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CN105051203A - 三羧酸(tca)中间体用于控制细胞培养中的氨产生的用途 - Google Patents

三羧酸(tca)中间体用于控制细胞培养中的氨产生的用途 Download PDF

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CN105051203A
CN105051203A CN201480016165.6A CN201480016165A CN105051203A CN 105051203 A CN105051203 A CN 105051203A CN 201480016165 A CN201480016165 A CN 201480016165A CN 105051203 A CN105051203 A CN 105051203A
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CN
China
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cell culture
tca
cell
culture medium
acid
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Application number
CN201480016165.6A
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O.拉拉-韦拉斯科
C.M.韦纳
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GlaxoSmithKline Intellectual Property No 2 Ltd
Original Assignee
GlaxoSmithKline Intellectual Property No 2 Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明涉及减少哺乳动物细胞培养物中的铵离子浓度的方法、维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生产力的方法、维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生长的方法和减少细胞培养物中铵离子积累对抗体糖基化模式的影响的方法，所述方法包括以下步骤：在细胞培养基中培养所述细胞，和给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。

Description

三羧酸(TCA)中间体用于控制细胞培养中的氨产生的用途
发明领域
本发明涉及细胞培养基领域和培养工程改造成表达治疗性蛋白的哺乳动物细胞的方法。
发明背景
三羧酸(TCA)循环被视作细胞产生能量的必需途径。该途径是从燃料分子得到能量的最终共同途径。将糖、氨基酸和脂肪酸氧化以得到ATP形式的能量。
与此同时，TCA给细胞供应基本结构单元以在细胞中产生其它分子。在细胞生长和分裂过程中和在蛋白合成过程中，可以从TCA循环的几个点抽离脂肪酸、氨基酸、嘌呤、嘧啶以及其它物质的中间体。
在没有足够中间体来补充TCA循环的情况下，细胞可以使用氨基酸来补充那些中间体。那些氨基酸向中间体的转化需要脱酰胺化作为第一步，铵离子(NH4 +)是氨基酸向TCA中间体的转化的副产物。取决于细胞对中间体的要求，铵离子可以在培养基中积累至有害效应。那些铵离子当以抑制浓度存在时可以影响抗体糖基化模式、细胞生产力和细胞生长。
为了避免有害水平的铵离子浓度，目前，将具有抑制水平的氨的水性细胞生长培养基简单地抛弃和用新鲜培养基替换。这是无效的，因为它需要额外设备进行新鲜培养基的灭菌和贮存以及对新鲜培养基中的昂贵血清的伴随替换。因此，需要从哺乳动物细胞培养物除去氨和铵离子的方法，其免除了培养基的替换，且其可以与已知的多种现有细胞系一起使用。
发明概述
在一个方面，本发明涉及减少哺乳动物细胞培养物中的铵离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
在细胞培养基中培养所述细胞，和
给所述细胞培养基施用有效量的三羧酸(“TCA)中间体组合物或与其接触。
在另一个方面，本发明涉及维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生产力的方法，其中所述铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
在细胞培养基中培养所述细胞，和
给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
在另一个方面，本发明涉及维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生长的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
在细胞培养基中培养所述细胞，和
给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
在另一个方面，本发明涉及减少细胞培养物中铵离子积累对抗体糖基化模式的影响的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
在细胞培养基中培养所述细胞，和
给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
在另一个方面，本发明涉及包含TCA中间体组合物的细胞培养基。
附图简述
图1描绘了TCA循环中间体的剂量应答研究的实验设计。
图2描绘了TCA循环中间体相互作用研究的区组# 1的实验设计。
图3描绘了TCA循环中间体相互作用研究的区组# 2的实验设计。
图4描绘了多种条件的活细胞浓度，线显示了一式两份摇瓶的平均值。
图5描绘了摇瓶研究中的乳酸盐积累。线显示了一式两份条件的平均值。
图6描绘了测试的所有条件的铵积累。线显示了测试的每种条件的一式两份摇瓶的平均值。
图7描绘了向培养物添加α-酮戊二酸盐和草酰乙酸的铵积累。线显示了测试的每种条件的一式两份摇瓶的平均值。
图8描绘了用不同水平的TCA中间体处理过的培养物的细胞比生产率。误差棒显示了值范围。
