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TW201718632A - Ｇｉｔｒｌ融合蛋白及其用途 - Google Patents

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TW201718632A
TW201718632A TW105125874A TW105125874A TW201718632A TW 201718632 A TW201718632 A TW 201718632A TW 105125874 A TW105125874 A TW 105125874A TW 105125874 A TW105125874 A TW 105125874A TW 201718632 A TW201718632 A TW 201718632A
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protein
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羅斯 安東尼 史都華特
娜塔立 喬 提格
雷斯里 琳 樣
丹尼爾 雷曼莎 喜家茲
麗莎 班柏
蘇達森 史里答蘭
瑞貝卡 雷藍地
尼可拉斯 馬森 杜爾翰
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梅迪繆思有限公司
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Abstract

本發明提供GITRL融合多肽次單元，其包含IgG Fc域、三聚域及GITR配位體的受體結合域，其中該等融合多肽次單元可自組裝成六聚蛋白質。亦提供製備融合多肽次單元及六聚蛋白質之方法，及使用方法，例如治療癌症。

Description

GITRL融合蛋白及其用途 對以電子方式提交之序列表之參考
與本申請案一起遞交的以電子方式提交之ASCII正文檔案序列表(名稱GITRLF-100P2_ST25.txt；大小：56,159位元組；及創建日期：2016年6月15日)之內容以全文引用之方式併入本文中。
糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體(TNFR)-相關蛋白質(GITR)(亦稱為TNFRSF18、AITR或CD357)在調節性T細胞上表現且在經抗原刺激(antigen experienced)之CD4+輔助細胞及CD8+細胞毒性T細胞以及活化NK細胞上上調(Stephens等人J.Immunol.(2004)173(8)：5008-5020；Clothier及Watts,Cytokine Growth Factor Rev.(2014))。GITR為參與藉由抗原曝露控制T細胞活化之受體及配位體之複雜系統之一部分。GITR具有一個已知內源配位體，GITR配位體(GITRL)，其以鬆散三聚形式存在且可使GITR聚集，在T細胞內引起有效細胞信號傳導事件(Chattopadhyay等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(49)：19452-19457)。GITR與GITRL之間的相互作用引起正共刺激信號傳遞至T細胞，此藉由抗原曝露增強其增殖及活化，幫助促進記憶細胞產生及將調節性T細胞再程式化；降低其抑制功能(Clothier及Watts,Cytokine Growth Factor Rev.(2014)Jan 4；Schaer et al.Curr Opin Immunol.(2012))。
本發明係關於多肽次單元，作為融合多肽其各包括以下：GITR配位體(GITRL)之受體結合域、多聚合域(例如三聚域)及IgG Fc域；該等次單元能夠形成穩定的多聚(例如六聚)蛋白質。提供適用於癌症免疫療法及治療病毒感染之組合物及方法。
在某些態樣中，提供經分離單鏈多肽次單元，其包括：IgG Fc域；功能性多聚合域；及糖皮質激素誘導之TNF受體配位體(GITRL)之受體結合域，其中多肽次單元可自組裝成三聚或六聚蛋白質。
在某些態樣中，提供三聚蛋白質，其包括三個單鏈多肽次單元，該等次單元各包括：IgG Fc域；功能性多聚合域；及糖皮質激素誘導之TNF受體配位體(GITRL)之受體結合域。
在某些態樣中，提供六聚蛋白質，其包括六個單鏈多肽次單元，該等次單元各包括：IgG Fc域；功能性多聚合域；及糖皮質激素誘導之TNF受體配位體(GITRL)之受體結合域。
在某些態樣中，提供包括六聚蛋白質及載劑之組合物。
在某些態樣中，提供包括編碼單鏈多肽次單元或六聚蛋白質之核酸的聚核苷酸。
在某些態樣中，提供包括編碼單鏈多肽次單元或六聚蛋白質之聚核苷酸的載體。
在某些態樣中，提供宿主細胞，其包括編碼單鏈多肽次單元或六聚蛋白質之聚核苷酸或包括該等包括聚核苷酸之載體。
在某些態樣中，提供產生多肽次單元或產生六聚蛋白質之方法，其中該等方法包括在表現由聚核苷酸或載體編碼之多肽次單元或六聚蛋白質的條件下培養包括編碼多肽次單元或六聚蛋白質之聚核苷酸或載體的宿主細胞，及回收多肽次單元或六聚蛋白質。
在某些態樣中，提供促進抗原刺激之T細胞及/或活化NK細胞之存活或增殖之方法，其中該等方法包括使抗原刺激之T細胞及/或活化 NK細胞與六聚蛋白質或組合物接觸，其中六聚蛋白質可在T細胞及/或NK細胞之表面上特異性結合至GITR。
在某些態樣中，提供誘導自活化表現GITR之免疫細胞釋放細胞因子之方法，其中該等方法包括使此等細胞與六聚蛋白質或組合物接觸，其中六聚蛋白質可在此等細胞之表面上特異性結合至GITR。
在某些態樣中，提供促進T細胞或NK細胞活化之方法，其中該等方法包括使T細胞或NK細胞與六聚蛋白質或組合物接觸，其中六聚蛋白質可在T細胞或NK細胞之表面上特異性結合至GITR。
在某些態樣中，提供提供治療個體之癌症之方法，其中該等方法包括向需要治療之個體投與有效量之六聚蛋白質或組合物。
在某些態樣中，提供增強個體之免疫反應之方法，其中該等方法包括向有需要之個體投與治療有效量之六聚蛋白質或組合物。
在某些態樣中，提供治療個體之實體腫瘤之方法，其包含向該個體投與上文揭示之經分離單鏈多肽次單元及OX40促效劑。
在另一態樣中，提供治療個體之實體腫瘤之方法，其包含向該個體投與上文揭示之經分離單鏈多肽次單元及T細胞激活劑。
圖1.使用蛋白質G及尺寸排外層析法純化之重組GITRL融合蛋白(FP)(基質素(Matrilin)1wt)及GITRL FP(冠蛋白1a wt)蛋白質之SDS-PAGE分析。
圖2A-D.顯示六聚GITRL FP變異體與表現GITR之CHO細胞之結合概況的圖。
圖3A-D.顯示競爭三聚GITRL與GITR-Fc之結合的六聚GITRL FP變異體之抑制概況之圖。
圖4A-D.顯示使用人類GITR轉染之NF-κB螢光素酶基因報導細胞株的GITRL FP分子相對效能之圖。
圖5A-D.六聚GITRL FP(GCN4 pII)、GITRL FP(冠蛋白1a wt)、GITRL FP(蘭格素wt)及GITRL FP(蘭格素變異體)之去摺疊轉變。
圖6.溶離峰之莫耳質量組成。圖顯示呈溶液形式之多聚GITRL FP基質素-1蛋白質(虛線)，重量平均莫耳質量(自左至右)為612、312及215kDa之三種物質，無可容易地鑑別的主要物質。另一方面，>90%之多聚GITRL FP(冠蛋白1a wt；虛線)及多聚GITRL FP(GCN4 pII；實線)蛋白物質以單一蛋白質種類溶離。然而此等峰不完全單分散，此最可能歸因於附接至蛋白質之聚糖之異質性。
圖7.六聚GITRL FP分子之示意圖。
圖8.代表性GITRL IgG1融合多肽次單元之核苷酸及轉譯蛋白質序列。突出個別域且標註。ECD=細胞外域；GITRL=糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體配位體；HA=血球凝集素。圖8之核酸序列以SEQ ID NO：7形式提供且經編碼前驅蛋白序列以SEQ ID NO：8形式提供。
圖9.還原GITRL IgG1 FP次單元之解卷積LC-QTOF MS譜圖。如藉由液相層析與四極飛行時間(QTOF)質譜(LC-QTOF MS)結合測定，GITRL IgG1 FP單體次單元(SEQ ID NO：6)之準確質量與在Fc域中在典型糖基化位點處每個鏈添加一個雙觸角聚糖(主要為G0f)之預期胺基酸序列一致。
圖10.在均相時差式螢光分析中與銪穴狀化合物結合之人類GITR-Fc結合至hGITRL-HA。IgG1同型對照抗體之滴定不抑制此結合。包含具有SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列的單體次單元的六聚GITRL IgG1 FP以0.562nM之半最大抑制濃度(IC50)抑制hGITR與hGITRL之間的結合。在兩個重複孔中進行實驗。誤差條表示平均值之標準誤差。GITR(L)=糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體(配位體)。
圖11.六聚GITRL FP為GITR受體之有效促效劑。向用hGITR及連 接至NFκB啟動子之螢光素酶報導基因轉染之傑卡特(Jurkat)細胞中添加指示濃度之呈溶液之測試物品。在三小時之後測定以發光形式量測之螢光素酶活性。包含具有SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的單體次單元的六聚GITRL IgG1 FP或包含具有SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的單體次單元的六聚GITRL IgG4P FP引起發光之濃度依賴性增加。關於此效果，六聚GITRL IgG1 FP之EC50為182pM。關於此效果，六聚GITRL IgG4P FP之EC50為289pM。同型對照抗體不具有效果。在三個重複孔中進行實驗。誤差條表示平均值之標準誤差。
圖12.六聚GITRL FP增強初級人類T細胞回應於抗CD3及抗CD28之增殖。初級人類T細胞回應於抗CD3及抗CD28之增殖藉由添加包含具有SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列的單體次單元的盤結合六聚GITRL IgG1 FP或包含具有SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的單體次單元的六聚GITRL IgG4P FP而增加。效果為濃度依賴性，GITRL IgG1 FP之EC50為0.3nM且GITRL IgG4P FP之EC50為0.5nM。同型對照抗體之添加不具有效果。在三個重複孔中進行實驗。誤差條表示平均值之標準誤差。
圖13.藉由初級人類T細胞回應於抗CD3及抗CD28之IFN-γ釋放藉由添加包含具有SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列的單體次單元的盤結合六聚GITRL IgG1 FP或包含具有SEQ ID NO：40中闡述之胺基酸序列的單體次單元的六聚GITRL IgG4P FP增加。效果為濃度依賴性，GITRL IgG1 FP之EC50為0.6nM且GITRL IgG4P FP之EC50為0.8nM。同型對照抗體之添加不具有效果。在三個重複孔中進行實驗。誤差條表示平均值之標準誤差。
圖14.六聚GITRL IgG1 FP藉由NK細胞介導初級人類T細胞之ADCC。抗原刺激初級人類T細胞經螢光標記且以1個T細胞比32個NK細胞之比與初級人類NK細胞混合。如所指示添加測試物品且在24小 時培育之後計算T細胞之溶解%。包含具有SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列的單體次單元的六聚GITRL FP IgG1引起溶解百分比增加。效果為濃度依賴性，EC50為239pM。陰性對照，包含具有SEQ ID NO：40中闡述之胺基酸序列的單體次單元的六聚GITRL IgG4P FP，未引起T細胞之溶解百分比之任何增加。
圖15.藉由六聚GITRL IgG1 FP介導之ADCC有利於產生增加之CD8：CD4 T細胞比率。抗原刺激初級人類T細胞經螢光標記且以1個T細胞比32個NK細胞之比與初級人類NK細胞混合。如所指示添加測試物品且在24小時培育之後藉由流式細胞測量術評估總T細胞群體中存在之CD4+及CD8+ T細胞之百分比。包含具有SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列的單體次單元的六聚GITRL IgG1 FP引起CD8：CD4 T細胞比率之濃度依賴性偏移，其有利於CD8 T細胞。
圖16.六聚GITRL IgG1 FP克服調節性T細胞介導之對效應T細胞增殖之抑制。在用抗CD3及抗CD28抗體刺激五天之後藉由流式細胞測量術分析分裂的CD4+ CD25-效應T細胞之百分比。在增加數目之T-reg存在下分裂細胞之百分比降低。添加盤結合同型對照進一步降低分裂細胞之百分比。在指示濃度下添加包含具有SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列的單體次單元的盤結合六聚GITRL IgG1 FP使分裂細胞之百分比恢復至在不存在T-reg的情況下觀測之百分比。僅使用效應子之實驗在單獨孔中進行。在兩個重複孔中進行所有其他實驗。誤差條表示平均值之標準誤差。
圖17.用mGITRL FP處理之小鼠之存活率為同型依賴性。藉由在皮下植入CT26細胞之後自第6天至第23天每日以5或10mg/kg腹膜內投與mGITRL FP mIgG2a或mGITRL IgG1 FP來處理小鼠。投與鹽水作為陰性對照。
圖18. mGITRL FP引起T細胞之增殖增加。在用單次劑量之0.2 mg/kg或1mg/kg mGITRL FP處理之後七天藉由流式細胞測量術量測Ki67在脾臟T細胞中之表現。帶圓圈之黑色線=CD8 T細胞；帶正方形之深灰色線=CD4+ Foxp3-；帶三角形之淺灰色線=CD4+ Foxp3+細胞。使用史都登氏T測試(Student's T test)計算顯著性，其中*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
圖19. mGITRL FP引起活化標記物ICOS在T細胞上之表現增加。在用單次劑量之0.2mg/kg或1mg/kg mGITRL FP處理之後七天藉由流式細胞測量術量測ICOS在脾臟T細胞中之表現。帶圓圈之深灰色線=CD8 T細胞；帶正方形之黑色線=CD4+ Foxp3。使用史都登氏T測試計算顯著性，其中*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。用mGITRL FP處理引起腫瘤內CD4+ FOXP3+調節性T細胞及CD4+ FOXP3-輔助細胞之頻率降低，但未改變CD8+細胞毒性T細胞之頻率。總體結果為腫瘤微環境內之CD8：CD4比率增加。
圖20. mGITRL FP引起腫瘤內之CD8：CD4比率增加。在用單次劑量之0.2mg/kg或1mg/kg mGITRL FP處理之後7天藉由流式細胞測量術量測腫瘤內之CD8 T細胞(帶圓圈之黑線)、CD4+ Foxp3-細胞(帶正方形之深灰色線)、CD4+ Foxp3+細胞(帶三角形之淺灰色線)之頻率。使用史都登氏T測試計算顯著性，其中*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
圖21.展現六聚hGITRL IgG1 FP結合至人類及食蟹獼猴GITR-Fc之ELISA資料。經生物素標記之包含具有SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列的單體次單元之六聚hGITRL IgG1 FP與重組人類及食蟹獼猴(cyno)GITR之結合。CD137-Fc用作陰性對照以測定分析中之背景信號。在三個重複孔中進行實驗。誤差條表示標準差。CD137=分化簇137(TNFRSF9)；CD137-Fc=與hIgG1之Fc域連接之分化簇137細胞外域；Cyno=食蟹獼猴；ELISA=酶聯免疫吸附分析；GITR-Fc=與 hIgG1之Fc域連接之糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體細胞外域；OD450nm=450nm波長下之光密度讀數。
圖22.六聚hGITRL IgG1 FP處理之食蟹獼猴中KI67陽性T細胞亞群%之量測。監測食蟹獼猴之KI67陽性T細胞亞群%之基線水準20天，用媒劑對照(圓圈)、1mg/kg hGITRL IgG1 FP(三角形)或10mg/kg hGITRL IgG1 FP(正方形)在第0天處理，且隨後在第1、3、5、9、11、15、18、22及29天監測KI67陽性T細胞亞群%。
圖23 A-B.競爭三聚hGITRL與hGITR-Fc之結合的hGITRL FP蛋白質之抑制概況及IC50值。hGITRL FP wt、N92D及N104D(A)及hGITRL FP、N161D(B)
圖24.與hGITR-Fc結合之hGITRL FP蛋白質之結合概況及Kd值。
圖25 A-C.顯示使用人類GITR轉染之NF-κB螢光素酶基因報導細胞株的GITRL FP分子之相對效能及EC50值的圖。hGITRL FP wt及N92D(A)；hGITRL FP wt、N161D、N129A及N129A/N161D(B)；N161D及N129A/N161D(C)
圖26 A-C.顯示GITRL FP分子之相對效能之圖，其使用人類初級CD3+ T細胞再刺激分析用胸苷併入讀數。hGITRL FP wt及N92D(A)；hGITRL FP wt、N92D及N104D(B)；wt及N161D(C)。
圖27. GITRL FP wt及N92D變異體之去摺疊轉變。
圖28.在於中國倉鼠卵巢細胞中產生之hGITRL FP中發現的主要寡醣結構；複合類型(A)；高甘露糖(B)。Man=甘露糖；GlcNAc=N-乙醯基葡糖胺；Fuc=海藻糖；Gal=半乳糖；NANA=N乙醯基神經胺糖酸(唾液酸)。
圖29 A-C. GITRL FP肽圖譜。針對GITRL FP wt(Ai)及GITRL FP N161D(Aii)之含有Fc N-糖基化位點之胰蛋白酶肽7(T7)的萃取離子層析圖。針對GITRL FP wt(Aiii)及GITRL FP N161D(Aiv)之顯示主要糖 型之T7的組合解卷積質譜。針對GITRL FP wt(Bi)及GITRL FP N161D(Bii)之含有GITRL ECD N129 N-糖基化共同序列之胰蛋白酶肽40(T40)的萃取離子層析圖。針對GITRL FP wt(Biii)及GITRL FP N161D(Biv)之顯示與在N129處不存在N-糖基化一致之質量的T40的組合解卷積質譜。分別針對GITRL FP wt(Ci)及GITRL FP N161D(Cii)之胰蛋白酶肽42-43(T42-43)及43(T43)的萃取離子層析圖。針對GITRL FP wt(Ciii)之T42-43的組合解卷積質譜，其顯示GITRL ECD N161N-糖基化位點處之主要糖型。針對GITRL FP N161D(Civ)之T43之組合解卷積質譜，其顯示確認N161D取代及N-糖基化不存在之質量。
圖30 A-C.鼠GITR配位體融合蛋白之結構及促效潛能。(A)鼠GITRL-FP之示意圖，其自N端至C端由免疫球蛋白G1(IgG1)或2a(IgG2a)之片段可結晶(Fc)區域、多聚域(MD)及鼠GITR配位體之細胞外(GITR結合)域(ECD)組成。(B)純化鼠GITRL-FP之SDS-PAGE。(C)在用mGITRL-FP、DTA-1 rIgG2b同型對照或mOX40L-FP處理之後鼠GITR受體轉導之傑卡特細胞株中之NF-κB相關之發光。資料代表至少兩次獨立實驗。
圖31 A-E.在Balb/c小鼠中綜合FcγR接合增加抗腫瘤活性但不驅使GITR下游之增加的T細胞增殖，(A)腫瘤生長。如所指示藉由鹽水對照、mGITRL-FP mIgG1或mGITRL-FP mIgG2a之腹膜內注射來處理小鼠一次。在各個別圖(B)，在處理CT26腫瘤攜帶小鼠之後4天脾臟T細胞中Ki67表現之頻率上指示消退之數目。在如所指示用10mg/kg mGITRL-FP或鹽水對照處理CT26腫瘤攜帶小鼠之後4天(C)瘤內T細胞子組之頻率及(D)瘤內CD8+與CD4+ FoxP3+細胞之比。(E)在處理之後4天脾臟及瘤內T細胞子組上GITR表現之中值螢光強度。誤差條指示平均值之標準誤差；每組n=7-10隻小鼠。如藉由雙因子ANOVA計算，對於(B)及(C)，**p<0.005、***p<0.001及****p<0.0001；C之顯 著性為：對於CD4+ Foxp3+細胞之變化，為黑色且對於CD4+ FoxP3-細胞之變化，為灰色；如藉由單因子ANOVA計算，對於(D)，*P<0.05；如藉由史都登氏t測試計算，對於(E)，****p<0.0001。
圖32 A-B.在用mGITRL-FP mIgG2a或mIgG1處理之後的瘤內T-reg去除及CD4+ FoxP3-：T-reg比率。在CT26植入後6天用鹽水對照、mGITRL-FP mIgG1(10mg/kg)或mGITRL-FP mIgG2a(10mg/kg)對CT26腫瘤攜帶小鼠進行腹膜內注射一次。(A)顯示在處理之後4天腫瘤中之CD4+ Foxp3+ T-reg比例的流動式細胞測量圖。基於Foxp3螢光減一個(FMO)對照安置CD4+ Foxp3+流式細胞測量術分析閘。(B)瘤內CD4+ FoxP3-：如所指示在處理之後4天量測之T-reg比率。使用單因子ANOVA進行統計分析，其中****指示<0.0001之P值。
圖33 A-C.鼠GITRL-FP mIgG2a以劑量及時程依賴性方式介導抗腫瘤活性。Balb/c小鼠中之腫瘤生長。藉由腹膜內注射(A)單次劑量之在指示劑量下的mGITRL-FP mIgG2a或(B)每日[Q1D]或每週[Q1W]給與之多次劑量之0.2mg/kg mGITRL-FP mIgG2a來處理小鼠。(C)在使用指示劑量及時程投與後mGITRL-FP之預測血清濃度。虛線指示達成最大抗腫瘤活性所需要之mGITRL FP mIgG2a之血液濃度臨限值。
圖34 A-D.鼠GITRL-FP mIgG2a以劑量及時程依賴性方式介導T細胞增殖及活化中之PD變化。在一次、每三天[Q3D]或每日[Q1D]用0.2或1mg/kg mIgG2a mGITRL-FP處理之後7天CT26腫瘤攜帶小鼠之腫瘤引流淋巴結中(A)Ki67、(B)ICOS、(C)PD-1及(D)OX40陽性CD4+T細胞之頻率。誤差條表示來自每組7-8隻小鼠之平均值之標準誤差。如藉由單因子ANOVA計算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
圖35 A-B.小鼠OX40配位體融合蛋白之結合及效能概況。(A)結合ELISA，其顯示mGITRL-FP mIgG1及mIgG2a各特異性結合至重組 小鼠GITR-Fc(黑色條)且不結合至重組小鼠OX40-Fc且mOX40L-FP mIgG1及mIgG2a各特異性結合至重組小鼠OX40(灰色條)且不結合至重組小鼠GITR。mOX40L-FP Y182A同型對照最低限度地結合至重組小鼠OX40-Fc。(B)在傑卡特人類OX40 NF-κB報導細胞株上mOX40L-FP mIgG1(黑色圓)或Y182A同型對照(空心圓)與人類OX40之結合。在報導子分析中小鼠OX40L FP mIgG1誘導NF κB信號傳導但此對於mOX40L-FP Y182A同型對照不明顯。
圖36 A-B.在CT26模型中mGITRL-FP之抗腫瘤活性優於mOX40L-FP。(A)Balb/c小鼠中之腫瘤生長。每週兩次用5mg/kg mIgG2a或mIgG1 mGITRL-FP或mOX40L-FP、5mg/kg mIgG1融合蛋白同型對照或鹽水之腹膜內注射處理小鼠，在各個別圖上指示總消退之數目。(B)在如所指示之處理之後10天CT26腫瘤攜帶Balb/c小鼠中瘤內CD4+、FoxP3+ T-reg之頻率。
圖37 A-E.藉由mGITRL-FP mIgG2a及mOX40L-FP mIgG1介導之藥效學(PD)變化不同且可經由組合增強。在每週兩次用25mg/kg mGITRL-FP mIgG2a、15mg/kg mOX40L-FP mIgG1或兩種分子的組合處理之後14天CT26腫瘤攜帶小鼠之脾中(A)CD4+ FoxP3-或CD8+、Ki67+ T細胞；(B)CD4+或CD8+、CD44+ CD62L Lo/-效應記憶T細胞；(C)CD4+ CD44+ CD62L+中樞記憶T細胞、(D)CD4+或CD8+、T-bet+ T細胞及(E)CD4+ EOMES+ T細胞之頻率。如藉由單因子ANOVA計算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
圖38 A-B.組合mGITRL-FP mIgG2a及mOX40L-FP mIgG1協同作用以誘導在B16F10-Luc2及CT26腫瘤攜帶小鼠中之抗腫瘤活性增加。在B16F10-Luc2及CT26腫瘤攜帶小鼠中之腫瘤生長。(A)用鹽水、持續兩週每兩週用25mg/kg mGITRL-FP mIgG2a、持續三週每兩週用15mg/kg mOX40L-FP mIgG1或用兩種分子之組合腹膜內向B16F10-Luc2 腫瘤攜帶小鼠給藥且量測腫瘤生長。(B)CT26腫瘤攜帶小鼠未經處理或藉由腹膜內注射同型對照、7.5mg/kg mOX40L-FP mIgG1每週兩次持續兩次給藥、在0.1mg/kg下之單一次優劑量之mGITRL-FP mIgG2a或兩種分子之組合來處理。緊接於各個別圖指示總消退之數目。
圖39.與單一療法處理相比，mGITRL-FP mIgG2a與mOX40L-FP mIgG1之組合誘導攜帶B16F10-Luc2腫瘤之小鼠之存活率增加。腹膜內用鹽水、25mg/kg mGITRL-FP mIgG2a每兩週持續兩週、15mg/kg mOX40L-FP mIgG1每兩週持續三週或兩種分子的組合向B16F10-Luc2腫瘤攜帶小鼠給藥且量測存活率。對數等級測試，其中***指示<0.001之P值，**指示<0.01之P值且*指示<0.05之P值。
