)는 Accession Number: NC_006616의 주형 DNA에 대하여, 서열번호 3로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5 내지 8로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PCR 증폭 실행한 결과이다. 도 6(c)와 도 6(d)는 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 멜팅커브 분석법을 이용하여 상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명의 다양한 실시예가 첨부된 도면을 참조하여 기재된다. 본 발명은 특정 실시예에 대해 한정되지 아니며, 본 발명의 실시예들의 다양한 변경(Modification), 균등물(Equivalent) 및/또는 대체물(Alternative)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 도면의 설명과 관련하여, 유사한 구성요소에 대해서는 유사한 참조 부호가 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "가진다", "가질 수 있다", "포함한다", 또는 "포함할 수 있다" 등의 표현은 해당 특징(예: 수치, 기능, 동작, 또는 부품 등의 구성요소)의 존재를 가리키며, 추가적인 특징의 존재를 배제하지 않는다.
본 명세서에서, "A 또는 B", "A 또는/및 B 중 적어도 하나", 또는 "A 또는/및 B 중 하나 또는 그 이상" 등의 표현은 함께 나열된 항목들의 모든 가능한 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, "A 또는 B", "A 및 B 중 적어도 하나", 또는 "A 또는 B 중 적어도 하나"는, (1) 적어도 하나의 A를 포함, (2) 적어도 하나의 B를 포함, 또는 (3) 적어도 하나의 A 및 적어도 하나의 B 모두를 포함하는 경우를 모두 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 표현 "~하도록 구성된(또는 설정된)(Configured to)"은 상황에 따라, 예를 들면, "~에 적합한(Suitable for)", "~하는 능력을 가지는(Having the capacity to)", "~하도록 설계된(Designed to)", "~하도록 변경된(Adapted to)", "~하도록 만들어진(Made to)", 또는 "~를 할 수 있는(Capable of)"과 바꾸어 사용될 수 있다. 용어 "~하도록 구성(또는 설정)된"은 "특별히 설계된(Specifically designed to)"것 만을 반드시 의미하지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어들은 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 다른 실시예의 범위를 한정하려는 의도가 아닐 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함할 수 있다. 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 용어들은 본 명세서에 기재된 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어들 중 일반적인 사전에 정의된 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 동일 또는 유사한 의미로 해석될 수 있으며, 본 명세서에서 명백하게 정의되지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 경우에 따라서, 본 명세서에서 정의된 용어일지라도 본 명세서의 실시예들을 배제하도록 해석될 수 없다.
본 명세서에 개시된 실시예는 개시된, 기술 내용의 설명 및 이해를 위해 제시된 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 따라서, 본 명세서의 범위는, 본 발명의 기술적 사상에 근거한 모든 변경 또는 다양한 다른 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일부 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하에서는 본 발명에 대하여, 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 '프라이머'는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 '주형'은 '주형 핵산'을 의미하며, PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로 사용되는 핵산을 말한다. '주형'은 천연에 존재하거나 천연적으로 생성된 것 또는 합성된 것을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명에서 '주형'은 반려동물의 PIK3CA 유전자를 의미할 수 있다.
상기 프라이머는 적절한 완충 용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소, 역전사효소 등) 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 시발체라고도 하며, DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 이들의 혼합 등으로 형성되어 유전자 증폭에 이용될 수 있는 다양한 형태일 수 있다.
상기 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트법, 포스포디에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머 염기 서열은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 변형될 수 있다. 프라이머는 전형적으로는, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드)이다. 프라이머의 길이는 연속하는 10 내지 50개의 뉴클레오타이드 범위, 바람직하게는 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 범위에서 의도되는 사용에 따라 달라진다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 혼성화 착물을 형성하기 위해 보다 저온의 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하는 것은 요구되지 않으나, 프라이머가 신장되기 위한 주형과 혼성화되기 위해 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '프라이머 세트'는 복수의 프라이머를 의미한다. 상기 프라이머 세트는 프라이머를 수용하기 위한 컨테이너를 더 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트의 복수의 프라이머는 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함할 수 있으며, 이는 검출하고자 하는 유전자 돌연변이를 포함하는 유전자 시료의 증폭에 통상적으로 사용되는 일반적인 시발체를 의미한다. 이러한 프라이머 세트 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 및 상기 돌연변이를 포함하는 유전자에 따라서 용이하게 결정할 수 있는 사항이다.