图9描绘了在DOE的区组1和区组2中测试的所有条件的活细胞浓度。
图10描绘了在DOE的区组1和区组2中测试的所有条件的氨积累特性。
图11描绘了在DOE的区组1和区组2中测试的所有条件的最大氨积累。
图12描绘了在DOE的区组1和区组2中测试的所有条件的最终细胞比生产率。
图12a、12b和12c描绘了与对照培养物相比的丙酮酸盐剂量应答。NH4 +的浓度依赖于剂量，但是效应仅持续几天。一旦丙酮酸盐耗尽，NH4 + 产生继续(图12b)。图的次序显示了(a)活细胞浓度，(b)随培养时间变化的NH4 + 积累，和(c)细胞特异性的NH4 + 产生。在图(c)中，曲线的斜率指示细胞特异性的产生或消耗速率。
图13a、13b和13c描绘了与对照培养物相比α-酮戊二酸盐剂量应答。
图14a、14b和14c描绘了与对照培养物相比苹果酸盐剂量应答。
图15a、15b和15c描绘了与对照培养物相比的草酰乙酸盐剂量应答。
图16a、16b和16c描绘了与对照培养物相比的富马酸盐剂量应答。
图17描绘了与对照培养物相比的柠檬酸盐剂量应答。
图18a、18b和18c描绘了与对照培养物相比的苹果酸盐、丙酮酸盐、α-酮戊二酸盐、富马酸盐和草酰乙酸盐剂量应答。
图19a、19b和19c描绘了向培养物中添加两种TCA中间体的影响。
图20a、20b和20c描绘了向培养物中添加3种TCA中间体的影响。
图21-24描绘了添加一种TCA中间体(图21和22)、两种TCA中间体(图23)和三种TCA中间体(图24)的组合的平均细胞比生产率。
发明详述
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于实践本发明的测试。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
应当理解，本发明不限于特别的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以变化。还应该理解，本文中使用的术语仅用于描述特别的实施方案的目的，且无意进行限制。在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个（a、an）”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，对“糖”的提及包括两种或更多种糖的组合等。
当提及可测量的值诸如量、持续时间等时，本文中使用的“约”意在包括从指定的值变化±20%或±10%(包括±5%、±1%和±0.1%)，因为这样的变化适于执行所公开的方法。
在一个方面，本发明涉及减少哺乳动物细胞培养物中的铵离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
在细胞培养基中培养所述细胞，和
给所述细胞培养基施用有效量的三羧酸(“TCA)中间体组合物或与其接触。
在另一个方面，本发明涉及维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生产力的方法，其中所述铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
在细胞培养基中培养所述细胞，和
给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
在另一个方面，本发明涉及维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生长的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
在细胞培养基中培养所述细胞，和
给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
在另一个方面，本发明涉及减少细胞培养物中铵离子积累对抗体糖基化模式的影响的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
在细胞培养基中培养所述细胞，和
给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
在另一个方面，本发明涉及包含TCA中间体组合物的细胞培养基。
在某些实施方案中，所述TCA中间体是丙酮酸、α-酮戊二酸、富马酸、苹果酸和草酰乙酸。在某些实施方案中，所述TCA中间体是丙酮酸、α-酮戊二酸、富马酸、苹果酸和草酰乙酸的钾或钠盐。
在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM草酰乙酸(或其盐)。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3 mM至约45 mM草酰乙酸(或其盐)。在某些实施方案中，将草酰乙酸(或其盐)加入所述培养物中达到约5 mM、约10 mM或约15mM的终浓度。
在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM苹果酸(或其盐)。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3 mM至约45 mM苹果酸(或其盐)。在一个实施方案中，将苹果酸(或其盐)加入所述培养物中达到约5 mM、约10 mM或约15mM的终浓度。
在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM丙酮酸(或其盐)。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3 mM至约45 mM丙酮酸(或其盐)。在某些实施方案中，将丙酮酸(或其盐)加入所述培养物中达到约15 mM、约30 mM或约45mM的终浓度。
在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mMα-酮戊二酸(或其盐)。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3 mM至约45 mMα-酮戊二酸(或其盐)。在某些实施方案中，将α-酮戊二酸(或其盐)加入所述培养物中达到约15 mM、约30 mM或约45mM的终浓度。