圖40(A)-(G). (A)將CT26細胞皮下植入至Balb/C小鼠中，5×105個細胞/小鼠。在第6天基於腫瘤體積將小鼠隨機分配且開始給藥(群組n=10隻小鼠)。用mGITRL FP IgG2a在(B)單次給藥或(C)每隔一天持續9次給藥，Q2D×9下腹膜內向小鼠給藥。其在5、1、0.5、0.2、0.1及0.04mg/kg下給藥。顯示之資料代表兩次重複實驗。(D)在第11天，其基於腫瘤尺寸隨機分配且不處理、用DTA-1(抗GITR mAb)或mGITRL-FP處理(群組n=9)。(E)在第8、10、12、14及16天小鼠去除CD8 T細胞。在第11天，其基於腫瘤尺寸隨機分配且不處理、用DTA-1或mGITRL-FP IgG2a處理。(F)中值存活率。(G)在第18天，殺死有CT26腫瘤之未經處理小鼠以檢查脾及腫瘤中CD8 T細胞及Treg上之GITR表現。
圖41(A)-(H). (A)將CT26細胞皮下植入至Balb/C小鼠中，5×105個細胞/小鼠。在第10天基於腫瘤體積將小鼠隨機分配且開始給藥。用mGITRL-FP IgG2a每兩週持續4次總給藥腹膜內向小鼠給藥。在第18天，殺死小鼠以檢查(B)Treg、(C)CD8 T細胞。(D)小鼠脾、腫瘤用10μg/mL AH1肽/蛋白質傳輸抑制劑再刺激5小時且針對IFNγ及 TNFα染色。(E)CD8細胞上之GITR表現。(F)脾、淋巴結及腫瘤中Treg上之GITR表現。(G)CD4 T細胞上之KI-67及(H)CD8 T細胞上之KI-67。
圖42(A)-(C). mGITRL FP以劑量依賴性方式擴增抗原特異性T細胞。(A)在第85天[R箭頭]，用單次劑量之mGITRL FP IgG2a處理之CT26腫瘤攜帶小鼠清除腫瘤且經保護以用5E5 CT26細胞/小鼠再攻擊。(B)在用CT26再攻擊之後，在第120天，收集小鼠脾[PD箭頭]，處理成單細胞且用10μg/mL AH1肽/蛋白質傳輸抑制劑再刺激5小時。小鼠具有AH1特異性T細胞之劑量依賴性增加。(C)來自各組之5隻小鼠之代表性圖。為了比較，包括未處理小鼠及在第10天有CT26腫瘤之未經處理小鼠。
圖43(A)-(C). (A)-(B)將TC-1細胞植入至C57BL/6小鼠之腳掌中，2×104個細胞/小鼠。在第14天基於腫瘤體積將小鼠隨機分配且開始給藥。用mGITRL-FP IgG2a每兩週持續4次總給藥腹膜內向小鼠給藥。在第24天，殺死未經處理小鼠以檢查(C)Treg上之GITR表現及CD8 T細胞上之GITR表現。針對E7特異性T細胞評估小鼠，且無一者藉由E7 restim或藉由dextramer偵測。
圖44(A)-(K). (A)為了產生E7特異性T細胞，在尾根用10ug含E7 SLP之CpG(Addavax)注射未處理C57BL/6小鼠。隨後用1mg/kg下之mGITRL-FP IgG2a處理小鼠持續3次給藥。針對脾(B)CD4 T細胞、(C)CD8 T細胞、(D)E7 Dextramer+ T細胞、(E)Treg、(F)抗原特異性細胞上之GITR含量評估小鼠。(G)將TC-1細胞植入至C57BL/6小鼠之腳掌中，2×104個細胞/小鼠。在第14天基於腫瘤體積將小鼠隨機分配且開始給藥。在尾根用10ug含E7 SLP之CpG(Addavax)注射C57BL/6小鼠。在第28天，殺死小鼠。針對(H)-(I)E7及特異性CD8 T細胞(J)-(K)評估脾及腫瘤。
圖45. (A)將TC-1細胞植入至C57BL/6小鼠之腳掌中，2×104個細胞/小鼠。在第14天基於腫瘤體積將小鼠隨機分配且開始給藥。(B)在尾根用3.3ug含E7 SLP之CpG(Addavax)注射經接種C57BL/6小鼠。用GITRL-FP IgG2a每兩週持續4次總給藥腹膜內向經處理小鼠給藥。(C)在TC-1植入之後小鼠之Kaplan-Meier存活率，P<0.05。(D)群組之中值存活率。(E)為了檢查藥效學效果，殺死在(A)中經相同處理之小鼠組且收集脾及腫瘤。合併腫瘤且以個別脾形式保留脾。(F)在腫瘤中評估CD45+細胞。(G)小鼠脾及腫瘤用1μg/mL E7肽/蛋白質傳輸抑制劑再刺激5小時且針對IFNγ及TNFα染色，且量測脾及腫瘤Treg。
在藉由抗原激活期間或之後不久GITR受體在T細胞(例如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)上之接合引起T細胞(例如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)對抗原之反應增加。例如在藉由活化信號(例如抗原曝露)激活期間或之後不久GITR受體在NK細胞或B細胞上之接合引起NK細胞或B細胞之反應增加。在本發明的情況下，術語「接合」係指結合至且刺激由GITR受體介導之至少一種活性。舉例而言，與僅對抗原之反應相比，GITR受體在抗原特異性物(例如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)上之接合引起T細胞增殖增加及細胞激素產生增加。對抗原之升高的反應可維持大體上長於無GITR受體接合存在下之一段時間。因此，經由GITR受體之刺激藉由增強非自身，例如腫瘤抗原或病毒抗原之T細胞、NK細胞或B細胞識別增強抗原特異性免疫反應。GITR參與某些慢性病毒感染之T細胞介導之控制(Pascutti，等人，PLoS Pathog.2015 Mar 4；11(3)；Clouthier，等人，PLoS Pathog.2015 Jan 15；11(1))。
在藉由抗原激活T細胞期間或之後不久向個體投與時GITR促效劑可增強個體(諸如人類個體)中之抗原特異性免疫反應。GITR促效劑包括GITR配位體(「GITRL」)，諸如可溶GITRL融合蛋白及抗GITR抗體 或其片段。特定實例為融合多肽次單元，其包含GITRL之受體結合域；多聚合域，例如三聚域，例如衍生自冠蛋白1a之α螺旋形捲曲螺旋域；及IgG Fc域，其中多肽次單元自組裝成多聚(例如三聚或六聚)融合蛋白。本文中亦描述包括編碼此類融合多肽之聚核苷酸序列的核酸。本發明亦提供使用多聚GITRL融合蛋白增強個體之抗原特異性免疫反應的方法。本文關於GITRL融合蛋白揭示之組合物及方法可更一般而言應用於多聚(例如三聚及六聚)受體結合融合蛋白之製備及使用，例如在治療癌症之方法、治療病毒感染之方法或增強個體之免疫反應之方法中。
定義
術語「一個(a/an)」實體係指該實體中之一或多者；例如「多肽次單元」理解為表示一或多個多肽次單元。因此，術語「一個(a/an)」、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。舉例而言，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999,Academic Press；及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press，向此項技術者提供本發明中所用之許多術語的通用辭典。
單位、前綴及符號以其國際單位制(Système International de Unites；SI)接受之形式表示。數值範圍包括界定該範圍之數字。除非另外指示，否則胺基酸序列以胺基至羧基方向自左向右書寫。本文提供之標題並非本發明之各種態樣或態樣的限制，其可作為整體由說明書提及。因此，下文緊接著定義之術語由整個說明書更充分定義。
如本文所用，片語「經抗原刺激」用於描述已曝露於抗原之細 胞，其中曝露於該抗原已在細胞中引發反應。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單數「多肽」以及複數「多肽」，且係指由經醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)組成之分子。術語「多肽」係指兩個或多於兩個胺基酸之任何鏈，且不指產物之特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指兩個或多於兩個胺基酸之鏈的任何其他術語包括在「多肽」之定義內，且可使用術語「多肽」替代此等術語中之任一者，或術語「多肽」可與此等術語中之任一者互換使用。術語「多肽」亦意指多肽之表現後修飾產物，包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/阻斷基團衍生化、蛋白水解分裂或藉由非標準胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物學來源或藉由重組技術製得，但不一定自指定的核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成。
如本文所用之「蛋白質」可指單一多肽，即如上文所定義之單一胺基酸鏈，但亦可指例如藉由二硫鍵、氫鍵或疏水相互作用締合以產生多聚蛋白質之兩個或多於兩個多肽。如本文所用，術語「多肽次單元」係指可與其他多肽次單元(相同或不同)相互作用以形成多聚蛋白質，例如如本文所描述之六聚蛋白質的胺基酸之多肽鏈。
如本文中所揭示之多肽之尺寸可為約3個或超過3個、5個或超過5個、10個或超過10個、20個或超過20個、25個或超過25個、50個或超過50個、75個或超過75個、100個或超過100個、200個或超過200個、500個或超過500個、1,000個或超過1,000個、或2,000個或超過2,000個胺基酸。多肽可具有定義的三維結構，但其不一定具有此類結構。具有定義之三維結構的多肽稱為摺疊，且不具有定義之三維結構而是可採用許多不同構形之多肽稱為展開。
「經分離」物質、組合物、實體及/或物質、組合物或實體之任 何組合或其任何語法變體(例如經分離生物材料)為不在其天然環境中之物質。不需要特定的純化程度。舉例而言，經分離抗體為不產生於或位於其自然或天然環境中之抗體。以重組方式產生之生物材料視為如本文中所揭示之經分離，在非天然細胞(諸如融合瘤)中產生之材料亦如此。若物質(例如生物材料)已經分離、分級分離或部分或基本上藉由任何適合之技術純化，則其亦視為「經分離」。在某些態樣中，經分離物質(例如經分離生物材料)可為「非天然存在的」。
如本文所用，術語「非天然存在之」物質、組合物、實體及/或物質、組合物或實體之任何組合或其任何語法變體為條件性術語，其明確不包括，但僅不包括由一般熟習此項技術者充分理解為「天然存在」或在任何時間經或可經評審員或管理機構(諸如美國專利及商標局(United States Patent and Trademark Office)或司法機構確定或解釋為「天然存在」之彼等形式之物質、組合物、實體及/或物質、組合物實體之任何組合。舉例而言，術語「非天然存在之」抗體明確不包括存在於自然界中之彼等抗體，例如將天然存在於曝露於正常抗原刺激環境之小鼠之免疫系統中的抗體，或最終由管理機構，例如美國專利及商標局，或司法機構，例如聯邦法院確定為「天然存在」之抗體。
本文所揭示之其他多肽為前述多肽之片段、衍生物、類似物或變異體，及其任何組合。當指如本文中所揭示之多肽次單元或多聚蛋白質時，術語「片段」、「變異體」、「衍生物」及「類似物」可包括保留完整多肽或蛋白質之至少一些活性但結構上不同之任何多肽或蛋白質。多肽之片段包括例如蛋白水解片段，以及缺失片段。變異體包括如上文所描述之片段，以及由於胺基酸取代、缺失或插入而具有改變之胺基酸序列的多肽。變異體可自然地存在或有意地經構築。有意地經構築之變異體可使用技術中已知之突變誘發技術產生。變異體多肽 可包含保守性或非保守性胺基酸取代、缺失或添加。衍生物為已經改變以便展示在天然多肽上未發現之其他特徵的多肽。實例包括融合蛋白。變異體多肽亦可在本文中稱為「多肽類似物」。如本文所用，「衍生物」係指具有一或多個藉由功能性側基之反應化學衍生之胺基酸的受試多肽。亦包括為「衍生物」的為含有二十個標準胺基酸之一或多個標準或合成胺基酸衍生物的彼等肽。舉例而言，4-羥基脯胺酸可取代脯胺酸；5-羥基離胺酸可取代離胺酸；3-甲基組胺酸可取代組胺酸；高絲胺酸可取代絲胺酸；及鳥胺酸可取代離胺酸。
「保守性胺基酸取代」為一個胺基酸經另一具有類似側鏈之胺基酸置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例而言，用苯丙胺酸取代酪胺酸為保守性取代。鑑定不消除蛋白質活性之核苷酸及胺基酸保守性取代之方法在此項技術中熟知(參見例如Brummell等人，Biochem.32：1180-1 187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；及Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：.412-417(1997))。
如本文所用，術語「抗體」(或其片段、變異體或衍生物)係指能夠結合至抗原之抗體之至少最少部分，例如在藉由B細胞產生之典型抗體的情況下為至少重鏈(VH)之可變域及輕鏈(VL)之可變域。脊椎動物系統中的基本抗體結構相對充分理解。參見例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)。
抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物包括(但不限於)多株、單株、人類、人類化或嵌合抗體、單鏈抗體、抗原決定基結合片段(例如Fab、Fab'及F(ab')2)、Fd、Fv、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵聯之Fv(sdFv)、包含VL或VH域之片段及藉由Fab表現文庫產生之片段。ScFv分子為此項技術中已知的且描述於例如美國專利5,892,019中。本發明涵蓋之免疫球蛋白或抗體分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類別。
術語「聚核苷酸」意欲涵蓋單數核酸以及複數核酸，且係指經分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸」係指存在於聚核苷酸中之任何一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。「經分離」核酸或聚核苷酸意指已自其原生環境中移除的核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，編碼載體中所含有的多肽次單元之重組性聚核苷酸視為如本文中所揭示經分離。經分離聚核苷酸之其他實例包括異源宿主細胞中所維持的重組性聚核苷酸或溶液中經純化(部分或基本上)之聚核苷酸。經分離RNA分子包括聚核苷酸之活體內或活體外RNA轉錄物。經分離聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生之此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
如本文所用，「編碼區」為包含轉譯成胺基酸之密碼子的核酸部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)並未轉譯成胺基酸，其可視為編碼區之一部分，但任何側接序列，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及其類似者不為編碼區之一部分。兩個或 多於兩個編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體中，例如單一載體上，或存在於單獨聚核苷酸構築體中，例如單獨(不同)載體上。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或多於兩個編碼區，例如單一載體可單獨地編碼免疫球蛋白重鏈可變區及免疫球蛋白輕鏈可變區。此外，載體、聚核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，其融合或不融合至編碼如本文所提供之多肽次單元或融合蛋白之核酸。異源編碼區包括(但不限於)專用元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能性域。
在某些實施例中，聚核苷酸或核酸為DNA。在DNA之情況下，包含編碼多肽之核酸的聚核苷酸通常可包括啟動子及/或與一或多個編碼區可操作地締合之其他轉錄或轉譯控制元件。可操作締合或連接為在基因產物(例如多肽)之編碼區以將基因產物之表現置於調節序列之影響或控制下之方式與一或多個調節序列締合時。若誘導啟動子功能導致編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其締合的啟動子)為「可操作地締合」。因此，若啟動子能夠實現編碼多肽之核酸的轉錄，則啟動子區域與該核酸可操作地締合。啟動子可為僅導引預定細胞中之DNA實質性轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子之外的其他轉錄控制元件(例如強化子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與導引細胞特異性轉錄的聚核苷酸可操作地締合。適合啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。
多個轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及強化子區段，其來自巨細胞病毒(即刻早期啟動子，連同內含子-A)、猿猴病毒40(早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-血球蛋白)之彼等區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他適合之轉錄控制區包括組織特異性啟動子及強化子以及淋巴激素誘導之啟動子(例如，可由干擾素或介白素誘導之啟動子)。
類似地，多種轉譯控制元件已為一般技術者所知。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，及來源於小核糖核酸病毒之元件(尤其內部核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。
在其他實施例中，聚核苷酸可為RNA，例如呈信使RNA(mRNA)形式。
聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌及信號肽之其他編碼區締合，該等其他編碼區導引由如本文中所揭示之聚核苷酸(例如編碼本文提供之多肽次單元的聚核苷酸)編碼之多肽的分泌。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌的蛋白質具有在已引發生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網輸出之後自成熟蛋白質裂解之信號肽或分泌性前導序列。一般技術者意識到，脊椎動物細胞分泌的多肽一般具有與多肽N端融合之信號肽，該信號肽自完全或「全長」多肽裂解以產生分泌或「成熟」形式之多肽。在某些實施例中，使用天然信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或該序列之功能衍生物，其保留了導引與其可操作地締合的多肽之分泌的能力。或者，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經A型流感病毒血球凝集素、人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。
「載體」為如引入宿主細胞中，進而產生經轉型宿主細胞的核酸分子。載體可包括准許其在宿主細胞中複製之核酸序列，諸如複製 起點。載體亦可包括一或多個可選標記基因及此項技術中已知的其他遺傳元件。
「經轉型」細胞或「宿主」細胞為已藉由分子生物學技術引入核酸分子之細胞。如本文所用，術語轉型涵蓋核酸分子可藉由其引入至此類細胞中之所有技術，包括用病毒載體轉染、用質體載體轉型及藉由電穿孔、脂質體轉染及粒子槍加速引入裸DNA。經轉型細胞或宿主細胞可為細菌細胞或真核細胞。
「特異性結合」一般意謂分子(例如GITRL或其受體結合片段)經由其受體結合域結合至另一分子(例如GITR)，且結合需要配位體與其受體之間的一些互補。根據此定義，當配位體經由其受體結合域結合於該受體比其結合於隨機、不相關分子更容易時，配位體稱為「特異性結合」至受體。術語「特異性」在本文中用於限定某一配位體與某一受體結合之相對親和力。舉例而言，可認為配位體「A」比配位體「B」對給定受體具有更高特異性，或配位體「A」可稱為以高於其對相關受體「D」之特異性結合於受體「C」。
「受體結合域」意謂配位體(例如如本文中所揭示之GITRL)中包含之結合域。
配位體，例如如本文中所揭示之GITRL融合多肽次單元或多聚GITRL融合蛋白可以小於或等於5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1之解離速率(k(解離))結合至受體(例如GITR)。配位體，例如如本文中所揭示之GITRL融合多肽次單元或多聚GITRL融合蛋白可以小於或等於5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1之解離速率(k(解離))結合至受體(例如GITR)。
術語「抑制」、「阻斷」及「抑止」在本文中可互換使用且係指生物活性之任何統計顯著降低，包括活性完全阻斷。舉例而言，「抑 制」可指生物活性降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
如本文所用，術語「親和力」係指配位體與其同源受體之結合強度之量度。如本文所用，術語「親合力」係指一群配位體與受體之間的複合物之總體穩定性，亦即配位體與受體之組合之功能組合強度，例如六聚GITRL IgG融合蛋白(GITRL FP)與細胞表面GITR之相互作用。親合力與具有特異性受體之群體中個別受體結合域之親和力，以及配位體及受體之價數有關。
配位體，例如如本文中所揭示之GITRL融合多肽次單元或多聚GITRL融合蛋白亦可關於其與配位體之結合親和力經描述或規定。舉例而言，配位體可以不大於5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M之解離常數或KD結合至受體。
配位體，例如如本文中所揭示之GITRL融合多肽次單元或多聚GITRL融合蛋白可以大於或等於103M-1 sec-1、5×103M-1 sec-1、104M-1 sec-1或5×104M-1 sec-1之締合速率(k(締合))結合至受體(例如GITR)。配位體，例如如本文中所揭示之GITRL融合多肽次單元或多聚GITRL融合蛋白可以大於或等於105M-1 sec-1、5×105M-1 sec-1、106M-1 sec-1或5×106M-1 sec-1或107M-1 sec-1之締合速率(k(締合))結合至受體(例如GITR)。
GITR或「GITR受體」為蛋白質，亦不同地稱為糖皮質激素誘導之TNF相關蛋白質、腫瘤壞死因子配位體超家族成員18、TNSF18、活化誘導型TNF相關受體、AITR、CD357及RP5-902P8.2，其在活化 NK細胞及抗原刺激之T細胞(例如CD4+及CD8+ T細胞)之表面上，以及在CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞上表現(Tregs；Stephens等人J.Immunol.(2004)173(8)：5008-5020)。GITR為例如SEQ ID NO：47之蛋白質。「GITR配位體」(「GITRL」)亦不同地稱為糖皮質激素誘導之TNF相關配位體、腫瘤壞死因子配位體超家族成員18配位體、TNFSF18配位體、TL6、活化誘導型TNF相關配位體、AITR配位體、AITRL及RP1-15D23，其基本上發現於抗原呈現細胞上(APCs；Stephens等人J.Immunol.(2004)173(8)：5008-5020)。GITRL在細胞之表面上表現且包括細胞內、跨膜及細胞外受體結合域。
如本文所用，術語「GITRL」係指全部GITR配位體、可溶GITR配位體及GITR配位體之功能活性部分。在GITRL之定義內亦包括GITRL之天然存在之對偶基因變異體、胺基酸序列與天然存在之GITR配位體分子不同之GITR配位體變異體及此類變異體之組合，其中變異體保留特異性結合至GITR受體之能力。本文中藉由SEQ ID NO：1之成熟GITRL蛋白質中之殘基數目鑑定GITRL之包含胺基酸殘基取代之某些變異體。舉例而言，N161D係指SEQ ID NO：1之成熟人類GITRL之位置161處的天冬醯胺醯基殘基經天冬胺醯基殘基取代以及SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8之人類GITRL之細胞外域中的等效位置中之相同取代。在提及SEQ ID NO：1之GITRL序列中的各種取代中，本文亦提供除SEQ ID NO：1之GITRL多肽外的GITRL多肽中對應殘基之等效取代。此類對應殘基可容易地藉由將SEQ ID NO：1序列與待取代之GITRL序列比對來鑑定。舉例而言，具有添加至SEQ ID NO：1之單一胺基酸N端添加的GITRL肽可具有位置162處之天冬醯胺醯基殘基取代，其將等效於SEQ ID NO：1之位置161處之天冬醯胺醯基殘基取代。
如本文所用，術語「GITRL融合多肽次單元」或「GITRL FP次 單元」係指包含以下之單鏈多肽次單元：人類IgG Fc域；功能性三聚域；及糖皮質激素誘導之TNF受體配位體(GITRL)之受體結合域，其中多肽次單元可自組裝成多聚，例如三聚或六聚蛋白質。術語「多聚GITRL融合蛋白」或「多聚GITRL FP」指GITRL融合多肽次單元之自組裝多聚體，包括例如三聚體及六聚體。當在GITRL FP次單元中使用某一同型之IgG Fc域時，具有該同型之GITRL FP描述為「GITRL IgGX FP」，其中X可為1、2、2a、3、4或4P，例如GITRL IgG1 FP、GITRL IgG2 FP、GITRL IgG2a FP、GITRL IgG3 FP、GITRL IgG4 FP及GITRL IgG4P FP。
如本文所用，「OX40多肽」意謂與NCBI寄存編號NP_003318具有至少約85%胺基酸一致性之多肽或其片段。OX40為表現於抗原活化之哺乳動物CD4+及CD8+ T淋巴細胞之表面上之受體之TNFR超家族之成員。參見例如Paterson等人，Mol Immunol 24,1281-1290(1987)；Mallett等人，EMBO J 9,1063-1068(1990)；及Calderhead等人，J Immunol 151,5261-5271(1993))。OX40亦稱為CD134、ACT-4及ACT35。OX40受體序列為此項技術中已知的且提供於例如GenBank寄存編號：AAB33944或CAE11757處。
下文提供例示性人類OX40胺基酸序列： (SEQ ID NO：52)