본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 크기, Tm값, 프라이머의 GC 함량, 프라이머 내의 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)에 의한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기 서열의 3회 이상 반복 금지 등을 충분히 고려하고, 반려동물의 PIK3CA 유전자 돌연변이 검출의 민감도와 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 '돌연변이'란 유전자 또는 염색체의 이상에 의해 유전자에 질적 또는 양적인 변화가 생겨 유전형질에 변화를 유발하는 현상을 의미한다. 상기 돌연변이는 유전자 단위의 돌연변이일 수 있으며, 바람직하게는 치환, 삽입 및 결실로부터 선택된 점돌연변이(point mutation) 또는 다중 돌연변이(multiple mutation)일 수 있다. 상기 돌연변이는 침묵 돌연변이, 중성 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프래임 시프트 돌연변이 등 일 수 있으며, 그 종류를 제한하지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 '종양'은 고형 종양을 의미할 수 있다. 상기 고형 종양은 중피종, 자궁경부암, 췌장암, 난소암, 편평세포암(예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함하는 위암, 췌장암, 교모세포종, 간암, 방광암, 간종(hepatoma), 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁 내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 두경부암 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된다.
본 발명에서 사용되는 용어 'PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄 반응)'은 형광물질을 이용하여 유전자의 증폭 여부를 확인하는 방법으로서, 유전자를 동시에 증폭하여 검출할 수 있는 유전자 증폭법이다. PCR 반응은 (i) 초기 변성(denaturation) 단계; (ii) 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 연 장(extension)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 단계; 및 (iii) 최종 열처리 단계; 또는 이들 단계을 적합하게 변형한 써멀사이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자 증폭은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real time RT-PCR), 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), 실시간 정량중합효소연쇄반응(RT-qPCR), 역중합효소연쇄반응(Inverse PCR) 및 길고 정확한 중합효소 연쇄반응(Long and Accurate PCR)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 증폭 방법을 이용하는 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 프라이머 세트를 이용한 유전자 증폭은 바람직하게, RT-PCR, RT-qPCR 및 Real time PCR으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 증폭 방법을 이용하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게, RT-qPCR을 이용하는 것일 수 있다. 'RT-qPCR'은 'RT-PCR'과 'qPCR'의 결합 기술로서 유전자 발현의 정량화가 가능하며 신속하고 정확한 검출을 가능하게 한다.
PCR, RT-PCR, RT-qPCR 또는 Real time PCR 증폭 결과는 아가로스겔 전기영동법 등으로 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 본 발명에서는 RT-qPCR 증폭 결과를 아가로스겔 전기영동법 또는 멜팅커브(melting curve analysis, 융해곡선 분석법)을 이용하여 결과를 분석할 수 있다.