在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM富马酸(或其盐)。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3 mM至约45 mM富马酸(或其盐)。在某些实施方案中，将富马酸(或其盐)加入所述培养物中达到约15 mM、约30 mM或约45mM的终浓度。
在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM苹果酸(或其盐)和约0.1 mM至约100 mM丙酮酸(或其盐)。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3 mM至约45 mM苹果酸(或其盐)和约3 mM至约45 mM丙酮酸(或其盐)。
术语“细胞培养基”和“培养基”和“发酵培养基”表示用于培养哺乳动物细胞的营养溶液，其通常提供来自一种或多种以下类别的至少一种组分：
1)能源，其通常呈碳水化合物诸如葡萄糖的形式；
2)所有必需氨基酸，且经常是20种氨基酸的基础集合+半胱氨酸；
3)在低浓度需要的维生素和/或其它有机化合物；
4)游离脂肪酸；和
5)痕量元素，其中将痕量元素定义为通常在非常低浓度（经常在微摩尔范围内）需要的无机化合物或天然存在的元素。
可以任选地用来自任何以下类别的一种或多种组分补充所述营养溶液：
1)激素和其它生长因子，例如，胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；
2)盐和缓冲液，例如，钙、镁和磷酸盐；
3)核苷和碱基，例如，腺苷、胸苷和次黄嘌呤；和
4)蛋白和组织水解物。
当所述培养基基本上不含有得自任何哺乳动物来源的血清(例如胎牛血清[FBS])时，所述细胞培养基通常是“无血清的”。“基本上不含有”是指，所述细胞培养基包含约0-5%血清，优选约0-1%血清，且最优选约0-0.1%血清。
术语“哺乳动物宿主细胞”、“宿主细胞”、“哺乳动物细胞”等表示从哺乳动物衍生出的细胞系，当置于单层培养物中或含有适当营养物和生长因子的培养基中的悬浮培养物中时，其能够生长和存活。无需过多实验根据经验可以容易地确定特定细胞系的必需生长因子，如例如以下文献中所述：Mammalian Cell Culture, Mather, J. P. 编, Plenum Press, N.Y. (1984), 和Barnes和Sato, (1980) Cell, 22:649。通常，所述细胞能够表达和分泌大量特定目标糖蛋白到培养基中。在本发明的上下文中的合适哺乳动物宿主细胞的例子可以包括：中国仓鼠卵巢细胞，CHO/-DHFR (CHO, Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；dp12.CHO细胞(EP 307,247，1989年3月15日公开)；小鼠支持细胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；人宫颈癌细胞(HELA, ATCC CCL 2)；人肺细胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562, ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982])；MRC 5细胞；FS4细胞。
在某些实施方案中，还维持所述细胞的细胞比生产率。在某些实施方案中，所述细胞选自CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、K562细胞、BHK细胞、PER.C6细胞和HEK细胞。在某些实施方案中，所述细胞是CHO细胞或CHO细胞的亚克隆，包括、但不限于，CHO K1、CHO pro3-、CHO DUXB11和CHO DG44细胞。
细胞培养的“生长期”表示指数细胞生长阶段(对数期)，其中细胞通常快速地分裂。在该阶段中，将细胞培养特定时间段，经常1-5天，且在使得细胞生长最大化的条件下。无需过多实验，对于预见到的特别的宿主细胞，可以确定宿主细胞的生长周期的确定。“时间段和在使得细胞生长最大化的条件下”等表示这样的培养条件：对于特别的细胞系，其被确定为对于细胞生长和分裂而言是最佳的。在生长期中，在控湿气氛下，通常在约30℃至40℃，优选地在约37℃，在含有必要添加剂的营养培养基中培养细胞，使得实现特别的细胞系的最佳细胞生长。将细胞在生长期维持约1-5天的时段，经常在2-3天之间。
细胞培养的“过渡期”表示这样的时间段：在其中使用用于生产期的培养条件。在过渡期中，将环境因素（诸如铜离子浓度和温度）从生长条件转变至生产条件。
细胞培养的“生产期”表示这样的时间段：在其中细胞生长已经达到平稳或维持在接近恒定的水平。在生产期中，对数细胞生长已经结束，且蛋白生产是主要的。在该时间段中，通常补充培养基以支持持续的蛋白生产和实现期望的糖蛋白生产。
术语“表达”在本文中用于表示在宿主细胞内发生的转录和翻译。基于存在于细胞中的对应mRNA的量或由细胞产生的产物基因所编码的蛋白的量，可以确定宿主细胞中的产物基因的表达水平。例如，理想地通过RNA印迹杂交来定量从产物基因转录的mRNA。Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第7.3-7.57页(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。通过测定蛋白的生物活性或通过采用独立于这样的活性的测定（诸如蛋白质印迹法或放射免疫测定法，其使用能够与蛋白反应的抗体），可以定量由产物基因编码的蛋白。Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第18.1-18.88页(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。
