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TW201540321A - ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合多肽之替選調配物 - Google Patents

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TW201540321A
TW201540321A TW103137994A TW103137994A TW201540321A TW 201540321 A TW201540321 A TW 201540321A TW 103137994 A TW103137994 A TW 103137994A TW 103137994 A TW103137994 A TW 103137994A TW 201540321 A TW201540321 A TW 201540321A
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TW
Taiwan
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composition
concentration
buffer
sucrose
human
Prior art date
Application number
TW103137994A
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English (en)
Inventor
Carlos Banado
Cedric Bes
Orla Mcgarvey
Original Assignee
Mabxience S A
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50732113&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW201540321(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Mabxience S A filed Critical Mabxience S A
Publication of TW201540321A publication Critical patent/TW201540321A/zh

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Abstract

本發明係關於適用於儲存含有TNFR：Fc之多肽的水性穩定醫藥組合物。

Description

TNFR：Fc融合多肽之替選調配物
本發明係關於不含一些選定的適用於儲存含TNFR：Fc之多肽的胺基酸的水性穩定醫藥組合物。
治療性多肽製劑在使用之前常常經儲存。然而，多肽若以水性形式儲存延長的時間段，特定言之在不存在諸如精胺酸之穩定劑的情況下，則其為不穩定的。對於依賴水性儲存的替選方案為製備乾燥凍乾形式之多肽，儘管復原乾燥多肽常常導致凝集或變性。此多肽之凝集是不合需要的，因為其可能產生免疫原性。
可購得的可溶形式之融合到Fc域(TNFR：Fc)的TNF(腫瘤壞死因子)受體稱為依那西普(etanercept)。依那西普(商品名稱ENBREL®)藉由充當TNF抑制劑干擾腫瘤壞死因子(TNF)。由連接到人類IgG1之Fc部分的人類75kDa(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)之細胞外配位體結合部分組成的此二聚融合多肽目前與L-精胺酸及/或L-半胱胺酸一起調配作為防止多肽凝集的凝集抑制劑(參見EP1478394 B1)。
儘管如此，精胺酸可在一些人中導致嚴重的副作用。在精胺酸注射之後可能發生一種稱為全身性過敏反應之嚴重過敏性反應，以及胃不適，包括噁心、胃痙攣，或糞便數量增加。其他潛在副作用包括低血壓及血液中的大量化學物質及電解質發生變化，諸如高鉀、高 氯、低鈉、低磷酸鹽、高血尿素氮及高肌酐含量。理論上，精胺酸可增加出血風險、增加血糖含量、增加鉀含量且可能使鐮狀細胞疾病之症狀惡化。
半胱胺酸為非必要的胺基酸且與胱胺酸緊密相關，因為胱胺酸由兩個接合在一起的半胱胺酸分子組成。其為不穩定的養分且易於轉化為胱胺酸。在身體中過多的胱胺酸可導致胱胺酸症，其為一種罕見的可導致胱胺酸結晶在身體中形成且產生膀胱或腎結石的疾病。亦已知，罹患糖尿病及胱胺酸尿症之人可能對半胱胺酸補充劑有副作用。
WO2013/006454揭示不含精胺酸之含多肽組合物，其中在如EP1478394 B1中所揭示的類似組合物中使用的精胺酸已經鹽替代，該等鹽根據所提供之實例為140mM(參見實例1)。未參考在高溫下之穩定。實際上，其中所揭示之組合物以液體形式在2-8℃或冷凍下儲存。
本發明藉由提供允許儲存TNFR：Fc多肽之新穎穩定液體調配物來解決此等問題。出人意料地，本發明人已觀測到如本文所揭示之穩定水性組合物可製備為完全不含精胺酸及半胱胺酸且在高溫下高度穩定。
本發明係基於以下發現：包含為融合至人類IgG1之Fc區的人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽之水性調配物中之某些組分，諸如緩衝劑、鹽或賦形劑之量，可產生蛋白質在高溫下(高於5℃)之增加的穩定性。
因此，本發明係關於一種水性組合物，其包含：-分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；-鹽；及 -選自海藻糖及蔗糖及其組合之賦形劑，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
特定言之，本發明係關於一種水性組合物，其包含：-分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；-濃度為70mM至95mM或105mM至130mM之鹽，較佳為氯化鈉且更佳為濃度為約90mM之氯化鈉；-選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑，及-水性緩衝劑，其中該水性緩衝劑為丁二酸(丁二酸鹽)，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
另外，本發明係關於一種水性組合物，其包含：-分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；-鹽；-選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑，及-水性緩衝劑，其中該水性緩衝劑為濃度為30mM至150mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
圖1顯示條形圖，其顯示所發現之所有樣品之相對展開溫度(T起始/℃)，及使用330nm與310nm之間的螢光比率發現之誤差條。
圖2顯示條形圖，其具有所有調配物在初始時間時的pH及重量莫耳滲透濃度量測值。
圖3顯示在t=0及t=3個月時及在條件(-20℃、2-8℃及25℃，且在-20℃/25℃下之4個凍融循環之後)下之調配物F1、F3、F5、F6及F8及作為對照物之引發劑(僅在25℃，t=0及t=3下測試)之蛋白質濃度量測 值(在280nm處之吸光度)。
圖4顯示在長達3個月(0、1及3個)之時間及條件(-20℃、2-8℃、25℃，1，2及4次冷凍/融化(-20℃/25℃))下之調配物F1、F5、F6及F8與引發劑(t=0及3個月且在25℃下)相比之渾濁度量測值(在330nm處之吸光度)。
圖5A顯示藉由HIAC在t=0、1及3個月時對於調配物F1、F3、F5、F6及F8，且亦在t=6個月時對於F3，在-20℃及2-8℃下使用標準-杜克科學計數Cal所量測之亞可見粒子分析。
圖5B顯示藉由HIAC在t=0、1及3個月時對於調配物F1、F3、F5、F6及F8，且亦在t=6個月時對於F3，在25℃下，且在-20℃/25℃下之冷凍/融化(1次、2次、4次(1、2、4))下對於F1、F3、F5、F6及F8之亞可見粒子分析。
圖6A顯示調配物F5、F6及F7及引發劑(對照物)在t=0時及在1次-20℃/25℃條件下之冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
圖6B顯示調配物F8、F9及F1及引發劑(對照物)在t=0時及在1次-20℃/25℃條件下之冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
圖6C顯示調配物F1及F5在t=1個月時在-20℃、2-8℃及25℃下及在-20℃/25℃條件下之2個循環冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
圖6D顯示調配物F1及F5在t=3個月時在-20℃、2-8℃及25℃下及在-20℃/25℃條件下之4個循環冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
