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TW201512397A - 於細胞培養中三羧酸（ｔｃａ）中間物用以控制氨產生的用途 - Google Patents

於細胞培養中三羧酸（ｔｃａ）中間物用以控制氨產生的用途 Download PDF

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TW201512397A
TW201512397A TW103108908A TW103108908A TW201512397A TW 201512397 A TW201512397 A TW 201512397A TW 103108908 A TW103108908 A TW 103108908A TW 103108908 A TW103108908 A TW 103108908A TW 201512397 A TW201512397 A TW 201512397A
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TW
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cell culture
culture medium
tca
acid
cell
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Application number
TW103108908A
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Oscar Lara-Velasco
Christina Michele Waehner
Original Assignee
Glaxosmithkline Ip No 2 Ltd
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Abstract

本發明是關於一種在哺乳動物細胞培養中降低氨離子濃度的方法、一種在哺乳動物細胞培養中維持或增加細胞生產力的方法、一種在哺乳動物細胞培養中維持或增進細胞生長的方法，以及一種在細胞培養中降低氨離子累積量對抗體醣基化型態的影響的方法，其包含使該等細胞於細胞培養基中生長，以及使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基的步驟。

Description

於細胞培養中三羧酸(TCA)中間物用以控制氨產生的用途
本發明是有關於被設計成表現治療性蛋白質之哺乳動物細胞生長的細胞培養基以及方法的領域。
三羧酸(TCA)循環被認為是產生能量供細胞使用的必要路徑。這個路徑是從燃料分子獲得能量的最終共同路徑。糖、胺基酸與脂肪酸被氧化而獲得呈ATP形式的能量。
同時，TCA供應細胞主要建構單元來生成細胞內的其他分子。脂肪酸、胺基酸、嘌呤、嘧啶的中間物尤其可在細胞生長與分裂期間，以及在蛋白質合成期間的數個時間點被取出。
在沒有足夠中間物補充TCA循環的情況下，細胞可使用胺基酸來補充彼等中間物。將那些胺基酸轉換成中間物需要去醯胺化作為第一步驟，其中氨離子(NH4+)是胺基酸轉換成TCA中間物的副產物。端視細胞對中間物的需求而定，氨離子可能在培養基中累積達到有害影響。當以抑制性濃度存在時，彼等氨離子可能影響抗體醣基化型態、細胞生產力，以及細胞生長。
為了避免有害程度的氨離子濃度，目前純粹將具有抑制性濃度氨的水性細胞培養基丟棄並置換成新鮮培養基。這是沒有效率的，因為需要額外用於消毒與儲存新鮮培養基的設備以及在新鮮培養基中伴隨替換昂貴的血清。因此，需要從哺乳動物細胞培養物中移除氨以及氨離子而不需要置換培養基，且可被已知廣泛不同的細胞株所採用的方法。
在一個態樣中，本發明是關於一種在哺乳動物細胞培養中降低氨離子濃度的方法，包含以下步驟：使該等細胞於細胞培養基中生長，以及使有效量的三羧酸(“TCA)中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的三羧酸(“TCA)中間物組成物投與至細胞培養基。
在另一個態樣中，本發明是關於一種在哺乳動物細胞培養中維持或增加細胞生產力的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：使該等細胞於細胞培養基中生長，以及使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基。
在另一個態樣中，本發明是關於一種在哺乳動物細胞培養中維持或增進細胞生長的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：使該等細胞於細胞培養基中生長，以及使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基。
在另一個態樣中，本發明是關於一種在細胞培養中降低氨離子累積量對抗體醣基化型態的影響的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：使該等細胞於細胞培養基中生長，以及 使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基。
在另一個態樣中，本發明是關於一種包含TCA中間物組成物的細胞培養基。
除非另有定義，否則本文所用全部技術與科學術語具有與本發明所屬技術中具有通常技術者共同理解的意思。任何與本文所述者類似或相同的方法和材料可用於實施本發明測試。在說明與請求本發明之時，將使用下列術語。
應理解，本發明不限於特定方法、試劑、化合物、組成物或生物系統，它們當然可以予以改變。亦應理解，本文所用術語僅供說明特定具體利用，不欲具有限制之意。如本說明書以及隨附申請專利範圍中所用，除非上下文另有清楚指明，否則單數型「一」(a、an)與「該」包括複數指涉對象。因此，例如提到”一種糖”包括兩種或更多種糖與類似物的組合。