「OX40配位體」意謂與NCBI寄存編號NP_003317具有至少約85%胺基酸一致性且與OX40受體特異性結合之多肽或其片段。參見例如Baum P.R.，等人.EMBOJ.13：3992-4001(1994))。術語OX40L包括整個OX40配位體、可溶OX40配位體及包含OX40配位體之功能活性部分的與第二部分(例如，蛋白質域)共價連接的融合蛋白。在 OX40L之定義內亦包括胺基酸序列與天然存在之OX4L不同但保留特異性結合至OX40受體之能力的變異體。在OX40L之定義內進一步包括增強OX40之生物活性的變異體。OX40配位體序列為此項技術中已知的且提供於例如GenBank寄存編號：NP_003318處。
下文提供例示性人類OX40配位體胺基酸序列： (sEQ ID NO：53)
如本文所用，「OX40促效劑」意謂特異性地與OX40受體相互作用且增加OX40受體之生物活性之OX40配位體。理想地，將生物活性增加至少約10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。在某些態樣中，如本文中所揭示之OX40促效劑包括OX40結合多肽，諸如抗OX40抗體(例如OX40促效劑抗體)、OX40配位體或此等分子之片段或衍生物。
如本文所用，「OX40抗體」意謂特異性結合OX40之抗體。OX40抗體包括對OX40及其抗原結合片段具有特異性之單株及多株抗體。在某些態樣中，如本文所描述之抗OX40抗體為單株抗體(或其抗原結合片段)，例如鼠、人類化或完全人類單株抗體。在一個特定實施例中，OX40抗體為OX40受體促效劑，諸如由Weinberg等人，J Immunother 29,575-585(2006)描述之小鼠抗人類OX40單株抗體(9B12)。在其他實施例中，與OX40特異性結合之抗體或其抗原結合片段結合至與mAb 9B12相同之OX40抗原決定基。在另一態樣中，抗體為MEDI0562。參見例如美國公開案第2016/0137740號。
如本文所用，「OX40配位體融合蛋白(OX40L FP)」意謂特異性結合OX40受體且增加免疫反應之蛋白質。在一個實施例中，OX40配位體融合蛋白與OX40受體之結合藉由強化T細胞識別增強腫瘤抗原特異性免疫反應。例示性OX40配位體融合蛋白描述於名為「Trimeric OX40 Immunoglobulin Fusion Protein and Methods of Use」之美國專利7,959,925中。其他OX40配位體融合蛋白描述於例如美國專利第6,312,700號中。在一個實施例中，OX40配位體融合蛋白增強腫瘤特異性T細胞免疫性。在一個實施例中，OX40配位體融合蛋白為MEDI6383(SEQ ID NO：50)。參見例如美國公開案第2016/0024176號。
「三聚域」為多肽內促進多肽組裝成三聚體之胺基酸序列。舉例而言，三聚域可經由與其他三聚域(具有相同或不同胺基酸序列之其他多肽之域)締合而促進組裝成三聚體。術語亦用以指編碼此類肽或多肽之聚核苷酸。
術語「Fc」域係指抗體恆定區之一部分。傳統地，術語Fc域係指包涵抗體之配對CH2、CH3及鉸鏈區之蛋白酶(例如番木瓜蛋白酶)裂解產物。在本發明的情況下，術語Fc域或Fc係指任何多肽(或編碼此類多肽之核酸)，不論製備方式，其包括免疫球蛋白多肽之所有或一部分CH2、CH3及鉸鏈區。
如本文所用，術語「IgG Fc域」係指IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白之Fc域，及此類Fc域之變異體。IgG4 Fc域之變異體包括(但不限於)IgG4P Fc域。
如本文所用，術語「CH2域」包括使用習知編號流程例如自抗體之約胺基酸244延伸至胺基酸360(胺基酸244至360，Kabat編號系統；及胺基酸231-340，EU編號系統)之重鏈分子之Fc域的部分。亦有據可查的為CH3域自IgG分子之CH2域延伸至C端，且包含大約108個胺基酸。
如本文所用，術語「連接區域」包括任何用於融合或接合兩個蛋白質域的肽。此類連接子包括(但不限於)：包含(Gly4)n基元、(Gly4Ser)n基元(SEQ ID NO：19)及Ser(Gly4Ser)n基元(SEQ ID NO：22) 之肽。
如本文所用，術語「IgG鉸鏈區」包括將CH1域接合至CH2域之重鏈IgG分子之Fc域的部分。此鉸鏈區包含大約25個胺基酸且為可撓性的，因此允許兩個N端抗原結合區獨立地移動。鉸鏈區可細分為三個不同域：上部、中部及下部鉸鏈域(Roux等人，J.Immunol.161：4083(1998))。
如本文所用，術語「二硫鍵」包括在兩個硫原子之間形成的共價鍵。胺基酸半胱胺酸包含可與第二硫醇基形成二硫鍵或橋之硫醇基。在本文提供之某些態樣中，人類IgG4 Fc域可在鉸鏈區中突變以確保在兩個鉸鏈區之間形成二硫鍵，特定言之，位置228(根據EU編號)處之絲胺酸至脯胺酸突變。包含S228P突變之人類IgG4 Fc域在本文中稱為「IgG4P Fc域」。
如本文所用，術語「連接」、「融合(fused/fusion)」可互換使用。此等術語係指藉由包括化學結合或重組手段之任何手段使多於兩種元素或組分接合在一起。「框內融合」係指兩個或多於兩個聚核苷酸開放閱讀框架(ORF)以維持原始ORF之正確轉譯閱讀框架之方式接合形成連續較長ORF。因此，重組融合蛋白為含有對應於由原始ORF編碼之多肽的兩個或多於兩個區段(該等區段通常在自然界中並非如此接合)之單一蛋白質，例如如本文所提供的GITRL融合多肽次單元。雖然在整個融合區段中如此使閱讀框架連續，該等區段可藉由例如框內連接子序列在物理或空間上分離。
在多肽的情況下，「直鏈序列」或「序列」為多肽中在胺基至羧基末端方向上的胺基酸之順序，其中序列中彼此相鄰之胺基酸在多肽之初級活化結構中鄰接。
如本文所用之術語「表現」係指基因產生生物化學物質(例如多肽)之過程。該過程包括細胞內基因之功能性存在的任何表現形式， 包括(但不限於)阻斷基因表現以及短暫表現及穩定表現。其包括(但不限於)基因轉錄成信使RNA(mRNA)及該mRNA轉譯成多肽。若最終所要產物為生物化學物質，則表現包括彼生物化學物質及任何前驅體之形成。基因表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸，例如藉由基因轉錄產生之信使RNA，或為自轉錄物轉譯之多肽。本文所描述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如聚腺苷酸化)之核酸，或具有轉譯後修飾(例如，甲基化、糖基化、脂質添加、與其他蛋白質次單元結合、蛋白水解分裂及其類似修飾)之多肽。
如本文所用，當在治療癌症的情況下(例如在片語「治療癌症患者」中)使用時術語「治療(treat/treatment/treatment of)」係指減少疾病病理學之可能、減少疾病症狀之出現，例如在個體具有較長存活率或減少之不適的程度上。舉例而言，治療可指當向個體投與時，療法減少疾病症狀、病徵或病因之能力。治療亦指減少或減輕至少一種臨床症狀及/或抑制或延遲病狀進展及/或預防或延遲疾病或病痛發作。
如本文所用，當在治療病毒感染的情況下(例如在片語「治療病毒感染」中)使用時術語「治療(treat/treatment/treatment of)」係指減少與病毒感染相關之病理學病狀及/或症狀。
「個體(subject)」或「個體(individual)」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意謂需要診斷、預後或治療的任何個體，尤其哺乳動物個體。哺乳動物個體包括人類、馴養動物、農畜、運動動物及動物園動物，包括例如人類、非人類靈長類動物、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、熊等。
術語「醫藥組合物」係指一種製劑，其呈使活性成分之生物活性有效之形式，且其不含對組合物將投與之個體具有不可接受之毒性的其他組分。此類組合物可為無菌的。
如本文所揭示的抗體之「有效量」為足以進行具體所述目的之 量。「有效量」可憑經驗且以與所述目的相關的常規方式確定。
GITRL融合多肽次單元
本發明係關於可組裝成多聚(例如三聚或六聚)蛋白質之具有改良之特性的GITRL融合多肽次單元，該等改良之特性包括(但不限於)當在經轉染哺乳動物細胞培養物中表現時改良之產率；改良之對GITR之結合親和力；在各種生物分析中之改良之活性及/或當純化或部分純化時與先前揭示之含有GITRL之多肽相比改良之均質性(參見例如Wyzgol等人，J Immunol 2009；183：1851-1861)。本文提供之GITRL融合多肽次單元可包含IgG Fc域(例如人類IgG Fc域)、三聚域及人類GITRL之受體結合域。例示性實施例示意性地說明於圖7中。通常，IgG Fc域、三聚域及GITRL受體結合域在N端至C端方向上配置。例示性GITRL IgG1融合多肽次單元由SEQ ID NO：6表示。
在某些實施例中，GITRL受體結合域為人類GITRL之細胞外域。一個此類域之序列由SEQ ID NO：37表示。
在某些態樣中，GITRL受體結合域為GITRL變異體細胞外域。可使用之GITRL變異體細胞外域包括(但不限於)跨越SEQ ID NO：37之整個長度具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在某些態樣中，GITRL變異體細胞外域為跨越SEQ ID NO：34之整個長度具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在某些態樣中，與SEQ ID NO：1之天冬醯胺醯基161對應之GITRL變異體細胞外域殘基經任何胺基酸或經天冬胺醯基殘基取代。其中與SEQ ID NO：1之天冬醯胺醯基161對應之殘基經任何胺基酸或經天冬胺醯基殘基取代的GITRL變異體細胞外域包括(但不限於)跨越SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37之整個長度具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性之多 肽。此類取代可減少或消除GITRL變異體細胞外域中此位點之N連接之糖基化。在某些態樣中，與SEQ ID NO：1之天冬醯胺醯基106對應之GITRL變異體細胞外域殘基經丙胺醯基殘基取代。在某些情況下，hGITRL之N106A取代可引起與GITR之結合增加及T細胞增殖反應改良(Chattopadhyay等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(49)：19452-19457)。在某些態樣中，與Glu 52、Phe 62、Pro 66、Pro 67、Met 71、Pro 77、Val 79、Asn 92、Ser 83、Gly 99、Asn 104、Pro 112、Arg 116、Met 123、Asn 153、Val 158、Asn 161、Iso 167、Iso 168及其組合對應之GITRL變異體細胞外域殘基獨立地經非天然存在之胺基酸殘基或對偶基因變異體之胺基酸殘基取代。GITRL變異體細胞外域之非限制性實例提供在SEQ ID NO：35中，其中X1=Glu或Ala，X2=Ser或Phe，X3=Thr或Pro，X4=Leu或Ser，X5=Thr或Met，X6=Leu或Pro，X7=Met或Val，X8=Thr、Phe或Ser，X9=Ser或Gly，X10=Arg或Pro，X11=Trp或Arg，X12=Leu或Met，X13=Ser或Asn，X14=Phe或Val，X15=除Asn或Asp外之任何胺基酸，X16=Val或Ile，X17=Leu或Ile，且其中X1-X17獨立地經選擇且可以任何組合存在。
保留與GITR受體之結合之所需特性的任何GITRL多肽序列適用於本文中描述之融合多肽及方法。
鄰近GITRL受體結合域的為三聚域。術語「鄰近」包括例如相鄰，或經由連接區域或異源劑締合。當彼此相鄰時此類域為彼此直接融合之域。三聚域用以促進個別GITRL融合多肽次單元自組裝成三聚蛋白質或六聚蛋白質。在某些實施例中，具有三聚域之GITRL融合多肽次單元自組裝成六聚GITRL融合蛋白。在一個實施例中，三聚域為捲曲螺旋域，例如白胺酸拉鏈域。例示性三聚白胺酸拉鏈域為經工程改造之酵母GCN4 pII變異體，其由Harbury等人(1993)Science 262：1401-1407描述，其揭示內容出於所有目的併入本文中。例示性三聚域包括：TNF受體相關因子-2(TRAF2)(GENBANK®寄存編號Q12933[gi：23503103]；胺基酸310-349)；凝血栓蛋白1(寄存編號PO7996[gi：135717]；胺基酸291-314)；基質素-4(寄存編號O95460[gi：14548117]；胺基酸594-618)；軟骨基質蛋白質(基質素-1)(寄存編號NP002370[gi：4505111]；胺基酸463-496)；熱休克轉錄因子(HSF)(寄存編號AAX42211[gi：61362386]；胺基酸165-191)；及古比林(Cubilin)(寄存編號NP001072[gi：4557503]；胺基酸104-138)。
在某些態樣中，三聚域包含α-螺旋形捲曲螺旋域。適用之α-螺旋形捲曲螺旋域包括(但不限於)衍生自基質素1、冠蛋白1a、營養不良性肌強直激酶(DMPK)、蘭格素及其組合的域。此類衍生物包括(但不限於)具有野生型序列之捲曲螺旋域以及包含捲曲螺旋域野生型序列中之一或多個胺基酸取代的變異體。含有冠蛋白1a三聚域之冠蛋白1a蛋白質有時亦同義稱為冠蛋白樣蛋白質A、Clipin-A、冠蛋白樣蛋白質p57、含色胺酸天冬胺酸鹽之鞘蛋白及HUGO名稱CORO1A中之任一者。衍生自可使用之各種蛋白質的野生型捲曲螺旋域之非限制性實例包括基質素1(SEQ ID NO：28)、DMPK(SEQ ID NO：30)、蘭格素(SEQ ID NO：32)及冠蛋白1a(SEQ ID NO：11)。α-螺旋形捲曲螺旋域之變異體可包括對偶基因變異體、經工程改造之變異體及其組合。α-螺旋形捲曲螺旋域通常以七聯體序列重複「hpphcpc」(或abcdefg)組織，該等序列重複可獨立地在重複中之一或多者中「h」位置(「a」及/或「d」位置)中之一或多者處經丙胺酸、白胺酸、異白胺酸或纈胺酸殘基取代。在此類「hpphcpc」七聯體重複中，h表示疏水性殘基，c通常表示帶電殘基，且p表示極性(且因此親水性)殘基。提供基質素1、冠蛋白1a、營養不良性肌強直激酶(DMPK)及蘭格素之α-螺旋形捲曲螺旋域變異體，其中彼等三聚域的一或多個七聯體重複中之 「a」及/或「d」位置中之一或多者經丙胺酸、白胺酸、異白胺酸或纈胺酸殘基取代。可使用之α-螺旋形捲曲螺旋域變異體之非限制性實例包括基質素1(SEQ ID NO：29)、DMPK(SEQ ID NO：31)、蘭格素(SEQ ID NO：32)及冠蛋白1a(SEQ ID NO：12-18)。在某些態樣中，GITRL融合多肽次單元中使用之變異基質素1三聚域可包括(但不限於)跨越SEQ ID NO：29之整個長度具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性的多肽。在某些態樣中，GITRL融合多肽次單元中使用之變異DMPK三聚域可包括(但不限於)跨越SEQ ID NO：31之整個長度具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性之多肽。在某些態樣中，GITRL融合多肽次單元中使用之變異蘭格素三聚域可包括(但不限於)跨越SEQ ID NO：33之整個長度具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性之多肽。在某些態樣中，GITRL融合多肽次單元中使用之冠蛋白1a三聚域可包括(但不限於)跨越SEQ ID NO：11之整個長度具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性之多肽。在某些態樣中，以SEQ ID NO：10形式提供冠蛋白1a三聚域變異共同序列，其中彼等三聚域的一或多個七聯體重複中之「A」及/或「D」位置中之一或多者經可在GITRL融合多肽次單元中使用之丙胺酸、白胺酸、異白胺酸或纈胺酸殘基取代。可在GITRL融合多肽次單元中使用之例示性冠蛋白1a wt及變異序列呈現在表A中。
當與具有不同三聚域之其他GITRL融合多肽次單元相比時，具有本文提供之某些三聚域(例如冠蛋白1a三聚域或其變異體)之GITRL融合多肽次單元可展示改良之特性。更特定言之，具有冠蛋白1a三聚域或其變異體之GITRL融合多肽次單元可展示改良之特性，該等特性包括(但不限於)當在經轉型哺乳動物細胞培養物(例如CHO細胞)中表現時改良之產率；改良之對GITR之結合親和力；在各種生物分析(例如NF-κB信號傳導路徑之活化)中之改良之活性；及/或當純化或部分純化時改良之均質性。在不希望受理論限制的情況下，咸信具有冠蛋白1a三聚域或其變異體之GITRL融合多肽次單元之此類改良之特性可促進GITRL融合多肽次單元之製造及/或改良多聚GITRL融合蛋白在各種治療應用中之功效。
除GITRL受體結合域及三聚域以外，如本文所提供的GITRL融合多肽次單元包括免疫球蛋白域，諸如恆定區或「Fc」域。在某些態樣中，本發明提供至少包括鉸鏈區之人類IgG1及IgG4 Fc域。在某些態樣中，人類IgG1或IgG4 Fc域進一步包括CH2域。在某些態樣中，人類IgG1或IgG4 Fc域進一步包括CH3域。在某些態樣中，Fc域為人類IgG1 Fc域或其變異體。人類IgG Fc域可包含具有與SEQ ID NO：21具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的肽。可使用之IgG Fc域(例如IgG1 Fc 域)之變異體包括(但不限於)含有一或多個獨立地選自由以下組成之群的胺基酸殘基之IgG Fc域：252Y、254T、256E及其組合，其中殘基根據EU編號來編號。在某些態樣中，IgG4 Fc區之鉸鏈區可包含位置228(根據EU編號)處之絲胺酸至脯胺酸突變，其賦予完整的重鏈間二硫鍵形成。在某些態樣中，IgG4鉸鏈區包含SEQ ID NO：40之胺基酸1至12。在某些態樣中，人類IgG4 Fc域為具有SEQ ID NO：38之S228P突變的IgG4P-Fc域。
與使三個GITRL受體結合域結合在一起的三聚域組合，兩個IgG Fc域之間的二硫鍵形成使得形成六聚蛋白質(圖7)。因此，免疫球蛋白域充當二聚域，其經由未配對免疫球蛋白域之間的相互作用促進在兩個三聚GITRL融合蛋白之間組裝成穩定六聚體(亦即含有六個GITRL融合多肽次單元之多聚體)。在某些態樣中，人類IgG4 Fc域在不促進效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性)的情況下向六聚蛋白質提供穩定性。在其他態樣中，人類IgG1 Fc域向六聚蛋白質提供穩定性同時促進效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性)。
在某些態樣中，本發明提供自組裝以形成可特異性結合至GITR的六聚蛋白質之單鏈多肽次單元。例示性多肽次單元包含人類IgG Fc域、功能性三聚域及GITRL之受體結合域。在特定態樣中，多肽次單元可自組裝成六聚蛋白質。在某些態樣中，多肽次單元自胺基端至羧基端如下配置：人類IgG Fc域，接著三聚域，接著GITRL受體結合域。三個域可緊鄰。舉例而言，在某些態樣中人類IgG Fc域之羧基端直接融合至三聚域之胺基端，且三聚域之羧基端直接融合至GITRL受體結合域之胺基端。替代地，兩個或三個域可藉由一或多個連接子、間隔子或其他異源多肽分離。適用之連接子包括(但不限於)(Gly4)n基元、(Gly4Ser)n基元(SEQ ID NO：19)、Ser(Gly4Ser)n基元(SEQ ID NO： 22)、GGGGSGGGGSGGGGSAL(SEQ ID NO：23)或GGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO：24)，及其組合，其中n為選自由以下組成之群的正整數：1、2、3、4、5、6、7、8、9及10。
在某些態樣中，如本文所提供的GITRL融合多肽次單元可特異性結合至人類GITR。在某些態樣中，如本文所提供的GITRL融合多肽次單元可特異性結合至非人類靈長類動物GITR，例如食蟹獼猴GITR或恆河猴GITR。在某些態樣中，如本文所提供的GITRL融合多肽次單元不結合至小鼠GITR或大鼠GITR。
如本文所提供的GITRL融合多肽次單元可含有一或多種保守性胺基酸變化，例如至多十種保守性變化(例如兩個經取代之胺基酸、三個經取代之胺基酸、四個經取代之胺基酸或五個經取代之胺基酸等)，其限制條件為變化可在多肽中在不改變GITRL融合多肽次單元或多聚GITRL FP之生物化學功能的情況下作出。
舉例而言，一或多種保守性變化可在GITRL受體結合域中在不改變其結合至GITR之能力的情況下作出。類似地，一或多種保守性變化可在三聚域中在不改變其三聚之能力的情況下作出。
本文提供之GITRL融合多肽次單元亦可含有一或多種阻斷或減少GITRL之天冬醯胺醯基殘基161之N連接之糖基化的胺基酸取代、插入或缺失。在某些態樣中，GITRL之天冬醯胺醯基殘基161經除天冬醯胺醯基殘基外之任何胺基酸取代以阻斷或減少糖基化。在某些態樣中，GITRL之天冬醯胺醯基殘基161經天冬胺醯基殘基取代，例如為如SEQ ID NO：4中所示之GITRL之N161D變異體。在某些態樣中，GITRL之天冬醯胺醯基殘基161之N連接之糖基化藉由破壞GITRL殘基161-163之N連接之糖基化位點序列NNT的胺基酸取代、插入或缺失阻斷或減少使得此序列不再符合典型N連接之糖基化位點序列NX(T、S或C)。在某些實施例中，用除絲胺醯基或半胱胺醯基外之胺基酸殘基 取代蘇胺醯基殘基163可用於阻斷或減少GITRL之天冬醯胺醯基殘基161的N連接之糖基化，其限制條件為變化可在多肽中在不改變GITRL融合多肽次單元或多聚GITRL融合蛋白之生物化學功能的情況下作出。
另外，可在不削弱或消除所有功能的情況下缺失多肽域之一部分。類似地，可在多肽鏈中在不削弱或消除其功能的情況下如下文所描述作插入或添加，例如添加抗原決定基標籤。可在不顯著地削弱多肽之一或多種功能的情況下作出之其他修飾包括例如併入不尋常胺基酸之活體內或活體外化學及生物化學修飾。此類修飾包括例如乙醯化、羧化、磷酸化、糖基化、標記(例如用放射性核種)及各種酶修飾，如一般技術者輕易地瞭解。此項技術中熟知多種用於標記多肽之方法及適用於此類目的之標記，且包括放射性同位素(諸如32P)、螢光團、化學發光劑、酶及抗配位體(antiligands)。
融合多肽次單元可進一步包括異源劑，例如穩定劑、免疫反應調節劑或可偵測劑。在某些態樣中，異源劑包含一或多個經由肽鍵融合至多肽次單元的其他多肽序列，諸如信號序列(例如分泌信號序列)、連接子序列、胺基酸標籤或標記或促進純化之肽或多肽序列。在某些態樣中，異源多肽可融合至IgG-Fc域之N端，異源多肽可融合至GITRL之受體結合域之C端，異源多肽可融合至IgG-Fc域之C端及三聚域之N端，或異源多肽可融合至三聚域之C端及GITRL之受體結合域之N端。或者，異源多肽可在IgG Fc域、三聚域或GITRL受體結合域中之任一者內內部融合，只要維持該域之功能特性。
在某些態樣中，異源劑可以化學結合至多肽次單元。可以化學結合至多肽次單元之例示性異源劑包括(但不限於)連接子、藥物、毒素、顯影劑、放射性化合物、有機及無機聚合物及任何其他可提供多肽次單元自身不提供之所需活性的組合物。特定劑包括(但不限於)聚 乙二醇(PEG)、細胞毒性劑、放射性核種、顯影劑、生物素。
在某些態樣中，GITRL融合多肽次單元以及包含彼等次單元之任何三聚體或六聚蛋白質可用作對照、開展或執行診斷分析(例如用於劑量確定)之參考標準或研究工具。舉例而言，本發明提供如上文所描述之GITRL融合多肽次單元，其中GITRL受體結合域包含SEQ ID NQ：34、35、36或37中之任一者。在某些態樣中，對照、參考標準或工具可包含與SEQ ID NO：6具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性的GITRL融合多肽次單元。在另一實例中，本發明提供如上文所描述之可形成多聚蛋白質的GITRL融合多肽次單元，但其中GITRL受體結合域為小鼠或大鼠GITRL受體結合域，且Fc域為人類或鼠來源之Fc域，且多聚域為例如三聚域，例如冠蛋白1a三聚域。此融合蛋白可用於在嚙齒動物中進行活體內實驗。在不希望受理論限制的情況下，由小鼠中之不同IgG同型賦予之IgG Fc域效應功能一般不同於由人類中之相同IgG同型賦予之效應功能。然而，先前已經顯示特異性小鼠IgG同型視為與人類中之替代IgG同型類似或相當，例如小鼠IgG2a視為與人類IgG1類似且小鼠IgG1視為與人類IgG4相當。因而，在具有給定小鼠IgG Fc域同型之小鼠中獲得之結果可用於預測在具有類似或相當人類IgG同型之人類中獲得之結果。
多聚GITRL融合蛋白
如上文所描述之GITRL融合多肽次單元可自組裝成六聚GITRL FP。因此，本發明提供包含六個如上文所描述之多肽次單元的六聚蛋白質。實例中描述之例示性多肽次單元自組裝成本文中稱為「六聚GITRL FP」的六聚蛋白質。自組裝成六聚GITRL FP之GITRL融合多肽次單元之胺基酸序列之非限制性實例提供在SEQ ID NO：6中。然而，一般技術者將鑒於本發明認識到許多其他序列亦滿足本文針對六 聚GITRL FP所闡述之準則。本文亦提供包含六個與SEQ ID NO：6具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性之GITRL融合多肽次單元的六聚GITRL FP。
在某些態樣中，本文提供之某些GITRL融合多肽次單元亦可自組裝成包含三個GITRL融合多肽次單元之三聚GITRL FP。此可例如在GITRL FP中使用無法二聚之Fc域產生三聚蛋白質之情況下發生。無法二聚且因此適用於製備三聚GITRL FP之Fc域之實例包括(但不限於)單體IgG1 Fc分子(Ying等人J Biol Chem.Jun 1,2012；287(23)：19399-19408)及單價IgG4分子(Wilkinson，等人MAbs.May 1,2013；5(3)：406-417)。
如本文所提供的多聚GITRL融合蛋白(例如六聚GITRL FP)可特異性結合至如在初級抗原刺激之T細胞，例如來自人類、食蟹獼猴、恆河猴或其任何組合之初級抗原刺激之T細胞上表現的GITR。