圖6E顯示調配物F6及F8在t=1個月時在-20℃、2-8℃及25℃下及在-20℃/25℃條件下之2個循環冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS- PAGE凝膠。圖6F顯示調配物F6及F8在t=3個月時在-20℃、2-8℃及25℃下及在-20℃/25℃條件下之4個循環冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。圖7A顯示在t=0時在調配物F1、F5、F6、F7、F8、F9及引發劑(對照物)中的尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7B顯示在-20℃/25℃下之1個週期冷凍/融化之後在調配物F1、F5、F6、F7、F8、F9及引發劑中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7C顯示針對t=1個月在-20℃下在調配物F1、F5、F6、F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7D顯示針對t=3個月在-20℃下在調配物F1、F3、F5、F6及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7E顯示針對t=1個月在2-8℃下在調配物F1、F5、F6、F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7F顯示針對t=3個月在2-8℃下在調配物F1、F3、F5、F6及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7G顯示針對t=1個月在25℃下在調配物F1、F5、F6、F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7H顯示針對t=3個月在25℃下在調配物F1、F3、F5、F6、F8及引發劑中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7I顯示針對t=1個月在25℃下在調配物F1、F5及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7J顯示針對t=3個月在25℃下在調配物F1、F3、F5、F8及引發劑中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7K顯示針對t=1個月在25℃下在調配物F1、F3、F5及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7L顯示在-20℃/25℃下之2個循環冷凍/融化之後在調配物F1、F5、F6及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7M、圖7N及圖7O顯示針對以下條件之在調配物F1、F3、F5、F6及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖之圖形概述：-20℃(圖7M)、2-8℃(圖7N)及25℃(圖7O)，就調配物F3而言在長達6個月之時間點下，就調配物F1、F5、F6及F8而言在長達3個月之時間點下。已量測且表示峰百分比(峰前百分比、主峰百分比及峰後百分比)。
圖7P顯示在t=0時及-20℃/25℃條件下之1個及2個循環冷凍/融化(1次及2次FzTh)之後在調配物F1、F3、F5、F6及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖之圖形概述。已量測且表示峰百分比(峰前百分比、主峰百分比及峰後百分比)。各條件之條按以下調配物次序指示：F1、F3、F5、F6及F8(亦即t=0，1次FzTh或2次FzTh)。
圖8顯示包括對基於細胞的效能分析(相對效能之百分比，與參考標準之效能相比較)之分析的圖表，該基於細胞的效能分析在調配物F1、F3、F5、F6及F8中在3個月之後(且F3亦在6個月之後)在25℃下進行，且與引發劑在3個月之後於25℃下相比較。緊鄰該圖亦提供針對25℃條件之資料表，其包括來自-20℃、2-8℃下及在-20℃/25℃下之4次冷凍/融化之後的相對效能百分比。
圖9顯示藉由HIC-HPLC在t=0時及3個月之後在2-8℃及-20℃儲存條件下按比例產生的F8之峰前、主峰及峰後百分比之圖形概述(驗收準則：主峰百分比83.1%，峰前百分比0.0%且峰後百分比16.9%)。
圖10顯示藉由競爭ELISA分析所測定之按比例產生的F8之相對結合百分比之圖形概述(驗收準則：80-125%相對結合活性)。
本發明係關於一種水性組合物，其包含：-分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分； -鹽；及-選自由海藻糖及蔗糖及其組合組成之群之賦形劑，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
特定言之，本發明係關於一種水性組合物，其包含：-分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；-濃度為70mM至95mM或105mM至130mM之鹽，較佳為氯化鈉且更佳為濃度為約90mM之氯化鈉；-選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑，及-水性緩衝劑，其中該水性緩衝劑為丁二酸(丁二酸鹽)，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
該組合物之pH可為6.0至7.0，較佳為約6.3。
另外，本發明係關於一種水性組合物，其包含：-分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；-鹽；-選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑，及-水性緩衝劑，其中該水性緩衝劑為濃度為30mM至150mM，較佳為約50mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
該組合物之pH可為6.0至7.0，較佳為約6.3。
較佳地，該組合物之進一步特徵在於組合物中不存在游離胺基酸。舉例而言，組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含甘胺酸，亦不包含甲硫胺酸，亦不包含組胺酸，亦不包含絲胺酸，亦不包含纈胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含麩胺酸鹽。
如本文所用，術語「組合物(composition或compositions)」可係指一或多種調配物，其包含經製備以適用於注射及/或投與至需要其之個體的多肽。「組合物」亦可稱為「醫藥組合物」。在某些實施例中，本文所提供之組合物實質上無菌且不含任何對接受者為過度毒性或感染性之藥劑。此外，如本文所用，溶液或水性組合物可意謂流體(液體)製劑，其含有一或多種溶解於適合溶劑(例如，水及/或其他溶劑，例如有機溶劑)或相互可互溶的溶劑之混合物中的化學物質。此外，如本文所用，術語「約」意謂所指示的值±其值之5%，術語「約」較佳完全意謂所指示的值(±0%)。
應注意，儘管根據本發明之組合物不包含單獨或經添加至組合物中之精胺酸或半胱胺酸(或較佳為任何其他胺基酸，諸如脯胺酸、甘胺酸、甲硫胺酸、組胺酸、絲胺酸、纈胺酸、離胺酸、麩胺酸鹽)，多肽本身可在其鏈中含有精胺酸或半胱胺酸(或任何其他胺基酸，諸如脯胺酸、甘胺酸、甲硫胺酸、組胺酸、絲胺酸、纈胺酸、離胺酸、麩胺酸鹽)胺基酸殘基。
在某些實施例中，含有經表達Fc域之多肽係藉由任何標準方法純化。當含有Fc域之多肽在細胞內產生時，微粒碎片係例如藉由離心或超過濾移除。當多肽被分泌至培養基中時，來自該等表達系統之上清液可首先使用標準多肽濃縮過濾器濃縮。亦可添加蛋白酶抑制劑以抑制蛋白分解，且可包括抗生素以阻止微生物生長。在一些實施例中，含有Fc域之多肽係使用例如羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析及親和性層析法及/或已知或待發現之純化技術之任何組合來純化。舉例而言，可使用蛋白A來純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之含有Fc域之多肽(Lindmark等人，1983,J.Immunol.Meth.62：1-13)。
取決於需要，亦可利用其他用於多肽純化之技術，諸如在離子交換管柱上分餾、乙醇沈澱、逆相HPLC、在矽石上層析、在肝素 SEPHAROSETTM上層析、在陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。可使用其他多肽純化技術。
在一較佳實施例中，鹽濃度為70mM至130mM，較佳為80mM至130mM，諸如70mM至90mM，或80mM至90mM，或70mM至95mM，或75至95，或80mM至95mM；或105mM至130mM，諸如110mM至130mM，諸如115mM至130mM，諸如115mM至125mM。較佳地，鹽濃度為90至130，諸如90mM至95mM，諸如105mM至125mM，諸如約90mM(或精確為90mM)、100mM或125mM。較佳地，鹽濃度為約(或精確為)90mM。如上所述，在本發明之上下文中，術語「約」意謂所指示的值±其值之5%，術語「約」較佳完全意謂所指示的值(±0%)。
與濃度無關，鹽較佳為氯化鈉，儘管亦可使用其他鹽，諸如氯化鉀、檸檬酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣、次氯酸鈉、硝酸鈉、硫化汞、鉻酸鈉及二氧化鎂。在一較佳實施例中，氯化鈉濃度為70mM至130mM，較佳為80mM至130mM，諸如70mM至90mM，或80mM至90mM，或75至95，或70mM至95mM，或80mM至95mM，或105mM至130mM，諸如110mM至130mM，諸如115mM至130mM，諸如115mM至125mM。較佳地，氯化鈉濃度為90至130，諸如90mM至95mM，諸如105mM至125mM，諸如約90mM(或精確為90mM)、100mM或125mM。較佳地，氯化鈉濃度為約(或精確為)90mM。此特定鹽濃度範圍允許獲得在高溫(即使高達50℃)下穩定的根據本發明之組合物。另外，此範圍中之值與先前技術中所用之彼等值(例如140mM)相比較接近人體中之生理重量莫耳滲透濃度，從而產生待用於(例如)皮下投與之更適合的組合物。如上所述，在本發明之上下文中，術語「約」意謂所指示的值±其值之5%，術語「約」較佳完全意謂所指示 的值(±0%)。