如本文所用，當意指可測量數值(諸如數量、持續時間及類似者)時，”約”意欲含括相對於指定數值±20%或±10%的變化，包括±5%、±1%及±0.1，只要此等變化適於實施揭示的方法即可。
在一個態樣中，本發明是關於一種在哺乳動物細胞培養中降低氨離子濃度的方法，包含以下步驟：使該等細胞於細胞培養基中生長，以及使有效量的三羧酸(“TCA)中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的三羧酸(“TCA)中間物組成物投與至細胞培養基。
在另一個態樣中，本發明是關於一種在哺乳動物細胞培養中維持或增加細胞生產力的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：使該等細胞於細胞培養基中生長，以及使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基。
在另一個態樣中，本發明是關於一種在哺乳動物細胞培養中維持或增進細胞生長的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：使該等細胞於細胞培養基中生長，以及使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基。
在另一個態樣中，本發明是關於一種在細胞培養中降低氨離子累積量對抗體醣基化型態的影響的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：使該等細胞於細胞培養基中生長，以及使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基。
在另一個態樣中，本發明是關於一種包含TCA中間物組成物的細胞培養基。
在某些具體例中，該等TCA中間物為丙酮酸、α-酮戊二酸、延胡索酸、蘋果酸與草醋酸。在某些具體例中，該等TCA中間物為丙酮酸、α-酮戊二酸、延胡索酸、蘋果酸與草醋酸的鉀鹽或鈉鹽。
在一個具體例中，TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM草醋酸(或其鹽)。在另一個具體例中，TCA中間物組成物包含約3mM至約45mM草醋酸(或其鹽)。在某些具體例中，草醋酸(或其鹽)被添加至培養物中達約5mM、約10mM或約15mM的最終濃度。
在一個具體例中，TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM蘋果酸(或其鹽)。在另一個具體例中，TCA中間物組成物包含約3mM至約45mM蘋果酸(或其鹽)。在一個具體例中，蘋果酸(或其鹽)被添加至培養物中達約5mM、約10mM或約15mM的最終濃度。
在一個具體例中，TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM丙酮酸(或其鹽)。在另一個具體例中，TCA中間物組成物包含約3mM至約45mM 丙酮酸(或其鹽)。在某些具體例中，丙酮酸(或其鹽)被添加至培養物中達約15mM、約30mM或約45mM的最終濃度。
在一個具體例中，TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM α-酮戊二酸(或其鹽)。在另一個具體例中，TCA中間物組成物包含約3mM至約45mM α-酮戊二酸(或其鹽)。在某些具體例中，α-酮戊二酸(或其鹽)被添加至培養物中達約15mM、約30mM或約45mM的最終濃度。
在一個具體例中，TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM延胡索酸(或其鹽)。在另一個具體例中，TCA中間物組成物包含約3mM至約45mM延胡索酸(或其鹽)。在某些具體例中，延胡索酸(或其鹽)被添加至培養物中達約15mM、約30mM或約45mM的最終濃度。
在一個具體例中，TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM蘋果酸(或其鹽)及約0.1mM至約100mM丙酮酸(或其鹽)。在另一個具體例中，TCA中間物組成物包含約3mM至約45mM蘋果酸(或其鹽)及約3mM至約45mM丙酮酸(或其鹽)。
術語”細胞培養基”及”培養基”與”發酵培養基”意指用於哺乳動物細胞生長的營養液，其通常提供下列類型中一或多種的至少一種組分：1)一能量來源，通常呈諸如葡萄糖之碳水化合物的形式；2)所有必需胺基酸，且通常為二十種胺基酸加上半胱胺酸的基本組合；3)以低濃度需求的維生素及/或其他有機化合物；4)游離脂肪酸；以及5)微量元素，其中微量元素定義為以極低濃度需求的無機化合物或天然元素，通常在微莫耳範圍內。
該營養液可視情況補充下列類型中任一者的一或多種組分：1)激素與其它生長因子，諸如胰島素、運鐵蛋白及表皮生長因子；2)鹽類與緩衝劑，諸如鈣、鎂和磷酸鹽； 3)核苷與鹼基，諸如腺苷、胸苷與次黃嘌呤；以及4)蛋白質與組織水解物。
當培養基本質上無任何哺乳動物來源的血清(例如胎牛血清[FBS])時，細胞培養基通常為”無血清”。”本質上無”表示細胞培養基包含約0-5%血清，較佳約0-1%血清且最佳約0-0.1%血清。