在适合于培养的特别的细胞的培养基中制备本发明的哺乳动物细胞培养物。商购可得的培养基诸如Ham氏F10 (Sigma)、最低必需培养基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)和Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM, Sigma)是示例性的营养溶液。另外，在以下文献中描述的任何培养基，可以用作培养基：Ham和Wallace, (1979) Meth. Enz., 58:44; Barnes和Sato, (1980) Anal. Biochem., 102:255；美国专利号4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 5,122,469或4,560,655；国际公开号WO 90/03430；和WO 87/00195；其全部的公开内容都通过引用并入本文。在必要时可以给这些培养基中的任一种补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素™药物)、痕量元素(定义为经常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)、脂质(诸如亚油酸或其它脂肪酸)和它们的合适的载体和葡萄糖或等同能源。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任意其它必要的补充物。
在一个特定实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞是CHO细胞，优选CHO DUX (DHFR-)或其亚克隆诸如CHO K1、CHO pro3-、CHO DG44、CHO DP12细胞，合适的培养基含有基础培养基组分诸如基于DMEM/HAM F-12的制剂(关于DMEM和HAM F12培养基和特别是无血清培养基的组合物, 参见American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 第6版, 1988, 第346-349页中的培养基制剂) (在美国专利号5,122,469中描述的培养基制剂是特别适当的)，其含有修改浓度的一些组分诸如氨基酸、盐、糖和维生素，且任选地含有甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷；重组人胰岛素、水解的蛋白胨诸如蛋白酶蛋白胨2和3、Primatone HS或Primatone RL (Difco, USA; Sheffield, 英国)或等效物；细胞保护剂，诸如Pluronic F68或等效的Pluronic多元醇；庆大霉素；和痕量元素。优选地，所述细胞培养基是无血清的。
通过在多种细胞培养条件下培养表达期望的蛋白的细胞，可以生产多肽。例如，用于大或小规模生产蛋白的细胞培养程序本发明的上下文中可能是有用的。在以后的2个系统中可以使用程序包括、但不限于流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养、或搅拌罐生物反应器系统，含有或不含微载体，并可选地以分批、补料分批或连续模式运行。
在一个实施方案中，在搅拌罐生物反应器系统中执行本发明的细胞培养，并采用补料分批培养程序。在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞和培养基的补料分批培养物首先供应至培养容器，并在培养过程中将额外的培养营养物连续地或以不连续增量补料给培养物，在培养终止之前有或没有定期细胞和/或产物收获。补料分批培养可以包括，例如，半连续补料分批培养，其中定期除去整个培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基替换。补料分批培养不同于简单的分批培养，在后者中，在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应至培养容器。补料分批培养可以进一步与灌注培养区分开，因为在该过程中没有从培养容器除去上清液(在灌注培养中，例如通过过滤、包囊、锚定至微载体、沉降等，将细胞限制在培养物中，并连续地或间歇地从培养容器引入和除去培养基)。
此外，根据可能适合于特别的宿主细胞和预见到的特别的生产计划的任何路线图或惯例，可以繁殖培养物的细胞。因此，本发明预见到单步骤或多步骤培养程序。在单步骤培养中，将宿主细胞接种进培养环境中，并细胞培养的单个生产期中采用本发明的方法。可选地，预见到多阶段培养。在多阶段培养中，可以在许多步骤或阶段中培养细胞。例如，可以在第一步或生长期培养中培养细胞，其中将细胞（可能从贮存物取出）接种进适合于促进生长和高生存力的培养基中。通过将新鲜培养基加入宿主细胞培养物中，可以将细胞维持在生长期合适的时间段。
根据本发明的另一个方面，设计了补料分批或传代细胞培养条件以增强处于细胞培养的生长期的哺乳动物细胞的生长。在生长期中，在使生长最大化的条件下培养细胞一段时间。培养条件诸如温度、pH、溶解氧(dO2)等是与特定宿主一起使用的那些，且是普通技术人员显而易见的。通常，使用酸(例如，CO2)或碱(例如，Na2CO3或NaOH)，将pH调至约6.5和7.5之间的水平。用于培养哺乳动物细胞诸如CHO细胞的合适温度范围是在约30-38℃之间，且优选约37℃，且合适的dO2是在空气饱和度的5-90%之间。
在特别的阶段，可以使用细胞接种细胞培养的生产期或步骤。可选地，如上所述，所述生产期或步骤可以与接种或生长期或步骤连续。在一个实施方案中，所述细胞培养是补料分批细胞培养。
“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换地用于表示氨基酸残基的聚合物。多肽可以具有天然的(组织来源的)起源，从原核或真核细胞制备物重组或天然表达，或经由合成方法化学产生。该术语适用于这样的氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸模拟物表示这样的化学化合物：其结构不同于氨基酸的一般化学结构，但是其作用方式类似于天然存在的氨基酸。在科学和专利文献中充分描述了非天然残基；在下面描述了可用作天然氨基酸残基的模拟物的几种示例性非天然组合物和指南。芳族氨基酸的模拟物可以通过用例如以下氨基酸替换而产生：D-或L-萘基(naphyl)丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩基丙氨酸；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸: D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸: D-对氟-苯丙氨酸；D-或L-对联苯基苯丙氨酸；K-或L-对甲氧基-联苯基苯丙氨酸: D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基丙氨酸(ainine)，其中烷基可以是被取代的或未被取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、sec-isotyl、异戊基或非酸性的氨基酸。非天然氨基酸的芳族环包括，例如，噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳族环。