在另一較佳實施例中，分離多肽為依那西普。依那西普之Fc組分含有恆定重2(CH2)域、恆定重3(CH3)域及鉸鏈區，但不含有人類IgG1之恆定重1(CH1)域，依那西普可藉由重組DNA技術在中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)哺乳動物細胞表達系統中產生。其由934個胺基酸組成且具有大致150千道爾頓之表觀分子量(Physicians' Desk Reference,2002,Medical Economics Company Inc.)。
分離多肽，較佳為依那西普之濃度較佳為10mg/mL至100mg/mL，更佳在20mg/mL與60mg/mL之間且甚至更佳地，濃度為約25mg/mL或約50mg/mL。較佳地，濃度為約50mg/mL。如上所述，在本發明之上下文中，術語「約」意謂所指示的值±其值之5%，術語「約」較佳完全意謂所指示的值(±0%)。
在一較佳實施例中，賦形劑為海藻糖。較佳地，海藻糖以10mg/mL至80mg/mL，較佳30mg/mL至65mg/mL之濃度且更佳以10mg/mL，或20mg/mL，或30mg/mL，或34mg/mL，或60mg/mL海藻糖之濃度且以海藻糖二水合物之形式存在。在另一較佳實施例中，賦形劑為蔗糖。較佳地，蔗糖以5mg/mL至80mg/mL，諸如5mg/mL至40mg/mL之濃度存在。較佳地，蔗糖以10mg/mL至40mg/mL，更佳10-35mg/mL，10-25mg/mL之範圍存在，且更佳地，蔗糖濃度為約10mg/mL。如上所述，在本發明之上下文中，術語「約」意謂所指示的值±其值之5%，術語「約」較佳完全意謂所指示的值(±0%)。
舉例而言，賦形劑為濃度為5mg/mL至80mg/mL，諸如5mg/mL至40mg/mL，諸如5mg/mL至35mg/mL，諸如34mg/mL，諸如30mg/mL，諸如25mg/mL，諸如20mg/mL，諸如15mg/mL，諸如10mg/mL，諸如5mg/mL之海藻糖及/或蔗糖。在一特定實施例中，蔗糖及/或海藻糖濃度高於30mg/mL，例如在30-70mg/mL範圍內，更佳在 30-45mg/mL範圍內，諸如34mg/mL。
在另一實施例中，海藻糖濃度為10mg/mL。在一較佳實施例中，蔗糖濃度為10mg/mL。在另一實施例中，蔗糖濃度為34mg/mL。在另一較佳實施例中，賦形劑為蔗糖與海藻糖之間的組合，其中濃度分別在5mg/mL至80mg/mL(諸如5mg/mL至40mg/mL)範圍內或在10mg/mL至80mg/mL(諸如5mg/mL至40mg/mL)範圍內。較佳地，賦形劑為濃度為約34mg/mL之蔗糖。更佳地，賦形劑為濃度為(約)10mg/mL之蔗糖。
根據本發明之組合物可進一步包含水性緩衝劑。較佳地，該水性緩衝劑為磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀、順丁烯二酸、乙酸銨、參-(羥基甲基)-胺基甲烷(參)、乙酸鹽、丁二酸鹽、二乙醇胺、組胺酸或其組合。在一較佳實施例中，該水性緩衝劑為磷酸鈉。在一較佳實施例中，該水性緩衝劑為丁二酸鹽。在另一較佳實施例中，該水性緩衝劑為組胺酸。
與組合物中所用的緩衝劑無關(單獨或組合)，其濃度較佳在15mM與150mM之間，諸如15mM至100mM，較佳在20mM至150mM範圍內，諸如20mM至50mM或25mM至50mM或20mM至30mM。在一較佳實施例中，該濃度在20mM與100mM之間，較佳在20mM至50mM範圍內，諸如20mM、22mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM；或更高，諸如55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、90mM、100mM、150mM或更高。在一更佳實施例中，該濃度為約50mM。
較佳緩衝劑為磷酸鈉及丁二酸鹽緩衝劑(例如丁二酸鈉)。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約25mM之磷酸鈉。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約50mM之磷酸鈉。濃度為約50mM之丁二酸鹽緩衝劑為最佳緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為15mM至150mM之丁二酸鹽緩 衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為15mM至100mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約30mM至約150mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約30mM至約100mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約30mM至約80mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約20mM至約80mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約30mM至約70mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約30mM至約60mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約40mM至約60mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約45mM至約55mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約25mM至約55mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約20mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約22mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約25mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約30mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約35mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約40mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約45mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約50mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約55mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約60mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約65mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約70mM之丁二酸鹽緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可為濃度為約75mM之丁二酸鹽緩衝劑。最佳地，緩衝劑為濃度為約(或精確為)50mM之丁二酸鹽緩衝劑。如上所述，在本發明之上下文中，術語「約」意謂所指示的值±其值之5%，術語「約」較佳完全意謂所指示的值(±0%)。
在一較佳實施例中，丁二酸鹽濃度在20mM與100mM之間，較 佳在20mM至50mM或更高範圍內，諸如20mM、22mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM或75mM。
熟習此項技術者瞭解製備丁二酸鹽緩衝劑之方法。舉例而言，丁二酸鹽緩衝劑可藉由將丁二酸(succinic acid)(亦稱為丁二酸(butanedioic acid)，C4H6O4，MW：118.09g/mol)溶解在蒸餾水中來製備。緩衝劑之pH可隨後用例如氫氧化鈉(NaOH)調節。
在另一實施例中，無論不存在或存在水性緩衝劑，除組合物中已提供的一種賦形劑之外(海藻糖及/或蔗糖)，根據本發明之組合物可進一步包含一或多種賦形劑。在某些實施例中，本文所描述之組合物中之一或多種賦形劑之濃度為約0.001至5重量百分比，而在其他實施例中，一或多種賦形劑之濃度為約0.1至2重量百分比。賦形劑在此項技術中為熟知的，且藉由已知方法製造且可自商業供應者獲得。較佳地，該賦形劑為乳糖、甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麥芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人類血清白蛋白(SA)、重組血球凝集素(HA)、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、羥基乙基纖維素(HEC)、聚乙二醇、乙二醇、二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、脯胺酸、L-絲胺酸、麩胺酸、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸、肌胺酸、γ-胺基丁酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚山梨醇酯、聚氧化乙烯共聚物、磷酸鉀、乙酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、三甲胺N-氧化物、甜菜鹼、鋅離子、銅離子、鈣離子、錳離子、鎂離子、3-[(3-膽醯胺丙基)-二甲基銨基]-1-丙烷硫酸鹽(CHAPS)、蔗糖單月桂酸酯或其組合。在一更佳實施例中，賦形劑為聚山梨醇酯20，且在一甚至更佳實施例中，聚山梨醇酯20以0.1%之濃度存在。在另一更佳實施例中，賦形劑為甘胺酸，且在一甚至更 佳實施例中，甘胺酸以0.5%之濃度存在。