본 발명의 'PIK3CA'는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)의 유전자로, 상기 PI3K는 세포 신호전달에 관여하는 포스파티딜이노시톨 4,5-비스인산(phosphatidyl-inositol 4,5-bisphosphate, PIP2)을 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스인산(Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)으로 인산화시키는 반응을 촉매하는 지질 키나아제이다. PI3K는 구조, 작용 기작, 기질 특이성에 근거하여 클래스 I, II, III로 구분된다. 그 중 클래스 IB PI3K는 p110γ를 포함하며, 이는 G단백질 결합 수용체에 의해 활성화된다. p110α를 통한 세포 신호전달 경로는 인간 암세포에서 과다하게 활성화된다. 그리고 PI3K 세포 신호전달 경로가 비정상적으로 조절되면 PIP3의 수치가 높아져 하위 효소인 Akt를 활성화시키고, 결과적으로 암, 면역 장애, 심 혈관 장애에 영향을 미치게 된다. p110α를 암호화하는 PIK3CA 유전자는 다양한 원발성 암에서 변이되어 과다 발현된다. PIK3CA 유전자의 돌연변이는 PI3K(Phosphatidylinositol 3-kinase) 단백질의 활성화를 가져오고 PI3K는 타이로신 키나아제 수용체의 신호전달 체계를 활성화한다. 활성화된 타이로신 키나아제는 세포의 생존과 분열을 억제하는 단백질의 기능과 대사촉진을 방해하며 세포 성장을 돕는 단백질의 기능을 활성화시킴으로써 발암과정에 관여한다. PIK3CA 유전자 돌연변이는 암 진행 속도를 빠르게 하고 전이 빈도를 증가시켜 암 발생의 예후를 악화시킨다. 또한 표피성장인자류(Human Epidermal Growth Factor, HER family)의 하류부분(downstream)의 신호전달 체계에 속하여 HER 패밀리의 표적 치료제들의 내성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 PIK3CA 유전자 돌연변이는 종양을 유발할 수 있고, 상기 종양은 유선종양일 수 있다. 상기 유선종양은 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 신생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 반려동물은 반려견, 고양이, 마우스, 토끼, 말, 양, 햄스터, 고슴도치, 페럿(ferret) 및 기니 피그(guinea pig)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 반려동물은 반려견일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트는 PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047Y로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 돌연변이를 검출하는 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 또는 PIK3CA_H1047Y 중 어느 하나를 각각 증폭시키거나, PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047Y로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 돌연변이를 동시에 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 'PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트'는 PIK3CA 유전자에서 PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047Y로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 돌연변이 부위에 특이적으로 결합하여 신장 반응을 일으킬 수 있는 프라이머 쌍들로 구성된 집합을 의미한다. 상기 각 프라이머 쌍은 PIK3CA 유전자 돌연변이에 대해서는 PCR 산물을 생성하지만 야생형 PIK3CA 유전자에 대해서는 거의 생성하지 않는다.
상기 서열번호 1 내지 8로 표시되는 프라이머는 다음과 같다:
cPIK3CA-E545-WT-fwd-1: 5'- gatcctctctctgaaatcactg-3'(서열번호 1)
cPIK3CA-E545K-fwd-1: 5'- gatcctctctctgaaatcacta -3'(서열번호 2)
cfPIK3CA-H1047-fwd-2: 5'- catacattcgaaagaccctagc-3'(서열번호 3)
cfPIK3CA-E545-rve-1: 5'- aggttagtaccaatgcagcgt-3'(서열번호 4)
cPIK3CA-H1047-WT-rve-2: 5'- tgttgtccagccaccatgatg-3'(서열번호 5)
cPIK3CA-H1047R-rve-2: 5'- ttgttgtccagccaccatgag-3'(서열번호 6)
cPIK3CA-H1047L-rve-2: 5'- ttgttgtccagccaccatgaa-3'(서열번호 7)
cPIK3CA-H1047Y-rve-2: 5'- tgttgtccagccaccatgata-3'(서열번호 8)
상기 서열번호 2의 정방향 프라이머 3'말단의 1 염기가 표적 DNA 서열의 돌연변이 가능성이 높은 위치와 대응하는 돌연변이 검출용도일 수 있다.
상기 서열번호 6의 역방향 프라이버 3'말단의 1 염기가 표적 DNA 서열의 돌연변이 가능성이 높은 위치와 대응하는 돌연변이 검출용도일 수 있다.
상기 서열번호 7의 역방향 프라이버 3'말단의 1 염기가 표적 DNA 서열의 돌연변이 가능성이 높은 위치와 대응하는 돌연변이 검출용도일 수 있다.
상기 서열번호 8의 역방향 프라이버 3'말단의 1 염기가 표적 DNA 서열의 돌연변이 가능성이 높은 위치와 대응하는 돌연변이 검출용도일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; b) 서열번호 2로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; c) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; d) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; e) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및 f) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및 b) 서열번호 2로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물로서, 상기 프라이머 세트는 PIK3CA_E545K 돌연변이를 검출하는 것인 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 c) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; d) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; e) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및 f) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물로서, 상기 프라이머 세트는 PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047Y로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 것인 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 또는 PIK3CA_H1047Y 중 어느 하나를 각각 증폭시키거나, PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047Y로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 돌연변이를 동시에 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트를 이용하여 반려동물의 PIK3CA 유전자에 대하여 RT-qPCR을 수행하는 단계; 상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 진단 방법에 관한 것이다.