如本文所提供的六聚蛋白質(例如六聚GITRL FP)可特異性結合至重組GITR。在某些態樣中，如本文所提供的六聚蛋白質(例如六聚GITRL FP)可以約1nM至約120nM，例如約10nM至約100nM，例如約20nM至約100nM，例如約60nM至約100nM(所有均如藉由動力學排除分析所量測)之結合親和力結合至重組人類GITR。舉例而言，如本文所提供的六聚蛋白質(例如六聚GITRL FP)可以約0.1nM、約0.5nM、約1nM、約2nM、約3nM、約4nM、約5nM、約6nM、約7nM、約8nM、約9nM、約10nM、約20nM、約30nM、約40nM、約50nM、約60nM、約70nM、約80nM、約90nM、約100nM、約120nM、約250nM或約500nM(所有均如藉由動力學排除分析所量測)之結合親和力結合至重組人類GITR。在某些態樣中，如本文所提供的六聚蛋白質(例如六聚GITRL FP)可以約0.1nM、約0.5nM、約1nM、約2nM、約3nM、約4nM、約5nM、約6nM、約7nM、約8 nM、約9nM、約10nM、約20nM、約30nM、約40nM、約50nM、約60nM或約70nM中之任一者至約90nM、約100nM、約120nM、約250nM或約500nM中之任一者(所有均如藉由動力學排除分析所量測)之結合親和力結合至重組人類GITR。在某些態樣中，如本文所提供的六聚蛋白質(例如六聚GITRL FP)可以如藉由動力學排除分析所量測之約82nM之結合親和力結合至重組人類GITR。結合親和力可藉由許多不同方法及/或儀器量測，且相對結合親和力可視方法或儀器而變化，如一般技術者充分理解。
在另一實例中，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可結合至在初級抗原刺激食蟹獼猴T細胞，例如CD4+或CD8+ T細胞上表現之食蟹獼猴GITR。
在某些態樣中，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可在基於盤之分析中誘導抗原刺激之CD3+ T細胞之劑量依賴性增殖。舉例而言，在使用如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL)之活體外分析中，可在初級抗原刺激人類CD3+ T細胞中在約0.03nM至約0.2nM(例如約0.16nM)之六聚蛋白質濃度下實現20%最大增殖反應(EC20)，可在初級抗原刺激人類CD3+ T細胞中在約0.2nM至約1nM(例如約0.4nM)之六聚蛋白質濃度下實現50%最大增殖反應(EC50)，且可在初級抗原刺激人類CD3+ T細胞中在約0.7nM至約5nM(例如約1.8nM)之六聚蛋白質濃度下實現90%最大增殖反應(EC90)，所有均如藉由胸苷併入所量測。
在某些態樣中，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL IgG融合蛋白)可誘導自抗原刺激之T細胞，例如人類初級抗原刺激之CD3+ T細胞之劑量依賴性細胞因子釋放。在某些態樣中，所釋放之細胞因子為IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12 p70、IL-1β或其任何組合。在某些態樣中，細胞因子為IFNγ、 TNFα、IL-5、IL-10或其任何組合。類似地，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可增強初級抗原刺激食蟹獼猴T細胞及初級抗原刺激恆河猴T細胞中之T細胞增殖及細胞因子釋放。
在其他態樣中，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可在GITR表現之T細胞中活化NFκB路徑。舉例而言，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可以約20pM至約300pM(例如對於六聚GITRL IgG1FP為約182pM且對於六聚GITRL IgG4FP為289pM)之EC50在回應於NFκB信號傳導路徑之刺激產生螢光素酶之表現GITR之傑卡特NFκB-螢光素酶報導細胞中活化NFκB路徑。替代地，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可在表現人類GITR、食蟹獼猴GITR或恆河猴GITR之細胞中活化NFκB路徑。
在另一態樣中，當以有效劑量形式向需要癌症治療之個體投與時，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可例如藉由減緩腫瘤生長、停止腫瘤生長或降低現有腫瘤之尺寸來促進癌症治療。在某些態樣中，可在T細胞存在下實現癌症治療之促進。在某些態樣中，當以有效劑量形式向需要治療之個體投與時，與投與同型匹配對照分子相比，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可將腫瘤生長減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%。
在另一態樣中，當以有效劑量形式向需要治療之個體(例如感染有病毒之個體)投與時，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可例如藉由減緩病毒增殖、停止病毒增殖或減少感染復發或感染復發頻率來促進病毒感染之治療。此類個體可有慢性或潛伏病毒感染。在某些態樣中，治療為針對有潛伏病毒感染之個體且與用安慰劑治療之個體相比，減少感染復發或感染復發頻率。在某些態樣中，促進病毒感染之治療可在T細胞存在下實現。在某些態樣中，當以有效劑量形 式向需要治療之個體投與時，與投與同型匹配對照分子相比，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可將病毒負荷減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%。在某些態樣中，當以有效劑量形式向需要治療之個體投與時，與投與同型匹配對照分子相比，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)可將病毒感染之復發減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%或至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%。
在其他態樣中，如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL IgG4融合蛋白)可經由與GITR結合誘導抗原刺激、GITR表現之T細胞之增殖，但基本上不觸發針對抗原刺激之T細胞之補體依賴性或抗體依賴性細胞毒性。此外在某些態樣中，如本文所提供的六聚蛋白質(例如多聚GITRL IgG1融合蛋白)可經由與GITR結合誘導抗原刺激、GITR表現之T細胞之增殖，但結合至C1q且觸發抗原刺激之CD4+ T細胞(尤其FOXP3+ CD4+調節性T細胞)之Fc受體介導之抗體依賴性細胞毒性或吞噬作用。
編碼GITRL IgG融合多肽次單元之聚核苷酸
本發明進一步提供一種聚核苷酸，其包含編碼如本文所提供的GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)之核酸。編碼GITRL融合多肽次單元之例示性聚核苷酸序列由SEQ ID NO：5表示。在某些態樣中，編碼IgG Fc域、三聚域及GITRL受體結合域之核酸序列在5'至3'方向上接合，例如在5'至3'方向上連續地連接。在其他態樣中，所提供之聚核苷酸可進一步包含編碼例如分泌信號肽之信號序列或膜定位序列。本發明提供編碼任何及所有GITRL融合多肽次單元或包含該等次單元之多聚(例如六聚)蛋白質的聚核苷酸。
在某些態樣中，本發明提供包含編碼GITRL融合多肽次單元之核酸的聚核苷酸。在某些態樣中，核酸序列包含SEQ ID NO：5。
編碼如本文所提供的GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)之聚核苷酸包括去氧核糖核苷酸(DNA、cDNA)或核糖去氧核苷酸(RNA)序列或任一種核苷酸之經修飾形式，其編碼本文中描述之融合多肽。術語包括單股及雙股形式之DNA及/或RNA。
亦提供包含有包含一種或少量缺失、添加及/或取代之核酸序列的聚核苷酸。此類變化可相鄰或可分佈在核酸中之不同位置。基本上相同之核酸序列可例如具有1或2或3或4或甚至更多種核苷酸缺失、添加及/或取代。在某些態樣中，一或多種缺失、添加及/或取代不改變由聚核苷酸序列編碼之閱讀框架，使得在核酸表現後產生經修飾(「突變」)但基本上相同之多肽。
胺基酸(及/或核酸)序列之間的相似性根據序列之間的相似性表示，另外稱為序列一致性。序列一致性常常根據一致性(或相似性)百分比量測；百分比越高，兩個序列之初級活化結構越類似。「一致性百分比(%)」在本文中定義為在比對序列及視需要在候選及/或所選序列中引入缺口以達成最大序列一致性百分比之後，候選序列中之胺基酸殘基與所選序列中之胺基酸殘基一致之百分比，且不將任何保守性胺基酸取代視為序列一致性之一部分。
因此，包含編碼如本文所提供的GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)之核酸的聚核苷酸可與SEQ ID NO：5或其至少一個子序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少96%、常常至少97%、98%或99%一致。出於測定同源性百分比(亦即序列相似性)或一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如使用公用或專用演算法。舉例而言，序列相似性可使用成對比對方法，例如BLAST、BLAST-2、 ALIGN或ALIGN-2，或多序列比對方法，諸如Megalign(DNASTAR)、ClustalW或T-Coffee軟體測定。熟習此項技術者可確定合適的計分函數，例如用於量測比對之空位罰分或計分矩陣，包括在比較之序列之全長上實現最佳比對品質所需要之任何演算法。此外，可使用結構比對方法(例如使用二級或三級結構資訊來比對兩個或多於兩個序列之方法)或組合序列、結構及譜系學資訊來鑑定及最佳地比對候選蛋白質序列之混合方法來實現序列比對。
NCBI鹼基局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.(1990)215：403)可獲自數種來源，包括國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI，Bethesda，MD)及在網際網路上，其與序列分析程式blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx結合使用。如何使用此程式測定序列一致性之描述可在網際網路上在NCBI網站上獲得。
因此，與SEQ ID NO：5基本上相同或基本上類似之核酸序列涵蓋在本發明內。若在核苷酸對核苷酸基礎上序列與參考序列之至少子序列(例如SEQ ID NO：4)相同，則該序列基本上與SEQ ID NO：5一致。相對於SEQ ID NO：4此類核酸可包括例如插入、缺失及取代。舉例而言，此類核酸可與參考核酸至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或甚至99%一致，或編碼與參考多肽序列(例如SEQ ID NO：4)至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或甚至99%一致的多肽。
另外，包含編碼如本文所提供之GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)之核酸的聚核苷酸亦可包括促進核酸之表現或複製的聚核苷酸序列，諸如表現調節序列及/或載體序列。類似地，包含編碼如本文所提供之GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)之核酸的聚核苷酸可包括賦予經編碼多肽功能屬性的其他 編碼序列。此類序列包括(但不限於)分泌信號序列及膜定位信號。對與編碼GITRL融合多肽次單元之核酸可操作地連接的信號肽編碼的核酸之非限制性實例提供在SEQ ID NO：7中。
包含編碼如本文所提供之GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)之核酸的聚核苷酸可藉由習知技術引入載體(諸如真核表現載體)中。因此，本發明提供包含如本文所提供之聚核苷酸的載體。表現載體經設計以藉由提供引發及增強cDNA之轉錄且確保其適當拼接及聚腺苷酸化之調節序列來准許編碼如本文所提供之GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)的聚核苷酸序列在細胞中轉錄。許多表現載體為熟習此項技術者已知，且市售，或可根據習知分子生物學程序自個別組分組裝。
表現控制序列及表現載體之選擇將視宿主細胞之選擇而定。可採用各種表現宿主/載體組合。適用於真核宿主之表現載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列的載體。適用於細菌宿主之表現載體包括已知之細菌質體，諸如來自大腸桿菌之質體，包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物，更寬宿主範圍質體，諸如M13及絲狀單股DNA噬菌體。
適用於表現如本文所提供之GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)的宿主細胞包括在合適啟動子控制下之原核生物、酵母、昆蟲或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌或桿菌。高等真核細胞包括如下文所描述之已確立之哺乳動物來源細胞株。亦可採用無細胞之轉譯系統。關於蛋白質製備(包括抗體產生)之方法的其他資訊可見於例如美國專利公開案第2008/0187954號、美國專利第6,413,746號及第6,660,501號，及國際專利公開案第WO 2004/009823號中，其中之每一者特此以全文引用之方式併入本文中。
亦提供包含如本文所提供之聚核苷酸或載體的宿主細胞。可有利地採用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現本文提供之多肽次單元或六聚蛋白質。由於重組蛋白質一般正確摺疊、經適當修飾且具有完全功能，因此此類蛋白質可在哺乳動物細胞中表現。適合哺乳動物宿主細胞株之實例包括HEK-293及HEK-293T、Gluzman(Cell 23：175,1981)描述之COS-7猴腎細胞株及其他細胞株，包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、海拉(HeLa)及BHK細胞株。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件，諸如複製起點、連接至待表現基因之適合啟動子及強化子，及其他5'或3'側接非轉錄序列，及5'或3'未轉譯序列，諸如必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、拼接供體及受體位點及轉錄終止序列。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質的桿狀病毒系統由Luckow及Summers,BioTechnology 6：47(1988)綜述。
可使用標準實驗室技術進行如本文所提供之蛋白質，諸如GITRL融合多肽次單元，或六聚蛋白質(例如GITRL FP)之表現及純化。本文中論述或提及此類方法之實例。在表現之後，純化蛋白質具有許多用途，包括例如功能分析、抗體產生及診斷，以及下文描述之預防性及治療性用途。舉例而言，本文提供之多肽次單元或六聚蛋白質可用於產生醫藥組合物，包括適用於預防性及/或治療性投與之疫苗組合物。
如本文所提供之藉由經轉型宿主產生之GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)可根據任何適合之方法純化。此類標準方法包括層析(例如離子交換、親和性及篩分管柱層析法)、離心、差異溶解性或藉由用於蛋白質純化的任何其他標準技術。諸如六組胺酸、麥芽糖結合域、流感包膜序列及麩胱甘肽-S-轉移酶之親和性標籤可連接至蛋白質，以允許藉由通過適當親和性管柱而容易純化。經分離之蛋白質亦可使用諸如蛋白分解、核磁共振及x射線結晶學之技術進 行物理表徵。
舉例而言，來自分泌重組蛋白質至培養基中之系統的上清液可首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超過濾單元)濃縮。濃縮步驟之後，可將濃縮物施加於適合純化基質上。或者，可採用陰離子交換樹脂，例如具有側接二乙胺基乙基(DEAE)基團之基質或受質。基質可為丙烯醯胺、瓊脂糖、聚葡萄糖、纖維素或常用於蛋白質純化之其他類型。或者，可採用陽離子交換步驟。適合之陽離子交換劑包括包含磺丙基或羧甲基之各種不溶基質。最後，可採用一或多種使用疏水性RP-HPLC介質(例如具有側接甲基或其他脂族基之矽膠)的逆相高效液相層析(RP-HPLC)步驟來進一步純化B型流感/Yamagata病毒結合分子。亦可採用各種組合的一些或所有以上純化步驟以提供均質重組蛋白質。
可例如藉由自細胞集結粒進行初始提取，接著進行一或多個濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排外層析步驟來分離如本文所提供之在細菌培養物中產生之GITRL融合多肽次單元或六聚蛋白質(例如GITRL FP)。可採用高效液相層析(HPLC)進行最終純化步驟。在重組蛋白質表現中所採用之微生物細胞可藉由任何適宜方法，包括凍融循環、音波處理、機械破壞或使用細胞溶解劑來破壞。
醫藥組合物及投與方法
製備如本文所提供之六聚蛋白質(例如如本文所提供之GITRL FP)及向有需要之個體投與(例如以增強癌症患者中之免疫反應，例如以抑制或減少腫瘤生長)或向有病毒感染之患者投與(例如以減少病毒負荷或減少病毒感染復發)之方法為熟習此項技術者熟知或可容易地由熟習此項技術者確定。如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)之投與途徑可為例如經口、非經腸、藉由吸入或局部。如本文所用之術語非經腸包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、直腸或 陰道投與。雖然清楚地涵蓋所有此等投與形式作為適合之形式，投與形式之另一實例將為用於注射，特定言之用於靜脈內或動脈內注射或滴注之溶液。通常，適合之醫藥組合物可包含(但不限於)緩衝液(例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液)、界面活性劑(例如聚山梨醇酯)、穩定劑(例如人類白蛋白)等。在與本文中之教示相容之其他方法中，如本文所提供之六聚蛋白質(例如如本文所提供之GITRL FP)可直接傳遞至不利細胞群體之部位進而使患病組織曝露於治療劑增加。
本文所提供之某些醫藥組合物可以可接受劑型經口投與，包括例如膠囊、錠劑、水性懸浮液或溶液。某些醫藥組合物亦可藉由經鼻氣溶膠或吸入投與。此類組合物可使用苯甲醇或其他適合之防腐劑、增強生物可用性之吸收促進劑及/或其他習知溶解或分散劑在鹽水中製備成溶液。
如本文所提供之可與載劑材料組合以產生單一劑型之六聚蛋白質(例如GITRL FP)之量將視所治療之個體及特定投與模式而變化。組合物可以單次劑量、多次劑量投與，或以輸注方式經確定之時段投與。亦可調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療性或預防性反應)。
「治療有效劑量或量」或「有效量」意欲為如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)的量，當投與時其引起對於患待治療之疾病或病狀之患者之治療的陽性治療反應。
套組
本發明進一步提供包含如本文所提供之六聚蛋白質(例如本文中描述之GITRL FP)且可用以進行本文所描述之方法的套組。在某些實施例中，套組包含在一或多個容器中之至少一種經純化之如本文所提供的六聚蛋白質(例如GITRL FP)。熟習此項技術者將容易地認識到所揭示之如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)可容易地併入至此 項技術中熟知的已確立之套組形式中之一者中。
免疫分析
可藉由此項技術中已知之任何方法分析如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)的特異性及/或選擇性結合。僅舉幾例，可使用之免疫分析包括(但不限於)使用諸如西方墨點之技術的競爭性及非競爭性分析系統、放射免疫分析、ELISA(酶聯結免疫吸附分析)、螢光聚焦分析(FFA)、微量中和分析、血球凝集抑制分析(HAI)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射分析、螢光免疫分析。此類分析為常規的且在此項技術中熟知(參見例如Ausubel等人，編，(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)第1卷，其以全文引用的方式併入本文中)。FFA、微量中和分析及HAI將在以下實例中詳細地論述。
適用於測定如本文所提供之六聚蛋白質之結合特徵的方法及試劑在此項技術中已知及/或可商購。針對此類動力學分析所設計之設備及軟體可商購(例如BIAcore®、BIAevaluation®軟體，GE Healthcare；KINEXA®軟體，Sapidyne Instruments)。
免疫增強及治療之方法
可使用廣泛多種方法藉由在抗原活化期間或之後在抗原刺激之T細胞(例如抗原刺激之CD4+或CD8+ T細胞上接合GITR來實現個體(例如哺乳動物個體，諸如人類個體)之抗原特異性免疫反應之增強。所選方法將主要視需要增強針對其之免疫反應的抗原之類型而定，且下文論述可用之各種方法。無論選擇何方法，如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)可向個體(例如人類患者)投與使得在藉由抗原激活T細胞期間或之後不久其呈遞至個體之T細胞。使用OX40六聚蛋白質活化個體(例如人類個體)之免疫反應之例示性方法呈現在美國公開案 第2016/0024176號中，其以全文引用的方式併入本文中，且可適合於與本文提供之GITRL FP一起使用。
在某些態樣中，本發明提供一種促進抗原刺激之T細胞(例如抗原刺激之CD4+或CD8+ T細胞)之存活或增殖的方法，其包含使抗原刺激之T細胞(例如抗原刺激之CD4+或CD8+ T細胞)與如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)在六聚蛋白質可在T細胞(例如抗原刺激之CD4+或CD8+ T細胞)之表面上特異性結合至GITR的條件下接觸。在某些態樣中，接觸為活體外。在某些態樣中，接觸為活體內，例如經由向需要治療之個體投與有效劑量之六聚蛋白質。在某些態樣中，接觸可與T細胞活化(例如抗原活化)同時進行，在某些態樣中，接觸可在T細胞活化之後進行。
在其他態樣中，本發明提供促進自抗原刺激之T細胞(例如抗原刺激之CD4+或CD8+ T細胞)釋放細胞因子的方法，其包含使抗原刺激之T細胞(例如抗原刺激之CD4+或CD8+ T細胞)與如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)接觸，其中六聚蛋白質可在抗原刺激之T細胞(例如抗原刺激之CD4+或CD8+ T細胞)之表面上特異性結合至GITR。在某些態樣中，接觸為活體外。在某些態樣中，接觸為活體內，例如經由向需要治療之個體投與有效劑量之六聚蛋白質。在某些態樣中，接觸可與T細胞活化(例如抗原活化)同時進行，在某些態樣中接觸可在T細胞活化之後進行。在某些態樣中，細胞因子可為IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12 p70、IL-1β、GM-CSF或其任何組合。在某些態樣中，細胞因子為IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-4、IL-13、GM-CSF或其任何組合。
在某些態樣中，抗原刺激之T細胞(例如抗原刺激之CD4+或CD8+ T細胞)為人類CD4+或CD8+ T細胞、食蟹獼猴CD4+或CD8+ T細胞、恆河猴CD4+或CD8+ T細胞或其組合。
本發明進一步提供促進T細胞活化之方法，其包含使T細胞與如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL融合蛋白)接觸，其中六聚蛋白質可在T細胞之表面上特異性結合至GITR。在某些態樣中，接觸在抗原(例如腫瘤抗原)存在下進行。在某些態樣中，方法進一步包含經由GITRL FP之IgG-Fc域與表現FcγR之例如以下之細胞的相互作用使六聚GITRL融合蛋白交聯：B細胞、單核細胞、巨噬細胞、骨髓或漿細胞樣樹突狀細胞、濾泡樹突狀細胞、蘭格漢氏細胞(Langerhans cell)、內皮細胞、NK細胞、嗜中性白血球、嗜伊紅血球、血小板、肥大細胞、來自初級人類腫瘤或腫瘤引流或非引流淋巴結之CD45+細胞、來自其他次級或三級淋巴結構之CD45+細胞或其組合。在某些態樣中，T細胞活化可以NFκB信號轉導路徑之刺激之形式量測。在某些態樣中，促進T細胞活化之GITRL FP為GITRL IgG1 FP、GITRL IgG4 FP或其變異體。在某些態樣中，接觸為活體外。在某些態樣中，接觸為活體內，例如經由向需要治療之個體投與有效劑量之六聚蛋白質。
本文亦提供治療癌症之方法，其包含投與GITRL FP及OX40促效劑(例如OX40配位體融合蛋白或OX40促效劑抗體)。在小鼠腫瘤模型中投與GITRL FP及OX40配位體融合蛋白引起腫瘤體積減小及存活率增加。在某些態樣中，向呈現實體腫瘤之患者投與GITRL FP及OX40配位體融合蛋白(例如MEDI6383)。
用包括GITRL FP及OX40促效劑之癌症療法進行的有效治療包括例如在原發腫瘤部位或在一或多個轉移灶中降低癌症之進展速率、延遲或穩定腫瘤或轉移性生長、腫瘤縮小及/或腫瘤消退。在一些態樣中，腫瘤生長之減少或延遲可為統計顯著的。腫瘤生長降低可藉由與基線下患者腫瘤之生長、預期腫瘤生長、基於大型患者群體之預期腫瘤生長或對照群體之腫瘤生長比較來量測。在其他實施例中，本發明之方法增加存活率。