術語"哺乳動物宿主細胞”、”宿主細胞”、”哺乳動物細胞”與類似者意指衍生自哺乳動物的細胞株，當置放在含有適當營養素與生長因子的培養基中的單層培養物或懸浮培養物中時能夠生長並存活下來。特定細胞株的必須生長因子無需過度實驗即可按經驗來決定，如例如在Mammalian Cell Culture,Mather,J.P.ed.,Plenum Press,N.Y.(1984)，與Barnes and Sato,(1980)Cell,22：649中所述。通常細胞能夠表現並分泌大量特定感興趣醣蛋白至培養基中。在本發明的上下文中，適當哺乳動物宿主細胞的實例可包括中國倉鼠卵巢細胞、CHO/-DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77：4216(1980))；dp12.CHO細胞(EP 307,247 published Mar.15,1989)；小鼠賽特利細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23：243-251(1980))；人類子宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.,383：44-68[1982])；MRC 5細胞；FS4細胞。
在某些具體例中，維持細胞的細胞專一性生產力。在某些具體例中，細胞是選自由下列組成之群：CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、K562細胞、BHK細胞、PER.C6細胞，以及HEK細胞。在某些具體例中，該細胞為CHO細胞或CHO細胞的亞純系(subclone)，包括(但不限於)CHO K1、CHO pro3-、CHO DUXB11以及CHO DG44細胞。
細胞培養的”生長期”意指指數細胞生長的期間(對數期)，其中細胞大體上快速地分裂。在這段時期期間，細胞培養一段時間，通常介於1-5天，且 在此情況下細胞生長為最高。宿主細胞生長週期的測定是測量預期的特定宿主細胞而不需要過度實驗。”細胞生長為最大的時間期間以及條件”與類似者意指彼等針對特定細胞株測定為對細胞生長與分裂最佳的培養條件。在生長期期間，細胞於潮濕受控氣氛下培養在含有必須添加物的營養培養基中，通常在約30℃-40℃，較佳在37℃，以達到對特定細胞株來說的最佳生長。細胞維持在生長期約一至五天的期間，通常介於二至三天。
細胞培養的”過渡期”意指生產期之培養條件所佔的時間期間。在過渡期期間，諸如銅離子濃度與溫度的環境因素從生長條件被轉換至生產條件。
細胞培養的”生產期”意指細胞生長達到平線區(plateaued)或維持在近乎恆定程度的時間期間。在生產期期間，對數細胞生長終止且蛋白質產生為首要。在這段時間期間，培養基大體上經補充以幫助持續蛋白質產生並達到所要的醣蛋白產物。
術語”表現(expression)”或”表現(expresses)”在本文中用來意指宿主細胞內發生的轉錄與轉譯。在宿主細胞中，產物基因的表現程度可基於存在於細胞內的對應mRNA數量或由產物基因編碼之被細胞表現的蛋白質數量來決定。舉例而言，由產物基因轉錄的mRNA可如所需要地藉由北方雜交來進行定量。Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,pp.7.3-7.57(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。由產物基因編碼的蛋白質可以藉由分析蛋白質的生物活性或藉由採用與此活性無關的分析(例如使用能夠與該蛋白質反應之抗體的西方墨點或放射免疫分析)來進行定量。Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,pp.18.1-18.88(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
在適於特定細胞的培養基中製備本發明的哺乳動物細胞培養物；要被培養。商業上可取得的培養基(諸如漢氏F10(Sigma)、最低必須培養基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)，以及杜貝可氏改良伊格氏培養基(DMEM,Sigma))為例示性營養液。另外，可使用下列中所述培養基的任一者作為培 養基：Ham and Wallace,(1979)Meth.Enz.,58：44；Barnes and Sato,(1980)Anal.Biochem.,102：255；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第5,122,469號或第4,560,655號；國際公開案第WO 90/03430號；與第WO 87/00195號；其所有揭示內容併入本文做為參考資料。此等培養基中的任一者視需要補充有激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(諸如氯化鈉、鈣、鎂與磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷(諸如腺苷與胸苷)、抗生素(諸如健他黴素(Gentamycin)TM藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍的最終濃度存在的無機化合物)脂質(諸如亞麻油酸或其他脂肪酸)及其適當載劑，和葡萄糖或相同能量來源。任何其他必須補充劑也以習於技藝者熟知的適當濃度被納入。
在一個特定具體例中，哺乳動物宿主細胞為CHO細胞，較佳為CHO DUX(DHFR-)或其亞純系，諸如CHO K1、CHO pro3-、CHO DG44、CHO DP12細胞，且適宜培養基含有基礎培養基組分，諸如以DMEM/HAM F-12為基礎的配方(用於DMEM與HAM F12培養基的組成以及尤其是無血清培養基，參見American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,Sixth Edition,1988,pages 346-349中的培養基配方)(如美國專利第5,122,469號中所述的培養基配方尤其適宜)，其中一些組分(諸如胺基酸、鹽類、糖與維生素)的濃度經修改，且視情況含有甘胺酸、次黃嘌呤與胸苷；重組人類胰島素、經水解腖(諸如蛋白酶腖2與3、Primatone HS或Primatone RL(Difco,USA；Sheffield,England))或其等效物；細胞保護劑，諸如Pluronic F68或等效物Pluronic多元醇；健他黴素；以及微量元素。細胞培養基較佳無血清。