상기 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양은 유선종양일 수 있다. 상기 유선종양은 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 신생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트를 이용하여 반려동물의 PIK3CA 유전자에 대하여 RT-qPCR을 수행하는 단계는, 표적 DNA를 주형으로 사용하고, 상기 표적 DNA에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복하여 표적 DNA를 증폭하는 과정을 의미한다. 상기 표적 DNA는 이하의 [표 1]의 NCBI genebank에 등록되어 있는 개의 PIK3CA 유전자 정보를 주형으로 하여 사용할 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트를 이용하여 반려동물의 PIK3CA 유전자에 대하여 RT-qPCR을 수행하는 단계에 있어서, 구체적인 PCR 조건으로는 90~95℃에서 1~20분간 열처리하여 초기 변성시킨 후, 90~95℃에서 10초~2분간 변성 단계(denaturation); 58~70℃에서 10초~2분간 어닐링 단계(annealing); 70~75℃에서 10초~2분간 합성 단계(extension)를 총 10~40회 반복하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 상기 반응 온도 및 반응 시간 조건은 당업자가 적절하게 변형하여 수행할 수 있다. 보다 바람직하게는, 95℃에서 3분간 초기 변성시킨 후, 95℃에서 10초간 변성 단계; 66℃에서 10초 어닐링 단계; 72℃에서 30초 합성 단계를 실시할 수 있다.
상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 상기 분석은 당업계에 알려진 이의의 방법을 사용하여 PCR 증폭 산물의 크기 분석을 수행할 수 있다. 바람직하게, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 확인하거나, 멜팅커브 분석법으로 PIK3CA 돌연변이를 검출할 수 있다.
상기 멜팅커브 분석법은 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 해리시키는 온도를 확인하여 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이를 특이적으로 검출해내는 것을 의미한다. 상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 멜팅커브 분석법을 이용하여 상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하였다. 표적 PIK3CA 야생형(WT) DNA에 대한 PIK3CA 돌연변이 DNA의 비율을 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 50%, 100%로 정하여 본 발명 프라이머 키트의 분석적 감도를 평가한 결과, 돌연변이의 비율이 0.001%인 것에서부터 돌연변이가 검출되었다(도 1 및 도 4 참조). 바람직하게는 돌연변이의 비율이 0.01%인 것에서부터 돌연변이가 검출되었다. 더욱 바람직하게는 돌연변이의 비율이 1%인 것에서부터 돌연변이가 검출된 것을 확인할 수 있다(도 1 내지 2 및 도 4 내지 5 참조). 이와 관련하여, 종래의 연구 결과에서는 돌연변이 DNA의 농도가 10% 이상일 경우에 비로소 염기서열 분석 결과 돌연 변이가 발견될 수 있다고 보고된 바 있는데, 본 발명은 이러한 종전의 보고와 비교해 볼 때, 10%보다도 훨씬 낮은 돌연변이 DNA 비율 0.001%에서도 돌연변이를 검출할 수 있어 본 발명 키트의 민감도가 매우 뛰어남을 보여준다.
상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PIK3CA_E545K 돌연변이 검출을 확인한 결과 하나의 Melt Peak가 확인되었으며(도 1 및 도 3 참조), 형광 감도가 급격하게 감소한 구간이 81 내지 84℃의 범위 안에서 이루어져 Melt Curve를 확인하였을 때 단일의 특정 융해온도를 가지는 것을 확인할 수 있다(도 1 및 도 3 참조). 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PIK3CA_E545K 돌연변이 특이도가 매우 우수함을 확인할 수 있다.