對投與包括GITRL FP及OX40促效劑之癌症療法之臨床反應可使用臨床醫師已知的診斷技術評估，包括(但不限於)磁共振成像(MRI)掃描、x放射線成像、電腦斷層攝影(CT)掃描、流式細胞測量術或螢光活化細胞分選儀(FACS)分析、組織學、大體病理學及血液化學，包括(但不限於)可藉由ELISA、RIA及層析偵測之變化。
本發明進一步提供治療個體之癌症或病毒感染之方法，其包含向需要治療之個體投與有效量之如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)或包含該六聚蛋白質之組合物或調配物。在某些態樣中，癌症為實體腫瘤。根據此方法，投與六聚蛋白質或組合物可抑制腫瘤生長；可促進腫瘤減小，或兩者。在某些態樣中，腫瘤生長抑制在T細胞存在下實現。
術語「癌症」、「腫瘤」、「癌性」及「惡性」係指或描述哺乳動物中通常以不受調控之細胞生長為特徵之生理病狀。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤，包括腺癌、淋巴瘤、母細胞瘤、黑色素瘤、肉瘤及白血病。此類癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、霍奇金氏(Hodgkin's)及非霍奇金氏淋巴瘤、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(諸如肝癌瘤及肝腫瘤)、膀胱癌、乳癌(包括激素介導之乳癌，參見例如Innes等人(2006)Br.J.Cancer 94：1057-1065)、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、骨髓瘤(諸如多發性骨髓瘤)、唾液腺癌、腎癌(諸如腎細胞癌及威耳姆士腫瘤(Wilms' tumor))、基底細胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睪丸癌、食道癌、血液癌(包括(但不限於)急性骨髓白血病(AML)及多發性骨髓瘤(MM))、各種類型之頭頸癌(包括(但不限於)鱗狀細胞癌)及黏液來源之癌症(諸如黏液性卵巢癌、膽管癌(肝臟)及腎乳頭狀癌)。在某些實施例中，血液癌選自由以下組成之群：霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性 淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病及慢性骨髓性白血病。
一些實施例係關於預防或治療有需要個體之癌症或病毒感染之方法，其包含向該個體投與有效量之如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)、包含六聚蛋白質的組合物或調配物、或如本文所描述之聚核苷酸、載體或宿主細胞。
亦提供治療有需要之個體之病毒感染的方法，其包含向該個體投與有效量之六聚蛋白質或包含該六聚蛋白質之組合物。在某些實施例中，病毒感染可為慢性或潛伏病毒感染。此類慢性病毒感染為以數週、數月或數年之病毒感染為特徵之病毒感染，其中發生病毒粒子增殖。此類潛伏病毒感染為以病毒粒子不增殖之時段為特徵的病毒感染。有需要之個體可在某些實施例中藉由進行診斷個體或獲自個體之樣品中病毒之存在的分析鑑定。在某些實施例中，治療可提供病毒負荷降低、病毒再活化減少、與該感染相關之症狀改善或其組合。在某些實施例中，病毒負荷、再活化或症狀之減少為與用安慰劑治療之對照個體相比。在前述方法中之任一者的某些實施例中，病毒感染係藉由選自由以下組成之群的病毒：人類免疫缺乏病毒(HIV)、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、麻疹、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus；EBV)、巨細胞病毒(CMV)、腺病毒(AdV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、單純疱疹病毒(HSV)、水痘-帶狀疱疹病毒(VZV)及其組合。
本發明之組合物可藉由任何適合之方法投與，例如非經腸、腦室內、經口、藉由吸入噴霧、局部、經直腸、經鼻、頰內、經陰道或經由植入式貯器。如本文所用之術語「非經腸」包括皮下、靜脈內、肌肉內、關節內、滑液內、胸骨內、鞘內、肝內、病灶內及顱內注射或輸注技術。
本發明進一步提供增強個體之免疫反應之方法，其包含向有需 要之個體投與治療有效量之如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)或包含該六聚蛋白質之組合物或調配物。
待治療之個體可為需要治療之任何動物，例如哺乳動物，在某些態樣中，個體為人類個體。
在其最簡單形式中，向個體投與之製劑為如本文所提供之六聚蛋白質，例如GITRL FP，其以習知劑型投與，且較佳與如本文中他處所描述之醫藥賦形劑、載劑或稀釋劑組合。
如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)可藉由如本文中他處所描述之任何適合之方法投與，例如經由靜脈內輸注。在某些態樣中，可將如本文所提供之六聚蛋白質(例如GITRL FP)引入腫瘤中或腫瘤細胞附近。
所有類型之腫瘤潛在地能夠藉由此方法治療，包括(但不限於)乳房癌、肺癌、胰臟癌、卵巢癌、腎癌、結腸癌及膀胱癌以及黑色素瘤、肉瘤及淋巴瘤。
T細胞激活劑
亦提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包含向個體投與有效量之六聚蛋白質或包含六聚蛋白質與T細胞激活劑之組合的組合物。在某些態樣中，T細胞激活劑為DNA疫苗加佐劑。在特定態樣中，此組合為例如E7合成長肽(SLP)及CpG寡脫氧核苷酸。在其他態樣中，T細胞激活劑為表觀遺傳修飾劑，例如5-氮雜-2'-脫氧胞苷，或組蛋白修飾劑，諸如HDAC抑制劑。在其他態樣中，T細胞激活劑為病毒，例如牛痘、李氏菌屬(Listeria)或新城雞瘟病毒(Newcastle Disease Virus)。
***
除非另外指示，否則本發明採用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉殖基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習知技 術，其在此項技術內。此類技術在文獻中充分解釋。參見例如Sambrook等人編(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人編(1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover編，(1985)DNA Cloning，第I卷及第II卷；Gait編(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller及Calos編(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人，編，Methods In Enzymology，第154卷及第155卷；Mayer及Walker，編(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir及Blackwell，編，(1986)Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；及Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,MD.)。
抗體工程改造之通用原理闡述在Borrebaeck編(1995)Antibody Engineering(第2版；Oxford Univ.Press)中。蛋白質工程改造之通用原理闡述在Rickwood等人編(1995)Protein Engineering,A Practical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)中。抗體及抗體-半抗原結合之通用原理闡述在：Nisonoff(1984)Molecular Immunology(第2版；Sinauer Associates,Sunderland,Mass.)；及Steward(1984)Antibodies,Their Structure and Function(Chapman and Hall,New York,N.Y.)中。另外，一般遵循此項技術中已知且不特定描述之免疫學標準方法，如在以下中：Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York；Stites等人，編(1994)Basic and Clinical Immunology(第8版；Appleton & Lange,Norwalk,Conn.)及Mishell及Shiigi(編)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and Co.,NY)。
闡述免疫學之通用原理之標準參考著作包括Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York；Klein(1982)J.,Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination(John Wiley & Sons,NY)；Kennett等人，編(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press,NY)；Campbell(1984)「Monoclonal Antibody Technology」,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Burden等人，編(Elsevier,Amsterdam)；Goldsby等人，編(2000)Kuby Immunology(第4版；H.Freemand & Co.)；Roitt等人(2001)Immunology(第6版；London：Mosby)；Abbas等人(2005)Cellular and Molecular Immunology(第5版；Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann及Dubel(2001)Antibody Engineering(Springer Verlag)；Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Lewin(2003)Genes VIII(Prentice Hall 2003)；Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Dieffenbach及Dveksler(2003)PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)。
上文所引述之所有參考文獻以及本文中所引述的所有參考文獻 均以全文引用的方式併入本文中。
以下實例係以說明而非限制之方式提供。
實例
實例1：GITRL IgG Fc融合蛋白之工程改造 鑑定可用於產生多聚人類GITRL-FP分子之適合人類三聚基元
產生人類六聚GITRL FP之工作最初集中於使用GCN4 pII三聚基元來穩定GITRL三聚體及形成六聚蛋白質。然而，此基元來源於酵母蛋白質且向人類投與含有非人類基元之GITRL FP可引起免疫原性。因此，產生含有來源於人類蛋白質之三聚基元的等效GITRL FP視為理想的。經由蛋白質資料庫(PDB；可經由網際網路經由全球資訊網網站「wwpdb.org」獲得)鑑定51種形成三聚捲曲螺旋基元(如藉由其三維晶體結構或直系同源物之結構展現))之蛋白質的胺基酸序列且選擇4個捲曲螺旋基元之子組以便併入GITRL FP分子中以用於經驗實驗測試。
方法
使用PyMol觀測圖形軟體分析冠蛋白-1A(PDB代碼：2akf)、基質素1(1aq5)、蘭格素(3kqg)及營養不良性肌強直激酶DMPK(PDB代碼：1wt6)捲曲-螺旋基元之三維晶體結構。
結果
在於蛋白質資料庫(PDB)中搜尋鑑定51個候選序列之三聚捲曲螺旋蛋白質序列之後，選擇四個序列用於產生多聚GITRL FP(表1-1)。此四個序列為來自人類蛋白質冠蛋白1a、基質素1、蘭格素及DMPK之捲曲螺旋序列。來自小鼠冠蛋白1a(PDB代碼：2akf)之捲曲螺旋基元之結構據報導在溶液中為穩定三聚體(Kammerer,R.A.等人PNAS,第102卷，第13891-13896頁(2005))。人類冠蛋白1a捲曲螺旋序列顯示與小鼠蛋白質之較高序列一致性(78.1%序列一致性)，因此預測此序列形成三聚捲曲螺旋結構。類似地，來自雞基質素1(PDB代碼：1aq5)之捲曲螺旋基元之結構據報導為三聚體(Dames,S.A.等人NAT.STRUCT.BIOL.5：687-691(1998)；PDB代碼：1aq5)。基於其與雞直系同源物之較高序列一致性(60.0%序列一致性)，預測人類基質素1捲 曲螺旋序列形成三聚捲曲螺旋結構。人類蘭格素(PDB代碼：3kqg)及人類DMPK(PDB代碼：1wt6)捲曲螺旋序列亦據報導為三聚的(Feinberg,H.等人，J.BIOL.CHEM.285：13285-13293(2010))且經選擇用於產生多聚人類GITRL融合蛋白。
為提供用於GITRL融合蛋白之其他捲曲螺旋序列，產生來自人類冠蛋白-1A、基質素-1、蘭格素及DMPK之野生型捲曲螺旋序列之變異體。為了產生此等變異序列，使用ProCoil演算法(可經由網際網路經由全球資訊網網站「bioinf.jku.at/software/procoil/」獲得)之線上實施。此演算法預測給定序列形成二聚及三聚捲曲螺旋結構之機率。預測上文所提及之野生型捲曲螺旋序列之數種變異體與野生型序列相比，對於形成三聚體具有較高機率分數。具有成為三聚體之最高機率的變異序列經選擇用於產生六聚GITRL FP。
經選擇用於所有以上四種人類蛋白質之變異捲曲螺旋序列顯示在表1-1中。
用以將三聚基元排序之電子雜交分析
藉由用演算法(LOGICOIL)分析表1-1中之序列來進行將產生更穩定GITRL三聚體，且因此更穩定多聚GITRL FP之基元之電子雜交預測以預測其寡聚狀態。此外，經由兩種演算法(MARCOIL及 LOGICOIL)之組合將關於平行三聚體之形成所獲得之分數與自整個人類蛋白質組鑑定之捲曲螺旋的分數相比較。
方法
對自ftp網站「ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/H_sapiens/mRNA_Prot/human.protein.faa.gz」下載之人類蛋白質組執行全基因組預測。此版本包括71861個蛋白質序列之總數。掃描此等序列且藉由執行自全球資訊網網站「bcf.isb-sib.ch/Delorenzi/Marcoil/Marcoilcode.tar.gz」下載之軟體MARCOIL來鑑定捲曲螺旋基元。使用自網際網路經由全球資訊網網站「coiledcoils.chm.bris.ac.uk/LOGICOIL/LOGICOIL_Source.zip」下載之LOGICOIL演算法進一步分析通過某些特定臨限值(亦即0.01、0.10、0.50、0.90及0.99)之所有基元以預測捲曲螺旋序列之寡聚狀態(平行或反向平行二聚體、三聚體或四聚體)。此套件以R語言實施(版本3.0.2-2013-09-25)。開發特用perl指令碼將來自MARCOIL之輸出轉換成LOGICOIL預期之檔案格式。直方圖使用晶格套件(版本0.20-23)以R繪製。
結果
對來自Refseq之所有人類序列中的捲曲螺旋基元進行預測(使用MARCOIL)。針對不同臨限值藉由MARCOIL演算法預測之捲曲螺旋基元之數目顯示在表1-2中。0.99臨限值之所有基元之寡聚狀態隨後使用LOGICOIL，與八個所選三聚捲曲螺旋域一起在表1-2中預測。
此研究中使用之基元之此等分數及排序之分佈顯示在表1-3中。
產生含有不同人類三聚基元之GITRL FP變異體
除GCN4 pII序列以外，將所選三聚基元中之每一者之序列以合適構型選殖至DNA載體中，該等DNA載體編碼GITRL FP之其他元件，即在人類Fc域與人類GITRL之細胞外域之間，其藉由短可撓性胺基酸連接子序列分離。此等載體用於短暫轉染哺乳動物細胞，允許重組六聚GITRL FP蛋白質之分泌及隨後純化。
方法
懸浮CHO細胞使用PEI用編碼不同六聚GITRL FP之DNA載體短暫轉染且在37℃下生長八天，在140rpm下在80%濕度下震盪。藉由在1,600 x g下離心及過濾自細胞及細胞碎片分離四十毫升含有分泌蛋白質之改良性培養基。使用Mab SelectSureTM樹脂純化蛋白質且藉由還原性SDS-PAGE分析其尺寸及完整性。
隨後對六聚GITRL FP(冠蛋白1a wt)及六聚GITRL FP(基質素1wt)採用大規模表現及兩步純化方案。此處，使較大體積之改良性CHO(400ml)經受蛋白質G層析接著尺寸排外層析步驟(S200 16/60)。此等純化蛋白質用於SEC-MALLS分析。
結果
所有重組六聚GITRL FP蛋白質在類似水準下表現，但含有冠蛋白1a wt基元之六聚GITRL-FP似乎提供比其他蛋白質高之產率(表1-4：圖1)。
含有不同人類三聚基元之GITRL FP變異體之表徵 GITRL FP變異體與表現GITR之細胞之結合
為了判定六聚GITRL FP分子是否可結合至細胞表面表現之GITR，將其與過度表現GITR之細胞一起培育且經由其Fc域偵測其結合。
方法
在兩個重複孔中將固定濃度之DyLight-649結合抗人類IgG抗體緩衝液，接著2倍稀釋度之上文在章節1.3中所描述之純化六聚GITRL FP蛋白質及同型對照抗體(NIP228)添加至384孔黑色壁澄清底盤中。向所有孔中添加穩定表現GITR之CHO細胞且在室溫下培育盤四小時。使用MirrorballTM盤細胞計數器用640nm雷射測定與CHO-GITR細胞之結合，且量測螢光。
結果
結果呈現在圖2A-D中。獲得之結合概況展現「鉤狀效應(hook effect)」，其在六聚GITRL FP之濃度超過DyLight-649結合偵測抗體之濃度時觀測到，使得在較高濃度之六聚GITRL FP下偵測到較少結合；因此產生鐘形結合概況。儘管此現象，不同六聚GITRL FP分子產生極類似結合概況。
GITRL FP變異體與重組三聚配位體對結合至GITR的競爭
使用均相時差式螢光(HTRF)分析確定六聚GITRL FP分子對結合至人類GITR之人類GITRL之效果。
方法
將六聚GITRL FP分子滴定至量測GITRL HA(血球凝集素標籤)與GITR-Fc之結合的HTRF分析中。將人類GITR Fc與銪穴狀化合物結合且將與XL665結合之抗HA抗體用於偵測GITRL-HA蛋白質。藉由用Prism 5.01軟體(GraphPad)將分析資料曲線擬合至四參數對數方程式來測定IC50值。
結果
結果呈現在圖3A-D及表1-5中。具有不同三聚基元之六聚GITRL FP分子均為結合至GITR-Fc之三聚GITRL-HA的有效抑制劑。除與GITRL FP(GCN4)相比展現8倍較低效能之GITRL FP(蘭格素wt)之外，大部分GITRL FP變異體產生類似抑制概況及IC50值。在0.61nM下GITRL FP(冠蛋白1a)具有最低IC50值。
報導子分析中GITRL FP變異體之活性
在使用穩定表現GITR之NFκB-螢光素酶報導細胞的分析中測定不同GITRL FP分子(六聚GITRL IgG1 FP(SEQ ID NO：6)及六聚GITRL IgG4 FP(SEQ ID NO：40))之功能活性。量測發光，其藉由GITR之促效作用及NFκB路徑之隨後活化驅動。
方法
針對六點資料曲線將GITRL FP蛋白質4倍連續稀釋且一式三份地添加至96孔盤。隨後向分析盤之所有孔中添加用人類GITR轉染之傑卡特NF-κB螢光素酶報導細胞且在37℃下培育三小時。藉由向分析盤之所有孔中添加Steady-Glo試劑來偵測螢光素酶表現。在室溫下培育盤五分鐘且隨後量測發光且使用log(促效劑)對反應可變斜率非線性曲線擬合在GraphPad Prism 5.01(GraphPad)中產生EC50值。
結果
結果呈現在圖4A-D及表1-6中。所有六聚GITRL FP蛋白質觸發NF-κB信號傳導。蛋白質產生與GITRL FP(GCN4)類似之效能概況及EC50值。
表1-6：使用人類GITR轉染NF-κB螢光素酶基因報導細胞株的GITRL
GITRL FP變異體之熔融溫度
使用發光特性在未摺疊蛋白質存在下改變之螢光染料(Sypro Orange)測定GITRL FP蛋白質之熔融溫度。
方法
使用基於Sypro Orange之分析評估多聚GITRL FP變異體之熱穩定性以計算熔融溫度(Tm)。將不同蛋白質首先在2×PBS中稀釋至0.5mg/mL，隨後分配至96孔PCR盤中。在盤上向各孔中添加Sypro OrangeTM，隨後密封盤。在Real-TimeTM PCR機器上使用Chromo4TM連續螢光偵測器讀取盤。將溫度設定成自20℃增加至90℃，伴隨每1℃讀取一次及1s之保持時間。藉由隨溫度而變繪製螢光強度及螢光衍生物來測定去摺疊轉變。一式兩份分析各多聚GITRL-FP蛋白質。
結果
結果呈現在圖5A-D中。九種多聚GITRL-FP蛋白質中之每一者之熔融溫度概述在以下表1-7中。除GITRL FP(DMPK wt)之外，所有變異體具有類似概況，GITRL FP(DMPK wt)與大部分其他變異體GITRL FP(蘭格素wt)及GITRL FP(蘭格素變異體)之62-64℃相比，其展示在 59℃下之單一轉變峰，GITRL FP(蘭格素wt)及GITRL FP(蘭格素變異體)兩者均展示在低溫(45-50℃)下之另一轉變峰，表明一些結構不穩定性。
GITRL FP變異體之電子雜交免疫原性分析
使用ProPred演算法確定8個捲曲螺旋域及其周圍序列之預測免疫原性。
方法
使用ProPred[Singh及Raghava(2001)Bioinformatics 17(12)]，評估八個所選人類三聚基元及酵母GCN4 pII之T分數。任意胺基酸序列之T-分數將相對於胺基酸序列之總長度，強結合MHC II類抗原決定基之數目量化。若ProPred返回比藉由評估一組10,000個無規產生之九聚體序列獲得的分數之95百分位高的結合分數，則九聚體子序列視為強結合抗原決定基。對於八個最常見人類對偶基因，計算各基元之T-分數，包括基元前的2x[G4S]序列及基元後的[G4]序列及GITRL域之前4個胺基酸。總體T-分數隨後形成為個別對偶基因T-分數之總和。
結果
各三聚基元及其周圍序列之總體T分數顯示在表1-8中。注意最大分數等於八，其對應於對於測試之所有八個對偶基因，序列中之各九聚體為強結合抗原決定基之情況。引起關注地，此整體分析預測除DMPK wt以外，幾乎所有候選物具有與GCN4相比略微較強之免疫原性概況。基質素wt及變異體兩者均具有最高總體T分數。
GITRL FP變異體之SEC-MALLS分析 方法
在BioSep-Sec-STM 4000上分析蛋白質(空隙體積，V0=5.7ml)且所有操作在0.5ml/min之流動速率下進行30分鐘。用UV280、折射率及多角度雷射光散射偵測器監測溶離。將樣品(在1-2mg/ml下)裝載在管柱上且隨後計算莫耳質量及粒子直徑。
結果 多聚GITRL FP(基質素1wt)
具有基質素-1三聚基元之GITRL FP在凝膠-過濾管柱上產生三個不同峰：峰2具有與糖基化六聚體之預期莫耳質量一致的312kDa之重量平均莫耳質量且構成總蛋白質質量之40.9%，而峰1具有與六聚體之二聚體對應之重量平均莫耳質量(約610kDa)且構成注射之總質量之41.3%。峰3具有比預期低之質量(約215kDa)，其可歸因於來自六聚體之二聚體之片段化或損失。其構成總蛋白質質量之17.7%。此蛋白 質製劑之組成因此為非均質的，無單一主要寡聚物質。
多聚GITRL FP(冠蛋白1a wt)
UV280、折射率及900-雷射散射跡線之疊加之分析顯示93.9%此蛋白質在16.4min時以300kDa之單分散物質形式溶離。此質量觀測值與六聚GITRL FP多肽之預測質量(274.95kDa)一致。質量計算值與觀測值之間的25kDa之差最可能由糖基化引起。14.7min之次峰具有690kDa之重量平均莫耳質量，此可歸因於六聚體之二聚體。
多聚GITRL FP(GCN4 pII)
類似地，具有GCN4 pII三聚基元之GITRL FP之雷射散射及折射率層析圖之分析展現93.75%此蛋白質以與糖基化六聚體一致，330kDa之單分散物質形式溶離。在15分鐘時溶離之峰僅含有6.25%總蛋白質且具有大約700kDa之重量平均莫耳質量，此很可能反映存在六聚體之二聚體。
莫耳質量對時間曲線
圖6顯示三種多聚GITRL FP蛋白質中之每一者之溶離峰之莫耳質量組成。對於所有三種蛋白質，跨越具有約15分鐘滯留時間之早期峰的莫耳質量高度可變，尤其在GITRL FP(基質素1wt)的情況下，其中在同一峰開始及結束時溶離之分子之質量相差多於100kDa。在約17分鐘時溶離之峰之分子組成較均質，GITRL FP(冠蛋白1a wt)之最大莫耳質量變化小於20kDa。重量平均莫耳質量之變化最可能由在同一峰內溶離之糖蛋白之聚糖含量之差所引起。
表徵資料之概述
在分析如比較多聚GITRL FP中之各種捲曲螺旋三聚域之效能的表1-9中所示之編譯資料中，冠蛋白1a捲曲螺旋域提供改良之表現量。然而，冠蛋白-1a捲曲螺旋基元與來自人類序列之分類為三聚捲曲螺旋之基元的預測分數之比較顯示冠蛋白-1a wt之LOGICOIL排序 為5。
實例2：GITRL融合蛋白之產生及表徵、其表徵及小鼠GITRL融合蛋白之表徵 衍生及組成
構築包含具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的單體次單元之六聚GITRL IgG1融合蛋白。SEQ ID NO：6之各GITRL IgG1 FP單體次單元包含3個不同域：1)人類IgG1 Fc域；2)來源於人類冠蛋白1A蛋白質之α螺旋形捲曲螺旋三聚域及3)人類GITRL ECD，在人類GITRL ECD中有消除唯一佔據之糖基化位點的單點突變(N161D)。各域藉由可撓性甘胺酸及富含絲胺酸或富含甘胺酸，例如(Gly)4連接子(圖8)分離。各單體中之人類GITRL ECD域與兩種其他單體在溶液中形成弱非共價三聚體，且此締合經由產生穩定三聚結構之人類冠蛋白1A三聚域之間的相互作用加強。各三聚體中存在之IgG1 Fc域之相互作用致使隨後形成GITRL三聚體之二聚體，產生最終六聚構形。