可藉由生長中細胞來製造多肽，該等細胞在不同的細胞培養條件下表現所需要的蛋白質。例如，大規模或小規模蛋白質生產的細胞培養程序在本發明中是有效可用的。可使用包括(但不限於)流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、迴轉瓶培養或攪拌槽生物反應器系統的程序(在最後兩個系 統中有或沒有微擔體)，且可選擇地以批次、饋料批次或連續模式來進行操作。
在一個具體例中，本發明的細胞培養是在攪拌槽生物反應器系統中進行且採用饋料批次培養程序。在一個具體例中，哺乳動物宿主細胞的饋料批次培養物以及培養基一開始被供應至培養容器中，且在培養期間以連續或不連續增量的方式饋送額外培養營養素至培養物，其中在培養中止之前有或沒有週期性細胞及/或產物收取。饋料批次培養可包括(例如)半連續饋料批次培養，其中定期地移除整個培養物(包括細胞與培養基)並且置換為新鮮培養基。饋料批次培養與單純批次培養不同之處在於細胞培養用的所有組分(包括細胞與所有培養營養素)在培養程序開始之時被供應至培養容器。饋料批次培養可進一步因為上清液不會在過程期間從培養容器中移除而有別於灌注培養(在灌注培養中，細胞是藉由例如過濾、囊封、錨定至微擔體、沉積等而留滯在培養物中，且培養基連續或間斷地被引入並從培養容器被移除)。
此外，培養物的細胞可依據任何流程或慣用程序而被擴增，前述流程或慣用程序對於預期的特定宿主細胞與特定生產計劃來說是適宜的。因此，本發明預想到單步驟或多步驟培養程序。在單步驟培養中，宿主細胞被接種至培養環境中並且在細胞培養的一個單獨生產期期間採用本發明方法。或者，可預想多階段培養。在多階段培養中，可在一些步驟或階段中培育細胞。例如，細胞可生長在第一步驟或生長期(其中細胞可能從儲存被移除)中，其被接種至適於促使生長與高存活率的培養基中。細胞可以藉由將新鮮培養基添加至宿主細胞培養物而在生長期中維持一段適宜時間期間。
依據本發明的另一個態樣，可設計饋料批次或連續細胞培養條件以提高哺乳動物細胞在細胞培養的生長期中的生長。在生長期中，細胞在針對生長最大化的條件與時間期間下生長。培養條件(諸如溫度、pH、溶氧(dO2) 與類似者)是彼等針對特定宿主所使用且對於具有通常技術者來說是輕易的。一般而言，使用酸(例如CO2)或鹼(Na2CO3或NaOH))將pH調整至介於約6.5至7.5的程度。培養哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)的適當溫度範圍介於30至38℃，且較佳約37℃。而適宜dO2介於5-90%飽和空氣。
在特定階段時，細胞可被用來接種生產期或階段的細胞培養物。或者，如上所述生產期或階段可以與接種或生長期或階段相接續。在一個具體例中，細胞培養為饋料批次細胞培養。
”多肽”、”肽”及”蛋白質”在本文交替用來意指胺基酸殘基的聚合物。多肽可以是天然(組織衍生的)來源、原核或真核細胞製品的重組或天然表現物，或經由合成方法以化學的方式製造。該等術語適用於胺基酸聚合物(其中一或多個胺基酸殘基為對應天然胺基酸的人工化學擬似物)，以及天然胺基酸聚合物與非天然胺基酸聚合物。胺基酸擬似物意指具有與胺基酸的大體結構不同的結構，但是以與天然胺基酸類似的方式發揮作用的化學化合物。於科學與專利文獻中充分說明了非天然殘基；可用作為天然胺基酸殘基擬似物的一些例示性非天然組成物以及指引描述於下文。芳香族胺基酸擬似物可藉由被例如下列置換而產生：D-或L-萘基丙胺酸；D-或L-苯基甘胺酸；D-或L-2噻吩基丙胺酸；D-或L-1,-2,3-或4-芘基丙胺酸；D-或L-3噻吩基丙胺酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙胺酸；D-或L-(4-異丙基)-苯基甘胺酸：D-(三氟甲基)-苯基甘胺酸：D-(三氟甲基)-苯基丙胺酸；D-p-氟-苯基丙胺酸；D-或L-p-聯苯基苯基丙胺酸；K-或L-p-甲氧基-聯苯基苯基丙胺酸：D-或L-2-吲哚(烷基)丙胺酸；以及D-或L-烷基丙胺酸，其中烷基可以是經取代或未經取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、第二仲異基、異戊基或非酸性胺基酸。非天然胺基酸的芳香環包括，例如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基以及吡啶基芳香環。
如本文所用”肽”包括本文具體指明之彼等肽的守恆性變異的肽。如本 文所用”守恆性變異”表示胺基酸殘基被另一個生物學上相似的殘基取代。守恆性變異的實例包括(但不限於)一個疏水性殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸、正白胺酸或甲硫胺酸)置換成另一者，或一個極性殘基置換成另一者(諸如精胺酸置換成離胺酸、麩胺酸置換成天冬胺酸，或麩醯胺酸置換成天冬醯胺酸)以及類似者。可置換成另一者的天然親水性胺基酸包括天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸與蘇胺酸。”守恆性變異”也包括經取代胺基酸取代未經取代的母體胺基酸，前提是針對經取代多肽的抗體也會與未經取代的多肽發生免疫反應。此等守恆性置換在本發明肽分類的定義中。如本文所用”正統”意指任何在pH 7.4具有靜正電荷的肽。該等肽的生物學活性也可藉由習於技藝者熟知與本文所述的標準方法來測定。
當與提及蛋白質一起使用時，”重組”表明蛋白質已經藉由引入異源性核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而被修飾。