상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계에서 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 또는 PIK3CA_H1047Y 돌연변이 검출을 확인한 결과 하나의 Melt Peak가 확인되었으며(도 4 및 도 6 참조), 형광 감도가 급격하게 감소한 구간이 81 내지 84℃의 범위 안에서 이루어져 Melt Curve를 확인하였을 때 단일의 특정 융해온도를 가지는 것을 확인할 수 있다(도 4 및 도 6 참조). 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물을 이용하여 PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 또는 PIK3CA_H1047Y 돌연변이 특이도가 매우 우수함을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 암 시료 또는 암 돌연변이 발생 의심 시료에서 PIK3CA 유전자를 분리하는 단계; 상기 분리된 PIK3CA 유전자를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트를 이용하여 RT-qPCR을 수행하는 단계; 및 상기 RT-qPCR으로 증폭된 산물의 PIK3CA 유전자의 특정 부위를 확인하는 단계를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 치료에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 '시료'는 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 부위를 포함하는 유전자 시료를 말한다. 구체적으로, 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액 등, 또는 이들로부터 추출된 내인성 유전자 또는 외인성(exogenous) 유전자 일 수 있다.
상기 암 시료 또는 암 돌연변이 발생 의심 시료에서 PIK3CA 유전자를 분리하는 단계에서 상기 암 시료 또는 암 돌연변이 발생 의심 시료는 반려동물의 혈액 샘플에서 채취된 것일 수 있다. 상기 반려동물은 반려견일 수 있다.
상기 암 시료 또는 암 돌연변이 발생 의심 시료에서 PIK3CA 유전자를 분리하는 단계에서 상기 시료에서 PIK3CA 유전자를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 분리를 실시할 수 있다.
상기 분리된 PIK3CA 유전자를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트를 이용하여 RT-qPCR을 수행하는 단계에서 상기 RT-qPCR은 표적 DNA를 주형으로 사용하고, 상기 표적 DNA에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복하여 표적 DNA를 증폭하는 과정을 의미한다.
상기 RT-qPCR으로 증폭된 산물의 PIK3CA 유전자의 특정 부위를 확인하는 단계에서 상기 PIK3CA 유전자의 특정 부위는 PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047Y로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 돌연변이를 검출하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
상기 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머를 이용하여 수행된 RT-qPCR은 신뢰성이 높고 신속하게 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이를 확인할 수 있으므로 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양을 신속하게 진단하고, 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 치료에 필요한 정보를 신속하게 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '키트'는 PCR 증폭 반응을 수행하기 위해 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다. 상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다.
상기 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출은 암의 예후 평가 또는 암 돌연변이 발생 위험도를 예측하기 위한 것일 수 있다.
상기 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출은 암의 표적 치료에 필요한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1
1. 주형 DNA
하기 [표 1]은 본 발명에서 유전자 증폭의 주형으로 사용할 NCBI genebank에 등록되어 있는 개의 PIK3CA 유전자 정보를 나타낸 것이다.
No Source Size(bp) Acession Number
1 Canis lupus familiaris (dog) 42263871 bp NC_051838
2 Canis lupus familiaris (dog) 51113282 bp NC_006616
2. 프라이머 세트의 제작
PIK3CA 유전자 돌연변이에 대해서는 PCR 산물을 생성하지만 야생형 PIK3CA 유전자에 대해서는 생성하지 않는 프라이머를 디자인하기 위해 SnapGene 프로그램을 이용하여 프라이머 크기, Tm값, 프라이머의 GC 함량, 프라이머 내에서 자가-상보적 서열이 있는지 여부 등을 확인하여 8개의 프라이머를 디자인하였다. 디자인된 프라이머의 염기서열은 [표 2]에 나타냈다.
No. Name of Primer Sequence (5'-3') Length Tm %GC
1 cPIK3CA-E545-WT-fwd-1 gatcctctctctgaaatcactg 22 54 45
2 cPIK3CA-E545K-fwd-1 gatcctctctctgaaatcactA 22 53 41
3 cfPIK3CA-H1047-fwd-2 catacattcgaaagaccctagc 22 55 45
4 cfPIK3CA-E545-rve-1 aggttagtaccaatgcagcgt 21 59 48
5 cPIK3CA-H1047-WT-rve-2 tgttgtccagccaccatgatg 21 60 52
6 cPIK3CA-H1047R-rve-2 ttgttgtccagccaccatgaG 21 59 52
7 cPIK3CA-H1047L-rve-2 ttgttgtccagccaccatgaA 21 59 48
8 cPIK3CA-H1047Y-rve-2 tgttgtccagccaccatgatA 21 60 48
실시예 2
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머로 주형 DNA(Accession Number: NC_051838, NC_006616)의 PCR을 수행하였다. 각 10 uL 반응에는 마스터 믹스 5 uL, 프라이머 1 uL(각각 0.1 uM 최종 농도), 핵산 분해 효소가 없는 물 2 uL 및 주형 DNA 1 uL(0.1ng/ul)가 포함되었다. PCR 실행은 Bio-Rad CFX Maestro 소프트웨어 버전 2.3으로 분석되었다. 모든 분석에서 자동 임계값을 설정하여 임계값 주기(Ct)를 결정했다. PCR 조건은 [표 3]과 같다.