使用標準分子生物學技術合成SEQ ID NO：7中闡述之編碼具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的前驅體GITRL IgG1 FP多肽次單元的DNA分子且選殖至允許高效短暫重組蛋白表現之表現載體中。
核苷酸及SEQ ID NO：6中闡述之GITRL IgG1 FP多肽次單元之次單元單體之推斷胺基酸序列顯示在圖8中。
重組蛋白之表現及純化
將在wavebag生物反應器中在與CD-CHOTM(Life Technologies Ltd,Paisley,UK)類似的化學成分確定之培養基中在懸浮液中生長之CHO細胞用編碼不同六聚GITRL FP之DNA載體轉染。使用與CHO CD-Efficient Feed A TM(Life Technologies Ltd,Paisley,UK)類似之營養饋料將培養物維持為分批饋料持續10-12天，此時使用過濾收集其以用於細胞移除。隨後在純化之前冷凍改良性培養基。
使用MabSelectSureTM樹脂自改良性培養基純化蛋白質。中和溶離峰且在進一步純化之前在羥基磷灰石1型樹脂上過濾。用鹽梯度進行溶離。在整個過程中藉由SEC HPLC監測純度。
GITRL IgG1 FP多肽次單元之糖基化分析
使用液相層析與四極飛行時間(QTOF)質譜之組合(LC-QTOF MS)及肽圖譜與質譜測定SEQ ID NO：6之GITRL IgG1 FP多肽次單元之糖基化狀態。結果顯示在圖9中。
藉由還原多肽次單元之LC-QTOF MS分析獲得之SEQ ID NO：6之GITRL IgG1 FP多肽次單元之準確質量與每個鏈添加一個雙觸角聚糖(主要為G0f)之預期胺基酸序列一致。質量概況與如藉由肽圖譜確認，在SEQ ID NO：6之GITRL IgG1 FP多肽次單元之GITRL ECD中之N129(融合蛋白中之N369)處無N-聚糖佔據的Fc域糖基化一致。此等資料亦確認GITRL ECD中之N161D突變(融合蛋白中之N401)產生去糖基化GITRL ECD，N-糖基化僅存在於Fc域中之典型糖基化位點處。
六聚GITRL IgG1 FP之活體外表徵 六聚GITRL IgG1 FP對配位體-受體結合之效果
使用均相時差式螢光(HTRF)分析確定具有SEQ ID NO：6之單體 GITRL IgG1 FP次單元序列的六聚GITRL IgG1 FP對結合至人類GITR之人類GITRL之效果。將GITRL IgG1 FP滴定至量測GITRL-HA(血球凝集素標籤)與GITR-Fc之結合的HTRF分析中。將人類GITR-Fc與銪穴狀化合物結合且將與XL665結合之抗HA抗體用於偵測GITRL-HA蛋白質。藉由用Prism 6.0x軟體(Graphpad)將分析資料曲線擬合至四參數對數方程式來測定IC50值。圖10中顯示之代表性結果展現GITRL IgG1 FP以0.562nM之IC50抑制GITRL-HA與GITR之結合。在同型對照抗體NIP228之情況下未觀測到抑制。
GITR促效作用
此實驗之目的為確定GITRL融合蛋白(FP)經由GITR受體傳遞信號之能力。
方法
將呈溶液之六聚GITRL FP添加至用hGITR及與核因子κB(NFκB)啟動子連接之螢光素酶報導基因轉染之傑卡特細胞。在此分析中，GITR受體之活化引起經由NFκB路徑信號傳導，其又引起可經由發光量測之螢光素酶活性增加。
結果
將六聚GITRL FP添加至分析系統引起發光增加。觀測到之效果為濃度依賴性，EC50為大約180pM。相比之下，添加同型對照抗體無效果。結果顯示在圖11中。此等資料展現六聚GITRL FP為GITR受體之有效促效劑。
初級T細胞活化
進行此實驗以評估由六聚GITRL FP介導之GITR促效作用對人類T細胞之增殖及功能之影響。
方法
自健康人類血液分離總人類T細胞且藉由在盤結合抗CD3存在下 培養4天來進行抗原刺激以便上調GITR之表現。藉由僅在培養基中培養來將抗原刺激細胞靜置2天，隨後用次佳濃度之抗CD3及抗CD28在六聚GITRL FP存在下再刺激。藉由歷經18小時時段將進入細胞中之胸苷併入定量來評估細胞增殖。使用meso scale discovery將干擾素γ(IFN-γ)之釋放定量。
結果
抗CD3連同抗CD28之添加引起最低水準之增殖及最少IFN-γ釋放。盤結合六聚GITRL FP連同盤結合抗CD3及抗CD28之添加引起增殖水準以及IFN-γ釋放之濃度依賴性增加。代表性資料顯示在圖12及圖13中。同型對照抗體對增殖或細胞因子釋放無效果。
ADCC
小鼠六聚GITRL IgG1 FP在活體內顯示去除瘤內CD4陽性T細胞，包括FOXP3陽性調節性T細胞，造成腫瘤內CD8+與CD4+ T細胞之比增加。進行此實驗以確定六聚GITRL FP經由ADCC介導人類T細胞去除之能力及評估存活細胞群體中CD8：CD4比率之所得變化。
方法
將健康人類血液分離之初級人類T細胞用植物血球凝集素(PHA)及IL-2進行抗原刺激以上調GITR表現。其隨後用螢光染料標記且與初級NK細胞在指示比率下連同六聚GITRL FP在指示濃度下培育24小時。使用流式細胞測量術定量分析結束時存在之活T細胞之百分比，且用此計算經處理孔相對於未處理孔之溶解百分比。亦藉由流式細胞測量術定量CD4及CD8細胞之比例。
結果
僅NK細胞介導初級T細胞之少量溶解，此藉由添加包含SEQ ID NO：6中所示之含有IgG1 Fc域之GITRL融合多肽次單元的六聚GITRL FP以濃度依賴性方式顯著增強。使用包含SEQ ID NO：40之含有不能 結合NK細胞上Fcγ受體之IgG4 Fc域之GITRL融合多肽次單元的六聚GITRL FP作為陰性對照，且其對量測之溶解量無影響(圖14)。
分析結束時存在之CD4+及CD8+ T細胞百分比之流動式細胞量測分析指示六聚GITRL FP介導之ADCC有利於產生增加之CD8：CD4 T細胞比率(圖15)。
調節性T細胞分析
GITR以增加量表現於調節性T細胞(T-reg)上，且已表明經由GITR之信號傳導影響T-reg抑制其他T細胞之能力。進行此實驗以評估六聚GITRL FP對T-reg功能之影響。
方法
自健康人類供體之末梢血液分離CD4+ CD25-效應T細胞及CD4+ CD25+ T-reg。效應T細胞用CFSE標記，隨後在抗CD3抗體、抗CD28抗體、所示比率之T-reg以及測試物品存在下培養。藉由流式細胞測量術分析效應T細胞增殖之百分比。
結果
觀測效應T細胞對於抗CD3及抗CD28之添加反應的增殖。添加增加數目之T-reg造成分析期間分裂之效應T細胞之百分比減少。盤結合同型對照之添加進一步降低分裂細胞之百分比，而盤結合六聚GITRL FP之添加將分裂細胞之百分比恢復至T-reg不存在下所觀測到之百分比。結果顯示在圖16中。
此研究證明六聚GITRL FP克服調節性T細胞介導之抑制其他T細胞效果的能力。
活體內生物/功能活性之測試 同型依賴性抗腫瘤活性
因為人類GITRL不與小鼠GITR交叉反應，所以人類GITRL FP無法在具有免疫能力的癌症小鼠模型中測試。為了能夠進行此測試，產 生替代小鼠mGITRL IgG1 FP及mGITRL IgG2a FP。進行此研究以便評估mGITRL FP在癌症CT26模型中之抗腫瘤活性，及確定Fc同型對此活性之量值之影響。
方法
Balb/c小鼠植入有CT26小鼠結腸直腸癌細胞株。在植入之後第6天，藉由腹膜內(i.p.)注射一次或每日持續17天來向動物投與mGITRL FP。測試兩種不同形式之mGITRL FP；一個含有mIgG2a Fc域且另一個含有mIgG1 Fc域。測試兩種不同劑量之各mGITRL FP；5mg/kg及10mg/kg。鹽水處理用作陰性對照。
結果
鹽水處理組中之中值存活率為22天且直至研究結束時此組中之小鼠中無一者存活。用10mg/kg下之mGITRL FP處理將中值存活率延長至32天且在研究結束時引起50%存活率。在用5mg/kg下之mGITRL FP處理之組中，在研究結束時10隻小鼠中之9隻存活且中值存活時間不可定義。用5或10mg/kg下之mGITRL FP mIgG1處理分別將中值存活率延長至28及22.5天且使得10隻小鼠中之2隻存活直至研究結束。結果呈現在圖17中。
此研究展現mGITRL FP介導抗腫瘤活性之潛能且指示FP之同型可影響觀測到之抗腫瘤活性之水準。
藥效學效果
進行此研究以確定mGITRL FP對活化狀態之影響及腫瘤攜帶小鼠之脾及腫瘤中T細胞之比例。
方法
如所指示藉由腹膜內注射用0.2或1mg/kg下之mGITRL FP處理7-9週齡之CT26腫瘤攜帶Balb/c雌性小鼠。鹽水處理用作陰性對照。在開始處理之後7天殺死小鼠且使用流式細胞測量術評估脾及腫瘤中之細 胞之頻率及表型。
結果
用mGITRL FP處理引起脾中所有T細胞子組中增殖標記物Ki67之表現增加，表明此等細胞之增殖增加。參見圖18。
用mGITRL FP處理引起脾中所有T細胞子組中活化標記物ICOS之表現增加，表明此等細胞之活化增加。參見圖19。
用mGITRL FP處理引起腫瘤內CD4+ FOXP3+調節性T細胞及CD4+ FOXP3-輔助細胞之頻率降低，但未改變CD8+細胞毒性T細胞之頻率。總體結果為腫瘤微環境內之CD8：CD4比率增加。參見圖20。
方法 細胞株及試劑
自ATCC(目錄號CRL 6475，Manassas，VA)獲得TC-1腫瘤株且維持在DMEM+10% FBS+1%青黴素/鏈黴素中。自ATCC(Manassas，VA)獲得CT26腫瘤株且維持在補充有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中。自Bio X Cell(West Lebanon，NH)購買DTA-1及同型抗體。
腫瘤模型
TC-1實驗使用自傑克遜實驗室(Jackson Labs)(Bar Harbor，ME)獲得之雌性C57BL/6小鼠(目錄號000664)。CT26實驗使用自Envigo(Frederick，MD)獲得之雌性Balb/C小鼠。在腫瘤植入時小鼠在6及8週齡之間。所有動物實驗均根據由機構動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)確定之準則進行。對於TC-1腫瘤植入，將2×104個活TC-1細胞皮下植入至左後腳掌中。對於CT26腫瘤植入，將5×105個細胞植入在右側腹中。藉由用測徑規1直接量測來評估腫瘤生長。每2-4天收集雙向量測值，且使用體積=(長度．寬度2)/2計算腫瘤體積。使腫瘤發展6-14天且隨後依據腫瘤體積將腫瘤攜帶小鼠隨機分配至處理組。根據IACUC方案當對於TC-1/ 腳掌原發腫瘤超過1000mm3且對於CT26/側腹超過2000mm3時使小鼠安樂死。對於PD研究，使小鼠安樂死且收集腫瘤及脾，經由70uM過濾器(Corning，Corning，NY)壓碎，且處理成單細胞懸浮液。
功能性T細胞反應及流式細胞測量術
對於抗原特異性刺激，每孔用1ug AH1肽序列SPSYVYHQF(SEQ ID NO：56)(Anaspec，Fremont，CA)塗覆1-2×106個活細胞。對於所有染色，染色之次序為live/dead blue(Life Tech)、細胞外蛋白質、FOXP3 Fix/Perm套組(Ebioscience)及接著細胞內細胞因子。抗體包括GITR(純系DTA-1)。所有樣品在LSR-II或Fortessa(BD San Jose，CA)上操作。使用FlowJo(Treestar，Ashland，OR)分析所有資料。
結果 mGITRL-FP為高度有效GITR促效劑且此引起CT26腫瘤之排斥反應
先前已顯示GITR促效作用在引起Bablc小鼠中之CT26腫瘤之消退及消除方面有效。Balb/c小鼠植入有CT26腫瘤細胞且在6天之後依據腫瘤體積隨機分配(群組n=10)且用mGITRL-FP IgG2a之單次投與或重複投與(Q2D×9)處理。劑量範圍為5毫克/公斤體重下至0.04毫克/公斤體重。對於單次投與，直至第30天下至1mg/kg mGITRL-FP之劑量消除除一個CT26小鼠腫瘤外之所有者(圖40B)。最低劑量在0.2mg/kg組中產生3次消除且在0.1mg/kg組中產生2次消除。添加mGITRL-FP之額外投與增加功效且除0.04mg/kg之最低劑量組外所有均發現100%消除率(圖40C)。最低重複投與組發現4次消除。
為了評估mGITRL-FP功能，將其與已知單株GITR促效劑DTA-1相比較。先前已描述每隻小鼠使用在100μg至500μg範圍內之劑量。各小鼠估計為大致20公克，因此劑量範圍為5mg/kg至25mg/kg。Balb/c小鼠植入有CT26腫瘤細胞且在10天之後依據腫瘤體積隨機分配(群組n=10)且隨後用1mg/kg下之mGITRL-FP IgG2a或5mg/kg或25 mg/kg下之DTA-1之單次投與處理(圖40D)。
增加DTA-1之劑量增加功效，然而1mg/kg之mGITRL-FP顯示與5mg/kg下之DTA-1類似之功效及腫瘤生長動力學。為了判定CD8 T細胞是否為吾人之藥物效果所必需，評估相同組但使用單株去除抗體選擇性去除CD8 T細胞(圖40E)。在無CD8 T細胞的情況下，DTA-1或mGITRL-FP完全消除CT26腫瘤之能力顯著減弱。僅1-2隻來自各組之小鼠無腫瘤存活。
另外，在無CD8 T細胞的情況下，在增加中值總體存活率方面與DTA-1相比mGITRL-FP較不有效(圖40F)。為了理解mGITRL-FP如何與CD8相互作用，評估GITR在個別淋巴群體上之表現。與CD8 T細胞相比CD4+ Treg表現較高量之GITR；然而，腫瘤中之Treg及CD8 T細胞與其在脾中之各別群體相比均表現較高量之GITR(圖40G)。
mGITRL-FP去除Treg且增加腫瘤抗原特異性T細胞
先前已顯示GITR促效劑減少Treg以及增加較高親合力T細胞反應。為了理解GITRL-FP能夠介導何種藥效學效果，在腫瘤消退期間評估CT26模型。用mGITRL-FP IgG2a處理有CT26之Balb/c小鼠且在開始給藥之後8天，收集脾及腫瘤。包括兩個研究組，TGI(腫瘤生長抑制)組(n=5)及PD(藥效學)組(n=5)。除用mGITRL-FP處理之單隻小鼠外之所有者之CT26均治癒(圖41A)。在第18天，殺死PD組且評估存在於脾及腫瘤中之免疫細胞之表型。隨後藉由用CT26免疫顯性抗原決定基AH1再刺激來評估CD8 T細胞功能。mGITRL-FP顯著減少脾及腫瘤中之Treg之數目(圖41B)。雖然mGITRL-FP未改變CD8之百分比，其顯著增加對AH1具有抗原特異性之CD8之數目(圖41C-D)。在脾中，5-10%之總CD8具有抗原特異性且能夠產生IFNγ及TNFα。在腫瘤中，該數目為5-15%。此為腫瘤浸潤性淋巴細胞以及周邊儲存庫之顯著擴增。為了評估mGITRL-FP是否已結合至CD4 Treg及CD8 T細胞兩 者，使用DTA-1抗體將GITR染色(圖41 E-F)。Treg顯示GITR MFI(平均螢光強度)之多於75%降低。在CD8 T細胞上觀測到此相同效果，顯示mGITRL-FP在CD8 T細胞上改變DTA-1結合。基於此資料，假設T細胞將顯示增加之KI-67增殖。在處理之後8天進行評估之後，在腫瘤及脾中CD4及CD8 T細胞均顯示顯著更多之KI-67陽性細胞(圖41G-H)。
mGITRL-FP以劑量依賴性方式擴增抗原特異性CD8 T細胞
隨後研究CT26得到治癒之小鼠是否免受同一腫瘤之再攻擊。為了評估此，再攻擊來自用單次劑量之1.0、0.5或0.2mg/kg mGITRL-FP IgG2a處理之組的治癒小鼠(圖42A)。顯示所有自初始劑量向下之小鼠，但僅再攻擊在第85天治癒之小鼠。CT26最初得到治癒之所有小鼠免受該腫瘤之再攻擊，但在最低給藥組中，量測到較小質量但快速消除。為了進一步查詢此結果，在第120天殺死小鼠，將脾細胞抽樣，且用AH1肽再刺激。存在AH1特異性T細胞之數目之劑量依賴性增加(圖42 B-C)。在1mg/kg mGITRL-FP組中，25%之脾CD8 T細胞對CT26之單一抗原決定基具有特異性。在再攻擊期間此等小鼠不顯示尺寸增加。最低劑量0.2mg/kg具有6%抗原特異性CD8且顯示在再攻擊後之較小生長質量，其在第120天清除。
六聚GITRL IgG1 FP對人類GITR之結合親和力
使用動力學排除分析(KinExA)使用KinExA 3200儀器(Sapidyne Instruments，BoiseIdaho)測定包含SEQ ID NO：6之GITRL IgG1 FP單體次單元的六聚GITRL IgG1 FP對重組人類GITR之溶液KD(解離常數)。
將六聚GITRL IgG1 FP於D-PBS、0.02%鈉及1mg mL-1牛血清白蛋白緩衝液中之2nM溶液用重組人類GITR滴定且在25℃下平衡隔夜。將樣品轉移至溫度控制在25℃下之KinExA 3200儀器。使用已用 最低限度地經胺生物素標記之人類GITR滴定的吖內酯珠粒結合抗生蛋白鏈菌素實現平衡混合物之取樣。使用之二級偵測試劑為Fc特異性試劑DyLight 650標記之蛋白質G'(可購自Sigma之蛋白質G之片段)。使用KinExAPro軟體(版本3.6.8.)處理及解譯資料。對於六聚GITRL IgG1 FP與人類GITR之結合，獲得82nM之KD。
藉由KinExA之六聚GITRL IgG1 FP與重組食蟹獼猴GITR之結合
使用KinExA以與關於人類GITR在章節6.1中所描述相同之方式測定包含SEQ ID NO：6之GITRL IgG1 FP單體次單元的六聚GITRL IgG1 FP對重組獼猴GITR之溶液KD。對於六聚GITRL IgG1 FP與食蟹獼猴GITR之結合獲得107nM之KD。
藉由ELISA之六聚GITRL IgG1 FP與重組食蟹獼猴GITR之結合
使用ELISA測定包含SEQ ID NO：6之GITRL IgG1 FP單體次單元的六聚GITRL IgG1 FP對食蟹獼猴GITR之交叉反應性。六聚GITRL IgG1 FP經生物素標記且使用抗生蛋白鏈菌素-HRP及TMB受質偵測與固定食蟹獼猴GITR-Fc之結合。圖21顯示六聚GITRL IgG1 FP與食蟹獼猴GITR之結合極類似於人類GITR，且未觀測到與陰性對照CD137-Fc蛋白質之結合。
實例3：靜脈內GITRL IgG1 FP處理在食蟹獼猴中之活體內藥效學效果
為了測定食蟹獼猴中六聚GITRL IgG1融合蛋白(FP)之藥效學參數，藉由靜脈內(IV)快速注射來向雄性食蟹獼猴之群組(5隻/組)投與包含SEQ ID NO：6之GITRL IgG1 FP單體次單元的六聚GITRL IgG1 FP。
方法
在第1天、第3天及第5天用1或10mg/kg六聚GITRL IgG1 FP注射各別動物組。對照動物接受媒劑(20mM磷酸鈉、230mM蔗糖、0.02% P80，pH 7.5)。在給藥前階段期間及在第1、3、5、9、11、 15、18、22及29天獲取血液樣品以便量測藥效學端點。
使用標準流式細胞測量術方法，量測來自全血之Ki67陽性T細胞群體。
結果
觀測到Ki67陽性T細胞亞群%增加，例如(CD3+CD4+CD95高CD28+/dim/-總記憶CD4+及CD3+CD8+CD95高CD28+/dim/-總記憶CD8+ T細胞)，指示細胞增殖(圖22)。此觀測結果在給藥階段之第11或15天達到最大值且隨後在研究即將結束之際下降。
實例4：GITRL FP內之胺基酸突變及其對受體結合、促效劑活性及熱穩定性之影響 產生在GITRL受體結合域中具有突變之hGITRL FP變異體
產生hGITRL FP變異體且測試其與GITR結合且對GITR促效之能力。在一些情況下，亦評估其熱穩定性。
方法
使用基因合成及標準DNA選殖技術，產生編碼GITRL FP變異體之DNA載體。使用PEI用編碼不同六聚hGITRL融合蛋白之DNA載體短暫轉染懸浮CHO細胞且在37℃下生長八天，在140rpm下在80%濕度下震盪。藉由在1,600 x g下離心及過濾自細胞及細胞碎片分離四十毫升含有分泌蛋白質之改良性培養基。使用Mab SelectSureTM樹脂純化蛋白質且藉由還原性SDS-PAGE分析其尺寸及完整性。
GITRL FP變異體與重組三聚配位體競爭與GITR之結合
使用均相時差式螢光(HTRF)分析測定GITRL FP分子對結合至人類GITR之人類GITRL之效果。
方法
將GITRL FP分子滴定至量測GITRL-HA(血球凝集素標籤)與GITR-Fc之結合的HTRF分析中。將人類GITR Fc與銪穴狀化合物結合 且將與XL665結合之抗HA抗體用於偵測GITRL-HA蛋白質。藉由用Prism 5.01軟體(GraphPad)將分析資料曲線擬合至四參數對數方程式來測定IC50值。
結果
突變六聚GITRL FP分子(hGITRL-FP wt、N92D、N104D及N161D)均為與GITR-Fc結合之三聚GITRL-HA的有效抑制劑且產生類似抑制概況及IC50值(圖23 A、B)。
GITRL FP變異體與重組GITR-Fc之結合
在使用穩定表現hGITR之NFκB-螢光素酶報導細胞的分析中測定不同hGITRL FP分子之功能活性。量測發光，其藉由hGITR之促效作用及NFκB路徑之隨後活化驅動。
方法
將hGITRL FP分子滴定至量測hGITRL FP與hGITR-Fc之結合的HTRF分析中。將人類hGITR Fc與銪穴狀化合物結合且將與XL665結合之抗FLAG抗體用於偵測hGITRL FP蛋白質。藉由用Prism 5.01軟體(GraphPad)將分析資料曲線擬合至單位點飽和結合方程式來測定KD值。
結果
hGITRL FP wt及hGITRL FP N161D之結合概況極類似(分別1.225nM及1.079nM之KD)，而N129A突變hGITRL FP顯示減少之與hGITRFc之結合(KD=3.774nM)。當N129A突變與N161D突變組合時，進一步不利地影響hGITRL FP分子之結合能力(KD=11.85nM)(參見圖24)。
報導子分析中GITRL FP變異體之活性
在使用穩定表現hGITR之NFκB-螢光素酶報導細胞的分析中測定不同hGITRL-FP分子之功能活性。量測發光，其藉由hGITR之促效作 用及NFκB路徑之隨後活化驅動。
方法
針對6點資料曲線將hGITRL FP蛋白質4倍連續稀釋且一式三份地添加至96孔盤。隨後向分析盤之所有孔中添加用人類GITR轉染之傑卡特NF-κB螢光素酶報導細胞且在37℃下培育三小時。藉由向分析盤之所有孔中添加Steady-Glo試劑來偵測螢光素酶表現。在室溫下培育盤五分鐘且隨後量測發光且使用log(促效劑)對反應可變斜率非線性曲線擬合在GraphPadTM Prism 5.01(GraphPad Software，Inc.La Jolla，CA USA)中產生EC50值。
結果
所有GITRL FP蛋白質觸發NF-κB信號傳導。N92D及N161D突變hGITRL FP蛋白質產生與GITRL FP(wt)類似之效能概況及EC50值。在此分析中N129A及N129A/N161D突變不利地影響hGITRL FP對GITR促效之能力(圖25 A-C)。
T細胞再刺激分析中GITRL FP變異體之活性
在共刺激分析中使用初級人類T細胞及胸苷併入讀數測定不同hGITRL FP分子之功能活性。
方法
經由在37℃下在塗佈有小鼠抗人類CD3抗體之TC處理盤中培育四天來刺激人類周邊血液單核細胞(PBMC)-衍生之CD3+ T細胞。其隨後藉由離心粒化，再懸浮於分析培養基中，添加至TC處理盤且在37℃下培育兩天(靜置階段)。hGITRL FP分子在分析培養基中2倍連續稀釋10次且一式三份地添加至預塗佈有小鼠抗人類CD3之TC處理盤。在兩小時之後，洗滌分析盤且向各孔中添加先前製備之CD3+ T細胞且在37℃下培育四天。在四天之後，將含氚化胸苷之分析培養基添加至各孔中且在37℃下再培育盤18小時。在培育之後，使用TopcountTM量測胸苷 併入。
結果
除在兩個獨立實驗中具有降低之活性的N92D之外，測試之所有hGITRL FP突變體展現與hGITRL FP wt等效之活性(圖26 A-C)。
GITRL FP變異體之熔融溫度
使用發光特性在未摺疊蛋白質存在下改變之螢光染料(SyproTM Orange)測定GITRL FP wt及N92D蛋白質之熔融溫度。
方法
使用基於Sypro Orange之分析評估wt及N92D GITRL FP變異體之熱穩定性以計算熔融溫度(Tm)。將蛋白質首先在2×PBS中稀釋至0.5mg/mL，隨後分配至96孔PCR盤中。在盤上向各孔中添加SyproTM Orange，隨後密封盤。在Real-Time PCR機器上使用Chromo4TM連續螢光偵測器讀取盤。將溫度設定成自20℃增加至90℃，伴隨每1℃讀取一次及1s之保持時間。藉由隨溫度而變繪製螢光強度及螢光衍生物來測定去摺疊轉變。一式兩份分析各GITRL FP蛋白質。
結果
兩種GITRL FP蛋白質之熔融溫度概括在以下表4-1中。兩種變異體均具有在67℃下之轉變峰，然而hGITRL FP N92D展示在低溫(54℃)下之另一寬轉變峰，表明結構不穩定性(圖27)。
資料概述及結論
在GITR/GITRL競爭結合分析及初級T細胞再刺激分析中N104D GITRL FP蛋白質展現與野生型hGITRL FP對應物等效之活性，表明N104在hGITRL FP之活性中不起重要作用。Asn161突變成Asp代表移 除N連接之糖基化位點(參見實例4中之資料)且此突變體(hGITRL FP N161D)在所有分析(GITR/GITRL競爭結合、直接結合、報導子及初級T細胞再刺激分析)中保留活性，表明Asn161及此位點處之聚糖不參與重要功能，諸如GITR之結合及促效作用。
在報導子分析中N129A突變體展現與hGITR之結合減少及活性降低，表明其在與hGITR之結合及hGITR之隨後促效作用中起作用。引起關注地，當此突變與N161D突變(其單獨不影響活性)組合時，GITR之結合及促效作用甚至進一步減少。
當在報導子分析中測試時N92D突變似乎不影響hGITRL FP之活性，然而，在初級T細胞再刺激分析中觀測到hGITRL FP N92D之活性降低。當研究N92D突變體之熱穩定性時，觀測到與hGITRL FP相比之另一極寬較低熔融溫度轉變峰，表明在低溫(包括37℃)下之一些結構不穩定性。由於初級T細胞分析之較長時間過程(4天)，可設想hGITRL FP N92D分子變得不穩定及展開，引起在此分析中與報導子分析相比活性降低(3小時)。因此，Asn92突變成Asp似乎在結構穩定性方面不利。
實例5：鑑定hGITRL FP內之經糖基化之胺基酸殘基.