本文中使用的“肽”包括为本文具体举例说明的那些肽的保守变异的肽。本文中使用的“保守变异”表示使用另一种生物学上相似的残基替代氨基酸残基。保守变异的例子包括、但不限于，一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水残基，或一个极性残基置换另一个极性残基，诸如精氨酸置换赖氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸、或谷氨酰胺置换天冬酰胺等。可互相置换的中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。“保守变异”还包括使用取代的氨基酸替代未取代的母体氨基酸，前提条件是，针对取代的多肽的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。这样的保守置换是在本发明的肽的种类的定义之内。本文中使用的“阳离子的”表示在pH 7.4具有净正电荷的任何肽。通过本领域技术人员已知的和本文描述的标准方法，可以确定肽的生物活性。
当关于蛋白使用“重组”时，表示该蛋白已经通过引入异源核酸或蛋白或者改变天然核酸或蛋白进行了修饰。
本文中使用的“治疗性蛋白”表示这样的任何蛋白和/或多肽：其可以施用给哺乳动物以引起组织、系统、动物或人的生物学或医学应答，所述应答是例如研究人员或临床医师所寻求的。治疗性蛋白可以引起超过一种生物学或医学应答。此外，术语“治疗有效量”是指这样的任何量：与未接受该量的相应受试者相比，该量导致、但不限于疾病、病症或副作用的痊愈、预防或改善，或者疾病或障碍的进展速率的下降。该术语在其范围内还包括有效地增强正常生理功能的量、以及在患者中有效地造成增强或有助于第二种药学试剂的治疗效果的生理功能的量。
本文中鉴定的所有“氨基酸”残基呈天然的L-构型。与标准多肽命名法一致，氨基酸残基的缩写如下：
1个字母 3个字母 氨基酸
Y Tyr L-酪氨酸
G Gly L-甘氨酸
F Phe L-苯丙氨酸
M Met L-甲硫氨酸
A Ala L-丙氨酸
S Ser L-丝氨酸
I Ile L-异亮氨酸
L Leu 亮氨酸
T Thr L-苏氨酸
V Val L-缬氨酸
P Pro L-脯氨酸
K Lys L-赖氨酸
H His L-组氨酸
Q Gln L-谷氨酰胺
E Glu L-谷氨酸
W Trp L-色氨酸
R Arg L-精氨酸
D Asp L-天冬氨酸
N Asn L-天冬酰胺
C Cys L-半胱氨酸。
应当指出，所有的氨基酸残基序列在本文用式表示，所述式从左至右的方向为从氨基端至羧基端的常规方向。
在另一个实施方案中，所述多肽是抗原结合多肽。在一个实施方案中，所述抗原结合多肽选自可溶性的受体、抗体、抗体片段、免疫球蛋白单个可变结构域、Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv或双抗体。
本文中使用的术语“抗原结合多肽”表示能够结合抗原的抗体、抗体片段和其它蛋白构建体。
术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2使用它们的标准含义(参见，例如，Harlow等人, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988))。
“嵌合抗体”表示一类经工程改造的抗体，其含有来源于供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)以及来源于受体抗体的轻链和重链恒定区。
“人源化抗体”表示一类经工程改造的抗体，其具有来源于非人供体免疫球蛋白的它的CDR，该分子的剩余的免疫球蛋白衍生的部分来源于一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力(参见，例如，Queen等人, Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson等人, Bio/Technology, 9:421 (1991))。合适的人受体抗体可以是这样的抗体：其通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性而选自常规数据库，例如，KABAT.RTM. 数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库。特征在于与供体抗体的框架区的同源性(在氨基酸基础上)的人抗体可能适于为供体CDR的插入提供重链恒定区和/或重链可变框架区。可以以类似的方式选择能够提供轻链恒定或可变框架区的合适受体抗体。应当指出，不要求受体抗体重链和轻链源自相同受体抗体。现有技术描述了几种生产这样的人源化抗体的方法--参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。
术语“供体抗体”表示这样的抗体(单克隆的和/或重组的)：其将它的可变区、CDR或它们的其它功能片段或类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体，从而提供改变的免疫球蛋白编码区并产生表达的改变的抗体，该抗体具有所述供体抗体表征的抗原特异性和中和活性。
术语“受体抗体”表示与供体抗体异源的抗体(单克隆的和/或重组的)，其将编码它的重链和/或轻链框架区和/或它的重链和/或轻链恒定区的全部(或任何部分，但在一些实施方案中全部)氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体。在某些实施方案中，人抗体是受体抗体。
“CDR”被定义为抗体的互补性决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如，Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，本文中使用的“CDR”表示所有三个重链CDR或所有三个轻链CDR(或如果合适，所有的重链CDR和所有的轻链CDR)。抗体的结构和蛋白折叠可能意味着其它残基被视作抗原结合区的组成部分，且被技术人员理解为这样。参见例如Chothia等人, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, 第877-883页。