在另一較佳實施例中，組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，可能為選自6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8及6.9之任何pH。在一更佳實施例中，組合物之pH為約6.3。
在一特定實施例中，根據本發明之組合物包含50mg/mL之依那西普、25mM磷酸鈉緩衝劑、10mg/mL蔗糖、125mM氯化鈉，其中組合物之pH為6.3。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含50mg/mL之依那西普、25mM磷酸鈉緩衝劑、10mg/mL蔗糖、100mM氯化鈉，其中組合物之pH為6.3。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含50mg/mL之依那西普、50mM磷酸鈉緩衝劑、60mg/mL海藻糖二水合物、0.1%聚山梨醇酯20，其中組合物之pH為約pH 6.2。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含50mg/mL之依那西普、25mM磷酸鈉、34mg/mL蔗糖、90mM氯化鈉，其中組合物之pH為6.3。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含50mg/mL之依那西普、25mM磷酸鈉、10mg/mL蔗糖、90mM氯化鈉、0.5%甘胺酸，其中組合物之pH為6.3。
特定言之，本發明係關於一種水性組合物，其包含以下各者或由其組成：-分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；-濃度為70mM至130mM，諸如70mM至95mM，或105mM至130mM，較佳濃度為(約)90mM之鹽；-選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑，及 -水性緩衝劑，其中該水性緩衝劑為丁二酸(丁二酸鹽)，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
組合物之pH可為6.0至7.0，較佳為約6.3。
特定言之，本發明係關於一種水性組合物，其包含以下各者或由其組成：-分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；-濃度為70mM至95mM之鹽，其較佳為氯化鈉；-選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑，及-水性緩衝劑，其中該水性緩衝劑為約50mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
組合物之pH可為6.0至7.0，較佳為約6.3。
在另一實施例中，組合物包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；濃度為70mM至95mM之氯化鈉；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一實施例中，組合物包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；濃度為70mM至95mM之鹽(較 佳為氯化鈉)；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為30-150mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一實施例中，組合物包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；濃度為105mM至130mM之氯化鈉；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
舉例而言，組合物包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；濃度為90mM之氯化鈉；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含 半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
另外，本發明係關於一種水性組合物，其包含以下各者或由其組成：-分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；-鹽；-選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑，及-水性緩衝劑，其中該水性緩衝劑為濃度為30mM至150mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；鹽(較佳為氯化鈉)；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為30mM至100mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；鹽(較佳為氯化鈉)；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度 為30mM至80mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；鹽(較佳為氯化鈉)；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為30mM至70mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；鹽(較佳為氯化鈉)；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為30mM至60mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；鹽(較佳為氯化鈉)；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為40mM至60mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；鹽(較佳為氯化鈉)；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為45mM至55mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；鹽(較佳為氯化鈉)；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為(約)50mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包 含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；濃度為約90mM之氯化鈉；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為丁二酸(丁二酸鹽)，其濃度較佳為約15mM至約100mM，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為50mg/mL之依那西普)；以80mM至130mM之濃度存在的鹽(較佳為氯化鈉)；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為30mM至150mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；以80mM至130mM之濃度存在的鹽；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為約50mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為約6.3。