온도℃ 시간 사이클
초기 변성 95 3초
변성 95 10초 40
어닐링 66 10초
연장 72 30초
유지 4 유지
상기 실험을 통해, PIK3CA 유전자 돌연변이를 표적할 수 있는 프라이머는 정상 DNA를 검출하지 않고, 돌연변이를 보유하는 DNA만을 선택적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 프라이머는 종양을 유발하는 PIK3CA 유전자 돌연변이를 특이적으로 검출할 수 있고, 반려동물의 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양의 진단에 유용하게 활용될 수 있다.
cPIK3CA-E545-WT-fwd-1: 5'- gatcctctctctgaaatcactg-3'(서열번호 1)
cPIK3CA-E545K-fwd-1: 5'- gatcctctctctgaaatcacta -3'(서열번호 2)
cfPIK3CA-H1047-fwd-2: 5'- catacattcgaaagaccctagc-3'(서열번호 3)
cfPIK3CA-E545-rve-1: 5'- aggttagtaccaatgcagcgt-3'(서열번호 4)
cPIK3CA-H1047-WT-rve-2: 5'- tgttgtccagccaccatgatg-3'(서열번호 5)
cPIK3CA-H1047R-rve-2: 5'- ttgttgtccagccaccatgag-3'(서열번호 6)
cPIK3CA-H1047L-rve-2: 5'- ttgttgtccagccaccatgaa-3'(서열번호 7)
cPIK3CA-H1047Y-rve-2: 5'- tgttgtccagccaccatgata-3'(서열번호 8)

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트는 PIK3CA_E545K, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047Y로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 돌연변이를 검출하는 것인 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트.
  3. a) 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
    b) 서열번호 2로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
    c) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
    d) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
    e) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및
    f) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물.
  4. a) 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및
    b) 서열번호 2로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물로서,
    상기 프라이머 세트는 PIK3CA_E545K 돌연변이를 검출하는 것인 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물.
  5. c) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
    d) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
    e) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및
    f) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물로서,
    상기 프라이머 세트는 PIK3CA_H1047R, PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047Y로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 것인 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물.
  6. 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트를 이용하여 반려동물의 PIK3CA 유전자에 대하여 RT-qPCR을 수행하는 단계;
    상기 RT-qPCR의 유전자 증폭을 분석하여 반려동물 PIK3CA 돌연변이를 검출하는 단계
    를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 진단 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양은 유선종양인 것인 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 진단 방법.
  8. 암 시료 또는 암 돌연변이 발생 의심 시료에서 PIK3CA 유전자를 분리하는 단계;
    상기 분리된 PIK3CA 유전자를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머와 서열번호 4 내지 8로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출용 프라이머 세트를 이용하여 RT-qPCR을 수행하는 단계; 및
    상기 RT-qPCR으로 증폭된 산물의 PIK3CA 유전자의 특정 부위를 확인하는 단계
    를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 치료에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 암 시료 또는 암 돌연변이 발생 의심 시료는 반려동물의 혈액 샘플에서 채취된 것인 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 치료에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법.
  10. 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머를 포함하는 반려동물 PIK3CA 유전자 돌연변이성 종양 검출에 사용하기 위한 키트.
PCT/KR2024/018465 2023-11-24 2024-11-21 반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물 및 이를 이용한 반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 진단방법 Pending WO2025110738A1 (ko)

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