本文中使用的术语“结构域”表示一种折叠的蛋白结构，其具有独立于该蛋白的其它部分的三级结构。通常，结构域会引起蛋白的不同功能特性，且在许多情况下，可以将结构域添加、除去或转移至其它蛋白，而不损失所述蛋白的剩余部分和/或所述结构域的功能。“抗体单个可变结构域”是一种折叠的多肽结构域，其包含表征抗体可变结构域的序列。因此，它包括完全的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环已经被这样的序列替换：所述序列不是表征抗体可变结构域的序列，或已被截短的抗体可变结构域，或者包含N-端或C-端延伸，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠的片段。
短语“免疫球蛋白单个可变结构域”表示独立于不同的V区域或结构域而特异性地结合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单个可变结构域可以与其它不同的可变区或可变结构域一起以某种形式(例如同型多聚体或异型多聚体)存在，其中其它区域或结构域不是该单个免疫球蛋白可变结构域结合抗原所必需的(即，其中该免疫球蛋白单个可变结构域独立于另外的可变结构域而结合抗原)。本文中使用的术语“结构域抗体”或“dAb”与能够结合抗原的“免疫球蛋白单个可变结构域”相同。免疫球蛋白单个可变结构域可以是人抗体可变结构域，但是也包括来自其它物种诸如啮齿动物(例如，如在WO 00/29004中公开的)、铰口鲨和骆驼科VHH dAb (纳米抗体（nanobodies）)的单个抗体可变结构域。骆驼科VHH是来源于包括骆驼、骆马、羊驼、单峰骆驼和原驼在内的物种的免疫球蛋白单个可变结构域多肽，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。这样的VHH结构域可以根据本领域可用的标准技术人源化，且这样的结构域仍被认为是根据本发明的“结构域抗体”。本文中使用的“VH”包括骆驼科VHH结构域。NARV是在软骨鱼（包括铰口鲨）中鉴定出的另一类免疫球蛋白单个可变结构域。这些结构域也被称作新型的抗原受体可变区(通常简写成V(NAR)或NARV)。关于其它细节，参见Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)和US20050043519A。
术语“表位结合结构域”表示独立于不同的V区域或结构域特异性地结合抗原或表位的结构域，这可以是结构域抗体(dAb)，例如人、骆驼科或鲨鱼免疫球蛋白单个可变结构域。
本文中使用的术语“抗原结合位点”表示蛋白上的能够特异性地结合抗原的位点，这可以是单结构域，例如表位结合结构域，或者它可以是如在标准抗体上可发现的成对的VH/VL结构域。在本发明的某些方面，单链Fv (ScFv)结构域可以提供抗原结合位点。
术语“mAbdAb”和“dAbmAb”在本文中用于表示本发明的抗原结合蛋白。所述两个术语可以互换使用，并意图具有与本文中使用的相同的含义。
实施例1--材料和方法/实验设计
基于商业可得性，选择几个TCA循环中间体用于剂量应答实验，酸或它的钠盐购自Sigma Aldrich，以制备要在研究中使用的储备溶液补料。选择的化合物是丙酮酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、富马酸、苹果酸(或钠盐)和草酰乙酸(不可得到钠盐)。
将草酰乙酸和苹果酸加入培养物中达到5 mM、10 mM和15mM的终浓度。将剩余的测试的TCA中间体加入培养物中达到15 mM、30 mM和45 mM的终浓度。图1概述了测试的TCA循环组分和它们在途径中的位置。表1概述了研究中摇瓶的运行条件以及剂量应答研究的补料计划。
每次开始研究分支时，建立对照摇瓶。那些对照摇瓶是没有加入任何TCA中间体的补料分批培养物。一式两份摇瓶地执行所有测试条件。
表1 用于剂量应答研究的摇瓶的运行条件
细胞系 DG44 CHO
容器体积/工作容积(mL) 250/150
搅拌速度(RPM) 150
温度(℃) 35
培养箱中的CO2浓度(%) 5
目标最初活细胞浓度(iVCC) (x 106细胞/mL) 0.8-1.0
培养基类型 9-01-3-0174
水解物补料 在接种后第4天
TCA中间体补料 在接种后第5天
实施例2—测试对选择的TCA中间体的相互作用的实验设计(DOE)/分析方法
在2个块中进行测试所有选择的组分的相互作用的实验。将每个区组设计成含有中心点和对照摇瓶(分批培养，没有加入任何组分)。第一区组测试丙酮酸、α-酮戊二酸、富马酸和草酰乙酸的相互作用。第二区组测试丙酮酸、α-酮戊二酸、富马酸、草酰乙酸和苹果酸的相互作用。图2显示了区组# 1的实验设置，且图3显示了区组# 2的实验设置。一式两份地运行所有条件。摇瓶的运行条件显示在表2中。
表2 用于DOE研究的摇瓶的运行条件
细胞系 DG44 CHO
容器体积/工作容积(mL) 250/150
搅拌速度(RPM) 150
温度(℃) 35
培养箱中的CO2浓度(%) 5
目标最初活细胞浓度(iVCC) (x 106细胞/mL) 1.0
培养基类型 9-01-3-0174
水解物补料和维生素补料 在接种后第4天
TCA中间体补料 在接种后第5天
每隔天将摇瓶培养物取样以确定总细胞浓度(TCC)、活细胞浓度(VCC)、细胞生存力、代谢物(葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐和氨)浓度和渗透压。将主要样品分入基于细胞的测定(TCC、生存力测定)和无细胞测定(代谢物浓度、渗透压)中。如下生产用于将来参考的贮存样品(无细胞上清液)：将主要样品的一部分离心，并将1.8 mL等分进Nunc冷冻小瓶中，随后将其在-70℃储存。在穿过0.22µm过滤器过滤的样品上确定滴度。
使用基于锥虫蓝排除方法的自动化细胞计数器(ViCell XR, Beckman Coulter)，确定TCC、VCC和生存力。在使用等体积的蛋白酶储备溶液和培养物进行细胞计数(TripLE, Life Technologies, USA)之前，用蛋白酶预处理样品。在轻轻摇动下在37℃温育20-25分钟以实现解离。使用运行在基于酶的电化学反应上的Nova Bioprofile (Nova Bioprofile 400)，测量代谢物。渗透压测量是基于冰点降低法(Advanced Instruments, Model N/A)。将过滤的无细胞样品发送至Bioanalytical Development组用于抗体积累和结合活性确定(Biacore)。