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為50mg/mL之依那西普)；以70mM至95mM之濃度存在之NaCl；濃度為10mg/mL之蔗糖；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為30mM至150mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為50mg/mL之依那西普)；以105mM至130mM之濃度存在之NaCl；濃度為10mg/mL之蔗糖；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為30mM至150mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物 之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為50mg/mL之依那西普)；以70mM至95mM之濃度存在之NaCl；濃度為10mg/mL之蔗糖；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為15mM至100mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為50mg/mL之依那西普)；以105mM至130mM之濃度存在之NaCl；濃度為10mg/mL之蔗糖；及水性緩衝劑，其中水性緩衝劑為濃度為15mM至100mM之丁二酸(丁二酸鹽)，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺 酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本發明之水性組合物可包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分，其較佳為依那西普；15-100mM丁二酸鹽(諸如22mM丁二酸鹽或諸如50mM丁二酸鹽)；5-80mg/mL蔗糖及/或海藻糖；80-130mM鹽，諸如90mM，氯化鈉為較佳鹽，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；15-100mM丁二酸鹽；5-40mg/mL蔗糖及/或海藻糖；80-130mM鹽，氯化鈉為較佳鹽，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西 普)；15-100mM丁二酸鹽；5-80mg/mL蔗糖及/或海藻糖，蔗糖更佳；約90mM之鹽，氯化鈉為較佳鹽，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；20-50mM丁二酸鹽；5-80mg/mL蔗糖及/或海藻糖，蔗糖更佳；80-130mM氯化鈉，其中組合物之pH為約6.3。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分(較佳為依那西普)；約50mM丁二酸鹽；5-80mg/mL蔗糖及/或海藻糖，蔗糖更佳；90-130mM氯化鈉，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸 鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之依那西普；約50mM丁二酸鹽；5-15mg/mL蔗糖及/或海藻糖，蔗糖更佳；約90mM氯化鈉，其中組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0，約6.3之pH為最佳pH。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在依那西普中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分，較佳為依那西普；約50mM丁二酸鹽；約10mg/mL蔗糖及/或海藻糖，蔗糖更佳；約90mM氯化鈉，其中組合物之pH為約6.3。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分，較佳為依那西普；約50mM丁二酸鹽；約10mg/mL蔗糖；約80-130mM氯化鈉，其中組合物之pH為約6.3。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦 不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分，較佳為依那西普；約30-70mM丁二酸鹽；蔗糖及/或海藻糖；80-130mM鹽，較佳為氯化鈉80-130mM，其中組合物之pH在6與7之間，較佳為6.3。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分的分離多肽中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：約50mg/mL之依那西普、約50mM丁二酸鹽、約10mg/mL蔗糖、約90mM氯化鈉，其中組合物之pH為約6.3。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在依那西普中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物包含50mg/mL之依那西普、約50mM丁二酸鹽、約10mg/mL蔗糖、約90mM氯化鈉，其中組合物之pH為6.3。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在依那西普中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一特定實施例中，根據本發明之組合物由50mg/mL之依那西普、50mM丁二酸鹽、10mg/mL蔗糖、90mM氯化鈉組成，其中組 合物之pH為6.3。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在依那西普中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
在另一實施例中，根據本發明之組合物包含以下各者或由其組成：50mg/mL之依那西普、22mM丁二酸鹽、10mg/mL蔗糖、90mM氯化鈉，其中組合物之pH為6.3。較佳地，此組合物不含額外胺基酸(除包含在依那西普中之胺基酸外)。較佳地，此組合物既不包含精胺酸，亦不包含半胱胺酸，亦不包含離胺酸，亦不包含脯胺酸，亦不包含麩胺酸鹽，亦不包含絲胺酸，亦不包含甲硫胺酸。
本文所揭示之組合物可非經腸投與，例如皮下、肌肉內、靜脈內、腹膜內、腦脊髓內、關節內、滑膜內及/或鞘內投與。
包含在根據本發明之組合物中的分離多肽之治療效果為此項技術中已知的的，且包括但不限於治療類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎、肉芽腫病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、慢性阻塞性肺病、C型肝炎、子宮內膜異位、哮喘、惡病體質、牛皮癬或異位性皮膚炎或其他炎症或自身免疫相關的疾病、病症或病況。組合物可以足以治療病症(減輕其症狀，停止或減緩其進展)之量投與(例如治療有效量)。
以下實例用以說明本發明且不應理解為限制其範疇。
實例 製備用於實例1及實例2之組合物
以下組合物藉由簡單混合製備：
源材料：
含有62.5mg/mL之依那西普、1.2mg/mL參、40mg/mL甘露糖醇、10mg/mL蔗糖之工程運行材料，pH為7.4。在-20℃下儲存。
大量Enbrel®商業調配物用作對照物樣品(本文中指示為「Enbrel」或「Innovator」)。商業Enbrel調配物含有50mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、25mM精胺酸、100mM NaCl、10mg/mL蔗糖，pH 6.3)。
在與Enbrel®調配物相同的調配物中之依那西普用作內部對照物(50.9mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、25mM精胺酸、100mM NaCl、10mg/mL蔗糖，pH 6.3)。此調配物稱為F1。
藉由將所要量之丁二酸(C4H6O4，MW 118.09g/mol)溶解在蒸餾水中製備50mM丁二酸鹽緩衝劑。隨後用0.2N氫氧化鈉(NaOH)調節緩衝劑之pH。
候選調配物：
F2：水性調配物中之依那西普(49.4mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、100mM NaCl、10mg/mL蔗糖，pH 6.3)
F3：水性調配物中之依那西普(49.5mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、125mM NaCl、10mg/mL蔗糖，pH 6.3)
F4：水性調配物中之依那西普(50.9mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉、60mg/mL海藻糖二水合物，pH 6.2，0.1%聚山梨醇酯20)
F5：水性調配物中之依那西普(50.0mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、90mM NaCl、34mg/mL蔗糖，pH 6.3)
F6：在水性調配物中之依那西普(50.0mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、90mM NaCl、10mg/mL蔗糖、0.5%(5mg/mL)甘胺酸，pH 6.3)
F7：在水性調配物中之依那西普(50.0mg/mL依那西普、28mM組胺酸/HCl、90mM NaCl、10mg/mL蔗糖、6mg/mL甘胺酸，pH 6.3)
F8：在水性調配物中之依那西普(50.0mg/mL依那西普、50mM 丁二酸鹽、90mM NaCl、10mg/mL蔗糖，pH 6.3)。使用丁二酸50mM製備丁二酸鹽緩衝劑，且添加NaOH以調節pH至6.3。
實例1 內源蛋白質螢光發射光譜及靜態光散射
在266nm及473nm兩者處獲得在266nm處經激發之內源蛋白質螢光發射光譜以及靜態光散射資料。將各樣品載入微光析槽陣列(MCA)中且置放入Optim 1000中以說明膠態及構形穩定性之差異。在此研究中，以1℃之步長將熱斜坡實驗之溫度自15℃增加至95℃，且將樣品保持在各溫度下60秒以允許熱平衡。在等溫實驗中，溫度保持在62℃下，且重複200次量測樣品，各量測之間保持60秒。
Optim 1000儀器使用熱電加熱及冷卻以用於精密控制樣品溫度，從而允許進行熱斜坡或等溫型實驗。樣品同時經雷射光之多種波長照明，從而允許同時獲取螢光及光散射資料兩者。蛋白質之天然內源螢光允許其構象在無需添加外源染料的情況下經監視。此可用於判定蛋白質展開之溫度(Tm)、量測時間依賴性展開速率及量測構象隨溶劑環境或蛋白質一級序列之變化。同時獲取之靜態光散射允許靈敏監視由於熱或溶劑逆境所造成之蛋白質凝集(Tagg)且允許此與蛋白質構象之變化相關聯。