如本文所用，”治療性蛋白質”意指任一種蛋白質及/或多肽，其可被投與給哺乳動物而引起被例如研究人員或臨床醫師所檢驗之組織、系統、動物或人的生物學或醫學反應。治療性蛋白質可引起超過一種生物學或醫學反應。此外，術語”治療有效量”表示相較於未服用此數量的對應個體，產生(但不限於)治癒、預防或改善疾病、病症或副作用，或減低疾病或病症進展速率的任一數量。該術語在其範圍內也包括有效增強正常生理學功能的數量，還有在患者體內增強或有助於第二醫藥劑之治療效用的生理學功能的數量。
本文表明的所有”胺基酸”殘基呈L構型。遵循標準多肽命名，胺基酸殘基的縮寫如下：
應注意，所有胺基酸殘基序列在本文是由慣用式來表示，其左至右方向是胺基端至羧基端的習知方向。
在另一個具體例中，該多肽為抗原結合多肽。在一個具體例中，該抗原結合多肽是選自由下列組成之群：可溶性受體、抗體、抗體片段、免疫球蛋白單可變域、Fab、F(ab')2、Fv、雙硫連結Fv、scFv、封閉型構型多特異性抗體、雙硫連結scFv或雙鏈抗體。
術語”抗原結合多肽”如本文所用意指能夠結合至抗原的抗體、抗體片段或其他蛋白質構築體。
術語Fv、Fc、Fd、Fab，或F(ab)2是以其標準意思來使用(參見例如Harlow et al.,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988))。
”嵌合抗體”意指一種類型的經工程化抗體，其含有一個衍生自供體抗體的天然可變區(輕鏈與重鏈)與衍生自受體抗體的輕鏈與重鏈恆定區相締合。
”人類化抗體”意指一種類型的經工程化抗體，其具有衍生自非人類供體免疫球蛋白的CDR，分子其餘衍生自免疫球蛋白的部分是衍生自一(或多) 種人類免疫球蛋白。此外，骨架支撐殘基可以被改變成保留結合親和力(參見例如Queen et al.,Proc.Natl.Acad Sci USA,86：10029-10032(1989),Hodgson et al.,Bio/Technology,9：421(1991))。適宜的人類受體抗體可以是依據與供體核苷酸和胺基酸序列的同源性而自習知資料庫(例如KABAT.RTM.資料庫、Los Alamos資料庫以及Swiss Protein資料庫)選定者。藉由供體抗體骨架區的同源性(以胺基酸為主)來鑑別的人類抗體可能適於提供用於插入供體CDR的重鏈恆定區及/或重鏈可變骨架區。以類似方式來選定能夠供給輕鏈恆定或可變骨架區的適宜受體抗體。應注意，受體抗體重鏈與輕鏈不必然衍生自相同的受體抗體。先前技術說明數種製造此等人類化抗體的方法-參見例如EP-A-0239400以及EP-A-054951。
術語”供體抗體”意指一種抗體(單株及/或重組)，其將其可變區、CDR或其他功能性片段或其類似者的胺基酸序列貢獻至第一免疫球蛋白夥伴，因而提供有所改變的免疫球蛋白編碼區並因而表現帶有供體抗體之抗原特異性與中和活性特徵的經改變抗體。
術語”受體抗體”意指一種與供體抗體為異源性的抗體(單株及/或重組)，其將所有(或任一部份，但在一些具體例中為全部)編碼其重及/或輕鏈骨架區及/或其重及/或輕鏈恆定區的胺基酸序列貢獻至第一免疫球蛋白夥伴。在某些具體例中，人類抗體為受體抗體。
”CDR”定義為抗體的互補決定區胺基酸序列，其為免疫球蛋白重鏈與輕鏈的超變異區。參見例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的變異部分中有三個重鏈以及三個輕鏈CDR(或CDR區)。因此，”CDR”如本文所用意指所有三個重鏈CDR，或所有三個輕鏈CDR(或若適當的話全部重鏈CDR以及所有輕鏈CDR)。抗體的結構以及蛋白質摺疊可表示其他殘基被視為抗原結合區的一部分且能被習於技藝者所理解。參見例如Chothia et al.,(1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions；Nature 342,p 877-883。
如本文所用術語”結構域”意指摺疊的蛋白質結構，其具有與蛋白質其餘部分無關的三級結構。大體上，結構域是蛋白質的分散功能特性的主因且在許多情況下可以被添加、移除或轉移至其他蛋白質而不喪失蛋白質其餘部分及/或結構域的功能。”抗體單可變域”是摺疊的多肽域，其包含抗體可變域的序列特徵。因此，其包括完整抗體可變域以及經修飾的可變域，例如其中一或多個環被置換成並非抗體可變域的序列，或抗體可變域已被截斷或包含N或C端延伸部分，以及至少保有全長結構域之結合活性與特異性的可變域折疊片段。
片語”免疫球蛋白單可變域”意指抗體可變域(VH、VHH、VL)，其特異地結合某個抗原或表位而與不同的V區或結構域無涉。免疫球蛋白單可變域可與其他不同可變區或可變域呈現某種形式(例如同集合體或雜集合體)，其中其他區或結構域對於被單免疫球蛋白可變域的抗原結合來說是不需要(例如免疫球蛋白單可變域結合抗原與額外可變域無關)。”域抗體”或”dAb”與”免疫球蛋白單可變域”相同，能夠結合至如本文所用的術語抗原。免疫球蛋白單可變域可以是人類抗體可變域，但也包括其他物種(諸如囓齒動物(例如，如WO 00/29004中所揭示)、鉸口鯊與駱駝科VHH Dab(奈米抗體))的單抗體可變域。駱駝科VHH為免疫球蛋白單可變域多肽，其衍生自包括駱駝、駱馬、羊駝、單峰駝與原駝的物種，它們製造缺少輕鏈的天然重鏈抗體。此等VHH域可依據技藝中可取得的標準技術予以人類化，且此等域依據本發明仍被視為”域抗體”。如本文所用”VH包括駱駝科VHH域。NARV是另一種類型的免疫球蛋白單可變域，其在軟骨魚(包括鉸口鯊)中被鑑定。此等結構域也已知為新穎抗原受體可變區(Novel Antigen Receptor variable region)(通常縮寫為V(NAR)或NARV)。更多詳細內容參見Mol.Immunol.44,656-665(2006)and US20050043519A。
術語"表位-結合域”意指特異地結合抗原或表位而與不同V區或結構域無涉的結構域，這可能是域抗體(dAb)，例如人類、駱駝科或鯊魚免疫球蛋白單可變域。
如本文所用，術語"抗原-結合位點"意指蛋白質上的一個位點，其能夠特異地結合至抗原，這可能是單域，例如表位-結合域，或其可以是如標準抗體上所發現的成對VH/VL域。在本發明的一些態樣中，單鏈Fv(ScFv)域可提供抗原-結合位點。