在GITR結合域內存在兩個潛在N-糖基化共同位點(N161及N129)。藉由質譜測定此等位點處以及Fc域內之典型N-糖基化位點(在IgG的情況下為N297；成熟hGITRL FP序列中之N78)處聚糖之存在及結構。
方法 重組蛋白表現及純化
自用編碼相關蛋白質之載體短暫轉染之CHO細胞之改良性培養基使用親和性層析法及隨後尺寸排外層析法純化重組hGITRL FP wt及N161D蛋白質。
胰蛋白酶肽圖譜
將hGITRL FP wt及hGITRL FP N161D之樣品變性，還原且將經還原之半胱胺酸烷基化。隨後用胰蛋白酶消化樣品。在37℃下4小時之後，藉由添加酸淬滅消化。藉由逆相在UPLC上分離肽且使用UV偵測器及質譜儀量測。所得胰蛋白酶肽序列提供在表5-1中。
結果：
N =天冬醯胺部分N-糖基化共同序列。
D=hGITRL FP N161D中之N161D取代
在各種hGITRL FP中發現之寡醣結構之類型之示意圖提供在圖28中。質譜資料提供在圖29 A、B及C中。
結論
使用肽圖譜分析來確定GITRL及Fc域中之N-糖基化位點佔據，以及各位點處之主要寡醣之結構。在hGITRL FP wt及hGITRL FP N161D蛋白質兩者中，典型Fc N-糖基化位點(N78)經糖基化且主要碳水化合物結構為中性雙觸角複合類型寡醣；對於在CHO細胞中表現之IgG Fc區為典型的。在hGITRL FP wt或hGITRL FP N161D中，GITRL RBD內N129處之N-糖基化共同位點不經任何寡醣結構佔據。在hGITRL FP wt中GITRL RBD內N161處之N-糖基化共同位點經佔據且發現主要碳水化合物結構為中性及帶電雙觸角複合類型寡醣。在hGITRL FP N161D蛋白質中，肽圖譜確認N161D胺基酸取代，其自GITRL RBD移 除N161 N-糖基化共同位點。正如所料在D161處未偵測到N-糖基化。
實例6：鼠模型及OX40組合研究
為了較好地理解GITR之靶向，將鼠GITRL-FP之活性及藥效學效果與靶向OX40之促效鼠OX40L FP相比較。
材料及方法 NF-κB報導子分析
如所指示將傑卡特mGITR或人類OX40 NFκB細胞在37℃、5% CO2及85%濕度下在96孔盤中以50,000個細胞(傑卡特mGITR)或200,000個細胞(傑卡特人類OX40)/孔與抗GITR抗體DTA-1(Biolegend)、NIP rIgG2b同型對照、mGITRL-FP mIgG2a或盤固定mOX40L-FP mIgG1或同型對照(在致使蛋白質不能經由OX40信號傳導之位置(Y182A)包含單一胺基酸突變)一起培養。在5小時之後或在16小時之後向盤中添加含有螢光素受質之Steady Glo®試劑(Promega)以用於含有mOX40L-FP mIgG1之分析且在黑暗中在盤震盪器上培育盤30分鐘。使用Envision盤讀取器(Perkin Elmer)偵測分析信號。
SDS PAGE
將五微克蛋白質與裝載緩衝液及還原劑混合，在80℃下變性10min且與蛋白質分子量標記物(Rainbow Marker，GE Healthcare)一起裝載至4-20% Tris-甘胺酸SDS-PAGE凝膠(Thermo Fisher)上。將蛋白質在200V下電泳45min且使用Instant Blue蛋白質染料(Sigma)染色。
小鼠及腫瘤模型
自Charles River UK Ltd.或Harlan Laboratories Inc.獲得8-10週齡BALB/c或C57BL/6雌性小鼠。將CT26或B16F10-Luc2細胞於PBS中之在5×106個細胞/毫升或5×104個細胞/毫升100μl之細胞密度下之100μL懸浮液皮下注射至各動物之右側腹中。B16F10-Luc2細胞株在CAG啟動子控制下併入螢光素酶報導子且將細胞植入在50% PBS及50%生 長因子減少及無酚紅基質膠(Corning)中。基於腫瘤體積將可量測腫瘤隨機分配。用電子測徑規每週3次量測各腫瘤之長度(mm)及寬度(mm)。基於公式(長度[mm]×寬度[mm]2)/2計算腫瘤之體積(mm3)。若不存在可量測腫瘤或存在持續腫瘤生長抑制使得在研究結束時體積小於200mm3，則將腫瘤生長反應分類為反應。各蜘蛛圖上指示之消退數目為相對於植入之腫瘤總數的比例。在植入同基因型腫瘤後6天或當其達到200mm3之體積時用mGITRL-FP或mOX40L-FP腹膜內向小鼠給藥。在B16F10-Luc2攜帶小鼠中給與25mg/kg mGITRL-FP僅耐受持續四次給藥。
流式細胞測量術
剝離腫瘤、脾或腫瘤引流淋巴結且置放於冰上RPMI-1640培養基中。藉由將各組織傳送通過40或100μm耐綸細胞過濾器(Falcon)來解聚組織，且藉由離心粒化細胞且再懸浮於紅血球溶解緩衝液(Sigma)中。在室溫下培育2分鐘之後，洗滌細胞且再懸浮於流式細胞測量緩衝液(Ebioscience)中。使用溫和MACS解離劑及腫瘤解離套組(Miltenyi Biotec)遵循製造商之說明處理腫瘤組織樣品。
使用live dead fixable blue(Life Technologies)遵循製造商之說明針對活力將樣品染色且隨後用抗-CD16/32(ebioscience)阻斷，隨後用螢光染料結合抗體染色。自ebioscience購買CD4(Rm4.5)、Foxp3(FJK-16S)、Ki67(Sol A15)、ICOS(7E.17G9)、Eomes(Dan11mag)、T-bet(Apr-46)及GITR(DTA-1)。自Biolegend購買CD45(30-F11)、CD44(IM7)、CD62L(MEL-14)、PD-1(29F.1A12)及OX40(OX86)。自BD Pharmingen購買CD8(53-6.7)。對於細胞內抗原之染色，根據製造商之說明使用Foxp3染色套組(ebioscience)。將樣品固定在3.7%福馬林中，隨後使用Fortessa(Becton Dickinson)採集樣品。用FlowJo軟體(Ashland，OR)分析資料。
藥物動力學建模
向Balb/c小鼠投與5或15mg/kg mGITRL-FP mIgG2a一次。在處理之後5分鐘、0.5、1、2、6、24、72、144及240小時每組殺死三隻小鼠。收集血清樣品且在夾心ELISA中使用抗鼠GITRL mAb(R&D Systems)作為捕捉及偵測來評估存在之循環mGITRL-FP mIgG2a之含量。
合併自2個給藥組獲得之藥物動力學(PK)資料且使用群體方法同時建模。使用藥物統計學(pharmacostatistical)軟體套件NONMEM(版本7.2，ICON Development Solutions，Ellicott City，Maryland)進行群體分析。採用有交互選項之FOCE方法。藉由二室模型充分描述鼠GITRL-FP mIgG2a PK。
細胞株
將HEK293T-17細胞(ATCC，CRL-11268)維持在DMEM(Invitrogen)加10% v/v熱失活胎牛血清(HI FBS，HyClone)及1 X非必需胺基酸(NEAA，Invitrogen)中。將傑卡特細胞(ATCC，TIB-152)維持在RPMI 1640(Invitrogen)加10% v/v HI FBS中。將傑卡特mGITR NFκB細胞維持在補充有10% HI FBS、5μg/mL殺稻瘟菌素(Invitrogen)及5μg/mL嘌呤黴素(Invitrogen)之RPMI 1640中。
細胞株產生
藉由慢病毒轉導使用第三代慢病毒系統(Systems Biosciences)產生傑卡特mGITR NFκB細胞株。將鼠GITR基因(NM_009400.2)選殖至在CAG啟動子控制下且含有嘌呤黴素抗性基因之表現質體中。NFκB報導子表現質體經設計以在最小啟動子下及在螢火蟲螢光素酶報導子(luc2，Promega)上游連同殺稻瘟菌素抗性基因一起表現NFκB反應元件之五個複本。使用脂染胺2000(Invitrogen)將各表現質體與封裝質體(Systems Biosciences)一起共轉染至HEK293T-17中。轉染後48h收 集含有病毒粒子之上清液且用於轉導傑卡特細胞。自轉導後48h起將病毒轉導之傑卡特細胞在培養基加選擇抗生素、5μg/mL殺稻瘟菌素及5μg/mL嘌呤黴素中培養。除轉導經設計以組成性表現人類OX40之慢病毒載體外，使用類似程序產生傑卡特人類OX40 NFκB細胞株。小鼠OX40L結合至人類OX40；因此，表現人類OX40之NFκB螢光素酶報導子傑卡特細胞株可用於評估鼠OX40L融合蛋白之活性。
ELISA
將重組小鼠GITR-Fc及OX40-Fc(R&D Systems)糖蛋白在1μg/mL下在PBS中隔夜塗佈至96孔盤(Greiner)上。用PBST(PBS+0.01% Tween-20)洗滌盤，在室溫下用含有1%(w/v)BSA之PBS阻斷1小時，且在PBST中再洗滌。向孔中添加二十五微升在分析緩衝液[PBS+1%牛血清白蛋白(BSA)]中稀釋之1μg/mL小鼠GITRL或OX40L FP，且在室溫下培育盤2小時。在3次洗滌之後，向各孔中添加25μL在分析緩衝液中稀釋之1μg/mL辣根過氧化酶結合抗小鼠Fc抗體(Sigma)，且培育盤1小時。在培育之後，在PBST中洗滌盤3次，向各孔中添加25μL四甲基聯苯胺受質溶液(KPL)，且培育盤5分鐘。在培育之後，向所有孔中添加15μL 0.5M硫酸停止溶液。使用EnVision盤讀取器(PerkinElmer)量測在450nm下之光學密度。
統計學
使用Prism統計軟體版本6進行所有統計分析。
結果 mGITRL-FP活體外效能
為了研究GITR受體信號傳導對活體內免疫細胞活化及抗腫瘤活性之效果，產生四聚mGITRL-FP。mGITRL-FP經設計以引發在效應細胞上與GITR受體及FcγR之親合結合。分子自N端至C端由免疫球蛋白G(IgG)之片段可結晶(Fc)區、異白胺酸拉鏈域(ILZ)及鼠GITR配位 體之細胞外(GITR結合)域(ECD)組成(圖30A)。當藉由SDS-PAGE觀測純化變性mGITRL-FP(圖30B)時，其展現高均質度及略微高於48kDa之預期分子量的分子量，此大概歸因於Fc及mGITRL域之糖基化。在GITR依賴性NFκB報導基因細胞分析中mGITRL-FP mIgG2a及抗GITR抗體(DTA-1)均能夠誘導NF-κB信號傳導，而鼠OX40L FP mIgG1(mOX40L-FP mIgG1)及同型對照缺乏任何可偵測信號(圖30C)。重要地，在此分析中關於GITR促效作用四聚mGITRL-FP展現0.05nM之EC50，其比展現2.31nM之EC50之DTA-1更有效幾乎50倍。
用mIgG2a Fc工程改造之mGITRL-FP之抗腫瘤活性
先前研究已顯示活化FcγR為DTA-1抗體之抗腫瘤活性所需，且當其攜帶mIgG2a Fc時，與缺乏FcγR結合之rIgG2b Fc或N297A突變Fc相比，此抗體之抗腫瘤活性增加。為了確定Fc同型對mGITRL-FP之抗腫瘤活性之影響，用具有mIgG2a或mIgG1 Fc同型之mGITRL-FP處理CT26腫瘤攜帶小鼠。用5或10mg/kg任一種同型處理小鼠引起與鹽水處理對照相比之顯著抗腫瘤活性，如由腫瘤體積減小證明(圖31A)。然而，總體抗腫瘤活性在用mGITRL-FP mIgG2a處理之後更大(11/20總消退)，此與mGITRL-FP mIgG1相反(7/20總消退，圖31A)。
為了確定Fc變異體之活性之此差異是否歸因於其介導T細胞活化及GITR促效作用下游之隨後事件之能力的差異，在CD4+ FoxP3-(效應T細胞)、CD8+(效應T細胞)及CD4+ FoxP3+(T-reg)細胞上使用Ki67表現之流動式細胞量測分析評估脾T細胞群體之增殖。當與鹽水對照相比時，mGITRL-FP之兩種同型均引起所有三個脾T細胞子組之增殖之相當顯著增加(圖31B)。在處理之後脾T-reg細胞群體展示最高Ki67表現(在mGITRL-FP mIgG2a處理之後為53.95%±0.75且在mGITRL-FP mIgG1處理之後為58.43%±1.26)，接著為CD4+ FoxP3-(在mGITRL-FP mIgG1之情況下為9.52%±0.58且在mGITRL-FP mIgG1之情況下為 10.89%±0.56)及CD8+ T細胞(在mGITRL-FP mIgG2a之情況下為7.60%±0.27且在mGITRL-FP mIgG1之情況下為7.79±0.43)。此資料表明僅脾T細胞活化不能造成在mGITRL-FP之mIgG1及mIgG2a Fc同型之間在抗腫瘤免疫性中觀測到的差異。
隨後研究T細胞群體之瘤內變化是否可解釋在mIgG2a之情況下相對於mGITRL-FP之mIgG1變異體觀測到的抗腫瘤活性增加。用mGITRL-FP mIgG2a處理小鼠誘導瘤內T-reg之頻率自鹽水處理動物中之13.31%±1.06顯著降低至3.60%±0.79，顯著性值為p<0.0001(圖31C及圖32)，及與對照處理動物相比CD8：T-reg(圖31D)及CD4：T-reg(圖32B)比率之隨後增加。相比之下，對於mGITRL-FP之mIgG1 Fc變異體腫瘤內T-reg之減少不明顯(12.95%±1.34)。亦存在用mGITRL-FP mIgG2a處理(8.64%±1.21)之後與對照動物(13.01%±1.12)相比瘤內CD4+ FoxP3- T細胞之比例顯著減少之跡象，但此未達到針對T-reg所觀測之程度。T-reg藉由mGITRL-FP mIgG2a之較佳耗儘可能歸因於GITR在瘤內T-reg上之較高表現(圖31E)及活化FcγR在CT26腫瘤之腫瘤微環境中之較高表現，且暗示藉由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之清除。總體而言，此等資料表明為了在mGITRL-FP處理之後的最佳抗腫瘤活性，需要與瘤內T-reg減少一致的周邊CD4+及CD8+ T細胞增殖。
mGITRL-FP mIgG2a介導之抗腫瘤活性
因為與mGITRL-FP mIgG1相比，mGITRL-FP mIgG2a引發抗腫瘤活性增加，隨後將mGITRL-FP mIgG2a在血液中之曝露水準及曝露時間如何與CT26腫瘤攜帶小鼠中之抗腫瘤反應相關表徵。首先，藉由用單次劑量之鹽水對照或0.2、1或5mg/kg mGITRL-FP mIgG2a處理小鼠來量測增加劑量對腫瘤生長之效果。用0.2mg/kg mGITRL-FP mIgG2a處理僅引起1/10完全消退，然而當劑量自0.2升高至1mg/kg或 5mg/kg時，存在抗腫瘤免疫性之劑量依賴性增加之跡象，該等劑量分別引起6/10及9/10消退(圖33A)。此外，抗腫瘤活性亦可藉由將0.2mg/kg給藥之頻率增加至每日一次(Q1D)或每週一次(Q1W)來改良(圖33B)。此等結果指示存在誘導最佳抗腫瘤活性所需之mGITRL-FP mIgG2a之所需曝露水準，如由完全腫瘤消退及最小殘餘腫瘤體積所定義，其僅在使用Q1D時程時達到。為了確定此臨限值，在用2個替代劑量之mGITRL-FP處理的小鼠血液中量測mGITRL-FP mIgG2a之濃度且隨後將此等結果併入PK模型中。基於此模型，藉由Q1D時程持續且視為維持最佳抗腫瘤活性所需之mGITRL-FP mIgG2a血液濃度經計算為等於或大於1μg/mL(圖33C)。
在mGITRL-FP mIgG2a處理之後接著研究抗腫瘤活性之PD生物標記物。使用Ki67之表現評估增殖，同時亦分析ICOS、PD-1及OX40，其均已知在活化之後在T細胞上表現。藉由增加劑量或藉由增加投與頻率來增加mGITRL-FP mIgG2a之曝露引起表現Ki67、ICOS、PD-1及OX40之周邊CD4+ T細胞之頻率之漸進更大增加(圖34A-D)。
mGITRL-FP與mOX40L-FP抗腫瘤活性之比較分析
為了理解相較於OX40靶向，GITR之相對機制，將mGITRL-FP之抗腫瘤活性直接與包含類似蛋白質結構、不與GITR受體交叉反應且能夠在OX40報導細胞分析中誘導NFκB表現之mOX40L-FP相比較(圖35A及B)。
用mIgG1或mIgG2a Fc同型之5mg/kg mGITRL-FP或mOX40L-FP處理CT26腫瘤攜帶小鼠一週兩次且量測腫瘤生長。如在mGITRL-FP之情況下所見，在用mIgG2a同型(9/10消退)處理之後與用mIgG1(1/10消退；圖36A)相比在mOX40L-FP之情況下觀測到之抗腫瘤活性較大。然而，相對於在用mOX40L-FP mIgG1處理之後可見之抗腫瘤活性，用mGITRL-FP mIgG1處理(6/10消退)引發抗腫瘤活性增加且在 mIgG2a同型(10/10)之情況下比mOX40L-FP mIgG2a稍微較好(圖36A)。在用具有mIgG2a Fc同型之mGITRL-FP及mOX40L-FP處理之後觀測到瘤內T-reg之類似去除，但此對於任一分子之mIgG1 Fc同型不明顯(圖5B)。此資料指示對於在CT26腫瘤攜帶小鼠中誘導GITR及OX40促效劑之抗腫瘤活性而言，mIgG2a同型優於mIgG1。
mGITRL-FP mIgG2a及mOX40L-FP mIgG1組合研究
鑒於在用mGITRL-FP mIgG2a處理之後CD4+ T細胞上之OX40受體上調(圖34D)，進一步研究使T細胞活化最大化之潛能。使用mGITRL-FP mIgG2a及mOX40L-FP mIgG1評估靶向GITR及OX40路徑之組合試劑之潛在益處。
每兩週用mGITRL-FP mIgG2a及mOX40L-FP mIgG1組合處理與鹽水對照(7.82%±0.30及9.22%±0.31)或用任一單一療法(對於mGITRL-FP處理之CD4及CD8 T細胞為14.2%±0.45及15.52%±0.66，且對於mOX40L-FP處理之CD4及CD8 T細胞為17.02%±0.49及16.22%±1.22；圖37A)處理相比，引起脾CD4+(29.16%±1.51)及CD8+(24.4%±0.87)T細胞中Ki67之表現顯著增加，顯示組合兩種分子之相加效應。脾CD4+及CD8+ T細胞群體之其他分析顯示組合處理將定義為CD44+及CD6210(圖37B)之CD4+及CD8+效應記憶室及如定義為CD44+及CD62+(圖37C)之CD4+中央記憶群體之頻率增加至高於單一療法處理。在IFNy製備中顯示冗餘且在CD8+ T細胞中顯示細胞毒性以及在Th1分化中具有作用之轉錄因子T-bet(圖37D)及Eomes(圖37E)之表現在組合期間與任一單一療法相比亦在CD4+及CD8+ T細胞上在較大程度上增加。GITR與OX40路徑之間的機制差異為與用mGITRL-FP mIgG2a處理之動物相比，在mOX40L-FP mIgG1處理動物中T-bet及Eomes在CD4+ T細胞上之表現顯著較高。
基於此等發現，確定組合mGITRL-FP mIgG2a與mOX40L-FP mIgG1對腫瘤生長之效果。隨後研究藉由與單一次佳劑量之mGITRL-FP mIgG2a組合是否可進一步改良用mOX40L-FP mIgG1進行之小鼠處理。用mOX40L-FP mIgG1單一療法處理誘導5/10消退，mGITRL-FP mIgG2a單一療法處理誘導3/10消退，但mGITRL-FP mIgG2a與mOX40L-FP mIgG1兩者之組合引起抗腫瘤活性增強，顯示8/10消退(圖38A)。
鑒於在較高劑量下用mGITRL-FP mIgG2a之單一療法處理在CT26模型中之大部分小鼠中誘導完全腫瘤消退，研究高劑量mOX40L-FP mIgG1與mGITRL-FP mIgG2a之組合在B16F10-Luc 2模型中之增加的益處。在此模型中用任一單一療法給藥未誘導任何腫瘤消退，然而與單一療法處理相比，兩種分子之組合引起改良之抗腫瘤活性；腫瘤生長延遲及存活率增加(圖38B及圖39)。
實例7：T細胞激活劑與mGITRL-FP之組合 材料及方法 細胞株及試劑
自ATCC(目錄號CRL 6475，Manassas，VA)獲得TC-1腫瘤株且維持在DMEM+10% FBS+1%青黴素/鏈黴素中。自ATCC(Manassas，VA)獲得CT26腫瘤株且維持在補充有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中。自Bio X Cell(West Lebanon，NH)購買DTA-1及同型抗體。
E7 SLP及疫苗接種
自New England Peptide(Gardner，MA)合成由45聚體HPV16-E7序列SSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVD(SEQ ID NO：57)組成之E7合成長肽(SLP)。E7 SLP在10或3.3μg下給藥且與20μg含CpG ODN 2395(TriLink，San Diego，CA)之Addavax(Life Technologies，Carlsbad，CA)及PBS一起以50μL之總體積調配。將疫苗接種皮下投與至尾根之背面。
腫瘤模型
TC-1實驗使用自傑克遜實驗室(Bar Harbor，ME)獲得之雌性C57BL/6小鼠(目錄號000664)小鼠。CT26實驗使用自Envigo(Frederick，MD)獲得之雌性Balb/C小鼠。在腫瘤植入時小鼠在6及8週齡之間。所有動物實驗均根據由機構動物護理及使用委員會確定之準則進行。對於TC-1腫瘤植入，將2×104個活TC-1細胞皮下植入至左後腳掌中。對於CT26腫瘤植入，將5×105個細胞植入在右側腹中。藉由用測徑規1直接量測來評估腫瘤生長。每2-4天收集雙向量測值，且使用體積=(長度．寬度2)/2計算腫瘤體積。使腫瘤發展6-14天且隨後依據腫瘤體積將腫瘤攜帶小鼠隨機分配至處理組。根據IACUC方案當對於TC-1/腳掌原發腫瘤超過1000mm3且對於CT26/側腹超過2000mm3時使小鼠安樂死。對於PD研究，使小鼠安樂死且收集腫瘤及脾，經由70uM過濾器(CorningTM，Corning，NY)壓碎，且處理成單細胞懸浮液。
功能性T細胞反應及流式細胞測量術
對於抗原特異性刺激，每孔用1ug AH1肽序列SPSYVYHQF(SEQ ID NO：56)(Anaspec，Fremont，CA)或10μg E7肽序列RAHYNIVTF(SEQ ID NO：58)(Anaspec)及蛋白質傳輸抑制劑(Ebioscience，Santa Clara，CA)塗覆1-2×106個活細胞。在5小時之後，將細胞染色。對於所有染色，染色之次序為live/dead blue(Life Tech)、細胞外蛋白質、FOXP3 Fix/Perm套組(Ebioscience)及接著細胞內細胞因子。。抗體包括CD45(純系30-F11)、CD4(純系RM4-5)、CD8(純系53-6.7)、GITR(純系DTA-1)、IFNγ(純系XMG 1.2)、TNFα(純系MP6-XT22)、FOXP3(純系FJK-16s)、KI-67(純系SolA15)。自Immudex(Fairfax，VA)購買裝載有RAHYNIVTF之H2-Db E7 Dextramer且吾人遵循其染色方案。所有樣品在LSR-II或Fortessa(BD San Jose，CA)上操作。使用FlowJo(Treestar，Ashland，OR)分析所有資料。
mGITRL-FP需要抗原特異性細胞
CT26為具有較高瘤內CD45及基底CTL含量之極具免疫原性腫瘤模型。已顯示CT26自身激活低含量之AH1特異性T細胞。為了評估mGITRL-FP是否可引起抗原特異性反應之重新產生，使用E6/E7轉型TC-1腫瘤模型。此模型具有已知CD8 T細胞抗原決定基且該E7特異性免疫反應可使得免於攜帶E7之腫瘤。將TC-1腫瘤細胞植入在C57/b6小鼠之腳掌中。在第14天量測小鼠，基於腫瘤尺寸隨機分配且用1mg/kg、5mg/kg及20mg/kg下之mGITRL-FPIgG2a處理(圖43A)。在測試之任何劑量下存在腫瘤生長之延遲或抑制(圖43B)。在第24天，殺死未經處理及1mg/kg處理小鼠之子組且收集脾及腫瘤。評估T細胞群體及E7抗原特異性反應。GITR含量存在於CD4及CD8T細胞上，且在腫瘤中顯著較高(圖43C)。在無E7激活的情況下，mGITRL-FP不能延遲TC-1腫瘤生長或產生抗腫瘤免疫反應。
mGITRL-FP擴增經激活抗原特異性CD8T細胞
已經顯示用DNA疫苗進行疫苗接種在產生使得預防及抑制TC-1腫瘤模型之腫瘤生長的E7特異性反應中有效。此研究假設mGITRL-FP可需要經激活抗原特異性T細胞來驅動抗腫瘤反應。為了產生此反應，未處理C57/b6小鼠在尾根用10μgE7合成長肽(SLP)及CpG(addavax)接種。在此時間期間，用3個劑量之mGITRL-FP IgG2a處理小鼠。在7天之後，將脾細胞抽樣且用E7 dextramer評估T細胞之抗原特異性(圖44A)。在CD4及CD8百分比中未發現差異，但當用mGITRL-FP處理時觀測到抗原特異性細胞之較大增加(圖44B-D)。另外，僅評估接種小鼠上之GITR含量，與Dex-CD8T細胞相比抗原特異性Dex+細胞具有較高GITR MFI(圖44E-F)。假設此差異在有腫瘤之小鼠中將 甚至更高，因為GITR含量似乎在腫瘤微環境中最高。C57/b6小鼠植入有TC-1腫瘤且用E7 SLP/CpG(Addavax)接種(圖44G)。如藉由dextamer在脾及腫瘤中量測來觀測抗原特異性E7細胞之激活(圖44H-I)。在脾及腫瘤中就GITR而言，用dextramer陽性染色之細胞亦較高(圖44J-K)。E7 SLP能夠成功地在腫瘤及經激活表現與其他CD8 T細胞相比較高含量之GITR的抗原特異性細胞存在或不存在下激活E7特異性反應。
mGITRL-FP可擴增藉由E7 SLP激活之抗原特異性細胞且產生針對TC-1腫瘤之保護性免疫反應
為了評估mGITRL-FP是否可擴增針對TC-1腫瘤細胞之E7特異性反應，將TC-1腫瘤細胞植入至腳掌中且在第14天依據腫瘤體積將小鼠隨機分配。在尾根與CpG(Addavax)與mGITRL-FP IgG2a一起持續四次給藥給與之單次劑量之E7 SLP開始疫苗接種(圖45A)。包括兩個研究組，TGI(腫瘤生長抑制)組(n=10)及PD(藥效學)組(n=5)。對照小鼠腫瘤快速生長且所有小鼠以27天之中值存活率死亡。僅E7 SLP向有TC-1腫瘤之小鼠提供存活優勢，其中10隻小鼠中1隻存活且在第85天無腫瘤且中值存活率為46.5天(圖45B)。E7 SLP+mGITRL-FP顯著延遲腫瘤生長，其中3/10小鼠無腫瘤且5/10在第85天存活且中值存活率為80.5天(圖45C-D)。僅疫苗接種提供腫瘤進程延遲且在更進一步延遲進程上添加mGITRL-FP。假設此由於腫瘤特異性CD8之選擇擴增而出現。在第21天，殺死PD小鼠組且收集脾及腫瘤用於藥效學分析。歸因於收集之組織量，合併來自腳掌之腫瘤(圖45E)。單獨或與mGITRL-FP組合之疫苗接種引起進入腫瘤中之CD45+細胞顯著增加(圖45F)。為了評估抗原特異性功能，用1ug/mL E7肽再刺激腫瘤或脾之單細胞懸浮液。在脾及腫瘤兩者中疫苗接種提供抗原特異性細胞之基本增加且添加mGITRL-FP進一步將此增強至較高量(圖45G)。當存 在E7 SLP疫苗時mGITRL-FP似乎不去除脾中之Treg且僅能夠去除腫瘤中之Treg(圖45G)。
實例8：核苷酸及蛋白質序列.