樣品經266nm及473nm雷射源照明期間之時間稱為曝露時間。曝露時間之選擇視多個因素而定，諸如螢光發射為多強及樣品對光褪色有多敏感。就所有此等樣品而言，使用1秒之曝露時間。
隨著改變曝露時間，有可能改變控制進入偵測器之光量的實體狹縫之尺寸。增加此開口之尺寸增加所量測之螢光信號，但減小儀器之頻譜解析度。
由Optim 1000進行之分析包含兩個連續位準，一級及二級。
Optim 1000軟體提供自動化一級及二級分析。如同任何自動化資 料擬合軟體，必須謹慎小心以確保輸入資料具良好品質以致自動化功能送回可靠結果。所有結果已由經培訓之分析者人工檢查。
一級分析自原始螢光發射及光散射資料提取光譜參數：
‧Optim可使用數學函數以提供一級位準資訊，諸如預期波長(亦稱為質心平均值)，其在科學文獻中愈來愈常用。此研究平均發射波長(或質量中心)，且為消除光譜資料中之任何雜訊之良好方法。
‧自260nm與270nm之間的(瑞利(Rayleigh)散射UV激發光)積分強度計算散射光強度。散射效率極其依賴於波長，因此波長愈短，光藉由溶液中之分子的散射就愈有效。266nm雷射之散射為針對平均分子質量之微小變化之極其靈敏的探針。
在此研究中，已使用在350nm與330nm之間的螢光強度之比率來研究抗體之熱展開，及使用來自266nm及473nm雷射之散射光強度來量測經熱誘發之樣品凝集。
二級分析採用來自一級分析之參數且判定樣品之熔融溫度「Tm」及凝集起始溫度「Tagg」(若此等存在)。熔融溫度經測定為經繪製為隨溫度變化之一級資料中之拐折點。
凝集溫度之起始經測定為散射光強度增加至相對於資料中之雜訊之臨限值以上的溫度。自所量測之最低溫度開始，將所量測之各散射強度值添加至所有先前量測值之資料集。在各點處，隨著分析進展，施加線性擬合且測定擬合度。若資料自直線顯著偏離(其中顯著性係藉由資料中之雜訊判定)，則此定義為凝集起始之溫度。若資料未顯著偏離，則算法前進至資料集中之下一點且再次測試此偏差。此方法已針對多種蛋白質及條件經測試且為穩定的。在較大凝集物形成且沈澱之極端情形中，若懸浮液中之粒子離開入射雷射之焦點體積，則光散射信號可實際上下降。然而，儘管隨後發生任何沈澱，初始起始可重複地經檢測。
就所有靜態光散射資料而言，無論樣品看起來是否沈澱出溶液，已包括所有點。在不同的重複實驗中之相同樣品將有時沈澱且有時不沈澱，但在各情況下凝集過程之開始可再現。
結論
發現在所有樣品之間的Tagg及T起始資料兩者極其類似。
‧在F1緩衝劑中，發現產物具有63.7±0.3℃之螢光T起始及66.8±0.3℃之Tagg。
‧在F2緩衝劑中，發現產物具有63.2±0.1℃之螢光T起始及65.9±0.1℃之Tagg。
‧在F3緩衝劑中，發現產物具有63.4±0.3℃之螢光T起始及65.6±0.4℃之Tagg。
‧在F4緩衝劑中，發現產物具有63.3±0.1℃之螢光T起始及64.8±0.1℃之Tagg。
‧在F5緩衝劑中，發現產物具有64.5±0.4℃之螢光T起始及63.0±0.6℃之Tagg。
‧在F6緩衝劑中，發現產物具有63.9±0.5℃之螢光T起始及65.4±0.2℃之Tagg。
‧在F7緩衝劑中，發現產物具有61.0±0.7℃之螢光T起始及63.6±0.1℃之Tagg。
‧在F8緩衝劑中，發現產物具有64.0±0.0℃之螢光T起始及66.2±0.8℃之Tagg。
‧發現Enbrel引發劑本身具有63.4±0.1℃之螢光T起始及65.6±0.1℃之Tagg。
藉由使用15℃與95℃之間的熱斜坡使用Optim 1000檢查樣品相對於各自之穩定性。使用靜態光散射及內源蛋白質螢光兩者對其進行分析。如上文所示，所有蛋白質開始展開之溫度在61℃與64.5℃之間。 此表明其為相當類似的，且若吾人排除樣品F7之貢獻，則其他5個樣品在63.4℃與64.5℃範圍內開始展開。亦發現樣品之Tagg值彼此非常接近且在63℃與67.4℃之間。
基於T起始資料，樣品F7似乎略微不同於其他5個樣品。Tagg資料顯示樣品F5及F7在與其他5個樣品相比較低的溫度下開始凝集。亦以替選方式比較樣品，其中比較自15℃至95℃之473nm靜態光散射。
因此，就此熱斜坡實驗而言，所有樣品在膠態及構形穩定性兩者上呈現為彼此及與引發劑極其類似，其中F1緩衝劑中之樣品與其他緩衝劑相比呈現為略微更穩定。藉由所有方法均將樣品F7選出為所有樣品中之最不穩定者。然而，此等差異僅為極其微小的，且所有樣品之穩定性仍可視為相當可比的。
在熱斜坡實驗之後，進行等溫實驗。在分析及回顧熱斜坡結果之後，似乎所有樣品均具有約64℃之Tagg值，且因此選擇62℃之溫度用於等溫實驗，亦即略低於Tagg但足夠接近以使樣品在合理的時間段內經歷構形及膠態變化。
圖1顯示調配物F1、F5、F6、F7、F8及引發劑(對照物)之結果，其中趨勢為F5>F8>F6>F1>Enbrel>F7。
實例2 短逆境穩定性研究 方法
進行短期(2週)穩定性研究以便在執行較長期研究之前評估可能的依那西普調配物。此外，對F3調配物進行長達6個月之長期穩定性研究，且對F5、F6及F8調配物進行長達3個月之長期穩定性研究。
測試九個調配物：
評估各調配物在t=0、3、7及14天時之穩定性，隨後使其曝露於兩個高溫(25℃及50℃)及一個實時溫度，另外施加攪動及凍融逆境。
就F3調配物而言，以0、1、3及6個月之時間點在曝露於三個溫度(2-8℃、-20℃及25℃)之後評估穩定性，另外施加具有經受-20℃冷凍/25℃融化之1、2及4次凍融循環的凍融逆境。
就F5、F6及F8調配物而言，亦以0、1及3個月之時間點在曝露於三個溫度(2-8℃、-20℃及25℃)之後評估穩定性，另外施加具有經受-20℃冷凍/25℃融化之1、2及4次凍融循環的凍融逆境。
使用8個分析分析之組評估各調配物之穩定性。
‧pH(t=僅為0)
‧重量莫耳滲透濃度(t=僅為0)
‧蛋白質濃度(A280nm)
‧渾濁度(A330nm)
‧HIAC
‧還原型SDS-PAGE(庫馬斯藍(coomassie blue)染料)
‧尺寸排阻-HPLC(SE-HPLC)
‧基於細胞之效能
pH及重量莫耳滲透濃度
圖2顯示具有在初始時間時的pH及重量莫耳滲透濃度量測值的條形圖。所有調配物之此等經量測值在將樣品設定在各條件下之前均在目標pH或理論重量莫耳滲透濃度值之範圍內。
蛋白質濃度/A280
下表及圖3概述在t=0及t=3個月時在-20℃、2-8℃及25℃下，且在-20℃/25℃下之4個凍融循環之後獲得之調配物F1、F3、F5、F6及F8及作為對照物之引發劑(僅在25℃，t=0及t=3下測試)之資料。所有調配物之蛋白質濃度均在目標(50mg/mL)下或接近目標。
調配物F5、F6及F8(在280nm處之吸光度)在時間=3個月時的蛋白質濃度量測值保持在所有此等調配物之目標值下，另外F1在所有條件下保持在目標值下。
渾濁度/A330
下表概述在t=0及t=3個月時且在-20℃/25℃下之1、2及4個凍融循環之後獲得之調配物F1、F5、F6、F7、F8、F9及在t=0及25℃下之引發劑(對照物)之渾濁度資料。調配物F1、F5及F8未呈現渾濁度之較大變化。當在25℃下儲存時，F6呈現渾濁度之最高變化。
如上所述，在1或3個月之後在所有條件下且與t=0時相比未觀測到調配物F5、F8或F1之渾濁度之顯著進一步增加(圖4)。
HIAC(液體粒子計數器) 方法：
HIAC 9703液體粒子計數系統用於實驗。HIAC由取樣器、粒子計數器及Royco感應器組成。Royco感應器能夠確定2μm至100μm之間的粒子大小且對其進行計數。該儀器可計數粒子10,000計數/毫升。
‧樣品體積(mL)：0.2
‧流動速率mL/min：10
‧運行之次數(每一樣品)：4(捨棄第一次運行)
程序：
‧首先，在不稀釋的情況下分析樣品，但歸因於樣品之高黏度，確定其需要經稀釋以獲得更精確的結果。
‧持續1小時使樣品達到室溫。
‧在適當的調配物緩衝劑中以1：3稀釋樣品，對其脫氣(1.5小時)且在量測之前小心地混合。
‧標準-杜克(Duke)科學計數Cal：用EZY-Cal 5μm及15μm粒度控制標準進行系統適用性檢查。在開始時分析控制標準以檢驗感應器之解析度。
圖5A及圖5B顯示藉由HIAC在t=0、1及3個月時且在-20℃、2-8℃(圖5A)、25℃，1、2、3及4次冷凍/融化(在-20℃/25℃下之1次、2次、3次及4次FzTh)(圖5B)下使用標準-杜克科學計數Cal所量測之對於調配物F1、F3、F5、F6及F8之亞可見粒子分析。
用於構造該圖5A之資料在下表中提供。
用於構造圖5B之資料在下表中提供。
如在圖5A及圖5B中可見，對於2-8℃時間點在3個月之後自t=0未觀測到F1、F3、F5、F6及F8之亞可見粒子計數之顯著變化。在25℃下隨時間推移F8無顯著變化，其顯示此調配物之穩定性。
在25℃下在3個月之後未觀測到對照物樣品(引發劑產物)之亞可 見粒子計數之顯著變化。隨時間推移，引發劑產物與F1、F3、F5、F6及F8相比呈現最高粒子計數(參見下表)。
SDS-PAGE
圖6A顯示調配物F5、F6及F7及引發劑(對照物)在t=0時及在1次-20℃/25℃條件下之冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
圖6B顯示調配物F8、F9及F1及引發劑(對照物)在t=0時及在1次-20℃/25℃條件下之冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
在t=0時及在-20℃/25℃下之1個凍融週期之後的調配物F8、F9、F1與參考標準相當。
圖6C顯示調配物F1及F5在t=1個月時在-20℃、2-8℃及25℃下及在-20℃/25℃條件下之2個循環冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
調配物F1及F5在1個月時間點時在所有條件下均與參考標準相當。1個月之後在25℃下調配物F5顯示額外~100kDa之譜帶的輕微跡象。
圖6D顯示調配物F1及F5在t=3個月時在-20℃、2-8℃及25℃下及在-20℃/25℃條件下之4個循環冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