参数计算
活细胞浓度的积分(IVC)
使用VCC数据并应用遵循下式的梯形规则，计算活细胞的积分，
(2)
其中：
IVC, 活细胞密度的积分[=] (106个细胞/mL).天
t, 培养时间[=]天
VCC, 活细胞密度[=] 106个细胞/mL
ni, 在培养中所取样品的数目，为了计算目的，i=4
使用最后一个滴度数据点除以最后一个计算的IVC值，计算比生产率。
实施例3--剂量应答结果
将实验分成3区组。第一区组测试丙酮酸、柠檬酸、α-酮戊二酸和富马酸。第二区组测试草酰乙酸，第三区组测试苹果酸。
图4显示了所有摇瓶的合并平均VCC结果。所有用柠檬酸处理过的培养物在向培养物添加柠檬酸以后的2天内急剧丧失生存力，如活细胞浓度的下降所指示的。向培养物中加入的高浓度(15 mM和30 mM)的苹果酸也诱导培养物的细胞生存力的丧失，如在图4中所见。在该情况下，苹果酸的加入显示出剂量应答效应，30 mM浓度的苹果酸诱导生存力的最快下降，随后是15mM，且当培养物中的苹果酸浓度是5 mM时，没有生存力下降(与对照摇瓶相比)。
乳酸盐积累依赖于加入培养物中的TCA中间体的类型和量。对照摇瓶显示在约第7天达到峰值的低乳酸盐积累(< 1.0 g/L)，随后是乳酸盐消耗阶段。
当将45 mM丙酮酸加入培养物中时，乳酸盐积累达到约3 g/L。所有其它的TCA中间体影响乳酸盐积累达到1 g/L至2 g/L的水平。在加入苹果酸达到5mM的终浓度的摇瓶中的乳酸盐积累特性类似于在对照摇瓶中观察到的结果。
铵概况显示出不同的积累水平。摇瓶测试对照条件下的氨浓度达到接近9mM。图6概述了在剂量应答研究中测试的所有条件的数据。在第5天向培养物中加入丙酮酸达到45 mM的终浓度诱导氨消耗直到第10天。在培养的该时间点以后，氨积累恢复并达到7 mM的终浓度。当加入丙酮酸至30 mM时，氨消耗效应仅持续至第8天，然后氨积累至8 mM。达到15 mM终浓度的丙酮酸添加对氨的减少仅具有微小影响，且培养物积累氨至比在对照摇瓶中发现的水平稍微更高的水平。
提供氨积累的最佳控制的TCA中间体是α-酮戊二酸和草酰乙酸。在测试浓度的那些中间体维持氨浓度在3 mM和6 mM之间。图7概述了α-酮戊二酸和草酰乙酸对氨积累的影响。
TCA中间体向培养物的添加还会影响最终的细胞比生产率。在对照培养物的情况下，计算的细胞比生产率值平均为31 pg/细胞/天(范围24 - 35 pcd)；用45 mM丙酮酸处理的培养物显示细胞比生产率下降至~24 pg/细胞/天。如在图8中所示，仅用草酰乙酸处理的培养物显示氨积累水平的下降和持续的细胞比生产率值。所有其它TCA中间体的添加显示细胞比生产率的下降。
因此，控制氨和维持细胞比生产率水平的最佳TCA中间体是在培养物中5-15 mM浓度的草酰乙酸。
实施例4-- TCA中间体(2-5种)之间的相互作用。DOE结果
从剂量应答实验，将丙酮酸、苹果酸、草酰乙酸、富马酸和α-酮戊二酸进一步测试相互作用。选择每种中间体的浓度作为在剂量应答实验中显示出应答的浓度。在某些情况下，选择的浓度是在剂量应答实验中实际测试的2个值之间。
由于在整个研究中摇瓶的数目，在2个区组中建立实验。图2和图3显示了每个区组测试的条件。每个区组含有对照条件(没有加入TCA中间体)。
对于所有测试的条件，活细胞浓度显示类似的峰值，如在图9中所示。TCA中间体的添加解释了在第6天观察到的VCC的下降，因为培养物的某种稀释恰好在培养物中得到期望的终浓度。
在氨积累的情况下，对中间体的应答显示出大变化。在对照条件下的培养物显示高达9 mM的氨积累，而20 mM丙酮酸、20 mMα-酮戊二酸盐、20 mM富马酸的混合物显示在培养结束时达到2 mM的最低氨积累。如在剂量应答研究中观察到的，苹果酸和丙酮酸可以抑制氨产生数天，然后氨水平升高至与对照培养物的浓度类似的终浓度。图10概述了所有条件的数据。
图11显示了测试的所有条件的峰氨积累。文本框显示了具有最低氨积累的条件。几种组合显示对氨浓度的控制。所有标记的条件显示接近4 mM的最大氨浓度(对照中的氨浓度是~ 9 mM)。
当将导致低氨积累的条件映射成细胞比生产率数据时(图12)，结果表明有些TCA中间体组合与对照相比对细胞比生产率具有负面效应。
在测试的所有条件中，组合5 mM苹果酸/20 mM丙酮酸、5 mM苹果酸/20 mM富马酸、5 mM苹果酸/20 mMα-酮戊二酸和20 mMα-酮戊二酸维持细胞比生产率和控制氨产生。在所有情况下，细胞比生产率维持在接近30 pg/细胞/天的水平。
实施例5—TCA中间体实验的进一步分析。
图12a、12b和12c显示了与对照培养物相比的丙酮酸盐剂量应答。NH4 +的浓度依赖于剂量，但是该效应仅仅持续几天。一旦丙酮酸盐耗尽，NH4 + 产生恢复(图12b)。图的次序显示了(a)活细胞浓度，(b)随培养时间变化的NH4 + 积累，和(c)细胞特异性的NH4 + 产生。在图(c)中，曲线的斜率指示细胞特异性的产生或消耗速率。
在α酮戊二酸盐(α-KG)的情况下，细胞分裂似乎停止(在中间体加入以后的扁平VCC曲线)。在测试的所有浓度，NH4 + 积累象细胞比生产率一样减少。45mM浓度的α-KG似乎是减少培养物中的NH4 +产生的最有效浓度(图13c)。
在苹果酸盐的情况下，剂量应答实验指示，高于5 mM的浓度对细胞有毒。在5mM浓度，不存在苹果酸对NH4 + 积累或产生的明显影响，如在图14b和14c中所示。
草酰乙酸盐添加对细胞生长不具有任何有害作用(图15a)，且在10mM和15 mM浓度，它可以减小培养物中的细胞比生产率和NH4 + 积累。
富马酸盐向培养物的添加会减小细胞生长(图16a)，且对NH4 + 积累和产生仅具有部分作用。在培养的第10天后，需要较高剂量的富马酸盐(30mM和45 mM)来稳定培养物中的氨产生(和积累)。
柠檬酸盐的添加对培养物具有有害作用。应当避免它的减少NH4 + 积累的应用。
使用在特定浓度添加的选择的中间体，建立第二个实验来验证得自第一个实验的结果。在该实验中，在证实结果的同时，观察到对细胞浓度的仅微小影响。苹果酸盐、草酰乙酸盐和丙酮酸盐的添加部分地减小NH4 + 积累和减少(图18b和18c)；富马酸盐添加减慢NH4 + 产生和积累。在α-KG的情况下，图18c指示，NH4 +被消耗，这也显示在图18b中。