術語"mAbdAb”以及"dAbmAb”在本文中用來意指本發明的抗原-結合蛋白質。兩個術語可互換使用，且意欲具有如本文所使用的相同意思。
圖1說明TCA循環中間物之劑量反應研究的實驗設計。
圖2說明TCA循環中間物交互作用研究的區塊#1的實驗設計。
圖3說明TCA循環中間物交互作用研究的區塊#2的實驗設計。
圖4說明關於條件的活細胞濃度，線顯示二重複搖瓶的平均數。
圖5說明搖瓶研究中的乳糖累積量。線顯示二重複條件的平均數。
圖6顯示所有測試條件的氨累積量。線顯示各個測試條件的二重複搖瓶平均數。
圖7說明α-酮戊二酸與草醋酸添加至培養物的氨累積量。線顯示各個測試條件的二重複搖瓶平均數。
圖8說明經不同濃度TCA中間物處理的培養物的細胞專一性生產力。誤差槓顯示數值範圍。
圖9說明在DOE的區塊1與區塊2中，所有測試條件的活細胞濃度。
圖10說明在DOE的區塊1與區塊2中，所有測試條件的氨累積量概況。
圖11說明在DOE的區塊1與區塊2中，所有測試條件的最大氨累積量。
圖12說明在DOE的區塊1與區塊2中，所有測試條件的最終細胞專一性生產 力。
圖12a、12b與12c說明相較於對照培養的丙酮酸劑量反應。NH4 +濃度取決於劑量，但效用僅持續數天。在丙酮酸消耗之後重新生成NH4 +(圖12b)。圖序顯示(a)活細胞濃度，(b)NH4 +累積量作為培養時間的函數，以及(c)細胞NH4 +比生產率。在圖(c)中，曲線斜率表示細胞專一性生產率或消耗率。
圖13a、13b與13c說明相較於對照培養的α-酮戊二酸劑量反應。
圖14a、14b與14c說明相較於對照培養的蘋果酸劑量反應。
圖15a、15b與15c說明相較於對照培養的草醋酸劑量反應。
圖16a、16b與16c說明相較於對照培養的延胡索酸劑量反應。
圖17說明相較於對照培養的檸檬酸劑量反應。
圖18a、18b與18c說明相較於對照培養的蘋果酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、延胡索酸與草醋酸劑量反應。
圖19a、19b與19c說明添加兩種TCA中間物對培養的影響。
圖20a、20b與20c說明添加三種TCA中間物對培養的影響。
圖21至24說明添加一種TCA中間物(圖21與22)、兩種TCA中間物的組合(圖23)以及三種TCA中間物的組合(圖24)的平均對細胞專一性生產力。
實例1--材料與方法/實驗設計
依據商業可取得性，針對劑量反應實驗來選定數個TCA循環中間物，自Sigma Aldrich購得酸或其鈉鹽以製備用於本研究中的原液饋料。選定的化合物為丙酮酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、延胡索酸、蘋果酸(或鈉鹽)以及草醋酸(無鈉鹽可用)。
草醋酸以及蘋果酸被添加至培養物中達5mM、10mM與15mM的最終濃度。測試的其餘TCA中間物被添加至培養物中達15mM、30mM與45mM的最終濃度。圖1歸納測試的TCA循環組分及其在路徑中的位置。表1歸納 在研究中搖瓶的操作條件以及各劑量反應研究的饋料時間表。
每次在研究組開始之時建立對照搖瓶。那些對照搖瓶為饋料批次培養且沒有添加任何TCA中間物。以兩個重複的搖瓶進行所有測試條件。
實例2--測試選定TCA中間物交互作用的實驗設計(DOE)/分析方法
在兩個區塊中進行測試所有選定化合物交互作用的實驗。區塊的每一者被設計成含有中心點以及對照搖瓶(批次培養，無添加任何組分)。第一區塊測試丙酮酸、α-酮戊二酸、延胡索酸與草醋酸的交互作用。第二區塊測試丙酮酸、α-酮戊二酸、延胡索酸、草醋酸與蘋果酸的交互作用。圖2顯示區塊#1的實驗建立，而圖3顯示區塊#2的實驗建立。以二重複的方式進行所有條件。搖瓶的操作條件顯示於表2中。
每隔一天取樣搖瓶培養物以測定總細胞濃度(TCC)、活細胞濃度(VCC)、細胞存活率、代謝物(葡萄糖、乳糖、麩醯胺酸、麩胺酸以及氨)濃度與滲透度。標準樣品被分成以細胞為主的分析(TCC、存活率分析)以及無細胞分析(代謝物濃度、滲透度)。將來參考用的補充樣品(無細胞上清液)是藉由將一部分的標準藥品離心並在Nunc冷凍管中等分成1.8mL來產生，冷凍管接著被儲存在-70℃下。針對濾過0.22μm-過濾器的樣品測定滴定濃度。
使用自動細胞計數器基於錐蟲藍排除法(ViCell XR,Beckman Coulter)來測定TCC、VCC以及存活率。在細胞計數(TripLE,Life Technologies,USA)之前，使用等體積蛋白酶原液與培養物將樣品以蛋白酶預先處理。於溫和搖動下容許解離的培育在37℃下進行歷時20-25分。使用Nova Bioprofile(Nova Bioprofile 400)測量代謝物；其依據以酵素為基礎的電化學反應來操作。滲透度測量是基於冰點降低法(Advanced Instruments,Model N/A)。針對抗體累積量以及結合活性測定(Biacore)將經過濾的無細胞樣品送至生物分析發展群。
參數計算
活細胞濃度的積分
活細胞的積分是使用VCC數據來計算並遵循下式推算至梯形法，
其中：IVC，活細胞密度的積分[=](106細胞/mL).天
t，培養時間[=]天
VCC，活細胞密度[=]106細胞/mL
ni，在整個培養中取得的樣品數目，為計算目的i=4
比生產力是使用最後滴定濃度數據點除以最後IVC計算值來計算。
實例3--劑量反應結果
本實驗分成三個區塊。第一個區塊測試丙酮酸、檸檬酸、α-酮戊二酸與延胡索酸。第二個區塊測試草醋酸而第三個區塊測試蘋果酸。
圖4顯示所有搖瓶的合併平均VCC結果。所有以檸檬酸處理的培養物在添加檸檬酸至培養物之後兩天內立刻喪失存活率，如同活細胞濃度降低所指明。以高濃度(15mM與30mM)添加至培養物的蘋果酸也引起培養物的細胞存活率損失，如圖4中所見。在這個情況下，添加蘋果酸顯示劑量反應效用，其中30mM濃度的蘋果酸引起的存活率下降最快，接著是15mM，而當培養物中的蘋果酸濃度為5mM時，存活率沒有降低(相較於對照搖瓶)。