圖6E顯示調配物F6及F8在t=1個月時在-20℃、2-8℃及25℃下及在-20℃/25℃條件下之2個循環冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
在-20℃及2-8℃下在1個月之後，包括在-20℃/25℃下之2個循環冷凍/融化之後的調配物F6及F8經顯示與參考標準相當。
1個月之後在25℃下調配物F6展現幾乎完全丟失主要譜帶，若干額外低分子量分解譜帶為明顯的。
圖6F顯示調配物F6及F8在t=3個月時在-20℃、2-8℃及25℃下及在-20℃/25℃條件下之2個循環冷凍/融化之後的用庫馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
3個月後在25℃下對F6觀測到顯著變化，其中150kD譜帶消失且出現若干LMW分解譜帶。對於F6及F8兩者僅顯示在~50kDa及~30kD下之極微弱的帶出現之輕微跡象。
SE HPLC(尺寸排阻HPLC)條件：
‧管柱：TSKGel SuperSW3000 4.6×300mm，4μm(Tosoh,18675)CV=2.5mL
‧管柱溫度：25℃
‧行動相：0.2M磷酸鹽緩衝劑，pH 6.8
‧流動速率：0.35mL/min
‧運行時間：20min
‧樣品負載：37.6μg
‧自動取樣器溫度：4℃
圖7A顯示在t=0時在調配物F1、F5、F6、F7、F8、F9及引發劑(對照物)中的尺寸排阻HPLC之層析圖。
所有此等調配物在t=0時呈現相當之層析曲線。
在t=0時的引發劑(對照物)與t=0時的F1、F5、F6、F7、F8及F9相比呈現顯著較高的峰前百分比及峰後百分比兩者。
圖7B顯示在-20℃/25℃下之1個循環冷凍/融化之後在調配物F1、F5、F6、F7、F8及F9中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
調配物F1、F5、F6、F7及F8在1個凍融週期之後為相當的。
下表提供用尺寸排阻HPLC針對t=0及在-20℃/25℃條件下之1個循環冷凍/融化(1次FzTh)之後在調配物F1、F5、F6、F7、F8及F9及引發劑(對照物)中之較長期研究之結果。
對照物(引發劑)在t=0時與F1、F5、F6、F7、F8及F9相比呈現最高的峰前凝集物百分比。
圖7C顯示針對t=1個月在-20℃下在調配物F1、F5、F6、F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
1個月之後在-20℃儲存條件下調配物之間未顯示顯著差異。僅對於調配物F5觀測到略微較低的峰後。
圖7D顯示針對t=3個月在-20℃下在調配物F1、F3、F5、F6、F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
3個月之後在-20℃儲存條件下，就F1、F5、F6及F8而言調配物之間未顯示顯著差異。3個月之後在-20℃下對於F3觀測到較高峰前及峰後且與所有其他調配物相比較。
圖7E顯示針對t=1個月在2-8℃下在調配物F1、F5、F6、F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
1個月之後在2-8℃儲存條件下未顯示調配物之間的顯著差異。對於調配物F5觀測到略微較低的峰後。
圖7F顯示針對t=3個月在2-8℃下在調配物F1、F3、F5、F6、F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
3個月之後在2-8℃儲存條件下未顯示調配物之間的顯著差異。3個月之後在2-8℃下對於F3觀測到較高峰前及峰後且與所有其他調配物相比較。
圖7G顯示針對t=1個月在25℃下在調配物F1、F5、F6、F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
1個月之後在25℃條件下在F6中觀測到劇烈變化，其中主峰完全丟失，從而導致峰後衰減。1個月之後在25℃下未觀測到所有其他調配物(F1、F5、F8)之顯著變化。
圖7H顯示針對t=3個月在25℃下在調配物F1、F3、F5、F6、F8及引發劑中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
3個月之後在25℃儲存條件下就F1、F3、F5、F6、F8而言在調配物之間未顯示顯著差異，其中對於F5觀測到略微較低的峰後。3個月之後在25℃下，引發劑展現對F3所觀測到之最高峰前及峰後。F6呈現曲線之劇烈變化，其中主峰完全丟失。
圖7I顯示針對t=1個月在25℃下在調配物F1、F5及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
圖7J顯示針對t=3個月在25℃下在調配物F1、F3、F5、F8及引發劑中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
3個月之後在25℃儲存條件下在F1、F3、F5與F8調配物之間無顯著差異。引發劑與所有其他調配物相比顯示顯著峰前凝集物及峰後降解產物。
圖7K顯示針對t=1個月在25℃下在調配物F1、F3、F5及F8中之尺 寸排阻HPLC之層析圖。
1個月之後在25℃下調配物F3呈現最高的峰前凝集物百分比。
圖7L顯示在-20℃/25℃下之2個循環冷凍/融化之後在調配物F1、F5、F6及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖。
在-20℃/25℃下之2個凍融循環之後未顯示調配物之間的顯著差異。僅對於調配物F5觀測到略微較低的峰後。
下表提供用尺寸排阻HPLC針對t=0、1及3個月在-20℃、2-8℃及25℃儲存條件下且在-20℃/25℃條件下之1、2及4個循環冷凍/融化(1、2及4次FzTh)之後在調配物F1中之較長期研究之結果。
下表提供用尺寸排阻HPLC針對t=0、1及3個月在-20℃、2-8℃及25℃儲存條件下且在-20℃/25℃條件下之1、2及4個循環冷凍/融化(1次、2次及4次FzTh)之後在調配物F5中之較長期研究之結果。
下表提供用尺寸排阻HPLC針對t=0、1及3個月在-20℃、2-8℃及25℃儲存條件下且在-20℃/25℃條件下之1、2及4個循環冷凍/融化(1次、2次及4次FzTh)之後在調配物F6中之較長期研究之結果。
下表提供用尺寸排阻HPLC針對t=0、1及3個月在-20℃、2-8℃及25℃儲存條件下且在-20℃/25℃條件下之1、2及4個循環冷凍/融化(1次、2次及4次FzTh)之後在調配物F8中之較長期研究之結果。
圖7M、圖7N及圖7O顯示針對以下條件之在調配物F1、F3、F5、F6及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖之圖形概述：-20℃(圖7M)、2-8℃(圖7N)及25℃(圖7O)，就調配物F3而言在長達6個月之時間點下，就調配物F1、F5、F6及F8而言在長達3個月之時間點下。已量測且表示峰百分比(峰前百分比、主峰百分比及峰後百分比)。
圖7P顯示在t=0時及-20℃/25℃條件下之1個及2個循環冷凍/融化(1次及2次FzTh)之後在調配物F1、F3、F5、F6及F8中之尺寸排阻HPLC之層析圖之圖形概述。已量測且表示峰百分比(峰前百分比、主峰百分比及峰後百分比)。各條件之條按以下調配物次序指示：F1、F3、F5、F6及F8(亦即t=0，1次FzTh或2次FzTh)。
下表提供用尺寸排阻HPLC針對t=0在25℃儲存條件下在調配物引發劑中之較長期研究之結果。
基於細胞之效能分析 方法： -對於較短時間點(0、3、7及14天)
‧分兩個批次測試樣品(在t=0及t=3天(d)之後及在t=7及t=14 d時間點之後)。
‧所有樣品均由單一分析者在生物分析中測試一次，除了對照物樣品，其在六個(6)測試日中之每一者均經測試。
‧採取在A280nm處之吸光度量測值以判定原始稀釋液及後續樣品稀釋液之精確濃度。
‧總體分析效能為可接受的。106個劑量反應曲線(來自53個培養板)中之三個(3)需要在至多2個不同濃度處遮蔽一個孔以滿足孔-至-孔變化性分析準則
‧孔-至-孔變化性%CV20%
‧分析窗口(D/A)6
‧R2 0.98
量測47個測試樣品之相對效能一次且量測對照物不同的六(6)次。對照物之平均相對效能為100.2%，95% CI為96.9%至103.6%。
‧對照物之六次單獨量測之分析變化性(%GCV)為3.2%。此方法之低分析變化性表明，自單一量測獲得之測試樣品之相對效能值為可接受的。
‧基於單一量測，大部分測試樣品具有接近100%之相對效能(與參考標準之相對效能相當)。
‧當儲存在高溫下(50℃)三(3)天時，測試樣品開始失去效能且效能在後續時間點處下降。
-對於較長時間點(3個月及6個月)
‧在一個批次中測試樣品(包括t=6個月(F3)及t=3個月(所有其他樣品及條件)。
‧所有樣品均由單一分析者在生物分析中測試一次所使用之參 考標準為E16 ADS Lot DC-4168-85。
‧採取在A280nm處之吸光度量測值以判定原始稀釋液及後續樣品稀釋液之精確濃度。
‧總體分析效能為可接受的。所有劑量反應曲線(來自6個培養板之12個劑量反應曲線)滿足孔-至-孔變化性分析準則而無需遮蔽任何孔。在TME 0498-01中指定的分析驗收準則如下：
-孔-至-孔變化性%CV20%
-分析窗口(D/A)6
-R2 0.98
‧用於分析中之劑量反應曲線之分析窗口介於~4至4.5。劑量反應曲線之所有關鍵參數(A、B、C及D)均在歷史資料之正常範圍內。之前已顯示過，較小的分析窗口(>3)將不包含分析精確度，且因此，此分析之結果被接受。
在此情況下，使用Softmax Pro v5.2分析資料以檢驗分析驗收準則，且若需要，以遮蔽孔。
基於細胞之生物分析結果：
圖8顯示包括對基於細胞的效能分析(相對效能之百分比，與參考標準、引發劑之效能相比較)之分析的圖表，該基於細胞的效能分析在調配物F1、F3、F5、F6及F8中在3個月之後(且F3在6個月之後)在-20℃、2-8℃、25℃下及在-20℃/25℃下之4次冷凍/融化之後，與引發劑在3個月之後於25℃下相比較。緊鄰該圖亦提供資料表。