图19a至19c显示了两种TCA中间体向培养物的添加的影响。一般而言，VCC不受极大影响(图19a)，因为细胞计数没有显示与对照培养物相比的巨大差异或随着培养继续而回收。
在NH4 +产生和积累的情况下，证实了两种TCA中间体的添加会产生更好的NH4 + 控制。从图19c，可能指出，含有α-KG的组合在培养物中产生了较低细胞比生产率和稳定的NH4 + 浓度(在黑色虚线周围的曲线)。
图20a至20c显示了3种TCA中间体向培养物的添加的影响。对于组合α-KG/富马酸盐/OAA和丙酮酸盐/α-KG/OAA，在该组合添加以后显著地影响细胞计数，从而提示应答避免使用。在组合丙酮酸盐/α-KG/富马酸盐的情况下，对细胞计数的影响不太显著。该相同组合显示NH4 + 生产率的下降和NH4 + 浓度的稳定(分别是图20c和20b)。
图21-24显示了添加一种TCA中间体(图21和22)、两种TCA中间体(图23)和三种TCA中间体(图24)的组合的平均细胞比生产率。
将α-KG鉴别为当单独使用时最有效的减少NH4 + 积累的TCA中间体。但是，如在图21和22中所示，它也倾向于显示细胞比生产率的下降(与对照相比下降了约10-20%)。
在TCA中间体的组合的情况下，组合丙酮酸盐/苹果酸盐(5mM/20mM)保持细胞比生产率，同时达到可接受的NH4 + 减少(图19b和19c)。存在许多可能的组合，其可以用于减少NH4 + 积累，且它们应当基于目的进行评估。预见到以减少的细胞比生产率为代价，包括α-KG的组合比其它组合更好地工作。
最后，有些包括3种TCA中间体的组合也减少NH4 + 积累。

Claims (23)

1.减少哺乳动物细胞培养物中的铵离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的三羧酸(“TCA”)中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM草酰乙酸。
2.维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生产力的方法，其中所述铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM草酰乙酸。
3.维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生长的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM草酰乙酸。
4.减少细胞培养物中铵离子积累对抗体糖基化模式的影响的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM草酰乙酸。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中还维持细胞比生产率。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述TCA中间体组合物包含约3 mM至约45 mM草酰乙酸。
7.细胞培养基，其包含约0.1 mM至约100mM草酰乙酸。
8.根据权利要求7所述的细胞培养基，其中还维持细胞比生产率。
9.根据权利要求7或8所述的细胞培养基，其中所述培养基包含约3 mM至约45 mM草酰乙酸。
10.降低哺乳动物细胞培养物中的铵离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的三羧酸(“TCA)中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM苹果酸和约0.1 mM至约100 mM丙酮酸。
11.维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生产力的方法，其中所述铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM苹果酸和约0.1 mM至约100 mM丙酮酸。
12.维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生长的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM苹果酸和约0.1 mM至约100 mM丙酮酸。
13.减少细胞培养物中铵离子积累对抗体糖基化模式的影响的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mM苹果酸和约0.1 mM至约100 mM丙酮酸。
14.根据权利要求10-13中的任一项所述的方法，其中还维持细胞比生产率。
15.根据权利要求10-14中的任一项所述的方法，其中所述TCA中间体组合物包含约3 mM至约45 mM苹果酸和约3 mM至约45 mM丙酮酸。
16.细胞培养基，其包含约0.1 mM至约100 mM苹果酸和约0.1 mM至约100 mM丙酮酸。
17.根据权利要求16所述的细胞培养基，其中还维持细胞比生产率。
18.根据权利要求16或17所述的细胞培养基，其中所述培养基包含约3 mM至约45 mM苹果酸和约3 mM至约45 mM丙酮酸。
19.降低哺乳动物细胞培养物中的铵离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的三羧酸(“TCA)中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mMα-酮戊二酸盐。
20.减少细胞培养物中铵离子积累对抗体糖基化模式的影响的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤：
a. 在细胞培养基中培养所述细胞，和
b. 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触，其中所述TCA中间体组合物包含约0.1 mM至约100 mMα-酮戊二酸盐。
21.根据权利要求19或20中的任一项所述的方法，其中所述TCA中间体组合物包含约3 mM至约45 mMα-酮戊二酸盐。
22.细胞培养基，其包含约0.1 mM至约100mMα-酮戊二酸盐。
23.根据权利要求22所述的细胞培养基，其中所述培养基包含约3 mM至约45 mMα-酮戊二酸盐。
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