乳糖累積量取決於被添加至培養物中的TCA中間物類型與數量。對照搖瓶顯示低乳糖累積量(<1.0g/L)，在約第7天達到最高，然後是乳糖消耗期。
當45mM丙酮酸被添加至培養物，乳糖累積量達到約3g/L。所有其他TCA中間物影響乳糖累積量達1g/L至2g/L的程度。在被添加蘋果酸達最終濃度為5mM的搖瓶中，乳糖累積量概況與對照搖瓶中所見相似。
氨概況顯示不同程度的累積量。在搖瓶測試對照條件中的氨濃度達到接近於9mM。圖6歸納在劑量反應研究中所有測試條件的數據。添加丙酮酸至培養物中達最終濃度為45mM在第5天導致氨消耗量至多到第10天。這個時間點之後，在培養物中氨累積量重新達到最終濃度為7mM。當丙酮酸被添加至30mM，氨消耗效用僅持續到第8天且接著氨累積至8mM。丙酮酸添加至最終濃度為15mM僅對氨降低有少許影響且培養物累積氨達到比在對照搖瓶中略高的程度。
在氨累積量方面提供最佳控制的TCA中間物是α-酮戊二酸以及草醋酸。在測試濃度下，彼等中間物將氨濃度維持在3mM與6mM之間。圖7歸納α-酮戊二酸與草醋酸對氨累積量的影響。
添加TCA中間物至培養物也會影響最終細胞專一性生產力。在對照培養物的情況下，計算出的細胞專一性生產力值平均為31pg細胞/天(範圍 24-35pcd)；以45mM丙酮酸處理的培養物顯示細胞專一性生產力降低至~24pg/細胞/天。僅有以草醋酸處理的培養物顯示氨累積量程度降低且維持細胞專一性生產力值，如圖8中所示。添加所有其他TCA中間物顯示細胞專一性生產力降低。
因此，控制氨以及維持細胞專一性生產力程度的最佳TCA中間物是在培養物中濃度5~15mM的草醋酸。
實例4--TCA中間物(二至五)的交互作用。DOE結果
由劑量反應實驗，丙酮酸、蘋果酸、草醋酸、延胡索酸以及α-酮戊二酸進一步來測試交互作用。該等中間物每一者的濃度被選定為在劑量反應實驗期間顯示反應的濃度。在一些情況下，所選濃度是在劑量反應實驗期間介於兩個實際測試的數值之間。
因為整個研究中的搖瓶數量，實驗是以兩個區塊來建立。圖2與圖3顯示每個區塊的測試條件。每個區塊包括對照條件(沒有添加TCA中間物)。
如圖9中所示，所有測試條件的活細胞濃度顯示相似的峰值。在第6天觀察到VCC下降，解釋為添加TCA中間物，因為一些稀釋度的培養物碰巧在培養物中獲得所要最終濃度。
在氨累積量的情況下，對中間物的反應顯示大幅差異。培養條件下的培養物顯示氨累積量高至9mM，而20mM丙酮酸、20mM α-酮戊二酸、20mM延胡索酸的混合物顯示在培養結束時的最低氨累積量達2mM。如劑量反應研究中所觀察到，蘋果酸與丙酮酸可以壓抑氨產生歷時數天，且氨濃度升高至與對照培養物類似的最終濃度。圖10歸納所有條件的數據。
圖11顯示所有測試條件的峰氨累積量。文字方塊顯示具有最低氨累積量的條件。數種組合顯示對於氨濃度的控制。所有標記的條件顯示最大氨濃度接近4mM(對照的氨濃度為~9mM)。
當產生低氨累積量的條件在細胞專一性生產力數據中被繪示出來時(圖 12)，結果顯示一些TCA中間物組合相較於對照對細胞專一性生產力有負面影響。
在所有測試條件中，組合5mM蘋果酸/20mM丙酮酸、5mM蘋果酸/20mM延胡索酸、5mM蘋果酸/20mM α-酮戊二酸，以及20mM α-酮戊二酸維持細胞專一性生產力並控制氨生成。在所有情況下，細胞專一性生產力維持在接近30pg/細胞/天的程度。
實例5--TCA中間物實驗的更多分析
圖12a、12b與12c顯示相較於對照培養的丙酮酸劑量反應。NH4 +濃度取決於劑量，但效用僅持續數天。在丙酮酸消耗之後重新生成NH4 +(圖12b)。圖序顯示(a)活細胞濃度，(b)NH4 +累積量作為培養時間的函數，以及(c)細胞NH4 +比生產率。在圖(c)中，曲線斜率表示細胞專一性生產率或消耗率。
在阿伐酮戊二酸(α-KG)的情況下，細胞分裂似乎停止了(在添加中間物之後平坦的VCC曲線)。在所有測試濃度中，NH4 +累積量以及細胞專一性生產率降低。45mM濃度的α-KG似乎是在培養物中降低NH4 +製造的最有效濃度(圖13c)。
在蘋果酸的情況下，劑量反應實驗指出高於5mM的濃度對細胞是有毒性的。在5mM濃度下，蘋果酸對NH4 +累積量或生產率沒有清楚的效用，如圖14b與14c中所示。
草醋酸添加對於細胞生長不具有任何有害影響(圖15a)，而在10mM與15mM濃度下其可能在培養物中降低細胞專一性生產率以及NH4 +累積量。
添加延胡索酸至培養物中會降低細胞生長(圖16a)，且對NH4 +累積量與生產率僅有部分影響。在培養第10天後於培養物中需要更高劑量的延胡索酸(30mM與45mM)來穩定氨製造(以及累積量)。
添加檸檬酸對於培養物有有害效用。應避免用它來降低NH4 +累積量。
使用以某些濃度來添加的選定中間物，建立第二個實驗來檢核第一個 實驗的結果。在這個實驗中，僅有觀察到對細胞濃度的影響最小並確認結果。添加蘋果酸、草醋酸以及丙酮酸在某種程度上降低NH4 +累積量以及還原(圖18b與圖18c)；延胡索酸添加會減緩NH4 +製造與累積量。在α-KG的情況下，圖18c指出NH4 +被消耗，其亦顯示於圖18b中。
圖19a至19c顯示添加兩種TCA中間物對培養的影響。大體上，VCC並未大大受到影響(圖19a)，因為細胞計數相較於對照培養物或當持續培養所回收者沒有顯示大幅差異。
在NH4 +製造與累積量的情況下，添加兩種TCA中間物明顯產生更好的NH4 +控制。從圖19c，可以注意到含有α-KG的組合在培養物中使得細胞專一性生產率更低以及穩定的NH4 +濃度(大約在黑色虛線周圍的曲線)。
圖20a至20c顯示添加3種TCA中間物對培養的影響。就α-KG/延胡索酸/OAA以及丙酮酸/α-KG/OAA的組合來說，在添加這個組合之後細胞計數明顯受到影響，暗示應避免這樣使用。在丙酮酸/α-KG/延胡索酸組合的情況下，對細胞計數的影響較不明顯。這個相同組合顯示降低NH4 +製造並穩定NH4 +濃度(分別為圖20c與20b)。