與引發劑相比，在所有條件下F1、F3、F5與F8之間未觀測到相對效能百分比之顯著差異。所有樣品具有與參考標準相當之相對效能。F6在3個月之後在25℃下無剩餘效能。所有樣品具有與參考標準相當之相對效能。
實例3
以2000L規模製造且在F8中調配之原料藥批次在經受逆境研究時展示與按比例縮小之批次相當的穩定性。用於逆境研究之F8按比例樣品為：
‧在50mM丁二酸/NaOH(丁二酸鹽緩衝劑)中之51.3mg/mL依那西普、90mM NaCl、10mg/mL蔗糖，pH 6.3。
藉由將丁二酸溶解在蒸餾水中製備丁二酸鹽緩衝劑。用0.2N氫氧化鈉將緩衝劑之pH值調節至6.3。
作為與引發劑產品之連接，Enbrel，~50mg/mL之代表性批次包括在所有分析方法中作為參考/對照物，其中待分析產品品質且其中未經受逆境。
在使樣品F8經受選定物理逆境及藉由6種方法之後續分析之後評估該材料之化學及生物穩定性。逆境之影響係藉由蛋白質濃度(OD 280nm)、渾濁度(OD 340nm)、pH、SE-HPLC、HI-HPLC及競爭性結合ELISA判定。
特定而言，來自批次F8之七個樣品用於判定逆境之影響，如下：
‧1次緩慢T/F(融化樣品及再冷凍)：樣品在室溫(RT)下融化1h，按體積劃分為等分試樣用於各別方法且在-20℃下再冷凍
‧3次緩慢T/F：如上，但T/F循環進行三次
‧1次快速T/F：樣品在保溫箱中在37℃下融化1h，按體積劃分為等分試樣用於各別方法且在-20℃下再冷凍
‧3次快速T/F：如上，但T/F循環進行三次
‧攪動/RT：樣品在RT下融化且在RT下置放於600rpm下之定軌搖動器上24小時。此後按體積劃分為等分試樣用於各別方法且在-20℃下再冷凍。
‧過濾/RT：樣品經由0.45μm過濾，且隨後樣品經由0.2μm再過 濾。此後將樣品置放在RT下24小時。此後按體積劃分為等分試樣用於各別方法且在-20℃下再冷凍。
‧對照物/無逆境。使其融化且按體積劃分為等分試樣用於各別方法且在-20℃下再冷凍。
應用六種測試方法以分析處於逆境下的樣品之任何潛在化學及生物變化：
‧蛋白質濃度(OD280)
‧用額外340nm量測之蛋白質濃度
‧在測試樣品中之pH、電位測定-通用程序
‧SEC(尺寸排阻層析法)，雜質測試
‧HIC(疏水性相互作用層析法)，雜質測試
‧競爭性結合ELISA分析
對稀釋至~1mg/mL之樣品進行OD280。在340nm下對未經稀釋樣品進行渾濁度。在500μL樣品中用用於較小體積之電極進行pH量測。
F8調配物之蛋白質濃度(OD280)、渾濁度(OD340)及pH之結果編輯於下表中。
如上文所示，渾濁度及pH未受逆境影響。濃度不同，但其與歸因於所施加的逆境相比可能更歸因於較小體積之方法及使用。
藉由SE-HPLC所測定之雜質曲線編輯於下表中。
上表包括峰之所用命名；在主峰前方溶析之峰稱為「峰前」，且「峰後」用於在主峰後方溶析之峰。示範運行批次之雜質曲線包括極小的峰前百分比；0.9-1.1%及1.1-1.1%之峰後。峰曲線似乎不歸因於所施加之不同逆境而變化。
因此，物理逆境不改變藉由SE-HPLC測定之純度曲線。
藉由HI-HPLC測定之雜質曲線編輯於下表中。
物理逆境不改變藉由HI-HPLC測定之純度曲線。偵測「攪動/RT」樣品中之峰後含量與其他樣品相比似乎更歸因於此樣品之層析能力。
對於競爭性結合ELISA，基於劑量依賴性效能計算相對結合活性以與引發劑參考結合競爭。
下表包括來自至TNF-α之結合效能的資料。活性係相對於參考材 料測定；且因此係相對於在表1中報告的蛋白質濃度測定。相對結合效能經測定為93-133%，其被認為在分析之變化內。
就所有樣品而言，認為至TNF-α配位體之相對結合效能在歸因於方法之變化內均為類似的。
實例4 按比例穩定性
以2000L規模製造且在F8中調配之原料藥(依那西普)之批次展示與按比例縮小之批次相當的穩定性，如在t=0時及在2-8℃及-20℃下儲存3個月之後，藉由蛋白質濃度(A280)、SEC、SDS-PAGE(還原型)、渾濁度及基於細胞之效能所評估。亦已藉由HIC-HPLC及競爭結合ELISA在t=0時及在2-8℃及-20℃下儲存3個月之後量測F8按比例批次之原料藥之額外穩定性資料，如圖9及圖10中分別所示。
以製造比例填充入預填充注射器中之藥品批次亦在t=0時經分析，且藉由蛋白質濃度(A280)、SEC-HPLC、HIC-HPLC、SDS-PAGE(還原型)、渾濁度及基於細胞之效能及相對結合百分比(競爭ELISA)表明與先前報告之F8資料之可比較性。填充後亦分析F8藥品之亞可見微粒，且結果在10μm(119個粒子粒子及25μm(11個粒子)之驗收準則範圍內。
總體概述
基於來自所進行之分析之總體最高穩定性及相對效能，調配物F5(25mM磷酸鈉、90mM NaCl、34mg/mL蔗糖，pH 6.3)及F8(50mM丁二酸鹽/NaOH、90mM NaCl、10mg/mL蔗糖，pH 6.3)被識別為領先調配物，且如上表所示，其指示F8與F1(引發劑液體調配物)相比表現相當或更佳且亦比F3及F6調配物表現更佳。

Claims (18)

  1. 一種水性組合物，其包含：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；鹽；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑，及水性緩衝劑，其中該水性緩衝劑為濃度在30mM至150mM範圍內之丁二酸鹽緩衝劑，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
  2. 如請求項1之組合物，其中該鹽濃度為80mM至130mM。
  3. 一種水性組合物，其包含：分離多肽，其為融合至人類IgG1之Fc區之人類p75腫瘤壞死因子受體之細胞外配位體結合部分；濃度為70mM至95mM或濃度為105mM至130mM之鹽；選自海藻糖及蔗糖或其組合之群之賦形劑，及水性緩衝劑，其中該水性緩衝劑為丁二酸鹽緩衝劑，其特徵在於該組合物中既不存在精胺酸亦不存在半胱胺酸。
  4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該鹽之濃度為90mM。
  5. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該鹽為氯化鈉。
  6. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該分離多肽為依那西普(etanercept)。
  7. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該分離多肽係以45mg/mL至55mg/mL之濃度存在。
  8. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該分離多肽係以50mg/mL之濃度存在。
  9. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該賦形劑為蔗糖。
  10. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該賦形劑係以5mg/mL至80mg/mL之濃度存在。
  11. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該賦形劑係以8mg/mL至20mg/mL之濃度存在。
  12. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該賦形劑係濃度為10mg/mL之蔗糖。
  13. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該丁二酸鹽緩衝劑係以50mM之濃度存在。
  14. 如請求項1至3中任一項之組合物，其進一步包含一或多種賦形劑。
  15. 如請求項14之組合物，其中該賦形劑為乳糖、甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麥芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人類血清白蛋白、重組血球凝集素、葡聚糖、聚乙烯醇、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、羥基乙基纖維素(HEC)、聚乙二醇、乙二醇、二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、脯胺酸、L-絲胺酸、麩胺酸、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸、肌胺酸、γ-胺基丁酸、聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-80、十二烷基硫酸鈉、聚山梨醇酯、聚氧化乙烯共聚物、磷酸鉀、乙酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、三甲胺N-氧化物、甜菜鹼、鋅離子、銅離子、鈣離子、錳離子、鎂離子、3-[(3-膽醯胺丙基)-二甲基銨基]-1-丙烷硫酸鹽、蔗糖單月桂酸酯或其組合。
  16. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該組合物之pH為pH 6.0至pH 7.0。
  17. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該組合物之pH為pH 6.3。
  18. 如請求項1至3中任一項之組合物，其包含50mg/mL之依那西普、50mM丁二酸鹽、90mM NaCl、10mg/mL蔗糖，其中該組合物之pH為pH 6.3。
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