此處揭示之核苷酸及蛋白質序列之標註形式提供在表6-1中。
***
本發明之廣度及範疇不應由上述例示性實施例中之任一者限制，而應僅根據以下申請專利範圍及其等效物進行界定。
<110> 羅斯 安東尼 史都華特 娜塔立 喬 提格 雷斯里 琳 樣 丹尼爾 雷曼莎 喜家茲 麗莎 班柏 蘇達森 史里答蘭 瑞貝卡 雷藍地
<120> GITRL融合蛋白及其用途
<130> GITRLF-100P2
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 177
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<213> 人工
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<223> 合成
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<221> MISC_FEATURE
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 20
<210> 21
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 21
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 22
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 23
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 24
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 25
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 26
<210> 27
<211> 28
<212> PRT
<213> 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 27
<210> 28
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
<210> 29
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 29
<210> 30
<211> 70
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
<210> 31
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 31
<210> 32
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
<210> 33
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 33
<210> 34
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
<210> 35
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Glu或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Ser或Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa為Thr或Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Xaa為Leu或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> Xaa為Thr或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa為Leu或Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa為Met或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> Xaa為Thr、Phe或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa為Ser或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (63)..(63)
<223> Xaa為Arg或Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> Xaa為Trp或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (74)..(74)
<223> Xaa為Leu或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (104)..(104)
<223> Xaa為Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (109)..(109)
<223> Xaa為Phe或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (112)..(112)
<223> Xaa為除Asn外之任何胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (118)..(118)
<223> Xaa為Val或Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (119)..(119)
<223> Xaa為Leu或Ile
<400> 35
<210> 36
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (112)..(112)
<223> Xaa為除Asn外之任何胺基酸
<400> 36
<210> 37
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 37
<210> 38
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 38
<210> 39
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 39
<210> 40
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 40
<210> 41
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 41
<210> 42
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 42
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
<210> 45
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 46
<210> 47
<211> 241
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47

Claims (136)

  1. 一種經分離之單鏈多肽次單元，其包含：IgG Fc域；功能性多聚域；及糖皮質激素誘導之TNF受體配位體(GITRL)之受體結合域，其中該多肽次單元可自組裝成三聚或六聚蛋白質。
  2. 如請求項1之多肽次單元，其中該多聚域為三聚域。
  3. 如請求項1或2之多肽次單元，其自胺基端至羧基端包含該IgG Fc域、接著該多聚或三聚域、接著該GITRL受體結合域。
  4. 如請求項1至3中任一項之多肽次單元，其中該IgG Fc域之羧基端經由第一連接區域融合至該多聚或三聚域之胺基端。
  5. 如請求項1至4中任一項之多肽次單元，其中該多聚或三聚域之羧基端經由第二連接區域融合至該GITRL受體結合域之胺基端。
  6. 如請求項1至4中任一項之多肽次單元，其中該IgG Fc域之羧基端直接融合至該多聚或三聚域之胺基端。
  7. 如請求項5或6之多肽次單元，其中該IgG Fc域在胺基端包括IgG鉸鏈區。
  8. 如請求項5或6之多肽次單元，其中該IgG鉸鏈區包含賦予完整重鏈間二硫鍵形成的突變。
  9. 如請求項7或8之多肽次單元，其中該IgG鉸鏈區包含IgG1鉸鏈區、IgG4鉸鏈區或其變異體。
  10. 如請求項9之多肽次單元，其中該IgG4鉸鏈區在根據EU編號之位置228具有絲胺酸至脯胺酸突變(S228P)(IgG4P)。
  11. 如請求項1至10中任一項之多肽次單元，其中該IgG Fc域為人類IgG Fc域。
  12. 如請求項1至4或至6至10中任一項之多肽次單元，其中該多聚或三聚域之羧基端直接融合至該GITRL受體結合域之胺基端。
  13. 如請求項5至12中任一項之多肽次單元，其中該第一連接區域、該第二連接區域或該第一及第二連接區域存在時，獨立地選自由含有以下之連接區域組成之群：(Gly4)n基元(motif)、(Gly4Ser)n基元(SEQ ID NO：19)、Ser(Gly4Ser)n基元(SEQ ID NO：22)、GGGGSGGGGSGGGGSAL(SEQ ID NO：23)、GGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO：24)及其組合，其中n為選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群的正整數。
  14. 如請求項13之多肽次單元，其中該第一及第二連接區域獨立地選自由GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：25)及GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：26)組成之群。
  15. 如請求項13或14之多肽次單元，其中該第一連接區域為GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：20)且該第二連接區域為(Gly4)基元。
  16. 如請求項1至15中任一項之多肽次單元，其中該IgG Fc域包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IG4P Fc域或其變異體。
  17. 如請求項1至16中任一項之多肽次單元，其中該IgG Fc域含有一或多個選自由252Y、254T、256E及其組合組成之群的胺基酸殘基取代，其中殘基係根據EU編號來編號。
  18. 如請求項1至17中任一項之多肽次單元，其中該IgG Fc域包含CH2區。
  19. 如請求項18之多肽次單元，其中該IgG Fc域進一步包含CH3區。
  20. 如請求項19之多肽次單元，其中該IgG Fc域包含與SEQ ID NO：21具有至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
  21. 如請求項19之多肽次單元，其中該IgG Fc域包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
  22. 如請求項1至21中任一項之多肽次單元，其中該三聚域包含α-螺旋形捲曲螺旋域、白胺酸拉鏈域或其組合。
  23. 如請求項22之多肽次單元，其中該三聚域來源於基質素(Matrilin)1、冠蛋白(Coronin)1a、營養不良性肌強直激酶(DMPK)、蘭格素(Langerin)或其組合。
  24. 如請求項23之多肽次單元，其中該三聚域來源於基質素1或冠蛋白1a。
  25. 如請求項24之多肽次單元，其中該三聚域來源於冠蛋白1a。
  26. 如請求項25之多肽次單元，其中該三聚域包含與SEQ ID NO：11具有至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之冠蛋白1a三聚域。
  27. 如請求項26之多肽次單元，其中該冠蛋白1a三聚域包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
  28. 如請求項26之多肽次單元，其中該三聚域包含SEQ ID NO：10之冠蛋白1a三聚域。
  29. 如請求項26之多肽次單元，其中該冠蛋白1a三聚域包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18之胺基酸序列，或其任何組合或變異體。
  30. 如請求項24之多肽次單元，其中該三聚域包含與SEQ ID NO：28具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之基質素1三聚域。
  31. 如請求項23之多肽次單元，其中該三聚域包含與SEQ ID NO：30具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之DMPK三聚域。
  32. 如請求項23之多肽次單元，其中該三聚域包含與SEQ ID NO：32 具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之蘭格素三聚域。
  33. 如請求項23之多肽次單元，其中該三聚域包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33之胺基酸序列。
  34. 如請求項1至33中任一項之多肽次單元，其中該GITRL受體結合域包含與SEQ ID NO：34具有至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
  35. 如請求項1至33中任一項之多肽次單元，其中該GITRL受體結合域包含與SEQ ID NO：37具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之胺基酸序列，其中殘基161不為天冬醯胺醯基殘基。
  36. 如請求項35之多肽次單元，其中該GITRL受體結合域包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列。
  37. 如請求項1至33中任一項之多肽次單元，其中該GITRL受體結合域包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，其中殘基161為天冬胺醯基殘基。
  38. 如請求項37之多肽次單元，其中該GITRL受體結合域包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。
  39. 如請求項38之多肽次單元，其中該GITRL受體結合域包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
  40. 如請求項1至39中任一項之多肽次單元，其中由該等多肽次單元中之六者組裝的六聚蛋白質可特異性結合至人類GITR。
  41. 如請求項1至40中任一項之多肽次單元，其中該蛋白質未糖基化。
  42. 如請求項1至41中任一項之多肽次單元，其包含與SEQ ID NO：6 具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
  43. 如請求項42之多肽次單元，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
  44. 如請求項1至43中任一項之多肽次單元，其中該次單元具有促效劑(agonist)活性。
  45. 如請求項1至44中任一項之多肽次單元，其進一步包含相關異源劑。
  46. 如請求項45之多肽次單元，其中該異源劑為異源多肽且經由肽鍵融合至該多肽次單元。
  47. 如請求項46之多肽次單元，其中該異源多肽融合至該IgG-Fc域之N端、融合至該GITRL受體結合域之C端、融合至該IgG-Fc域之C端及該三聚域之N端，或融合至該三聚域之C端及該GITRL受體結合域之N端。
  48. 如請求項45之多肽次單元，其中該異源劑以化學結合至該多肽次單元。
  49. 如請求項45至48中任一項之多肽次單元，其中該異源劑包含細胞毒性分子、穩定劑、免疫反應調節劑或可偵測劑。
  50. 一種三聚蛋白質，其包含三個如請求項1至49中任一項之多肽次單元。
  51. 一種六聚蛋白質，其包含六個如請求項1至49中任一項之多肽次單元。
  52. 如請求項51之六聚蛋白質，其可特異性結合至人類或非人類靈長類動物，視情況食蟹獼猴(cynomolgus monkey)、恆河猴或其任何組合的CD4+或CD8+ T細胞、B細胞或NK細胞上表現之糖皮質激素誘導之TNF受體(GITR)，其中該等CD4+或CD8+ T細胞或B細胞視情況經抗原刺激(experienced)，或該等NK細胞視情況經 活化。
  53. 如請求項52之六聚蛋白質，其可特異性結合至人類或非人類靈長類動物，視情況食蟹獼猴、恆河猴或其任何組合之初級(primary)CD4+或CD8+ T細胞上表現的GITR。
  54. 如請求項52或53中任一項之六聚蛋白質，其中該等CD4+或CD8+ T細胞經抗原刺激。
  55. 如請求項51或54之六聚蛋白質，其中如動力學排除分析(kinetic exclusion assay)所量測，對人類GITR之結合親和力為約54nM至約111nM。
  56. 如請求項55之六聚蛋白質，其中如動力學排除分析(KinExA)中所量測，該結合親和力為約82nM。
  57. 如請求項51至56中任一項之六聚蛋白質，其可誘導劑量依賴性增殖及劑量依賴性細胞因子自GITR陽性免疫細胞釋放。
  58. 如請求項57之六聚蛋白質，其中在基於盤之分析中該等GITR陽性免疫細胞為T細胞。
  59. 如請求項52至58中任一項之六聚蛋白質，其中該等細胞為CD4+、CD8+、NK或B細胞。
  60. 如請求項57至59中任一項之六聚蛋白質，其中該等GITR陽性免疫細胞、T細胞、CD4+、CD8+或B細胞經抗原刺激及/或NK細胞經活化。
  61. 如請求項60之六聚蛋白質，如藉由胸苷併入所量測，其可以約0.1至約2.7nM之EC50刺激初級抗原刺激之人類T細胞之增殖。
  62. 如請求項61之六聚蛋白質，其中該EC50為約0.5nM。
  63. 如請求項57之六聚蛋白質，其中該細胞因子為IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12 p70、IL-1β，或其任何組合。
  64. 如請求項51至63中任一項之六聚蛋白質，其可活化GITR表現細胞中之下游信號傳導路徑，視情況其中該下游信號傳導路徑為NFκB路徑或MAPK路徑。
  65. 如請求項64之六聚蛋白質，其中該等GITR表現細胞為T細胞。
  66. 如請求項64之六聚蛋白質，其中該等GITR表現T細胞為表現GITR之傑卡特(Jurkat)NFκB-螢光素酶報導細胞，其對於該NFκB信號傳導路徑之刺激反應產生螢光素酶。
  67. 如請求項51至66中任一項之六聚蛋白質，其中向需要癌症治療之個體投與有效劑量可抑制該個體中腫瘤生長。
  68. 如請求項67之六聚蛋白質，其中該腫瘤生長抑制係在GITR陽性免疫細胞，視情況T細胞或NK細胞存在下達成。
  69. 如請求項67或68之六聚蛋白質，其中與投與同型匹配(isotype-matched)對照相比，腫瘤生長抑制至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%。
  70. 如請求項51至69中任一項之六聚蛋白質，其中該多肽次單元包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4P Fc域且可經由與GITR結合來誘導GITR表現之CD4+或CD8+ T細胞之細胞因子活化及增殖，但基本上不觸發針對該等CD4+或CD8+ T細胞之補體依賴性或抗體依賴性細胞毒性。
  71. 如請求項51至69中任一項之六聚蛋白質，其中該多肽次單元包含IgG1 Fc域且觸發針對表現高量GITR之細胞的Fc受體依賴性細胞毒性。
  72. 如請求項51至69中任一項之六聚蛋白質，其中該多肽次單元包含IgG2、IgG3、IgG4或IG4P Fc域且可經由與GITR結合來誘導GITR表現細胞之增殖。
  73. 如請求項71之六聚蛋白質，其中該Fc受體依賴性細胞毒性為抗體依賴性細胞毒性或抗體依賴性吞噬作用。
  74. 如請求項71之六聚蛋白質，其中該等表現高量GITR之細胞為腫瘤細胞。
  75. 如請求項71之六聚蛋白質，其中該等表現高量GITR之細胞為CD4+ FOXP3+ T細胞或抗原刺激之CD4+ FOXP3- T細胞。
  76. 如請求項71之六聚蛋白質，其中與對照相比，該六聚蛋白質提供降低CD4+ FOXP3+調節性T細胞之頻率。
  77. 如請求項71之六聚蛋白質，其中與對照相比，該六聚蛋白質提供降低腫瘤內CD4+ FOXP3+調節性T細胞之頻率。
  78. 一種組合物，其包含如請求項51至77中任一項之六聚蛋白質及載劑。
  79. 一種聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至49中任一項之多肽次單元或如請求項51至78中任一項之六聚蛋白質的核酸。
  80. 如請求項79之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步包含編碼與該多肽次單元可操作地連接之信號肽的核酸序列。
  81. 如請求項80之聚核苷酸，其中編碼該信號肽之核酸可操作地連接於編碼該多肽次單元之IgG Fc域之胺基端的核酸。
  82. 如請求項79之聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：5。
  83. 一種載體，其包含如請求項79至82中任一項之聚核苷酸。
  84. 一種宿主細胞，其包含如請求項79至82中任一項之聚核苷酸或如請求項83之載體。
  85. 一種產生如請求項1至49中任一項之多肽次單元或如請求項51至77中任一項之六聚蛋白質的方法，其包含如請求項84之宿主細胞在表現該聚核苷酸或載體編碼之多肽次單元或六聚蛋白質的條件下培養，且回收該多肽次單元或六聚蛋白質。
  86. 一種促進抗原刺激之T細胞及/或NK細胞之存活或增殖的方法，其包含使抗原刺激之T細胞及/或NK細胞與如請求項51至77中任一項之六聚蛋白質或如請求項78之組合物接觸，其中該六聚蛋白質可特異性結合至該等T細胞及/或NK細胞表面上之GITR。
  87. 一種誘導活化之GITR表現之免疫細胞釋放細胞因子之方法，其包含使此等細胞與如請求項51至77中任一項之六聚蛋白質或如請求項78之組合物接觸，其中該六聚蛋白質可特異性結合至此等細胞表面上之GITR。
  88. 如請求項87之方法，其中該細胞因子為IFNγ、TNFα、IL-10、GM-CSF或其任何組合。
  89. 如請求項87或88中任一項之方法，其中該等GITR表現之免疫細胞為抗原刺激之CD4+ T細胞、抗原刺激之CD8+ T細胞、活化之NK細胞或其組合。
  90. 如請求項86至89中任一項之方法，其中該等活化之NK細胞、抗原刺激之CD4+或抗原刺激之CD8+ T細胞為人類NK細胞、CD4+或CD8+ T細胞，食蟹獼猴NK細胞、CD4+或CD8+ T細胞，恆河猴NK細胞、CD4+或CD8+ T細胞或其組合。
  91. 一種促進T細胞或NK細胞活化之方法，其包含使T細胞或NK細胞與如請求項51至77中任一項之六聚蛋白質或如請求項78之組合物接觸，其中該六聚蛋白質可特異性結合至該等T細胞或NK細胞表面上之GITR。
  92. 如請求項91之方法，其進一步包含經由該Fc域與表現FcγR之細胞相互作用使該六聚蛋白質交聯。
  93. 如請求項92之方法，其中該表現FcγR之細胞為B細胞、單核細胞、巨噬細胞、骨髓或漿細胞樣樹突狀細胞、濾泡性樹突狀細胞、蘭格漢氏細胞(Langerhans cell)、內皮細胞、NK細胞、嗜中 性白血球、嗜伊紅血球、血小板、肥大細胞、來自初級人類腫瘤或腫瘤引流(draining)或非引流淋巴結之CD45+細胞、來自其他次級或三級淋巴結構之CD45+細胞或其組合。
  94. 如請求項91至93中任一項之方法，其中NK細胞或T細胞活化可經由刺激該NFκB或MAPK信號轉導路徑量測。
  95. 如請求項91至94中任一項之方法，其中該等NK或T細胞為活化之NK細胞、抗原刺激之CD4+ T細胞、抗原刺激之CD8+ T細胞或其組合。
  96. 如請求項95之方法，其中該等NK細胞、CD4+或CD8+ T細胞為初級人類NK細胞、CD4+或CD8+ T細胞，食蟹獼猴NK細胞、CD4+或CD8+ T細胞，恆河猴NK細胞、CD4+或CD8+ T細胞或其組合。
  97. 如請求項86至96中任一項之方法，其中該接觸包含向個體投與有效量之該六聚蛋白質或包含該六聚蛋白質的組合物。
  98. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向需要治療之個體投與有效量之如請求項51至77中任一項之六聚蛋白質或如請求項78之組合物。
  99. 如請求項98之方法，其中該個體為人類個體或犬類個體。
  100. 如請求項98之方法，其中該癌症為實體腫瘤。
  101. 如請求項100之方法，其中該實體腫瘤係與選自由以下組成之群的癌症相關：結腸直腸癌、乳癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、間皮瘤、頭頸癌、胃癌、胰臟癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、神經膠母細胞瘤、睪丸癌、甲狀腺癌、前列腺癌及食道癌。
  102. 如請求項98之方法，其中該癌症為血液癌。
  103. 如請求項102之方法，其中該血液癌選自由以下組成之群：霍奇 金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病及慢性骨髓性白血病。
  104. 如請求項98至103中任一項之方法，其中投與該六聚蛋白質或組合物可抑制腫瘤生長、可促進腫瘤減小或兩者。
  105. 如請求項98至104中任一項之方法，其中腫瘤生長抑制係在NK細胞或T細胞存在下達成。
  106. 如請求項104或105之方法，其中與投與缺乏GITRL受體結合域之同型匹配對照相比，腫瘤生長抑制至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100%。
  107. 如請求項98至106中任一項之方法，其中該六聚蛋白質包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4P Fc域且可經由與GITR結合來誘導抗原刺激、GITR表現之免疫細胞之增殖，但基本上不觸發針對該等活化免疫細胞之補體依賴性或抗體依賴性細胞毒性。
  108. 如請求項107之方法，其中該等GITR表現之免疫細胞為CD4+ T細胞、NK細胞或CD8+ T細胞。
  109. 如請求項98至106中任一項之方法，其中該六聚蛋白質包含IgG1 Fc域且觸發表現高量GITR之細胞的NK細胞及/或巨噬細胞介導之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞吞噬作用。
  110. 如請求項109之方法，其中該等表現高量GITR之細胞為腫瘤細胞。
  111. 如請求項109之方法，其中該等表現高量GITR之細胞為CD4+ FOXP3+ T細胞。
  112. 如請求項111之方法，其中與對照相比，該六聚蛋白質提供降低CD4+ FOXP3+調節性T細胞之頻率。
  113. 如請求項111之方法，其中與對照相比，該六聚蛋白質提供降低腫瘤內CD4+ FOXP3+調節性T細胞之頻率。
  114. 一種增強個體之免疫反應之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如請求項51至77中任一項之六聚蛋白質或如請求項78之組合物。
  115. 如請求項114之方法，其中該個體為人類個體或犬類個體。
  116. 如請求項115之方法，其中該有需要之個體患有癌症。
  117. 如請求項116之方法，其中該癌症為實體腫瘤。
  118. 如請求項114至117中任一項之方法，其中該個體患有結腸直腸癌、乳癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、間皮瘤、頭頸癌、胃癌、胰臟癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、神經膠母細胞瘤、睪丸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、食道癌、膀胱癌、頭頸鱗狀細胞癌(SCCHN)、血液癌或其組合。
  119. 如請求項118之方法，其中該癌症為血液癌。
  120. 如請求項119之方法，其中該血液癌選自由以下組成之群：霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病及慢性骨髓性白血病。
  121. 如請求項114至120中任一項之方法，其中投與該六聚蛋白質或組合物可抑制腫瘤生長、可促進腫瘤減小或兩者。
  122. 如請求項114至121中任一項之方法，其中腫瘤生長抑制係在NK細胞或T細胞存在下達成。
  123. 如請求項121或122中任一項之方法，其中與投與缺乏GITRL受體結合域之同型匹配對照相比，腫瘤生長抑制至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70、至少 80%、至少90%、至少95%、至少98%或100%。
  124. 如請求項114至123中任一項之方法，其中該六聚蛋白質包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4P Fc域且可經由與GITR結合來誘導活化、GITR表現之免疫細胞之增殖，但基本上不觸發針對該等活化免疫細胞之補體依賴性或抗體依賴性細胞毒性。
  125. 如請求項124之方法，其中該等GITR表現之免疫細胞為CD4+ T細胞、NK細胞或CD8+ T細胞。
  126. 如請求項114至123中任一項之方法，其中該六聚蛋白質包含IgG1 Fc域且觸發表現高量GITR之細胞的NK細胞及/或巨噬細胞介導之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞吞噬作用。
  127. 如請求項126之方法，其中該等表現高量GITR之細胞為腫瘤細胞。
  128. 如請求項126之方法，其中該等表現高量GITR之細胞為CD4+ FOXP3+ T細胞。
  129. 如請求項126之方法，其中與對照相比，該六聚蛋白質提供降低CD4+ FOXP3+調節性T細胞之頻率。
  130. 如請求項126之方法，其中與對照相比，該六聚蛋白質提供降低腫瘤內CD4+ FOXP3+調節性T細胞之頻率。
  131. 一種治療個體之實體腫瘤之方法，其包含向該個體投與如請求項1之經分離之單鏈多肽次單元及OX40促效劑。
  132. 如請求項131之方法，其中該OX40促效劑為OX40配位體融合蛋白或抗OX40抗體中之一或多者。
  133. 如請求項132之方法，其中該OX40配位體融合蛋白為MEDI 6383。
  134. 如請求項132之方法，其中該抗OX40抗體為MEDI0562。
  135. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向需要治療之個體投與有效量之如請求項51至77中任一項之六聚蛋白質或如請求項78之組合物與T細胞激活劑(priming agent)組合。
  136. 如請求項136之方法，其中該T細胞激活劑為E7合成長肽(SLP)及加CpG寡脫氧核苷酸。
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