圖21至24顯示添加一種TCA中間物的平均細胞專一性生產力(圖21與22)、兩種TCA中間物的組合的平均細胞專一性生產力(圖23)以及三種TCA中間物的組合的平均細胞專一性生產力(圖24)。
α-KG被認為是當單獨使用時降低NH4 +累積量最有效的TCA中間物。但是，亦有趨勢顯示其降低細胞專一性生產力，如圖21與22中所示(相較於對照達約10-20%)。
在TCA中間物組合的情況下，組合丙酮酸/蘋果酸(5mM/20mM)保留了細胞專一性生產力，同時達到可接受的NH4 +降低(圖19b與19c)。一些組合可能可以用來降低NH4 +累積量且基於這個目的來評估它們。在以細胞比生產力降低為代價的情形下，包括α-KG的組合預期會比其他組合來的好。
最後，一些包括3個TCA中間物的組合也降低NH4 +累積量。

Claims (23)

  1. 一種在哺乳動物細胞培養中降低氨離子濃度的方法，包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的三羧酸(“TCA”)中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的三羧酸(“TCA”)中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM草醋酸。
  2. 一種在哺乳動物細胞培養中維持或增加細胞生產力的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM草醋酸。
  3. 一種在哺乳動物細胞培養中維持或增進細胞生長的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM草醋酸。
  4. 一種在細胞培養中降低氨離子累積量對抗體醣基化型態的影響的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM草醋酸。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中亦維持細胞專一性生產力。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該TCA中間物組成物包含約3mM至約45mM草醋酸。
  7. 一種細胞培養基，其包含約0.1mM至約100mM草醋酸。
  8. 如申請專利範圍第7項之細胞培養基，其中亦維持細胞專一性生產力。
  9. 如申請專利範圍第7或8項之細胞培養基，其中該培養基包含約3mM至約45mM草醋酸。
  10. 一種在哺乳動物細胞培養中降低氨離子濃度的方法，包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的三羧酸(“TCA)中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的三羧酸(“TCA)中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM蘋果酸以及約0.1mM至約100mM丙酮酸。
  11. 一種在哺乳動物細胞培養中維持或增加細胞生產力的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM蘋果酸以及約0.1mM至約100mM丙酮酸。
  12. 一種在哺乳動物細胞培養中維持或增進細胞生長的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM蘋果酸以及約0.1mM至約100mM丙酮酸。
  13. 一種在細胞培養中降低氨離子累積量對抗體醣基化型態的影響的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM蘋果酸以及約0.1mM至約100mM丙酮酸。
  14. 如申請專利範圍第10至13項中任一項之方法，其中亦維持細胞專一性生產力。
  15. 如申請專利範圍第10至14項中任一項之方法，其中該TCA中間物組成物包含約3mM至約45mM蘋果酸以及約3mM至約45mM丙酮酸。
  16. 一種細胞培養基，其包含約0.1mM至約100mM蘋果酸以及約0.1mM至約100mM丙酮酸。
  17. 如申請專利範圍第16項之細胞培養基，其中維持細胞專一性生產力。
  18. 如申請專利範圍第16或17項之細胞培養基，其中該培養基包含約3mM至約45mM蘋果酸以及約3mM至約45mM丙酮酸。
  19. 一種在哺乳動物細胞培養中降低氨離子濃度的方法，包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的三羧酸(“TCA)中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的三羧酸(“TCA)中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM α-酮戊二酸。
  20. 一種在細胞培養中降低氨離子累積量對抗體醣基化型態的影響的方法，其中氨離子產生被降低，該方法包含以下步驟：a. 使該等細胞於細胞培養基中生長，以及b. 使有效量的TCA中間物組成物與細胞培養基接觸或將有效量的TCA中間物組成物投與至細胞培養基，其中該TCA中間物組成物包含約0.1mM至約100mM α-酮戊二酸。
  21. 如申請專利範圍第19或20項中任一項之方法，其中該TCA中間物組成物包含約3mM至約45mM α-酮戊二酸。
  22. 一種細胞培養基，其包含0.1mM至約100mM α-酮戊二酸。
  23. 如申請專利範圍第22項之細胞培養基，其中該培養基包含約3mM至約45mM α-酮戊二酸。
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